JP2003528816A

JP2003528816A - ヒトおよび動物の病原体のゲノム由来の構築物に基づいたｄｎａワクチン

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Publication number: JP2003528816A
Application number: JP2001534425A
Authority: JP
Inventors: ウィリアムエフ．スウェイン，; リーケイ．ロバーツ，; レンドンジー．パイン，; ラルフピー．ブラウン，
Original assignee: パウダージェクトヴァクシンズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1999-11-03
Filing date: 2000-11-02
Publication date: 2003-09-30
Also published as: EP1225920A1; CN1409641A; CA2389693A1; IL149413A0; AU785066B2; NZ538837A; WO2001032221A1; AU1359101A

Abstract

(57)【要約】１以上の大きなゲノムＤＮＡフラグメントを投与することによって、被験体に免疫応答を惹起する方法が提供される。抗原性ポリペプチドをコードする配列を同定する方法も提供される。また、１以上の大きなゲノムＤＮＡフラグメントを含むワクチン組成物も提供される。本発明は、遺伝的構築物の使用を提供し、この構築物は、この構築物を脊椎動物被験体に投与することによって被験体に免疫応答を惹起するための医薬の製造において、病原体由来の少なくとも５ｋｂのサイズのゲノムＤＮＡフラグメントを保有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、一般的にワクチン組成物およびその使用方法に関する。より詳細に
は、本発明は、１以上の巨大ゲノムＤＮＡフラグメントを被験体に投与すること
によって被験体における免疫応答を惹起することに関する。

【０００２】（背景）細胞媒介免疫応答を誘導するワクチンは、寄生虫、自己免疫障害、アレルギー
疾患および癌と戦う重要なストラテジーとして現される。一般的に、従来のワク
チンストラテジーは、「生（ｌｉｖｅ）」または「死（ｄｅａｄ）」ワクチンの
いずれかの投与を含む。Ｅｒｔｌら（１９９６）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６
：３５７９〜３５８２。いわゆる生ワクチンは、弱毒化微生物および生きている
ベクターに基いた組換え分子を含む。死ワクチン（ｄｅａｄｖａｃｃｉｎｅ）
は、死滅病原体の全部、およびサブユニットワクチン（例えば、可溶性病原体サ
ブユニットまたはタンパク質サブユニット）に基くワクチンを含む。一般的に、
生ワクチンは、免疫化された被験体に効果のある免疫応答を提供することにおい
て成功を収めている：しかし、このようなワクチンは、免疫無防備状態もしくは
妊娠中の被験体には危険であり得、病原生物に復帰し得、または他の病原体で汚
染され得る。Ｈａｓｓｅｔｔら（１９９６）、ＴｒｅｎｄｓｉｎＭｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．８：３０７〜３１２。死ワクチンは、生ワクチンに関する安全性面で
の問題を回避する；しかし、このようなワクチンは、しばしば免疫化された被験
体に適切および／または有効な免疫応答を提供することに失敗する。

【０００３】より最近、針および注射器を用いる筋肉内（Ｗｏｌｆｆら（１９９０）、Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ２４７：１４６５：１４６８）または皮下注射（Ｒａｚら（１９９
４）、ＰＮＡＳＵＳＡ９１：９５１９〜９５２３）によるプラスミドＤＮＡ
の直接注射が記載される。弾道的（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）ＤＮＡ送達または粒子
媒介ＤＮＡ送達といわれる別のアプローチは、ＤＮＡでコーティングした微視的
な金のビーズを表皮細胞に直接投与するための針のない粒子送達デバイスを使用
する（Ｙａｎｇら（１９９０）ＰＮＡＳＵＳＡ８７：９５６８〜９５７２）
。従って、多くの送達技術（核酸でコーティングしたミクロ粒子を標的組織に送
達する粒子媒介技術を含む）を使用して、免疫化のための核酸を送達し得る（例
えば、１９９９年２月２日に発行された、共有に係る米国特許第５，８６５，７
９６号を参照のこと）。粒子媒介核酸免疫化技術は、ナノグラムのＤＮＡ量の皮
下送達後に体液性および細胞傷害性の両方のＴリンパ球免疫応答を惹起すること
を示されてきた。Ｐｅｒｔｍｅｒら（１９９５）、Ｖａｃｃｉｎｅ１３：１４
２７〜１４３０。このような粒子媒介送達技術は、他の型の核酸接種と比較され
、顕著に優れていることが見出されている（Ｆｙｎａｎら（１９９５）、Ｉｎｔ
．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ１７：７９〜８３、Ｆｙｎａｎ
ら（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１１
４７８〜１１４８２、およびＲａｚら（１９９４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：９５１９〜９５２３）。

【０００４】制御された投薬量の、無傷の皮膚へ、および皮膚を介して、固形薬物含有粒子
を送達するための針のない注射の使用を伴う、新規な経皮的薬物送達系が、記載
されている。特に、Ｂｅｌｌｈｏｕｓｅらに与えられた共有に係る米国特許第５
，６３０，７９６号は、超音速ガス流（ｓｕｐｅｒｓｏｎｉｃｇａｓｆｌｏ
ｗ）と同調して、薬学的粒子を送達する粒子送達デバイス（例えば、針のない注
射器）を記載する。粒子送達デバイスが、粉末の薬物化合物および組成物の経皮
的送達のために用いられ、生きた細胞中の遺伝物質の送達（例えば、遺伝子治療
）、および皮膚、筋肉、血液、またはリンパへの生物薬剤の送達のために用いら
れる。針のない注射器はまた、薬物および生物製剤を、組織表面、固形腫瘍およ
び／または外科的な腔（例えば、腫瘍切除後の腫瘍ベッド、または腔）へ送達す
るために、手術と組み合わせて使用され得る。実質的に固形の粒子形態に適する
ように調製され得る薬学的な薬剤は、このようなデバイスを用いて、安全かつ容
易に送達され得る。

【０００５】１つの特定の粒子送達デバイスは、一般的に、最初はノズルを介した通路を塞
いでおり、そしてノズルの上流端に実質的に隣接している変化させた破裂し得る
膜を有する、細長い管状ノズルを含む。送達される治療剤の粒子は、破裂し得る
膜に隣接して配置され、そして膜を破裂させ、そしてそれらの下流端から送達の
ためのノズルを通して超音速ガス流（薬学的粒子を含む）を産生するために充分
な膜の上流側へのガス圧を加える加圧手段を用いて送達される。従って、粒子が
、破裂し得る膜の破裂を容易に得ることのできるマッハ１〜マッハ８の間の送達
速度で針のない注射器から送達され得る。

【０００６】超音速ガス流中に同調する薬学的粒子を有する代わりに、ノズルの下流端が、
静止している「裏返し」位置（ここでは、薬学的粒子を含有するために、隔壁が
下流面に凹面に存在する）と活性な「裏返し」の位置（ここでは、隔壁が、隔壁
の上流面に適応された超音波衝撃波の結果として、下流面に外向きに凸面である
）の間を動くことができる双安定の隔壁を提供されることを除いては、別の粒子
送達デバイスの構成は、一般的に、上記と同様の要素を含む。この様式において
、この隔壁の凹面内に含有される薬学的粒子は、それらの経皮的送達のためのデ
バイスから、標的化された皮膚または粘膜表面へ、高初速で発射される。

【０００７】上記のデバイスの構成を用いる経皮的送達は、一般的に、約０．１〜２５０μ
ｍの間の範囲のおよそのサイズを有する粒子を用いて実行される。約２５０μｍ
より大きな粒子がまた、粒子サイズが皮膚細胞に有害なダメージを引き起こす点
である、上限の粒子サイズでデバイスから送達され得る。送達された粒子が貫通
する実際の距離は、粒子サイズ（例えば、概算的な球状の粒子幾何学から想定さ
れる名目状の粒子の直径）、粒子密度、粒子が皮膚表面に衝突する初速度、そし
て皮膚の密度および運動粘度に依存している。針のない粒子注射に一般的に用い
るための標的粒子密度は、約０．１と２５ｇ／ｃｍ³との間の範囲であり、そし
て注入速度は、一般的に約１５０と３，０００ｍ／秒との間の範囲である。

【０００８】ＤＮＡ−ワクチンで達成される有効な保護のレベルは、伝統的なタンパク質サ
ブユニットワクチンおよび死滅または弱毒化したウイルスワクチンにより惹起さ
れた保護レベルと類似する；しかし、天然の感染から回復した後の回復期動物に
観察されるより伝統的に低い。Ｍａｎｉｃｋａｎら（１９９７）、Ｃｒｉｔｉｃ
ａｌＲｅｖｉｅｗＩｍｍｕｎｏｌ．１７：１３９〜１５４．ヘルペス感染は
非常に流行し、そしてヘルペス感染は２種のウイルス（単純ヘルペスウイルス１
型（ＨＳＶ−１）および単純ヘルペス２型（ＨＳＶ−２））によって引き起こさ
れる。通常、ＨＶＳ−１は、幼児期おいて後天性であり、そして口内感染の主な
原因である。通常、ＨＳＶ−２感染は、性的に感染した陰部感染に関する。しか
し、陰部ヘルペスの２５％までは、ＨＳＶ−１により引き起こされる。天然の感
染は、他の種（すなわち、ＨＳＶ−２）への暴露にもかかわらず、１つの種（す
なわち、ＨＳＶ−１）で感染させた個体が、他の種で低い感染率を有するという
点では、２つのＨＳＶ種間の交差保護を与えるようである。Ｍｅｒｔｚら（１９
９２）、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１１６：１９７−２０２。このような
所見に対する理由は完全に解明されてはいない。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ
）での感染に対してほぼ完全な保護が死滅または改変したウイルスを用いるワク
チンによりマウスおよび／またはブタにおいて達成され得るが、回復期の動物に
おける保護の程度は、ワクチン性能の改善のための目標を規定する。

【０００９】ＨＳＶは、約１５０〜１６０ｋｂｐのゲノムを有する二本鎖ＤＮＡウイルスで
ある。ＨＳＶ−１ゲノムおよびＨＳＶ−２ゲノムは、同一線形順序に並んでおり
、そしてゲノム全体にわたって５０％の相同性を共有する。いくつかのゲノムに
対して、２つのウイルス型間のアミノ酸の同一性は８０〜９０％同じである。こ
の類似性の結果、多くのＨＳＶ特異的抗体は、両方のウイルスに対して交差反応
的である。

【００１０】このウイルスのゲノムは、膜にエンベロープされた２０面体のヌクレオカプシ
ド中に包まれる。この膜（またはエンベロープ）は、少なくとも１０のウイルス
にコード化された糖タンパク質を含み、最も豊富なのはｇＢ、ｇＣ、ｇＤおよび
ｇＥである。ウイルス性糖タンパク質は、ウイルスの細胞レセプターへの結合プ
ロセスおよび細胞内へのウイルスの侵入を可能にするウイルスと宿主細胞膜の融
合に関与する。糖タンパク質は、ビリオン表面上に位置する。結果として、これ
らは中和抗体の標的であり、そして抗体は細胞の細胞毒性（ＡＤＣＣ）に依存す
る。ウイルスの型の中で、制限された（１〜２％）種から種への糖タンパク質遺
伝子の配列多様性が存在する。ウイルスゲノムはまた、７０以上の他のタンパク
質をコードし、これらのタンパク質は、カプシドとエンベロープの間に位置する
ビリオン外皮に関するＶＰ１６およびＶＰ２２のようなビリオンタンパク質を含
む。さらに、約５つのＩＣＰ群が、ウイルスによりコードされる（例えば、ＩＣ
Ｐ−４を含むワクチンに関するＷＯ／９５１６７７９を参照のこと）。これらの
初期タンパク質は、ウイルス複製サイクル初期、ウイルスのライフサイクル後期
にのみ生成されるエンベロープ糖タンパク質との接触において合成される。

【００１１】ＨＳＶの分子構造および分子構成の再調査のため、例えば、Ｒｏｉｚｍａｎお
よびＳｅａｒｓ（１９９６）「Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｅｓ
ａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、ＦｉｅｌｄｓＶｉｒｏｌ
ｏｇｙ、第３編、Ｆｉｅｌｄｓら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−ＲａｖｅｎＰｕ
ｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡを参照のこと。

【００１２】ＨＳＶワクチンの開発アプローチの１つは、予防および治療の両方が示されて
きた単離された糖タンパク質の使用であった。例えば、Ｂｕｒｋｅら、Ｖｉｒｏ
ｌｏｇｙ（１９９１）１８１：７９３〜７９７；Ｂｕｒｋｅら、Ｒｅｖ．Ｉｎｆ
ｅｃｔ．Ｄｉｓ．（１９９１）１３（Ｓｕｐｐｌ１１）：Ｓ９０６〜Ｓ９１１
；Ｓｔｒａｕｓら、Ｌａｎｃｅｔ（１９９４）３４３：１４６０〜１４６３；
Ｈｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８９）６３：２９５１〜２９５８；Ｓｔｒａｎ
ｂｅｒｒｙら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（１９８８）１５７：１５６〜１６
３；およびＳｔａｎｂｅｒｒｙら（１９８７）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５
５：９１４〜９２０；Ｓｔａｎｂｅｒｒｙ、Ｌ．Ｒ．「ＳｕｂｕｎｉｔＶｉｒ
ａｌＶａｃｃｉｎｅｓ：ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｎｄｔｈｅｒａｐｅ
ｕｔｉｃｕｓｅ」：ＡｕｒｅｌｉａｎＬ（編）Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ
、ｔｈｅＩｍｍｕｎｅＳｙｓｔｅｍｓａｎｄＡｉｄｓ、Ｋｌｕｗｅｒ、
Ｂｏｓｔｏｎ、３０９〜３４１頁を参照のこと。しかし、臨床試験は、ｇＢ糖タ
ンパク質およびｇＤ糖タンパク質からなるサブユニットワクチンでワクチン接種
されたヒトにおける顕著な予防免疫性を示すことに失敗してきた。

【００１３】免疫学的エピトープをコードする配列を同定する方法の１つは、発現ライブラ
リーの使用を包含し、そして発現ライブラリー免疫法（ＥＬＩ）として公知であ
る。国際公開ＷＯ９６／３１６１３は、ｃＤＮＡ由来のクローン化された発現ラ
イブラリーまたはフラグメント化されたゲノムＤＮＡを被検体に導入することが
、免疫原エピトープを有する配列を含むライブラリーを選択するために定量化さ
れ得る免疫応答を誘発することを報告する。選択されたプールは、次に同定され
そして特徴づけされる。使用されるゲノムフラグメントは、比較的小さく、約１
０と１００塩基対の間の長さである。さらに、ＥＬＩ法において、ゲノムフラグ
メントは外因性（すなわち、異種）プロモーターを有するベクターにスプライス
される。ＥＬＩのゲノムクローンには、未同定の配列が残っており、従って、い
ずれの抗原配列も、特定のワクチンが開発される前に、広範囲に精製されかつ特
徴づけされなければならない。

【００１４】これらの報告にかかわらず、抗原に対する動物の天然の応答をより緊密に模倣
する免疫応答を惹起する方法の必要性が残っている。本発明は、このことおよび
その他の問題に対する解決法を提供する。

