JP2003534004A

JP2003534004A - アンモニア酸化細菌

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Publication number: JP2003534004A
Application number: JP2001587108A
Authority: JP
Inventors: ティモシー・エー・ホヴァネック; ポール・シー・バレル
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Priority date: 2000-05-19
Filing date: 2001-05-17
Publication date: 2003-11-18
Also published as: WO2001090312A1; DE60109441T2; DK1282688T3; BR0110977A; DE60137089D1; ATE291078T1; AU2001263305B2; AU6330501A; EP1282688B1; EP1502948B1; ATE417920T1; CA2410216C; MXPA02011412A; EP1502948A1; ES2238047T3; CA2410216A1; WO2001090312A9; EP1282688A1; DE60109441D1

Abstract

(57)【要約】アンモニア酸化細菌、アンモニア酸化細菌を検出するためのオリゴヌクレオチド・プローブおよびPCRプライマー、ならびに水槽環境でのアンモニアの集積を防止または抑制するためのその使用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、全体としてアンモニア酸化剤に関し、特にアンモニアを亜硝酸塩に
酸化できる新規4種の細菌、それらの新規細菌ならびに他のアンモニア酸化細菌
の検出のための種々のオリゴヌクレオチド・プローブおよびPCRプライマーに関
する。

【０００２】

【従来の技術】

アンモニアは、淡水および海水の両方に生息する真骨魚類および無脊椎動物に
よる主要窒素排泄物である。アンモニアは有機体がその食餌から取り込むタンパ
ク質の脱アミノ化またはアミノ交換反応により生じる。しかし、高濃度のアンモ
ニアは同じ水生有機体の多くにとって毒となり得る。自然の系、例えば湖、川お
よび海では、水量あたりの魚(および他の有機体)の密度が少ないので、アンモニ
ア濃度が有毒なレベルに達することはめったにない。

【０００３】しかし、人工的な水系、例えば水産養殖囲い、タンク、導水路および生け簀な
らびに水槽では、公共物および私物のいずれにおいても、アンモニアは、時に非
常に早い速度で有毒濃度に達する可能性がある。その理由の1つは、前記系で、
少ない水量に対して魚類密度が非常に高くなり得ることである。もう1つの理由
は、これらの系の多くで、水が連続的に交換されず、むしろ単に周期的に一部の
水を交換して系に循環させていることである。

【０００４】従って、ほとんどの水産養殖系および水槽では、何らかの形態の濾過を行い、
水生有機体の保全および増殖に適するように、水質の度合いを調節している。こ
のような濾過ユニットの主要構成成分は、バイオロジカル・フィルターである。
バイオロジカル・フィルターは、酸化によりアンモニアを他の化合物、即ち亜硝
酸塩に変換する能力を有する細菌を増殖させるための基体または部位として機能
するという事実から名付けられている。高濃度の亜硝酸塩も有毒になり得るが、
バイオロジカル・フィルター上で増殖し、亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する他の細菌
種が存在する。硝酸塩は非常に高い濃度の極端な場合を除いて、水生有機体に対
して無毒であると考えられている。

【０００５】バイオロジカル・フィルターを使用する他の状況または応用分野がある。これ
らには下水処理施設、廃水処理施設および飲料水濾過設備が含まれる。それぞれ
独自にバイオロジカル・フィルターを使用する理由を有するが、その目的は同じ
であり、無機窒素化合物をより無害な物質に変換することである。アメリカ合衆
国環境保護局(EPA)により規定された国際推奨水質判定基準(National Recommend
ed Water Quality Criteria)に合致させるために、多くの施設がバイオロジカル
・フィルターを必要としている。

【０００６】アンモニアの亜硝酸塩への酸化は、細菌-介在工程である。特に、以下の式で
示されるアンモニアの亜硝酸塩への変換を含む二段階酸化である: NH₃+O₂+H₂O+2e^-→NH₂OH+H₂O (1) NH₂OH+H₂O→NO₂ ^-+5H⁺+4e^- (2)

【０００７】最も良く知られているアンモニア酸化細菌(AOB)はNitrosomonas europaeaであ
る。これはもともと土壌から単離され、水産養殖施設(Wheaton, F. W. 1977. Aq
uacultural Engineering. John Wiley & Sons, Inc. New York.これらの参考文
献およびここで引用する他の全ての参考文献を参照により明細書に組み込んであ
る)、廃水処理施設(Painter, H. A. 1986. Nitrification in the treatment of
sewage and waste-waters. In Nitrification J. I. Prosser ed. IRL Press.
Oxford)および水槽(Spotte, S. 1979. Seawater Aquariums- The Captive Envir
onment. Wiley-Interscience. New York)において、活性AOBと称される。

【０００８】しかし、有機体(または有機体群)のDNA配列の独自性を利用する現代的な分子
方法により実施された近年の研究は、Nitrosomonas europaeaおよびその近隣種
が淡水水槽環境において検出限界を下回ることを見出した(Hovanec, T. A.およ
びE. F. DeLong. 1996. Comparative analysis of nitrifying bacteria associ
ated with freshwater and marine aquaria. Appl. Environ. Microbiol. 62: 2
888〜2896)。別の研究は、N.europaeaが廃水処理施設において主要なAOBでない
ことを実証した(Juretschko, S. et. al. 1998. Combined molecular and conve
ntional analyses of nitrifying bacterium diversity in activated sludge:
Nitrosococcus mobilis and Nitrospira-like bacteria as dominant populatio
ns. Appl. Environ. Microbiol. 64: 3042〜3051)。

【０００９】従って、このような環境中に未だに同定されていない、新規の、アンモニア酸
化を担うアンモニア酸化細菌が存在すると考えられる。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】

本発明の課題は、アンモニアを亜硝酸塩に酸化できる単離細菌または菌株を提
供することである。特に有利な実施形態において、細菌または菌株の16SrDNAは
、SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、またはSEQ ID No:4のヌクレオチド
配列あるいはSEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、またはSEQ ID No:4と少
なくとも96%類似したそのバリアントを有する。

【００１１】本発明はまた、核酸配列および、SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、
またはSEQ ID No:4と少なくとも96%、より好ましくは99%類似した配列を有する
細菌に関する。本明細書において、「96%類似」とは、単独の塩基置換が塩基の4
%までで起こることを意味する。「99%類似」とは、単独の塩基置換が塩基の1%ま
でで起こることを意味する。

【００１２】

【課題を解決するための手段】

本発明は淡水水槽中でアンモニア酸化を担う新規菌株の発見を基礎とする。

【００１３】本発明は、アンモニアを亜硝酸塩に酸化できる単離菌株または菌株の生物学的
に純粋な培養物を提供し、この際、菌株の16SrDNAは表1〜4に示すSEQ ID No:1、
SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、またはSEQ ID No:4のヌクレオチド配列を含有する
。

【００１４】表1.AOBタイプAアンモニア酸化細菌の配列。R7クローン140による。SEQ ID NO
:1。

【表１】

【００１５】表2.AOBタイプA1アンモニア酸化細菌の配列。R7クローン187による。SEQ ID N
O:2。

【表２】

【００１６】表3.AOBタイプBアンモニア酸化細菌の配列。R3クローン5による。SEQ ID NO:3
。

【表３】

【００１７】表4.AOBタイプCアンモニア酸化細菌の配列。R7クローン47による。SEQ ID NO:
4。

【表４】

【００１８】本発明の目的に関し、単離菌株とは、天然環境からある程度精製された1種類
の株を意味する。細菌の少なくとも20%が1つの菌株に由来する場合、細菌培養物
は生物学的に純粋であると見なされる。しかし、培養物は少なくとも33%純粋で
あるのが好ましく、培養物が少なくとも45%純粋であればより好ましく、最も好
ましくは少なくとも90%が純粋である。

【００１９】本発明の菌株は、含水媒体を維持または精製するための組成物を提供するため
に、菌株同士、他の細菌種、栄養分、および/または他の成分と組み合わせてよ
い。例えば本発明の細菌を、含水媒体から汚染物質または所望しない化合物を除
去することができる細菌と混合するのが望ましい。このような細菌の例には、亜
硝酸塩酸化細菌(亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する化学無機独立栄養細菌)、従属栄養
細菌(有機材料をアンモニアおよび他の物質に無機化する)、および当業者に公知
の別の細菌が含まれる。亜硝酸塩酸化細菌は、Proteobacteriaのアルファ、ガン
マおよびデルタ亜門のNitrospira細菌群から知られている。その例にはNitrospi
ra、NitrospinaおよびNitrobacter属の種が含まれる。硝酸塩還元細菌は、Azoar
cus、PseudomonasおよびAlcaligenes属から知られている。従属栄養細菌は、Bac
illus、PseudomonasおよびAlcaligenes属から知られている。これらは公知の源
から入手でき(例えばAmerican Type Culture Collection, 10801 University Bl
vd., Manassas VA 20100, USA)または水槽バイオフィルターから直接単離できる
。

【００２０】例えば、本発明の菌株は、水系に存在するアンモニアを亜硝酸塩に酸化し、亜
硝酸塩を硝酸塩に酸化する亜硝酸塩酸化細菌と、混合することができる。他の例
は、本発明の菌株を好気性または嫌気性脱窒細菌と混合することであろう。この
場合、本発明の菌株と亜硝酸塩酸化細菌との相互作用により生成される硝酸塩は
、二窒素または他の窒素をベースとする生成物に還元されよう。第3の例は、本
発明の菌株を、有機物をより単純な無機物に無機化し、次いで本発明の菌株によ
り基質として利用され得る従属栄養細菌と混合するものである。

【００２１】本発明の単離菌株はProteobacteriaのベータ細目のアンモニア酸化細菌(AOB)
に類似した細菌を含有する。しかし、SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2の菌株は、
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4および他のAOBベータ細目Proteobacteriaを除いて、
以下の配列を有するオリゴヌクレオチド・プローブを用いた蛍光in situハイブ
リダイゼーション(FISH)により検出できる: 5'-CCC CCC TCT TCT GGA TAC3'(SEQ ID NO:5)。

【００２２】 SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2の菌株は、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、および
他のAOBベータ細目Proteobacteriaを除いて、以下の配列で表されるプライマー
・セットを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により検出できる: フォワード・プライマー 5'-CGG AAC GTA TCC AGA AGA3'(SEQ ID NO:6) リバース・プライマー 5'-ATC TCT AGA AAA TTC GCT3'(SEQ ID NO:7)。

【００２３】 SEQ ID NO:3の菌株は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、および他の
AOBベータ細目Proteobacteriaを除いて、以下の配列を有するオリゴヌクレオチ
ド・プローブを用いた蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)により検出で
きる; 5'-TCC CCC ACT CGA AGA TAC G3'(SEQ ID NO:8)。

【００２４】 SEQ ID NO:8のオリゴヌクレオチド・プローブは、Nitrosospira AOB分岐メン
バーであるNitrosospira briensis(135505)、Nitrosospira tenuis(m96405)、お
よびNitrosospira tenuis(m96404)に対して配列の中央部に1つミスマッチを有す
る。プローブのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション法でホルムアミ
ド濃度を変化させることにより調節でき、従って当業者はこれらの分岐メンバー
とSEQ ID NO:3で表される菌株とを区別することができる。

【００２５】 SEQ ID NO:3の菌株は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、および他の
AOBベータ亜門Proteobacteriaを除いて、以下の配列を有するプライマー・セッ
トを用いてPCRにより検出できる: フォワード・プライマー 5'-ATC GGA ACG TAT CTT CG3'(SEQ ID NO:9) およびリバース・プライマー 5'-CCA CCT CTC RGC GGG C3'(SEQ ID NO:10)。

