JP2003520940A - Ｒｎａその他の生体分子の分子相互作用部位の修飾 - Google Patents

Ｒｎａその他の生体分子の分子相互作用部位の修飾

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Abstract

(57)【要約】 生体分子を阻害または刺激することのいずれかで修飾する化合物の同定法が提供される。核酸、特にＲＮＡはこのような修飾を受けやすい基質である。この方法は技術の新規な組合せを提供する点で特に強力であり、これは通常有機「低」分子化合物を生じさせ、それはＲＮＡその他の生体分子活性への強力な修飾剤である。本発明の好適実施例に従って、非常に多くの化合物がテストされ得て、本質的に同時に、その化合物が分子相互作用部位と相互反応しそうか、生物分子活性を修飾しそうか決定され得る。薬剤、動物用薬剤、農業用化学薬品、工業用化学薬品、研究用化学薬品その他多くの有用な化合物が本発明の態様に従って同定され得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【関連出願のクロス・リファレンス】
本発明は１９９８年５月１２日出願の米国出願番号０９／０７６，４０４の一
部継続で、１９９８年５月１２日出願の米国出願番号６０／０８５，０９２の優
先権を主張し、これらのそれぞれは関連による 併合である。
【０００２】
【本発明の分野】
本発明は、生体分子を阻害または刺激することのいずれかで修飾する化合物を
同定することに関する。核酸とくにＲＮＡはこのような修飾が行なわれる基質と
して好適で、このような基質のすべてが、このような修飾の「標的」になること
が証明されている。本発明の方法は、ＲＮＡおよびその他の生体分子の活性に対
して非常に強力な修飾作用がある、通常「低」分子の有機化合物である化合物を
つくりだす、新規な技術の組合せを提供する上で特に有効である。非常に多くの
化合物が、分子相互作用を起こす部位に反応しそうか、即ち、生体分子の作用を
修飾しそうかを決めるためにｉｎ ｓｉｌｉｃｏで試験される。薬剤、動物用薬
剤、農業用化学薬品、工業用化学薬品、研究用化学薬品およびその他多くの化合
物が本発明の態様に従って同定されるだろう。
【０００３】
【発明の背景】
ゲノム研究、分子生物学および構造生物学の最近の進歩は、細胞内でタンパク
質が発現するために必要な出来事の多くに、ＲＮＡがどのように関与し、制御し
ているかを明確にしてきた。単なる中間産物としての機能ではなく、ＲＮＡ分子
はＤＮＡからの転写、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡ分子のスプライスおよび編集、リ
ボゾーム内のペプタイド合成、新しく形成されたタンパク質の細胞膜への移動促
進、およびメッセージの翻訳速度の微調整といったことを活発に行なっている。
ＲＮＡ分子は、これらの機能を発揮するのに必要な枠組みを提供する、多くの独
自の構造上のモチーフを使うことができる。
【０００４】 特に構造化ＲＮＡ分子に結合する「低」分子の治療剤は、ポリマーではない有
機化合物の分子である。「低」分子治療剤には、最も強力な自然に存在する抗生
物質が含まれる。例えば、アミノグルコシドおよびマクセライド系抗生物質はリ
ボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）構造中の特定領域に結合して作用する「低」分子で
あり、タンパク合成に必要なＲＮＡ中のコンフォメーション変化をブロックする
ことにより作用すると考えられている。ＲＮＡ分子のコンフォメーションの変化
は、ｍＲＮＡ分子の転写と翻訳を調整することが明らかにされている。
【０００５】 別の組織で、細胞が同じタンパク質に翻訳される別のｍＲＮＡ分子を頻繁に作
り出す場合、薬剤発見のためにＲＮＡを標的とする機会は増加する。例えば、別
のスプライシングと別のポリアデニル化のプロセスは、特定の組織内に独自のま
たは豊富な転写を行なうことがある。その結果、腫瘍を含め、必要な組織の特有
なＲＮＡ部位に結合し、他の組織のタンパク発現に影響を与えないか、タンパク
発現への影響が軽度で、その結果、タンパクを標的にする治療で、一般的に達成
できない薬剤の特異性レベルを持つ薬剤を設計する機会が提供される。
【０００６】 ＲＮＡ分子または関連するＲＮＡ分子の基は、細胞によるタンパク合成を調節
するのに用いられる調節部位を持っていると、出願人は考えている。その細胞は
、タンパク質の合成されるタイミングと合成される量の両方を、ｍＲＮＡとの直
接、特定の相互作用により、調節すると考えられている。この考えは転写につい
て非常に注目されている遺伝子調節についての科学文献を読むことによって得ら
れる印象とは矛盾する。ＲＮＡの成熟、移動、細胞間局在および翻訳のプロセス
は、薬剤結合に好適な機会を提供するＲＮＡの認識部位で豊富に行なわれる。出
願人の発明は、ヒトゲノムのみならず、その他の動物ゲノムおよび原核ゲノム中
のＲＮＡ分子の、このような部位を発見しようとするものである。
【０００７】 コンビナトリアルケミストリーは、化学者の手段として最近加えられたもので
、多数の化学物質の合成を取り扱う化学の分野である。これは、一定の反応シー
ケンスにより決められるすべての組合せについて、少数の試薬と凝縮させること
により行なわれる。この化学分野の進歩には、実際のライブラリー化合物の合成
より規模の大きい合成の可能性を検討することを可能にした化学ソフトウェアお
よび高度なコンピュータのハードウエアの使用が含まれる。仮想ライブラリーの
概念が、関連する反応およびこれらの反応に影響を与える薬剤を含む組合せ合成
から理論的に出てくる候補となる構造のコレクションを示すのに用いられる。こ
の仮想ライブラリーの中から実際に合成される化合物が選択される。
【０００８】 Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＭＤＬ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）は、組合せ研究の努力を
支援するデスクトップ・ソフトウェア・システムだと言われている（Ｐｒａｃｔ
ｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，Ａ．Ｗ．Ｃｚａｒｎｉｋ 及び Ｓ．Ｈ．ＤｅＷｉｔｔ，ｅｄｓ．，１９９
７，ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。このソフトウェアはブロック
、個々の分子、完全なコンビナトリアルライブラリーおよび分子の混合物の表示
と検索のための情報管理モジュール、および混合物の追跡と散在した化合物ライ
ブラリーのコンピュータによるサポート用のモジュールが含まれていると言われ
ている。
【０００９】 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍａｎａｇｅｒ（Ｔｒｉｐｏｓ，
Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）は化合物ライブラリーの作成、選択および
管理のためのソルトウエア・モジュールの一式だと言われている（Ｐｒａｃｔｉ
ｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，Ａ．Ｗ．Ｃｚａｒｎｉｋ 及び Ｓ．Ｈ．ＤｅＷｉｔｔ，ｅｄｓ．，１９９７
，ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。ＬＥＧＩＯＮ ａｎｄ ＳＥＬ
ＥＣＴＯＲモジュールは、二次元および三次元構造の両方のフィンガー・プリン
ト、置換基パラメター、トポロジー的指標および物理化学的パラメターについて
のライブラリーを作り、分子を特徴付けるのに有用だと言われている。
【００１０】 Ａｆｆｅｒｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）は
データベース用の仮想分子を作り出すコンビナトリアルライブラリー用のソフト
ウェアを提供すると言われている。これは、実際に合成できるであろう前駆分子
を仮想的に反応させ、選択することによって行なわれると言われている（Ｗｉｌ
ｓｏｎ，Ｃ＆ＥＮ，Ａｐｒｉｌ ２７，１９９８，ｐ．３２）。 Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｌｉｂｒａｒｙ及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ Ｍａｎａｇｅｒだけが入手可能であるが、これらの製品は、生成された目的
とする化合物にフラグメントを導入するのに用いた反応剤を効率的に追跡する設
備が提供されていない。さらに、これらの製品は、複数の反応剤の使用により、
複数のフラグメントを導入して得られた化合物の混合物を追跡することができな
い。従って、個々の化合物やそれらの混合物の合成に用いられた化学反応あるい
は転換を追跡する方法のみならず、化合物の混合物を取り扱うことができる入手
可能な方法があることが望ましい。
【００１１】 コンビナトリアルケミストリーは、化学者の道具箱として最近加えられたもの
で、多数の化学物質の合成を扱う化学の分野を表している。この方法では、少数
の反応剤を、一定の反応順序で、示されたすべての組合せで凝縮させることによ
り行なわれる。この分野の化学の発展には、化学ソフトウェアという道具および
ライブラリーにある化合物を実際の合成よりも大きい規模で合成することを可能
にした、先進のコンピュータ・ハードウエアを使用することにより達成される。
「仮想ライブラリー」というコンセプトは、関心のある反応、およびそれらの反
応に影響を与える反応剤を含む組合せ合成により理論的に得られる構造の候補の
コレクションを指すのに用いられる。この仮想ライブラリーの中から、実際に合
成される化合物が選択される。
【００１２】 Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＭＤＬ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓ
ｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）は組合せ研究の努力をサ
ポートするソフトウェア・システムだと言われている（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇ
ｕｉｄｅ ｔｏ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ．Ｗ．
Ｃｚａｒｎｉｋ 及び Ｓ．Ｈ．ＤｅＷｉｔｔ，ｅｄｓ．，１９９７，ＡＣＳ，
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。このソフトウェアには、構成ブロック、個
々の化合物、完全なコンビナトリアルライブラリーおよび分子の混合物を、表示
および検索のための情報管理モジュール、および混合物および散在している化合
物のライブラリーを追跡するための、コンピュータによるサポートのためのその
他のモジュールが入っていると言われている。
【００１３】 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍａｎａｇｅｒ（Ｔｒｉｐｏｓ，
Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）は、化合物ライブラリーの生成、選択およ
び管理のためのソフトウェア・モジュールの一式だと言われている（Ｐｒａｃｔ
ｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，Ａ．Ｗ．Ｃｚａｒｎｉｋ 及び Ｓ．Ｈ．ＤｅＷｉｔｔ，ｅｄｓ．，１９９
７，ＡＣＳ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。Ｔｈｅ ＬＥＧＩＯＮ ａｎ
ｄ ＳＥＬＥＣＴＯＲモジュールは、二次元および三次元の両方の構造的フィン
ガー・プリント、置換基パラメター、トポロジー指標および物理化学的パラメタ
ーの観点からライブラリーを生成し、分子を特徴付けるのに有用と言われている
。
【００１４】 Ａｆｆｅｒｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）は
データベース用の仮想分子を生成するコンビナトリアルライブラリーを提供する
ためのソフトウェアだと言われている。これらのことは、仮想的な反応前駆物質
分子でおこない、実際に合成できる化合物を選択することができると言われてい
る（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃ＆ＥＮ，Ａｐｒｉｌ ２７，１９９８，ｐ．３２）。 Ｐｒｏｊｅｃｔ Ｌｉｂｒａｒｙ及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ Ｍａｎａｇｅｒだけが入手可能であるが、これらの製品は、生成された目的
とする化合物にフラグメントを導入するのに用いた反応剤を効率的に追跡する設
備が提供されていない。さらに、これらの製品は、複数の反応剤を用いて、複数
のフラグメントを導入して得られた化合物の混合物を追跡することができない。
従って、個々の化合物やそれらの混合物の合成に用いられた化学反応あるいは転
換を追跡する方法のみならず、化合物の混合物を取り扱うことができる入手可能
な方法があることが望ましい。
【００１５】 合成とスクリーニング用の化合物の選択は、どのような薬剤発見のプロセスで
も決定的なステップである。このことは、コンビナトリアルケミストリーを基に
する発見方法では特に重要で、合理的な時間の枠内で準備できるよりはるかに厖
大な数の化合物を考え付くことができる。計算機化学の方法では、スクリーニン
グするための化合物の最良の組合せを見付けるために使用される。スクリーン上
で、構造未知の巨大分子の標的に対して、生物学的活性を持ったものを見付けだ
す可能性を増加させるために、ライブラリーの化学薬品の「広がり」を最適化す
る一つの方法が用いられた。
【００１６】 核酸を標的とすることが、生物学的経路を阻害し、疾患治療のための有効な方
法であることが認められた。この点に関して、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およ
びリボ核酸（ＲＮＡ）の両方が、多くの治療法の目標になっている。オリゴマー
、オリゴヌクレオチドのような「低」分子が核酸と結合親和性をもつことが明ら
かになってきた。核酸の機能を妨害する非常に多くの実験が、標的核酸中の特定
塩基、塩基対および／または塩基の一次配列へのリガンドの特異な結合をへて行
なわれる。ある化合物がＤＮＡ小溝中のＡ−Ｔ塩基対へ優先的に結合し、対応す
るＲＮＡ（塩基）配列には殆ど結合しないような、核酸の一次および二次構造の
両方の特徴を認識して相互作用を生じる、複合特異性をもつことが証明された。
【００１７】 生物学的標的の三次元構造の知識の活用は、薬剤設計および薬剤発見の見地か
ら有用な手法である。このことは、多くの薬剤の設計および開発、および多くの
病態生理学的経路に関係するタンパク質を標的とする薬剤候補の設計および開発
で証明されている。タンパク質の三次元構造は、Ｘ線結晶学、分子モデリングお
よびＮＭＲのような技法により、広く決定されてきているが、核酸は困難な研究
対象である。Ｘ線結晶法により決定されたと言われるｔＲＮＡを含む生物学的活
性のあるＲＮＡの三次元構造については、文献でもほとんど報告されていない。
Ｑｕｉｇｌｅｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９７５，２，２
３２９；及び Ｍｏｒａｓら，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），１９８０，２８
８，６６９．適当な結晶生成が困難になったこと、およびＸ線法による核酸研究
に伴う困難が、生物学的に重要な小ＲＮＡの数の増加に伴い、新しい構造決定法
とこのような標的に対する新薬剤研究法のニーズを増大させてきている。
【００１８】 ＲＮＡの構造を予測する多くの方法が科学文献中で討論されている。本質的に
これらには、標的の一次配列と潜在的に折り畳まれた構造を示すことを第一歩と
して、ＲＮＡのような核酸の塩基配列およびゲノム分析が含まれる。第二段階と
して、塩基対のような構造上の制約の意義や架橋、生化学的および遺伝的な構造
−機能の研究から得られる情報に基づき塩基間の長いレンジの相互作用がでてく
る。この情報はモデリングとシミュレーションのソフトウェアを共に用いること
で、科学者はＲＮＡおよびＤＮＡの三次元モデルを予測することが可能になった
。これらのモデルはＸ線結晶構造のように強力ではないが、ある種の構造上の特
徴および構造と機能の関係を明らかにする上で有用である。
【００１９】 核酸の特異な形状モチーフの構造上の特徴、特に、ヘアピン、ループ、らせん
、二重らせんのような特徴を理解することは、分子的洞察を得る上で有用である
ことが分かった。例えば、二重らせんのステムおよび一本鎖ループを含むヘアピ
ンの形状モチーフは、核酸の最も簡単であるが非常に重要な構造要素だと考えら
れる。このようなヘアピン構造は核形成部位だと提案されており、ＲＮＡの三次
元構造の折畳みのための主要な構築ブロックとなっていると提案されている。Ｓ
ｈｅｎら，ＦＡＳＥＢ Ｊ．，１９９５，９，１０２３．ヘアピンにはまた、遺
伝子発現を調節するための多様なタンパク質と特異な相互作用が含まれている。
Ｆｅｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３４，１６５，Ｗｉｔｈｅｒｅｌｌら
，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９
９１，４０，１８５ 及び Ｐｈｉｌｌｉｐｅら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１
９９０，２１１，４１５．従って、核酸のヘアピン構造は制約分子動力学および
距離幾何学のような、ＮＭＲ、分子モデル技法（Ｃｈｅｏｎｇら，Ｎａｔｕｒｅ
，１９９０，３４６，６８０ 及び Ｃａｉｎら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．，１９９５，２３，２１５３）、Ｘ線結晶学（Ｖａｌｅｇａｒｄら，Ｎａｔｕ
ｒｅ，１９９４，３７１，６２３ 及び Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａら，Ｎ
ａｔｕｒｅ，１９８８，３３４，１７５）、および理論的方法（Ｔｕｎｇ，Ｂｉ
ｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊ．，１９９７，７２，８７６，Ｅｒｉｅら，Ｂｉｏｐｏ
ｌｙｍｅｒｓ，１９９３，３３，７５ 及び Ｒａｇｈｕｎａｔｈａｎら，Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１，３０，７８２）を用いて広く研究されてきた
。
【００２０】 核酸およびそれに伴う構造上の形状モチーフの潜在的三次元構造の決定は、Ｒ
ＮＡによる触媒作用の研究、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−核酸相互作用、
ＲＮＡ−タンパク質相互作用および核酸による低分子の認識といった分野を洞察
することを可能にした。ＲＮＡの代表的な三次元構造の発生について、一般的に
は、四つの解決方法が文献に説明されている。これらの総てがＲＮＡのような標
的である核酸内での折畳みと三次元の相互作用のシミュレーションのための精巧
な分子モデルとコンピュータを用いたアルゴリズムを使っている。Ｗｅｓｔｈｏ
ｆ 及び Ａｌｔｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９４
，９１，５１３３）は、会話形コンピュータ・モデリング・プロトコルにより、
Ｍ１ ＲＮＡ、Ｅ ｃｏｌｉからＲＮＡ分解酵素の触媒的ＲＮＡサブユニットの
三次元的作業モデルの生成について記載している。極低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏ
−ＥＭ）分野での重要な研究の本体部分をてこにして、リボゾームＲＮＡの生化
学的研究が、Ｍｕｅｌｌｅｒ 及び Ｂｒｉｍａｃｏｍｂｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１９９７，２７１，５２４）により行なわれ、Ｅ ｃｏｌｉ １６Ｓリボ
ゾームＲＮＡの三次元モデルがつくられた。核酸のヘアピンの形状モチーフをモ
デルにする方法は、核酸構造を描くための一組の換算座標軸を基にする方法と、
モンテカルロ法（ＭＣ）によるシミュレーションを用いて構造を平衡状態におく
、サンプリング・アルゴリズム法が開発された（Ｔｕｎｇ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ
ａｌ Ｊ．，１９９７，７２，８７６、関連による併合）。ＭＣ−ＳＹＭは制約
−満足法を用いたＲＮＡの三次元構造を予測する、もう一つの方法である。Ｍａ
ｊｏｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９３，９０，９４０
８．ＭＣ−ＳＹＭプログラムは、質問入力の制約を満足させる、すべてのモデル
に対して、コンフォメーション・スペースを探す、制約−満足をベースとするア
ルゴリズムであり、例えば、Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎら，ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒ
ｅ Ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，１９９８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，ｐ．３７−７５に記載されている。ＲＮＡの三次元
構造は、成長するオリゴヌクレオチドモデルに対して、一つまたはそれ以上、い
くつかのコンフォメーションを持つヌクレチオドを段階的に付加する方法で作ら
れた。
【００２１】 Ｗｅｓｔｈｏｆ 及び Ａｌｔｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，１９９４，９１，５１３３）は、会話形コンピュータ・モデリング・プロ
トコルにより、Ｍ１ ＲＮＡ、Ｅ ｃｏｌｉからＲＮＡ分解酵素の触媒的ＲＮＡ
サブユニットの三次元的作業モデルの生成について記載している。このモデリン
グ・プロトコルは、化学的および酵素の保護実験、系統分類分析、突然変異体の
活性研究および基質がＭ１ ＲＮＡへ結合することにより、触媒作用を受ける反
応の動力学からのデータを入れた。モデリングは大部分、文献記載の通りに機能
した。Ｗｅｓｔｈｏｆら，Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，Ｂｅｖｅｒｉｄｇｅ ａｎｄ Ｌａｖｅｒｙ（ｅｄｓ．），Ａｄｅｎｉｎｅ，ＮＹ，１９９０，３９９
．一般的に、Ｍ１ ＲＮＡの第一次配列から始まり、ステム−ループ構造および
二次構造のその他の要素が形成された。それに続くこれらの要素の三次元構造へ
の組み立ては、コンピュータ・グラフィック・ステーションとＦＲＯＤＯ（Ｊｏ
ｎｅｓ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．，１９７８，１１，２６８）
を用いて行なわれ、それに続いて、ＮＵＣＬＩＮ−ＮＵＣＬＳＱを用いた精密化
が、正確な形を持ち、不適切な接触がなく、適正な立体化学に合ったＲＮＡモデ
ルを与えることにより実施された。このようにして出来たモデルは、Ｍ１ ＲＮ
Ａの経験上の厖大なデータと矛盾せず、ＲＮＡ分解酵素Ｐの作用メカニズムにつ
いての仮説に対する扉を開いた。しかし、この方法で作られたモデルは、Ｘ線結
晶学により決められた構造に対しては、あまり解決にならなかった。 Ｍｕｅｌｌｅｒ 及び Ｂｒｉｍａｃｏｍｂｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１
９９７，２７１，５２４）はＥＲＮＡ−３Ｄというモデリング・プログラムを用
いて、Ｅ ｃｏｌｉ １６ＳリボゾームＲＮＡの三次元モデルを構築した。この
プログラムは、低解像力回折データから得られた電子密度に適合する一本鎖の動
的ドッキングを経て、Ａの形をしたＲＮＡらせんおよび一本鎖部位の三次元構造
を形成する。らせん要素が決定し、モデル内で位置が決まった後、一本鎖領域の
コンフィギュレーションは、ＲＮＡタンパク質架橋およびフートプリントのデー
タのような既知の生化学的制約を満足するように調整される。
【００２２】 核酸のヘアピンの形状モチーフをモデルにする方法は、核酸構造を描くための
換算座標軸のセットに基づくもの、およびモンテカルロ法（ＭＣ）によるシミュ
レーションを用いて構造を平衡にするサンプリング・アルゴリズムによる方法が
開発された。Ｔｕｎｇ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊ．，１９９７，７２，８７
６、関連による併合。核酸のステムはカノニカル二重鎖形成法を用いて、充分モ
デル化できる。一組の換算座標軸を用いて、一組の所定の端を持った一本鎖ルー
プの構造を形成することが可能なアルゴリズムが出来た。このことは、コンフォ
メーション・スペース内のループの効率的な構造的サンプリングにより可能にな
った。このアルゴリズムを変形メトロポリス・モンテカルロのアルゴリズムと組
合せて、コンピュータによる核酸のヘアピン構造の研究を単純化する構造シミュ
レーション・パッケージが提供された。
【００２３】 前述の技術の知識とその技術をマスターすることは、当業者にとっては技能の
一部となっていると推量される。当業界では、核酸、特にＲＮＡの重要な調節そ
の他の要素の三次元構造を決定する改良された方法が提供されることが、長い間
期待されていた。リガンドと潜在的リガンド、または核酸、特にＲＮＡとの間の
相互作用の本質について、新しい知識が得られることが非常に望まれている。本
発明は、これらの目的を満たそうとするものである。
【００２４】 薬剤発見のプロセスは、このプロセスにインパクトを与える多くの技術の急速
な進歩と進化により、非常に速いペースで変化している。薬剤の発見は、数十年
前までは実質的に、天然物質のランダム・スクリーニングに始まり、リガンド、
アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤のような潜在的生物活性剤として、多くの
合成分子が合理的で組合せ的に設計されたものを含むだけでなく、ポリペプタイ
ド、タンパク質または核酸といった生物学的標的の同定、およびメカニスティッ
クスや構造上の特徴までも含む科学的プロセスの検討が行なわれた。これらの薬
剤設計および構造的生物学の重要な分野は、疾患を理解し治療する上で極めて重
要である。しかしながら、特定の生物学的標的に高度の親和性をもつリガンドを
同定しあるいは開発しようとする場合、重要なハードルを乗り越えなければなら
ない。このようなハードルには、他の分子が結合したり会合したりしている標的
の構造を解明する課題をめぐる困難、新しくリードするためまたは現在のリード
を最適なものにするために選別する必要がある多くの化合物、活性度および結合
親和性に対応する構造上の特徴との関連で多くの化合物間の構造上の類似性およ
び非類似性を分ける必要があること、および少しの構造変化でも化合物の生物学
的活性に大きな影響を及ぼすことがあるという事実が含まれる。
【００２５】 従来、薬剤の発見とその最適化には、費用と時間がかかり、従って、少しずつ
構造が変わった一つ一つの化合物を合成し評価するという、ゆっくりしたプロセ
スで行なわれてきた。天然物を使用する場合には、抽出物の個々の成分の生物学
的評価の前に、純粋な化合物にするという骨が折れる綿密な分離を行なわなけれ
ばならない。更に、すべての化合物はｉｎ ｖｉｔｒｏのスクリーニングの前に
注意深く分析され特徴を把握する必要がある。このスクリーニングでは、一般的
に、候補にあがった化合物について、標的との結合親和性、リガンドの結合部位
に対する競合、阻害、細胞増殖、活性化、あるいはきっ抗性終点により決まる標
的の動態の評価が含まれる。薬剤の設計およびスクリーニングでは、これらの総
ての面を考慮しなければならないことが、薬剤発見のプロセスを遅いものにして
おり、これらの事項を減らし解決するための多くの方法が、薬剤発見に関わる人
々によって実行されてきた。
【００２６】 薬剤の発見プロセスを速くする一つの方法は、大きなコレクション、ライブラ
リーまたは化合物の配列を作り出すことである。この方法では、個々に合成して
テストしていた化合物の間での薬剤としてリードで選抜する方法から、厖大な化
合物のコレクションからスクリーニングすることになった。これらのコレクショ
ンは天然物からのもの（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５，９２，１６０９−１６１３）、あるいは、コンビ
ナトリアルケミストリーのような合成方法で作り出されたものであってもよい（
Ｅｃｋｅｒ 及び Ｃｒｏｏｋｅ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９５，
１３，３５１−３６０およびＵ．Ｓ．パテント ５，５７１，９０２、関連によ
る併合）。これらの化合物のコレクションは、個々に特徴のある合成された化合
物のライブラリーとして生成される。例えば、高スループットの平行合成により
、数百または数千分子になるまで、分割−混合またはその他の組合せ方法により
合成された混合物またはプールである。これらのコンビナトリアルライブラリー
のスクリーニングには通常、リガンド−受容体の相互作用の度合いを決めるため
の結合アッセイ（Ｃｈｕら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８
，７８２７−３５）が含まれる。しばしばリガンドまたは標的受容体は、ポリマ
ーのビーズや板のようなものの表面に固定されている。結合力検出後、リガンド
はレリーズされ同定される。固相スクリーニングアッセイは非特定相互作用によ
る困難を軽減することができる。
【００２７】 コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングは、固相−溶液法で行なわれ
るが、そうでなければ、標的に結合したライブラリーのこれらの成分を速く有効
な方法で同定することは一つの挑戦になり、非常に興味深いことである。組合せ
の、およびその他の薬剤発見プロセスを容易かつ有効に達成するためには、尚こ
れは改善されなければならないプロセスである。生体ポリマーおよびその他、治
療対象である標的の構造理解を容易にするためのいくつかの方法が、薬剤の発見
と発展のプロセスを促進するために開発された。これらには、タンパク質および
核酸の配列決定法が含まれる（Ｓｍｉｔｈ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，
１９９７；Ｆｉｎｄｌａｙ 及び Ｇｅｉｓｏｗ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８９；Ｂｒｏｗｎ，ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｉ
ＲＬ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９
９４；Ａｄａｍｓ，Ｆｉｅｌｄｓ 及び Ｖｅｎｔｅｒ，Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４）。これらには、生体ポリマーの
二次三次構造をＮＭＲで（Ｊｅｆｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．
，１９８８，２３，２７５；Ｅｒｉｋｓｏｎら，Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈ
ｅｍ．，１９９２，２７，２７１−２８９）、Ｘ線結晶学で（Ｅｒｉｋｓｏｎら
，Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２７１−２８９）、および
タンパク質の折畳みの予測を試みるコンピュータ・アルゴリズムの利用で（Ｃｏ
ｐｅｌａｎｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ，Ｃｈａｐｍａｎ 及び Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９４；
Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆｏｌｄｉｎｇ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａ
ｎ ａｎｄ Ｃｏ．，１９９２）解明することが含まれる。ＥＬＩＳＡのような
実験（Ｋｅｍｅｎｙ 及び Ｃｈａｌｌａｃｏｍｂｅ，ＥＬＩＳＡ ａｎｄ ｏ
ｔｈｅｒ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ： Ｔｈｅｏｒ
ｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ；Ｗｉｌｅｙ，Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８）、および放射性リガンド結合アッセイ（Ｂｅｒｓｏ
ｎら，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，ｌ９６８，２２，５１−６０；Ｃｈａｒ
ｄ，Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａ
ｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ｐｒ
ｅｓｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２）、表面プラズモン
共鳴の利用（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｍｉｃｈａｅｌｓｓｏｎ 及び Ｍａｔｔｓｏ
ｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９１，１４５，２２９；Ｊｏｎ
ｓｓｏｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９１，１１，６２０）、および
シンチレーション近接アッセイ（Ｕｎｄｅｎｆｒｉｅｎｄら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．，１９８７，１６１，４９４−５００）が受容体−リガンド相互作用
の本質を理解するために使用されている。
【００２８】 前述の範例および技術のすべては、当業界で普通の技術を持つ人であれば入手
可能で、それらを理解し習熟していると思われる。 同様に、高スループットの生物学的スクリーニングのための化合物の化学合成
でも進歩が起こっている。コンビナトリアルケミストリー、計算機化学、および
大量の化合物の混合物または個別化合物のコレクションの合成により、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏスクリーニングのための大量の化合物の急速合成が容易になっている。
これらの進歩にかかわらず、薬剤の発見と最適化のプロセスは困難な段階の連続
である。このプロセスはまた、各段階に含まれるコストおよび個別に多数のもの
をスクリーニングする必要性のために費用がかかる。更に、標的の受容体の構造
的特徴が確認しにくい。
【００２９】 生体活性確認の一つのステップには、テストする化合物の特定のタンパク質ま
たは核酸あるいはそれらの組合せのような生体ポリマーまたはその他の受容体と
の結合親和性の決定が含まれる。コンビナトリアルケミストリーでは、合成能力
または天然原料からの分離能力によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏの生物学的スクリー
ニング用に大量の化合物がつくられ、このチャレンジは尚増幅中である。コンビ
ナトリアルケミストリーは大量の化合物、あるいは、しばしば混合物から分離さ
れる大量の天然物を生み出し、これらのライブラリーや混合物のメンバーで最も
活性度が高く標的の受容体と最高の親和性で結合するものを急速に決定する方法
が必要である。 関連する見方から、薬剤発見を担当する科学者は、標的−リガンドの相互作用
の力および化学量論を決めるため、生物学的に関心のある標的の構造解析のため
、および組合せ混合物の活性成分決定のために、多くの器具や技法が入手可能で
ある。
【００３０】 タンパク質や核酸のような生物学的標的の配列決定のための技術や機器は、前
述のように入手可能である（即ち、Ｓｍｉｔｈ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１９９７、Ｆｉｎｄｌａｙ 及び Ｇｅｉｓｏ
ｗ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐ
ｐｒｏａｃｈ，１９８９）。これらの技法は有用ではあるが、これらの配列決定
方法に感受性のない、ある種の生体ポリマー標的や構造があり、どんな場合でも
、より便利で経済性のあるものが求められる。現在の配列決定技術の欠点は標的
の一次構造または配列より以上のことは何も明らかにする能力がないことである
。
【００３１】 Ｘ線結晶学は生体ポリマー標的の二次三次構造のあるものの決定を可能にする
が（Ｅｒｉｋｓｏｎら，Ａｎｎ．Ｒｅｐ．ｉｎ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９２
，２７，２７１−２８９）、この技術は費用がかかり、実施が困難である。生体
ポリマーの結晶化は非常にむつかしく、十分な分解能で実施することは困難で、
しばしば科学というよりは技能だとみなされる。更に、薬剤発見プロセスでＸ線
による結晶構造解析を適用するのを躊躇させるのは、液相では結晶学の真実を明
らかにすることが出来ないことである。従って、生物学的に適切で、標的の構造
解析に向くものがないことになる。
【００３２】 以前に引用したように、リガンド（動作体、アンタゴニストまたは阻害剤）と
その標的との間の性質および相互作用の力についての解析は、ＥＬＩＳＡ（Ｋｅ
ｍｅｎｙ 及び Ｃｈａｌｌａｃｏｍｂｅ，ＥＬＩＳＡ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ： １９８８）、放射性リ
ガンドの結合アッセイ（Ｂｅｒｓｏｎら，Ｃｌｉｎ．１９６８，Ｃｈａｒｄ，Ａ
ｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙａｎ
ｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８２）、表面プラズモン共鳴
（Ｋａｒｌｓｓｏｎら，ｌ９９１，Ｊｏｎｓｓｏｎら，Ｂｉｏｔｅｈｃｎｉｑｕ
ｅｓ，１９９１）、またはシンチレーション近接アッセイ（Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎ
ｄら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８７）によって行なわれ、これらは既
に引用されている。放射性リガンド結合アッセイは、放射性リガンドの結合で放
射活性を使用する必要があるので、結合部位で未知のものと競合的結合をアッセ
イする場合にのみ典型的に有効である。表面プラズモン共鳴法は、使用上は直接
的であるが、コストが非常に高い。従来から行なわれている、結合動力学および
解離・会合定数を測定する生化学的アッセイは、標的とリガンドの相互作用の性
質を明らかにする上では有用である。
【００３３】 化合物の組合せ混合物のスクリーニングの場合、薬剤を発見しようとする科学
者は、通常活性のあるもののプールを同定し、その再合成をへて、個々のメンバ
ーに分けて、コンピュータで解析し、個々の化合物の分析を通して活性メンバー
を同定する。現在の多くの生物学的に適切な標的に対するコンビナトリアルライ
ブラリーの研究用のプロトコルは多くの欠点を持っている。冗長性、高コスト、
段階的性格で、上記スクリーニング技法の多くが、低感度なことは現在入手可能
な道具としての欠点である。更に、現在入手可能な技術が常に最も適切な構造情
報を供給するものではなく、例えば、溶液中の標的の構造はその例である。それ
らは標的の構造の中を洞察することを可能にするが、それは固相の場合である。
また、特注の反応試薬や特定の課題のための実験は、現在の薬品発見およびスク
リーニング技法の慣行に対する挑戦である。現在の方法は、プールまたは混合物
中の分散したメンバーを手間のかかる方法で再合成・再分析することなしに、ラ
イブラリー中の活性メンバーを解明し、同定することの必要性に対する便利な解
答を提供することがで出来ていない。
【００３４】 従って、複雑な化学ライブラリー、特にコンビナトリアルライブラリーのスク
リーニングと同定方法は、一つ以上の標的とリガンドの両方の構造、標的とリガ
ンド間の相互作用の部位、および標的−リガンド相互作用の強さを決定できるこ
とが大きなニーズになっている。更に、薬剤発見を促進するために、混合物から
生物活性メンバーを直接同定し、複数の生体ポリマーのスクリーニングを一回の
手順で行なえる、新コンビナトリアルライブラリー・スクリーニング法が必要で
ある。生体ポリマーの特異的で制御された切断を可能にする直截的方法は、構造
情報を提供するフラグメントの分析をすることと共に、生化学および薬剤発見に
関与した人々にとっては重大な価値があり、長い間求められてきたものである。
更に、その方法は、生体分子標的の一種に限定されず、核酸、ペプタイド、タン
パク質およびオリゴ糖のような色々な標的に適用できることが望ましい。
【００３５】 従って、本発明の主目的は、核酸、特にＲＮＡ中の分子の相互作用を同定する
ことである。本発明の更なる目的は、「低」分子などと重要な治療用、制御用、
その他の相互作用を生じさせる確率が極めて大きいＲＮＡ中の二次構造要素を同
定することである。ＲＮＡ中の組織−富化したユニークな構造の同定が本発明の
その他の目的である。 本発明のその他の目的はＲＮＡとその他の核酸およびリガンドまたは潜在的リ
ガンド間の相互作用の改良された特徴を提供することである。 本発明の更なる目的は、ＲＮＡの分子相互作用部位と、それと相互作用が提案
されている化合物を比較することである。 本発明の好適な態様に従い、ＲＮＡの分子相互作用部位と他の化合物との比較
を、分子相互作用部位の三次元構造の色々な表現とリガンドの三次構造とのその
方式での比較により、その相互作用が質の面で比較できるような方法で実施する
。
【００３６】 本発明の他の目的は、ＲＮＡおよび他の核酸標的の分子相互作用部位を、相互
作用する能力に従って階層付け、あるいは並べて、リガンドの階層をつくること
である。 本発明の尚その他の目的は、核酸の分子相互作用部位の三次元構造およびリガ
ンド・ライブラリーの三次元構造の数多くの表現のデータベースを作ることであ
る。このようなデータベース・ライブラリーは潜在的リガンドの分子相互作用部
位の構造と相互作用の解明および予測のための強力な手段を提供する。 本発明の更なる目的は、ペプタイド、タンパク質、オリゴヌクレオチドおよび
核酸のような生体分子標的の生体ポリマーとしての一次配列、二次および折畳ま
れた構造、およびさらに高次の分子内および分子間相互作用に起因する生体分子
の三次元および四次元構造のような、構造上の特徴を決めることである。
【００３７】 本発明の尚その他の目的は、生体分子標的と結合しているリガンドまたはリガ
ンド間の相互作用部位とその性質を明らかにすることである。結合リガンドは多
分低分子で、ペプタイド、オリゴヌクレオチドまたはオリゴ糖、天然物質または
コンビナトリアルライブラリーのメンバーような生体分子である。 本発明の更なる目的は、生体ポリマー標的に結合しているリガンドの相対的結
合親和性または解離定数を決定することである。好ましくは、これはＲＮＡ／Ｄ
ＮＡ標的とリガンド、即ち、組合せ合成されたライブラリーの構成メンバーのよ
うな生体ポリマー間の相対的結合親和性の決定を行なうことである。
【００３８】 本発明の更なる目的は、生体ポリマー標的に結合しているリガンドの絶対結合
親和性またはリガンドの解離定数を決定することである。 本発明の更なる目的は、ライブラリーのどの成分が標的に結合しているかを決
めるために、核酸のような生体分子標的に対して、個別の化合物あるいは化合物
の混合物からなるコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングをする一般的
方法を提供することである。 本発明の追加の目的は、生体分子標的に結合しているコンビナトリアルライブ
ラリーのメンバーの分子量と構造を決定するための方法を提供することである。
【００３９】 本発明の尚その他の目的は、化合物のコンビナトリアルライブラリーに対する
、核酸、タンパク質およびその他の生体分子およびオリゴマーのような複数の標
的を同時にスクリーニングする方法を提供することである。 本発明の尚更なる目的は、ＲＮＡのような、特に核酸である生物学的分子の分
子相互作用部位と結合しまたは相互作用する「低」分子の有機化合物について、
特に化合物の特異性と親和性を確認することである。このような分子は、多分ラ
ンク付けされ、望ましくは、分子相互作用部位において、予想または計算された
これら部位での相互作用の可能性に従いランク付けされたリガンドおよび潜在的
リガンドの階層を形成する。
【００４０】 本発明のその他の目的は、スクリーニングする標的の混合物および組合せの、
またはその他の化合物の混合物分析から生じた質量スペクトル内でのピークのオ
ーバーラップ問題を緩和することにある。好適な態様では、本発明は、組合せの
、またはその他の化合物の混合物で質量重複性を解決するための方法を提案し、
さらに、標的の混合物がスクリーニングされる場合の質量重複性の問題を解決す
る方法を提供する。 本発明の更なる目的は、対照と比較して、標的に対して、リガンドの結合特異
性を決める方法を提供することにある。本発明は、選択性の決定、非特異的効果
の同定、および薬剤発見の努力に対する更なる 配慮から非特異性リガンドの除去を容易にする。
【００４１】
【発明の概要】
本発明は生体分子、特にＲＮＡの修飾を通じて作用する、新しい薬剤、農業用
化学薬品、工業用化学薬品その他の同定を目指している。多くの方法およびプロ
トコルは、強力な薬品およびその他の生物学的に有用な化合物の同定を提供する
多くのこのましい方法としてプロトコルが統合されている。 出願人の発明は、「分子相互作用部位」と名付けられた、原核および真核ＲＮ
Ａの二次構造を同定する方法を目指している。分子相互作用部位は、低分子量、
好ましくは７０ヌクレオチド未満、更に好ましくは５０ヌクレオチド未満、もし
くは３０ヌクレオチド未満で、より大きなＲＮＡ分子内に含まれる、独立して折
畳まれた、機能的下位領域である。出願人の方法は、好ましくは、核酸、好まし
くはＲＮＡの配列を分析し、その構造と機能を予測する統合されたプロセスのグ
ループを含む。出願人の方法は、好ましくは、サブルーチンを順番に実行するプ
ロセスを含み、そこでは、一つのプロセスの結果がアクションの特定のコースの
引き金を引くか、他のステップへの数またはインプットを供給する。好ましくは
、このプロセスに決定ポイントがあり、そこでは経路が、詳細なリアルタイムの
人の介入なしに決定が下せるエキスパートプロセスにより決定される。ＲＮＡ配
列分析の自動化は、ＲＮＡの配列がゲノム配列データベースその他から入手可能
になると同時に、調節部位を確認する能力を与えている。この発明は、例えば、
中枢神経系（ＣＮＳ）疾患、代謝疾患、痛み、老化による変性疾患、がん、炎症
性疾患、循環器系疾患および多くのその他の条件との関係で分子相互作用を同定
するのに使用し得る。出願人の発明はまた、例えば真核細胞、特にヒトの真核細
胞にはない分子相互作用を同定するのに使用でき、それは原核細胞のＲＮＡの促
進または抑制のいずれかの平行修飾をもった「低」分子結合用部位として利用で
きる。このようにして、ウイルス性または細菌性、寄生虫による疾患の治療で、
ヒトへの毒性を回避することができる。
【００４２】 本発明は、好ましくは、標的核酸内の分子相互作用部位は、標的核酸のヌクレ
チオド配列を異なる分類学上の種からの複数の核酸のヌクレチオドの配列と比較
し、複数の核酸中に有効に保存されたものおよび標的核酸中に、少なくとも一つ
の配列領域を同定し、その保存された領域が二次構造を持ち、かつ、二次構造を
もつ保存された領域について二次構造を同定することにより得られる。
【００４３】 本発明はまた、真核および原核ＲＮＡ中の分子相互作用部位に関連するデータ
ベースを提供することを目指すものである。このデータベースは標的核酸のヌク
レチオド配列を異なる分類学上の種からの複数の核酸のヌクレチオドの配列と比
較し、複数の核酸中に保存されたものおよび標的核酸中に、少なくとも一つの配
列領域を同定し、その保存された領域が二次構造を持ち、かつ、二次構造をもつ
保存された領域について二次構造を同定し、このような二次構造のグループを集
積することにより得られる。
【００４４】 本発明はなお、特定の生物のＲＮＡ中に存在し、かつ、少なくとももう一つの
生物のＲＮＡ中にも存在する分子相互作用部位を含むオリゴヌクレチオドを提供
することを目指すものであり、そこでは、分子相互作用部位は、少なくとも一つ
の分子に対して統合部位として役立ち、その分子相互作用部位へ結合した場合に
は、それにより特定生物体のＲＮＡ発現を修飾する。
【００４５】 本発明はまた、原核細胞ＲＮＡ中に存在し、かつ、少なくとももう一つの原核
細胞ＲＮＡ中に存在する分子相互作用部位を含むオリゴヌクレチオドを提供する
ことを目指すものであり、そこでは、その分子相互作用部位は、少なくとも一つ
の分子の統合部位として役立ち、その分子相互作用部位に結合した場合には、原
核細胞のＲＮＡの発現が修飾される。 本発明は、原核細胞ＲＮＡおよび少なくとももう一つの原核細胞ＲＮＡ中に存
在する分子相互作用部位をもつオリゴヌクレオチドを含む医薬用組成物に関係し
、そこでは、その分子相互作用部位は、少なくとも一つの「低」分子のための結
合部位として役立つ。このような分子は分子相互作用部位に結合した場合、原核
細胞ＲＮＡの発現を修飾する。また、好ましくは、医薬用担体も含まれる。
【００４６】 本発明はまた、特定生物体の中に存在し、少なくとももう一つの生物体のＲＮ
Ａ中にも存在する分子相互作用部位を含むオリゴヌクレチオドを含む医薬用組成
物を提供しようとするものである。分子相互作用部位は、少なくとも一つの分子
の結合部位として役立ち、分子相互作用部位に結合した場合には、特定の生物体
および医薬品用担体内のＲＮＡの発現を修飾する。
【００４７】 結局、本発明の方法は、その核酸が存在する生物体にとって非常に重要である
、標的核酸中に存在する物理的構造を同定する。このような構造−−分子相互作
用部位は分子種と相互作用が働くことができ、その結果、核酸の特徴または効果
を変性させることになる。このことは、当業者には分かるように、医薬品として
活用され得る。このような構造は農業、汚染制御、工業用生化学、その他にとっ
て重要である生物体の核酸中に見られる。従って、殺虫剤、除草剤、防かび剤、
酵母、バクテリア、ウイルスその他のような工業的に用いられる生物体、および
生体触媒系にとって有用であろう。
【００４８】 本発明に従い、低分子の仮想コンビナトリアルライブラリー形成のための方法
が提供される。これらのライブラリーの分子またはメンバーはｉｎ ｓｉｌｉｃ
ｏに生成される。高分子量のライブラリーメンバー、例えば、性質が重合性のも
のもまた、本発明の方法を用いて生成することができる。 更に本発明は、フラグメント、反応物およびライブラリーメンバーのｉｎ ｓ
ｉｌｉｃｏでの生成に用いられた、これらのもののユニークな組合せをデータベ
ース中で追跡し保存する方法を提供する。並列配列シンセサイザーのような、機
器上でライブラリーメンバーを実際に合成することとを指示するよう設計された
命令のように、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでライブラリー生成に必要な情報をインター
フェイスする方法もまた、本発明により提供される。
【００４９】 本発明はまた、ライブラリーメンバーと同定された標的分子のドッキングをｉ
ｎ ｓｉｌｉｃｏで行なう方法を提供する。この方法によれば、個々のライブラ
リーメンバーは標的に対して高親和性結合を示すこれらのライブラリーメンバー
を同定するために必要な標的分子へ結合することを許容される。 本発明によれば、低分子の仮想コンビナトリアルライブラリーを生成する方法
が提供される。これらのライブラリーの分子またはメンバーはｉｎ ｓｉｌｉｃ
ｏで生成される。高分子量のライブラリーメンバー、例えば、重合性の性質を持
ったものも、本発明の方法を用いて形成することができる。
【００５０】 更に、本発明は、フラグメント、反応剤およびライブラリーメンバーのｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの生成に用いられた、これらのもののユニークな組合せをデータ
ベース中で追跡して保存するための方法を提供する。並列配列シンセサイザーの
ような機器上で実際にライブラリーメンバーを合成することを指示するように設
計された命令のような、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでライブラリーの生成に必要な情報
をインターフェイスするための方法もまた、本発明により提供される。
【００５１】 本発明はまた、分子相互作用部位の三次元的構造を数値表現し、多数の有機化
合物の三次元的構造の数値表記を含む、化合物のデータセットを提供することを
含む、核酸の分子相互作用部位へ結合する化合物を同定する方法を目指している
。分子相互作用部位の数値表現は分子相互作用部位と物理的相互作用を形成する
有機化合物のその能力に従ってランク付けされる有機化合物の階層を生成するた
めの化合物のデータ・セットのメンバーと比較される。
【００５２】 本発明はまた、分子相互作用部位の三次元構造の数値表現を含むデータベース
および複数の有機化合物の三次元構造の数値表現を目指している。 本発明は、核酸の分子相互作用部位に結合する化合物を同定する方法を目指し
ている。この方法は、分子相互作用部位の三次元構造の数値表現を供給し、複数
の有機化合物の三次元構造の数値表現を含む化合物のデータセットを供給し、分
子相互作用部位の数値表現を化合物のデータセットのメンバーと比較し、その結
果、分子相互作用部位の物理的相互作用を形成するために、有機化合物の能力に
従ってランク付けされた有機化合物の階層を形成することからなる。
【００５３】 本発明の一つの態様は、質量分析法を用いて核酸のような生物分子標的の構造
を決定する方法である。この方法は核酸標的の配列を決定する第一次構造だけで
なく、不適合な塩基対、ループ、バルジ、キンクおよびステム構造についての情
報を含む、核酸、ＲＮＡおよびＤＮＡの二次構造、三次構造についての情報を提
供する。これは、一つの態様に従って達成され、デオキシヌクレオチド残基また
はその他の変性された基をオリゴリボヌクレオチドの特定の部位へ取込むことに
より、質量分析計の中で、これらのハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡの特異的切断が
続いて起こった。核酸の電気スプレーによるイオン化、核酸の切断、それに続き
、直列ＭＳｎ分光法は、核酸の配列とその構造を示すフラグメントのパターンを
供給することが分かった。切断は、デオキシヌクレチオドまたはその他の外来残
基の取込み部位および核酸の二次構造に依存する。従って、この方法は、核酸の
配列中に存在する二次構造の部位およびタイプを同定する質量分析データを提供
する。
【００５４】 この方法が生体分子の標的の混合物およびリガンドまたは標的に結合している
分子に対して行なわれたとき、リガンドと生体分子間の相互作用の程度および相
互作用の場所を確認することができる。このリガンドの生体分子への結合は、生
体分子上の結合部位を質量分析法で測定する間、簡単に切断することから保護す
る。従って、この方法を用いて発生した、リガンドまたは薬剤との結合がある場
合とない場合の、ＲＮＡ／ＤＮＡに対する、発生したＥＳＩ−ＭＳｎ質量分析の
比較が結合場所を明らかにする。切断パターンが変わったスペクトルは、質量ス
ペクトル内で明らかに識別され、核酸の配列および構造に関係する。このように
、テスト・リガンドの絶対結合親和性は本発明の方法で測定できる。核酸・リガ
ンドの非共有複合イオンの存在量とその結合親和力が知られている標準化合物（
例えば、１６Ｓ ＲＮＡ Ａ部位に対するパラモミシン）で生成する同様の複合
イオンの存在量との比較により、テスト・リガンドの相対的結合親和力を決める
ことが可能になる。
【００５５】 本発明の方法は、大量の化合物のコレクションをすばやくスクリーニングする
のに用いることがでできる。また、本発明の方法は組合せ方法やその他の方法で
生成した大量の化合物の混合物のスクリーニングにも使用することができる。化
合物の大きな混合物を、核酸のような生物分子の標的に暴露すると、リガンドの
小さな画分は、核酸にいくらかの結合親和力を示すことがある。バインダーとし
て検出されたリガンドの実数は、標的核酸の濃度、組合せ混合物の成分の相対的
濃度、およびこれらの成分の絶対的および相対的な結合親和性に基づいている。
この方法は、選択的イオントラッピング、または衝突活性化による解離ＭＳn 実
験を用い、結合したリガンドの構造や同一性に対する個々の複合体の集積や分析
のようなテクニックを用い異なる非共有複合体の分離に有効である。従って、本
方法は、生体分子の標的に結合する分子を対象にコンビナトリアルライブラリー
をスクリーニングする方法として役立つばかりでなく、直接的方法として、結合
リガンドの構造的同一性を選択することができる。コンビナトリアルライブラリ
ーの大量の重複も問題を提起することはない。というのは、この方法は、高分解
能の分子質量分析計が取り付けられ、尚且つ、直列接続で同一分子質量のリガン
ドの異なる構造間の差を識別することができるから。
【００５６】 好ましい態様において、分子相互作用部位を持ったＲＮＡのような標的生体分
子は、相互部位用の、一つまたはそれ以上のリガンドまたは潜在的リガンドを、
そのリガンドの相互作用または結合が、分子相互作用部位と起こるような条件に
なっている。その結果として得られる複合体は、ＲＮＡその他の生物分子がつい
たリガンドの一つ、または、時として何百もの複合体であり、本発明の方法に準
拠した質量分析評価対象である。「調整的」質量分析法は、個々の複合体を分離
し、次いで質量分析的環境に制御された条件下で、次に続く分析用にフラグメン
ト化される。このようにして、リガンドの分子相互作用部位への性質と結合度合
、または絶対結合親和性が確認される。特異的で強力な結合力をもったリガンド
の同定が行なわれ、このように選択されたものは、治療用、農業用、工業用また
はその他の化学薬品用として使用されたり、同じものが、これらの用途で改良さ
れた形へ引き続き変性させるための主導的化合物として用いられる。
【００５７】 本発明のさらなる応用は、コンビナトリアルライブラリーまたは化合物の混合
物に対する、複数の生体分子標的の同時スクリーニング用質量分析法として用い
ることである。このやや複雑なスクリーニング法は、質量分析法とスクリーニン
グを行なう方法の組合せによる力で可能になった。複数標的核酸をスクリーニン
グする場合、例えば、質量重複性が関係する場合、特に、もし二つまたはそれ以
上の標的が類似の配列組成または質量スペクトルの場合である。この問題は、本
発明により、異なる核酸標的に、特別の質量修飾法、分子量の標識を付けること
が検討され、軽減された。これらの質量修飾タグとしては、代表的なものとして
、多くの異なるサイズと重量のものが市販されていて、ポリエチレングリコール
、ポリアクリルアミドおよびデキストランを含むが、それらに限定されない高分
子量、非イオン性ポリマーも挙げられており、それらは核酸上の多くの異なる可
能な部位のうちの一つ又はそれ以上に付着してもよい。このように、類似の核酸
の標的には別々のタグが付けられ、質量スペクトルで、その電荷比（ｍ／ｚ信号
）に対する明らかに異なる質量により、お互いを容易に区別することができる。
本発明の方法を用いると、スクリーニングでは、複数の標的は多数の化合物の混
合物でも、現在では同時にスクリーニングすることができるようになり、顕著な
進歩が見られた。
【００５８】 本発明の方法に関連するもうひとつの利点は、新しいリガンドと生体分子の標
的との間の結合相互作用の特異性を決定する能力である。例えば、標的核酸およ
び一つまたはそれ以上の対照核酸とコンビナトリアルライブラリーまたは特定の
リガンドを同時スクリーニングすることにより、本発明の方法を使用することで
、そのリガンドが標的とする核酸にだけ結合しているのか、あるいは、標的と共
に測定された結合は対照の核酸でも再現され、従って非特異的なものなのかを確
認することが可能になる。
【００５９】 本発明の方法は、次のように多様な生物分子標的の研究に応用可能であり、ペ
プタイド、タンパク質、受容体、抗体、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、
ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、オリゴ糖、炭水化物およびグリコペプチドが含ま
れるが、それに限定されるものではない。本発明の方法を用いてスクリーニング
され得る分子としては、次のものを挙げることができるが、それらに限定される
ものではない。即ち、有機化合物や無機化合物、低分子量から高分子量の個々の
化合物、リガンドの混合物およびコンビナトリアルライブラリー、阻害剤、アゴ
ニスト、アンタゴニスト、基質、およびペプタイド、核酸またはオリゴヌクレオ
チドのような生体ポリマーが含まれる。本発明の方法で用い得る質量分析技術に
は次のものがあるが、これらに限定されるものではない。即ち、ＭＳn 、衝突活
性化解離（ＣＡＤ）および衝突誘導解離（ＣＩＤ）および赤外多重光子解離（Ｉ
ＲＭＰＤ）などを含む。多くのイオン化技術が使用可能となり、エレクトロスプ
レー、ＭＡＬＤＩおよびＦＡＢが含まれるが、これに限定されるものではない。
本発明のこの方法に使用される質量検出器には次のものがあるが、これらに限定
されるものではない。即ち、ＦＴＩＣＲ、イオントラップ、四本極、磁気セクタ
ー、飛行時間型（ＴＯＦ）、Ｑ−ＴＯＦおよび三重四極型を含む。本発明のこの
方法は尚ハイフン付の技法、例えば次のものが使用可能だが、それに限定される
ものではない。即ち、ＬＣ／ＭＳおよびＣＥ／ＭＳであるが、記述のこれらのこ
とすべては、以後さらに充分説明する。
【００６０】 分子相互作用部位とリガンド間の結合力を特徴付ける方法は、例えば、有機化
合物で好まれる方法、米国特許出願番号Ｎｏｓ．０９／０７６，４４０，０９／
０７６，４０５，０９／０７６，４４７，０９／０７６，２０６，０９／０７６
，２１４および０９／０７６，４０４、これらはそれぞれ１９９８年５月１２日
に出願された。前記特許のすべては参照により本明細書中に組み入れられる。
【００６１】
【発明の説明】
以上説明したように、本発明はＲＮＡその他の生物分子を修飾する能力をもっ
た分子の同定法を提供するものである。新しい方法との組合せは本方法に非常な
力と汎用性を与えている。以後、さらに詳細に説明するように、ある態様では、
本出願の譲受人によって開発された多くの方法を組合せることが望ましく、他の
方法との組合せがよい結果を生むということも認識しておく必要がある。このよ
うに、本発明の示すところに従いＲＮＡやその他の分子上にある分子結合部位を
決めることは非常に有用であるが、確認されたリガンドとリガンド・ライブラリ
ーおよびＲＮＡとその他の分子の間の相互作用は興味あるもので、本発明の他の
面からも大いに役立つものである。このような組合せのすべては本発明の考え方
に含まれるものである。
【００６２】 好適な態様に従い、原核細胞および真核細胞の核酸、分子相互作用部位の特定
な構成要素が同定されている。このようにして、本発明は、他の分子と相互作用
し、ＲＮＡの修飾に影響を与える真核細胞および原核細胞の核酸、特にＲＮＡ分
子内の特定の構造要素を同定する方法を指向している。「修飾」はＲＮＡの活動
または表現を増加させたり減少させたりすることを意味する。本発明の内容は図
１にフローチャートの形でアウトラインを示してある。真核細胞および原核細胞
中の構造要素は「分子相互作用部位」と言われている。これらの要素は二次構造
をもち、即ち、「低」分子その他と相互作用する能力がある三次元の形を持って
おり、また「低」分子、オリゴマー（例えば、オリゴヌクレオチド）とその他の
化合物と相互作用するための部位として利用することが期待されている。
【００６３】 図１について、標的である核酸中の分子相互作用部位の同定のための好ましい
段階は、フローダイアグラムに示されている。標的核酸のヌクレオチドの配列は
異なる分類学上の種，１０からの複数の核酸のヌクレオチド配列と比較される。
標的核酸は、真核細胞、原核細胞の中に存在することがあり、標的核酸は、例え
ばヒトのような高等な生物体に属することもあるし、バクテリアあるいはウイル
スのものであることもある。どのようなタイプの核酸でも標的核酸として役立ち
得る。好ましい標的核酸にはｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｐｒｅ
−ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）、ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮ
Ａ（ｔ−ＲＮＡ）、リボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、または小核ＲＮＡ（ｓｎ
ＲＮＡ）が含まれるが、それらに限定されない。特定の標的核酸を初めに選択す
るには、何らかの機能基準に基づく。核酸は、炎症、心臓血管関連疾患、痛み、
がん、関節炎、外傷、肥満症、ハンチントン病、神経系疾患、その他疾患や障害
に主要な関係があり、典型的な標的核酸である。
【００６４】 核酸は病原性ゲノム、例えばバクテリアゲノム、ウイルスゲノム、および酵母
ゲノムに含まれており、それらは代表的な原核細胞核酸標的である。病原性のバ
クテリア、ウイルス、酵母は当業者によく知られている。代表的な核酸標的を図
１表に示した。しかし出願人は表１の標的に限定されるものではなく、本発明が
極めて一般的であると考 えられている点が理解されなければならない。
【００６５】
【表１】
【００６６】
【表２】
【００６７】
【表３】
【００６８】
【表４】
【００６９】 追加の核酸標的は独立に決めることもできるし、公入手可能な原核細胞および
真核細胞については当業者によく知られている遺伝子データベースから決めるこ
ともできる。好ましいデータベースにはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉ
ｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）、ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇ
ｅｎｏｍｅ Ａｎａｔｏｍｙ Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＣＧＡＰ）、ＧｅｎＢａｎｋ、
ＥＭＢＬ、ＰＩＲ、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ等が含まれる。疾患に関連した遺伝子
突然変異のデータベースであるＯＭＩＭは、部分的にｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏ
ｎ（ＮＣＢＩ）によって開発される。ＯＭＩＭはインターネットを通じてアクセ
ス可能で、例えば、 HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/" http://www.n
cbi.nlm.nih.gov/0min/ 。例えばＣＧＡＰはがん細胞の分子解剖学を解読するた
めに必要な情報および技術ツールとして設立された学際的なプログラム。ＣＧＡ
Ｐはインターネットを通じてアクセスが可能で、例えば、 HYPERLINK "http://w
ww.ncbi.nlm.nih.gov/" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ncicgap/ 。これらのデ
ータベースのあるものは、完全にまたは部分的にヌクレオチド配列を含む。さら
に核酸標的は自分の遺伝子をデータベースから選ぶこともできる。代わりに核酸
標的を入手可能な出版物から選択したり、あるいは特に本発明に関わる使用に決
定することができる。
【００７０】 核酸標的が選ばれ、使用可能になった後、核酸標的のヌクレオチド配列が決め
られ、次いで異なる分類学上の種からとった複数の核酸のヌクレオチド配列と比
較される。本発明の一つの態様において、核酸標的ヌクレオチド配列は少なくと
も一つの遺伝子データベースをスキャニングして決めるか、または入手可能な出
版物において同定する。好ましいデータベースとして知られ、当業者が入手し得
るものに例えば、Ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｄ Ｇｅｎｅ Ａｎｔｏｍｙ Ｄａｔ
ａｂａｓｅ（ＥＧＡＤ）およびＵｎｉｇｅｎｅ−Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ Ｄ
ａｔａｂａｓｅ（Ｕｎｉｇｅｎｅ），ＧｅｎＢａｎなどである。ＥＧＡＤにはヒ
トの転写された（ＨＴ）配列の重複のないセットが含まれ、インターネットを通
じて、例えば、HYPERLINK "http://www.tigr.org/tdb/egad/egad.html" http://
www.tigr.org/tdb/egad/egad.html からアクセスできる。ＵｎｉＧｅｎｅは自動
的にＧｅｎＢａｎｋの配列を分割して、重複性のない遺伝子指向のクラスターの
セットにするシステムである。それぞれのＵｎｉｇｅｎｅクラスターはユニーク
な遺伝子を代表する配列を含み、遺伝子が発現される組織型や地図の場所等の関
連情報を含んでいる。
【００７１】 さらにＵｎｉｇｅｎｅ は無数の新しい発現配列タグ（ＥＳＴ）を含んでいる
。Ｕｎｉｇｅｎｅ はインターネットでアクセス可能で、例えば、HYPERLINK "h
ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene
/ 。これらのデータベースは当業者によく知られており、入手可能なＥｎｔｒｅ
ｚ等の検索プログラムに関連して使用することができる。Ｅｎｔｒｅｚはインタ
ーネットでアクセス可能で、例えば、HYPERLINK "http://www.ncb.nlm.nih.gov/
Entrez" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/ 。好ましくは種々のデータベー
スから入手可能な最も完全な核酸配列の表現を使用する。当業者に知られている
入手可能なＧｅｎＢａｎｋのデータベースは最も完全なヌクレオチドは配列を入
手するのに使用可能である。ＧｅｎＢａｎｋはＮＩＨの遺伝子配列データベース
であり、すべて公に入手可能なＤＮＡ配列の注釈つきのコレクションである。例
えばＧｅｎＢａｎｋはＮｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９８，２６，１−７
に記載され（関連により併合）、その当業者はインターネット経由でアクセスす
ることができる。例えば、HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.gov/Web/Genbank/i
ndex.html" http://www.ncbi.nlm.gov/Web/Genbank/index.html である。代わり
に核酸標的の部分ヌクレオチドの配列は完全なヌクレオチド配列が入手不可能な
場合、使用可能である。
【００７２】 本発明の他の態様で、核酸標的のヌクレオチドの配列は、オーバーラップして
いる複数の発現配列タグ（ＥＳＴｓ）を組み合わせて決定する。当業者によりよ
く知られており、入手可能なＥＳＴデータベース（ｄｂ ＥＳＴ）は約５００な
いし１０００のヌクレオチドからなる約１００万の異なるヒトｍＲＮＡ配列と多
くの有機体からの様々な複数なＥＳＴが含まれている。ｄｂ ＥＳＴはインター
ネットでアクセスでき、HYPERLINK "http://ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.htm
l" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index.html である。これらの配列はゲ
ノム配列用のｃＤＮＡ発現クーロンを用いる。クーロン法により引出されたもの
である。ＥＳＴは新しい遺伝子の発見、ゲノムのマッピング、ゲノム配列中のコ
ーデイング領域を同定できるアプリケーションを持っている。急速に利用できる
ようになっているＥＳＴ配列情報の別の重要な特徴として、組織特異性のある遺
伝子発現データがある。これは治療的発明のための選択的遺伝子を標的とする場
合にきわめて有用である。ＥＳＴ配列は相対的に短いことから、それらは完全な
配列を提供するように組み立てられなければならない。あらゆるの入手可能なク
ーロンは配列されているので多くの重複領域がデータベースに報告されている。
【００７３】 ５' および３' の両方に沿って伸ばされたオーバーラップするＥＳＴの組み立
ては等身大の仮想転写物になる。この結果として得られた仮想転写配列は現に特
徴付けられた核酸を示し、またはおそらく新規の核酸で完全に知られていない生
物学的機能を持つものである。Ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏ
ｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｄｅｘ
（ＨＧＩ）ｄａｔａｂａｓｅは当業者にはよく知られ利用可能で、ヒトの転写さ
れた配列のリストを含んでいる。ＴＩＧＲはインターネットでアクセス可能で、
例えば、HYPERLINK "http://www.tigr.org" http://www.tigr.org である。この
転写物はＴＩＧＲ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｒを用いて生成でき、これは仮想転写物を
作り出すエンジンである。このことは当業者にはよく知られており、利用可能で
ある。ＴＩＧＲ−ＡｓｓｅｍｂｌｅｒはＥＳＴ、ＢＡＣでオーバーラップ配列デ
ータの大きなセットまたは小さなゲノムをアセンブルするためのツールであり、
真核細胞または原核細胞の配列をアセンブルするのに使用できる。ＴＩＧＲ−Ａ
ｓｓｅｍｂｌｅｒは例えばＳｕｔｔｏｎら，Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆
Ｔｅｃｈ．，１９９５，１，９−１９関連により併合された。インターネット
、例えば、http://ftp.tigr.org./pub/software/TIGR assemblerでアクセスでき
る。さらに当業者に知られており利用可能なＧＬＡＸＯ−ＭＲＣは仮想転写され
た配列を構成するためにプロトコルであり適応性のある当業者にはよく知られて
いる Ｆｉｎｄ Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｅ ＥＳＴ Ｂ
ｌａｓｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌはＵＮＩＸのプラットホーム上で動き出願人により
仮想転写された配列を構成するために開発された。Ｆｉｎｄ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ
ｓ ａｎｄＡｓｓｅｍｂｌｅ ＥＳＴ Ｂｌａｓｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌの好まし
い段階は図２に示したフローチャートに記載されている。ＰＨＲＡＰはＦｉｎｄ
Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｅ ＥＳＴ Ｂｌａｓｔ ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌで配列のアッセンブリーに用いられている。ＰＨＲＡＰはインター
ネットを通して、例えば、HYPERLINK "http://chimera.washington.edu./uwgc/t
ools/phrap.html" http://chimera.biotechwashington.edu./uwgc/tools/phrap.
