JP2003516759A - チトクロムｐ４５０についてのインジケーターとしてのジエトキシフルオレセイン - Google Patents

チトクロムｐ４５０についてのインジケーターとしてのジエトキシフルオレセイン

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、チトクロムＰ４５０酵素の基質としてのジエトキシフルオレセインに関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明はチトクロムＰ４５０酵素の基質としてのフルオレセイン誘導体の使用
に関する。 大多数の代謝を基礎とする薬物間相互作用は、チトクロムＰ４５０酵素の阻害
に由来する。個々のＰ４５０酵素に関する薬物間相互作用はインビトロの方法を
用いて予測することができる。典型的なインビトロでのＰ４５０酵素アッセイは
、酵素源と適当な基質とのインキュベーションを必要とする。元来、これらのイ
ンキュベーションにおける代謝産物を検出するために時間のかかるクロマトグラ
フィー法が用いられてきた。より最近では、蛍光プレートリーダーの利用可能性
が、一般に、酵素アッセイのより高度な処理能力を容易にした。Ｐ４５０アッセ
イを蛍光プレートリーダー方法に適応させるには、適当な蛍光生成物を用いて個
々の酵素についての基質を検出することを必要とする。生体異物を代謝するチト
クロムＰ４５０のうち、ＣＹＰ３Ａ４が薬物の代謝作用に一般に関与する酵素の
１つである。また、ＣＹＰ２Ｃ８はいくつかの薬物の代謝作用に関与しているも
のとして同定されている。
【０００２】 ハイスループットなＣＹＰ３Ａ４阻害スクリーニングのためのレゾルフィン（
Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）ベンジルエーテルが記載されている（Crespiら、Anal. Bi
ochem.、1997、248、188-190）。しかしながら、ＣＹＰ３Ａ４によるレゾルフィ
ンベンジルエーテルの代謝速度は遅く、したがってさらにハイスループットな阻
害スクリーニングを可能にするのに、より適当なＣＹＰ３Ａ４基質が必要である
。ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｃ８の基質として、ベンジルフルオレセインの使
用もまた、Crespiらの１９９９年８月２２日から２６日にハンガリーのブタベス
トで開かれた第７回ヨーロッパＩＳＳＸ会議にて発表された「薬物代謝研究の革
新的な技術」で開示された。しかしながら、このアッセイにはノイズに対して小
さな比率のシグナルがあり、したがって、阻害スクリーニングの感度をよくする
のに、より適当なＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ２Ｃ８基質が必要である。 ミラーは、Anal. Biochem.、1983、133、46-57において、ジエトキシフルオレ
セイン化合物およびマウス肝臓ホモジェネートおよび培養マウス肝臓ガン細胞に
よるその代謝の研究について記載している。ミラーはジエトキシフルオレセイン
は誘導性マウスチトクロムＰ４５０の検出に有用でないと結論している。 国際公開番号ＷＯ００／４４９３３はＣＹＰ３Ａ４基質としてのレゾルフィン
誘導体を開示する。
【０００３】 この度、ジエトキシフルオレセインがヒトチトクロムＰ４５０酵素の一般的な
基質として同定された。特に、ジエトキシフルオレセインはヒトＣＹＰ３Ａ４お
よびＣＹＰ２Ｃ８の改良基質であり、ハイスループットな阻害スクリーニングア
ッセイを構成するのに有用である。 本発明によれば、ヒトチトクロムＰ４５０酵素の阻害剤を同定するアッセイで
あって、該酵素および式（Ｉ）：
【化３】 で示される化合物を試験化合物と接触させ、該酵素による式（Ｉ）の化合物のＯ
−脱アルキル化阻害を測定することを含む、方法が提供される。
【０００４】 本発明の方法で用いられるヒトチトクロムＰ４５０酵素は、好ましくはＣＹＰ
３Ａ４またはＣＹＰ２Ｃ８、より好ましくはＣＹＰ３Ａ４である。 一般に、試験化合物の不存在下での式（Ｉ）の化合物のＯ−脱アルキル化速度
は、所定の時点でのＯ−脱アルキル化度として知られている。該アッセイは断続
的なまたは特定の時点でのＯ−脱アルキル化の阻害を同定することができる。 例えば、式（Ｉ）の化合物をＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ２Ｃ８と一緒にインキ
