JP2003509662A - マッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーによるｄｎａ分離のための改良カラム - Google Patents
マッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーによるｄｎａ分離のための改良カラムInfo
- Publication number
- JP2003509662A JP2003509662A JP2001523107A JP2001523107A JP2003509662A JP 2003509662 A JP2003509662 A JP 2003509662A JP 2001523107 A JP2001523107 A JP 2001523107A JP 2001523107 A JP2001523107 A JP 2001523107A JP 2003509662 A JP2003509662 A JP 2003509662A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- column
- beads
- dna
- separation
- mixture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/366—Ion-pair, e.g. ion-pair reversed phase
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
- B01J20/26—Synthetic macromolecular compounds
- B01J20/265—Synthetic macromolecular compounds modified or post-treated polymers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
- B01J20/282—Porous sorbents
- B01J20/285—Porous sorbents based on polymers
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
- B01D15/16—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the conditioning of the fluid carrier
- B01D15/166—Fluid composition conditioning, e.g. gradient
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
- B01D15/20—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the conditioning of the sorbent material
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
- B01D15/22—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the construction of the column
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
- G01N30/30—Control of physical parameters of the fluid carrier of temperature
- G01N2030/3084—Control of physical parameters of the fluid carrier of temperature ovens
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Abstract
(57)【要約】
改善された分離カラム及び、マッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー（Matched Ion Polynucleotide Chromatography）による二本鎖ＤＮＡ断片の混合物の分離法。円筒形のカラムは約５ｍｍより大きいＩＤをもち、ポリマービーズを含有する。ビーズは１〜１００ミクロンの平均直径をもち、未置換ポリマービーズであるかもしくは、１〜１，０００，０００炭素を含む炭化水素基で置換されたポリマービーズである。好ましいビーズはＤＮＡと自由に結合することができる多価カチオンを実質的に含まないことを特徴とする。改良カラムは約１００〜２０，０００塩基対の範囲のサイズをもつＤＮＡ断片の増加した分離を提供する。当該カラムはまた、不適正塩基対の部位でＤＮＡの部分的変性をもたらす条件下でクロマトグラフィーを実施する突然変異検出法において、ヘテロ二量体及びホモ二量体ＤＮＡ分子の増加した分離を提供する。
Description
【０００１】
（発明の分野）
本発明はＤＮＡ分離システム及びＤＮＡの、サイズ（塩基対の長さ）に基づい
た分離を実施するのに適した方法に関する。本発明はマッチドイオンポリヌクレ
オチドクロマトグラフィー［Matched Ion Polynucleotide Chromatography（Ｍ
ＩＰＣ）］により分離することができるＤＮＡ断片の塩基対の長さの範囲を増加
し、そして部分的変性条件下のＭＩＰＣを使用してヘテロ二量体及びホモ二量体
ＤＮＡの分離を改善するための改良分離カラムに関する。
た分離を実施するのに適した方法に関する。本発明はマッチドイオンポリヌクレ
オチドクロマトグラフィー［Matched Ion Polynucleotide Chromatography（Ｍ
ＩＰＣ）］により分離することができるＤＮＡ断片の塩基対の長さの範囲を増加
し、そして部分的変性条件下のＭＩＰＣを使用してヘテロ二量体及びホモ二量体
ＤＮＡの分離を改善するための改良分離カラムに関する。
【０００２】
（発明の背景）
ＤＮＡのようなポリヌクレオチドの分離は伝統的に、スラブゲル電気泳動もし
くはキャピラリー電気泳動を使用して実施されてきた。しかし、それらを分離後
の、分析を自動化し、画分を回収する能力のために、ポリヌクレオチドの液体ク
ロマトグラフィー分離がより重要になって来ている。従って、液体クロマトグラ
フィー（ＬＣ）によるポリヌクレオチド分離のためのカラムがますます重要にな
ってきている。
くはキャピラリー電気泳動を使用して実施されてきた。しかし、それらを分離後
の、分析を自動化し、画分を回収する能力のために、ポリヌクレオチドの液体ク
ロマトグラフィー分離がより重要になって来ている。従って、液体クロマトグラ
フィー（ＬＣ）によるポリヌクレオチド分離のためのカラムがますます重要にな
ってきている。
【０００３】
ＤＮＡ分子はデオキシヌクレオチドと呼ばれるサブユニットを含んで成るポリ
マーである。ＤＮＡ中に発見された４種のデオキシヌクレオチドは、本明細書中
でそれぞれＡ、Ｇ、Ｃ及びＴと呼ばれる４種の塩基、アデニン（プリン）、グア
ニン（プリン）、チトシン（ピリミジン）及びチミン（ピリミジン）のいずれか
に共有結合されている共通の環式の糖、デオキシリボースを含んで成る。リン酸
基が、１個のデオキシヌクレオチドの３’−ヒドロキシルをもう１個のデオキシ
ヌクレオチドの５’−ヒドロキシルと結合してポリマー鎖を形成する。二本鎖Ｄ
ＮＡにおいては、２本の鎖が相補的塩基と呼ばれるものの間の水素結合によりら
せん構造でしっかり保持されている。塩基の相補性はそれらの化学構造により決
定される。二本鎖ＤＮＡにおいては、ＡはそれぞれＴとマッチドし、Ｇはそれぞ
れＣとマッチドする、すなわちプリンはピリミジンとマッチドする。理想的には
、ＤＮＡはヒトの身体もしくは他の生物の細胞分裂期間にＤＮＡポリメラーゼに
より正確な複製体に複製される。ＤＮＡ鎖はまた、インビトロで、「ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」により複製されることができる。時々、正確な複製が失
敗して、不適正な塩基のマッチドが起こる。更に、新規の鎖の複製が親のものか
らの塩基配列と遺伝的な相異を含む二本鎖ＤＮＡの子孫を産生する。塩基対配列
のこれらの遺伝的な変化が突然変異と呼ばれる。
マーである。ＤＮＡ中に発見された４種のデオキシヌクレオチドは、本明細書中
でそれぞれＡ、Ｇ、Ｃ及びＴと呼ばれる４種の塩基、アデニン（プリン）、グア
ニン（プリン）、チトシン（ピリミジン）及びチミン（ピリミジン）のいずれか
に共有結合されている共通の環式の糖、デオキシリボースを含んで成る。リン酸
基が、１個のデオキシヌクレオチドの３’−ヒドロキシルをもう１個のデオキシ
ヌクレオチドの５’−ヒドロキシルと結合してポリマー鎖を形成する。二本鎖Ｄ
ＮＡにおいては、２本の鎖が相補的塩基と呼ばれるものの間の水素結合によりら
せん構造でしっかり保持されている。塩基の相補性はそれらの化学構造により決
定される。二本鎖ＤＮＡにおいては、ＡはそれぞれＴとマッチドし、Ｇはそれぞ
れＣとマッチドする、すなわちプリンはピリミジンとマッチドする。理想的には
、ＤＮＡはヒトの身体もしくは他の生物の細胞分裂期間にＤＮＡポリメラーゼに
より正確な複製体に複製される。ＤＮＡ鎖はまた、インビトロで、「ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）」により複製されることができる。時々、正確な複製が失
敗して、不適正な塩基のマッチドが起こる。更に、新規の鎖の複製が親のものか
らの塩基配列と遺伝的な相異を含む二本鎖ＤＮＡの子孫を産生する。塩基対配列
のこれらの遺伝的な変化が突然変異と呼ばれる。
【０００４】
本明細書で使用される二本鎖ＤＮＡは二量体と呼ばれる。１本鎖の塩基配列が
他の鎖の塩基配列に完全に相補的である場合、その二量体はホモ二量体と呼ばれ
る。二量体が相補的でない少なくとも１個の塩基対を含む場合、その二量体はヘ
テロ二量体と呼ばれる。ヘテロ二量体は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によりエラー
が起こり、非相補的塩基が、複製されているポリヌクレオチド鎖に付加される時
に、ＤＮＡ複製中に形成される。更に、ヘテロ二量体の複製は理想的には、ヘテ
ロ接合性のホモ二量体を産生するであろう、すなわち、これらのホモ二量体は最
初の親ＤＮＡ鎖に比較して変化した配列をもつであろう。親ＤＮＡが天然に存在
する集団中で優勢な配列を有する場合は、その配列は概括的に「野生型」と呼ば
れる。
他の鎖の塩基配列に完全に相補的である場合、その二量体はホモ二量体と呼ばれ
る。二量体が相補的でない少なくとも１個の塩基対を含む場合、その二量体はヘ
テロ二量体と呼ばれる。ヘテロ二量体は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素によりエラー
が起こり、非相補的塩基が、複製されているポリヌクレオチド鎖に付加される時
に、ＤＮＡ複製中に形成される。更に、ヘテロ二量体の複製は理想的には、ヘテ
ロ接合性のホモ二量体を産生するであろう、すなわち、これらのホモ二量体は最
初の親ＤＮＡ鎖に比較して変化した配列をもつであろう。親ＤＮＡが天然に存在
する集団中で優勢な配列を有する場合は、その配列は概括的に「野生型」と呼ば
れる。
【０００５】
多数の異なる型のＤＮＡ突然変異が知られている。ＤＮＡ突然変異の例は、そ
れらに限定はされないが、不適正な塩基マッチドが起こる「点突然変異」もしく
は「一塩基対突然変異」を含む。最も一般的な点突然変異は、１個のプリンもし
くはピリミジン塩基がもう１つの塩基と置き換わる「トランジション（transiti
ons）」及び、プリンがピリミジンと置き換わる（及びその反対も）「トランス
バージョン（transversions）」を含んで成る。点突然変異はまた、塩基が付加
されるか、もしくはＤＮＡ鎖から欠失される突然変異を含んで成る。これらの「
挿入」もしくは「欠失」はまた「フレームシフト突然変異」として知られている
。それらは点突然変異ほど頻繁に発生はしないが、多数の塩基対に影響を与える
、より大規模な突然変異も起こすことができ、重要であるかも知れない。突然変
異の、より詳細な考察はModrich(1995)に対する米国特許第５，４５９，０３９
号及びCotton(1997)に対する米国特許第５，６９８，４００号明細書に認めるこ
とができる。
れらに限定はされないが、不適正な塩基マッチドが起こる「点突然変異」もしく
は「一塩基対突然変異」を含む。最も一般的な点突然変異は、１個のプリンもし
くはピリミジン塩基がもう１つの塩基と置き換わる「トランジション（transiti
ons）」及び、プリンがピリミジンと置き換わる（及びその反対も）「トランス
バージョン（transversions）」を含んで成る。点突然変異はまた、塩基が付加
されるか、もしくはＤＮＡ鎖から欠失される突然変異を含んで成る。これらの「
挿入」もしくは「欠失」はまた「フレームシフト突然変異」として知られている
。それらは点突然変異ほど頻繁に発生はしないが、多数の塩基対に影響を与える
、より大規模な突然変異も起こすことができ、重要であるかも知れない。突然変
異の、より詳細な考察はModrich(1995)に対する米国特許第５，４５９，０３９
号及びCotton(1997)に対する米国特許第５，６９８，４００号明細書に認めるこ
とができる。
【０００６】
ＤＮＡ塩基対の配列はタンパク質産生のためのコードである。とりわけ、ＤＮ
Ａ鎖のエクソン部分のＤＮＡ配列はタンパク質の対応するアミノ酸配列をコード
する。従って、ＤＮＡ配列の突然変異はタンパク質のアミノ酸配列の変化をもた
らすことができる。アミノ酸配列のこのような変化は完全に良性であるかもしく
は、タンパク質を不活性化するかまたはその機能を変化させて、生命の危機をも
たらすかまたは致死的になることができる。他方で、ＤＮＡ鎖のイントロン部分
の突然変異は、イントロン部分がタンパク質生産のコードを含まないので、生物
学的影響をもつとは期待されないであろう。それにもかかわらず、イントロン部
分の突然変異検出は例えば、法医学の研究で重要であるかも知れない。
Ａ鎖のエクソン部分のＤＮＡ配列はタンパク質の対応するアミノ酸配列をコード
する。従って、ＤＮＡ配列の突然変異はタンパク質のアミノ酸配列の変化をもた
らすことができる。アミノ酸配列のこのような変化は完全に良性であるかもしく
は、タンパク質を不活性化するかまたはその機能を変化させて、生命の危機をも
たらすかまたは致死的になることができる。他方で、ＤＮＡ鎖のイントロン部分
の突然変異は、イントロン部分がタンパク質生産のコードを含まないので、生物
学的影響をもつとは期待されないであろう。それにもかかわらず、イントロン部
分の突然変異検出は例えば、法医学の研究で重要であるかも知れない。
【０００７】
従って、突然変異の検出は、疾病の診断、疾病の原因の理解、及び可能な処置
の開発において極めて重要である。ＤＮＡ試料の突然変異の検出及び類似性もし
くは相異の識別はまた、疾病抵抗性のそして／もしくはより高い生産率の作物株
を開発することにより世界食糧供給を増加すること、法医学的科学において、進
化及び集団の研究において、そして科学的研究全般において極めて重要である（
Guyer,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:10841(1995);Cotton,TIG 13:43(1997
)）。
の開発において極めて重要である。ＤＮＡ試料の突然変異の検出及び類似性もし
くは相異の識別はまた、疾病抵抗性のそして／もしくはより高い生産率の作物株
を開発することにより世界食糧供給を増加すること、法医学的科学において、進
化及び集団の研究において、そして科学的研究全般において極めて重要である（
Guyer,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:10841(1995);Cotton,TIG 13:43(1997
)）。
【０００８】
良性のもしくは否定的な結果をもたないＤＮＡ配列の変化は時々「多型性」と
呼ばれる。本出願の目的のためのＤＮＡ配列の変化はすべて、それらが否定的な
結果をもつか否かにかかわらず、本明細書において「突然変異」と定義される。
簡略化のために、「突然変異（mutaion）」の術語は本明細書においては、対照
の鎖（必ずしもそうではないが、概して野生型）に比較したＤＮＡ鎖の塩基配列
における変化を意味するために使用される。本明細書で使用される「突然変異」
の術語は「多型性」の術語または当該技術分野のその他の類似のもしくは同等な
術語すべてを含む。
呼ばれる。本出願の目的のためのＤＮＡ配列の変化はすべて、それらが否定的な
結果をもつか否かにかかわらず、本明細書において「突然変異」と定義される。
簡略化のために、「突然変異（mutaion）」の術語は本明細書においては、対照
の鎖（必ずしもそうではないが、概して野生型）に比較したＤＮＡ鎖の塩基配列
における変化を意味するために使用される。本明細書で使用される「突然変異」
の術語は「多型性」の術語または当該技術分野のその他の類似のもしくは同等な
術語すべてを含む。
【０００９】
二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）断片の分離及びＤＮＡ突然変異の検出
は医学、自然科学及び社会科学において、そして法医学研究において極めて重要
である。「ヒトゲノム計画（Human Genome Project）」は膨大な量の遺伝子情報
を提供し、突然変異とヒトの障害の間の相関の評価のための新規な情報を提供し
ている（Guyer,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:10841(1995)）。例えば、疾
病の究極的根源は野生型と異なる遺伝暗号により説明される（Cotton,TIG 13:43
(1997)）。疾病の遺伝的基礎の理解は治療の出発点であることができる。同様に
、遺伝暗号の相異の決定は進化及び集団の研究に力強いそして恐らく決定的な洞
察を提供することができる（Cooper,et.al.,Human Genetics vol.69:201(1985)
）。遺伝暗号化に関するこれらの争点の理解は野生型に比較したＤＮＡ断片の異
常、すなわち突然変異を識別する能力を要求する。
は医学、自然科学及び社会科学において、そして法医学研究において極めて重要
である。「ヒトゲノム計画（Human Genome Project）」は膨大な量の遺伝子情報
を提供し、突然変異とヒトの障害の間の相関の評価のための新規な情報を提供し
ている（Guyer,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:10841(1995)）。例えば、疾
病の究極的根源は野生型と異なる遺伝暗号により説明される（Cotton,TIG 13:43
(1997)）。疾病の遺伝的基礎の理解は治療の出発点であることができる。同様に
、遺伝暗号の相異の決定は進化及び集団の研究に力強いそして恐らく決定的な洞
察を提供することができる（Cooper,et.al.,Human Genetics vol.69:201(1985)
）。遺伝暗号化に関するこれらの争点の理解は野生型に比較したＤＮＡ断片の異
常、すなわち突然変異を識別する能力を要求する。
【００１０】
伝統的なクロマトグラフィーは「固定相」と「移動相」間に混合物の成分を分
配することに基づいた分離法である。固定相はセルロース、シリカゲル、コート
シリカゲル、ポリマービーズ、多糖類、等の粒子もしくは通路表面の形態の数々
の異なる物質を含んで成ることができる固体物質の表面により提供される。これ
らの物質はガラス板のような固体表面上に支持するかもしくはカラム中に充填す
ることができる。移動相は液体でも、ガスクロマトグラフィーにおける気体でも
よい。本発明は液体の移動相に関する。
配することに基づいた分離法である。固定相はセルロース、シリカゲル、コート
シリカゲル、ポリマービーズ、多糖類、等の粒子もしくは通路表面の形態の数々
の異なる物質を含んで成ることができる固体物質の表面により提供される。これ
らの物質はガラス板のような固体表面上に支持するかもしくはカラム中に充填す
ることができる。移動相は液体でも、ガスクロマトグラフィーにおける気体でも
よい。本発明は液体の移動相に関する。
【００１１】
分離の原理は概括的に、使用される物質、物質の形態、もしくは使用される機
器に関係なく、同一である。混合物の異なる成分は固定相中そして移動相中でそ
れぞれ異なる溶解度を有する。従って、移動相が固定相上を流動する時に、試料
の成分が固定相と移動相間で分配される平衡が存在する。移動相がカラム中を通
過する時に、平衡は、移動相の方向に恒常的に移動する。これは、平衡混合物が
常に新しい移動相をみて、新しい移動相中に分配するために起こる。移動相がカ
ラム中を運搬されると、移動相は新しい固定相をみて、固定相中に分配される。
最終的に、カラムの末端では、固定相はもはや存在せず、試料は単に移動相中に
入ってカラムを排出する。
器に関係なく、同一である。混合物の異なる成分は固定相中そして移動相中でそ
れぞれ異なる溶解度を有する。従って、移動相が固定相上を流動する時に、試料
の成分が固定相と移動相間で分配される平衡が存在する。移動相がカラム中を通
過する時に、平衡は、移動相の方向に恒常的に移動する。これは、平衡混合物が
常に新しい移動相をみて、新しい移動相中に分配するために起こる。移動相がカ
ラム中を運搬されると、移動相は新しい固定相をみて、固定相中に分配される。
最終的に、カラムの末端では、固定相はもはや存在せず、試料は単に移動相中に
入ってカラムを排出する。
【００１２】
混合物成分の分離は、混合物成分が、僅かに異なる、固定相に対する親和性及
び／もしくは移動相に対する溶解度をもち、従って異なる分配平衡値をもつため
に起こる。従って、混合物成分は異なる速度でカラムを通過する。
び／もしくは移動相に対する溶解度をもち、従って異なる分配平衡値をもつため
に起こる。従って、混合物成分は異なる速度でカラムを通過する。
【００１３】
伝統的液体クロマトグラフィーにおいては、ガラスカラムに固定相粒子を充填
し、そして移動相がカラムを通過し、重力によってのみ引かれる。しかし、より
小さい固定相粒子をカラム中に使用する時には、重力の引力のみでは移動相にカ
ラムを通過させるのには不十分である。その代わりに、圧力をかけなければなら
ない。しかし、ガラスのカラムは約２００ｐｓｉに耐えるのみである。５ミクロ
ンの粒子を充填されたカラムに移動相を通過させることは約２０００ｐｓｉ以上
の圧力をカラムにかける必要がある。５〜１０ミクロンの粒子が今日標準である
。５ミクロン未満の粒子は、特に困難な分離物もしくはある特別な場合に使用さ
れる。この方法は、「高速液体クロマトグラフィー」の術語もしくはＨＰＬＣと
呼ばれる。
し、そして移動相がカラムを通過し、重力によってのみ引かれる。しかし、より
小さい固定相粒子をカラム中に使用する時には、重力の引力のみでは移動相にカ
ラムを通過させるのには不十分である。その代わりに、圧力をかけなければなら
ない。しかし、ガラスのカラムは約２００ｐｓｉに耐えるのみである。５ミクロ
ンの粒子を充填されたカラムに移動相を通過させることは約２０００ｐｓｉ以上
の圧力をカラムにかける必要がある。５〜１０ミクロンの粒子が今日標準である
。５ミクロン未満の粒子は、特に困難な分離物もしくはある特別な場合に使用さ
れる。この方法は、「高速液体クロマトグラフィー」の術語もしくはＨＰＬＣと
呼ばれる。
【００１４】
ＨＰＬＣは大粒の重力によるカラムにより可能なものよりも、より広範な化学
構造物を分離するために使用される、ずっとより多様な種類の粒子の使用を可能
にした。しかし、それでも分離の原則は同じである。
構造物を分離するために使用される、ずっとより多様な種類の粒子の使用を可能
にした。しかし、それでも分離の原則は同じである。
【００１５】
ＨＰＬＣ−に基づいたイオンマッチドクロマトグラフィー法が最近、二本鎖ポ
リヌクレオチド全般そしてとりわけＤＮＡ混合物を有効に分離するために紹介さ
れ、そこでは分離物が塩基対の長さに基づいている（Bonn（1996）に対する米国