htmlでアクセスできる。当業者は図２に提示されている好ましい段階を実行する
ためのソースコードを構成することもできる。
【００７４】 核酸標的のヌクレオチド配列は異なる分類学上の種から複数の核酸のヌクレオ
チド配列と比較する。異なる分類学上の種から核酸およびそのヌクレオチド配列
は入手可能な出版物の遺伝子データベース内で得ることができ、あるいは本発明
と関連して特別に使うことを決定することもできる。本発明の態様の一つとして
、核酸標的は配列類似性検索、オーソログ検索、または両方を使って異なる分類
学上の種からの複数の核酸のヌクレオチド配列と比較する。このような検索は当
業者の技能を持った人にはよく知られている。
【００７５】 配列類似性検索の結果は、複数の核酸が標的核酸の少なくとも８〜２０ヌクレ
オチド領域と同種のヌクレオチド配列の一部を持っており、ウインドウ領域と言
う。複数のヌクレオチド配列が少なくとも一つの場所で標的核酸のウインドウ領
域と少なくとも６０％同種であることが好ましい。さらに同種であるものが少な
くとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、最も好ましいのは少なくと
も９０％である。例えばウインドウサイズ、複数の配列を比較すると標的ヌクレ
オチドの部分は約８から約２０、好ましいのは１０から１５、最も好ましいのは
約１１から１２の連続ヌクレオチドである。ウインドウサイズはそれ相応に調節
することができる。異なる分類学上の種の複数の核酸は好ましくは複数配列の全
ての部分が標的核酸のウインドウと比較されるまで同種らしい各ウインドウと比
較される。複数の核酸の配列が少なくとも６０％、好ましいのは少なくとも７０
％、さらに好ましいのは標的核酸とのウインドウ配列とも同種である部分を少な
くとも８０％、最も好ましいのは９０％持っているものを同種らしい配列とみな
す。
【００７６】 配列の類似性検索は手ですることもできるが、またはいくつかの入手可能な当
業者に知られているコンピュータプログラムを使って行うこともできる。好まし
くはＢｌａｓｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムなどを使
うことができ、これらは当業者が入手可能でよく知られている。Ｂｌａｓｔはヌ
クレオチドおよびタンパク質配列データベースの分析をサポートすされるために
設計されたＮＣＢＩの配列類似性検索ツールである。Ｂｌａｓｔは例えばインタ
ーネット経由でアクセスできる。HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLA
ST" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。公開ドメインデータベース又は、地
方でも入手可能な検索に使えるデータベースで、一般に使えるＢｌａｓｔの地方
バージョンがＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅにより提供されている。ＧＣＧ Ｐａｃｋ
ａｇｅＶ．９．０は配列を編集しマッピングし、比較して位置合わせすることに
より分析できる１００を超える相互に関係したソフトウェア・プログラムを含む
市販のソフトウェアパッケージである。ＧＣＧ Ｐａｃｋａｇｅに含まれる他の
プログラムには、例えばＲＮＡ二次構造の予測、核酸フラグメントの組み立てお
よび進化分析を容易にするプログラムである。さらに顕著な遺伝子データベース
（ＧｅｎＢａｎｋ，ＥＭＢＬ，ＰＩＲ，及び ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）がＧＣＧ
Ｐａｃｋａｇｅと一緒に頒布され、検索及び操作プログラムに充分アクセスで
きる。ＧＣＧはインターネット経由で、例えば、HYPERLINK "http://www.gcg.co
m/" http://www.gcg.com/ でアクセスできる。ＦｅｔｃｈはＧＣＧの中で入手可
能なツールで、アクセスナンバーを基にした注釈つきＧｅｎＢａｎｋの記録を入
手することができ、Ｅｎｔｒｅｚ同様である。他の配列類似性検索は、Ｇｅｎｅ
Ｗｏｒｌｄ およびＰａｎｇｅａからＧｅｎｅ Ｔｈｅｓａｕｒｕｓで行うこと
ができる。ＧｅｎｅＷｏｒｌｄ ２．５は、ポリヌクレオチドおよびタンパク質
配列の分析用に自動化され、フレキシブルで高スループットな分析ができる。Ｇ
ｅｎｅＷｏｒｌｄは自動分析及び配列の注釈を可能にする。ＧＣＧ同様、Ｇｅｎ
ｅＷｏｒｌｄは、いくつかのツールを同種検索、遺伝子発見、複数配列の位置合
わせ、二次構造予測およびモチーフ同定用に組み込んでいる。Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｓａｕｒｕｓ １．０ｔｍは複数の情報源から情報を提供する公共およびローカ
ル用データベースのため関連データモデルを提供する配列および注釈データの購
読サービスである。
【００７７】 その他、選び得る配列類似性検索は、例えばＢｌａｓｔＰａｒｓｅで行える。
ＢｌａｓｔＰａｒｓｅはＵＮＩＸのプラットホーム上で動くＰＥＲＬスクリプト
で、上記の方法で自動的に実行される。ＢｌａｓｔＰａｒｓｅは標的アクセス番
号を取り込み、図３に説明されているフローチャート記載の好ましいプロセスを
通して各番号を取り込む。ＢｌａｓｔＰａｒｓｅはすべてＧｅｎＢａｎｋ分野を
構文分析して「タグで区切った」テキストにし、検索及び分析をより容易にする
ため「関連データベース」フォーマットに保存する。その結果、柔軟性が得られ
る。最終結果は完全に構文分析された一連のＧｅｎＢａｎｋレコードで、注釈つ
き関連データベースのように容易にソート、ふるいがけ、照会ができる。
【００７８】 配列類似性検索およびデータ編集できる他のツールキットは、これもまたＮＣ
ＢＩのＳＥＡＬＳである。このツールセットはパールとＣで書かれ、どのコンピ
ュータプラットホームでも動かすことができ、この言語をサポートしている。こ
れは例えば、HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Walker/SEALS/" http:/
/www.ncbi.nlm.nih.gov/Walker/SEALS/ からダウンロードすることができる。こ
のツールキットはＢｌａｓｔ２またはｇａｐｐｅｄ ｂｌａｓｔへアクセスする
ことができる。またｔａｘ＿ｃｏｌｌｅｃｔｏｒと言うツールをもっている。こ
れはｔａｘ＿ｂｒｅａｋとの関連でＢｌａｓｔ２の出力を構文分析して、それぞ
れの存在する種に関する問い合わせ配列に対し最も同類らしい配列の識別子を返
してくる。他の有用なツールｆｅａｔｕｒｅ２ｆａｓｔａであり、注釈を基に入
力された配列から配列フラグメントを抽出する。このツールの代表的な用途は、
ｃＤＮＡ配列の５' 非翻訳領域を含む配列ファイルを作り出すことである。
【００７９】 好ましくは、配列類似性検索で上述のように、標的核酸と相同である異なる分
類学の種からの複数の核酸について、その中に標的核酸のオーソログを見つける
ためにさらに記述する。オーソログは遺伝子分類学上定義付けられた用語で、著
しく相違する生物種の２つの遺伝子が類似の配列を持ち、その結果、生物体の構
造内で類似の機能を果たすことを言う。反対にパラローグは一つの種内の遺伝子
複製時に生じるが、新しい機能を発達させる遺伝子であり、アイソタイプと言わ
れる。オプションとしてパラローグ検索もまた行うことができる。オーソログ検
索を行うことにより、広い範囲の生物体から同種の配列の膨大なリストが得られ
る。従って、これらの配列はオーソログとして、規準を満たす最良の代表的配列
を選択するために分析される。オーソログ検索は例えばｃｏｍｐａｒｅを含む当
業者が入手し得るプログラムにより行うことができる。好ましくはオーソログ検
索が配列のそれぞれに対してＧｅｎＢａｎｋの注釈を完成し構文分析するようア
クセスを行って実行する。現状ではＧｅｎＢａｎｋからの記録は「フラットファ
イル」で自動化分析には理想的に適合していない。好ましくはオーソログ検索は
Ｑ−Ｃｏｍｐａｒｅプログラムを用いて行われる。Ｑ−Ｃｏｍｐａｒｅプロトコ
ルの好ましい段階は図４のフローチャートに記されている。Ｂｌａｓｔ Ｒｅｓ
ｕｌｔ−Ｒｅｌａｔｉｏｎデータベースは図３に書かれてており、図３に書かれ
ている注釈関連データベースはＱ−Ｃｏｍｐａｒｅプロトコルの中で使用され、
その結果は種間配列プログラムの中で以下に述べるように比較するためのオーソ
ログ配列のリストになる。
【００８０】 上記類似性検索はカットオフ値に基づく結果でありｅ−ｓｃｏｒｅと言われる
。ｅ−ｓｃｏｒｅはヌクレオチドの一定のウインドウ内でのランダムな配列マッ
チの確立を示している。ｅ−ｓｃｏｒｅが低ければマッチングはよくなる。当業
者はｅ−ｓｃｏｒｅに慣れている。ユーザーは厳重なｅ−ｖａｌｕｅカットオフ
または望ましい同一性の度合いを上記のように定義している。本発明の態様にお
いて原核細胞の分子相互作用部位が同定された場合、同定されたどのような同一
性のヌクレオチド配列もヒトのものでないことが好ましい。
【００８１】 本発明の態様では、この必要とされる配列はオーソログデータベースを検索す
ることにより得られた。このようにデータベースの一つはＨｏｖｅｒｇｅｎであ
り、脊椎動物のオーソログの巡回して得られたものである。オーソログのセット
がこのデータベースからエクスポートされ、そのまままたは上記のように配列類
似性検索のための種として使われる。例えば非脊椎動物のオーソログの検索が望
まれる。Ｈｏｖｅｒｇｅｎは、例えば、http://pbil.univ-lyonl.fr/pub/hoverg
en/ からダウンロードできる。原核細胞のオーソログのデータベースＣＯＧＳは
入手可能でインターネット上で相互に使用できる。例えば、HYPERLINK "http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/" http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/ で見ることが
できる。
【００８２】 本発明のもう一つの態様として、異なる分類上の種からの複数の核酸のヌクレ
オチド配列を標的核酸のヌクレオチド配列ｄｂ ＥＳＴのようなものを用いて配
列類似性検索を実施し、仮想の文字列にした。ＥＳＴ情報の使用は２つの明らか
な理由がある。第１はＧｅｎＢａｎｋデータベースの中で進化論的明確な生物体
の中にヒト遺伝子のオーソログを同定する能力に限られている。さらにこれらの
進化的にあきらかな生物体からＥＳＴを同定する方向で努力が払われているｄｂ
ＥＳＴはオーソログ情報のよりよいソースなったようである。 第２にヒトゲノムを配列する試みで、完成したのは１０％未満である。このよ
うにヒトｄｂＥＳＴは第１の目標を同定するためにより多くの情報を提供すると
思われる。これはヒトゲノムの配列は完成に近づいていくためである。ＥＳＴは
短く、使うために組み立てる必要がる。好ましくは上記のようにヒト配列を除外
してｄｂＥＳＴに対し、非常に厳しい状態で、配列類似性検索はＳｍｉｔｈ−Ｗ
ａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使って行われた。ｄｂＥＳＴには新しい配列への
正確な検索のため挿入および削除があり、配列エラーを含み、使用された検索法
はこれらのギャップを許容しなければならない。入手可能なクローンはどれも配
列するから、多くのオーバーラップしている領域がデータベースに報告される結
果になった。フルレングスまたは部分的なヒト以外のＲＮＡの「仮想の文字化」
はオーバーラップしているＥＳＴ配列は「フルレングス」文字列が得られるまで
５' および３' 両方向へ伸ばすというプロセスによって構成される。他の態様で
はキメラのような仮想の文字化が構成されている。
【００８３】 その結果得られた仮想文字化が既に特徴をもったＲＮＡ分子を表象することも
ありまた新しいＲＮＡ分子が今まで知られている生物学的機能をも持たなくなる
こともある。ＴＩＧＲ ＨｇＩデータベースはＴＩＧＲ−Ａｓｓｅｍｂｌｅｒと
言う仮想の文字を作るエンジンを利用可能にＧＬＡＸＯ− ＭＲＣおよびＰａｎ
ｇｅａからのＧｅｎｅＷｏｒｌｇは仮想の文字化の構築に同様に役立っている。
既述Ｆｉｎｄ Ｎｅｉｇｂｏｒｓ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｅ ＥＳＴ Ｂｌａ
ｓｔは仮想の文字化にも使うことができる。
【００８４】 図１に関連して、上記のオーソログや仮想文字化は配列類似性検索やオーソロ
グ・検索を通じて異なる種から複数の核酸の中に保留されていた、少なくとも１
つの配列領域および標的核酸が同定された、２０。種間の配列比較は多くのコン
ピュータ・プログラムを用いて行なうことができ、そのプログラムは入手可能で
、当業者の人々にはよく知られている。好ましくは、種間配列比較はＣｏｍｐａ
ｒｅを用いて行なわれ、それは入手可能で当業者には知られたものである。Ｃｏ
ｍｐａｒｅはＧＣＧツールで、ｗｉｎｄｏｗ／ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ｃｒｉｔ
ｅｒｉｏｎを使用する配列の対での比較を行なうことを可能にする。Ｃｏｍｐａ
ｒｅは特定の品質の突き合わせが見つかるポイントを含む出力ファイルをつくる
。これらのものを構築するには、他のＧＣＧｔｏｏｌ、ＤｏｔＰｌｏｔを用いる
。
【００８５】 また、保存された配列領域の同定は、上記のようにＣｏｍｐａｒｅＯｖｅｒＷ
ｉｎｓとの組合せでＱ−Ｃｏｍｐａｒｅから発生したオーソログ配列を用いて、
種間配列比較により行なわれる。好ましくは、比較するための配列のリスト、即
ち、図４に示したＱ−Ｃｏｍｐａｒｅから生成したオーソログ配列はＣｏｍｐａ
ｒｅＯｖｅｒＷｉｎｓアルゴリズムにいれる。ＣｏｍｐａｒｅＯｖｅｒＷｉｎｓ
の中の好ましいステップ段階は図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃに記載されている。好ま
しくは、種間配列比較は対方式の配列比較で行なわれる。そこで、質問の配列は
、中心となる標的配列上のウィンドウ上をスライドする。好ましくは、ウィンド
ウは約９から約９９のヌクレオチドであることである。
【００８６】 標的核酸のウィンドウ配列および上記のようにして得られた、複数の核酸配列
の問題配列の間の配列一致は、好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは
少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、一番好ましくは少なく
とも９０％である。最も好ましいしきい値を選ぶ方法は、コンピュータで自動的
に、すべてのしきい値が５０％から１００％の間とし、それからユーザーにより
支給される判定基準に基づいてしきい値を選ぶ。一つのこのような基準値はしき
い値を正確にｎヒットが返るようにする。この場合、ｎは普通３とする。このプ
ロセスは、上記のように複数の核酸のメンバーである、問題の核酸上のそれぞれ
の塩基を、マスターの標的配列上のそれぞれの塩基と比較する。得られたスコア
・マトリックスは散布・プロットとして構築できた。ある一定の場所での一致の
密度を基に、それは、点がない、隔離した点、または点の組が非常に密に集まり
、その結果、線のようになる。しかし、線は細く、第１次の配列の一致を示して
いる。代表的なこのような種間配列比較の代表的な散布・プロット図は図６に描
写されている。核酸分子内配列の保存、特にＲＮＡのＵＴＲ、は保存された調整
要素のインジケータであり２次構造を持っているようである。種間配列比較の結
果は、ＭＳ Ｅｘｃｅｌを用いて分析可能で、完全に自動化された方法により、
目で見得る基本的なツールを用いて行い、この方法は当業者の間でよくしられて
いる。
【００８７】 図１において、核酸標的のヌクレオチド配列および分類学的異種、好ましくは
はオーソログを通じて、複数の核酸のヌクレオチド配列の間に保存された少なく
とも１ヶの領域が確認され、その保存された領域は二次構造を持つか否か分析す
る、３０。同定され、保存された領域が二次構造を持つか否かを決めることは、
当業者に知られている多くの方法で行なうことができる。二次構造の決定は、好
ましくは、自己相補性比較、位置合わせおよび共分散分析、二次構造予測あるい
はこれらの組合せで行なわれる。
【００８８】 本発明の一つの態様として、二次構造解析は、位置合わせおよび共分散分析で
行なわれた。位置合わせおよび共分散分析のための、多くのプロトコルは、当業
者には知られている。好ましくは、位置合わせはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて行な
われ、それは当業者の人々にとっては入手可能かつよく知られている。Ｃｌｕｓ
ｔａｌＷは複数配列位置合わせのための方法であり、ＧＣＧの一部ではないが、
現存のＧＣＧツール・セットの延長として加えることができ、局部的な配列に用
いられる。ＣｌｕｓｔａｌＷは、インターネットを通じて、例えば http://dot.imgen.bcm.tmc.edu:9331/multi-align/Options/clustalw.html. からアクセスできる。ＣｌｕｓｔａｌＷはまた、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｎｕｃ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９４，２２，４６７３−４６８０の中に記載されて
おり、これは関連により併合されたものである。これらのプロセスは、保存され
たＵＴＲ領域を早期に同定し、自動的な使用になるようスクリプトしておくこと
ができる。Ｓｅｑｅｄ、ＵＮＩＸのコマンドライン・インターフェイスは当業者
によく知られており、入手可能である。これは、大きな配列から選択した局部的
領域を抽出することができる。色々な異なる種からの多くの配列をクラスターし
、その後の分析のために位置合わせすることができる。
【００８９】 本発明の一つの態様として、すべての可能な、ＣｏｍｐａｒｅＯｖｅｒＷｉｎ
ｄｏｗｓ比較による、対方式の出力は集積し、ＡｌｉｇｎＨｉｔｓというプログ
ラムを使用して、対照配列と位置合わせをする。このプログラムの作業のダイヤ
グラムが図５Ｄに示されている。このプログラムは当業者により再生することが
できる。このプログラムの好ましい目的は、対方式で比較したすべてのヒットを
元の基準配列の上に戻そうというものである。ＣｏｍｐａｒｅＯｖｅｒＷｉｎｄ
ｏｗｓおよにＡｌｉｇｎＨｉｔｓと組合せるこの方法は、どのアルゴリズムより
も局部的位置合わせ（２０−１００塩基以上）を提供している。この局部的位置
合わせは、後に述べるように共変化またはＲｅｖＣｏｍｐのような日常的なもの
に見られる構造の場合必要である。このアルゴリズムは位置合わせ配列のｆａｓ
ｔａ ｆｉｌｅを書き込む。既述のように、このアルゴリズムは、単一塩基の挿
入や削除を訂正しない。このことは、通常アウトプットを他で紹介したＣｌｕｓ
ｔａｌＷで出力することで実施できる。これをＣｏｐａｒｅＯｖｅｒＷｉｎｄｏ
ｗｓおよびＡｌｉｇｎＨｉｔｓなしに、それ自身でＣｌｕｓｔａｌＷを使用する
場合と区別することが重要である。
【００９０】 共変化は系統発生分析で、一次配列情報を共通二次構造予測に使う場合に用い
られるプロセスである。共変化は次の文献に記載されている（これらは関連によ
る併合により記載された）。Ｇｕｔｅｌｌら、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ Ｐｅｒｆｏｒ
ｍｅｄ Ｄｕｒｉｎｇ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｉｎ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮ
Ａ ＧｒｏｕｐＩ Ｉｎｔｒｏｎｓ，Ｇｒｅｅｎ，Ｅｄ．，Ａｕｓｔｉｎ：Ｌａ
ｎｄｅｓ，１９９６；Ｇａｕｔｈｅｒｅｔら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，
１９９７，２５，１５５９−１５６４；Ｇａｕｔｈｅｒｅｔら、ＲＮＡ，１９９
５，１，８０７−８１４；Ｌｏｎｄｍｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１９９５，９２，１０５５５−１０５５９；Ｇａｕｔｈｅ
ｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９５，２４８，２７−４
３；Ｇｕｔｅｌｌ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９４，２２，３５０２
−３５１７；Ｇｕｔｅｌｌ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９３，２１，
３０５５−３０７４；Ｇｕｔｅｌｌ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９３
，２１，３０５１−３０５４；Ｗｏｅｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，３１１９−３１２２；およびＷｏｅｓｅら、Ｎ
ｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９８０，８，２２７５−２２９３。好ましくは
、共分散分析には、共分散ソフトウエアが使われる。好ましくは、共変化、位置
合わせからＲＮＡ構造の比較分析用の一組のプログラムが使用される。共変化は
一次配列情報の系統樹分析を共通二次構造分析予測に使用する。共変化はインタ
ーネットを通じて、http://www.mbio.ncsu.edu/RNaseP/info/programs/programs
.html.から入手できる。このプログラムの一つのＶｅｒｓｉｏｎの完全な既述が
出版されている。（Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｗ．１９９１ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｍａ
ｃｉｎｔｏｓｈ ｃｏｍｐｕｔｅｒ．ＣＡＢＩＯＳ７：３９１−３９３）現在の
ｖ４．１で、これは標準共変化分析、代償的な塩基変化および相互情報分析を
含むＲＮＡ配列位置合わせから、共変化分析の種々のタイプを行なうことができ
る。このプログラムはよく書かれており、厖大な実例ファイルが付いている。こ
れは、スタンドアロン・プログラムとして集積しＨｙｐｅｒｃａｒｄを必要とし
ない（非常に小さい ｓｔａｃｋ ｖｅｒｓｉｏｎが含まれている）。このプロ
グラムは、ＭａｃＯＳｖ７．１以上のどんなＭａｃｉｎｔｏｓｈ システム環境
でも動く。より高速機（６８０４０またはＰｏｗｅｒＰＣ）の方が、相互情報分
析や大きな配列の位置合わせ分析には適当である。
【００９１】 本発明は他の態様では、二次構造分析が二次構造予測によって行なわれる。熱
動力学パラメーターおよびエネルギー計算をもとにしたＲＮＡ二次構造を予測す
るアルゴリズムが沢山ある。好ましくは、二次構造予測は、Ｍ−ｆｏｌｄ ｏｒ
ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２．５２を用いて行なわれる。Ｍ−ｆｏｌｄは
インターネットを通じて、例えば、HYPERLINK http://www.ibc.wustl.edu http:
//www.ibc.wustl.edu-zuker/ma/form2.cgiまたはＵＮＩＸプラットホーム・ユー
スからダウンロードすることができる。ＧＣＧ ｐａｃｋａｇｅの一部として入
手できる。ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２．５２はＭ−ｆｏｌｄアルゴリズム
のウィンドウ版でインターネットを通じて、例えば、http://128.151.176.70/RN
A-structure.htmlからアクセスできる。
【００９２】 本発明の他の態様としては二次構造分析は自己相補性比較により行なわれる。
好ましくは、自己相補性比較は、前述の通りＣｏｍｐａｒｅを使用しておこなわ
れる。さらに好ましくは、Ｃｏｍｐａｒｅは従来からのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃ
ｋ Ｇ−Ｃ／Ｃ−ＧまたはＡ−Ｕ／Ｕ−Ａ対に加えてＧ−ＵまたはＵ−Ｇベース
対も説明する。ペアリング・マトリックスを拡張するよう修正できる。このよう
に、修正Ｃｏｍｐａｒｅプログラムは一定の配列内では、すべての可能な塩基対
の予測を始めている。前述のように、小さい保存された領域、好ましくはＵＴＲ
はオーソログのシリーズの一次配列比較を基に同定される。修正Ｃｏｍｐａｒｅ
では、これらの配列のそれぞれは、自己の逆相補に比較され、図７は代表的な自
己相補分析を示している。許容される塩基対には、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ Ａ−Ｕ，Ｇ−Ｃペアリングおよび非規定Ｇ−Ｕペアリングがある。すべての入手
可能なオーソログの自己相補性プロットおよび最も繰り返しが多いパターンに対
する選択は、それぞれ可能性のある重ねられたたコンフィギュレーションになる
。図８は代表定なオーバーレイの実例である。これらのオーバーレイは上記のエ
ネルギー関連で強制されたり、最もありそうな二次構造を推論することを含め、
追加の制約との関連で使用することができる。
【００９３】 本発明の他の態様としてＡｌｉｇｎＨｉｔｓの出力はＲｅｖＣｏｍｐというプ
ログラムで読まれる。このプログラムのブロック・ダイアグラムは図５３に示さ
れている。このプログラムは、当業者の人々によって再生可能である。このプロ
グラムの好ましい目的はＲＮＡ二次構造予測ための塩基対リング・ルールおよび
オーソログを使用することである。ＲＮＡの二次構造はステムと言われる単一鎖
領域および塩基対領域からできている。進化によって保存された構造について研
究されているが、オーソログ配列の一定の位置合わせにおける最もあり得るステ
ムは殆どの配列で形成され得た例である。可能性のあるステム形成または塩基対
リングのルールは、ＮＭＲのような他の方法で決められたステムの塩基対リング
分析することにより決定される。ＲｅｖＣｏｍｐの出力はこの構造を形成できる
オーソログ・セット・メンバーのパーセントで位置付けられる。このアプローチ
はパーセントしきい値法を用いるが、ノイズ配列に対して感度が低い。ノイズ配
列は本当はオーソログでないか、配列の同一性が高かったので、探している構造
の例ではなかったが、ＡｌｉｇｎＨｉｔｓの出力に出てしまったものである。与
えられた配列のセットに対して、逆相補マトリックスを生成するために、ＰＣ上
で動かすのには、Ｖｉｓｕａｌ ｂａｓｉｃ ｆｏｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ（ＶＢＡ）およびＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを用い、それらには非常に
類似のアルゴリズムが使われている。
【００９４】 上記の二次構造研究の結果は、位置合わせと共変化、自己補正性分析、例えば
、Ｍ−ｆｏｌｄまたはそれ以上のような二次構造予測が、どのように行なわれた
かが、標的核酸および異種の分類学上の種からの複数の核酸中の保存された領域
内における、二次構造の同定である、４０。同定された代表的な二次構造には、
次のものを含むが、それに限定されるものではない、即ち、バルジ、ループ、ス
テム、ヘアピン、ノット、トリプルインタラクト、クローバーの葉、またはらせ
ん、あるいはそれらの組合せである。その代わり、新しい二次構造が同定される
。
【００９５】 本発明のその他の態様について、保存領域の二次構造が同定された場合、既述
のように、二次構造を持つ保存領域のための、少なくとも一つの構造上のモチー
フが同定される。これらの構造上のモチーフは上記の同定された二次構造と対応
する。例えば、自己相補性による二次構造の分析は、一つのタイプの二次構造を
提供し、その場合、Ｍ−ｆｏｌｄによる分析は、他の二次構造を提供する。二次
構造分析で同定された、すべての可能性のある二次構造は、構造モチーフのファ
ミリーにより代表される。
【００９６】 異なる分類学上の種からの核酸の二次構造と同様に、標的とする核酸の二次構
造が同定されると、上記のように一次のヌクレチド配列よりもさらに核酸は構造
をもとに検索することにより同定される。上記のようにして見つかった二次構造
類似か同一二次構造をもった付加された核酸は、上記のように、構造上のモチー
フに対する記述子要素のファミリーを構成することにより同定され、そして、記
述子要素に対応する二次構造を持つ他の核酸を同定する。二次構造を持つどのよ
うな、あるいは、すべての核酸の組合せは、データベースの中に集積できる。全
体のプロセスは、他の標的とする核酸に対しても繰り返され、複数の異なる二次
構造グループを生成し、それがデータベースへ集積できる。このように、分子相
互作用部位のデータベースは、このような発明を記述することにより集積できる
。
【００９７】 仮定の構造上のモチーフが、二次構造分析から決定された後、構造記述子要素
のファミリーが構築される。好ましくは、上記の構造上のモチーフは記述語のフ
ァミリーに転換される。代表的な記述子要素は、図９に示されている。当業者は
記述語の構造に親しみを持っている。構造記述語は、例えばＬａｆｅｒｒｉｅｒ
ｅら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，１９９４，１０，２１１−２
１２（関連により併合された）に記載されている。記述子要素の異なる構造は、
二次構造分析から固定された構造的モチーフのそれぞれに対して構成されている
。簡単には、二次構造は図９に示されるように遺伝子テキストのストリングに転
換される。新しいモチーフに対しては、更なる生化学的分析、例えば化学的マッ
ピングあるいは突然変異誘発により、構造予測を確認する必要があるだろう。記
述語エレメントは、多様な厳密さを持つことが決定されるだろう。
【００９８】 例えば、図９によれば、ステムの一番目の領域を含むＨ１と名付けられた領域
はＮＮＮ：ＮＮＮと記述することができ、それはＧ−Ｃ、Ｃ−Ｇ、Ａ−Ｕおよび
Ｕ−Ａを含む、何らかの相補的な塩基対リングを予想させる。Ｈ１領域もＣ−Ｇ
またはＡ−Ｕなどの塩基対リングしか含まない。さらに、記述語エレメントはゆ
らぎを許容するよう定義付けることもできる。このように、記述語のエレメント
は使用者にとって必要とされる厳密さのレベルを保っていると言うことができる
。出願人の発明は、このように、異なる記述語エレメントを含むデータベースを
指向している。
【００９９】 構造記述子要素のファミリーが構築された後、構造記述子要素に対応する二次
構造をもつ核酸が同定される。好ましくは、構造記述子要素に対応する二次構造
をもつ核酸は、少なくとも一つのデータベースを検索して、クラスタリングと分
析を行い、オーソログの確認、またはそれらの組合せを行なうことにより同定さ
れる。このように、同定された核酸は、記述子要素により定義付けられる二次構
造の範囲内に入る二次構造を持っている。このようにして、同定された核酸は、
記述子要素の厳密さにより標的核酸と同じか殆ど同じである。
【０１００】 本発明の一つの態様として、構造記述子要素に対応する二次構造を持つ核酸が
、少なくとも一つのデータベースを検索することにより同定される。どのような
遺伝子データベースも検索することができる。好ましくは、そのデータベースは
メッセンジャーＲＮＡ内の非翻訳領域を集積したＵＴＲデータベースである。Ｕ
ＴＲのデータはインターネット経由でftp://area.ba.cnr.it/pub/embnet/databa
se/utr/ を通じてアクセスすることができる。好ましくは、このデータベースは
、コンピュータ・プログラムＤａｎｉｅｌ Ｇａｕｔｈｅｒｅｔから入手できる
モチーフ・検索・ツールであるＲｎａｍｏｔ。同じモチーフを持っているそれぞ
れの新しい配列は、パブリックドメインのデータベースから、配列付加を同定し
ているか質問を受ける。これらの結果は、既述のようにＵＴＲで、オーソログ配
列追加というパターンの再発について分析した結果、ＲＮＡ二次構造のデータベ
ースが構築された。当業者はＲｎａｍｏｔをよく知っている。簡単に言えば、Ｒ
ｎａｍｏｔは図９に示されている中の一つのように、記述語ストリングを取り、
可能性のある一致に対してＦａｓｔａフォーマットのデータベースを検索する。
記述語は正確にヌクレオチドと一致するため、非常に特定的で、組み込まれた同
義性をもつこともできる。ステムやループの長さも特異なものにすることもでき
る。一本鎖ループ領域は可変長さとすることができる。Ｇ−Ｕペアリングは許容
され、ゆらぎパラメーターとして特異なもにすることができる。許容し得るミス
マッチとしては、記述語の定義に含ませることもできる。以前の分析に基づき、
その生物学的役割が分かっていれば、機能上の重要性をモチーフに割り当てるこ
とができる。鉄反応成分のような調節領域として知られているものは、この技術
を用いて発見された（後記実施例１参照）。本発明の態様において、原核細胞の
分子相互作用部位を持つデータベースが集積され、ヒト配列の検索では繰り返し
は好ましいが、逆にヒト配列が見つかったときは捨てている。
【０１０１】 本発明の他の態様では、例えば、Ｒｎａｍｏｔを用いるＵＴＲデータベースを
検索することで同定された核酸は、ゲノム内のその場所を決定するためにクラス
ターされ分析される。Ｒｎａｍｏｔで提供された結果は、簡単に二次構造を含む
配列を同定したが、ゲノム内の配列場所といった指摘はなかった。クラスタリン
グと分析は後述のように、好ましくＣｌｕｓｔａｌＷで行なわれる。 本発明の他の実施様態において、前述のようにクラスタリングと分析が行なわ
れ、上述のようにオーソログが確認される。しかし、上記のようにオーソログが
同定されたこととは対照的に、それは一次ヌクレオチド配列を基に単独で同定さ
れ、この新しいオーソログの配列は、Ｒｎａｍｏｔを使用して確認された核酸を
用いて同定される。上述のようにオーソログの同定はＢｌａｓｔＰａｒｓｅまた
はＱ−Ｃｏｍｐａｒｅを用いて行なわれる。本発明の態様において、分子相互作
用部位を含むデータベースは集積され、ヒトのオーソログを見付けることを繰り
返し、反対にヒトオーソログが見つかったら捨てる。
【０１０２】 構造記述子要素に対応する二次構造を持つ核酸が同定された後、いくらかまた
は全部のヌクレオチド配列が、当業者に知られている標準的なコンパイルプロト
コルにより、データベースに収集され得る。一つのデータベースは真核細胞の分
子相互作用部位だけ、他のデータベースでは、原核細胞の分子相互作用部位のも
のだけを集める。 本発明は、特定の生物のＲＮＡ内にあり、少なくとも１つ、好ましくはいくつ
かのＲＮＡ中にもある分子相互作用部位を含むオリゴヌクレオチドを指向してい
る。オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が選択され、上記分子相互作用部位
の二次構造を提供することが決められた。上記標準核酸のヌクレオチド配列より
オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の方が好ましい。反対に複数の異なる種
からの核酸のヌクレオチド配列よりヌクレオチド配列の方が好ましい。それは分
子相互作用部位を持っている。分子相互作用部位は、分子相互作用部位で結合し
たとき、少なくとも一つの分子に対する結合部位になり、特定生物体内で、ＲＮ
Ａの発現を修飾する。
【０１０３】 本発明はまた、分子相互作用部位を含む、オリゴ核酸に向けられており、その
オリゴ核酸は、原核細胞ＲＮＡにあり、また少なくとも一つの追加する原核細胞
のもあり、そこでは、分子相互作用部位は、それが分子相互作用部位に結合する
場合には、少なくとも分子の、結合部位として役立ち、原核細胞ＲＮＡの発現を
修飾する。追加する生物体はすべて真核生物および原核生物から運ばれ、細胞は
選択された生物種のように同じ生物種ではない。オリゴヌクレオキドとその変性
物は、当業者によく知られている。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、分
子相互作用部位と結合する天然に存在する分子を検出する研究用反応剤として使
用できる。本発明のオリゴヌクレオチドは、研究・診断および治療用細胞内で天
然に存在する分子相互作用部位と張り合うためのおとりとして使用できる。分子
相互作用部位に結合する分子はＲＮＡの発現を増強したり減少させたりして、Ｒ
ＮＡを修飾する。このオリゴヌクレオチドはまた、農業用、工業用およびその他
の用途に使用できる。
【０１０４】 本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドが医薬品用に担体を組合せた場合を含
む、薬剤組成物を指向している。「医薬品用担体」とは医薬品として受け付け得
る溶媒、希釈液、懸濁剤、その他の医薬品的に不活性なビヒクルで、一つまたは
それ以上の核酸を動物へ送達する。そして、これらのことは、当業者にはよく知
られているものである。担体は、液体または固体で、「投与の計画方法を心にお
いて」、要求されるバルク、コンシステンシー等医薬組成物の他の成分を結合し
たとき送達する。代表的な医薬品用担体には次のものが含まれるが、それに限定
されるものではない。例えば、結合剤（例えば、プリゲラチナイズド（ｐｒｅｇ
ｅｌａｎｉｓｅｄ）・トウモロコシ・澱粉、ポリビニルピロリドン、またはヒド
ロキシプロピルメチルセルロースなど）、フィラー（例えば、ラクトースおよび
その他の糖、ミクロクリスタリンセルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシ
ウム、エチルセルロース、ポリアクレートまたは第二リン酸カルシウムなど）、
潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイダル・シ
リコン・ジオキサイド、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、水添植物油、コー
ンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリムなど
）、崩壊剤（例えば、硫酸ラウリルナトリウム塩など）。
【０１０５】 本発明は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計合成する低分子のコンビナトリアルライ
ブラリーを用いる、計算法を指向している。ライブラリーメンバーは一般的にｉ
ｎ ｓｉｌｉｃｏで生成する。本発明はまた、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでライブラリ
ーメンバーを生成、生じた情報を後からアクセスして使用するために、関連デー
タベースへ入れる方法である。本明細書のこの目的のため、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ
はコンピュータ・メモリー内、即ちシリコンその他のチップに創出すること。特
記しなり限り、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏは仮想を意味する。
【０１０６】 本発明の方法により、おのおのの化合物またはライブラリーメンバーは、フラ
グメントと言われる、その成分または構成成分に区切られる。このように、生成
された化合物は構成成分であるフラグメントを含み、その結果それぞれのフラグ
メントの分子式の合計は、それを足し合わせれば、全体として生成した化合物の
分子式になる。この解体は化学的直感により色々な方法で行なえる。このように
して、多くの成分とのフラグメントは同定され、そのおのおのは、広範囲な化合
物を生成するために入手可能な反応剤や反応を生み出すのに貢献する。さらに、
それぞれのフラグメントは、少なくとも一つの反応剤と適合する、その化合物は
、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで発生したもので、その要求されるフラグメントを、その
化合物に入れるために使用される必要な化学薬品である。化合物の解体は、反応
剤の合成の容易さ、購入可能性、あるいはその組合せをもとにしている。それぞ
れのフラグメントおよび反応剤は関連データベースの中に蓄積され、データベー
ス内の特徴を確認するため、記録されている。フラグメントは色々な出発原料ま
たは反応計画から入手可能になっている。従って、ライブラリーが生成したとき
、それは結果として、データベースを作ることになり、このライブラリーを作る
のに使用されたフラグメントは、データベース内に貯えられ対応する反応剤およ
び反応条件のセットを使用する。他のライブラリーが生成される時には、データ
ベース内に貯えられているフラグメント情報は、化合物の新しいライブラリーの
生成に使用可能になる。同様に、第３のライブラリーが生成されると、もっと多
くの量のフラグメント、反応剤・反応情報がデータベース内で使用可能になる。
このようにして、本発明の方法は、化合物のライブラリーを作るのに伴い、デー
タベースを生じるダイナミックな方法であることを示している。初めのライブラ
リーの生成は、フラグメント、反応剤および変換が望ましいライブラリーには必
要である。しかし、データベースが成長すると、多くのフラグメント・反応剤が
データベース内で使用可能となり、そのことが、それ以後のライブラリーの生成
を簡単にし、より日常的な組合せ合成努力が行なえ、ずっと容易に効率的に行え
るようになる。
【０１０７】 データベース内に記録されたフラグメントは、同定用特性を使って定義付けら
れる。フラグメントを定義付ける同定特性としては、構造上の表示（二次元また
は三次元ファイルのように）、名称、分子量、分子式および付着ポイントまたは
ノード（フラグメントがｉｎ ｓｉｌｉｃｏで生成した化合物の他のフラグメン
トは付着または結合する時の部位を示す）が含まれる。この発明を記載する目的
から二次元表示が使用され、さらには、特定の実在の化学品とは関係ない記号表
示が使用されることにより簡素化される。ここに用いられる記号表示は、単にい
かにフラグメントが、本発明の更なる方法まで追跡できるかを示している。他の
定義付け用特性がデータベースに付けられることもある。追跡したい特性は、デ
ータベース内に含まれ、生物学的データ、化学反応速度またはその他の物理的ま
たは化学的性質である。さらに、フラグメントはまた反応剤を変えることにより
生じ、このような修飾は反応剤の構造を変える変化に基づいてデータベースに加
えられる。同定特性のあるものは、どのフラグメントについても、対応する反応
剤に対しては共通である。このようにして生成された関連フラグメントは、関連
データベース内に貯えられる。
【０１０８】 反応剤を定義する同定特性には、構造特性、名称、分子量、分子式、および例
えば、供給者のような出典、あるいはユーザーにより定義付けされるようなユニ
ークなものがある。反応剤の市販のソースの場合には、カタログ・ナンバー、ウ
ェブのリンクも含む。反応剤および関連フラグメントに関して、同定特性間には
共通の性質が存在することがある。 さらに、本発明に関し、ある化合物が色々の変換の結果となる場合がある。変
換は、本発明では、化学合成に起因する名称である。変換はフラグメントと反応
剤の間の１：１結合である。従って、それぞれの変換は化合物に導入したときの
対応するフラグメントへの特異的な反応剤の変換を示している。ｉｎ ｓｉｌｉ
ｃｏに生成される化合物はその成分であるフラグメントに分けられ、対応する反
応剤が同定された時、各々のフラグメントは変換を記載するために１：１の関係
で対応する反応剤に結びついている。このように、本発明によれば、変換はフラ
グメントのソースと見られており、これによりフラグメントを特定の合成法や反
応に結び付ける。本発明の方法で、変換の記述は、また、使用されることにより
反応に影響を与える、必要な温度、圧力、触媒、活性化剤、溶媒、その他添加物
等の形質変換によって表示されるあらゆる補助反応剤や条件を含む。
【０１０９】 フラグメントと反応剤の１：１の各組合せで異なる変換が起こる場合がある。
従って、各々の変換は、独自のものである。本発明は、それらのフラグメントが
ライブラリーの化合物の中に導入される反応または変換に関連したフラグメント
の追跡を許容している。このように、データベースには化合物がその成分フラグ
メントに関連して生成されることを記載しているだけでなく、これらの化合物を
生産する合成経路、即ち、これらのライブラリー化合物を生成する変換に関連し
て化合物が生成されることを記載している。この方法で、本発明のユーザーは、
必要とするフラグメントを単に選択することで、仮想の化合物ライブラリーを生
成することができる。逆に、ユーザーも化合物の実際の合成に必要な化学的経路
を選択することで、化合物を生成することができる。これは、目的とする化合物
の生成に関連して適切な変換を選択することにより実施される。これに、ユーザ
ーは、目的とする化合物の生成または合成を許容すると期待されるそれらの変換
を選択することを支援する直感またはｉｎ ｓｉｌｉｃｏ専門家システムを用い
る。Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで生成される形転換の各々は関連データベースに蓄積さ
れ、同定特性に関連して記載する。変換を定義付ける同定特性には、フラグメン
ト、反応剤、補助反応剤、または反応剤が化合物に組み入れられるフラグメント
へ転換するのに影響を与えるに必要な条件が含まれる。
【０１１０】 例えば、図１４における、本発明の方法による化合物ＣＩのｉｎ ｓｉｌｉｃ
ｏでの生成について考察する。図１４に示すように、ＣＩの分割（分子式はＣ12 Ｈ18Ｎ2 Ｏ5 Ｓ1 ）で、その成分フラグメントはＦｉ（分子式、Ｈ2 ＮＯ）、Ｆ
ｉｉ（分子式、Ｃ5 Ｈ9 ＮＯ）、Ｆｉｉｉ （分子式、Ｃ7 Ｈ7 Ｏ3 Ｓ）で示さ
れる。Ｆｉはまた、ヒドロキシルアミンの部分であり、固相支持体とつながって
いる。即ちＰ−Ｏ−ＮＨ、ここでＰは固相支持体。それぞれのフラグメントの分
子式の合計は、化合物ＣＩの分子式になる。
【０１１１】 図１５に示すようにＦｉ、ＦｉｉおよびＦｉｉｉのそれぞれは関連データベー
スに蓄積され、構造表示（おそらく、二次元または三次元）、識別名または名称
、分子式および付着ポイントまたは化合物ＣＩ内で他のフラグメントに結合する
フラグメントの部位を意味するノードを含む同定特性に関連して記載される。分
子量などそれ以外の情報もデータベースのフラグメントと関連している。
【０１１２】 図１６に示すように対応する反応剤（Ｒｉ、ＲｉｉおよびＲｉｉｉ）も又関連
データベースに蓄積され同定特性に関連して記載される。反応剤を定義するため
に使用される同定特性には、構造表示、識別語または名前および分子式がある。
フラグメントの場合と同様、分子量のような関連情報および情報源（商業的ソー
スかユーザー供給者か、在庫量、特別な取扱い等）も個別反応剤との関係でデー
タベースに蓄積しておく。
【０１１３】 次に、化合物ＣＩのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ生成に関連する各々の変換もまた、関
連データベースに蓄積される。図１７に示すように変換Ｔｉは反応剤ＲｉとＦｉ
とを１：１関係で結び、ＴｉｉはＲｉｉとＦｉｉとを１：１関係で結び、Ｔｉｉ
ｉはＲｉｉｉとＴｉｉｉとを１：１関係で結ぶ。また、それぞれの変換に関連し
て、必要な反応条件、従って、変換Ｔｉは反応条件αと関連し、Ｔｉｉは反応条
件βに関連し、Ｔｉｉｉは反応条件γに関連している。変換Ｔｉｉｉの場合、反
応剤Ｒｉｉｉはおそらくヒドロキシルアミンで、固形支持体へ付着し、その結果
、フラグメントＦｉｉｉはヒドロキシルアミンの部分で、固体支持体へ付着して
いることを表す。
【０１１４】 それぞれのフラグメントは到着するか、あるいは独自の対応する反応剤で生成
される間、本発明はまた、２またはそれ以上の反応剤を経て生成される、共通の
フラグメントを包み込み、その結果、２またはそれ以上の変換がその同じフラグ
メントへリードする。図１８に示すように、共通のフラグメントＣＨ3 −ＣＨ2 −Ｃ（＝Ｏ）−が変換Ａを経て到着し、それは反応剤Ｘ（酸クロライド）、ＣＨ 3 −ＣＨ2 −Ｃ（＝Ｏ）Ｃｌを用いる。共通のフラグメントはｉｎ ｓｉｌｉｃ
ｏで変換Ｂを経由して、生成された化合物へ導入される。そこでは反応剤Ｙ（酸
無水物）、ＣＨ3 −ＣＨ2 −Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2 −ＣＨ3 を用
いる。従って、本発明のこの方法により、共通のフラグメントは、２またはそれ
以上の異なる反応剤を経由して、従って２またはそれ以上の明確な変換をへて、
その化合物に導入された。
【０１１５】 また、１つの共通の反応剤が、２またはそれ以上の変換を行なって、２または
それ以上の異なるフラグメントになる。次に異なる条件に関連する、２またはそ
れ以上の変換を提示する。例えば、図１９Ａに示すように共通の反応剤Ｚ、ＣＨ 3 −ＣＨ2 −ＮＨ2 は、アルケン・フラグメントをその化合物にＳｃｈｉｆｆ塩
基形成条件下で導入する。これが変換Ｘである。しかし、同じ共通反応剤Ｚもま
た、アミドフラグメントを、別の一組の条件を使い、その化合物に導入するため
に用いることができ、変換Ｙを構成する。このように、共通の反応剤が２または
それ以上の異なるフラグメントをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで生成されている最終化合
物に導入することができ、２またはそれ以上の変換が、それぞれの変換に関連し
た条件下で起こる。
【０１１６】 さらに、一つのフラグメントが、一つの化合物に導入されれば、それがさらに
修飾され、その形成される化合物内で、他の化学変化に影響を与えることなく、
他のフラグメントに転換することがある。一例が図１９Ｂに示されており、共通
の反応剤Ｚ 、ＣＨ3 −ＣＨ2 −Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ2 −Ｃｌについて考察する。共
通の反応剤Ｚ は、次の構造ＣＨ3 −ＣＨ2 −Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2 −を持つフラ
グメントに対応する。共通の反応剤Ｚ は、還元脱水に適した条件下で、変換Ｘ
‘に代表されるアルケン・フラグメントの最終化合物への導入に使用することも
できる。しかしながら、共通反応剤Ｚ は還元に適した条件Ｆで、ヒドロキシア
ルキルフラグメントを最終化合物に導入させることにも使用できる。これを変換
Ｙとする。
【０１１７】 本発明は、記号表現の関連で、より一般的に記述してもよい。記号表現は本発
明の方法説明に用いた。その理由は、このような表現は、特別の化学に限定され
るものではないからである。記号表現は単に複数の化学薬品を用いた本発明の使
用方法を示しているにすぎない。本発明を記述で提示するのに用いる、それぞれ
の記号は一つの化合物または複数の化合物を示してもよい。その理由は、本発明
は一つの化合物を追跡するのに限らず、生成できる多くの化合物を追跡するのに
使用し得る。
【０１１８】 図２０は、化合物ＣＩ を得るフラグメントの付加を記号で示した。このフラ
グメントは、構造Ｆｉ、ＦｉｉおよびＦｉｉｉを持ち、それらは順次付加され、
化合物ＣＩ を得る。構造Ｆｉ、ＦｉｉおよびＦｉｉｉは、化合物ＣＩ を構成
するフラグメントの記号表示である。これらのフラグメントは、構造表示、名称
、分子式および付着部位またはノードを含む各フラグメントの同定特性と共に、
関連データバンクに蓄積することができる。化合物ＣＩおよびＣＩ の目視検査
によると、化学化合物ＣＩと化合物ＣＩ の記号表示との間は、フラグメントの
化学構造とフラグメントの記号構造の間と同様、共通の性質があることが分かる
。
【０１１９】 記号表示された反応剤の表が図２１に示されている。反応剤Ｒ１からＲ１０は
その構造、名称、分子式、分子量およびソースについて記載され、それ以外の反
応剤と関わればいいと思われる情報もまた記載される。Ｒ３およびＲ４は別の反
応剤であるが同じフラグメントを１つの化合物に導入するのに用いてもよい。そ
れは使用する反応条件に依存し、反応剤Ｒ３は１セットの条件による変換、反応
剤Ｒ４は異なる反応条件のセットによる他の変換に用いられる。同様に反応剤Ｒ
５は２つの反応剤または組成物で、構成される。それはおそらく（Ｒ）−および
（Ｓ）立方異性体、ＤおよびＬ−異性体、あるいは２つの全く異なる反応剤であ
る。Ｒ５は２つの反応剤または組成物も混合物であり、本発明の方法を２つまた
はそれ以上の反応剤の混合物を用いて実施したことがある当業者により理解され
る。ライブラリーを構成するのに用いられる代表的な反応剤の混合物は混合物を
構成する個別反応剤を４，５またはそれ以上もってもよい。
【０１２０】 図２２は記号表示されたフラグメントを表で示したものである。フラグメント
Ｆ１からＦ８は、構造表示、名称、分子量、分子式、および付着部位またはノー
ドを含む同定特性と共に関連データバンクに蓄積される。この表では、図２１で
記号表示された反応剤を用いて、ライブラリー化合物に導入する各種フラグメン
トの記号表現を記載する。このようにしてフラグメントＦ１は反応剤Ｒ１を用い
て化合物に導入することができる。フラグメントＦ１でＸ付着部位の識別子で、
このことはＸはＦ１が化合物の他のフラグメントに結合するときの部位である。
同様にフラグメントＦ２は反応剤Ｒ２を用いて、化合物に導入（そのＸ部位に付
着）されてもよい。
【０１２１】 しかしフラグメントＦ３は反応剤Ｒ３かＲ４を用いて化合物に導入することが
できる。このことは使用する反応剤の選択が許容されており、このことは他のフ
ラグメントをその化合物に導入することに関して、化学の適合への考慮も許容さ
れている。次いで、図２１においてフラグメントＦ４（フラグメントの混合物）
を反応剤の混合物である反応剤Ｒ５を用いても導入することができる。 フラグメントＦ５には２つの付着部位があり、Ｆ５が１つの化合物に組み込ま
れている場合、他のフラグメントが付着部位ＸおよびＹに付着できることを示し
ている。２つの付着部位の存在により、Ｆ５を扱う場合、化合物を形成するには
２つの付着が行われることを示している。ここで再び、上述のように、他のフラ
グメントを導入し化合物を形成する際に必要な反応条件及び化学により、Ｆ５が
反応剤Ｒ６またはＲ７を使って化合物に導入可能となる。
【０１２２】 フラグメントＦ７およびＦ８はｉｎ ｓｉｌｉｃｏに生成された化合物に、反
応剤Ｒ９およびＲ１０それぞれを使って導入することができる。これらのフラグ
メントは共に３つの付着部位を持つことにより、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで生成され
た化合物を形成する別のフラグメントを使用する際、別のフラグメントに３つの
付着が生じることが示されている。フラグメントＦ７およびＦ８に３つの付着部
位がある。当業者は３つ以上の付着部位がフラグメントに存在しうることを認識
し、（適切な反応剤を使用して）その化合物への導入により更に多くの付着が許
容される。
【０１２３】 フラグメントと反応剤の表を関連データベースの中に入れ、本発明の方法に対
応する変換が作られる。それは１つのフラグメントを１つの反応剤を結び付ける
ことにより作られ、独自の変換が形作られる。図２３は記号の変換の表を示し、
そこでフラグメントは反応剤と１：１の関係で結びつく。それぞれの変換を記載
する同定特性にはフラグメントと反応剤間の１：１結合と触媒、濃度、温度、圧
力要件、または適切な反応剤を用いることにより、そのフラグメントをその化合
物へ導入することに影響を与えるのに必要な補助反応剤がある。補助反応剤は、
触媒、活性剤、酸、塩基、その他の化学薬品あるいは添加物を含み、前記フラグ
メントの導入に影響を与えるために必要があるものもある。例えばある塩基はハ
ロゲン化アルキルと共に常に加えられハロゲン化アルキルの使用に伴って生成す
る酸を捕捉する。
【０１２４】 図２３に示されているように、変換Ｔ１はフラグメントＦ１と反応剤Ｒ１と結
合して、Ｔ１はこの１：１結合と関連する反応条件（α）をも特定する。同様に
Ｔ２は条件（β）のもとＦ２をＲ２と結びつける。変換Ｔ３とＴ４は、共通のフ
ラグメントＦ３と結びついているにもかかわらずそれぞれ独自の変換である。変
換Ｔ３は条件αで共通のフラグメントＦ３と反応剤Ｒ３を結びつけるが変換Ｔ４
は異なる条件である条件δで共通フラグメントＦ３と共通でない反応剤Ｒ４でを
結びつける。例えば反応剤Ｒ３は塩化アルキルであるがＲ４はおそらく沃化アル
キルである。これらの反応剤は類似しているが、（それらは両方ともハロゲン化
アルキルである）、それらは異なる反応条件で使用される。ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ
で生成された化合物に同じフラグメントを導入するのに影響を与える異なる反応
剤の使用は２つの独自の変換を示す。このことは同じフラグメントをその化合物
に導入する２つの全く異なる独自の合成方法を示している。化合物の合成に関連
した化学反応のステップ全体によって、同じフラグメントをその化合物に導入す
る変換で、１つの変換が他の変換より好まれる。
【０１２５】 変換Ｔ５はフラグメントＦ４と反応剤Ｒ５を結びつける。（Ｒ５）は（Ｒ）−
（ステップ）−立体異性体、Ｄ−および−Ｌ−異性体、あるいはまたは２つ以上
の異なる反応剤などの混合物である。この結果、Ｒ５を使用するとフラグメント
Ｆ４の混合物かがその化合物へ導入されることになる。当業者はそれらが一緒に
混合される性質をもち、相互に反応しなくなり、類似の反応条件下で反応するよ
うなＲ５の多数の反応剤が選ばれることを認識しているであろう。例えば、Ｒ５
が酸ハロゲン化物の混合物であるとすると、これらは相互に反応しないが、同様
の反応条件下で同様に求核物質と反応する。当業者により反応剤はわずか１〜２
成分またはある成分の反応剤に限定されず、事実２、３、４、５、あるいはさら
に多くの反応剤または成分であることも認識さている。
【０１２６】 反応剤の混合物を使用する場合、個々の成分の反応剤それぞれは異なる化学的
反応速度を持っている。もしこのことに訂正の必要がなけば、このことはその製
品化合物がその成分を平等に表示していないこととなる。このことは反応混合物
内のそれぞれの反応剤の濃度を混合物の中の他の反応剤に比例するよう、例えば
相対反応速度が同じになるように調整することにより解消される。これは反応剤
それぞれの反応と１つ選んだ標準反応とを比較することで解決する。種々の反応
速度を補償するために標準化された反応速度が反応剤混合物の中の各成分である
反応剤の濃度を調整し使用することができる。このようにして異なる反応速度を
持つ反応剤混合物は一つの反応剤混合物中で使用できるようになり、そのライブ
ラリーで目的の化合物と等価量が普遍に生成される。
【０１２７】 変換Ｔ６とＴ７は変換Ｔ３とＴ４とはこれらの変換のそれぞれを同定する条件
が異なることを除いて類似している。変換Ｔ６は条件ｅのもとでフラグメントＦ
５と反応剤Ｒ６を結びつけるが、変換Ｔ７は異なる条件（条件α）のもとでＦ５
と異なる反応剤Ｒを結びつける。変換Ｔ６とＴ７に関連する条件は異なるが、こ
のことはある特定の合成が行われているとき他のフラグメントについて互換性の
ある化学物質を選ぶことが可能であることを示している。このことは現実のライ
ブラリーを実際に合成する場合非常に有用かつ重要である。フラグメントを化合
物に導入したい場合、化合物をつくるのに用いる現実の化学的物質は、当初変換
Ｔ６またはＴ７で、従って、反応剤Ｒ６またはＲ７の選択を考えることができる
。どの化学薬品データベースの形成者にとっても、反対の方向である。それはデ
ータベースの形成者は化合物の構造のことを考えており、化合物をつくるのに必
要な化学物質のことを考えていないからである。
【０１２８】 変換Ｔ９およびＴ１０は反応剤Ｒ９の使用でフラグメントＦ７へ、反応剤Ｒの
使用でフラグメントＦ８へ、それぞれつながる。両方の変換とも反応条件ｇで関
連していることが同定された。フラグメントＦ７およびＦ８には３つの付着部位
があるが、これらのフラグメントには４つ以上の付着があるものと考えられる。
従って、この生成化合物の複雑性が増し、他のフラグメントの付着に用いるラウ
ンド数が増加する。部位が３つある場合で説明すると、異なる反応剤混合物の３
つのセットそれぞれが１つのセット内に５つの反応剤が用いられていると、１２
５化合物がフラグメント７に対して生成され、さらに１２５化合物フラグメント
８に対してが生成される。
【０１２９】 本発明の方法は１つの化合物または化合物の混合物を生成するために使用でき
る。混合物は２つまたはそれ以上の化合物からなり、２つまたはそれ以上の反応
剤（要するに、２つまたはそれ以上のフラグメントの導入）の使用がライブラリ
ー生成の初めに、反応剤（次いで、２つまたはそれ以上のフラグメントの混合物
）の混合物の導入がライブラリー生成のそれに続く段階に、または両方のテクニ
ックの組み合わせが含まれてもよい。図２４および図２５が本発明の２つの局面
を示している。
【０１３０】 図２４に示されているように、本発明の方法は単一化学物質、例えば、Ｃ１お
よびＣ４を生成するのにも使えるが、化合物Ｃ２およびＣ３を含む混合物Ｍ１を
生成するのにも使用することができる。ライブラリーの生成は第１ラウンド（ｉ
．ｅ．ラウンドｎ）でフラグメントＦ７（付着部位３）の選択に始まる。第２合
成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋１）で、Ｆ７はフラグメントＦ２と結合し、
合成経路Ｐ１ａを組み立てる。その結果、複合フラグメントＣＦ１が形成される
。Ｆ７には付着部位が３つある（ｉ．ｅ．Ｘ、ＹおよびＺ）。このようにラウン
ドｎ＋１はＸ、ＹおよびＺのそれぞれが使われてしまわなければ終了しない。も
し必要があれば、他のフラグメントに結合する。Ｘ、ＹおよびＺのそれぞれの歩
き回り、及びこれらの部位へのフラグメントの付着は順次に起こる。一度、フラ
グメントのＸ、ＹおよびＺが第１ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ）で選択され、
それが放出されると、現在付着部位のいずれかに歩き回りが起きる。次のフラグ
メントの添加が始まり継続する、次の合成ラウンド（ｉ．ｅ．第３ラウンドまた
はｎ＋２）が添加される。ここで再びこのフラグメント上のすべての要求された
付着部位が使用された時、特定の合成ラウンドは終了する。加えられたフラグメ
ントの要求され、使用可能な付着部位の周辺の付着の繰り返しは要求された化合
物の生成が終わるまで行われる。
【０１３１】 図２４に示されているようにＣＦ１は次に合成経路Ｐ１ｂに従い、そこでフラ
グメントＦ１はＣＦ１に導入され、それにより複合フラグメントＣＦ２が形成さ
れる。ＣＦ２は合成経路Ｐ１ｃに従い、そこでＦ５がＣＦ２に加えられ、複合フ
ラグメントＣＦ３が形成される。これは合成ラウンドｎ＋１（ｉ．ｅ．化合物を
合成するため、第２ラウンドのフラグメントの投入または合成）である。フラグ
メントＦ５は付着部位が２つあり、ＣＦ３には使用可能な付着部位（ｉ．ｅ．部
位Ｙ）がある。この部位（部位Ｙ）のフラグメント導入は合成ラウンドｎ＋２（
ｉ．ｅ．第３ラウンド）を構成する。それはフラグメントを加える前のすべての
要求された付着部位が放出されたからである。次いでＣＦ３は合成経路Ｄ２に従
い、そこでフラグメントＦ４が付着部位ＹのＣＦ３に導入される。Ｆ４は２つの
成分、化合物Ｃ２およびＣ３の２つの混合物（Ｍ１）であり、生成される。
【０１３２】 しかしながら、単一化合物はフラグメント導入の現在のスキームを使用しても
生成できる。このようにして、化合物Ｃ１はＣＦ３をＰ１ｄに従わせれば生成す
ることができ、ＣＦ３はＦ３と結合して、ＣＦ３の部位Ｙへ付着する。Ｆ３をＣ
Ｆ３に入れると、第３合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋２）を構成し、Ｃ１
の生成を導く。 また、ＣＦ３を合成経路Ｐ３ａに従わせ、Ｆ６をＣＦ３へ入れるとＣＦ４を形
成する。これが第３合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋２）で、ＣＦ４は２つ
以上の使用可能な付着部位（ｉ．ｅ．Ｙ）で、Ｆ２は合成経路Ｐ３ｂを経由して
付着することができる。これが化合物Ｃ４を生成して、複雑性が増加する。それ
は選択されたフラグメント上の付着部位の数と使用する合成経路が原因である。
フラグメントＦ６をＣＦ４へ加え第３合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋２）
を継続する。フラグメントＦ２をＣＦ４に加え、第４合成ラウンドまたはラウン
ドｎ＋３を表現する。これは、フラグメントＦ６のＣＦ３への追加により生成さ
れる部位（ｉ．ｅ．ＣＦ４内の部位Ｙ）にフラグメントを加えることを含み、そ
してＣＦ４（ｉ．ｅ．フラグメントＦ５）内の前に追加されたフラグメント上の
使用可能な付着部分を放出するためである。即ち、フラグメントＦ６を加え、ラ
ウンドｎ＋２を終了（または第３合成ラウンド）である。これはＦ６はＣＦ３（
ｉ．ｅ．ＣＦ３内の部位Ｙ）の最後の使用可能な部位へ付着したからである。
【０１３３】 図２４の経路Ｐ１ｃにおいて反応が起こり、単一フラグメント（Ｆ５）は反応
剤Ｒ６またはＲ７（このようにＲ６およびＲ７が関連した変換を経由）の使用を
経由してＣＦ２を加える。発明上の観点においてデータベースの中で追跡を行う
ことに対して、これらの付加が２つのユニークな変換を表しているようであるが
、これらの付加は事実上同じ化学的変換を行っているのである。このように、本
発明の方法により、自動的に化合物の追跡が起こったコンピュータとは化合物の
仮想ライブラリーと仕事をする上で有効なばかりでなく、ユーザーが現実に合成
される場合、ユーザーは合成経路を選択できるようにした。本発明を追跡の観点
から見れば、フラグメントの導入を説明する新しくユニークな方法は、そのフラ
グメントと結びつき、それに関連する変換（または反応）が起こり、その上、共
通のフラグメントの目的の化合物を導入させる。本発明は複数の反応剤を使って
生成した個別の化合物を追跡するだけでなく複数の変換を経由して生成した複数
の化合物を同時に追跡することを可能にした。個々に書かれた方法は記号表示と
表であるが、上記の個別あるいは同時に追跡を行うことについて、多くのコンピ
ュータのアルゴリズムコードや技術などを使っていることは当業者により認めら
れているところである。
【０１３４】 本発明はさらに単一容器内で異なる開始フラグメントを使用するライブラリー
生成から出発し、単一容器で化合物の混合物を製造する方法を提供する。化合物
の単一容器生成または合成は複数の化合物を単一の反応容器（即ち、単一容器）
で生成することをいう。このことは、共立する化学的性質のものを選んだ場合可
能である。そのような単一容器の例としてこの例示により限定されるものではな
く、複数のウエルの付いたプレート、例えば、９６ウエルプレート、反応用フラ
スコ、２５ｍＬのフラスコ、さらに工業用反応容器を挙げることができる。反応
または転換を１つの容器内で行い、反応容器の大きさは関係ない。単一容器合成
のコンセプトが化合物の仮想ライブラリーと思うのは適当ではない。それはこれ
らの仮想ライブラリーは単にｉｎ ｓｉｌｉｃｏに発生しただけである。単一容
器合成のコンセプトは適切になってきたが、しかし、いつ実際に化合物ライブラ
リーの合成が行われるだろうか。従って、化合物は追跡でき、化合物つくりとは
別に、明確な化学構造を持つために、しかし、両者は仲間同士で合成のためには
同じポットの中でつくられる。
【０１３５】 単一容器合成の一例が図２４に示されている。複合反応剤Ｒ５を加えて、混合
物Ｍ１をつくる。さらにもう一つの単一容器合成は図２５に示されている。そこ
ではさらに化合物の混合物を発生させた。混合物Ｍ２、化合物Ｃ１およびＣ５が
フラグメントＦ７およびＦ８からスタートして、第１合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラ
ウンドｎ）に進む。このフラグメントはそれぞれ３つの付着部位を持ち、その上
に他のフラグメントを導入される。結果として、２つのフラグメントを合成経路
Ｐ１ａに従わせ、そこではＦ７およびＦ８はフラグメントＦ５と部位Ｘで結合さ
れ、その結果複合フラグメントＣＦ１およびＣＦ５になった。ＣＦ１およびＣＦ
５は次いで合成経路Ｐ１ｂに従い、そこでフラグメントＦ１はＣＦ１およびＣＦ
５へ部位Ｙで導入し、それにより複合体形成され、フラグメントＣＦ２およびＣ
Ｆ６を得た。ＣＦ２およびＣＦ６は次いで合成経路Ｐ１ｃに従わせた。フラグメ
ントＦ５はこれら複合フラグメントに部位Ｚ（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋１）で導入
された、ＣＦ３およびＣＦ７を形成した。これで第２合成ラウンドを終了（ｉ．
ｅ．ラウンドｎ＋１）。フラグメントＦ５は付着部位が２つあり、ＣＦ３および
ＣＦ７へ導入した後、さらに他のフラグメントを導入するためにまた付着部位が
利用可能である（ｉ．ｅ．部位Ｙ）。このようにＣＦ３およびＣＦ７は化合物Ｃ
１およびＣ５を反応含む混合物（Ｍ２）は合成経路Ｐ１ｄを経由して、ここにＣ
Ｆ３およびＣＦ７はフラグメントＦ３と結合し、部位Ｙに付着しフラグメントＦ
５上でＣＦ３およびＣＦ７へ導入した。部位ＹでフラグメントＦ３をＣＦ３およ
びＣＦ７への導入は第３合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋２）を示している
。
【０１３６】 もう一つの化合物の混合物の単一容器合成は、本発明に従い、図２６に示され
ている。化合物のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ生成はフラグメントＦ７の選択を開始し付
着部位を３つもっている（ｉ．ｅ．Ｘ、ＹおよびＺ）。これは第１合成ラウンド
（ｉ．ｅ．ラウンドｎ）、次いでＦ７を合成経路Ｐ１ａに従わす。そこではＦ７
はフラグメントＦ２に結合している。Ｆ２はフラグメントＦ７の部位Ｘに付着し
、複合フラグメントＣＦ１を形成する。この段階でＣＦ１は２つの合成経路Ｐ１
ｂおよびＰ１ｂ' をもっている。Ｐ１ｂはＣＦ１上の部位Ｙへ導入するフラグメ
ントＦ１を用いる。これにより複合フラグメントＣＦ２の形成は終了し、他方、
Ｐ１ｂ' はＦ３を用いてＣＦ１上の部位Ｙへ導入され、これにより複合フラグメ
ントＣＦ８を形成する。このようにして複合混合物（ＣＦ２およびＣＦ８）を形
成される。両フラグメントＦ１およびＦ３を化合物に導入する際に必要な化学が
適合する場合、化合物の単一容器生成の為に、両フラグメントを同時に導入する
（これらは「単一反応ボトル」で実際に合成を行った）。そうでなければ、これ
らのフラグメントは別々に導入される。次いで、ＣＦ２およびＣＦ８は合成経路
Ｐ１ｃに従い、両者の複合フラグメントＦ５と結合し、ＣＦ２およびＣＦ８上に
部位Ｚに付着する。それにより、複合フラグメントＣＦ３およびＣＦ９が形成さ
れる。ＣＦ３およびＣＦ９の形成で第２合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋１
）が終了する。フラグメントＦ５は付着部位を２つもっており、部位Ｙはやはり
他のフラグメントへの付着に使用可能である。従って、ＣＦ３は合成経路Ｐ３に
従い、そこでＣＦ３はフラグメントＦ４と結合する。Ｆ４の導入は第３合成ラウ
ンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋２）を表す。図２２に示されているように、Ｆ４は
フラグメントの混合物（反応剤の混合物を加えることで導入された）である。結
果として合成経路Ｐ２は化合物Ｃ２およびＣ３の形成に導く。同時に合成経路Ｐ
２' を経て、ＣＦ９はフラグメントＦ４と結合し、化合物Ｃ７およびＣ８の生成
に導く。このようにして、化合物Ｃ２、Ｃ３、Ｃ７およびＣ８を含むＭ３が形成
される。
【０１３７】 本発明はまた化合物のきわめて複雑な混合物を生成するための方法を提供する
。図２７Ａおよび図２７Ｂに一例が示されている。そこでは、混合物Ｍ４が生成
され、１６の化合物を含んでいる。混合物Ｍ４の中の化合物は第１合成ラウンド
（ｉ．ｅ．ラウンドｎ）のフラグメントＦ７およびＦ８からスタートして生成す
ることができる。これらのフラグメントはフラグメントＦ２と結合してＦ７およ
びＦ８はそれぞれの部位に導入され、複合フラグメントＣＦ１およびＣＦ５を形
成する。これに続きフラグメントＦ１およびＦ３の混合物はこの複雑なフラグメ
ントの部位ＹにあるＣＦ１およびＣＦ５に導入され、４つの符号フラグメントＣ
Ｆ２、ＣＦ６、ＣＦ８およびＣＦ１１を形成することを導く。これらの複合フラ
グメントは次いでフラグメントＦ５およびＦ６の混合物と結合する。Ｆ５および
Ｆ６は２つの付着部位を持ち、Ｆ５およびＦ６の部位ＸがＣＦ２、ＣＦ６、ＣＦ
８およびＣＦ１１上の部位Ｚに付着し、８コの複合フラグメントＣＦ３、ＣＦ７
、ＣＦ９、ＣＦ１２、ＣＦ１３、ＣＦ１４、ＣＦ１５およびＣＦ１６の混合物を
形成する。ここで第２合成経路（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋１）が終了する。フラグ
メントＦ５およびＦ６は２つの付着部位（ｉ．ｅ．部位Ｙ）があり、その上に他
のフラグメントが導入できる。これら８つの複合フラグメント上の部位Ｙへの付
着が第３合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋２）を表す。次にフラグメントＦ
４がＣＦ３、ＣＦ７、ＣＦ９、ＣＦ１２、ＣＦ１３、ＣＦ１４、ＣＦ１５および
ＣＦ１６に導入される。フラグメントＦ４は２つの成分フラグメントの混合物で
１６の化合物が生成される。即ち、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ
１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９およ
びＣ２０である。このようにして複合フラグメントを単一容器方式で使い、フラ
グメントの混合物を結合させて、非常に複雑な化合物の混合物を生成することが
わかった。図２７Ａおよび図２７Ｂの例はこのライブラリーが２つのフラグメン
トからスタートして生成した時、１６のユニークな化合物は混合物Ｍ４として生
成されることを示している。もし、ライブラリー生成が３つ以上または複合フラ
グメントからスタートすれば、同じ前駆フラグメントが加わり、さらに複雑な化
合物の混合物が生成されることは当業者に認められるところである。
【０１３８】 本発明はまた種々の合成ラウンドでフラグメント付加を追跡する方法を提供す
るものである。この追跡システムはフラグメント付加に関係する様々な合成ラウ
ンドを表にして実行する。本発明を説明する点から、フラグメント付加を追跡す
ることを表にする方法をここに記述する。その他のアルゴリズム、アルゴソース
、コード、コンピュータが読み取れるメディア、その他のソフトウエアのコーデ
ィング技術、それらは追跡に使用されるコンピュータ技術関係の人々には知られ
ているものが使われている。このことは当業者により認められるところである。
フラグメント付加を追跡する表は化合物の構造表示に使用され、化合物の実際の
合成を望まれない仮想ライブラリーを作るのにも使えるものである。しかし、変
換を追跡する表は適切な変換を選び、多数の変換の場合には必要なフラグメント
を合成される化合物に導入するのに適した変換を選ぶことにより使用可能である
。
【０１３９】 図２８はそれぞれの合成ラウンドで加えられるフラグメントに関する化合物Ｃ
１についての記述である。第１合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ）はフラグメ
ントＦ７の選択で始まる。これに続きフラグメントＦ２、Ｆ１およびＦ５の付加
が順次第２合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋１）で行われる。最後に化合物
Ｃ１が第３合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋２）のフラグメントＦ３の付加
で生成する。このようにして、生成され化合物は二次元の仮想ライブラリーとし
てに蓄積されるか、三次元仮想ライブラリーに変換され、目的標的分子にｉｎ ｓｉｌｉｃｏでドッキングに使うことができる。
【０１４０】 化合物の仮想ライブラリーの生成およびライブラリーメンバーの標的分子への
ドッキングには種々の合成ラウンドでのフラグメントの付加を追跡するフラグメ
ントに関連した関連データベースに、化合物を加えることで充分である。しかし
、ライブラリーの目標化合物の実際の合成を行う場合には、実際の合成ステップ
、反応剤、溶液、濃度、必要な補助化合物および現実の化学化合物のそのような
実際の合成に影響を与えるその他多くの合成要素を特定する必要がある。このよ
うな合成段階、反応剤、溶剤、濃度および補助化合物が実際に上述した変換に組
み込まれる。このように、変換のコンセプトを用いることにより本発明は加えら
れるフラグメントに関することのみでなく、それぞれの合成ラウンドに必要とさ
れる合成のためのパラメータなど生成する化合物を追跡する方法を提供するもの
である。
【０１４１】 図２８はまた、合成ラウンドで採用された多くの変換に関連して化合物Ｃ１の
生成を示している。４つの合成経路で化合物Ｃ１の合成が行える。その理由は多
数階の変換が実行でき、それにより同じセグメントが合成された場合、同じフラ
グメントをその化合物に導入できるからである。このようにして、図２８にみら
れるように、フラグメントＦ７の選択が第１合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンド．
ｎ）で変換Ｔ９を構成する。次いで、変換Ｔ２により、達成されたフラグメント
Ｆ２が加えられる。ついで、フラグメントＦ１が変換Ｔ１経由に加えられる。し
かしフラグメントＦ５は合成経路１および３により変換Ｔ６を経て、反応剤Ｒ６
を用いるか、合成経路２および４により変換Ｔ７を経て反応剤Ｒ７を用いて加え
られる。同様に、最終フラグメントＦ３は合成経路１および２により、変換Ｔ３
を経て、反応剤３を用いるか、合成経路３および４により、変換Ｔ４を経て、反
応剤Ｒ４を用いて、最終フラグメントＦ３が加えられる。このように図２８は化
合物Ｃ１が現実に４つの異なる合成方法の１つで合成され、その方法を追跡して
表にし、本発明の方法を使用していることを明らかにすることができる。４つの
表それぞれは完全にＣ１用の４つの経路のそれぞれに基づいている。このように
して、本発明により利用者は同じ反応を行う代替経路のすべてが利用可能であり
、目的とする化合物を製造するために、好みによりまたは最も適切な合成ルート
を選ぶことができる。
【０１４２】 図２９は混合物Ｍ１の中で化合物Ｃ２およびＣ３に対すると同様の変換追跡表
である。化合物Ｃ２およびＣ３の合成はフラグメントＦ７を選ぶことから始まり
、Ｆ７は最初の合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ）で、変換Ｔ９（図２９のス
テップ１）を行う。ついで、Ｆ７は第２合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ ＋
１）（ステップ２）で変換Ｔ２を経て、フラグメントＦ２と結合する。同じラウ
ンドでフラグメントＦ１は変換Ｔ１経由、フラグメントＦ５は変換Ｔ７を経由し
継続的に加えられる（ステップ３および４）。最終的にはフラグメントＦ４は第
３合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋２）で加えられる。Ｆ４は２つの成分フ
ラグメントの混合物であり（２成分反応剤のため）、この表はこの段階（ステッ
プ５）で、変換Ｔ５が行うかもしれない２つの異なる合成経路に責任を与えるよ
うに複写される（ｉ．ｅ．Ｔ５1 およびＴ５2 ）。ステップ５は化合物Ｃ２およ
びＣ３を表す。このように、本発明では、特定の変換に関し、２つ以上の反応剤
が関係し、この表はこのような反応剤があるたびに複写されることがわかる。
【０１４３】 図３０は混合物Ｍ３において、化合物Ｃ１およびＣ２の変換追跡表を示してい
る。合成が２つのフラグメントＦ７およびＦ８で始まるため、追跡は２つの平行
した表（図３０のステップ１）で始まる。第１合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンド
ｎ）で、Ｆ７が変換Ｔ９を経て選ばれ、Ｆ８は変換Ｔ１０経由で、Ｆ８が選ばれ
る。第２合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋１）は、変換Ｔ２を経由してフラ
グメントＦ２の導入のステップ２で始まる。ステップ３で、変換Ｔ１がフラグメ
ントＦ１をその化合物へ導入する。ステップ４で、変換Ｔ７はフラグメントＦ５
を導入する。これで第２合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋１）は完了する。
最終的には第３合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋２）で変換Ｔ４がフラグメ
ントＦ３を導入するのに使用され（ステップ５）、化合物Ｃ１およびＣ５を含む
混合物Ｍ２を作る。本例では、この表がフラグメントＦ７およびＦ８の混合物を
始めに使用しているので、合成方法において早い時期に表が複写される。
【０１４４】 混合物Ｍ３の化合物Ｃ２、Ｃ３、Ｃ７およびＣ８の変換追跡表が図３１に示さ
れている。これらの化合物の合成は第１合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ）で
、フラグメントＦ７を選ぶことから始まる。このことは変換Ｔ９（図３１のステ
ップ１に示す）に示されている。図３１のステップ２が第２合成ラウンド（ｉ．
ｅ．ラウンドｎ＋１）を記述し、変換Ｔ２を経由、フラグメントＦ２の導入を起
こしている。ステップ１および２はそれぞれ単独の変換であるが、ステップ３は
２つの異なる変換を引き起こしている。その理由は２つの異なるフラグメントが
２つの異なる反応剤の使用を経て、この化合物に導入されている。従って、ステ
ップ３では、この表は２回複写されている。その理由は２つの異なる反応剤が２
つの異なる変換を経由し、２つの異なるフラグメントが導入されたからである。
ステップ３で変換Ｔ１がフラグメントＦ１の導入に用いられ、一方変換Ｔ３はフ
ラグメントＦ３の導入に用いられている。第２合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンド
ｎ＋１）はステップ４の変換Ｔ７で終了し、それがフラグメントＦ５を導入して
いる。最終成分ラウンド（ｉ．ｅ．第３ラウンドまたはラウンドｎ＋２）では変
換５がフラグメントＦ４の導入に使用されている。Ｆ４は２つの成分フラグメン
トの混合物であるため、ステップ５のそれぞれの表は変換Ｔ５1 およびＴ５2 に
対して２回複写され、それらはフラグメントＦ４の成分のそれぞれを示している
。
【０１４５】 これらの図は種々のフラグメント、反応剤および変換が１つの化合物または化
合物の混合物の生成または合成の間、追跡された唯一の方法を示している。しか
し、当業者の人にとって、化合物がｉｎ ｓｉｌｉｃｏで生成される時、種々の
他のアルゴリズムの方法も採用され、変換を通してフラグメントが導入されるも
のであるということを追跡、説明することを認識している。 本発明の方法により生成されたライブリー・メンバーおよび化合物は市販で入
手可能なソフトウエアを使用して三次元表示ができる。さらに、三次元構造で示
された化合物は同定された標的にドッキングし、それも三次元構造で示すことが
できる。
【０１４６】 これらのライブリー・メンバー（またはリガンド）とのドッキングは、そのメ
ンバーと目的の標的分子とのｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの結合を生じる。低分子物質
とタンパク質および核酸のような生物学的標的との相互作用を検討し、最適化す
ることについて、多くの理論的およびコンピュータを使用した方法が文献上で知