ュベートさせ、その化合物をＯ−脱アルキル化に付し、次式：
【化４】 で示されるような互変異型にて存在する、Ｏ−脱アルキル化された化合物を得る
。
【０００５】 低ｐＨでは、非蛍光性ラクトン（ＩＩａ）が優勢であるが、中性ないし塩基性
のｐＨでは、蛍光性荷電形態（ＩＩｂ）が優勢である。 容易に定量できる式（ＩＩｂ）の蛍光性化合物を適当な励起および発光波長、
例えば４８５ｎｍの励起波長および５３０ｎｍの発光波長でスキャンすることが
できる。該酵素による式（Ｉ）の化合物のＯ−脱アルキル化の阻害を、好ましく
は式（ＩＩｂ）の化合物を定量することにより測定する。
【０００６】 アッセイを溶液中または酵素が固体担体に結合する場合には固体担体を利用し
て行ってもよい。アッセイを溶液中で行う場合、適した溶媒にはメタノールおよ
びアセトニトリルを含む。 例えば、リン酸カリウムまたはトリスＨＣｌ緩衝液を用いて、ｐＨ７．４また
は７．５に緩衝化した溶液中でアッセイを行うことが好ましい。また、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２を含む、リン酸カリウム緩衝液中で行ってもよい。好ましくは、アッ
セイを３７℃の温度で行う。 基質を添加する前に、試験化合物を酵素とともに予めインキュベーションをし
てもよく、または別法として基質を試験化合物と同時に加えてもよい。アッセイ
を行うための適当な処理速度を得るように、酵素および基質の最終濃度を計算す
る。所望により、例えば酸または溶媒を添加することにより、反応をとめること
ができる。
【０００７】 当業者に明白であるように、ヒトチトクロムＰ４５０酵素の補因子がアッセイ
系に存在していてもよく、ヒトチトクロムＰ４５０酵素の補因子はＮＡＤＰ、グ
ルコース６リン酸およびグルコース６脱水素酵素である。ＮＡＤＨまたはＮＡＤ
ＰＨをＮＡＤＰの代わりに用いてもよい。試験化合物／酵素／基質混合物に、好
ましくは３７℃に予め加温してある補因子溶液を添加することによりアッセイを
開始するのが都合がよい。 式（ＩＩｂ）の蛍光性生成物は、蛍光検出のいずれか一般的な系、例えばマル
チウェルプレート／蛍光プレートリーダーを用いて分析することができる。 式（Ｉ）の化合物は、Miller、Anal. Biochem.、1983、133、46-57に記載され
た操作に基づいて調製することができる。
【０００８】 チトクロムＰ４５０酵素の阻害は薬物／薬物間相互作用の機構であることが多
いため、本発明に係るアッセイは、有害な薬物／薬物間相互作用を生じさせる可
能性のある化合物を同定するのに特に有用である。それゆえ、アッセイを試験化
合物の化学的修飾と組み合わせて用いて、医薬として使用する試験化合物の可能
性を増加させることができる。 したがって、本発明のさらなる態様によれば、化合物のヒトチトクロムＰ４５
０酵素阻害活性を減少させる方法であって、上記したアッセイにて、ヒトチトク
ロムＰ４５０酵素の阻害剤としての化合物を同定し；その後、ヒトチトクロムＰ
４５０酵素阻害に関与していると考えられる官能性を排除または変形する、化学
的に修飾された形態の試験化合物を生成することを含む、方法；およびこの方法
により生成される新規な化合物が提供される。 この方法に基づく試験化合物の化学的修飾を、当業者でよく知られた方法を用
いて行うことができる。 本発明のこの態様に従って生成された新規な化合物は医薬としての用途を見出
すことができる。この方法に従って生成された化合物は周知文献およびデータベ
ース検索を行うことにより新規なものとして、容易に同定することができるだろ
う。かかる化合物の医薬活性は当業者に知られた通常の生物学的スクリーニング
方法を用いて容易に確かめることができる。
【０００９】 特許および特許出願を含め、本明細書中に引用したすべての刊行物を、出典明
示により本明細書の一部とする。 本発明を次の実施例および添付図面を用いて説明する。
【００１０】実施例１ ＣＹＰ３Ａ４のアッセイ方法 原料： ５００μＭジエトキシフルオレセイン（すなわち、アセトニトリル中０．１９４
ｍｇ／ｍＬ）：約−２０℃で暗室中で保存 ２％（ｗ／ｖ）ＮａＨＣＯ３：約４℃で保存 ５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４） 新たに調製した補因子溶液：２％（ｗ／ｖ）ＮａＨＣＯ３１ｍＬ当たり略以下の