【００１５】（発明の要旨）本発明は、被検体において免疫応答を惹起する方法および組成物を提供する。
１つの局面において、本発明は、１以上の病原体から得られたまたは１以上の病
原体から誘導されたゲノムＤＮＡフラグメントを保有する構築物を投与する工程
を包含する脊椎を有する被検体における免疫応答を惹起する方法を提供する。一
旦ゲノムＤＮＡフラグメントが被検体に投与されると、ゲノムＤＮＡフラグメン
トに存在するコード配列によってコードされる抗原が免疫応答を惹起するに十分
な量で発現される。ゲノムフラグメントは、好ましくは５キロベース（ｋｂ）以
上の大きさである。特定の方法において、構築物は、約５ｋｂと２５ｋｂの間の
大きさのゲノムＤＮＡフラグメントを保有するプラスミドである。なお他の方法
において、構築物は、約２５ｋｂと約５０ｋｂとの間の大きさのゲノムＤＮＡフ
ラグメントを保有するコスミドである。特定の方法において、ゲノムＤＮＡフラ
グメント中に含まれるコード配列（すなわち、抗原コード配列）の発現は、異種
プロモーターによって駆動されない。例えば、病原体は、細菌の１以上の型また
はウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス、すなわち「ＨＳＶ」）の１以上の
型であり得る。構築物（例えば、プラスミドまたはコスミド）は、例えば、経皮
投与によって投与され得る。

【００１６】従って、本発明はまたゲノムＤＮＡフラグメントを少なくとも５ｋｂの大きさ
で保有する遺伝的構築物の使用を提供し、このゲノムＤＮＡフラグメントは、前
記構築物を被検体に投与することにより脊椎を有する被検体における免疫応答を
惹起する薬剤の製造における病原体由来であり、これにより、前記ゲノムＤＮＡ
フラグメントに含まれる配列によりコードされた抗原が、免疫応答を惹起するに
十分な量で発現される。

【００１７】別の局面において、本発明は、脊椎のある被検体における免疫応答を惹起する
方法を提供する。この方法は以下の工程を包含する：（ａ）１以上の病原体から
得られたまたは１以上の病原体に由来したゲノムＤＮＡフラグメントを保有する
構築物でコーティングしたコアキャリアを提供する工程であって、ここでゲノム
ＤＮＡフラグメントが抗原をコードする配列を含む工程；および（ｂ）粒子媒介
経皮送達技術を使用して被験体にコーティングしたコアキャリアを投与する工程
であって、ここでゲノムＤＮＡフラグメントに存在するコード配列によりコード
された抗原が、免疫応答を惹起するに十分な量で被検体において発現される工程
。ゲノムＤＮＡフラグメントは、約５キロベースより大きな大きさである。特定
の方法において、この構築物はプラスミドであり、そして約５〜２５キロベース
の範囲の大きさのゲノムＤＮＡフラグメントを保有する。他の方法において、こ
の構築物はコスミドであり、そして約２５〜５０キロベースの範囲の大きさのゲ
ノムＤＮＡフラグメントを保有する。特定の方法において、この構築物（例えば
、プラスミドまたはコスミド）のゲノムＤＮＡフラグメント中に含まれるコード
配列の発現は、異種のプロモータによって駆動されない。本明細書中で記載され
た任意のプラスミドまたはコスミドに対するコアキャリアは代表的には平均約０
．５〜約５μｍの直径を有し、そして被験体へ経皮送達させるに十分な密度を有
する。コアキャリアは、金属、例えば金で構成され得る。例えば、病原体は、細
菌の１以上の型、ウイルスの１以上の型であり得、そして２以上の異なる病原体
由来であり得る。なおさらなる方法は、初回投与および追加免疫投与を提供する
ために工程（ｂ）を繰り返す工程を包含する。

【００１８】従って、本発明はまたゲノムＤＮＡフラグメントを少なくとも５ｋｂの大きさ
で保有する遺伝的構築物の使用を提供し、このゲノムＤＮＡフラグメントは、前
記構築物を被検体に投与することにより脊椎を有する被検体における免疫応答を
惹起する薬剤の製造における１以上の病原体由来であり、ここで、この遺伝的構
築物はコアキャリア上にコートされ、そしてコートされたコアキャリアは経皮粒
子媒介送達技術を使用して被験体に投与され、さらにここで、ゲノムフラグメン
ト中に存在するコード配列によりコードされた抗原は、免疫応答を惹起するに十
分な量で被験体において発現される。

【００１９】本発明のなお別の局面において、抗原ポリペプチドをコードする配列を同定す
るための方法が提供される。この方法は以下の工程を伴う：（ａ）１以上の病原
体から得られた、または１以上の病原体に由来するゲノムＤＮＡフラグメントを
保有する構築物を投与する工程であって、ここでこのゲノムＤＮＡフラグメント
が、抗原ポリペプチドに対するコード配列を含むかまたは含んでいると疑われ、
そして被験体への送達において、抗原ポリペプチドが、免疫応答を惹起するに十
分な量でコード配列から発現される、工程。および（ｂ）抗原ポリペプチドをコ
ードする構築物上の配列を同定する工程。１つの方法において、工程（ｂ）は、
工程（ａ）の構築物の１以上のフラグメントを投与する工程および抗原ポリペプ
チドをコードするフラグメントを同定する工程を包含する。別の方法において、
工程（ｂ）は、構築物を配列決定する工程を包含する。

【００２０】従って、本発明はゲノムＤＮＡフラグメントを少なくとも５ｋｂの大きさで保
有する遺伝的構築物の使用をさらに提供し、このゲノムＤＮＡフラグメントは、
被験体にこの構築物を投与することにより抗原ポリペプチドをコードする配列を
同定するための組成物の製造における１以上の病原体に由来し、ここでこのゲノ
ムＤＮＡフラグメントは、この抗原ポリペプチドをコードする配列を含み、送達
において、この抗原ポリペプチドは、免疫応答を惹起するに十分な量で発現され
；そして抗原ポリペプチドをコードする構築物上の配列を同定する。

【００２１】関連する局面において、本発明は、１以上の病原体から得られるかまたは１以
上の病原体に由来するゲノムＤＮＡフラグメントを保有する１以上の構築物を含
むワクチン組成物を提供し、このようなワクチン組成物として、例えば、単純ヘ
ルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）由来のゲノムＤＮＡフラグメントを保有する
１以上の構築物（例えば、クローン番号６８）を含むワクチン組成物が挙げられ
る。特定の実施形態において、この構築物は約５ｋｂ〜２５ｋｂの範囲の大きさ
のゲノムＤＮＡフラグメントを保有するプラスミドである。なお他の実施形態に
おいて、この構築物は約２５ｋｂ〜約５０ｋｂの範囲の大きさのゲノムＤＮＡフ
ラグメントを保有するコスミドである。本明細書中で記載されるすべての方法ま
たは組成物において、ＨＳＶ−２のようなウイルスの初期領域（例えば、ＩＣＰ
２７、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２など）、例えば、ＨＳＶ−２ゲノムのお
およそヌクレオチド１１４５８９からヌクレオチド１３４９８０をスパンする領
域、またはＨＳＶ−２ゲノムのヌクレオチド１１０９３１からヌクレオチド１３
９６９７をスパンするＥｃｏＲＩフラグメントを含み得る。ＨＳＶ−２ゲノム配
列は公表された供給源（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ００１７９８で
寄託された）より入手可能である。特定の実施形態において、構築物（例えば、
プラスミドまたはコスミド）のゲノムＤＮＡフラグメント中に含まれるコード配
列の発現は、異種プロモーターによって駆動されない。ワクチン組成物はまた、
１以上のアジュバンドを含み得る。

【００２２】本明細書中の開示を考慮すると、本発明のこれらおよび他の実施形態は当業者
が容易に思いつく。

【００２３】（本発明を実施するための形態）詳細に本発明を記載する前に、本発明は、特定の抗原または抗原をコードする
配列を限定しないことが理解される。また、開示される方法の異なる適用が当該
分野における特定の必要性に合わせて変更され得ることも理解される。また、本
明細書中で使用される用語法は、本発明の特定の実施形態を記載する目的のみの
ためであり、そして限定を意図しないことも理解される。

【００２４】本明細書中で引用される全ての出版物、特許および特許出願は、前出または後
出であろうと、本明細書によってその全体が参考として援用される。

【００２５】本明細書および添付された特許請求の範囲において使用される場合、単数型の
「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が明らかに別のものを指定しな
い限り、複数の対象を含むことを注意しなければならない。従って、例えば、「
ある抗原」に対する参照は、２以上のこのような抗原の混合物を含み、「粒子」
に対する参照は、２以上の粒子の混合物に対する参照を含み、「ある賦形剤細胞
」に対する参照は、２以上のこのような細胞の混合物を含む、などである。

【００２６】（定義）他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用
語は、本発明が関係する分野の当業者によって一般に理解されている意味と同じ
意味を有する。

【００２７】以下の用語は、以下に示されるように定義されることが意図される。

【００２８】用語「ワクチン組成物」は、抗原を含む任意の薬学的組成物（例えば、抗原を
コートするポリヌクレオチド）を意図し、その組成物は、被験体における疾患ま
たは症状を予防または処置するために使用され得る。従って、この用語は、両方
のサブユニットワクチン（すなわち、天然において抗原が結合される生物体全体
から分離および分散された抗原を含むワクチン組成物、ならびに全て殺されるか
、弱毒化されるか、または不活性化された細菌、ウイルス、寄生虫あるいは他の
微生物全体を含む組成物）を含む。

【００２９】用語「経皮」送達とは、皮内（例えば、真皮または上皮中へ）、経皮（ｔｒａ
ｎｓｄｅｒｍａｌ）（例えば、「経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）」）および
経粘膜の投与（すなわち、皮膚または粘膜組織中へのもしくはそれを通る薬剤の
通過による送達）を意図する。例えば、以下を参照のこと：Ｔｒａｎｓｄｅｒｍ
ａｌＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ：ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＩｓｓｕ
ｅｓａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｉｔｉａｔｉｖｅｓ，Ｈａｄｇｒａｆｔ
ａｎｄＧｕｙ（編），ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，（１９８９
）；ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎ
ｔａｌｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＲｏｂｉｎｓｏｎａｎｄＬ
ｅｅ（編），ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒＩｎｃ．，（１９８７）；および
ＴｒａｎｓｄｅｒｍａｌＤｅｌｉｖｅｒｙｏｆＤｒｕｇｓ，Ｖｏｌｓ．１
−３，ＫｙｄｏｎｉｅｕｓａｎｄＢｅｒｎｅｒ（編），ＣＲＣＰｒｅｓｓ
，（１９８７）。従って、この用語は、米国特許第５，６３０，７９６号に記載
される粒子送達デバイス（例えば、無針シリンジ）からの送達、および米国特許
第５，８６５，７９６号において記載されるような粒子媒介される送達からの送
達を包含する。

【００３０】「コアキャリア」とは、核酸（例えば、ＤＮＡ）が、規定された粒子サイズを
付与し、そして充分に高い密度を提供して細胞膜貫通に必要なモーメントを達成
し、その結果、そのＤＮＡが粒子媒介技術（例えば、米国特許第５，１００，７
９２号に記載される技術）を用いて送達され得るようにコーティングされるキャ
リア粒子を意味する。コアキャリアは、代表的には、タングステン、金、白金、
フェライト、ポリスチレン、およびラテックスのような材料を含む。例えば、以
下を参照のこと：ＰａｒｔｉｃｌｅＢｏｍｂａｒｄｍｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙｆｏｒＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒ，（１９９４）Ｙａｎｇ，Ｎ．版，
ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ
１０−１１頁。

【００３１】「粒子送達デバイス」または「針のない注射」は、皮膚を突き刺す従来の針を
有さない、粒子状組成物を経皮的に送達する装置を意味する。本発明での使用の
ための粒子送達デバイスは、本明細書を通して議論される。

【００３２】「抗原」は、宿主の免疫系を刺激して、細胞性の抗原特異的な免疫応答、また
は体液性の抗体応答を生じる１以上のエピトープを含む分子を意味する。従って
、抗原としては、タンパク質、ポリペプチド、抗原性タンパク質フラグメント、
オリゴ糖類、多糖類などが挙げられる。さらに、抗原は、任意の既知のウイルス
、細菌、寄生虫、植物、原生生物、または真菌由来であり得、そして生物体全体
であり得る。この用語はまた、腫瘍抗原を含む。同様に、抗原を発現するオリゴ
ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡの免疫適用において）は
また、抗原の定義に含まれる。合成抗原（例えば、ポリエピトープ、隣接エピト
ープ、および他の組換え体または合成的に由来する抗原）もまた含まれる（Ｂｅ
ｒｇｍａｎｎら（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２７７７−２
７８１；Ｂｅｒｇｍａｎｎら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３２４
２−３２４９；Ｓｕｈｒｂｉｅｒ，Ａ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．ａｎｄ
ＣｅｌｌＢｉｏｌ．７５：４０２−４０８；Ｇａｒｄｎｅｒら（１９９８）１
２ｔｈＷｏｒｌｄＡＩＤＳＣｏｎｆｅｒｅｎｃｅ、Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉ
ｔｚｅｒｌａｎｄ、Ｊｕｎｅ２８−Ｊｕｌｙ３、１９９８）。

【００３３】「安定な免疫応答」は、本発明の方法は、免疫化された被験体に、抗原（単数
または複数）に特異的なＢおよび／またはまたはＴリンパ球の産生によって特徴
付けられる免疫応答を引き起こし得ることを意味する。

【００３４】用語「ペプチド」は、その最も広い意味で使用され、２以上のサブユニットア
ミノ酸の組成物、アミノ酸アナログまたは他のペプチド模倣物をいう。このサブ
ユニットは、ペプチド結合または他の結合（例えば、エステル結合、エーテル結
合など）によって結合し得る。本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸」
は、天然アミノ酸、および／または天然でない、すなわち合成アミノ酸のいずれ
かをいい、これは、グリシンおよびＤまたはＬの両方の光学異性体、ならびにア
ミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を含む。３以上のアミノ酸のペプチドは、
一般的に、ペプチド鎖が短い場合、オリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長
い場合、このペプチドは、典型的に、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる
。

【００３５】用語「病原体」は、広義の意味で使用され、免疫応答を誘発する任意の分子の
供給源をいう。従って、病原体としては、有毒のウイルスまたは弱毒化ウイルス
、細菌、真菌、原生動物、寄生虫、癌細胞などが挙げられるが、これらに限定さ
れない。典型的に、免疫応答は、これらの病原体によって産生される１以上のペ
プチドによって誘発される。以下に詳細に記載されるように、これらの病原体お
よび他の病原体由来の抗原性ペプチドをコードするゲノムＤＮＡは、自然の感染
に対する応答を模倣する免疫応答を引き起こすために使用される。本明細書中の
教示から、この方法は、１以上の病原体から得られるゲノムＤＮＡの使用を包含
することも明白である。

【００３６】用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は、任意の長さのヌクレオチド
（デオキシリボ核酸またはリボ核酸のいずれか）の重合形態、あるいはそれらの
アナログと交換可能に使用され、そしてそれらをいう。ポリヌクレオチドは、任
意の３次元構造を有し得、そして既知または未知の機能を行い得る。ポリヌクレ
オチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子フラグメント、エキソン、イン
トロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ
）、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝
ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任
意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーが挙げられる。

【００３７】ポリヌクレオチドは、典型的に、４つの核酸塩基：アデニン（Ａ）；シトシン
（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；およびチミン（Ｔ）（ポリヌクレオチドがＲＮＡの場
合は、チミン（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ））の特定の配列からなる。従って
、用語ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド分子の直鎖状の代表である。
この直鎖状の代表は、中央処理単位を有するコンピュータのデータベースへの入
力であり得、そして機能的なゲノム研究および相同性研究のような生命情報科学
の適用のために使用され得る。