られている。この構造に基づく薬剤設計ツールはタンパク質と低分子物質のリガ
ンドの相互作用のモデリングおよびその相互作用の最適化に非常に有用である。
代表的なこのタイプの研究は、タンパク質受容体の構造が受容体に対して、１回
に１つ、個々の低分子に聞くことによりわかる場合に行われた。通常これらの低
分子は受容体と共結晶するか、共結晶した他の分子、またはこれと受容体との相
互作用について知っている人がいる場合のいずれかに関連する。この分野での顕
著なＤＯＣＫというソフトウエアプログラムの発達で、それにより既知分子と関
連がある受容体との相互作用を構造データベース研究で測定し、確認することが
可能になった（Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１９
９４，２７，１１７；Ｇｓｃｈｗｅｎｄ ａｎｄ Ｋｕｎｔｚ，Ｊ，Ｃｏｍｐｔ
．−Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．，１９９６，１０，１２３）。ＤＯＣＫは分
子のスクリーニング、その三次元構造をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで生成することがで
き、そのために受容体との相互作用に関する事柄の知識が何もなくてもできる。
従ってＤＯＣＫは関心のある受容体に対する新しいリガンドを発見する上で助け
になるツールを提供している。このようにしてＤＯＣＫは生成された化合物を本
発明の方法に従って、目的の標的分子とドッキングさせるのに使用することがで
きる。
【０１４７】 ＤＯＣＫプログラムはタンパク質の標的に適用され、タンパク質に結合するリ
ガンドの同定に使用されている。ＤＯＣＫのソフトウエアプログラムにはＳＰＨ
ＧＥＮ（Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８２，１６
１，２６９）およびＣＨＥＭＧＲＩＤ（Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｏｍｐｕ
ｔ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，１３，５０５）などいくつかのモジュールがある。
ＳＰＨＧＥＮは標的受容体の結合ポケットの溶媒にアクセス可能な面を描くオー
バーラップ面のクラスターを生成する。それぞれのクラスターが低分子と結合可
能な部位を表している。ＣＨＥＭＧＲＩＤは標的と結合分子との間の相互作用の
立場をスコアするために必要な情報をグリッドファイルに予め計算して蓄積する
。このスコア機能が分子メカニズムの相互作用エネルギーを概算し、ヴァンデル
ヴァールス力と静電気の成分からなる。ＤＯＣＫは受容体上の標的部位内の配向
リガンド分子への特定表面クラスターを利用している。事前に生成した３Ｄデー
タベースのそれぞれの分子は部位内の何千もの方向でテストされ、それぞれの方
向付けをスコア付け機能で評価する。それぞれの化合物について最高のスコアを
見出した方向のみがアウトプットファイルにスコアされる。最終的に、データベ
ースのすべての化合物がそのスコア順にランク付けされ、その中の最良の候補の
コレクションが経験的に選ばれる。
【０１４８】 ＤＯＣＫの使用で、あるタンパク質標的に対するリガンドが同定された。最近
の成果はＤＯＣＫを使用に関する報告書に載り、ＲＮＡ二重らせんのような核酸
に対し特異的な結合をする低分子リガンドの設計と確認である。ＲＮＡはＡＩＤ
Ｓ、ウイルスやバクテリア感染のような多くの疾患に顕著な役割を持っているが
、低分子で特定のＲＮＡ結合する能力についてはほとんど研究されていない。そ
の深い主溝と特有の幾何学的関係からＲＮＡ二重らせんに対して特異性を持つ化
合物がＤＯＣＫの方法論を用いて同定された（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，３６，１１４０２；Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．
，Ａｃｃ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１９９４，２７，１１７）。Ａ型ＲＮＡ二重ら
せん構造に対するモデル構造として、ｒ（ＵＡＡＧＧＡＧＧＵＧＡＵ）．ｒ（Ａ
ＵＣＡＣＣＵＣＣＵＵＡ）についての最近のＸ線構造研究で、ＤＯＣＫはＲＮＡ
の溝と相補的な形が特徴のリガンドの候補として、いくつかのアミノグルコシド
を同定した。アミノグルコシドの１つはＢ形ＲＮＡよりＲＮＡに優先的に結合す
るだけではなく、そのリガンドは標的ＲＮＡの主溝へも結合している。ＤＮＡ４
重鎖リガンド認識問題に最近のＤＯＣＫを応用したことも報告されている（Ｃｈ
ｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９６，９
３，２６３５）。
【０１４９】 ＤＯＣＫのこのようなプログラムは典型的に結合したリガンドの厳密なコンフ
ォメーションの知識を推定し、分子ドッキング研究で付与したリガンドのコンフ
ォメーションを使用してリガンド受容体複合体（それが結合エネルギー計算の前
提）に到着した。しかし、ほとんどのリガンドはおおくの回転可能な結合を有し
、そのことが計算を複雑にした。フレキシブルなリガンドとのドッキングが望ま
れるが、莫大な立体配置的な空間を検索することが必要になる。例えば、アミノ
グルコシド抗生物質１６Ｓ Ａ−部位ＲＮＡターゲットに結合する（パロモアイ
シン）の研究では約１０30もの解のある可能性がある空間の検討が必要である。
【０１５０】 ＱＸＰはフレキシブルなリガンドのドッキングを許容する計算法である（Ｍｃ
Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．ａｎｄ Ｂｏｈａｃｅｋ，Ｒ．Ｓ．，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．−
Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌｅ．Ｄｅｓｉｇｎ，１９９７，１１，３３３）。この方法で
は、フレキシブルなリガンドの全立体配置的の研究が行われた。ＱＸＰ研究のア
ルゴリズムにはデカルト空間でのエネルギー最少化に用いるモンテカルロ摂動テ
クニックを用いる。補足的的なすばやい調査ステップが初期摂動とエネルギー最
小化間に導入されている。この方法は最近好んで使用されてきている。
【０１５１】 ＲＮＡ標的に対する仮想ライブラリーの評価についての報告はまだない。仮想
ライブラリーの生成に関するある報告書はライブラリー設計、生成およびタンパ
ク質標的に対するスクリーニングについてである。同様にＲＮＡモデルの生成分
野の研究は文献に報告されている。しかし、これらの標的と結合する、例えば低
分子、オリゴヌクレオチドまたは他の核酸のようなリガンドを同定するため、Ｒ
ＮＡ構造の三次元モデルについて仮想ライブラリー構造ベースの設計によるアプ
ローチを利用しようとする報告書はない。
【０１５２】 本発明はＲＮＡ構造の三次元モデルの構築、低分子、ポリメリック化合物、オ
リゴヌクレオチドおよびその他の核酸、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのＲＮＡ標的に対
するこのような仮想ライブラリーのスクリーニング、このようなライブラリーか
ら最高の潜在的バインダーの評価と同定、最後にこのような分子を組合せ方法で
合成し、これらの標的への新リガンドとして実験的に同定するという問題への解
答を提供する。
【０１５３】 本発明の方法は標的分子と高親和性で結合するライブラリーメンバーの同定を
可能にすることにより薬剤発明のプロセスの助けになり、従って、薬剤の候補を
リードするものを実際に合成開発する分子を提示する。 本発明は低分子のコンビナトリアルライブラリーの設計と合成をｉｎ ｓｉｌ
ｉｃｏで行うためのコンピュータを活用した方法を指向する。ライブラリーメン
バーはｉｎ ｓｉｌｉｃｏで生成する。本発明はまたｉｎ ｓｉｌｉｃｏでライ
ブラリーメンバーを生成する間に生じる情報を追跡して、関連データベースに蓄
積し、後からこの情報にアクセスして、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで生成したものに対
応する化合物を合成するための情報として使用する。本明細書の目的として、ｉ
ｎ ｓｉｌｉｃｏはコンピュータ・メモリーで発生したことを意味する、すなわ
ち、シリコンチップ上またはその他のチップ上で生成したことを意味し、従って
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏは「仮想」を意味する。
【０１５４】 本発明の方法によれば、それぞれの化合物またはライブラリーメンバーはフラ
グメントといわれる成分または構成部分に切断される。このように、生成された
それぞれの化合物は構成フラグメントを含むものと認められるため、それぞれの
フラグメントの分子式を合計した場合、合計は生成した化合物の分子式になる。
この切断は科学的直感を用いて色々な方法で行うことができる。 このようにして、多くのフラグメントの成分は同定され、それぞれはすぐに入
手可能な反応剤に役立つか、または反応として種々の化合物を生成する。それぞ
れのフラグメントは少なくとも１つの反応剤と関連し、その目的のフラグメント
をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで生成したその他の化合物に導入して使用するときに必要
な化学品を示している。化合物の切断は反応剤の合成の容易さ、反応剤の市販性
またはその組み合わせを基にする。フラグメントと反応剤それぞれは関連データ
ベースに蓄積され、そのデータベース内の同定特性に従って記載される。フラグ
メントの多くは原料または反応図式から入手できる。従って、ライブラリーが生
成されたなら、それはデータベースを作成することに伴い、そのライブラリーを
作成するのに使われたフラグメントに対応する反応剤が反応条件のセットを使っ
てデータベースに蓄積される。他のライブラリーが生成されるときはデータベー
ス内に蓄積されたフラグメントへの情報は化合物の新しいライブラリーの生成に
使用可能である。同様に第３のライブラリーが生成されるときには、さらに大量
のフラグメント、反応剤および反応に関する情報がデータベース内で使用可能に
なっている。このようにして、本発明の方法は化合物のライブラリーを作成する
のに伴って、データベースが作られるダイナミックな方法である。初めにライブ
ラリーの生成には目的とするライブラリーに必要なフラグメント、反応剤および
変換のために、データベースのインプットが必要である。しかし、データベース
が成長するに従い、多くのフラグメントおよび反応剤がデータベース内で使用可
能になり、そのことが次の化合物のライブラリー生成を簡単にし、さらに容易か
つ効率的に実行され、より日常的な組合せ合成作業になる。
【０１５５】 データベース内に記録されたフラグメントは同定特性で定義付けられる。フラ
グメントを定義付ける同定特性には構造表示（二次元または三次元ファイルとし
て）、名称、分子量、分子式および付着する点またはノード（これがフラグメン
トがｉｎ ｓｉｌｉｃｏで生成した他のフラグメントへフラグメントが付着また
はリンクする部位）を示す。この発明を記載するために、二次元表示が使用ささ
れるが、それは記号表示により、特定の化学的実体との関連がなく簡単にできる
。ここで使用される記号表示はフラグメントがどのように追跡でき、さらに本発
明の方法が示せるかという目的のみで使用されている。他の同定特性もデータベ
ースに加えることができる。どのような特性が追跡される必要があるのかは、生
物学的データ、化学的反応速度、その他の物理化学的特性も含めデータベースに
入れることができる。さらにフラグメントは反応剤を変更すれば生じる。従って
、そのような変更は反応剤に変化を与えるものとしてデータベースに追記するこ
とができる。どのフラグメントにも関連する同定特性のあるものは対応する反応
剤にとっては共通のものであり得る。このように生成された関連フラグメントは
関連データベースに蓄積することができる。
【０１５６】 化学反応剤に付ける同定特性には構造表示、名称、分子量、分子式および出所
、商業上の出所またはユーザーが付けたユニークな化合物のこともある。反応剤
の商業上の出所の場合、カタログＮｏ．またはウエブへのリンクなどが記載され
る。反応剤の同定特性と関連フラグメントの同定特性との間にはある程度の共通
性があり得る。 さらに、本発明に従えば、化合物は種々の変換の合計である。変換は本発明の
方法により化学合成に帰着される命名法である。変換はフラグメントと反応剤と
の間の１：１のリンクである。このように、それぞれの変換は反応剤に対応する
フラグメントの化合物が導入されたときの反応剤のユニークな転換を記載したも
のである。化合物がｉｎ ｓｉｌｉｃｏで生成されたとき、その成分フラグメン
トに分割され、対応する反応剤が同定され、それぞれのフラグメントは対応する
反応剤と１：１の関係で変換を記載する順序にリンクされる。このように、本発
明に従い、変換はフラグメントの出所としてみることができ、それにより、フラ
グメントは特定の合成法または合成反応へリンクされる。本発明の方法による変
換の記述または変換によって影響を与える補助反応剤の反応条件、例えば、必要
な温度、圧力、触媒、活性化剤、溶媒、その他の添加剤がある。
【０１５７】 フラグメントと反応剤の１：１のリンクのそれぞれの組み合わせは他の変換を
含む。従って、それぞれの変換はユニークである。本発明はフラグメントの追跡
をフラグメントがライブラリーの化合物に導入された反応または変換との関連で
行うことを許容している。このようにして、データベースは構成フラグメントと
の関係で生成した化合物だけではなく、これらの化合物を生成する合成経路との
関係、すなわちライブラリー化合物を生成する関連変換について記載する。この
ようにして、本発明の利用者は、単に目的とするフラグメントを選択することに
より、化合物の仮想ライブラリーを生成することができる。他方、ユーザーはそ
の化合物の実際の化学合成に必要な化学的経路を選択することにより化合物を生
成することができる。これは目的とする化合物の生成に伴う適当な変換を選択す
ることにより実施できる。ここにユーザーは目的とする化合物を生成または合成
を可能にすると思われる変換の選択を直感で行うこともでき、ｉｎ ｓｉｌｉｃ
ｏのエキスパートシステムを使用することもできる。Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで生成
される変換のそれぞれは関連データベースに蓄積され同定特性に従って記述され
る。同定特性は変換を定義し、フラグメント、反応剤、反応助剤または化合物と
の組み合わせで反応剤がフラグメントへ転換の影響を与えるのに必要な条件であ
る。
【０１５８】 例えば、本発明によるＣＩのｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの生成について述べた図１
４を考察する。図１４に示されたようにＣＩ（分子式Ｃ12Ｈ18Ｎ2 Ｏ5 Ｓ1 の切
断に当たっては、その構成フラグメントはＦi （分子式Ｃ5 Ｈ9 ＮＯ）、Ｆii（
分子式Ｃ5 Ｈ7 Ｏ3 Ｓ）およびＦiii （分子式Ｃ7 Ｈ7 Ｏ3 Ｓ）である。 Ｆｉは固相支持体へリンクしているヒドロキシルアミンの一部、すなわちＰ−Ｏ
−ＮＨで、ここでＰは固相支持体である。それぞれのフラグメントの分子式の合
計はＣＩの分子式の合計と同じである。 図１５に示すようにそれぞれのフラグメントＦi 、ＦiiおよびＦiii は関連デ
ータベースに蓄積され、同定特性との関係で構造表示（おそらく二次元または三
次元）、識別子または名称、分子式、付着ポイントまたはノードで、化合物ＣＩ
内で他のフラグメントとリンクするときのフラグメントの部位を示すのが記述さ
れている。他の情報、例えば、分子量もフラグメントと一緒にデータベースに入
れることができる。
【０１５９】 図１６に示されているように、対応するそれぞれの反応剤は（Ｒi 、Ｒiiおよ
びＲiii ）もまた関連データベースに蓄積され、同定特性とともに記載される。
反応剤を規定するのに使われる同定特性には構造表示、識別子または名称および
分子式を含む。分子式フラグメントについては分子量と出所（商業上の出所ｖｓ
ユーザー供給、在庫量、特別扱いなど）もそれぞれの反応剤に関連してデータベ
ースに蓄積できる。 次いで、化合物ＣＩのｉｎ ｓｉｌｉｃｏにおける生成に関し、変換の個別項
目も関連データベースへ蓄積することができる。図１７に見られるように、変換
Ｔi は反応剤Ｒi とフラグメントＦi ともにリンクし、ＴiiはＲiiとともにリン
クし、Ｔiii はＲiii とＦiii とともに１：１の関係でリンクする。また、それ
ぞれの変換に関連して、必要な反応条件があり、従って変換Ｔi は対応条件α、
Ｔiiは反応条件β、さらにＴiii は反応条件γが関連する。変換Ｔiii の場合、
反応剤Ｒiii は固相支持体に付着しているヒドロキシルアミンであり、従ってフ
ラグメントＦｉｉｉは固相支持体へ付着しているヒドロキシルアミン部分を表し
ている。
【０１６０】 それぞれのフラグメントはユニークな対応をする反応剤に到達または生成して
いると思われるが、本発明はまた２またはそれ以上の反応剤を経て生成する共通
のフラグメントを含んでおり、従って２またはそれ以上の変換が同じフラグメン
トへ到達することもある。図１８に示されているように、共通フラグメントＣＨ 3 −ＣＨ2 −Ｃ（＝Ｏ）−は反応剤Ｘ（酸塩化物）、ＣＨ3 −ＣＨ2 −Ｃ（＝Ｏ
）Ｃｌを使用する変換Ａ経由でも到達できる。共通フラグメントはまたｉｎ ｓ
ｉｌｉｃｏで生成した経変換Ｂにより導入でき、その場合は反応剤Ｙ（酸無水物
）ＣＨ3-Ｈ2 −Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2 −ＣＨ3 ）が使用される。
従って、本発明の方法により共通フラグメントはその化合物に２またはそれ以上
の異なる反応剤により、２またはそれ以上の異なる変換を経て導入される。
【０１６１】 また、共通反応剤が２またはそれ以上の転換を起こし、２またはそれ以上の異
なるフラグメントを形成することがある。これはその後２またはそれ以上の異な
る変換を異なる条件下で表すことになる。例えば、図１９Ａに示されているよう
に、共通の反応剤Ｚ、ＣＨ3 −ＣＨ2 −ＮＨ2 はアルケンフラグメントをその化
合物にＳｃｈｉｆｆの塩基形成法としてよく用いられている条件下で導入するこ
とができる。これを変換Ｘと表す。しかしながら同じ共通反応剤Ｚはアミドフラ
グメントをその化合物に別の一組の条件、変換Ｙを構成する方法で導入するのに
使用することができる。このように、共通反応剤は２またははそれ以上の異なる
フラグメントをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで生成された最終化合物へ導入することがで
き、２またはそれ以上の変換が関連し、それぞれの変換に対応した条件下で行わ
れる。
【０１６２】 さらに、ある１つのフラグメントはある１つの化合物に導入されると、それは
さらに修飾されて、他のフラグメントに転換され、その形成された化合物では他
に何も修飾は行われていない。図１９Ｂに示されているように共通反応剤Ｚ' 、
ＣＨ3 −ＣＨ2 −Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ2 −Ｃｌを検討する。共通反応剤Ｚ' はＣＨ3 −ＣＨ2 −Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ2 −Ｃｌ−構造をもってフラグメントに対応する。共
通反応剤Ｚ' はアルケンフラグメントを最終化合物に導入するのに用いられ、変
換Ｘ' と表し、還元および脱水が起こる条件である。しかし、共通反応剤ヒドロ
キシアルキルフラグメントを最終化合物に導入するのにも、還元が起こりやすい
条件下で使用される。これを変換Ｙ' で表す。
【０１６３】 本発明は最も一般的に記号表現と言われる方法で記述する。記号表現は本発明
の方法を記述するのに用いてきた。その理由は、このような表現法は特別な化学
に限定されるものではないからである。記号表現は本発明で用いられる方法を複
数の化学的実体で表すだけである。本発明を記述するのに用いられるそれぞれの
記号は１つの化合物を表す場合も、複数の化合物を表す場合もある。その理由は
、本発明は１つの化合物を追跡することに限定せず、多くの生成した化合物を追
跡するのに用いられることもあり得るからである。
【０１６４】 図２０は化合物ＣＩ' を得るフラグメントの付加を記号で表している。フラグ
メントは構造Ｆi 、ＦiiおよびＦiii を用い、それらは順次付加されてＣＩ' を
得る。Ｆi 、ＦiiおよびＦiii はＣＩ' を構成するフラグメントを記号表示した
ものである。これらのフラグメントはそれぞれ対応する同定特性を付けて構造表
示、名称、分子式および付着部位またはノードを関連データベースに蓄積するこ
とができる。化合物ＣＩおよびＣＩ' を見ると、フラグメントの化学構造と記号
構造の間にはもちろん、化合物ＣＩと化合物ＣＩ' の記号表現との間に共通性が
あることが明らかになる。
【０１６５】 記号反応剤の表は図２１に示されている。反応剤Ｒ１からＲ１０はその構造、
名称、分子式、分子量および出所が記載され、反応剤に関連するその他の情報も
記載されている。Ｒ３とＲ４は２つの異なる反応剤であるが、同じフラグメント
を化合物に導入する方法として使用されている。それは反応剤Ｒ３で使用される
反応条件は一組の条件として変換で使用されているが、反応剤Ｒ４では変換が別
の条件のセットで使用されていることによる。同様に、反応剤Ｒ５は２つの反応
剤または成分の混合物を含んでいる。これらはおそらく（Ｒ）−および（Ｓ）−
立体異性体、Ｄ−およびＬ−異性体または２つの全く異なる反応剤のこともある
。ここでＲ５はただ２つの反応剤または成分の混合物として表現されているが、
本発明の方法が２つまたはそれ以上の反応剤の混合物も使用可能なことは当業者
には明らかなことと思われる。ライブラリーを構成する代表的な反応剤の混合物
は、４、５またはそれ以上の個別の反応剤を混合剤にしたものもある。
【０１６６】 図２２は記号表現のフラグメントの表である。フラグメントＦ１からＦ８は関
連データベースに、同定特性とともに蓄積されており、同定特性には構造表現、
名称、分子量、分子式および付着する部位またはノードがある。この表では図２
１の反応剤を使用して化合物のライブラリーに導入された多くのフラグメントの
記号表現が記載されている。このようにして、フラグメントＦ１が反応剤Ｒ１を
用いて化合物に導入されたことがわかる。フラグメントＦ１のなかで、Ｘは付着
部位に対する識別子である。このことはＦ１が他の化合物のフラグメントに付着
するときの部位であることを示している。同様にフラグメントＦ２は化合物（Ｘ
部位で付着）が反応剤Ｒ２で導入される。
【０１６７】 しかし、フラグメントＦ３は他の化合物の反応剤Ｒ３またはＲ４を使用して導
入することができる。このことは使用する反応剤の選択ができることで、それは
その化合物に他のフラグメントを導入するときにも、その化学的性質には互換性
があることを意味している。次に、フラグメントＦ４（フラグメントの混合物）
は反応剤Ｒ５を使用して導入されるが，これは図２１に示されているように反応
剤の混合物である。 フラグメントＦ５は２つの付着部位を持ち、Ｆ５と組み合わされる場合には部
位ＸおよびＹでその他のフラグメントと付着できる。付着部位が２つあることは
Ｆ５を使用すれば、化合物を作るのに２つ付着できることである。前と同様に、
ここでもまたＦ５は反応剤Ｒ６またはＲ７によって化合物に導入され、それは反
応条件と化合物を作るのに他のフラグメントを導入するときに組み合わせるもの
の化学的性質による。 フラグメントＦ７およびＦ８はｉｎ ｓｉｌｉｃｏで作られた化合物へ、それ
ぞれ反応剤Ｒ９およびＲ１０を使用して導入される。両フラグメントとも３つの
付着部位を持ち、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでこれらのフラグメントを使用する場合に
は、他のフラグメントが付着する部位が３つあることを示している。フラグメン
トＦ７およびＦ８は３つの付着部位を持っているが、当業者にとっては、化合物
に導入するとき付着部位を増加すること（適切な反応剤の使用により）で１つの
フラグメントに３つ以上の付着部位もあり得ることは理解できることである。
【０１６８】 フラグメントと反応剤の表を関連データベースに入れることにより、本発明の
方法によるフラグメントと反応剤をリンクすることで、新しい変換を作り出すた
めの変換表ができる。図２３はフラグメントを反応剤と１：１の関係でリンクし
た記号による変換表である。各変換を記載する同定特性にはフラグメントと反応
剤の間の１：１リンク（１対１リンク）および溶媒、必要な温度と圧力、適切な
反応剤を使用してフラグメントを化合物に導入するのに影響を与える補助反応剤
などの反応条件が含まれる。補助反応剤には触媒、活性化剤、酸、塩基、その他
の化学品およびフラグメントの導入に必要な添加物である。例えば、ハロゲン化
アルキルの使用により生じる酸を補足するため、ハロゲン化アルキルには常に塩
基が添加される。
【０１６９】 図２３に示されているように、変換Ｔ１はフラグメントＦ１と反応剤Ｒ１をリ
ンクする。Ｔ１はこれを１：１リンクで結ぶ反応条件（α）を特定する。同様に
、Ｔ２はＦ２およびＲ２を条件βの基にリンクする。変換Ｔ３およびＴ４はそれ
ぞれ共通のフラグメントＦ３に関連する特異な変換である。変換Ｔ３は共通のフ
ラグメントＦ３を反応剤Ｒ３と、反応条件αでリンクするが、変換Ｔ４は共通の
フラグメントＦ３を他の反応剤Ｒ４とその他の条件δでリンクする。例えば、反
応剤Ｒ３が塩化アルキルで、Ｒ４が沃化アルキルとする。これらの反応剤は類似
しているが、（これらはともにハロゲン化アルキルである）が、それらは異なる
反応条件下で使用されている。同じフラグメントをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで発生し
た化合物へ導入することに影響を与える、異なる反応剤の使用が２つのユニーク
な合成法を示している。このことは同じフラグメントを同じ化合物に導入する２
つの明白で、ユニークな合成法を示している。その化合物の合成に関わる化学的
ステップ全体から、同じフラグメントをその化合物に導入する変換で、あるもの
が他のものより優先する。
【０１７０】 変換Ｔ５はフラグメントＦ４を反応剤Ｒ５でリンクする。Ｒ５は反応剤の混合
物、例えば、（Ｒ）−および（Ｓ）−立体異性体、Ｄ−およびＬ−異性体あるい
は２つまたはそれ以上の異なる反応剤である。結果として、Ｒ５の使用で、フラ
グメントＦ４の混合物のその化合物への導入が起きる。当業者は多成分反応剤Ｒ
５を選択した結果、それらは混合した状態になり、相互に反応せず、同様の反応
条件下で反応が起きたことを認めるものと思われる。例えば、Ｒ５は酸ハロゲン
化物の混合物を含んでいると考えられる。これらは互いに反応しないが、同様の
条件下で、求核物質と同様の反応をする。当業者はまた、反応剤は１つまたは２
つの成分あるいは構成反応剤に限定されることはなく、現実には２、３、４また
はそれ以上の反応剤または成分を含んでいることを認識している。
【０１７１】 反応剤の混合物を使用するとき、個々の成分反応剤が異なる化学反応速度を持
っている。もし修正が行われなければ、このことはそれらの生成品が製品化合物
の中で不均一に現れるという結果になることがある。これは反応混合物中のそれ
ぞれの反応の濃度を混合物中の他の反応剤との対比で、反応の相対速度が同じに
なるようにすることで解決できる。これはそれぞれの反応剤の反応速度をある１
つ選んだ標準反応剤と比較することで達成できる。標準化された反応速度は反応
混合物中のそれぞれの構成反応剤の濃度を変更された反応速度に補正するのに使
うことができる。このようにして、異なる速度の反応剤の混合物も１つの反応混
合物内でライブラリーの目的の化合物が同じ量そのままに発生する状態で使用で
きる。
【０１７２】 変換Ｔ６およびＴ７は変換Ｔ３およびＴ４と、これらの変換のそれぞれを同定
する条件が異なるほかは同じである。変換Ｔ６はフラグメントＦ５を反応剤Ｒ６
で条件ｅの下で、変換Ｔ７は同じフラグメントＦ５を別の反応剤Ｒ７で異なる条
件（条件α）の下でリンクする。変換Ｔ６およびＴ７の条件は異なるが、これは
特定の合成が使用されている間も他のフラグメントの両立する化学的性質の選択
を可能にする。これは実際にはライブラリーの合成をする上で、有用かつ重要な
考慮すべき事柄である。フラグメントＦ５を化合物に導入しようとするとき、化
合物をつくるのに用いられる実際の化学的性質は、始めに変換Ｔ６またはＴ７、
従って、反応剤Ｒ６またはＲ７を選択したときに考慮されている。これらは化学
構造のみを考慮し、その化合物をつくるのに必要な実際の化学的性質を考慮しな
い化学薬品データベース生成者にとっては反対の方向である。
【０１７３】 変換Ｔ９およびＴ１０はフラグメントＦ７を反応剤Ｒ９で、フラグメントＦ８
を反応剤Ｒ１０それぞれリンクする。その両方の変換は反応条件ｇで関連してい
ることが確認されている。フラグメントＦ７およびＦ８は付着部位を３つもって
いるが、これらのフラグメントが３つ以上の部位を持っているかもしれないこと
が認められており、従って、化合物の複雑性の増加および他のフラグメントを付
着させるために用いるラウンド数の増加になっている。３つの部位で説明すると
、３セットの異なる反応剤混合物、それぞれがそのセットに５つの反応剤が入っ
ているものを使用すれば、フラグメントＦ７に対して１２５の化合物を生成し、
フラグメントＦ８に対してもさらに１２５の化合物が生成する。
【０１７４】 本発明の方法は単一の化合物または化合物混合物を生成させることに使用する
こともできる。混合物は２つ以上の化合物を含み、２つ以上の反応剤（従って２
つ以上のフラグメントの導入）がライブラリー生成の初めに関与していて、ライ
ブラリ生成の直後の段階で反応剤混合物（従ってフラグメントの混合物）あるい
はその両方の技術の組み併せを導入することができる。図２４および図２５は本
発明のこの側面を説明している。
【０１７５】 図２４に示されているように、本発明の方法はＣ１およびＣ４のような単一の
化合物の生成に使用でき、化合物Ｃ２およびＣ３を含む混合物Ｍ１の生成にも使
用可能である。ライブラリー生成はフラグメントＦ７（付着部位３つ）を第１ラ
ウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ）に選択することから始まる。第２合成ラウンド（
ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋１）でＦ７はフラグメントＦ２と結合し合成経路Ｐ１ａ、
複合フラグメントＣＦ１の形成となる。Ｆ７には付着部位３つ（すなわちＸ、Ｙ
およびＺ）がある。このように、ラウンドｎ＋１はＸ，ＹおよびＺのそれぞれが
使用されるまで終わらず、必要があれば他のフラグメントに付着する。Ｘ、Ｙお
よびＺそれぞれの周りを回り、それらの部位にフラグメントを付着させることは
順次起きる。第１合成ラウンド（すなわちラウンドｎ）で選択されたフラグメン
トのＸ、ＹおよびＺの部位が放出されると、現在ある付着部位の周り回ることは
次のフラグメントに加えられて、次の合成ラウンド（すなわち、第３合成ラウン
ドまたはラウンドｎ＋２）でも継続する。さらに、このフラグメント上のすべて
の目的の付着部位が使用されると、この特定の合成ラウンドは終了する。加えら
れたフラグメントが目的とするラウンド使用可能な付着部位の周りで付着の繰り
返しを目的とする化合物ができるまで継続する。
【０１７６】 図２４に示されているようにＣＦ１が次に合成経路Ｐ１ｂに投入され、そこで
はフラグメントＦ１がＣＦに入れられ、それにより混合フラグメントＣＦ２が形
成される。次いで、ＣＦ２が合成経路Ｐ１ｃに投入され、そこでフラグメントＦ
５がＣＦ２に加えられ複合フラグメントＣＦ３の形成へと導かれる。これは合成
ｎ＋１（すなわちフラグメント導入またはこの化合物を作るための合成）で終わ
る。フラグメントＦ５が２つの付着部位のとき、ＣＦ３は使用可能付着部位（す
なわち部位Ｙ）を持つ。この部位（Ｙ部位）へのフラグメントの投入は合成ラウ
ンドｎ＋２（即ち第３ラウンド）へ続くのは、前に投入されたフラグメント上の
目的の付着部位が全部放出されたからである。次にＣＦ３は合成経路Ｐ２へ投入
され、そこでフラグメントＦ４がＣＦ３付着部位Ｙに入れられる、Ｆ４は２つの
化合物の混合物であり、化合物Ｃ２およびＣ３の混合物ＭＩが生成される。
【０１７７】 しかし、単一の化合物もまたこのフラグメント投入図式を用いて生成される。
このように化合物Ｃ１はＣＦ３を合成経路Ｐ１ｄへ投入、ここではＣＦ３はフラ
グメントＦ３と結合しＣＦ3 の部位Ｙに付着する。フラグメントＦ３のＣＦ３へ
の投入は第３合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋２）まで続き、Ｃ１の生成を
導く。 変わりにＣＦ３を合成経路Ｐ３ａへ投入し、そこでフラグメントＦ６がＣＦ３
に導入されＣＦ４が形成される。これは第３合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ
＋２）を示す。ＣＦ４はもう１つの使用可能な付着部位（ｉ．ｅ．部位Ｙ）を持
ち、それへフラグメントＦ２が合成経路Ｐ３ｂで付着する。これが化合物Ｃ４の
生成へと導く。それは非常に複雑な化合物である。その理由は選んだフラグメン
トおよび使用した合成経路からくる付着部位が多いからである。フラグメントＦ
６のＣＦ４への付加は第３合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋２）を構成する
。フラグメントＦ２のＣＦ４への付加は第４合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ
＋３）を表す。その理由はＰ３ｂはフラグメント（フラグメントＦ２）の部位（
ｉ．ｅ．ＣＦ４上の部位Ｙ）への付加を伴い、それはフラグメントＦ６をＣＦ３
へ投入し、その結果ＣＦ４（ｉ．ｅ．フラグメントＦ５）に既に加えられたフラ
グメント上の使用可能な部位が放出される。即ち、フラグメントＦ６の付加はｎ
＋２（第３合成ラウンド）を終了させる。その理由はＦ６がＣＦ３（ｉ．ｅ．Ｃ
Ｆ３上の部位）上の最後の使用可能な部位に付着しているからである。
【０１７８】 図２４の経路Ｐ１ｃへの影響を与えた反応に対して、単一フラグメント（Ｆ５
）は反応剤Ｒ６またはＲ７を経由してＣＦ２に加えられた（このように、Ｒ６お
よびＲ７が関連する変換を通して）。これらの付加は本発明のデータベースでの
追跡目的に２つのユニークな変換を加えたが、これらの付加は実質上同じ化学変
換を行っている。このように、本発明の方法に従う自動的な化合物の追跡は化合
物の仮想ライブラリーにとって有用なばかりではなく、ユーザーに化合物が実際
に合成させる合成経路の選択を与えることになる。本発明のこの追跡への観点は
導入されるフラグメント、フラグメントに関連する変換（反応）および共通フラ
グメントを目的の化合物への導入の代わりに対する新しいユニークな方法である
。本発明は複数の反応剤の使用により生成される個々の化合物の追跡のみでなく
、複数の変換で生成した複数の化合物の自動的追跡も可能にする。ここに記述し
た方法は本発明の追跡面を記号表示あるいは表で示しているが、当業者は多くの
コンピュータ・アルゴリズム・コードと技術が上述の個別の、あるいは自動追跡
面で使用されていることは認識していることであろう。
【０１７９】 本発明はさらに単一容器方式で、スタート時点で異なるフラグメントを使用し
、ライブラリー生成を始めて、化合物の混合物を単一容器で生成する方法を提供
する。化合物の単一容器生成または合成は単一反応容器（ｉ．ｅ．１つのポット
）の中で複数の化合物を生成することを言う。これは両立する化学的性質が選択
されれば可能である。このような単一容器の例には次のものが含まれるが、それ
に限定されるものではない。即ち９６−ウエルプレート、反応フラスコ、例えば
２５ｍＬのフラスコまたは工業用反応器である。反応または変換は反応容器のサ
イズに関わらず１つの容器で行う。単一容器合成の考え方は化合物の仮想ライブ
ラリー生成には不適切である。これら仮想ライブラリーは単にｉｎ ｓｉｌｉｃ
ｏで生成するためである。しかし、単一容器合成の考え方は実際上化合物を実験
室で合成する場合にも適切である。このように、化合物は異なる化学構造を生成
するための化合物つくりにおいて、化合物はそれぞれに追跡することができるが
、合成ではそれらを一緒にして同じ「容器」の中で行うこともあり得る。
【０１８０】 単一容器合成の一つの例が図２４に示されており、複合反応剤Ｒ５を加えた混
合物Ｍ１を生成する。さらにもう１つの単一容器合成が図２５に示されており、
ここでは、さらに化合物の混合が行われている。混合物Ｍ２は化合物Ｃ１および
Ｃ５を含み、フラグメントＦ７およびＦ８からスタートして第１合成ラウンド（
ｉ．ｅ．ラウンドｎ）で生成される。これらのフラグメントのそれぞれは付着部
位が３つあり、その上に他のフラグメントが導入されている。結果として、２つ
のフラグメント合成経路Ｐ１ａに投入し、そこでＦ７およびＦ８はフラグメント
Ｆ５と部位Ｘで結合し、結果として複合フラグメントＣＦ１およびＣＦ５が単一
容器で形成される。ＣＦ１およびＣＦ５は次で合成経路Ｐ１ｂへ投入され、そこ
ではフラグメントＦ１はＣＦ１およびＣＦ５の部位Ｙに導入され、それにより複
合フラグメントＣＦ２およびＣＦ６が形成される。ＣＦ２およびＣＦ６は次いで
合成経路Ｐ１ｃへ投入され、そこではフラグメントＦ５がこれらの複合フラグメ
ントの部位Ｚに導入され、ＣＦ３およびＣＦ７を形成する。これで第２合成ラウ
ンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋１）が終了する。フラグメントＦ５は２つの付着部
位を持つため、ＣＦ３およびＣＦ７に導入後、そこには尚付着可能な付着部位（
ｉ．ｅ．部位Ｙ）があり、他のフラグメントをさらに導入できる。このようにし
て、ＣＦ３およびＣＦ７は化合物Ｃ１およびＣ５の混合物（Ｍ２）に合成経路Ｐ
１ｄを経て転換され、そこでＣＦ３およびＣＦ７はフラグメントＦ３と結合する
。それはＣＦ３およびＣＦ７のなかのフラグメントＦ５上のＹ部位と結合してい
る。フラグメントＦ３をＣＦ３およびＣＦ７のＹ部位への導入は第３合成ラウン
ド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋２）で示す。
【０１８１】 なお、本発明による化合物の混合物を単一容器で生成するこの他の例は図２６
に示されている。Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで化合物の生成はフラグメントＦ７を選択
することから始まり、それには３つの付着部位（Ｘ、ＹおよびＺ）がある。これ
は第一合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ）を表す。次いでＦ７は合成経路Ｐ１
ａに投入され、そこでフラグメントＦ７はフラグメントＦ２と結合する。Ｆ２は
Ｆ７部位Ｘに付着し、複合フラグメントＣＦ１を形成する。この段階でＣＦ１は
第２合成経路Ｐ１ｂおよびＰ１ｂ' へ投入される。Ｐ１ｂはフラグメントＦ１を
使用し、それはＣＦ１の部位Ｙに導入され、そこで複合フラグメントＣＦ２が形
成され、その間、Ｐ１ｂ はフラグメントＦ３を使用し、ＣＦ１の部位Ｙに導入
され、それにより複合フラグメントＣＦ８が形成される。このようにして複合フ
ラグメントの混合物（ＣＦ２ およびＣＦ８）を生成する。両フラグメントＦ１
およびＦ３はともに導入され（例えば、実際の合成が行われる場合には単一反応
剤容器から）、化学的性質がこれらのフラグメントの化合物への導入で両立する
ことがあれば、化合物の単一容器生成で行われる。そうでなければ、これらのフ
ラグメントは別々に導入することもできる。次いで、ＣＦ２およびＣＦ８は合成
経路Ｐ１ｃに投入され、そこで両方の複合フラグメントはフラグメントＦ５と結
合され、それはＣＦ２およびＣＦ８上の部位Ｚに付着し、それにより複合フラグ
メントＣＦ３およびＣＦ９が形成される。ＣＦ３およびＣＦ９の形成で、第２合
成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋１）は完了する。フラグメントＦ５は付着の
ための２つの部位を持っているため、部位Ｙは他のフラグメントの付着が可能で
ある。従って、ＣＦ３は合成経路Ｐ３へ投入され、そこではＣＦ３はフラグメン
トＦ４と結合する。Ｆ４の導入は第３合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋２）
を表す。Ｆ４はフラグメントの混合物であり（反応剤の混合物を加えて導入され
る）、図２２に示されている。結果として、合成経路Ｐ２は化合物Ｃ２およびＣ
３の生成となる。同時にＣＦ９はフラグメントＦ４と結合し、合成経路Ｐ２' を
経由して化合物Ｃ７およびＣ８の生成となる。このようにして、化合物Ｃ２、Ｃ
３、Ｃ７およびＣ８を含む混合物Ｍ３が形成される
【０１８２】 本発明はまた非常に複雑な化合物の混合物の生成を提供する。その一例は図２
７Ａおよび図２７Ｂに示され、そこでは混合物Ｍ４が生成され、１６の化合物が
含まれる。混合物Ｍ４の中の化合物は第１合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ）
のフラグメントＦ７およびＦ８からスタートして生成される。これらのフラグメ
ントはフラグメントＦ２と結合し、それらはそれぞれＦ７およびＦ８の部位に導
入され、複合フラグメントＣＦ１およびＣＦ５を形成する。これに続き、フラグ
メントＦ１およびＦ３の混合物はＣＦ１およびＣＦ５はこれらの複合フラグメン
トの部位Ｙへ導入され、４つの複合フラグメントＣＦ２、ＣＦ６、ＣＦ８および
ＣＦ１１へ導かれる。これらの複合フラグメントは次いでフラグメントＦ５およ
びＦ６の混合物と結合される。Ｆ５およびＦ６の両方は２つの付着部位があり、
Ｆ５およびＦ６上の部位Ｘ、ＣＦ２、ＣＦ６、ＣＦ８およびＣＦ１１上には部位
Ｚがあり、８つの複合フラグメントＣＦ３、ＣＦ７、ＣＦ９、ＣＦ１２、ＣＦ１
３、ＣＦ１４、ＣＦ１５およびＣＦ１６の混合物を形成する。これで第２合成ラ
ウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋１）が終了する。フラグメントＦ５およびＦ６は
２つの付着部位ＸおよびＹを持つため、上記の８種の複合フラグメントはただ１
つの使用可能な付着部位（ｉ．ｅ．部位Ｙ）を持ちその上に他のフラグメントを
導入することができる。これらの８つの複合フラグメント上の部位Ｙへのフラグ
メントの付着は第３合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋２）を表す。次いでフ
ラグメントＣＦ４がＣＦ３、ＣＦ７、ＣＦ９、ＣＦ１２、Ｃｆ１３、ＣＦ１４、
ＣＦ１５およびＣＦ１６へ導入される。フラグメントＦ４は２つの構成フラグメ
ントの混合物のため、１６の化合物を生成する。即ち、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ７、Ｃ８
、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、
Ｃ１８、Ｃ１９およびＣ２０である。このようにして、単一容器方法で複数のフ
ラグメントを使用し、フラグメントの混合物を組み合わせると、化合物の混合物
は非常に複雑なものを生成できることがわかった。図２７Ａおよび図２７Ｂの実
施例では２つのフラグメントからはじめてライブラリーを生成すると、混合物Ｍ
４として１６のユニークな化合物の混合物が生成している。当業者は、ライブラ
リー生成が３つ以上のフラグメントで始まり、あるいは多フラグメントが同じ前
駆フラグメントに加えられればさらに複雑な化合物の混合物を生成することは認
識していることであろう。
【０１８３】 本発明はまた、各種合成ラウンドでフラグメント付加後の追跡を行う方法を提
供する。このシステムの説明はフラグメントの付加に関連する合成ラウンドを表
にして行なわれる。本発明の説明の目的で、フラグメント付加を追跡する方法を
表にしてここに示す。当業者により、他のアルゴリズム、アルゴリズムコード、
コンピュータが読める媒体および多くのソフトウエアのコーデイング技術など、
コンピュータ技術関係の業者に知られている技術がこの追跡に使用されているこ
とは明らかである。フラグメント付加の追跡表は化合物の構造を示し、仮想ライ
ブラリーをつくり、これら化合物の実際の合成を目的としない場合に使用できる
。しかし、変換を追跡する表は適切な変換の選択により化合物を合成し、多数の
変換の場合、好ましい変換を選択して、必要なフラグメントを化合物に導入して
合成するのに使用することができる。
【０１８４】 図２８はそれぞれの合成ラウンドで、フラグメントが加えられる場合の化合物
Ｃ１について記述している。第１合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ）はフラグ
メントＦ７の選択から始まる。これに続いてフラグメントＦ２、Ｆ１およびＦ５
は第２合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋１）にある。最後に、化合物Ｃ１は
フラグメントＦ３が付加して第３合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋２）で生
成される。このようにして、生成された化合物は二次元の仮想ライブラリーに蓄
積されるか、または三次元の仮想ライブラリーに変換され、そこで目的の標的分
子とのドッキングをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで行うのに使用できる。
【０１８５】 化合物の仮想ライブラリーでの生成およびライブラリーメンバーの標的分子と
のドッキングのためには、化合物を各種合成ラウンドでフラグメントの付加を追
跡するためそのフラグメントに関連した関連データベースに加えれば事足りる。
しかし、ライブラリーの目的化合物の実際の合成が行われるときには実際の合成
ステップ、反応剤、溶媒、濃度、補助化合物および実際の化合物合成に影響を与
える各種の合成要因を特定する必要が生じる。このように合成ステップ、反応剤
、溶媒、濃度および補助化合物は事実、上記記載の変換でも併用される。このよ
うにして、変換の考え方をとることにより、本発明はフラグメントを加えること
に関連して発生した化合物だけでなく、それぞれの合成ラウンドに必要な合成パ
ラメータをも追跡する方法を提供する。
【０１８６】 図２８はまた、合成ラウンドで使用した各種変換に関して化合物Ｃ１の生成を
示している。４つの合成経路は化合物Ｃ１の合成へ導く。その理由は多数変換を
利用すると合成される化合物に同じフラグメントを導入することができるからで
ある。図２８に示されているようにフラグメントＦ７の選択が第１合成ラウンド
（ｉ．ｅ．ラウンドｎ）で変換Ｔ９を構成する。続いてフラグメントＦ２の付加
が行われ、それは変換Ｔ２を用いて実施される。ついで、フラグメントＦ１が変
換Ｔ１を経由して加えられる。しかし、フラグメントＦ５は合成経路１および３
で、Ｔ６の変換を通じて反応剤６を用いてかあるいは合成経路２および４で変換
Ｔ７経由で反応剤Ｒ７を用いることで行われる。同様に最後のフラグメントＦ３
は合成経路１および２で変換Ｔ３経由して反応剤Ｒ３を用いてかまたは合成経路
３および４により変換Ｔ４を経由して反応剤Ｒ４を用いて加えられる。このよう
にして、図２８は化合物Ｃ１が４つの異なる合成スキームの１つを経由して実際
に合成され、そのスキームは追跡されるかまたは表にされ本発明の方法を用いて
説明できる。４つの表のそれぞれはＣ１製造のための４つの合成経路のそれぞれ
を完全に説明している。このようにして、本発明のユーザーは同じ反応の実行（
同じフラグメントの導入）についてすべての代替経路が使用可能であり、目的の
化合物を製造するために最も適切なまたは好ましいルートを選択することができ
る。
【０１８７】 図２９は混合物Ｍ１のなかの化合物Ｃ２およびＣ３に対する同様の変換追跡表
を示している。化合物Ｃ２およびＣ３の合成はフラグメントＦ７の選択から始ま
り、それは第１合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ）で変換Ｔ９（図２９のステ
ップ１）を示している。次いでフラグメントＦ７は第２合成ラウンド（ｉ．ｅ．
ラウンドｎ＋１）（ステップ２）で変換Ｔ２を経由してフラグメントＦ２と結合
する。同じラウンドで、変換Ｔ１を経由してフラグメントＦ１が、変換Ｔ７を経
由してフラグメントＦ５が順次加えられる（ステップ３および４）。最終的にフ
ラグメントＦ４が第３合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋２）で加えられる。
Ｆ４は２つの構成フラグメントの混合物であるため（２成分構成反応剤のため）
、表はこの段階（ステップ５）で複写されることで、変換Ｔ５（ｉ．ｅ．Ｔ５1 およびＴ５2 ）が完了する異なる合成経路を説明することができる。ステップ５
は化合物Ｃ２およびＣ３を示している。このようにして、本発明によれば、特定
の変換に２つ以上の反応剤が関与すれば、この表はそのような反応剤が出るたび
に複写されることがわかる。
【０１８８】 図３０は混合物Ｍ３の中の化合物Ｃ１およびＣ５のための変換追跡表を示して
いる。合成が２つのフラグメントＦ７およびＦ８で始まるため、追跡は２つの平
行した表で始まる（図３０のステップ１）。第１合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウン
ドｎ）で、Ｆ７は変換Ｔ９経由で選択され、Ｆ８は変換Ｔ１０経由で選択される
。第２合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋１）はステップ２で、変換Ｔ２経由
でフラグメントＦ２の導入で始まる。ステップ３で変換Ｔ１はフラグメントＦ１
を化合物に導入する。ステップ４で、変換Ｔ７はフラグメントＦ５を導入する。
これで第２合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋１）は終了する。最終的に、第
３合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋２）で、変換Ｔ４はフラグメントＦ３（
ステップ５で）の導入に用いられ、化合物Ｃ１およびＣ５を含む混合物Ｍ２をつ
くる。この例ではフラグメントＦ７およびＦ８の混合物が初めに使用されるため
この表は合成スキームの早い時期に複写される。
【０１８９】 図３１に混合物Ｍ３の化合物Ｃ２、Ｃ３、Ｃ７およびＣ８の変換追跡表が示さ
れている。これらの化合物の合成は第１合成ラウンド（すなわちラブンドｎ）で
始まり、そこでフラグメントＦ７が選択される。これは変換Ｔ９（図３１のステ
ップ１に示される）を表す。図３１のステップ２は第２合成ラウンド（ｉ．ｅ．
ラウンドｎ＋１）について述べ、変換Ｔ２経由でフラグメントＦ２の付加を含ん
でいる。ステップ１およびステップ２はそれぞれ単一変換を含みステップ３は２
つの異なる変換を含む。その理由は２つの異なる反応剤の使用により２つの異な
るフラグメントが化合物には導入される。従って、ステップ３では表は２回複写
される。その理由は２つの異なる反応剤は２つの異なる変換を経由し、２つの異
なるフラグメントの導入に用いられるからである。ステップ３では変換Ｔ１がフ
ラグメントＦ１の導入に用いられ、変換Ｔ３はフラグメントＦ３の導入に用いら
れるからである。第２合成ラウンド（ｉ．ｅ．ラウンドｎ＋１）はステップ４の
変換Ｔ７で終了し、フラグメントＦ５を導入する。最終成分ラウンド（ｉ．ｅ．
第３ラウンドまたはラウンドｎ＋２）では変換Ｔ５が用いられフラグメントＦ４
を導入する。Ｆ４は２成分フラグメントの混合物であるが、ステップ５のそれぞ
れの表は変換Ｔ５I およびＴ５2 のため２回複写され、それはＦ４の構成フラグ
メントのそれぞれを表す。
【０１９０】 これらの図は種々のフラグメント、反応剤および変換が単一化合物または化合
物の混合物で、その生成または合成の間追跡できる唯一の方法を示している。し
かし、当業者はその他の多くのアルゴリズムのスキームは追跡のために用いられ
、化合物がｉｎ ｓｉｌｉｃｏに生成したとき、そのスキームは変換経由でフラ
グメントが導入されることを説明することを認識しているだろう。 上記ライブラリーおよび他の方法でつくられたライブラリーは様々な自動化し
た自動機により合成される。説明のため、上記ライブラリーの合成に用いられた
自動シンセサイザーは米国特許５，４７２，６７２および５，５２９，７５６に
記載されている。自動シンセサイザーの変形したものであり、その全体を参考に
して本明細書に組み入れる。この特許に記載されている自動シンセサイザーはＸ
軸方向への動きに加えて、Ｙ軸方向へ動くよう改良されている。そのように改良
され、化合物の９６−ウエル配列が自動シンセサイザーにより、成分合成される
。自動シンセサイザーはさらに温度調節され、合成の全フェーズで、不活性ガス
を保持する能力がある。反応剤の配列送りフォーマットは反応容器マトリックス
のＸ軸直交方向への動きおよび反応剤の配列のＹ軸方向への動きをとり入れてい
る。それぞれの反応剤は反応剤の相互汚染、ラインフラッシングおよび／または
ピペット洗浄の可能性をなくすための、専用プラミングシステムを備えている。
これが反応剤割り当てシステムで得られる高速送達スピードと結合することによ
り反応剤を非常に高速で送達することを可能にしている。さらにこれにより長く
複雑な反応シーケンスが効率よく軽快に動くことを可能にする。
【０１９１】 以下に記載されているように自動シンセサイザーと連携して用いられるソフト
ウエアは多くの化合物の平行合成を簡単なプログラムで行える。このソフトウエ
アはシーケンス（．ｓｅｑ）ファイルのルックアップを経て特定のウエルに加え
るべき特定の反応剤を呼び出すコマンド（．ｃｍｄ）ファイルの形式で一般的な
合成手段を用いる。容器位置、流速および各反応剤の濃度はルックアップデーブ
ル（．ｔａｂ）ファイルに蓄積されている。このように、一度合成法がアウトラ
インされると、化合物のプレートは一連の反応剤の組み合わせにより作成され、
その結果アウトプットはテキストファイルに書かれる。テキストファイルは直接
シンセサイザーに入力され化合物のプレートの合成に使用される。自動シンセサ
イザーは関連データベースと調和することにより、合成された化合物に関するデ
ータのアウトプットは非常に効率よく記録される。
【０１９２】 ．ｓｅｑ、．ｃｍｄおよび．ｔａｂファイルがつくられ、または構成され、一
度構成されると適切なデータベースに蓄積される。．ｃｍｄファイルは合成ファ
イルである。このファイルは化学合成のステップのセットを反映する完全に新し
いマシンコマンドを反映するために新しく作成され（例えば上記の変換）、また
はデータベースに蓄積された現存ファイルを編集して変更することもできる。．
ｃｍｄファイルはワードプロッセサーを用いて、指示のコマンドセットが次のよ
うにアウトラインされるように作成される。 ．ｃｍｄファイル作成と同様の方法で、．ｔａｂファイルは自動シンセサイザ
ーで使用された必要な反応剤が目的化合物のライブラリーに必要な特定化学的性
質を反映するようにつくられている。このようにしてこれらの化学的性質のセッ
トそれぞれに．ｔａｂファイルがつくられ、データベースに蓄積されている。．
ｃｍｄファイルについては．ｔａｂファイルを編集し、．ｔａｂファイルのさら
なる構成に使用できるようにする。
【０１９３】 ．ｃｍｄファイルと．ｔａｂの両方はデータベースから後日検索できるようリ
ンクする。リンキングは．ｃｍｄファイルが．ｔａｂファイルと適切に関連する
ファイルネームを使用して、できるだけ簡単にすることができる。例えばｓｙｎ
ｔｈｅｓｅｓ ．ｃｍｄ はそのネームの中から同じプリアンブルを使ってｓｙ
ｎｔｈｅｓｅｓ ．ｔａｂとリンクすることができる。
【０１９４】 自動マルチウエル並行配列シンセサイザーは反応剤に入れる送りフォーマット
を有し、そこでそれぞれ使用される反応剤は専用のプラミングシステムを備えて
いる。図３２および図３３に示されているように不活性ガス１０は合成のすべて
のフェーズで保持さている。温度はサーマルトランスファー・プレート１２で調
節され、それはインジェクション・モールデイングの反応ブロック１４を備えて
いる。反応プレート・アセンブリーはＸ軸方向にスライドし、８つのノズルブロ
ック（１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８および３０）は反応剤のライ
ンを持ち、Ｙ軸方向にスライドし、６４の反応剤のいずれもが９６ウエルに超高
速送達されることを可能にしている。さらに、６つの固定ノズル・ブロックバン
ク（３２、３４、３６、３８、４０および４２）があり、それは同じ反応剤また
は溶材を８つのウエルに同時に送達し、合計７２の反応剤が使用可能である。ス
クリーニングのための化合物を自動合成するとき標的反応容器、９６ウエルプレ
ート４４（二次元配列）はＸ軸の一方向に動き、一連の独立制御反応剤送達ノズ
ル（１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８および３０）は反応容器４６に
対してＹ軸方向に動く。反応プレート４４および反応剤ノズル（１６、１８、２
０、２４、２６、２８および３０）は同時に独立して動かせて、この配置が７２
の反応剤を独立して９６の反応容器ウエルのそれぞれに超高速送達を容易にして
いる。
【０１９５】 このシステムソフトウエアは非常に多くの化合物の合成を簡単にプログラムミ
ングすることを可能にしている。それは別の反応剤テーブルファイルに蓄積され
た容器の位置、流量および各反応剤の濃度が記載されたシーケンスファイルのル
ックアップを介して特定のウエルへ加えるある反応剤を呼び出すコマンドファイ
ルの形で一般的な合成手段を供給することにより可能になる。、化合物は種々の
スケールで、例えば、少ないものは２００ｎモルから大きいものは１０μ（３−
５ｍｇ）モルまで合成できる。得られた粗化合物は一般に純度＞８０％、直接高
スループットスクリーニングアッセイで使用される。また、使用前その純度を確
認するため品質管理下に置くこともある。自動シンセサイザーを使用してスクリ
ーニングのために化合物の平行合成を行うことは効率的な方法である。
【０１９６】 ソフトウエアのインプットはいずれもテキスト編集者からのタブで区切ったテ
キストファイルを受け入れる。主なコマンドファイル、．ｃｍｄファイルは例５
表３に示されている。代表的なシーケンスファイル．ｓｅｑファイルは例５、表
４に示されおり、また代表的な反応剤ファイル．ｔａｂファイルは例５、表５に
示されている。典型的な９６ウエルプレートの中には空で残されている（個別の
合成の化合物数）またはウエルのいくつかは分析目的の際の比較のため、標準と
して使用される化合物が入る場合もある。 反応剤をロードする前に、湿度に敏感な反応剤ラインはアルゴン１０で、２０
分間バージする。反応剤は適当な濃度に溶解されて自動シンセサイザーにインス
トールする。図３２の４６に示されているように（８つの送達ラインがある）大
瓶が集められて洗浄溶媒として使用され、一般の活性化剤、分割反応剤およびそ
の他の反応剤はどのような特殊な合成でも、複数のウエルで使用するものに用い
る。小さなセプター瓶は集合的に図３２の４８に示されていて、個々の反応化合
物が入っている。これは無水調整および複数の反応剤を効率的にインストールす
ることを可能にし、その瓶への加圧を針で行うとともに送達経路として使用する
。すべての反応剤が設置された後にラインに反応剤で満たして流速を測定し、そ
れらが反応剤テーブル（．ｔａｂファイル）へ入れる。乾燥樹脂をロードしたプ
レートは真空から取り出され、合成のため機械にインストールされる。
【０１９７】 改良された９６ウエルポリプロピレンプレート４４が反応容器に用いられる。
各ウエル内の稼動容量は約７００μｌである。各ウエルの底には圧入ポリプロピ
レンのフリット２０μβがあり、長いカピラリーの出口がコレクションチャンバ
ーの低い方に入っていて、前に引用した米国特許５．３７２．６７２の図５に説
明した通りである。合成中に増大する化合物を保持するのに用いる保持体が合成
プレート４４のウエル内にロードされ、サポートのバランスを取った比重のスラ
リーの必要量をピペットで取った。代表的な溶媒はアセトニトリル・メチレンク
ロライド混合物である。反応は種々のスケール、例えば、２００μモルおよび１
０μモルで行われた。合成にさまざまなサポートが行われ、特に有用なサポート
は中程度にローデイングしているポリプロピレンＰＥＧのサポート、例えばＴｅ
ｎｔａＧｅｌTMあるいはＡｒｇｏＧｅｌTMである。
【０１９８】 図３３に示されているように合成用プレートは前後にＸ軸方向に移動し、８稼
動バンクの配列（１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８および３０）で８
つのノズル（合計６４）、Ｙ方向には６バンク（３２、３４、３６、３８、４０
および４２）の４８の固定ノズルで、従ってそれぞれのウエルは各リザーバー（
大瓶または小さなセプタ瓶）から適当な量の反応剤およびまたは溶媒を受けるこ
とができる。スライドするバルンタイプのシール５０がこのノズル配列の周りを
囲み、それを反応プレートのヘッドスペース５２に接続してある。ゆったりした
窒素またはアルゴン２０が流れるようにプレートのヘッドスペースの向こう側が
常圧になるようにして、水分のない環境を保持する。
【０１９９】 各ウエルの液体内容物はヘッドスペースの圧力が出口ノズルの中の液面上のキ
ャピラリー圧力を超えるまで溢れることはない。低い方のコレクションチャンバ
ーの中へわずかに正圧をかけることで一杯になったウエルから、ゆっくりした漏
洩をなくすことができ、あるいはサスペンションを通して不活性ガスを攪拌して
泡を立てる。ウエルを空にするため、ヘッドスペース逃し出口バルブを閉じ、内
圧を約２ｐｓｉまで上げる。通常、液状内容物は直接廃棄５４へ吹き出す。しか
し、９６ウエル・ミクロタイタープレートは各ウエルの溶出液を反応の進行およ
び収量を分光光度的にモニタリング用に集めるため、合成プレートの低いほうの
チャンバーに挿入することができる。
【０２００】 この機械の基本的なプラミングの考え方は反応剤へガス圧をかけて送出する方
法である。それぞれの反応剤は専用の供給ラインで、合成プレートへ送られ、そ
れが５６で集中的に同定され、ソレノイドバルブが５８で集中的に同定され、ノ
ズルは６０で集中的に認められる。反応剤は反応ウエルに到達するまでに経路を
横切ることはない。このようにして、ラインは次に使用する前に洗浄またはフラ
ッシュする必要がなく、反応剤のクロスコンタミネーションが発生する可能性は
ない。液流出速度はきわめて強力でウエル内の内容物を完全に混合して、均一な
液にすることができ、密度が異なる場合でも充分混合できる。この混合により一
度均一な溶液になると、拡散により個々の成分が固体サポート・マトリックスの
中および外側に行き渡り、そこで、目的の反応が起きる。それぞれの試薬リザー
バは単一ノズルまたは８つのノズルまでコンビネーション・ノズルでプラムされ
る。それぞれのノズルはまた同軸ノズル・ウオッシャーが付けられていて、供給
ノズルの外側を洗浄し、ノズルの端では溶液の蒸発が遅いため、結晶化した反応
物が積み重なるよう問題が起こらないようにしてある。ノズルと供給ラインはダ
ミー・ウエルセット内にプライムされ、いつでも直接廃棄できる。
【０２０１】 全体のプラムシステムはテフロンチューブを使用し、反応剤リザーバーはシリ
ンジ／セプタ経由または直接高能力ボトルに接続している。セプタム・バイアル
４８は取り外し可能な８ボトル用ラックに保持され、セットアップおよびクリー
ニングが容易にできる。それぞれのラインのプライミング容量は約３５０μｌで
ある。最小送液量は約２μｌ、流量精度は±５％である。実際に送られた物質量
は液体のそのときの流量による。ある触媒の速度はその速度とテフロンチューブ
の漏れ特性による。速度（代表的な２００−３５０μｌ／ｓ）は実験的に決めら
れ、この情報は反応剤テーブル・セットアップファイルに集められる。
【０２０２】 反応ブロック１４の加熱およびクーリングはＰＣＲサーモサイクラーに見られ
るものに類似したリサーキュレーテイング熱交換プレート１２を用いて行い、熱
接触がよいようにポリプロピレン合成プレート４４にネストしてある。ウエル内
の液体内容物は加熱冷却は１０℃／分、＋５℃から＋８０℃の範囲で行われる。
ポリプロピレンは約８０℃で柔らかくなり、変形し始める。この温度以上の場合
、ステンレスまたはモネルを機械加工し交換可能なフリット付きディスポーサブ
ルでない合成用プレートを使用する必要がある。
【０２０３】 ハードウエア・コントローラは３コの１ＭＨｚ８６３３２チップの周りに設計
されている。このコントローラは単一Ｘ軸および８−Ｙ軸方向のステッパー・モ
ーターを駆動するとともに合計１５４のソレノイドバルブに対してもタイミング
機能を備えている。それぞれのチップにはそのタイマープロセッシング・ユニッ
ト（ＴＰＵ）内に１６コの２方向タイマーＩ／Ｏおよび８コの中断チャンネルが
ある。これらはステップおよびディレクション信号を出し、１つのチップ当たり
３コのモータ−をコントロールするために３個のエンコーダ入力および２コのリ
ミットスイッチの読み取りを行うために使用される。それぞれの８６３２２チッ
プはｍｓｅｃ精度の６４コのバルブへ出力するため８コのＵＮＣ５８９１Ａダー
リントン・アレイ・チップのシリアルチェーンを駆動する。このコントローラは
１９２００Ｈｚ反応剤直列チャンネル経由してＰＣ上で作動するウィンドウズの
ソフトウエア・インターフェースプログラムと通信し、ｖａｌｖｅ−ｎｕｍｂｅ
ｒ、ｔｉｍｅ−ｏｐｅｎ、 ｍｏｔｏｒ−ｎｕｍｂｅｒおよび ｐｏｓｉｔｉｏ
ｎ−ｄａｔａを通信するのにはｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ
ｓｅｔを伝達するために基本命令セットを使用する。
【０２０４】 この配列式自動シンセサイザーを動かすソフトウエアの３要素は、一般的な方
法またはコマンド（．ｃｍｄ）ファイルで、これで実行すべき合成指示を特定す
る。シーケンス（．ｓｅｑ）ファイル、これは反応のスケールおよびコアシント
ンに付加される各グループのオーダーを特定して、さらに、反応剤表（．ｔａｂ
）ファイル、ここでは化学品の名称、保管場所（ボトルＮｏ．）、流速および濃
度を特定して、これらはｃｏｍｍａｎｄ ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎの基本セット
との関連で使用される。
【０２０５】 Ｃｏｍｍａｎｄ ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎの基本セット ＡＤＤ ＩＦ ｛インストラクションのブロック｝ＥＮＤ＿ＩＦ ＲＥＰＥＡＴ｛インストラクションのブロック｝ ＥＮＤ＿ＲＥＰＥＡＴ ＰＲＩＭＥ，ＮＯＺＺＬＥ＿ＷＡＳＨ ＷＡＩＴ，ＤＲＡＩＮ ＬＯＡＤ ＮＥＸＴ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＯＯＰ＿ＢＥＧＩＮ，ＬＯＯＰ＿ＥＮＤ
【０２０６】 ＡＤＤインストラクションには２種あり、標準的化学式に目を向け、感心を持
つことを意図する。反応剤は番号が名称、識別子より前ならばモル数、番号が識
別子より後ならばｍｌで絶対容積を加えて特定する。反応剤の番号で加えられる
ものには“＋" 印で分けられた解析リストがある。変更できる反応剤の識別子、
キーワード、＜ｓｅｑ＞は、加えるべき反応剤の特定には配列表を見よの意であ
る、キーワード＜ａｃｔ＞は特定＜ｓｅｑ＞に関連する反応剤を加えることを意
味する。反応剤の送達順序は次のリストのように特定される。
【０２０７】 従って ADD ACN 300 意味：名称ACN の反応剤300 μl をactive synthesisの各ウエルに加える。 ADD ＜seq ＞ 300 意味：もしseq ファイルのsequence pointerが反応剤リストの反応剤なら、sc
ale とは別に、特定された反応剤300 μl をウエルへ加える。 ADD 1.1 PYR+.1.0＜seq ＞+ ＜actl＞ 意味：seq.ファイルのsequence pointerがacids in the Class ACIDS＿1 にあ
り、PYR がピリジンの名称であり、クロロギ酸エチルがtab file activate th
e class に定義される Acids ＿1, ADDS＿1,従ってこのインストラクションの意味 加える 1.1 当量 ピリジン 1.0 当量 そのウエルに特定された酸 1.1 当量 アクチベータ、クロロギ酸エチル
【０２０８】 If commandはどんなタイプの反応剤が＜seq ＞変数にあるか測定し、次のコマ
ンドブロックに進むことができる。 従って ACYLATION ｛方法の名称｝ BIGIN IF CLASS ＝ACIDS ＿1 ADD 1.0<＜seq ＞+1.1＜act1＞+1.1PYR WAIT 60 ENDIF IF CLASS = ACDS-2 ADD 1.0 ＜seq ＞+1.2＜act1＞+1.2PYR 1TEA ENDIF WAIT 60 DRAIN 16 END 意味：反応剤Ａｃｉｄ＿１クラスに特定されていたなら、このウエルはそこに記
載のように実施し、ＷＡＩＴ ６０ ｓｅｃ、もし反応剤Ａｃｉｄｓ＿２クラス
に特定されていたなら、このウエルはそこに記載のように実施し、ＷＡＩＴ ６
０ ｓｅｃ ｌｏｎｇｅｒ、それから全プレートＤＲＡＩＮにする。Ａｃｉｄ＿
１グループは合計１２０ ｓｅｃ反応、Ａｃｉｄ＿２グループの反応時間は６０
秒。
【０２０９】 ＲＥＰＥＡＴ ｃｏｍｍａｎｄ は単純に同じＢｌｏｃｋ ｏｆ ｃｏｍｍａ
ｎｄを複数回繰り返す。 従って、 WASH＿1 ｛方法の名称｝ BEGIN REPEAT 3 ADD ACN 300 DRAIN１５ END ＿REPEAT END 意味：アセトニトリル添加とドレインをそれぞれのウエルに３回繰り返す。
【０２１０】 ＰＲＩＭＥ ｃｏｍｍａｎｄは特定名称、反応剤を使用するか、＜．ｓｅｑ＞
ｏｐｅｒａｔｉｏｎが付いた次の操作で使用されるノズルまで反応剤を入れてお
く意味がある。μｌａｍｏｕｎｔ ｄｉｓｐｅｎｓｅｄ ｉｎｔｏ ｐｒｉｍｅ
ｐｏｒｔはコンフィギュレーション・データファイルに特定されている一定量
である。 ＮＯＺＺＬＥ＿ＷＡＳＨは反応ノズルの外側に、反応剤の溶媒の蒸発で付着し
た残渣がないよう洗浄するためのコマンドで、特定名称の反応剤を使用するか、
＜．ｓｅｑ＞ｏｐｅｒａｔｉｏｎする前に使用されたノズルで作動する場合であ
る。機械はブロック中のいずれかのノズルが使用されれば、ブロックのすべての
ノズルがｐｒｉｍｅ ｐｏｒｔで洗浄される。 ＷＡＩＴ ａｎｄ ＤＲＡＩＮは秒単位で指示され、ドレインコマンドではウ
エルをドレインするためにプレートの最表面にかけるガス圧力をかける。 Ｔｈｅ ＬＯＡＤ ａｎｄ ＲＥＭＯＶＥはオペレータ作業のために機械を止
める指示である。 Ｔｈｅ ＮＥＸＴ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥはｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｏｉｎｔｅｒを
シーケンスファイルで、次に加えるべき置換基へ移動する。
【０２１１】 ．ｓｅｑ ｆｉｌｅ ｅｎｔｒｙの普通の書き方は定義： WELL＿No WELL ＿ID Scale Sequence Ｓｅｑｕｅｎｃｅ情報にはカラムの列で、それぞれに特定の場合に加えられた
種々の反応剤が示されている。Ｓｃａｌｅ（μモル）も含まれるためスケールを
変えて反応を同時に実験することもできる。反応剤はルックアップ表（ｔｈｅ ．ｔａｂ ｆｉｌｅ）に書かれ、そこにはシーケンスファイルおよびコマンドフ
ァイルで使用される反応剤の名称が特定されており、保管場所（ボトルＮｏ．）
、流速および濃度が記載されている。この情報はコントローラ・ソフトウエアお
よびハードウエアでプレートを定位置につけるため、適切なスライダー・モーシ
ョンおよび特定の反応剤を送達するためのアームをスライドさせ、特定のバルブ
に適切な反応剤が送達されるのに必要とする時間を決めるのに用いられる。反応
剤が正確に分類されるにはコマンドファイル内ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ＩＦ ｌｏｏｐｓを使用して、それが反応剤を個々に“１回のステップ" で９６のウエ
ルへ自動的に加えることが可能になっている。反応剤は“ｃｌａｓｓ" に従って
分けられている。アミノ酸をベースにしたフラグメントを使用し、特定の合成す
べてにＡＭＩＮＯ＿ＡＳＩＤＳ" のｃｌａｓｓがつくられている。特別なｃｌａ
ｓｓ Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓは反応剤の特別なクラスに常に加えられる反応剤（
例、ＢｅｔａｉｎｅはＡＭＩＮＯ ＡＣＩＤＳクラスの活性化に使用される）を
定義している。
【０２１２】 ．ｔａｂファイルの一般型は、次の定義である： Class Bottle Regent name Flow ＿rate Conc. Ｔｈｅ ＬＯＯＰ＿ＢＥＧＩＮおよびＬＯＯＰ＿ＥＮＤはコマンドブロックの
処理が続けられＮＥＸＴ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥコマンドが反応剤の最長リストの終
わりを過ぎた点を指定するまで継続することを示す。 ＭＯＶＥコマンドはコマンドのセットに含まれない。上記コマンドのすべてに
対して、もしプレートまたはノズルの移動が必要な場合には、目的となる溶媒ま
たは反応剤送達操作を行うために自動的に実施される。これは適当な反応剤添加
に必要な正しいノズルとウエルを決めるコントローラ・ソフトウエアおよびハー
ドウエアにより行われ、次いで反応剤を加える前にノズルおよびウエルに必要と
される位置に同調させる。
【０２１３】 ＭＡＮＵＡＬ ｍｏｄｅも使用され、その場合には合成プレートおよびノズル
ブロックはオペレーターにより" 元の位置" またどの位置へも移動でき、ノズル
はプライムまたは洗浄され、いろいろな反応剤ボトルは減圧され、溶媒で洗浄さ
れ、チャンバーに加圧することができる。自動ＣＯＭＡＮＤモードはどんな位置
でも解除しＭＡＮＵＡＬコマンドを実行でき、その後適当な場所から操作を再開
できる。合成をコマンドファイルのどの場所からでも再スタートさせるために、
シーケンス・ポインタを前に進ませることができる。
【０２１４】 合成化合物は、合成最適化するために再開分類される。そのような分類は合成
の最適化に至るいずれかのパラメータに基づいて行うことができる。注目する１
つのファクターとして、支持樹脂に直接リンクする化合物フラグメントがある。
同じフラグメントが何回も使用された場合、それはバッチ法でサポートに結合す
ることができ、このバッチ方式の一部または合成スタート前に合成プレートの個
別のウエルに入れる。他のパラメータは化合物が互いに近くにあるようポジショ
ニングすることである。フラグメントを互いに接近させグルーピングすると、機
械の動作は制御され合成時間が短くなる。
【０２１５】 化合物合成に複数のウエルを使用すると、合成されるそれぞれの化合物が、適
当な第１フラグメントをのせているサポートの一部は合成ウエルへ入ってしまう
ことがある。このようにして、．ｓｅｑファイルに従い、合成されるべき一連の
化合物をのせる前に、フラグメントよりソートされる。そのソーテイングに基づ
き、同様の第１フラグメントを持つすべての化合物がプレート上に近接ウエルに
配置される。このように、フラグメントをもつ保持体を合成ウエルにロードする
と機械の動きが制約される。化合物を生成する別な方法として固体サポートのみ
をウエルに入れ、次いで第１段階として第１フラグメントをこのようにタンパク
質リサポートにリンクする。．ｓｅｑファイルは第１フラグメントが加えられる
ことを反映するよう適切に変更される。
【０２１６】 一度いくつかのタイプに分けると、プレート上の合成の場所は上述のように．
ｓｅｑファイルを作ることで特定できる。．ｓｅｑファイルは特定の化学的性質
を合成するために、．ｃｍｄファイルおよび．ｔａｂファイルと関連しており、
それを規定しているのは化合物であり、その化合物は．ｃｍｄファイルおよび．
ｔａｂファイルをデータベースのように検索することで見分けられる。これらの
ファイルは化合物合成用の多ウエル自動シンセサイザーに入力される。合成終了
時、出荷、貯蔵、ハンドリングの目的から必要があれば、このプレートは凍結乾
燥される。凍結乾燥に当たっては、それぞれのウエルはそこにある化合物がドラ
イな化合物として存在する。
【０２１７】 本発明の好ましい実施様態を説明するため、種々の方法によるヒドロキサム酸
の小ライブラリー（〜１２００）を生成する本発明の方法を用いた合成実験を行
った。全ライブラリーは下の表２に示されている。２つの異なる化学経路がヒド
ロキサム酸化合物の例証ライブラリーの自動合成に用いられた。これらは図３４
および図３５に示されている。それぞれの経路はそれぞれの利点を持っている。
【０２１８】 この説明用のヒドロキサム酸ライブラリーの化合物は図１４化合物ＣＩの構造
に対応し、図１５のヒドロキシアルアミン・フラグメント、バリン・フラグメン
ト（アミノ酸フラグメント）およびスルホニル−４−メトキシベンゼン・フラグ
メント（スルホニルフラグメント）から形成された。これらはアミノ酸フラグメ
ントおよびスルホニルフラグメントにおいて互いに異なる。これらはヒドロキシ
アルアミン・フラグメントでは共通している。化合物ＣＩは直接（それらは同じ
物の１つ）表２のａ−ｘ化合物に対応する。この化合物はさらに記号化合物ＣＩ
' に対応する。
【０２１９】 複雑な化学構造および混合物を説明する目的からは図２８、図２９、３０およ
び図３１に示されている記号表で、複雑な記号構造および同じく複雑な化学構造
を記述する。これらの複雑な構造と混合物を比較すると、化合物ＣＩ' は複雑で
はないが、その構造はこれらの図の構造記述に用いられたのと同じ原則が具体化
している。それは同じ原則を具体化したため、同様のＣＩ' の表を構成すること
ができる。このようにして、ラウンドｎでフラグメントＦi ' 、ラウンドｎ＋１
でフラグメントＦiiおよびラウンドｎ＋２で、フラグメントＦｉｉｉを持ってい
ると考えられる。変換表も同様に構成され、ラウンドｎのＴi ，ラウンドｎ＋１
のＴii，およびラウンドｎ＋２のＴiii を上げることができる。この情報は自動
シンセサイザーで実際にライブラリーをつくるとき、指示して使用された。 説明のヒドロキシアミンのライブラリーは図３５の合成経路を用いており、第
１フラグメントのヒドロキシアミンフラグメントはそのライブラリーメンバーの
すべてで同じである。従って合成上の容易さから合成プレートのウエルで固体サ
ポートに付着していたものを加えた。このことは合成の複雑性を１ファクターで
「１フラグメント」に減少させ、順にさらにラウンド数を合成の１つまで減少し
、自動シンセサイザーにも影響を与える。要約して言えば、このことが図２８、
図２９、図３０および図３１の表のラウンドｎを消去した。
【０２２０】 上述のごとく、一般的フォームである．ｓｅｑファイルのエントリー： WELL ＿No WELL ＿ID Scale Sequence ここに「シーケンス」情報がコラムのシリーズとしてのせられている。ラウン
ドｎの変換は合成プレートのそれぞれのウエルへ固体サポートの付着したヒドロ
キシルアミン・フラグメントを加えることで一般化し、ただ２つのシーケンスコ
ラムで一つは合成を記録するのに必要である。一つはラウンドｎ＋１で使用する
アミノ酸反応剤を示し、もう一つはラウンドｎ＋２で使用するスルホニル反応剤
を示すことである。この反応剤は１対１の関係でリンクし、変換してその結果が
得られるフラグメントになる。
【０２２１】 多くのアルゴリズムがコンピュータプログラミング技術に通じた人には明らか
であるが追跡表に含まれる情報を変換するのに用いられる。それらはここに記載
の平行配置の自動シンセサイザーを用いた合成に適したフォーマットで書かれて
いる。これを実行する好ましい方法の一つはそれぞれの化合物または化合物のグ
ループに関して合成のそれぞれの特定ラウンドに必要な変換を追跡表の中から探
すことである。適切な複合または単一の反応剤は、次いでその変換に使用された
反応剤が．ｓｅｑファイルの単一コラムのエントリーに対応して、適切な合成ラ
ウンドで、追跡表に示されるようなフォーマットで、ソフトウエアに書き込まれ
る。この化合物または化合物のグループは、データベースに蓄積され、そこで合
成されて、反応容器内の場所が．ｓｅｑファイルのＷＥＬＬ＿ＩＤによってリン
クされ、データベースにより割り当てられる。この化合物をその変換で説明した
のは合成に必要な．ｓｅｑファイルの簡単な構造を考慮したものである。これは
平行配置自動シンセサイザー用の合成ファイルについて以上のように詳細に説明
したが、このプロセスはきわめて適当にプログラム化できる化学合成装置につい
ても適用できる。
【０２２２】 同様に、一般的な．ｔａｂファイルは次の通りである： Class Bottle Regent Name Flow Rate Conc． ここで複雑なまたは単一の反応剤は「反応剤名称」の中で特定され、反応剤ま
たは反応剤の混合物が入れられているボトルにより定義付けられる。それが単一
の反応剤でも、複合反応剤の混合物でも、特定の変換で特定されれば、その情報
は自動シンセサイザーにその反応剤用の適切な．ｔａｂファイルに持ち込まれる
。．ｓｅｑファイルの生成に関し、変換追跡表の情報は容易に．ｔａｂファイル
用に変換できる。合成反応に必要なそれぞれの複雑なまたは簡単な反応剤は．ｔ
ａｂファイルにエントリーしている。さらに複合反応剤の単一反応剤成分は、複
雑な反応剤を調整するするのを容易にするため、．ｔａｂファイルのコメントセ
クションに特定されている。対応する変換で示したように特定の反応剤に対する
適切な条件が．ｔａｂファイルの指定分野にも書かれている。さらに、特定の変
換を実施するための関連反応剤（例えば、活性化剤、塩基、捕捉剤、カップリン
グ剤など）もまた．ｔａｂファイルに書き込まれている。説明的なヒドロキサム
酸ライブラリーの合成で、" ｂｅｔａｉｎｅ" と呼ばれる活性化剤がアミノ酸を
固体サポートへ付着する変換において関連している。それは．ｔａｂファイルに
変性剤がどの反応剤に関連したか特定して記載されている。これらの化合物を．
ｔａｂファイルの変換、構造に記載した結果、合成に関する要求は軽減される。
このことは合成ファイルによって、平行配置自動シンセサイザーについて詳細に
説明したが、このプロセスは適切なプログラムを用い化学合成装置に対しても適
用可能である。
【０２２３】 ライブラリーの中の化合物に対するフラグメントの複雑性は、例えば、図２４
のＰ１ａ、Ｐ１ｂ、Ｐ１ｃ、Ｐ１ｃおよびＰ３ｂとなるに従い、増加し、ついに
さらに多くのエントリーが．ｓｅｑファイルの「シーケンス」部分に必要になる
。しかし、複雑性が反応剤の混合物の使用の結果起きたものであれば、図２４の
ステップＰ２の例のように、それは調和して使用され、．ｔａｂファイルに特定
されているように単一反応剤ボトルに置くことでコントロールされる。 再度、説明的な表２のヒドロキサム酸のライブラリーを見ると、図３４に説明
されている第１の合成方法は市販のＡｒｇｏＧｅｌ−ＯＨTM（反応性機能基とし
てＰＥＧベースのアルコールを持つ）由来で、ＦＭＯＣ−アミノ酸を持ち、その
変形、Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ反応経由でスルホンアミドベタイン１を活性種として
利用したものである。この反応は本質的に１００％反応が進行し（ＦＭＯＣに対
して）、数時間で完了し、他の負荷方法（対称性無水物％ＤＭＡＰ）により、ア
ミノ酸のラミセル化の可能性を除いていることも優れている。それはなお同等性
が低く、アミノ酸１当量が対称性無水物の形成により無駄にされることがなく、