通りである。 １．７ｍｇＮＡＤＰ（モノナトリウム塩） ７．８ｍｇグルコース６リン酸（モノナトリウム塩） ６単位グルコース６リン酸脱水素酵素（パン酵母由来のＶＩＩ型）
【００１１】 方法： １）プレートリーダーをオーブンで３７℃に予め加温し、少なくとも１０分間ラ
ンプを予め加温する。 ２）インキュベートあたり、２．５μＬの５００μＭジエトキシフルオレセイン
、４μｌ（４０μｇ）ＣＹＰ３Ａ４ミクロソームタンパク質および２１３．５μ
Ｌ緩衝液を混合する（最終濃度、５μＭジエトキシフルオレセインおよび１６０
μｇ／ｍＬタンパク質となる）。 ３）９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに２２０μＬのインキュベーション
混合物および５μＬの試験化合物溶液を加える（または対照ウェル用に５μＬの
適当な溶媒−メタノールまたはアセトニトリルを用いてもよい）。 ４）プレートリーダー中のマルチウェルプレートを３７℃で５分間予めインキュ
ベートする。補因子溶液を３７℃で５分間予め加温する。 ５）２５μＬ補因子溶液をそれぞれのウェルに加え、４８５ｎｍの励起波長およ
び５３０ｎｍの発光波長で８０のゲインでスキャンする。１分の間隔で１０サイ
クルをスキャンする。
【００１２】結果 ジエトキシフルオレセインのＣＹＰ３Ａ４の基質としての確認を、診断用ＣＹ
Ｐ３Ａ４阻害剤であるケトコナゾールを用いて行った（Baldwinら、Xenobiotica
、1995、25、261-270）。ケトコナゾ−ルを用いて、ジエトキシフルオレセイン
はＩＣ５０が他のよく特徴付けられたＣＹＰ３Ｃ４基質の典型的な阻害値である
６３ｎＭ（図１）で阻害された。
【００１３】実施例２ ＣＹＰ２Ｃ８のアッセイ方法 原料： ４００μＭジエトキシフルオレセイン（すなわち、アセトニトリル中０．１５５
ｍｇ／ｍＬ）：約−２０℃の暗室中で保存 ２％（ｗ／ｖ）ＮａＨＣＯ３：約４℃で保存 ５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４） 新たに調製した補因子溶液：２％（ｗ／ｖ）ＮａＨＣＯ３１ｍＬ当たり略以下の
通りであった。 １．７ｍｇＮＡＤＰ（モノナトリウム塩） ７．８ｍｇグルコース６リン酸（モノナトリウム塩） ６単位グルコース６リン酸脱水素酵素（パン酵母由来ＶＩＩ型）
【００１４】 方法： １）プレートリーダーをオーブンで３７℃に予め加温し、ランプを少なくとも１
０分間予め加温する。 ２）インキュベートあたり、２．５μＬの４００μＭジエトキシフルオレセイン
、５μｌ（５０μｇ）ＣＹＰ２Ａ８ミクロソームタンパク質および２１２．５μ
Ｌ緩衝液を混合する（最終濃度、４μＭジエトキシフルオレセインおよび２００
μｇ／ｍＬタンパク質となる）。 ３）９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに２２０μＬのインキュベーション
混合物および５μＬの試験化合物溶液を加える（または対照ウェル用に５μＬの
適当な溶媒−メタノール、ＤＭＳＯまたはアセトニトリルを用いてもよい）。 ４）プレートリーダー中のマルチウェルプレートを３７℃で５分間あらかじめイ
ンキュベートする。補因子溶液を３７℃で５分間予め加温する。 ５）２５μＬ補因子溶液をそれぞれのウェルに加え、４８５ｎｍの励起波長およ
び５３０ｎｍの発光波長で８０のゲインでスキャンする。１分の間隔で１０サイ
クルをスキャンする。
【００１５】結果 ジエトキシフルオレセインのＣＹＰ２Ｃ８基質としての確認を、ＣＹＰ２Ｃ８
阻害剤であるケルセチンを用いて行った（Rahmanら、Cancer Research、1994、5
4(1)、5543-5546）。ケルセチンを用いて、ジエトキシフルオレセイン代謝はＩ
Ｃ５０が他のよく特徴付けられたＣＹＰ２Ｃ８基質の典型的な阻害値である３μ
Ｍ（図２）で阻害された。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＣＹＰ３Ａ４によるジエトキシフルオレセイン代謝作用のケトコ
ナゾール（Ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ）阻害を示す。
【図２】 ＣＹＰ２Ｃ８によるジエトキシフルオレセイン代謝作用のケルセ