【００２６】 SEQ ID NO:4の菌株は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3および他のAO
Bベータ亜門Proteobacteriaを除いて、以下の配列を有するプライマー・セット
を用いてPCRにより検出できる: フォワード・プライマー 5'-TCA GAA AGA AAG AAT CAT G3'(SEQ ID NO:11)およびリバース・プライマー 5'-GTC TCC AYT AGA TTC CAA G3'(SEQ ID NO:12)。

【００２７】本発明はまた、アンモニアを亜硝酸塩に酸化できる濃縮菌株を含有する混合物
を提供し、この際、細菌の16SrDNAは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3
またはSEQ ID NO:4のヌクレオチド配列を有する。本発明において、菌株が天然
での濃度よりも高い濃度で生じる場合、菌株が濃縮されていると見なす。一般的
に、適当なコントロールと列挙法を用い、当業者に公知の蛍光in situハイブリ
ダイゼーション技法を使用する分子検索等の標準技術により測定される場合、菌
株の濃度は、サンプル中の全細胞の少なくとも20%である。より好ましくは全細
胞の33%以上であり、更に好ましくは45%、最も好ましくは全細胞の90%以上であ
る。しかし、混合物中にSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3またはSEQ ID
NO:4のヌクレオチド配列を有する細菌を1種以上有するのが好ましい。この場合
、前記パーセンテージは、細胞集団の平衡が亜硝酸塩酸化細菌または他種細菌か
ら成ることを理解した上で、混合物中の全AOBのパーセンテージを述べたもので
ある。

【００２８】本発明の菌株、および混合物は、粉末、液体、凍結形および凍結乾燥形の形態
であってよい。これらは一般的に「市販の添加剤」として参照される。このよう
な形態には、以下のものが含まれるが、これに限定するものではない: (1)液体形、この際、1種以上の株が無機塩または有機化合物を含有する液体溶液
中に存在し、細胞の生存率は貯蔵中に損なわれない; (2)凍結形、この際、1種以上の株が、細胞の溶解を防止するため任意に凍結保護
化合物を含有する前記液体混合物中に存在し、これを凍結させ、32°Fを下回る
温度で貯蔵する; (3)粉末形、これは凍結乾燥または他の方法で製造され、この際、1種以上の株ま
たは混合物の脱水形は、通常の室温で生存率を損なうことなく貯蔵できる。

【００２９】本発明の菌株および混合物を適当な形で取得することについては、近年の報告
の見地から当業者が精通している。本発明の菌株および混合物が単独で使用でき
、または他の成分と組み合わせることができることも認識されている。このよう
な成分の例は、亜硝酸塩酸化細菌、従属栄養亜硝酸酸化細菌、従属栄養アンモニ
ア酸化細菌、および類似体であるが、これに限定するものではない。生物学的に
純粋な菌株の全ての形態は、栄養分、アミノ酸、ビタミン、および菌株の増殖を
維持促進するための他の化合物を含有してよい。本発明の菌株および混合物なら
びに組成物を、アンモニアの集積を抑制するために、淡水水槽、海水水槽、およ
び廃水に使用してもよい。これらを、アンモニアにより引き起こされる汚染レベ
ルを低減するために、バイオメディエーション(生物的環境浄化)プロセスに利用
してもよい。バイオメディエーション（生物的媒介）プロセスは、バイオオーグ
メンテーション(生物的強化)とも呼称され、元の系に存在する1種以上の形態の
化学化合物を結果的に変化させる、生物学的および/または化学的方法を促進ま
たは確立するために、系(例えば、生物学的または化学的な汚染の見られる場所)
へ微生物を補足添加することが含まれるが、これに限定するものではない。

【００３０】従って、本発明の1つの態様は、媒体中のアンモニアの集積を抑制する方法を
提供することである。この方法は、媒体中のアンモニアの集積を抑制するために
、アンモニアを亜硝酸塩へ酸化できる十分な量の菌株を、媒体中に導入するステ
ップを含み、この際、菌株の16SrDNAは、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO
:3またはSEQ ID NO:4と96%以上の類似性を示すヌクレオチド配列を有する。添加
した細菌が媒体中のアンモニアの集積を抑制または防止できれば、菌株の量は十
分である。一般的に、本発明の1種以上の菌株の淡水または塩水水槽への添加は
、最大アンモニア濃度を、菌株不在で到達するレベルの少なくとも50%を超える
まで低下させることが予想される。

【００３１】前記設定で達成される実際のレベルが系の大きさと内容、すなわち魚類、植物
等の数の関数であることが分かる。新規の機構は10匹の魚がいる37リットルの水
槽で、アンモニア濃度は菌株の添加なしでは7mg/L以上に達し、これに対して菌
株を添加することにより、最大レベルを約2mg/Lまで低下させることができる。
通常、本発明の菌株をこのような系へ添加する場合、最大アンモニア濃度が3mg/
Lを超えることは考えられない。系が定常状態に達すると、アンモニア・レベル
は0.5mg/Lまで戻り、本発明の菌株ではこの過程がより迅速になる。

【００３２】本発明の1つの形態では、本発明の菌株を淡水水槽、海水水槽および廃水等の
媒体(これに限定するものではない)へ直接導入する。好ましくは、細菌を接触回
転板処理装置で最初に増殖させ、その後、媒体へ導入することができる。異なる
形態では、本発明の細菌は、媒体中に存在するバイオフィルター単位に導入でき
る。別の形態では、本発明の細菌を、アクリルアミドまたはアルギネートやカラ
ゲナンで構築されたポリマー等の固定化ポリマー(これに限定するものではない)
中に固定化し、次いで細菌入りのポリマー材料をフィルター中に導入するかまた
はそれ自体を施設の濾液流中に導入する。

【００３３】ここで使用する用語「水槽」は、水を保持しかつその中で水生有機体(例えば
魚類、植物、細菌および無脊椎動物)が生存する容器を意味し、容器はガラス、
プラスチック、または木材(これに限定するものではない)を組み合わせてまたは
それ自体で作成されている。水槽は、水生有機体の展示、短時間または長時間の
保持、科学的調査、輸送および他の目的を意図する。淡水水槽は一般的に、液体
媒体が1000分の15部より低い塩度を示す水槽である。塩水水槽は一般的に、液体
媒体が1000分の15部より高い塩度を示す水槽である。使用される「水槽水」とい
う用語は、水槽中に含まれる媒体、およびそれに付随したフィルター系を意味し
、中には水槽有機体が生息している。水槽水は広い範囲の無機または有機化学物
質を含有してよく、従って、幾つか例を挙げれば塩、pH、全溶解固体、および温
度等のパラメーターも広い集中範囲を有する。

【００３４】ここで使用される「廃水」は一般的に工場または人為的な過程で生じる液体媒
体を意味する。廃水は1回以上の濾過法で処理して環境に優しい状態にし、政府
の規定した排液標準に合致するようにしなければならない。廃水は環境に排出し
ないように循環させることもできる。

【００３５】ここで使用される「バイオロジカル・フィルター」とは、「バイオフィルター
」とも称され、一般的に、その目的が微生物の増殖促進であるかまたは微生物の
付着と増殖のための物質を提供することであるような種類のフィルターを意味す
る。バイオフィルターは水槽の濾過系または廃水濾過系の一部であってよい。こ
こで使用する用語「接触回転板処理装置」は、一般的に、水中または媒体中で回
転する種類のバイオフィルターを意味する。これは水または媒体中に完全にまた
は部分的に浸漬していてよい。当業者であれば、接触回転板処理装置を、米国特
許明細書第2,085,217号、第2,172,067号、第5,423,978号、第5,419,831号、第5,
679,253号、第5,779,885号、および全ての継続出願、改良出願および対応する外
国出願において具現化されているものと認識すると思われるが、それらは本発明
の譲受人により共に保持されており、それぞれ参照により特にここに組み込まれ
ている。

【００３６】ここで使用される「フィルター・フロス」は、バイオフィルター、機械的フィ
ルターまたはそれらの組み合わせとして機能する、不規則な形状をした天然また
は合成多系材料を意味する。

【００３７】ここで使用される「水槽用砂利」は、水槽の内部の底に一般的に敷かれている
物質を意味する。それは、岩、サンゴ、プラスチックまたは他の材料の不規則な
またな規則的な形状破片であってよい。それはバイオフィルター、機械的フィル
ターとして、装飾目的で、またはそれらの組み合わせとして機能するものであっ
てよい。

【００３８】ここで使用される「フィルター・スポンジ」は、水槽中で使用されるかまたは
水槽濾過系の一部として使用される場合に、機械的フィルターまたはバイオフィ
ルターまたはその両方として機能する天然または合成の材料を意味する。

【００３９】ここで使用される「プラスチック・フィルター・メディア」は、バイオフィル
ターまたは機械的フィルターまたはその両方として機能する人工の材料を意味す
る。これはプラスチック成形品または注入成形品であってよい。

【００４０】本発明は、媒体中に存在する本発明の細菌の量を検出および測定するためのヌ
クレオチド・プローブを提供する。1つのプローブは、5'-CCC CCC TCT TCT GGA
TAC 3'(SEQ ID NO:5)のヌクレオチド配列を有し、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:
2の16SrDNAヌクレオチド配列を有するタイプAのAOBを検出できる。別のプローブ
は5'-TCC CCC ACT CGA AGA TAC G3'(SEQ ID NO:8)の配列を有し、SEQ ID NO:3の
16SrDNAヌクレオチド配列を有するタイプBのAOBを検出できる。本発明のヌクレ
オチド・プローブは従来公知の方法で合成できる。

【００４１】本発明のヌクレオチド・プローブは、検出可能な任意のラベルで標識できる。
好適なラベルの例には、放射線ラベル、蛍光ラベルおよびそれに類するものが含
まれるが、これに限定しない。好適な標識材料は購買入手され、当業者に一般公
知である。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの標識法は、当業者に公
知である(例えばSambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis. Molecular Cl
oning - A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Press
参照)。検出法も様々可能であり、ここに記載する方法に限らない。他の手段、
例えばDNAチップまたは定量的PCR装置で、ここに記載したプローブを使用でき、
従って、これらの検出法および手段ならびに他の検出法および手段はここに組み
込まれるものとする。

【００４２】本発明のヌクレオチド・プローブは、本発明の菌株の16SrDNAとハイブリダイ
ズする。従って、本発明のヌクレオチド・プローブは本発明の細菌の量を検出測
定するための方法で使用するのに非常に適している。

【００４３】本発明の1つの態様において、アンモニアを亜硝酸塩へ酸化できる細菌の媒体
中の量を検出測定するための方法が提供され、この際、細菌の16SrDNAはSEQ ID
NO:1、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:3のヌクレオチド配列を有する。この方法は
以下のステップを含む: (a)本発明の検出可能な標識プローブを供給する; (b)媒体から全DNAを単離する; (c)プローブが細菌の核酸とのみハイブリダイズするような条件下に単離した全D
NAを検出可能な標識プローブへと曝露する、この際、細菌の16SrDNAはID NO:1、
SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:3のヌクレオチド配列を有する。 (d)細菌の量を検出測定するためにハイブリダイズしたプローブを検出測定する
。

【００４４】媒体は水槽水であってよく、そこからDNAを単離する。媒体はまた水槽用砂利
、スポンジ・フィルター材料、フィルター・フロス、およびプラスチック・フィ
ルター・メディアから成る群より選択される材料を含有してよいが、これに限定
するものではない。従って、DNAは、そのような細菌が存在すると考えられる前
記のおよび他の源から単離できる。