【００３８】「ベクター」または「構築物」は、核酸分子を標的細胞に移入し得る任意の成
分である（例えば、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、粒子状キャリア、
およびリポソーム）。「プラスミド」ベクターは、宿主細胞で自己複製し得る染
色体外の遺伝的エレメントである。「コスミド」ベクターは、バクテリオファー
ジラムダ（λ）のｃｏｓは配列を使用する特定の型のプラスミドベクターである
。用語「ｃｏｓ末端」または「ｃｏｓ部位」とは、λＤＮＡの一本鎖の１２塩基
対の相補的伸展をいう。コスミドは、例えば、約５０ｋｂのサイズに至るまでの
、大きな挿入を保有し得、一方、典型的なプラスミドは、１０ｋｂのサイズのフ
ラグメントを保有し得る。大きなフラグメントを保有するこれらの能力のために
、コスミドは、ゲノムライブラリーの構築のために有用である。典型的には、「
ベクター」、「構築物」、「発現ベクター」、および「遺伝子移入ベクター」は
、目的の遺伝子の発現を指向し得、そして標的細胞に遺伝子配列を移入し得る任
意の核酸構築物を意味する。従って、この用語は、クローニングビヒクルおよび
発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。「ゲノムライブラリー」は、
生物の全ゲノムを一緒に発現する組換え核酸分子の収集体である。

【００３９】「コード配列」はまたは選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適
切な調節配列（または「制御配列」）の制御下におかれた場合、インビボでポリ
ペプチドへと転写（ＤＮＡの場合）または翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分
子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端での開始コドンおよび３’
（カルボキシ）末端での翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、ウ
イルス由来のｃＤＮＡ、原核細胞または真核細胞のｍＲＮＡ、ウイルスまたは原
核細胞ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえ挙げられるが
、これらの限定されない。転写終止配列は、コード配列に対して３’側に位置し
得る。コード配列の転写および翻訳は、代表的に、「制御エレメント」によって
調節され、転写プロモーター、転写エンハンサーエレメント、シャインおよびダ
ルガーノ配列、転写終止シグナル、ポリアデニル化配列（翻訳停止コドンの３’
側に位置する）、翻訳開始の最適化のための配列（コード配列の５’側に位置す
る）、および翻訳終止配列が挙げられるが、これらの限定されない。

【００４０】「プロモーター」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を指
示するヌクレオチド配列である、プロモーターとしては、誘導性プロモーター（
プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補
因子、調節タンパク質などにより誘導される場合）、抑制性プロモーター（プロ
モーターに作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現が、分析物、補因子
、調節タンパク質などにより抑制される場合）および構成性プロモーターが挙げ
られ得る。用語「プロモーター」または「制御エレメント」は、全長プロモータ
ー領域およびこれらの領域の機能的（例えば、転写または翻訳を制御する）セグ
メントを含むことが意図される。

【００４１】「単離されたポリヌクレオチド」分子は、核酸が天然に見い出される生物全体
から分離および分散された核酸分子；通常、天然にそれと関連する配列に（全体
または一部が）ない核酸分子；または、天然に存在するが、それと関連する（以
下に詳細に規定されるような）異種配列を有する場合、配列である。配列は、供
給源分子の領域と同じか、またはこれらと実質的に同じ塩基対配列、そのｃＤＮ
Ａ、それらの相補体を有する場合、あるいは以下に記載されるような配列相同性
を表示する場合は、分子「由来」であるか、または分子「から得られる」。

【００４２】「作動可能に連結される」とは、そのように記載された成分が、それらの普通
の機能を奏するように構成されるエレメントの配置をいう。従って、（例えば、
目的の抗原をコードする）コード配列に作動可能に連結した所定のプロモーター
は、適切な酵素が存在する場合にそのコード配列の発現をもたらし得る。プロモ
ーター又は他の調節エレメントは、その発現を方向付けるように機能する限り、
その配列と連続している必要はない。従って、例えば、転写されたが、未だ翻訳
されていない配列の介入は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、
そしてなおこの核酸配列およびプロモーター配列は、コード配列に「作動可能に
連結され」ていると考えられ得る。

【００４３】核酸分子を記載するために本明細書中で使用される場合、「組換え（体）」は
、その起源または操作により、（１）それが天然に関連づけられているポリヌク
レオチドの全てまたは一部と関連づけられず、および／または（２）それが天然
に連結するポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結するゲノム、ｃＤＮ
Ａ、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質または
ポリペプチドに関して使用される場合、用語「組換え体」は、組換えポリヌクレ
オチドの表現によって産生されるポリペプチドを意味する。

【００４４】核酸およびアミノ酸の「配列同一性」を決定するための技術はまた、当該分野
において公知である。代表的に、そのような技術は、遺伝子についてのｍＲＮＡ
のヌクレオチド配列を決定する工程、および／またはそれによりコードされるア
ミノ酸配列を決定する工程、ならびに第２のヌクレオチド配列またはアミノ酸配
列とこれらの配列を比較する工程を包含する。一般的に、「同一性」とは、それ
ぞれ、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のヌクレオチド対ヌ
クレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の正確な一致をいう。２つ以上の配列（ポ
リヌクレオチドまたはアミノ酸）が、それらの「パーセント同一性」を決定する
ことによって比較され得る。２つの配列のパーセント同一性は、核酸配列または
アミノ酸配列のいずれにおいても、整列された２つの配列の間の正確に一致する
数を、より短い方の配列の長さにより除算し、そして１００を乗算したものであ
る。核酸配列に対する近似のアラインメントが、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍ
ａｎ、ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈｅｍａｔｉｃｓ２
：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって提供される
。このアルゴリズムは、Ｄａｙｈｏｆｆ、ＡｔｌａｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎ
ＳｅｑｕｅｎｃｅａｎｄＳｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、
５補遺、３：３５３−３５８、ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅ
ｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ＵＳ
Ａによって開発された得点マトリックスを使用することによってアミノ酸配列に
対して適用され得、そしてＧｒｉｂｓｋｏｖ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．
１４（６）：６７４５−６７６３（１９８６）によって規格化され得る。配列の
パーセント同一性を決定するためのこのアルゴリズムの例示的実行が、「ベスト
フィット（ＢｅｓｔＦｉｔ）」ユーティリティーアプリケーションにおけるＧ
ｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によ
って提供される。この方法についてのデフォルトパラメータは、Ｗｉｓｃｏｎｓ
ｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰａｃｋａｇｅＰｒｏｇｒａｍ
Ｍａｎｕａｌ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８（１９９５）（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐ
ｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）中に記載される。
本発明の文脈においてパーセント同一性を確立する好ましい方法は、Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙｏｆＥｄｉｎｂｕｒｇｈによって著作権が所有されて、Ｊｏｈｎ
Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅＳ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され
て、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（ＭｏｕｎｔａｉｎＶ
ｉｅｗ，ＣＡ）によって配給されるＭＰＳＲＣＨパッケージのプログラムを使用
することである。デフォルトパラメータが得点表について使用される場合、この
スート（ｓｕｉｔｅ）のパッケージから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴ
リズムが使用され得る（例えば、１２のギャップオープンペナルティー、１のギ
ャップイクステンションペナルティーおよび６のギャップ）。その生成されたデ
ータから、「一致」値は、「配列同一性」を示す。配列間のパーセント同一性ま
たは類似性を計算するための適切な他のプログラムは、一般的に当該分野におい
て公知であり、例えば、別のアラインメントプログラムはＢＬＡＳＴであり、デ
フォルトパラメータと共に使用される。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴ
Ｐは、以下のデフォルトパラメータを使用して使用され得る：遺伝子暗号＝標準
；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予期（ｅｘｐｅｃｔ）＝１
０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０配列；分類（ｓｏｒｔｂｙ
）＝高得点（ＨＩＧＨＳＣＯＲＥ）；データベース＝非重複性、ＧｅｎＢａｎ
ｋおよびＥＭＢＬおよびＤＤＢＪおよびＰＤＢおよびＧｅｎＢａｎｋＣＤＳ翻
訳およびＳｗｉｓｓタンパク質およびＳｐｕｐｄａｔｅおよびＰＩＲ。これらの
プログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．
ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴにおいて見出され得る
。

【００４５】あるいは、相同性は、相同な領域間の安定な二本鎖を形成する条件下で、ポリ
ヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって決定され得、次いで一本鎖特異
的ヌクレアーゼを用いて消化し、そして消化されたフラグメントのサイズを決定
する。上記の方法を使用して決定される場合、２つのＤＮＡ配列または２つのポ
リペプチド配列は、その分子の定義された長さに渡って、その配列が少なくとも
約８０％〜８５％配列同一性、好ましくは少なくとも約９０％配列同一性および
最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％配列同一性を示す場合、互いに「実
質的に相同」である。本明細書中で使用される場合、また、実質的に相同である
とは、特定化されたＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に対して完全な同一性を
示す配列をいう。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、例えば、その特別な系につ
いて定義されるようなストリンジェントな条件下におけるサザンハイブリダイゼ
ーション実験において同定され得る。例えば、ストリンジェントなハイブリダイ
ゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＣ、０
．１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含み得、そして洗
浄条件は、３７℃にて２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、次いで６８℃にて１×ＳＳ
Ｃ、０．１％ＳＤＳを含み得る。適切なハイブリダイゼーション条件を定義する
ことは、当業者の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ、前出；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ、前出を参照のこと。

【００４６】本明細書中で使用される場合、用語「アジュバント」とは、薬物、抗原、ポリ
ヌクレオチド、ベクターなどの作用を増強する任意の材料をいう。常に明白にい
われるわけではないが、野生型または精製されたペプチドアジュバントと類似の
生物学的活性を有する分子（例えば、組み換え的に産生されたもの、またはそれ
らのムテイン）、およびこれらの分子をコードする核酸が意図され、本発明の精
神および範囲内で使用されることが意図される。

【００４７】本明細書中で使用される場合、用語「処置」は、以下の任意のものを含む：感
染または再感染の予防；症状の減少または除去；および病原体の減少または完全
な除去。処置は、（感染の前に）予防的に、または（感染後に）治療的になされ
得る。

【００４８】「脊椎動物」は、任意の数の亜門ｃｏｒｄａｔａ、時に哺乳動物（ヒトおよび
他の霊長類を含むが、これらに限定されない）を意味する。この用語は、特定の
年齢を意味しない。従って、成体および新生児の両方の固体が包含されることが
意図される。

【００４９】（発明の一般的概要）本発明を詳細に記述する前に、本発明は、特定の処方物または特定のプロセス
パラメーターに限定されず、もちろん、それ自体が変化し得るということが理解
されるべきである。本明細書中で使用される専門用語は、本発明の特定の実施形
態のみを記述する目的のためであり、そして限定することを企図されないことが
また理解されるべきである。

【００５０】本発明は被験体の免疫応答を惹起する新規の方法を提供する。簡単には、１以
上の病原体（例えば、細胞、組織、ウイルスなど）を表す巨大ポリヌクレオチド
（例えば、ＤＮＡ）フラグメントを保有するベクターライブラリーが作製される
。代表的には、このベクターは、プラスミドまたはコスミドであり、ゲノムフラ
グメントの大きさに依存する。ライブラリーは、オーバーラップ挿入または非オ
ーバーラップ挿入を含む。１以上の選択されたゲノムライブラリークローンは、
次に免疫応答を惹起するに十分な量で被験体に投与される。この方法において、
多数の抗原（およびこれらの対応するエピトープ）が、１回の免疫化工程におい
て被験体に投与され得る。さらに、巨大ゲノムフラグメントがこれらの内因性の
発現制御エレメントを含む構築物（例えば、コスミドまたはプラスミド）により
運ばれるため、さらなる分子操作（例えば、ゲノムフラグメントに存在するコー
ド配列から発現を駆動するための異種プロモーター配列の挿入）が必要とされな
い。しかし、異種制御は、例えば、ゲノム配列が細菌のような真核生物由来であ
る場合に、構築物中に存在し得る。さらに、内因性制御エレメント（例えば、シ
スおよび／またはトランス作用調節エレメント）が、宿主被験体における抗原の
発現を駆動し、従って、免疫原性遺伝子産物が天然の感染のレベルと類似のレベ
ルで産生されるため、この構築物により惹起された免疫応答全体が、天然の感染
に起因する応答をより緊密に模倣する。対照的に、前述した発現ライブラリー免
疫法における異種のプロモーターの使用は、非選択的な病原体遺伝子の発現を生
じる。

【００５１】本発明はまた、抗原フラグメントをコードする配列を同定するための効率的な
方法を含む。詳細には、公知の遺伝的組成物を有する構築物の使用が、抗原ポリ
ペプチドをコードする配列を同定する方法を可能にする。例えば、被験体におい
て免疫応答を誘導するコスミドまたはプラスミドクローンが同定される。次に被
験体における免疫応答に含まれる正確な配列は、当該分野で公知の方法（例えば
、クローンの配列決定）または挿入するコスミドもしくはプラスミドのさらなる
フラグメント化およびより小さなこれらのフラグメントの免疫原性に対する試験
を行うことにより決定され得る。

【００５２】本発明のポリヌクレオチドは、例えば、従来のトランスフェクション技術によ
りまたは粒子上にポリヌクレオチドをコーティングし、次に粒子媒介トランスフ
ェクションを使用して細胞にコーティングした粒子を投与することによりインビ
トロまたはインビボで細胞中に導入され得る。あるいは、ポリヌクレオチドは粒
子（例えば、パウダー）の形態で提供され得、これらは以下および国際公開番号
ＷＯ９８／１０７５０の開示（本明細書中で参考として援用される）により詳細
に考察される。

【００５３】本発明の利点として、（ｉ）免疫応答を惹起するために使用される抗原の数を
拡大すること；（ｉｉ）天然の感染抗原をより緊密に模倣する抗原（例えば、エ
ピトープ）の配列（ａｒｒａｙ）を提供すること；（ｉｉｉ）抗原とこれらに関
する野生型調節エレメントを同一細胞に同時に送達することを達成し、複数の抗
原の協調した発現を達成すること；（ｉｖ）天然の感染により惹起される免疫応
答と類似の免疫応答を惹起すること；（ｖ）天然の感染により惹起される免疫応
答よりもより保護性のある免疫応答を惹起すること（例えば、免疫優先抗原の排
除または免疫応答を阻害する遺伝子の排除により）；（ｖｉ）免疫応答を惹起す
るために使用するプラスミドの引続く産生のため最も有効な抗原の組み合わせを
同定すること；および（ｖｉｉ）抗原プロセシングおよび細胞内感染のクリアラ
ンスに通常含まれる抗原提示経路を誘発することが挙げられるが、これらに限定
されない。

【００５４】（抗原）本明細書中で記載される方法は、広範で多様な細胞、組織およびヒトの病原体
または動物の病原体に対して免疫応答を惹起することにおいて有用である。これ
らの病原体は、１以上の抗原を含む。コスミドまたはプラスミドライブラリーの
ためのＤＮＡゲノム供給源の例としてウイルス、細菌細胞、真菌細胞、および他
の病原性生物が挙げられるが、限定ではない。