ＦＭＯＣのロスの可能性も最小限に押えられる。樹脂が結合したエステル２は次
いでプロテクトを外され、ビリジンの中でスルホン酸塩化物を用いてスルホニル
化する。Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ負荷段階からの収率をＦＭＯＣのプロテクトを外し
たときから、洗滌液を集め分光光度法で、９６ウエルプレート・リーダーに放出
された量を測定した。この情報はデータベース内のインポートデータベースに記
入され、自動合成された化合物の収率推定値として与えられる。エステル４の１
．４ジオキサンの中でのヒドロキサミンによる切断（５０％ＮＨ2 ＯＨ水溶液を
最終的に１．４−ジオキサンＮＨ2 ＯＨ４Ｍ）は一般的に常温で１日置くことで
完了し、目的のヒドロキサム酸５が得られる。少量（１０−２０％）の対応する
カルボン酸がバリンのような阻害されたアミノ酸との競合加水分解の結果として
生じる（例，無水のヒドロキシルアミンを用いても）。表２の下に示されている
ように、いくつかの阻害性アミノ酸および電子欠乏スルホニルクロライドを用い
る方法は完全に失敗した。
【０２２４】 この方法は直交したプロテクトを外すと、切断法が採用でき、標準的なペプチ
ド酸活性側鎖保護（ｔ−ブチルベース、トリチル、ＰＭＣなど）をアミノ酸成分
に使用できる。このことが生成物の単離を可能にし、通常使用される、トリチル
およびスルホニルベースでヒスチジン、アルギニン、グルタミンおよびアスパラ
ギンの保護をするとき側鎖保護からくる副作用はない。このようにして樹脂に結
合したエステル４は無水ＴＦＡで４時間機器上に置くと完全に側鎖保護が外れる
。合成反応直後にＴＦＡを清浄化すれば、機器はラインおよびバルブを含め極端
な条件の影響は受けない。その後サポートを洗浄し、生産物５は標準的方法でサ
ポートから外せる。一般的な方法としてのみ機能する非常に少ないコマンドファ
イルを用いて、この合成はきわめて容易に自動化平行配置シンセサイザーで実行
できた。Ｓｅｑｕｎｃｅおよびｔａｂファイルのコマンドは実施例５の下の合成
を説明しているところに詳述されている。
【０２２５】 第２の方法は酸易編成Ｗａｎｇベースのヒドロキシルアミンサポート６を用い
る方法（図３５）で、小さな問題である競合加水分解を克服し、電子欠乏スルホ
ニルクロイドによる失敗を回避する。樹脂はＡｔｈｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓ
ｏｌｉｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａ
ｐｐｒｏａｃｈ；ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ： Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ １９８９： Ｐ
１３５記載の方法と類似する方法でつくり、初めＡｒｇｏＧｅｌ−ＷａｎｇTM
ｒｅｓｉｎとＮ−ヒドロキシフタルイミドとＭｉｔｓｕｎｏｂｅ反応を用い、メ
チルヒドラジンでプロテクトを外し、６を与えて、ｇｅｌ−ｐｈａｓｅ 13Ｃ
ＮＭＲでは定量的に収率を得た。ヒドロキシルアミン樹脂はＦＭＯＣ−アミン酸
を用い、標準的なペプタイド、カップリング法で７を得た。プロテクトを外し、
スルホニル化し、前と同様、樹脂に結合したヒドロキサム酸８を得た。Ｅｔ３Ｓ
ｉＨ（５％ ｖ／ｖ）含有ＴＦＡで効率的に樹脂から、捕捉剤として化合物５を
得た。
【０２２６】 分子相互作用部位は二次構造をもつ核酸の領域である。分子相互作用部位は分
類学上複数の種間でも保存されているのが好ましい。核酸は真核細胞性のものも
原核細胞性のものもある。核酸は好ましくはｍＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、ｔＲ
ＮＡ、ｒＲＮＡまたはｓｎＲＮＡである。ＲＮＡはウイルス性、細菌性、寄生虫
性、細菌性および酵母性がある。好ましいのは、分子相互作用部位は、複数の分
類学上の種が異なっても高度に保存され、ＲＮＡの領域に存在している。本発明
の好適な態様に従い、分子相互作用部位、特にＲＮＡを有する生体分子がいくつ
かのソースから派生したことは、高く評価すべきことである。かくして、このよ
うなＲＮＡ標的内を必ず三次元で同定し、相互に作用させて、ＲＮＡ修飾化合物
を同定するのに用いた。
【０２２７】 分子相互作用部位は好ましくは、ＲＮＡの三次元構造は数値表示法で描かれて
いている。現実に機能している化学および入手可能な反応基礎単位をベースとし
て分子を設計する能力を当業者に提供するコンピュータソフトウエアは商業的に
入手可能である。例えばＴｒｉｐｏｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ），Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ），ＭＤＬ Ｉｎｆ
ｏｒｍａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ ＣＡ）およびＣｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ （ＮＪ）などの会社からのソフトウェアパッケー
ジは、が構造をコンピュータで生成する手法を提供している。これらのソフトウ
エアはまたコンピュータを使用して生成した分子およびその構造を評価、比較す
る手段でもある。分子相互作用部位のｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのコレクションは上
記ベンダーおよびその他からのソフトウエアを使用して生成でき、このソフトウ
エアの入手も可能である。
【０２２８】 ＲＮＡ上の分子相互作用部位に対する一連上の構造上の制約は生化学的分析、
例えば酵素マッピングと化学プローブおよび共変と配列などのゲノム情報から生
じる。このような情報は特定の二次構造のステム、またはその他の領域の塩基を
対にするのに使用できる。追加の構造上の仮説はループおよびバルジ領域内の認
められていない塩基対スキームに対して生じる。ＭｏｎｔｅＣａｒｌｏ 研究法
はＲＮＡのあり得べきコンフォメーションをサンプルし、そのプログラムと矛盾
せずに、三次元構造をつくる。
【０２２９】 Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏの表示つまり、での三次元表示の生成のレポートがタンパ
ク質を対象とするライブラリー設計、生成、スクリーニングの立場から利用可能
である。同様にＲＮＡモデル発生領域の研究が文献に報告されている。しかし、
有機分子、「低」分子、オリゴヌクレオチド又はその他の核酸のｉｎ ｓｉｌｉ
ｃｏ表示疑問を投げかける表示、ＲＮＡ三次元構造、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ表示な
どの構造ベースに関する設計法の利用といった報告はない。本発明は好ましくは
コンピュータソフトウエアを利用し、それがＲＮＡ構造の三次元モデルを構成し
、三次元の構成、複数の有機化合物、「低」分子、重合性、オリゴヌクレオチド
およびその他の核酸、これらのｉｎ ｓｉｌｉｃｏでのＲＮＡ分子相互作用部位
のスクリーニング表示、複数の化合物からベストな潜在的バインダーのスコアリ
ングと同定、最後にこれら化合物を、組み合わせて合成し、それらを経験的にテ
ストして、これら標的に対する新しいリガンドの同定である。
【０２３０】 本発明の好適な態様は、自動化コンピュータ研究のアルゴリズム、例えば上述
のものを用いて、可能な三次元分子相互作用部位の構造、ＲＮＡがユーザーによ
り特定された生化学的およびゲノムと矛盾しないものであることが好ましい。こ
れらの二乗平均の偏差値に基づき、これらの構造はいくつか異なる形にわけられ
た。それぞれのグループ代表的メンバーはさらに明白な解を持つ分子動力学を用
い構造をより明確することができる。
【０２３１】 これらのソフトウエアプログラムによる構造の列挙と表示は典型的には分子に
よる足場を作り、それを二次元上に変換することである。一度描かれ、コンピュ
ータに蓄積され、これらの分子は、現在市販されているソフトウエア内にあるア
ルゴリズムを用いて三次元にすることができる。好ましくはＭＣ−ＳＹＭが分子
相互作用部位の三次元表示をつくりだすために使われる。二次元構造を三次元構
造に変更することは、典型的に低エネルギーコンフォメーションを作るか、また
はそれぞれの分子の低エネルギー・コンホーアーを集めることである。市販プロ
グラムから得られる結果は分子相互作用部位を含む核酸の配列を、同様の分子相
互作用部位の三次元構造と同様な数字表現の仲間に変換することである。これら
の数字表現がアンサンブルなデータセットを形成する。
【０２３２】 複数の化合物、好ましくは有機「低」分子の三次元構造は化合物の三次元構造
の数値表現を含む化合物のデータセットとして、設計される。ここで「低」分子
とはオリゴアーのようではなく、有機化合物をいう。化合物の二次元構造は上述
のような分子相互作用部位について述べたが、三次元構造に変換できる。このこ
とは、分子相互作用部位の三次元構造に疑問をなげかけるために用いられた。化
合物の二次元構造は構造を表現するアルゴリズムが市販されてから急速に普及し
た。化合物は重合性のものであっても、例えば、オリゴヌクレオチド、その他の
核酸構造であっても、上記文献記載の方法を用いて生成できる。「低」分子また
はその他の化合物の三次元表示を生成することができ、短分子動力学最小化から
低エネルギーコンフォメーションを得ることができる。これらの三次元構造は関
連データベースに蓄積することができる。三次元構造で表示された化合物は正当
なものでも、市販のものでも、仮想のものでも作ることができる。
【０２３３】 本発明の好適な態様において、複数の有機化合物の三次元構造の数値表現を含
むデータセットは以下のようなところから出されている。例えば、Ｃｏｎｖｒｔ
ｅｒ（ＭＳＩ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）二次元化合物ライブラリー、市販コンピュ
ータプログラムを使用。その他の適切なデータベースは化合物の二次元構造を三
次元構造に転換して作成してある（前述）。ソフトウエアはその他の米国出願に
詳細に書かれている。最終結果は、有機化合物の二次元表示を複数の有機化合物
について数値表示の三次元表示にしたことであった、これらの数値表現は化合物
のデータセットとして出ている。
【０２３４】 分子相互作用部位の三次元構造の数値表示および複数有機化合物について、そ
の三次元構造の数値表示を含む化合物データセットおよび分子相互作用部位の数
値表現を、その化合物のデータセットと比較し有機化合物の階層性の生成した。
階層性は有機化合物が分子相互作用部位と物理的相互作用を形成するか否かでラ
ンク付けをされた。比較はむしろ化合物のデータセットのメンバー順に行った。
ある態様に従い、複数の分子相互作用部位について同時に比較を行った。
【０２３５】 多くの理論的およびコンピュータによる方法は当業者により「低」分子または
有機化合物と核酸等の生物学的標的との間の相互作用を研究し、最適化すること
が行われてきた。これらの構造をベースにする薬剤設計ツールはタンパク質と低
分子リガンドの相互作用およびその相互作用の最適化がモデリングにおいて非常
に有用である。
【０２３６】 典型的には、このタイプの研究はタンパク質受容体の構造は、「低」分子が個
別に１回に１コずつ受容体に問い合わせればわかった。通常はこれらの「低」分
子は受容体と共結晶したものを共結晶した他の分子で関係付けるか、分子に付い
て誰かが受容体との相互作用についての知識をもっている場合である。この分野
の顕著な発展はＤＯＣＫと呼ばれるソフトウエアプログラムの開発であり、これ
が問題の受容体に結合すると予想される分子の発見と確認を行うため、構造に基
づくデータベースの研究を可能にした。Ｋｕｎｔｚ，ｅｔａｌ．，Ａｃｃ．Ｒｅ
ｓ．，１９９４，２７，１１７およびＧｓｃｈｗｅｎｄ ａｎｄ Ｋｕｎｔｚ，
Ｊ．Ｃｏｍｐｔ，−Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．，１９９６，１０，１２３．
ＤＯＣＫ ４．０は市販されており、Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから購入でき、同様なプログラムは
また本発明で有用と理解される。ＤＯＣＫはｉｎ ｓｉｌｉｃｏで三次元構造が
生成された大量の分子をコンピュータが読み込めるフォーマットでスクリーニン
グでき、そのためにリガンドとの間の相互作用について何も事前の知識を必要と
しない。従って、ＤＯＣＫは関心のある分子の新リガンドを発見する方法として
はきわめて重要であり、現時点では好んで使用されている。
【０２３７】 ＤＯＣＫプログラムはタンパク質標的へ広く利用されてきて、タンパク質に結
合するリガンドの同定に広く利用されてきた。主として既知の標的に結合する新
種の分子が同定され、後に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験で確認された。ＤＯＣＫソフ
トウエアプログラムはＳＰＨＧＥＮ（Ｋｕｎｔｚ，ｅｔ ｅｌ．，Ｊ．ＭＯＬ．
Ｂｉｏｌ．，１９８２，１６１，２６９）およびＣＨＥＭＧＲＩＤ （Ｍｅｎｇ
，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ＞ Ｃｈｅｍ．，１９９２，１３，５０５）
などいくつかのモジュールからなっている。ＳＰＨＧＥＮはオーバーラップして
いる表面にクラスターを生成する。これが標的受容体内の結合ポケットの溶媒ア
クセスが可能な表面である。それぞれのクラスターは「低」分子に対する結合部
位となりうる。ＣＨＥＭＧＲＩＤは結合分子と標的間の相互作用の力場でのスコ
アに対して必要なグリッドファイルに情報を事前計算結果とともに入れてある。
スコアリング機能は分子メカニックスの交互作用エネルギーと概略一致し、ｖａ
ｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ および静電気成分とからなる。ＤＯＣＫは特定のクラ
スター表面を受容体上の標的部位で、リガンド分子の方向付けに利用している。
既に生成した三次元データベースは、部位内で何千もの方向でテストされ、各方
向はスクリーニング機能で評価された。ベストスコアの方向をスクリーニングし
、アウトプットファイルに蓄積する。最終的にデータベースのすべての化合物は
そのスコア順に階層にランクされ、最優秀候補がこの中から実験用に選択される
。
【０２３８】 ＤＯＣＫを使用して多くのリガンドが、種々のタンパク質標的に対して同定さ
れた。この分野の細菌の研究はＤＯＣＫの使用で、ＲＮＡ二重らせんのような核
酸に特別の結合性を示す低分子リガンドの同定および設計が行われた。ＲＮＡは
ＡＩＤＳウイルスや細菌の感染のような多くの疾患に重要な役割を果たしている
が、特定ＲＮＡの「低分子」との関係はについてほとんど試験が行われていない
。ＲＮＡ二重らせんに特異性を持っている化合物は、その深い主溝がユニークな
幾何学的関係に基づいて、ＤＯＣＫ分類法を使用して同定された。Ｃｈｅｎ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，３６，１１４０２ および
Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，１９９４，２７，
１１７．最近のＤＯＣＫのＤＮＡ４重鎖内でのリガンドの確認したという問題に
ついての報告がある。Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．，１９９６，９３，２６３５．
【０２３９】 好ましくは、個々の化合物はｍｏｌファイルとして示される。例えば、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの収集も含め、適切な化学構造を示すプログラムまたは相当のソ
フトウエアが使用されている。これらの二次元ｍｏｌファイルは輸出され、市販
のソフトウエア、例えば、Ｃｏｎｖｅｒｔｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕ
ｌａｔｉｏｎ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏｍｈ）または相当のソフトウエア
で三次元構造に変換されている。Ｄｏｃｋ、ＱＸＰのようなドッキングプログラ
ムと一緒に使用するのに適したＡｔｏｍタイプのソフトウエアにはすべて原子を
Ｂａｂｅｌまたは他の相当のソフトウエア等の三次元ｍｏｌファイルに指定して
いる。
【０２４０】 それぞれの低エネルギーコンフォメーションはＤｉｓｃｏｖｅｒ（ＭＳＩ，Ｓ
ａｎ Ｄｉｅｇｏ）のようなソフトウエアで生成される。方向検索は複数の化合
物の１コづつ分子相互作用部位に近接した場所でＤＯＣＫまたはＱＸＰを使って
多くの方向について行う。コンタクト・スコアはそれぞれの方向に出し、その化
合物にとって最適な方向として決定される。逆に、化合物のコンフォメーション
は以前決定したようにｓｃａｆｆｏｌｄのテンプレートコンフォメーションから
決定される。
【０２４１】 複数の化合物と分子相互作用部位の相互作用は分子相互作用部位の数値表示と
化合物のデータセットのメンバー比較することで検査される。 好ましくはコンピュータプログラムなどで、生成させ、分子相互作用部位へは化
合物の二面角結合の間でランダム運動を行わせて比較する。この分子相互作用部
位１つに対し２０．０００から１００．０００の化合物を比較する。 代表的には２０．０００化合物を５つの分子相互作用部位と比較して、スコア
を出した。三次元構造の個々のコンフォメーションは多くの方向で標的側にあっ
た。さらにＤＯＣＫプログラムを実施中、化合物と分子相互作用部位は" フレキ
シブル" であることが可能で、最適水素結合、静電気、ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａ
ｌｓが最適の場合実現する。相互作用のエネルギーは計算され、化合物と分子相
互作用部位の１０−１５の可能性がある方向に蓄積される。ＱＸＰ法は真のフレ
キシビリテイをリガンドと標的の両方について出し、現在はそのほうが好まれる
。
【０２４２】 それぞれのエネルギーの相対ウエイトは常に更新され、全化合物に対して計算
された結合スコアが実験による結合エネルギーに反映している。それぞれの方向
の結合エネルギーはｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓコンタクト、静電気、溶媒和／
脱溶媒和および適合度で基本的に決まる。最低エネルギーのｖａｎ ｄｅｒ Ｗ
ａａｌｓ、ダイポールと化合物の分子相互作用部位内の水素結合相互作用が決定
され合計される。好適な態様では、これらのパラメータは経験的に得られた結果
によって調整される。それぞれの分子と標的への結合エネルギーが関連データベ
ースに出力される。関連データベースは化合物と分子相互作用部位間の物理的相
互作用形成能力によるランク階層の化合物が含まれる。ランクの高い化合物は分
子相互作用部位との間で一層物理的相互作用することができる。
【０２４３】 好適な態様では最高のランキング、即ちベストフィテイング化合物が合成のた
めに選別してある。本発明の好適な態様では、結合データに基づいた結合特性を
持つと思われる化合物は合成目的で選択してある。合成には上位５％以内に入る
ものを使用するのが望ましい。さらに上位１０％以内から選択するのがさらに望
ましい。さらに望ましいのは上位２０％から選択することである。選択された化
合物の合成は平行配列シンセサイザーを用いて自動的に行われ、または溶液相そ
の他固相法で行われる。分子相互作用部位を含む核酸との高ランク有機化合物の
相互作用は相互力のランクが高く、以下に記載のように評価する。
【０２４４】 高いランクの有機化合物相互作用と、分子相互作用部位を有する核酸は当業者
によく知られた多くの方法で評価される。例えば、最高ランクの化合物は高スル
ープット（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＨＴＳ）で機能およびセルラース
クリーニングを行う。それぞれの標的ＲＮＡに対するＨＴＳの分析にはシンチレ
ーション近接法、沈殿法、蛍光ベース、フォーマット、濾過ベースアッセイ、比
色アッセイ、その他が明らかになっている。リード化合物はスケールアップし、
動物モデルで、活性と毒性を調査する。アセスメントには核酸と少なくとも１つ
の化合物または機能的バイオアッセイを加えた混合物の質量スペクトル法が望ま
しい。
【０２４５】 質量スペクトル法を使用する方法がＵＳ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ Ｓｅｒ．Ｎｏ．０９／０７６．２０６ 出願日１９９８年５月１２日で開
示され、この特許の譲受人に割り当てられる。ここには有用かつ好ましい質量ス
ペクトル法の技術が例示として全て引用することで１つにまとめられている。し
かしこれらの特定の 質量スペクトル法が本発明実施上必要と言っているのでは
なく、逆にどのような評価方法も本発明の目的が維持される限り使用し得る。
【０２４６】 本発明の好適な態様において、ＤＯＣＫプログラムを使用して生成した階層の
上位２０％に入る化合物またはＱＸＰを使用して生成化学的に階層上位の化合物
と関連する化合物を含む更なる有機化合物の三次元表示のデータセットを生成し
た。ベストフィッテイング化合物は上位１％にランクされる。上位２０％までの
ものは第２比較で幅を広げた（リングサイズ、鎖長、反応基）。このプロセスは
分子相互作用部位の少しのエラーは化合物の同定プロセスに影響を与えない。結
果として構造／スコアデータ（上位２０％のランキング）は例えば、数学的に検
討（クラスター）し、結合を強化するこの化合物内の傾向または特徴を把握した
。この化合物はまた別の異なるグループに分けた。化合物の化学的成分とスクリ
ーニングは上述のようにコンピュータによるＤＯＣＫまたはＱＸＰスコアを実際
の結合データと相関することができる。これらの化合物を調整しスクリーニング
した後、予測された結合エネルギーとｋｄ測定値はそれぞれの化合物と相関する
。
【０２４７】 予測してスコア化する計画を開発するために結果を使用し、それは様々な因子
（立体的、静電気的）を適宜荷重する。上記戦略によって高くランク付けされた
化合物の様々な官能基のサイズや形状を変化させた数多くの骨格を迅速に評価す
ることができる。この方法において、階層で高くランク付けられた有機化合物に
化学的に関連する化合物を含んでいる有機化合物を代表する更なるデータセット
を分子相互作用部位の数値の代表と比較することができ、有機化合物が分子相互
作用部位との物理的相互作用を形成する能力に従ってランク付けされる更なる階
層を定めることができる。この方法において、階層で高くランクされた化合物に
関係する化合物の３次構造を代表する更なるデータセットが作成され、実際上、
仮想結合と現実結合との相関によって最適化される。階層の中で最高位の化合物
が所望の数だけ生産されるまで、所望のように全体のサイクルを繰り返すことが
できる。
【０２４８】 標的生体分子、特に標的ＲＮＡに対する親和性及び特異性を持つことが確定し
た、又は標的ＲＮＡに結合し、その調節に影響を与えることが判明した化合物は
、本発明の態様に従って検出可能な方法でタグを付ける、又は標識する。このよ
うな標識には、例えば、蛍光物質、放射性標識、酵素標識及びその他の多くの形
状のような当業者に既知のあらゆる標識形態を包含してもよい。そのような標識
やタグ付けによって分子相互作用部位の検出が円滑になり、染色体地図の作成及
びその他の有用な工程が容易になる。
【０２４９】 質量分析（ＭＳ）は、分子構造及び小さな分子と大きな分子との相互作用を研
究するのに強力な分析ツールである。現在のＭＳ最先端技術では、物質のフェム
トモル未満の量を質量分析を用いて容易に分析し、サンプル中の分子含量に関す
る情報が得られる。サンプルの分子量が数百であろうと、又は１０万を超える原
子量単位又はダルトン（Ｄａ）であろうと関わりなく、物質の分子量の正確な算
定が迅速に得られる可能性がある。今や質量分析が重要な生物分子の意味のある
点を解明できることが判っている。本発明に従った、分析ツールとしてのＭＳの
有用性に関する１つの理由は、サンプルに関して様々な情報提供ができる様々な
異なるＭＳ法、装置及び技術を利用できることである。
【０２５０】 そのようなＭＳ技術の１つは、エレクトロスプレー・イオン化質量分析（ＥＳ
Ｉ−ＭＳ）である（Ｓｍｉｔｈら、 Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９０年、６２
、８８２〜８９９；Ｓｎｙｄｅｒ著、エレクトロスプレー・イオン化質量分析の
生化学的及びバイオテクノロジーでの応用、米国化学会、ワシントンＤＣ、１９
９６年；Ｃｏｌｅ著、エレクトロスプレー・イオン化質量分析：その基本と計測
、ワイリー、ニューヨーク、１９９７年）。ＥＳＩは、極めて強い静電場の存在
下でサンプル溶液を徐々に霧状にすることによって調べているサンプルの強く荷
電した液滴を作成する。これによって、中性溶媒の蒸発のために縮むような強く
荷電した液滴を生じ、最終的には穏やかな条件下で陽子の付加又は抽出を介して
典型的に、サンプル物質の荷電したイオンを増やすことができる「クーロンの爆
発」を招く。ＥＳＩ−ＭＳは特に１０ｋＤａより大きなタンパク質や核酸のよう
な極めて大きな分子量の生体ポリマーに有用であり、何らかの意味ある大きさの
フラグメントにすることなく、サンプル生体ポリマーの増えている荷電した分子
の分布を明らかにする。観察された各ピークは個々のサンプルの分子量の平均計
算値を提供しているので、生体ポリマーの分子量を測定する場合、１つのサンプ
ルに数個のピークが認められるという事実は、異なった荷電でイオンを形成して
いることにより、ＥＳＩ−ＭＳの精度に寄与している。単一のＥＳＩ質量スペク
トルからそのようにして得られた分子量の複数読み取りを平均するということは
、単一分子イオンピークが質量分析で提供されるべきである場合に得られるもの
よりもはるかに正確な分子量を計算することができる。ＥＳＩ−ＭＳの柔軟性に
更に付け加えるものは、正のイオン化又は負のイオン化のいずれの形態でも測定
する能力があるということである。
【０２５１】 近年、タンパク質、核酸及び炭水化物のような巨大分子の分析に対して広い適
用性があるために、分析技術として、エレクトロスプレー・イオン化質量分析（
ＥＳＩ−ＭＳ）が広範に増えている。Ｂｏｗｅｒｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６年、１００、１２８９７〜１
２９１０；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅら、 Ｊ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８年
、７０、６４７Ｒ〜７１６Ｒ；Ｂｉｅｍａｎｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，１９９２年、６１、９７７〜１０１０；及びＣｒａｉｎら、Ｃｕｒｒ Ｏ
ｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９８年、９、２５〜３４．この分野で最
も重要な進歩の１つは、適当な溶液条件及び検体濃度のもとで、 原型のまま気
相に移してきた特定の非共有結合巨大分子を観察することである。Ｌｏｏ著、質
量分析概説、１９９７年、１６、１〜２３；Ｓｍｉｔｈら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１９９７年、２６、１９１〜２０２；Ｅｎｓ
ら、Ｓｔａｎｄｉｎｇ，Ｋ．Ｇ．及びＣｈｅｒｎｕｓｈｅｖｉｃｈ，Ｉ．Ｖ．編
者、生体分子複合体研究の新しい方法（１９９６年６月１６〜２０日にカナダの
アルバータで開催されたＮＡＴＯ先端研究ワークショップの会議録：ＮＡＴＯ ＡＳＩ Ｓｅｒ．，Ｓｅｒ．Ｃ．１９９８年）；Ｋｌｕｗｅｒ，Ｄｏｒｄｒｅｃ
ｈｔ，Ｎｅｔｈ．，１９９８年。最近の例には多重結合タンパク質（Ｆｉｔｚｇ
ｅｒａｌｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６年、
９３、６８５１〜６８５６）、酵素−リガンド複合体（Ｇａｎｇｕｌｙら、Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９３年、４９、７９８５〜７９９６）、タンパク質−
ＤＮＡ複合体（Ｃｈｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
，１９９６年、９３，７０２２〜７０２７）、多重結合ＤＮＡ複合体（Ｇｒｉｆ
ｆｅｙら、Ｐｒｏｃ．ＳＰＩＥ−Ｉｎｔ．Ｓｏｃ．Ｏｐｔ．Ｅｎｇ．，１９９７
年、２９８５、８２〜８６）、及びＤＮＡ−薬剤複合体（Ｇａｌｅら、ＪＡＣＳ
、１９９４年、１１６、６０２７〜６０２８）が挙げられ、開示はその全体を参
考として本明細書に組み入れる。
【０２５２】 スミスとその共同研究者は、溶液における競合結合条件下で、酵素−リガンド
混合物のＥＳＩ−ＭＳによる測定では、測定された液相の解離定数（ＫD ）と相
関する気相におけるイオン発生量を回収することを立証した。Ｃｈｅｎｇら、Ｊ
ＡＣＳ、１９９５年１１７、８８５９〜８８６０の開示は、その全体を参考とし
て本明細書に組み入れる。彼らは、炭酸脱水酵素に対する修飾したベンゼンスル
ホアミド阻害剤の２５６個からなるライブラリの結合親和性をランク付けするこ
とができた。ＥＳＩ−ＭＳによって測定されるような相対的量から、遊離のリガ
ンド及び結合したリガンド及び基質の濃度を直接定量することができ、溶液での
測定に一致する分子解離定数を量的に測定するためにこのような測定法を使用す
ることができる。ジョルゲンソン（Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ）とその共同研究者は、
Ｄ−及びＬ−トリペプチドとバンコマイシン系抗生物質との間に形成された非共
有結合複合体の相対的イオン量を、溶液の結合定数を測定するために使用できる
ことを立証した。Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８年、
７０巻、４４２７〜４４３２ページの開示は、その全体を参考として本明細書に
組み入れる。グリフィ（Ｇｒｉｆｆｅｙ）とその共同研究者は、ＲＮＡ標的に結
合している小さな分子の結合部位を確定するのにタンデム型ＥＳＩ−ＭＳ法を使
用できることを明らかにした。Ｇａｌｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒ
ｙ、１９９５年、６巻、１１５４〜１１６４ページの開示は、その全体を参考と
して本明細書に組み入れる。
【０２５３】 フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析（ＦＴ−ＩＣＲ ＭＳ）は、
類い稀な精度と確度を以って分子量の測定を提供し、極めて小さな質量の差異
を解明することができる。Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．
Ｒｅｖ．，１９９８年、１７巻、１〜３５ページ。独特の元素組成を持った各小
分子は、「正確な」分子量に相当する固有の質量ラベルを持っているので、標的
の巨大分子に結合している密接に関係したライブラリのメンバーを同定するには
、単に正確な分子量の測定が必要とされる。標的及び可能性のあるリガンドには
、放射性標識、蛍光タグ付け、又は単一化合物の再合成を介した逆重畳の必要は
ない。その上、リガンドの濃度と標的を調整することによって、競合結合条件又
は非競合結合条件のもとで、並列形式でＥＳＩ−ＭＳアッセイを行うことができ
る。＜１０ｎＭ〜１００ｍＭの範囲の解離定数を持つ複合体からシグナルを検出
することができる。
【０２５４】 ＲＮＡの構造化された領域に結合する小分子は治療効果を示すことができる。
例えば、アミノグリコシド系抗生物質は、本質的なＲＮＡ−タンパク質及びＲＮ
Ａ−ＲＮＡ相互作用を乱すことによって細菌の増殖を阻害する。Ｄｅ Ｓｔａｓ
ｉｏら、ＥＥＭＢＯ Ｊ．１９８９年の８巻１２１３〜６ページ及びＢｒｙａｎ
，Ｌ．Ｅ．抗菌療法の新しい次元；Ｒｏｏｔ，Ｒ．Ｋ．，Ｓａｎｄｅ，Ｍ．Ａ．
，編、チャーチル・リビングストン、ニューヨーク、１９８４年、第１巻１７〜
３５ページ。最も広く研究されているアミノグリコシドである、パロモマイシン
は、２００ｎＭのＫD をもつ、原核生物１６ＳｒＲＮＡ（Ａ部位）の解読領域に
結合し、翻訳の間に遺伝暗号の読み違いを誘発する。Ｗｏｎｇら、Ｃｈｅｍ．Ｂ
ｉｏｌ．，１９９８年５巻、３９７〜４０６ページ。しかしながら、結合特異性
を提供するＲＮＡとアミノグリコシドとの間の相互作用の特徴は、ほとんど判っ
ていない。原核及び真核リボソームの解読部位に相当する２つの密接に関係した
ＲＮＡコンストラクトモデルと集めたアミノグリコシド系抗生物質の個々のメン
バーとの特異的な相互作用を検出するのにＥＳＩ−ＦＴＩＣＲが用いられる。
【０２５５】 マトリックス支援型レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）は
、生体分子を研究するのに使用することができるもう１つの方法である（Ｈｉｌ
ｌｅｎｋａｍｐら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９１年、６３巻、１１９３Ａ〜
１２０３Ａページ）。この技術では、サンプル物質を最小限にフラグメント化す
ることにより高分子量の生体ポリマーをイオン化する。これは典型的には、ＵＶ
又はＩＲレーザー照射を吸収するマトリックスの中に分析すべきサンプルを取り
込むことによって達成される。このエネルギーは次いで、マトリックスからサン
プルに転換され、サンプルの気相への脱離を招き、それに続いてイオン化と最小
限のフラグメント化が起きる。ＥＳＩ−ＭＳよりもＭＡＬＤＩ−ＭＳの方が有利
な点の１つは、ＭＡＬＤＩのスペクトルは一般に１つずつ荷電した種が占めてい
るので、得られるスペクトルが単純だということである。典型的には、ＭＡＬＤ
Ｉ技術によって生じるガス状イオンは、このようなイオンの飛行時間型（ＴＯ）
を測定することによって検出され、解析される。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳは解
像度の高い技術ではないが、タンデム型ＭＳ技術、又はフーリエ変換（ＦＴ）及
び４極イオントラップのような他の型のアナライザーを用いることにより、その
ようなシステムに改変を加えることによって解像度を改善することができる。
【０２５６】 フーリエ変換質量分析は、ＥＳＩ又はＭＡＬＤＩのイオン化と共に、他のＭＳ
検出技術よりも優れた精度と解像度を組み合わせた質量測定を行う能力の故に、
特に有用な分析技術である（Ａｍｓｔｅｒ，Ｊ．，Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ
．，１９９６年、３１巻、１３２５〜１３３７ページ）。その上、他のいかなる
イオン化技術によって生じたイオンの質量スペクトルの高い解像度を得るために
もそれを使用してもよい。ＦＴＭＳの基本は、イオンと間接的ではない磁場との
相互作用の結果であるイオン・サイクロトロン運動である。イオンのサイクロト
ロン頻度を測定することによりＦＴＭＳ装置によってイオンの質量対荷電比（ｍ
／ｑ又はｍ／ｚ）を定める。イオンの動的エネルギーに対するサイクロトロン頻
度の感度の無さがＦＴＭＳで極めて高い解像度を実現できる基本的な理由の１つ
である。ＥＳＩ及びＭＡＬＤＩを含めた様々なイオン化法により生じたイオン、
又は衝突活性化解離（ＣＡＤ）により生じた産物イオンを分析するために、ＦＴ
ＭＳは、通常の又はタンデム型質量分析における優れた検出器である。
【０２５７】 衝突が誘発する解離（ＣＩＤ）としても知られている衝突活性化解離（ＣＡＤ
）は、エネルギーのある衝突によって中性又は荷電した種から検体イオンを解離
し、その結果、フラグメントイオンが生じ、続いてそれを質量分析するという方
法である。選択した親イオンに由来するフラグメントイオンを質量分析すること
によって親イオンに関係する特定の配列又はその他の構造情報を提供することが
できる。そのような方法は一般にタンデム型質量分析（ＭＳ又はＭＳ／ＭＳ）と
呼ばれ、今日用いられているＭＳに基づいた生体分子の配列決定法の基本である
。 イオン・トラップ型及び４極型質量アナライザーのようなＦＴＩＣＲ−ＭＳに
よって、実際に他の分子と大きな生体分子との弱い非共有結合複合体であるかも
しれないイオンを選択することができ（Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，１９９１年、６３巻、Ａ２１５〜Ａ２２９ページ；Ｂｅｕら、Ｊ．Ａｍ．
Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１９９３年、４巻、５６６〜５７７ペ
ージ；Ｗｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１
９９３年、４巻、５６６〜２７７ページ）；（Ｈｕａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，１９９１年、６３巻、７３２〜７３９ページ）、例えばＬＣ−ＭＳ（Ｂｒ
ｕｉｎｓら、１９８７年、５９巻、２６２４〜２６４６ページ；Ｈｕａｎｇら、
Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１９９０年、Ｉ巻、１５８
〜１６５ページ；Ｈｕａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９１年、６３巻、
７３２〜７３９ページ）及びＣＥ−ＭＳ（Ｃａｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ
．，１９９５年、７０３巻、６６７〜６９２ページ）実験のようなハイフンでつ
ないだ技術も可能になる。イオン−分子反応経路及び動態の研究にもＦＴＩＣＲ
−ＭＳを応用している。
【０２５８】 いわゆる「ハイフンでつないだ」技術は、分離と質量検出という二重の特徴を
提供するので、構造の解明に使用することができる。そのような技術は、天然産
物、合成反応、又はコンビナトリアルケミストリーから単離したもののような化
合物の混合物の特定の成分を分離及び同定するために使用されている。ハイフン
でつないだ技術では典型的には第一工程として分離法を使用する；ＨＰＬＣ、微
小孔ＬＣ、微小キャピラリーＬＣのような液体クロマトグラフィ、又はキャピラ
リー電気泳動が、そのような混合物の成分を分離するために使用される典型的な
分離法である。このような分離法の多くは、ＭＳによる検出に適合できる緩やか
な流速で作動する一方で、迅速であり、成分の高い解像度を提供する。流速が速
過ぎる場合、「メガフロー」ＥＳＩ源及びサンプル分流技術によってオンライン
式質量分析と共にその実施が促進される。ハイフンでつないだ分析技術の第２工
程には、分離した成分を質量分析計に直接注入することが含まれ、分析計は、第
１工程で分離した物質の質量及び組成に関する情報を提供する検出器として機能
する。このような技術は、複合成分のサンプルにおける様々な成分の質量を知る
という見地からは価値があるが、それらは、構造上の詳細を提供することができ
ない。しかしながら、構造上の詳細の中には、例えば、水素／重水素変換又は衝
突誘発解離のようなタンデム型質量分析の使用を介して突き止められるかも知れ
ないものもある。
【０２５９】 典型的には、タンデム型質量分析は、分離及び検出工程が質量分析に基づいて
いる２つ以上の質量分析の連結使用を含んでいる。さらに構造情報を得るべきサ
ンプルのイオン又は成分を選択するために第１工程を使用する。次いで（ＣＩＤ
）又は光解離によってこの選択されたイオンをフラグメント化する。それから、
生じたフラグメント又は産物イオンの質量を検出し、測定するために第２工程を
使用する。フラグメント化イオンを検出する際に、ＦＴＩＣＲは関心のある具体
的なイオンを選択し、捕捉でき、高い解像度と感度を持つので、ＦＴＩＣＲ−Ｍ
Ｓの出現は、タンデム型ＭＳn 法の有用性に重大な衝撃を与えた。そのようなイ
オンの選択とその後のフラグメント化は、サンプルの分子構造を本質的に、完全
に分析できるように複数回行うことができる。２工程タンデム型ＭＳ実験はＭＳ
−ＭＳ実験と呼ばれるが、ｎ工程のタンデム型実験は、ＭＳn 実験と呼ぶ。サン
プルの複雑さ及び所望の構造的詳細のレベルによって、２より大きなｎ値でのＭ
Ｓn 実験を行ってもよい。
【０２６０】 イオン・トラップに基づいた質量分析計は、解離及び測定工程が空間的にでは
なく、一時的に分かれているので、そのようなタンデム型実験にうまく適合して
いる。例えば、タンデム型質量分析を行う共通基盤は、三重４極質量分析計であ
る。第１と第３の４極は質量フィルターとして機能し、第２の４極はＣＡＤの衝
突セルとして機能する。トラップに基づいた質量分析計では、親イオンの選択と
解離は真空チャンバーの同じ部分で起き、トラップ因子と衝突ガス圧に適用され
るラジオ周波数の波長のコントロールに影響される。従って、三重４極質量分析
計は、２工程質量分析（即ちＭＳ−ＭＳ）に限定されるが、イオン・トラップ質
量分析計は、ＭＳn 分析を行うことができ、そこでは、親イオンが単離され、解
離し、質量分析が行われ、単離された関心のあるフラグメントイオンも更に解離
され、質量分析などが行われる。数多くのＭＳ4 法及びそれより多いものが最近
の文献に見られ、本明細書でも使用することができる（Ｃｈｅｎｇら、タンパク
質化学における技術、ＶＩＩ、１３〜２１ページ）。
【０２６１】 特定の生体分子の分子量を迅速に直接的に測定するのにＥＳＩ及びＭＡＬＤＩ
の適用が見られる（Ｆｅｎｇら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２年、６４巻、
２０９０〜２０９５ページ；Ｎｅｌｓｏｎら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａ
ｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１９９４年、８巻、６２７〜６３１ページ）。この
ような技術は、例えばペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、核酸、糖タ
ンパク質、オリゴ糖及び炭水化物のような特定の生体分子の同一性及び完全性を
確認するのに使用されてきた。更に、このようなＭＳ技術は、タンパク質におけ
る翻訳後の修飾を検出し、同定するのにも適用が見られる。長さ１００塩基対未
満のＤＮＡ及びＲＮＡ配列の証明もまた、核酸の分子量を測定するためのＦＴＭ
Ｓと共にＥＳＩを用いて達成されている（Ｌｉｔｔｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ
．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５年、９２巻、２３１８〜２３２２ページ
）。
【０２６２】 ＥＳＩタンデム型ＭＳは、高分子量タンパク質の研究のために、ペプチド及び
タンパク質の配列決定のために、リン酸化、硫酸化又はグリコシル化のような翻
訳後修飾の同定に、及び酵素メカニズムの研究に使用されている（Ｒｏｓｓｏｍ
ａｎｄｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１９９２年、
８９巻、５７７９〜５７８ページ；Ｋｎｉｇｈｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
，１９９３年、３２巻、２０３１〜２０３５ページ）。 ＥＳＩを用いて、電子
対を共有する酵素中間体又は酵素阻害剤複合体を検出し、ＥＳＩ−ＭＳによって
分析して酵素における修飾部位を確定している。文献ではタンパク質の配列決定
の例が示されており、そこでは、原型のままのタンパク質の複数荷電したイオン
が衝突活性化解離の対象とされ、配列情報をもったフラグメントイオンが提供さ
れている（Ｌｉｇｈｔ−Ｗａｈｌら、Ｂｉｏｌ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．，
１９９３年、２２巻、１１２〜１２０ページ）。ＥＳＩタンデム型ＭＳは、オリ
ゴヌクレオチドと核酸の研究にも適用されている（Ｎｉら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ
．，１９９６年、６８巻、１９８９〜１９９９ページ；Ｌｉｔｔｌｅら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５年、９２巻、２３１８〜２
３２２ページ）。
【０２６３】 オリゴヌクレオチドのタンデム型ＥＳＩの質量スペクトルは複雑になることが
多いが、数グループでは大きなオリゴヌクレオチドの配列決定にＥＳＩタンデム
型ＭＳをうまく適用している（ＭｃＬｕｃｋｅｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓ
ｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．，１９９２年、３巻、６０〜７０ページ；ＭｃＬｕｃｋｅ
ｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９３年、１１５巻、１２０８５〜１
２０９５ページ；Ｌｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９４年
、１１６巻、４８９３〜４８９７ページ）。 ＭｃＬｕｃｋｅｙらが定式化した
ように（Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍ．，１９９２年、３巻、
６０〜７０ページ；ＭｃＬｕｃｋｅｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９
９３年、１１５巻、１２０８５〜１２０９５ページ）、オリゴヌクレオチドの原
則的な解離経路に関する一般則は、オリゴヌクレオチドの質量スペクトルの解釈
を助け、例えば、塩基の段階的喪失とその後の関連した糖の３' −Ｃ−Ｏ結合の
切断のようなフラグメント化に関する知見を含んでいる。オリゴヌクレオチドの
配列決定に関してタンデム型ＭＳと共にＥＳＩを使用することのほかには、２つ
の他の質量分析法が利用できる：オリゴヌクレオチドの酵素的切断の産物に関す
る質量分析（Ｐｉｅｌｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９３
年、２１巻、３１９１〜３１９６ページ；Ｓｈａｌｅｒら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍ
ｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１９９５年、９巻、９４２〜９４７ペ
ージ；Ｇｌｏｖｅｒら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏ
ｍ．，１９９５年、９巻、８９７〜９０１ページ）、及び質量選択技術を用いな
い、最初のイオン化／解離で生じたフラグメントイオンの質量分析（Ｌｉｔｔｌ
ｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４年、６６巻、２８０９〜２８１５ページ
；Ｎｏｒｄｈｏｆｆら、Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１９９５年、３０
巻、９９〜１１２ページ；Ｌｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１
９９４年、１１６巻、４８９３〜４８９７ページ；Ｌｉｔｔｌｅら、Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９５年、１１７巻、６７８３〜６７８４ページ）であ
る。ＥＳＩ−ＭＳ及びＣＩＤ技術を用いてデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の配列を
決定することは可能であるが（ＭｃＬｕｃｋｅｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓ
ｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１９９２年、 ３巻、６０〜７０ページ；ＭｃＬｕｃ
ｋｅｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９３年、１１５巻、１２０８５
〜１２０９５ページ）、ＲＮＡの配列決定ははるかに困難である。従って、６個
のオリゴのような小さなＲＮＡの配列は決定しているが（ＭｃＬｕｃｋｅｙら、
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９３年、１１５巻、１２０８５〜１２０９
５ページ）、それより大きなＲＮＡでは、質量分析を用いて配列を決定するのは
困難である。
【０２６４】 エレクトロスプレー質量分析は、例えば、酵素、タンパク質、及び核酸とその
リガンド、受容体又は基質のような生体ポリマーの生化学的な相互作用を研究す
るのに用いられている。生体ポリマーの電子対を共有する修飾を招くような相互
作用はかねてから研究されているが、電子対を共有しない性質の相互作用は動的
技術以外の方法では従来研究するのが困難であった。今やそのような非共有結合
的相互作用の化学量論や性質に関する情報は質量分析から得ることができる。Ｍ
Ｓは、気相における生体ポリマーとその他の分子との相互作用に関する情報を提
供することができる；しかしながら、そのようにして出したデータは、質量スペ
クトルが生じた液相の現象を反映できることが実験によって立証されている。
【０２６５】 ＥＳＩは、有意な分子のフラグメント化を起こさない、生体ポリマーとその他
の分子との間の弱い結合の複合体でもそれを保つような、穏やかなイオン化法な
ので、複合体を原型のまま質量分析で検出する。ＥＳＩ−ＭＳを用いて様々な生
体ポリマーの非共有結合的複合体が調べられており、文献に報告されている（Ｌ
ｏｏら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５年、６巻、
６４４〜６６５ページ；Ｓｍｉｔｈら、Ｂｉｏｌ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ
．，１９９３年、２２巻、４９３〜５０１ページ；Ｌｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ
．Ｓｏｃ．，１９９３年、１１５巻、８４０９〜８４１３ページ）。これらには
、ペプチド−タンパク質複合体（Ｂｕｓｍａｎら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．
Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１９９４年、８巻、２１１〜２１６ページ；Ｌ
ｏｏら、Ｂｉｏｌ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１９９４年、２３巻、６〜
１２ページ；Ａｎｄｅｒｅｇｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９５年
、１１７巻、１３７４〜１３７７ページ；Ｂａｃｚｙｎｓｋｙｊら、Ｒａｐｉｄ
ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１９９４年、８巻、２８０〜
２８６ページ）、ポリペプチドと金属の相互作用（Ｌｏｏら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ
．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１９９４年、５巻、９５９〜９６５ページ；
Ｈｕら、Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１９９５年、３０巻、１０７６〜
１０７９ページ；Ｗｉｔｋｏｗｓｋａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９
９５年、１１７巻、３３１９〜３３２４ページ；Ｌａｎｅら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂ
ｉｏｌ．，１９９４年、１２５巻、９２９〜９４３ページ）、タンパク質−小分
子複合体（Ｇａｎｅｍら、Ｃｈｅｍ．Ｔｒａｃｔｓ−Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９
９３年、６巻、１〜２２ページ；Ｈｅｎｉｏｎら、Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｍｏｎ
ｉｔ．，１９９３年、１５巻、５６３〜５６９ページ；Ｂａｃａら、Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９２年、１１４巻、３９９２〜３９９３ページ）、多
重結合タンパク質の四次構造に関する研究（Ｂａｃａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．，１９９２年、１１４巻、３９９２〜３９９３ページ；Ｌｉｇｈｔ−Ｗ
ａｈｌら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９４年、１１６巻、５２７１〜
５２７８ページ；Ｌｏｏ，Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１９９５年、３
０巻、１８０〜１８３ページ）及び核酸複合体（Ｌｉｇｈｔ−Ｗａｈｌら、Ｊ．
Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９３年、１１５巻、８０３〜８０４ページ；Ｇ
ａｌｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９４年、１１６巻、６０２７〜
６０２８ページ；Ｇｏｏｄｌｅｔｔら、Ｂｉｏｌ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ
．，１９９３年、２２巻、１８１〜１８３ページ；Ｇａｎｅｍら、Ｔｅｔ．Ｌｅ
ｔｔ．，１９９３年、３４巻、１４４５〜１４４８ページ；Ｄｏｃｔｙｃｚら、
Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４年、６６巻、３４１６〜３４２２ページ；Ｂａ
ｙｅｒら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４年、６６巻、３７５８〜３８６３ペ
ージ；Ｇｒｅｉｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９５年、１１７巻、
１０７６５〜７６６ページ）が含まれている。
【０２６６】 弱い非共有結合の相互作用に関するＥＳＩ−ＭＳによる研究で出したデータ及
び至った結論は、液相で見られる相互作用の性質を一般にある程度反映している
が、普遍的な非特異的相互作用の可能性を除外するためにコントロール実験が必
要であると文献では指摘されている（Ｓｍｉｔｈら、Ｂｉｏｌ．Ｍａｓｓ Ｓｐ
ｅｃｔｒｏｍ．，１９９３年、２２巻、４９３〜５０１ページ）。穏やかなエレ
クトロスプレー／解離工程に関する多重結合たんぱく質の研究に対してＥＳＩ−
ＭＳ及びＭＡＬＤＩ−ＭＳの使用を適用することがあり、水素結合、疎水性及び
／又はイオン相互作用で結合している弱い結合の複合体を気相への移行するのに
際して原型のまま保つことができる。気相研究からのＥＳＩ−ＭＳのデータが溶
液中で見られる非共有結合の相互作用を反映するだけでなく、そのような相互作
用の強度も測定できることを文献は明らかにしている。ｓｒｃＳＨ２ドメインタ
ンパク質に対する様々なペプチド阻害剤の相互作用に関する結合定数は、ＥＳＩ
−ＭＳで測定した場合、液相で測定されたその結合定数に一致していることが判
った（Ｌｏｏら、Ｐｒｏｃ．４３ｒｄＡＳＭＳ Ｃｏｎｆ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ
ｔｒｏｍ．ａｎｄＡｌｌｉｅｄ Ｔｏｐｉｃｓ，１９９５年）。 ＥＳＩ−ＭＳ
は、バンコマイシン系抗生物質とトリペプチド・リガンドとの結合定数を測定す
るためのスキャッチャード・プロットを作成するのにも用いられた（Ｌｉｍら、
Ｊ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，１９９５年、３０巻、７０８〜７１４ペー
ジ）。
【０２６７】 核酸の非共有結合相互作用を調べるためにも同様の実験が行われている。核酸
とタンパク質の非共有結合相互作用を調べるのにＥＳＩ−ＭＳ及びＭＡＬＤＩ−
ＭＳの両方が用いられている。ＭＡＬＤＩは典型的には、原型のままで非共有結
合の複合体を残すことはできないが、成分と複合体との間で共有結合を作る架橋
法を使用することによって、そのような研究でこれを用いることができる。核酸
−タンパク質の相互作用について相互作用の化学量論と相互作用の部位が確定さ
れた（Ｊｅｎｓｅｎら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏ
ｍ．，１９９３年、７巻、４９６〜５０１ページ；Ｊｅｎｓｅｎら、４２ｎｄ ＡＳＭＳ Ｃｏｎｆ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．ａｎｄＡｌｌｉｅｄ Ｔｏ
ｐｉｃｓ，１９９４年、９２３ページ）。典型的には、非共有結合又は共有結合
の複合体のどちらかをタンパク質分解することによって相互作用の部位を定める
（Ｊｅｎｓｅｎら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．
，１９９３年、７巻、４９６〜５０１ページ；Ｊｅｎｓｅｎら、４２ｎｄ ＡＳ
ＭＳ Ｃｏｎｆ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．ａｎｄＡｌｌｉｅｄ Ｔｏｐｉ
ｃｓ，１９９４年、９２３ページ；Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，
１９９５年、４巻、１０８８〜１０９９ページ）。タンパク質だけの質量スペク
トルとタンパク質分解して生じた質量スペクトルを比較することによって、核酸
−タンパク質複合体における切断部位への接近のし易さ又は保護に関する情報が
提供され、従って複合体で相互作用するそのような生体ポリマーの部分に関する
情報が得られる。
【０２６８】 エレクトロスプレー質量分析は、例えば、タンパク質とリガンド、酵素と阻害
剤、及びタンパク質と核酸のような電子対を共有しない巨大分子複合体の結合定
数を確定するために効果的に用いられる。グレイグ（Ｇｒｅｉｇ）らは、（Ｊ．
Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９５年、１１７巻、１０７６５〜１０７６６ペ
ージ）オリゴヌクレオチド−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）複合体の解離定数（
ＫD ）を決定するためにＥＳＩ−ＭＳを使用したことを報告した。ＥＳＩ−ＭＳ
によって定めたＫD は、キャピラリー電気泳動法を用いて得られた液体中のＫD 値と一致すると報告された。
【０２６９】 Ｃｈｅｎｇら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５年、１１７号、８８５
９〜８８６０ページ）はＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ質量分析を、炭酸脱水酵素の競合性
阻害剤混合物の構造決定方法、および相対的結合定数の決定方法として使用し、
これを報告した。彼らはＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳを単独で用いて非共有結合複
合体イオンの相対的存在度を測定することにより、阻害剤と酵素の間の非共有結
合性交互作用の相対結合定数を確認した。さらに、そのようにして決定したこれ
ら化合物のＫD は、溶液中におけるそれらの既知結合定数と類似していた。この
方法では、ＦＴＩＣＲの高い分解能および多段階解離質量分析に基づき、阻害剤
の小混合物の密着結合リガンドの構造同定もできる。関係する研究で、Ｇａｏら
は（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９６年３９号、１９４９〜５５ページ）、炭酸
脱水酵素ＩＩの密着結合阻害剤探索において、可溶性ペプチドライブラリーのス
クリーニングにＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳを使用し、これを報告した。研究では
密着結合ペプチド阻害剤の構造同期同定および結合定数決定が同時に行われた。
質量分析によるイオン存在度から決定された結合親和性は、溶液中で決定された
親和性とよく対応していることが判明した。この技法を薬剤発見の試みへの適用
は、タンパク質とリガンド間のこのような非共有結合性交互作用部位の情報、お
よび交互作用の機序に関する情報が欠けており限界がある。
【０２７０】 また、これらの方法における、タンパク質間のリガンド交互作用の研究につい
ても、検討しているが、限界があるようだ。オリゴヌクレオチド、ＲＮＡやＤＮ
Ａのような核酸、およびその他の生体巨大分子の非共有結合性交互作用の研究に
関して、結合の分析方法および解離定数の質量分析方法が適当であるかについて
は、文献の中で言及していない。 高速処理合成法および組み合わせ化合物は、生物活性スクリーニング用の膨大
な合成化合物の集合と混合物をもたらし、これによって近年の薬剤発見手順は大
きく変わった。このような多数の混合物および化合物の集積は、生物学的検定と
分析に関わる科学者に重大な難問をもたらす。分析には、ある混合物からの活性
成分の分離と、その構造の同定という二重の問題がある。ＬＣ、ＨＰＬＣ、ＣＥ
などの種々の分離方法が利用できる。しかし、生物活性成分を、一つあるいはそ
れ以上の標的とコンビナトリアルライブラリーとの混合物から分離するという観
点から、リガンドと標的の複合体（通常は非共有結合）を選択し分離する方法の
利用開発が必要である。親和性カラム法を選択的単離に使用し、続いて化合物混
合物の結合成分が分析された。例えば、Ｋａｓｓｅｌら（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＶＩ、Ｊ．Ｃｒａｂｂ，Ｅｄ．
、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９５年、３９〜４
６ページ）は、リンペプチドに結合する高親和性構造の分離に固定化したｓｒｃ
ＳＨ２ドメインタンパク質カラムを使用し、続いてＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳで
分析を行った。
【０２７１】 類似した技法であるＡＣＥ−ＥＳＩ−ＭＳでは、生体分子標的と化合物のコン
ビナトリアルライブラリーの混合、または生体分子標的と化合物の混合物の混合
で形成した非共有結合複合体の分離に、親和性キャピラリー電気泳動法を使用す
る。通常、受容体をキャピラリーに組み込むことにより、組み合わせ混合物にあ
るリガンドは標的と交互作用し、キャピラリーの中で保持されるかまたは衰える
。これらの非共有結合複合体は、一旦分離されると、複合体の構造およびその結
合成分の構造を突き止めるためにＥＳＩ−ＭＳ直結で分析される。この方法は前
もって別々に遂行された二つの段階、すなわち、以前にバコマイシンに関して実
証された、成分／非共有結合複合体選択段階（Ｃｈｕら、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒ
ｅｓ．、１９９５年、２８号、４６１〜４６８ページ、Ｃｈｕら Ｊ．Ｏｒｇ．
Ｃｈｅｍ．１９９３年、５８号、６４８〜５２ページ）、および成分同定段階（
Ｃａｉら、Ｃｈｒｍａｔｏｇｒ １９９５年、７０３、６６７〜６９２）の二段
階を一つに組み込むものである。例えば、ＡＣＥ−ＥＳＩ−ＭＳは、バコマイシ
ンとペプチドライブラリーの混合物に適用され（Ｃｈｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ
．Ｓｏｃ．１９９６年、１１８号、７８２７〜３５ページ）、形成された非共有
結合複合体の迅速なスクリーニング、およびバコマイシンに結合したペプチドの
同定が可能になった。
【０２７２】 コンビナトリアルライブラリーからの活性成分の分離および同定の別の方法で
は、粒径排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用い、続いて、ＬＣ／ＭＳもしく
はＣＥ／ＭＳ分析を用いる。粒径排除は、生体巨大分子標的分離、および生体巨
大分子標的とコンビナトリアルライブラリーの低分子メンバーとの複合体分離の
ための、簡単だが強力な方法である。これらの複合体は一旦ＳＥＣで単離される
と、変性溶液状態下で解離され、結合リガンドは最終的には質量分析で分析され
る。この方法は、低分子のコンビナトリアルライブラリーからのヒト血清アルブ
ミン（ＨＳＡ）に高い親和性を持つリガンドの同定に適用されてきた（Ｄｕｎａ
ｙｅｖｓｋｉｙら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｍ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｄｔｒｏｍ．
、１９９７年、１１号、１１７８〜８４ページ）。
【０２７３】 生体親和性解析質量分析（ＢＡＣＭＳ）は、リガンドの混合物と生体分子標的
の非共有結合性交互作用を解析する、さらに別の方法である（Ｂｒｕｃｅら、Ｒ
ａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｍ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｄｔｒｏｍ．、１９９５年、９号、
６４４〜５０ページ）。ＢＡＣＭＳでは、親和性標的とリガンド（あるいはコン
ビナトリアルライブラリー）の混合物の両方を含む溶液のエレクトロスプレーイ
オン化と、それに続くＦＴＩＣＲイオントラップ中の全イオン種のトラップを行
う。そのあとで、関連のある複合体を質量分析によって同定し、選択イオン集積
によって単離する。そして、低エネルギー解離、つまり「加温」で、複合体にあ
る高親和性リガンドを解離する。最終的に、衝突活性化解離（ＣＡＤ）を用いて
高結合親和性リガンドの構造情報を得る。親和性クロマトグラフィーのようなラ
イブラリー研究に通常必要な時間のかかる技法は、複合体の分離と精製に固体の
支持体を使用し、そのあとで選択されたリガンド解析のため分析を行うのだが、
ＢＡＣＭＳの最も進歩した点は、これらの技法のすべてがＦＴＩＣＲ−ＭＳに備
わっている点である。今までのところ、ＢＡＣＭＳはタンパク質標的に適用され
ただけである。 しかし、前述の方法で、種々の生体分子標的への適用が実証されたものはない
。また、このような方法では、組み合わせ由来のリガンドと生体巨大分子間の交
互作用部位の迅速な決定が得られない。
【０２７４】 ＦＴＩＣＲにおけるエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、三連四重極子、
あるいはイオントラップ質量分析を用いて遂行するタンデム質量分析は、生体分
子の構造を決定する強力なツールであることが判明している。大小両方のＲＮＡ
およびＤＮＡ（＞３０００ ｋｂａｓｅ）を、エレクロトスプレー技法を用いて
無傷のまま溶液から気相へ移行させる技術が知られている。さらに、この技術の
高度な技法では、気相においてイオンがイオンとしての溶液構造をかなりの程度
とどめていることが分かっている。これは、質量分析技法によって、核酸とタン
パク質の非共有結合複合体を研究する場合、また核酸と低分子の非共有結合複合
体を研究する場合に特に有用である。
【０２７５】 オリゴヌクレオチドおよび核酸は、衝突誘導解離（ＣＩＤ）の間、特定の断片
化パターンに従うこと、およびこれらの断片とパターンは核の配列決定に使用で
きることが研究によって実証されている（ＭｃＬｕｃｋｅｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏ
ｃ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９２年、３号、６０〜７０ページ、ＭｃＬｕｃｋｅ
ｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９３年、１１５号、１２０８
５〜１２０９５ページ）。エレクトロスプレーイオン化は、核酸の有意な断片化
を全く伴わずに、親核酸の様々な多重電荷イオンを生じる。通常、核酸の単一電
荷状態は三連四重極子イオントラップ、あるいはサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）
装置で単離される。このイオンは刺激され、ヘリウムやアルゴンあるいは窒素の
ような天然のガスに衝突させ、核酸イオンにおいて特定の結合の開裂を生じる。
あるいは、イオンはレーザーパルスで刺激され断片化される。通常、二系列の断
片イオンが形成されることが分かっている。ａ−ＢａｓｅおよびＷ系列である。
【０２７６】 ａ−Ｂａｓｅ系列断片は、同時のＣ−２' 陽子抽出、後に続く３' −リン酸基
およびＣ−４' 陽子の除去により、グリコシド結合の初期開裂から生じる。この
断片化スキームは３' −リン酸基に付着する残留フランを生じ、またａ−Ｂａｓ
ｅ断片系列をもたらす。ａ−Ｂａｓｅ断片系列の質量は、核酸の５' 末端から順
次増加する。したがって、この衝突によって誘導された断片の質量を測定するこ
とにより、５' から３' 方向における核酸の配列決定を得る。断片のＷ系列は、
核酸の開裂を介して、それぞれの断片上の５' リン酸残基を残すという方法で生
じる。こうしたＷ系列断片の質量監視により５' から３' 方向の核酸配列が決定
できる。断片の両系列から生じる配列情報を用いて、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ
）配列の認識が可能である。リボ核酸について同様の質量分析情報を得るのは、
はるかに困難な課題である。ＲＮＡの衝突誘導解離（ＣＩＤ）はＤＮＡの場合に
比べてエネルギー的な支持がかなり少ない。これは、ＲＮＡにおいてはグリコシ
ド結合が非常に強いためである。それゆえ６−ｍｅｒのような小ＲＮＡはＣＩＤ
ＭＳを用いて配列決定されたが、一般に、大きいＲＮＡではタンデムＭＳを用
いた配列決定は成功しなかった。
【０２７７】 タンパク質や核酸のような生体分子の構造決定は、溶液生化学的開裂とそれに
続く質量分析を用いて試みることができる。しかし、これらの方法は扱いにくく
、また開裂した生成物をＭＳ分析する前に必要な、いくつかの生化学的開裂と分
離段階が必ずしもうまくいくとは限らない。また、これによって得られる生体分
子の二次構造および三次構造に関する情報のレベルも限られている。したがって
、科学文献記載の方法は、その方法で得る生体分子および生体分子標的の配列情
報、およびその構造情報という点で、非常に制限されている。 本発明の方法の一側面により、核酸のような生体分子標的の質量分析を用いた
構造決定方法が得られる。核酸の構造、特にＲＮＡの構造は、突き止めるのが困
難であることが多いが、本発明を用いて迅速に決定できる。核酸の構造はＭＳn 実験装置で観察される断片化パターンから決定する。核酸配列中の特異的残基位
置にあるデオキシヌクレオチドあるいはヌクレオシド残基を選択的に組み込むこ
とにより、方向付けされたＲＮＡの断片化が容易になる。ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ
核酸のＣＩＤの間に、デオキシヌクレオチドあるいは他の非天然残基が組み込ま
れた部位の開裂が容易に行える。開裂は、生体分子の局所二次構造および三次構
造によっても影響を受ける。したがって、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドで観察さ
れる開裂パターンは、不適正塩基対、バルジ領域、その他の特徴を持った核酸の
局所構造を明らかにする。
【０２７８】 露出したデオキシヌクレオチド残基は、ＭＳ実験装置のＣＩＤ開裂に過敏であ
ることが分かっているので、このような残基のＲＮＡへの体系的な組み込みによ
って、ＲＮＡの局所構造の体系的探索が行える。本発明のこの態様を用いて、不
適正塩基対、ループ、バルジ、およびキンク−ステム構造などの核酸の二次構造
および三次構造が決定できる。 ＲＮＡの構造の決定は、以下に述べる本発明の実証例の方法を用いて遂行でき
る。構造を決定するＲＮＡを自動核酸合成装置により合成する。ＲＮＡ合成の間
に、その構造を探索する特異部位の配列の中にデオキシヌクレオチドを選択的に
組み込む。ここで、衝突活性に感作させたこのＲＮＡ／ＤＮＡキメラ核酸を、タ
ンデムＭＳ実験装置による配列および構造決定に使用する。ＥＳＩ−ＭＳと、後
に続く選択イオンのトラップおよび各イオンのＣＩＤによって、核酸ハイブリッ
ドのどの位置が不一致であるか（すなわち上位からの指令構造に関与していない
か）の情報を得る。ゆえに、どこの位置が開裂に利用可能であるかの情報が得ら
れる。試験用ＲＮＡ配列へのデオキシヌクレオチド組み込みの体系的パターンに
よって、核酸の特定の領域もしくは核酸全体の構造の体系的質量分析が行える。
ＤＮＡの代りに他の修飾された核酸残基を使用した。Ｚ1 −修飾のような化学的
に修飾された核酸サブユニット、例えば修飾２' −Ｏ−アルキル塩基、バックボ
ーン修飾、他の残基などが使用できる。このような残基はＲＮＡのみならずＤＮ
Ａの評価も行える。
【０２７９】 また、本発明によって生体標的と結合リガンドの間の交互作用部位およびその
性質を決定する方法も得られる。この情報は薬剤発見過程にとって決定的な価値
がある。現在の生体分子スクリーニング方法では、結合リガンドと生体分子標的
の間の交互作用の性質の決定についても直接的な手段が得られない。交互作用の
化学量およびおよび結合親和性に関する情報はさらなる生化学的分析による確認
を必要とすることが多い。そのため、薬剤発見は遅れ、コストは高くなる。薬剤
もしくはリガンドが核酸のような生体標的に結合すると、生体分子は違う構造へ
と構造変化することが多い。これはもまた、開裂に対する生体分子保護の一因と
なる場合がある。
【０２８０】 本発明により、結合リガンドが交互作用する生体分子標的上の一つあるいは複
数の部位の決定を行う簡便な方法が得られる。これは、複合体の開裂が生体分子
の露出部位においてのみ生じるように、非共有結合生体分子−リガンド複合体の
衝突活性化解離（ＣＩＤもしくはＣＡＤ）を遂行できるという知識に基づいて達
成される。リガンドとの結合に関係する生体分子に存在する開裂部位は、ＣＩＤ
の間に生じる結合イベントからの構造的な指令が増大することにより保護される
。この方法を用いて作成するＥＳＩ−ＭＳn スペクトルは、リガンド結合（また
は薬剤結合）の存在下および非存在下において、リガンドが開裂部位の保護を引
き起こすことによって生じる差次的な断片化パターンを明らかにする。それゆえ
、結合リガンドの存在下と非存在下とにおいて作成された質量分析スペクトルを
比較すると、生体分子配列でリガンドと生体分子間の交互作用が生じている位置
が明らかになる。
【０２８１】 結合リガンドと生体分子間の交互作用部位を決定するこれらの方法は幅広い適
用が可能である。この方法を使って研究できる生体分子標的は、ペプチド、タン
パク質、抗生物質、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡなどの核酸、糖ペプチ
ド、オリゴ糖などがあるが、これに限らない。生体分子標的は、核酸であること
が望ましい。デオキシヌクレオチド（あるいは他の残基）を特異的位置の配列に
選択的に組み込むために合成されたキメラＲＮＡ／ＤＮＡ核酸であることがさら
に望ましい。
【０２８２】 結合リガンドは、分子グループの一つであることもある。この分子クループは
、有機または無機、大から小までの分子量の個々の化合物、混合物およびリガン
ドのコンビナトリアルライブラリー、阻害剤、アゴニスト、アンタゴニスト、基
質、およびペプチドあるいはオリゴヌクレオチドのような生体巨大分子などを含
むが、これに限らない。 ＲＮＡ標的にあって、結合リガンドとの交互作用を生じる部位の決定は以下の
ようにして行う。生体分子標的として検査するＲＮＡを自動合成装置で調製し、
デオキシヌクレオチドを特異的部位の配列に選択的に組み込む。このＲＮＡ／Ｄ
ＮＡキメラの部分標本を直接ＥＳＩ−ＭＳで使用し、その後選択的に集積したイ
オンのＣＩＤ分析を行い、この生体分子標的の未変性構造および開裂パターンを
確証する。ＲＮＡ／ＤＮＡキメラの第２の部分標本を、生体標的と結合すること
が分かっている薬剤またはリガンドの溶液と混合する。この標的とリガンドは溶
液中で交互作用し非共有結合複合体を形成すると予測される。この非共有結合生
体分子−リガンド複合体溶液に本発明の方法を適用することにより、非共有結合
交互作用および結合化学量を維持したままで複合体がイオン化される。その後、
この複合体のＣＩＤによって露出した断片化部位の生体分子配列の開裂が誘導さ
れる。生体分子とリガンドの結合に関与していて、断片化が別に生じる可能性の
ある部位は、これらの部位またはその隣接する部位の開裂がＣＩＤ局面の間は妨
げられよう保護されている。結合リガンドの存在下または非存在下で本発明の方
法を適用した生体分子の断片化パターンの差は、保護されており、したがってリ
ガンド結合に関与している生体分子上の一つあるいは複数の部位を示唆する。
【０２８３】 同様に、本発明の方法を用いると、デオキシヌクレオチドの試験用ＲＮＡの配
列への組み込みの体系的パターンにより、核酸の特定領域もしくはその全体にお
ける結合部位および交互作用の体系的な質量分析が行える。したがって、本発明
は「フットプリント」生体分子標的、特に「フットプリント」核酸という新しい
方法も提供する。質量分析によるこのフットプリントは生体分子標的の構造調査
、およびリガンドと標的の交互作用部位の調査の直接的な方法である。
【０２８４】 本発明の方法を用いて、結合リガンドと生体分子標的との間の交互作用の性質
も迅速に調査できる。生体分子−リガンド非共有結合複合体の化学量および絶対
的解離定数・相対的解離定数は、本発明を使用することで迅速に確認できる。非
共有結合生体分子−リガンド複合体の形成に関与したリガンド分子数および生体
分子受容体数の割合は、生化学者および医化学者にとって意味深く重要である。
同様に非共有結合複合体の強さ、すなわち生体分子標的に対するリガンドの結合
親和性は、リガンドと生体分子標的間の相補性の程度の指標となるため重要であ
る。また、この結合親和性決定は、リガンド系列の構造と活性の関係を得るため
、および特別な生体分子標的に対してより強く結合するリガンドの設計を容易に
するための様々なリガンドの順位序列付けとしても重要である。
【０２８５】 本発明の方法によって、スクリーニングで検索される生体分子標的に対するリ
ガンドの結合化学量と親和性の両方の決定が可能である。エレクトロスプレーイ
オン化は、発生させるガス状のイオンにおいて、生体分子およびその非共有結合
複合体の液相構造をかなりの程度保持することが知られている。ゆえに、非共有
結合複合体の化学量の決定には、リガンド、生体分子標的および非共有結合生体
分子−リガンド複合体の質量データのみ必要となる。この決定の遂行に必要なデ
ータは実際、リガンドと生体分子標的の結合構造の決定および結合部位の決定を
行う質量分析実験装置で入手可能である。標的生体分子の構造と配列の知識に基
づき、生体分子−リガンド複合体のＭＳ分析によって非共有結合複合体にあるリ
ガンドおよび標的分子の数を明らかにする。質量分析で観察された非共有結合複
合体イオンのｍ／ｚ値が、標的生体分子およびリガンドのそれぞれの分子の増加
ｍ／ｚ値から予想されるｍ／ｚ値と同等である場合、非共有結複合体は生体分子
とリガンド間の１：１の交互作用から形成されるのが好ましい。同様に、分子量
および標的とリガンドの電荷における簡単な数学的操作によって、リガンドと生
体分子の間のより高いレベルの交互作用も決定できる。ＦＴＩＣＲ質量分析の高
分解能により、非結合核酸に相対させた複合体の質量測定の結果に基づいて、結
合リガンドの直接同定ができる。
【０２８６】 本発明に沿った質量分析の使用によりサンプルから生じるイオン電荷に対する
質量の比だけでなく、このイオンの相対的存在度の情報も得ることができる。し
たがって、標準実験条件下で、非共有結合生体分子−リガンド複合体イオン存在
度を、基質あるいは阻害剤として知られているような標準分子と生体分子との間
に形成された非共有結合複合体のイオン存在度比較することができる。この比較
をとおして、リガンドの生体分子に対する結合親和性を、標準分子の既知の結合
に相対させて確認することができる。さらに、絶対的結合親和性も決定できる。
【０２８７】 リガンドの生体分子標的に対する交互作用の性質の決定は、小分子リガンドと
核酸標的の結合で実証したようにして行われた。まず、試験用リガンドと結合し
ている調査対象のキメラＲＮＡ／ＤＮＡ生体分子標的を自動合成手順で調製する
。既知濃度のキメラ核酸の部分標本を、この核酸と結合することが知られている
既知濃度および既知量のアミノグリコシドパロモマイシンのような標準化合物で
処理する。アミノグリコシドパロモマイシンはＲＮＡの１６Ｓ Ａ部位と結合す
ることが分かっている。パロモマイシン−核酸複合体のＥＳＩ−ＭＳに続いてＣ
ＩＤを行い複合体および交互作用の対照スペクトルを得る。次にキメラ核酸の第
２の部分標本を対照実験装置で用いたと同じ量および濃度の試験用リガンドで処
理する。本発明をこの核酸−リガンド非共有結合複合体へ適用することで、試験
用スペクトラムを得ることができ、生体分子−リガンド交互作用の性質が明らか
になる。複合体の二つの成分の既知分子量に基づく非共有結合核酸−リガンド複
合体の分析により、複合体にある核酸分子の数およびリガンドの数が決定できる
。さらに、核酸−リガンド複合体イオンの存在度を、例えばパロモマイシン−核
酸複合体（あるいは他のすべての既知交互作用種との複合体）から生じるイオン
の存在度と比較することにより、標準（パロモマイシン）と比較した場合の試験
用リガンドの結合親和性を直接且つ簡便に推定できる。この標準はよく解析され
ており、その溶液結合親和性は他の実験もしくは他の出典文献から当然よく分か
っている。例えば、パロモマイシンは 〜１μＭの親和性で、試験用２７−ｍｅ
ｒＲＮＡに結合する。ＭＳ実験装置でパロモマイシンに相対させた試験リガンド
の結合親和性を知ることにより、検査核酸標的に対する試験用リガンドの分子結
合親和性を決定できる。相対的結合親和性は、標的生体分子との混合物における
ように、単一の試験分析において、標準化合物と試験用リガンドを同時にテスト
することによっても測定できる。
【０２８８】 本発明の別の目的は、薬剤発見のための普遍的な化合物スクリーニング法を提
供することである。本発明によって、これらに限られないが、ペプチド、タンパ
ク質、受容体、抗生物質、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮ
Ａハイブリッド、核酸、オリゴ糖、炭水化物、および糖ペプチドなどの様々な生
体分子標的のスクリーニング方法が得られる。本発明の方法を用いてスクリーニ
ングできる分子は、有機または無機化合物、大小の分子量の個々の化合物、混合
物およびリガンドのコンビナトリアルライブラリー、阻害剤、アゴニスト、アン
タゴニスト、基質、およびペプチドあるいはオリゴヌクレオチドのような生体巨
大分子などであるが、これに限らない。
【０２８９】 化合物の大きな集合や混合物のスクリーニングにおける主要な問題は、生物学