【００４５】本発明の検出方法は、媒体中でアンモニアを亜硝酸塩へ酸化できる細菌の発生
をモニターしかつ検出するための効果的なツールを提供する。

【００４６】方法はまた、本発明の細菌の発生および活性を測定することにより、特に淡水
水槽での添加物の効果を測定し、市販の添加物を確認するためのツールを提供す
る。

【００４７】本発明は、媒体中に存在する本発明の細菌の検出および定量化のためのPCRプ
ライマー・セットを提供する。プライマー・セットは以下の配列から成る;セッ
ト1)フォワード・プライマー5'-CGG AAC GTA TCC AGA AGA3'(SEQ ID NO:6)およ
びリバース・プライマー5'-ATC TCT AGA AAA TTC GCT3'(SEQ ID NO:7);セット2)
フォワード・プライマー5'-ATC GGA ACG TAT CTT CG3'(SEQ ID NO:9)およびリバ
ース・プライマー5'-CCA CCT CTC RGC GGG C3'(SEQ ID NO:10);セット3)フォワ
ード・プライマー5'-TCA GAA AGA AAG AAT CAT G3'(SEQ ID NO:11)およびリバー
ス・プライマー5'-GTC TCC AYT AGA TTC CAA G3'(SEQ ID NO:12)。本発明のPCR
プライマーは従来公知の方法で合成できる。

【００４８】本発明のPCRプライマーは本発明の細菌の量を検出測定するための方法で使用
するのに非常に適している。

【００４９】本発明の1つの態様において、媒体中でアンモニアを亜硝酸塩に酸化できる細
菌の量を検出測定するための方法が提供され、この際、細菌の16SrDNAはSEQ ID
NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:4のヌクレオチド配列を有す
る。方法は以下のステップを含む: (a)本発明のPCRプライマー・セットを供給する; (b)媒体から全DNAを単離する; (c)プライマーが細菌の核酸とのみ特異的にアニールするような条件下で、単離
した全DNAをPCRプライマー・セットへ曝露する、この際、細菌の16SrDNAはSEQ I
D NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:4のヌクレオチド配列を有
する。

【００５０】本発明の形態の例を以下に詳細に説明する。

【００５１】

【発明の実施の形態】

材料および方法一連のアッセイおよび実験は、ここに報告する菌株の単離、同定および効果の
提示のために実施された。これらには種々の細菌培養技術、培養物サンプルから
抽出したDNAの分子生物学的分析、菌株の分子生物学的分析、および菌株の濃縮
培養物を水槽へ適用することによるアンモニア濃度の調整能の測定が含まれる。

【００５２】細菌培養:多数の細菌培養容器(反応容器と称する)を製造し、使用中の水槽か
ら収集した細菌バイオマスを播種した。各反応容器に、50g KH₂PO₄、50g K₂HPO₄ 、18.75g MgSO₄・7H₂O、1.25g CaCl₂・2H₂Oおよび1g FeSO₄・7H₂Oを含有する無機塩
溶液(蒸留水中で製造する)4.95Lを導入した。可溶化酸素が7.5mg/L以上になるよ
うに空気を送り、攪拌し、反応容器を約28℃で暗いキャビネット中に放置した。

【００５３】アンモニアおよび亜硝酸塩濃度を、電極でpHを測定しながら(Denver Instrume
nts Model 225 pH/ISE meterおよび関連のpH/ATC電極)、フロー・インジェクシ
ョン分析により毎日測定した。硝酸塩および伝導度を定期的に測定し、水の交換
をすべきかを決定する際にデータを利用した。バイオマスは本質的にまさに綿状
であるので、細菌バイオマスは水の交換中も反応容器に停留させた。従って、適
当な抜き取り口を介して反応容器の体積の50%をデカントする前に、空気を除き
かつ装置を1時間攪拌することにより、バイオマスを沈降させる。更に、反応容
器を時々こすって表面からバイオマスを除き、バイオマスを懸濁液に戻す。更な
る分析を行うためのDNA抽出(PCR用)および細胞固定(FISH用)のために、微生物サ
ンプルを日常的に回収した。

【００５４】核酸のサンプリングおよび抽出:DNA抽出のために、適当な生物学的濾過媒体の
サンプルを回収し、細胞溶解バッファー(40mM EDTA、50mM Tris-HCl、pH8.3)中
に再懸濁した。サンプルを抽出を行うまで-20℃または-74℃で貯蔵した。処理に
際し、終濃度が10mg/mlとなるようにリゾチームをサンプルへ添加した。37℃で9
0分インキュベートした後、20%のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を終濃度が1%に
なるように添加した。次いでサンプルを凍結/解凍サイクルに課し、その後プロ
テイナーゼK(貯蔵濃度、10mg/ml)を終濃度が2mg/mlとなるように添加し、70℃で
35分インキュベートした。時には、更にプロテイナーゼ-KおよびSDSを添加し、
サンプルを55℃で更に30分インキュベートした。

【００５５】細胞溶解後、Easy DNA extractionキット(Qiagen Inc., Santa Clarita, CA)
を用いてDNAを抽出した。DNAを50μl体積まで溶出させ、Hoechstタイプ33258染
料の結合および蛍光測定(DynaQuant 200, Hoefer Pharmacia Biotech Inc., San
Francisco, Calif.)により定量化した。

【００５６】 PCR増幅rRNA遺伝子のクローン・ライブラリー。クローン・ライブラリーは反
応容器および水槽から回収したバイオマス・サンプルのDNAエキストラクトに由
来する。細菌のリボゾームRNA遺伝子フラグメントを、プライマーS-D-Bact-0011
-a-S-17(8f;GTT TGA TCC TGG CTC AG)(SEQ ID NO:13)および1492r(真性細菌;GGT
TAC CTT GTT ACG ACT T)(SEQ ID NO:14)を用いて増幅した。PCR条件、サイクル
・パラメーター、および反応成分はこれまでに記載の通りであった(DeLong, E.
F. 1992. Archaea in coastal marine environments Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 89: 5685〜5689)。PCR生成物をアガロース・ゲル電気泳動により評価した。T
Eバッファーで洗浄し、Centricon(登録商標)濃縮装置(Amicon, Inc. Beverly, M
A)で30μlまで濃縮した後、TA Cloningキット(Invitrogen, Carlsbad, Calif.)
を用いて、製造元仕様書の記載に従い、PCRフラグメントをクローン化した。

【００５７】シークエンスおよび系統分析。クローン・ライブラリーを含む各クローン由来
の16SrDNA挿入物を、A)16SrDNA挿入物が増幅可能であるかを評価しB)16SrDNAが
、HaeIII酵素で切断される場合に特殊なREAパターンを示すかどうかを決定する
ために、制限酵素HaeIIIを使用して、制限酵素分析(REA)により選別した。クロ
ーンが増幅可能で、特殊なREAパターンを有する場合、次いで、当該16SrDNA挿入
物を有するクローンのプラスミドを部分的にシークエンスした。シークエンスの
ために選択された、各クローンの増幅PCR16SrDNAテンプレートを、PCR Purifica
tionキット(カタログ番号28142(Qiagen, Santa Clarita, CA))を用いて清浄した
。シークエンスはLiCor4000L自動DNAシークエンサーを使用してテンプレートに
関して実施され、蛍光標識プライマーおよびSequiTherm EXCEL(商標)II DNA Seq
uencingキット(Epicentre Technologies, Madison, WI)を用いて周期的に配列決
定した。同一のREAパターンを示す2または3種のクローンまでが部分的にシーク
エンスされ、それらが同一であることが確認された。多くのクローン(しかし特
にProteobacteria網のベータ亜門のNitroso分岐に属するクローン)を完全にシー
クエンスし、PAUP(Phylogenetic Analysis Using Parsimony ver 4.0b2a, D. L.
Swofford)(ブーストラップ値および距離分析)、ARB(A Software Environment
for Sequence Date, W. Ludwig and O. Strunk)(系統樹)およびPhylip(Phylogen
y Inference Package J. Felsentein)(類型マトリクス)により系統的に分析した
。クローン・ライブラリーに由来する当該クローンのためのプライマーおよびプ
ローブを、ARBプローブ・デザインおよびプローブ・マッチ・プログラムならび
にアフタ・マニュアル・アラインメントを使用して発展させた。プライマーおよ
びプローブをBLAST(Altschul, S. F., W. Gish, W. Miller, E. W. Myers, and
D. J. Lipman. 1990. Basic local alignment tool. J. Mol. Biol. 215: 403〜
410)で二重確認した。プライマーの特異性は、それをクローン由来のDNA抽出物
および公知細菌の純培養物に使用することにより決定した。プローブの特異性を
、公知細菌の純培養物および反応容器由来のサンプルを用いて試験した。

【００５８】 DGEE分析およびプロファイリング。一般的な真性細菌DGGE分析のため、Murray
等が記載するように(Murray, A. L., J. T. Hollibaugh and C. Orrego. 1996.
Phylogenetic compositions of bacterioplankton from two California estuar
ies compared by denaturing gradient gel electrophoresis of 16S rDNA frag
ments. Appl. Environ. Microbiol. 62: 2676〜2680)、5'末端に40bpのGCクラン
プを有するフォワード358f(真性細菌;CCT ACG GGA GGC AGC AG)(SEQ ID NO:15)
およびリバース・プライマーS-^*-Univ-0519-a-A-18(519r:GWA TTA CCG CGG CKG
CTG)(SEQ ID NO:16)を用いてrDNA断片を増幅した。特殊AOB DGGE分析のために、
5'末端に40bpのGCクランプを有するフォワード・プライマー358f(真性細菌;CCT
ACG GGA GGC AGC AG)(SEQ ID NO:15)およびリバース・プライマーS-^*-Ntros-063
9-a-A-20(Nitroso4e:CAC TCT AGC YTT GTA GTT TC)(SEQ ID NO:17)を使用した。
PCR条件は同一であり、Stratagene Robocycler Gradient96(La Jolla, Calif)上
で、QiagenTAQ PCRコア・キット(Qiagen, Santa Clarita, Calif.)を用いて実施
した。PCR条件はホット・スタート(80℃)およびタッチダウン法を含む。最初の
変性を94℃で3分実施した後、94℃で1分変性し、タッチダウン・アニーリングを
65℃から55℃で1分29秒実施し(タッチダウン中サイクル毎に1.4秒ずつアニーリ
ング時間を延長する)、プライマー伸長を72℃で56秒実施した(サイクル毎に1.4
秒ずつ伸長時間を延長する)。前記の熱サイクルの後半の温度系を全部で20サイ
クル繰り返し、その後72℃で5分、最後の伸長を行う。アンプリコンをアガロー
ス・ゲル電気泳動により調査した。DGGEをBio-Rad D-GENESystem(Bio-Rad Labor
atories, Hercules, Calif.)を用いて実施した。ゲルは、Bio-Rad試薬(D GENE E
lectrophoresis Reagent Kit, Bio Rad Laboratories, Hercules, Calif.)を使
用した8.5%のアクリルアミド/Bisであった。20〜60%の変性勾配(100%の変性は脱
イオン化ホルムアミド40%と7M 尿素との混合物である)を有するBio-Rad試薬(D G
ENE Electrophoresis Reagent Kit, Bio Rad Raboratories. Hercules, Calif.)
およびBio-Rad勾配輸送系(Model 475, Bio Rad Laboratories, Hercules, Calif
.)を使用して、ゲル勾配をかける。全てのゲルを200ボルトで6時間操作した。ゲ
ルを二元の片方で可視化した。分離したDNAバンドの可視化および回収のために
、ゲルを最初に、100μlのエチジウム・ブロマイド(1mg/ml)を添加した1×TAEバ
ッファー250ml中で10分染色し、次いで1×TAEバッファーで10分洗浄した。考察
目的で、いくつかのゲルをVistra Green(1:10,000希釈)(Molecular Dynamics, S
unnyvale, Calif)で20分染色し、次いで1×TAEバッファーで20分洗浄し、FluorI
magerSI(Molecular Dynamics, Sunnyvale, Calif)でスキャンした。