【００５５】適切なウイルス抗原として、肝炎ウイルスファミリー（Ａ型肝炎ウイルス（Ｈ
ＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、δ型肝炎
ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（Ｈ
ＧＶ）を含む）から得られるかまたはこれらに由来するウイルスが挙げられるが
、これらに限定されない。例えば、国際公開番号ＷＯ８９／０４６６９；同ＷＯ
９０／１１０８９；および同ＷＯ９０／１４４３６を参照のこと。ＨＣＶゲノム
はいくつかのウイルスタンパク質（Ｅ１およびＥ２を含む）をコードする。例え
ば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら（１９９１）、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ１４：３８１〜３
８８を参照のこと。これらのタンパク質をコードする配列を含むゲノムフラグメ
ントおよびこれらの抗原フラグメントは、本方法における使用が見出される。同
様に、ＨＤＶ由来のδ抗原に対するコード配列が公知である（例えば、米国特許
第５，３７８，８１４号を参照のこと）。

【００５６】同様の様式において、ヘルペスウイルスファミリー由来の広範で多様なタンパ
ク質は、本発明において抗原として使用され得る。このようなタンパク質として
、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型（例えば、ＨＳＶ−１および
ＨＳＶ−２の糖タンパク質ｇＢ、ｇＤおよびｇＨ）由来のタンパク質；水痘−帯
状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）およびサイ
トメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶｇＢおよびＣＭＶｇＨを含む）由来の抗原
；およびＨＨＶ６およびＨＨＶ７のような他のヒトヘルペスウイルス由来の抗原
が挙げられる（例えば、Ｃｈｅｅら（１９９０）、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒ
ｕｓｅｓ（Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、
１２５〜１６９頁）；ＭｃＧｅｏｃｈら（１９８８）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ
．６９：１５３１〜１５７４；米国特許第５，１７１，５６８号；Ｂａｅｒら（
１９８４）Ｎａｔｕｒｅ３１０：２０７〜２１１；およびＤａｖｉｓｏｎら（１
９８６）、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７：１７５９〜１８１６）。

【００５７】種々のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ゲノムサブタイプを含むＨＩＶ抗原（
例えば、多数のＨＩＶ−１単離体およびＨＩＶ−２単離体）が公知でありかつ報
告されており（例えば、Ｍｙｅｒｓら、ＬｏｓＡｌａｍｏｓＤａｔａｂａｓ
ｅ、ＬｏｓＡｌａｍｏｓＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｏｓ
Ａｌａｍｏｓ、ＮｅｗＭｅｘｉｃｏ（１９９２）；およびＭｏｄｒｏｗら（
１９８７）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：５７０〜５７８を参照のこと）、そしてこ
れらの単離体のいずれかに由来するかまたはこれらの単離体のいずれかから得ら
れるゲノムフラグメントを含む抗原は、本発明おける使用が見出される。さらに
、種々のＨＩＶ単離体のいずれかに由来するかまたはこれらの単離体のいずれか
から得られる他の免疫原性タンパク質は、本明細書中における使用を見出され、
これらは1以上の種々のエンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１６０およびｇ
ｐ４１）、ｇａｇ抗原（例えば、ｐ２４ｇａｇ、ｐ５５ｇａｇ）、ならびにｐｏ
ｌ，ｅｎｖ，ｔａｔ，ｖｉｆ，ｒｅｖ，ｎｅｆ，ｖｐｒ，ｖｐｕおよびＨＩＶの
ＬＴＲ領域由来のタンパク質を含む。

【００５８】他のウイルスに由来するまたは他のウイルスから得られる抗原もまた、本明細
書中での使用が見出され、このような抗原として、例えば、以下に挙げられる科
のメンバー由来の抗原が挙げられるが、限定ではない。ピコルナウイルス科（例
えば、ポリオウイルス、ライノウイルスなど）；カリチウイルス科；トガウイル
ス科（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；フラビウイルス科；コ
ロナウイルス科；レオウイルス科（例えば、ロタウイルスなど）；ビルナウイル
ス科；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、狂犬病ウ
イルスなど）；オルトミクソウイルス科（例えば、Ａ型、Ｂ型およびＣ型インフ
ルエンザウイルスなど）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えば、
流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウ
イルスなど）；ブンヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科（例え
ば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、
ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしても公知））。これらに含まれる抗原として、単離体
ＨＩＶ_IIIb、ＨＩＶ_SF2、ＨＩＶ_LAV、ＨＩＶ_LAI、ＨＩＶ_MN；ＨＩＶ−１_CM235、
ＨＩＶ−１_US4；とりわけＨＩＶ−２；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）；乳頭
腫ウイルス属、ダニ媒介の脳炎ウイルス；など由来の抗原が挙げられるが限定で
はない。例えば、これらのウイルスおよび他のウイルスの記述に対して、Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ、第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎ
ｔａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎ
ｉｐｅ編、１９９１）を参照のこと。

【００５９】いくつかの状況において、代表的には、粘膜表面を介して身体に侵入し、ヒト
の疾患（例えば、ＨＩＶ（ＡＩＤＳ）、インフルエンザウイルス（Ｆｌｕ）、単
純ヘルペスウイルス（性感染、単純ヘルペス、ＳＴＤ）、ロタウイルス（下痢）
、パラインフルエンザウイルス（呼吸感染）、ポリオウイルス（灰白髄炎）、Ｒ
Ｓウイルス（呼吸感染）、麻疹ウイルスおよび流行性耳下腺炎ウイルス（麻疹、
流行性耳下腺炎）、風疹ウイルス（風疹）、およびライノウイルス（普通感冒）
が挙げられるが、これらに限定されない）を引き起こすかまたはヒトの疾患に関
係するとして公知のウイルス性病原体から得られるかもしくはこれらに由来する
選択されたウイルス性抗原が好まれ得る。

【００６０】細菌性抗原および寄生生物性抗原を含むゲノムフラグメントは、以下に挙げら
れる疾患（限定ではない）に対して応答性の公知の原因物質から得られるかまた
はこれらに由来し得る。ジフテリア、百日咳、破傷風、結核、細菌性肺炎もしく
は真菌性肺炎、中耳炎、淋病、コレラ、腸チフス、髄膜炎、単核細胞症、ペスト
、細菌性赤痢もしくはサルモネラ症、レジオネラ疾患（Ｌｅｇｉｏｎａｉｒｅ’
ｓＤｉｓｅａｓｅ）、ライム病、らい病、マラリア、鉤虫、オンコセルカ症、
住血吸虫症、トリパノソーマ症、リーシュマニア症（Ｌｅｓｍａｎｉａｓｉｓ）
、ジアルジア属、アメーバ症、フィラリア症、ボレリア属（Ｂｏｒｅｌｉａ）、
および旋毛虫症。なおさらなる抗原は、従来にはないウイルス（例えば、クール
ー、クロイツフェルト−ヤーコプ病（ＣＪＤ）、スクラピー、ミンクの伝染性脳
症および慢性消耗病の原因因子）、あるいは狂牛病に関連するプリオンのような
タンパク質様感染粒子から得られるか，またはそれらに由来し得る。

【００６１】特定の病原体としてＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｎ
．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｖｉｂ
ｒｉｏＣｈｏｌｅｒａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａｐａｌｌｉｄｕａ、Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ
、Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａｔｕｌｏｒｅｎｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅ
ｒｐｙｌｏｒｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｒｉａｉｎｔｅｒｒｏｇａｕｓ、Ｌｅｇｉ
ｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓ、Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ａ型およびＢ型）、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍ
ｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａ（ｂ型
）、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｇｏｎｄｉｃ、Ｃｏｍｐｌｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｏ
ｓｉｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｄｏｎｏｃａｎｏｓｉ
ｓ、およびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｏｓｉｓ；カンジダ症およびアスペルギルス症を
含む真菌性病原体；テニア属、吸虫類、回虫、アメーバ症、ジアルジア症、クリ
プトスポリジウム属、住血吸虫属、ニューモシスティス、トリコモナス症および
旋毛虫症を含む寄生性病原体が挙げられ得る。従って、本発明はまた、多数の獣
医学の疾患（例えば、手足口病、コロナウイルス属、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ
ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓｖｕ
ｌｇａｒｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａ、ウシのウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ
、ＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓおよびＢｏｒｄｅｔｅｌ
ｌａｂｒｏｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）に対する適切な免疫応答を提供するために
使用され得る。

【００６２】（アジュバンド）いくつかの実施形態において、本発明は適切なアジュバンドまたはアジュバン
ドの組み合わせで効率的に使用され得る。例えば、適切なアジュバントとしては
、限定はしないが、以下が挙げられる。水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウ
ム、硫酸アルミニウムなどのようなアルミニウム塩（ミョウバン）から形成され
るアジュバント；完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイン
トアジュバント（ＩＦＡ）のような水中油および油中水の乳濁液処方物；リポ多
糖（例えば、リピドＡまたはモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）（Ｉｍｏｔｏら
（１９８５）Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２６：１５４５−１５４８）、トレハロースジ
ミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ））を含む細菌細胞壁成分か
ら形成されるアジュバント；熱ショックタンパク質またはこれらの誘導体；ＡＤ
Ｐ−リボシル化細菌毒素（ジフテリア毒素（ＤＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、コレ
ラ毒素（ＣＴ）、Ｅ．ｃｏｌｉ非耐熱性毒素（ＬＴ１およびＬＴ２）、Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓエンドトキシンＡ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシンＳ、
Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ細胞外酵素、Ｂ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ毒素、Ｃ．ｌｉｍｏｓ
ｕｍ細胞外酵素、Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍＣ２およびＣ３毒素、ならびにＣ．
ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃ．ｓｐｉｒｉｆｏｒｍａ、およびＣ．ｄｉｆｆｉｃ
ｉｌｅ由来の毒素、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＥＤＩＮ、お
よびＣＲＭ₁₉₇のようなＡＤＰ−リボシル化細菌毒素変異体、非毒素ジフテリア
毒素変異体（例えば、Ｂｉｘｌｅｒら（１９８９）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂ
ｉｏｌ．２５１：１７５；およびＣｏｎｓｔａｎｔｉｎｏら（１９９２）Ｖａｃ
ｃｉｎｅを参照のこと）；ＱｕｉｌＡ（米国特許第５，０５７，５４０号）の
ようなサポニンアジュバント、またはＩＳＣＯＭ（免疫賦活複合体）のようなサ
ポニンから生成された粒子；インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、
ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２など）、イン
ターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因
子（Ｍ‐ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ディフェンシン１または２、ＲＡ
ＮＴＥＳ、ＭＩＰ１−αおよびＭＩＰ−２などのようなケモカインおよびサイト
カイン；Ｎ‐アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈ
ｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−^L−アラニル−^D−イソグルタミン
（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−^L−アラニル−^D−イソグルタミニ
ル−^L−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３
ヒドロキシホスホリロキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などのようなムラ
ミルペプチド；ＣｐＧ分子ファミリー、ＣｐＧジヌクレオチドおよびＣｐＧモチ
ーフ（例えば、ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ（配列番号１）およ
びＡＴＣＧＡＣＴＣＴＣＧＡＧＣＧＴＴＣＴＣ（配列番号２））を含む合成オリ
ゴヌクレオチド（例えば、Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９５）３７４：５
４６およびＤａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）１６０：８７０〜
８７６を参照のこと）由来のアジュバンド；およびＰＣＰＰ（ポリ［ジ（カルボ
キシルアトフェノキシ）ホスファゼン）（Ｐａｙｎｅら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（１
９９８）１６：９２〜９８）のような合成アジュバント。このようなアジュバン
トは、多数の業者から市販されている（例えば、ＡｃｃｕｒａｔｅＣｈｅｍｉ
ｃａｌｓ；ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｅｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍ
Ｔ；ＧＩＢＣＯ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。

【００６３】このアジュバンドは個々に送達され得るかまたは２以上のアジュバンドの組み
合わせで送達され得る。この点に関して、組み合わされたアジュバンドは、免疫
応答を促進することにおいて相加的または相乗的効果を有し得る。相乗的効果は
、２以上のアジュバンドを組み合わせることによって達成される結果が、個々に
投与された場合に各アジュバンドを用いて達成された結果を単に加えることによ
り期待される結果よりその効果が大きいことである。

【００６４】（ゲノムライブラリーの調製）ゲノムライブラリーは当該分野で公知の任意の方法により生成され得る。ゲノ
ムＤＮＡに対して種々の供給源が使用され得る。ゲノムＤＮＡは、例えば、Ａｄ
ｖａｎｃｅｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ（ＡＢＩ）およびＣｌ
ｏｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．のような供給源から商業的に入手可能であり得る。別
の標準的な供給源は、もちろん生物（例えば、ウイルス、細菌、寄生生物または
他の病原体）、細胞（例えば、癌細胞）、または選択された組織から単離された
ゲノムＤＮＡである。あるいは、ＤＮＡは、当該分野で利用可能な技術によりＲ
ＮＡ（例えば、ＲＮＡウイルス）から調製され得る。ゲノムＤＮＡは、選択され
た供給源から標準的な手順により単離され得る。標準的な手順は、代表的には連
続的なフェノールおよびフェノール／クロロホルム抽出に続くエタノール沈殿を
含む。沈殿後、生物、細胞または目的の組織由来のＤＮＡは、制限エンドヌクレ
アーゼで処置され得る。このような制限エンドヌクレアーゼは、完全にＤＮＡを
消化するかまたは部分的にＤＮＡを消化するかのいずれかにより適切なフラグメ
ントを生成し得る。選択された大きさのＤＮＡフラグメントは多くの技術によっ
て分離され得る。このような方法として、アガロースまたはポリアクリルアミド
ゲル電気泳動またはパルスフィールドゲル電気泳動（Ｃａｒｌｅら（１９８４）
Ｎｕｃ．ＡｃｉｄＲｅｓ．１２：５６４７〜５６６４；Ｃｈｕら（１９８６）
Ｓｃｉｅｎｃｅ２３４；１５８２；Ｓｍｉｔｈら（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１５１：４６１）が挙げられ、クローニングのため
の適切な大きさの開始マテリアルを提供する。

【００６５】本明細書中で使用する核酸配列を得る別の方法は、組換え手段によるものであ
る。従って、所望の核酸配列は、標準的な分子生物学手順を使用して同じ配列を
保有するベクターから切除され得る。部位特異的ＤＮＡ切断は、当該分野で一般
的に理解され得る条件（詳細は、市販されている制限酵素の製造者により指定さ
れる）下で適切な制限酵素を用いて処置することにより行われ得る。所望される
場合、切断されたフラグメントの大きさの選別が、標準的な技術を使用するポリ
アクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動により行われ得る。

【００６６】所望される場合、制限切断フラグメントは、標準的技術を使用して４つのデオ
キシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の存在下でＥ．ｃｏｌｉポリメ
ラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）の巨大フラグメントを用いて処置することにより平滑
末端化され得る。クレノウフラグメントは５’一本鎖突出末端を埋めるが、たと
え４つのｄＮＴＰが存在しても３’一本鎖突出末端は消化する。所望である場合
、選択されたｄＮＴＰの１つのみまたは選択されたｄＮＴＰのいくつかを供給す
ることによって天然の突出により決定された制限内で選択的な修復が行われ得る
。クレノウ処置後、混合物は、例えば、フェノール／クロロホルム、およびエタ
ノール沈殿で抽出され得る。Ｓ１ヌクレアーゼまたはＢＡＬ−３１を用いる適切
な条件下での処置は、任意の一本鎖部分の加水分解を生じる。