的に関連性のある活性を見つけることではない。なぜなら、これは多くの他の例
で既に示されているからである。難問はこのようなスクリーンからの活性化合物
の同定、また、よくある例だが、活性であることが判明している化合物の混合物
および化合物の集積からの活性化合物の同定である。高速処理薬剤発見における
高度な技術によって行われてきた一つの解決手法は、混合物の反復逆裏畳である
。逆裏畳は必然的に、化合物の組み合わせ集積または関係する標的のスクリーニ
ングにおいて、活性であることが判明した混合物の再合成を伴う。再合成はより
小さい集積あるいは混合物のセット、もしくは個々の化合物のセットを生じる。
再スクリーニングおよび反復逆裏畳は親混合物のスクリーンで観察された活性の
原因である個々の化合物が単離されるまで行われる。
【０２９０】 しかし、分析的技法で、組み合わせの試みで生じる混合物の様々なタイプを十
分に扱うには限界がある。組み合わせ混合物あるいは組み合わせ集積メンバーの
類似性、およびそのような混合物の複雑さのゆえに、この混合物が個々の化合物
あるいは最少のほんの一握りの成分の集積へと逆裏畳されるまで、効果的な分析
的評価は妨げられる。逆裏畳の過程は、再合成、再スクリーニング、および分析
を含み、非常に扱いにくく時間がかかり、また経費もかかる。薬剤発見過程では
、活性混合物を迅速に明らかにしその混合物の活性成分を速やかに同定すること
によって、これらの問題を軽減する一般的な方法が、時間と経費節減のために必
要であるのは明らかである。
【０２９１】 本発見は生体分子標的に対する組み合わせ混合物の活性を迅速に評価し、また
その混合物の活性成分の構造を速やかに同定する方法の必要性に応えるものであ
る。以下に述べるように、核酸標的に結合するための組み合わせ混合物のスクリ
ーニングでこれを実証する。既知配列のキメラＲＮＡ／ＤＮＡ標的を、生物学的
関連性に基づきスクリーニング標的として選択する。このキメラ核酸標的は自動
合成で調整される。核酸の部分標本を１０μＭ濃度で用い、１５０ｎＭ濃度のｅ
．ｑ．パロモマイシン酢酸塩で処理する。混合物のサンプルをこの発明の方法で
分析し、パロモマイシン−核酸複合体イオンの観察によりパロモマイシンの結合
を実証する。次に、混合物の部分標本を、化合物の組み合わせ混合物のＤＭＳＯ
溶液で混合物の各成分の最終濃度が 〜１５０ｎＭになるよう処理する。このサ
ンプルは次にＥＳＩ−ＭＳに供し、コンビナトリアルライブラリーの成分によっ
て形成される新しい核酸−リガンド非共有結合に対応する、新しい信号の出現の
ために質量スペクトルを監視する。
【０２９２】 これらの新しい複合体の相対的解離定数は、新しいイオンの存在度をパロモマ
イシン−核酸複合体イオンの存在度と比較して決定する。標的に対するパロモマ
イシン−核酸複合体イオンの結合親和性は先験的に分かっている。観察された新
しいイオンのアルゴリズム的逆裏畳によって、同時に標的の質量およびコンビナ
トリアルライブラリーの成分質量を考慮に入れて、観察された非共有結合複合体
にある結合リガンドの分子量が得られる。もう一つの方法として、三連四重極子
イオントラップあるいはイオンサイクロトロン共鳴装置（ＩＣＲ）の使用に続き
、断片質量分析で従来の同定を行う方法を用いて、新しく観察された複合体を初
めに単離し、結合リガンドの同一性を決定することもできる。例えば、単離の際
に、非共有結合複合体イオンを「加温」し、成分リガンドおよび生体分子イオン
の中に解離させる。その結果、ＭＳ／ＭＳ実験装置をリガンドの断片化の調査に
利用できる。この情報によって結合リガンド構造の直接の証明が得られる。した
がって本発明のこの方法により、核酸標的に結合する化合物の組み合わせなどに
よる混合物のメンバーの同一性と相対的結合親和性の両方を得ることができる。
【０２９３】 本発明は、分子量の定量法および、化合物の結合もしくは混合物の結合構成成
分の絶対的結合親和性および相対的結合親和性の判定法となるだけでなく、標的
生体分子における結合部位について有益な情報を提供する。この情報により、特
定の生物活性を持つ化合物の同定が可能になる。また、この情報は、動物薬、農
薬、工業用化学薬品、診断学、その他の有益な化合物等の有用な薬剤を生み出す
。これは、三重四重極子・イオントラップもしくはイオンサイクロトロン共鳴装
置（ＩＣＲ）を用いて、新しく観察された錯イオンを分離することによって行わ
れる同じ質量分析的処理過程の一部分になる。たとえば、分離において、非共有
親和性の錯イオンは、曝露されたデオキシヌクレオチド部位において、キメラ核
酸を切断するため衝突活性化される。このＭＳ／ＭＳ 手順では、次に標的生体
分子の断片の調査に取り掛かることができる。
【０２９４】 このようにして得た非共有結合複合体の核酸構成成分の切断と断片のパターン
を未変性核酸だけのパターンと比較することにより、リガンド結合に保護されて
いる核酸上の位置が明らかになる。これは、核酸上のリガンドの結合部位を示唆
する。切断パターンを標準核酸錯イオンのＣＩＤで観察された切断パターンと比
較することにより、新しいリガンド結合と標準結合部位との間の関連が得られる
。この方法において、核酸標的に結合するリガンドは、標準結合が存在する核酸
上の同じ結合部位と競合するものであるか、もしくは核酸上の全く異なる新しい
部位に結合するものであると同定される可能性がある。このタイプの観察はいず
れも薬剤発見の観点で価値がある。
【０２９５】 本発明の方法は本稿で記載するすべての生体分子の金属イオン結合部位の同定
に使用できる。金属イオン結合部位は、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金属
と結合することが望ましく、金属イオンはＮａ+ 、Ｍｇ++、およびＭｎ++である
ことがさらに望ましい。 多くの様々なタイプの生体分子標的の中で、どのタイプを使用する薬剤発見に
おいても、特定の標的に対する結合活性に対して、大量の化合物のコンビナトリ
アルライブラリーと混合物を迅速にスクリーニングできる本発明の方法が使用で
きる。スクリーニングに使われる化合物のコンビナトリアルライブラリーおよび
混合物は、構造は異なるが基本的な組成が類似しているため、もしくは極めてま
れだが、異性体や鏡像異性体であるために質量の類似した構成成分を含む可能性
がある。このような例では、結合リガンドの分子量の単純なアルゴリズム計算は
同じ分子量の多成分が存在するリガンドの同定には不適当である。本発明の方法
ではこのリガンド同定の問題を扱い解決することができる。非共有結合からのリ
ガンドイオンの選択的イオン集積に続き、結合リガンドをさらに断片化するため
のＭＳ／ＭＳ実験の使用は、結合リガンドの構造細部を得る簡単な技法である。
本発明の方法により得られた質量と構造の情報は、化合物の大量のコンビナトリ
アルライブラリーと混合物のスクリーニングに関連する大部分の質量重複問題を
解決すると予想される。
【０２９６】 好適な態様では、本発明により、化合物のコンビナトリアルライブラリーおよ
び混合物、もしくは化合物の集合に対する複数の生体分子標的を同時スクリーニ
ングする方法が得られる。これは、このような結合の構成成分のスクリーニング
において、現行の技術状況を凌駕する本発明の大きな利点である。複数の標的を
同時に且つ迅速にスクリーニングでき、その上標的リガンドおよび結合リガンド
の構造細部を同時に得ることができる先行技術はないと考えられている。さらに
、複数の標的を同時に且つ迅速にスクリーニングする方法に加えて、本発明は、
標的および結合リガンドの両方の構造および結合の親和性質を決定する方法を提
供できる。
【０２９７】 前述のとおり、本発明の質量分析法により、溶液中の標的生体分子に結合する
結合的混合物のスクリーニングと同定のための直接的な手段を得る。効率を上げ
るために、結合活性のための複数の標的を同時スクリーニングすることで、化合
物のコンビナトリアルライブラリーや混合物のスクリーニング過程を多重化する
ことは好ましい。通常であれば、スクリーニングの間に形成され得る全ての潜在
的非共有親和性の生体分子−リガンド複合体が引き起こす電荷分布および望まし
くない質量／電荷の重複によって、この方法は制限される。質量スペクトルにお
ける重複ピークの問題は、スクリーニングする生体分子の配列、組成、または分
子量が類似している場合はさらに悪化する。このような例では、広範な質量重複
が調査対象生体分子のプールに現れること、またスクリーニングされるコンビナ
トリアルライブラリーに広範な質量重複があり得ることにより、迅速かつ簡単な
操作での生体分子- リガンド複合体の組成確認は不可能であろう。
【０２９８】 本発明の方法は、特別な質量修飾分子量タグを使用し、標的生体分子質量重複
の問題を軽減する。これらの質量修飾タグは、これに限定されないが、通常はア
ルキル基およびテトラアルキルアンモニウムグループのように、電荷していない
か、もしくは正電荷を持つ。また、これに限定はされないが、通常は、ポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレン、ポリスチレン、セルロース、セフ
ァデックス、デキストラン、シクロデキストリン、ペプチドおよびポリアクリル
アミドのような重合体である。これらの質量修飾タグは、その生体分子量の寄与
率およびイオンの性質に基いて選択される。これらの質量修飾タグは、標的核酸
の２' −Ｏ−、３' 末端、５' 末端、もしくは糖リン酸バックボーンに沿った位
置などの一箇所、もしくは複数の個所において生体巨大分子に付加されるが、こ
れに限定されない。合成オリゴヌクレオチド５' 末端への質量修飾タグの付加は
、従来のホスホラミダイトの化学的性質や、その他の従来の化学的性質を用いた
方法、もしくは、生化学的手段や酵素による方法のどちらでも実現された。この
ような核酸の質量修飾タグは、従来の手動技法もしくは自動化された技法のどち
らでも達成できる。あるいは、質量修飾タグの付加は、適切に修飾された重合体
もしくは核酸の固相合成のためのＣＰＧ担体を用いて、３' 末端においても達成
できる。３' 末端における質量修飾は、生化学的手段もしくは酵素的手段によっ
ても遂行できる。核酸のヌクレオチド間結合への質量修飾タグの付加も可能であ
る。これは、適切に修飾されたホスホラミダイト、もしくは核酸合成の間に他の
ヌクレオシドが作るブロックの使用により、遂行できる。あるいはヌクレオチド
間結合の合成後の修飾によっても可能である。さらに、核酸標的の質量修飾タグ
の付加は、核酸のすべての部位においてニ機能リンカーの使用によっても達成で
きる。同様に、生体分子標的の他のクラスと連携する場合、これらの生体分子の
一箇所もしくは複数箇所において同じように質量修飾タグを組み入れることがで
きる。後に明らかにするが、同位体の質量ラベルの標的もしくはリガンドを含め
ることも有益である。
【０２９９】 このように、類似した核酸および他の生物学的標的は、本発明の方法によって
迅速な質量分析を行うために区別をつけてタグをつける。小さな分子量のコンビ
ナトリアルライブラリーの混合物である複数の核酸標的のスクリーニングをこの
多重化されたスクリーニングで行い、非共有結合複合体が観察された場合、四重
極子、イオントラップ、ＩＣＲ、磁気セクター、もしくはＴＯＦなど、およびそ
れに続くＭＳ／ＭＳのような従来の質量分析器によって、成分リガンドおよび生
体分子が迅速に同定される。これは、質量修飾タグが、質量分析では異なるが電
荷は類似する各標的生体分子リガンド錯イオンから発生する信号のｍ／ｚ（質量
／電荷率）を作成し、これによって明確に分かれたイオンピークが得られるから
である。質量重複とピークオーバーラップは質量修飾タグの使用により回避され
る。
【０３００】 本発明は、ＲＮＡなどの核酸の分子相互作用部位と交互作用を行うリガンド同
定のための他の技術との組み合わせにおいても非常に有用である。ＲＮＡにある
分子相互作用部位は、ＲＮＡの機能の中でも非常に重要であると考えられている
。分子相互作用部位のヌクレオチド配列は非常によく保持されており、多種多様
な種の間でさえ保持されている。さらに、このような分子相互作用部位は特異な
構造を持っており、これによってリガンド結合の機会を得る。各リガンド結合の
相対的親和性および特異性を決定することと同様に、どのリガンドがこの部位に
結合するか確認することにより、治療薬、農薬、工業用化学薬品などの薬剤発見
のためのリード化合物が得られる。
【０３０１】 本件の質量分析技法、特にＭＡＳＳ技法およびそれらに類似した分析的な強さ
と力を持つ技法は、薬剤などの発見および分子相互作用部位へ結合するリガンド
の決定のような、同定プログラムとの組み合わせに理想的に適応している。ＲＮ
Ａなどの核酸の分子相互作用部位同定、およびこのような分子相互作用部位と結
合しやすい分子リガンドの階層決定は、本件の技法によって評価できる。このよ
うに、本発明の好適な態様のとおり、あるＲＮＡの分子相互作用部位への結合に
ついて予想もしくは算出されたリガンドの尤度に従いリガンド階層が評価され、
リガンドが実際に合成された。このような合成は、自動化もしくはロボット化さ
れた方法において果たされるのが望ましく、評価されたリガンド階層へ参加にお
いて提供された命令セットで達成されることが望ましい。本件の質量分析法は複
数個の化合物を評価し、同時に化合物のＲＮＡのある複合体も評価するので、化
合物はライブラリーもしくは混合物の中で調製することができる。
【０３０２】 リガンドの合成後（合成はライブラリー法が望ましい）、これらのリガンドを
関連のある分子相互作用部位を持つＲＮＡと接触させる。錯化もしくは結合（慣
習的に、非共有結合）を生じさせることができる。次に質量分析によって複合型
のＲＮＡリガンドライブラリーを分析する。分析の主な目的は、どのリガンドが
ＲＮＡ分子相互作用部位へ結合し、また、リガンドの間でどのリガンドが特異性
および親和性の点でより高い評価を持つか決定することであることが望ましい。
その結果、化合物の混合物もしくは化合物のライブラリーから、どの化合物が特
定の分子相互作用部位に対して、修飾のために最も交互作用的であるか同定する
ことができる。このような化合物はそれ自身を利用することもできる。また、薬
剤、農薬、環境用化学薬品、工業用化学薬品、食品用化学薬品などへ構造を変え
るためのリード化合物としての利用もさらに有望である。
【０３０３】 これまで述べたように、既に分子相互作用部位に作用する可能性があると予想
あるいは算出されている化合物のライブラリーに対して交互作用部位を持つＲＮ
Ａを調べることは、非常に望ましい。このような分子は評価された階層に所属し
、標的ＲＮＡの分子の中で高い潜在性を持つ分子発見に最も高い可能性を持つと
期待される。 ＲＮＡや他の生物分子の分子相互作用部位と交互作用する可能性を持つ化合物
の同定には多くの方法があるが、提出した方法論は、米国出願番号 ０９／０７
６，４４０、０９／０７６，４０５、０９／０７６，４４７、０９／０７６，２
０６、０９／０７６，２１４、および０９／０７６，４０４、に記載されており
、いずれも１９９８年５月１２日に出願され、本発明の譲受人に譲渡された。前
述の出願の全てを参照として、完全な形でここに加える。
【０３０４】 前述の一般的に所有されている発明の技法と組み合わせた場合に、特に有用な
一つの質量分析法によって、ＲＮＡ標的に対するリガンドの特異性および親和性
が決定できる。ＭＡＳＳ（複数標的親和性／特異性スクリーニング）技法により
、核酸、特にＲＮＡの分子相互作用部位に対するリガンドの特異性および親和性
分析のための高処理能力スクリーニング法を得ることができる。ＭＡＳＳでは、
高性能エレクトロスプレーイオン化・フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴・
質量分析（ＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ）を用いて、ａ）コンビナトリアルライブ
ラリー起源の選択された親和性リガンドの組成の決定、ｂ）標的に複合したリガ
ンド相対解離定数（Ｋｄ）の決定、およびｃ）リガンドの位置決定、を行う。こ
の情報は各標的もしくはライブラリーセットから１回の分析で１５分以内に集め
られる。エレクトロスプレーイオン化処理の「柔かい」性質によって、特異的非
共有結合複合体はイオン化され、損なわれないまま気相に移行することができ、
続いて、イオン化された複合体は、気相で質量分析による性質決定が行える。Ｆ
ＴＩＣＲプラットフォームが提供する高い分解能は、複合混合物の性質決定を促
進する。この複合混合物の性質決定は、ＦＴＩＣＲに備わる高い質量精度と組み
合わせられ、分子相互作用部位や標的部位もしくは標的と複合したリガンドの明
白な同定を提供する。
【０３０５】 遊離標的および複合標的の気相断片化パターンと絶対的結合親和性を比較し、
結合部位の情報を得ることができる。一方、内部標準として既知のＫｄを持つ複
合体を使用することにより、複合体の相対存在度から相対結合定数を引き出せる
。標的ＲＮＡの分子相互作用部位に対するリガンドの特異性と親和性の知識によ
って、そのＲＮＡ修飾に望ましいリード化合物もしくは最終化合物が決定される
。このようなＲＮＡ修飾によって利を受ける治療薬、農薬、工業化学製品などの
生産物は、この結果に伴うものである。
【０３０６】 分子量が同じで、配列の異なる２個の核酸標的に対する質量７００〜７５０の
コンビナトリアルライブラリーの同時スクリーニングは、質量修飾タグを用いて
実証される。両方の調査対象核酸標的が質量８９２７の２７メルＲＮＡである場
合、質量７００〜７５０の分子のライブラリースクリーニングは２個の核酸とラ
イブラリーの混合物の質量分析において、非共有結合錯イオンの困惑を招くよう
ながらくたをもたらす可能性がある。しかし、２個の標的のうち１個が質量修飾
されていた場合、例えば、質量３５７５のＰＥＧ鎖を標的の５' 末端に付加した
場合、質量スペクトルは極めて単純化される。２７メルはエレクトロスプレーイ
オン化後、多重電荷イオン信号を発し、（Ｍ−６Ｈ）6-、（Ｍ−５Ｈ）5-、およ
び（Ｍ−４Ｈ）4-の電荷状態における、それぞれの質量／電荷値は１４８６．８
、１７８４．４、および２２３０．８であることが分かっている。質量７００〜
７５０の低分子に結合する場合、非修飾ＲＮＡリガンド複合体は、１６０３．２
〜１６１１．６、１９２４．４〜１９３４．４、および２４０５．８〜２４１８
．３ のｍ／ｚ範囲で生じると予測される。第２番目の標的が全く修飾されない
場合、複合体からの信号は、同じ領域で発生する。しかし、質量３５７５のＰＥ
Ｇ鎖を負った質量修飾ＲＮＡを用いると、対応する質量修飾ＲＮＡリガンド複合
体は２１９９〜２２０７．４、２６３９〜２６４９、および３２９９〜３３１１
のｍ／ｚ範囲で生じ、観察されることになる。こうして、第２番目の質量修飾核
酸からの信号はすべて、第１番目のＲＮＡから明白に分離される。先に述べたよ
うに、これらの非共有結合錯イオンは、例えば三連四重極子・イオントラップも
しくはＩＣＲ法によって選択され、さらにリガンド−ＲＮＡ交互作用部位および
その交互作用の性質の詳細を提供するため、ＭＳ／ＭＳによって調査される。
【０３０７】 さらなる態様では、本発明による方法がリガンドと生体分子標的の間の結合交
互作用の特異性決定に適用できることを示す。本発明の方法を用いた、１個もし
くは２個の化合物に対する複数生体分子的同時スクリーニングによって、リガン
ドが特異的にただ一つの標的生体分子に結合するか否か、もしくは、標的で観察
された結合がコントロール生体分子群で同様に再現され、ゆえに非特異的である
か否かを確認することができる。これは、大きなライブラリーおよび化合物の大
きな集合をスクリーニングする場合に行われる重要な識別である。生体分子標的
に対して選択的もしくは特異的であるリガンドと、非特異的で他標的および全標
的に結合するリガンドを迅速に識別することが望ましい。薬剤発見においては、
望ましくない生物活性が、無関係の生体分子への無差別の非特異的な分子結合に
よって生じることが非常に多い。本発明は、リガンドと標的パネル間交互作用の
特異性分析のために有益で簡単な技法となる。
【０３０８】 複数生体分子標的の同時スクリーニングのために質量修飾タグを用いることは
、リガンドの結合特異性決定にも同様に適用できる。質量修飾タグは、特異的生
体分子標的と対照させる個々の化合物のコンビナトリアルライブラリーのスクリ
ーニングおいて、コントロールパネルとして役立つ様々な生体分子標的の識別に
利用できる。本発明の質量分析法を使用した複数の生体分子標的同時スクリーニ
ングの場合、結合リガンドのある各標的とその複合体から生じるイオンの良好な
分別の保証が必要である。このピークの重複は異なる質量修飾タグを異なる調査
対象生体分子標的にたやすく導入することで容易に排除できる。生体分子標的お
よびコントロールパネルの混合物を評価されるリガンドに混ぜ合わせる。この溶
液は次にＥＳＩ−ＭＳによってイオン化される。観察された非共有結合錯イオン
は、混合物中にある様々な生体分子標的由来の一つの特異的標的にリガンドが結
合することで生じたものであると直ちに同定される。この方法においては、コン
トロール生体分子に対比させた場合の望ましい標的の結合の特異性もしくは選択
性の定性的指標を得ることができる。この選択性は、既知の結合親和性の適切な
基準の使用、およびそのリガンドのある生体分子錯イオン存在度を標準生体分子
の存在度と比較することによっても定量できる。さらに、異なる生体分子に対す
るリガンドの特異的もしくは非特異的交互作用の詳細な性質を、前述のとおり、
次のイオン選択およびそれに続くＭＳ／ＭＳ実験によって得ることができる。
【０３０９】 同様に、本発明の方法を用いて、複数の生体分子標的の比例的結合を決定でき
る。このように、異なる生体分子標的上の適切な質量修飾タグの使用により、リ
ガンドの差別的結合を介して形成された異なる非共有結合複合体は、質量分析の
中で直ちに識別される。これらのイオンの存在度測定により、結合は定量化でき
る。これらイオンの相対存在度の比較は、異なる生体分子標的に対するリガンド
の比例的結合を決定する手段となる。
【０３１０】 さらに、本発明は他に、起点の異なる生体分子標的に対するリガンドの差別的
な結合の決定に適用できる。ＲＮＡ標的に対する低分子リガンドの結合を調査す
る場合、２個の異なるＲＮＡ標的に対する結合から生じた非共有結合リガンド−
ＲＮＡ複合体の識別は簡単であり、同じ分析中の混合物として両方が同時にスク
リーニングされる場合でさえそうである。加えて、あるＲＮＡと別のＲＮＡを対
比させた場合の、リガンドの特異性と選択性の決定もできる。また、各ＲＮＡ標
的への結合の相対的親和性も決定できる。
【０３１１】 本発明の方法は、これらに限定されないが、ペプチド、タンパク質、受容体、
抗体、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、核
酸、修飾オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）、オリゴ糖、炭水化物
、グリコペプチドなどの広範な生体分子標的の調査に適用できる。さらに、これ
らの生体分子標的は自然原料から合成もしくは分離できる。自然由来の生体分子
標的には、これらに限定されないが、微生物、植物、動物、ウイルス、などから
得たものがあり、また、これらに限定されないがヒトの構成材料である、細胞、
細胞抽出物、体液、組織、および器官などから得たものがある。
【０３１２】 本発明の方法を使用してスクリーニングされた分子には、これらに限定されな
いが、大から小に至る分子量を持つ個々の有機化合物もしくは無機化合物、およ
びコンビナトリアル混合物もしくはリガンドライブラリー、阻害剤、アゴニスト
、アンタゴニスト、基質、およびペプチド、オリゴヌクレオチドのような生体巨
大分子などがある。
【０３１３】 コンビナトリアル混合物には、これらに限定されないが、化合物の集合および
化合物のライブラリーなどがある。これらの混合物は混合物の結合合成、もしく
は個々の化合物の混合によって生成することができる。化合物の集合には、これ
らに限定されないが、個々の化合物のセット、もしくは混合物のセット、もしく
は化合物のプールなどがある。これらのコンビナトリアルライブラリーは、合成
原料から、あるいは例えば微生物、植物、海生、ウイルス、動物などの自然原料
から得た。コンビナトリアルライブラリーには少なくともおよそ２０の化合物お
よび何千もの個々の化合物があり、もっと多い可能性がある。コンビナトリアル
ライブラリーが化合物の混合物である場合、これらの混合物は、通常２０から５
０００の化合物を含む。望ましいのは５０〜１０００の化合物であり、５０〜１
００の化合物を含むのがより望ましい。１００〜５００化合物の結合は５００〜
１０００の個々の種を所有する混合物であるので有用である。コンビナトリアル
ライブラリーのメンバーは約５０００Ｄａ以下の分子量である。
【０３１４】 本発明の方法で使用される質量分析技法は、ここに述べたすべての技法および
システムもしくは、それに続いて開発される技法およびシステムを含む。タンデ
ム型の技法も有用であり、前述した全ての技法の組み合わせおよびＬＣ／ＭＳを
含んでいる。本発明の方法を用いた質量分析は単式四重極、三連四重極子、磁場
形、飛行時間形機器およびＦＴＩＣＲなどである。今後、質量分析に対する修飾
は、ここにある有用な技法の改良をもたらすと期待される。
【０３１５】 本発明の別の態様では、アミノグリコシド混合物の結合によって、同じ長さお
よび類似（もしくは同一）分子量を持つ複数のＲＮＡを同時に測定できる。中性
の質量タグをＲＮＡ標的の一つに添付すると、ＲＮＡ標的はより高い質量／電荷
率へと移動する。そこでは、低分子を持つ複合体の明確な定量が可能である。適
切に配置された中性のタグはＲＮＡリガンド結合を変化させない。この方法は原
核および真核の小サブユニットｒＲＮＡの解読領域に対応するモデルＲＮＡ、お
よび例えば５アミノグリコシドのような化合物の混合物で実証されるのが望まし
い。後に示す例では、複合体はアミノグリコシドライブラリーと原核のｒＲＮＡ
モデルの間で観察されたが、質量タグを付けた真核細胞ｒＲＮＡモデルへのアミ
ノグリコシド結合は観察されなかった。差別的結合データは、ネオマイシンクラ
スアミノグリコシドの侵入および結合を防止する原核Ａ部位ｒＲＮＡと比較した
別の確証を持つ真核細胞Ａ部位ｒＲＮＡと一致した。中性質量標的を付けた巨大
分子標的の質量分析は、新しい高い処理能力の範例となる。この分析では、低分
子の集合に対する複数標的の交互作用が平行して評価される 。
【０３１６】 ここで使用した好ましいモデルシステムは、５個の２−デオキシストレプタミ
ンアミノグリコシド抗体から成るライブラリーを擁する。この２−デオキシスト
レプタミンアミノグリコシド抗体は約２８ｎＭから約１．５ｍＭにわたる原核お
よび真核リボソームの解読部位に対する結合親和性域を持つ。図１４９は１６Ｓ
および１８Ｓ ｒＲＮＡ 解読部位の２７−ヌクレオチドモデルの二次構造を説
明する。これらの構造物は非正準Ｕ−ＵおよびＵＵＣＧテトラループに近い膨隆
アデノシン残基に隣接するプリンアデノシン不適正塩基対を含む７塩基対幹構造
から成る。１６Ｓとパロモマイシンの複合体のＮＭＲ調査では、ＲＮＡが一次水
素結合、静電およびアミノグリコシドと接触するスタッキングを作ることが示さ
れ（Ｆｏｕｒｍｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９６年、２７４号、１３６７〜１３
７１ページ）、また、Ａ−Ａ塩基対および単一膨隆アデニンによって作られたポ
ケット内のモデルＡ−部位ＲＮＡの主要な溝にパロモマイシンが結合することが
示された。２個のＲＮＡモデルは１５．０１１Ｄａのみ異なり、これらの構造の
（Ｍ−５Ｈ+ ）5- 種は３ｍ／ｚ単位のみ異なる。ＦＴＩＣＲ質量分析の高い分
解能によってこれらの種は分解可能であるが、両方のＲＮＡを含む溶液の質量分
析は、遊離ＲＮＡおよびそれらのナトリウム付加種とカリウム付加種からの信号
における重複によって複雑になる。
【０３１７】 １６Ｓおよび１８Ｓ ＲＮＡからの信号間の重複のために生じる質量分析にお
ける付随信号の分離を進める方法をここに述べる。５' 末端に結合させた付加無
電化機能グループによって修飾されたＲＮＡ標的が合成されている。この合成修
飾をここでは中性質量タグと呼ぶ。質量タグ付き巨大分子の質量の変化、および
それに付随するｍ／ｚの変化は、タグ付けされたＲＮＡからの信号群を質量分析
の分解領域へと移動させる。 未タグ１６Ｓおよび未タグ１８Ｓによる低分子のコンビナトリアルライブラリ
ー同時スクリーニングは、複合物が１６Ｓより高い５１５．０１１Ｄａで観察さ
れる時、その複合物が１６Ｓ標的に複合する５１５．０１１Ｄａのリガンドであ
るか、または１８Ｓに複合する５００．０００ダルトンのリガンドであるかを（
タンデム型ＭＳ法なしで）直ちに決定することはできない。さらに、正電荷され
たリガンドは、ＲＮＡオリゴマーと非特異的交互作用を持つことができるので、
特異的結合および非特異的結合のためのライブラリーの、単一のＥＳＩ−ＭＳ実
験での複数ＲＮＡ標的の同時スクリーニングによる分析は、望ましいことが多い
（例えば構造化標的配列および非構造化コントロール配列）。この多重化効果は
、類似あるいは同一質量の複数のＲＮＡ標的をライブラリー分析する必要がある
ＲＮＡ薬剤発見領域をさらに開拓できる。２００の化合物のコンビナトリアルラ
イブラリーで５個のＲＮＡ標的をスクリーニングする単一分析は、単一質量分析
の取得からの１０００ＲＮＡ−リガンド交互作用の直接評価を促進する。
【０３１８】 密接に関連する巨大分子のｍ／ｚ範囲を変化させる能力は、先に述べたとおり
非常に望ましいが、質量タグが標的の主要な物理的性質もしくはリガンド結合性
質を変化させないことが望ましい。ＲＮＡオリゴマーの５' 末端にホスホジエス
テル結合を介して付加された１８−原子質量タグ（Ｃ12Ｈ25Ｏ9 ）の使用が望ま
しい。この質量タグはオリゴヌクレオチド溶解性、イオン化効率、紫外線吸収度
に対して感知できる影響を持たず、ＲＮＡ−リガンド結合を変化させない。この
後者の特性は、図１５０のデータ、すなわち原核の競合的結合状態下の微生物解
読部位タグＲＮＡモデルとタグを付けていないＲＮＡモデルに対する遊離：結合
の保存比率を説明したデータで証明している。
【０３１９】 アミノグリコシド抗生物質は、必須の原核ＲＮＡ−タンパク質交互作用および
ＲＮＡ−ＲＮＡ交互作用を阻害することによって、細菌成長を阻害する。生体内
実験では、パロモマイシンが原核における必須ＲＮＡ交互作用を変化させるので
（高い親和性を持つ１６Ｓ Ａ−部位の結合による）治療的効果が実現される。
しかし、真核細胞ＲＮＡ複合体の機能をかなり阻害する（１８Ｓ Ａ部位に対す
るパロモマイシンの低い親和性による）。１６Ｓと１８ＳのＡ部位の両方に同じ
ような親和性をもって結合する化合物は、細菌成長を阻害しやすいが、真核細胞
において有害な細胞障害性効果を持つ場合もあり、適切な治療薬にならないこと
があった。このように、１６Ｓ／１８Ｓ モデルＲＮＡシステムは新世代抗生物
質にとって興味深い標的として役に立つだけでなく、ＲＮＡ−リガンド親和性分
析を基にした我々の質量分析にとって、特徴ある調節機器の役割を果たす。
【０３２０】 図１５１に示したＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ質量分析は、等モルの５アミノグリコシ
ドのあるところで、タグを付けていない１６Ｓおよびタグ１８Ｓの１０ｍＭ混合
物から取得した。このアミノグリコシドは２つのクラスの２デオキシストレプタ
ミン、すなわちそれぞれ５００ｎＭである ４，５−二置換（パロモマイシンお
よびリビドマイシン）、および４，６−二置換（トブラマイシン、シソマイシン
およびベカナマイシン）から選ばれた。個々のアミノ酸配糖体の１：１結合に対
応する複合体は１６５Ｓとアミノ酸配糖体混合物の全メンバーとの間で観察され
、実質的には異なるそれぞれの化合物の存在度から推定される明白な親和性を持
っている。パルモマイシン（ｍ／ｚ １９９５．５７２）およびリビドマイシン
（ｍ／ｚ １９５４．７９０）を持つ複合体からの信号強度は、ＭＳで測定した
解離定数、それぞれ１１０ｎＭおよび２８ｎＭと一致した。トブラマイシン（ｍ
／ｚ １８９５．９６０）、ベカナマイシン（ｍ／ｚ １８９９．１７１）、お
よびシソマイシン（ｍ／ｚ １８９１．９７２）を持つ１６Ｓ複合体の信号強度
は減少し、溶液解離定数 〜１．５ｍＭと一致した。Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ １９９７年、３６号、７６８〜７７９ページ。ゆえに、これらの
分析条件下では、ＭＳで観察されるイオン存在度は、溶液解離定数を反映する。
図１５１にある図は各複合体の同位体エンベロープを分離する能力を示し、また
、この図により同一同位体種からの質量差算出が可能である。したがって、ＲＮ
Ａ標的とＲＮＡ−リガンド複合体との間のｍ／ｚ差の測定により、リガンドの正
確な質量決定が可能になる。スペクトルは、遊離ＲＮＡの（Ｍ−５Ｈ+ ）5-およ
び（Ｍ−４Ｈ+ ）4- の電荷状態という複数の同位体ピークを、複合体が観察さ
れるｍ／ｚ範囲を一括する内部質量標準として用いて換算する。図１５１にある
複合体について求めた平均質量測定誤差は、２．１ｐｐｍである。これは１６Ｓ
と各複合体との間の最も大きい（４ 13Ｃ）同位体ピークのｍ／ｚ差を測定した
場合の平均質量測定誤差である。この換算後の図式は容易に自動化され、高速処
理法により複数の標的について、選択された結合性の迅速で高精度の質量測定が
可能になる。
【０３２１】 １６Ｓに対するパロモマイシンの親和性に関連して、１６Ｓに対するリビドマ
イシンの亢進した親和性は興味深い。リビドマイシンは１６Ｓリボソームサブユ
ニットに結合すると考えられるが、交互作用の正確な部位は証明されていない。
リビドマイシンは、パロモマイシンと比べると二つの著しい差異がある。第１に
、付加されたマンノピラノシルリングはＲＮＡと接触する新しい巨大分子を生成
することができる。しかし、パロモマイシンリングＩＶの配向は、１６Ｓのある
複合体のＮＭＲ由来の構造において障害される。さらに、Ａ１４９２との接触を
作るリングＩ上のヒドロキシル基が失われる。１６Ｓ−リビドマイシン複合物の
比較的高い存在度は、リビドマイシンが１６Ｓ Ａ部位、もしくはその近くに結
合し、結合親和性をほぼ４倍に亢進することを示唆する。おそらく、図１５１に
あるスペクトラムの最も著しい特徴は、１８Ｓとパロモマイシンもしくはリビド
マイシンとの間の複合体の完全な欠如である。この結果により、形状が不良であ
り、且つアミノグリコシド４，５ニ置換２−ＤＯＳクラスと解読部位真核リボソ
ームの保存構造との間の静電相補性が不良であるにちがいないことが示唆しされ
る。
【０３２２】 このようにして、本発明に従い、質量分析を用いた標的とリガンド間の結合測
定のため、類似した（もしくは同一の）分子量を持つＲＮＡ標的に、中性低分子
によってタグを付けることができる。リガンド混合物に対する複数標的の同時ス
クリーニングによって、分析の情報内容は増強され、その結果、必要であった多
くの分析が劇的に減少した。複数の基質／リガンド混合物では複雑さが増し質量
分析器に高い要求が課されるが、ここに述べた方法によって、同一の溶液状態下
およびリガンド濃度下で、多くの標的の同時分析が容易にできる。さらに、スク
リーニング方法の高い処理能力性は増強され、親密に関連する標的との結合親和
性の直接比較が可能になる。この「合理的な」標的デザインの概念は、アミノ酸
配列の異なるタンパク質の調査にも当然適用できる。
【０３２３】 本発明は、２４ヌクレオシド以上７０ヌクレオシド以下の結合配列を含み、且
つ二次構造を持つ核酸も対象にしている。この二次構造は、第１二重鎖領域の第
１部位を形成する３個のヌクレオチド、内部ループ領域の第１部位を形成する２
個のヌクレオチド、第２二重鎖領域の第１部位を形成する４個のヌクレオチド、
末端ループ領域を形成する４個または５個のヌクレオチド、第２二重鎖領域の第
２部位を形成する４個のヌクレオチド、内部ループ領域の第２部位を形成する４
個のヌクレオチド、および第１二重鎖領域の第２部位を形成する３個のヌクレオ
チドによって定義される二次構造である。核酸は、７０ヌクレオチド、６５ヌク
レオチド、６０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、もしくは
３０ヌクレオチドまでであることが望ましい。
【０３２４】 好適な態様では、内部ループ領域の第１部位を形成する２個のヌクレオチドが
配列ＮＣである。他の好適な態様では、第２二重鎖領域の第１部位を形成する４
個のヌクレオチドが配列ＮＮＮＮであり、第２二重鎖領域の第２部位を形成する
４個のヌクレオチドは配列ＮＡＮＮである。他の望ましい態様では末端ループ領
域を形成する４個または５個のヌクレオチドは、配列ＮＮＮＵＮもしくはＮＮＵ
Ｎである。核酸はビメンチンＲＮＡのタンパク質を含むことが望ましく、ビメン
チンｍＲＮＡの３' ＵＴＲのタンパク質を含んでいることがさらに望ましい。
【０３２５】 他の好適な態様では、核酸断片は共通配列ＮＮＮＮＣＮＮＮＮＮＮ（もしくは
欠如）ＮＵＮＮＡＮＮＮＮＮＮＮＮを含み、第１二重鎖領域、内部ループ領域、
第２二重鎖領域、および末端ループ領域を持つ核酸断片である。他の好適な態様
では、機械内実験で、二つ以上の種を横断して保存された核酸断片表現は、共通
配列ＮＮＮＮＣＮＮＮＮＮＮ（もしくは欠如）ＮＵＮＮＡＮＮＮＮＮ ＮＮＮを
含む。他の好適な態様では、精製および分離された複数の種を横断して保存され
た核酸断片は、配列ＮＮＮＮＣＮＮＮＮＮＮ（もしくは欠如）ＮＵＮＮＡＮＮＮ
ＮＮＮＮＮを含む核酸断片である。他の好適な態様では、精製および分離された
核酸断片は、ヒト配列ＵＵＵＡＣＡＡＣＡＵＡＡＵＣＵＡＧＵＵＵＡＣＡＧＡＡ
ＡＡＡＵＣを含む核酸断片である。他の好適な態様では、機械内実験での核酸断
片表現はヒト配列ＵＵＵＡＣＡＡＣＡＵＡＡＵＣＵＡＧＵＵＵＡＣＡＧＡＡＡＡ
ＡＵＣを含む。
【０３２６】 本発明は上記の精製および分離された核酸も対象にしている。さらに本発明は
上記の機械内実験における核酸も対象にしている。 本発明は４１以上７０以下の結合配列を含み、且つ２次構造を持つ核酸も対象
にしている。この二次構造は第１二重鎖領域の第１部位を形成する３個のヌクレ
オチド、第１内部ループ領域の第１部位を形成する３個のヌクレオチド、第２二
重鎖領域の第１部位を形成する５個または６個のヌクレオチド、第２内部ループ
領域の第１部位を形成する１個から３個のヌクレオチド、第３二重鎖領域の第１
部位を形成する４個のヌクレオチド、末端内部ループ領域を形成する４個から６
個のヌクレオチド、第３二重鎖領域の第２部位を形成する４個のヌクレオチド、
第２内部ループの第２部位を形成する１個のヌクレオチド、および第２二重鎖領
域の第２部位を形成し随意的に単一のヌクレオチド膨隆を持つ６個のヌクレオチ
ド、第１ループ領域の第２部位を形成する７個または９個のヌクレオチド、およ
び第１二重鎖領域の第２部位を形成する３個のヌクレオチドによって定義される
二次構造である。この核酸は７０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、６０ヌクレ
オチド、もしくは５０ヌクレオチドまでであることが望ましい。
【０３２７】 好適な態様では、第１二重鎖領域の第１部位を形成するヌクレオチドは配列Ｎ
ＮＮであり、第１二重鎖領域の第２部位を形成するヌクレオチドは配列ＵＵＮで
ある。他の好適な態様では、第１内部ループ領域の第１部位を形成するヌクレオ
チドは配列ＮＡＮである。他の好適な態様では、第１内部ループ領域の第２領域
を形成するヌクレオチドは配列ＧＧＡＡＡＣＵＮＮもしくはＧＧＡＡＡＣＵであ
る。他の好適な態様では、第２二重鎖領域の第１部位を形成するヌクレオチドは
配列ＡＵＧＧＧＮもしくはＡＵＧＧＧであり、随意的に膨隆を持つ第２二重鎖領
域の第２部位を形成するヌクレオチドは配列ＵＣＣＵＡＵである。他の好適な態
様では、第２内部ループ領域の第１部位を形成するヌクレオチドは配列ＮＮＵも
しくはＵである。他の好適な態様では、第２内部ループ領域の第２部位を形成す
るヌクレオチドはＵである。他の好適な態様では、第３二重鎖領域の第１部位を
形成するヌクレオチドは配列ＣＡＣＡであり、第３二重鎖領域の第２部位を形成
するヌクレオチドはＵＧＵＧである。
【０３２８】 他の好適な態様では、末端ループを形成するヌクレオチドは配列ＮＮＵＡＮＣ
もしくはＮＮＵＡＣである。この核酸はオルニチン脱炭酸酵素ＲＮＡの一部分を
含むことが望ましく、オルニチン脱炭酸酵素ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部分であ
ることがさらに望ましい。 他の好適な態様では、核酸は共通配列ＮＮＮＮＡＮＡＵＧＧＧＮ（または欠如
）Ｎ（または欠如）Ｎ（または欠如）ＵＣＡＣＡＮＮＵＡＮ（または欠如）ＣＵ
ＧＵＧＵＵＣＣＵＡＵＧＧＡＡＡＣＵＮ（または欠如）Ｎ（または欠如）ＵＵＮ
を含み、第１二重鎖領域、第１内部ループ領域、第２二重鎖領域、第２内部ルー
プ領域、第３二重鎖領域、および末端ループ領域を持つ核酸である。他の好適な
態様では、精製および分離された核酸断片はヒト配列ＵＡＧＧＡＵＡＵＧＧＧＵ
ＣＡＣＡＣＵＵＡＵＣＵＧＵＧＵＵＣＣＵＡＵＧＧＡＡＡＣＵＡＵＵＵＧを含む
核酸断片である。他の好適な態様では、精製および分離された核酸断片はマウス
配列ＵＡＧＧＡＧＡＵＧＧＧＧＧＵＣＡＣＡＣＵＵＡＣＵＧＵＧＵＵＣＣＵＡＵ
ＧＧＡＡＡＣＵＵＵＧを含む核酸断片である。他の好適な態様では、精製および
分離された核酸断片はラット配列ＵＡＧＧＡＧＡＵＧＧＧＧＧＧＵＣＡＣＡＣＵ
ＵＡＣＵＧＵＧＵＵＣＣＵＡＵＧＡＡＡＣＵＵＵＵＧを含む核酸断片である。 本発明は前述の精製および分離された核酸も対象にしている。さらに、本発明
は前述の機械内実験における核酸も対象にしている。
【０３２９】 本発明は２６以上７０以下のヌクレオチドの結合配列を含み、且つ二次構造を
持つ核酸も対象にしている。この二次構造は、第１二重鎖領域の第１部位を形成
する５個または６個のヌクレオチド、内部ループ領域の第１部位を形成する１個
から３個のヌクレオチド、第２二重鎖領域の第１部位を形成する４個のヌクレオ
チド、末端ループ領域を形成する４個から６個のヌクレオチド、第２二重鎖領域
の第２部位を形成する４個のヌクレオチド、内部ループ領域の第２部位を形成す
る１個のヌクレオチド、および第１二重鎖領域の第２部位を形成し随意的に単一
ヌクレオチド膨隆を持つ６個のヌクレオチドによって定義される二次構造である
。また、この核酸は７０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、
５０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、もしくは３０ヌクレオチドまでであるこ
とが望ましい。
【０３３０】 好適な態様においては、第１二重鎖領域の第１部位のヌクレオチドは配列ＡＵ
ＧＧＧＮまたはＡＵＧＧＧであり、随意的に膨隆を持つ第１二重鎖領域の第２部
位を形成するヌクレオチドは配列ＵＣＣＵＡＵである。他の好適な態様において
は、内部ループ領域の第１部位を形成するヌクレオチドは配列ＮＮＵまたはＵで
ある。他の好適な態様においては、内部ループ領域の第２部位を形成するヌクレ
オチドはＵである。他の好適な態様においては、第２二重鎖領域の第２部位を形
成するヌクレオチドは、配列ＣＡＣＡであり、第２二重鎖領域の第２部位を形成
するヌクレオチドはＵＧＵＧである。他の好適な態様においては、末端ループ領
域を形成するヌクレオチドは配列ＮＮＵＡＮＣまたはＮＮＵＡＣである。この核
酸はオルニチン脱炭酸酵素ＲＮＡの一部分を含むことが望ましく、オルニチン脱
炭酸酵素ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部分であることがさらに望ましい。
【０３３１】 他の好適な態様においては、核酸は共通配列ＡＵＧＧＧＮ（または欠如）Ｎ（
または欠如）Ｎ（または欠如）ＵＣＡＣＡＮＮＵＡＮ（または欠如）ＣＵＧＵＧ
ＵＵＣＣＵＡＵを含み、第１二重鎖領域、内部ループ領域、第２二重鎖領域、お
よび末端ループ領域を持つ核酸である。精製および分離された核酸断片はヒト配
列ＡＵＧＧＧＵＣ ＡＣＡＣＵＵＡＵＣＵＧＵＧＵＵＣＣＵＡＵを含む核酸断片
である。他の好適な態様においては、精製および分離された核酸断片はマウス配
列ＡＵＧＧＧＧＧＵＣ ＡＣＡＣＵＵＡＣＵＧＵＧＵＵＣＣＵＡＵを含む核酸断
片である。他の好適な態様では、精製および分離された核酸断片はラット配列Ａ
ＵＧＧＧＧＧＧＵＣＡＣ ＡＣＵＵＡＣＵＧＵＧＵＵＣＣＵＡＵを含む。
【０３３２】 本発明は前述の精製および分離された核酸も対象にしている。さらに、本発明
は前述の機械内実験における核酸も対象にしている。 本発明はまた１７以上７０以下の結合ヌクレオチドを含み、且つ二次構造を持
つ核酸を対象にしている。この二次構造は、二重鎖領域の第１部位を形成する５
個のヌクレオチド、末端ループ領域を形成する７個のヌクレオチド、およびこの
二重鎖の第２部位を形成する５個のヌクレオチドによって定義される二次構造で
ある。この核酸は７０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、５
０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、もしくは２０ヌクレオ
チドまでであることが望ましい。
【０３３３】 好適な態様では、二重鎖領域の第１部位を形成するヌクレオチドは配列ＣＡＡ
ＧＮ、ＣＡＡＧＣ、もしくはＣＡＡＧＵであり、二重鎖領域の第２部位を形成す
るヌクレオチドは配列ＧＣＵＵＧである。他の好適な態様では、末端ループ領域
を形成するヌクレオチドは配列ＮＵＵＵＮＵＡ、ＧＵＵＵＧＵＡ、ＡＵＵＵＧＵ
Ａ、もしくはＡＵＵＵＡＵＡである。他の好適な態様では、二重鎖領域の第２部
位を形成するヌクレオチド配列はＧＣＵＵＧである。この核酸はオルニチン脱炭
酸酵素ＲＮＡの一部分を含むことが望ましく、オルニチン脱炭酸酵素ｍＲＮＡの
３' ＵＴＲの一部分であることがさらに望ましい。
【０３３４】 他の好適な態様では、核酸は共通配列ＣＡＡＧＮＮＵＵＵＮＵＡＧＣＵＵＧを
含み、第１二重鎖領域および末端ループ領域を持つ核酸である。他の好適な態様
では、精製および分離された核酸断片はヒト配列ＣＡＡＧＣＡＵＵＵＧＵＡＧＣ
ＵＵＧＵを含む核酸断片である。他の好適な態様では、精製および分離された核
酸断片はマウス配列ＣＡＡＧＣＧＵＵＵＧＵＡＧＣＵＵＧＵもしくはＣＡＡＧＣ
ＡＵＵＵＡＵＡＧＣＵＵＧＵを含む核酸断片である。他の好適な態様では、精製
および分離された核酸断片はラット配列ＣＡＡＧＣＡＵＵＵＧＵＡＧＣＵＵＧＵ
を含む核酸断片である。
【０３３５】 本発明は前述の精製および分離された核酸も対象にしている。さらに、本発明
は前述の機械内実験における精製および分離された核酸も対象にしている。 本発明はまた１７以上７０以下の結合ヌクレオチドを含み、且つ二次構造を持
つ核酸を対象にしている。この二次構造は、第１二重鎖領域の第１部位を形成す
る５個のヌクレオチド、第１末端ループ領域を形成する４個のヌクレオチド、第
１二重鎖領域の第２部位を形成する５個のヌクレオチド、第１内部ループ領域の
第１部位を形成する３個のヌクレオチド、第２二重鎖領域の第１部位を形成する
５個のヌクレオチド、第２内部ループ領域の第１部位を形成する１個のヌクレオ
チド、第３二重鎖領域の第１部位を形成する６個のヌクレオチド、第２末端ルー
プ領域を形成する８個のヌクレオチド、第３二重鎖領域の第２部位を形成する６
個のヌクレオチド、第２内部ループ領域の第２部位を形成する１個のヌクレオチ
ド、第２二重鎖領域の第２部位を形成する５個のヌクレオチド、第１内部ループ
領域の第２部位を形成する２個のヌクレオチド、第４二重鎖領域の第１部位を形
成する３個のヌクレオチド、第３末端ループ領域を形成する５個のヌクレオチド
、および第４二重鎖領域の第２部位を形成する３個のヌクレオチドによって定義
される二次構造である。この核酸は７０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、６０
ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、もし
くは２０ヌクレオチドまでであることが望ましい。
【０３３６】 好適な態様では、第２二重鎖領域の第１部位を形成するヌクレオチドは配列Ａ
ＡＡＮＵ、ＡＡＡＡＵ、もしくはＡＡＡＵＵであり、第２二重鎖領域の第２部位
を形成するヌクレオチドは配列ＧＮＵＮＮ、ＧＵＵＵＵ、ＧＧＵＵＵ、ＧＧＵＧ
ＵもしくはＧＧＵＵＣである。他の好適な態様では、第２内部ループ領域の第１
部位を形成するヌクレオチドはＵであり、第２内部ループ領域の第２部位を形成
するヌクレオチドはＮ、Ｕ、もしくはＣである。他の好適な態様では、第３二重
鎖領域の第１部位を形成するヌクレオチドは配列ＵＡＵＡＵＵであり、第３二重
鎖領域の第２部位を形成するヌクレオチドは配列ＮＡＵＮＮＡ、ＧＡＵＡＵＡ、
ＡＡＵＧＵＡ、ＧＡＵＧＣＡ、もしくはＧＡＵＧＵＡである。他の好適な態様で
は、第２末端ループ領域を形成するヌクレオチドは配列ＵＡＵＵＮＵＵＮ、ＵＡ
ＵＵＵＵＵＵ、ＵＡＵＵＧＵＵＧ、もしくはＵＡＵＵＵＵＵＧである。他の好適
な態様では、第１内部ループ領域の第１部位を形成するヌクレオチドは配列ＵＵ
Ｕであり、第１内部ループ領域の第２部位を形成するヌクレオチドは配列ＮＣ、
ＣＣ、ＧＣ、ＵＣ、もしくはＡＣである。他の好適な態様では、第４二重鎖領域
の第１部位を形成するヌクレオチドは配列ＵＡＮ、ＵＡＣ、もしくはＵＡＡであ
り、第４二重鎖領域の第２部位を形成するヌクレオチドは配列ＮＵＡ、ＧＵＡ、
もしくはＣＵＡである。他の好適な態様では、第３末端ループ領域を形成するヌ
クレオチドは配列ＣＵＮＵＵ、ＣＵＵＵＵ、もしくはＣＵＡＵＵである。この核
酸はインターロイキン−２ ＲＮＡの一部分であることが望ましく、インターロ
イキン−２ ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部分であることがさらに望ましい。
【０３３７】 他の好適な態様では、核酸は共通配列ＵＡＵＵＵＡＵＵＵＡＡＡＵＡＵＵＵＡ
ＡＡＮＵＵＵＡＵＡＵＵＵＡＵＵＮＵＵＮＮＡＵＮＮＡＮＧＮＵＮＮＮＣＵＡＮ
ＣＵＮＵＵＮＵＡを含み、第１二重鎖領域、第１末端ループ領域、第１内部ルー
プ領域、第２二重鎖領域、第２内部ループ領域、第３二重鎖領域、第２末端ルー
プ領域、第４二重鎖領域、および第３末端ループ領域を持つ核酸である。他の好
適な態様では、精製および分離された核酸断片はヒト配列ＵＡＵＵＵＡＵＵＵＡ
ＡＡＵＡＵＵＵＡＡＡＡＵＵＵＵＡＵＡＵＵＵＡＵＵＧＵＵＧＡＡＵＧＵＡＵＧ
ＧＵＵＵＧＣＵＡＣＣＵＡＵＵＧＵＡを含む核酸断片である。
【０３３８】 本発明は前述の精製および分離された核酸も対象にしている。さらに、本発明
は前述の機械内実験における核酸も対象にしている。 本発明は３２以上７０以下のヌクレオチドの結合配列を含み、且つ二次構造を
持つ核酸も対象にしている。この二次構造は第１二重鎖領域の第１部位を形成す
る５個のヌクレオチド、第１内部ループ領域の第１部位を形成する１個のヌクレ
オチド、第２二重鎖領域の第１部位を形成する６個のヌクレオチド、第１内部ル
ープ領域形成する８個のヌクレオチド、第２二重鎖領域の第２部位を形成する６
個のヌクレオチド、第１内部ループ領域の第２部位を形成する１個のヌクレオチ
ド、および第１二重鎖領域の第２部位を形成する５個のヌクレオチドによって定
義される二次構造である。この核酸は７０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、６
０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、もしくは４０ヌクレオチドまでであること
が望ましい。
【０３３９】 好適な態様では、第１二重鎖領域の第１部位を形成するヌクレオチドは配列Ａ
ＡＡＮＵ、ＡＡＡＡＵ、もしくはＡＡＡＵＵであり、第１二重鎖領域の第２部位
を形成するヌクレオチドは配列ＧＮＵＮＮ、ＧＵＵＵＵ、ＧＧＵＵＵ、ＧＧＵＧ
Ｕ、もしくはＧＧＵＵＣである。他の好適な態様では、第１内部ループ領域の第
１部位を形成するヌクレオチドはＵであり、第１内部ループ領域の第２部位を形
成するヌクレオチドはＮ、Ｕ、もしくはＣである。他の好適な態様では、第２二
重鎖領域の第１部位を形成するヌクレオチドは配列ＵＡＵＡＵＵであり、第２二
重鎖領域の第２部位を形成するヌクレオチドは配列ＮＡＵＮＮＡ、ＧＡＵＡＵＡ
、ＡＡＵＧＵＡ、ＧＡＵＧＣＡ、もしくはＧＡＵＧＵＡである。他の好適な態様
では、第１末端ループ領域を形成するヌクレオチドは配列ＵＡＵＵＮＵＵＮ、Ｕ
ＡＵＵＵＵＵＵ、ＵＡＵＵＧＵＵＧ、もしくはＵＡＵＵＵＵＵＧである。この核
酸はインターロイキン−２ ＲＮＡの一部分であることが望ましく、インターロ
イキン−２ ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部分であることがさらに望ましい。
【０３４０】 他の好適な態様では、核酸は共通配列ＡＡＡＮＵＵＵＡＵＡＵＵＵＡＵＵＮＵ
ＵＮＮＡＵＮＮＡＮＧＮＵＮＮを含み、第１二重鎖領域、第１内部ループ領域、
第２二重鎖領域、および末端ループ領域を持つ核酸である。他の好適な態様では
、精製および分離された核酸断片は、ヒト配列ＡＡＡＵＵＵＵＡＵＡＵＵＵＡＵ
ＵＧＵＵＧＡＡＵＧＵＡＵＧＧＵＵＵを含む核酸断片である。 本発明は前述の精製および分離された核酸も対象にしている。さらに、本発明
は機械内実験における前述の核酸も対象にしている。 本発明は４３以上７０以下の結合配列を含み、且つ２次構造を持つ核酸も対象
にしている。この二次構造は第１二重鎖領域の第１部位を形成する６個のヌクレ
オチド、第１内部ループ領域の第１部位を形成する３個のヌクレオチド、第２二
重鎖領域の第１部位を形成する６個のヌクレオチド、第１末端ループを形成する
４個のヌクレオチド、第２二重鎖領域の第２部位を形成する６個のヌクレオチド
、第１内部ループ領域の第２部位を形成する２個のヌクレオチド、第１二重鎖領
域の第２部位を形成する６個のヌクレオチド、第１二重鎖領域と第３二重鎖領域
の間の膨隆を形成する１個のヌクレオチド、第３二重鎖領域の第１部位を形成す
る２個または４個のヌクレオチド、第２末端ループ領域を形成する３個のヌクレ
オチド、および第３二重鎖領域の第２部位を形成する２個または４個のヌクレオ
チドによって定義される二次構造である。この核酸は７０ヌクレオチド、６５ヌ
クレオチド、６０ヌクレオチド、もしくは５０ヌクレオチドまでであることが望
ましい。
【０３４１】 好適な態様では、第１二重鎖領域の第１部位を形成するヌクレオチドは配列Ｎ
ＮＵＮＮＮ、ＧＡＵＡＡＡ、ＵＡＵＡＡＡ、もしくはＵＣＵＧＵＵであり、第１
二重鎖領域の第２部位を形成するヌクレオチドはＵＮＵＮＮＮ、ＵＵＵＧＵＡ、
ＵＣＵＧＵＡ、もしくはＵＵＵＵＧＵである。他の好適な態様では、第１内部ル
ープ領域の第１部位を形成するヌクレオチドはＮＮＮ、ＵＡＵ、ＣＵＡ、もしく
はＣＡＵであり、第１内部ループ領域の第２部位を形成するヌクレオチドはＵＵ
である。他の好適な態様では、第２二重鎖領域の第１部位を形成するヌクレオチ
ドは配列ＮＧＡＵＣＮ、ＧＧＡＵＣＵ、もしくはＡＧＡＵＣＡであり、第２二重
鎖領域の第２部位を形成するヌクレオチドはＮＧＡＵＮＣ、ＡＧＡＵＵＣ、ＵＧ
ＡＵＣＣ、もしくはＵＧＡＵＵＣである。他の好適な態様では、第３ステム領域
の第１部位を形成するヌクレオチドは、配列Ｎ（または欠如）Ｎ（または欠如）
ＣＣ、ＧＣＣＣ、もしくはＣＣであり、第３ステム領域の第２部位を形成するヌ
クレオチドは配列ＮＮＮＮ、ＧＧＧＣ、もしくはＧＣＧＣである。この核酸はイ
ンターロイキン−２ ＲＮＡの一部分であることが望ましく、インターロイキン
−２ ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部分であることがさらに望ましい。
【０３４２】 他の好適な態様では、核酸は共通配列ＮＮＵＮＮＮＮＮＮＮＧＡＵＣＮＵＮＮ
ＮＮＧＡＵＮＣＵＵＵＮＵＮＮＮＡＮ（または欠如）Ｎ（または欠如）ＣＣＮＮ
ＮＮＮＮＮを含み、第１二重鎖領域、第１内部ループ領域、第２二重鎖領域、第
１末端ループ領域、第３二重鎖領域、および第２末端ループ領域を持つ核酸であ
る。他の好適な態様では、精製および分離された核酸断片はヒト配列ＵＡＵＡＡ
ＡＵＡＵＧＧＡＵＣＵＵＵＵＡＵＧＡＵＵＣＵＵＵＵＵＧＵＡＡＧＣＣＣＵＡＧ
ＧＧＧＣを含む核酸断片である。他の好適な態様では、精製および分離された核
酸断片はマウス配列ＧＡＵＡＡＡＵＡＵＧＧＡＵＣＵＵＵＡＡＡＧＡＵＵＣＵＵ
ＵＵＵＧＵＡＡＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣを含む核酸断片である。他の好適な態様
では、精製および分離された核酸断片はラット配列ＧＡＵＡＡＡＵＡＵＧＧＡＵ
ＣＵＵＵＡＡＡＧＡＵＵＣＵＵＵＵＵＧＵＡＡＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣを含む核
酸断片である。
【０３４３】 本発明は前述の精製および分離された核酸も対象にしている。さらに、本発明
は機械内実験における前述の核酸も対象にしている。 本発明は、また、２９ヌクレオシド以上７０ヌクレオシド以下の結合配列を含
み、且つ二次構造を持つ核酸も対象にしている。この二次構造は、第１二重鎖領
域の第１部位を形成する５個のヌクレオチド、第１末端ループ領域の第１部位を
形成する４個のヌクレオチド、第１二重鎖領域の第２部位を形成する５個のヌク
レオチド、第１二重鎖領域と第２二重鎖領域の間の膨隆を形成する２個のヌクレ
オチド、第２二重鎖領域の第１部位を形成する５個のヌクレオチド、第２末端ル
ープ領域を形成する３個のヌクレオチド、および第２二重鎖領域の第２部位を形
成する５個のヌクレオチドによって定義される二次構造である。この核酸は７０
ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、４０
ヌクレオチド、もしくは３０ヌクレオチドまでであることが望ましい。
【０３４４】 好適な態様では、第１二重領域の第１部位を形成するヌクレオチドは配列ＮＮ
ＮＧＡ、ＵＡＡＧＡ、ＡＡＡＧＡ、ＵＡＵＧＡ、もしくはＵＵＵＧＡであり、第
１二重鎖領域の第２部位を形成するヌクレオチドは配列ＧＮＧＮＮ、ＧＧＧＣＵ
、もしくはＧＣＧＵＧである。他の好適な態様では、第１末端ループ領域を形成
するヌクレオチドは配列ＵＮＣＵ、ＵＵＣＵ、もしくはＵＣＣＵである。他の好
適な態様では、第２二重鎖領域の第１部位を形成するヌクレオチドは配列ＡＧＣ
ＣＣであり、第２二重鎖領域の第２部位を形成するヌクレオチドは配列ＧＮＧＮ
Ｎ、ＧＧＧＣＵ、もしくはＧＣＧＵＧである。他の好適な態様では、第２末端ル
ープ領域を形成するヌクレオチドは配列ＮＡＮ、ＵＡＣ、ＵＡＧ、ＣＡＡ、もし
くはＵＡＡである。この核酸はインターロイキン−２ ＲＮＡの一部分であるこ
とが望ましく、インターロイキン−２ ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部分であるこ
とがさらに望ましい。
【０３４５】 他の好適な態様では、核酸はコンセンサスＮＮＮＧＡＵＮＣＵＵＵＮＮＧＵＡ
ＡＧＣＣＣＮＡＮＧＮＧＮＮを含み、第１二重鎖領域、第１末端ループ領域、第
２二重鎖領域、および第２末端ループ領域を持つ核酸である。他の好適な態様で
は、精製および分離された核酸断片はヒト配列ＵＡＵＧＡＵＵＣＵＵＵＵＵＧＵ
ＡＡＧＣＣＣＵＡＧＧＧＧＣＵを含む核酸断片である。他の好適な態様では、精
製および分離された核酸断片はマウス配列ＡＡＡＧＡＵＵＣＵＵＵＵＵＧＵＡＡ
ＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣＵを含む核酸断片である。他の好適な態様では、精製お
よび分離された核酸断片はラット配列ＡＡＡＧＡＵＵＣＵＵＵＵＵＧＵＡＡＧＣ
ＣＣＣＡＡＧＧＧＣＵを含む核酸断片である。
【０３４６】 本発明は前述の精製および分離された核酸も対象にしている。さらに機械内実
験における前述の核酸も対象にしている。 本発明は、また、２６ヌクレオシド以上７０ヌクレオシド以下の結合配列を含
み、且つ二次構造を持つ核酸も対象にしている。この二次構造は、第１二重鎖領
域の第１部位を形成する６個または７個のヌクレオチド、第１末端ループを形成
する４個のヌクレオチド、第１二重鎖領域の第２部位を形成し単一ヌクレオチド
膨隆を持つ７個または８個のヌクレオチド、第１二重鎖領域および第２二重鎖領
域にリンクする１個のヌクレオチド、第２二重鎖領域の第１部位を形成する３個
のヌクレオチド、第２末端ループ領域を形成する３個のヌクレオチド、および第
２二重鎖領域の第２部位を形成する２個または３個のヌクレオチドによって定義
される二次構造である。この核酸は７０ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、６０
ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、もしくは３０ヌクレオチ
ドまでであることが望ましい。
【０３４７】 好適な態様では、第１二重鎖領域の第１部位を形成するヌクレオチドは配列Ｎ
ＮＮＮＮＮ（または欠如）Ｎ、ＡＵＡＡＣＣＵ、ＵＧＧＵＡＡＡ、ＵＧＡＵＡＡ
Ｕ、ＵＧＡＵＡＡＡ、ＧＡＵＡＡＣＣ、ＧＡＵＡＡＡＣ、ＵＧＡＵＡＵ、ＧＡＧ
ＡＣＣＣ、もしくはＧＡＣＡＡＡＣであり、第１二重鎖入りの第２部位を形成す
るヌクレオチドは配列Ｎ（または欠如）ＵＧＮＣＵＮＮ、ＵＧＵＣＵＣＣ、ＵＵ
ＧＵＣＵＣＡ、ＵＵＧＣＣＵＣＡ、ＵＵＧＵＣＵＣＣ、ＵＵＧＵＣＵＣＵ、ＣＵ
ＧＵＣＵＵＵ、もしくはＣＵＧＵＣＵＣＡである。他の好適な態様では、第１末
端ループ領域を形成するヌクレオチドは配列ＮＮＮＮ、ＵＡＡＵ、ＣＣＡＡ、Ｕ
ＵＡＡ、ＵＡＣＵもしくはＡＡＡＵである。第２二重鎖領域の第１部位を形成す
るヌクレオチドは配列ＮＮＮ、ＡＵＣ、ＡＵＵ、ＡＣＵ、ＧＵＣ、ＣＣＣ、もし
くはＡＡＵであり、第２二重鎖領域の第２部位を形成するヌクレオチドは配列Ｎ
ＮＮ（または欠如）、ＧＡ、ＡＧＵ、ＡＣＵ、ＧＣＧ、もしくはＡＣである。他
の好適な態様では、第２末端ループ領域を形成するヌクレオチドは配列ＮＮＮ、
ＡＣＵ、ＧＵＣ、ＡＧＧ、ＧＡＡ、もしくはＣＣＵである。この核酸はインター
ロイキン−４ ＲＮＡの一部分であることが望ましく、インターロイキン−４ ｍＲＮＡの５' ＵＴＲの一部分であることがさらに望ましい。
【０３４８】 他の好適な態様では、核酸はコンセンサスＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＧＮＣ
ＵＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮを含み、第１二重鎖領域、第１末端ループ領域、第
２二重鎖領域、および第２末端ループ領域を持つ核酸である。他の好適な態様で
は、精製および分離された核酸断片はヒト配列ＵＧＡＵＡＡＡＣＵＡＡＵＵＧＣ
ＣＵＣＡＣＡＵＵＧＵＣＡＣＵを含む核酸断片である。他の好適な態様では、精
製および分離された核酸断片はマウス配列ＧＡＵＡＡＡＣＵＵＡＡＵＵＧＵＣＵ
ＣＵＣＧＵＣＡＣＵＧＡ、ＵＧＡＵＡＵＵＡＣＵＣＵＧＵＣＵＵＵＣＣＣＣＡＧ
ＧＧＣＧ、もしくはＧＡＧＡＣＣＣＡＡＡＵＣＵＧＵＣＵＣＡＣＡＡＵＧＡＡＡ
Ｃを含む核酸断片である。 本発明は前述の精製および分離された核酸も対象にしている。さらに、本発明
は機械内実験における前述の核酸も対象にしている。
【０３４９】 本発明は、また、１９ヌクレオシド以上７０ヌクレオシド以下の結合配列を含
み、且つ二次構造を持つ核酸も対象にしている。この二次構造は、第１二重鎖領
域の第１部位を形成する３個のヌクレオチド、内部ループ領域の第１部位を形成
する１個のヌクレオチド、第３二重鎖領域の第１部位を形成する３個のヌクレオ
チド、末端ループ領域を形成する５個のヌクレオチド、第２二重鎖領域の第２部
位を形成する３個のヌクレオチド、内部ループ領域の第２部位を形成する１個の
ヌクレオチド、および第１二重鎖領域の第２部位を形成する３個のヌクレオチド
によって定義される二次構造である。この核酸は７０ヌクレオチド、６５ヌクレ
オチド、６０ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、３０ヌクレ
オチド、もしくは２０ヌクレオチドまでであることが望ましい。
【０３５０】 好適な態様では、第１二重鎖領域の第１部位を形成するヌクレオチドは配列Ｎ
ＮＮ、ＡＵＵ、ＡＡＧ、ＧＡＧ、ＡＵＧ、ＧＡＡ、ＧＡＣ、ＡＡＵ、ＡＡＡ、も
しくはＣＣＡであり、第１二重鎖領域の第２部位を形成するヌクレオチドは配列
ＮＮＮ、ＵＡＵ、ＵＵＵ、ＡＡＡ、ＣＣＵ、ＡＣＵ、もしくはＧＣＵである。他
の好適な態様では、第１末端ループを形成するヌクレオチドは配列ＮＮＮＮＮ、
ＵＡＡＡＡ、ＡＵＡＵＣ、ＡＡＡＡＡ、ＡＵＡＵＵ、ＵＵＡＡＵ、ＣＵＡＵＵ、
ＡＵＧＡＧ、ＵＡＡＧＧ、ＣＵＵＣＣ、もしくはＡＧＧＡＧである。他の好適な
態様では、第２二重鎖領域の第１部位を形成するヌクレオチドは配列ＮＮＮ、Ｕ
ＵＡ、ＵＧＡ、ＵＵＵ、ＵＡＡ、ＣＣＡ、もしくはＡＡＡであり、第２二重鎖領
域の第２部位を形成するヌクレオチドは配列ＮＮＮ、ＵＡＡ、ＵＵＡ、ＡＧＣ、
ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＵＵＣ、もしくはＣＡＡである。この核酸はインターロイキン
−４ ＲＮＡの一部分であることが望ましく、インターロイキン−４ ｍＲＮＡ
の３' ＵＴＲの一部分であることがさらに望ましい。
【０３５１】 他の好適な態様では、核酸は共通配列ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ
Ｎを含み第１二重鎖領域、内部ループ領域、第２二重鎖領域、および末端ループ
領域を持つ核酸である。他の好適な態様では、精製および分離された核酸断片は
マウス配列ＡＡＵＣＵＧＡＡＵＧＡＧＡＡＵＧＣＣＵ、ＡＵＵＧＣＣＡＵＡＡＧ
ＧＵＵＣＵＡＣＵ、ＣＣＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＣＡＡＧＧＣＵである。 本発明は前述の精製および分離された核酸も対象にしている。さらに、本発明
は機械内実験における前述の核酸も対象にしている。 次の実施例はこの発明の模範的な好適な態様とするが、これに限定しようとす
るものではない。
【０３５２】
【実施例】
実施例１：鉄反応成分（測定法１） １．選択ＲＮＡ標的 低分子相互作用部位同定法を説明するため、ヒトフェリチンによってコード化
されたｍＲＮＡの鉄反応成分（ＩＲＥ）を同定する。ＩＲＥはＲＮＡ構造成分の
典型的な例であり、鉄代謝に関連するｍＲＮＡの翻訳レベルの調節に使われる。
ＩＲＥの構造は近年、ＮＭＲ分光法により決定された。加えて、ＩＲＥ構造のＮ
ＭＲ分析はＧｄａｎｉｅｃら、Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９８年、３７号、１５０５
〜１５１２ページ、およびＡｄｄｅｓｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７年
、２７４号、７２〜８３ページに記載されている。ＩＲＥはおよそ３０ヌクレオ
チドのＲＮＡ成分で、ヘアピン構造に折りたたまれており、特異的タンパク質と
結合する。この構造はよく調査されており、多くの種のｍＲＮＡに現れることが
知られているので、出願人の方法論がどのように機能するかについての卓越した
例となる。
【０３５３】 ２．ＲＮＡ標的のヌクレオチド配列決定 フェリチンのヒトｍＲＮＡ配列は、初期ｍＲＮＡのインタレスト配列またはマ
スター配列として用いられる。フェリチンタンパク質配列は分析にも用いられ、
特に、関連のある配列発見に利用される初期段階で用いる。ヒトフェリチン遺伝
子の例では、最良の入力はＵＮＩＧＥＮＥから得られる完全長注釈付きｍＲＮＡ
およびタンパク質配列である。しかし、関連のある多くの遺伝子に関して、同じ
レベルの詳細な情報を得ることはできない。これらの例では、優れた配列の情報
の代替情報源を、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＴＩＧＲ、ＧｅｎＢａｎｋ のＥＳＴ
データベース部門、あるいは民間研究所から得た配列情報のような情報源から得
る。出願人の方法は、いかなるレベルの入力配列の使用でも機能するが、良質の
注釈付き入力配列のある幾つかの段階が必要である。
【０３５４】 ３．類似配列の同定 処理過程の早い段階では、データベース（オーソログまたはパラログ）の中か
ら関連のある配列を検出し、評価するためにマスター配列（ヌクレオチドまたは
タンパク質）を使う。この目的のために、配列類似性検索アルゴリズムを使う。
全ての配列類似性アルゴリズムは類似性の定量的程度を算出する。結果はそれぞ
れマスター配列と比較される。定量結果の一例はブラストアルゴリズムから得た
Ｅ値である。フェリチンｍＲＮＡを照会配列として使った、重複のないＧｅｎＢ
ａｎｋデータベースのブラスト検索のためのＥ値は、配列類似性の定量分析の使
用を説明する。Ｅ値は照会配列とデータベース配列の間の一致が無作為の機械に
よって生じる可能性を示す。したがって、Ｅ値が低いほど、２つの配列が本当に
関連があることを表している。フェリチンで記録されたＥ値の最も低いプロット
を図１０に示した。後に述べる規定セットに従って行う詳細な比較のために、切
り捨て基準を満たす配列が選ばれた。配列類似性検索の目的は、オーソログとパ
ラログの遠く離れた関連を検出することであるから、切り捨て基準は厳しすぎな
いことが望ましい。そうでないと検索の標的が除外される可能性がある。
【０３５５】 ４．保存領域の同定 保存領域の同定は、ＣｏｍｐａｒｅＯｖｅｒＷｉｎｓと共にＱ−比較を用い、
対をなす配列の比較によって行う。異なる種からの機能を持つ遺伝子間の構造の
保存は、好ましい薬剤結合部位を検出するために利用できる主要な指標である。
保存された構造は、遠く離れて関連する配列を使用すること、および保存されて
いる配列のレムナントを繋ぎ合わせて、可能性のある構造の分析と組み合わせる
ことで同定される。配列の比較は、異なる種からの対になったｍＲＮＡの間で行
われ、Ｑ−比較を用いる。Ｑ−比較は、非常に多岐した生物体からでさえその配
列保存の痕跡を同定できる。ＣｏｍｐａｒｅＯｖｅｒＷｉｎｓと共に用いるＱ−
比較は、一つの配列を他の配列に上方に端から端まで移動させて特定の大きさの
窓の中で一致した数を測定して、それぞれの配列の全領域を比較する。
【０３５６】 それぞれ５' ＵＴＲにＩＲＥを含む、ヒトｍＲＮＡおよびマウスｍＲＮＡのフ
ェリチン配列がこの方法で分析される場合、図１９に示すように、配列類似性の
領域を示すプロットがもたらされる。ヒトおよびマウスフェリチンｍＲＮＡの対
をなす分析は、このタイプの分析の幾つかの重要な面を示す。アミノ酸配列をコ
ード化する各ｍＲＮＡの領域は、最も高い類似性を持ち、一方、翻訳されていな
い領域は類似性が低い。図１９では、ＩＲＥの位置を示す。ヒトとマウスのフェ
リチンｍＲＮＡの両方で、ＩＲＥは各ｍＲＮＡの極端な５' 末端に位置する。こ
れは重要な点を意味している。つまり、ＩＲＥ構造領域の配列保存はバックグラ
ウンドのヒトとマウスのフェリチン配列の配列類似性に対して際立ってはいない
ということである。対照的に、ヒトとマス（図１１）もしくはヒトとニワトリ（
図１２）のフェリチンｍＲＮＡの比較では、ＩＲＥは直ちに同定された。これは
、ヒトとマスもしくはヒトとニワトリの間のＵＴＲの配列が、進化的にヒトとマ
ウスよりも大きな距離をもって分別されたためである。これは他の動物と比べた
ときに、ヒトを鳥類や魚類から隔てる進化的距離から見て当然である。ヒト配列
を鳥類および魚類の配列と比べることは参考になる。進化による自然の緩やかな
変化がＵＴＲにおける多くの配列変化を可能にしてきたからである。しかしＩＲ
Ｅ配列は重要な構造を形成するため、もっと制限されている。このように、ＩＲ
Ｅ配列は目立っており、迅速に同定される。
【０３５７】 マスとニワトリの配列をお互いに比較する場合、同じ原理が適用できる。両方
とも数億年の進化によってヒトから引き離されているが、お互いからも遠く引き
離されている。これは本発明で使われる別の重要な方策を示している。つまり、
２つの非ヒトＲＮＡ配列の比較は、実際にヒト配列を持っていない調節ＲＮＡ構
造の検出に使えるということである。非ヒト比較機能は実際、可能性のある薬剤
標的としてヒト対応物を発見しようとする技術において、優れた技術である。
【０３５８】 進化的な距離は、どの配列を比較するかの決定、と同様にどの配列を比較しな
いかの決定に用いることができる。ヒトとマウスのように、マスとサケの比較は
あまり参考にならない。なぜなら、これらの種は近すぎるので、ＩＲＥはＵＴＲ
バックグラウンドの上で目立たないからである。ヒトとショウジョウバエのフェ
リチンｍＲＮＡの比較は、現れているにも関わらず、どちらの種においてもＩＲ
Ｅの検出に失敗した。これは、ヒトとショウジョウバエの間のＩＲＥの配列が、
構造が保存されているにもかかわらず、分岐してしまっているからである。しか
し、ショウジョウバエと蚊のフェリチンｍＲＮＡを比較した場合は、ＩＲＥは同
定され、ヒトの薬剤発見に関連する調節成分を同定するためにヒト配列は手をつ
ける必要がないことが再び示される。
【０３５９】 本発明で使用されるソフトウェアは種の間の進化的な距離に基づくルックアッ
プ表を用いる対になった配列を比較すべきか否か判定する。例を用いた前述の小
ルックアップ表の例を図１３に示した。本発明のルックアップ表はＧｅｎＢａｎ
ｋに蓄積されている全ての種を含む。ＣｏｍｐａｒｅＯｖｅｒＷｉｎｓと共に用
いるＱ−比較は、どの配列を対にして比較するか判定する。
【０３６０】 ５．二次構造の同定 オーソログおよびパラログ、あるいは他の関連のある遺伝子中の保存の証拠を
示す配列のセットは、内部構造を形成する能力のために分析される。この分析は
、配列がＸ軸の５' から３' にプロットされ、逆相補体がＹ軸の５' から３' に
プロットされるマトリックスにおいて各配列を分析して行う。分子内塩基対に対
応する一致は、値の一覧表に従って記入される。ヒトフェリチンＩＲＥ配列がこ
の方法で解析される場合、対角線は、潜在する自己相補的な領域を示す。この例
で記述された１３ＩＲＥ配列のそれぞれは同じ方法で分析された。各配列は様々
に異なる構造を形成することができるが、もっとも生じやすい構造は全ての配列
に共通する一つの構造である。１３の個々の配列全てのプロットを重ね合わせる
ことにより（図８参照）、全ての配列に共通する潜在構造が推論される。
【０３６１】 実施例２： 鉄反応成分（方法Ｂ） ２．ＲＮＡ標的のヌクレオチド配列の決定 フェリチンのヒトｍＲＮＡ配列は、インタレスト配列もしくはマスター配列の
初期ｍＲＮＡとして用いられた。フェリチンタンパク質配列は分析にも用いられ
、特に、関連のある配列発見のために利用される初期段階で用いた。ヒトフェリ
チン遺伝子の例では、最良の入力はＵＮＩＧＥＮＥから得られる完全長注釈付き
ｍＲＮＡ（ｇｉ５０７２５１）およびタンパク質配列である。しかし、関連のあ
る多くの遺伝子に関して、同じレベルの詳細な情報を得ることはできない。これ
らの例では、優れた配列の情報の代替情報源を、例えばＨｏｖｅｒｇｅｎおよび
ＧｅｎＢａｎｋのような情報源から得る。出願人の方法は、いかなるレベルの入
力配列の使用でも機能するが、良質の注釈付き入力配列のある幾つかの段階が必
要である。
【０３６２】 ３．類似配列の同定 オーソログを検出するための好ましい代替方法はＨｏｖｅｒｇｅｎのデータベ
ースとＤｕｒｅｔら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４年、２２号、２３
６０〜２３６５ページに記載された照会ツールを使う。この照会ツールは参照と
して完全な形でここに加えた。関連のある配列同定のためのＨｏｖｅｒｇｅｎの
使用は図５５（種レベルの３分類）および図５６（目レベルの分類）に示す。こ
れらのオーソログのそれぞれに対応する配列はＧｅｎＢａｎｋフォーマットで保
存され、単一のデータファイルに一緒に集められた。図５７に示すように、コー
ディング領域の５' 側面と３' 側面の両方の未翻訳領域はＳＥＡＬＳおよびＣＯ
ＷＸによって抽出した。
【０３６３】 ４．保存領域の同定 ＩＲＥ配列は重要な構造を形成するため、より大きな制約がある。したがって
この配列はくっきりと目立っており、親密に関連している配列であっても迅速に
同定できる。しかし、比較アルゴリズムは、どの遺伝子でも機能するように書き
直した（図５Ａ−Ｃ参照）。この新しいツールＣｏｍｐａｒｅＯｖｅｒＷｉｎｓ
は、ヒットの許容範囲とウインドウサイズの範囲の両方が動的に選択できる。こ
のアルゴリズムには解析し分離された５' および３' ＵＴＲ配列が必要であり、
これは前掲のＳｅａｌ遺伝子分析パッケージにあるツールで行うことができる。
図５７に、関与するステップを示した。
【０３６４】 ここで述べた方法を用いて鉄反応成分を同定するために、ウインドウを凌駕す
る比較アルゴリズムが使用され、結果はＡｌｉｇｎ Ｈｉｔｓにて描出された（
このアルゴリズムに関しては図５Ｄ）。代表的な結果を図６２に示した。許容範
囲の最適化に加え、ＣｏｍｐａｒｅＯｖｅｒＷｉｎｓはヒットに対応する配列も
抽出する。抽出した配列に局所的な切れ目を入れたアレイを作るためにＣｌｕｓ
ｔａｌ Ｗ（バージョン１．７４）を用いた（図６３参照）。この方法の代表的
な模式図を図６４に示した。
【０３６５】 ５．二次構造の同定 オーソログおよびパラログまたは他の関連のある遺伝子の保存を証明する配列
のセットについて、内部構造形成能力を分析した。これは配列がＸ軸上に５' か
ら３' までプロットされ、その配列の相補体がＹ軸上に５' から３' までプロッ
トされたマトリックスにおいて、例えば自己相補性分析のように、各配列を分析
して行う。可能性のある分子内塩基対に対応する一致は数値表に従って記録され
る。ヒトフェリチンＩＲＥ配列をこの方法で分析する場合、対角線は潜在する自
己相補的な領域を示す。この例で記述された１３ＩＲＥ配列のそれぞれは同じ方
法で分析された。各配列は様々に異なる構造を形成することができるが、もっと
も生じやすい構造は全ての配列に共通する一つの構造である。１３ある個々の配
列すべてのプロットを重ね合わせることにより（図６５参照）、全配列に共通す
る潜在構造が推論される。
【０３６６】 上記の工程模式図はアルゴリズムとしてＲｅｖＣｏｍと呼ばれるプログラムに
導入された（図５３参照）。ＲｅｖＣｏｍｐはすべての構造の分類リストを作成
する。代表的な結果は「ｄｏｍｅ」出力（図６６参照）または「ｃｏｎｎｅｃｔ
」ファイル、もしくはＲＮＡ構造を見るための様々なプログラム（ＲＮＡＳｔｒ
ｕｃｔｕｒｅ、ＲＮＡＶｉｚなど）で使える「ｃｔ」ファイルなど、どれでも見
ることができる。このような構造を描く代表例を図６７に示す。
【０３６７】 実施例３：ヒストン ヒストン３' ＵＴＲは別の典型的なステム−ループ構造に現れる。この構造に
ついては広範な研究がなされており（ＥＭＢＯ、１９９７年、１６号、７６９ペ
ージ）、転写後のレベルで、ヒストンｍＲＮＡの３' 非翻訳領域ステム−ループ
構造が非常に重要であることが示されている（Ｓｏｎ、Ｓａｅｎｇｈｗａｈａｋ
Ｎｙｕｓｕ、１９９３年、１３号、６４−７０ページ）。下記の分析では、こ
こで述べる計画と方法を確証するため、この既知の構造の使用について述べる。 図６８と図６９はＨｏｖｅｒｇｅｎデータベースで出力されたすべてのヒスト
ンオーソログの系統樹を示している。これらのオーソログの各々はＧｅｎＢａｎ
ｋフォーマットで保存され、単一のデータファイルに集められる。コード化領域
の５' および３' 側面にある非翻訳領域は先に述べたとおりＳＥＡＬＳおよびＣ
ＯＷＸを用いて抽出され、比較される（図５７、図６４参照）。
【０３６８】 ＳＥＡＬＳおよびＣＯＷＸを用いた抽出と比較の後、関連をもつ可能性のある
領域の決定にＡｌｉｇｎ Ｈｉｔが使用される（図７０参照）。該当領域を円で
囲んで示している。関連のある領域に対応する配列は、全ての種から抽出、整列
される。これは、ＣＬＵＳＴＬ Ｗ（１．７４）によって行う。Ａｌｉｇｎ Ｈ
ｉｔからの配列情報の抽出に続いて、ＣＬＵＳＴＬ Ｗ（１．７４）で複数配列
整列表示を行う（図７１参照）。それぞれの推定ヒット配列について、内部構造
形成能力を分析する。これは、配列をＸ軸上に５' から３' までプロットし、そ
の配列の相補体をＹ軸上に５' から３' までプロットしたマトリックスにおいて
、それぞれの配列を分析して行う。対角線に沿った塩基対は、二次構造を形成す
る可能性のある自己相補的領域を示す。図７２は逆相補体マトリックスを示して
いる。図７３は、塩基対間の可能性のあるステム構成を示す代表的配列整列をｄ
ｏｍｅフォーマットで示している。ｄｏｍｅフォーマットファイルをｃｔファイ
ルに変換した後、ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３．２１が構造の視覚化に使用
される（図７４参照）。
【０３６９】 実施例４：ビメンチン ビメンチンは中間径フィラメントタンパク質であり、その３' ＵＴＲは種の間
で高度に保存されている。Ｚｅｈｎｅｒら（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９
９７年、２５号、３３６２〜３３７０ページ）はこれまでの研究で、この領域内
に含まれる、提案された複合ステム−ループ構造が、ｍＲＮＡ局在化のようなビ
メンチンｍＲＮＡ機能に重要である可能性が示した。本分析を用いて同じ領域が
同定されており、本方法の確証となる。加えて、ここに記述した分析に基づき、
前に提案された構造の下流に生じる二次構造が同定された（図７５参照）。この
二次構造は前に提案された構造と同様なビメンチン機能を調節する役割を果たす
可能性を持つ。
【０３７０】 図７６はＨｏｖｅｒｇｅｎデータベースで出力されたすべてのビメンチンオー
ソログの系統樹を示している。これらのオーソログはそれぞれＧｅｎＢａｎｋフ
ォーマットで保存され、単一のデータファイルに集められる。コード化領域の５
' および３' 側面にある非翻訳領域は先に述べたとおりＳＥＡＬＳおよびＣＯＷ
Ｘを用いて抽出、比較する（図５７、図６４参照）。 ＳＥＡＬＳおよびＣＯＷＸを用いた抽出と比較の後、関連をもつ可能性のある
領域の決定にＡｌｉｇｎ Ｈｉｔが使用される。該当する二つの領域が現れ、こ
れに続く分析に使用された（図７７参照）。領域１についてＡｌｉｇｎ Ｈｉｔ
からの配列情報の抽出に続き、ＣＬＵＳＴＬ Ｗで複数配列アレイ表示（図７８
参照）を行う。図７９は、これによって得たｄｏｍｅフォーマットでの塩基対間
の可能性のあるステム構成を示している。ｄｏｍｅフォーマットファイルをｃｔ
ファイルに変換した後、ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３．２１を構造の視覚化
に使用する（図８０参照）。この構造はＺｅｈｎｅｒらが提案した構造と非常に
よく似ている（図８１参照）。Ｚｅｈｅｒらは、彼らが提案したビメンチンの３
' ＵＴＲにおける微細結合領域構造の、詳細な化学的分析を提示した。この分析
はリード酢酸に曝露した後と同じく、一本鎖特異的（ＣｈＳまたはＴ１）もしく
は二本鎖特異的（Ｖ１）核酸分解酵素による開裂を含んでいた。
【０３７１】 領域２についてＡｌｉｇｎ Ｈｉｔからの配列情報の抽出に続き、図８２に示
すようにＣＬＵＳＴＬ Ｗで複数配列アレイ表示を行う。これにより、領域２の
塩基対間の、可能性のあるステム構成がｄｏｍｅフォーマットで得られる（図８
３）。ｄｏｍｅフォーマットファイルをｃｔファイルに変換した後、ＲＮＡ Ｓ
ｔｒｕｃｔｕｒｅ ３．２１を構造の視覚化に使用する（図８５参照）。
【０３７２】 実施例５：トランスフェリン受容体 フェリチンの調節と同様に（実施例１および実施例２）、ＩＲＥの別の既知の
機能はトランスフェリンの調節を受ける。５個のＩＲＥが既知トランスフェリン
受容体ｍＲＮＡの３' ＵＴＲで同定された（Ｋｕｈｎら、ＥＭＢＯ １９８７
年、６号、１２８７〜９３ページおよびＣａｓｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９
８年、２４０号、９２４〜９２８ページ）。どちらも完全な形でここに参照とし
て加えた。５個のＩＲＥ全てが鉄調節タンパク質（ＩＲＰ）と独立的に交互作用
を示した。本技法は、トランスフェリン受容体のこれらの保存成分同定に適用で
きた。
【０３７３】 図８４はＨｏｖｅｒｇｅｎデータベースで出力されたすべてのトランスフェリ
