JP2003521922A5

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Publication number: JP2003521922A5
Application number: JP2001558013A
Authority: JP
Filing date: 2001-01-31
Publication date: 2008-03-21
Anticipated expiration: 2021-01-31

Description

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）各々のタンパク質がＮ末端又はＣ末端の何れかにおいてマーカー部分によりタグ付加されたタンパク質をコードする複数のcDNA分子を提供すること；
（b）個々のタグ付加されたタンパク質を、空間的に分離されたフォーマットで発現させること；
（c）各々のタグ付加されたタンパク質を、単一のステップで、空間的に規定されたフォーマットで精製、固定して、タンパク質アレイを作成すること
を備えたタンパク質アレイを作成する方法。
【請求項２】
前記マーカー部分が、
（a）ヘキサヒスチジンタグ；
（b）完全なタンパク質又はタンパク質ドメイン；
（c）抗体のエピトープ；
（d）ビオチン類似物；および
（e）マルトース結合タンパク質ドメイン
からなる群より選択されるペプチド配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マーカー部分が、タグ付加されたタンパク質の精製を可能とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記アレイ中のタンパク質が、前記マーカー部分によって表面に固定化されている、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記マーカー部分が、翻訳後修飾されている、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記翻訳後修飾が、ビオチンまたは脂質分子の付加を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記タグ付加されたタンパク質が、正しく折り畳まれ、機能を維持している、請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記タグ付加されたタンパク質が、完全長である、請求項１〜７の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記マーカー部分が、前記タグ付加されたタンパク質の発現の確認を可能にする、請求項１〜８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記マーカー部分が、前記タグ付加されたタンパク質の折り畳みの確認を可能にする、請求項１〜９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
タグ付加されたタンパク質をコードする前記cDNA分子が、前記１以上のDNA分子に存在する開始コドンの直後または停止コドンの直前の何れかに、マーカー部分をコードする追加の公知のDNA配列を挿入することを含む、以下の工程を備えた方法により作成される、請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法：
（a）前記１以上のDNA分子から入れ子状態の欠失物のセットを作成する工程；
（b）入れ子状態の欠失物のセットに、オリゴヌクレオチドの第一または第二のセットをアニーリングし、ライゲートする工程；ここで、
（i）3つの可能な停止コドンの一または複数の配列または相補配列は、オリゴヌクレオチドの第一のセットの混合物の中に提示され、
（ii）3つの主要な開始コドンの一または複数の配列または相補配列は、オリゴヌクレオチドの第二のセットの混合物の中に提示され、
（c）オリゴヌクレオチドの第一または第二のセットに相補的になるように選択されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いたプライマー伸張反応により、ライゲート産物を特異的に増幅する工程。
【請求項１２】
請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法であって、１以上のテスト化合物を、前記タンパク質アレイと接触させる工程と、前記アレイ中の前記タンパク質への前記１以上の化合物の結合を測定し、これにより前記１以上の化合物を生物学的活性についてスクリーニングする工程とを更に備えた方法。
【請求項１３】
請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法であって、１以上のタンパク質、例えば、細胞表面受容体を、前記タンパク質アレイと接触させる工程と、前記１以上の特異的なタンパク質の、前記アレイの前記タンパク質との結合を測定し、これにより１以上のタンパク質を特異的なタンパク質−タンパク質相互作用についてスクリーニングする工程とを更に備えた方法。
【請求項１４】
請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法であって、１以上の核酸プローブを、前記タンパク質アレイと接触させる工程と、前記プローブの、前記アレイ中の前記タンパク質への結合を測定し、これにより１以上のタンパク質を特異的なタンパク質−核酸相互作用についてスクリーニングする工程とを更に備えた方法。
【請求項１５】
請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法であって、前記タンパク質アレイ中の１以上のタンパク質が抗体ライブラリー中の少なくとも１つの抗体に結合するように、前記タンパク質アレイを、抗体ライブラリーと接触させる工程と、結合していない全ての抗体を除去する工程と；前記タンパク質アレイ中のタンパク質に結合した抗体を固定化し、これにより抗体アレイを作成する工程とを更に備えた方法。
[Claims]
(1)
(A) that each of the proteins to provide a plurality of cDNA molecules encoding tagged proteins by Oite marker moiety to either the N-terminus or C-terminus;
(B) expressing the individual tagged proteins in a spatially separated format;
(C) purifying and immobilizing each tagged protein in a single step in a spatially defined format to produce a protein array, comprising: Method.
(2)
Wherein the marker portion is
(A) a hexahistidine tag;
(B) the complete protein or protein domain;
(C) an epitope of the antibody;
(D) a biotin analog; and
(E) Maltose binding protein domain
2. The method of claim 1, wherein the method is a peptide sequence selected from the group consisting of:
(3)
3. The method of claim 1 or 2, wherein the marker moiety allows for purification of the tagged protein.
(4)
The method according to any one of claims 1 to 3 , wherein the proteins in the array are immobilized on a surface by the marker portion .
(5)
The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the marker portion is post-translationally modified.
6.
6. The method of claim 5, wherein said post-translational modification comprises addition of biotin or a lipid molecule.
7.
The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the tagged protein is correctly folded and retains its function.
Claim 8.
The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the tagged protein is full length.
9.
9. The method according to any one of the preceding claims, wherein the marker moiety allows confirmation of the expression of the tagged protein.
10.
10. The method of any one of claims 1 to 9, wherein the marker portion allows for confirmation of folding of the tagged protein.
11.
The cDNA molecule encoding the tagged protein inserts an additional known DNA sequence encoding a marker moiety either immediately after the start codon or immediately before the stop codon present in the one or more DNA molecules. A method according to any one of the preceding claims, wherein the method is made by a method comprising the following steps:
(A) creating a set of nested deletions from the one or more DNA molecules;
(B) annealing and ligating a first or second set of oligonucleotides to a set of nested deletions;
(I) one or more sequences or complements of the three possible stop codons are presented in a mixture of the first set of oligonucleotides;
(Ii) one or more sequences or complementary sequences of the three major start codons are presented in a mixture of the second set of oligonucleotides;
(C) a step of specifically amplifying the ligated product by a primer extension reaction using an oligonucleotide primer selected to be complementary to the first or second set of oligonucleotides.
12.
11. The method according to any one of claims 1 to 10 , wherein contacting one or more test compounds with the protein array and binding the one or more compounds to the proteins in the array. measured, thereby further method and a step of screening said one or more compounds for biological activity.
Claim 13
The method according to any one of claims 1 to 10, wherein one or more proteins, for example, a cell surface receptor, is contacted with the protein array ; method further comprising the step of screening for protein interactions - the measured binding of the protein, thereby specific protein one or more proteins of the array.
14.
The method according to any one of claims 1 to 10, one or more nucleic acid probes, comprising the steps of contacting said protein array, the probe, and measuring binding to the proteins in the array , thereby specific protein one or more proteins - method further comprising the step of screening for nucleic acid interactions.
15.
The method according to any one of claims 1 to 10, as one or more proteins in the protein array bind to at least one of the antibodies in the antibody library, the protein arrays, antibody live how immobilized antibody bound to the proteins in the protein array, with which further a step of making antibodies array; a step of contacting the slurry, removing any unbound antibody.