【００６７】一旦ゲノムフラグメントが調製または単離されると、このような配列は適切な
任意のベクターまたはレプリコンにクローン化され得る。多数のクローニングベ
クターが当業者に公知であり、適切なクローニングベクターの選択は、好みの問
題である。１つの好ましい実施形態において、ゲノムフラグメントがコスミドに
クローン化されコスミドライブラリーが作製される。コスミドクローニングベク
ターが使用される場合、フラグメントは巨大であり、好ましくは約２０，０００
ｂｐ（２０ｋｂ）〜５０，０００塩基対（５０ｋｂ）の間の大きさ（またはこれ
らの間の任意の整数）、好ましくは約２５ｋｂ〜５０ｋｂの間、より好ましくは
３０〜３５ｋｂ〜５０ｋｂの間、およびさらに好ましくは約３５ｋｂ〜５０ｋｂ
の間である。適切なコスミドベクターは、例えば、市販されているＳｕｐｅｒＣ
ｏｓ１ＣｏｓｍｉｄＶｅｃｔｏｒＫｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ
Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）である。コスミドへのＤＮＡのライゲーシ
ョンは、製造者により指導されたように行うかまたはこの明細書の教示の観点に
おける当該分野での公知の方法を使用して経験的に決定され得る。

【００６８】別の好ましい実施形態において、ゲノムフラグメントをプラスミドにクローニ
ングし、プラスミドライブラリーを作製する。プラスミドクローニングベクター
を使用する場合、フラグメントは、代表的には、約５，０００ｂｐ（５ｋｂ）と
２５，０００塩基対（２５ｋｂ）との間（または、その間の任意の整数）のサイ
ズであり、好ましくは、約１０ｋｂと２５ｋｂとの間、より好ましくは、約１０
〜１５ｋｂと２５ｋｂとの間、そしてさらにより好ましくは、約１５ｋｂと２０
ｋｂとの間である。適切なプラスミドベクターは、市販されている。プラスミド
へのＤＮＡの連結は、本明細書中の教示を考慮して、当該分野で周知の方法を使
用して実施される。

【００６９】上記のように、本発明の１つの利点は、その大きいゲノムフラグメントが、内
因性の転写および翻訳調節エレメントを含むことである。このような調節性の制
御配列としては、例えば、プロモーター（転写開始に関連する配列）、エンハン
サー（転写を増強するシス作用性配列）、および他のエレメント（化学的または
物理的刺激（調節化合物の存在を含む）に応答してコード配列の発現を開始また
は停止させるエレメントを含む）が挙げられる。従って、好ましい実施形態にお
いて、ベクターおよび／または挿入されるポリヌクレオチドの分子改変の数は、
最小化される。

【００７０】ベクター構築物内の選択されたヌクレオチド配列が、例えば、そのゲノムフラ
グメントが、細菌または他の原核生物由来であり、そして発現が、真核生物被験
体中で所望される場合に、異種調節配列（例えば、異種プロモーター）の制御下
に配置され得ることもまた、可能である。目的の特定のタンパク質をコードする
配列の改変は、この目的を達成するために所望され得る。例えば、いくつかの場
合において、その配列を制御配列に適切な方向で連結する（すなわち、読み枠を
維持する）ように、その配列を改変することが必要であり得る。制御配列および
他の調節配列は、ベクターへの挿入前に、そのコード配列に連結され得る。ある
いは、コード配列は、制御配列および適切な制限部位を既に含む発現ベクターに
、直接クローニングされ得る。

【００７１】（ポリヌクレオチドの投与）本明細書中に記載されるゲノムフラグメントおよび補助物質は、任意の適切な
方法によって投与され得る。好ましい実施形態（以下に記載される）において、
ポリヌクレオチドフラグメントを、それらのフラグメントを含む適切な構築物（
例えば、コスミドまたはプラスミド）は、コアキャリア粒子上にコートし、そし
て次いで、そのコート粒子を被験体または細胞に投与することによって、投与さ
れる。しかし、これらのゲノムフラグメントはまた、ウイルスベクターを使用し
てまたは非ウイルス系（例えば、裸の核酸送達）を使用しても送達され得る。

【００７２】（ウイルスベクター）多くのウイルスベースの系が、遺伝子送達のために使用されている。例えば、
レトロウイルス系が、公知であり、これは、一般に、組み込み欠損（ｉｎｔｅｇ
ｒａｔｅｄｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）プロウイルス（「ヘルパー」）を有するパッ
ケージング株を使用する。このプロウイルスは、そのウイルスの遺伝子の全てを
発現するが、パッケージングシグナル（ｐｓｉ配列として公知）の欠失に起因し
てそれ自身のゲノムをパッケージングし得ない。従って、この細胞株は、空のウ
イルスシェルを産生する。プロデューサー株は、パッケージング株から誘導され
得、この株は、ヘルパーに加えて、そのウイルスの複製およびパッケージングに
シスに必要とされる配列（長末端反復（ＬＴＲ）として公知）を含むウイルスベ
クターを含む。目的のゲノムフラグメントは、このベクターに挿入され得、そし
てこのレトロウイルスヘルパーによって合成されたウイルスシェルにパッケージ
ングされ得る。次いで、この組換えウイルスを、単離しそして被験体に送達し得
る（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号を参照のこと）。代表的なレトロ
ウイルスベクターとしては、ＬＨＬ、Ｎ２、ＬＮＳＡＬ、ＬＳＨＬおよびＬＨＬ
２ベクター（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号（これは、その全体が参
考として本明細書中に援用される）に記載される）のようなベクター、ならびに
、これらのベクターの誘導体（例えば、本明細書中に記載の改変型Ｎ２ベクター
）が挙げられるが、これらに限定されない。レトロウイルスベクターは、当該分
野で周知の技術を使用して構築され得る。例えば、米国特許第５，２１９，７４
０号；Ｍａｎｎら（１９８３）Ｃｅｌｌ３３：１５３−１５９を参照のこと。

【００７３】アデノウイルスベースの系は、遺伝子送達のために開発されており、そして本
明細書中に記載のゲノムフラグメントを送達するために適切である。ヒトアデノ
ウイルスは、二本鎖ＤＮＡウイルスであり、これは、レセプター媒介エンドサイ
トシスによって細胞に侵入する。これらのウイルスは、ゲノム移入に特に良好に
適切である。なぜなら、これらは、増殖および操作が容易であり、そしてインビ
ボおよびインビトロでの広範な宿主範囲を提示するからである。例えば、アデノ
ウイルスは、造血起源、リンパ起源および骨髄起源のヒト細胞を感染し得る。さ
らに、アデノウイルスは、静止状態ならびに複製中の標的細胞を感染する。宿主
ゲノムに組み込むレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは、染色体外に維
持され、従って、挿入性の変異に関連する危険性を最小化する。このウイルスは
、高力価で産生され、そして精製および保存され得るのに安定である。複製コン
ピテントな形態にあっても、アデノウイルスは、ほんの低レベルの罹患を生じる
のみであり、ヒトの悪性疾患に関連しない。従って、アデノウイルスベクターは
、これらの利点を使用して開発されてきた。アデノウイルスベクターおよびそれ
らの使用の説明については、例えば、Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ（
１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ
．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら（１９９４
）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら（
１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら（１９９４）Ｇ
ｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．（１９８
８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６１６−６２９；Ｒｉｃｈら（１９９３
）ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ４：４６１−４７６を参照のこと。

【００７４】アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）もまた、本明細書中に記載のいくらか
の小さいゲノムフラグメント（例えば、５ｋｂ）を投与するために使用され得る
。ＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶ血清型（限定されないが、ＡＡＶ−１、ＡＡ
Ｖ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶＸ７などが挙げられる）
から誘導され得る。ＡＡＶベクターは、全体または一部が欠失された１以上のＡ
ＡＶ野生型遺伝子（好ましくは、ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子）を有し得
るが、１以上の機能的な隣接する逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を保持し得る。
機能的ＩＴＲ配列は、一般に、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケ
ージングに必要であると考えられている。従って、ＡＡＶベクターは、少なくと
も、このウイルスの複製およびパッケージングのためにシスに必要な配列（例え
ば、機能的ＩＴＲ）を含む。ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はな
く、そしてその配列が、機能的なレスキュー、複製およびパッケージングを提供
する限り、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更され得る
。

【００７５】ＡＡＶ発現ベクターは、少なくとも、転写の方向にある作動可能に連結された
成分として、転写開始領域を含む制御エレメント、目的のＤＮＡおよび転写終結
領域を提供するように、公知技術を使用して構築される。制御エレメントは、哺
乳動物細胞において機能的であるように選択される。作動可能に連結された成分
を含む、この得られた構築物は、機能的ＡＡＶＩＴＲ配列に（５’側および３
’側で）結合される。適切なＡＡＶ構築物は、当該分野で周知の技術を使用して
設計され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９
，９４１号；国際公開番号ＷＯ９２／０１０７０（１９９２年１月２３日公開）
およびＷＯ９３／０３７６９（１９９３年３月４日公開）；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ
ら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｖ
ｉｎｃｅｎｔら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ９０（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．
（１９９２）ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎ
ｔＴｏｐｉｃｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌ．１５
８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）ＨｕｍａｎＧｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ（１
９９４）ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ１：１６５−１６９；およびＺｈｏｕら（
１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５を参照のこと。

【００７６】（従来の薬学的調製物）本発明のゲノムＤＮＡフラグメントを含む調製物の処方（アジュバント組成物
の添加を含むかまたは含まない）は、標準的な薬学的処方物の化学および方法（
これらの全ては、当業者に容易に利用可能である）を使用して行われ得る。例え
ば、１以上のゲノムフラグメント（例えば、プラスミドまたはコスミドに存在す
る）を含む組成物に、１以上の薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクルを合わ
せて、液体調製物を提供し得る。

【００７７】補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）が、賦形剤また
はビヒクル中に存在し得る。これらの賦形剤、ビヒクルおよび補助物質は、一般
に、組成物を受ける個体において免疫応答を誘導せず、かつ過度の毒性を伴わず
に投与され得る、薬学的薬剤である。薬学的に受容可能な賦形剤としては、水、
生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロールおよびエタ
ノールのような、液体が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に受容可
能な塩（例えば、鉱酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩な
ど）；ならびに有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安
息香酸塩など）が、これらに含まれ得る。必要ではないが、特に、ペプチド、タ
ンパク質または他の同様の分子について、それらがワクチン組成物に含まれる場
合に、安定化剤として作用する薬学的に受容可能な賦形剤を、その調製物が含む
こともまた、好ましい。これもまたペプチドについて安定化剤として作用する適
切なキャリアの例としては、限定はしないが、薬学的グレードのデキストロース
、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノ
シトール、デキストランなどが挙げられる。他の適切なキャリアとしては、これ
もまた限定はしないが、デンプン、セルロース、リン酸ナトリウムもしくはリン
酸カルシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高分子量ポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）およびこれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に受容可能な賦形剤
、ビヒクルおよび補助物質の徹底的考察は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’ＳＰＨＡＲ
ＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳＣＩＥＮＣＥＳ（ＭａｃｋＰｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ
．１９９１）（本明細書中に参考として援用される）にて入手可能である。

【００７８】核酸取込みおよび／または発現の特定の促進剤（「トランスフェクション促進
剤」）もまた、この組成物中に含まれ得、それは例えば、ブピバカイン、カルジ
オトキシンおよびスクロースのような促進剤、ならびに核酸分子を送達するため
に慣用的に使用されるリポソーム調製物もしくは脂質調製物のような、トランス
フェクション促進ビヒクルである。アニオン性リポソームおよび中性リポソーム
は、核酸分子を送達するために広く利用可能であり、かつ周知である（例えば、
Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（１９９０）
ＲＰＣＮｅｗＥｄ．、ＩＲＬＰｒｅｓｓを参照のこと）。カチオン性脂質
調製物もまた、核酸分子の送達における使用のための周知のビヒクルである。適
切な脂質調製物としては、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ
）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド）（商標名Ｌｉ
ｐｏｆｅｃｔｉｎ^TMの下で入手可能）およびＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイ
ルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）（例えば、Ｆｅｌｇｎｅ
ｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４
１３〜７４１６；Ｍａｌｏｎｅら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：６０７７〜６０８１；米国特許第５，２８３，１８５号
および同第５，５２７，９２８号および国際公開番号ＷＯ９０／１１０９２、Ｗ
Ｏ９１／１５５０１およびＷＯ９５／２６３５６を参照のこと）が挙げられ
る。これらのカチオン性脂質は、好ましくは、中性脂質（例えば、ＤＯＰＥ（ジ
オレイルホスファチジルエタノールアミン）と会合して使用され得る。上記脂質
調製物またはリポソーム調製物に添加し得るなおさらなるトランスフェクション
促進組成物としては、スペルミン誘導体（例えば、国際公開番号ＷＯ９３／１
８７５９）および膜透過性化化合物（例えば、ＧＡＬＡ、グラミシジンＳおよび
カチオン性胆汁酸塩（例えば、国際公開番号ＷＯ９３／１９７６８を参照のこ
と））が挙げられる。

【００７９】あるいは、本発明の核酸分子は、粒子状キャリアにカプセル化されても、吸着
されても、または結合してもよい。適切な粒子状キャリアとしては、ポリメチル
メタクリレートポリマーに由来するキャリア、ならびにポリ（ラクチド）および
ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコシド）に由来するＰＬＧ微粒子が、挙げられる。
例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら（１９９３）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１０：３６２〜３
６８を参照のこと。他の粒子状の系およびポリマー（例えば、ポリリジン、ポリ
アルギニン、ポリオルニチン、スペルミン、スペルミジン、ならびにこれらの分
子の結合体のような、ポリマー）もまた使用され得る。

【００８０】従って、処方されたワクチン組成物は、代表的には、免疫学的応答をマウント
するに十分な量で、選択された病原体由来の少なくとも１つのゲノムフラグメン
トを含むポリヌクレオチド（例えば、プラスミドまたはコスミド）を含む。適切
な有効量は、当業者により容易に決定され得る。このような量は、慣用的試験を
介して決定され得る比較的広範な範囲内にある。例えば、免疫応答は、１μｇ程
度の少なさのＤＮＡを使用して得られているが、一方他の投与は、２ｍｇまでの
ＤＮＡが使用されいる。ゲノムフラグメントを含むポリヌクレオチドの有効用量
は約１０μｇ〜１０００μｇの範囲内にあるが、この範囲を超える用量およびこ
の範囲より下の用量もまた、有効であることが見出され得ることが、一般的に予
期される。従って、この組成物は、約０．１％〜約９９．９％のポリヌクレオチ
ド分子を含み得る。

【００８１】（従来の薬学的調製物の投与）上記の薬学的調製物の投与は、処置の過程の間中、連続的または断続的に、一
用量で効果を及ぼし得る。送達は、最も典型的に、液体組成物のためおよび粒子
状組成物を含む液体懸濁液のために従来の針およびシリンジを介する。さらに、
種々の液体ジェット注入器が、当該分野において公知であり、そして本組成物を
投与するために利用され得る。最も有効な投与の手段および用量を決定する方法
は、当該分野において周知であり、そして送達ビヒクル、治療の組成物、標的細
胞および処置されている被験体によって変化する。一回または複数回の投与は、
主治医によって選択されている用量レベルおよびパターンによって実施され得る
。１より多いゲノムフラグメントが、送達されるポリヌクレオチドベクター構築
物によって運ばれ得ることが理解されるべきである。あるいは、別のベクター（
例えば、コスミドまたはプラスミド）（それぞれ、任意の病原体由来の１以上の
抗原を発現する）はまた、本明細書中に記載されるように、被験体に送達され得
る。