特許第５，５８５，２３６号明細書、Huber,et al.,Chromatographia 37:653(19
93)、Huber, et al.,Anal.Biochem. 212:351(1993)）。これらの引用文献及びそ
の中に含まれた文献はそれら全体を本明細書に取り込まれている。分離の機序が
伝統的分配よりむしろ分離物表面からのＤＮＡの結合及び放出に基づいているこ
とが見いだされたので、本明細書ではマッチドイオンポリヌクレオチドクロマト
グラフィー（ＭＩＰＣ）の術語が定義され、本法に適用される。ＭＩＰＣは塩基
対の長さに基づいてＤＮＡ断片を分離し、ゲルに基づいた分離法と関連した欠点
により制約されない。
リヌクレオチド全般そしてとりわけＤＮＡ混合物を有効に分離するために紹介さ
れ、そこでは分離物が塩基対の長さに基づいている（Bonn（1996）に対する米国
特許第５，５８５，２３６号明細書、Huber,et al.,Chromatographia 37:653(19
93)、Huber, et al.,Anal.Biochem. 212:351(1993)）。これらの引用文献及びそ
の中に含まれた文献はそれら全体を本明細書に取り込まれている。分離の機序が
伝統的分配よりむしろ分離物表面からのＤＮＡの結合及び放出に基づいているこ
とが見いだされたので、本明細書ではマッチドイオンポリヌクレオチドクロマト
グラフィー（ＭＩＰＣ）の術語が定義され、本法に適用される。ＭＩＰＣは塩基
対の長さに基づいてＤＮＡ断片を分離し、ゲルに基づいた分離法と関連した欠点
により制約されない。
【００１６】
本明細書で使用されるマッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーは
非極性の分離媒体を使用する、一本及び二本鎖のポリヌクレオチドを分離するた
めの方法と定義され、そこで、その方法は対イオン剤及び分離媒体からポリヌク
レオチドを遊離するために有機溶媒を使用する。ＭＩＰＣ分離は１０分未満で完
了することができ、５分未満で完了することも多い。
非極性の分離媒体を使用する、一本及び二本鎖のポリヌクレオチドを分離するた
めの方法と定義され、そこで、その方法は対イオン剤及び分離媒体からポリヌク
レオチドを遊離するために有機溶媒を使用する。ＭＩＰＣ分離は１０分未満で完
了することができ、５分未満で完了することも多い。
【００１７】
ＭＩＰＣ分離法は、液体がカラムを通過する時の移動相と固定相間の一連の平
衡分離によりその分離が達成されない点で、伝統的ＨＰＬＣ分離法とは異なる。
その代わりに、試料ｄｓＤＮＡを分離媒体の表面に結合させる溶媒の強度を使用
して、カラム中に試料を供給する。特定の塩基対の長さの鎖が固定相の表面から
除去されて、特定の溶媒濃度によりカラム中を運ばれる。試料中に増加勾配の溶
媒を通過させることにより、継続的により長い塩基対が連続的に除去されて、カ
ラム中を通過させられる。
衡分離によりその分離が達成されない点で、伝統的ＨＰＬＣ分離法とは異なる。
その代わりに、試料ｄｓＤＮＡを分離媒体の表面に結合させる溶媒の強度を使用
して、カラム中に試料を供給する。特定の塩基対の長さの鎖が固定相の表面から
除去されて、特定の溶媒濃度によりカラム中を運ばれる。試料中に増加勾配の溶
媒を通過させることにより、継続的により長い塩基対が連続的に除去されて、カ
ラム中を通過させられる。
【００１８】
Bonnに対する米国特許第５，５８５，２３６号、Oefnerに対する第５，７９５
，９７６号及び１９９８年１０月３０日出願のGjerdeに対する米国特許出願第０
９／１８３，１２３号、及び１９９８年１０月３０日出願のGjerdeに対する同第
０９／１８３，４５０号明細書のようなＭＩＰＣの使用の記載は、約１０００〜
２０００未満の塩基対の長さをもつｄｓＤＮＡの分離を開示している。当該技術
に受け入れられるＤＮＡの長さの範囲の上限は例えばクローン法で日常的に使用
されるような２０００ｂｐより大きい断片の精製におけるＭＩＰＣの使用を妨げ
ていた。
，９７６号及び１９９８年１０月３０日出願のGjerdeに対する米国特許出願第０
９／１８３，１２３号、及び１９９８年１０月３０日出願のGjerdeに対する同第
０９／１８３，４５０号明細書のようなＭＩＰＣの使用の記載は、約１０００〜
２０００未満の塩基対の長さをもつｄｓＤＮＡの分離を開示している。当該技術
に受け入れられるＤＮＡの長さの範囲の上限は例えばクローン法で日常的に使用
されるような２０００ｂｐより大きい断片の精製におけるＭＩＰＣの使用を妨げ
ていた。
【００１９】
突然変異を検出する信頼性のある方法は、野生型の株を含む試料中の想像の突
然変異株の雑種形成による（Lehman,et al.,Meth.Enzymol.,155:482(1987)。突
然変異株が存在する時は、ハイブリッド形成法の結果として、２個のホモ二量体
及び２個のヘテロ二量体が形成されるであろう。従って、ホモ二量体からのヘテ
ロ二量体の分離は試料中の突然変異ＤＮＡ片の存在もしくは不在を確認する直接
的方法を提供する。
然変異株の雑種形成による（Lehman,et al.,Meth.Enzymol.,155:482(1987)。突
然変異株が存在する時は、ハイブリッド形成法の結果として、２個のホモ二量体
及び２個のヘテロ二量体が形成されるであろう。従って、ホモ二量体からのヘテ
ロ二量体の分離は試料中の突然変異ＤＮＡ片の存在もしくは不在を確認する直接
的方法を提供する。
【００２０】
ＭＩＰＣの使用及び理解が進展するに従って、ＭＩＰＣ分析を部分的変性温度
、すなわち、不適正塩基対部位でヘテロ二量体を変性させるのに十分な温度で実
施される時に、ホモ二量体は同一の塩基対の長さをもつヘテロ二量体から分離す
ることができるであろうことが発見された（米国特許第５，７９５，９７６号明
細書、Hayward-Lester, et al., Genome Research 5:494(1995)、Underhill, et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:193(1996)、 Doris,et al.,DHPLC Workshop,St
anford University,(1997)）。これらの文献及びその中に含まれた文献はその全
体を本明細書中に取り込まれている。従って、「変性ＨＰＬＣ（ＤＨＰＬＣ）」
の使用は突然変異検出に適用された（Underhill, et al., Genome Research 7:9
96(1997)、Liu, et al., Nucleic Acid Res., 26;1396(1998)）。
、すなわち、不適正塩基対部位でヘテロ二量体を変性させるのに十分な温度で実
施される時に、ホモ二量体は同一の塩基対の長さをもつヘテロ二量体から分離す
ることができるであろうことが発見された（米国特許第５，７９５，９７６号明
細書、Hayward-Lester, et al., Genome Research 5:494(1995)、Underhill, et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:193(1996)、 Doris,et al.,DHPLC Workshop,St
anford University,(1997)）。これらの文献及びその中に含まれた文献はその全
体を本明細書中に取り込まれている。従って、「変性ＨＰＬＣ（ＤＨＰＬＣ）」
の使用は突然変異検出に適用された（Underhill, et al., Genome Research 7:9
96(1997)、Liu, et al., Nucleic Acid Res., 26;1396(1998)）。
【００２１】
突然変異検出においてホモ二量体からヘテロ二量体を分離するために使用され
た部分的変性条件下におけるマッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィ
ー（ＭＩＰＣ）の適用は以後ＤＭＩＰＣと呼ぶ。ＤＭＩＰＣにおいては、移動相
及び固定相の両方を部分的変性温度、すなわち、ヘテロ二量体鎖の突然変異部位
に存在する不適正マッチドＤＮＡは変性するが、マッチドＤＮＡは二本鎖中に結
合したままであるであろう温度に維持するために、正確な温度制御が必要である
。
た部分的変性条件下におけるマッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィ
ー（ＭＩＰＣ）の適用は以後ＤＭＩＰＣと呼ぶ。ＤＭＩＰＣにおいては、移動相
及び固定相の両方を部分的変性温度、すなわち、ヘテロ二量体鎖の突然変異部位
に存在する不適正マッチドＤＮＡは変性するが、マッチドＤＮＡは二本鎖中に結
合したままであるであろう温度に維持するために、正確な温度制御が必要である
。
【００２２】
ハイブリッド形成法は２個のホモ二量体及び２個のヘテロ二量体を産生する。
理想的には、最適な温度においては、ＤＭＩＰＣ分析時に４個の明白なピークの
出現が認められる。ＤＭＩＰＣは１個の塩基対のような小さいものだけ異なるヘ
テロ二量体を分離することができる。しかし、幾つかの場合には、ホモ二量体及
びヘテロ二量体の分離物は十分に分離されない（例えば、Liu et al., Nucleic Acids Res . 26: 1369-1400(1998)により記載のような）。突然変異の存在は全く
見落とされることすらある。幾つかの突然変異分析においては、ＤＭＩＰＣ分析
において、２個のピークのみ、または一部分離した１個もしくは複数のピークが
認められる。２個のホモ二量体のピークが１個のピークとしてもしくは一部分離
したピークとして見え、そして２個のヘテロ二量体のピークが１個のピークもし
くは一部分離したピークとして見えるかも知れない。幾つかの場合には、部分的
変性条件下では、最初のピークの広がりのみが認められる。
理想的には、最適な温度においては、ＤＭＩＰＣ分析時に４個の明白なピークの
出現が認められる。ＤＭＩＰＣは１個の塩基対のような小さいものだけ異なるヘ
テロ二量体を分離することができる。しかし、幾つかの場合には、ホモ二量体及
びヘテロ二量体の分離物は十分に分離されない（例えば、Liu et al., Nucleic Acids Res . 26: 1369-1400(1998)により記載のような）。突然変異の存在は全く
見落とされることすらある。幾つかの突然変異分析においては、ＤＭＩＰＣ分析
において、２個のピークのみ、または一部分離した１個もしくは複数のピークが
認められる。２個のホモ二量体のピークが１個のピークとしてもしくは一部分離
したピークとして見え、そして２個のヘテロ二量体のピークが１個のピークもし
くは一部分離したピークとして見えるかも知れない。幾つかの場合には、部分的
変性条件下では、最初のピークの広がりのみが認められる。
【００２３】
ＭＩＰＣにより分離されたＤＮＡ断片の分離度を改善し、この方法により分離
することができる塩基対の範囲を広げる必要がある。更に、ＤＭＩＰＣを使用し
てヘテロ二量体及びホモ二量体ＤＮＡ断片の分離度を改善する必要もある。
することができる塩基対の範囲を広げる必要がある。更に、ＤＭＩＰＣを使用し
てヘテロ二量体及びホモ二量体ＤＮＡ断片の分離度を改善する必要もある。
【００２４】
（発明の要約）
ポリヌクレオチドの改善された分離を与え、約１０００より長い長さをもつポ
リヌクレオチドの分離を許し、そして部分的変性条件下でホモ二量体及びヘテロ
二量体ＤＮＡの改善した分離をもたらすＭＩＰＣ分離カラムを提供することが本
発明の目的である。
リヌクレオチドの分離を許し、そして部分的変性条件下でホモ二量体及びヘテロ
二量体ＤＮＡの改善した分離をもたらすＭＩＰＣ分離カラムを提供することが本
発明の目的である。
【００２５】
本発明は、一アスペクトにおいて、マッチドイオンポリヌクレオチドクロマト
グラフィー（ＭＩＰＣ）による二本鎖のＤＮＡ断片の混合物を分離するための改
善された分離カラムに関する。混合物は約１０００を越える塩基対の長さをもつ
断片を含む。カラムは約５ｍｍより大きいＩＤをもち、ポリマービーズを含むシ
リンダーを含む。ビーズは１〜１００ミクロンの平均直径をもち、未置換ポリマ
ービーズであるかもしくは、１〜１，０００，０００炭素をもつ炭化水素基で置
換されたポリマービーズである。好ましいビーズは、ＤＮＡと自由に結合できる
多価カチオンを実質的に含まないことを特徴とする。１つの態様においては、カ
ラムＩＤは約７ｍｍより大きい。もう１つの態様においては、カラムＩＤは約１
０ｍｍより大きい。更にもう１つの態様においては、カラムＩＤは約５０ｍｍよ
り大きい。更にもう１つの態様においては、カラムＩＤは約５ｍｍ〜約１ｍの範
囲にある。
グラフィー（ＭＩＰＣ）による二本鎖のＤＮＡ断片の混合物を分離するための改
善された分離カラムに関する。混合物は約１０００を越える塩基対の長さをもつ
断片を含む。カラムは約５ｍｍより大きいＩＤをもち、ポリマービーズを含むシ
リンダーを含む。ビーズは１〜１００ミクロンの平均直径をもち、未置換ポリマ
ービーズであるかもしくは、１〜１，０００，０００炭素をもつ炭化水素基で置
換されたポリマービーズである。好ましいビーズは、ＤＮＡと自由に結合できる
多価カチオンを実質的に含まないことを特徴とする。１つの態様においては、カ
ラムＩＤは約７ｍｍより大きい。もう１つの態様においては、カラムＩＤは約１
０ｍｍより大きい。更にもう１つの態様においては、カラムＩＤは約５０ｍｍよ
り大きい。更にもう１つの態様においては、カラムＩＤは約５ｍｍ〜約１ｍの範
囲にある。
【００２６】
もう１つのアスペクトにおいて本発明は、混合物が約１０００を越える塩基対
の長さをもつ断片を含む、ＭＩＰＣによる二本鎖のＤＮＡ断片の混合物を分離す
るための改善方法に関する。その方法は、（ａ）ＤＮＡ断片の溶液及び対イオン
試薬を分離ビーズに適用する第１段階を含む。ビーズは分離カラム内に保持され
ている。カラムは約５ｍｍより大きいＩＤを有する。ビーズは１〜１００ミクロ
ンの平均直径を有し、未置換ポリマービーズもしくは、１〜１，０００，０００
炭素をもつ炭化水素基で置換されたポリマービーズから成る。好ましいビーズは
ＤＮＡと自由に結合することができる多価カチオンを実質的に含まないという特
徴をもつ。段階（ｂ）は対イオン剤を含有する増加する有機成分濃度の溶離溶媒
の勾配で断片を溶離することを伴う。溶離期間中、断片の溶液及び溶離溶媒によ
り接触される表面はそれらからの多価金属カチオンを捕捉もしくは遊離しない物
質である。溶離はヘテロ二量体を少なくとも一部変性させるのに有効で、溶離が
ホモ二量体からのヘテロ二量体の分離をもたらすような条件下で実施される。こ
のアスペクトの一態様においては、カラムＩＤは約７ｍｍより大きい。もう一つ
の態様においては、カラムＩＤは約１０ｍｍより大きい。更にもう一つの態様に
おいては、カラムＩＤは約５０ｍｍより大きい。更にもう一つの態様においては
、カラムＩＤは約５ｍｍ〜約１ｍの範囲にある。
の長さをもつ断片を含む、ＭＩＰＣによる二本鎖のＤＮＡ断片の混合物を分離す
るための改善方法に関する。その方法は、（ａ）ＤＮＡ断片の溶液及び対イオン
試薬を分離ビーズに適用する第１段階を含む。ビーズは分離カラム内に保持され
ている。カラムは約５ｍｍより大きいＩＤを有する。ビーズは１〜１００ミクロ
ンの平均直径を有し、未置換ポリマービーズもしくは、１〜１，０００，０００
炭素をもつ炭化水素基で置換されたポリマービーズから成る。好ましいビーズは
ＤＮＡと自由に結合することができる多価カチオンを実質的に含まないという特
徴をもつ。段階（ｂ）は対イオン剤を含有する増加する有機成分濃度の溶離溶媒
の勾配で断片を溶離することを伴う。溶離期間中、断片の溶液及び溶離溶媒によ
り接触される表面はそれらからの多価金属カチオンを捕捉もしくは遊離しない物
質である。溶離はヘテロ二量体を少なくとも一部変性させるのに有効で、溶離が
ホモ二量体からのヘテロ二量体の分離をもたらすような条件下で実施される。こ
のアスペクトの一態様においては、カラムＩＤは約７ｍｍより大きい。もう一つ
の態様においては、カラムＩＤは約１０ｍｍより大きい。更にもう一つの態様に
おいては、カラムＩＤは約５０ｍｍより大きい。更にもう一つの態様においては
、カラムＩＤは約５ｍｍ〜約１ｍの範囲にある。
【００２７】
更にもう一つのアスペクトにおいて、本発明は混合物中のヘテロ二量体とホモ
二量体ＤＮＡ分子を分離する改良された方法に関する。当該方法は（ａ）断片の
溶液及び対イオン試薬を分離ビーズに適用する第１段階を含み、前記ビーズが約
５ｍｍより大きいＩＤをもつ分離カラム内に保持されている。ビーズは１〜１０
０ミクロンの平均直径をもつ。ビーズは未置換ポリマーのビーズもしくは、１〜
１，０００，０００炭素をもつ炭化水素基で置換されたポリマーのビーズである
。好ましいビーズはＤＮＡと自由に結合できる多価カチオンを実質的に含まない
ことを特徴とし、そこで前記カラムが約５ｍｍより大きいＩＤをもつ。段階（ｂ
）において、断片を、対イオン剤を含む、増加する有機成分の濃度の勾配溶離溶
媒で溶離する。溶離期間中に、断片の溶液及び溶離溶媒により接触されている面
は、それらからの多価金属カチオンを捕捉もしくは遊離しない物質である。溶離
はヘテロ二量体を少なくとも一部は変性するのに有効で、溶離がヘテロ二量体の
ホモ二量体からの分離をもたらす条件下で実施される。このアスペクトの一態様
において、カラムＩＤは約７ｍｍより大きい。もう一つの態様においては、カラ
ムＩＤは約１０ｍｍより大きい。更にもう一つの態様においては、カラムＩＤは
約５０ｍｍより大きい。更にもう一つの態様においては、カラムＩＤは約５ｍｍ
〜約１ｍの範囲内にある。
二量体ＤＮＡ分子を分離する改良された方法に関する。当該方法は（ａ）断片の
溶液及び対イオン試薬を分離ビーズに適用する第１段階を含み、前記ビーズが約
５ｍｍより大きいＩＤをもつ分離カラム内に保持されている。ビーズは１〜１０
０ミクロンの平均直径をもつ。ビーズは未置換ポリマーのビーズもしくは、１〜
１，０００，０００炭素をもつ炭化水素基で置換されたポリマーのビーズである
。好ましいビーズはＤＮＡと自由に結合できる多価カチオンを実質的に含まない
ことを特徴とし、そこで前記カラムが約５ｍｍより大きいＩＤをもつ。段階（ｂ
）において、断片を、対イオン剤を含む、増加する有機成分の濃度の勾配溶離溶
媒で溶離する。溶離期間中に、断片の溶液及び溶離溶媒により接触されている面
は、それらからの多価金属カチオンを捕捉もしくは遊離しない物質である。溶離
はヘテロ二量体を少なくとも一部は変性するのに有効で、溶離がヘテロ二量体の
ホモ二量体からの分離をもたらす条件下で実施される。このアスペクトの一態様
において、カラムＩＤは約７ｍｍより大きい。もう一つの態様においては、カラ
ムＩＤは約１０ｍｍより大きい。更にもう一つの態様においては、カラムＩＤは
約５０ｍｍより大きい。更にもう一つの態様においては、カラムＩＤは約５ｍｍ
〜約１ｍの範囲内にある。
【００２８】
更にもう一つのアスペクトにおいて、本発明は、変性マッチドイオンポリヌク
レオチドクロマトグラフィー（ＤＭＩＰＣ）により、混合物中のヘテロ二量体と
ホモ二量体ＤＮＡ分子を分離するための改良分離カラムに関する。混合物中のＤ
ＮＡ分子は等しい長さをもつ断片から成る。カラムは約５ｍｍより大きいＩＤを
もち、ポリマービーズを含むシリンダーを含む。ビーズは１〜１００ミクロンの
平均直径をもち、未置換ポリマービーズであるかもしくは、１〜１，０００，０
００炭素をもつ炭化水素基で置換されたポリマービーズである。好ましいビーズ
はＤＮＡと自由に結合することができる多価カチオンを実質的に含まないことを
特徴とする。一つの態様において、カラムＩＤは約７ｍｍより大きい。もう一つ
の態様において、カラムＩＤは約１０ｍｍより大きい。更にもう一つの態様にお
いて、カラムＩＤは約５０ｍｍより大きい。更にもう一つの態様において、カラ
ムＩＤは約５ｍｍ〜約１ｍの範囲内にある。
レオチドクロマトグラフィー（ＤＭＩＰＣ）により、混合物中のヘテロ二量体と
ホモ二量体ＤＮＡ分子を分離するための改良分離カラムに関する。混合物中のＤ
ＮＡ分子は等しい長さをもつ断片から成る。カラムは約５ｍｍより大きいＩＤを
もち、ポリマービーズを含むシリンダーを含む。ビーズは１〜１００ミクロンの
平均直径をもち、未置換ポリマービーズであるかもしくは、１〜１，０００，０
００炭素をもつ炭化水素基で置換されたポリマービーズである。好ましいビーズ
はＤＮＡと自由に結合することができる多価カチオンを実質的に含まないことを
特徴とする。一つの態様において、カラムＩＤは約７ｍｍより大きい。もう一つ
の態様において、カラムＩＤは約１０ｍｍより大きい。更にもう一つの態様にお
いて、カラムＩＤは約５０ｍｍより大きい。更にもう一つの態様において、カラ
ムＩＤは約５ｍｍ〜約１ｍの範囲内にある。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明は改良された分離カラムに関する。カラムは本明細書に記載されたとお
りのマッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー（ＭＩＰＣ）に使用す
ることができる。ＭＩＰＣシステムは、試料選択の自動化オプション、移動相の
勾配選択及び制御、カラム及び移動相の温度制御、並びに広範なＭＩＰＣ分離法
に対する断片の収集を提供する。以前の、係属、共同指定の米国特許もしくは特
許出願書（それぞれがその全体を本明細書中に引用により取り込まれている、米
国特許第５，７７２，８８９号、同第５，９９７，７４２号、同第５，９７２，
２２２号、同第５，９８６，０８５号明細書、１９９８年１０月３０日出願の米
国特許出願第０９／１８３，１２３号、１９９９年７月９日出願の同第０９／３
５０，７３７号、１９９８年５月１８日出願の同第０９／０８０，５４７号、１
９９９年５月２５日出願の同第０９／３１８，４０７号、１９９９年１２月２２
日出願の同第０９／４６９，５５１号明細書）に記載のように、ＭＩＰＣ分離法
はＤＮＡ断片のサイズに基づいた分離、突然変異の検出、ＤＮＡ断片の精製、Ｐ
ＣＲ法のモニター、及びその他の新規な方法を実施するために適用することがで
きる。
りのマッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー（ＭＩＰＣ）に使用す
ることができる。ＭＩＰＣシステムは、試料選択の自動化オプション、移動相の
勾配選択及び制御、カラム及び移動相の温度制御、並びに広範なＭＩＰＣ分離法
に対する断片の収集を提供する。以前の、係属、共同指定の米国特許もしくは特
許出願書（それぞれがその全体を本明細書中に引用により取り込まれている、米
国特許第５，７７２，８８９号、同第５，９９７，７４２号、同第５，９７２，
２２２号、同第５，９８６，０８５号明細書、１９９８年１０月３０日出願の米
国特許出願第０９／１８３，１２３号、１９９９年７月９日出願の同第０９／３
５０，７３７号、１９９８年５月１８日出願の同第０９／０８０，５４７号、１
９９９年５月２５日出願の同第０９／３１８，４０７号、１９９９年１２月２２
日出願の同第０９／４６９，５５１号明細書）に記載のように、ＭＩＰＣ分離法
はＤＮＡ断片のサイズに基づいた分離、突然変異の検出、ＤＮＡ断片の精製、Ｐ
ＣＲ法のモニター、及びその他の新規な方法を実施するために適用することがで
きる。
【００３０】
ポリヌクレオチドの術語は一つのリボース（もしくはデオキシリボース）から
もう１つにリン酸残基により結合された無限の数のヌクレオチドを含む直鎖状ポ
リマーと定義される。本発明は、二本もしくは一本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡの
分離に使用することができる。本発明の説明を簡単にするために、それに制約さ
れずに、二本鎖ＤＮＡの分離法は本明細書では例において説明され、すべてのポ
リヌクレオチドが本発明の範囲内に含まれることが意図されることが理解される
であろう。
もう１つにリン酸残基により結合された無限の数のヌクレオチドを含む直鎖状ポ
リマーと定義される。本発明は、二本もしくは一本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡの
分離に使用することができる。本発明の説明を簡単にするために、それに制約さ
れずに、二本鎖ＤＮＡの分離法は本明細書では例において説明され、すべてのポ
リヌクレオチドが本発明の範囲内に含まれることが意図されることが理解される