【００５９】個々のバンドをアルコール滅菌したメスでDGGEゲルから切り出した。ゲルから
のDNAの切り出しはFerris等の方法に準じた(Ferris, M. J.. G. Muyzer, and D.
M. Ward. 1996. Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of 16S
rRNA - defined population inhabiting a hot spring microbial mat communit
y. Appl. Environ. Microbiol. 62: 340〜346)。切り出したバンドを500μlの滅
菌脱イオン水の入った2mlのスクリュー・キャップ・チューブに導入した。チュ
ーブは半分がガラス・ビーズ(カタログ番号11079-101、Biospec Products Inc.,
Bartlesville, Okla.)で満たされ、最も高い設定で3分間、機械的なビーズ・ビ
ーター中に導入した(Mini-beadbeater-8, Biospec Products Inc., Bartlesvill
e, Okla)。処理したDNAを4℃で一晩チューブ中に放置した。一晩貯蔵した後、チ
ューブを3,200×gで、4℃で8分遠心し、ゲル断片を濃縮した。上清を清浄なエッ
ペンドルフ・チューブに移行した。

【００６０】抽出効率を確認するために、上清をDGGEプライマーで再増幅し、DGGEで再分析
した。混合集団サンプル中で元のDGGEバンドと共に移動する単一バンドがDGGE分
析で認められた場合に、抽出を許容し得るとみなした。切り出したバンドのヌク
レオチド配列は、先に記載した蛍光標識プライマーを使用した方法により決定さ
れた。

【００６１】オリゴヌクレオチド・プローブ、PCRプライマーの開発、およびFISHハイブリ
ダイゼーション法。オリゴヌクレオチド・プローブは、本研究において、反応容
器に由来する3種の非常に密接な関係を有する細菌から単離された16SrRNA遺伝子
配列と、特異的にハイブリダイズするように設計された。1つのプローブ(S-G-Ns
spa-0149-a-A-18)(SEQ ID NO:5)は、SEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:4で表される
配列を含む他のベータ細目Proteobacterialアンモニア酸化細菌ではなく、SEQ I
D NO:1およびSEQ ID NO:2で表される、2種類の、反応容器由来Nitrosospira様細
菌を標的としている。第2のプローブ(S-G-Nsspa-0149-a-A-19)(SEQ ID NO:8)は
、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:4ならびに他のベータ細目Proteob
acterialアンモニア酸化細菌ではなく、SEQ ID NO:3の配列で表される、1種類の
、反応容器由来Nitrosospira様細菌を標的としている。プローブが合致するかは
最初にBLAST(Altschul, S. F., W. Gish, W. Miller, E. W. Myers, and D. J.
Lipman. 1990. Basic local alignment tool. J. Mol. Biol. 215: 403〜410)お
よびCHECK_PROBE(Maidak, B. L., N. Larsen, M. J. Mccaughey, R. Overbeek,
G. J. Olsen, K. Fogel, J. Blandy, and C. R. Woese. 1994. The ribosomal d
atabase project. Nucleic Acids Res. 22: 3485〜3487)を使用して調査した。
プローブは、Operon Tech, Inc.(Alameda, Calif.)により合成された。プローブ
のヌクレオチド配列および位置を表5に示す。

【００６２】表5.アンモニア酸化細菌のためのオリゴヌクレオチド・プローブおよびPCRプ
ライマー・セットのヌクレオチド配列および位置

【表５】プローブ(SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:8)のストリンジェンシーは、反応容器
バイオマスを本明細書の細菌配列(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:3
)のポジティブ・コントロールとして使用し、異なるホルムアミド濃度でFISH実
験を実施することにより決定された。プローブの特異性は、他のベータ亜門アン
モニア酸化細菌(Nitrosomonas europaea、Nitrosospira multiformisおよびNitr
osomonas cryotolerans)の純培養物のネガティブ・コントロール細胞に対して試
験することにより検証された。固定し不動化した細胞のin situハイブリダイゼ
ーションを、0.9M NaCl、20mM Tris/HCl(pH7.4)、0.01%ドデシル硫酸ナトリウム
(SDS)、25ng オリゴヌクレオチド・プローブおよび種々の量のホルムアミドを含
有するハイブリダイゼーション溶液中で実施した。スライドを、平衡化した湿度
を有するチャンバー中で、46℃で、90〜120分インキュベートした。ハイブリダ
イゼーション溶液を予め加熱(48℃)した洗浄溶液で洗い流した。次に、スライド
を洗浄溶液中で、48℃で15分インキュベートした。洗浄ステップにおいて、ハイ
ブリダイゼーションステップと同様の緊縮性を得るために、洗浄溶液には20mM T
ris/HCl(pH7.4)、0.01% SDS、5mM EDTAおよびNaClを含有させた。NaClの濃度は
、溶液で使用するホルムアルデヒドの割合に応じて変化した。20%ホルムアルデ
ヒドではNaCl濃度は215mMであり、30%では120mMであり、40%ではNaCl濃度は46mM
であった。細胞は、FITC/FLUO3およびHQ CY3のフィルター・セットを装備したZe
iss Axioskop2表面蛍光顕微鏡(Carl Zeiss, Jena, Germany)を使用して検出され
た。S-G-Nsspa-0149-a-A-18プローブの場合、至適緊縮性は30%ホルムアミドで測
定された。S-G-Nsspa-0149-a-A-19プローブでは、至適緊縮性は20%ホルムアミド
で測定された。

【００６３】 PCR:本明細書で報告する配列を有するNitrosospira様細菌を特異的に検出する
2セットのPCRプライマーを開発した。本明細書で報告する配列を有するNitrosom
onas様細菌を特異的に検出する第3セット目のPCRプライマーを開発した。第1セ
ット(SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:7)は、他のアンモニア酸化細菌ではなく、配
列SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2を有するNitrosospira様細菌を特異的に検出す
る(表6)。第2セット(SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:10)は、他のアンモニア酸化
細菌ではなく、配列SEQ ID NO:3を有するNitrosospira様細菌を特異的に検出す
る(表6)。第3セットは(SEQ ID NO:11およびSEQ ID NO:12)は、他のアンモニア酸
化細菌ではなく、配列SEQ ID NO:4を有するNitrosomonas様細菌を特異的に検出
する(表6)。PCR条件はアニーリング温度が異なる以外、前記した通りであった。

【００６４】表6.開発されたPCRプライマーの特異性試験およびアニーリング温度実験の結
果

【表６】各プライマー・セットの特異性は、Stratagene Robocyclerの温度勾配モード
で各プライマー・セットを使用したPCR実験を実施することにより至適化された
。このモードでは、12種類までの異なるアニーリング温度を用いた全ての反応を
、1回の実験で実施できる。典型的には、2℃ずつの間隔で上昇させた4〜6種類の
異なる温度で実験を実施した。各PCRプライマー・セットを、SEQ ID NO:1、SEQ
ID NO:2、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:4のヌクレオチド配列を有するクローン
生成物に対して試験した。Nitrosomonas europaea、Nitrosolobus multiformis
およびNitrosomonas cryotoleransの純培養物から抽出されたrDNAも試験した。
表5にPCRプライマー・セットが記載され、至適アニーリング温度の結果は表6に
記載される。

【００６５】結果および議論アンモニアを亜硝酸塩に酸化するアンモニア酸化剤の同一性を検討するために
、数種の淡水硝化バイオマスから、9種のクローン・ライブラリーを構築した。
バイオマスの詳細を表7に記載する。

【００６６】表7.反応容器および水槽の詳細(該反応容器および水槽からバイオマスを抽出
しクローン・ライブラリーを構築する)

【表７】クローン・ライブラリー・データは、低アンモニア供給反応容器(例えばR3、R
7)に生息する3群のアンモニア酸化細菌の存在を示している。しかし、全ての反
応容器に3種全部のAOBタイプが見出されたのではない。3種の細菌は3種のAOBク
ローン群-AOBタイプA(SEQ ID NO:1)(およびサブタイプA1(SEQ ID NO:2))、AOBタ
イプB(SEQ ID NO:3)により表される。4種目のクローンタイプは、高アンモニア
供給装置で見出され、AOBタイプC(SEQ ID NO:4)であった。

【００６７】類似性のランク付けを4種のクローン配列に対してRDPを用いて実施した(Maida
k, B. L., J. R. Cole, C. T. Parker, Jr, G. M. Garrity, N. Larsen, B. Li,
T. G. Lilburn, M. J. McCaughey, G. J. Olsen, R. Overbeek, S. Pramanik,
T. M. Schmidt, J. M. Tiedje and C. R. Woese. A new version of the RDP (R
ibosomal Database Profect).Nucleic Acids Res. 27: 171〜173(1999))(表8)。
類似性分析により、AOBタイプA(SEQ ID NO:1)およびタイプA1(SEQ ID NO:2)が99
.6%類似することが分かった。このことは、タイプA(SEQ ID NO:1)のタイプ配列
とタイプA1(SEQ ID NO:2)のタイプ配列との間で、16SrDNAに5個のミスマッチが
存在するという16SrDNAデータとも一致する。この類似性分析から、タイプAおよ
びA1配列がNitrosospiraまたはNitrosomonas分岐のいずれの公知AOBとも大きく
異なっていることが分かった(表8)。この結果は、更に、AOBタイプA(SEQ ID NO:
1)およびタイプA1(SEQ ID NO:2)分岐が共に、NitrosospiraまたはNitrosomonas
分岐のいずれとも異なるグループであることを示すブートストラップ分析によっ
ても支持される(図1)。従って、AOBタイプA(SEQ ID NO:1)およびタイプA1(SEQ I
D NO:2)で表される細菌は少なくとも新規種である。

【００６８】表8.反応容器および水槽から単離されたアンモニア酸化クローンに関する類似
性のランク付け

【表８】

【００６９】 AOBタイプB(SEQ ID NO:3)の類似性分析は、この細菌がAOBのNitrosospira分岐
になることを示している(表8)。ブートストラップ分析がこの結果を確証してい
る(図1)。しかし、有機体は近縁のNitrosospira AOB(Nitrosovibrio tenuis)と
は全く異なっており、従って新機種と見なしてよい。

【００７０】 AOBタイプC(SEQ ID NO:4)の類似性分析は、この細菌がAOBのNitrosomonas分岐
になることを示している(表8)。ブートストラップ分析がこの結果を確証してい
る(図1)。しかし、有機体は近縁のNitrosomonasAOB(Nitrosomonas europaea)と
は全く異なっており、従って新機種と見なしてよい。

【００７１】表8に示した類似性のランク付けは、それぞれの菌株の特殊性を決定するのに
役立つ。どの程度の割合で新機種と考えるかについて、堅固とした確固たる規則
はない。しかし、0.989の類似性ランクを示すNitrosolobus multiformisおよびN
itrosovibrio tenuisは、あらゆる微生物の権威から異種であると認識されてお
り、Nitrosolobus multiformisおよびNitrosospira briensis(類似性ランク0.98
0)も同様である。本明細書で報告される菌株の類似性の値は、前記の種のペアで
記載した値よりも高くなく、このことは記載の株が新規かつ特殊なものであるこ
とを立証している。