【００８２】さらに、本発明の方法によって送達されたポリヌクレオチドは、他の適切な組
成物または治療と組み合わされることも意図される。例えば、被験体における免
疫応答を増強するために、本明細書中に記載される組成物および方法は、薬理学
的因子、サイトカインなどのような補助物質（例えば、アジュバント）をさらに
含み得る。補助物質は、例えば、本明細書中に記載されるＤＮＡワクチン（例え
ば、コスミドまたはプラスミド）の投与時に、投与前に、または投与に続いて、
タンパク質または他の高分子として投与され得る。核酸分子組成物はまた、当業
者に公知の方法を用いて、被験体に直接投与され得るか、あるいは、被験体由来
の細胞へエキソビボで送達され得る。

【００８３】（コートされた粒子）１つの実施形態において、ゲノムフラグメントを含む構築物（例えば、プラス
ミドまたはコスミド）、および他の補助成分（例えば、アジュバント）は、キャ
リア粒子を用いて送達される。このような核酸調製物を投与するための粒子媒介
送達方法は、当該分野において公知である。従って、一旦、調製され、そして安
定に精製されると、上記のプラスミドおよびコスミド構築物は、当該分野におい
て公知の種々の技術を用いて、キャリア粒子（例えば、コアキャリア）上にコー
トされ得る。キャリア粒子は、適切な粒子送達デバイスからの細胞内送達のため
に典型的に使用される粒子サイズの範囲で適切な密度を有する材料から選択され
る。最適なキャリア粒子のサイズは、もちろん、標的細胞の直径に依存する。

【００８４】本発明の目的のために、タングステン、金、白金およびイリジウムコアキャリ
ア粒子が使用され得る。タングステンおよび金粒子が好ましい。タングステン粒
子は、直径が０．５〜２．０μｍの平均サイズにおいて容易に入手可能である。
このような粒子は、粒子送達方法における利用のために最適な密度を有し、そし
てＤＮＡによる高度に有効なコーティングを可能とするが、タングステンは、特
定の細胞型に対して潜在的に有毒であり得る。従って、金粒子または微晶質の金
（例えば、金パウダーＡ１５７０（これは、ＥｎｇｅｌｈａｒｄＣｏｒｐ．、
ＥａｓｔＮｅｗａｒｋ、ＮＪから入手可能））はまた、本方法による使用を見
い出す。金粒子は、サイズの均一性（１〜３μｍの粒子サイズがＡｌｐｈａＣ
ｈｅｍｉｃａｌｓから入手可能、または０．９５μｍを含む範囲の粒子サイズが
Ｄｅｇｕｓｓａ、ＳｏｕｔｈＰｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪから入手可能）、お
よび減少した毒性を提供する。

【００８５】多くの方法が公知であり、そして金またはタングステン粒子状にＤＮＡまたは
ＲＮＡをコーティングまたは沈殿させるために記載された。このような方法のほ
とんどは、通常、前もって決められた量の金またはタングステンとプラスミドＤ
ＮＡ、ＣａＣｌ₂およびスペルミジンを組み合わせる。得られた溶液は、反応混
合物の均一性を保証するために、コーティング手順の間、頻繁にボルテックスさ
れる。核酸の沈殿後、コートされた粒子は、適切な膜へと移され得、そして使用
前に乾燥させられ、サンプルモジュールまたはカセットの表面上へコートされ、
あるいは適切な粒子送達デバイスにおける使用のための送達カセットへと充填さ
れ得る。

【００８６】ペプチドアジュバント（例えば、サイトカインおよび細菌毒素）はまた、同じ
かまたは類似したコアキャリア粒子上にコートされ得る。例えば、ペプチドは、
経験的に決定された割合で２つの成分を単に混合することによるか、硫酸アンモ
ニウム沈殿または当業者に知られた他の溶媒沈殿方法によってか、あるいはキャ
リア粒子へのペプチドの化学結合によって、キャリア粒子に付着され得る。Ｌ−
システイン残基の金への結合は、以前に記載された（Ｂｒｏｗｎら、Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌＳｏｃｉｅｔｙＲｅｖｉｅｗｓ９：２７１−３１１（１９８０））
。他の方法としては、例えば、無水エタノール、水、またはアルコール／水混合
物中にペプチドアジュバントを溶解させ、一定量のキャリア粒子をこの溶液に添
加し、次いで、ボルテックスする間に、空気または窒素ガス流の下でこの混合物
を乾燥させる方法が挙げられる。あるいは、アジュバントは、真空下での遠心分
離によってキャリア粒子上に乾燥させ得る。一旦乾燥すると、コートされた粒子
は、適切な溶媒（例えば、エチルアセテートまたはアセトン）中に再懸濁され、
そして実質的に均質な懸濁液を提供するために（例えば、超音波処理によって）
粉砕させ得る。次いで、アジュバントでコートされたコアキャリア粒子は、ゲノ
ムフラグメント構築物を有するコアキャリア粒子と結合され得、そして一回の粒
子注入工程において投与され得るか、またはゲノムフラグメント組成物とは別々
に投与され得る。

【００８７】（コートされた粒子の投与）本発明の核酸調製物で（単独に、または例えば、アジュバント調整物と組み合
わせて）コートされたキャリア粒子は、これらの形成に続いて、粒子媒介送達技
術を用いて被験体に送達される。

【００８８】粒子媒介送達技術に適した種々の粒子送達デバイスは、当該分野において公知
であり、そして全て本発明の実施における使用に適している。現在のデバイス設
計は、標的細胞にコートされたコアキャリアを進ませるために、爆発性の電子ま
たはガス放電を利用する。コートされた粒子は、それら自身が移動可能なキャリ
アシートに放出可能に付着され得るか、またはガス流が通る表面に移動可能に付
着し、粒子を表面からから持ち上げ、そしてそれらを標的に向かって加速し得る
。ガス放電デバイスの例は、米国特許第５，２０４，２５３号に記載される。爆
発型のデバイスは、米国特許第４，９４５，０５０号に記載される。電子放電型
の粒子加速装置の一例は、米国特許第５，１２０，６５７号に記載される。本明
細書中での使用に適した別の電子放電装置は、米国特許第５，１４９，６５５号
に記載される。これらの特許の全ての開示は、本明細書中でその全体が参考とし
て援用される。

【００８９】コートされた粒子は、投与処方物に適合可能な形態で、そして所望の免疫応答
を引き起こすのに有効な量で、処置されるべき被験体に投与される。投与される
べき組成物の量（これは、核酸分子の場合は、通常、用量あたり０．００１〜１
００．０μｇ、より典型的には、０．０１〜１０．０μｇの範囲の核酸分子であ
り、そしてペプチドまたはタンパク質分子の場合は、１μｇ〜５ｍｇ、より典型
的には、１〜５０μｇのペプチドである）は、処置されるべき被験体に依存する
。必要な正確な量は、免疫化される個体の年齢および通常の状態、選択される特
定のヌクレオチド配列またはペプチド、および他の因子に依存して変化する。適
切な有効量は、瞬時の仕様の読み取りに依存して、当業者によって容易に決定さ
れ得る。

【００９０】従って、本明細書中に記載されるゲノムフラグメントの有効量は、免疫化され
た被験体に適切な免疫応答を引き起こすのに十分であり、そして普通の治験によ
って決定され得る比較的幅広い範囲になる。好ましくは、コートされたコア粒子
は、処置される被験体に免疫応答（例えば、Ｔ細胞活性化）を引き起こすために
、適切なレシピエント細胞に送達される。

【００９１】（粒子状組成物）あるいは、本発明のゲノムフラグメント（例えば、ゲノムフラグメントを有す
るプラスミドまたはコスミド構築物）および１以上の選択されたアジュバントは
、粒子状素子得物として処方され得る。より具体的には、目的のゲノムフラグメ
ントを含む粒子の処方は、標準的な薬学的処方化学または方法論を用いて実施さ
れ得、これらは全てかなり熟練した当業者に容易に利用可能である。例えば、１
以上のベクター構築物および／またはアジュバントは、１以上の薬学的に受容可
能な賦形剤またはビヒクルと結合し得、ワクチン組成物を提供し得る。界面活性
剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質は、賦形剤またはビヒクル
に存在する。これらの賦形剤、ビヒクルおよび補助物質は、通常、それら自身は
、その組成物を受け取る個体に免疫応答を引き起こさず、そして過度の毒性なし
で投与され得る薬学的因子である。薬学的に受容可能な賦形剤としては、水、生
理的食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセリンおよびエタノ
ールのような液体が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に受容可能な
塩としては、その中に、例えば、無機酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リ
ン酸塩、硫酸塩など）；および有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、
マロン酸塩、安息香酸塩など）が含まれ得る。必要とされないが、また、核酸組
成物は、特に、ペプチド、タンパク質あるいは他の同様なアジュバントまたは補
助的材料のために、スタビライザーとして作用する薬学的に受容可能なキャリア
を含むことも好ましい。ペプチドのためのスタビライザーとしても作用する適切
なキャリアの例としては、限定なしに、以下が挙げられる：薬学的グレードのブ
ドウ糖、スクロース、ラクトース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストランなど。他の適切な
キャリアとしては、また限定なしに、以下が挙げられる：デンプン、セルロース
、リン酸ナトリウムまたはリン酸カルシウム、クエン酸、酒石酸、グリシン、高
分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびそれらの組合せ。薬学的に
受容可能な賦形剤、キャリア、スタビライザーおよび他の補助物質の徹底的な議
論は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮＳＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳＣＩＥＣＥＳ
（ＭａｃｋＰｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）において利用可能であり、こ
れは本明細書中で参考として援用される。

【００９２】処方された組成物は、上記のように免疫的応答を引き起こすのに十分な量の目
的のゲノムフラグメントを含む。適切な有効量は、当業者によって容易に決定さ
れ得る。このような量は、通常、目的の核酸構築物の約０．１μｇ〜２５ｍｇ以
上の範囲の比較的広い範囲にあり、そして特定の適切な量は、通常の治験によっ
て決定され得る。この組成物は、約０．１％〜約９９．９％の核酸分子を含み得
る。アジュバントが組成物に含まれる場合、または粒子状アジュバント組成物を
提供するための方法が使用される場合、アジュバントは、上記のような適切な量
で存在する。次いで、組成物は、標準的な技術（例えば、単純エバポレーション
（空気乾燥）、真空乾燥、スプレー乾燥、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅｄｒｙｉｎ
ｇ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））、スプレー凍結乾燥、スプ
レーコーティング、沈殿、超臨界流体粒子形成など）を用いて、粒子として調製
される。所望される場合、得られた粒子は、共有に係る国際公開番号ＷＯ９７／
４８４８５（これは本明細書中で参考として援用される）に記載される技術を用
いて密度を高められ得る。

【００９３】一回単位の用量または多用量の容器（これには、使用前に粒子がパッケージさ
れ得る）としては、適切な核酸構築物（例えば、プラスミドまたはコスミド）お
よび／あるいは（例えば、ワクチン組成物を提供するための）選択されたアジュ
バントを含む適切な量の粒子を同封する密閉してシールされた容器が挙げられ得
る。粒子状組成物は、無菌の処方物としてパッケージングされ得、次いで、密閉
してシールされた容器が本発明の方法における使用まで処方物を無菌に保つため
に設計され得る。所望される場合、容器は、粒子送達デバイスにおける直接の使
用のために適合され得る。このような容器は、カプセル、ホイルポーチ、袋（ｓ
ａｃｈｅｔ）カセットなどの形態をとり得る。適切な粒子送達デバイス（例えば
、無針シリンジ）は、本明細書中に記載される。

【００９４】粒子がパッケージングされる容器は、組成物を同定し、そして明らかな用量の
情報を提供するために、さらに標識され得る。さらに、容器は、政府の機関（例
えば、食品医薬品局）に規定された形式の警告で標識され得、ここで、この警告
は、ヒト投与のために容器の中に含まれる抗原、アジュバント（またはワクチン
組成物）の製造、使用あるいは販売の連邦法の下におけるこの機関による承認を
示す。

【００９５】次いで、粒子状の組成物（目的の１以上のフラグメント単独を含むか、または
選択されたアジュバントと組み合わせた）は、経皮送達技術を用いて投与され得
る。好ましくは、粒子状組成物は、パウダー注入方法を用いて、例えば、共有に
係る国際公開番号ＷＯ９４／２４２６３、ＷＯ９６／０４９７４、ＷＯ９６／１
２５１３およびＷＯ９６／２００２２（これらは全て、本明細書中で参考として
援用される）に記載されるシステムのような無針シリンジシステムから送達され
る。このような無針シリンジシステムからの粒子の送達は、典型的に、通常０．
１〜２５０μｍの範囲、好ましくは、約１０〜７０μｍの範囲のおおよそのサイ
ズを有する粒子で実施される。約２５０μｍより大きな粒子はまた、デバイスか
ら送達され得、これは、粒子のサイズが皮膚細胞に対して厄介な損傷を引き起こ
す点である上限を有する。送達される粒子が標的表面を貫通する実際の距離は、
粒子サイズ（例えば、球状の粒子ジオメトリーを粗く仮定する名目上の粒子直径
）、粒子密度、粒子が表面に衝突する初期速度、ならびに標的化された皮膚組織
の密度および力学的粘度に依存する。この点において、無針注入における使用の
ための最適な粒子密度は、通常、約０．１と２５ｇ／ｃｍ³の間、好ましくは約
０．９と１．５ｇ／ｃｍ³の間の範囲であり、そして注入粘度は、通常、約１０
０と３，０００ｍ／秒の間の範囲であるか、またはそれより大きい。適切なガス
圧によって、１０〜７０μｍの平均直径を有する粒子は、駆動しているガス流の
超音速に近づく速度でノズルを通って加速され得る。

【００９６】所望される場合、これらの無針シリンジシステムは、ゲノムフラグメントおよ
び／または選択されたアジュバントを含む粒子の適切な用量を含む前もって充填
された状態で提供され得る。充填されたシリンジは、密閉してシールされた容器
内にパッケージングされ得、この容器は、さらに上記のように標識され得る。

【００９７】従って、約１０〜約２５０μｍ、好ましくは約１０〜１５０μｍの範囲、そし
て最も好ましくは約２０〜約６０μｍのサイズ；および約０．１〜約２５ｇ／ｃ
ｍ³の範囲の粒子密度、ならびに約０．５〜約３．０ｇ／ｃｍ³、またはそれ以上
のバルク密度を有する核酸粒子を得るための方法が使用され得る。

【００９８】同様に、約０．１〜約２５０μｍ、好ましくは約０．１〜約１５０μｍの範囲
、そして最も好ましくは約２０〜約６０μｍのサイズ；約０．１〜約２５ｇ／ｃ
ｍ³の範囲の粒子密度、および好ましくは、約０．５〜約３．０ｇ／ｃｍ³、そし
て最も好ましくは約０．８〜約１．５ｇ／ｃｍ³のバルク密度を有する選択され
たアジュバントの粒子を得ることができる。

【００９９】（粒子状組成物の投与）粒子状組成物（例えば、パウダー）を、それらの形成に続いて、適切な経皮送
達技術を用いて、脊椎動物被験体の組織に経皮的に送達し得る。目的の物質を投
与するのに適した種々の粒子送達デバイスは、当該分野において公知であり、そ
して本発明の粒子における使用が見い出される。特に好ましい経皮粒子送達シス
テムは、制御された用量でインタクトな皮膚および組織へ、そしてそれらを通っ
て固体粒子を発射するために、無針シリンジを利用する。例えば、Ｂｅｌｌｈｏ
ｕｓｅらに対する米国特許第５，６３０，７９６号（これは、無針シリンジ（こ
れは、「ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ（登録商標）粒子送達デバイス」としても知られ
る）について記載する）。他の無針シリンジコンフィギュレーションは、当該分
野において公知であり、そして本明細書中に記載される。