であろう。
【００３１】
図１は本発明の一態様に従うシステムのスキームのレイアウトである。移動相
を形成する、溶媒、対イオン及びその他の溶液のような溶液の貯蔵器として複数
の容器を使用することができる。例えば、容器２は対イオン剤（例えば、酢酸ト
リエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ））の水溶液のような移動相の水性成分を含む
ことができ、容器４は対イオン剤の水溶液及び有機（駆動）溶媒（例えばＴＥＡ
Ａ及びアセトニトリル）を含むことができる。補助液（例えば共溶媒）は容器６
中に保持することができる。これらの溶液を混合して、分離期間中の、移動相中
の有機溶媒の選択された濃度を達成する。これらの溶液の他の例は、本明細書の
「実施例」及び前記の共同指定特許中に提供されている。容器は、対イオン溶液
輸送配管８、溶媒溶液輸送配管１０及び、それらと連絡し、脱気装置１４に誘導
している補助液輸送配管１２のようなそれぞれの輸送配管を有する。
を形成する、溶媒、対イオン及びその他の溶液のような溶液の貯蔵器として複数
の容器を使用することができる。例えば、容器２は対イオン剤（例えば、酢酸ト
リエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ））の水溶液のような移動相の水性成分を含む
ことができ、容器４は対イオン剤の水溶液及び有機（駆動）溶媒（例えばＴＥＡ
Ａ及びアセトニトリル）を含むことができる。補助液（例えば共溶媒）は容器６
中に保持することができる。これらの溶液を混合して、分離期間中の、移動相中
の有機溶媒の選択された濃度を達成する。これらの溶液の他の例は、本明細書の
「実施例」及び前記の共同指定特許中に提供されている。容器は、対イオン溶液
輸送配管８、溶媒溶液輸送配管１０及び、それらと連絡し、脱気装置１４に誘導
している補助液輸送配管１２のようなそれぞれの輸送配管を有する。
【００３２】
脱気装置１４は溶解された気体を液体から除去する。適当な脱気装置の例はDe
gassit Model 6324である。溶解された酸素の除去は、その存在がシステムの構
成部品中の鉄もしくはその他の酸化可能な金属を酸化し、従って移動相液中に、
対応するカチオンを導入する危険性を増大するために、特に重要である。
gassit Model 6324である。溶解された酸素の除去は、その存在がシステムの構
成部品中の鉄もしくはその他の酸化可能な金属を酸化し、従って移動相液中に、
対応するカチオンを導入する危険性を増大するために、特に重要である。
【００３３】
カラム洗浄液も同様に、脱気装置１４に導き、それらと連絡している洗浄液輸
送導管１８を有する洗浄液容器１６中に含まれる。この態様においては、洗浄液
は、容器１６が脱気装置及び注入弁５４より上方に揚げられると、重力の圧力に
より流動することができる。あるいはまた、洗浄液の流れを達成するために、図
２に示したポンプ１１０を提供することができる。
送導管１８を有する洗浄液容器１６中に含まれる。この態様においては、洗浄液
は、容器１６が脱気装置及び注入弁５４より上方に揚げられると、重力の圧力に
より流動することができる。あるいはまた、洗浄液の流れを達成するために、図
２に示したポンプ１１０を提供することができる。
【００３４】
本発明のシステムは移動相の溶媒溶液及び水性成分の流量を制御する通常の移
動相流量制御手段を取り込んでいる。一態様において、移動相流量制御手段は、
それぞれ、下記のようにコンピューターの制御下で自動的開放制御装置を伴う、
１組の流量制御弁を含んで成る。もう１つの態様においては、移動装置流量制御
手段は、その流量設定が下記のようなコンピューター制御装置に反応性の１組の
ポンプを含んで成る。
動相流量制御手段を取り込んでいる。一態様において、移動相流量制御手段は、
それぞれ、下記のようにコンピューターの制御下で自動的開放制御装置を伴う、
１組の流量制御弁を含んで成る。もう１つの態様においては、移動装置流量制御
手段は、その流量設定が下記のようなコンピューター制御装置に反応性の１組の
ポンプを含んで成る。
【００３５】
図１に示したシステムは１組の流量制御弁を含む移動相流量制御手段の一態様
を利用している。脱気された対イオン溶液導管２０、脱気溶媒溶液導管２２、及
び脱気装置１４から誘導している脱気補助液導管２４はそれぞれ、水性成分比例
弁２６、溶媒溶液比例弁２８及び補助液比例弁３０と連絡する。これらの比例弁
のための目盛り（settings）が設定され、それと連結されたステップモーターの
ような弁作動装置により変更され、これらの弁作動装置が、更により詳細に下記
に説明される移動相流量制御ソフトウエアモジュールからの命令に反応して目盛
り（settings）の所望の設定を確立するように反応する。流量制御弁２６、２８
及び３０は移動相の溶媒溶液及び他の成分の流量を制御する移動相流量制御手段
の一態様を含んで成る。これらの弁の目盛りはインゼクター弁及び分離カラムを
通る液体（共溶媒、溶媒溶液、等）の比率を制御する。導管３２、３４及び３６
はそれぞれの比例弁２６、２８及び３０からポンプ３８の取り込み部分に導く。
を利用している。脱気された対イオン溶液導管２０、脱気溶媒溶液導管２２、及
び脱気装置１４から誘導している脱気補助液導管２４はそれぞれ、水性成分比例
弁２６、溶媒溶液比例弁２８及び補助液比例弁３０と連絡する。これらの比例弁
のための目盛り（settings）が設定され、それと連結されたステップモーターの
ような弁作動装置により変更され、これらの弁作動装置が、更により詳細に下記
に説明される移動相流量制御ソフトウエアモジュールからの命令に反応して目盛
り（settings）の所望の設定を確立するように反応する。流量制御弁２６、２８
及び３０は移動相の溶媒溶液及び他の成分の流量を制御する移動相流量制御手段
の一態様を含んで成る。これらの弁の目盛りはインゼクター弁及び分離カラムを
通る液体（共溶媒、溶媒溶液、等）の比率を制御する。導管３２、３４及び３６
はそれぞれの比例弁２６、２８及び３０からポンプ３８の取り込み部分に導く。
【００３６】
洗浄液輸送導管３１は洗浄液弁４０に導く。場合により使用される洗浄液導管
４２は弁４０から導き、ポンプ３８の入り口と連絡する。弁３３は導管４２を通
る流量を制御する。
４２は弁４０から導き、ポンプ３８の入り口と連絡する。弁３３は導管４２を通
る流量を制御する。
【００３７】
ＭＩＰＣによるサイズに基づくＤＮＡ分離は溶媒濃度の関数であるため、弁２
６、２８及び３０の開口部は、本システムの最も重要な部分の、移動相内の有機
溶媒と他の成分との相対的比率を正確に設定する。様々なＤＮＡ断片の分離法に
関連して説明されるように、時間の関数としての有機溶媒の勾配の傾きが分離法
期間中に変化し、最も臨界的な相は非常に正確な勾配、もしくは幾つかの方法に
対しては著しく正確なイソクラティックな（一定の溶媒濃度の）組成物を必要と
するかも知れない。弁２６、２８及び３０の設定（settings）は通常の弁制御装
置への信号により遠隔設定することができる通常の弁作動装置により確立される
。
６、２８及び３０の開口部は、本システムの最も重要な部分の、移動相内の有機
溶媒と他の成分との相対的比率を正確に設定する。様々なＤＮＡ断片の分離法に
関連して説明されるように、時間の関数としての有機溶媒の勾配の傾きが分離法
期間中に変化し、最も臨界的な相は非常に正確な勾配、もしくは幾つかの方法に
対しては著しく正確なイソクラティックな（一定の溶媒濃度の）組成物を必要と
するかも知れない。弁２６、２８及び３０の設定（settings）は通常の弁制御装
置への信号により遠隔設定することができる通常の弁作動装置により確立される
。
【００３８】
好ましい態様において、分離システムは３５で表されるコンピューター制御下
にある。コンピューターは、システムの作動期間中の適当な時間に、正確な流量
値に弁２６、２８及び３０の設定を確立するためのコンピューターに制御された
指示を提供する、米国特許出願第０９／４６９，５５１号明細書に記載のような
Instrument Control Software（機器制御ソフトウエア）を含む。
にある。コンピューターは、システムの作動期間中の適当な時間に、正確な流量
値に弁２６、２８及び３０の設定を確立するためのコンピューターに制御された
指示を提供する、米国特許出願第０９／４６９，５５１号明細書に記載のような
Instrument Control Software（機器制御ソフトウエア）を含む。
【００３９】
同様な方法で、本発明の「機器制御ソフトウエア」はポンプの閉／開状態及び
ポンプの圧力もしくは流速の設定のような、ポンプ３８の作動パラメーターを確
立するためのコンピューター制御指示を提供する。
ポンプの圧力もしくは流速の設定のような、ポンプ３８の作動パラメーターを確
立するためのコンピューター制御指示を提供する。
【００４０】
ポンプ流出導管４４はインラインのミキサー４６と連絡し、成分の完全な混合
のために、液体流にミキサー４６中を通過させる。混合された液体流出導管４８
はＤＮＡ断片の分離を妨げるであろう多価金属カチオン及びその他の汚染物を除
去するために混合液を処理するために、場合により使用される保護カラム５０と
連絡する。保護カラム５０は通常のイオン交換による多価金属カチオンの除去の
ためのナトリウムもしくは水素の形態のカチオン交換樹脂を含むことができる。
導管５２は保護カラムの出口及び洗浄液インゼクター弁５４の入り口と連絡する
。洗浄液供給導管５６は弁４０を洗浄液インゼクター弁５４と連結し、廃棄物出
口導管５８は廃棄口に導く。導管６０は弁５４から試料注入弁６２に導く。
のために、液体流にミキサー４６中を通過させる。混合された液体流出導管４８
はＤＮＡ断片の分離を妨げるであろう多価金属カチオン及びその他の汚染物を除
去するために混合液を処理するために、場合により使用される保護カラム５０と
連絡する。保護カラム５０は通常のイオン交換による多価金属カチオンの除去の
ためのナトリウムもしくは水素の形態のカチオン交換樹脂を含むことができる。
導管５２は保護カラムの出口及び洗浄液インゼクター弁５４の入り口と連絡する
。洗浄液供給導管５６は弁４０を洗浄液インゼクター弁５４と連結し、廃棄物出
口導管５８は廃棄口に導く。導管６０は弁５４から試料注入弁６２に導く。
【００４１】
試料アリクオート選択装置６４は試料導管６６を通って、インゼクター弁６２
に連絡する。廃棄物導管６８はインゼクター弁から導き、廃棄液を除去する。
に連絡する。廃棄物導管６８はインゼクター弁から導き、廃棄液を除去する。
【００４２】
インゼクター弁６２において、試料は導管６０から弁を通過している溶媒及び
キャリヤ液の流れ中に導入される。試料の導管７０はインゼクター弁６２の出口
及び空気浴オーブン７２中のカラムプレフィルター７４と連絡する。キャピラリ
ー配管コイル７６はプレフィルター７４及び分離カラム７８の入り口と連絡する
。キャピラリーコイル７６の伸長された長さが加熱されたオーブン空気からコイ
ルを通過する液体中への豊富な熱の通過を許して、液体を選択された温度の±０
．０５℃以内にもたらす。オーブン７２はプレフィルター７４、コイル７６及び
分離カラム７８のこの温度の均一性を確立する。
キャリヤ液の流れ中に導入される。試料の導管７０はインゼクター弁６２の出口
及び空気浴オーブン７２中のカラムプレフィルター７４と連絡する。キャピラリ
ー配管コイル７６はプレフィルター７４及び分離カラム７８の入り口と連絡する
。キャピラリーコイル７６の伸長された長さが加熱されたオーブン空気からコイ
ルを通過する液体中への豊富な熱の通過を許して、液体を選択された温度の±０
．０５℃以内にもたらす。オーブン７２はプレフィルター７４、コイル７６及び
分離カラム７８のこの温度の均一性を確立する。
【００４３】
分離カラム７８はＭＩＣＰ法により対−イオンの存在におけるＤＮＡ断片のサ
イズ−に基づいた分離をもたらす独特な分離面をもつビーズを充填されている。
分離法並びにカラム及びビーズについての詳細は以下に詳細に説明される。塩基
対の長さのサイズにより−分離されたＤＮＡ断片を含む移動相の流れが分離カラ
ム７８から導管８０を通過する。
イズ−に基づいた分離をもたらす独特な分離面をもつビーズを充填されている。
分離法並びにカラム及びビーズについての詳細は以下に詳細に説明される。塩基
対の長さのサイズにより−分離されたＤＮＡ断片を含む移動相の流れが分離カラ
ム７８から導管８０を通過する。
【００４４】
導管８０は検出装置８４と連絡している。検出装置は液体の移動相中のＤＮＡ
断片構造物のＵＶ吸収を測定する通常のＵＶ吸収装置にすることができる。吸収
はテストされる液体中のＤＮＡ断片の濃度の関数である。
断片構造物のＵＶ吸収を測定する通常のＵＶ吸収装置にすることができる。吸収
はテストされる液体中のＤＮＡ断片の濃度の関数である。
【００４５】
あるいはまた、ＤＮＡが蛍光マーカーで標識される場合は、検出装置はそのマ
ーカーに最も適した周波数の発光レベルを検出することにより液体中の蛍光マー
カーのレベルを連続的に測定することができる蛍光検出装置にすることができる
。その中のＤＮＡ断片の濃度の関数である液体の特徴を連続的に測定することが
できるあらゆる検出システムが適当であり、本発明の範囲内にあることが意図さ
れていることは容易に明らかであろう。適した検出装置の例はHitachiから入手
できるL-7420 UV-Vis検出装置、及びL-7480蛍光検出装置を含む。検出装置から
の電気出力は好ましくはＡ／Ｄ変換器によりディジタル形態に変換されて、コン
ピュータ３５のディスクドライブのようなディジタル保存装置に標準ディジタル
フォーマットで記録される。導管８６は試験された液体を除去する。
ーカーに最も適した周波数の発光レベルを検出することにより液体中の蛍光マー
カーのレベルを連続的に測定することができる蛍光検出装置にすることができる
。その中のＤＮＡ断片の濃度の関数である液体の特徴を連続的に測定することが
できるあらゆる検出システムが適当であり、本発明の範囲内にあることが意図さ
れていることは容易に明らかであろう。適した検出装置の例はHitachiから入手
できるL-7420 UV-Vis検出装置、及びL-7480蛍光検出装置を含む。検出装置から
の電気出力は好ましくはＡ／Ｄ変換器によりディジタル形態に変換されて、コン
ピュータ３５のディスクドライブのようなディジタル保存装置に標準ディジタル
フォーマットで記録される。導管８６は試験された液体を除去する。
【００４６】
次いで、移動相は断片収集装置８８に通過し、そこで分離されたＤＮＡ画分を
含む移動相の選択された一部分を後の処理もしくは分析のためにバイアル中に収
集する。未収集画分は廃棄導管９０をとおって除去される。
含む移動相の選択された一部分を後の処理もしくは分析のためにバイアル中に収
集する。未収集画分は廃棄導管９０をとおって除去される。
【００４７】
ＤＮＡ分離法は多価カチオンの存在により損なわれる。前記説明において、液
体のフローシステムは導管の連続として説明されている。導管は液体中への多価
カチオンの導入を回避するように選択されたキャピラリー配管である。好ましい
キャピラリー配管材料はチタン及びＰＥＥＫである。同様な理由により、システ
ムの他の構成部品は好ましくは、それらを酸化から遮蔽し、液体中への多価カチ
オンの導入を妨げるために、チタンもしくはＰＥＥＫで製造されるかまたはＰＥ
ＥＫでコートした、液体に露出される表面をもつ。ステンレス鋼もまた、それが
すべての酸化された表面の物質を除去するように処理され、ステンレス鋼の表面
に接触する溶液が溶解された酸素を含まない場合には、使用することができる。
体のフローシステムは導管の連続として説明されている。導管は液体中への多価
カチオンの導入を回避するように選択されたキャピラリー配管である。好ましい
キャピラリー配管材料はチタン及びＰＥＥＫである。同様な理由により、システ
ムの他の構成部品は好ましくは、それらを酸化から遮蔽し、液体中への多価カチ
オンの導入を妨げるために、チタンもしくはＰＥＥＫで製造されるかまたはＰＥ
ＥＫでコートした、液体に露出される表面をもつ。ステンレス鋼もまた、それが
すべての酸化された表面の物質を除去するように処理され、ステンレス鋼の表面
に接触する溶液が溶解された酸素を含まない場合には、使用することができる。
【００４８】
移動相の流量の制御手段のもう１つの態様を示している図２は、移動相の組成
を確定するためのポンプシステムの部分スキーム図である。このシステムは、以
下に記載の溶液Ａ及びＢのような水性成分と溶媒溶液との比率を制御するための
比例ポンプに依存する。比例ポンプの入り口９２、９４及び９６はそれらそれぞ
れの供給導管９８、１００及び１０２により脱気装置１４と連絡し、そしてそれ
らそれぞれの排出導管１０４、１０６及び１０８によりインラインミキサー４６
と連絡している。これらの比例ポンプの運転速度はそれを通る流速に目盛り合わ
せされて、以下に更に詳細に説明される流量制御ソフトウエアモジュールにより
制御される。これら比例弁に対する設定は液体流速並びにインゼクター弁及び分
離カラムを通る液体（共溶媒、駆動溶媒、等）の比率を制御する。
を確定するためのポンプシステムの部分スキーム図である。このシステムは、以
下に記載の溶液Ａ及びＢのような水性成分と溶媒溶液との比率を制御するための
比例ポンプに依存する。比例ポンプの入り口９２、９４及び９６はそれらそれぞ
れの供給導管９８、１００及び１０２により脱気装置１４と連絡し、そしてそれ
らそれぞれの排出導管１０４、１０６及び１０８によりインラインミキサー４６
と連絡している。これらの比例ポンプの運転速度はそれを通る流速に目盛り合わ
せされて、以下に更に詳細に説明される流量制御ソフトウエアモジュールにより
制御される。これら比例弁に対する設定は液体流速並びにインゼクター弁及び分
離カラムを通る液体（共溶媒、駆動溶媒、等）の比率を制御する。
【００４９】
ポンプ１１０は場合により使用される導管１１２を通って洗浄液をシステムに
供給することができる。場合により使用される導管１０７は導管１１２から導き
、インラインミキサー４６と連絡している。弁１１１は導管１０７中の流れを制
御する。
供給することができる。場合により使用される導管１０７は導管１１２から導き
、インラインミキサー４６と連絡している。弁１１１は導管１０７中の流れを制
御する。
【００５０】
本発明における使用に適した移動相制御手段の例はHitachから入手可能なプロ
グラム可能な二重ピストンポンプModel L-7100及びWatersから入手可能なModel
2690 Separations Moduleを含む。
グラム可能な二重ピストンポンプModel L-7100及びWatersから入手可能なModel
2690 Separations Moduleを含む。
【００５１】
図３はＭＩＰＣシステムに使用される自動試料収集サブシステムのスキーム図
である。この自動試料収集装置は複数ウェル１１３中に支持された選択されたウ
ェルもしくはバイアル（例えば、ミクロ遠心分離管）から、前以て決められた容
量を含むアリクオートを取り出す。ミクロウェル板は、標準の９６ウェルのマル
チウェル板のような、各ウェルに対して正確なディメンションの位置をもつ、あ
らゆる前以て決められた数のウェル１１４をもつことができる。試料収集針１１
５は試料収集キャリッジ１１６上に支持されている。試料収集キャリッジ１１６
は垂直の支持体１１７上の垂直な移動のために設置された針支持体１１８を有す
る。垂直な支持体１１７はキャリッジ１１６上の横方向の移動のために設置され
ている。支持体１１７の横方向の移動が、選択されたウェルもしくは注入弁１２
０のインゼクター口１１９の上方に針を配置する。柔軟な配管１２３が片方の端
で針１１５と、そして他方の端でシリンジの針１２４と密閉嵌合で設置されてい
る。シリンジの針１２４はシリンジのシリンダー１２５の内部容量と連絡してい
る。ピストン１２６がシリンジのアクチュエーターロッド１２８上に設置され、
シリンダー１２５の内壁と密閉嵌合を形成する。操作中は、シリンジのアクチュ
エーターロッド１２８の垂直の上方への移動がシリンダー１２５内の液体を追い
出し、シリンジのアクチュエーターロッド１２８の垂直の下方への移動がシリン
ジ中に液体を吸引する。ロッド１２８はガイド素子１３２に沿った移動のために
支持されているクランプ１３０に取り付けられている。弁１２２が針１２４と配
管１２３との間の連絡をもたらすように配置されると、ピストン１２６の下方へ
の移動がウェル１１４から針１１５中に試料を吸引する。針１１５がインゼクタ
ー弁入り口１１９の上方に配置されると、ピストン１２６の上方への移動が針１
１５から入口１１９中に試料を排出する。
である。この自動試料収集装置は複数ウェル１１３中に支持された選択されたウ
ェルもしくはバイアル（例えば、ミクロ遠心分離管）から、前以て決められた容
量を含むアリクオートを取り出す。ミクロウェル板は、標準の９６ウェルのマル
チウェル板のような、各ウェルに対して正確なディメンションの位置をもつ、あ
らゆる前以て決められた数のウェル１１４をもつことができる。試料収集針１１
５は試料収集キャリッジ１１６上に支持されている。試料収集キャリッジ１１６
は垂直の支持体１１７上の垂直な移動のために設置された針支持体１１８を有す
る。垂直な支持体１１７はキャリッジ１１６上の横方向の移動のために設置され
ている。支持体１１７の横方向の移動が、選択されたウェルもしくは注入弁１２
０のインゼクター口１１９の上方に針を配置する。柔軟な配管１２３が片方の端
で針１１５と、そして他方の端でシリンジの針１２４と密閉嵌合で設置されてい
る。シリンジの針１２４はシリンジのシリンダー１２５の内部容量と連絡してい
る。ピストン１２６がシリンジのアクチュエーターロッド１２８上に設置され、
シリンダー１２５の内壁と密閉嵌合を形成する。操作中は、シリンジのアクチュ
エーターロッド１２８の垂直の上方への移動がシリンダー１２５内の液体を追い
出し、シリンジのアクチュエーターロッド１２８の垂直の下方への移動がシリン
ジ中に液体を吸引する。ロッド１２８はガイド素子１３２に沿った移動のために
支持されているクランプ１３０に取り付けられている。弁１２２が針１２４と配
管１２３との間の連絡をもたらすように配置されると、ピストン１２６の下方へ
の移動がウェル１１４から針１１５中に試料を吸引する。針１１５がインゼクタ
ー弁入り口１１９の上方に配置されると、ピストン１２６の上方への移動が針１
１５から入口１１９中に試料を排出する。
【００５２】
導管１３１は弁１２２から洗浄液貯水器１２１に伸長している。弁１２２が針
１２４と導管１３１との間の連絡を提供する位置にある時には、ピストン１２６
の下方への移動が洗浄液を針中に吸引する。針１１５がインゼクター口１１９の
上方に配置され、弁１２２が針１２４と導管１２３との間の連絡をもたらすよう
に配置される時には、ピストン１２６の上方への移動が洗浄液をインゼクター口
１１９中に排出させる。適した自動試料収集装置の例は、HITACHI Model L-7250
Programmable Autosampler（プログラム可能な自動試料収集装置）及びHTS PAL
High Throughout Autosampler（高速自動試料収集装置）(Shimadzu, Columbia,
MD）を含む。
１２４と導管１３１との間の連絡を提供する位置にある時には、ピストン１２６
の下方への移動が洗浄液を針中に吸引する。針１１５がインゼクター口１１９の
上方に配置され、弁１２２が針１２４と導管１２３との間の連絡をもたらすよう
に配置される時には、ピストン１２６の上方への移動が洗浄液をインゼクター口
１１９中に排出させる。適した自動試料収集装置の例は、HITACHI Model L-7250
Programmable Autosampler（プログラム可能な自動試料収集装置）及びHTS PAL
High Throughout Autosampler（高速自動試料収集装置）(Shimadzu, Columbia,
MD）を含む。
【００５３】
図４はＭＩＰＣシステムに使用のための試料注入弁及び洗浄液注入弁の構造を
示すスキーム図である。同様な弁構造物を試料注入及び洗浄液注入の両方に使用
することができる。注入弁１５０はステップモーター（図示されていない）のよ
うな通常の弁モーターにより作動される六口回転弁である。例示的な弁はRHEODY