【００７２】従ってクローン・データ、PCR結果、系統分析、DGGEデータおよび類似性のラ
ンク付けの全体から、本明細書で報告する菌株が特殊であり、公知のアンモニア
酸化細菌とは異なることが実証される。更に、ここに記載するような矮小(また
は特殊)環境での付加的な実験が、本明細書に報告する株に関連した別のAOBの発
見に繋がることを期待する。

【００７３】タイプA AOB(SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2)のクローン・メンバーは、BF16
バイオマス(クローン・ライブラリー9%)およびBC5バイオマス(クローン・ライブ
ラリー1〜2%)の両方で見出された(図2)。BC5バイオマスを使用して低濃度アンモ
ニア反応容器(R1)に播種し、これをR7に播種するのに使用した。タイプA AOBク
ローン(SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2)(クローン・ライブラリー7%)のみを含有
するR7バイオマスからR7クローン・ライブラリーが得られた(図2)。故に、タイ
プA AOB細菌は淡水バイオファームからBC5タンクへ、次いでR1反応容器を経由し
てR7反応容器へ、上手く前培養された。このことは、細菌の良好な培養力と、こ
こに記載する配列を有するAOBの増殖可能な培養の維持能力とを実証している。
更に、この細菌の割合がBC5クローン・ライブラリーの1〜2%からR7ライブラリー
の7%に増加することから、タイプA AOBを選択的に富有する能力についても実証
される。

【００７４】表面上は、3つの系の操作(バイオファーム16、BC5タンクおよびR7反応容器)は
全く異なっている(表7参照)。しかし、これらの系には、タイプA AOBの存在を説
明する共通の物理化学的条件がある。バイオファームは最初高濃度のアンモニア
を供給されるが、ある期間でアンモニア濃度が低レベルに低下し(5mg/L NH₃-Nを
下回る)、従ってタイプA細菌は系に留まり、非常に低いアンモニア濃度(<5mg/L
NH₃-N)で増殖できる特殊な生理学的地位が開拓される。同様に、BC5タンクおよ
びR7反応容器では、いずれもアンモニアを5mg/L NH₃-N以下のレベルで供給維持
した。タイプA AOB細菌は5mg/L NH₃-Nを上回るアンモニア濃度で存在できるが、
高濃度のアンモニアでは、他のタイプのAOBによって競合排除されることが明ら
かであり(例えばタイプB(SEQ ID NO:3)および/またはタイプC(SEQ ID NO:4))、
反応容器中のこれらのタイプのAOBの存在およびタイプA AOBの不在は、アンモニ
ア濃度が高く維持されていることを示している(表9)(図2)。

【００７５】 R7バイオマスは、細菌添加試験VI(BA6)およびVII(BA7)おいて(以下に考察)特
に良好であり、同じ播種(R1)を用いた同一の形態の増殖バイオマス(R19)も細菌
添加試験VIII(BA8)(R19)で同様であった。タイプA AOBが、特異的タイプA AOB P
CRならびにFISH試験により、多数の反応容器および多数のPostBA試験バイオマス
の両方で見出された(表9)(図2)。

【００７６】従って、タイプA AOB(SEQ ID NO:1)およびタイプA1(SSEQ ID NO:2)の2種の新
規細菌が、水槽等の低アンモニア濃度環境で優勢であることが見出された;これ
を天然よりも精製された状態でこのような環境へ添加すると、このような環境中
でのアンモニア酸化の確立を促進できる(以下の考察)。

【００７７】 BCタンク(BC5)へ播種するために使用された淡水バイオファーム・バイオマス(
例えばクローン・ライブラリーのBF16〜34%)中で、タイプBのクローン・メンバ
ーが見出された。タイプB AOB細菌はBC5およびR7クローン・ライブラリーに存在
せず、このことは、これらのAOBが高アンモニア濃条件およびバイオファームの
供給法に適することを示している(図2)。タイプB AOBはまた、R3クローン・ライ
ブラリー(クローン・ライブラリーの19%)でも見出された(図2)。R3反応溶液の変
遷は、そのバイオマスを最初に高アンモニア濃度(3000mg/L NH₃-N)において高濃
度で存在させ、11ヶ月貯蔵し、その後、低アンモニア濃度(5mg/L NH₃-N)で反応
容器を長期間熟成させるものであった。最初の培養期間中、アンモニア濃度は期
間を通して低下するようであり-従って、タイプA AOBよりもタイプCおよび/また
はタイプB AOBの増殖がより助長された。11ヶ月の貯蔵の間にアンモニアが消費
されてタイプB AOB細菌の系中での維持および、培養期間中に生き延びた残留タ
イプA AOBの生存を後押しすることが可能になった。最後に、反応容器の成熟期
において、タイプB AOB細菌は維持され、タイプA AOBの濃度が高まり、最初の培
養期で最初に選択された残留タイプCは競合排除され消滅した。

【００７８】比較において、バイオファームのバイオマスに、設定期間中、比較的高濃度の
アンモニアを供給し、期間を通してアンモニアを徐々に消費し、高濃度から低濃
度へのアンモニア濃度の勾配を起こし(タイプB AOBの増殖を助長)、しばしばゼ
ロに達して、タイプA AOB-低アンモニア濃度の増殖ウィンドーをもたらす。これ
はR3バイオマスの培養期よりも速度の速いサイクル(日)であるが、バイオマス中
での高濃度から低濃度へのアンモニア濃度条件の変化と同様である。従って、バ
イオファーム・バイオマスでのアンモニア濃度の勾配は、各AOBタイプの富化範
囲を助長し、このことはクローン・ライブラリー・データおよびDGGE試験の結果
から裏付けられる。

【００７９】タイプB AOBが、多数の反応容器および多数のPostBA試験バイオマスの両方で
、特異的タイプB AOB PCR、DGGEおよびFISHにより見出された。しかし、細菌添
加後試験またはクローン・ライブラリーで、タイプA AOBほどは見られなかった(
表9)。タイプA AOBを試験に接種すると多くの場合に回復されるが、タイプB AOB
は、タイプA AOBが接種物に予め存在しない系でのみ回復したようであった。従
って、タイプA AOBは、それらが存在する系では優先的に増殖するが、タイプB A
OBはタイプA AOBが不在な場合に良好であった。

【００８０】タイプA AOBは、水槽等の低アンモニア環境における好ましいAOB硝化群集の重
要なメンバーであるが、それは、存在する唯一のAOBではない。他のAOB、例えば
タイプB(SEQ ID NO:3)は、系において、たとえ短期間(日)であっても効率的にア
ンモニアの濃度を変動させるのに必要である。

【００８１】タイプC AOBは、水槽で見られる典型的な低アンモニア濃度のための細菌添加
物中のAOBとしては所望のものではない。タイプC AOB細菌が低濃度アンモニウム
環境であるBF16、BC5またはR7クローン・ライブラリーで見られなかったことは
、タイプC AOB細菌が上記3種類の環境における条件とは異なる条件下に増殖する
ことを示している(図2)。タイプC細菌は、R5、R3およびR17クローン・ライブラ
リーで見出された(図2)。R5バイオマスは高濃度(30mg/L NH₃-N)でむらなく増殖
し、その播種物は非常に高いアンモニア濃度に由来し(>500mg/L NH₃-N)、R3のバ
イオマスは低アンモニア濃度(5mg/L NH₃-N)に変化させる前に高アンモニア濃度
で最初に増殖させ、R17バイオマスは低濃度(5mg/L NH₃-N)から高アンモニア濃度
(30mg/L NH₃-N)へ変化させ更に元に戻したものである。

【００８２】 R5バイオマスは、R5反応容器へ移行される前も長期間、高アンモニア濃度で富
化され、アンモニア濃度がフィード・マイクロフィルター中で低レベルに決して
低下しないことから、タイプA AOB細菌の増殖は事実上、起こらない。バイオマ
スをR5へ移行する際、アンモニアの濃度が低アンモニア・レベルへ低下し、これ
によりタイプB細菌が富化できる。タイプC細菌は最初にマイクロフィルター中で
富化される細菌の代表であり、ついで比較的高いアンモニア濃度(30mg/L NH₃-N)
で供給を維持することにより、R5バイオマス中に残存した。

【００８３】 R3バイオマスは最初に高アンモニア濃度で増殖されるが、時間の経過と共にア
ンモニアが消費される。この方法ではまずタイプC AOB(高アンモニア濃度におい
て)およびタイプB AOB(アンモニアを使用する)の増殖が助長される。更にこれら
が圧迫して、常に低アンモニア・レベルに依存するタイプA AOBの富化を許さな
い。R3反応容器の低アンモニウム濃度での稼動中に、タイプC AOB細菌はこれに
対抗して富化し、タイプBもまだ生存しているが、タイプA AOB細菌は最初の富化
で当初から最小化されていたので、反応容器中の新しい条件を利用できるものは
ほんの僅かしか残存しない。従って、タイプB AOBがこの環境で優勢なAOBである
と考えられる。

【００８４】 R17バイオマスは、タイプAおよび/またはタイプB AOBを培養するのに必要でな
い内容を示す典型的なものである。R17バイオマスはR7バイオマスに由来するが
、3週間高アンモニア濃度(30mg/L NH₃-N)で培養し、細菌群集のシフトが起こる
かどうかを観察した。シフトは起き、タイプC AOBが優勢となり、このことはFIS
H、PCRおよびDGGE実験により実証された。更に、シフトは不可逆的であった。バ
イオマスを低アンモニア濃度(5mg/L NH₃-N)に再変化させた後、タイプC AOBはま
だ優勢なAOBであり、これに対してタイプAおよびタイプB AOBはFISHまたはDGGE
のいずれでも検出されなかった。このことは3週間の間にタイプA およびB AOBが
R17バイオマスから排除されることを示唆している。R17バイオマスが続くBAVIII
試験で好ましくない結果であったことは、タイプC AOBが、水槽の比較的低いア
ンモニア状況で使用されるべき効果的な細菌添加物に必要とされる、好適なAOB
タイプでないことを示唆している。この結果は更に、市販のNitrosomonas分岐AO
Bを含む細菌混合物が水槽中での硝化の確立を加速するには効果的でないことを
示す細菌添加試験の結果からも支持される(以下に議論)。

【００８５】タイプC 細菌は、ほぼ30mg/L NH₃-Nのアンモニア濃度を供給されている排水処
理施設中で見出された(R5に類似の)細菌と系統分類的に非常に密接に関連してい
る。

【００８６】ここに記載するPCRプライマーを、様々な環境でここに報告されているAOB株が
存在しているかしていないかを検出するために使用した。環境には、細菌添加物
試験前の混合物、細菌添加物試験後の水槽フィルター、および他の会社から製造
販売されている硝化細菌混合物が含まれる。更に、別のAOBの純培養物から抽出
したDNAを試験した。

【００８７】これらの実験の結果を表9に要約した。データは、PCRプライマー群がここに報
告した細菌に特異的であり、他の株ではなく、それぞれの株を検出できることを
示している。更に、公知のAOB純培養物をここに報告した任意のPCRプライマー・
セットで増幅した。このことは、ここで報告される細菌が公知AOBとは区別でき
ることを実証するものである。

【００８８】このデータはまた、近年市場に出回っている添加物が、好適な細菌を含有して
いないために、新規にセットアップされた水槽での硝化の確立を促進できないこ
とを示している(更に詳細には以下に述べる)。

【００８９】クローンおよび反応容器の変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)調査:ここに報告され
る4種の菌株の新規性は、DGGE試験の結果から更に実証される。図3は、各タイプ
A AOB(SEQ ID NO:1)、タイプA1 AOB(SEQ ID NO:2)、タイプB AOB(SEQ ID NO:3)
、およびタイプC AOB(SEQ ID NO:4)の一般的な真正細菌DGGEにおける、それぞれ
2クローンずつの結果を示すものである。本明細書で請求する各AOBタイプの細菌
配列は、ゲルの異なる部位で変性される。これは独特で、その他の各AOBタイプ
と既知のAOBを識別する別法である。その4種の細菌配列はいずれもNitorosomona
s europaea、Nitrosospira multiformisおよびNitrosomonas cryotoleransと一
緒に移動することはなかった(図3)。