ンオーソログの系統樹を示している。これらのオーソログはそれぞれＧｅｎＢａ
ｎｋフォーマットで保存され、単一のデータファイルに集められる。コード化領
域の５' および３' 側面にある非翻訳領域は先に述べたとおりＳＥＡＬＳおよび
ＣＯＷＸを用いて抽出、比較する（図５７、図６４参照）。 ＳＥＡＬＳおよびＣＯＷＸを用いた抽出と比較の後、図８５に示すように関連
をもつ可能性のある領域の決定にＡｌｉｇｎ Ｈｉｔを使用する。これは、種の
セットからの配列情報を表す横方向の連続を縦線が横切る部分で見ることができ
る。トランスフェリン受容体３プライムＵＴＲ塩基対９２０から９９０の間の領
域はすべての種より抽出、整列させた。これはＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（１．７４）
によって行われた。
【０３７４】 領域１についてＡｌｉｇｎ Ｈｉｔからの配列情報の抽出に続き、ＣＬＵＳＴ
Ｌ Ｗ（１．７４）で、図８６に示すように複数配列整列を行う。図８７に示す
ように、この配列整列について、塩基対間の代表的な可能性のあるステム構成を
ｄｏｍｅフォーマットで得る。ｄｏｍｅフォーマットファイルをｃｔファイルに
変換した後、ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３．２１を構造の視覚化に使用する
（図８８参照）。これは、種のセットからの配列情報を表す横方向の連続を縦線
が横切る部分で見ることができる。トランスフェリン受容体３プライムＵＴＲ塩
基対９９０から１０５０の間の領域は全ての種より抽出、整列させた。これはＣ
ＬＵＳＴＡＬ Ｗ（１．７４）によって行われた（図８９参照）。
【０３７５】 領域２についてＡｌｉｇｎ Ｈｉｔからの配列情報の抽出に続き、ＣＬＵＳＴ
Ｌ Ｗ（１．７４）で、図９０に示すように複数配列整列を行う。こうして、図
９１に示すように、この配列整列について、塩基対間の代表的な可能性のあるス
テム構成をｄｏｍｅフォーマットで得る。ｄｏｍｅフォーマットファイルをｃｔ
ファイルに変換した後、図９２に示すように構造の視覚化にＲＮＡ Ｓｔｒｕｃ
ｔｕｒｅ ３．２１を使用する。ＳＥＡＬＳおよびＣＯＷＸを用いた抽出と比較
の後、関連をもつ可能性のある領域の決定にＡｌｉｇｎ Ｈｉｔが使用される。
これは、種のセットからの配列情報を表す横方向の連続を縦線が横切る部分で見
ることができる。トランスフェリン受容体３プライムＵＴＲ塩基対１３７２から
１４２３の間の領域は全ての種から抽出し、整列させた。これはＣＬＵＳＴＡＬ
Ｗ（１．７４）によって行われた（図９３参照）。
【０３７６】 領域３についてＡｌｉｇｎ Ｈｉｔからの配列情報の抽出に続き、ＣＬＵＳＴ
Ｌ Ｗ（１．７４）で、図９４に示すように複数配列整列を行う。こうして、図
９５に示すように、この配列整列について、塩基対間の代表的な可能性のあるス
テム構成をｄｏｍｅフォーマットで得る。ｄｏｍｅフォーマットファイルをｃｔ
ファイルに変換した後、図９６に示すようにＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３．
２１が構造の視覚化に使用される。ＳＥＡＬＳおよびＣＯＷＸを用いた抽出と比
較の後、関連をもつ可能性のある領域の決定にＡｌｉｇｎ Ｈｉｔを使用する。
これは、種のセットからの配列情報を表す横方向の連続を縦線が横切る部分で見
ることができる。トランスフェリン受容体３プライムＵＴＲ塩基対１４３９から
１４７９の間の領域は全ての種から抽出し、整列させた。これはＣＬＵＳＴＡＬ
Ｗ（１．７４）によって行われた（図９７参照）。
【０３７７】 領域４についてＡｌｉｇｎ Ｈｉｔからの配列情報の抽出に続き、ＣＬＵＳＴ
Ｌ Ｗ（１．７４）で、図９８に示すように複数配列整列を行う。図９９に示す
ように、この配列整列について、塩基対間の代表的な可能性のあるステム構成を
ｄｏｍｅフォーマットで得る。ｄｏｍｅフォーマットファイルをｃｔファイルに
変換した後、図１００に示すようにＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３．２１を構
造の視覚化に使用する。ＳＥＡＬＳおよびＣＯＷＸを用いた抽出と比較の後、関
連をもつ可能性のある領域の決定にＡｌｉｇｎ Ｈｉｔを使用する。これは、種
のセットからの配列情報を表す横方向の連続を縦線が横切る部分で見ることがで
きる。トランスフェリン受容体３プライムＵＴＲ塩基対１４７９から１５４２の
間の領域は全ての種から抽出し、整列させた。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（１．７４）
によって行われた（図１０１参照）。
【０３７８】 領域５についてＡｌｉｇｎ Ｈｉｔからの配列情報の抽出に続き、ＣＬＵＳＴ
Ｌ Ｗ（１．７４）で、図１０２に示すように複数配列整列を行う。図１０３に
示すように、この配列整列について、塩基対間の代表的な可能性のあるステム構
成をｄｏｍｅフォーマットで得る。ｄｏｍｅフォーマットファイルをｃｔファイ
ルに変換した後、図１０４に示すようにＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３．２１
を構造の視覚化に用いる。
【０３７９】 実施例６：オルニチンデカルボキシラーゼ オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）はポリアミン生合成経路の第１酵素
である。これまでの研究で５' および３' 非翻訳領域の両方の翻訳調節要素の存
在が示されている（ＧｒｅｎらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９０年、２６５号
、１１８１０ページ）。二次構造はこの両方の領域で存在していると提案されて
いるが、確証を得ていない。ここに述べる方法は、後述にあるとおり、３' ＵＴ
Ｒにおける二つの構造を同定した。これらの構造表現の一つ（図１０５参照）が
、質量分析探索を用いて立証された（Ｇｒｉｆｆｅｙら、Ｐｒｏｃ．ＳＰＩＥ−
Ｉｎｔ．Ｓｏｃ．Ｅｎｇ．、２９８５（超高感度生化学的診断学ＩＩ ８２〜８
６ページ）を完全な形でここに参照として加えた）。僅かな長さの変異を示す二
つの代表的な配列（図１０６参照）がＲＮＡの中に作られ、質量分析構造探索の
対となった。図１０５で示した結果によって、ステム−ループ構造の存在が確証
される。このように、新規の二次構造の同定はここに述べた方法で可能であり、
その存在が構造探索により独立的に立証されている。
【０３８０】 図１０７と図１０８はＨｏｖｅｒｇｅｎデータベースで出力されたすべてのオ
ルニチンデカルボキシラーゼオーソログの系統樹を示している。これらのオーソ
ログはそれぞれＧｅｎＢａｎｋフォーマットで保存され、単一のデータファイル
に一緒に集められる。コード化領域の５' および３' 側面にある非翻訳領域は先
に述べたとおりＳＥＡＬＳおよびＣＯＷＸを用いて抽出し、比較される（図５７
、図６４参照）。
【０３８１】 ＳＥＡＬＳおよびＣＯＷＸを用いた抽出と比較の後、図１０９に示すように関
連をもつ可能性のある領域の決定にＡｌｉｇｎ Ｈｉｔを使用する。該当する二
つの領域が現れ、これに続く分析に使用された。領域１についてＡｌｉｇｎ Ｈ
ｉｔからの配列情報の抽出に続き、ＣＬＵＳＴＬ Ｗ（１．７４）で複数配列整
列表示を行った。それぞれの推定ヒット配列について、図１１０で示すように逆
相補体マトリックスにおいて内部構造形成能力を分析する。これは、配列をＸ軸
上に５' から３' までプロットし、その配列の相補体をＹ軸上に５' から３' ま
でプロットしたマトリックスにおいて、それぞれの配列を分析して行われた。対
角線に沿った塩基対は、二次構造を形成する可能性のある自己相補的領域を示す
。これによって、ＲｅｖＣｏｍｐを用いて決定された配列整列に対する塩基対間
の可能性のあるステム構成をｄｏｍｅフォーマットで得る（図１１１参照）。Ｒ
ＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３．２１を構造の視覚化に使用する（図１１２参照
）。
【０３８２】 質量分析法を構造の探索に用いた。図１０６は、複数整列の中のギャップ／挿
入の存在を示している。この実験では、図１０６に示した整列から二つの代表的
なＲＮＡ（ｇｉ４０４５６１およびｇｉ３５１３５）を使用した。誘導された断
片化パターンの分析で、ステム−ループ構造の上半分に沿った塩基対が非常に強
い可能性を示した（逆転した状態で示されている）。これは４０４５６１の塩基
１１−１４および塩基２０−２３、もしくは３５１３５の塩基８−１１および１
８−２１に対応している。膨隆した塩基（４０４５６１のＧ９もしくは３５１３
５のＵ２２）もまた、断片化パターンの性質を示している。構造の下半分はより
安定性が低いように見え、なんらかの断片化が示された。これは我々の分析で予
測した塩基対の場所であった。特に３５１３５１配列において正確である。この
領域はいくつかの近接するＡ−Ｕ塩基対またはＧ−Ｕ塩基対があり、これらの安
定性は、より低い。ゆえに、より高い断片化の可能性を持っている。
【０３８３】 領域２についてＡｌｉｇｎ Ｈｉｔからの配列情報の抽出に続き、図１１３に
示すようにＣＬＵＳＴＬ Ｗ（１．７４）で複数配列整列を行う。こうして、図
１１４に示すように、配列整列に対する領域２における塩基対間の可能性のある
ステム構成をｄｏｍｅフォーマットで得る。ｄｏｍｅフォーマットファイルをｃ
ｔファイルに変換した後、図１１５に示すようにＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３．２１を構造の視覚化に使用する。
【０３８４】 実施例７：インターロイキン−２（ＩＬ−２） 図１１６はＨｏｖｅｒｇｅｎデータベースで出力されたすべてのＩＬ−２オー
ソログの系統樹を示している。これらのオーソログはそれぞれＧｅｎＢａｎｋフ
ォーマットで保存され、単一のデータファイルに集められる。コード化領域の５
および３ 側面にある非翻訳領域は先に述べたとおりＳＥＡＬＳおよびＣＯＷ
Ｘを用いて抽出、比較される（図５７、図６４参照）。 ＳＥＡＬＳおよびＣＯＷＸを用いた抽出と比較の後、３ＵＴＲ領域の中で関連
をもつ可能性のある領域の決定にＡｌｉｇｎ Ｈｉｔを使用した。該当する二つ
の領域が現れ、これに続く分析に使用された（図１１７参照）。領域１について
ＡｌｉｇｎＨｉｔからの配列情報の抽出に続き、ＣＬＵＳＴＬ Ｗ（１．７４）
で、図１１８に示すように複数配列整列を行う。これによって、ＲｅｖＣｏｍｐ
を用いて決定された配列整列に対する領域１における塩基対間の可能性のあるス
テム構成をｄｏｍｅフォーマットで得る（図１１９参照）。図１２０に示すよう
に、ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３．２１を構造の視覚化に使用する。領域２
についてＡｌｉｇｎ Ｈｉｔからの配列情報の抽出に続き、ＣＬＵＳＴＬ Ｗ（
１．７４）で、図１２１に示すように複数配列整列を行う。このようにして、図
１２２に示すように、配列整列について、領域２における塩基対間の可能性のあ
るステム構成をｄｏｍｅフォーマットで得る。ｄｏｍｅフォーマットファイルを
ｃｔファイルに変換した後、図１２３に示すようにＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
【０３８５】 ３．２１を構造の視覚化に使用する。 上記の二つの領域に加えて、領域２の下流にあり、且つ、一部分重複する第３
の領域が代替の照会配列（３０８７７８４．ｆａ）を用いて同定された。これは
図１２４に示す。この領域についてＡｌｉｇｎ Ｈｉｔからの配列情報の抽出に
続き、ＣＬＵＳＴＬ Ｗ（１．７４）で、図１２５に示すように複数配列整列を
行う。このようにして、図１２６に示すように、配列整列について、領域３にお
ける塩基対間の可能性のあるステム構成をｄｏｍｅフォーマットで得る。ｄｏｍ
ｅフォーマットファイルをｃｔファイルに変換した後、ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕ
ｒｅ ３．２１が構造の視覚化に使用される（図１２７参照）。
【０３８６】 実施例８：インターロイキン−４（ＩＬ−４） 図１２８はＨｏｖｅｒｇｅｎデータベースで出力されたすべてのＩＬ−４オー
ソログの系統樹を示している。これらのオーソログはそれぞれＧｅｎＢａｎｋフ
ォーマットで保存され、単一のデータファイルに集められる。コード化領域の５
および３ 側面にある非翻訳領域は先に述べたとおりＳＥＡＬＳおよびＣＯＷ
Ｘを用いて抽出、比較される（図５７、図６４参照）。 ＳＥＡＬＳおよびＣＯＷＸを用いた抽出と比較の後、図１２９に示すように、
５ＵＴＲ領域の中で関連をもつ可能性のある領域の決定にＡｌｉｇｎ Ｈｉｔを
使用した。上記の領域についてＡｌｉｇｎ Ｈｉｔからの配列情報の抽出に続き
、ＣＬＵＳＴＬ Ｗ（１．７４）で、図１３０に示すように複数配列整列を行う
。これによって、ＲｅｖＣｏｍｐを用いて決定された配列整列について、塩基対
間の可能性のあるステム構成をｄｏｍｅフォーマットで得る（図１３１参照）。
図１３２に示すように、ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３．２１を構造の視覚化
に使用した。
【０３８７】 図１３３は、代表的なＩＬ−４の３ＵＴＲ領域におけるＡｌｉｇｈ Ｈｉｔ表
示を示している。３ＵＴＲ領域についてＡｌｉｇｎ Ｈｉｔからの配列情報の抽
出に続き、ＣＬＵＳＴＬ Ｗ（１．７４）で、図１３４に示すように複数配列整
列を行う。図１３５に示すように、この配列整列について、領域２における塩基
対間の可能性のあるステム構成をｄｏｍｅフォーマットで得る。ｄｏｍｅフォー
マットファイルをｃｔファイルに変換した後、ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３
．２１が構造の視覚化に使用される（図１３６参照）。
【０３８８】 実施例９：ライブラリープレート自動合成のための一般的手順 ＡｒｇｏＧｅｌ−ＯＨTM（３６０ｍｇ、負荷０．４３ｍｍｏｌｅ／ｇ）を３：
１ ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＤＭＦ〜１６ｍＬ溶液に懸濁する。懸濁液は９６ウェルポリ
プロピレン合成プレート（３０ｍｇ／ウェル）の１２ウェルに等分に分配する。
溶媒を排出させ、レジンをＰ2 Ｏ5 存在下で終夜減圧乾燥させる。全ての固体試
薬は使用前にＰ2 Ｏ5 存在下で終夜減圧乾燥させる。方法１では、Ｍｉｔｕｎｏ
ｂｕ試薬１を乾燥させ、０．１５Ｍ濃度で無水ＣＨ2 Ｃｌ2 に溶解させた。また
、方法１では、ＦＭＯＣ−アミノ酸（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社、Ｂａｃｈｅｍ
ＣＡ社）を、２：１ 無水ＣＨ2 Ｃｌ2 ／ＤＭＦ溶液に、濃度０．３０Ｍで溶
解させ、方法２ではＦＭＯＣ−アミノ酸を、合成のため０．０４Ｍのコリジンを
含有するＤＭＦに０．２２Ｍ濃度で溶解する。スルフォニルクロリドはピリジン
に０．２Ｍの濃度で溶解させる。ピリジンはほとんどのスルフォニルクロリドに
対して容認性の溶媒であることが判明している。しかし、溶解性が制限される場
合は、ＭｅＣＮ、ＤＭＳＯ、ＣＨ2 Ｃｌ2 、ＤＭＦ、およびＮＭＰ（５０％まで
）のような共同溶媒を使用した。ＦＭＯＣ保護基は、調製し合成日に使用する無
水ＤＭＦ中の１０％ピペリジンによって取り除いた。レジンと初期アミノ酸の最
大結合率を確保するために低水洗浄溶媒を使用した。試薬添加の前に、水分感受
性試薬ラインをアルゴンで２０分間浄化した。試薬を適切な濃度まで溶解し合成
装置に導入した。大きい容器（８送達ラインを含む）は溶媒の洗浄と活性化物質
の送達に用いる。アミノ酸およびスルフォニルクロリドを含む小さい中隔容器で
は、針を容器の加圧と送達経路として使用することにより無水調製および複数試
薬の効果的な導入が行える。全ての試薬導入の後、ラインは試薬により初回刺激
され、流量を測定し、試薬表に記入する（．ｔａｂファイル）。プレートに装填
したレジンを減圧から外し、次の合成を行う装置に導入する。溶媒を支持体から
切断し、遠心気化した後、生成物をＭｅＯＨ／ＣＨ2 Ｃｌ2 混合物に溶解し、Ｕ
ＶおよびＩ2 の両方を用いたシリカゲル上のＴＬＣ（通常は１０％ＭｅＯＨ／Ｃ
Ｈ2 Ｃｌ2 ）によって純度を分析した。また、エレクトロスプレー質量分析（負
モード）で生成物同一性を分析した。選択したサンプルはＤＭＳＯ−ｄ6 に溶解
し、1 Ｈ ＮＭＲによって検査した。
【０３８９】 実施例１０：一般的ヒドロキサム酸合成法１（図３４） 市販のＡｒｇｏＧｅｌ−ＯＨTMレジン（１０μｍｏｌｅ）はＣＨ2 Ｃｌ2 で
洗浄し（６回）、適切なＦＭＯＣ−アミノ酸（３ ｅｑ）および１（３ ｅｑ）
で処理する。３０分後、ウェルを排出する。この手順は４回行う（１２ｅｑ）。
レジンはＣＨ2 Ｃｌ2 で６回、ＤＭＦで４回、およびＤＭＦ中の１０％ピペリジ
ンによって取り除いたＦＭＯＣで４回洗浄する。洗浄液を集め、適切に希釈する
。溶出したＦＭＯＣ発色団の量をＵＶ（ε７８００Ｌ＊ｍｏｌ-1＊ｃｍ-1、λ＝
３０１ｎｍ）で定量する。この値は最終生成物の収率の計算に用いる。次にレジ
ンをＤＭＦで４回、続いてＣＨ2 Ｃｌ2 で６回洗浄し、ピリジン中の適切なスル
フォニルクロリド（４ｘ６ｅｑ、１５分間）により処理を行う。次にＣＨ2 Ｃｌ 2 で６回、ＤＭＦで６回、およびＣＨ2 Ｃｌ2 で１０回洗浄する。この時点でレ
ジンを９０：５：５ ＴＦＡ／Ｈ2 Ｏ／Ｅｔ3 ＳｉＨにて４時間処理する。そし
て、必要であれば、レジンを、分子上のすべての側鎖保護基を取り除くための上
記の手順下に置く。プレートを装置から取り外し、個々のウェルを１，４−ジオ
キサン中の４Ｍヒドロキシルアミン（水性、５０％）にて４時間処理した。濾液
を深いウェルの９６ウェルプレートに集め、サンプルを凍らせ、必要なヒドロキ
サム酸を得るため凍結乾燥させる。新たな１，４−ジオキサンを追加し、凍結乾
燥手順を２回繰り返すことにより、すべての残留ヒドロキシアミンから化合物を
遊離させる（選択した生成物の1 Ｈ ＮＭＲによって行う）。
【０３９０】 実施例１１：一般的ヒドロキサム酸合成法２（図３５） レジン６は公開された手順に従ってＡｒｇｏＧｅｌ−ＯＨTMレジンから調製す
る。また、このレジン（１０μｍｏｌｅ）はＤＭＦ（６回）、ＣＨ2 Ｃｌ2 （６
回）にて洗浄し、ＤＭＦ＋コリジン（６ｅｑ）およびＨＡＴＵ（３ｅｑ）中の適
切なＦＭＯＣ−アミノ酸（３ｅｑ）で処理する。３０分後、ウェルを排出する。
この手順は４回繰り返す（１２ｅｑ）。レジンをＣＨ2 Ｃｌ2 （６回）、ＤＭＦ
（４回）にて洗浄し、ＤＭＦ中の１０％ピペリジンによって取り除いたＦＭＯＣ
で４回洗浄する。洗浄液を集め、適切に希釈する。溶出したＦＭＯＣ発色団の量
をＵＶ（ε７８００Ｌ＊ｍｏｌ-1＊ｃｍ-1、λ＝３０１ｎｍ）で定量する。この
値は最終生成物の収率の計算に用いる。次にレジンをＤＭＦで４回、続いてＣＨ 2 Ｃｌ2 で６回洗浄し、ピリジン中の適切なスルフォニルクロリド（４ｘ６ｅｑ
、１５分間）により処理する。次にＣＨ2 Ｃｌ2 で６回、ＤＭＦで８回、ＤＭＳ
Ｏで８回、およびＣＨ2 Ｃｌ2 で１０回洗浄する。プレートを装置から取り外し
個々のウェルを９０：５：５ ＴＦＡ／Ｅｔ3 ＳｉＨ／ Ｈ2 Ｏにて４時間処理
する。濾液を深いウェルの９６ウェルプレートに集め、レジンをＴＦＡで３回洗
浄し、サンプルを遠心減圧濃縮装置に濃縮する。新たな１，４−ジオキサンを追
加し、濃縮手順を二度繰り返し、終夜減圧乾燥を行い必要なヒドロキサム酸を得
る。
【０３９１】 実施例２および実施例３の両方の方法を、表２に示すＦＭＯＣ−アミノ酸およ
びスルフォニルクロリドの組み合わせによって生じた化合物の、ライブラリー作
成に利用した。
【０３９２】
【表５】
【０３９３】 a ここに示した、可能性を持つ組み合わせのすべてを、方法２による１２９６
ヒドロキサム酸合成の試みに使用した（図３５）。b ＦＭＯＣ−アミノ酸に使用
される標準の略語。使用したアミノ酸はすべてＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社、Ｂａ
ｃｈｅｍ社、もしくはＳｙｎｔｈｅｔｅｃｈ社より入手した。c 先端を切った形
の化学名を表中に記す。記載した接頭語に「塩化スルフォニル」を付加すると適
切な名前になる。使用したすべての塩化スルフォニルはＡｌｄｒｉｃｈ社、Ｌａ
ｎｃａｓｔｅｒ社、もしくはＭａｙｂｒｉｄｇｅ社より入手した。d 方法１によ
って調製した（図３４）。e 方法１では不成功であった。
【０３９４】 実施例１２：代表的な並行整列合成装置入力ファイル ソフトウエアの入力受け入れタブは全てのテキストエディタからのテキストフ
ァイルを区切る。図３４の手順を使ったヒドロキサム酸合成の例を表３（．ｃｍ
ｄファイル）および表５（．ｔａｂファイル）に示した。合成価値のあるウェル
を数個のみ簡略に示した。調製されたプレート全体に関しては、付加的塩化スル
フォニルおよび付加的アミノ酸のみ．ｔａｂファイルに付け加える必要があり、
この２つによる付加的組み合わせを．ｓｅｑファイルに付け加える必要がある。
．ｓｅｑファイルは９６ラインあり、それぞれのラインはただ一つの調製化合物
と対応している。
【０３９５】 エレクトロスプレー質量分析（負モード）、およびＭｅＯＨ／ＣＨ2 Ｃｌ2 混
合物溶媒混合物を使用した機械内薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって、
化合物の同一性および純度を決定した。全ての第３ウェルにおける合成生成物は
、ＴＬＣおよびエレクトロスプレー質量分析によって分析され、上記の合成法の
どちらを使った場合も、必要な化合物は一般に純度６０％から９０％で存在した
。
【０３９６】
【表６】 表３．図３４にある合成を実行する．ｃｍｄファイル（一般的合成手順）の例
。ヒドロキシルアミンのある支持体からの切断は別に行われる。 INITIAL＿WASH BEGIN Repeat6 Add CH2Cl2 300 Drain 20 End ＿Repeat END COUPLE ＿AMINO ＿ACID BEGIN Repeat4 Add<SEQ>100+<ACT1>200 Wait 1800 Drain 20 End＿Repeat Repeat 6 Add CH2Cl2 300 Drain 20 End＿Repeat Repeat4 Add DMF 300 Drain 20 End＿Repeat END REMOVE＿FMOC BEGIN Load ＿Tray Repeat 4 Add PIPERIDINE＿DMF 300 Wait 250 Drain 20 End＿Repeat Remove ＿Tray Repeat 4 Add DMF 300 Drain 20 End＿Repeat Repeat 6 Add CH2Cl2 300 Drain 20 End＿Repeat END SULFONYLATE＿AMINO ＿ACID BEGIN Next＿Sequence Repeat 4 Add<SEQ>300 Wait 900 Drain 20 End ＿Repeat Repeat 6 Add CH2Cl2 300 Drain 20 End ＿Repeat END FINAL＿WASH BRGIN Repeat 6 Add DMF 300 Drain 20 End＿Repeat Repeat 8 Add CH2Cl2 300 Drain 20 End＿Repeat Repeat 2 Add CH2Cl2 300 Drain 60 End＿Repeat END
【０３９７】
【表７】 表4 ．.seqファイル( 作成化合物リスト)の例 1 A1 10 FMOC ＿D ＿ALA 4＿MEO ＿BENZENE ＿SO2CL 2 A2 10 FMOC ＿D ＿VAL 2＿NAPTHYLENE＿SO2CL 3 A3 10 FMOC ＿D ＿PHE 3＿CF3 ＿BENZENE ＿SO2CL 4 A4 10 FMOC ＿D ＿NAL 4＿CL＿BENZEN＿SO2CL 5 A5 10 FMOC ＿D ＿SER(OTBU) 4＿MEO ＿BENZENE ＿SO2CL 6 A6 10 FMOC ＿D ＿ARG ＿PMC 2＿NAPTHYLENE＿SO2CL 7 A7 10 FMOC ＿D ＿ALA 3＿CF3 ＿BENZENE ＿SO2CL 8 A8 10 FMOC ＿D ＿VAL 4＿CL＿BENZEN＿SO2CL 9 A9 10 FMOC ＿D ＿PHE 4＿MEO ＿BENZENE ＿SO2CL 10 A10 10 FMOC ＿D ＿NAL 2＿NAPTHYLENE＿SO2CL 11 A11 10 FMOC ＿D ＿SER(OTBU) 3＿CF3 ＿BENZENE ＿SO2CL 12 A12 10 FMOC ＿D ＿ARG ＿PMC 4＿CL＿BENZEN＿SO2CL
【０３９８】
【表８】 表5 ．.tab( 使用試薬リスト)の例 AMINO ＿ACIDS BEGIN 1 FMOC＿D ＿ALA 265 0.30 2 FMOC＿D ＿VAL 265 0.30 3 FMOC＿D ＿PHE 265 0.30 4 FMOC＿D ＿NAL 265 0.30 5 FMOC＿D ＿SER(OTBU) 265 0.30 6 FMOC＿D ＿ARG ＿PMC 265 0.30 END SOLVENTS BEGIN 67 CH2CL2 330 1 66 DMF 240 1 SULFONYLCHLORIDES BEGIN 9 4＿MEO ＿BENZENE ＿SO2CL 220 0.20 10 2 ＿ NAPTHYLENE ＿SO2CL 220 0.20 11 3 ＿CF3 ＿BENZENE ＿SO2CL 220 0.20 12 4 ＿CL＿BENZEN＿SO2CL 220 0.20 END DEBLOCK BEGIN 68 PIPERIDINE＿DMF 230 1 END ACTIVATORS BEGIN 69 BETAINE 300 0.15 Activates AMINO＿ACIDS END
【０３９９】 実施例１３：活性化合物の手動溶液合成 メチル（２Ｒ）−２−アミノ−３−（２−ナフチル）プロパノエート ＭｅＯＨ（１７ ｍＬ）中のＤ−塩酸ナフチルアラニン（２．１５ｇ、１０ ｍｍｏｌｅ、Ｂａｃｈｅｍ ＣＡ社）の懸濁液に、ＴＭＳ−Ｃｌ（２．８ ｍＬ
、２２ ｍｍｏｌｅ）を攪拌しながら滴下する。この混合物は終夜攪拌し、その
結果生じた溶液を減圧濃縮しＫＯＨ下で乾燥させ、２．６５ｇ（１００％）のメ
チル（２Ｒ）−２−アミノ−３−（２−ナフチル）プロパノエートを得る。この
２．６５ｇ（１００％）のメチル（２Ｒ）−２−アミノ−３−（２−ナフチル）
プロパノエートは1 Ｈ ＮＭＲで純度が９５％より高く、さらなる精製を行わず
に使用した。Ｒｆ ０．６３（４：１：１ ｎ−ＢｕＯＨ／ＡｃＯＨ／Ｈ2 Ｏ）
、1 Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ８．７６（ｂｓ，３Ｈ），８．００−７．
０３（ｍ，７Ｈ），４．３９（ｔ，１Ｈ），３．６９（ｓ，３Ｈ），３．６６（
ｍ，２Ｈ））、ＭＳ（ＡＰＣＩ+ ）ｍ／ｅ ２３０（Ｍ＋Ｈ）であった。
【０４００】 （２Ｒ）−２−（（（４−ブロモフェニル）スルフォニル）アミノ）−３−（
２−ナフチル）プロパンヒドロキサム酸（５−ｎ−ｖｉ） Ｄ−ナフチルアラニン塩酸メチルエステル（１．３３ｇ、５ ｍｍｏｌｅ）、
（ｉ−Ｐｒ2 ）ＮＥｔ（２．６１ ｍＬ、１５ ｍｍｏｌｅ）、およびＣＨ2 Ｃ
ｌ2 （５０ ｍＬ）中の４−塩化ブロモベンゼンスルフォニル（１．５３ｇ、６
ｍｍｏｌ）懸濁液を室温で終夜攪拌した。この溶液を５％のＮａＨＣＯ3 で洗
浄し、乾燥（Ｎａ2 ＳＯ4 ）、濃縮する。次に、ｈｕｅ分析し（ＭｅＯＨ／ＣＨ 2 Ｃｌ2 のＣＨ2 Ｃｌ2 が１％になるまで）濃縮、２．５ｇのスルホンアミド
エステルを得る。この材料を１−４ジオキサン（５０ ｍＬ）に溶解し、水性ヒ
ドロキシルアミン（５０％ Ｗ／Ｗ）を加える。この混合物を室温で４８時間放
置した後、色相分析（２％から１０％のＭｅＯＨ／ＣＨ2 Ｃｌ2 ）でシリカ上に
濃縮させる。固体残留物を水とともに粉砕し、乾燥させ１．４５ｇ（６４％）の
５−ｎ−ｖｉを得る。Ｒｆ ０．３５（２％ ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２）、1 Ｈ
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ９．２６（ｂｓ，１Ｈ），７．９０−７．２０（
ｍ，１１Ｈ），３．８８（ｄｄ，１Ｈ），２．９０（ｍ，２Ｈ）、ＭＳ（エレク
トロスプレー- ）ｍ／ｅ ４４７，４４９（Ｍ−Ｈ）であった。Ｃ19Ｈ17Ｎ2 Ｏ 4 ＳＢｒ・０．５Ｈ2 Ｏの場合の計算値はＣ，４９．７９；Ｈ，３．９６；Ｎ，
６．１１。測定結果はＣ，４９．７１；Ｈ，３．９０；Ｎ，５．９７。
【０４０１】 （２Ｒ）−３−（２−ナフチル）−２（（２−ナフチルスルフォニル）アミノ
）プロパンヒドロキサム酸（５−ｎ−ｉｉ）． Ｄ−ナフチルアラニン塩酸メチルエステル（１．３３ｇ、５ ｍｍｏｌｅ）、
（ｉ−Ｐｒ2 ）ＮＥｔ（２．６１ ｍＬ、１５ ｍｍｏｌｅ）、およびＣＨ2 Ｃ
ｌ2 （５０ ｍＬ）中の４−塩化ブロモベンゼンスルフォニル（１．３６ｇ、６
ｍｍｏｌ）懸濁液を室温で終夜攪拌した。この溶液を５％のＮａＨＣＯ3 で洗
浄し、乾燥（Ｎａ2 ＳＯ4 ）、濃縮する。次に、色相分析し（ＭｅＯＨ／ＣＨ2 Ｃｌ2 のＣＨ2 Ｃｌ2 が１％になるまで）濃縮、２．０２ｇのスルホンアミド
エステルを得る。この材料を１−４ジオキサン（５０ ｍＬ）に溶解し、水性ヒ
ドロキシルアミン（５０％ Ｗ／Ｗ）を加える。この混合物を室温で４８時間放
置した後、色相分析（２％から１０％のＭｅＯＨ／ＣＨ2 Ｃｌ2 ）で濃縮させる
。固体残留物を水とともに粉砕し、乾燥させ１．１５ｇ（５５％）の５−ｎ−ｉ
ｉを得る。Ｒｆ ０．３３（２％ ＭｅＯＨ／ＣＨ2 Ｃｌ2 ）、1 Ｈ ＮＭＲ（
ＤＭＳＯ−ｄ6 ）δ９．１９（ｂｓ，２Ｈ），８．１７（ｓ，１Ｈ）， ７．９
５−７．３５（ｍ，１２Ｈ），３．９７（ｔ，１Ｈ），２．８３（ｍ，２Ｈ）、
ＭＳ（エレクトロスプレー- ）ｍ／ｅ ４１９（Ｍ＋Ｈ）であった。Ｃ23Ｈ20Ｎ 2 Ｏ4 Ｓ・０．７５Ｈ2 Ｏの場合の計算値はＣ，６３．８５；Ｈ，４．９９；Ｎ
，６．４５。測定結果はＣ，６３．５７；Ｈ，４．７４；Ｎ，６．７４。
【０４０２】 実施例１４：抗菌性試験 粗製化合物は抗菌性活性のための代表的な高速処理スクリーニング分析で選別
され、化合物５−ｎ−ｉｉおよび５−ｎ−ｖｉが大腸菌に対してそれぞれ０．７
−１．５μＭおよび３−６μＭの最小細菌発育阻止濃度（ＭＩＣ）の活性を持つ
ことが判明した。この活性は、上記の実施例６に述べたように分析的に純粋であ
り同一の活性を持つ材料の手動溶液合成によって立証された。
【０４０３】 実施例１５：機能的スクリーニング ＭＡＳＳあるいは従来の高速処理機能的スクリーンにより、化合物の結合親和
性をスクリーニングする。２５６−メンバーライブラリーの１６Ｓ Ａ部位リボ
ソームＲＮＡ構造対するドッキングから得た化合物の最高スコアを下の表に示し
た。ＤＯＣＫスコア範囲は表６に記したとおり ３０８．８から−１４４．２ま
でであった。ＮＭＲ構造がすでに決定されている１６Ｓ Ａ部位の２７−ｍｅｒ
モデルＲＮＡ配列にＭＡＳＳ分析を行った。転写／翻訳の分析はルシフェラー
ゼプラスミドの発現に基づく。
【０４０４】
【表９】
【０４０５】 パロモマイシンは、Ａ部位ＲＮＡ構造に結合することが分かっているアミノグ
リコシド抗生物質である。ＮＭＲ構造はＡ部位のパラモマイシン結合により決定
された。パロモマイシンは高い化学的スコアおよびエネルギースコアと共に、最
も高いＤＯＣＫ接触スコアを持つ。これらの化合物のドッキングの結果はＭＡＳ
Ｓ質量分析を用いた１６Ｓ Ａ部位断片への結合親和性と関連があり、また、こ
れら化合物の転写／翻訳分析におけるタンパク質合成阻害能力とも関連があった
。最高ＤＯＣＫのある１２の化合物のうちの４つが、ＭＡＳＳ分析においてＲＮ
Ａに対する良好な親和性（＜１０μＭ）を示し、＜１０μＭでルシフェラーゼプ
ラスミドの翻訳を阻害した。さらに、ＭＡＳＳ分析スコアで「良好」な結合を示
した９つの化合物はすべてＤＯＣＫ計算で上位３０％にあった。 トキ化合物１６９９７０は全化合物スコアの中で最高エネルギースコアを示し
たが、接触スコアは不良であった。この結果は、１６Ｓ Ａ部位との親密な接触
数増加のための構造修正により、生物活性が増加する可能性があることを示して
いる。
【０４０６】 実施例１６：ＴＡＲの標的部位 ＴＡＲ ＲＮＡ（Ｖａｒａｎｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５年、２５
３号、３１３ページ）のＮＭＲ溶液構造は、ＨＩＶ−１ ＴＡＲ ＲＮＡリガン
ドの仮想スクリーニングの研究に使用されてきた。有効化学薬品データベース（
ＡＣＤ）にある化合物は、その形式電荷（中性、＋１、＋２、など）に従い多く
のサブセットに区分され、ＴＡＲ構造にＤＯＣＫされている。アミノグリコシド
抗生物質は最高結合エネルギーのある２０の化合物の中にあった。
【０４０７】 また、多くの化合物はこれに続く溶媒和／脱溶媒和エネルギーの評価のあるＴ
ＡＲとドッキングした。見本結果を図３６に示す。図はＡＣＤ ００００１１９
９およびＡＣＤ ００１９２５０９が、低いＩＣ50値と同様に、比較的低い溶媒
和／脱溶媒和エネルギーを示すことを明らかにしている。
【０４０８】 実施例１７：Ｌ１１／チオストレプトン−高速処理ＲＮＡ／タンパク質分析の一
例 ＲＮＡ分子は、自然の状態では、構造的な機能から酵素的な機能まで、細胞機
能において多くの役割を果たす。これらのＲＮＡ分子は一つあるいはそれ以上の
タンパク質を持つ複合体で、あるいは、一つまたはそれ以上のＲＮＡ分子と共同
で、一つの大きな分子として機能する場合がある。リボソームで見られるような
、これらの複合体には、サイズが非常に大きくまた非常に複雑であるため、実質
的には高速処理スクリーニングの標的として扱いにくいものもある。リボソーム
は、一見して非常に有効な薬剤のための標的となりそうなＲＮＡ構造と機能の、
特に豊富な情報源である。この方法の普遍的成功を示すリボソーム標的を対象と
する多くの天然抗生物質が存在する。これらの天然抗生物質には、アミノグリコ
シド、キロロマイシン、ネオマイシン、パルモマイシン、チオストレプトン、お
よび他の多くの物質がある。環状ペプチド抗生物質であるチオストレプトンは、
５０ＳリボソームサブユニットのリボソームＧＴＰ加水分解酵素において、いく
つかの反応を阻害する。チオストレプトンが、同じ部位で５０Ｓサブユニットの
２３ＳリボソームｒＲＮＡ構成成分に結合することにより、大きなリボソームタ
ンパク質Ｌ１１として作用する証拠がある。Ｌ１１の２３ＳｒＲＮＡへの結合に
より、タンパク質三次構造で、大きな高次構造変化が引き起こされる。チオスト
レプトンのｒＲＮＡへの結合はＬ１１／２３Ｓ ｒＲＮＡ交互作用の強さの増加
を引き起こし、Ｌ１１タンパク質で高次構造遷移イベントを妨げるようである。
その結果翻訳が失速する。残念ながら、チオストレプトンの溶解性は非常に悪く
、比較的高い毒性があり、通常、抗生剤としては有用ではない。これらのタイプ
を対象にした新しい、新規性のある抗生物質の発見は大きな価値がある。
【０４０９】 リボソームに関連標的を対象にした新しい抗生物質高速処理分析の設計は、構
造が大きいこととＲＮＡ／タンパク質交互作用の結合親和性が低いことから、部
分的に困難がある。近年、リボソーム内のＲＮＡ構造に関する膨大な量のデータ
が作成されてきた。このデータにより、多くの構造が解明され、また、その他の
多くの構造予測が可能になった。さらに、ＳＰＡ分析フォーマットの使用により
、結合構成成分の濃度を下げる洗浄などの段階なしで分析することが可能である
。これにより、非常に低いＫｄ（＞１ μＭ）で結合交互作用が検査できるよう
になった。
【０４１０】 チオストレプトンの作用機序は、２３Ｓ ｒＲＮＡの領域を安定化させるよう
である。また、それはＬ１１プロテインで構造遷移を妨げるよう働くことによる
。ＲＮＡ／タンパク質交互作用を調べる多くの分析の中で、ＳＰＡ分析はチオス
トレプトン「類似」物質として効果を持ち得る低分子を探すために設計された。
この分析法は放射タグされた２３Ｓ ｒＲＮＡの小断片、すなわち、ドメインに
結合している２３Ｓ ｒＲＮＡおよびチオストレプトンを含むＬ１１タンパク質
の、ビオチンタグされた７５アミノ酸断片を使用する。２３Ｓ ｒＲＮＡ断片の
二次構造および三次構造の畳み込みの状態を検査し、Ｌ１１断片の２３Ｓ ｒＲ
ＮＡに対する結合状態とした。Ｌ１１−チオストレプトン分析は最適化され、２
３Ｓ ｒＲＮＡ断片は化合物に添加される前に、非折り畳み状態にされる。折り
畳みが解けたＲＮＡにＬ１１断片を添加することにより、検出可能な結合交互作
用は無くなる。高速処理分析は、不安定状態下で、２３Ｓ ｒＲＮＡ断片と関連
のある化合物の混合によって行い、混合物を温置した後、Ｌ１１断片を添加する
。ストレプタビジンコートしたＳＰＡビーズを結合検出のため添加する。チオス
トレプトンはポジティブコントロールとして用いる。ＲＮＡへのチオストレプト
ン添加は、妥当な二次折り畳み構造および／または三次折り畳み構造を増進し、
Ｌ１１断片の結合を可能にし、分析における信号の生成を導く。
【０４１１】 検査した概念図式は、ＲＮＡ／タンパク質機能、構造、および細菌での結合を
調べるための高速処理分析法および低処理量分析法を設計し、開発、遂行するた
めに開発した。しかし、先に述べたＬ１１／チオストレプトン分析は、高速処理
および低処理量スクリーニングのために設計開発した多くのＲＮＡ／タンパク質
交互作用および機能分析法の一つである。他の概念図式には、ＲｎａｓｅＰ、Ｒ
ｎａｓｅＥ、およびＥＦ−Ｔｕ活性などを測定する機能的分析などがある。細菌
性信号認識粒子の機能およびＳ３０集合を検査する分析法も考えられている。
【０４１２】 実施例１８：Ｐ４８−４．５Ｓ交互作用 細菌の信号認識粒子にある４．５Ｓ ＲＮＡ表現のＰ４８タンパク質結合領域
を標的として選択した。Ｐ４８の４．５５ ＳＲＮＡへの結合は細菌の生存に不
可欠であり、また、新しい抗菌性物質を生成するこの結合を持つ阻害剤の開発に
不可欠である。付加化学物質同様、有効化学薬品データベース（ＡＣＤ）からの
化合物（〜２ｘ１０5 ）を用いてＤＯＣＫ（Ｍｅｎｇら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅ
ｍ．１９９２年、１３号、５０５〜５２４ページ）による初期スクリーニングを
行った。ＤＯＣＫは参照としてここに加えた（完全な形で）（４．０版）。４６
ｍｅｒＮＭＲ構造とのドッキングで合理的で良好な相補性を持つデータベースの
約１５〜２０％が残されるはずである。この４６ｍｅｒＮＭＲ構造はＥ．ｃｏｉ
ｌ ４．５Ｓ ＲＮＡの非対称バルジ領域由来の構造である。それぞれの高次構
造の局所的極小化と共に、ＩＣＭプログラム（２．６版）を用いて、ねじれ角に
おける偽性ブラウンモンテカルロ検索を行い、ＮＭＲ構造および経験的な自由エ
ネルギー関数を用いて予測した親和性スコアに、先端を切り捨てた潜在リガンド
を自動的に柔軟にドッキングさせた。
【０４１３】 約２０００の最高スコア化合物を実験的に検査し、そのＰ４８の４．５Ｓ Ｒ
ＮＡへの結合阻害能を検証した。選択された化合物が提供するＰ４８の４．５Ｓ
ＲＮＡ結合は、（ｈｉｓ）6 −でタグされたＰ４８および33Ｐ−ＲＮＡを使っ
て高処理量シンチレーション接近分析システムによって測定する。この２０００
の化合物の間の構造活性関連性は、拡大する合成の試みの基礎として役立つだろ
う。
【０４１４】 非対称ＲＮＡバルジ領域への低分子のドッキングによって、生体内で４．５Ｓ
−Ｐ４８交互作用を不安定化させる選択性を有する可能性の高い化合物の同定が
期待される。図３７に示した標的ＲＮＡの構造はこの提案の第１相において、Ｎ
ＭＲを用いて決定する。有効化学薬品データベース（ＡＣＤ）からの化合物（〜
２ｘ１０5 ）をこの構造にドッキングさせ、予測親和性を得る。分子のＲＮＡ−
タンパク質交互作用を分裂させる能力をスクリーニングすることにより最良の分
子を得る。定量的構造活性関連性（ＱＳＡＲ）研究は最も活動的な化合物につい
て行い、臨界の特徴およびＲＮＡとの交互作用を同定する。新しい化合物（〜２
０，０００）は、組み合わせによる添加、および／または、ヒトの対応する部分
に関係する細菌ＳＲＰのための化合物の活性と特異性を向上させる、水素結合、
芳香族、および荷電官能基の再ポジショニングによって調製する。さらに、それ
ぞれの高次構造の局所的極小化と共に、ＩＣＭプログラム２．６版（Ａｂａｇｙ
ａｎら、Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．１９９４年、１５号、４８８−５０６。参照にて
完全な形でここに記載）を用いて、ねじれ角における偽性ブラウンモンテカルロ
検索を行い、ＮＭＲ構造モデルに、先端を切り捨てたデータベースを自動的に柔
軟にドッキングさせる。
【０４１５】 柔軟なドッキング遂行の後、リガンドを評価するために、これらの結合自由エ
ネルギーを評価する関数を用いる。結合自由エネルギー評価には経験的な多くの
方法があるが、熱力学的結合サイクルからの経験的な自由エネルギー関数を使用
する方針である（Ｆｉｌｉｋｏｖら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．−Ａｉｄｅｄ Ｍｏｌｅｃ
．Ｄｅｓｉｇｎ １９９８年、１２号、１−１２ページ。参照として全体をここ
に記載）。
【０４１６】 実施例１９：分子ドッキングにより同定された「低」分子による分子相互作用部
位を含有するｍＲＮＡの翻訳の阻害 真核細胞内のｍＲＮＡの翻訳は５' −キャップ（ｍ7 Ｇｐｐｐ）での翻訳開始
複合体の形成に続いて起こる。様々な開始因子がこの５' −キャップに結合しプ
レイニシエーション複合体を形成し、その後ＡＵＧ開始コドンの上流側の５' −
非翻訳部位に４０Ｓリボソームサブユニットが結合する。Ｐａｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ
．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９６，２３６，７４７−７７１。この５' −キャップ
近くのＲＮＡ２次構造がｍＲＮＡの翻訳速度に影響を及ぼし得ることが明らかに
されている。Ｋｏｚａｋ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１，２６
６，１９８６７−１９８７０。これらのＲＮＡ構造はタンパクと結合することが
でき、翻訳のレベルを阻害する。スタンダートら、ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９
４，７６，８６７−８７９。この翻訳機械はｅＩＦ−４ａ／ｅＩＦ−４ｂ複合体
と緊密な関係にあるＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼ活性を持ち、通常の条件の下
ではこのＲＮＡ構造はヘリカーゼにより開かれ、ｍＲＮＡの翻訳速度を低下させ
ることはない。このｅＩＦ−４ａはプレイニシエーション複合体に対し親和性が
低い（−μＭ）。
【０４１７】 ５' −キャップ近辺のｍＲＮＡ構造の安定化はまた特定の「低」分子によって
行われ、このような結合によりｍＲＮＡの翻訳効率が減少するであろうと考えら
れている。この仮説を試験するために、ＮＭＲにより構造を調べたＨＩＶ ＴＡ
Ｒステム−ループバルジの２７−ｍｅｒ ＲＮＡ構成体を含有するルシフェラー
ゼメッセージを５' −ＵＴＲの後ろに持つプラスミドを構築した。得られたｍＲ
ＮＡはＴ７ポリメラーゼを補足した小麦胚芽溶解物翻訳システム中で、ｍ7 Ｇを
この溶解物に添加した後、発現およびキャップすることができた（図３８Ａ参照
）。９塩基リーダーをＴＡＲ構造の前に挿入することにより（ＨＩＶｌｕｃ＋９
）、翻訳効率が強化されたが、これはおそらくプリイニシエーション複合体が形
成されたことによる。このプレイニシエーション複合体と緊密に結びついている
ヘリカーゼ活性はＴＡＲ ＲＮＡ構造を一時的に溶解することができ、メッセー
ジが翻訳される（図３８Ａ参照）。３９個のアミノ酸ｔａｔペプチドを溶解物に
添加すると、ＴＡＲ ＲＮＡおよびｔａｔ間の特異的相互作用から予測されると
おり、ＴＡＲ ＲＮＡ構造が安定化され、ルシフェラーゼタンパクの発現が阻害
された（図３８Ｂ参照）。
【０４１８】 ついでＴＡＲ−ルシフェラーゼｍＲＮＡの翻訳を阻害することができた有機「
低」分子をＴＡＲ ＲＮＡ構造を安定化することによって見つけだした。有効化
学薬品ディレクトリ（ＡＣＤ）の化合物をＴＡＲ ＲＮＡ構造へドッキングさせ
、結合エネルギーを記録した。上位２５の化合物の中にＡＣＤ００００１１９９
があるが、その構造を下記に示す。この化合物はＴＡＲ ＲＮＡと充分な親和力
を持って結合し、１μＭの濃度で、ｔａｔペプチドとの相互作用を破壊すること
がわかった。 ＡＣＤ００００１１９９構造
【０４１９】
【化１】
【０４２０】 ００００１１９９をルシフェラーゼｍＲＮＡを含有する小麦胚芽分解物翻訳シ
ステムへ添加することにより、極めて高い濃度において若干翻訳の阻害が生じた
（図３９参照）。しかし、この化合物は５' −ＵＴＲにＴＡＲ ＲＮＡ構造を持
つルシフェラーゼｍＲＮＡの翻訳を阻害する上ではるかに有効であり、ＴＡＲ
ＲＮＡ構造へ特異的に結合しない低分子の濃度が５０・・の時に、翻訳を５０％
低下させ、またどちらのｍＲＮＡ構成体の翻訳にも影響しなかった（データは未
掲載）。
【０４２１】 実施例２０：１６Ｓ ｒＲＮＡ Ａ部位に相当する２７−ｍｅｒ ＲＮＡの構造
を決定する 配列５' −ＧＧＣ−ＧＵＣ−ＡＣＡ−ＣＣＵ−ＵＣＧ−ＧＧＵ−ＧＡＡ−ＧＵ
Ｃ−ＧＣＣ−３' の１６Ｓ ｒＲＮＡ Ａ部位に相当する２７−ｍｅｒ ＲＮＡ
の構造を研究するために、３つのデオキシアデノシン（ｄＡ）残基を７，２０お
よび２１位に含有するキメラＲＮＡ／ＤＮＡ分子を自動シンセサイザー上で標準
核酸合成プロトコルを用いて生成した。配列５' −ＧＧＣ−ＧＵＣ−ｄＡＣＡ−
ＣＣＵ−ＵＣＧ−ＧＧＵ−ＧｄＡｄＡ−ＧＵＣ−ＧＣＣ−３' のキメラ核酸を水
溶液の形で、エレクトロスプレー質量分析計へ注入した。このキメラのエレクト
ロスプレーイオン化により多様に帯電された一組のイオンを得ることができ、そ
の中で核酸の（Ｍ−５Ｈ）5-の形に相当するイオンをさらに衝突誘導解離（ＣＩ
Ｄ）に付すことにより研究した。このイオンはＣＩＤにより切断され、ｍ／ｚが
それぞれ１００６．１、１１６２．８および１０６６．２である３つのフラグメ
ントが生じることがわかった。これらのフラグメントはそれぞれ導入されたｄＡ
残基の隣のキメラ核酸の切断により形成される、Ｗ7 (2-)、Ｗ8 (2-)およびａ7 −Ｂ(2-)フラグメントに相当している。
【０４２２】 キメラＲＮＡ／ＤＮＡの切断およびフラグメンテーションがこれら３つのｄＡ
部位に隣接して生じることが観察されたので、このテストＲＮＡはｄＡ残基導入
位置の周りに配列されているのではないことがわかる。したがってテストＲＮＡ
は７、２０および２１位において構成されていない。 一連のキメラＲＮＡ／ＤＮＡ分子を系統的に合成し、ＲＮＡの異なる部位にデ
オキシ残基を含有する種々の分子を得た。このようなＲＮＡ／ＤＮＡメンバーを
混合して一つの溶液を作る。この混合物に対し、上述のようなＭＳ分析を行い、
二次あるいは三次構造に関与する残基といかなる構造にも関与しない残基とを示
す、完全なマップ、すなわち「フットプリント」を得た。図４０参照。
【０４２３】 実施例２１：１６Ｓ ｒＲＮＡ Ａ部位に相当する２７−ｍｅｒ ＲＮＡ上のパ
ロモマイシンの結合部位の決定 実施例２０のＲＮＡのパロモマイシンの結合を研究するために、実施例２０の
キメラＲＮＡ／ＤＮＡ分子を自動シンセサイザー上で標準の自動核酸合成プロト
コルを使用して合成した。この核酸のサンプルを次いでＥＳＩに付し、それから
質量分析計中でＣＩＤを行い実施例２０に記載のようにｄＡ導入部位における構
造の欠失を示すフラグメンテーションパターンを得た。これによりこれらのｄＡ
部位のキメラ核酸構造中でのアクセスの容易さが示された。 次にこのキメラ核酸の別のサンプルをパロモマイシンの溶液で処理し、得られ
た混合物をＥＳＩで分析し、ついで質量分析計中でＣＩＤにより分析した。この
エレクトロスプレーイオン化により、核酸だけから観察される物とは異なる一組
の多様に荷電されたイオンが生成されたことがわかった。また観察されたイオン
複合体の質量が増加していたことから、パロモマイシンとこのキメラ核酸とが結
合していることがまた示された。さらに、パロモマイシン核酸複合体中の核酸が
よりコンパクトな構造へとその構造を変化させたことを反映した、多様に荷電さ
れたイオン複合体の分布におけるシフトもまた観察された。 ＣＩＤによる複合体の切断およびフラグメンテーションによりキメラ核酸への
パロモマイシンの結合の位置に関する情報が得られた。ＣＩＤは核酸におけるｄ
Ａ部位でのフラグメンテーションを引き起こさないことが分かった。したがって
パロモマイシンは全３個のｄＡ残基であるいはその近傍で結合しているに違いな
い。パロモマイシンはしたがってこのＲＮＡ／ＤＮＡキメラ標的中のｄＡバルジ
に結合しているものと考えられ、全３個のｄＡ残基を質量分析中の切断から保護
する構造変化を引き起こしている。図４１参照。
【０４２４】 実施例２２：生体分子標的へ結合するコンビナトリアルライブラリーのメンバー
の決定 ３つのｄＡ残基を含有する２７−ｍｅｒ ＲＮＡ（実施例２０で得た物）の溶
液１ｍＬ（０．６Ｏ．Ｄ．）を５００μＬのイソプロパノール／水（１対１）溶
液中に加えて希釈し、酢酸アンモニウム１５０ｍＭ、ｐＨ７．４、ＲＮＡ含量が
１０ｍＭである溶液となるよう調整した。この溶液に酢酸パロモマイシンの溶液
のアリコートを加えて濃度が１５０ｎＭとなるようにした。この混合物を次いで
ＥＳＩ−ＭＳに付し、核酸とその複合体のイオン化を質量スペクトルで追跡した
。パロモマイシン−２７ｍｅｒ複合体の（Ｍ−５Ｈ）５−イオンに相当するピー
クがｍ／ｚ値が１９０７．６の所に見られた。予想の通り、過剰の２７−ｍｅｒ
が約１７８４に（Ｍ−５Ｈ）5-ピークとして質量スペクトル中で観察された。こ
の質量スペクトルは１９０７．６で（これは２７−ｍｅｒとパロモマイシンの質
量の和から予想される）１：１の複合体のみが形成されていること、またｍ／ｚ
＝２０３６．５に現れると予測され得るビス複合体の存在が認められないことを
確認するものである。
【０４２５】 この２７−ｍｅｒ ＲＮＡ／ＤＮＡキメラおよびパロモマイシンの混合物にさ
らに１０μＭのコンビナトリアルライブラリーの原液を０．７ｍＬ加え、この２
７−ｍｅｒ標的を含有する混合物中でのコンビナトリアルライブラリーの各メン
バーの最終濃度が約１５０ｎＭとなるようにした。この２７−ｍｅｒ、パロモマ
イシンおよびコンビナトリアルライブラリー化合物の混合物を次いでＥＳＩ−Ｍ
Ｓへ５ｍＬ／分の速度で注入し、信号平均２分で、全部で５０回の走査（それぞ
れ４マイクロスキャン）を積算し、混合物の質量スペクトルを得た。
【０４２６】 このようにして得たＥＳＩ質量スペクトルを図４２に示すが、これによりｍ／
ｚ値が１８９７．８、１８９１．３および１８８４．４における（Ｍ−５Ｈ）5- イオンに対する新しい信号の存在が確認された。これらの新規信号を２７−ｍｅ
ｒのみのイオンピークと比較すると、この標的に結合しているコンビナトリアル
ライブラリーのメンバーの観察されたｍ／ｚの値が計算できる。このライブラリ
ー結合メンバーの質量はそれぞれ５６６．５、５３４．５および４８２．５であ
ることが分かった。骨格の構造およびこのライブラリーの形成に用いた置換基を
知ることにより、どのような置換パターン（置換基の組み合わせ）がこの結合分
子中に存在するかを決定することができる。
【０４２７】 ｍ／ｚが４８２．５、５３４．５および５６６．５の化学種が酢酸＋ＭＰＡＣ
基、芳香族＋ピペリジルグアニジン基、およびＭＰＡＣ＋グアニジルエチルアミ
ド基をそれぞれもつライブラリーメンバーであろうということがわかった。この
ようにして、もしコンビナトリアルライブラリーの組成が先験的に分かっていれ
ば、結合成分の同定は簡単に行うことができる。 このような操作においてＦＴＭＳ機器を使用すれば、この方法の感度並びに正
確さの両方を強化することができる。ＦＴＭＳを用いると、この方法はこれらの
サンプルのエレクトロスプレー質量分析において観察される化学ノイズを大きく
減少でき、したがって結合親和力がはるかに弱いバインダーをさらにたくさん容
易に検出することができる。さらに、ＦＴＭＳを用いると、その解像度が高いた
めコンビナトリアルライブラリーの結合成分の質量の正確な見積もりが行え、ラ
イブラリーの構造的な構成が分かっている場合にはこれらの成分が何かを直接決
定することができる。
【０４２８】 実施例２３：生体分子標的に結合するコンビナトリアルライブラリーのメンバー
の結合部位の決定 標的としての、２７−ｍｅｒ ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ核酸のパロモマイシンお
よび実施例２２の化合物のコンビナトリアルライブラリーの混合物を実施例２２
で述べたのと同じＥＳＩ−ＭＳ法に付した。実施例２１で得たＥＳＩスペクトル
では、ライブラリーメンバーが標的に結合することから生じる複合体の発生する
新規信号がｍ／ｚ＝１８９７．８、１８９１．３および１８８４．４に見られた
。パロモマイシン−２７ｍｅｒ複合体イオンはｍ／ｚ＝１９０７．３に観察され
た。
【０４２９】 このスペクトルから二つの複合体イオンをさらなる分析のために選び出し、２
７−ｍｅｒ ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ上のその成分リガンドの結合部位を決定した
。まずパロモマイシン−２７ｍｅｒ複合体に相当する１９０７．３のイオンをイ
オン分離手順により分離し、ＣＩＤに付した。切断は見られず、質量スペクトル
にフラグメンテーションは観察されなかった。これによりパロモマイシンは前記
３つのｄＡ残基が存在するこの核酸のバルジ領域内あるいは近傍に結合すること
がわかる。パロモマイシンはしたがって複合体中のｄＡ残基をＣＩＤによるフラ
グメンテーションから保護する。
【０４３０】 同様に、２７−ｍｅｒ標的とライブラリーメンバーの複合体に相当する、ｍ／
ｚが１８９７．８のイオンをイオン分離手順により分離し、先の複合体に仕様し
たのと同じ条件を用いてＣＩＤに付し、データを３分平均した。その結果得られ
た質量スペクトル（図４３）では６つの主なフラグメントイオンがｍ／ｚ＝１０
０５．８、１０６５．６、１１６２．８、２３４１．１、２４０６．３および２
４４６．０に見られた。ｍ／ｚ値が１００５．８、１０６５．６そして１１６２
．８である３つのフラグメントは核酸標的からのｗ6 (2-)、ａ7 −Ｂ(2-)および
ｗ7 (2-)イオンに相当する。より質量の多い３つのイオン、２３４１．１、２４
０６．３および２４４６．０のものはａ20−Ｂ(3-)イオン＋５６６Ｄａ、Ｗ21(3
-)イオン＋５６６Ｄａおよびａ21−Ｂ(3-)イオン＋５６６Ｄａに相当する。この
データから少なくとも二つのことが示される。第１に核酸のみがこのＥＳＩ−Ｃ
ＩＤ実験においてフラグメントイオンを与えるべく活性化され得るので、新規フ
ラグメントイオンが観察されるということから１８９７．８のイオンピークが核
酸標的に結合したライブラリーメンバーから生じていることがわかる。第２に、
このライブラリーメンバーは分子量が５６６である。このライブラリーメンバー
は核酸標的（１６Ｓ ｒＲＮＡ Ａ部位に相当するＲＮＡ／ＤＮＡキメラ）のス
テム構造の４つの塩基対あるいはＧＣＵＵテトラループに結合し、核酸標的のＵ
＊Ｕミスマッチ対を含有する６塩基対ステムあるいはバルジＡ部位には結合しな
い。 ライブラリーメンバーの結合部位に関するさらなる詳細は、デオキシヌクレオ
チドの取り込み位置が異なる標的核酸分子との相互作用およびそのフラグメンテ
ーションに与える影響を研究することによって得ることができる。
【０４３１】 実施例２４：生体分子標的と結合するコンビナトリアルライブラリーのメンバー
の同定、および標的への結合の位置の決定 ３つのｄＡ残基を含有する１６Ｓ ｒＲＮＡ Ａ部位に相当する、２７−ｍｅ
ｒ ＲＮＡ標的（実施例２０で得た物）の１００ｍＭ酢酸アンモニウムに溶かし
た、ｐＨが７．４の１０ｍＭ溶液を、酢酸パロモマイシンの溶液とスクリーニン
グする第二のコンビナトリアルライブラリーのＤＭＳＯ溶液のアリコートで処理
した。加えたパロモマイシンの量は最終濃度が１５０ｎＭとなるように調節した
。同様に添加したライブラリーのＤＭＳＯ溶液の量はこのライブラリーの２１６
のメンバーのそれぞれの最終濃度が約１５０ｎＭとなるように調節した。この溶
液をＦｉｎｎｉｇａｎＬＣＱイオントラップ質量分析計に注入し、エレクトロス
プレーによりイオン化した。核酸標的およびパロモマイシンおよびコンビナトリ
アルライブラリーのメンバーとの結合から生じたその複合体のイオンに対し、１
０００−３０００ｍ／ｚの範囲を走査した。通常２００回の走査を５分間平均し
た。核酸標的からのイオンは、（Ｍ−Ｈ）5-イオンがｍ／ｚ＝１７８４．４、（
Ｍ−４Ｈ）4-イオンがｍ／ｚ＝２２３０．８で観察された。このパロモマイシン
−核酸複合体はまた（Ｍ−５Ｈ）5-イオン信号がｍ／ｚ＝１９０７．１で、（Ｍ
−４Ｈ）4-イオン信号がｍ／ｚ＝２３８４．４ｕで観察された。
【０４３２】 コンビナトリアルライブラリーのメンバーと核酸標的の複合体に対するスペク
トルを分析することにより、幾つかの新規信号がライブラリーメンバーと核酸標
的との非共有結合から生じていることがわかった。少なくとも６つの信号がこの
ような非共有複合体に対して質量スペクトル中で観察された。これらのうちｍ／
ｚ値が最も低い信号は核酸標的への結合が極めて強いものであることがわかった
。このリガンドー核酸複合体イオンとパロモマイシンー核酸複合体から得られる
イオンの発生量とを比較すると、相対的結合親和性（見かけのＫD ）が得られる
が、これはパロモマイシンの値と類似していた。
【０４３３】 約６分の信号平均化によるＭＳ／ＭＳ実験をこの複合体に対しても行い、結合
したリガンドの分子量をさらに求めた。機器の性能の正確さが±１．５Ｄａしか
なかったので、求めた質量は７３０．０±２Ｄａとなった。この結合リガンドの
得られた質量と既知の骨格構造およびコンビナトリアルライブラリーを作るのに
用いた置換基より、このＰＡＰ５骨格上の置換基の３つの可能な組み合わせのど
れかになるようにリガンドの構造が決定された。この複合体のＭＳ／ＭＳ分析か
らまたハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡのｄＡ残基がＣＩＤ切断において弱い保護を
受けていることがわかった。７３０Ｄａの質量増加を持つフラグメントが観察さ
れることから、この分子はｒＲＮＡ標的の上部ステム−ループ領域に結合するこ
とがわかる。
【０４３４】 実施例２５：生体分子標的と結合するコンビナトリアルライブラリーのメンバー
の同定、および標的への結合の位置の決定 ３つのｄＡ残基を含有する１６Ｓ ｒＲＮＡ Ａ部位に相当する、２７−ｍｅ
ｒ ＲＮＡ標的（実施例２０で得た物）の１００ｍＭ酢酸アンモニウムに溶かし
た、ｐＨが７．４の１０ｍＭ溶液を、酢酸パロモマイシンの溶液とスクリーニン
グする第三のコンビナトリアルライブラリーのＤＭＳＯ溶液のアリコートで処理
した。加えたパロモマイシンの量は最終濃度が１５０ｎＭとなるように調節した
。同様に添加したライブラリーのＤＭＳＯ溶液の量はこのライブラリーの２１６
のメンバーのそれぞれの最終濃度が約１５０ｎＭとなるように調節した。この溶
液をＦｉｎｎｉｇａｎＬＣＱイオントラップ質量分析計に注入し、エレクトロス
プレーによりイオン化した。核酸標的およびパロモマイシンおよびコンビナトリ
アルライブラリーのメンバーとの結合から生じたその複合体のイオンに対し、１
０００−３０００ｍ／ｚの範囲を走査した。通常２００回の走査を５分間平均し
た。核酸標的からのイオンは、（Ｍ−５Ｈ）5-イオンがｍ／ｚ＝１７８４．４、
（Ｍ−４Ｈ）4-イオンがｍ／ｚ＝２２３０．８で観察された。このパロモマイシ
ンー核酸複合体はまた（Ｍ−５Ｈ）5-イオン信号がｍ／ｚ＝１９０７．１で、（
Ｍ−４Ｈ）4-イオン信号がｍ／ｚ＝２３８４．４ｕで観察された。
【０４３５】 コンビナトリアルライブラリーのメンバーと核酸標的の複合体に対するスペク
トルを分析することにより、幾つかの新規信号がライブラリーメンバーと核酸標
的との非共有結合から生じていることがわかった。少なくとも２つの信号がこの
ような非共有複合体に対して質量スペクトル中で観察された。約６分の信号平均
化によるＭＳ／ＭＳ実験をこの２つの複合体に対しても行い、結合したリガンド
の分子量をさらに求めた。
【０４３６】 最初の複合体は７２０．２±２Ｄａの質量の分子が標的に結合したものから生
じていることがわかった。このコンビナトリアルライブラリーのメンバーに対し
ては、骨格の構造とライブラリーを構築するために用いた置換基に基づいて、二
つの可能な構造が演繹された。このなかには質量７２０．４の構造と質量７２１
．１の構造とが含まれる。ＣＩＤを用いてこのリガンドー標的複合体イオンに対
するＭＳ／ＭＳ実験を行い、標的のバルジ構造中でＡ残基が強力に保護されてい
ることがわかった。したがって、このリガンドはＲＮＡ／ＤＮＡ標的のバルジｄ
Ａ残基に強力に結合しているに違いない。
【０４３７】 このライブラリーのスクリーニングから観察された第二の主な複合体は、６６
５．２±２Ｄａの質量の分子の標的への結合から生じていることがわかった。こ
のコンビナトリアルライブラリーのメンバーに対しては、骨格の構造とライブラ
リーを構築するために用いた置換基に基づいて、二つの可能な構造が演繹された
。ＣＩＤを用いたこのリガンドー標的複合体イオンに対するＭＳ／ＭＳ実験から
標的の強力なフラグメンテーションが示された。したがってこのリガンドはＲＮ
Ａ／ＤＮＡ標的のバルジｄＡ残基に強力に結合していないに違いない。むしろ、
フラグメンテーションパターンおよび、標的のループ部分からのフラグメントに
結合した添加質量の観察とから、このリガンドはＲＮＡ／ＤＮＡ標的のループ領
域における残基に結合しているに違いないとの示唆が得られる。図４５参照。
【０４３８】 実施例２６：化合物のコンビナトリアルライブラリーの二つの核酸標的に対する
同時スクリーニング スクリーニングする二つのＲＮＡ標的を自動核酸シンセサイザーを用いて合成
する。第１の標的（Ａ）は、実施例２０と同様、３つのｄＡ残基を含有する、１
６Ｓ ｒＲＮＡ Ａ部位に相当する２７−ｍｅｒ ＲＮＡである。第二の標的（
Ｂ）は３つのｄＡ残基を持つ２７−ｍｅｒ ＲＮＡであり、標的（Ａ）と同一の
塩基組成ではあるが、配列は完全にスクランブルされたものである。標的（Ｂ）
は自動合成の最後のステップで、質量修飾タグ、ポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）ホスホラミダイトをその５' −末端に加えることにより、修飾されている。
これにより質量修飾タグを持つ標的（Ｂ）においては標的（Ａ）と比べて質量が
３５７５増加している。
【０４３９】 １０ｍＭの標的（Ａ）および１０ｍＭの質量修飾標的（Ｂ）を含有する溶液を
、適当量の両標的をｐＨ７．４の１００ｍＭの酢酸アンモニウムに溶かして調製
した。この溶液を酢酸パロモマイシン溶液とスクリーニングすべきコンビナトリ
アルライブラリーのＤＭＳＯ溶液のアリコートで処理する。添加パロモマイシン
の量は最終濃度が約１５０ｎＭとなるように調整する。同様に添加ＤＭＳＯライ
ブラリー溶液の量はライブラリーの２１６のメンバー成分の最終濃度が約１５０
ｎＭとなるように調製する。このライブラリーメンバーは７００−７５０Ｄａの
範囲の質量を持つ分子である。この溶液をＦｉｎｎｉｇａｎＬＣＱイオントラッ
プ質量分析計に注入し、エレクトロスプレーによりイオン化する。核酸標的のイ
オンおよびそのパロモマイシンおよびコンビナトリアルライブラリーのメンバー
との結合から生じる複合体のイオンに対し、１０００−３０００ｍ／ｚの範囲を
走査する。通常２００回の走査を行い５分間平均する。
【０４４０】 核酸標的（Ａ）からのイオンは（Ｍ−６Ｈ）6-イオンがｍ／ｚ＝１４８６．８
、（Ｍ−５Ｈ）5-イオンがｍ／ｚ＝１７８４．４，そして（Ｍ−４Ｈ）4-イオン
が／ｚ＝２２３０．８で認められる。標的（Ａ）のライブラリーメンバーとの複
合体からの信号はｍ／ｚ値が１６０３．２−１６１１．６、１９２４．４−１９
３４．４および２４０５．８−２４１８．３の範囲に生じるであろうと予測され
る。 質量修飾ＰＥＧタグを持つ、核酸標的（Ｂ）のコンビナトリアルライブラリー
のメンバーとの複合体からの信号は、ｍ／ｚ値が２１９９−２２０７．４、２６
３９−２６４９および３２９９−３３１１の範囲に認められる。したがって、標
的（Ｂ）との非共有複合体の信号は第１の標的（Ａ）から生じる複合体の信号か
らははっきりと分離されている。したがって質量スペクトル中で認められる新規
の信号は、標的（Ａ）あるいは標的（Ｂ）のどちらとライブラリーメンバーが結
合したことから生じているのかが容易に割り当てられる。 この質量修飾技法を特有の高分子量中性および陽イオン性ポリマーを用いて、
より多数の標的へと拡大して行うことにより、各化合物やコンビナトリアルライ
ブラリーに対し二つ以上の標的を同時にスクリ ーニングすることができる。
【０４４１】 実施例２７：化合物のコンビナトリアルライブラリーの二つのペプチド標的に対
する同時スクリーニング スクリーニングする二つのペプチド標的を自動ペプチドシンセサイザーを用い
て合成する。第１の標的（Ａ）は既知の配列を持つ２７−ｍｅｒポリペプチドで
ある。第二の標的（Ｂ）もまた２７−ｍｅｒポリペプチドであり、標的（Ａ）と
同一のアミノ酸組成ではあるが、配列は完全にスクランブルされたものである。
標的（Ｂ）は自動合成の最後のステップで、質量修飾タグ、ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ）クロロフォルメートをそのアミノ末端に加えることにより、修飾
されている。これにより質量修飾タグを持つ標的（Ｂ）においては、標的（Ａ）
と比べて質量が約３６００増加している。
【０４４２】 １０ｍＭの標的（Ａ）および１０ｍＭの質量修飾標的（Ｂ）を含有する溶液を
、適当量の両標的をｐＨ７．４の１００ｍＭの酢酸アンモニウムに溶かして調製
した。この溶液をスクリーニングするコンビナトリアルライブラリーのＤＭＳＯ
溶液のアリコートで処理する。添加したＤＭＳＯライブラリー溶液の量はライブ
ラリーの２１６のメンバー成分の最終濃度が約１５０ｎＭとなるように調整する
。このライブラリーメンバーは７００−７５０Ｄａの範囲の質量を持つ分子であ
る。この溶液をＦｉｎｎｉｇａｎＬＣＱイオントラップ質量分析計に注入し、エ
レクトロスプレーによりイオン化する。ポリペプチド標的のイオンとそのコンビ
ナトリアルライブラリーのメンバーとの結合から生じる複合体のイオンに対し、
１０００−３０００ｍ／ｚの範囲を走査する。通常２００回の走査を行い５分間
平均する。
【０４４３】 ポリペプチド標的（Ａ）のイオンおよび標的（Ａ）のライブラリーメンバーと
の複合体からのイオンは質量修飾ＰＥＧタグを持つポリペプチド標的（Ｂ）およ
びそのコンビナトリアルライブラリーのメンバーとの複合体からの信号よりはる
かにｍ／ｚ値が低いところに生じると予想される。したがって、標的（Ｂ）との
非共有複合体の信号は第１の標的（Ａ）から生じる複合体の信号からははっきり
と分離される。したがって質量スペクトル中で認められる新規の信号は、標的（
Ａ）あるいは標的（Ｂ）のどちらとライブラリーメンバーが結合したことから生
じているのかが容易に割り当てられる。このようにして各化合物、あるいはコン
ビナトリアルライブラリーへの結合に対し、二つ 以上のペプチド標的を簡単にスクリーニングすることができる。
【０４４４】 実施例２８：構造決定のための核酸の気相解離 核酸二重鎖はエレクトロスプレーイオン化により無傷の二重鎖のまま溶液から
気相に移送することができ、フーリエ変換、イオントラップ、四重極、飛行時間
型、あるいは磁気セクター質量分析計を用いて検出する。二重鎖の単一の荷電状
態に相当するイオンはレゾナンスエジェクション、オフ−レゾナンスエキサイテ
ーション、あるいは質量分析の分野で既知の同様の方法により、分離することが
できる。分離されると、これらのイオンは黒体放射、赤外多光子解離あるいは衝
突活性化によりエネルギー的に活性化される。この活性化によりグリコシド結合
やホスフェートバックボーンの解離が起こり、ｗシリーズ（無傷の３' −末端を
持つ物と内部切断後の５' −リン酸塩を持つもの）およびａ−塩基シリーズ（無
傷の５' −末端と３' −フランを持つ物）と呼ばれる二つのシリーズのフラグメ
ントイオンを生成する。これらの生成物イオンはＭＳ／ＭＳ実験においてその質
量／電荷比を測定することにより同定することができる。
【０４４５】 この方法のパワーの例を図４７と図４８に示す。図４７パートＡに示すのは、
Ｇ−Ｇミスマッチ塩基対を含有するＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖からの（Ｍ−５Ｈ）5- イオンの衝突活性から生じたｗおよびａ−塩基イオンの存在量を図示した物であ
る。ｗシリーズのイオンは黒で強調されており、二重鎖の方を向いており、一方
ａ−塩基シリーズのイオンは灰色で強調されており、二重鎖とは反対の方向に向
いている。このフラグメントイオンの存在量が高ければ高いほど、それぞれの矢
印は長く、太くなる。主なフラグメンテーションは両鎖においてミスマッチ塩基
対の両脇で観察される。対照ＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖イオンの衝突活性化に続いて
得られる結果を図４７のパートＢに示す。幾つかの生成物イオンは共通であるが
、フラグメンテーションのパターンはミスマッチ塩基対を含有する二重鎖のもの
とは大きく異なってる。フラグメントイオンおよびフラグメンテーションパター
ンの分析により、ミスマッチ塩基対の位置を明白に同定することができる。さら
に、この結果から二重鎖ＮＤＡイオンの気相構造はミスマッチ対の存在により活
性化に続くフラグメンテーションが容易となるように変化することが示唆される
。
【０４４６】 ３つのＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖との第二の一連の実験を図４８に示す。上の図に
おいてＡ−Ｃミスマッチ対がこの二重鎖に導入されている。ｗおよびａ−塩基イ
オンを生成する広範囲のフラグメンテーションがミスマッチ対の近傍で観察され
る。しかし、ＲＮＡ中でのグリコシド結合の強度が大きくなるため、ＲＮＡ鎖の
フラグメンテーションは制限される。したがって、このフラグメンテーションは
ＤＮＡ鎖に集中する。中央の図において、Ｃ−Ｃミスマッチ塩基対が二重鎖に導
入されており、このミスマッチ対の部位においてフラグメンテーションの強化が
観察される。上記のように、ＲＮＡ鎖のフラグメンテーションはＤＮＡ鎖に比べ
て弱められている。下の図にはすべてが相補的塩基対である、対照ＲＮＡ：ＤＮ
Ａ二重鎖に対するフラグメンテーションが掲載されている。これら３つの場合に
おいて、共通のフラグメンテーションパターンがＧ５−Ｔ４塩基間に観察される
。しかし、塩基対ミスマッチを含有している二重鎖と比較すると相補的二重鎖に
おいてフラグメンテーションの程度は軽い。
【０４４７】 実施例２９：リガンドの分子相互作用部位への結合を調べるためのＲＮＡ−リガ
ンド複合体のＭＡＳＳ分析 提案されたリガンドがＲＮＡの分子相互作用部位へ結合するのかどうかを質量
分析を通じて見極める能力を示す。図４９および５０に未知の官能基含有分子と
して図示されているリガンドとステム−ループ構造を持つＲＮＡセグメントの質
量分析法を示す。このリガンドはＲＮＡフラグメントとの結合を容易にすべく選
択された条件の下で合わされ、その結果をマルチ標的親和性／特異性スクリーニ
ング（ＭＡＳＳ）プロトコルによって分析する。これは好ましくは先に解説し、
ここに引用した参考文献中に記載されている、エレクトロスプレーイオン化フー
リエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析を用いて行われる。上記に記載した
「質量クロマトグラフィー」により、一つの生体分子複合体に注目し、その複合
体が固有のイオンへとフラグメンテーションする様を研究することができる。リ
ガンドのＲＮＡへの結合部位はしたがってそのようなフラグメントの評価−すな
わち分子の相互作用部位に相当するフラグメントの存在および、その分子相互作
用部位へ結合していることが示されるリガンドにより決定することができる。 図４９には非Ａ部位結合分子の結合位置のＭＡＳＳ分析が示されている。「質
量クロマトグラフィー」による分離とその後の（Ｍ−５Ｈ）５−複合体の解離は
ｍ／ｚ＝１９１９．８で認められる。遊離ＲＮＡに対して観察されるフラグメン
テーションに対し、選択されたフラグメントで観察される質量のシフトからリガ
ンドがどこに結合しているかについての情報が得られる。ｍ／ｚ＝１２００未満
に認められる（２−）フラグメントはＲＮＡのステム構造に相当し、これらのフ
ラグメントは複合化の際に質量のシフトが生じない。これはリガンドがステム構
造に結合していないことと一致する。
【０４４８】 図５０には非Ａ部位結合分子の結合位置のＭＡＳＳ分析を示す。分離（すなわ
ち「質量クロマトグラフィー」）とその後の（Ｍ−５Ｈ）５−複合体の解離はｍ
／ｚ＝１９２９．４に認められ、これらによりＡ−部位の近傍でのフラグメンテ
ーションからの多大なる保護が与えられている。これは２３００−２５００ｍ／
ｚ範囲におけるｗおよびａ−塩基フラグメントイオンの存在量が減少しているこ
とから明らかである。遊離ＲＮＡに対して観察されるフラグメンテーションと比
較し、選択されたフラグメントにおいて観察される質量のシフトからリガンドが
どこに結合しているかの情報が得られる。ＲＮＡの厳密な分子量はＲＮＡに結合
している分子の同定の際、内部、あるいは固有質量ラベルとして用いることがで
きる。ｍ／ｚ＝１２００未満に認められる（２−）フラグメントはＲＮＡのステ
ム構造に相当する。これらのフラグメントは複合化の際に質量のシフトが生じず
、リガンドがステム構造に結合していないことと一致する。したがってＲＮＡへ
のリガンドの結合位置が決定できる。
【０４４９】 実施例３０：ＲＮＡ標的へのリガンドライブラリーの特異性および親和性の決定 好ましいＭＡＳＳスクリーニングの第１ステップはＲＮＡ標的（一つあるいは
複数）を標的分子上の特定部位に結合するよう設計されているリガンドのコンビ
ナトリアルライブラリーと混合することである。溶液中で標的とライブラリーメ
ンバーのいずれかとの間に形成された特異的非共有複合体を気相に移送し、ＥＳ
Ｉによるイオン化に付す。ここに記載するように、複合体と遊離標的との間の測
定質量の差から結合しているリガンドが何かを決定することができる。この複合
体の解離定数は二つの方法によって測定できる。すなわちもし標的に対する既知
の結合親和力を持つリガンドを手に入れることができるなら、その既知のリガン
ドを内部対照として用い、相対的Ｋｄを対照の存在量に対する未知の複合体の存
在量を測定することによって求めることができ、あるいは、もし内部対照が得ら
れなければ、リガンドの濃度を変えて一連の測定を行い「滴定」曲線からＫｄを
得ることもできる。
【０４５０】 スクリーニングには多数の類似した、好ましくは組み合わせ的に派生された、
化合物を使用することが好ましいので、このライブラリーからの何かが標的に結
合するのか否かを知るのみならず、その標的に結合するのがどの化合物であるか
を知ることが好ましい。極めて精密な質量測定により、未知のリガンドの質量が
分かれば唯一の元素組成を求めることができる。この唯一の質量はその化合物の
「固有質量ラベル」と呼ばれる。例えば分子量が約６１５Ｄａになる元素組成は
多数存在するが、単一同位体分子量が約６１５．２９６３０１２Ｄａであるもの
と一致する元素組成はたった一つＣ23Ｈ45Ｎ5 Ｏ14である。例えば、１６Ｓ Ａ
−部位に非共有結合しているリガンド（この場合パロモマイシン）の質量は遊離
ＲＮＡを内部質量標準として用いると６１５．２９６９＋０．０００６（質量測
定誤差１ｐｐｍ）であると測定された。１００ｐｐｍの質量測定誤差では明白な
化合物の指定は不可能であり、約４００種類のＣ、Ｈ、ＮおよびＯ原子のみから
なる元素組成との一致がある。拡張された考えに示されているこの同位体分布は
主に１３Ｃ原子の天然の取り込みの結果である。高性能ＦＴＩＣＲが１２Ｃ−１
３Ｃ質量差を簡単に分解できるため、同位体クラスターの各成分が内部質量標準
として使用できるのである。さらに遊離ＲＮＡの理論的同位体分布が正確にシミ
ュレートでき、「ホモ同位体」種間の質量差を測定することができる（この例に
おいては質量差は４つの１３Ｃ原子を含有する化学種の間で測定される）。
【０４５１】 結合しているリガンドが何であるかが一度決定されれば、この複合体を気相中
で分離し（すなわち「質量クロマトグラフィー」）解離させる。遊離標的のフラ
グメンテーションパターンをリガンドと複合している標的のそれと比較すること
により、リガンドの結合部位が決定できる。複合体の解離はフラグメンテーショ
ンが中性のものとの高エネルギー衝突により行われる、衝突活性解離（ＣＡＤ）
あるいは、高エネルギーＩＲレーザーからの光子が複合体のフラグメンテーショ
ンを引き起こす赤外多光子解離（ＩＲＭＰＤ）によって行われる。
【０４５２】 １６Ｓ ｒＲＮＡのＡ−部位を含有する２７−ｍｅｒ ＲＮＡを確認実験のた
めの標的として選択した。図５１を参照。アミノグリコシドパロモマイシンはＫ
ｄが２００ｎＭの非対アデノシン残基に結合することが知られており、内部標準
として用いられた。標的は初期濃度１０ｍＭであり、一方パロモマイシンおよび
２１６ライブラリーメンバーのそれぞれは初期濃度が１５０ｎＭであった。用い
たのは四重極イオントラップで、これはＦＴＩＣＲの持つ高解像度あるいは質量
精度はないが、ＭＡＳＳの概念を説明する役には立つ。遊離ＲＮＡに相当する分
子イオンはｍ／ｚ＝１７８４．４（Ｍ−５Ｈ＋）５−および２２３０．８４（Ｍ
−４Ｈ＋）４−において認められる。ＲＮＡ−パロモマイシン内部対照からの信
号はｍ／ｚ＝１９０７．１４（Ｍ−５Ｈ＋）５−および２３８４．４４（Ｍ−４
Ｈ＋）４−において認められる。予想されたパロモマイシン複合体に加えて、ラ
イブラリーメンバーの標的への結合に相当する数多くの複合体がさらに観測され
た。図５２参照。
【０４５３】 このライブラリーの一メンバー（ＭＷ＝６７５．８＋１．５）は標的と強固な
複合体を形成するが、ＭＳ／ＭＳ研究によるとこのリガンドはＡ−部位のフラグ
メンテーションに対して保護を与えず、したがってループ領域に結合しているこ
とが分かる。質量が約７４３．８＋１．５であるもう一つのメンバーＩｓｉｓ１
１３０６９は標的への強固な結合を示し、ＭＳ／ＭＳ実験により明らかなように
非対Ａ残基を保護するので、Ａ−部位での結合という考えと一致する。 ＭＡＳＳアプローチの高速でパラレルな性格から、同時に複数の標的に対し多
数の化合物のスクリーニングを行うことが可能になり、サンプルスループットと
情報内容が大きく強化される。１５分足らずで行われる一つのアッセイでＭＡＳ
Ｓは１０個の標的を５００を越す化合物を含有するライブラリーに対してスクリ
ーニングし、その化合物がどの標的に結合し、どこで結合が行われ、その結合親
和力がどの位であるかを報告することができるのである。
【０４５４】 実施例３１：ＱＸＰ予測リガンド−ＤＮＡ構造とＸ線結晶学との比較 核酸標的へ結合するリガンドに関しＱＸＰの有用性を評価した。二つの異なる
二重鎖ＤＮＡ配列（それぞれＰＤＢ ＩＤ：２６１ｄおよび１９５ｄであり、こ
こでＰＤＢ ＩＤとはＲｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓで管理されているタン
パク質データバンクに預託された構造に対する識別コードである）に結合したネ
トロプシン（小さい方の溝に結合する薬品）のＸ線データおよび８量体二重鎖（
ＰＤＢ ＩＤ：２ｄ５５）に結合したインターカレーターを確認研究で使用した
。最低エネルギードック構造（初期構造としてはランダムに無秩序化したリガン
ドを持つ）とエネルギー最小化Ｘ線構造との間の実効（ｒｍｓ）偏差はすべての
場合に０．６オングストローム以内に収まった。高次構造空間を調べるために、
ＱＸＰ法がモンテカルロ型のアルゴリズムを用いたとして、この方法が確実に全
体としての最小値をもたらすようにするため、初期のリガンド構造を大きく変化
させて、少なくとも１０回のＱＸＰシミュレーションを行った。ＱＸＰドッキン
グ法の性能は結晶学的に観察された構造から１．０オングストロームｒｍｓ以内
でリガンドの結合構造を同定することができるレベルであるとわかる。上記に記
載のテストケースでは、ＱＸＰの成功率は８０％の範囲であった。結晶構造から
のｒｍｓ偏差とドックした構造のスコアとの間には殆ど直線的な相関があり、こ
れからリガンド−受容体の複合体の構造を予測する上でＱＸＰ法が充分精密であ
ることが示された。
【０４５５】 実施例３２：ＱＸＰ法を用いたパロモマイシン−ＲＮＡ複合体構造の予測 ＲＮＡ標的へ結合したリガンドの正確な構造を導き出すために、ＱＸＰ法を用
いた。パロモマイシンへ結合したバクテリア１６ＳリボソームＡ部位のＮＭＲ構
造（Ｆｏｕｒｍｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９６，２７４，１３６７；ＰＤＢ ＩＤ：１ｐｂｒ）を規準状態として用いた。アミノグリコシド抗生物質をリガン
ド−ＲＮＡ複合体から除去した。パロモマイシンの高次構造空間はＱＸＰ法を用
いて最もエネルギーの低い構造型を求めて網羅的に検索された。標的ＲＮＡを固
定し、パロモマイシンを完全柔軟なものとして扱かった。初期構造としてランダ
ムに分裂させたパロモマイシンを用いて多数回のドッキング検索を行った。図１
３７に示すように、この検索から得られた最もエネルギーの低い構造を代表する
物（濃い灰色）を結合した複合体のＮＭＲ構造（薄い灰色）に重ね合わせる。Ｑ
ＸＰ法の力強さを得られたｒｍｓ偏差とＱＸＰエネルギースコア間の相関として
図１３８に示す。
【０４５６】 実施例３３：１６Ｓ Ａ部位ＲＮＡ／パロモマイシン複合体の精密ＥＳＩ−ＦＴ
ＩＣＲ質量測定 エレクトロスプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析
を５ｍＭの １６Ｓ ＲＮＡ（図１４９に示す２７−ｍｅｒ構造体）および５０
０ｎＭパロモマイシンを含有する溶液に対して行った。図５２に示す。１：１の
複合体がパロモマイシンとＲＮＡの間に観察され、特異的アミノグリコシドがＡ
−部位に結合していることと一致する。ここに挿入した図は遊離ＲＮＡおよびＲ
ＮＡ−パロモマイシン複合体の（Ｍ−５Ｈ+ ）5-種の測定された同位体エンベロ
ープと計算された同位体エンベロープを示している。精密質量分析は遊離ＲＮＡ
の（Ｍ−５Ｈ+ ）5-および（Ｍ−４Ｈ+ ）4-荷電状態の同位体ピークを内部質量
標準として用いて遊離ＲＮＡと結合ＲＮＡ間のｍ／ｚ差を測定することにより行
った。
【０４５７】 実施例３４：１６Ｓ Ａ−部位ＲＮＡに対する６０メンバーライブラリーの質量 ＦＴＭＳスペクトルを１６Ｓ ＲＮＡモデル（１０ｍＭ）および６０メンバー
コンビナトリアルライブラリーの混合物から得た。複合体からの信号は挿入部の
中で強調されている。１６Ｓ ＲＮＡモデルへの６０メンバーを含有するコンビ
ナトリアルライブラリーの結合を各ライブラリーメンバーがＲＮＡに対して５倍
以上過剰に存在する条件の下で調べた。図１３９に示すように、１６Ｓ ＲＮＡ
およびライブラリー中の約５個のリガンド間に複合体が観察された。 図１３９からの複合体１８６３の拡大図を図１４０に示す。ライブラリー中の
化合物のなかで二つが３９８．１Ｄａの名目質量を持っていた。分子式に基づき
計算されたこれらの分子量からこれらは４６ｍＤａだけ質量が異なることがわか
る。この複合体（ｍ／ｚ＝１８６３．７４８）の各単一同位体（すべてが12Ｃ、 14 Ｎおよび16Ｏである）［Ｍ−５Ｈ］5-に対する分子量および遊離ＲＮＡ（ｍ／
ｚ＝１７８４．１２６）の分子量を正確に測定すると、リガンドの質量は計算に
より３９８．１１０±０．００９Ｄａであると求められる。 図１４１に図１３９および１４０において用いたライブラリーの高解像度ＥＳ