NE(Cotati, CA)から入手可能なLabPRO弁を含む。弁は流入及び排出導管に恒久的
に連結された６個の外部の口を有する。外部の口１５２は分析される試料を受け
取るための注入ライン１５４と連結している。外部口１５６は分離カラム７８（
図１）と連絡しているカラム供給導管１５８と連結している。外部口１６０はポ
ンプ３８の出口（図１）と連絡している流入導管１６２と連結している。外部口
１６４は廃棄物導管１６６と連結している。相対する排出口１６８及び１７０は
試料ループ１７２の相対する試料流入口及び出口末端と連絡している。洗浄液の
注入時、弁は１塊の洗浄液を溶媒流中に注入して、注入部の下流の分離カラム及
びその他の構成部品を再生し、洗浄し、以前の分離物から残留している表面の蓄
積した残留物及びあらゆる残留ＤＮＡを除去する。
示すスキーム図である。同様な弁構造物を試料注入及び洗浄液注入の両方に使用
することができる。注入弁１５０はステップモーター（図示されていない）のよ
うな通常の弁モーターにより作動される六口回転弁である。例示的な弁はRHEODY
NE(Cotati, CA)から入手可能なLabPRO弁を含む。弁は流入及び排出導管に恒久的
に連結された６個の外部の口を有する。外部の口１５２は分析される試料を受け
取るための注入ライン１５４と連結している。外部口１５６は分離カラム７８（
図１）と連絡しているカラム供給導管１５８と連結している。外部口１６０はポ
ンプ３８の出口（図１）と連絡している流入導管１６２と連結している。外部口
１６４は廃棄物導管１６６と連結している。相対する排出口１６８及び１７０は
試料ループ１７２の相対する試料流入口及び出口末端と連絡している。洗浄液の
注入時、弁は１塊の洗浄液を溶媒流中に注入して、注入部の下流の分離カラム及
びその他の構成部品を再生し、洗浄し、以前の分離物から残留している表面の蓄
積した残留物及びあらゆる残留ＤＮＡを除去する。
【００５４】
図１の洗浄液インゼクター弁５４及び試料インゼクター弁６２における外部口
及び内部通路間の連結並びにそれらの操作は図５〜８に説明される。以下の説明
は試料注入弁６２につき提示されるが、注入される液体とそれらの源を除いて、
同様な関係及び操作が洗浄液注入弁に適用される。
及び内部通路間の連結並びにそれらの操作は図５〜８に説明される。以下の説明
は試料注入弁６２につき提示されるが、注入される液体とそれらの源を除いて、
同様な関係及び操作が洗浄液注入弁に適用される。
【００５５】
図５及び６は、より大量の試料（もしくは洗浄液）が注入される時に使用され
るモードの、充填されたループ注入のための弁の使用を説明する。図５は試料充
填位置にある注入弁のスキーム図であり、図６は注入位置にある注入弁のスキー
ム図である。図５に示した充填位置において、弁の第１の内部通路１７４はルー
プ１７２の第１の端１７６を試料注入ライン１５４と連結し、第２の内部通路１
７８はループ１７２の第２の端１８０を廃棄導管１６６と連結する。第３の内部
通路１８２はポンプの排出導管１６２を分離カラム７８への導管１５８と連結す
る。注入口１５４からの試料が通路１７４を通って試料ループ１７２中に導入さ
れる間に、ループ１７２中のあらゆる過剰物もしくは液体が通路１７８を通って
廃棄導管１６６に追い出される。同時に、移動相溶液がポンプ導管１６２から第
３の導管１８２を通って分離カラム７８に流動する。
るモードの、充填されたループ注入のための弁の使用を説明する。図５は試料充
填位置にある注入弁のスキーム図であり、図６は注入位置にある注入弁のスキー
ム図である。図５に示した充填位置において、弁の第１の内部通路１７４はルー
プ１７２の第１の端１７６を試料注入ライン１５４と連結し、第２の内部通路１
７８はループ１７２の第２の端１８０を廃棄導管１６６と連結する。第３の内部
通路１８２はポンプの排出導管１６２を分離カラム７８への導管１５８と連結す
る。注入口１５４からの試料が通路１７４を通って試料ループ１７２中に導入さ
れる間に、ループ１７２中のあらゆる過剰物もしくは液体が通路１７８を通って
廃棄導管１６６に追い出される。同時に、移動相溶液がポンプ導管１６２から第
３の導管１８２を通って分離カラム７８に流動する。
【００５６】
図６に示した注入位置への矢印１５０の方向への弁の回転は、内部通路を移動
させて、流入及び排出導管との異なる組み合わせの連結を設立する。通路１７９
はループ１７２の一方の端１８０を、分離カラムに導く導管１５８に連結し、通
路１７５はループ１７２の他方の端１７６を、ポンプに導く流入導管１６２と連
結する。ポンプからの移動相溶液は通路１７５に侵入して、ループ１７２を通過
して、カラムに導く導管１５８中に試料溶液を追い出し、ループを濯ぎ続けて、
あらゆる残留物をカラム導管１５８中に運ぶ。その間、通路１８３は試料注入導
管１５４を廃棄口に連結して、所望される場合は通路１８３中への洗浄液の通過
を許す。この方法は、液体が分離カラムに到達する前にそれがプレフィルター７
４及び温度制御コイル７６を通過することにより、分離カラム７８（図１）に導
く導管中への測定された容量の試料溶液の信頼できる注入をもたらす。
させて、流入及び排出導管との異なる組み合わせの連結を設立する。通路１７９
はループ１７２の一方の端１８０を、分離カラムに導く導管１５８に連結し、通
路１７５はループ１７２の他方の端１７６を、ポンプに導く流入導管１６２と連
結する。ポンプからの移動相溶液は通路１７５に侵入して、ループ１７２を通過
して、カラムに導く導管１５８中に試料溶液を追い出し、ループを濯ぎ続けて、
あらゆる残留物をカラム導管１５８中に運ぶ。その間、通路１８３は試料注入導
管１５４を廃棄口に連結して、所望される場合は通路１８３中への洗浄液の通過
を許す。この方法は、液体が分離カラムに到達する前にそれがプレフィルター７
４及び温度制御コイル７６を通過することにより、分離カラム７８（図１）に導
く導管中への測定された容量の試料溶液の信頼できる注入をもたらす。
【００５７】
本発明のシステムは分離カラム及びカラムに侵入する移動相の温度を制御する
ためのオーブン温度制御手段を取り込んでいる。
ためのオーブン温度制御手段を取り込んでいる。
【００５８】
図９及び１０は温度制御手段の一態様を示す。図９はＨＰＬＣ ＤＮＡ分析装
置カラムオーブンの処理室の正面図であり、図１０は図９に示したＨＰＬＣ Ｄ
ＮＡ分析装置のカラムオーブンの上面図である。図９及び１０に示した態様の処
理室は、その中に排気口２０２が配置されている後壁２００により加熱室から分
離されている。入口を通過する空気温度を測定するために、熱電対もしくはサー
ミスターのような温度センサーを包含している金属棒２０４が、入口２０２中に
配置されている。キャピラリー配管２０６は試料インゼクター（図示されていな
い）からプレフィルター２０８に導く。プレフィルター２０８は侵入してくる液
体から汚染物を取り除く、米国特許第５，７７２，８８９号明細書に記載のよう
なインラインのフィルターもしくは遮蔽カートリッジである。キャピラリー配管
の細長いコイル２１０は、それから移動相液を受け取るためにプレフィルター２
０８と連絡している流入端を有する。細長いコイル２１０は分離カラム２１４の
流入端２１２と連絡している流出端を有する。分離カラム２１４は好ましくは、
ＭＩＰＣ分離媒体を含む。流出配管２１６は分離カラム２１４の流出端２１８か
ら検出装置８４（図１）に導く。コイル２１０はチタンもしくはＰＥＥＫのよう
なＤＮＡ相容性の、多価カチオンを含まない配管から製造された液体加熱用コイ
ルである。使用される配管の長さ及び直径は処理室内の空気の平衡温度に到達す
るために液体の移動相をそこを通過させることができるのに十分なあらゆる長さ
である。６〜４００ｃｍの配管長さ及び０．１５〜０．４ｍｍの配管ＩＤで通常
十分である。配管２１０の長さがシステムにより達成された成分の分離を妨げな
いので、その長さは処理液の有効な加熱を達成するのに要する長さに基づいて選
択することができる。
置カラムオーブンの処理室の正面図であり、図１０は図９に示したＨＰＬＣ Ｄ
ＮＡ分析装置のカラムオーブンの上面図である。図９及び１０に示した態様の処
理室は、その中に排気口２０２が配置されている後壁２００により加熱室から分
離されている。入口を通過する空気温度を測定するために、熱電対もしくはサー
ミスターのような温度センサーを包含している金属棒２０４が、入口２０２中に
配置されている。キャピラリー配管２０６は試料インゼクター（図示されていな
い）からプレフィルター２０８に導く。プレフィルター２０８は侵入してくる液
体から汚染物を取り除く、米国特許第５，７７２，８８９号明細書に記載のよう
なインラインのフィルターもしくは遮蔽カートリッジである。キャピラリー配管
の細長いコイル２１０は、それから移動相液を受け取るためにプレフィルター２
０８と連絡している流入端を有する。細長いコイル２１０は分離カラム２１４の
流入端２１２と連絡している流出端を有する。分離カラム２１４は好ましくは、
ＭＩＰＣ分離媒体を含む。流出配管２１６は分離カラム２１４の流出端２１８か
ら検出装置８４（図１）に導く。コイル２１０はチタンもしくはＰＥＥＫのよう
なＤＮＡ相容性の、多価カチオンを含まない配管から製造された液体加熱用コイ
ルである。使用される配管の長さ及び直径は処理室内の空気の平衡温度に到達す
るために液体の移動相をそこを通過させることができるのに十分なあらゆる長さ
である。６〜４００ｃｍの配管長さ及び０．１５〜０．４ｍｍの配管ＩＤで通常
十分である。配管２１０の長さがシステムにより達成された成分の分離を妨げな
いので、その長さは処理液の有効な加熱を達成するのに要する長さに基づいて選
択することができる。
【００５９】
図１０において、処理室２２０からの空気は温度調節のための加熱装置／ファ
ンシステム２２２をとおって、壁２００の開口部２０２を通過する。加熱室２２
４により受納された調節空気は側壁２２７と外側オーブン壁２２８との間の隙間
により区画された通路２２６に沿って処理室２２０に戻して再利用される。図９
及び１０に示した態様における加熱コイルは±０．２℃の範囲内の温度精度を提
供し、５℃の温度変化に対して５分未満に、そして１℃までの温度変化に対して
２分未満に、温度設定目盛り間の温度平衡時間を減少させる。
ンシステム２２２をとおって、壁２００の開口部２０２を通過する。加熱室２２
４により受納された調節空気は側壁２２７と外側オーブン壁２２８との間の隙間
により区画された通路２２６に沿って処理室２２０に戻して再利用される。図９
及び１０に示した態様における加熱コイルは±０．２℃の範囲内の温度精度を提
供し、５℃の温度変化に対して５分未満に、そして１℃までの温度変化に対して
２分未満に、温度設定目盛り間の温度平衡時間を減少させる。
【００６０】
図１１及び１２は温度制御手段のもう一つの態様を示す。図１１は小型カラム
ヒーターの末端図であり、図１２は図１１の線Ａ−Ａに沿って採られた断面図で
ある。この態様は温度変化及び精度を達成するためにシステムの構成部品（comp
onents）へのそしてそれらからの熱の金属から金属への直接的伝導に依存し、空
気浴によらない。所望の場合には、それは１本カラムに対して使用することがで
きるであろうが、この態様は２本のカラムシステムにつき示されている。それは
システムの構成部品を収納できるサイズ及び形状をもつ受け入れ容器（receptac
le）をもつ熱伝導性ブロック（２３０、２３２）を含んで成る。フィルターの隙
間、もしくはプレフィルター受け入れ容器（２３４、２３６）はプレフィルター
（２３８、２４０）を受け入れるサイズをもつ内面をもち、その外面と熱移動接
触を確立する。分離カラム受け入れ容器（２４２、２４４）は、それぞれの分離
カラム（２４６、２４８）及び、キャピラリー配管をそれぞれの分離カラムに連
結する分離カラムカプラー（２５０）（その一つは図１２に示す）を受け入れる
サイズの内面をもつ。受け入れ容器（２４２、２４４）はブロック（２３０、２
４２）の内部熱移動面とその中に受け入れた分離カラムの構成部品との間の熱移
動接触を確立するようなサイズ及び形状をもつ。キャピラリーコイル受け入れ容
器（２５２）（一つは図１２に示す）はキャピラリー配管２５４（一つは図１２
に示す）のコイルを受け入れ、その外面と熱移動接触を確立する形状の内面をも
つ。これらの図面に示した態様において、受け入れ容器（２３４、２３６）及び
（２４２、２４４）は共通の面上に横たわるほぼ平行な中心軸をもつ円筒形の穴
にすることができる。他の形態も同様に適切であり、すべての形態が本発明の範
囲内にあると考えられることは当業者には容易に明らかであろう。
ヒーターの末端図であり、図１２は図１１の線Ａ−Ａに沿って採られた断面図で
ある。この態様は温度変化及び精度を達成するためにシステムの構成部品（comp
onents）へのそしてそれらからの熱の金属から金属への直接的伝導に依存し、空
気浴によらない。所望の場合には、それは１本カラムに対して使用することがで
きるであろうが、この態様は２本のカラムシステムにつき示されている。それは
システムの構成部品を収納できるサイズ及び形状をもつ受け入れ容器（receptac
le）をもつ熱伝導性ブロック（２３０、２３２）を含んで成る。フィルターの隙
間、もしくはプレフィルター受け入れ容器（２３４、２３６）はプレフィルター
（２３８、２４０）を受け入れるサイズをもつ内面をもち、その外面と熱移動接
触を確立する。分離カラム受け入れ容器（２４２、２４４）は、それぞれの分離
カラム（２４６、２４８）及び、キャピラリー配管をそれぞれの分離カラムに連
結する分離カラムカプラー（２５０）（その一つは図１２に示す）を受け入れる
サイズの内面をもつ。受け入れ容器（２４２、２４４）はブロック（２３０、２
４２）の内部熱移動面とその中に受け入れた分離カラムの構成部品との間の熱移
動接触を確立するようなサイズ及び形状をもつ。キャピラリーコイル受け入れ容
器（２５２）（一つは図１２に示す）はキャピラリー配管２５４（一つは図１２
に示す）のコイルを受け入れ、その外面と熱移動接触を確立する形状の内面をも
つ。これらの図面に示した態様において、受け入れ容器（２３４、２３６）及び
（２４２、２４４）は共通の面上に横たわるほぼ平行な中心軸をもつ円筒形の穴
にすることができる。他の形態も同様に適切であり、すべての形態が本発明の範
囲内にあると考えられることは当業者には容易に明らかであろう。
【００６１】
温度センサー受け入れ容器（２５６、２５８）は熱伝導ブロック（２３０、２
３２）中に提供されている。熱伝導関係にある連結配管２６２を受納するための
キャピラリー容器の通路２６０もまた、熱伝導ブロック（２３０、２３２）中に
提供されている。キャピラリーコイル容器２５２は本図では受け入れ容器（２３
４、２３６）及び（２４２、２４４）の軸に垂直なそれらの軸をもつ円筒形の内
腔であるように示されている。場合によっては、金属ブロックの加熱アセンブリ
ーとコイル中の液体との間の熱移動面積を増加させるために、伝導性金属円筒（
図示されていない）をその内面と熱伝導的接触しているキャピラリーコイル内に
配置することができる。熱を熱伝導ブロックに移動させるために、KAPTON抵抗ヒ
ーターもしくはその他の型の加熱ユニット２６４を加熱ブロック（２３０、２３
２）の面２６６と２６８の間にそしてそれらと熱伝導接触性に配置している。ヒ
ートシンク（heat sinks）（２７０、２７２）は、それから熱を除去するために
熱伝導ブロック（２３０、２３２）の向かい合った冷却面（２７４、２７６）と
熱伝導関係に配置されている。冷却ファン２７８及び２８０はヒートシンク２７
０及び２７２と熱除去関係にあり、それからの熱除去を加速するように作動され
る。
３２）中に提供されている。熱伝導関係にある連結配管２６２を受納するための
キャピラリー容器の通路２６０もまた、熱伝導ブロック（２３０、２３２）中に
提供されている。キャピラリーコイル容器２５２は本図では受け入れ容器（２３
４、２３６）及び（２４２、２４４）の軸に垂直なそれらの軸をもつ円筒形の内
腔であるように示されている。場合によっては、金属ブロックの加熱アセンブリ
ーとコイル中の液体との間の熱移動面積を増加させるために、伝導性金属円筒（
図示されていない）をその内面と熱伝導的接触しているキャピラリーコイル内に
配置することができる。熱を熱伝導ブロックに移動させるために、KAPTON抵抗ヒ
ーターもしくはその他の型の加熱ユニット２６４を加熱ブロック（２３０、２３
２）の面２６６と２６８の間にそしてそれらと熱伝導接触性に配置している。ヒ
ートシンク（heat sinks）（２７０、２７２）は、それから熱を除去するために
熱伝導ブロック（２３０、２３２）の向かい合った冷却面（２７４、２７６）と
熱伝導関係に配置されている。冷却ファン２７８及び２８０はヒートシンク２７
０及び２７２と熱除去関係にあり、それからの熱除去を加速するように作動され
る。
【００６２】
熱伝導ブロック２３０及び２３２、並びにヒートシンク２７０及び２７２は、
鉄金属のような他の熱伝導性の固体もしくは、不可欠な熱伝導性をもつあらゆる
他の固体物質から製造することができるが、それらはアルミナムもしくは銅のよ
うな高い熱伝導度をもつ物質から製造される。熱パイプもまたヒートシンクとし
て使用することができる。
鉄金属のような他の熱伝導性の固体もしくは、不可欠な熱伝導性をもつあらゆる
他の固体物質から製造することができるが、それらはアルミナムもしくは銅のよ
うな高い熱伝導度をもつ物質から製造される。熱パイプもまたヒートシンクとし
て使用することができる。
【００６３】
最大熱移動効率のためにはチタンが好ましいが、キャピラリー配管はＰＥＥＫ
もしくはチタンから製造することができる。この改良された熱移動により、キャ
ピラリーコイルは１０ｃｍの最小のコイル長さが好ましいが、５ｃｍのような短
い完全伸長長さをもつことができる。チタンキャピラリー配管と同様な熱移動を
達成するためには、ＰＥＥＫ配管では、より長いコイルが要求されるであろう。
もしくはチタンから製造することができる。この改良された熱移動により、キャ
ピラリーコイルは１０ｃｍの最小のコイル長さが好ましいが、５ｃｍのような短
い完全伸長長さをもつことができる。チタンキャピラリー配管と同様な熱移動を
達成するためには、ＰＥＥＫ配管では、より長いコイルが要求されるであろう。
【００６４】
図１１及び１２に示したシステムは鏡像関係にある２種類のシステムを含んで
成る。１本のカラムに対しては、システムの半分で十分で、本発明の範囲内に含
まれることが意図されることは容易に明白であろう。容器の位置、配列及び間隔
は本発明の重要な特徴物ではない。小型の、熱移動効率のよい結果をもたらすあ
らゆる配列及び形態が本発明の範囲内に含まれることが意図される。
成る。１本のカラムに対しては、システムの半分で十分で、本発明の範囲内に含
まれることが意図されることは容易に明白であろう。容器の位置、配列及び間隔
は本発明の重要な特徴物ではない。小型の、熱移動効率のよい結果をもたらすあ
らゆる配列及び形態が本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【００６５】
図１１及び１２に示した態様はヒーター制御装置に対して、より反応性の小型
のヒーターを提供し、１つの温度プラットホームからもう１つのものへの早急な
変化をもたらし、そして設定温度の±０．５℃以内の温度精度を維持する。加熱
ブロックと加熱される素子との間の金属対金属の接触で得た熱移動速度は空気浴
システム中で得ることができるものよりもずっと大きく、変化した温度へのより
早急な反応及びより大きな温度精度をもたらす。それはまた、より短いキャピラ
リー配管コイルによる工程液温度の調整を可能にする。
のヒーターを提供し、１つの温度プラットホームからもう１つのものへの早急な
変化をもたらし、そして設定温度の±０．５℃以内の温度精度を維持する。加熱
ブロックと加熱される素子との間の金属対金属の接触で得た熱移動速度は空気浴
システム中で得ることができるものよりもずっと大きく、変化した温度へのより
早急な反応及びより大きな温度精度をもたらす。それはまた、より短いキャピラ
リー配管コイルによる工程液温度の調整を可能にする。
【００６６】
温度制御手段の更にもう一つの図において、図１３は好ましいペルチエ（Pelt
ier）加熱装置／冷却装置の態様のスキーム図を示す。加熱ブロック２８２は所
望の温度に到達し、維持するために要する加熱もしくは冷却のためのペルチエ加
熱素子（図示されていない）と伝導的に接触している。チャンネル２８４はプレ
フィルター２８８と熱伝導関係にある内面２８６をもつプレフィルター受容器で
ある。チャンネル２９０はカラム並びに、カプラー２９４及び、分離カラム２９
８の末端ナット素子２９６と熱伝導関係にある内面２９２をもつカラム保護受容
器である。キャピラリー配管３００はプレフィルター２８８及び試料及び溶液源
（図示されていない）と連絡している。分離カラム２８８の出口からのキャピラ
リー配管３０２は分析装置８４と連絡している（図１）。キャピラリー配管３０
４はカプラー２９４とプレフィルター２８８の出口端を連結し、それが順次、分
離カラム２９８と連絡している。キャピラリー配管３０４は、増加したキャピラ
リーの長さ及び、キャピラリー配管３０４と加熱ブロック２８２間の面接触を提
供するために加熱ブロック２８２のチャンネルの迷路様の形態中に受容される。
迷路及び配管の形態は、追加のループ及び、チャンネル１本当たり１本より多い
キャピラリーの通過の配置を含む、適当なキャピラリーの長さ及び面接触を提供
するどんな形態にもすることができる。キャピラリー配管３０４はＰＥＥＫもし
くはチタンにすることができ、その高い熱伝導性のためにチタンが好ましい。加
熱ブロック２８２はどんな熱伝導性金属であることができる。鋼のような鉄金属
を使用することはできるが、アルミナムもしくは銅がそれらのより高い熱伝導性
のために好ましい。ペルチエヒーターは通常の温度で、ペルチエ熱循環装置に使
用されるシステムのような制御システム（図示されていない）により制御される
。図１１及び１２に示す態様によるような、ペルチエ加熱ブロックにより達成さ
れる温度精度は±０．５℃である。
ier）加熱装置／冷却装置の態様のスキーム図を示す。加熱ブロック２８２は所
望の温度に到達し、維持するために要する加熱もしくは冷却のためのペルチエ加
熱素子（図示されていない）と伝導的に接触している。チャンネル２８４はプレ
フィルター２８８と熱伝導関係にある内面２８６をもつプレフィルター受容器で
ある。チャンネル２９０はカラム並びに、カプラー２９４及び、分離カラム２９
８の末端ナット素子２９６と熱伝導関係にある内面２９２をもつカラム保護受容
器である。キャピラリー配管３００はプレフィルター２８８及び試料及び溶液源
（図示されていない）と連絡している。分離カラム２８８の出口からのキャピラ
リー配管３０２は分析装置８４と連絡している（図１）。キャピラリー配管３０
４はカプラー２９４とプレフィルター２８８の出口端を連結し、それが順次、分
離カラム２９８と連絡している。キャピラリー配管３０４は、増加したキャピラ
リーの長さ及び、キャピラリー配管３０４と加熱ブロック２８２間の面接触を提
供するために加熱ブロック２８２のチャンネルの迷路様の形態中に受容される。
迷路及び配管の形態は、追加のループ及び、チャンネル１本当たり１本より多い
キャピラリーの通過の配置を含む、適当なキャピラリーの長さ及び面接触を提供
するどんな形態にもすることができる。キャピラリー配管３０４はＰＥＥＫもし
くはチタンにすることができ、その高い熱伝導性のためにチタンが好ましい。加
熱ブロック２８２はどんな熱伝導性金属であることができる。鋼のような鉄金属
を使用することはできるが、アルミナムもしくは銅がそれらのより高い熱伝導性
のために好ましい。ペルチエヒーターは通常の温度で、ペルチエ熱循環装置に使
用されるシステムのような制御システム（図示されていない）により制御される
。図１１及び１２に示す態様によるような、ペルチエ加熱ブロックにより達成さ
れる温度精度は±０．５℃である。
【００６７】
図９〜１３に関して前記に説明された改良空気浴オーブン及び固体ブロック加
熱システムの特徴物は、その全体が引用により本明細書に取り込まれている、１
９９９年４月１９日出願の共同所有の、係属米国特許出願第０９／２９５，４７
４号明細書に、更に詳細に記載されている。
熱システムの特徴物は、その全体が引用により本明細書に取り込まれている、１