【００９０】種々の反応容器から抽出されたバイオマスのDGGE分析は、PCRおよびFISH試験
の結果を確証するものである。

【００９１】細菌添加試験:一連の実験を行って、ここに記載の細菌株を含有する種々の細
菌混合物の効果を、1)混合物を供給されないコントロール水槽、2)熱帯魚水槽用
に他の会社が製造している細菌混合物を接種した水槽、および3)ここに記載の菌
株を保持または貯蔵した細菌混合物と比較した。

【００９２】ここに記載のアンモニア酸化菌株が水槽のアンモニアを酸化すること、および
更に、他の菌株、例えば亜硝酸酸化菌株と組み合わせると水槽での硝化の確立が
加速されることが分かり、これにより混合物の効果が実証される。硝化の確立は
少なくとも3種の方法で測定できる。第1の方法は、新しい水槽をセットアップし
てから、水槽水のアンモニアおよび亜硝酸塩濃度が0mg/l濃度に到達するまでに
かかる日数を計数するものである。新規にセットアップした淡水水槽において、
アンモニア濃度が0mg/lになるには約14日かかり、亜硝酸塩が0mg/lになるには約
30〜35日かかる。水槽へ添加した硝化菌株の有益な作用を測定する第2の方法は
、0mg/まで濃度が低下する前に到達するアンモニアまたは亜硝酸塩の最大濃度を
比較するものである。硝化細菌を添加した水槽で達するアンモニアまたは亜硝酸
塩の最大濃度がコントロール水槽で達する最大濃度よりもかなり低い場合、次に
効果の度合いを検証する。そこに組み込まれる硝化菌株および混合物の効果を評
価する第3の方法は、先の2つの方法を組み合わせて毒性曝露曲線を形成するもの
である。この種の曲線は、暴露の期間(日)と暴露の度合いまたは強度の両方を考
慮している。この曲線は、時間に対して毒素濃度をプロットして囲まれた面積を
算出することにより定量するものである。曲線面積を各処理および毒素で定量し
た。次いで、ひとつの試験処理を相互に、および同一試験のコントロールと比較
する。コントロールの表面積を任意値1とし、他の表面積をコントロールに対す
る割合として算出した。この方法では、処理で算出された値が1を上回る場合は
コントロールよりも効果的であり、逆に1を下回る場合は処理がコントロールよ
りも効果的でないことを意味し、硝化の確立を阻害していると考えられる。

【００９３】ここで報告した実験は、ここに記載の菌株および菌株を組み込んだ製品の効果
および実用性を実証するために行った種々の実験の代表例である。

【００９４】細菌添加試験VI:この試験の目的は、ここに記載の菌株を含む4種の細菌混合物
が、淡水水槽中の硝化確立を促進できるかを評価するものであり、どのような細
菌接種も行わないコントロール水槽の能力と比較する。

【００９５】材料および方法:27個の10-ガロン水槽および27個のPenguin 170B(Marineland
Aquarium Products)ハングオンザバック形式のパワー・フィルターを滅菌し、し
っかりと洗浄し、空気乾燥させた。次に洗浄した水槽用砂利(RMC Lonestar#3)10
lbsを水槽へ充填し、フィルターを取り付けた。水槽に活性炭を通して濾過した
水道水35lを導入した。フィルターを取り付けた後に各水槽の水位を印付け、蒸
発およびサンプル取りで失われる水を考慮して脱イオン水(DI)で全ての水槽を満
たしておくことができた。細菌添加物および魚類を添加する前にフィルターを一
晩稼動させた。

【００９６】試験0日目に、水槽をDI水で満タンにし、ベースラインの水のサンプルを分析
用に採取した。カーボン・カートリッジ(Marineland Aquarium Products, Part
No. PA 0133)を水道水で洗浄し、各フィルターに設置した。新しいBio Wheel(登
録商標)(Marineland Aquarium Products, Part NO. PR 1935B)を各フィルターに
設置した。30分後、各タンクに、それぞれ計画した細菌添加物を接種し、または
コントロール水槽の場合は細菌混合物を導入しない。

【００９７】実験用細菌添加物を添加30分後、2セット目の水のサンプルを分析用に採取し
た。次いで、5匹のロージーバルブ(Puntius conchoniun)および1匹のジャイアン
トダニオ(Danio aequipinnatus)を各タンクへ添加した。魚には、日に2回に分け
て、約0.4gの熱帯魚フレークスピリットを与えた(約9:00a.m.および4:30pp.m.)
。

【００９８】水サンプルを回収し、日毎に、pH、アンモニア、亜硝酸塩および伝導度を試験
して分析した。月曜日、水曜日、および金曜日に水を亜硝酸塩および濁度につい
て試験した。陰イオンおよび陽イオンを周期的に測定した。pHの測定を、Denver
Instruments pH組み合わせ電極を装備したDenver Instruments Model 225 pH/
イオンメーターを用いて行った。Tecator FIAstar 5010Analyzerを用い、Tecato
r Application Notesに記載の方法により、アンモニア、亜硝酸塩、および硝酸
塩(窒素)を測定した。陽イオン(ナトリウム、アンモニウム-窒素、カリウム、マ
グネシウム、およびカルシウム)を、CS15 4-mm Analytical Columnを備えたDion
ex DX500 Systemを用いて分析した。YSIModel30の手持ち形検塩計、伝導計、お
よび温度系を用いて、毎日、12:30頃に各タンクで直接、特異伝導度を測定した
。濁度データは、DRT-100濁度メーター(HF Scientific)で測定された。

【００９９】この試験では4種の細菌混合物を使用した。各処理において2種類の処理レベル
が存在する:それぞれ水槽あたり混合物30mlまたは100ml。それぞれの混合/用量
の組み合わせを有する3個の同様の水槽、更に細菌混合物を導入しない3個のコン
トロール水槽が存在するので、試験水槽は全部で27個であった((4×2×3)+3=27)
。細菌混合物とその条件は以下の通りであった: 1)BC5-試験前に553日培養した細菌混合物。この混合物の正の結果は、培養条件
下での細菌の長期生存性および培養技術の適正性を証明した; 2)Rtr3-これは試験前に118日暗闇で瓶詰めして貯蔵した細菌混合物である。この
混合物の正の結果は、貯蔵法の有効性および混合物がその生存を少なくとも貯蔵
下に119日保持されることを証明した; 3)Rtr4-これは試験前に118日暗闇で瓶詰めして貯蔵した細菌混合物である。この
混合物の正の結果は、貯蔵法の有効性および混合物がその生存を少なくとも貯蔵
下に119日保持されることを証明した; 4)Rtr7-これはBC5からの接種物を増殖させた細菌混合物である。この混合物の正
の結果は、連続世代の混合物中で細菌集合体を培養でき、その生存が維持される
ことを証明した。

【０１００】結果および議論:この試験は23日間実施した。このとき、全ての水槽で、アン
モニアおよび亜硝酸塩濃度は実質的に0mg/Lであった。しかし、全ての細菌混合
物とコントロール水槽で、a)アンモニアおよび亜硝酸塩の最大濃度の平均および
b)0mg/L濃度に到達するまでの時間(日)には大きな相違があった。更に、細菌混
合物間で、幾つかの僅かな相違が見られた(図10)。

【０１０１】表9.ここに記載するアンモニア酸化菌株の種々のサンプル中での検出。

【表９】

【０１０２】表10.細菌添加試験VIで使用した混合物のアンモニアまたは亜硝酸塩濃度が0.5
0mg/L-N以下に到達するまでの時間ならびに試験中に到達するアンモニアおよび
亜硝酸塩の最大濃度の平均(N=3)

【表１０】

【０１０３】図4は、4種混合物とコントロールとの試験期間を通してのアンモニアおよび亜
硝酸塩濃度の平均である。BC5混合物において、アンモニアは、BC5混合物を100m
l供給した水槽で8日目に、およびBC5混合物を30ml供給した水槽で10日目に0mg/l
に到達した。コントロール水槽のアンモニア濃度は12日まで0mg/lに達しなかっ
た。更に重要なのは、コントロール水槽で到達する最大平均アンモニア濃度が4.
9mg/L NH₃-Nを示したことである。しかし、BC5細菌混合物30mlを供給した水槽で
は、平均最大アンモニア濃度は4.1mg/l NH₃-Nであって、BC5細菌混合物100mlを
供給した水槽では平均最大アンモニア濃度が2.4mg/l NH₃-Nであた。従って、BC5
細菌混合物の新規セットアップ水槽への添加は、魚類へのアンモニアの暴露を低
下させる結果となった。

【０１０４】 BC5混合物を30mlまたは100ml供給した水槽のアンモニア曝露面積曲線値は、コ
ントロール水槽曲線面積値のそれぞれ67%および37%であった(表11)。これらの値
は、コントロール水槽と比較して処理水槽での魚類に対するアンモニアの曝露が
、混合物の添加により、それぞれ1.5および2.7分の1に低下したことを示してい
る。

【０１０５】表11.細菌添加VI試験の毒性曝露データ

【表１１】

【０１０６】 BC5細菌混合物を供給した水槽の亜硝酸塩濃度の点で、BC5混合物100mlを供給
した水槽は18日までに0mg/lの亜硝酸塩濃度に到達し、BC5混合物30mlを供給した
水槽は21日までに0mg/lNO₂-Nに到達した。コントロール水槽では23日に0mg/lに
達した。より重要であるのは、最大亜硝酸塩濃度の結果であった。コントロール
水槽は13.4mg/L NO₂-Nの平均最大亜硝酸塩コントロールに達した。BC5混合物を3
0ml供給した水槽は最大平均亜硝酸塩濃度が8.9mg/l NO₂-Nであり、BC5混合物を1
00ml供給した水槽は僅か4.5mg/l NO₂-Nの最大亜硝酸塩濃度を示した(表10;図4)
。

【０１０７】 BC5混合物を30mlまたは100ml供給した水槽の亜硝酸塩曝露面積曲線値は、コン
トロール水槽曲線面積値の、それぞれ、75%および33%であった(表11)。これらの
値は、コントロール水槽と比較して処理水槽での魚類に対する亜硝酸塩の曝露が
、混合物の添加により、それぞれ1.3および3.1分の1に低下したことを示してい
る。

【０１０８】 118日間貯蔵した細菌混合物Rtr3は、コントロール水槽と比較して、硝化が確
立される時間をかなり早めることを実証した。Rtr3混合物を30または100ml供給
した水槽の平均最大アンモニア濃度は、それぞれ、3.1 NH₃-Nおよび1.9mg/l NH₃ -Nであった(表10)。これは、4.9mg/l NH₃-Nの平均最大アンモニア濃度を有する
コントロール水槽と異なる。コントロール水槽では0mg/lのアンモニア濃度に達
するのに12日を要するが、Rtr3細菌混合物を30mまたは100ml供給した水槽では0m
g/l NH₃-Nに達するのにそれぞれ、僅か9日および7日しか要さない(表10)。