チン（Ｑｕｅｒｃｉｔｉｎ）阻害を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイ ション ＳＭＩＴＨＫＬＩＮＥ ＢＥＥＣＨＡＭ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ アメリカ合衆国ペンシルベニア州19406− 0939、キング・オブ・プルシア、スウェー ドランド・ロード709番 (72)発明者 ラメシュ・バンバル アメリカ合衆国ペンシルベニア州19406、 キング・オブ・プルシア、スウェードラン ド・ロード709番、グラクソスミスクライ ン・ファーマシューティカルズ (72)発明者 ジャクリーン・キャロル・ブルーマー イギリス、エイエル６・９エイアール、ハ ートフォードシャー、ウェルウィン、ザ・ フリス、グラクソスミスクライン・ファー マシューティカルズ Ｆターム(参考） 2G054 AA06 AB03 CE02 EA01 GA04 4B063 QA01 QA18 QQ20 QR02 QR41 QR58 QS36 QX02

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ヒトチトクロムＰ４５０酵素の阻害剤を同定するためのアッ
    セイであって、該酵素および式（Ｉ）： 【化１】 で示される化合物を試験化合物と接触させ、該酵素による式（Ｉ）の化合物のＯ
    −脱アルキル化阻害を測定することを含む、アッセイ。
  2. 【請求項２】 ヒトチトクロムＰ４５０酵素がＣＹＰ３Ａ４またはＣＹＰ２
    Ｃ８である請求項１記載のアッセイ。
  3. 【請求項３】 ヒトチトクロムＰ４５０酵素がＣＹＰ３Ａ４である請求項２
    記載のアッセイ。
  4. 【請求項４】 式（ＩＩｂ）： 【化２】 で示される化合物を定量することで、酵素による式（Ｉ）の化合物のＯ−脱アル
    キル化阻害を測定する、前記した請求項のうちいづれか１項記載のアッセイ。
  5. 【請求項５】 蛍光検出により式（ＩＩ）の化合物を定量する請求項４記載
    のアッセイ。
  6. 【請求項６】 ４８５ｎｍの励起波長および５３０ｎｍの発光波長でスキャ
    ンすることにより、式（ＩＩ）の化合物を定量する請求項５記載のアッセイ。
  7. 【請求項７】 化合物のヒトチトクロムＰ４５０酵素阻害活性を減少させる
    方法であって、請求項１ないし６のいずれか１項記載のアッセイにて、ヒトチト
    クロムＰ４５０酵素の阻害剤としての化合物を同定し；その後、ヒトチトクロム
    Ｐ４５０酵素の阻害に関与していると考えられる官能性を排除または変形する、
    化学的に修飾された形態の試験化合物を生成することを含む、方法。
  8. 【請求項８】 請求項７記載の方法に基づいて生成される新規な化合物。
JP2001545572A 1999-12-13 2000-12-08 チトクロムｐ４５０についてのインジケーターとしてのジエトキシフルオレセイン Withdrawn JP2003516759A (ja)

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WO (1) WO2001044495A2 (ja)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1210342A1 (en) * 1999-08-19 2002-06-05 Gentest Corporation The use of fluorescein aryl ethers in high throughput cytochrome p450 inhibition assays

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WO2001044495A2 (en) 2001-06-21
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DE60030322D1 (en) 2006-10-05
DE60030322T2 (de) 2007-08-30
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ATE337411T1 (de) 2006-09-15
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