【０１００】本明細書中に記載される治療的有効量の粉体化分子を含む組成物は、上記の粒
子送達デバイスによって任意の適切な標的組織へと送達され得る。例えば、組成
物は、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、軟
骨性骨（ｂｏｎｅｃａｒｔｉｌｇｅ）、膵臓、腎臓、膀胱、胃、腸管、精巣、
卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺および結合組織に送達され得る。核酸分子の
ために、送達は、好ましくは、最後まで分化した細胞へと送達され、そしてこれ
らの細胞においてこの分子は発現する；しかし、この分子はまた、未分化の細胞
または部分的に分化した細胞（例えば、血液の幹細胞または皮膚の繊維芽細胞）
へ送達され得る。

【０１０１】粉体化された組成物は、投与処方物と適合可能な形態で、そして予防的および
／または治療的に有効である量で、処置されるべき被験体に投与される。送達さ
れるべき組成物の量は、通常、０．５μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇの範囲の用
量あたりの核酸であるが、処置されるべき被験体に依存する。他の医薬品（例え
ば、生理学的に活性なペプチドおよびタンパク質）のための用量は、通常、約０
．１μｇ〜約２０ｍｇ、好ましくは、１０μｇ〜約３ｍｇの範囲である。必要な
正確な量は、処置されるべき個体の年齢および通常の状態、処置される状態の重
篤度、送達される特別の調製物、投与部位および他の因子に依存して変化する。
適切な有効量は、当業者によって容易に決定される。

【０１０２】従って、この粒子状化合物の「治療的有効量」は、疾患または状態の徴候の処
置または予防するのに十分であり、そして通常の治験を通して決定され得る比較
的幅広い範囲になる。

【０１０３】以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。実施例は、例示
的な目的のみのために提供され、そして本発明の範囲をいかなる形態でも限定す
ることを意図しない。

【０１０４】（実施例）使用された数値（例えば、量、温度など）に関して、正確さを保証するための
試みがなされたが、もちろん、いくらかの実験誤差および偏差を考慮するべきで
ある。

【０１０５】（実施例１：ＨＳＶ−２コスミドを用いる核酸免疫化）ＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡを含むＤＮＡワクチンコスミドを用いる核酸の免疫化
の特異性および有効性を評価するために、以下の研究を実施した。

【０１０６】（Ａ．コスミド調製）ＨＳＶ−２コスミド：ＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡを、ＨＳＶ−２株ＭＳ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５４Ｔ）
でＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１）を感染させ、そしてこの感染細胞
からゲノムＤＮＡを単離することによって得た。ＨＳＶ−２ゲノムのフラグメン
トを含むコスミドを、上記のように、制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａ
ｎｄＢｉｏｌａｂｓ）によってＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡを消化することによっ
て生成した。図１に示されるように、ＨＳＶゲノムをマッピングした。そしてＨ
ＳＶゲノムは、矢印で図中に示されるように、少なくとも１０のＥｃｏＲ１部位
を含む。消化されたＤＮＡを、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＳｕｐｅｒＣｏｓ
１ＣｏｓｍｉｄＶｅｃｔｏｒＫｉｔを用いて、製造者の指示に従って、コ
スミドに連結させた。まず、ポジティブコスミドを、精製したコスミドＤＮＡの
ＥｃｏＲＩ消化によって生成されたフラグメントのサイズから同定した。消化さ
れたＤＮＡを、１％アガロースゲル上に充填した（１５時間パルス場電気分解、
０．５×ＴＢＥ緩衝液中で、６Ｖ／ｃｍ、１２０°角、１４℃での実行時間）。
さらなる同定は、他の制限酵素によって作製した制限マップに基づいた。この予
備分析を使用して、図１に示されるＨＳＶ−２ゲノムに対するフラグメントの位
置を決定した。例えば、コスミド番号６８は、示される７番目から１０番目のＥ
ｃｏＲ１部位に伸びるＨＳＶ−２ゲノムのフラグメントを含み、一方、クローン
番号７４は、１番目から４番目の示されたＥｃｏＲ１部位を通って伸びるＨＳＶ
−２フラグメントを含む。

【０１０７】（Ｂ．コートされた微粒子の調製）コスミドＤＮＡを、Ｅｉｓｅｎｂｒａｕｍら（（１９９３）ＤＮＡＣｅｌｌＢｉｏｌ．１２：７９１−７９７）によって記載される技術を用いて、１〜３
μｍの金粒子（ＤｅｇｕｓｓａＣｏｒｐ．、ＳｏｕｔｈＰｌａｉｎｆｉｅｌ
ｄ、ＮＪ）上にコートした。簡潔にいうと、１３．２６ｍｇの１〜３ミクロンの
金パウダー（Ｄｅｇｕｓｓａ）および適切な量のコスミドＤＮＡ（金パウダー１
ｍｇ当たり２μｇ）を、０．０５Ｍのスペルミジン（Ｓｉｇｍａ）５００μｌ
を含む１．５ｍｌの遠心管に添加することによって、コスミドＤＮＡを金パウダ
ーに付着させた。コスミドＤＮＡおよび金を、ボルテックスする間に、１０％の
ＣａＣｌ₂（Ｆｕｊｉｓａｗａ）液滴５００μｌの添加によって共沈殿させ、
その後、沈殿物を数分間静置させた。金／ＤＮＡ沈殿物を、１５秒間のマイクロ
遠心分離（ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）における遠心分離によって濃縮し
、無水エタノール（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）中で３回洗浄し、そして適切な量のエタ
ノール（８．８４ｍｇ金パウダー／１ｍｌエタノール）およびポリビニルピロリ
ドン（ｐｙｒｒｉｌｏｄｉｎｅ）（ＰＶＰ）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ）（０．０５ｍ
ｇ／エタノール１ｍｌ）に再懸濁させた。次いで、懸濁液を、ガラスバイアルに
移し、これにキャップをして、そして２〜５秒間、ソニケーティング（ｓｏｎｉ
ｃａｔｉｎｇ）水浴に浸してクランプを溶解させた。次いで、このエタノール溶
液をＴｅｆｚｅｌ管材（ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ）へと注入し、そして遠心
力を用いて、金／ＤＮＡを管材の側面に付着させた。次いで、残りのエタノール
を、小さな制御された窒素ガス流を用いて放出した。次いで、この管を窒素ガス
流と共に１時間乾燥させ、そして次いで、０．５インチのカートリッジへと切り
分けた。このカートリッジを、使用まで防湿剤を用いて、きつくキャップしたガ
ラスシンチレーションバイアル中において、４℃で貯蔵した。

【０１０８】次いで、ＤＮＡコートされた金粒子を、ＭｃＣａｂｅに対する米国特許第５，
５８４，８０７号に記載されるように、Ｔｅｆｚｅｌ（登録商標）管材に充填し
、そして粒子送達デバイスにおいてカートリッジとして利用するために、この管
材を１，２７ｃｍの長さに切り分けた。ヘリウム−パルスＰｏｗｅｒＪｅｃｔ（
登録商標）ＸＲ粒子送達デバイスは、以前記載されており（米国特許第５，５８
４，８０７号を参照）、そしてこれを、ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔＶａｃｃｉｎｅ
ｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩから得た。ワクチン接種において、各１．２７ｃｍの
カートリッジは、通常、１μｇのＤＮＡでコートされた０．５ｍｇの金粒子を含
んだ。

【０１０９】（Ｃ．免疫化）Ｂａｌｂ／ｃマウスを、コスミドでコートされた単一鋳造の金ビーズを用いて
、粒子媒介送達によって免疫化した（約１μｇコスミド／１ｍｇ金、鋳造あたり
０．５ｍｇの送達される金）。動物を初回刺激後４週間目に、ブーストした。血
清をブースト時（４週間目）におよびその後２週間後（６週間目）に収集した。

【０１１０】６週間目のマウスの血清抗体レベルをＥＬＩＳＡを用いて検出した。簡潔に言
うと、ＨＳＶ−２抗原をＰＢＳ中に１０μｌ／ｍｌの濃度で調製した。約１μｇ
タンパク質／ウェルの濃度のために、ＨＳＶ−２抗原調製物１００マイクロリ
ットルを、９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）の各ウェルに添加した。このプ
レートを４℃で一晩インキュベートし、次いで、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０溶液で３回洗浄した。このプレートを、５％の粉乳と共にＰＢＳ／Ｔｗｅ
ｅｎで、室温で１時間ブロックした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中において１：１００
で、希薄なウサギ抗ＨＳＶ−２（コントロール）抗体またはマウス血清（未知）
を、適切なウェルに添加した。このプレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ
２０で３回洗浄した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ中のヤギ抗ウサギに結合したビオチ
ンの１；８０００期尺物を調製し、そして１００μｌを各ウェルに添加した。こ
のプレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄した。ストレプ
トアビジン−ＨＲＰの１：８０００希釈物を調製し、１００μｌを各ウェルに室
温で１時間のインキュベーションの間添加した。このプレートをＰＢＳ／０．０
５％Ｔｗｅｅｎ２０で６回洗浄した。ＴＭＢを使用直前に調製し、１００μ
ｌを各ウェルに添加し、そして室温で１５分間インキュベートした。反応を１Ｎ
のＮＨ₂ＳＯ₄ １００μｌの添加によって停止させ、そして光学密度の値を４５
０ｎｍで自動化プレートリーダー上で読んだ。１：１６０希釈物からの値を、個
体動物（各群あたり４匹）について平均化し、そしてコントロール群（エンプテ
ィ（ｅｍｐｔｙ）ベクターでワクチン接種された動物）の光学密度を減算した。
特定のコスミドの結果を図２に示す。バー上の数は、異なるコスミドクローンの
名前である。

【０１１１】（Ｄ．細胞性免疫応答）脾臓細胞増殖アッセイを、ＨＳＶ−２ゲノム由来のコスミドが細胞性免疫（Ｃ
ＭＩ）応答を惹起する能力をさらに評価するために行った。このアッセイは、Ｈ
ＳＶ−２抗原に反応して、インビトロで培養された脾臓由来のリンパ球が増殖す
る（すなわち、増殖および分裂し、次いで数を増やす）能力を測定する。増殖量
が多ければ、より高い刺激指数スコアによって評価されるので、抗原に対すｒ免
疫応答はより強い。

【０１１２】ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ｐＴａｒｇｅｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）へとクロ
ーン化されたＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡから増幅させたＨＳＶ−２ｇＤ−抗原Ｐ
ＣＲの発現に対する遺伝子を含むプラスミドか、またはＨＳＶ−２ゲノム由来の
コスミド（上記のように番号６８と命名された）のいずれかを用いて免疫化した
。ＰｏｗｄｅｒＪｅｃｔ（登録商標）ＸＲ粒子送達デバイスを使用して、プラス
ミド／コスミドＤＮＡコートされた金粒子を表皮へと送達することによってマウ
スをワクチン接種した。マウスをプライムおよび２回のブーストで（それぞれ４
週間離して与えた）免疫化した。各免疫化は、１μｇのＤＮＡ／０．５ｍｇ金を
送達する単一の注入剤からなっていた。これらのマウスに、タンパク質抽出物（
ＰＢＳ中の１００μｇ）も耳介に注入し、第３のブースト免疫化後１〜２週間目
に、これらのマウスの遅延型過敏性応答を起こす能力を評価した。これらの動物
の右耳および左耳に、ＨＳＶ−２感染した、またはＨＳＶ−２感染していない培
養ＶＥＲＯ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１）由来のタンパク質抽出物を、それ
ぞれ注入した。

【０１１３】タンパク質注入後３週間目に、２匹の非免疫ナイーブマウスと共に、各免疫化
群（図の凡例欄において、「ｇＤプラスミドおよびコスミド番号６８」と命名さ
れる）から２匹のマウスを屠殺した。これらの動物由来の脾臓細胞を単離し、そ
して純粋なｇＤタンパク質（０．１μｇ／ウェル）か、またはＨＳＶ−２感染し
たＶＥＲＯ細胞タンパク質抽出物（２５または１０μｇ／ウェル）のいずれかと
共に、あるいは添加される抗原なしでインビトロで培養した。培養の３日後に、
異なる脾臓細胞集団の抗原に惹起された増殖応答を、分裂細胞中へ取り込まれた
放射線標識されたチミジンの量によって測量した（シンチレーションカウンター
において、１分ごとの数として測定した）。刺激指数を、抗原刺激された脾臓細
胞内に取り込まれた放射能の量（すなわち、１分あたりの数（ｃｐｍ））を、そ
れらの抗原刺激されていない脾臓細胞部分のｃｐｍで除算することによって計算
した。図３において、抗原刺激された非免疫ナイーブ脾臓細胞の刺激指数を、免
疫化されたマウス由来の脾臓細胞の刺激指数から減算し、ｇＤ−抗原発現プラス
ミドによって惹起された抗原特異的細胞性免疫のレベルの、ＨＳＶ−２ゲノム由
来のコスミドによって惹起されたレベルと比較した、真の代表値を得た。

【０１１４】これらの結果は、明らかに、ＨＳＶ−２ゲノム由来のコスミド番号６８は、マ
ウスにおいて、ＨＳＶ−２抗原に対する強力なＣＭＩ応答を惹起し得ることを示
す。ｇＤタンパク質に対するＣＭＩ応答は、コスミド番号６８で免疫化したマウ
スから得られた脾臓細胞のＣＭＩ応答と比較して、ｇＤプラスミド免疫化された
マウスから得られた脾臓細胞に対してわずかにより高い。対照的に、ＨＳＶ−２
感染したＶＥＲＯ細胞（これは、ＨＳＶ−２抗原の多重配列を含む）由来のタン
パク質抽出物に対するＣＭＩ応答は、コスミド番号６８で免疫化されたマウスか
ら得られた脾臓細胞に対して、単一のｇＤ抗原発現プラスミドで免疫されたマウ
スから得られた脾臓細胞のＣＭＩ応答と比較して、有意により高かった。従って
、これらのデータは、より強力なＣＭＩ応答を引き起こすために、コスミドベー
スのＤＮＡワクチンの使用することの有用性を示す。

【０１１５】同様に、モルモット動物モデル系において、上記のＨＳＶ−２ゲノム由来のコ
スミドを用いて実験を行った。このコスミドもまた、これらの動物において、強
力なＣＭＩ応答を惹起した。免疫化されたモルモットにおける引き続いてのチャ
レンジ研究において、保護免疫が観察されなかったが、これらの結果は、決定的
ではないと考えられた。

【０１１６】（実施例２：ＨＳＶ−２プラスミドを用いた核酸免疫化）（Ａ．プラスミド構築物）ＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡを、ＨＳＶ−２株ＭＳ（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５４Ｔ）
でＶＥＲＯ細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１）を感染し、そして精製したウイル
ス粒子からゲノムＤＮＡを単離することによって得た。ゲノムＤＮＡを用いて、
ＰＣＲを行い、プラスミドベクターへのクローニングのためのセグメントを増幅
した。