９９９年４月１９日出願の共同所有の、係属米国特許出願第０９／２９５，４７
４号明細書に、更に詳細に記載されている。
【００６８】
本発明の重要なアスペクトは分離カラム７８の断面のディメンションに関する
。図１４は代表的な分離カラムの物理的構造の部分破断図である。カラムは両端
に外部フェルール３３５を伴うシリンダーもしくはチューブ３３４を含んで成る
。チューブは３３３に示すような内径（ＩＤ）をもち、分離媒体３３６で充填さ
れている。多孔質フリット３３８が末端嵌合体３４０により、分離媒体の上面に
接して保持されている。末端嵌合体３４０はフリット３３８を受容し、チューブ
３３４の末端に対してフリットを保持する。内部ねじ付きナット３４２がねじ嵌
合で外部ねじ嵌合体３４０を受納する。嵌合体３４０はキャピラリー配管末端カ
プラー（図示されていない）を受納するための内部ねじ付き末端受容体３４６を
有する。
。図１４は代表的な分離カラムの物理的構造の部分破断図である。カラムは両端
に外部フェルール３３５を伴うシリンダーもしくはチューブ３３４を含んで成る
。チューブは３３３に示すような内径（ＩＤ）をもち、分離媒体３３６で充填さ
れている。多孔質フリット３３８が末端嵌合体３４０により、分離媒体の上面に
接して保持されている。末端嵌合体３４０はフリット３３８を受容し、チューブ
３３４の末端に対してフリットを保持する。内部ねじ付きナット３４２がねじ嵌
合で外部ねじ嵌合体３４０を受納する。嵌合体３４０はキャピラリー配管末端カ
プラー（図示されていない）を受納するための内部ねじ付き末端受容体３４６を
有する。
【００６９】
シリンダーを含んで成る物質はポリマーもしくは金属にすることができる。本
発明における使用に適するステンレス鋼チューブは例えばIsolation Technologi
es Inc.(Hopedale, MA)から購入可能である。例は、４．６、６．５、７．８、
１０．０、２１．２、３０及び５０ｍｍのようなＩＤサイズをもつステンレス鋼
配管を含む。幾つかの分離は５００ｍｍのような大きな直径をもつカラムを使用
して実施される。１ｍのような大きなカラムは大規模な商業的製造に使用される
。カラムは好ましくは、両端の嵌合物の内部に多孔質フリット３３８（例えばMo
tt Corporation, Farmington, CTにより製造されたような）を含み、嵌合体（Up
church Scientific, Oak Harbor, WA 及び／もしくはIsolation Technologiesか
ら入手可能）中にねじ込む末端シール物を含むことができる。
発明における使用に適するステンレス鋼チューブは例えばIsolation Technologi
es Inc.(Hopedale, MA)から購入可能である。例は、４．６、６．５、７．８、
１０．０、２１．２、３０及び５０ｍｍのようなＩＤサイズをもつステンレス鋼
配管を含む。幾つかの分離は５００ｍｍのような大きな直径をもつカラムを使用
して実施される。１ｍのような大きなカラムは大規模な商業的製造に使用される
。カラムは好ましくは、両端の嵌合物の内部に多孔質フリット３３８（例えばMo
tt Corporation, Farmington, CTにより製造されたような）を含み、嵌合体（Up
church Scientific, Oak Harbor, WA 及び／もしくはIsolation Technologiesか
ら入手可能）中にねじ込む末端シール物を含むことができる。
【００７０】
分離媒体３３６は要求条件の構造及び非極性の表面をもつ有機ポリマー材料も
しくは無機材料を含んで成る。適した材料は以下及び、１９９８年４月１０日出
願の係属、共同指定米国特許出願第０９／０５８，５８０号及び１９９８年１０
月２０日出願の同第０９／１８３，１２３号明細書中に記載されている。
しくは無機材料を含んで成る。適した材料は以下及び、１９９８年４月１０日出
願の係属、共同指定米国特許出願第０９／０５８，５８０号及び１９９８年１０
月２０日出願の同第０９／１８３，１２３号明細書中に記載されている。
【００７１】
本発明の好ましい態様において、工程溶液接触面すべては、多価カチオン汚染
のあらゆる可能な源を排除するための多価カチオン除去処理を受ける。これらの
表面はカラムの内面、多孔質フリット、導管、移動相供給システム、インゼクタ
ー弁、ミキサー ポンプ頭、及び嵌合体を含む。多価カチオン除去処理の限定し
ない例は酸洗浄処理である。この洗浄処理はフラッシングもしくは浸漬を含むこ
とができ、音波処理を含むことができる。酸洗浄処理の一例は硝酸水溶液の存在
下でのチタンフリットの音波処理、次いで中性ｐＨが達成されるまで水中での音
波処理である。他の処理は、ＥＤＴＡ、ピロリン酸もしくはリン酸（例えば３０
重量％のリン酸）のような錯体形成剤との面接触を含む。
のあらゆる可能な源を排除するための多価カチオン除去処理を受ける。これらの
表面はカラムの内面、多孔質フリット、導管、移動相供給システム、インゼクタ
ー弁、ミキサー ポンプ頭、及び嵌合体を含む。多価カチオン除去処理の限定し
ない例は酸洗浄処理である。この洗浄処理はフラッシングもしくは浸漬を含むこ
とができ、音波処理を含むことができる。酸洗浄処理の一例は硝酸水溶液の存在
下でのチタンフリットの音波処理、次いで中性ｐＨが達成されるまで水中での音
波処理である。他の処理は、ＥＤＴＡ、ピロリン酸もしくはリン酸（例えば３０
重量％のリン酸）のような錯体形成剤との面接触を含む。
【００７２】
サイズに基づいたＤＮＡ分離の代表的な例は実施例１（図１５）に記載され、
そこではＤＮＡ断片、pGEM(R) DNA Markers（Promega Corp. Madison, WI)の標
準混合物を５０ｍｍ×４．６ｍｍＩＤカラムを使用して溶離した。混合物は図１
５に示すような塩基対長さをもつ二本鎖ＤＮＡの断片を含んだ。約６００ｂｐ、
とりわけ、１，１９８ｂｐ、１６０５ｂｐ及び２，６４５ｂｐ断片を越えるサイ
ズをもつ断片は、これらのピークの溶離中、移動相勾配のスロープが比較的浅い
（約０．３３％Ｂ／分で増加）場合でも、分割度が弱い。
そこではＤＮＡ断片、pGEM(R) DNA Markers（Promega Corp. Madison, WI)の標
準混合物を５０ｍｍ×４．６ｍｍＩＤカラムを使用して溶離した。混合物は図１
５に示すような塩基対長さをもつ二本鎖ＤＮＡの断片を含んだ。約６００ｂｐ、
とりわけ、１，１９８ｂｐ、１６０５ｂｐ及び２，６４５ｂｐ断片を越えるサイ
ズをもつ断片は、これらのピークの溶離中、移動相勾配のスロープが比較的浅い
（約０．３３％Ｂ／分で増加）場合でも、分割度が弱い。
【００７３】
驚くべきことには、出願者は、実施例２に記載のとおりの７．８ｍｍのＩＤを
もつカラム（図１６）を使用してｐＧＥＭ混合物の分離を実施した時に、これら
のピークの分離に劇的な予期しなかった改善を認めた。１１９８ｂｐ、１６０５
ｂｐ及び２６４５ｂｐ断片は明確に分離された。６００塩基対を越える長さをも
つｄｓＤＮＡ断片の改善された分離は約５ｍｍを越える内径をもつカラムを使用
して得られる。
もつカラム（図１６）を使用してｐＧＥＭ混合物の分離を実施した時に、これら
のピークの分離に劇的な予期しなかった改善を認めた。１１９８ｂｐ、１６０５
ｂｐ及び２６４５ｂｐ断片は明確に分離された。６００塩基対を越える長さをも
つｄｓＤＮＡ断片の改善された分離は約５ｍｍを越える内径をもつカラムを使用
して得られる。
【００７４】
他の実験において、７．８ｍｍのＩＤをもつカラムを使用する改善された分離
は、実施例９及び１０に記載のように、約１００〜約２０，０００塩基対の範囲
の断片を含むＤＮＡ混合物を使用して認められた。
は、実施例９及び１０に記載のように、約１００〜約２０，０００塩基対の範囲
の断片を含むＤＮＡ混合物を使用して認められた。
【００７５】
ＭＰＩＣによるＤＮＡの分離中の改善された分離は５ｍｍより大きい、好まし
くは約７ｍｍより大きい、より好ましくは約１０ｍｍより大きいＩＤをもつカラ
ムを使用して得られる。他の態様において、改善された分離は約５ｍｍ〜約１ｍ
の範囲内のＩＤをもつカラム缶で得られる。
くは約７ｍｍより大きい、より好ましくは約１０ｍｍより大きいＩＤをもつカラ
ムを使用して得られる。他の態様において、改善された分離は約５ｍｍ〜約１ｍ
の範囲内のＩＤをもつカラム缶で得られる。
【００７６】
本発明のもう一つのアスペクトは、ＤＭＰＩＣによるＤＮＡ突然変異検出実施
時の、改善された分離カラム及び使用法に関する。前記のように、本発明は二本
鎖ＤＮＡの突然変異を検出するために使用することができる。以下の定義が本明
細書で使用される。
時の、改善された分離カラム及び使用法に関する。前記のように、本発明は二本
鎖ＤＮＡの突然変異を検出するために使用することができる。以下の定義が本明
細書で使用される。
【００７７】
「ホモ二量体」は本明細書においては、各鎖の塩基が他の鎖のそれらの対抗す
る塩基に対して相補的である二本鎖ＤＮＡ断片を意味すると定義される。
る塩基に対して相補的である二本鎖ＤＮＡ断片を意味すると定義される。
【００７８】
「ヘテロ二量体」は本明細書においては、各鎖の少なくとも１個の塩基が他の
鎖の少なくとも１個の対抗塩基に相補的でない二本鎖ＤＮＡを意味すると定義さ
れる。これは非マッチド塩基もしくは欠失によることができる。ヘテロ二量体の
少なくとも１個の塩基対は相補性ではないので、ホモ二量体のその完全に相補性
の塩基対の類似体に比較すると、その部位の塩基を分離するためにより少ないエ
ネルギーを要する。これがホモ二量体に比して、ヘテロ二量体の非マッチド塩基
の部位の、より低い融点をもたらす。
鎖の少なくとも１個の対抗塩基に相補的でない二本鎖ＤＮＡを意味すると定義さ
れる。これは非マッチド塩基もしくは欠失によることができる。ヘテロ二量体の
少なくとも１個の塩基対は相補性ではないので、ホモ二量体のその完全に相補性
の塩基対の類似体に比較すると、その部位の塩基を分離するためにより少ないエ
ネルギーを要する。これがホモ二量体に比して、ヘテロ二量体の非マッチド塩基
の部位の、より低い融点をもたらす。
【００７９】
「ハイブリッド形成」の術語はｄｓＤＮＡ試料を加熱そして冷却する工程、例
えば９５℃に加熱後緩徐に冷却する工程、を意味する。加熱工程はＤＮＡ鎖を変
性させる。冷却すると、鎖は大部分統計的様態で二量体に再結合する。試料が野
生型及び突然変異ＤＮＡの混合物を含む場合は、ハイブリッド形成はヘテロ−及
びホモ二量体の混合物を形成するであろう。
えば９５℃に加熱後緩徐に冷却する工程、を意味する。加熱工程はＤＮＡ鎖を変
性させる。冷却すると、鎖は大部分統計的様態で二量体に再結合する。試料が野
生型及び突然変異ＤＮＡの混合物を含む場合は、ハイブリッド形成はヘテロ−及
びホモ二量体の混合物を形成するであろう。
【００８０】
「ヘテロ突然変異部位の分離温度」Ｔ（ｈｓｓｔ）は本明細書においては、突
然変異部位におけるヘテロ二重ＤＮＡを優先的に変性させ、ヘテロ二量体とホモ
二量体の間の変性の度合の最大の差をもたらす温度を意味すると定義される。こ
れは、ＤＭＩＰＣによりヘテロ二量体及びホモ二量体のクロマトグラフィー分離
を実施し、そして従って突然変異を検出するのに最適な温度である。
然変異部位におけるヘテロ二重ＤＮＡを優先的に変性させ、ヘテロ二量体とホモ
二量体の間の変性の度合の最大の差をもたらす温度を意味すると定義される。こ
れは、ＤＭＩＰＣによりヘテロ二量体及びホモ二量体のクロマトグラフィー分離
を実施し、そして従って突然変異を検出するのに最適な温度である。
【００８１】
「ヘテロ突然変異体」の術語は本明細書においては、多型性もしくは非相補性
塩基対を含むＤＮＡ断片を意味すると定義される。
塩基対を含むＤＮＡ断片を意味すると定義される。
【００８２】
「突然変異分離プロファイル」の術語は本明細書においては、ホモ二量体から
のヘテロ二量体の分離を示すＤＭＩＰＣ分離クロマトグラムを意味すると定義さ
れる。これらの分離プロファイルは突然変異もしくは多型性を含み、ＤＭＩＰＣ
により分離される前にハイブリッド形成された試料に特徴的である。
のヘテロ二量体の分離を示すＤＭＩＰＣ分離クロマトグラムを意味すると定義さ
れる。これらの分離プロファイルは突然変異もしくは多型性を含み、ＤＭＩＰＣ
により分離される前にハイブリッド形成された試料に特徴的である。
【００８３】
突然変異を検出する信頼できる方法は、野生型の鎖をもつ試料中の推定の突然
変異の鎖のハイブリッド形成によるものである（Lerman, et al.,Meth.Enzymol.
,155:482(1987)）。突然変異の鎖が存在する場合は、２個のホモ二量体及び２個
のヘテロ二量体が図１７に示すハイブリッド形成過程の結果として形成されるで
あろう。従って、ホモ二量体からのヘテロ二量体の分離が試料中の突然変異ＤＮ
Ａ断片の存在もしくは不在を確証する直接的方法を提供する。
変異の鎖のハイブリッド形成によるものである（Lerman, et al.,Meth.Enzymol.
,155:482(1987)）。突然変異の鎖が存在する場合は、２個のホモ二量体及び２個
のヘテロ二量体が図１７に示すハイブリッド形成過程の結果として形成されるで
あろう。従って、ホモ二量体からのヘテロ二量体の分離が試料中の突然変異ＤＮ
Ａ断片の存在もしくは不在を確証する直接的方法を提供する。
【００８４】
ＤＭＩＰＣ分析の一例において、一連の分離クロマトグラムとして図１８に示
すように、２０９塩基対のホモ二量体及びヘテロ二量体を含む標準体がＤＭＩＰ
Ｃにかけられ、その分離過程は実施例４に記載されている。突然変異断片が野生
型からの１個の塩基対の偏り（deviation）を含んだ２０９の塩基対ホモ二量体
断片のヘテロ接合性の試料を含む試料を、加熱、次いで冷却によりハイブリッド
形成させた。ハイブリッド形成法は図１７にスキームにより示すように、２個の
ホモ二量体及び２個のヘテロ二量体を生成した。
すように、２０９塩基対のホモ二量体及びヘテロ二量体を含む標準体がＤＭＩＰ
Ｃにかけられ、その分離過程は実施例４に記載されている。突然変異断片が野生
型からの１個の塩基対の偏り（deviation）を含んだ２０９の塩基対ホモ二量体
断片のヘテロ接合性の試料を含む試料を、加熱、次いで冷却によりハイブリッド
形成させた。ハイブリッド形成法は図１７にスキームにより示すように、２個の
ホモ二量体及び２個のヘテロ二量体を生成した。
【００８５】
図１８及び実施例３に関して、４．６ｍｍのＩＤをもつ分離カラムを使用して
ＤＭＩＰＣ分析を実施した。２個のヘテロ二量体３５０と３５２間及び更に２個
のホモ二量体３５４と３５６間に部分的重複があった。出願者は驚くべきことに
は、実施例４に記載のような７．８ｍｍのＩＤをもつカラムを使用して２０９塩
基対突然変異標準体の分離を実施した時に、ピークの分離の劇的で予期しなかっ
た改善を認めた（図１９）。結果は２個のホモ二量体断片３５０と３５２の相互
からの、２個のヘテロ二量体断片３５４と３５６の相互からの改善された分離及
び、ホモ二量体とヘテロ二量体対間の、距離「ｄ」により示される増加した分離
を示した。
ＤＭＩＰＣ分析を実施した。２個のヘテロ二量体３５０と３５２間及び更に２個
のホモ二量体３５４と３５６間に部分的重複があった。出願者は驚くべきことに
は、実施例４に記載のような７．８ｍｍのＩＤをもつカラムを使用して２０９塩
基対突然変異標準体の分離を実施した時に、ピークの分離の劇的で予期しなかっ
た改善を認めた（図１９）。結果は２個のホモ二量体断片３５０と３５２の相互
からの、２個のヘテロ二量体断片３５４と３５６の相互からの改善された分離及
び、ホモ二量体とヘテロ二量体対間の、距離「ｄ」により示される増加した分離
を示した。
【００８６】
ＤＭＩＰＣによるホモ二量体及びヘテロ二量体ＤＮＡの分離時の改善されたピ
ーク分離度を達成するために、その方法は好ましくは、約５ｍｍより大きい、よ
り好ましくは約７ｍｍより大きい、最も好ましくは約１０ｍｍより大きいＩＤを
もつカラムを使用して実施される。他の態様においては、カラムは約５ｍｍ〜約
１ｍの範囲内のＩＤをもつことができる。
ーク分離度を達成するために、その方法は好ましくは、約５ｍｍより大きい、よ
り好ましくは約７ｍｍより大きい、最も好ましくは約１０ｍｍより大きいＩＤを
もつカラムを使用して実施される。他の態様においては、カラムは約５ｍｍ〜約
１ｍの範囲内のＩＤをもつことができる。
【００８７】
その最も一般的な形態において、本発明のクロマトグラフィーシステムに使用
される分離法は、非極性の表面をもつ固定分離媒体を利用する、ポリヌクレオチ
ド、例えばＤＮＡの分離に関する。好ましい表面は本質的に、ポリヌクレオチド
を捕捉することができる多価カチオン汚染物を含まない。分離は固定表面上で実
施される。表面は多孔性にすることができるが、好ましくはあらゆる表面の孔が
、分析される最小のポリヌクレオチドを追い出すサイズである。
される分離法は、非極性の表面をもつ固定分離媒体を利用する、ポリヌクレオチ
ド、例えばＤＮＡの分離に関する。好ましい表面は本質的に、ポリヌクレオチド
を捕捉することができる多価カチオン汚染物を含まない。分離は固定表面上で実
施される。表面は多孔性にすることができるが、好ましくはあらゆる表面の孔が
、分析される最小のポリヌクレオチドを追い出すサイズである。
【００８８】
概括的に、本発明の分離ビーズの唯一の必須条件はそれらが本質的に非極性で
あるかもしくは、対イオン剤と相互作用するために十分に非極性をもつ面を形成
する材料と接着されている面をもたなければならないことである。
あるかもしくは、対イオン剤と相互作用するために十分に非極性をもつ面を形成
する材料と接着されている面をもたなければならないことである。
【００８９】
非孔質ポリマービーズは約０．５〜１００ミクロン、好ましくは１〜１０ミク
ロン、より好ましくは１〜５ミクロンの平均直径をもつことができる。１．０〜
３．０ミクロンの平均直径をもつビーズが最も好ましい。
ロン、より好ましくは１〜５ミクロンの平均直径をもつことができる。１．０〜
３．０ミクロンの平均直径をもつビーズが最も好ましい。
【００９０】
米国特許第５，５８５，２３６号明細書において、Bonn等は逆相イオンマッチ
ドクロマトグラフィー（ＲＰＩＰＣ）として、核酸分離法の特徴を記載した。し
かし、ＲＰＩＰＣは本発明に記載されたある本質的な特徴を取り込んでいないの
で、もう１つの術語、「マッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー（
ＭＩＰＣ）」の術語を選択した。本明細書で使用されるＭＩＰＣは、その方法が
、ビーズから核酸を溶離するために対イオン剤及び有機溶媒を使用する、非極性
ビーズを使用する、一本及び二本鎖ポリヌクレオチドの分離法と定義される。
ドクロマトグラフィー（ＲＰＩＰＣ）として、核酸分離法の特徴を記載した。し
かし、ＲＰＩＰＣは本発明に記載されたある本質的な特徴を取り込んでいないの
で、もう１つの術語、「マッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー（
ＭＩＰＣ）」の術語を選択した。本明細書で使用されるＭＩＰＣは、その方法が
、ビーズから核酸を溶離するために対イオン剤及び有機溶媒を使用する、非極性
ビーズを使用する、一本及び二本鎖ポリヌクレオチドの分離法と定義される。
【００９１】
本明細書で使用される、「非孔質」の術語は、そこで使用された溶媒媒体中の
分離物中の最小のＤＮＡ断片のサイズ及び形状より小さい直径をもつ表面の孔を
もつビーズを意味すると定義される。この定義には、それらの天然の状態でこれ
らの規定された最大サイズの制約をもつか、もしくは要求される最大有効孔サイ
ズを満たすためにそれらの孔サイズを減少させるように処理されたポリマービー
ズが含まれる。
分離物中の最小のＤＮＡ断片のサイズ及び形状より小さい直径をもつ表面の孔を
もつビーズを意味すると定義される。この定義には、それらの天然の状態でこれ
らの規定された最大サイズの制約をもつか、もしくは要求される最大有効孔サイ
ズを満たすためにそれらの孔サイズを減少させるように処理されたポリマービー
ズが含まれる。
【００９２】
本発明の非孔質ビーズの表面構造物は分離法を妨げないへこみ及び浅い穴様構
造物を含むことができる。それを非孔質にさせるための多孔質ビーズの前処理は
ビーズ構造物の孔を充填し、ＭＩＰＣ法を著しくは妨げないあらゆる材料を使用
して実施することができる。
造物を含むことができる。それを非孔質にさせるための多孔質ビーズの前処理は
ビーズ構造物の孔を充填し、ＭＩＰＣ法を著しくは妨げないあらゆる材料を使用
して実施することができる。
【００９３】
孔は、移動相及び他の物質がビーズ構造物に侵入することができる開放構造物
である。孔はしばしば、１つの孔に侵入する流体がもう１つの孔から排出するこ
とができるように相互に連絡されている。出願者は、相互に連結された孔構造物
中そしてビーズ中へのポリヌクレオチドの移動を許すディメンションをもつ孔は
、分離物の分離を損なうかもしくは非常に長い滞留時間をもつ分離物をもたらす
と考える。しかし、ＭＩＰＣにおいては、ビーズは「非孔質」であり、ポリヌク
レオチドはビーズ構造物中に侵入しない。
である。孔はしばしば、１つの孔に侵入する流体がもう１つの孔から排出するこ
とができるように相互に連絡されている。出願者は、相互に連結された孔構造物
中そしてビーズ中へのポリヌクレオチドの移動を許すディメンションをもつ孔は
、分離物の分離を損なうかもしくは非常に長い滞留時間をもつ分離物をもたらす
と考える。しかし、ＭＩＰＣにおいては、ビーズは「非孔質」であり、ポリヌク
レオチドはビーズ構造物中に侵入しない。
【００９４】
カラムビーズのクロマトグラフィー効率は主として表面及び表面近傍部分の特
性により影響を受ける。このため、次の説明はポリマービーズの表面近傍領域に
特異的に関連する。これらビーズの主要な本体及び／もしくは中心は、本発明の
ポリマービーズの表面もしくは近傍に認められるものと全く異なる化学及び一連
の物理的特性を示すことができる。
性により影響を受ける。このため、次の説明はポリマービーズの表面近傍領域に
特異的に関連する。これらビーズの主要な本体及び／もしくは中心は、本発明の
ポリマービーズの表面もしくは近傍に認められるものと全く異なる化学及び一連
の物理的特性を示すことができる。
【００９５】
本発明の非孔質ポリマービーズは、小さい種ビーズは、最初に、適当な重合可
能なモノマーのエマルション重合により生成される二段階法により製造される。
本発明のエマルション重合法はGoodwin等の方法（Colloid & Polymer Sci.252:4
64-471(1974)）の変形である。種ビーズを生成するためにエマルション重合法に
使用することができるモノマーはスチレン、アルキル置換スチレン、アルファ−
メチルスチレン、及びアルキル置換アルファ−メチルスチレンを含む。次いで、
種ビーズを拡大し、場合によっては、様々な基による置換により修飾して、本発
明の非孔質ポリマービーズを生成する。
能なモノマーのエマルション重合により生成される二段階法により製造される。
本発明のエマルション重合法はGoodwin等の方法（Colloid & Polymer Sci.252:4
64-471(1974)）の変形である。種ビーズを生成するためにエマルション重合法に
使用することができるモノマーはスチレン、アルキル置換スチレン、アルファ−
メチルスチレン、及びアルキル置換アルファ−メチルスチレンを含む。次いで、
種ビーズを拡大し、場合によっては、様々な基による置換により修飾して、本発
明の非孔質ポリマービーズを生成する。
【００９６】
エマルション重合により生成された種ビーズはポリマービーズのサイズを増加
させるためのあらゆる既知の方法により拡大することができる。例えば、ポリマ
ービーズは米国特許第４，５６３，５１０号明細書に開示の活性化膨張法により
拡大することができる。拡大もしくは膨張ポリマービーズは更に、架橋重合可能
なモノマー及び重合開始剤により膨張される。重合は拡大ポリマービーズの架橋
密度を増加し、ビーズの表面多孔性を減少する。適した架橋モノマーは開始剤の
存在下で重合可能な少なくとも２個の炭素−炭素二重結合を含む。好ましい架橋
モノマーはジビニルモノマー、好ましくはアルキル及びアリール（フェニル、ナ
フチル、等）ジビニルモノマーであり、ジビニルベンゼン、ブタジエン、等を含
む。ポリマーの種ビーズの活性化膨張は１〜約１００ミクロンまでの範囲の平均