【０１０９】コントロール水槽では、亜硝酸塩濃度が13.4mg/l NO₂-Nの平均最大濃度に達す
るのに対して、Rtr3細菌混合物を30または100ml供給した水槽では、平均最大亜
硝酸塩濃度はそれぞれ、僅か5.9 NO₂-Nおよび3.4mg/l NO₂-Nであった。コントロ
ール水槽は23日で0mg/lの亜硝酸塩濃度に達するのに対して、Rtr3細菌混合物を3
0または100ml供給した水槽では、それぞれ僅か15日および11日で、0mg/l NO₂-N
に到達した(表10)。

【０１１０】 Rtr3混合物を30または100ml供給した水槽のアンモニア曝露面積曲線値は、コ
ントロール水槽曲線面積値に対して、それぞれ45%および26%であった(表11)。こ
れらの値は、コントロール水槽と比較して処理水槽での魚類に対するアンモニア
の曝露が、混合物の添加により、それぞれ2.2および3.9分の1に低下したことを
示している。

【０１１１】 Rtr3混合物を30または100ml供給した水槽の亜硝酸塩曝露面積曲線値は、コン
トロール水槽の曲線面積値の、それぞれ、28%および11%であった(表11)。これら
の値は、コントロール水槽と比較して処理水槽での魚類に対する亜硝酸塩の曝露
が、混合物の添加により、それぞれ3.6および8.8分の1に低下したことを示して
いる。

【０１１２】 Rtr4混合物を供給した水槽では、30および100mlの供給容積で、それぞれ、平
均最大アンモニア濃度は2.9 NH₃-Nおよび2.7mg/L NH₃-Nであった。コントロール
水槽は、4.9mg/l NH₃-Nの平均最大アンモニア濃度に達した。Rtr4混合物を30ま
たは100ml供給した水槽のアンモニア曝露面積曲線値は、コントロール水槽の曲
線面積値のそれぞれ45%および38%であった。これらの値は、コントロール水槽と
比較して処理水槽での魚類に対するアンモニアの曝露が、混合物の添加により、
それぞれ2.2および2.7分の1に低下したことを示している(表11)。Rtr4混合物を3
0ml供給した水槽は、10日で硝化サイクルを完了した。Rtr4を100ml供給した水槽
では8日で硝化が確立した(表10)。これらの時間を、コントロール水槽の硝化の
確立にかかる23日という時間と比較する。

【０１１３】 Rtr4細菌混合物を30または100ml供給した水槽では、平均最大亜硝酸塩濃度は
、それぞれ2.1 NO₂-Nおよび0.6mg/l NO₂-Nであった。コントロール水槽は13.4mg
/l NO₂-Nの平均最大亜硝酸塩濃度を有した。

【０１１４】 Rtr4混合物を30または100mlを供給した水槽での亜硝酸塩曝露面積曲線値は、
コントロール水槽の曲線面積値の、それぞれ5%および2%であった。これらの値は
、コントロール水槽と比較して処理水槽での魚類に対する亜硝酸塩の曝露が、混
合物の添加により、それぞれ20.2および60.9分の1に低下したことを示している(
図4;表11)。

【０１１５】 BC5混合物から継代培養した細菌混合物Rtr7は、コントロール水槽と比較して
硝化確立の時間をかなり早めることを実証した。コントロール水槽では0mg/l NH₃ -Nのアンモニア濃度に達するのに12日を要するが、Rtr7細菌混合物30または100
mlを供給した水槽では、0mg/l NH₃-Nに達するのに、それぞれ僅か7日および6日
しか要しない(表10)。R7混合物を30または100ml供給した水槽の平均最大アンモ
ニア濃度は、それぞれ1.9 NH₃-Nおよび1.1mg/l NH₃-Nであった。これは、4.9mg/
l NH₃-Nの平均最大アンモニア濃度を有するコントロール水槽とは異なる(表10)
。

【０１１６】亜硝酸塩濃度は、コントロール水槽で、13.4mg/l NH₃-Nの平均最大濃度に達し
、これに対して、Rtr7細菌混合物を30または100ml供給した水槽では、平均最大
亜硝酸塩濃度は、それぞれ僅か3.7 NO₂-Nおよび1.4mg/l NO₂-Nであった(表10)。
コントロール水槽は23日で0mg/l NO₂-N亜硝酸塩濃度に到達したが、Rtr7細菌混
合物を30または100ml供給した水槽では、それぞれ僅か10日および7日で0mg/l NO₂ -Nに到達した(表10;図4)。

【０１１７】 Rtr7混合物を30または100ml供給した水槽のアンモニア曝露面積曲線値は、コ
ントロール水槽曲線面積値の、それぞれ28%および17%であった(表11)。これらの
値は、コントロール水槽と比較して処理水槽での魚類に対するアンモニアの曝露
が、混合物の添加により、それぞれ3.6および5.7分の1に低下したことを示して
いる。

【０１１８】 Rtr7混合物を30または100ml供給した水槽の亜硝酸塩曝露曲線値は、コントロ
ール水槽曲線面積値の、それぞれ10%および4%であった。これらの値は、コント
ロール水槽と比較して処理水槽での魚類に対する亜硝酸塩の曝露が、混合物の添
加により、それぞれ5.7および25.5分の1に低下したことを示している(表11)。

【０１１９】要約すると、試験のデータは、ここに記載の菌株を含む種々の菌株が、水槽の
硝化の確立を加速する効果を有することを明らかにした。ここに記載の菌株を組
み込んだ混合物の水槽での使用は、接種水槽の魚類に対するアンモニアおよび亜
硝酸塩の曝露の度合いを、コントロール水槽の魚類に対するよりも大きく低下さ
せた。特に、結果は、非常に長い時間にわたって混合物が生存維持され得ること
(例えばBC5)、混合物が数ヶ月貯蔵可能であること(例えばRtr3およびRtr4)、な
らびに混合物の継代培養物が硝化能を保持していること(例えばRtr7)を実証した
。

【０１２０】細菌添加試験VII:この試験の目的は、「実在世界」の設定で使用される状態で
、ここに記載の菌株の2種混合物を同時に評価し、近年に水槽産業の他の会社が
市販している細菌混合物の特性と比較することである。

【０１２１】一般的に、新しい水槽の持ち主は最初に水生生物を維持できる水槽を据え付け
るのに必要な全ての装具を購入する。装具には、水槽、装飾、ヒーターおよびフ
ィルター、ならびに水質調節剤が含まれる。水槽を次に据え付け、水で満たし、
フィルターの稼動を開始し、ヒーターを適当な水温に調節し、水質調節剤を添加
して塩素を除く。この時点で魚を通常加えるが、水槽のアンモニアおよび亜硝酸
塩濃度を安全濃度に保つ(0.5mg/l-N)アンモニア-および亜硝酸塩酸化細菌の群が
不十分である。従って、新規に据え付ける水槽は「ニュー・タンク・シンドロー
ム」(New tank syndrome)と称される事態を経験することとなる。ニュー・タン
ク・シンドロームは、アンモニアおよび亜硝酸塩の濃度を安全レベルに維持する
細菌の数が十分でない場合に、据え付けた新しい水槽の最初の数週間で生じるア
ンモニアおよび亜硝酸塩の測定濃度である。

【０１２２】従って、多くの場合、新しい水槽の持ち主は、ラベルにニュー・タンク・シン
ドロームを促進する、または時には無くすと記載された、瓶詰めの微生物混合物
または酵素混合物(細菌混合物)を購入する。これは、瓶詰め混合物を使用すると
、混合物を使用しない場合よりも、最初の数週間のアンモニアおよび亜硝酸塩濃
度が大きく低下することを意味している。更に、水槽中のアンモニアおよび亜硝
酸塩濃度が0mg/lに達するまでの時間の長さを、細菌混合物を使用して短縮すべ
きである。

【０１２３】材料および方法:33個の10ガロン水槽および33個のPenguin170B(Marineland Aq
uarium Products)ハングオンザバック形式のパワー・フィルターを滅菌し、しっ
かりと洗浄し、空気乾燥させた。次に洗浄した水槽用砂利(RMC Lonestar#3)10lb
sを各水槽へ充填し、フィルターを裏側に取り付けた。次に、水槽に活性炭を通
して濾過した水道水35Lを導入し、各水槽の水位を印付けた。この印は、水槽水
に蒸発およびサンプル採りで失われる水を補って満タンにする必要がある際、指
針として利用される。水槽を満タンにするのに脱イオン水を使用した。細菌添加
物および魚類を添加する前にフィルターを一晩稼動させた。

【０１２４】試験初日に、水およびベースライン水サンプルを考慮して水槽を脱イオン水で
満タンにした。カーボン・カートリッジ(Marineland Aquarium Products, Part
No. PA 0133)を水道水で洗浄し、各フィルターに設置した。新しいBio Wheel(登
録商標)(Marineland Aquarium Products, Part NO. PR 1935B)を各フィルターに
設置した。30分後、各タンクに、それぞれ計画した細菌添加物を接種した。接種
量は表12に記載した。細菌添加物の添加30分後に、2セット目のサンプルを分析
用に採取した。次いで、6匹の雑多なバルブ[(Puntius conchoniun)ロージーバル
ブ;(Puntiun tetrazona)アルビノタイガーバルブおよびタイガーバルブ]を各タ
ンクへ添加した。水槽中の魚には、日に2回(約9:00a.m.および4:30pp.m.)、1日
あたり全部で約0.4gの熱帯魚フレークスピリットを与えた。

【０１２５】水サンプルを回収し、日毎に、pH、アンモニア、亜硝酸塩および伝導度を試験
して分析した。月曜日、水曜日、および金曜日に水を亜硝酸塩および濁度につい
て試験した。陰イオンおよび陽イオンを周期的に測定した。pHの測定を、Denver
Instruments pH組み合わせ電極を装備したDenver Instruments Model 225 pH/I
onメーターを用いて行った。Tecator FIAstar 5010Analyzerを用い、Tecator Ap
plication Notesに記載の方法により、アンモニア、亜硝酸塩、および硝酸塩(窒
素)を測定した。陽イオン(ナトリウム、アンモニウム-窒素、カリウム、マグネ
シウム、およびカルシウム)を、CS15 4-mm Analytical Columnを備えたDionex D
X500 Systemを用いて分析した。YSIModel30の手持ち形検塩計、伝導計、および
温度系を用いて、毎日、12:30頃に各タンクで直接、特異伝導度を測定した。濁
度データは、DRT-100濁度メーター(HF Scientific)で測定された。

【０１２６】この際、ここに報告される菌株を含む2種の配合物を、購買入手可能な4種の細
菌混合物と共に試験した。試験初日、第1配合物(Rtr5と称する)100mlを4個の水
槽にそれぞれ添加し、第2配合物(Rtr7と称する)100mlを別の4個の水槽に添加し
た。

【０１２７】 Biozyme(登録商標),Cycle(登録商標),Tritz-ZymeNo.7(登録商標)およびStress
Zyme(登録商標)の処理のために、購買入手可能な細菌混合物を製造仕様書に従
って供給した。更に、前記の購買入手可能な各細菌混合物を推奨される供給レベ
ルで3回試験した(表12)。各処理/用量の組み合わせで4個の同様の水槽が存在す
るので、全部で水槽は33個であった((((4×3)×2)+(2×3)+3=33)。

【０１２８】結果および考察:細菌添加試験VIIの処理物およびコントロールのアンモニアお
よび亜硝酸塩傾向は図5に記載される。表出を明確にするために、試験した各購
買入手可能な細菌混合物はコントロールおよびここに記載の菌株を含む2種類の
試験混合物と共に記載される。各プロットの尺度は同一であるので、全ての処理
物を容易に比較できる。データは、ここに記載される菌株を含むRtr5およびRtr7
混合物が、新しくセットアップされる水槽において、処理されていない(コント
ロールの)水槽または購買入手可能な細菌混合物を供給した水槽よりも、硝化を
確立するまでの時間を著しく短縮することを示している。更に、Rtr5およびRtr7
混合物のいずれを供給した水槽でも、最大アンモニアおよび亜硝酸塩濃度は、別
の全ての処理物よりも著しく低下した(図5;表13)。