Ｉ−ＦＴＩＣＲスペクトルを示すが、これにより名目分子量が３９８．１である
ライブラリーメンバーが両方とも合成されたライブラリーに存在していることが
わかる。
【０４５８】 実施例３５：ＭＡＳＳを用いたＡ６０メンバーコンビナトリアルライブラリーか
らの化合物の同定 複合体の精密質量分析に基づき、結合リガンドの質量を化学式がＣ15Ｈ16Ｎ4 Ｏ2 Ｆ6 であり、分子量が３９８．１１７Ｄａ（図１４２）である、ライブラリ
ーメンバーと一致するように決定した。このように結合リガンドの同定は疑念の
余地無く行うことができた。
【０４５９】 実施例３６：元素組成による制約 正確な質量測定と元素による制約を用いて「未知」の結合リガンドの元素組成
を求めることができる。未知の分子中の元素の種類と数に対する一般的な制約と
精密質量分析との併用により測定された質量と一致する分子式の限定されたリス
トが決定できる。図１４３に関し、元素組成はＣ、Ｈ、ＮおよびＯ原子に限定さ
れ、さらに分子の「既知」の部分の元素組成による制約が与えられる。これらの
制約に基づき分子量が６１５．２９６９±０．０００６となる原子の膨大な数の
組み合わせが二つの可能性に減少される。所期のライブラリーメンバーを明白に
同定することに加え、この技法により当業者は分子標的へと結合する予期せぬ合
成副生物をも同定することができる。
【０４６０】 実施例３７：１６Ｓ−パロモマイシンに対するＭＡＳＳＫd の決定 質量分析を用いた液相解離定数（Ｋｄ）の直接測定の結果を図１４４に示す。
ＲＮＡの濃度を固定し、リガンドの濃度を様々に変えた溶液のＥＳＩ−ＭＳ測定
を行った。さまざまなリガンド濃度において結合：非結合ＲＮＡの比を測定する
ことにより、Ｋｄを「滴定曲線」の１／勾配により求めた。１１０ｎＭの値から
求めたＭＳは２００ｎＭの、先に報告した文献の値とよく一致している。
【０４６１】 実施例３８：多標的親和性／特異性スクリーニング タンデム型質量分析によるリガンド結合部位決定方法を図１４５に図示する。
一つのあるいは複数の分子標的を含有する溶液をリガンドのライブラリーと混合
し、溶液中で非共有複合体を形成する機会を与える。これらの非共有複合体を質
量分析する。非共有複合体はついで気相中でＩＲＭＰＤあるいはＣＡＤにより解
離させる。複合体の解離によって生じたフラグメントイオンを遊離ＲＮＡの解離
から生じたフラグメントイオンと比較することによて、リガンド結合部位がわか
る。
【０４６２】 実施例３９：２７メンバーライブラリーの１６Ｓ Ａ−部位ＲＮＡによるＭＡＳ
Ｓ分析 図１４６に原核細胞の１６Ｓ Ａ部位を表す、２７−ｍｅｒ ＲＮＡ構成体に
対する２７メンバーライブラリーのＭＡＳＳスクリーニングを示す。挿入図には
多数の化合物が１６Ｓ Ａ−部位と複合体を形成した様子が示されている。
【０４６３】 実施例４０：ＭＡＳＳ保護アッセイ デオキシアデノシン残基をパロモマイシン結合部位に含有する原核細胞の１６
Ｓ Ａ部位を表す、２７−ｍｅｒ ＲＮＡ構成体のＭＳ／ＭＳを図１４７に示す
。上のスペクトルは非複合体ＲＮＡからの［Ｍ−５Ｈ］５−イオン（ｍ／ｚが１
７８３．６）のＣＡＤによって得られたもので、デオキシアデノシン残基に大き
なフラグメンテーションを示している。下のスペクトルは１６Ｓ−パロモマイシ
ン複合体からの［Ｍ−５Ｈ］５−イオン（ｍ／ｚが１９０７．５）から上のスペ
クトルの際に用いたものと同一の活性エネルギーのもとでＣＡＤにより得たもの
である。下のスペクトルでは大きなフラグメントイオンは見られずリガンドによ
って結合部位の保護がなされているということと一致する。
【０４６４】 ＤＭＳＯに溶解した２１６のテトラアザシクロファン類を含有する二つのコン
ビナトリアルライブラリーを１０ｍＭの１６Ｓ ＲＮＡ（図１４９参照）を含有
するバッファ溶液と混合し、各ライブラリーメンバーが１００ｎＭで存在するよ
うにした。得られた質量スペクトルを図１４８に示すが、これにより、１６Ｓ ＲＮＡとライブラリーメンバーの間に同じ名目質量を持つ１０を越える複合体が
形成されていることがわかる。デオキシアデノシン残基をパロモマイシン結合部
位に持つ原核細胞の１６Ｓ Ａ部位を表す、２７−ｍｅｒ ＲＮＡ構成体と２１
６メンバーコンビナトリアルライブラリーの混合物から得たＭＳ／ＭＳスペクト
ル。上のスペクトルにおいて第１のライブラリーからのもっとも存在量の多い複
合体からのイオン（［Ｍ−５Ｈ］；５− ｍ／ｚ＝１９１９．０）を分離し解離
した。この複合体の解離により３つのフラグメントイオンがｍ／ｚ＝１００６．
１、１０６５．６および１１６２．４で生じたが、これは各ｄＡ残基での切断か
ら生じたものである。より強度の高い信号がｍ／ｚ＝２３７８．９、２４４３．
１および２４８３．１で観察されている。これらのイオンは６７６．０±０．６
Ｄａの質量を持つライブラリーメンバーと結合しているｗ２１（３−）、ａ２０
−Ｂ（３−）およびａ２１−Ｂ（３−）フラグメントに相当する。フラグメント
イオンの相対的な存在量は非複合体ＲＮＡで観察されるパターンと類似している
が、下のステムおよびテトラループからのイオンの質量はリガンドとの複合化に
よってシフトしている。このリガンドはデオキシアデノシン残基に対して殆ど保
護を与えないので、下のステム−ループに結合しているのに違いない。ライブラ
リーはバクテリアの増殖を阻害しなかった。下のスペクトルにおいてはｍ／ｚが
１９３４．３である、１６Ｓ ＲＮＡと第二のライブラリーの混合物からの最も
存在量の高い複合体の同じ衝突エネルギーでの解離によりわずかなフラグメント
イオンが生じており、主な信号は無損傷の複合体および中性アデニンの欠失から
生じている。切断のレベルが小さくなっていることおよびこの複合体に対しアデ
ニンの損失があることは、パロモマイシンと同様にモデルＡ部位領域でリガンド
の結合があるということと一致している。第二のライブラリーは５ｍＭでの転写
／翻訳を阻害し、大腸菌（ｉｍｐ−）およびＳ．ピオゲネスに対し２−２０ｍＭ
のＭＩＣを持つ。
【０４６５】 実施例４１：真核細胞および原核細胞のＡ部位の中性質量タグ 図１４９に１８Ｓ（真核細胞）および１６Ｓ（原核細胞）Ａ部位に相当する、
本実験に使用した２７−ｍｅｒ ＲＮＡモデルの二次構造を示す。この塩基配列
は７箇所（太字）で異なっており、二つの構成体の正味の質量差はわずか１５．
０１１Ｄａである。質量タグは従来のホスホラマダイト結合化学を用いてＲＮＡ
構成体の５' −末端へと結合した。 質量スペクトルにおいて結合している信号間の分離をよくする方法論はＲＮＡ
１６Ｓおよび１８Ｓからの信号間の重なりという観点から発展した。５' −末端
へ結合させた未変化官能基によってさらに修飾したＲＮＡ標的を合成した。この
ような合成による修飾をここでは中性質量タグと呼ぶ。質量タグ付き巨大分子の
質量のシフトとそれにともなうｍ／ｚのシフトによりタグ付きＲＮＡにより生じ
る信号群が質量分析の解像領域へと移動する。５００ｎＭのパロモマイシンの存
在下で得た、１６Ｓ Ａ−部位を表す２７−ｍｅｒの、５−末端に１８原子中性
質量タグを付けた物（７ｍＭ）および付けてない物（１ｍＭ）の混合物のＥＳＩ
−ＦＴＩＣＲスペクトルを図１５０に示す。未結合ＲＮＡとＲＮＡ−パロモマイ
シン複合体の比は１６Ｓと１６Ｓ＋タグＲＮＡ標的のものと等しく、中性質量タ
グがＲＮＡ−リガンド結合に対し、認めうる影響を及ぼさないことがわかる。
【０４６６】 実施例４２：アミノグリコシド混合物に対する１６S Ａ部位および１８S Ａ
部位モデルＲＮＡの同時のスクリーニング パロマイシン、リビドマイシン（ＭＷ＝７６１．３５４Ｄａ）、シソマイシン
（ＭＷ＝４４７．２６９Ｄａ）、トブラマイシン（ＭＷ＝４６７．２５９１Ｄａ
）、およびベカナマイシン（ＭＷ＝４８３．２５４Ｄａ）を、Ｓｉｇｍａ（ＳＴ
．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）およびＩＣＮ（Ｃｏｓｔａ Ｍｅｓａ，ＣＡ）から入手し
、そして１０ｍＭのストック溶液を生じるように溶解させた。原核生物（１６Ｓ
）ｒＲＮＡおよび真核生物（１８Ｓ）ｒＲＮＡのＡ部位（図１４９）を提示する
ＲＮＡ構築物の２' メトキシアナログを、研究室内で合成し、そしてアンモニア
（ｐＨ８．５）での脱保護後に１Ｍの酢酸アンモニウムから２回沈殿させた。質
量タグ化構築物は、ＲＮＡオリゴマーの５' −末端にホスホジエステル結合を通
じて付着させられた１８原子の質量タグ（Ｃ12Ｈ25Ｏ9 ）を含んだ。
【０４６７】 全ての質量スペクトル分析実験を、活性にシールドした７テスラの超処理（ｓ
ｕｐｅｒｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ）磁石を使用するＡｐｅｘ ＩＩ ７０ｅエレク
トロスプレーイオン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量スペクトル分
析器（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）を使用して行
った。ＲＮＡ溶液を、５０ｍＭのＮＨ4 ＯＡｃ（ｐＨ７）中で調製し、脱溶媒和
を補助するためにイソプロパノールと１：１のｖ：ｖで混合し、そして注射器を
使用して１．５ｍＬ／分の速度で注入した。イオンが、５０００Ｖで偏ったガラ
ス脱溶媒和キャピラリーの金属で覆った末端からｃａ．１．５ｃｍで配置された
地面にアースされたエレクトロスプレープローブである離れた軸を使用して、改
変されたエレクトロスプレー源（Ａｎａｌｙｔｉｃａ，Ｂｒａｎｆｏｒｄ）中で
形成された。２２５℃に加熱した乾燥酸素ガスのカウンター電流を、脱溶媒和プ
ロセスを補助するために使用した。イオンは、ＲＦ−６極のみのスキマー円錐体
、および質量分析のために捕捉したイオン細胞中への導入の前に１０００ｍｓの
補助電極から構成される外部のイオンリザーバーに集積した。各スペクトルは、
９０，９０９ｋＨｚのバンド幅を超える獲得した２５６個のデータ点から構成さ
れる１６個の中間体の同時付加(coadd) の結果であった。これによって、７００
ｍｓの検出間隔で得たパルス配列コントロール、データの集積、および集積後の
処理の全ての局面を、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，
ＣＡ）のＲ５０００コンピュータ上のＢｕｒｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓデータ
ステーション実行ＸＭＡＳＳ、バージョン４．０を使用して行った。
【０４６８】 質量スペクトル分析実験を、５個のアミノグリコシド（シソマイシン（Ｓｉｓ
）、トブラマイシン（Ｔｏｂ）、およびベカノマイシン（Ｂｅｋ）、パロマイシ
ン（ＰＭ）、リビドマイシン（ＬＶ））および２つのＲＮＡ標的を含有するライ
ブラリー間での複合体の形成を検出するために、同時に行った。遊離の１６Ｓお
よび１８Ｓ ＲＮＡの（Ｍ−５Ｈ+ ）5-荷電状態によるシグナルを、それぞれｍ
／ｚ １８０１．５１５および１８６８．３３８で検出した。図１５１に示すよ
うに、質量スペクトルアッセイによって、天然の質量リンカーを用いた１６Ｓ Ａ部位および１８Ｓ Ａ部位モデルに対するアミノグリコシドの既知の溶液結合
特性を再現した。１８Ｓ Ａ部位と比較した１６Ｓ部位についてのこれらのアミ
ノグリコシドの高い結合親和性と一致して、アミノグリコシド複合体は、１６Ｓ
ｒＲＮＡ標的を用いた場合にのみ観察される。１８Ｓ−パロモマイシンおよび
１８Ｓ−リビドマイシン複合体が存在しないことに注目する。これは、矢印によ
って示されるｍ／ｚで観察される。挿入された証拠は、複合体の同位元素の分解
能を示す。内部質量標準としての遊離のＲＮＡの（Ｍ−５Ｈ+ ）５- および（Ｍ
−４Ｈ+ ）4-荷電様態の複数の同位元素のピークを使用すると、複合体の質量測
定値の誤りの平均は、２．１ｐｐｍである。高親和性の複合体は、１６Ｓ Ａ部
位の２７マーと、パロモマイシンおよびリビドマイシンとの間でそれぞれ検出さ
れた。より弱い複合体が、シソマイシン、トブラマイシン、およびベカマイシン
を用いて観察された。アミノグリコシドと１８Ｓ Ａ部位との間では、複合体は
全く観察されなかった。従って、この結果は、標的ＲＮＡに特異的に結合する化
合物を同定するための質量スペクトルアッセイを証明する。２つのＲＮＡ標的に
対する化合物の結合の特異性についての情報を同時に提供することができる他の
タイプの高スループットアッセイは、存在しない。１６Ｓ Ａ部位に対するリビ
ドマイシンの結合は、上記の生化学的実験によって推測されている。１６Ｓ Ａ
部位の２７マーに対する、リビドマイシンについては２８ｎＭ、そしてパロマイ
シンについては１００ｎＭのＫD を測定するための質量スペクトル分析装置が、
本明細書中で使用されている。パロマイシンについての溶液のＫD は、１８０ｎ
Ｍから３００ｎＭまでの間であると見積もられている。
【０４６９】 実施例４３：オリゴリボヌクレオチドの標的化された部異特異的気相切断−リガ
ンド結合部位の質量スペクトル分析に基づく同定における適用 オリゴヌクレオチドの断片化は、複雑なプロセスであるが、グリコシド結合の
相対的な強度に関係するようである。この観察は、細菌のｒＲＮＡ Ａ部位領域
のキメラ２' −Ｏ−メチルリボヌクレオチドモデル中に選択的にデオキシ−ヌク
レオチドを取りこむことによって利用される。Ｍｉｙａｇｕｃｈｉら、Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９６、２４、１７００−１７０６；Ｆｏｕｒｍｙ
ら、Ｓｃｉｅｎｃ，１９９６、１７４、１３６７−１３７１；およびＦｏｕｒｍ
ｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，２７７，３３３−３４５．ＣＡＤの
間に、断片化が、より不安定なデオキシヌクレオチド部位にするように指向され
る。得られるＣＡＤ質量スペクトルは、容易に特定される相補性のフラグメント
イオンの小さなサブセットを含む。デオキシアデノシン残基に近いリガンドの結
合は、ＣＡＤプロセスを阻害するが、一方、離れた部位での複合体化は、解離に
影響は与えず、そして特異的なフラグメントイオンの質量を単に移動させる。こ
れらの方法は、Ａ部位領域のＲＮＡモデルに優先的に結合するコンビナトリアル
ライブラリーから化合物を同定するために使用される。
【０４７０】 細菌のＡ部位領域のセグメントの２７マーのモデルが、完全なリボヌクレオチ
ド（図１５２、化合物Ｒを参照のこと）および３つのデオキシアデノシン残基を
含有するキメラ２' −Ｏ−メチルリボヌクレオチド（図１５２、化合物Ｃを参照
のこと）として調製されている。ＲＮＡ ＲおよびＣは、固体支持体上での従来
のホスホルアミダイト化学を使用して調製される。ホスホルアミダイトは、Ｇｌ
ｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入し、そしてアセトニトリル中の０．１Ｍの溶液
として使用した。ＲＮＡ Ｒを、Ｗｉｎｃｏｔｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．，１９９５，２３，２６７７−２６８４において提供される手順に従って
調製した。この開示は、その全体が本明細書中で参考として援用されている。Ｒ
ＮＡ Ｃを、標準的なカップリングサイクル、脱保護、および１０ＭのＮＨ4 Ｏ
Ａｃからの沈殿を使用して調製いた。アミノグリコシドパラモマイシンは、０．
２５および０．４５マイクロモルのｋＤ値をそれぞれ有して、ＲおよびＣの両方
に結合する。報告されたｋＤ値は、およそ０．２μＭである。Ｒｅｃｈｔら、Ｊ
．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９６，２６２，４２１−２３６，Ｗｏｎｇら、Ｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，５，３９７−４０６，およびＷａｎｇら、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９７，３６，７６８−７７９。パロモマイシンは、２
７マーのモデルＲＮＡの主要な溝の中に結合し、そしてＡ１４０８、Ｇ１４９４
、およびＧ１４９１と接触しながら立体構造の変化を誘導することが、以前に示
されている。Ｍｉｙａｇｕｃｈｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１９９
６、２４，３７００−３７０６；Ｆｏｕｒｍｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，
２７４，１３６７−１３７１；およびＦｏｕｒｍｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
，１９９８，２７７，３３３−３４５。
【０４７１】 １２５ｎＭのパロモマイシンと混合したＣの５μＭの溶液から得られる質量ス
ペクトルは、ｍ／ｚ１９８３．６で遊離のＣに由来する[ Ｍ−５Ｈ] ５−イオン
、およびｍ／ｚ１９０７．３でパロモマイシン−Ｃ複合体の[ Ｍ−５Ｈ] ５−イ
オンを含む。質量スペクトル分析実験は、負のイオン化態様において作用するＬ
ＣＱ四極子イオン捕捉質量スペクトル分析装置（Ｆｉｎｎｉｇａｎ；Ｓａｎ Ｊ
ｏｓｅ，ＣＡ）上で行われている。ＲＮＡおよびリガンドを、脱溶媒和プロッセ
スを補助するためにイソプロピルアルコールを添加した（１：１のｖ：ｖ）、１
５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐｐＨ７．０）中に溶解させた。親イオン
を、１．５ｍ／ｚの窓で単離し、そして末端のキャップに適用したＡＣ電圧を、
親イオンの約７０％が解離するまで増大させた。エレクトロスプレーの針の電圧
を、−３．５ｋＶに調節し、そして噴霧を、５０ｐｓｉ（６０：４０のＮ２：Ｏ
２）のガス圧で安定させた。キャピラリー界面を、１８０℃の温度にまで加熱し
た。イオン捕捉部分中のＨｅガス圧は、１ｍのトールであった。ＭＳ−ＭＳ実験
においては、所望のｍ／ｚを有する１．５Ｄａの窓内のイオンを、共鳴噴出を介
して選択し、そしてｑ）０．２で保存した。励起ＲＦ電圧を、３０ｍｓで末端の
キャップに適用し、そして手動で１．１のＶｐｐに増大させて、親イオンの強度
を最少にしそして最大量のフラグメントイオンを生成させた。全部で１２８のス
キャンを、１００ｍｓのタッピング後にｍ／ｚ７００−２７００にわたって評価
した。Ｃおよおび複合体の［ｍ−４Ｈ］４−イオンに由来するシグナルは、それ
ぞれ、ｍ／ｚ２２２９．８および２３８４．４で検出される。トリプロピルアミ
ンを用いて変性させたサンプルについて観察されるより高く荷電したイオンから
は、シグナルは、観察されない。天然のタンパク質および変成させたタンパク質
を用いる研究での類似性においては、これは、Ｃおよびパロモマイシン複合体に
ついてのよりコンパクトな構造と一致する。Ｃの［Ｍ−５Ｈ］５−イオンによっ
て得られるＣＡＤ質量スペクトルを、図１５３Ｂに示す。フラグメントイオンは
、１００５．６（ｗ６）２−，１０６５．８（ａ７−Ｂ）２−、１１６２．６（
ｗ７）２−、１７５６．５（Ｍ−Ａｄ）５−、２１０８．９（ｗ２１−Ａｄ）３
−、２１５３．４（ａ２０−Ｂ）３−、２２１７．８（ｗ２１）３−、および２
２５８．３（ａ２１−Ｂ）３−で検出される。ＭｃＬｕｃｋｅｙら、Ｊ．Ａｍ．
Ｓｏｃ．，Ｍａｓ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ．，１９９２，３，６０−７０およびＭｃ
Ｌｕｃｋｅｙら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９３、１１５、１２０８
５−１２０９５．これらのフラグメントイオンは全て、３つのデオキシアデノシ
ンヌクレオチドからのアデニンの欠失、続く３' −Ｃ−Ｏ糖結合の切断によって
、得られる。同じ活性化エネルギーを用いて得られるＣとパロモマイシンとの間
での複合体の［Ｍ−５Ｈ］５−イオンについてのＣＡＤ質量スペクトルを、図１
５３Ｃに示す。図１５３Ｂの同一の解離条件を使用するデオキシアデノシン部位
での鎖の切断によって検出されるフラグメントイオンは存在しない。パロモマイ
シンの結合の際に観察される断片化パターンにおける変化は、ヌクレオチドの衝
突性の活性化および解離を妨げる、Ａ１４９２、Ａ１４９３、およびＡ１４０８
の局所的な電荷の分布、立体構造、または可動性における変化と一致する。
【０４７２】 ＤＭＳＯ中に溶解させた２１６個のテトラアザシクロパンを含有する２つのコ
ンビナトリアルライブラリーを、各ライブラリーのメンバーが１０ｎＭで存在す
るように、１０μＭのＣを含有する緩衝化した溶液と混合した。得られる質量ス
ペクトルは、Ｃとライブラリーのメンバーとの間での、同じ名目上の比を有する
＞１０個の複合体を明らかにする。第１のライブラリーに由来する最も豊富な複
合体に由来するイオン（［Ｍ−５Ｈ］；5-ｍ／ｚ１９１９．０）を単離し、そし
て解離させた。図１５４Ａに示すように、この複合体の解離によって、ｍ／ｚ１
００６．１、１０６５．６、および１１６２．４で３つのフラグメントイオンを
生じる。これは、それぞれのｄＡ残基での切断による。さらに強いシグナルが、
ｍ／ｚ２３７８．９、２４４３．１、および２４８３．１で観察される。これら
のイオンは、６７６．０＝０．６Ｄａの質量でライブラリーメンバーと結合した
ｗ21(3-)、ａ20−Ｂ(3-)、およびａ21(3-)フラグメントに対応する。フラグメン
トイオンの相対的な量は、複合体化していないＣについて観察されたパターンと
類似であるが、より低い基部および４個のループに由来するイオンの質量は、リ
ガンドとの複合体化によっては移動しない。このリガンドは、デオキシアデノシ
ン残基のわずかな保護を付与し、そしてより低い基部のループに結合しなければ
ならない。ライブラリーは、荷電した基と芳香族官能基との混合物から合成され
ており、そして、Ａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９
９８（印刷中）においてライブラリー２５および２３として記載されている。同
じ衝突性のエネルギーを用いる、ｍ／ｚ１９３４．３を有するＣと第２のライブ
ラリーとの混合物に由来する最も豊富な複合体の解離（図１５４Ｂ）は、いくつ
かのフラグメントイオンを生じる。優勢なシグナルは、完全な複合体および天然
のアデニンの欠失によって生じる。リガンドの質量（７５３．５Ｄａ）は、官能
基の２つの組み合わせを有するライブラリー中の６個の可能性のある化合物と一
致する。この複合体からのアデニンの切断および欠失の低下したレベルは、パロ
モマイシンと同様に、モデルＡ部位領域でのリガンドの結合と一致する。第２の
ライブラリーは、５μｍで転写／翻訳を阻害する。そしてＥ．ｃｏｌｉ（ｉｍｐ
−）およびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓに対して２−２０μＭのＭＩＣを有する。
【０４７３】 質量スペクトル分析に基づくアッセイは、ＲＮＡと低分子との間の複合体を同
定するための多くの利点を提供する。アッセイ混合物における全ての構成要素が
本来備わっている質量標識を保有し、そして放射性または蛍光タグを用いるさら
なる改変は、複合体の形成を検出するためには必要ではない。リガンドの科学的
な組成物は、測定される複合体の分子量から確認することができ、これによって
、ＲＮＡ標的に対する誘導を同定するためのライブラリーの迅速なデコンボリュ
ーションを可能にする。キメラオリゴヌクレオチド中へのデオキシヌクレオチド
の取りこみは、衝突によって活性化される乖離が好ましい場合には、一連の可動
性の部位を生成する。可動性の部位でのリガンドの結合は、ｍＳ−ＭＳ実験にお
いて観察されるＣＡＤによる保護を与える。本発明のこの質量スペクトル分析に
基づく保護方法は、さらなる化学的試薬放射性標識（ｒａｄｉｏｂａｂｅｌｉｎ
ｇ）の必要性を伴わずに、低分子リガンドについての結合部位を確立するために
使用され得る。この方法論は、ＤＮＡの配列決定およびゲノムの欠損の同定にお
いてもまた、使用され得る。
【０４７４】 本発明の好ましい実施態様に従うと、標的の生体分子と推定のリガンドとの間
での結合の決定の増大された精度が所望される。特定の質量スペクトル分析技術
が、このような増強を生じ得る。適切である場合は、標的の生体分子は、通常は
、光学顕微鏡によって分析されるサンプル中に過剰に存在する。このような標的
の実際の組成は、知られているものと同様である。従って、標的から誘導される
親の（および他の）イオンの同位元素の豊富さは正確であることが知られている
。 好ましい実施態様に従うと、質量スペクトル分析のデータは、１つ以上の、好
ましくは推定のリガンドまたは試験リガンドの混合物と接触させられる標的生体
分子（または生体分子）を含有するサンプルから回収される。このような化合物
の混合物は、本明細書中の別の場所で議論するように、ほとんど複合体である。
得られる質量スペクトルもまた複合体であるが、標的生体分子（単数または複数
）のシグナルの代表的なものは、容易に同定される。標的分子の同位元素のピー
クが同定され、そして質量分析データを内的に計算するために使用されることが
好ましく、従ってこのようなピークについてＭ／ｓが正確に知られているので、
回収される。結果として、標的とそれに結合するリガンドとの間で複合体を提示
するピークの実際の質量の移動（標的のシグナルに関して）を決定することが可
能となる。実際の質量の移動を生じる場合は、上記のリガンドの実際の分子量が
決定され得る。実際の分子量（通常は、数桁の小数点の精度まで）は、標的に実
際に結合したリガンドの実態を決定するために使用されることが好ましい。
【０４７５】 他の好ましい実施態様に従うと、回収された情報は、関連するかまたは他のデ
ータベース中に入れられ、これから、標的の生体分子に結合するリガンドに関係
するさらなる情報を得ることができる。これは、標的に対して結合することが見
出されている化合物の結合親和性が決定され、そしてデータベース中に含まれて
いる場合に、特に正確である。比較的高い結合親和性を有する化合物が、データ
ベース中に含まれるこのような情報に基づいて選択され得る。
【０４７６】 このようなデータの回収およびデータの操作が、一般的な目的のデジタルコン
ピュータを通じて達成されることが、好ましい。例示的なソフトウェアプログラ
ムが作成されており、そしてＲＮＡ標的に結合する低分子を同定するため、結合
定数を計算するため、および関連するデータベースに対する結果を記録するため
に、使用されている。このプログラムは、ＲＮＡおよび低分子の基本的な式を列
挙するファイルを入力として使用し、これは、研究下の混合物中にそして溶液中
にそれらの濃度で存在する。このプログラムは、最初に、それぞれの可能性のあ
る複合体の最も豊富な荷電状態についての同位元素の予想されるピーク分布を計
算し、次いで、ＦＴＭＳの結果のファイルを開く。このプログラムは、生データ
の素早いフーリエ変換を行い、質量軸を計算し、図１５５に示される例示的なス
ペクトルのような得られるスペクトル中のシグナルを積分する。スペクトル中の
ピークは、好ましくは、図１５６に示されるようなセントロイディングを痛いて
同定され、積分され、そして好ましくは、データベース中に保存される。例示的
なデータファイルを、図１５７に示す。予想され、そして観察されるピークは集
められ、そして積分は、内部標準の強度の基づいて結合定数に変換される。化合
物の実態および結合定数データは、相対的なデータベースに対して記載される。
このアプローチは、ヒトの介入を伴うことなく分析される質量スペクトルによっ
て作成され、これによって、有意に時間が削減される。
【０４７７】 図１５５は、１６Ｓ ＲＮＡ（Ｉｂｉｓ １６６２８）中に５ｍＭ、およびリ
ガンドＩｂｉｓ１００１９中に５００ｎＭである溶液の、エレクトロスプレーイ
オン化フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量スペクトル分析を示す。生時
間−ドメインデータセットは、自動的にアポダイズされ、そしてフーリエ変換の
前にゼロ調節（ｚｅｒｏｆｉｌｌｅｄ）される。スペクトルは、内部質量標準と
しての遊離のＲＮＡの（Ｍ−５Ｈ+ ）5-および（自動的に−４Ｈ+ ）4-電荷状態
の複数の同位元素ピークを使用して、そして遊離のＲＮＡと結合したＲＮＡとの
間での差異を測定することによって、後で自動的に較正される。遊離のＲＮＡの
同位元素分布は、事前に測定され、そして測定された分布は、ｍ／ｚの差異が同
種の同位元素種（例えば、単一の同位元素のピーク、または４個の13Ｃ原子を含
有する同位元素のピーク）間で測定されることを確実にするために、計算された
分布に適合させられる。
【０４７８】 図１５６は、ＲＮＡ−リガンド複合体が予想される場合に、ｍ／ｚの範囲にお
いて観察される同位元素クラスターが、ピークのセントロイディングおよび積分
によってさらに分析されることを示す。図１５７は、一覧表にしたデータを示し
、そして関係するデータベース中に保存した。ＲＮＡ標的とリガンドとの間での
複合体に対応するピークが指摘され、そしてデータベース中に記録される。内部
親和性標準が使用される場合は、相対的なＫｄは、標準の複合体と未知の複合体
の相対的な吸光度から計算され、そしてデータベース中に記録される。図１５８
は、本発明の特定の局面を実行するための１つのコンピュータプログラムについ
てのフローチャートを示す。
【０４７９】 コンピュータによって制御された上記の情報の回収が提供され、そして関連す
るデータベースのコンピュータ制御が使用される場合は、本発明は、質量スペク
トル分析的な結合情報の非常に高スループットな分析が可能である。このような
制御は、標的の生体分子に対して高い結合親和性を有するリガンドの同定を容易
にする。従って、自動化は、結合リガンド（単数または複数）の質量の自動的な
計算を、特に、標的の質量が内部較正の目的のために使用される場合には、可能
にする。結合リガンドの正確な質量によって、それらの実態が、自動化された方
法によって決定される。リガンド−標的相互作用についての解離定数もまた、既
知のＫｄおよび参照複合体の量のいずれかを使用して、または種々の標的／リガ
ンド比での複数の測定値を用いる滴定によって、確定され得る。さらに、タンデ
ムな質量スペクトル分析が、標的との低分子、リガンド相互作用の部位が、断片
化分析によって確定され得るような、自動化された様式で行われ得る。関連する
データベースからのコンピュータ入力および出力が、もちろん好ましい。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は真核細胞および原核細胞のＲＮＡの分子相互作用部位を同定するための
一つの好ましい方法のセットを含むフローチャートについて説明している。
【図２】 図２はＦｉｎｄ Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ Ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｅ ＥＳＴＢ
ｌａｓｔの手順の好ましいセットについて説明している。
【図３】 図３はＢｒａｓｔＰａｒｓｅプロトコルの好ましいステップについて説明した
フローチャートである。
【図４】 図４はＱ−Ｃｏｍｐａｒｅプロトコルの好ましいステップについて説明したフ
ローチャートである。
【図５】 図５Ａ，５Ｂ，５Ｃ，５ＤはＣｏｍｐａｒｅＯｖｅｒＷｉｎｓプロトコルの好
ましいステップを説明したフローチャートである。
【図６】 図６はフェリチンＲＮＡについてのマウスとヒトの種間配列比較の代表的な散
点プロットである。
【図７】 図７は単一配列の自己相補性分析の一例を示している。
【図８】 図８はあるオーソログの自己相補性プロットの重ね合わせで、それぞれの最も
繰り返しの多いパターンを選ぶと、ブロックの対角線上に紐状に描写された可能
性のある折り畳まれたコンフィギュレーションの最小の数として出ている。
【図９】 図９は代表的な記述語を示す。
【図１０】 図１０はフェリチンのｅ−ｖａｌｕｅスコアの一組を示している。
【図１１】 図１１はフェリチンＲＮＡについて、ヒトとますの間の種間配列を比較して代
表的な散点プロットを示している。
【図１２】 図１２はフェリチンＲＮＡについてヒトとニワトリの間の種間配列を比較して
代表的な散点プロットを示している。
【図１３】 図１３はＱ−ｃｏｍｐａｒｅ又は、ＣｏｍｐａｒｅＯｖｅｒＷｉｎｓで使用さ
れる代表的なルックアップ表を示している。
【図１４】 図１４は化合物ＣＩと構成フラグメントに切断されたものを示している。
【図１５】 図１５は化合物ＣＩを構成するフラグメントの各種の同定特性が示されている
。
【図１６】 図１６は化合物ＣＩを構成するそれぞれのフラグメントを導入するのに用いら
れる反応剤の各種の同定特性を示している。
【図１７】 図１７は化合物ＣＩの生成に関連してフラグメントと反応剤をリンクする変換
のリストについて説明している。
【図１８】 図１８は二つの異なる反応剤を用いて、共通のフラグメントを導入するための
図式を示している。
【図１９】 図１９Ａは一つ化合物に二つの異なるフラグメントを導入するには一種類の反
応剤を使って行なうための図式を示している。 図１９Ｂは生成された化合物内で、さらに二つの異なるフラグメントに変換さ
れ得る化合物に、共通フラグメントを導入するための共通反応剤の使用を示した
図式である。
【図２０】 図２０は記号で示したフラグメントの付加で記号で示した化合物ＣＩが得られ
ることを示している。
【図２１】 図２１は記号で示した反応剤の表。
【図２２】 図２２は記号で示したフラグメントの表。
【図２３】 図２３は記号で示した変換の表。
【図２４】 図２４は個々の化合物、化合物Ｃ１およびＣ４および混合物Ｍ１の生成を示し
ている。
【図２５】 図２５はさらなる混合物、混合物Ｍ２の生成を示している。
【図２６】 図２６は付加混合物、混合物Ｍ３の生成を示している。
【図２７】 図２７ＡおよびＢは付加混合物、混合物Ｍ４の生成を示している。
【図２８】 図２８はフラグメントを付加および／または変換を行なうことにより化合物Ｃ
１を追跡するための表を示している。
【図２９】 図２９は変換を行なって混合物Ｍ１を追跡するための表を示している。
【図３０】 図３０は変換を行なって混合物Ｍ２を追跡するための表を示している。
【図３１】 図３１は変換を行なって混合物Ｍ３を追跡するための表を示している。
【図３２】 図３２は化合物をロボットを使って合成するのに用いる装置を絵で表した立面
図を示している。
【図３３】 図３３は化合物をロボットを使って合成するのに用いる装置を絵で表した平面
図を示している。
【図３４】 図３４は化合物のライブラリーをつくるための第一合成反応の図式を示してい
る。
【図３５】 図３５は図３４の化合物のライブラリーをつくるための第二合成反応の図式を
示している。
【図３６】 図３６はＴＡＲとドッキングし、それに続いて溶媒和／脱溶媒和エネルギーを
計算した典型的な化合物を示している。
【図３７】 図３７は４．５Ｓ−Ｐ４８用の標的ＲＮＡを示している。
【図３８】 図３８Ａは小麦胚芽ライゼートシステムで三種のＤＮＡプラズミドのキャップ
依存翻訳の代表的な実証を示している。ａ）ＡＵＧ出発コドンの前に９塩基のリ
ーダー配列をもったルシフェラーゼ遺伝子、ｂ）キャップの隣のＴＡＲ ＲＮＡ
構造での構成の翻訳、ｃ）９塩基のリーダー配列によりキャップから分離された
ＴＡＲ ＲＮＡ構造での構成の翻訳。塗りつぶしたバー： ｍ7 Ｇ無添加、ハッ
チが入ったバー： ｍ7 Ｇ添加。 図３８Ｂは３９アミノ酸ｔａｔペプチドによるＴＡＲ ＲＮＡ構造を含むｍＲ
ＮＡ構造の典型的な翻訳の阻害を示している。ａ）１０μＭのｔａｔペプタイド
を加える場合と加えない場合で、９塩基リーダー配列をもったルシフェラーゼｍ
ＲＮＡの翻訳、ｂ）そのキャップの隣のＴＡＲ ＲＮＡ構造を含むルシフェラー
ゼｍＲＮＡの翻訳、ｃ）１０μＫＭ ｔａｔ ペプチドの存在／不存在下での９
塩基リーダーをもったルシフェラーゼ／ＴＡＲ ＲＮＡ構造の翻訳。
【図３９】 図３９はＡＣＤ００００１１９９（ＤｅｃｐＢｌｕｅ−３）による５ −ＵＴ
Ｒ内のＴＡＲ ＲＮＡ構造を含むルシフェラーゼｍＲＮＡ構造の翻訳の典型的な
用量依存の阻害について示している。実線：対照ｌｕｃ＋９プラズミドの翻訳の
阻害、破線： ５ −ＵＴＲ構造のＴＡＲ ＲＮＡを含むｌｕｃ＋９ｍＲＮＡの
表現阻害。
【図４０】 図４０は１６Ｓ ｒＲＮＡ Ａ部位に対応する２７−ｍｅｒ ＲＮＡ標的の配
列と構成を示している。
【図４１】 図４１はパロモマイシンの存在および不存在下の２７−ｍｅｒ ＲＮＡ／ＤＡ
ＮハイブリッドのＥＳＩ−ＣＩＤ−ＭＳについて示している。
【図４２】 図４２はパロモマイシンのみ存在下（パネルａ）とパロモマイシンとコンビナ
トリアルライブラリーの両方が存在する場合（パネルｂ）の２７−ｍｅｒ ＲＮ
Ａ／ＤＮＡハイブリッド標的のＥＳＩ−ＭＳを示している。
【図４３】 図４３はコンビナトリアルライブラリーメンバーである２７−ｍｅｒ ＲＮＡ
／ＤＮＡハイブリッドの非共有複合イオンのｍ／ｚ１９１９．０でのＥＳＩ−Ｃ
ＩＤ−ＭＳスペクトルを示す。
【図４４】 図４４は２７−ｍｅｒ ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドに対してスクリーニング
をしたコンビナトリアルライブラリーのＥＳＩ−ＭＳを示す。
【図４５】 図４５は他のコンビナトリアルライブラリーからの質量６６５の一つのメンバ
ーの結合から生じるｍ／ｚ １９１７．８ ｕ の信号のＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳ分
析を示す。
【図４６】 図４６はライブラリーからの質量７２０のメンバーの結合から生じたｍ／ｚ１
９３４．３ ｕ の信号のＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳ分析を示す。
【図４７】 図４７はＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖からのイオン（ＣＩＤ）から生じるｗおよびａ
−Ｂａｓｅの存在量をグラフで示した呈示量を示す。
【図４８】 図４８はＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖からのイオン（ＣＩＤ）から生じるｗ および
ａ−Ｂａｓｅの存在量をグラフで示した呈示量を示す。
【図４９】 図４９は分子相互作用部位へのリガンド結合を決定するためのｄｅｐｉｃｔＭ
ＡＳＳ分析を示している。
【図５０】 図５０は分子相互作用部位へのリガンド結合を決定するためのｄｅｐｉｃｔＭ
ＡＳＳ分析を示している。
【図５１】 図５１は分子相互作用部位へのリガンド結合を決定するためのｄｅｐｉｃｔＭ
ＡＳＳ分析を示している。
【図５２】 図５２はパロモマイシンと複合したＲＮＡの１６Ｓ Ａ部位の相互作用の高精
度ＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ質量測定について記述している。
【図５３】 図５３はＲｅｖＣｏｍｐといわれるプログラムの代表的なブロックダイアグラ
ムを示している。
【図５４】 図５４はオーソログを発見するための好ましいデータベース・検索法の好まし
い段階を示す代表的なフローチャートを示している。
【図５５】 図５５はフェリチン種分類のための代表的なＨｏｖｅｒｇｅｎ系統樹を示して
いる。
【図５６】 図５６はフィレチン哺乳類目分類の代表的なＨｏｖｅｒｇｅｎ系統樹を示して
いる。
【図５７】 図５７は好ましいＳＥＡＬＳ法の好ましい段階を示す代表的なフロースキーム
を示している。
【図５８】 図５８はヒトとマウスのフェリチン５ ＵＴＲ間の配列領域の類似性を示す代
表的プロットを示している。
【図５９】 図５９はマウスとヒトの５ ＵＴＲ中に保存されていた鉄反応成分を示す遺伝
子地図を示している。
【図６０】 図６０はヒトとますのフェリチン５ ＵＴＲ間の配列領域の類似性を示す代表
的プロットを示している。
【図６１】 図６１はヒトとニワトリとのフェリチン５ ＵＴＲ間の配列領域の類似性を示
す代表的なプロットを示す。
【図６２】 図６２は代表的なフェリチン５ ＵＴＲの位置合わせヒット図を示している。
【図６３】 図６３は代表的なフェリチン５ ＵＴＲのクラスターの位置合わせを示してい
る。
【図６４】 図６４は好ましいＳｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ法の好ましい段階
を示す代表的な流れ図を示している。
【図６５】 図６５はフェリチン５ ＵＴＲの代表的な逆相補体マトリックスを示している
。
【図６６】 図６６はフィリチン５ ＵＴＲ構造の代表的なドーム構造図を示している。
【図６７】 図６７はフェリチン５ ＵＴＲの代表的な構造図を示している。
【図６８】 図６８はヒストンに対する代表的なＨｏｖｅｒｇｅｎ系統樹を示している。
【図６９】 図６９はヒストンに対する脊椎動物の分類を示す代表的なＨｏｖｅｒｇｅｎ系
統樹をしめしている。
【図７０】 図７０はヒストン３ ＵＴＲについての代表的な位置合わせヒット図を示して
いる。
【図７１】 図７１はヒストン３ ＵＴＲについての代表的クラスターの位置合わせを示し
ている。
【図７２】 図７２はヒストン３ ＵＴＲについての代表的な逆相補体マトリックスを示し
ている。
【図７３】 図７３はヒストン３ ＵＴＲについての代表的ドーム構造図を示している。
【図７４】 図７４はヒストン３ ＵＴＲについての代表的な構造図を示している。
【図７５】 図７５はビメチン３ ＵＴＲの２領域についての代表的構造図を示している。
【図７６】 図７６はビメチンに対する代表的なＨｏｖｅｒｇｅｎ系統樹を示している。
【図７７】 図７７はビメチン３ ＵＴＲの代表的な位置合わせヒット図を示している。
【図７８】 図７８はビメチン３ ＵＴＲの領域１についての代表的クラスターの位置合わ
せを示している。
【図７９】 図７９はビメチン３ ＵＴＲの領域１についての代表的ドーム構造図を示して
いる。
【図８０】 図８０はビメチン３ ＵＴＲの領域１についての代表的構造図を示している。
【図８１】 図８１はビメチン３ ＵＴＲについてのＺｅｈｎｅｒ らにより提案された構
造を示している。
【図８２】 図８２はビメチン３ ＵＴＲの領域２についての代表的クラスター位置合わせ
を示している。
【図８３】 図８３はビメチン３ ＵＴＲの領域２についての代表的ドーム構造図を示して
いる。
【図８４】 図８４はトランスフェリン受容体の代表的Ｈｏｖｅｒｇｅｎ系統樹を示してい
る。
【図８５】 図８５はトランスフェリン受容体３ ＵＴＲの領域１の代表的な位置合わせヒ
ット図を示している。
【図８６】 図８６はトランスフェリン受容体３ ＵＴＲの領域１の代表的なクラスターの
位置合わせを示している。
【図８７】 図８７はトランスフェリン受容体３ ＵＴＲの領域１の代表的なドーム構造図
を示している。
【図８８】 図８８はトランスフェリン受容体３ ＵＴＲの領域１の代表的な構造図を示し
ている。
【図８９】 図８９はトランスフェリン受容体３ ＵＴＲの領域２の代表的な位置合わせヒ
ット図を示している。
【図９０】 図９０はトランスフェリン受容体３ ＵＴＲの領域２の代表的なクラスターの
位置合わせを示している。
【図９１】 図９１はトランスフェリン受容体３ ＵＴＲの領域２の代表的なドーム構造図
を示している。
【図９２】 図９２はトランスフェリン受容体３ ＵＴＲの領域２の代表的な構造図を示し
ている。
【図９３】 図９３はトランスフェリン受容体３ ＵＴＲの領域３の代表的な位置合わせヒ
ット図を示している。
【図９４】 図９４はトランスフェリン受容体３ ＵＴＲの領域３の代表的なクラスターの
位置合わせを示している。
【図９５】 図９５はトランスフェリン受容体３ ＵＴＲの領域３の代表的なドーム構造図
を示している。
【図９６】 図９６はトランスフェリン受容体３ ＵＴＲの領域３の代表的な構造図を示し
ている。
【図９７】 図９７はトランスフェリン受容体３ ＵＴＲの領域４の代表的な位置合わせヒ
ット図を示している。
【図９８】 図９８はトランスフェリン受容体３ ＵＴＲの領域４の代表的なクラスターの
位置合わせを示している。
【図９９】 図９９はトランスフェリン受容体３ ＵＴＲの領域４の代表的なドーム構造図
を示している。
【図１００】 図１００はトランスフェリン受容体３ ＵＴＲの領域４の代表的な構造図を示
している。
【図１０１】 図１０１はトランスフェリン受容体３ ＵＴＲの領域５の代表的な位置合わせ
ヒット図を示している。
【図１０２】 図１０２はトランスフェリン受容体３ ＵＴＲの領域５の代表的なクラスター
の位置合わせを示している。
【図１０３】 図１０３はトランスフェリン受容体３ ＵＴＲの領域５の代表的なドーム構造
図を示している。
【図１０４】 図１０４はトランスフェリン受容体３ ＵＴＲの領域５の代表的な構造図を示
している。
【図１０５】 図１０５はオルニチン・デカルボキシラーゼ３ ＵＴＲの領域１の代表的な質
量スペクトル構造プローブ分析を示す。
【図１０６】 図１０６はオルニチン・デカルボキシラーゼ３ ＵＴＲの領域１の代表的なク
ラスターの位置合わせを示している。
【図１０７】 図１０７はオルニチン・デカルボキシラーゼ３ ＵＴＲの代表的なＨｏｖｅｒ
ｇｅｎ系統樹を示している。
【図１０８】 図１０８は脊椎動物のオルニチン・デカルボキシラーゼ３ ＵＴＲの代表的な
Ｈｏｖｅｒｇｅｎ系統樹を示している。
【図１０９】 図１０９はオルニチン・デカルボキシラーゼ３ ＵＴＲの代表的な位置合わせ
ヒット図を示している。
【図１１０】 図１１０はオルニチン・デカルボキシラーゼ３ ＵＴＲの領域１の逆相補体マ
トリックスを示している。
【図１１１】 図１１１はオルニチン・デカルボキシラーゼ３ ＵＴＲの領域１の代表的なド
ーム構造図を示している。
【図１１２】 図１１２はオルニチン・デカルボキシラーゼ３ ＵＴＲの領域１の代表的な構
造図を示している。
【図１１３】 図１１３はオルニチン・デカルボキシラーゼ３ ＵＴＲの領域２の代表的なク
ラスターの位置合わせを示している。
【図１１４】 図１１４はオルニチン・デカルボキシラーゼ３ ＵＴＲの領域２の代表的なド
ーム構造図を示している。
【図１１５】 図１１５はオルニチン・デカルボキシラーゼ３ ＵＴＲの領域２の代表的な構
造図を示している。
【図１１６】 図１１６はインターロイキン−２（ＩＬ−２）の代表的なＨｏｖｅｒｇｅｎの
系統樹を示している。
【図１１７】 図１１７はＩＬ−２ ３ ＵＴＲの領域の代表的な位置合わせヒット図を示し
ている。
【図１１８】 図１１８はＩＬ−２ ３ ＵＴＲの領域１の代表的なクラスター位置合わせを
示している。
【図１１９】 図１１９はＩＬ−２ ３ ＵＴＲの領域１の代表的なドーム構造図を示してい
る。
【図１２０】 図１２０はＩＬ−２ ３ ＵＴＲの領域１の代表的な構造図を示している。
【図１２１】 図１２１はＩＬ−２ ３ ＵＴＲの領域２の代表的なクラスターの位置合わせ
を示している。
【図１２２】 図１２２はＩＬ−２ ３ ＵＴＲの領域２の代表的なドーム構造図を示してい
る。
【図１２３】 図１２３はＩＬ−２ ３ ＵＴＲの領域２の代表的な構造図を示している。
【図１２４】 図１２４はＩＬ−２ ３ ＵＴＲの代表的位置合わせヒット図を示している。
【図１２５】 図１２５はＩＬ−２ ３ ＵＴＲの領域３の代表的なクラスター位置合わせを
示している。
【図１２６】 図１２６はＩＬ−２ ３ ＵＴＲの領域３の代表的なドーム構造図を示してい
る。
【図１２７】 図１２７はＩＬ−２ ３ ＵＴＲの領域３の代表的な構造図を示している。
【図１２８】 図１２８はインターロイキン−４（ＩＬ−４）の代表的なＨｏｖｅｒｇｅｎの
系統樹を示している。
【図１２９】 図１２９はＩＬ−４ ５ ＵＴＲの代表的な位置合わせヒット図を示している
。
【図１３０】 図１３０はＩＬ−４ ５ ＵＴＲの代表的なクラスター位置合わせを示してい
る。
【図１３１】 図１３１はＩＬ−４ ５ ＵＴＲの代表的なドーム構造図を示している。
【図１３２】 図１３２はＩＬ−４ ５ ＵＴＲの代表的な構造図を示している。
【図１３３】 図１３３はＩＬ−４ ３ ＵＴＲの代表的な位置合わせヒット図を示している
。
【図１３４】 図１３４はＩＬ−４ ３ ＵＴＲの代表的なクラスターの位置合わせを示して
いる。
【図１３５】 図１３５はＩＬ−４ ３ ＵＴＲの代表的なドーム構造図を示している。
【図１３６】 図１３６はＩＬ−４ ３ ＵＴＲの代表的な構造図を示している。
【図１３７】 図１３７は最低エネルギーの配座異性体に対してＱＸＰ法を用いて同定された
バクテリアの１６ＳリボゾームＡ部位（示されていない）に結合したパロモマイ
シン（ダークグレイ）の代表的な最低エネルギー構造を示している。標的ＲＮＡ
は厳密に保たれているが、他方パラモマイシンは完全にフレキシブルに処理され
ている。ＮＭＲを使って得られた構造（ライトグレイ）で示されている。
【図１３８】 図１３８はパロモマイシンに結合したバクテリアの１６ＳリボゾームのＡ部位
について得られたｒｍｓ偏差とＱＸＰエネルギースコア間の代表的な関係を示す
。Ｉ１−Ｉ５は別の実験を示している。
【図１３９】 図１３９は１６Ｓ ＲＮＡモデル（１０μＭ）の一つと６０メンバーのコンビ
ナトリアルライブラリーの一つとの混合物から得られたＦＴＭＳスペクトルにつ
いて記述している。
【図１４０】 図１４０は図１３９の１８６３複合体の拡大図について記述している。
【図１４１】 図１４１はスタート時の化合物のライブラリーから決定された結合リガンドの
質量について記述している。
【図１４２】 図１４２は図１４０および図１４１で使用したライブラリーの高分解能ＥＳＩ
−ＦＴＩＣＲスペクトルについて記述している。
【図１４３】 図１４３は典型的な「未知」結合リガンドの元素組成を決定するための精密質
量測定と元素による制約について記述している。
【図１４４】 図１４４はＲＮＡ濃度一定でリガンド濃度が異なる溶液のＥＳＩ−ＭＳ測定に
ついて記述している。
【図１４５】 図１４５は直列質量分析法によるリガンド結合部位決定のための好ましい図に
よる表示について記述している。
【図１４６】 図１４６は原核細胞１６Ｓ Ａ部位に代表される２７−ｍｅｒＲＮＡ構造に対
する２７メンバー・ライブラリーのＭＡＳＳスクリーニングについて記述してい
る。
【図１４７】 図１４７はパロモマイシン結合部位でデオキシアデノシン残基を含む原核細胞
１６Ｓ Ａ部位を代表する２７−ｍｅｒ ＲＮＡ構造のＭＳ／ＭＳについて記述
している。
【図１４８】 図１４８はパロモマイシン結合におけるデオキシデノシン残基を含む原核細胞
１６Ｓ Ａ部位を代表する２７−ｍｅｒ ＲＮＡ構造と２１６メンバーのコンビ
ナトリアルライブラリーの混合物から得られるＭＳ−ＭＳスペクトルについて記
述している。
【図１４９】 図１４９は１８Ｓ（真核細胞）と１６Ｓ（原核細胞）のＡ部位に対応する作業
で使用された２７塩基ＲＮＡの二次構造について記述している。
【図１５０】 図１５０は５００ｎＭパロモマイシン存在下で５末端に１８原子の中性質量標
識を付けた場合（７μＭ）と付けない場合（１μＭ）の１６Ｓ Ａ部位の２７塩
基混合物の発現量のＥＳＩ−ＦＴＩＣＲスペクトルについて記述している。
【図１５１】 図１５１はアミノグリコシド混合物に対する１６Ｓ Ａ部位および１８Ｓ Ａ
部位のモデルＲＮＡの同時スクリーニングからの質量スペクトルについて記述し
ている。
【図１５２】 図１５２はオリゴヌクレオチドＲおよびＣの配列と構造について記述している
。
【図１５３】 図１５３Ａは５μＭ Ｃおよび１２５ｎＭパロモマイシン混合物から得られた
質量スペクトルについて記述している。図１５３Ｂは複合化しないＣから［Ｍ−
５Ｈ］5 −イオン（ｍ／ｚ １７８３．６）を単離後得られたＭＳ−ＭＳスペク
トルについて記述している。１５３Ｃはパロモマイシンで複合化したＣから［Ｍ
−５Ｈ］5 −イオン（ｍ／ｚ １９０７．５）を単離した後に得られたＭＳ−Ｍ
Ｓスペクトルについて記述している。
【図１５４】 図１５４Ａは１０μＭのＣおよび２１６メンバーのコンビナトリアルライブラ
リーの混合物で質量６７６．０±０．６のリガンドと複合したＣから［Ｍ−５Ｈ
］5 −イオン（ｍ／ｚ １９１９．０）を単離後に得られるＭＳ−ＭＳスペクト
ルについて記述している。 図１５４Ｂは１０μＭのＣおよび２１６メンバーのコンビナトリアルライブラ
リーの混合物で質量７５３．５±０．６のリガンドと複合したＣから［Ｍ−５Ｈ
］5 −イオン（ｍ／ｚ １９３４．３）を単離後得られたＭＳ−ＭＳスペクトル
について記述している。
【図１５５】 図１５５は標的／推定リガンド混合物のエレクトロスプレー・イオン化Ｆｏｕ
ｒｉｅｒ変換イオン・サイクロトロン共鳴質量分析法について記述している。
【図１５６】 図１５６は図１５５のスペクトルからの同位体クラスターを示す。
【図１５７】 図１５７は関連データベースに表わされストアされたデータについて記述して
いる。
【図１５８】 図１５８は本発明に従う方法に影響を与えるコンピュータ・プログラムのため
の典型的なフローチャートを示している。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年４月２３日（２００１．４．２３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項２９７】 マウス配列ＡＡＵＣＵＧＡＡＵＧＡＧＡＡＵＧＣＣＵ、
ＡＵＵＧＣＣＡＵＡＡＧＧＵＵＣＵＡＣＵ、ＣＣＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＣＡＡＧ
ＧＣＵを含んでなる、精製されかつ単離されたＲＮＡフラグメント。 特許請求の範囲の全体にわたって、外国語明細書の記載内容からみて不適切な
訳語が散在している。
【手続補正書】
【提出日】平成１３年４月２４日（２００１．４．２４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ ５Ｂ０７５ 33/566 33/566 Ｇ０６Ｆ 17/30 １７０ Ｇ０６Ｆ 17/30 １７０Ｆ 17/50 ６３８ 17/50 ６３８ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 グリフィー，リチャード アメリカ合衆国カリフォルニア州92084， ビスタ，バースビー・ストリート 360 (72)発明者 クルーク，スタンリー・ティー アメリカ合衆国カリフォルニア州92009， カールズバッド，ピラグア・ストリート 3211 (72)発明者 サンパス，ランガ アメリカ合衆国カリフォルニア州92129， サンディエゴ，マニックス・ロード 12223 (72)発明者 スウェイズ，エリック アメリカ合衆国カリフォルニア州92009， カールズバッド，パレンケ・ストリート 7789 (72)発明者 モーハン，ベンカトラマン アメリカ合衆国カリフォルニア州92009， カールズバッド，ビア・カバナ 7042 (72)発明者 ホフスタッドラー，スティーブン アメリカ合衆国カリフォルニア州92056， オーシャンサイド，ビューリッジ・ウェイ 5014 (72)発明者 マクネイル，ジョン アメリカ合衆国カリフォルニア州92037， ラ・ホーラ，レタハイム・ウェイ 427 Ｆターム(参考） 2G042 AA01 AA03 BD16 BD20 DA06 DA10 EA20 4B064 AF23 BH07 DA13 4C084 AA17 NA14 ZB212 4H006 AA05 AC90 5B046 BA02 DA02 DA08 FA06 FA09 JA04 KA06 KA08 5B075 UU19

Claims (297)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の工程を包含する、標的ＲＮＡの活性を調節する化合物
    を同定する方法： 前記標的ＲＮＡ上の少なくとも１つの分子相互作用部位を同定する工程； 該分子相互作用部位と相互作用することが推測されるかまたは計算された化合
    物の仮想ライブラリーをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで作成する工程；および 該分子相互作用部位との物理的な相互作用を形成するそれらのそれぞれの能力
    に従ってランク付けした該化合物の階層を作成するために、化合物の仮想ライブ
    ラリーのメンバーと該標的ＲＮＡの三次元の表現を比較する工程。
  2. 【請求項２】 前記化合物の階層の高くランク付けされたメンバーを合成す
    る工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記分子相互作用部位と相互作用するそれらの能力を決定す
    るために、前記高くランク付けされたメンバーを試験する工程をさらに包含する
    、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 以下の工程をさらに包含する、請求項２に記載の方法： 前記ＲＮＡと以下のメンバー（単数または複数）との間での複合体を提供する
    、前記高くランク付けされたメンバーの少なくとも１つと標的ＲＮＡとを接触さ
    せる工程： イオン化されている前記複合体； フラグメント化されている該イオン化された複合体；および 高くランク付けされたメンバーが該ＲＮＡの分子相互作用部位に結合するかど
    うかを決定する工程。
  5. 【請求項５】 他の高くランク付けされたメンバーの結合強度と比較して、
    高くランク付けされたメンバーの結合の強度を決定する工程をさらに包含する、
    請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 以下の工程を包含する、標的の生体分子の活性を調節する化
    合物を同定する方法： 該標的生体分子上の少なくとも１つの分子相互作用部位を同定する工程； 該分子相互作用部位と相互作用することが推測されるかまたは計算された化合
    物の仮想ライブラリーをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで作成する工程；および 該分子相互作用部位との物理的な相互作用を形成するそれらのそれぞれの能力
    に従ってランク付けした該化合物の階層を作成するために、化合物の仮想ライブ
    ラリーのメンバーと該標的ＲＮＡの三次元の表現を比較する工程。
  7. 【請求項７】 前記化合物の階層の高くランク付けされたメンバーを合成す
    る工程をさらに包含する、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記分子相互作用部位と相互作用するそれらの能力を決定す
    るために、前記高くランク付けされたメンバーを試験する工程をさらに包含する
    、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 以下の工程をさらに包含する、請求項７に記載の方法： 前記ＲＮＡと以下のメンバー（単数または複数）との間での複合体を提供する
    、前記高くランク付けされたメンバーの少なくとも１つと標的ＲＮＡとを接触さ
    せる工程： イオン化されている前記複合体； フラグメント化されている該イオン化された複合体；および 高くランク付けされたメンバーが該ＲＮＡの分子相互作用部位に結合するかど
    うかを決定する工程。
  10. 【請求項１０】 他の高くランク付けされたメンバーの結合強度と比較して
    、高くランク付けされたメンバーの結合の強度を決定する工程をさらに包含する
    、請求項４に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１に従って同定された、化合物。
  12. 【請求項１２】 請求項１に従って同定された化合物とＲＮＡとを接触させ
    る工程を包含する、ＲＮＡの作用を調節する方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１に従って同定された化合物を含有する薬学的薬品
    、農学的薬品、化学的薬品、または産業化学的薬品。
  14. 【請求項１４】 請求項６に従って同定された、化合物
  15. 【請求項１５】 請求項６に従って同定された化合物とＲＮＡとを接触させ
    る工程を包含する、生体分子の作用を調節する方法。
  16. 【請求項１６】 請求項６に従って同定された化合物を含有する薬学的薬品
    、農学的薬品、化学的薬品、または産業化学的薬品。
  17. 【請求項１７】 以下の工程を包含する、標的ＲＮＡの作用を調節する化合
    物を同定するための方法： 該分子相互作用部位と相互作用することが推測されるかまたは計算された化合
    物の仮想ライブラリーをｉｎ ｓｉｌｉｃｏで作成する工程； 該分子相互作用部位との物理的な相互作用を形成するそれらのそれぞれの能力
    に従ってランク付けした該化合物の階層を作成するために、化合物の仮想ライブ
    ラリーのメンバーと該標的ＲＮＡの三次元の表現を比較する工程；および 該化合物の階層の高くランク付けされたメンバーを合成する工程。
  18. 【請求項１８】 前記分子相互作用部位と相互作用するそれらの能力を決定
    するために、前記高くランク付けされたメンバーを試験する工程をさらに包含す
    る、請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 以下の工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法： 前記ＲＮＡと以下のメンバー（単数または複数）との間での複合体を提供する
    、前記高くランク付けされたメンバーの少なくとも１つと標的ＲＮＡとを接触さ
    せる工程： イオン化されている前記複合体； フラグメント化されている該イオン化された複合体；および 高くランク付けされたメンバーが該ＲＮＡの分子相互作用部位に結合するかど
    うかを決定する工程。
  20. 【請求項２０】 他の高くランク付けされたメンバーの結合強度と比較して
    、高くランク付けされたメンバーの結合の強度を決定する工程をさらに包含する
    、請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 少なくとも２４個のヌクレオチドであるが、７０個を超え
    ないヌクレオチドの連結された配列を含み、そして以下によって規定される二次
    構造を有する、ＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 内部のループ領域の第１の側を形成する２個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する４個のヌクレオチド； 末端のループ領域を形成する４個または５個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する４個のヌクレオチド； 該内部のループ領域の第２の側を形成する４個のヌクレオチド；および 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成する３個のヌクレオチド。
  22. 【請求項２２】 前記内部のループ領域の前記第１の側を形成する前記２個
    のヌクレオチドが、配列ＮＣである、請求項２１に記載のＲＮＡ。
  23. 【請求項２３】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記４個
    のヌクレオチドが、配列ＮＮＮＮであり、そして該第２の二本鎖領域の前記第２
    の側を形成する前記４個のヌクレオチドが、配列ＮＡＮＮである、請求項２１に
    記載のＲＮＡ。
  24. 【請求項２４】 前記末端のループ領域を形成する前記４個または５個のヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＮＵＮまたはＮＮＵＮである、請求項２１に記載のＲＮ
    Ａ。
  25. 【請求項２５】 ビメンチンＲＮＡの一部を含む、請求項２１に記載のＲＮ
    Ａ。
  26. 【請求項２６】 ビメンチンｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部を含む、請求項２
    １に記載のＲＮＡ。
  27. 【請求項２７】 以下の構造によって規定される二次構造を有するヌクレオ
    チドの連結された配列を含む、精製されそして単離されたＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 内部のループ領域の第１の側を形成する２個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する４個のヌクレオチド； 末端のループ領域を形成する４個または５個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する４個のヌクレオチド； 該内部のループ領域の第２の側を形成する４個のヌクレオチド；および 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成する３個のヌクレオチド。
  28. 【請求項２８】 前記内部のループ領域の前記第１の側を形成する前記２個
    のヌクレオチドが、配列ＮＣである、請求項２７に記載のＲＮＡ。
  29. 【請求項２９】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記４個
    のヌクレオチドが、配列ＮＮＮＮであり、そして該第２の二本鎖領域の前記第２
    の側を形成する前記４個のヌクレオチドが、配列ＮＡＮＮである、請求項２７に
    記載のＲＮＡ。
  30. 【請求項３０】 前記末端のループ領域を形成する前記４個または５個のヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＮＵＮまたはＮＮＵＮである、請求項２７に記載のＲＮ
    Ａ。
  31. 【請求項３１】 ビメンチンＲＮＡの一部を含む、請求項２７に記載のＲＮ
    Ａ。
  32. 【請求項３２】 ビメンチンｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部を含む、請求項２
    ７に記載のＲＮＡ。
  33. 【請求項３３】 以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの
    連結された配列を含む、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 内部のループ領域の第１の側を形成する２個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する４個のヌクレオチド； 末端のループ領域を形成する４個または５個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する４個のヌクレオチド； 該内部のループ領域の第２の側を形成する４個のヌクレオチド；および 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成する３個のヌクレオチド。
  34. 【請求項３４】 前記内部のループ領域の前記第１の側を形成する前記２個
    のヌクレオチドが、配列ＮＣである、請求項３３に記載のＲＮＡ。
  35. 【請求項３５】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記４個
    のヌクレオチドが、配列ＮＮＮＮであり、そして該第２の二本鎖領域の前記第２
    の側を形成する前記４個のヌクレオチドが、配列ＮＡＮＮである、請求項３３に
    記載のＲＮＡ。
  36. 【請求項３６】 前記末端のループ領域を形成する前記４個または５個のヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＮＵＮまたはＮＮＵＮである、請求項３３に記載のＲＮ
    Ａ。
  37. 【請求項３７】 ビメンチンＲＮＡの一部を含む、請求項３３に記載のＲＮ
    Ａ。
  38. 【請求項３８】 ビメンチンｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部を含む、請求項３
    ３に記載のＲＮＡ。
  39. 【請求項３９】 コンセンサス配列ＮＮＮＮＣＮＮＮＮＮＮ（または、なし
    ）ＮＵＮＮＡＮＮＮＮＮＮＮＮを含み、そしてここで、該配列が、第１の二本鎖
    領域、内部のループ領域、第２の二本鎖領域、および末端のループ領域を有する
    、ＲＮＡフラグメント。
  40. 【請求項４０】 コンセンサス配列ＮＮＮＮＣＮＮＮＮＮＮ（または、なし
    ）ＮＵＮＮＡＮＮＮＮＮＮＮＮを含む、少なくとも２つの種にわたって保存され
    ている、ＲＮＡフラグメントのｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの提示。
  41. 【請求項４１】 配列ＮＮＮＮＣＮＮＮＮＮＮ（または、なし）ＮＵＮＮＡ
    ＮＮＮＮＮＮＮＮを含む、少なくとも２つの種にわたって保存されている、精製
    されそして単離されたＲＮＡフラグメント。
  42. 【請求項４２】 ヒト配列ＵＵＵＡＣＡＡＣＡＵＡＡＵＣＵＡＧＵＵＵＡＣ
    ＡＧＡＡＡＡＡＵＣを含む、精製されそして単離されたＲＮＡフラグメント。
  43. 【請求項４３】 ヒト配列ＵＵＵＡＣＡＡＣＡＵＡＡＵＣＵＡＧＵＵＵＡＣ
    ＡＧＡＡＡＡＡＵＣを含む、ＲＮＡフラグメントのｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの提示
    。
  44. 【請求項４４】 少なくとも４１ヌクレオチドであるが、７０ヌクレオチド
    は超えない連結された配列を含み、そして以下によって規定される二次構造を有
    する、ＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 第１の内部のループ領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する５個または６個のヌクレオチド； 第２の内部のループ領域の第１の側を形成する１個から３個のヌクレオチド； 第３の二本鎖領域の第１の側を形成する４個のヌクレオチド； 末端のループ領域を形成する４個から６個のヌクレオチド； 該第３の二本鎖領域の第２の側を形成する４個のヌクレオチド； 該第２の内部のループ領域の第２の側を形成する１個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成し、そして必要に応じて単一のヌクレオ
    チドのふくらみを有する、６個のヌクレオチド； 該第１の内部のループ領域の第２の側を形成する７個または９個のヌクレオチ
    ド；および 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成する３個のヌクレオチド。
  45. 【請求項４５】 前記第１の二本鎖領域の第１の側を形成する前記ヌクレオ
    チドが、配列ＮＮＮであり、そして該第１の二本鎖領域の前記第２の側を形成す
    る前記ヌクレオチドが、配列ＵＵＮである、請求項４４に記載のＲＮＡ。
  46. 【請求項４６】 前記第１の内部のループ領域の前記第１の側を形成する前
    記ヌクレオチドが、配列ＮＡＮである、請求項４４に記載のＲＮＡ。
  47. 【請求項４７】 前記第１の内部のループ領域の前記第２の側を形成する前
    記ヌクレオチドが、配列ＧＧＡＡＡＣＵＮＮまたはＧＧＡＡＡＣＵである、請求
    項４４に記載のＲＮＡ。
  48. 【請求項４８】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌク
    レオチドが、配列ＡＵＧＧＧＮまたはＡＵＧＧＧであり、そして必要に応じて前
    記ふくらみを有する、該第２の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレ
    オチドが、配列ＵＣＣＵＡＵである、請求項４４に記載のＲＮＡ。
  49. 【請求項４９】 前記第２の内部のループ領域の前記第１の側を形成する前
    記ヌクレオチドが、配列ＮＮＵまたはＵである、請求項４４に記載のＲＮＡ。
  50. 【請求項５０】 前記第２の内部のループ領域の前記第２の側を形成する前
    記ヌクレオチドが、Ｕである、請求項４４に記載のＲＮＡ。
  51. 【請求項５１】 前記第３の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前期ヌク
    レオチドが、配列ＣＡＣＡであり、そして該第３の二本鎖領域の前記第２の側を
    形成する前記ヌクレオチドが、ＵＧＵＧである、請求項４４に記載のＲＮＡ。
  52. 【請求項５２】 前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配
    列ＮＮＵＡＮＣまたはＮＮＵＡＣである、請求項４４に記載のＲＮＡ。
  53. 【請求項５３】 オルニチンデカルボキシラーゼＲＮＡの一部を含む、請求
    項４４に記載のＲＮＡ。
  54. 【請求項５４】 オルニチンデカルボキシラーゼｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一
    部を含む、請求項４４に記載のＲＮＡ。
  55. 【請求項５５】 以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの
    連結された配列を含む、精製されそして単離されたＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 第１の内部のループ領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する５個または６個のヌクレオチド； 第２の内部のループ領域の第１の側を形成する１個から３個のヌクレオチド； 第３の二本鎖領域の第１の側を形成する４個のヌクレオチド； 末端のループ領域を形成する４個から６個のヌクレオチド； 該第３の二本鎖領域の第２の側を形成する４個のヌクレオチド； 該第２の内部のループ領域の第２の側を形成する１個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成し、そして必要に応じて単一のヌクレオ
    チドのふくらみを有する、６個のヌクレオチド； 該第１の内部のループ領域の第２の側を形成する７個または９個のヌクレオチ
    ド；および 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成する３個のヌクレオチド。
  56. 【請求項５６】 前記第１の二本鎖領域の第１の側を形成する前記ヌクレオ
    チドが、配列ＮＮＮであり、そして該第１の二本鎖領域の前記第２の側を形成す
    る前記ヌクレオチドが、配列ＵＵＮである、請求項５５に記載のＲＮＡ。
  57. 【請求項５７】 前記第１の内部のループ領域の前記第１の側を形成する前
    記ヌクレオチドが、配列ＮＡＮである、請求項５５に記載のＲＮＡ。
  58. 【請求項５８】 前記第１の内部のループ領域の前記第２の側を形成する前
    記ヌクレオチドが、配列ＧＧＡＡＡＣＵＮＮまたはＧＧＡＡＡＣＵである、請求
    項５５に記載のＲＮＡ。
  59. 【請求項５９】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌク
    レオチドが、配列ＡＵＧＧＧＮまたはＡＵＧＧＧであり、そして必要に応じて前
    記ふくらみを有する、該第２の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレ
    オチドが、配列ＵＣＣＵＡＵである、請求項５５に記載のＲＮＡ。
  60. 【請求項６０】 前記第２の内部のループ領域の前記第１の側を形成する前
    記ヌクレオチドが、配列ＮＮＵまたはＵである、請求項５５に記載のＲＮＡ。
  61. 【請求項６１】 前記第２の内部のループ領域の前記第２の側を形成する前
    記ヌクレオチドが、Ｕである、請求項５５に記載のＲＮＡ。
  62. 【請求項６２】 前記第３の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前期ヌク
    レオチドが、配列ＣＡＣＡであり、そして該第３の二本鎖領域の前記第２の側を
    形成する前記ヌクレオチドが、ＵＧＵＧである、請求項５５に記載のＲＮＡ。
  63. 【請求項６３】 前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配
    列ＮＮＵＡＮＣまたはＮＮＵＡＣである、請求項５５に記載のＲＮＡ。
  64. 【請求項６４】 オルニチンデカルボキシラーゼＲＮＡの一部を含む、請求
    項５５に記載のＲＮＡ。
  65. 【請求項６５】 オルニチンデカルボキシラーゼｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一
    部を含む、請求項５５に記載のＲＮＡ。
  66. 【請求項６６】 以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの
    連結された配列を有する、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 第１の内部のループ領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する５個または６個のヌクレオチド； 第２の内部のループ領域の第１の側を形成する１個から３個のヌクレオチド； 第３の二本鎖領域の第１の側を形成する４個のヌクレオチド； 末端のループ領域を形成する４個から６個のヌクレオチド； 該第３の二本鎖領域の第２の側を形成する４個のヌクレオチド； 該第２の内部のループ領域の第２の側を形成する１個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成し、そして必要に応じて単一のヌクレオ
    チドのふくらみを有する、６個のヌクレオチド； 該第１の内部のループ領域の第２の側を形成する７個または９個のヌクレオチ
    ド；および 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成する３個のヌクレオチド。
  67. 【請求項６７】 前記第１の二本鎖領域の第１の側を形成する前記ヌクレオ
    チドが、配列ＮＮＮであり、そして該第１の二本鎖領域の前記第２の側を形成す
    る前記ヌクレオチドが、配列ＵＵＮである、請求項６６に記載のＲＮＡ。
  68. 【請求項６８】 前記第１の内部のループ領域の前記第１の側を形成する前
    記ヌクレオチドが、配列ＮＡＮである、請求項６６に記載のＲＮＡ。
  69. 【請求項６９】 前記第１の内部のループ領域の前記第２の側を形成する前
    記ヌクレオチドが、配列ＧＧＡＡＡＣＵＮＮまたはＧＧＡＡＡＣＵである、請求
    項６６に記載のＲＮＡ。
  70. 【請求項７０】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌク
    レオチドが、配列ＡＵＧＧＧＮまたはＡＵＧＧＧであり、そして必要に応じて前
    記ふくらみを有する、該第２の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレ
    オチドが、配列ＵＣＣＵＡＵである、請求項６６に記載のＲＮＡ。
  71. 【請求項７１】 前記第２の内部のループ領域の前記第１の側を形成する前
    記ヌクレオチドが、配列ＮＮＵまたはＵである、請求項６６に記載のＲＮＡ。
  72. 【請求項７２】 前記第２の内部のループ領域の前記第２の側を形成する前
    記ヌクレオチドが、Ｕである、請求項６６に記載のＲＮＡ。
  73. 【請求項７３】 前記第３の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前期ヌク
    レオチドが、配列ＣＡＣＡであり、そして該第３の二本鎖領域の前記第２の側を
    形成する前記ヌクレオチドが、ＵＧＵＧである、請求項６６に記載のＲＮＡ。
  74. 【請求項７４】 前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配
    列ＮＮＵＡＮＣまたはＮＮＵＡＣである、請求項６６に記載のＲＮＡ。
  75. 【請求項７５】 オルニチンデカルボキシラーゼＲＮＡの一部を含む、請求
    項６６に記載のＲＮＡ。
  76. 【請求項７６】 オルニチンデカルボキシラーゼｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一
    部を含む、請求項６６に記載のＲＮＡ。
  77. 【請求項７７】 コンセンサス配列ＮＮＮＮＡＮＡＵＧＧＧＮ（または、な
    し）Ｎ（または、なし）Ｎ（または、なし）ＵＣＡＣＡＮＮＵＡＮ（または、な
    し）ＣＵＧＵＧＵＵＣＣＵＡＵＧＧＡＡＡＣＵＮ（または、なし）Ｎ（または、
    なし）ＵＵＮを含み、そして第１の二本鎖領域、第１の内部のループ領域、第２
    の二本鎖領域、第２の内部のループ領域、第３の二本鎖領域、および末端のルー
    プ領域を有する、ＲＮＡ。
  78. 【請求項７８】 配列ＮＮＮＮＡＮＡＵＧＧＧＮ（または、なし）Ｎ（また
    は、なし）Ｎ（または、なし）ＵＣＡＣＡＮＮＵＡＮ（または、なし）ＣＵＧＵ
    ＧＵＵＣＣＵＡＵＧＧＡＡＡＣＵＮ（または、なし）Ｎ（または、なし）ＵＵＮ
    を含む、少なくとも２つの種にわたって保存されている、ＲＮＡフラグメントの
    ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの提示。
  79. 【請求項７９】 配列ＮＮＮＮＡＮＡＵＧＧＧＮ（または、なし）Ｎ（また
    は、なし）Ｎ（または、なし）ＵＣＡＣＡＮＮＵＡＮ（または、なし）ＣＵＧＵ
    ＧＵＵＣＣＵＡＵＧＧＡＡＡＣＵＮ（または、なし）Ｎ（または、なし）ＵＵＮ
    を含む、少なくとも２つの種にわたって保存されている、精製されそして単離さ
    れたＲＮＡフラグメント。
  80. 【請求項８０】 ヒト配列ＵＡＧＧＡＵＡＵＧＧＧＵＣＡＣＡＣＵＵＡＵＣ
    ＵＧＵＧＵＵＣＣＵＡＵＧＧＡＡＡＣＵＡＵＵＵＧを含む、精製されそして単離
    されたＲＮＡフラグメント。
  81. 【請求項８１】 マウス配列ＵＡＧＧＡＧＡＵＧＧＧＧＧＵＣＡＣＡＣＵＵ
    ＡＣＵＧＵＧＵＵＣＣＵＡＵＧＧＡＡＡＣＵＵＵＧを含む、精製されそして単離
    されたＲＮＡフラグメント。
  82. 【請求項８２】 ラット配列ＵＡＧＧＡＧＡＵＧＧＧＧＧＧＵＣＡＣＡＣＵ
    ＵＡＣＵＧＵＧＵＵＣＣＵＡＵＧＡＡＡＣＵＵＵＵＧを含む、精製されそして単
    離されたＲＮＡフラグメント。
  83. 【請求項８３】 少なくとも２６個のヌクレオチドであるが、７０個を超え
    ないヌクレオチドの連結された配列を含み、そして以下によって規定される二次
    構造を有する、ＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する５個または６個のヌクレオチド； 内部のループ領域の第１の側を形成する１個から３個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する４個のヌクレオチド； 末端のループ領域を形成する４個から６個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する４個のヌクレオチド； 該内部のループ領域の第２の側を形成する１個のヌクレオチド；および 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成し、そして必要に応じて単一のヌクレオ
    チドのふくらみを有する、６個のヌクレオチド。
  84. 【請求項８４】 前記第１の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌク
    レオチドが、配列ＡＵＧＧＧＮまたはＡＵＧＧＧであり、そして必要に応じて前