直径をもつポリマービーズを生成するのに有用である。
させるためのあらゆる既知の方法により拡大することができる。例えば、ポリマ
ービーズは米国特許第４，５６３，５１０号明細書に開示の活性化膨張法により
拡大することができる。拡大もしくは膨張ポリマービーズは更に、架橋重合可能
なモノマー及び重合開始剤により膨張される。重合は拡大ポリマービーズの架橋
密度を増加し、ビーズの表面多孔性を減少する。適した架橋モノマーは開始剤の
存在下で重合可能な少なくとも２個の炭素−炭素二重結合を含む。好ましい架橋
モノマーはジビニルモノマー、好ましくはアルキル及びアリール（フェニル、ナ
フチル、等）ジビニルモノマーであり、ジビニルベンゼン、ブタジエン、等を含
む。ポリマーの種ビーズの活性化膨張は１〜約１００ミクロンまでの範囲の平均
直径をもつポリマービーズを生成するのに有用である。
【００９７】
あるいはまた、ポリマーの種ビーズは、エマルション重合からもたらされる種
ラテックスを単に加熱することにより、拡大することができる。この代替法は、
活性化溶媒による種ビーズの活性化膨張の必要を排除する。その代わりに、種ラ
テックスを架橋モノマー及び前記の重合開始剤と、架橋モノマーの水混和性溶媒
を伴いもしくは伴わずに混合される。適した溶媒はアセトン、テトラヒドロフラ
ン（ＴＨＦ）、メタノール及びジオキサンを含む。生成された混合物を約１〜１
２時間、好ましくは約４〜８時間、重合開始剤の開始温度より下の温度、概括的
には約１０℃〜８０℃、好ましくは３０℃〜６０℃で加熱される。場合によって
は、混合物の温度は１０〜２０％だけ増加し、混合物を更に１〜４時間加熱する
ことができる。少なくとも２００の重合度を確保するためには、モノマーの重合
開始剤に対する比率は少なくとも１００：１、好ましくは１００：１〜約５００
：１、より好ましくは約２００：１である。この重合度をもつビーズは高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の適用に使用することができるために十分に圧
力安定である。この熱膨張法は、約５ミクロンまで、好ましくは約２〜３ミクロ
ンまの平均直径をもつポリマービーズを得るために約１１０〜１６０％だけ、ビ
ーズのサイズを増加させることができる。従って熱膨張法は、以前は、活性化膨
張法によってのみ入手可能な、より小さい粉末度を生成するために使用すること
ができる。
ラテックスを単に加熱することにより、拡大することができる。この代替法は、
活性化溶媒による種ビーズの活性化膨張の必要を排除する。その代わりに、種ラ
テックスを架橋モノマー及び前記の重合開始剤と、架橋モノマーの水混和性溶媒
を伴いもしくは伴わずに混合される。適した溶媒はアセトン、テトラヒドロフラ
ン（ＴＨＦ）、メタノール及びジオキサンを含む。生成された混合物を約１〜１
２時間、好ましくは約４〜８時間、重合開始剤の開始温度より下の温度、概括的
には約１０℃〜８０℃、好ましくは３０℃〜６０℃で加熱される。場合によって
は、混合物の温度は１０〜２０％だけ増加し、混合物を更に１〜４時間加熱する
ことができる。少なくとも２００の重合度を確保するためには、モノマーの重合
開始剤に対する比率は少なくとも１００：１、好ましくは１００：１〜約５００
：１、より好ましくは約２００：１である。この重合度をもつビーズは高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の適用に使用することができるために十分に圧
力安定である。この熱膨張法は、約５ミクロンまで、好ましくは約２〜３ミクロ
ンまの平均直径をもつポリマービーズを得るために約１１０〜１６０％だけ、ビ
ーズのサイズを増加させることができる。従って熱膨張法は、以前は、活性化膨
張法によってのみ入手可能な、より小さい粉末度を生成するために使用すること
ができる。
【００９８】
熱拡大後、過剰な架橋モノマーを除去し、粒子を紫外線もしくは熱にさらすこ
とにより重合させる。重合は例えば、重合開始剤の活性化温度に拡大粒子を加熱
し、所望の度合の重合が達成されるまで重合を継続することにより実施すること
ができる。継続した加熱及び重合は５００を越える重合度をもつビーズを得るこ
とを可能にする。
とにより重合させる。重合は例えば、重合開始剤の活性化温度に拡大粒子を加熱
し、所望の度合の重合が達成されるまで重合を継続することにより実施すること
ができる。継続した加熱及び重合は５００を越える重合度をもつビーズを得るこ
とを可能にする。
【００９９】
本発明において、Bonn等もしくは米国特許第４，５６３，５１０号明細書によ
り開示された充填材料はアルキル基によるポリマービーズの置換により修飾する
かもしくはその未修飾状態のまま使用することができる。例えば、ポリマービー
ズはヨウ化メチルもしくはヨウ化エチルのようなアルキル化剤とビーズを接触さ
せることにより１もしくは２炭素原子によりポリマービーズをアルキル化させる
ことができる。アルキル化は、ポリマー混合物の表面の芳香環上で求電子芳香族
置換を実施するために、フリーデル−クラフト触媒の存在下でハロゲン化アルキ
ルとポリマービーズを混合することにより達成される。適したフリーデル−クラ
フト触媒は、当該技術分野で周知であり、塩化アルミナム、三フッ化ホウ素、四
塩化スズ、等のようなルイス酸を含む。ビーズは例えば、前記の方法で、ヨウ化
メチルに、対応するハロゲン化炭化水素を置換することにより置換された炭化水
素にすることができる。
り開示された充填材料はアルキル基によるポリマービーズの置換により修飾する
かもしくはその未修飾状態のまま使用することができる。例えば、ポリマービー
ズはヨウ化メチルもしくはヨウ化エチルのようなアルキル化剤とビーズを接触さ
せることにより１もしくは２炭素原子によりポリマービーズをアルキル化させる
ことができる。アルキル化は、ポリマー混合物の表面の芳香環上で求電子芳香族
置換を実施するために、フリーデル−クラフト触媒の存在下でハロゲン化アルキ
ルとポリマービーズを混合することにより達成される。適したフリーデル−クラ
フト触媒は、当該技術分野で周知であり、塩化アルミナム、三フッ化ホウ素、四
塩化スズ、等のようなルイス酸を含む。ビーズは例えば、前記の方法で、ヨウ化
メチルに、対応するハロゲン化炭化水素を置換することにより置換された炭化水
素にすることができる。
【０１００】
本発明のビーズに関して本明細書で使用されるアルキルの術語は１〜１，００
０，０００炭素をもつアルキル及びアルキル置換アリール基を含むと定義され、
アルキル基は、アルデヒド、ケトン、エステル、エーテル、アルキル基等を含む
様々な型の直鎖、分枝鎖、環式、飽和、不飽和の非イオン性官能基を含み、アリ
ール基はフェニル、ナフチル等を含む単環式、二環式、及び三環式芳香族炭化水
素基を含む。アルキル置換法は通常のもので、当該技術分野で周知であり、本発
明のアスペクトではない。置換体はまた、非極性で、逆相官能基であると考えら
れるヒドロキシ、シアノ、ニトロ基等を含むことができる。
０，０００炭素をもつアルキル及びアルキル置換アリール基を含むと定義され、
アルキル基は、アルデヒド、ケトン、エステル、エーテル、アルキル基等を含む
様々な型の直鎖、分枝鎖、環式、飽和、不飽和の非イオン性官能基を含み、アリ
ール基はフェニル、ナフチル等を含む単環式、二環式、及び三環式芳香族炭化水
素基を含む。アルキル置換法は通常のもので、当該技術分野で周知であり、本発
明のアスペクトではない。置換体はまた、非極性で、逆相官能基であると考えら
れるヒドロキシ、シアノ、ニトロ基等を含むことができる。
【０１０１】
Bonnの特許に報告されたクロマトグラフィー材料は、Bonn等がこの置換体をも
たないポリマービーズを使用して分離物を得ることに不成功であったために、少
なくとも３個の炭素をもつアルキル基で置換された非孔質ビーズに限定された。
更に、ポリマービーズはビニル芳香族モノマーの小さい群（group）に限定され
、Bonn等は他の材料による二重鎖ＤＮＡの分離を実施することができなかった。
たないポリマービーズを使用して分離物を得ることに不成功であったために、少
なくとも３個の炭素をもつアルキル基で置換された非孔質ビーズに限定された。
更に、ポリマービーズはビニル芳香族モノマーの小さい群（group）に限定され
、Bonn等は他の材料による二重鎖ＤＮＡの分離を実施することができなかった。
【０１０２】
本発明においては、二重鎖ＤＮＡの成功した分離を、未誘導の非孔質ビーズを
使用し、そして１〜１，０００，０００炭素をもつアルキル基で誘導されたビー
ズを使用して達成することができる。
使用し、そして１〜１，０００，０００炭素をもつアルキル基で誘導されたビー
ズを使用して達成することができる。
【０１０３】
本発明の基礎ポリマーはまた、他のポリマーであることができ、その限定され
ない例は、スチレン、置換スチレン、アルファ−置換スチレン及びジビニルベン
ゼンのようなモノ−及びジ−ビニル置換芳香族、アクリラート及びメタクリラー
ト、ポリプロピレン及びポリエチレンのようなポリオレフィン、ポリエステル、
ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボナート、並びに、TEFLONの商品名で一般
に知られているフッ素置換エチレンを含む置換ポリマーを含む。基礎ポリマーは
また、ポリマーの混合物であることができ、その限定されない例は、ポリ（スチ
レン−ジビニルベンゼン）及びポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン
）を含む。これらのポリマーからビーズを製造する方法は通常のもので、当該技
術分野で周知である（例えば、米国特許第４，９０６，３７８号明細書を参照さ
れたい）。ビーズの表面及び表面近傍領域の物理特性は、クロマトグラフィーの
効率に対する主要な影響物である。誘導もしくは未誘導ポリマーはＭＩＰＣ分離
のために非孔質の、非反応性の、そして非極性の表面を提供しなければならない
。 本発明の重要なアスペクトにおいて、本発明のビーズ及び他の媒体は、ＤＮ
Ａと自由に結合できる多価カチオンを実質的に含まないことを特徴とする。本発
明の好ましいビーズは、あらゆる多価カチオン汚染物（例えばＦｅ（III)、Ｃｒ
（III）、もしくはコロイド状金属汚染物）を実質的に除去する目的で、酸洗浄
処理のような脱汚染物処理を含む生成中の注意処理を受けたことを特徴とする。
生成されたビーズが最小の金属含量を有するであろうためには、非常に純粋な、
非金属を含む材料のみが、ビーズ生成に使用されなければならない。
ない例は、スチレン、置換スチレン、アルファ−置換スチレン及びジビニルベン
ゼンのようなモノ−及びジ−ビニル置換芳香族、アクリラート及びメタクリラー
ト、ポリプロピレン及びポリエチレンのようなポリオレフィン、ポリエステル、
ポリウレタン、ポリアミド、ポリカーボナート、並びに、TEFLONの商品名で一般
に知られているフッ素置換エチレンを含む置換ポリマーを含む。基礎ポリマーは
また、ポリマーの混合物であることができ、その限定されない例は、ポリ（スチ
レン−ジビニルベンゼン）及びポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン
）を含む。これらのポリマーからビーズを製造する方法は通常のもので、当該技
術分野で周知である（例えば、米国特許第４，９０６，３７８号明細書を参照さ
れたい）。ビーズの表面及び表面近傍領域の物理特性は、クロマトグラフィーの
効率に対する主要な影響物である。誘導もしくは未誘導ポリマーはＭＩＰＣ分離
のために非孔質の、非反応性の、そして非極性の表面を提供しなければならない
。 本発明の重要なアスペクトにおいて、本発明のビーズ及び他の媒体は、ＤＮ
Ａと自由に結合できる多価カチオンを実質的に含まないことを特徴とする。本発
明の好ましいビーズは、あらゆる多価カチオン汚染物（例えばＦｅ（III)、Ｃｒ
（III）、もしくはコロイド状金属汚染物）を実質的に除去する目的で、酸洗浄
処理のような脱汚染物処理を含む生成中の注意処理を受けたことを特徴とする。
生成されたビーズが最小の金属含量を有するであろうためには、非常に純粋な、
非金属を含む材料のみが、ビーズ生成に使用されなければならない。
【０１０４】
ビーズ自体が実質的に金属を含まないことに加えて、出願者はまた、ＭＩＰＣ
期間中の最適なピーク分離を達成するためには、分離カラム及びカラム内に保持
されたもしくはカラム中を流動するすべての処理溶液が好ましくは、実質的に、
多価カチオン汚染物を含まないことを発見した。共同所有の米国特許第５，７７
２，８８９号、同第５，９９７，７４２号及び同第５，９７２，２２２号及び係
属米国特許出願第０９／０８０，５４７号明細書に記載のように、これは、カラ
ムを多価カチオン汚染物から遮蔽するために、カラム内に保持されもしくはカラ
ムを流通する処理溶液中に多価カチオンを放出しない材料で製造された処理溶液
−接触表面をもつ構成部品を伴う分離カラムに侵入する溶液を供給することによ
り達成することができる。システムの構成部品の処理溶液−接触面は好ましくは
、チタン、コートステンレス鋼、不動態化ステンレス鋼及び有機ポリマーから成
る群から選択された材料である。
期間中の最適なピーク分離を達成するためには、分離カラム及びカラム内に保持
されたもしくはカラム中を流動するすべての処理溶液が好ましくは、実質的に、
多価カチオン汚染物を含まないことを発見した。共同所有の米国特許第５，７７
２，８８９号、同第５，９９７，７４２号及び同第５，９７２，２２２号及び係
属米国特許出願第０９／０８０，５４７号明細書に記載のように、これは、カラ
ムを多価カチオン汚染物から遮蔽するために、カラム内に保持されもしくはカラ
ムを流通する処理溶液中に多価カチオンを放出しない材料で製造された処理溶液
−接触表面をもつ構成部品を伴う分離カラムに侵入する溶液を供給することによ
り達成することができる。システムの構成部品の処理溶液−接触面は好ましくは
、チタン、コートステンレス鋼、不動態化ステンレス鋼及び有機ポリマーから成
る群から選択された材料である。
【０１０５】
ＭＩＰＣ分離には、多価カチオン結合剤、例えば錯体形成剤が使用される２カ
所が存在する。一つの態様においては、これらの結合剤は移動相が通過する固体
中に取り込むことができる。汚染物は、分離を害することができるシステム内の
場所にそれらが到達する前に捕捉される。これらの場合には、官能基は固体マト
リックスもしくは樹脂（例えば、流通カートリッジ、通常は有機ポリマー、しか
し時々はシリカもしくは他の材料）に付けられる。マトリックスの性能は好まし
くは、約２ミリ等量／ｇである。適した錯体形成樹脂の一例は、イミノジアセテ
ート官能基を含むCHELEX 100(Dow Chemical Co.)の商品名で入手可能である。
所が存在する。一つの態様においては、これらの結合剤は移動相が通過する固体
中に取り込むことができる。汚染物は、分離を害することができるシステム内の
場所にそれらが到達する前に捕捉される。これらの場合には、官能基は固体マト
リックスもしくは樹脂（例えば、流通カートリッジ、通常は有機ポリマー、しか
し時々はシリカもしくは他の材料）に付けられる。マトリックスの性能は好まし
くは、約２ミリ等量／ｇである。適した錯体形成樹脂の一例は、イミノジアセテ
ート官能基を含むCHELEX 100(Dow Chemical Co.)の商品名で入手可能である。
【０１０６】
もう一つの態様において、多価カチオン結合剤を移動相に添加することができ
る。結合官能基は有機化学構造物中に取り込まれる。好ましい多価カチオン結合
剤はこれらの必要条件を満たす。第１に、それは移動相に可溶性である。第２に
、金属との錯体が移動相に可溶性である。ＥＤＴＡのような多価カチオン結合剤
は、錯体形成剤及び多価カチオン結合剤−金属錯体の双方がそれら双方ともを水
溶性にさせる電荷を含むために、この必要条件を満たす。更に例えばアセトニト
リルを添加する時にどちらも沈澱しない。水性の移動相中の溶解度は硫酸、カル
ボン酸、もしくはヒドロキシのような共有結合されたイオン官能基を付加させる
ことにより増加させることができる。好ましい多価カチオン結合剤は水、有機溶
媒もしくは移動相で洗浄することによりカラムから容易に除去することができる
。第３に、結合剤はクロマトグラフィー法を妨げてはならない。
る。結合官能基は有機化学構造物中に取り込まれる。好ましい多価カチオン結合
剤はこれらの必要条件を満たす。第１に、それは移動相に可溶性である。第２に
、金属との錯体が移動相に可溶性である。ＥＤＴＡのような多価カチオン結合剤
は、錯体形成剤及び多価カチオン結合剤−金属錯体の双方がそれら双方ともを水
溶性にさせる電荷を含むために、この必要条件を満たす。更に例えばアセトニト
リルを添加する時にどちらも沈澱しない。水性の移動相中の溶解度は硫酸、カル
ボン酸、もしくはヒドロキシのような共有結合されたイオン官能基を付加させる
ことにより増加させることができる。好ましい多価カチオン結合剤は水、有機溶
媒もしくは移動相で洗浄することによりカラムから容易に除去することができる
。第３に、結合剤はクロマトグラフィー法を妨げてはならない。
【０１０７】
多価カチオン結合剤は配位化合物であることができる。好ましい配位化合物の
例は、水溶性錯体形成剤及びクラウンエーテルを含む。本発明に使用することが
できる多価カチオン結合剤の限定されない例はアセチルアセトン、アリザリン、
アルミノン、クロラニル酸、コージ酸、モリン、ロジゾン酸、チオナリド、チオ
ウレア、α−フリルジオキシム、ニオキシム、サリチルアルドキシム、ジメチル
グリオキシム、α−フリルジオキシム、クペロン、α−ニトロソ−β−ナフトー
ル、ニトロソ−Ｒ−塩、ジフェニルチオカルバゾン、ジフェニルカルバゾン、エ
リオクロム黒Ｔ、ＰＡＮ、ＳＰＡＤＮＳ、グリオキサル−ビス（２−ヒドロキシ
アニル）、ムレキシド、α−ベンゾインオキシム、マンデル酸、アントラニル酸
、エチレンジアミン、グリシン、トリアミノトリエチルアミン、チオナリド、ト
リエチレンテトラミン、ＥＤＴＡ、金属フタレイン、アルソン酸（arsonic acid
）、α、α’−ビピリジン、４−ヒドロキシベンゾチアゾール、８−ヒドロキシ
キナルジン、８−ヒドロキシキノリン、１，１０−フェナントロリン、ピコリン
酸、キナルジン酸、α、α’，α”−テルピリジル、９−メチル−２，３，７−
トリヒドロキシ−６−フルオロン、ピロカテコール、サリチル酸、チロン、４−
クロロ−１，２−ジメルカプトベンゼン、ジチオール、メルカプトベンゾチアゾ
ール、ルベアン酸、蓚酸、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム、及びジベン
ジルジチオカルバミン酸亜鉛を含む。これらの例はPerrinによりOrganic Comple xing Reagents:Structure, Behavior, and Application to Inorganic Analysis , Robert E. Krieger Publishing Co. (1964)中に記載されている。本発明にお
いて、好ましい多価カチオン結合剤はＥＤＴＡである。
例は、水溶性錯体形成剤及びクラウンエーテルを含む。本発明に使用することが
できる多価カチオン結合剤の限定されない例はアセチルアセトン、アリザリン、
アルミノン、クロラニル酸、コージ酸、モリン、ロジゾン酸、チオナリド、チオ
ウレア、α−フリルジオキシム、ニオキシム、サリチルアルドキシム、ジメチル
グリオキシム、α−フリルジオキシム、クペロン、α−ニトロソ−β−ナフトー
ル、ニトロソ−Ｒ−塩、ジフェニルチオカルバゾン、ジフェニルカルバゾン、エ
リオクロム黒Ｔ、ＰＡＮ、ＳＰＡＤＮＳ、グリオキサル−ビス（２−ヒドロキシ
アニル）、ムレキシド、α−ベンゾインオキシム、マンデル酸、アントラニル酸
、エチレンジアミン、グリシン、トリアミノトリエチルアミン、チオナリド、ト
リエチレンテトラミン、ＥＤＴＡ、金属フタレイン、アルソン酸（arsonic acid
）、α、α’−ビピリジン、４−ヒドロキシベンゾチアゾール、８−ヒドロキシ
キナルジン、８−ヒドロキシキノリン、１，１０−フェナントロリン、ピコリン
酸、キナルジン酸、α、α’，α”−テルピリジル、９−メチル−２，３，７−
トリヒドロキシ−６−フルオロン、ピロカテコール、サリチル酸、チロン、４−
クロロ−１，２−ジメルカプトベンゼン、ジチオール、メルカプトベンゾチアゾ
ール、ルベアン酸、蓚酸、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム、及びジベン
ジルジチオカルバミン酸亜鉛を含む。これらの例はPerrinによりOrganic Comple xing Reagents:Structure, Behavior, and Application to Inorganic Analysis , Robert E. Krieger Publishing Co. (1964)中に記載されている。本発明にお
いて、好ましい多価カチオン結合剤はＥＤＴＡである。
【０１０８】
ポリヌクレオチドの高度分離度クロマトグラフィー分離を達成するためには、
概括的に、固体相のポリマービーズでクロマトグラフィーカラムをきつく充填す
る必要がある。適した高度の分離度を得るために、カラム充填材によるカラムの
充填のあらゆる既知の方法を本発明に使用することができる。具体的には、ポリ
マービーズのスラーリをポリマービーズの密度以下の密度をもつ溶媒を使用して
調製する。次いで、カラムをポリマービーズのスラーリで充填し、カラム中のポ
リマービーズの充填密度を改善するために震盪もしくは撹拌する。充填密度を改
善するために、機械的震盪もしくは音波処理が具体的に使用される。
概括的に、固体相のポリマービーズでクロマトグラフィーカラムをきつく充填す
る必要がある。適した高度の分離度を得るために、カラム充填材によるカラムの
充填のあらゆる既知の方法を本発明に使用することができる。具体的には、ポリ
マービーズのスラーリをポリマービーズの密度以下の密度をもつ溶媒を使用して
調製する。次いで、カラムをポリマービーズのスラーリで充填し、カラム中のポ
リマービーズの充填密度を改善するために震盪もしくは撹拌する。充填密度を改
善するために、機械的震盪もしくは音波処理が具体的に使用される。
【０１０９】
例えば、５０×７．８ｍｍＩＤのカラムを充填するために、ビーズ３．０グラ
ムを音波の補助により、メタノール１５ｍＬに懸濁させることができる。次いで
懸濁液を８，０００ｐｓｉの圧力で、メタノール１００ｍＬを使用してカラム中
に充填する。これは充填床の密度を改善する。
ムを音波の補助により、メタノール１５ｍＬに懸濁させることができる。次いで
懸濁液を８，０００ｐｓｉの圧力で、メタノール１００ｍＬを使用してカラム中
に充填する。これは充填床の密度を改善する。
【０１１０】
本発明の分離法は概括的に、ＤＮＡ及びＲＮＡの一本及び二本鎖ポリヌクレオ
チドのクロマトグラフィー分離に適用できる。ポリヌクレオチドの混合物を含む
試料は、ポリヌクレオチドの総合的もしくは酵素による合成、エンドヌクレアー
ゼもしくは他の酵素もしくは化学薬品、並びに、ポリメラーゼ連鎖反応法を使用
して複製及び増幅された核酸試料によるＤＮＡもしくはＲＮＡの開裂からもたら
すことができる。
チドのクロマトグラフィー分離に適用できる。ポリヌクレオチドの混合物を含む
試料は、ポリヌクレオチドの総合的もしくは酵素による合成、エンドヌクレアー
ゼもしくは他の酵素もしくは化学薬品、並びに、ポリメラーゼ連鎖反応法を使用
して複製及び増幅された核酸試料によるＤＮＡもしくはＲＮＡの開裂からもたら
すことができる。
【０１１１】
本発明の改善された方法は約１０，０００塩基対までをもつ二本鎖ポリヌクレ
オチドを分離するために使用することができる。その方法は、約５から約１５，
０００〜２０，０００の間のヌクレオチドをもつポリヌクレオチドを分離するた
めに使用することができる。
オチドを分離するために使用することができる。その方法は、約５から約１５，
０００〜２０，０００の間のヌクレオチドをもつポリヌクレオチドを分離するた
めに使用することができる。
【０１１２】
好ましい態様において、分離は「マッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグ
ラフィー（ＭＩＣＰ）」による。本発明の非孔質ビーズは対イオン剤及び溶媒の