【０１１７】プライマーｇＢ２（これは、以下の配列を有する：ＣＧＣＧＴＣＴＡＧ
ＡＡＡＣＧＴＴＣＧＣＧＡＣＣＡＣＧＧＧＴＧＡＣ（配列番号３
））およびプライマーｇＢ３（これは、以下の配列を有する：ＣＧＣＧＴＣ
ＴＡＧＡＴＧＡＴＧＧＧＧＴＣＣＣＧＣＴＡＡＣＴＣＧＣ（配
列番号４）（これらは、それぞれ、ＨＳＶ−２ゲノムの５８１６０および５２９
３０での配列に対応する）を用いて、ＰＣＲによって、約５２００ｂｐの産物を
増幅した。第２のＰＣＲ産物を、プライマーｇＢ２（配列番号３）およびプライ
マーｇＢ４（これは、以下の配列を有する：ＣＧＣＧＴＣＴＡＧＡＣＣ
ＴＴＣＡＴＧＡＣＣＧＣＧＣＴＧＧＴＣＣＴ（配列番号５））（こ
れらは、それぞれ、ＨＳＶ−２ゲノムの５８１６０および４９６７０での配列に
対応する）を用いて、生成した。これは、約８５００ｂｐの産物を産生した。両
方の産物は、糖タンパク質Ｂプロテインをコードするゲノム配列を含む。

【０１１８】ＰＣＲサイクルの仕様は以下のとおりであった：９８℃３０秒、７０℃１０分
、を３５サイクルについて。ＰＣＲ反応を、ＥｘｐａｎｄＬｏｎｇｔｅｍｐ
ａｔｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を
用いて実施した。反応条件は、各プライマー２０ｐモル、ＨＳＶ−２ゲノムＤ
ＮＡ１μｇ、１×緩衝液番号１（５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．２、１
．６ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１．７５ｍＭＭｇＣｌ₂）、２００μＭデオキ
シヌクレオチド（ｄＮＴＰ、Ｓｉｇｍａ）、１％ＤＭＳＯ、１０ｍＭＭｇＳ
Ｏ₄、５０μｌまでのＨ₂Ｏおよび１ＵのＥｘｐａｎｄＤＮＡポリメラーゼ）。
ＰＣＲ産物を、さらなる１００μＭｄＮＴＰの添加後に、１ＵＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に、この産物を７２℃で１０分間インキ
ュベートすることによって、「Ａテール化（Ａ−ｔａｉｌｅｄ）」した。ＰＣＲ
フラグメントをアガロースゲルから精製し、そしてｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙベク
ター系（Ｐｒｏｍｅｇａ）へ、製造者の指示を用いて、連結させた。ＴＯＰ１
０Ｅ．ｃｏｌｉコンピテント細菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、エレクトロポ
レーションによって連結混合物で形質転換し、そしてプラスミドを保持する細菌
をアンピシリンで調製した寒天プレート上で単離した。ＤＮＡミニプレッツを、
選択された細菌クローンの一晩の培養物から作製し、そして精製したプラスミド
を所望の挿入物について試験した。アガロースゲル上での移動度および適切な制
限パターンを使用して、ポジティブプラスミドを同定した。

【０１１９】（Ｂ．コートされた微粒子の調製）プラスミドＤＮＡを、Ｅｉｓｅｎｂｒａｕｍら（（１９９３）ＤＮＡＣｅｌ
ｌＢｉｏｌ．１２：７９１−７９７）によって記載された技術を用いて、１〜
３μｍの金粒子（ＤｅｇｕｓｓａＣｏｒｐ．、ＳｏｕｔｈＰｌａｉｎｆｉｅ
ｌｄ、ＮＪ）上にコートした。簡潔にいうと、プラスミドＤＮＡを金パウダーお
よび適切な量のプラスミドＤＮＡを、スペルミジンを含む遠心管に添加すること
によって、金粒子に付着させる。プラスミドＤＮＡおよび金を、ボルテックスの
間に、ＣａＣｌ₂（Ｆｕｊｉｓａｗａ）液滴の添加によって共沈殿させ、この後
、この沈殿物を数分間静置した。金／ＤＮＡ沈殿物をマイクロ遠心分離（ｍｉｃ
ｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）における遠心分離によって濃縮し、無水エタノール
中で３回洗浄し、そして適切な量のエタノールおよびポリビニルピロリドン（ｐ
ｙｒｒｉｌｏｄｉｎｅ）（ＰＶＰ）に再懸濁させた。次いで、懸濁液を、ガラス
バイアルに移し、これにキャップをして、そして２〜５秒間、ソニケーティング
（ｓｏｎｉｃａｔｉｎｇ）水浴に浸してクランプを溶解させた。次いで、このエ
タノール溶液をＴｅｆｚｅｌ（登録商標）管材（ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ）
へと注入し、そして遠心力を用いて、金／ＤＮＡを管材の側面に付着させた。次
いで、残りのエタノールを、小さな制御された窒素ガス流を用いて放出した。次
いで、この管を窒素ガス流と共に１時間乾燥させ、そして次いで、カートリッジ
へと切り分けた。このカートリッジを、使用まで防湿剤を用いて、きつくキャッ
プしたガラスシンチレーションバイアル中において、４℃で貯蔵した。

【０１２０】（Ｃ．免疫化）Ｃ５７／黒マウスを、プラスミドでコートされた単一鋳造の金ビーズ（約２μ
ｇプラスミド／ｍｇ金、鋳造あたり０．５ｍｇの送達される金）を用いて、粒子
媒介送達によって免疫化した。動物を初回刺激後４週間目にブーストする。血清
をブースト時（４週間目）に収集し、そして、その後２週間後（６週間目）にも
収集する。

【０１２１】６週間目のマウスの血清抗体レベルを、上記の実施例１に記載されるのと実質
的に同じＥＬＩＳＡを用いて検出する。脾臓細胞増殖アッセイもまた、ＨＳＶ−
２ゲノム由来のプラスミドが細胞性免疫（ＣＭＩ）応答を惹起する能力をさらに
評価するために行う。

【０１２２】従って、この研究は、免疫応答を惹起するためにプラスミドベースのＤＮＡワクチンを使用することの有用性を示す。

【０１２３】従って、免疫応答を惹起するための新規な組成物が、記載された。これらの組
成物を使用する方法もまた記載された。本発明の好ましい実施例は、いくらか詳
細に記載されたが、明らかなヴァリエーションが、添付される特許請求の範囲に
よって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ること
が理解される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明で使用される種々のＨＳＶ−２コスミドの略図である。番号は
、動物を免疫化するために使用されるコスミドクローンに対する命名を表す。各
々のコスミドは、ＨＳＶ−２由来の約３０，０００〜４０，０００塩基対のＤＮ
Ａを含む。

【図２】ＨＳＶ−２コスミドで免疫化したマウスの血清抗体レベルを示す。

【図３】図３は、ＨＳＶ−２ｇＤプラスミドまたはＨＳＶ−２コスミドで免疫化した動
物における抗原特異的脾臓細胞増殖を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 31/12 31/12 31/22 31/22 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ロバーツ，リーケイ．アメリカ合衆国ウィスコンシン 53711，マディソン，サイエンスドライブ 585 (72)発明者パイン，レンドンジー．アメリカ合衆国ウィスコンシン 53711，マディソン，サイエンスドライブ 585 (72)発明者ブラウン，ラルフピー．アメリカ合衆国ウィスコンシン 53711，マディソン，サイエンスドライブ 585 Ｆターム(参考） 4C076 AA29 AA95 CC32 CC35 DD21 4C084 AA13 MA02 MA43 NA14 ZB332 ZB352 4C085 AA03 BA07 BA51 BA78 EE01 EE03 EE05 4C087 AA01 AA02 BC83 MA02 NA14 ZB33 ZB35

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】遺伝的構築物の使用であって、該構築物は、該構築物を脊椎
動物被験体に投与することによって該被験体に免疫応答を惹起するための医薬の
製造において、病原体由来の少なくとも５ｋｂのサイズのゲノムＤＮＡフラグメ
ントを保有し、ここで、該ゲノムＤＮＡフラグメントに含まれる配列によってコ
ードされる抗原が、免疫応答を惹起するために十分な量で発現される、使用。
【請求項２】前記ゲノムフラグメント内に含まれるコード配列の発現が、
異種プロモーターによって駆動されない、請求項１に記載の使用。
【請求項３】前記構築物が、５ｋｂ〜２５ｋｂのサイズの前記ゲノムフラ
グメントを保有するプラスミドである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】前記構築物が、少なくともの２５ｋｂのサイズの前記ゲノム
フラグメントを保有するコスミドである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】前記ゲノムＤＮＡフラグメントが、約３５ｋｂと約５０ｋｂ
の間のサイズである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】前記構築物が、２以上の病原体由来のゲノムフラグメントを
保有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】前記病原体が細菌である、請求項１〜６のいずれか１項に記
載の使用。
【請求項８】前記病原体がウイルスである、請求項１〜７のいずれか１項
に記載の使用。
【請求項９】前記ゲノムフラグメントが１より多いウイルス由来である、
請求項６に記載の使用。
【請求項１０】前記構築物が、経皮投与によって投与される、請求項１〜
９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】前記構築物が、コアキャリア上に提供される、請求項１０
に記載の使用。
【請求項１２】遺伝的構築物の使用であって、該遺伝的ゲノム構築物は、
脊椎動物被験体に免疫応答を惹起するための医薬の製造において、１以上の病原
体由来の抗原をコードする、少なくとも５ｋｂのサイズのゲノムＤＮＡフラグメ
ントを保有し、ここで、該遺伝的構築物は、コアキャリア上にコートされ、そし
て該コートされたコアキャリアは、経皮的な粒子媒介送達技術を用いて該被験体
に投与され、そしてさらに、該ゲノムフラグメントに存在するコード配列によっ
てコードされる抗原が、免疫応答を惹起するために十分な量で該被験体に発現さ
れる、使用。
【請求項１３】前記ゲノムフラグメント内に含まれるコード配列の発現が
、異種プロモーターによって駆動されない、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】前記構築物が、５ｋｂ〜２５ｋｂのサイズの前記ゲノムフ
ラグメントを含むプラスミドである、請求項１２または１３に記載の使用。
【請求項１５】前記構築物が、少なくともの２５ｋｂのサイズの前記ゲノ
ムフラグメントを保有するコスミドである、請求項１２または１３に記載の使用
。
【請求項１６】前記ゲノムＤＮＡフラグメントが、２以上の病原体由来で
ある、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】前記病原体がウイルスである、請求項１２〜１６のいずれ
か１項に記載の使用。
【請求項１８】前記ゲノムＤＮＡフラグメントが２以上のウイルス由来で
ある、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】前記病原体が細菌である、請求項１２〜１７のいずれか１
項に記載の使用。
【請求項２０】前記投与が、プライムおよびブースター投与を提供するた
めに繰り返される、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】前記コアキャリアが、約０．５μｍ〜約５μｍの平均直径
および前記被験体への送達を可能にするために十分な密度を有する、請求項１２
〜２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】前記コアキャリアが金属から構成される、請求項１２〜２
１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】前記金属が金である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】遺伝的構築物の使用であって、該構築物が、被験体に該構
築物を投与することによって、抗原性ポリペプチドをコードする配列を同定する
ため；および該抗原性ポリペプチドをコードする該構築物上で、該配列を同定す
るための組成物の製造において、１以上の病原体由来の、少なくとも５ｋｂのサ
イズのゲノムＤＮＡフラグメントを保有し、ここで、該ゲノムＤＮＡフラグメン
トは、該抗原性ポリペプチドについてのコード配列を含み、そして送達の際に、
該抗原性ポリペプチドが、免疫応答を惹起するために十分な量で発現される、使
用。
【請求項２５】前記ゲノムフラグメント内に含まれるコード配列の発現が
、異種プロモーターによって駆動されない、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】前記構築物が、５ｋｂ〜２５ｋｂのサイズの前記ゲノムフ
ラグメントを保有するプラスミドである、請求項２４または２５に記載の使用。
【請求項２７】前記構築物が、少なくとも２５ｋｂのサイズの前記ゲノム
フラグメントを保有するコスミドである、請求項２４または２５に記載の使用。
【請求項２８】前記抗原性ポリペプチドをコードする前記配列が１以上の
前記遺伝的構築物のフラグメントを投与し、そしてどのフラグメントが該抗原性
ポリペプチドをコードする該配列をフラグメントを含むのかを同定することによ
って同定される、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】前記抗原性ポリペプチドをコードする前記配列が、前記遺
伝的構築物を配列決定することによって同定される、請求項２４〜２７のいずれ
か１項に記載の使用。
【請求項３０】１以上の病原体由来のゲノムＤＮＡフラグメントを保有す
る１以上の構築物を含むワクチン組成物であって、該ゲノムフラグメントが、少
なくとも５ｋｂのサイズでありかつ少なくとも１つの抗原をコードする配列を含
む、ワクチン組成物。
【請求項３１】前記ゲノムフラグメント内に含まれるコード配列の発現が
、異種プロモーターによって駆動されない、請求項３０に記載のワクチン組成物
。
【請求項３２】単純ヘルペスウイルス−２（ＨＳＶ−２）由来のゲノムＤ
ＮＡフラグメントを保有する１以上の核酸構築物を含む、ワクチン組成物。
【請求項３３】前記ゲノムフラグメント内に含まれるコード配列の発現が
、異種プロモーターによって駆動されない、請求項３２に記載のワクチン組成物
。
【請求項３４】ＨＳＶ−２由来の前記ゲノムＤＮＡフラグメントが、図１
のＨＳＶ−２ゲノムマップに示される７番目から１０番目までのＥｃｏＲ１部位
に広がる配列に対して実質的に相同な配列を含む、請求項３２または３３に記載
のワクチン組成物。
【請求項３５】脊椎動物被験体に免疫応答を惹起するための方法であって
、該方法は、少なくとも５ｋｂのサイズのゲノムＤＮＡフラグメントを保有する
核酸構築物を投与する工程を包含し、ここで、該ゲノムフラグメントは、１以上
の病原体由来であるか、または１以上の病原体から得られており、そして該構築
物は、該ゲノムＤＮＡフラグメントに含まれる配列によってコードされる抗原に
対して免疫応答を惹起するために十分な量で、該被験体に投与される、方法。
【請求項３６】脊椎動物被験体に免疫応答を惹起するための方法であって
、該方法は、以下の工程：（ａ）１以上の病原体由来であるか、または１以上の病原体から得られたゲノ
ムＤＮＡフラグメントを保有する構築物でコートされたコアキャリアを提供する
工程であって、ここで、該ゲノムフラグメントは、抗原をコードする配列を含み
かつ５ｋｂより大きなサイズである、工程；および（ｂ）粒子媒介経皮送達技術を用いて、該被験体に該コートされたコアキャリ
アを投与する工程であって、ここで、該ゲノムフラグメントに存在するコード配
列によってコードされる抗原は、免疫応答を惹起するために十分な量で、該被験
体に発現される、工程、を包含する、方法。
【請求項３７】抗原性ポリペプチドをコードする配列を同定する方法であ
って、ここで、該方法は、以下の工程：（ａ）少なくとも５ｋｂのサイズでありかつ１以上の病原体から得られたか、
または１以上の病原体由来であるゲノムＤＮＡフラグメントを保有する１以上の
構築物を投与する工程であって、ここで、該ゲノムフラグメントは、該抗原性ポ
リペプチドに対するコード配列を含み、そして、送達の際に、該抗原性ポリペプ
チドは、免疫応答を惹起するために十分な量で該コード配列から発現される、工
程；および（ｂ）該抗原性ポリペプチドをコードする該構築物上に該コード配列を同定す
る工程、を包含する、方法。
【請求項３８】前記ゲノムフラグメント内に含まれるコード配列の発現が
、異種プロモーターによって駆動されない、請求項３５〜３７のいずれか１項に
記載の方法。