    記ふくらみを有する、該第１の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレ
    オチドが、配列ＵＣＣＵＡＵである、請求項８３に記載のＲＮＡ。
  85. 【請求項８５】 前記内部のループ領域の前記第１の側を形成する前記ヌク
    レオチドが、配列ＮＮＵまたはＵである、請求項８３に記載のＲＮＡ。
  86. 【請求項８６】 前記内部のループ領域の前記第２の側を形成する前記ヌク
    レオチドが、Ｕである、請求項８３に記載のＲＮＡ。
  87. 【請求項８７】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌク
    レオチドが、配列ＣＡＣＡであり、そして該第２の二本鎖領域の前記第２の側を
    形成する前記ヌクレオチドが、ＵＧＵＧである、請求項８３に記載のＲＮＡ。
  88. 【請求項８８】 前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配
    列ＮＮＵＡＮＣまたはＮＮＵＡＣである、請求項８３に記載のＲＮＡ。
  89. 【請求項８９】 オルニチンデカルボキシラーゼＲＮＡの一部を含む、請求
    項８３に記載のＲＮＡ。
  90. 【請求項９０】 オルニチンデカルボキシラーゼｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一
    部を含む、請求項８３に記載のＲＮＡ。
  91. 【請求項９１】 以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの
    連結された配列を含む、精製されそして単離されたＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する５個または６個のヌクレオチド； 内部のループ領域の第１の側を形成する１個から３個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する４個のヌクレオチド； 末端のループ領域を形成する４個から６個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する４個のヌクレオチド； 該内部のループ領域の第２の側を形成する１個のヌクレオチド；および 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成し、そして必要に応じて単一のヌクレオ
    チドのふくらみを有する、６個のヌクレオチド。
  92. 【請求項９２】 前記第１の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌク
    レオチドが、配列ＡＵＧＧＧＮまたはＡＵＧＧＧであり、そして必要に応じて前
    記ふくらみを有する、該第１の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレ
    オチドが、配列ＵＣＣＵＡＵである、請求項９１に記載のＲＮＡ。
  93. 【請求項９３】 前記内部のループ領域の前記第１の側を形成する前記ヌク
    レオチドが、配列ＮＮＵまたはＵである、請求項９１に記載のＲＮＡ。
  94. 【請求項９４】 前記内部のループ領域の前記第２の側を形成する前記ヌク
    レオチドが、Ｕである、請求項９１に記載のＲＮＡ。
  95. 【請求項９５】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌク
    レオチドが、配列ＣＡＣＡであり、そして該第２の二本鎖領域の前記第２の側を
    形成する前記ヌクレオチドが、ＵＧＵＧである、請求項９１に記載のＲＮＡ。
  96. 【請求項９６】 前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、配
    列ＮＮＵＡＮＣまたはＮＮＵＡＣである、請求項９１に記載のＲＮＡ。
  97. 【請求項９７】 オルニチンデカルボキシラーゼＲＮＡの一部を含む、請求
    項９１に記載のＲＮＡ。
  98. 【請求項９８】 オルニチンデカルボキシラーゼｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一
    部を含む、請求項９１に記載のＲＮＡ。
  99. 【請求項９９】 以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチドの
    連結された配列を含む、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する５個または６個のヌクレオチド； 内部のループ領域の第１の側を形成する１個から３個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する４個のヌクレオチド； 末端のループ領域を形成する４個から６個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する４個のヌクレオチド； 該内部のループ領域の第２の側を形成する１個のヌクレオチド；および 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成し、そして必要に応じて単一のヌクレオ
    チドのふくらみを有する、６個のヌクレオチド。
  100. 【請求項１００】 前記第１の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＡＵＧＧＧＮまたはＡＵＧＧＧであり、そして必要に応じて
    前記ふくらみを有する、該第１の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌク
    レオチドが、配列ＵＣＣＵＡＵである、請求項９９に記載のＲＮＡ。
  101. 【請求項１０１】 前記内部のループ領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＵまたはＵである、請求項９９に記載のＲＮＡ。
  102. 【請求項１０２】 前記内部のループ領域の前記第２の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、Ｕである、請求項９９に記載のＲＮＡ。
  103. 【請求項１０３】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＣＡＣＡであり、そして該第２の二本鎖領域の前記第２の側
    を形成する前記ヌクレオチドが、ＵＧＵＧである、請求項９９に記載のＲＮＡ。
  104. 【請求項１０４】 前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、
    配列ＮＮＵＡＮＣまたはＮＮＵＡＣである、請求項９９に記載のＲＮＡ。
  105. 【請求項１０５】 オルニチンデカルボキシラーゼＲＮＡの一部を含む、請
    求項９９に記載のＲＮＡ。
  106. 【請求項１０６】 オルニチンデカルボキシラーゼｍＲＮＡの３' ＵＴＲの
    一部を含む、請求項９９に記載のＲＮＡ。
  107. 【請求項１０７】 コンセンサス配列ＡＵＧＧＧＮ（または、なし）Ｎ（ま
    たはなし）Ｎ（または、なし）ＵＣＡＣＡＮＮＵＡＮ（または、なし）ＣＵＧＵ
    ＧＵＵＣＣＵＡＵを含み、そして第１の二本鎖領域、内部のループ領域、第２の
    二本鎖領域、および末端のループ領域を有する、ＲＮＡ。
  108. 【請求項１０８】 配列ＡＵＧＧＧＮ（または、なし）Ｎ（またはなし）Ｎ
    （または、なし）ＵＣＡＣＡＮＮＵＡＮ（または、なし）ＣＵＧＵＧＵＵＣＣＵ
    ＡＵを含む、少なくとも２つの種にわたって保存されている、ＲＮＡフラグメン
    トのｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの提示。
  109. 【請求項１０９】 配列ＡＵＧＧＧＮ（または、なし）Ｎ（またはなし）Ｎ
    （または、なし）ＵＣＡＣＡＮＮＵＡＮ（または、なし）ＣＵＧＵＧＵＵＣＣＵ
    ＡＵを含む、少なくとも２つの種にわたって保存されている、精製されそして単
    離されたＲＮＡフラグメント。
  110. 【請求項１１０】 ヒト配列ＡＵＧＧＧＵＣＡＣＡＣＵＵＡＵＣＵＧＵＧＵ
    ＵＣＣＵＡＵを含む、精製されそして単離されたＲＮＡフラグメント。
  111. 【請求項１１１】 マウス配列ＡＵＧＧＧＧＧＵＣＡＣＡＣＵＵＡＣＵＧＵ
    ＧＵＵＣＣＵＡＵを含む、精製されそして単離されたＲＮＡフラグメント。
  112. 【請求項１１２】 ラット配列ＡＵＧＧＧＧＧＧＵＣＡＣＡＣＵＵＡＣＵＧ
    ＵＧＵＵＣＣＵＡＵを含む、、精製されそして単離されたＲＮＡフラグメント。
  113. 【請求項１１３】 少なくとも１７ヌクレオチドであるが、７０個を超えな
    いヌクレオチドの連結された配列を含み、そして以下によって規定される二次構
    造を有する、ＲＮＡ： 二本鎖領域の第１の側を形成する５個のヌクレオチド； 末端のループ領域を形成する７個のヌクレオチド；および 該二本鎖領域の第２の側を形成する５個のヌクレオチド。
  114. 【請求項１１４】 前記二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌクレオ
    チドが、配列ＣＡＡＧＮ、ＣＡＡＧＣ、またはＣＡＡＧＵであり、そして該二本
    鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＧＣＵＵＧである、
    請求項１１３に記載のＲＮＡ。
  115. 【請求項１１５】 前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、
    配列ＮＵＵＵＮＵＡ，ＧＵＵＵＧＵＡ，ＡＵＵＵＧＵＡ、またはＡＵＵＵＡＵＡ
    である、請求項１１３に記載のＲＮＡ。
  116. 【請求項１１６】 前記二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオ
    チドが、配列ＧＣＵＵＧである、請求項１１３に記載のＲＮＡ。
  117. 【請求項１１７】 オルニチンデカルボキシラーゼＲＮＡの一部を含む、請
    求項１１３に記載のＲＮＡ。
  118. 【請求項１１８】 オルニチンデカルボキシラーゼｍＲＮＡの３' ＵＴＲの
    一部を含む、請求項１１３に記載のＲＮＡ。
  119. 【請求項１１９】 以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチド
    の連結された配列を含む、精製されそして単離されたＲＮＡ： 二本鎖領域の第１の側を形成する５個のヌクレオチド； 末端のループ領域を形成する７個のヌクレオチド；および 該二本鎖領域の第２の側を形成する５個のヌクレオチド。
  120. 【請求項１２０】 前記二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌクレオ
    チドが、配列ＣＡＡＧＮ、ＣＡＡＧＣ、またはＣＡＡＧＵであり、そして該二本
    鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＧＣＵＵＧである、
    請求項１１９に記載のＲＮＡ。
  121. 【請求項１２１】 前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、
    配列ＮＵＵＵＮＵＡ，ＧＵＵＵＧＵＡ，ＡＵＵＵＧＵＡ、またはＡＵＵＵＡＵＡ
    である、請求項１１９に記載のＲＮＡ。
  122. 【請求項１２２】 前記二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオ
    チドが、配列ＧＣＵＵＧである、請求項１１９に記載のＲＮＡ。
  123. 【請求項１２３】 オルニチンデカルボキシラーゼＲＮＡの一部を含む、請
    求項１１９に記載のＲＮＡ。
  124. 【請求項１２４】 オルニチンデカルボキシラーゼｍＲＮＡの３' ＵＴＲの
    一部を含む、請求項１１９に記載のＲＮＡ。
  125. 【請求項１２５】 以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチド
    の連結された配列を含む、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのＲＮＡ： 二本鎖領域の第１の側を形成する５個のヌクレオチド； 末端のループ領域を形成する７個のヌクレオチド；および 該二本鎖領域の第２の側を形成する５個のヌクレオチド。
  126. 【請求項１２６】 前記二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌクレオ
    チドが、配列ＣＡＡＧＮ、ＣＡＡＧＣ、またはＣＡＡＧＵであり、そして該二本
    鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＧＣＵＵＧである、
    請求項１２５に記載のＲＮＡ。
  127. 【請求項１２７】 前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、
    配列ＮＵＵＵＮＵＡ，ＧＵＵＵＧＵＡ，ＡＵＵＵＧＵＡ、またはＡＵＵＵＡＵＡ
    である、請求項１２５に記載のＲＮＡ。
  128. 【請求項１２８】 前記二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオ
    チドが、配列ＧＣＵＵＧである、請求項１２５に記載のＲＮＡ。
  129. 【請求項１２９】 オルニチンデカルボキシラーゼＲＮＡの一部を含む、請
    求項１２５に記載のＲＮＡ。
  130. 【請求項１３０】 オルニチンデカルボキシラーゼｍＲＮＡの３' ＵＴＲの
    一部を含む、請求項１２５に記載のＲＮＡ。
  131. 【請求項１３１】 コンセンサス配列ＣＡＡＧＮＮＵＵＵＮＵＡＧＣＵＵＧ
    を含み、そして第１の二本鎖領域および末端のループ領域を有する、ＲＮＡ。
  132. 【請求項１３２】 配列ＣＡＡＧＮＮＵＵＵＮＵＡＧＣＵＵＧを含む、少な
    くとも２つの種にわたって保存されている、ＲＮＡフラグメントのｉｎ ｓｉｌ
    ｉｃｏでの提示。
  133. 【請求項１３３】 配列ＣＡＡＧＮＮＵＵＵＮＵＡＧＣＵＵＧを含む、少な
    くとも２つの種にわたって保存されている、精製されそして単離されたＲＮＡフ
    ラグメント。
  134. 【請求項１３４】 ヒト配列ＣＡＡＧＣＡＵＵＵＧＵＡＧＣＵＵＧＵを含む
    、精製されそして単離され得たＲＮＡフラグメント。
  135. 【請求項１３５】 マウス配列ＣＡＡＧＣＧＵＵＵＧＵＡＧＣＵＵＧＵを含
    む、精製されそして単離されたＲＮＡフラグメント。
  136. 【請求項１３６】 ラット配列ＣＡＡＧＣＡＵＵＵＧＵＡＧＣＵＵＧＵを含
    む、精製されそして単離されたＲＮＡフラグメント。
  137. 【請求項１３７】 少なくとも６２個のヌクレオチドであるが、７０個を超
    えないヌクレオチドでありる連結された配列を含み、そして以下によって規定さ
    れる二次構造を有する、ＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する５個のヌクレオチド； 第１の末端のループ領域を形成する４個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成する５個のヌクレオチド； 第１の内部のループ領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する５個のヌクレオチド； 第２の内部のループ領域の第１の側を形成する１個のヌクレオチド； 第３の二本鎖領域の第１の側を形成する６個のヌクレオチド； 第２の末端のループ領域を形成する８個のヌクレオチド； 該第３の二本鎖領域の第２の側を形成する６個のヌクレオチド； 該第２の内部のループ領域の第２の側を形成する１個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する５個のヌクレオチド； 該第１の内部のループ領域の第２の側を形成する２個のヌクレオチド； 第４の二本鎖領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 第３の末端のループ領域を形成する５個のヌクレオチド；および 該第４の二本鎖領域の第２の側を形成する３個のヌクレオチド。
  138. 【請求項１３８】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＡＡＡＮＵ、ＡＡＡＡＵ、またはＡＡＡＵＵであり、そして
    該第２の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＧＮＵ
    ＮＮ、ＧＵＵＵＵ、ＧＧＵＵＵ、ＧＧＵＧＵ、またはＧＧＵＵＣである、請求項
    １３７に記載のＲＮＡ。
  139. 【請求項１３９】 前記第２の内部のループ領域の前記第１の側を形成する
    前記ヌクレオチドがＵであり、そして該第２の内部のループ領域の前記第２の側
    を形成する前記ヌクレオチドが、Ｎ、Ｕ、またはＣである、請求項１３７に記載
    のＲＮＡ。
  140. 【請求項１４０】 前記第３の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＵＡＵＡＵＵであり、そして該第３の二本鎖領域の前記第２
    の側を形成する前記ヌクレオチドが、ＮＡＵＮＮＡ、ＧＡＵＡＵＡ、ＡＡＵＧＵ
    Ａ、ＧＡＵＧＣＡ、またはＧＡＵＧＵＡである、請求項１３７に記載のＲＮＡ。
  141. 【請求項１４１】 前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、
    配列ＵＡＵＵＮＵＵＮ、ＵＡＵＵＵＵＵＵ、ＵＡＵＵＧＵＵＧ、またはＵＡＵＵ
    ＵＵＵＧである、請求項１３７に記載のＲＮＡ。
  142. 【請求項１４２】 前記第１の内部のループ領域の前記第１の側を形成する
    前記ヌクレオチドが、配列ＵＵＵであり、そして該第１の内部のループ領域の前
    記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＮＣ，ＣＣ、ＧＣ，ＵＣ，また
    はＡＣである、請求項１３７に記載のＲＮＡ。
  143. 【請求項１４３】 前記第４の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＵＡＮ、ＵＡＣ、またはＵＡＡであり、そして該第４の二本
    鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＮＵＡ、ＧＵＡ、ま
    たはＣＵＡである、請求項１３７に記載のＲＮＡ。
  144. 【請求項１４４】 前記第３の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＣＵＮＵＵ、ＣＵＵＵＵ、またはＣＵＡＵＵである、請求項１３７に
    記載のＲＮＡ。
  145. 【請求項１４５】 インターロイキン−２ ＲＮＡの一部を含む、請求項１
    ３７に記載のＲＮＡ。
  146. 【請求項１４６】 インターロイキン２ ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部を含
    む、請求項１３７に記載のＲＮＡ。
  147. 【請求項１４７】 以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチド
    の連結された配列を含む、精製されそして単離されたＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する５個のヌクレオチド； 第１の末端のループ領域を形成する４個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成する５個のヌクレオチド； 第１の内部のループ領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する５個のヌクレオチド； 第２の内部のループ領域の第１の側を形成する１個のヌクレオチド； 第３の二本鎖領域の第１の側を形成する６個のヌクレオチド； 第２の末端のループ領域を形成する８個のヌクレオチド； 該第３の二本鎖領域の第２の側を形成する６個のヌクレオチド； 該第２の内部のループ領域の第２の側を形成する１個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する５個のヌクレオチド； 該第１の内部のループ領域の第２の側を形成する２個のヌクレオチド； 第４の二本鎖領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 第３の末端のループ領域を形成する５個のヌクレオチド；および 該第４の二本鎖領域の第２の側を形成する３個のヌクレオチド。
  148. 【請求項１４８】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＡＡＡＮＵ、ＡＡＡＡＵ、またはＡＡＡＵＵであり、そして
    該第２の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＧＮＵ
    ＮＮ、ＧＵＵＵＵ、ＧＧＵＵＵ、ＧＧＵＧＵ、またはＧＧＵＵＣである、請求項
    １４７に記載のＲＮＡ。
  149. 【請求項１４９】 前記第２の内部のループ領域の前記第１の側を形成する
    前記ヌクレオチドがＵであり、そして該第２の内部のループ領域の前記第２の側
    を形成する前記ヌクレオチドが、Ｎ、Ｕ、またはＣである、請求項１４７に記載
    のＲＮＡ。
  150. 【請求項１５０】 前記第３の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＵＡＵＡＵＵであり、そして該第３の二本鎖領域の前記第２
    の側を形成する前記ヌクレオチドが、ＮＡＵＮＮＡ、ＧＡＵＡＵＡ、ＡＡＵＧＵ
    Ａ、ＧＡＵＧＣＡ、またはＧＡＵＧＵＡである、請求項１４７に記載のＲＮＡ。
  151. 【請求項１５１】 前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、
    配列ＵＡＵＵＮＵＵＮ、ＵＡＵＵＵＵＵＵ、ＵＡＵＵＧＵＵＧ、またはＵＡＵＵ
    ＵＵＵＧである、請求項１４７に記載のＲＮＡ。
  152. 【請求項１５２】 前記第１の内部のループ領域の前記第１の側を形成する
    前記ヌクレオチドが、配列ＵＵＵであり、そして該第１の内部のループ領域の前
    記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＮＣ，ＣＣ、ＧＣ，ＵＣ，また
    はＡＣである、請求項１４７に記載のＲＮＡ。
  153. 【請求項１５３】 前記第４の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＵＡＮ、ＵＡＣ、またはＵＡＡであり、そして該第４の二本
    鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＮＵＡ、ＧＵＡ、ま
    たはＣＵＡである、請求項１４７に記載のＲＮＡ。
  154. 【請求項１５４】 前記第３の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＣＵＮＵＵ、ＣＵＵＵＵ、またはＣＵＡＵＵである、請求項１４７に
    記載のＲＮＡ。
  155. 【請求項１５５】 インターロイキン−２ ＲＮＡの一部を含む、請求項１
    ４７に記載のＲＮＡ。
  156. 【請求項１５６】 インターロイキン２ ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部を含
    む、請求項１４７に記載のＲＮＡ。
  157. 【請求項１５７】 以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチド
    の連結された配列を含む、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する５個のヌクレオチド； 第１の末端のループ領域を形成する４個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成する５個のヌクレオチド； 第１の内部のループ領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する５個のヌクレオチド； 第２の内部のループ領域の第１の側を形成する１個のヌクレオチド； 第３の二本鎖領域の第１の側を形成する６個のヌクレオチド； 第２の末端のループ領域を形成する８個のヌクレオチド； 該第３の二本鎖領域の第２の側を形成する６個のヌクレオチド； 該第２の内部のループ領域の第２の側を形成する１個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する５個のヌクレオチド； 該第１の内部のループ領域の第２の側を形成する２個のヌクレオチド； 第４の二本鎖領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 第３の末端のループ領域を形成する５個のヌクレオチド；および 該第４の二本鎖領域の第２の側を形成する３個のヌクレオチド。
  158. 【請求項１５８】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＡＡＡＮＵ、ＡＡＡＡＵ、またはＡＡＡＵＵであり、そして
    該第２の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＧＮＵ
    ＮＮ、ＧＵＵＵＵ、ＧＧＵＵＵ、ＧＧＵＧＵ、またはＧＧＵＵＣである、請求項
    １５７に記載のＲＮＡ。
  159. 【請求項１５９】 前記第２の内部のループ領域の前記第１の側を形成する
    前記ヌクレオチドがＵであり、そして該第２の内部のループ領域の前記第２の側
    を形成する前記ヌクレオチドが、Ｎ、Ｕ、またはＣである、請求項１５７に記載
    のＲＮＡ。
  160. 【請求項１６０】 前記第３の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＵＡＵＡＵＵであり、そして該第３の二本鎖領域の前記第２
    の側を形成する前記ヌクレオチドが、ＮＡＵＮＮＡ、ＧＡＵＡＵＡ、ＡＡＵＧＵ
    Ａ、ＧＡＵＧＣＡ、またはＧＡＵＧＵＡである、請求項１５７に記載のＲＮＡ。
  161. 【請求項１６１】 前記末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチドが、
    配列ＵＡＵＵＮＵＵＮ、ＵＡＵＵＵＵＵＵ、ＵＡＵＵＧＵＵＧ、またはＵＡＵＵ
    ＵＵＵＧである、請求項１５７に記載のＲＮＡ。
  162. 【請求項１６２】 前記第１の内部のループ領域の前記第１の側を形成する
    前記ヌクレオチドが、配列ＵＵＵであり、そして該第１の内部のループ領域の前
    記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＮＣ，ＣＣ、ＧＣ，ＵＣ，また
    はＡＣである、請求項１５７に記載のＲＮＡ。
  163. 【請求項１６３】 前記第４の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＵＡＮ、ＵＡＣ、またはＵＡＡであり、そして該第４の二本
    鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＮＵＡ、ＧＵＡ、ま
    たはＣＵＡである、請求項１５７に記載のＲＮＡ。
  164. 【請求項１６４】 前記第３の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＣＵＮＵＵ、ＣＵＵＵＵ、またはＣＵＡＵＵである、請求項１５７に
    記載のＲＮＡ。
  165. 【請求項１６５】 インターロイキン−２ ＲＮＡの一部を含む、請求項１
    ５７に記載のＲＮＡ。
  166. 【請求項１６６】 インターロイキン２ ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部を含
    む、請求項１５７に記載のＲＮＡ。
  167. 【請求項１６７】 コンセンサス配列ＵＡＵＵＵＡＵＵＵＡＡＡＵＡＵＵＵ
    ＡＡＡＮＵＵＵＡＵＡＵＵＵＡＵＵＮＵＵＮＮＡＵＮＮＡＮＧＮＵＮＮＮＣＵＡ
    ＮＣＵＮＵＵＮＵＡを含み、そして第１の二本鎖領域、第１の末端のループ領域
    、第１の内部のループ領域、第２の二本鎖領域、第２の内部のループ領域、第３
    の二本鎖領域、第２の末端のループ領域、第４の二本鎖領域、および第３の末端
    のループ領域を有する、ＲＮＡ。
  168. 【請求項１６８】 配列ＵＡＵＵＵＡＵＵＵＡＡＡＵＡＵＵＵＡＡＡＮＵＵ
    ＵＡＵＡＵＵＵＡＵＵＮＵＵＮＮＡＵＮＮＡＮＧＮＵＮＮＮＣＵＡＮＣＵＮＵＵ
    ＮＵＡを含を含む、少なくとも２つの種にわたって保存されている、ＲＮＡフラ
    グメントのｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの提示。
  169. 【請求項１６９】 配列ＵＡＵＵＵＡＵＵＵＡＡＡＵＡＵＵＵＡＡＡＮＵＵ
    ＵＡＵＡＵＵＵＡＵＵＮＵＵＮＮＡＵＮＮＡＮＧＮＵＮＮＮＣＵＡＮＣＵＮＵＵ
    ＮＵＡを含む、少なくとも２つの種にわたって保存されている、精製されそして
    単離されたＲＮＡフラグメント。
  170. 【請求項１７０】 ヒト配列ＵＡＵＵＵＡＵＵＵＡＡＡＵＡＵＵＵＡＡＡＵ
    ＵＵＵＡＵＡＵＵＵＡＵＵＧＵＵＧＡＡＵＧＵＡＵＧＧＵＵＵＧＣＵＡＣＣＵＡ
    ＵＵＧＵＡを含む、精製されそして単離されたＲＮＡフラグメント。
  171. 【請求項１７１】 少なくとも３２個のヌクレオチドであるが、７０個を超
    えないヌクレオチドの連結された配列を含み、そして以下によって規定される二
    次構造を有する、ＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する５個のヌクレオチド； 第１の内部のループ領域の第１の側を形成する１個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する６個のヌクレオチド； 第１の末端のループ領域を形成する８個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する６個のヌクレオチド； 該第１の内部のループ領域の第２の側を形成する１個のヌクレオチド；および 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成する５個のヌクレオチド。
  172. 【請求項１７２】 前記第１の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＡＡＡＮＵ、ＡＡＡＡＵ、またはＡＡＡＵＵであり、そして
    該第１の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＧＮＵ
    ＮＮ、ＧＵＵＵＵ、ＧＧＵＵＵ、ＧＧＵＧＵ、またはＧＧＵＵＣである、請求項
    １７１に記載のＲＮＡ。
  173. 【請求項１７３】 前記第１の内部のループ領域の前記第１の側を形成する
    前記ヌクレオチドが、Ｕであり、そして該第１の内部のループ領域の前記第２の
    側を形成する前記ヌクレオチドが、Ｎ、Ｕ、またはＣである、請求項１７１に記
    載のＲＮＡ。
  174. 【請求項１７４】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＵＡＵＡＵＵであり、そして該第２の二本鎖領域の前記第２
    の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＮＡＵＮＮＡ、ＧＡＵＡＵＡ、ＡＡＵ
    ＧＵＡ、ＧＡＵＧＣＡ、またはＧＡＵＧＵＡである、請求項１７１に記載のＲＮ
    Ａ。
  175. 【請求項１７５】 前記第１の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＵＡＵＵＮＵＵＮ、ＵＡＵＵＵＵＵＵ、ＵＡＵＵＧＵＵＧ、またはＵ
    ＡＵＵＵＵＵＧである、請求項１７１に記載のＲＮＡ。
  176. 【請求項１７６】 インターロイキン−２ ＲＮＡの一部を含む、請求項１
    ７１に記載のＲＮＡ。
  177. 【請求項１７７】 インターロイキン−２ ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部を
    含む、請求項１７１に記載のＲＮＡ。
  178. 【請求項１７８】 以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチド
    の連結された配列を含む、精製されそして単離されたＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する５個のヌクレオチド； 第１の内部のループ領域の第１の側を形成する１個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する６個のヌクレオチド； 第１の末端のループ領域を形成する８個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する６個のヌクレオチド； 該第１の内部のループ領域の第２の側を形成する１個のヌクレオチド；および 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成する５個のヌクレオチド。
  179. 【請求項１７９】 前記第１の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＡＡＡＮＵ、ＡＡＡＡＵ、またはＡＡＡＵＵであり、そして
    該第１の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＧＮＵ
    ＮＮ、ＧＵＵＵＵ、ＧＧＵＵＵ、ＧＧＵＧＵ、またはＧＧＵＵＣである、請求項
    １７８に記載のＲＮＡ。
  180. 【請求項１８０】 前記第１の内部のループ領域の前記第１の側を形成する
    前記ヌクレオチドが、Ｕであり、そして該第１の内部のループ領域の前記第２の
    側を形成する前記ヌクレオチドが、Ｎ、Ｕ、またはＣである、請求項１７８に記
    載のＲＮＡ。
  181. 【請求項１８１】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＵＡＵＡＵＵであり、そして該第２の二本鎖領域の前記第２
    の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＮＡＵＮＮＡ、ＧＡＵＡＵＡ、ＡＡＵ
    ＧＵＡ、ＧＡＵＧＣＡ、またはＧＡＵＧＵＡである、請求項１７８に記載のＲＮ
    Ａ。
  182. 【請求項１８２】 前記第１の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＵＡＵＵＮＵＵＮ、ＵＡＵＵＵＵＵＵ、ＵＡＵＵＧＵＵＧ、またはＵ
    ＡＵＵＵＵＵＧである、請求項１７８に記載のＲＮＡ。
  183. 【請求項１８３】 インターロイキン−２ ＲＮＡの一部を含む、請求項１
    ７８に記載のＲＮＡ。
  184. 【請求項１８４】 インターロイキン−２ ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部を
    含む、請求項１７８に記載のＲＮＡ。
  185. 【請求項１８５】 以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチド
    の連結された配列を含む、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する５個のヌクレオチド； 第１の内部のループ領域の第１の側を形成する１個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する６個のヌクレオチド； 第１の末端のループ領域を形成する８個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する６個のヌクレオチド； 該第１の内部のループ領域の第２の側を形成する１個のヌクレオチド；および 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成する５個のヌクレオチド。
  186. 【請求項１８６】 前記第１の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＡＡＡＮＵ、ＡＡＡＡＵ、またはＡＡＡＵＵであり、そして
    該第１の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＧＮＵ
    ＮＮ、ＧＵＵＵＵ、ＧＧＵＵＵ、ＧＧＵＧＵ、またはＧＧＵＵＣである、請求項
    １８５に記載のＲＮＡ。
  187. 【請求項１８７】 前記第１の内部のループ領域の前記第１の側を形成する
    前記ヌクレオチドが、Ｕであり、そして該第１の内部のループ領域の前記第２の
    側を形成する前記ヌクレオチドが、Ｎ、Ｕ、またはＣである、請求項１８５に記
    載のＲＮＡ。
  188. 【請求項１８８】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＵＡＵＡＵＵであり、そして該第２の二本鎖領域の前記第２
    の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＮＡＵＮＮＡ、ＧＡＵＡＵＡ、ＡＡＵ
    ＧＵＡ、ＧＡＵＧＣＡ、またはＧＡＵＧＵＡである、請求項１８５に記載のＲＮ
    Ａ。
  189. 【請求項１８９】 前記第１の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＵＡＵＵＮＵＵＮ、ＵＡＵＵＵＵＵＵ、ＵＡＵＵＧＵＵＧ、またはＵ
    ＡＵＵＵＵＵＧである、請求項１８５に記載のＲＮＡ。
  190. 【請求項１９０】 インターロイキン−２ ＲＮＡの一部を含む、請求項１
    ８５に記載のＲＮＡ。
  191. 【請求項１９１】 インターロイキン−２ ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部を
    含む、請求項１８５に記載のＲＮＡ。
  192. 【請求項１９２】 コンセンサス配列ＡＡＡＮＵＵＵＡＵＡＵＵＵＡＵＵＮ
    ＵＵＮＮＡＵＮＮＡＮＧＮＵＮＮを含み、そして第１の二本鎖領域、第１の内部
    のループ領域、第２の二本鎖領域、および末端のループ領域を有する、ＲＮＡ。
  193. 【請求項１９３】 配列ＡＡＡＮＵＵＵＡＵＡＵＵＵＡＵＵＮＵＵＮＮＡＵ
    ＮＮＡＮＧＮＵＮＮを含む、少なくとも２つの種にわたって保存されている、Ｒ
    ＮＡフラグメントのｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの提示。
  194. 【請求項１９４】 配列ＡＡＡＮＵＵＵＡＵＡＵＵＵＡＵＵＮＵＵＮＮＡＵ
    ＮＮＡＮＧＮＵＮＮを含む、少なくとも２つの種にわたって保存されている、精
    製されそして単離されたＲＮＡフラグメント。
  195. 【請求項１９５】 ヒト配列ＡＡＡＵＵＵＵＡＵＡＵＵＵＡＵＵＧＵＵＧＡ
    ＡＵＧＵＡＵＧＧＵＵＵを含む、精製されそして単離されたＲＮＡフラグメント
    。
  196. 【請求項１９６】 少なくとも４３個のヌクレオチドであるが、７０個のヌ
    クレオチドを超えない連結された配列を含み、そして以下によって規定される二
    次構造を有する、ＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する６個のヌクレオチド； 第１の内部のループ領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する６個のヌクレオチド； 第１の末端ループ領域を形成する４個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する６個のヌクレオチド； 該第１の内部のループ領域の第２の側を形成する２個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成する６個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖領と第３の二本鎖領域との間にふくらみを形成する１個のヌク
    レオチド； 第３の二本鎖領域の第１の側を形成する２個または４個のヌクレオチド； 第２の末端のループ領域を形成する３個のヌクレオチド；および 該第３の二本鎖領域の第２の側を形成する２個または４個のヌクレオチド。
  197. 【請求項１９７】 前記第１の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＵＮＮＮ、ＧＡＵＡＡＡ、ＵＡＵＡＡＡ、またはＵＣＵ
    ＧＵＵであり、そして該第１のニ本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレ
    オチドが、配列ＵＮＵＮＮＮ、ＵＵＵＧＵＡ、ＵＣＵＧＵＡ、またはＵＵＵＵＧ
    Ｕである、請求項１９６に記載のＲＮＡ。
  198. 【請求項１９８】 前記第１の内部のループ領域の前記第１の側を形成する
    前記ヌクレオチドが、ＮＮＮ、ＵＡＵ、ＣＵＡ、またはＣＡＵであり、そして該
    第１の内部のループ領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、ＵＵで
    ある、請求項１９６に記載のＲＮＡ。
  199. 【請求項１９９】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＧＡＵＣＮ、ＧＧＡＵＣＵ、またはＡＧＡＵＣＡであり、
    そして該第２の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列
    ＮＧＡＵＮＣ、ＡＧＡＵＵＣ、ＵＧＡＵＣＣ、またはＵＧＡＵＵＣである、請求
    項１９６に記載のＲＮＡ。
  200. 【請求項２００】 前記第３のステム領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列Ｎ（または、なし）Ｎ（または、なし）ＣＣ、ＧＣＣＣ、ま
    たはＣＣであり、そして該第３のステム領域の前記第２の側を形成する前記ヌク
    レオチドが、配列ＮＮＮＮ、ＧＧＧＣ、またはＧＣＧＵである、請求項１９６に
    記載のＲＮＡ。
  201. 【請求項２０１】 インターロイキン−２ ＲＮＡの一部を含む、請求項１
    ９６に記載のＲＮＡ。
  202. 【請求項２０２】 インターロイキン−２ ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部を
    含む、請求項１９６に記載のＲＮＡ。
  203. 【請求項２０３】 以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチド
    の連結された配列を含む、精製されそして単離されたＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する６個のヌクレオチド； 第１の内部のループ領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する６個のヌクレオチド； 第１の末端ループ領域を形成する４個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する６個のヌクレオチド； 該第１の内部のループ領域の第２の側を形成する２個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成する６個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖領と第３の二本鎖領域との間にふくらみを形成する１個のヌク
    レオチド； 第３の二本鎖領域の第１の側を形成する２個または４個のヌクレオチド； 第２の末端のループ領域を形成する３個のヌクレオチド；および 該第３の二本鎖領域の第２の側を形成する２個または４個のヌクレオチド。
  204. 【請求項２０４】 前記第１の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＵＮＮＮ、ＧＡＵＡＡＡ、ＵＡＵＡＡＡ、またはＵＣＵ
    ＧＵＵであり、そして該第１のニ本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレ
    オチドが、配列ＵＮＵＮＮＮ、ＵＵＵＧＵＡ、ＵＣＵＧＵＡ、またはＵＵＵＵＧ
    Ｕである、請求項２０３に記載のＲＮＡ。
  205. 【請求項２０５】 前記第１の内部のループ領域の前記第１の側を形成する
    前記ヌクレオチドが、ＮＮＮ、ＵＡＵ、ＣＵＡ、またはＣＡＵであり、そして該
    第１の内部のループ領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、ＵＵで
    ある、請求項２０３に記載のＲＮＡ。
  206. 【請求項２０６】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＧＡＵＣＮ、ＧＧＡＵＣＵ、またはＡＧＡＵＣＡであり、
    そして該第２の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列
    ＮＧＡＵＮＣ、ＡＧＡＵＵＣ、ＵＧＡＵＣＣ、またはＵＧＡＵＵＣである、請求
    項２０３に記載のＲＮＡ。
  207. 【請求項２０７】 前記第３のステム領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列Ｎ（または、なし）Ｎ（または、なし）ＣＣ、ＧＣＣＣ、ま
    たはＣＣであり、そして該第３のステム領域の前記第２の側を形成する前記ヌク
    レオチドが、配列ＮＮＮＮ、ＧＧＧＣ、またはＧＣＧＵである、請求項２０３に
    記載のＲＮＡ。
  208. 【請求項２０８】 インターロイキン−２ ＲＮＡの一部を含む、請求項２
    ０３に記載のＲＮＡ。
  209. 【請求項２０９】 インターロイキン−２ ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部を
    含む、請求項２０３に記載のＲＮＡ。
  210. 【請求項２１０】 以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチド
    の連結された配列を含む、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する６個のヌクレオチド； 第１の内部のループ領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する６個のヌクレオチド； 第１の末端ループ領域を形成する４個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する６個のヌクレオチド； 該第１の内部のループ領域の第２の側を形成する２個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成する６個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖領と第３の二本鎖領域との間にふくらみを形成する１個のヌク
    レオチド； 第３の二本鎖領域の第１の側を形成する２個または４個のヌクレオチド； 第２の末端のループ領域を形成する３個のヌクレオチド；および 該第３の二本鎖領域の第２の側を形成する２個または４個のヌクレオチド。
  211. 【請求項２１１】 前記第１の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＵＮＮＮ、ＧＡＵＡＡＡ、ＵＡＵＡＡＡ、またはＵＣＵ
    ＧＵＵであり、そして該第１のニ本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレ
    オチドが、配列ＵＮＵＮＮＮ、ＵＵＵＧＵＡ、ＵＣＵＧＵＡ、またはＵＵＵＵＧ
    Ｕである、請求項２１０に記載のＲＮＡ。
  212. 【請求項２１２】 前記第１の内部のループ領域の前記第１の側を形成する
    前記ヌクレオチドが、ＮＮＮ、ＵＡＵ、ＣＵＡ、またはＣＡＵであり、そして該
    第１の内部のループ領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、ＵＵで
    ある、請求項２１０に記載のＲＮＡ。
  213. 【請求項２１３】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＧＡＵＣＮ、ＧＧＡＵＣＵ、またはＡＧＡＵＣＡであり、
    そして該第２の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列
    ＮＧＡＵＮＣ、ＡＧＡＵＵＣ、ＵＧＡＵＣＣ、またはＵＧＡＵＵＣである、請求
    項２１０に記載のＲＮＡ。
  214. 【請求項２１４】 前記第３のステム領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列Ｎ（または、なし）Ｎ（または、なし）ＣＣ、ＧＣＣＣ、ま
    たはＣＣであり、そして該第３のステム領域の前記第２の側を形成する前記ヌク
    レオチドが、配列ＮＮＮＮ、ＧＧＧＣ、またはＧＣＧＵである、請求項２１０に
    記載のＲＮＡ。
  215. 【請求項２１５】 インターロイキン−２ ＲＮＡの一部を含む、請求項２
    １０に記載のＲＮＡ。
  216. 【請求項２１６】 インターロイキン−２ ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部を
    含む、請求項２１０に記載のＲＮＡ。
  217. 【請求項２１７】 コンセンサス配列ＮＮＵＮＮＮＮＮＮＮＧＡＵＣＮＵＮ
    ＮＮＮＧＡＵＮＣＵＵＵＮＵＮＮＮＡＮ（または、なし）Ｎ（または、なし）Ｃ
    ＣＮＮＮＮＮＮＮを含み、そして第１の二本鎖領域、第１の内部のループ領域、
    第２の二本鎖領域、および第１の末端のループ領域、第３の二本鎖領域、および
    第２の末端ループ領域を有する、ＲＮＡ。
  218. 【請求項２１８】 配列ＮＮＵＮＮＮＮＮＮＮＧＡＵＣＮＵＮＮＮＮＧＡＵ
    ＮＣＵＵＵＮＵＮＮＮＡＮ（または、なし）Ｎ（または、なし）ＣＣＮＮＮＮＮ
    ＮＮを含む、少なくとも２つの種にわたって保存されている、ＲＮＡフラグメン
    トのｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの提示。
  219. 【請求項２１９】 配列ＮＮＵＮＮＮＮＮＮＮＧＡＵＣＮＵＮＮＮＮＧＡＵ
    ＮＣＵＵＵＮＵＮＮＮＡＮ（または、なし）Ｎ（または、なし）ＣＣＮＮＮＮＮ
    ＮＮを含む、少なくとも２つの種にわたって保存されている、精製されそして単
    離されたＲＮＡフラグメント。
  220. 【請求項２２０】 ヒト配列ＵＡＵＡＡＡＵＡＵＧＧＡＵＣＵＵＵＵＡＵＧ
    ＡＵＵＣＵＵＵＵＵＧＵＡＡＧＣＣＣＵＡＧＧＧＧＣを含む、精製されそして単
    離されたＲＮＡフラグメント。
  221. 【請求項２２１】 マウス配列ＧＡＵＡＡＡＵＡＵＧＧＡＵＣＵＵＵＡＡＡ
    ＧＡＵＵＣＵＵＵＵＵＧＵＡＡＵＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣを含む、精製されそし
    て単離されたＲＮＡフラグメント。
  222. 【請求項２２２】 ラット配列ＧＡＵＡＡＡＵＡＵＧＧＡＵＣＵＵＵＡＡＡ
    ＧＡＵＵＣＵＵＵＵＵＧＵＡＡＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣを含む、精製されそして
    単離されたＲＮＡフラグメント。
  223. 【請求項２２３】 少なくとも２９個のヌクレオチドであるが、７０個を超
    えないヌクレオチドの連結された配列を含み、そして以下によって規定される二
    次構造を有する、ＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する５個のヌクレオチド； 第１の末端ループ領域の第１の側を形成する４個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成する５個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖領域と第２の二本鎖領域との間にふくらみを形成する２個のヌ
    クレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する５個のヌクレオチド； 第２の末端のループ領域を形成する３個のヌクレオチド；および 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する５個のヌクレオチド。
  224. 【請求項２２４】 前記第１の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＮＧＡ，ＵＡＡＧＡ、ＡＡＡＧＡ，ＵＡＵＧＡ、または
    ＵＵＵＧＡであり、そして該第１の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＧＮＧＮＮ、ＧＧＧＣＵ、またはＧＣＧＵＧである、請求項
    ２２３に記載のＲＮＡ。
  225. 【請求項２２５】 前記第１の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＵＮＣＵ、ＵＵＣＵ、またはＵＣＣＵである、請求項２２３に記載の
    ＲＮＡ。
  226. 【請求項２２６】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＡＧＣＣＣであり、そして該第２の二本鎖領域の前記第２の
    側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＧＮＧＮＮ、ＧＧＧＣＵ，またはＧＣＧ
    ＵＧである、請求項２２３に記載のＲＮＡ。
  227. 【請求項２２７】 前記第２の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＮＡＮ、ＵＡＣ、ＵＡＧ、ＣＡＡ、またはＵＡＡである、請求項２２
    ３に記載のＲＮＡ。
  228. 【請求項２２８】 インターロイキン−２ ＲＮＡの一部を含む、請求項２
    ２３に記載のＲＮＡ。
  229. 【請求項２２９】 インターロイキン−２ ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部を
    含む、請求項２２３に記載のＲＮＡ。
  230. 【請求項２３０】 以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチド
    の連結された配列を含む、精製されそして単離されたＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する５個のヌクレオチド； 第１の末端ループ領域の第１の側を形成する４個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成する５個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖領域と第２の二本鎖領域との間にふくらみを形成する２個のヌ
    クレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する５個のヌクレオチド； 第２の末端のループ領域を形成する３個のヌクレオチド；および 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する５個のヌクレオチド。
  231. 【請求項２３１】 前記第１の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＮＧＡ，ＵＡＡＧＡ、ＡＡＡＧＡ，ＵＡＵＧＡ、または
    ＵＵＵＧＡであり、そして該第１の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＧＮＧＮＮ、ＧＧＧＣＵ、またはＧＣＧＵＧである、請求項
    ２３０に記載のＲＮＡ。
  232. 【請求項２３２】 前記第１の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＵＮＣＵ、ＵＵＣＵ、またはＵＣＣＵである、請求項２３０に記載の
    ＲＮＡ。
  233. 【請求項２３３】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＡＧＣＣＣであり、そして該第２の二本鎖領域の前記第２の
    側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＧＮＧＮＮ、ＧＧＧＣＵ，またはＧＣＧ
    ＵＧである、請求項２３０に記載のＲＮＡ。
  234. 【請求項２３４】 前記第２の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＮＡＮ、ＵＡＣ、ＵＡＧ、ＣＡＡ、またはＵＡＡである、請求項２３
    ０に記載のＲＮＡ。
  235. 【請求項２３５】 インターロイキン−２ ＲＮＡの一部を含む、請求項２
    ３０に記載のＲＮＡ。
  236. 【請求項２３６】 インターロイキン−２ ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部の
    一部を含む、請求項２３０に記載のＲＮＡ。
  237. 【請求項２３７】 以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチド
    の連結された配列を含む、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する５個のヌクレオチド； 第１の末端ループ領域の第１の側を形成する４個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖の第２の側を形成する５個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖領域と第２の二本鎖領域との間にふくらみを形成する２個のヌ
    クレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する５個のヌクレオチド； 第２の末端のループ領域を形成する３個のヌクレオチド；および 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する５個のヌクレオチド。
  238. 【請求項２３８】 前記第１の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＮＧＡ，ＵＡＡＧＡ、ＡＡＡＧＡ，ＵＡＵＧＡ、または
    ＵＵＵＧＡであり、そして該第１の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＧＮＧＮＮ、ＧＧＧＣＵ、またはＧＣＧＵＧである、請求項
    ２３７に記載のＲＮＡ。
  239. 【請求項２３９】 前記第１の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＵＮＣＵ、ＵＵＣＵ、またはＵＣＣＵである、請求項２３７に記載の
    ＲＮＡ。
  240. 【請求項２４０】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＡＧＣＣＣであり、そして該第２の二本鎖領域の前記第２の
    側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＧＮＧＮＮ、ＧＧＧＣＵ，またはＧＣＧ
    ＵＧである、請求項２３７に記載のＲＮＡ。
  241. 【請求項２４１】 前記第２の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＮＡＮ、ＵＡＣ、ＵＡＧ、ＣＡＡ、またはＵＡＡである、請求項２３
    ７に記載のＲＮＡ。
  242. 【請求項２４２】 インターロイキン−２ ＲＮＡの一部を含む、請求項２
    ３７に記載のＲＮＡ。
  243. 【請求項２４３】 インターロイキン−２ ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部を
    含む、請求項２３７に記載のＲＮＡ。
  244. 【請求項２４４】 コンセンサス配列ＮＮＮＧＡＵＮＣＵＵＵＮＮＧＵＡＡ
    ＧＣＣＣＮＡＮＧＮＧＮＮを含み、そして第１の二本鎖領域、第１の末端のルー
    プ領域、第２の二本鎖領域、および第２の末端のループ領域を有する、ＲＮＡ。
  245. 【請求項２４５】 配列ＮＮＮＧＡＵＮＣＵＵＵＮＮＧＵＡＡＧＣＣＣＮＡ
    ＮＧＮＧＮＮを含む、少なくとも２つの種にわたって保存されている、ＲＮＡフ
    ラグメントのｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの提示。
  246. 【請求項２４６】 配列ＮＮＮＧＡＵＮＣＵＵＵＮＮＧＵＡＡＧＣＣＣＮＡ
    ＮＧＮＧＮＮを含む、少なくとも２つの種にわたって保存されている、精製され
    そして単離されたＲＮＡフラグメント。
  247. 【請求項２４７】 ヒト配列ＵＡＵＧＡＵＵＣＵＵＵＵＵＧＵＡＡＧＣＣＣ
    ＵＡＧＧＧＧＣＵを含む、精製されそして単離されたＲＮＡフラグメント。
  248. 【請求項２４８】 マウス配列ＡＡＡＧＡＵＵＣＵＵＵＵＵＧＵＡＡＧＣＣ
    ＣＣＡＡＧＧＧＣＵを含む、精製されそして単離されたＲＮＡフラグメント。
  249. 【請求項２４９】 ラット配列ＡＡＡＧＡＵＵＣＵＵＵＵＵＧＵＡＡＧＣＣ
    ＣＣＡＡＧＧＧＣＵを含む、精製されそして単離されたＲＮＡフラグメント。
  250. 【請求項２５０】 少なくとも２６個のヌクレオチドであるが、７０個を超
    えないヌクレオチドの連結された配列を含み、そして以下によって規定される二
    次構造を有する、ＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する６個または７個のヌクレオチド； 第１の末端のループ領域を形成する４個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成し、そして単一のヌクレオチドのふくら
    みを有する、７個または８個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖領域と第２の二本鎖領域とを連結する１個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 第２の末端のループ領域を形成する３個のヌクレオチド；および 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する２個または３個のヌクレオチド。
  251. 【請求項２５１】 前記第１の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＮＮＮＮ（または、なし）Ｎ、ＡＵＡＡＣＣＵ、ＵＧＧ
    ＵＡＡＡ、ＵＧＡＵＡＡＵ、ＵＧＡＵＡＡＡ、ＧＡＵＡＡＣＣ、ＧＡＵＡＡＡＣ
    、ＵＧＡＵＡＵ、ＧＡＧＡＣＣＣ、またはＧＡＣＡＡＡＣであり、そして該第１
    の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列Ｎ（または、
    なし）ＵＧＮＣＵＮＮ、ＵＧＵＣＵＣＣ、ＵＵＧＵＣＵＣＡ、ＵＵＧＣＣＵＣＡ
    、ＵＵＧＵＣＵＣＣ、ＵＵＧＵＣＵＣＵ、ＣＵＧＵＣＵＵＵ，またはＣＵＧＵＣ
    ＵＣＡである、請求項２５０に記載のＲＮＡ。
  252. 【請求項２５２】 前記第１の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＮＮＮＮ、ＵＡＡＵ、ＣＵＡＡ，ＵＵＡＡ、ＵＡＣＵ、またはＡＡＡ
    Ｕである、請求項２５０に記載のＲＮＡ。
  253. 【請求項２５３】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＮ，ＡＵＣ、ＡＵＵ、ＡＣＵ，ＧＵＣ、ＣＣＣ、または
    ＡＡＵであり、そして該第２の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレ
    オチドが、配列ＮＮＮ（または、なし）、ＧＡ、ＡＧＵ、ＡＣＵ、ＧＣＧ、また
    はＡＣである、請求項２５０に記載のＲＮＡ。
  254. 【請求項２５４】 前記第２の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＮＮＮ、ＡＣＵ、ＧＵＣ、ＡＧＧ、ＧＡＡ、またはＣＣＵである、請
    求項２５０に記載のＲＮＡ。
  255. 【請求項２５５】 インターロイキン−４ ＲＮＡの一部を含む、請求項２
    ５０に記載のＲＮＡ。
  256. 【請求項２５６】 インターロイキン−４ ｍＲＮＡの５' ＵＴＲの一部を
    含む、請求項２５０に記載のＲＮＡ。
  257. 【請求項２５７】 以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチド
    の連結された配列を含む、精製されそして単離されたＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する６個または７個のヌクレオチド； 第１の末端のループ領域を形成する４個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成し、そして単一のヌクレオチドのふくら
    みを有する、７個または８個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖領域と第２の二本鎖領域とを連結する１個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 第２の末端のループ領域を形成する３個のヌクレオチド；および 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する２個または３個のヌクレオチド。
  258. 【請求項２５８】 前記第１の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＮＮＮＮ（または、なし）Ｎ、ＡＵＡＡＣＣＵ、ＵＧＧ
    ＵＡＡＡ、ＵＧＡＵＡＡＵ、ＵＧＡＵＡＡＡ、ＧＡＵＡＡＣＣ、ＧＡＵＡＡＡＣ
    、ＵＧＡＵＡＵ、ＧＡＧＡＣＣＣ、またはＧＡＣＡＡＡＣであり、そして該第１
    の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列Ｎ（または、
    なし）ＵＧＮＣＵＮＮ、ＵＧＵＣＵＣＣ、ＵＵＧＵＣＵＣＡ、ＵＵＧＣＣＵＣＡ
    、ＵＵＧＵＣＵＣＣ、ＵＵＧＵＣＵＣＵ、ＣＵＧＵＣＵＵＵ，またはＣＵＧＵＣ
    ＵＣＡである、請求項２５７に記載のＲＮＡ。
  259. 【請求項２５９】 前記第１の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＮＮＮＮ、ＵＡＡＵ、ＣＵＡＡ，ＵＵＡＡ、ＵＡＣＵ、またはＡＡＡ
    Ｕである、請求項２５７に記載のＲＮＡ。
  260. 【請求項２６０】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＮ，ＡＵＣ、ＡＵＵ、ＡＣＵ，ＧＵＣ、ＣＣＣ、または
    ＡＡＵであり、そして該第２の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレ
    オチドが、配列ＮＮＮ（または、なし）、ＧＡ、ＡＧＵ、ＡＣＵ、ＧＣＧ、また
    はＡＣである、請求項２５７に記載のＲＮＡ。
  261. 【請求項２６１】 前記第２の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＮＮＮ、ＡＣＵ、ＧＵＣ、ＡＧＧ、ＧＡＡ、またはＣＣＵである、請
    求項２５７に記載のＲＮＡ。
  262. 【請求項２６２】 インターロイキン−４ ＲＮＡの一部を含む、請求項２
    ５７に記載のＲＮＡ。
  263. 【請求項２６３】 インターロイキン−４ ｍＲＮＡの５' ＵＴＲの一部を
    含む、請求項２５７に記載のＲＮＡ。
  264. 【請求項２６４】 以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチド
    の連結された配列を含む、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する６個または７個のヌクレオチド； 第１の末端のループ領域を形成する４個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成し、そして単一のヌクレオチドのふくら
    みを有する、７個または８個のヌクレオチド； 該第１の二本鎖領域と第２の二本鎖領域とを連結する１個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 第２の末端のループ領域を形成する３個のヌクレオチド；および 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する２個または３個のヌクレオチド。
  265. 【請求項２６５】 前記第１の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＮＮＮＮ（または、なし）Ｎ、ＡＵＡＡＣＣＵ、ＵＧＧ
    ＵＡＡＡ、ＵＧＡＵＡＡＵ、ＵＧＡＵＡＡＡ、ＧＡＵＡＡＣＣ、ＧＡＵＡＡＡＣ
    、ＵＧＡＵＡＵ、ＧＡＧＡＣＣＣ、またはＧＡＣＡＡＡＣであり、そして該第１
    の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列Ｎ（または、
    なし）ＵＧＮＣＵＮＮ、ＵＧＵＣＵＣＣ、ＵＵＧＵＣＵＣＡ、ＵＵＧＣＣＵＣＡ
    、ＵＵＧＵＣＵＣＣ、ＵＵＧＵＣＵＣＵ、ＣＵＧＵＣＵＵＵ，またはＣＵＧＵＣ
    ＵＣＡである、請求項２６４に記載のＲＮＡ。
  266. 【請求項２６６】 前記第１の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＮＮＮＮ、ＵＡＡＵ、ＣＵＡＡ，ＵＵＡＡ、ＵＡＣＵ、またはＡＡＡ
    Ｕである、請求項２６４に記載のＲＮＡ。
  267. 【請求項２６７】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＮ，ＡＵＣ、ＡＵＵ、ＡＣＵ，ＧＵＣ、ＣＣＣ、または
    ＡＡＵであり、そして該第２の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレ
    オチドが、配列ＮＮＮ（または、なし）、ＧＡ、ＡＧＵ、ＡＣＵ、ＧＣＧ、また
    はＡＣである、請求項２６４に記載のＲＮＡ。
  268. 【請求項２６８】 前記第２の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＮＮＮ、ＡＣＵ、ＧＵＣ、ＡＧＧ、ＧＡＡ、またはＣＣＵである、請
    求項２６４に記載のＲＮＡ。
  269. 【請求項２６９】 インターロイキン−４ ＲＮＡの一部を含む、請求項２
    ６４に記載のＲＮＡ。
  270. 【請求項２７０】 インターロイキン−４ ｍＲＮＡの５' ＵＴＲの一部を
    含む、請求項２６４に記載のＲＮＡ。
  271. 【請求項２７１】 コンセンサス配列ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＧＮＣＵ
    ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮを含み、そして第１の二本鎖領域、第１の末端のルー
    プ領域、第２の二本鎖領域、および第２の末端のループ領域を有する、ＲＮＡ。
  272. 【請求項２７２】 配列ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＧＮＣＵＮＮＮＮＮＮ
    ＮＮＮＮＮＮを含む、少なくとも２つの種にわたって保存されている、ＲＮＡフ
    ラグメントのｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの提示。
  273. 【請求項２７３】 配列ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＵＧＮＣＵＮＮＮＮＮＮ
    ＮＮＮＮＮＮを含む、少なくとも２つの種にわたって保存されている、精製され
    そして単離されたＲＮＡフラグメント。
  274. 【請求項２７４】 ヒト配列ＵＧＡＵＡＡＡＣＵＡＡＵＵＧＣＣＵＣＡＣＡ
    ＵＵＧＵＣＡＣＵを含む、精製されそして単離されたＲＮＡフラグメント。
  275. 【請求項２７５】 マウス配列ＧＡＵＡＡＡＣＵＵＡＡＵＵＧＵＣＵＣＵＣ
    ＧＵＣＡＣＵＧＡ、ＵＧＡＵＡＵＵＡＣＵＣＵＧＵＣＵＵＵＣＣＣＣＡＧＧＧＣ
    Ｇ、またはＧＡＧＡＣＣＣＡＡＡＵＣＵＧＵＣＵＣＡＣＡＡＵＧＡＡＡＣを含む
    、精製されそして単離されたＲＮＡフラグメント。
  276. 【請求項２７６】 少なくとも１９個のヌクレオチドであるが、７０個を超
    えないヌクレオチドの連結された配列を含み、そして以下によって規定される二
    次構造を有する、ＲＮＡ； 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 内部のループ領域の第１の側を形成する１個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 末端のループ領域を形成する５個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する３個のヌクレオチド； 該内部のループ領域の第２の側を形成する１個のヌクレオチド；および 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成する３個のヌクレオチド；
  277. 【請求項２７７】 前記第１の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＮ、ＡＵＵ、ＡＡＧ，ＧＡＧ，ＡＵＧ，ＧＡＡ，ＧＡＣ
    、ＡＡＵ，ＡＡＡ、またはＣＣＡであり、そして該第１の二本鎖領域の前記第２
    の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＮＮＮ，ＵＡＵ，ＵＵＵ，ＡＡＡ、Ｃ
    ＣＵ，ＡＣＵ，またはＧＣＵである、請求項２７６に記載のＲＮＡ。
  278. 【請求項２７８】 前記第１の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＮＮＮＮＮ、ＵＡＡＡＡ、ＡＵＡＵＣ、ＡＡＡＡＡ、ＡＵＡＵＵ，Ｕ
    ＵＡＡＵ、ＣＵＡＵＵ、ＡＵＧＡＧ，ＵＡＡＧＧ、ＣＵＵＣＣ、またはＡＧＧＡ
    Ｇである、請求項２７６に記載のＲＮＡ。
  279. 【請求項２７９】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＮ、ＵＵＡ，ＵＧＡ，ＵＵＵ，ＵＡＡ，ＣＣＡ、または
    ＡＡＡであり、そして該第２の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレ
    オチドが、配列ＮＮＮ、ＵＡＡ、ＵＵＡ，ＡＧＣ，ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＵＵＣ、ま
    たはＣＡＡである、請求項２７６に記載のＲＮＡ。
  280. 【請求項２８０】 インターロイキン−４ ＲＮＡの一部を含む、請求項２
    ７６に記載のＲＮＡ。
  281. 【請求項２８１】インターロイキン−４ ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部を含
    む、請求項２７６に記載のＲＮＡ。
  282. 【請求項２８２】 以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチド
    の連結された配列を含む、精製されそして単離されたＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 内部のループ領域の第１の側を形成する１個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 末端のループ領域を形成する５個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する３個のヌクレオチド； 該内部のループ領域の第２の側を形成する１個のヌクレオチド；および 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成する３個のヌクレオチド。
  283. 【請求項２８３】 前記第１の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＮ、ＡＵＵ、ＡＡＧ，ＧＡＧ，ＡＵＧ，ＧＡＡ，ＧＡＣ
    、ＡＡＵ，ＡＡＡ、またはＣＣＡであり、そして該第１の二本鎖領域の前記第２
    の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＮＮＮ，ＵＡＵ，ＵＵＵ，ＡＡＡ、Ｃ
    ＣＵ，ＡＣＵ，またはＧＣＵである、請求項２８２に記載のＲＮＡ。
  284. 【請求項２８４】 前記第１の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＮＮＮＮＮ、ＵＡＡＡＡ、ＡＵＡＵＣ、ＡＡＡＡＡ、ＡＵＡＵＵ，Ｕ
    ＵＡＡＵ、ＣＵＡＵＵ、ＡＵＧＡＧ，ＵＡＡＧＧ、ＣＵＵＣＣ、またはＡＧＧＡ
    Ｇである、請求項２８２に記載のＲＮＡ。
  285. 【請求項２８５】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＮ、ＵＵＡ，ＵＧＡ，ＵＵＵ，ＵＡＡ，ＣＣＡ、または
    ＡＡＡであり、そして該第２の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレ
    オチドが、配列ＮＮＮ、ＵＡＡ、ＵＵＡ，ＡＧＣ，ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＵＵＣ、ま
    たはＣＡＡである、請求項２８２に記載のＲＮＡ。
  286. 【請求項２８６】 インターロイキン−４ ＲＮＡの一部を含む、請求項２
    ８２に記載のＲＮＡ。
  287. 【請求項２８７】 インターロイキン−４ ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部を
    含む、請求項２８２に記載のＲＮＡ。
  288. 【請求項２８８】 以下によって規定される二次構造を有するヌクレオチド
    の連結された配列を含む、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏのＲＮＡ： 第１の二本鎖領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 内部のループ領域の第１の側を形成する１個のヌクレオチド； 第２の二本鎖領域の第１の側を形成する３個のヌクレオチド； 末端のループ領域を形成する５個のヌクレオチド； 該第２の二本鎖領域の第２の側を形成する３個のヌクレオチド； 該内部のループ領域の第２の側を形成する１個のヌクレオチド；および 該第１の二本鎖領域の第２の側を形成する３個のヌクレオチド。
  289. 【請求項２８９】 前記第１の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＮ、ＡＵＵ、ＡＡＧ，ＧＡＧ，ＡＵＧ，ＧＡＡ，ＧＡＣ
    、ＡＡＵ，ＡＡＡ、またはＣＣＡであり、そして該第１の二本鎖領域の前記第２
    の側を形成する前記ヌクレオチドが、配列ＮＮＮ，ＵＡＵ，ＵＵＵ，ＡＡＡ、Ｃ
    ＣＵ，ＡＣＵ，またはＧＣＵである、請求項２８８に記載のＲＮＡ。
  290. 【請求項２９０】 前記第１の末端のループ領域を形成する前記ヌクレオチ
    ドが、配列ＮＮＮＮＮ、ＵＡＡＡＡ、ＡＵＡＵＣ、ＡＡＡＡＡ、ＡＵＡＵＵ，Ｕ
    ＵＡＡＵ、ＣＵＡＵＵ、ＡＵＧＡＧ，ＵＡＡＧＧ、ＣＵＵＣＣ、またはＡＧＧＡ
    Ｇである、請求項２８８に記載のＲＮＡ。
  291. 【請求項２９１】 前記第２の二本鎖領域の前記第１の側を形成する前記ヌ
    クレオチドが、配列ＮＮＮ、ＵＵＡ，ＵＧＡ，ＵＵＵ，ＵＡＡ，ＣＣＡ、または
    ＡＡＡであり、そして該第２の二本鎖領域の前記第２の側を形成する前記ヌクレ
    オチドが、配列ＮＮＮ、ＵＡＡ、ＵＵＡ，ＡＧＣ，ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＵＵＣ、ま
    たはＣＡＡである、請求項２８８に記載のＲＮＡ。
  292. 【請求項２９２】 インターロイキン−４ ＲＮＡの一部を含む、請求項２
    ８８に記載のＲＮＡ。
  293. 【請求項２９３】 インターロイキン−４ ｍＲＮＡの３' ＵＴＲの一部を
    含む、請求項２８８に記載のＲＮＡ。
  294. 【請求項２９４】 コンセンサス配列ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ
    ＮＮを含み、そして第１の二本鎖領域、内部のループ領域、第２の二本鎖領域、
    および末端のループ領域を有する、ＲＮＡ。
  295. 【請求項２９５】 配列ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮを含む、
    少なくとも２つの種にわたって保存されている、ＲＮＡフラグメントのｉｎ ｓ
    ｉｌｉｃｏでの提示。
  296. 【請求項２９６】 配列ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮを含む、
    少なくとも２つの種にわたって保存されている、精製されそして単離されたＲＮ
    Ａフラグメント。
  297. 【請求項２９７】 マウス配列ＡＡＵＣＵＧＡＡＵＧＡＧＡＡＵＧＣＣＵ、
    ＡＵＵＧＣＣＡＵＡＡＧＧＵＵＣＵＡＣＵ、ＣＣＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＣＡＡＧ
    ＧＣＵを含む、精製されそして単離されたＲＮＡフラグメント。
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