勾配とともに機能してＤＮＡ分離をもたらすであろう逆相材として使用される。
ＭＩＣＰにおいて、ポリヌクレオチドは対イオンとマッチドされ、次いで本発明
の非孔質ビーズを使用する逆相クロマトグラフィーにかけられる。
ラフィー（ＭＩＣＰ）」による。本発明の非孔質ビーズは対イオン剤及び溶媒の
勾配とともに機能してＤＮＡ分離をもたらすであろう逆相材として使用される。
ＭＩＣＰにおいて、ポリヌクレオチドは対イオンとマッチドされ、次いで本発明
の非孔質ビーズを使用する逆相クロマトグラフィーにかけられる。
【０１１３】
ＭＩＣＰによる使用に適した幾つかの種類の対イオンが存在する。これらは、
プロトン化されて正の対電荷を形成することができるモノ−、ジ−、もしくはト
リアルキルアミンまたは正の対電荷をすでに含む第四級アルキル置換アミンを含
む。アルキル置換体は、均一（例えば、酢酸トリエチルアンモニウムもしくは酢
酸テトラプロピルアンモニウム）または混合（例えば酢酸プロピルジエチルアン
モニウム）でもよい。アルキル基のサイズは、特に置換アルキル基の唯１個が大
きく、他は小さい場合には、小さく（メチル）もしくは大きく（３０炭素まで）
することができる。例えば、酢酸オクチルジメチルアンモニウムは適した対イオ
ン剤である。好ましい対イオン剤はエチル、プロピルもしくはブチルサイズの範
囲からのアルキル基を含むものである。
プロトン化されて正の対電荷を形成することができるモノ−、ジ−、もしくはト
リアルキルアミンまたは正の対電荷をすでに含む第四級アルキル置換アミンを含
む。アルキル置換体は、均一（例えば、酢酸トリエチルアンモニウムもしくは酢
酸テトラプロピルアンモニウム）または混合（例えば酢酸プロピルジエチルアン
モニウム）でもよい。アルキル基のサイズは、特に置換アルキル基の唯１個が大
きく、他は小さい場合には、小さく（メチル）もしくは大きく（３０炭素まで）
することができる。例えば、酢酸オクチルジメチルアンモニウムは適した対イオ
ン剤である。好ましい対イオン剤はエチル、プロピルもしくはブチルサイズの範
囲からのアルキル基を含むものである。
【０１１４】
アルキル基の目的はポリ核酸が分離媒体の非極性表面と相互作用することがで
きるようにマッチドイオン法によりポリ核酸に非極性の特徴を与えることである
。対イオン−ＤＮＡの組み合わせの非極性の度合の要求は、分離媒体の極性、分
離に必要な溶媒の条件、分離される断片の具体的なサイズ及び型による。例えば
、分離媒体の極性が増加すると、対イオン剤の極性は表面の極性にマッチドし、
対イオン−ＤＮＡの組み合わせの相互作用を増加するように変化しなければなら
ないかも知れない。余分の（extra）非極性の特徴が要求もしくは所望される時
には、テトラプロピルもしくはテトラブチルアンモニウム塩のような第四級アン
モニウム試薬を使用することができるが、酢酸トリエチルアンモニウムが好まし
い。概して、アルキル基の極性が増加すると、サイズに特異的な分離、配列に依
存しない分離がより可能になる。第四級対イオン試薬は揮発性ではないので、試
薬の除去をより困難にする。
きるようにマッチドイオン法によりポリ核酸に非極性の特徴を与えることである
。対イオン−ＤＮＡの組み合わせの非極性の度合の要求は、分離媒体の極性、分
離に必要な溶媒の条件、分離される断片の具体的なサイズ及び型による。例えば
、分離媒体の極性が増加すると、対イオン剤の極性は表面の極性にマッチドし、
対イオン−ＤＮＡの組み合わせの相互作用を増加するように変化しなければなら
ないかも知れない。余分の（extra）非極性の特徴が要求もしくは所望される時
には、テトラプロピルもしくはテトラブチルアンモニウム塩のような第四級アン
モニウム試薬を使用することができるが、酢酸トリエチルアンモニウムが好まし
い。概して、アルキル基の極性が増加すると、サイズに特異的な分離、配列に依
存しない分離がより可能になる。第四級対イオン試薬は揮発性ではないので、試
薬の除去をより困難にする。
【０１１５】
場合によっては、分離を実施するために使用される有機溶媒の濃度範囲を増加
することが所望されるかも知れない。例えば、対イオン剤のアルキルの長さを増
加することは、対イオン−ＤＮＡの組み合わせの非極性を増加し、移動相の有機
溶媒の濃度を増加するかもしくは、有機溶媒の種類の強度を増加する必要をもた
らすであろう、例えばアセトニトリルはポリ核酸を溶離するのにメタノールより
約２倍有効である。カラムから断片を溶離するために要する有機溶媒の濃度と断
片の長さとの間には正の相関がある。しかし、高い有機溶媒濃度においては、ポ
リヌクレオチドは沈澱することができるであろう。沈澱を回避するために、強力
な有機溶媒もしくはより小さい対イオンアルキル基を使用することができる。対
イオン試薬上のアルキル基はまた極性を緩和するためにハロゲン化物、ニトロ基
、等で置換することができる。
することが所望されるかも知れない。例えば、対イオン剤のアルキルの長さを増
加することは、対イオン−ＤＮＡの組み合わせの非極性を増加し、移動相の有機
溶媒の濃度を増加するかもしくは、有機溶媒の種類の強度を増加する必要をもた
らすであろう、例えばアセトニトリルはポリ核酸を溶離するのにメタノールより
約２倍有効である。カラムから断片を溶離するために要する有機溶媒の濃度と断
片の長さとの間には正の相関がある。しかし、高い有機溶媒濃度においては、ポ
リヌクレオチドは沈澱することができるであろう。沈澱を回避するために、強力
な有機溶媒もしくはより小さい対イオンアルキル基を使用することができる。対
イオン試薬上のアルキル基はまた極性を緩和するためにハロゲン化物、ニトロ基
、等で置換することができる。
【０１１６】
移動相は好ましくは対イオン剤を含む。典型的な対イオン剤は、低級アルキル
第一級、第二級及び低級第三級アミン、低級トリアルキルアンモニウム塩及び低
級第四級アルキルアンモニウム塩のような有機もしくは無機酸のトリアルキルア
ンモニウム塩を含む。低級アルキルはメチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル
、ｔ−ブチル、イソアミル、ｎ−ペンチル、及びイソペンチルにより例示される
ような１〜６個の炭素原子のアルキル基を意味する。対イオン剤の例は、酢酸オ
クチルアンモニウム、酢酸オクタジメチルアンモニウム、酢酸デシルアンモニウ
ム、酢酸オクタデシルアンモニウム、酢酸ピリジニウムアンモニウム、酢酸シク
ロヘキシルアンモニウム、酢酸ジエチルアンモニウム、酢酸プロピルエチルアン
モニウム、酢酸プロピルジエチルアンモニウム、酢酸ブチルエチルアンモニウム
、酢酸メチルヘキシルアンモニウム、酢酸テトラメチルアンモニウム、酢酸テト
ラエチルアンモニウム、酢酸テトラプロピルアンモニウム、酢酸テトラブチルア
ンモニウム、酢酸ジメチルジエチルアンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウム
、酢酸トリプロピルアンモニウム、酢酸トリブチルアンモニウム、酢酸テトラプ
ロピルアンモニウム、及び酢酸テトラブチルアンモニウムを含む。前記の例のア
ニオンは酢酸であるが、炭酸、リン酸、硫酸、硝酸、プロピオン酸、ギ酸、塩化
物及び臭化物を含む他のアニオン、もしくはカチオン及びアニオンのあらゆる組
み合わせ物も使用することができる。これらの物質はIon Chromatography, 2nd Ed .,Dr.Alfred Huethig Verlag Heidelberg(1987)中にGjerde等により説明され
ている。揮発性の対イオン剤が本発明の方法における使用に好ましく、酢酸トリ
エチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）及びトリエチルアンモニウムヘキサフルオロイ
ソプロピルアルコールが最も好ましい。
第一級、第二級及び低級第三級アミン、低級トリアルキルアンモニウム塩及び低
級第四級アルキルアンモニウム塩のような有機もしくは無機酸のトリアルキルア
ンモニウム塩を含む。低級アルキルはメチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル
、ｔ−ブチル、イソアミル、ｎ−ペンチル、及びイソペンチルにより例示される
ような１〜６個の炭素原子のアルキル基を意味する。対イオン剤の例は、酢酸オ
クチルアンモニウム、酢酸オクタジメチルアンモニウム、酢酸デシルアンモニウ
ム、酢酸オクタデシルアンモニウム、酢酸ピリジニウムアンモニウム、酢酸シク
ロヘキシルアンモニウム、酢酸ジエチルアンモニウム、酢酸プロピルエチルアン
モニウム、酢酸プロピルジエチルアンモニウム、酢酸ブチルエチルアンモニウム
、酢酸メチルヘキシルアンモニウム、酢酸テトラメチルアンモニウム、酢酸テト
ラエチルアンモニウム、酢酸テトラプロピルアンモニウム、酢酸テトラブチルア
ンモニウム、酢酸ジメチルジエチルアンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウム
、酢酸トリプロピルアンモニウム、酢酸トリブチルアンモニウム、酢酸テトラプ
ロピルアンモニウム、及び酢酸テトラブチルアンモニウムを含む。前記の例のア
ニオンは酢酸であるが、炭酸、リン酸、硫酸、硝酸、プロピオン酸、ギ酸、塩化
物及び臭化物を含む他のアニオン、もしくはカチオン及びアニオンのあらゆる組
み合わせ物も使用することができる。これらの物質はIon Chromatography, 2nd Ed .,Dr.Alfred Huethig Verlag Heidelberg(1987)中にGjerde等により説明され
ている。揮発性の対イオン剤が本発明の方法における使用に好ましく、酢酸トリ
エチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）及びトリエチルアンモニウムヘキサフルオロイ
ソプロピルアルコールが最も好ましい。
【０１１７】
本発明の他の特徴物は、本発明の説明のために与えられ、それを制約すること
を意図されない、例示的態様の以下の説明の過程で明白になるであろう。
を意図されない、例示的態様の以下の説明の過程で明白になるであろう。
【０１１８】
（実施例１）４．６ｍｍＩＤのカラムを使用するＭＩＰＣによるＤＮＡ断片のサイズに基づく 分離
５０ｍｍ×４．６ｍｍＩＤ分離カラム（DNASEP(R) cartridge, Transgenomic,
Inc., San Jose,CA）に充填したオクタデシル修飾された、非孔質のポリ（エチ
ルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）ビーズを使用し、WAVE(R) DNA 断片分離
システム（Transgenomic）を使用して、ｐＧＥＭ ＤＮＡサイズマーカー（部品
番号Ｇ１７４Ａ、Promega Corp.,Madison,WI）のＭＩＰＣ分析を実施した。溶離
剤Ａ：０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７．０；溶離剤Ｂ：０．１ＴＥＡＡ、２５％（
ｖ／ｖ）アセトニトリル、ｐＨ７．０。勾配条件は以下のとおりである。
Inc., San Jose,CA）に充填したオクタデシル修飾された、非孔質のポリ（エチ
ルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）ビーズを使用し、WAVE(R) DNA 断片分離
システム（Transgenomic）を使用して、ｐＧＥＭ ＤＮＡサイズマーカー（部品
番号Ｇ１７４Ａ、Promega Corp.,Madison,WI）のＭＩＰＣ分析を実施した。溶離
剤Ａ：０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７．０；溶離剤Ｂ：０．１ＴＥＡＡ、２５％（
ｖ／ｖ）アセトニトリル、ｐＨ７．０。勾配条件は以下のとおりである。
【０１１９】
時間（分） ％Ａ ％Ｂ
０．０ ６４ ３６
０．５ ５６ ４４
１２．８ ３５ ６５
２５．０ ３１ ６９
３７．３ ２８ ７２
４９．５ ２５ ７５
４９．６ ０ １００
５１．６ ０ １００
５１．７ ６４ ３６
５３．７ ６４ ３６
流速は０．９ｍＬ／分であり、カラム温度は５０℃であった。ＵＶ検出は２６
０ｎｍで実施した。注入容量は１０μＬであった。注入前に、８０μＬの０．１
ＭのＴＥＡＡをpGEM(R)DNA Marker２０μＬと混合した。注入したＤＮＡの量は
２μｇであった。クロマトグラムは図１５に示す。
０ｎｍで実施した。注入容量は１０μＬであった。注入前に、８０μＬの０．１
ＭのＴＥＡＡをpGEM(R)DNA Marker２０μＬと混合した。注入したＤＮＡの量は
２μｇであった。クロマトグラムは図１５に示す。
【０１２０】
（実施例２）７．８ｍｍＩＤカラムを使用するＭＩＰＣによるＤＮＡ断片のサイズに基づく分 離
分離カラムを同一ロットからの分離ビーズで充填した５０ｍｍ×７．８ｍｍＩ
Ｄのカラムで置き換えたことを除いて、実施例１に記載のものと同一条件を使用
してpGEM DNA Markersの分析を実施した。クロマトグラムは図１６に示す。
Ｄのカラムで置き換えたことを除いて、実施例１に記載のものと同一条件を使用
してpGEM DNA Markersの分析を実施した。クロマトグラムは図１６に示す。
【０１２１】
（実施例３）４．６ｍｍＩＤカラムを使用する、ＤＭＩＰＣによるホモ二量体及びヘテロ二量 体ＤＮＡの分離
２０９ｂｐの突然変異標準体のＤＭＩＰＣ分析を、DNASEP(R) ５０ｍｍ×４．
６ｍｍＩＤ分離カラムを使用し、WAVE(R) DNA断片分析システム（Transgenomic
）を使用して実施した。溶離剤Ａ：０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７．０；溶離剤Ｂ
：０．１ＭのＴＥＡＡ、２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、ｐＨ７．０。勾配条
件は以下のとおりである。
６ｍｍＩＤ分離カラムを使用し、WAVE(R) DNA断片分析システム（Transgenomic
）を使用して実施した。溶離剤Ａ：０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７．０；溶離剤Ｂ
：０．１ＭのＴＥＡＡ、２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、ｐＨ７．０。勾配条
件は以下のとおりである。
【０１２２】
時間（分） ％Ａ ％Ｂ
０ ５０ ５０
０．５ ４７ ５３
４．０ ４０ ６０
５．５ ０ １００
６．５ ５０ ５０
８．５ ５０ ５０
流速は５０℃で０．９ｍＬ／分であった。ＵＶ検出は２６０ｎｍで実施した。
販売会社（Transgenomic）による推奨に従い標準体混合物をハイブリッド形成し
た。注入容量は４μＬであった。突然変異分離プロファイルは図１８に示す。
販売会社（Transgenomic）による推奨に従い標準体混合物をハイブリッド形成し
た。注入容量は４μＬであった。突然変異分離プロファイルは図１８に示す。
【０１２３】
突然変異標準体（Transgenomicからの部品番号４４０５８２）はSeielstad et
al.,Hum. Mol. Genet. 3:2159(1994)に記載のような、１６８部位にＡからＧの
突然変異を伴うヒトＹ染色体、遺伝子座ＤＹＳ２７１からの２０９塩基対断片を
含んだ。
al.,Hum. Mol. Genet. 3:2159(1994)に記載のような、１６８部位にＡからＧの
突然変異を伴うヒトＹ染色体、遺伝子座ＤＹＳ２７１からの２０９塩基対断片を
含んだ。
【０１２４】
（実施例４）７．８ｍｍＩＤカラムを使用する、ＤＭＩＰＣによるホモ二量体及びヘテロ二量 体ＤＮＡの分離
分離カラムが実施例３で使用したものと同一バッチからの分離ビーズで充填し
た５０ｍｍ×７．８ｍｍＩＤカラムで置き換えたことを除いて、実施例３に記載
のものと同一の条件を使用して、２０９塩基対の突然変異標準体の分析を実施し
た。クロマトグラムは図１９に示す。
た５０ｍｍ×７．８ｍｍＩＤカラムで置き換えたことを除いて、実施例３に記載
のものと同一の条件を使用して、２０９塩基対の突然変異標準体の分析を実施し
た。クロマトグラムは図１９に示す。
【０１２５】
（実施例５）非孔質のポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）粒子の製造
塩化ナトリウム（０．２３６ｇ）を１．０リッターの容積をもつ反応容器中の
脱イオン水３５４ｍＬに添加した。反応容器は機械的撹拌機、還流コンデンサー
、及びガス導入チューブを備えていた。塩化ナトリウムの溶解は撹拌（３５０ｒ
ｐｍ）に補助され、高温（８７℃）で不活性雰囲気（アルゴン）下で実施した。
次いで、蒸留直後のスチレン（３３．７ｇ）及び、脱イオン水５０ｍＬに溶解し
た過酸化二硫酸カリウム（Ｋ2Ｓ2Ｏ8）０．２１８４ｇを添加した。これらの添
加直後に、ガス導入チューブを溶液から引き抜き、液体面より上方に配置した。
次いで反応混合物を８７℃で６．５時間撹拌した。この後、反応容器の中身を外
界温度まで冷却し、第１段階からもたらされた懸濁液１０００ｍＬ容量中ポリマ
ー化したスチレン５４．６ｇの濃度をもたらす容量まで希釈した。１０００ｍＬ
中のポリマー化スチレンの量は機械的撹拌機にまだ付着しているポリマーの量（
約５〜１０ｇ）を含むように計算された。懸濁液中の球状ビーズの直径は光学顕
微鏡により約１．０ミクロンであると決定された。
脱イオン水３５４ｍＬに添加した。反応容器は機械的撹拌機、還流コンデンサー
、及びガス導入チューブを備えていた。塩化ナトリウムの溶解は撹拌（３５０ｒ
ｐｍ）に補助され、高温（８７℃）で不活性雰囲気（アルゴン）下で実施した。
次いで、蒸留直後のスチレン（３３．７ｇ）及び、脱イオン水５０ｍＬに溶解し
た過酸化二硫酸カリウム（Ｋ2Ｓ2Ｏ8）０．２１８４ｇを添加した。これらの添
加直後に、ガス導入チューブを溶液から引き抜き、液体面より上方に配置した。
次いで反応混合物を８７℃で６．５時間撹拌した。この後、反応容器の中身を外
界温度まで冷却し、第１段階からもたらされた懸濁液１０００ｍＬ容量中ポリマ
ー化したスチレン５４．６ｇの濃度をもたらす容量まで希釈した。１０００ｍＬ
中のポリマー化スチレンの量は機械的撹拌機にまだ付着しているポリマーの量（
約５〜１０ｇ）を含むように計算された。懸濁液中の球状ビーズの直径は光学顕
微鏡により約１．０ミクロンであると決定された。
【０１２６】
第１段階からもたらされたビーズはまだ概括的にクロマトグラフィー充填物と
しての使用には小さく柔らか過ぎる（低い圧力安定性）。これらのビーズの柔ら
かさは不十分な度合の架橋により誘起される。第２段階において、ビーズを拡大
し、架橋度を増加させる。
しての使用には小さく柔らか過ぎる（低い圧力安定性）。これらのビーズの柔ら
かさは不十分な度合の架橋により誘起される。第２段階において、ビーズを拡大
し、架橋度を増加させる。
【０１２７】
第２段階のプロトコールはUgelstad 等（Adv. Colloid Interface Sci.,13:10
1-140(1980)）により記載の活性化膨潤法に基づく。活性化膨潤法、もしくは第
２の合成段階を開始するために、第１段階からのポリスチレンの種体の懸濁水（
２００ｍｌ）を最初にアセトン６０ｍＬと、次いで１−クロロドデカンエマルシ
ョン６０ｍＬと混合した。エマルションを調製するためには、ドデシル硫酸ナト
リウム０．２０６ｇ、脱イオン水４９．５ｍＬ、及び１−クロロドデカン１０．
５ｍＬを一緒に合わせ、生成された混合物を０℃で４時間維持し、＜０．３ミク
ロンの微細エマルションを得るまで、全期間にわたり音波処理により混合した。
ポリスチレンの種体、アセトン、及び１−クロロドデカンエマルションの混合物
を室温で約１２時間撹拌し、その期間にビーズの膨潤が起こった。次いで、アセ
トンを、８０℃で３０分間の蒸留により除去した。
1-140(1980)）により記載の活性化膨潤法に基づく。活性化膨潤法、もしくは第
２の合成段階を開始するために、第１段階からのポリスチレンの種体の懸濁水（
２００ｍｌ）を最初にアセトン６０ｍＬと、次いで１−クロロドデカンエマルシ
ョン６０ｍＬと混合した。エマルションを調製するためには、ドデシル硫酸ナト
リウム０．２０６ｇ、脱イオン水４９．５ｍＬ、及び１−クロロドデカン１０．
５ｍＬを一緒に合わせ、生成された混合物を０℃で４時間維持し、＜０．３ミク
ロンの微細エマルションを得るまで、全期間にわたり音波処理により混合した。
ポリスチレンの種体、アセトン、及び１−クロロドデカンエマルションの混合物
を室温で約１２時間撹拌し、その期間にビーズの膨潤が起こった。次いで、アセ
トンを、８０℃で３０分間の蒸留により除去した。
【０１２８】
アセトンの除去後、膨潤したビーズを更に、開始剤としてジベンゾイルペルオ
キシド２．５ｇをも含有するエチルジビニルベンゼン及びジビニルベンゼン（Ｄ
ＶＢ）の（１：１．７１）混合物３１０ｇの添加により成長させた。成長は撹拌
及び光学顕微鏡による時々の粉末度測定を伴って起こった。
キシド２．５ｇをも含有するエチルジビニルベンゼン及びジビニルベンゼン（Ｄ
ＶＢ）の（１：１．７１）混合物３１０ｇの添加により成長させた。成長は撹拌
及び光学顕微鏡による時々の粉末度測定を伴って起こった。
【０１２９】
膨潤及び成長段階の完了後、反応混合物を分液漏斗中に移動した。このように
、非撹拌溶液中で、ポリマービーズの懸濁物を含有する層から分離された過剰量
のモノマーを容易に除去することができた。残りのビーズの懸濁物は反応容器に
戻し、段階的に温度上昇（約７時間６３℃、約２時間７３℃、そして約１２時間
８３℃）を受け、更に重合度の増加をもたらした（＞５００）。本方法で製造さ
れたビーズの孔サイズは水銀ポロシメーター測定値の検出限度（＜３０Å）未満
であった。
、非撹拌溶液中で、ポリマービーズの懸濁物を含有する層から分離された過剰量
のモノマーを容易に除去することができた。残りのビーズの懸濁物は反応容器に
戻し、段階的に温度上昇（約７時間６３℃、約２時間７３℃、そして約１２時間
８３℃）を受け、更に重合度の増加をもたらした（＞５００）。本方法で製造さ
れたビーズの孔サイズは水銀ポロシメーター測定値の検出限度（＜３０Å）未満
であった。
【０１３０】
乾燥後、段階２からの乾燥ビーズ（１０ｇ）をｎ−ヘプタン１００ｍＬで４回
、次いで以下、ジエチルエーテル１００ｍＬ、ジオキサン１００ｍＬ、及びメタ
ノール１００ｍＬのそれぞれで２回洗浄した。最後にビーズを乾燥した。
、次いで以下、ジエチルエーテル１００ｍＬ、ジオキサン１００ｍＬ、及びメタ
ノール１００ｍＬのそれぞれで２回洗浄した。最後にビーズを乾燥した。
【０１３１】
（実施例６）ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ポリマービーズのアルキル化
以下の手順を２５０〜３００ｍＬ／分の流速で、窒素下で（Air Produts, Ult
ra Pure grade, Allentown, PA）実施した。実施例５で製造したビーズ２５ｇを
弓矢型ミキサー（２５０ｍＬの広首エルレンマイヤーフラスコを使用）を使用し
て１−クロロオクタデカン（製品番号０２３５、TCI America, Portland, OR）
１５０〜１６０ｇ中に懸濁した。温度を５０〜６０℃に設定して、１−クロロオ
クタデカンが固化することを防止した。ポリマーの大きいかけらを破砕して懸濁
を容易にした。２に速度を設定した撹拌機（Model RZRI, Caframo, ONT NOH2TO,
Canada）を使用して溶液を混合した。ポリマー懸濁液を三首ボトル（還流コン
デンサー、頭上撹拌機及びガス入り口を備えた）中に移した。１−クロロオクタ
デカン５２〜６２ｇを使用してエルレンマイヤーフラスコを濯ぎ、三首ボトルに
添加した。ボトルを８０℃に設定したエチレングリコール浴中で加熱した。溶液
を０に速度設定した撹拌機（Caframo）を使用して混合した。２０分後、ＡｌＣ
ｌ3粉末１．１ｇ（製品番号06218, Fluka, Milwaukee, WI）の添加により反応を
開始し、１６〜１８時間継続した。
ra Pure grade, Allentown, PA）実施した。実施例５で製造したビーズ２５ｇを
弓矢型ミキサー（２５０ｍＬの広首エルレンマイヤーフラスコを使用）を使用し
て１−クロロオクタデカン（製品番号０２３５、TCI America, Portland, OR）