【０１２９】表13.細菌添加試験VIIで使用した混合物の0.50mg/L-N以下のアンモニアまたは
亜硝酸塩濃度に達するまでの時間ならびに試験中に到達する平均最大アンモニア
および亜硝酸塩濃度

【表１３】

【０１３０】結果は、Rtr5およびRtr7混合物が、新しくセットアップされた水槽で、購買入
手可能な混合物および混合物を供給しない水槽よりも、非常に早く硝化を確立で
きることを示している。Rtr7混合物では8日、Rtr5混合物では10日で、完全に硝
化が確立された(表13)。これらに最も近い処理物は、通常供給レベルのFritz Zy
me(登録商標)、通常の3倍の供給レベルのCycle(登録商標)、および通常供給レベ
ルのStress Zyme(登録商標)であり、いずれも22日を要した(表13)。Rtr5およびR
tr7混合物はこれらの他の混合物よりも2.2〜2.8倍早く硝化を確立した。

【０１３１】種々の混合物およびコントロールで達成される最大アンモニアまたは亜硝酸塩
濃度の違いも非常に大きかった(表13)。Rtr5混合物では試験中に1.5mg/L NH₃-N
の平均(N=3)最大アンモニア濃度に達し、これは最も近い購買入手可能な混合物
である通常レベルのFritz Enzyme(登録商標)の4.8分の1であった(平均7.2mg/L N
H₃-N、N=3)(表13)。Rtr5混合物の平均最大亜硝酸塩濃度は0.9mg/L NO₂-Nであっ
た。再び、通常レベルのFritz-Zyme(登録商標)が最も近い購買入手可能な混合物
であり、平均最大亜硝酸塩濃度は3.1mg/L NO₂-Nであった。従って、Rtr5混合物
は、試験した現在の購買入手可能な混合物よりも、硝化の確立に3.4倍効果的で
あった。Rtr7混合物はRtr5混合物と同様の傾向を示し、この混合物を供給した水
槽では、最大アンモニア-窒素および亜硝酸塩-窒素濃度が、購買入手可能な細菌
混合物を供給した水槽よりもかなり低かった(表13)。Rtr7混合物はそれぞれ2.8
および1.3mg/Lの平均最大アンモニアおよび硝酸塩濃度を有した。これらは、そ
れぞれ、購買入手可能な細菌混合物(通常推奨レベルで供給したFritz-Zyme(登録
商標))の2.6および2.4分の1であった(図5;表13)。

【０１３２】曝露曲線に関して、ここに記載された菌株を組み込まれた細菌混合物Rtr5およ
びRtr7は、試験した購買入手可能な混合物よりも非常に優れていた(表14)。Rtr7
は、試験した全ての混合物の中で最も優秀で、魚類はコントロールと比較してア
ンモニアでは13%および亜硝酸塩では5%で曝露されただけであった。Rtr5もまず
まず良好であり、アンモニア曝露はコントロールの14%であり、亜硝酸塩曝露は
コントロールの9%であった(表14)。これらの結果は、Rtr7またはRtr5のいずれか
を供給された水槽の魚類が、コントロール水槽の魚類の、7.3および7.6分の1の
アンモニアならびに11.6および19.6分の1の亜硝酸塩に曝露されたことを意味し
ている。次に良好な混合物は、アンモニアおよび亜硝酸塩の曝露をコントロール
の50%までに低下させたに過ぎない(表14)。

【０１３３】表14.細菌添加VII試験での毒性曝露データ

【表１４】

【図面の簡単な説明】

【図１】 16S rDNA配列の比較分析から推測される3種の細菌株および1つの
亜株の系統的関係を示す図である。この系統樹は、最低1430ヌクレオチドを含む
配列の近隣距離分析(neighborjoining distance analysis)をベースとする。

【図２】本明細書に記載の選択した培養物およびアンモニア酸化細菌から
得られたバイオマスの変性勾配ゲル電気泳動(DGGE)を示す図である。

【図３】本明細書に記載する細菌株の特殊性を実証する変性勾配ゲル電気
泳動(DGGE)を示す図である。アンモニア酸化細菌の3種の純培養物から得た抽出
物と共に、本明細書に記載する各細菌種を2レーンずつ示す。

【図４Ａ】細菌添加VI試験のアンモニアおよび亜硝酸塩の平均的傾向を示
す図である。

【図４Ｂ】細菌添加VI試験のアンモニアおよび亜硝酸塩の平均的傾向を示
す図である。

【図４Ｃ】細菌添加VI試験のアンモニアおよび亜硝酸塩の平均的傾向を示
す図である。

【図４Ｄ】細菌添加VI試験のアンモニアおよび亜硝酸塩の平均的傾向を示
す図である。

【図５Ａ】細菌添加VII試験のアンモニアおよび亜硝酸塩傾の平均的傾向
を示す図である。

【図５Ｂ】細菌添加VII試験のアンモニアおよび亜硝酸塩傾の平均的傾向
を示す図である。

【図５Ｃ】細菌添加VII試験のアンモニアおよび亜硝酸塩傾の平均的傾向
を示す図である。

【図５Ｄ】細菌添加VII試験のアンモニアおよび亜硝酸塩傾の平均的傾向
を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０２Ｆ 3/34 １０１Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｆ４Ｄ０４０Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＭＧ０１Ｎ 33/53 33/566 33/566 33/58 Ａ 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2B104 EF01 2G045 AA35 BB05 BB20 CB21 DA13 DB06 FB02 FB05 4B024 AA10 AA11 AA17 CA02 CA09 GA27 HA14 4B063 QA01 QA05 QA13 QQ42 QQ52 QR32 QR55 QS25 QS34 QS36 QX02 4B065 AA01X AC08 BA25 CA16 CA54 CA60 4D040 BB02 BB13 BB42 BB91 DD00 DD03 DD14 DD31

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アンモニアを亜硝酸塩に酸化する単離菌株において、前記株
がSEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、およびSEQ ID No:4から成る群より
選択される配列と少なくとも96%類似した核酸配列を有することを特徴とする単
離菌株。
【請求項２】前記核酸配列が、SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3
、またはSEQ ID No:4と同一であることを特徴とする、請求項1に記載の菌株。
【請求項３】アンモニアを亜硝酸塩に酸化する菌株の生物学的に純粋な培
養物において、菌株の16SrDNAがSEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、また
はSEQ ID No:4で表される配列を示す核酸を有することを特徴とする培養物。
【請求項４】アンモニアを硝酸塩に酸化する単離菌株を含有する組成物に
おいて、前記菌株がSEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、またはSEQ ID No
:4で表される核酸配列を有することを特徴とする組成物。
【請求項５】凍結形態であることを特徴とする請求項4に記載の組成物。
【請求項６】凍結乾燥形態であることを特徴とする請求項4に記載の組成
物。
【請求項７】粉末形態であることを特徴とする請求項4に記載の組成物。
【請求項８】アンモニアを亜硝酸塩に酸化する濃縮菌株を含有する組成物
において、菌株の16SrDNAがSEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、およびSE
Q ID No:4から成る群より選択される配列と少なくとも96%類似した核酸配列を有
することを特徴とする組成物。
【請求項９】前記菌株がSEQ ID NO:1と少なくとも96%類似した16srDNA配
列を有することを特徴とする請求項8に記載の組成物。
【請求項１０】前記菌株がSEQ ID NO:2と少なくとも96%類似した16srDNA
配列を有することを特徴とする請求項8に記載の組成物。
【請求項１１】前記菌株がSEQ ID NO:3と少なくとも96%類似した16srDNA
配列を有することを特徴とする請求項8に記載の組成物。
【請求項１２】前記菌株がSEQ ID NO:4と少なくとも96%類似した16srDNA
配列を有することを特徴とする請求項8に記載の組成物。
【請求項１３】付加的に亜硝酸塩酸化微生物を無機塩溶液中に含有するこ
とを特徴とする請求項8に記載の組成物。
【請求項１４】付加的に硝酸塩還元微生物を無機塩溶液中に含有すること
を特徴とする、請求項8に記載の組成物。
【請求項１５】付加的に従属栄養微生物を、無機塩と有機物をベースとす
る溶液中に含有することを特徴とする請求項8に記載の組成物。
【請求項１６】付加的に亜硝酸塩酸化微生物および硝酸塩還元微生物を含
有することを特徴とする請求項8に記載の組成物。
【請求項１７】 SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、またはSEQ ID
No:4で表される配列または少なくとも96%類似したその変異体を有する単離ヌク
レオチド配列。
【請求項１８】アンモニアを亜硝酸塩に酸化できる十分量の菌株を媒体に
導入することにより、媒体へのアンモニアの集積を緩和するステップを含む、媒
体へのアンモニアの集積を緩和または防止する方法において、前記細菌がSEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、およびSEQ ID No:4から成る群のいずれかで
表されるヌクレオチド配列または少なくとも96%類似したその変異体を有するこ
とを特徴とする方法。
【請求項１９】アンモニアを、処理しなければ存在すると思われるレベル
より少なくとも30%減少させることを特徴とする請求項18に記載の方法。
【請求項２０】媒体が水槽であることを特徴とする請求項18に記載の方法
。
【請求項２１】水槽が淡水の水槽であることを特徴とする請求項20に記載
の方法。
【請求項２２】水槽が海水の水槽であることを特徴とする請求項20に記載
の方法。
【請求項２３】媒体が廃水を含むことを特徴とする請求項18に記載の方法
。
【請求項２４】接触回転板処理装置により菌株を媒体へ導入することを特
徴とする請求項18に記載の方法。
【請求項２５】バイオフィルターにより菌株を媒体へ導入することを特徴
とする、請求項18に記載の方法。
【請求項２６】 5'-CCC CCC TCT TCT GGA TAC3'(SEQ ID NO:5)および5'-TC
C CCC ACT CGA AGA TAC G3(SEQ ID NO:8)から成る群より選択されるオリゴヌク
レオチド・プローブ。
【請求項２７】 SEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3またはSEQ ID No
:4で表されるヌクレオチド配列を含む16SrDNAを有する、アンモニアを亜硝酸塩
に酸化できる細菌の、媒体中における量を検出および測定する方法において、以
下のステップ: (a)請求項26に記載の検出可能な標識プローブを供給し、 (b)媒体から全DNAを単離し、 (c)プローブが細菌の核酸にのみハイブリダイズする条件下で、単離した全DNAを
検出可能な標識プローブへ曝露し、ここで細菌の16SrDNAがSEQ ID No:1、SEQ ID
No:2、SEQ ID No:3、またはSEQ ID No:4のヌクレオチド配列を有し、 (d)細菌の量を検出および測定するためにハイブリダイズしたプローブを検出お
よび測定し、ここで細菌の16SrDNAがSEQ ID No:1、SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、
またはSEQ ID No:4のヌクレオチド配列を有する、を有することを特徴とする方法。
【請求項２８】媒体が水槽水であることを特徴とする、請求項27に記載の
方法。
【請求項２９】媒体が、水槽用の砂利、フィルター・スポンジ、フィルタ
ー・フロスおよびプラスチック・フィルター媒体から成る群より選択される材料
を含むことを特徴とする請求項27に記載の方法。
【請求項３０】全DNAを、水槽用の砂利、フィルター・スポンジ、フィル
ター・フロス、またはプラスチック・フィルター媒体から成る群より選択される
材料から単離することを特徴とする、請求項27に記載の方法。