１５０〜１６０ｇ中に懸濁した。温度を５０〜６０℃に設定して、１−クロロオ
クタデカンが固化することを防止した。ポリマーの大きいかけらを破砕して懸濁
を容易にした。２に速度を設定した撹拌機（Model RZRI, Caframo, ONT NOH2TO,
Canada）を使用して溶液を混合した。ポリマー懸濁液を三首ボトル（還流コン
デンサー、頭上撹拌機及びガス入り口を備えた）中に移した。１−クロロオクタ
デカン５２〜６２ｇを使用してエルレンマイヤーフラスコを濯ぎ、三首ボトルに
添加した。ボトルを８０℃に設定したエチレングリコール浴中で加熱した。溶液
を０に速度設定した撹拌機（Caframo）を使用して混合した。２０分後、ＡｌＣ
ｌ3粉末１．１ｇ（製品番号06218, Fluka, Milwaukee, WI）の添加により反応を
開始し、１６〜１８時間継続した。
【０１３２】
反応後、遠心分離により過剰１−クロロオクタデカンからポリマーを分離し、
次いで以下の連続的洗浄段階を実施した。添加物 記 50mL濃HCl、50のn-ヘフ゜タン ４回繰り返し、再利用ヘプタン使用 100mLH2O、50のn-ヘフ゜タン １回繰り返し、新鮮ヘプタン使用 50mL濃HCl、50のn-ヘフ゜タン １回繰り返し、新鮮ヘプタン使用 100mLH2O、50のn-ヘフ゜タン １回繰り返し、新鮮ヘプタン 150mLH2O、n-ヘフ゜タンなし ３回繰り返し、ポリマービーズの塊を破砕 するためにプラスチック撹拌機使用、段階４ 及び５を３回繰り返し、 ２分間遠心分離を伴わずに震盪、 100mLのTHF ３回繰り返し 100mLのTHF/n-ヘフ゜タン １回繰り返し 100mLのn-ヘフ゜タン １回繰り返し 100mLのTHF １回繰り返し 100mLのCH3OH ４回繰り返し 水性溶媒（ＨＣｌもしくはＨ2Ｏ）が使用された段階において、ｎ−ヘプタン
の添加前に、水相とともにポリマーを３０秒間震盪した。次いでｎ−ヘプタンを
添加し、混合物を２分間激しく震盪した。最終のポリマービーズを２〜３時間４
０〜５０℃で乾燥後、それらは充填の用意ができた。
次いで以下の連続的洗浄段階を実施した。添加物 記 50mL濃HCl、50のn-ヘフ゜タン ４回繰り返し、再利用ヘプタン使用 100mLH2O、50のn-ヘフ゜タン １回繰り返し、新鮮ヘプタン使用 50mL濃HCl、50のn-ヘフ゜タン １回繰り返し、新鮮ヘプタン使用 100mLH2O、50のn-ヘフ゜タン １回繰り返し、新鮮ヘプタン 150mLH2O、n-ヘフ゜タンなし ３回繰り返し、ポリマービーズの塊を破砕 するためにプラスチック撹拌機使用、段階４ 及び５を３回繰り返し、 ２分間遠心分離を伴わずに震盪、 100mLのTHF ３回繰り返し 100mLのTHF/n-ヘフ゜タン １回繰り返し 100mLのn-ヘフ゜タン １回繰り返し 100mLのTHF １回繰り返し 100mLのCH3OH ４回繰り返し 水性溶媒（ＨＣｌもしくはＨ2Ｏ）が使用された段階において、ｎ−ヘプタン
の添加前に、水相とともにポリマーを３０秒間震盪した。次いでｎ−ヘプタンを
添加し、混合物を２分間激しく震盪した。最終のポリマービーズを２〜３時間４
０〜５０℃で乾燥後、それらは充填の用意ができた。
【０１３３】
（実施例７） 酸洗浄処理
実施例６で製造したビーズをテトラヒドロフランで３回そしてメタノールで２
回洗浄した。最後に、テトラヒドロフラン１００ｍＬ及び濃塩酸１００ｍＬを含
む混合物中でビーズを１２時間撹拌した。この酸処理後、ポリマービーズを中性
（ｐＨ＝７）になるまで、テトラヒドロフラン／水混合物で洗浄した。次いでビ
ーズを１２時間４０℃で乾燥した。
回洗浄した。最後に、テトラヒドロフラン１００ｍＬ及び濃塩酸１００ｍＬを含
む混合物中でビーズを１２時間撹拌した。この酸処理後、ポリマービーズを中性
（ｐＨ＝７）になるまで、テトラヒドロフラン／水混合物で洗浄した。次いでビ
ーズを１２時間４０℃で乾燥した。
【０１３４】
（実施例８） カラム充填手順
オーブン乾燥ポリマービーズ３グラムを秤量後、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ
）１０ｍＬでスラーリを形成し、１５分間ヒュームフード下で音波処理装置内に
入れる。次いで、ＴＨＦ５ｍＬ及びメタノール（ＭｅＯＨ）５ｍＬを添加し、更
に１０分間音波処理する。充填アセンブリーをＭｅＯＨ２０ｍＬで前充填する。
スラーリを充填アセンブリー中に緩徐に注入する。ハスケルポンプ（Haskel Int
ernational,Inc.,Burbank,CA）を作動させ、最初の充填相に対して５０００ｐｓ
ｉまで充填圧力を緩徐に増加する。１０分後、充填圧力を９０００ｐｓｉまで緩
徐に増加し、２０分間第２の充填相を静置する。２０分後、充填溶離剤をＭｅＯ
Ｈから０．０５ＭのＮａ4ＥＤＴＡに変える。次いで４０分間最終充填相を静置
する。
）１０ｍＬでスラーリを形成し、１５分間ヒュームフード下で音波処理装置内に
入れる。次いで、ＴＨＦ５ｍＬ及びメタノール（ＭｅＯＨ）５ｍＬを添加し、更
に１０分間音波処理する。充填アセンブリーをＭｅＯＨ２０ｍＬで前充填する。
スラーリを充填アセンブリー中に緩徐に注入する。ハスケルポンプ（Haskel Int
ernational,Inc.,Burbank,CA）を作動させ、最初の充填相に対して５０００ｐｓ
ｉまで充填圧力を緩徐に増加する。１０分後、充填圧力を９０００ｐｓｉまで緩
徐に増加し、２０分間第２の充填相を静置する。２０分後、充填溶離剤をＭｅＯ
Ｈから０．０５ＭのＮａ4ＥＤＴＡに変える。次いで４０分間最終充填相を静置
する。
【０１３５】
（実施例９）４．６ｍｍＩＤカラムを使用するＭＩＰＣによるＤＮＡ断片のサイズに基づく分 離
λ DNA Hind III digest（サイズ１２５；５６４，２０２７，２３２２，４３
６１，６５５７，９４１６及び２３１３０ｐｂの断片を含む）（部分番号０３０
２０４、Kramel Biotech, Transgenomic Ltd., Northunberland, UK）のＭＩＰ
Ｃ分析を、５０ｍｍ×４．６ｍｍＩＤ分離カラム（DNASEP(R) cartridge）中に
充填したオクタデシル修飾の、非孔質のポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニル
ベンゼン）ビーズを使用し、WAVE(R) DNA Fragment Analysis System（DNA断片
分析システム）を使用して実施した。溶離剤Ａ：０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７．
０、溶離剤Ｂ：０．１ＭのＴＥＡＡ、２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、ｐＨ７
．０。勾配条件は以下のとおりである。時間（分） ％Ａ ％Ｂ 流速（ｍＬ／分） ０．０ ６５ ３５ ０．９ １．０ ６０ ４０ ０．９ １７．０ ２８ ７２ ０．９ １７．１ ０ １００ ０．９ １８．１ ０ １００ ０．９ １８．２ ６５ ３５ ０．９ ２０．１ ６５ ３５ ０．９ 移動相溶液は濃酢酸トリエチルアンモニウム（１００ｍＬTransgenomic part
No.553301）から調製して、Ａ＝０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７、Ｂ＝０．１Ｍの
ＴＥＡＡ及び２５％アセトニトリルを与えた。流速は０．９ｍＬ／分で、カラム
温度は５０℃であった。ＵＶ検出を２６０ｎｍで実施した。０．１ＭのＴＥＡＡ
４０μＬをλ DNA Hind III digest溶液１００μＬと混合した。注入容量は１５
μＬであった。注入したＤＮＡ量は２μｇであった。クロマトグラムは図２０に
示す。
６１，６５５７，９４１６及び２３１３０ｐｂの断片を含む）（部分番号０３０
２０４、Kramel Biotech, Transgenomic Ltd., Northunberland, UK）のＭＩＰ
Ｃ分析を、５０ｍｍ×４．６ｍｍＩＤ分離カラム（DNASEP(R) cartridge）中に
充填したオクタデシル修飾の、非孔質のポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニル
ベンゼン）ビーズを使用し、WAVE(R) DNA Fragment Analysis System（DNA断片
分析システム）を使用して実施した。溶離剤Ａ：０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７．
０、溶離剤Ｂ：０．１ＭのＴＥＡＡ、２５％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、ｐＨ７
．０。勾配条件は以下のとおりである。時間（分） ％Ａ ％Ｂ 流速（ｍＬ／分） ０．０ ６５ ３５ ０．９ １．０ ６０ ４０ ０．９ １７．０ ２８ ７２ ０．９ １７．１ ０ １００ ０．９ １８．１ ０ １００ ０．９ １８．２ ６５ ３５ ０．９ ２０．１ ６５ ３５ ０．９ 移動相溶液は濃酢酸トリエチルアンモニウム（１００ｍＬTransgenomic part
No.553301）から調製して、Ａ＝０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７、Ｂ＝０．１Ｍの
ＴＥＡＡ及び２５％アセトニトリルを与えた。流速は０．９ｍＬ／分で、カラム
温度は５０℃であった。ＵＶ検出を２６０ｎｍで実施した。０．１ＭのＴＥＡＡ
４０μＬをλ DNA Hind III digest溶液１００μＬと混合した。注入容量は１５
μＬであった。注入したＤＮＡ量は２μｇであった。クロマトグラムは図２０に
示す。
【０１３６】
（実施例１０）７．８ｍｍＩＤカラムを使用するＭＩＰＣによるＤＮＡ断片のサイズに基づく分 離
分離カラムを５０ｍｍ×７．８ｍｍＩＤ充填カラムで置き換えたことを除いて
実施例９に記載のものと同一条件を使用してλ DNA Hind III digestの分析を実
施した。クロマトグラムを図２１に示す。
実施例９に記載のものと同一条件を使用してλ DNA Hind III digestの分析を実
施した。クロマトグラムを図２１に示す。
【０１３７】
以上は本発明の具体的な態様を提示したが、これらの態様が実施例によっての
み提示されたことを理解することができる。他の人々は、以上のものとは異なる
が、本明細書に記載そして請求された本発明の精神及び範囲から逸脱しない修正
物を認識し実施するであろうことが期待される。
み提示されたことを理解することができる。他の人々は、以上のものとは異なる
が、本明細書に記載そして請求された本発明の精神及び範囲から逸脱しない修正
物を認識し実施するであろうことが期待される。
【図１】
溶離溶媒の勾配を確立するために弁及び弁制御装置を使用している、１本カラ
ムＭＩＰＣシステムのスキーム図である。
ムＭＩＰＣシステムのスキーム図である。
【図２】
溶離溶媒勾配を確立するためのポンプシステムの部分的スキーム図である。
【図３】
自動試料収集サブシステムのスキーム図である。
【図４】
ＭＩＰＣシステムに使用された注入弁のスキーム図である。
【図５】
充填されたループの充填位における注入弁のスキーム図である。
【図６】
充填されたループの注入位における注入弁のスキーム図である。
【図７】
部分的ループの充填位における注入弁のスキーム図である。
【図８】
部分的ループの注入位における注入弁のスキーム図である。
【図９】
本発明に従う、改善されたＨＰＬＣ ＤＮＡ分析カラムオーブンの分離室の正
面図である。
面図である。
【図１０】
図９に示したＨＰＬＣ ＤＮＡ分析カラムオーブンの上面図である。
【図１１】
本発明の小型カラムヒーターの態様の末端図である。
【図１２】
図１１の線Ａ−Ａに沿って採った断面図である。
【図１３】
本発明のペルチエヒーター／クーラーの態様のスキーム図である。
【図１４】
代表的分離カラムの物理的構造の図である。
【図１５】
５０ｍｍ×４．６ｍｍＩＤのカラム上のｐＧＥＭ ＤＮＡマーカーのＭＩＰＣ
分離物である。ピークは溶出した断片の塩基対の数で標識されている。
分離物である。ピークは溶出した断片の塩基対の数で標識されている。
【図１６】
５０ｍｍ×７．８ｍｍＩＤのカラム上のｐＧＥＭ ＤＮＡマーカーのＭＩＰＣ
分離物である。ピークは溶出した断片の塩基対の数で標識されている。
分離物である。ピークは溶出した断片の塩基対の数で標識されている。
【図１７】
ホモ二量体及びヘテロ二量体を形成するためのハイブリッド形成のスキーム図
である。
である。
【図１８】
５０ｍｍ×４．６ｍｍＩＤのカラムを使用する、２０９ｂｐのホモ二量体／ヘ
テロ二量体混合物の突然変異分離物のプロファイルである。
テロ二量体混合物の突然変異分離物のプロファイルである。
【図１９】
５０ｍｍ×７．８ｍｍＩＤのカラムを使用する、２０９ｂｐのホモ二量体／ヘ
テロ二量体混合物の突然変異分離物のプロファイルである。
テロ二量体混合物の突然変異分離物のプロファイルである。
【図２０】
５０ｍｍ×４．６ｍｍＩＤのカラム上のλ DNA Hind III digest標準体のＭＩ
ＰＣ分離物である。
ＰＣ分離物である。
【図２１】
５０ｍｍ×７．８ｍｍＩＤのカラム上のλ DNA Hind III digest標準体のＭＩ
ＰＣ分離物である。
ＰＣ分離物である。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年５月２７日（２００２．５．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項８】 マッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーによる
二本鎖ＤＮＡ断片の混合物の分離方法であって、混合物が約１０００塩基対を越
える長さをもつ断片を含んで成り、 ａ） 分離ビーズに前記断片の溶液及び対イオン試薬を適用すること、ここで、
前記ビーズが分離カラム中に保持され、前記ビーズが１〜１００ミクロンの平均
直径をもち、前記ビーズが未置換ポリマービーズもしくは、１〜１，０００，０
００炭素をもつ炭化水素基で置換されたポリマービーズであり、そして前記カラ
ムが約５ｍｍを越えるＩＤを有すること、 ｂ） 前記断片を対イオン剤を含有し、かつ、増加する有機成分濃度の勾配溶離 液 で溶離すること、 ここで、断片の溶液及び溶離溶媒により接触される表面がそれらから多価金属カ
チオンを捕捉もしくは放出しない物質であること、を特徴とする分離 方法。
二本鎖ＤＮＡ断片の混合物の分離方法であって、混合物が約１０００塩基対を越
える長さをもつ断片を含んで成り、 ａ） 分離ビーズに前記断片の溶液及び対イオン試薬を適用すること、ここで、
前記ビーズが分離カラム中に保持され、前記ビーズが１〜１００ミクロンの平均
直径をもち、前記ビーズが未置換ポリマービーズもしくは、１〜１，０００，０
００炭素をもつ炭化水素基で置換されたポリマービーズであり、そして前記カラ
ムが約５ｍｍを越えるＩＤを有すること、 ｂ） 前記断片を対イオン剤を含有し、かつ、増加する有機成分濃度の勾配溶離 液 で溶離すること、 ここで、断片の溶液及び溶離溶媒により接触される表面がそれらから多価金属カ
チオンを捕捉もしくは放出しない物質であること、を特徴とする分離 方法。
【請求項９】 混合物中のヘテロ二量体及びホモ二量体のＤＮＡ分子の分離 方法
であって、
ａ） 分離ビーズに前記断片の溶液及び対イオン試薬を適用すること、ここで、
前記ビーズが分離カラム中に保持され、前記ビーズが１〜１００ミクロンの平均
直径をもち、前記ビーズが未置換ポリマービーズもしくは、１〜１，０００，０
００炭素をもつ炭化水素基で置換されたポリマービーズであり、そして前記カラ
ムが約５ｍｍを越えるＩＤを有すること、 ｂ） 前記断片を対イオン剤を含有し、かつ、増加する有機成分濃度の勾配溶離
溶媒で溶離すること、 ここで、断片の溶液及び溶離溶媒により接触される表面がそれらから多価金属カ
チオンを捕捉もしくは放出しない物質であること、 ここで、前記溶離が前記ヘテロ二量体を少なくとも部分的に変性させるのに有効
で、前記溶離が前記ホモ二量体からの前記ヘテロ二量体の分離をもたらす条件下
で実施されること、 を特徴とする分離方法。
前記ビーズが分離カラム中に保持され、前記ビーズが１〜１００ミクロンの平均
直径をもち、前記ビーズが未置換ポリマービーズもしくは、１〜１，０００，０
００炭素をもつ炭化水素基で置換されたポリマービーズであり、そして前記カラ
ムが約５ｍｍを越えるＩＤを有すること、 ｂ） 前記断片を対イオン剤を含有し、かつ、増加する有機成分濃度の勾配溶離
溶媒で溶離すること、 ここで、断片の溶液及び溶離溶媒により接触される表面がそれらから多価金属カ
チオンを捕捉もしくは放出しない物質であること、 ここで、前記溶離が前記ヘテロ二量体を少なくとも部分的に変性させるのに有効
で、前記溶離が前記ホモ二量体からの前記ヘテロ二量体の分離をもたらす条件下
で実施されること、 を特徴とする分離方法。
【請求項１０】 変性マッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー
により、混合物中のヘテロ二量体及びホモ二量体ＤＮＡ分子を分離するための分 離カラムであって、混合物が等しい長さをもつ断片を含んで成り、カラムがポリ
マービーズを含有するシリンダーを備え、前記ビーズが１〜１００ミクロンの平
均直径を有し、前記ビーズが未置換ポリマービーズもしくは、１〜１，０００，
０００炭素を有する炭化水素基で置換されたポリマービーズであり、そして前記
カラムが約５ｍｍより大きいＩＤを有することを特徴とする分離カラム。
により、混合物中のヘテロ二量体及びホモ二量体ＤＮＡ分子を分離するための分 離カラムであって、混合物が等しい長さをもつ断片を含んで成り、カラムがポリ
マービーズを含有するシリンダーを備え、前記ビーズが１〜１００ミクロンの平
均直径を有し、前記ビーズが未置換ポリマービーズもしくは、１〜１，０００，
０００炭素を有する炭化水素基で置換されたポリマービーズであり、そして前記
カラムが約５ｍｍより大きいＩＤを有することを特徴とする分離カラム。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 30/34 Ｅ
Ｇ０１Ｎ 30/34 30/60 Ａ
30/60 30/88 Ｅ
30/88 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(31)優先権主張番号 ６０／１６７，５１５
(32)優先日 平成11年11月24日(1999．11．24)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ６０／１７７，１７７
(32)優先日 平成12年１月20日(2000．1．20)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ０９／５０１，７７５
(32)優先日 平成12年２月10日(2000．2．10)
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ
Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ
，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，
ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ
Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ
，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ
，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，
ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ヘツカー，カール・エイチ
アメリカ合衆国カリフオルニア州95035ミ
ルピタス・トローバーストリート1423
(72)発明者 ロク，ラケル
アメリカ合衆国カリフオルニア州95008キ
ヤンベル・レデイングロード270
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 CA11 HA11
HA19 HA20
4B029 AA07 AA23 BB20 CC01 CC02
CC13 FA12 FA15
4B063 QA01 QA12 QA20 QQ42 QQ52
QS17 QS36 QS39 QX01
4D017 AA09 BA03 CA13 CB01 DA03
Claims (23)
- 【請求項１】 マッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーにより
二本鎖ＤＮＡ断片の混合物を分離するための改良された分離カラムであって、混
合物が約１０００塩基対を越える長さをもつ断片を含んで成り、カラムがポリマ
ービーズを含有するシリンダーを備え、前記ビーズが１〜１００ミクロンの平均
直径を有し、前記ビーズが未置換ポリマービーズもしくは、１〜１，０００，０
００炭素を有する炭化水素基で置換されたポリマービーズであり、前記ビーズが
ＤＮＡと自由に結合できる多価カチオンを実質的に含まないことを特徴とし、前
記カラムが約５ｍｍより大きいＩＤを有するカラム。 - 【請求項２】 前記ＩＤが約７ｍｍより大きい、請求項１のカラム。
- 【請求項３】 前記ＩＤが約１０ｍｍより大きい、請求項１のカラム。
- 【請求項４】 前記ＩＤが約５０ｍｍより大きい、請求項１のカラム。
- 【請求項５】 前記ＩＤが約５ｍｍ〜約１ｍの範囲内にある、請求項１のカ
ラム。 - 【請求項６】 前記ＩＤが７．８ｍｍである請求項１のカラム。
- 【請求項７】 マッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーによる
二本鎖ＤＮＡ断片の混合物を分離するための改良法であって、混合物が約１００
０塩基対を越える長さをもつ断片を含んで成り、当該方法が、 ａ） 分離ビーズに前記断片の溶液及び対イオン試薬を適用すること、ここで、
前記ビーズが分離カラム中に保持され、前記ビーズが１〜１００ミクロンの平均
直径をもち、前記ビーズが未置換ポリマービーズもしくは、１〜１，０００，０
００炭素をもつ炭化水素基で置換されたポリマービーズであり、そこで前記ビー
ズがＤＮＡと自由に結合することができる多価カチオンを実質的に含まないこと
を特徴とし、前記カラムが約５ｍｍを越えるＩＤを有する、 ｂ） 前記断片を対イオン剤を含有する、増加する有機成分濃度の勾配溶離溶媒
で溶離すること、 ここで、断片の溶液及び溶離溶媒により接触される表面がそれらから多価金属カ
チオンを捕捉もしくは放出しない物質であり、 ここで、前記溶離が前記ヘテロ二量体を少なくとも部分的に変性させるのに有効
で、前記溶離が前記ホモ二量体からの前記ヘテロ二量体の分離をもたらす条件下
で実施されること、 を含んで成る方法。 - 【請求項８】 前記ＩＤが約７ｍｍより大きい、請求項７の方法。
- 【請求項９】 前記ＩＤが約１０ｍｍより大きい、請求項７の方法。
- 【請求項１０】 前記ＩＤが約５０ｍｍより大きい、請求項７の方法。
- 【請求項１１】 前記ＩＤが約５ｍｍ〜約１ｍの範囲内にある、請求項７の
方法。 - 【請求項１２】 混合物中のヘテロ二量体及びホモ二量体のＤＮＡ分子を分
離するための改良法であって、 ａ） 分離ビーズに前記断片の溶液及び対イオン試薬を適用すること、ここで、
前記ビーズが分離カラム中に保持され、前記ビーズが１〜１００ミクロンの平均
直径をもち、前記ビーズが未置換ポリマービーズもしくは、１〜１，０００，０
００炭素をもつ炭化水素基で置換されたポリマービーズであり、そこで前記ビー
ズがＤＮＡと自由に結合することができる多価カチオンを実質的に含まないこと
を特徴とし、前記カラムが約５ｍｍを越えるＩＤを有する、 ｂ） 前記断片を対イオン剤を含有する、増加する有機成分濃度の勾配溶離溶媒
で溶離すること、 ここで、断片の溶液及び溶離溶媒により接触される表面がそれらから多価金属カ
チオンを捕捉もしくは放出しない物質であり、 ここで、前記溶離が前記ヘテロ二量体を少なくとも部分的に変性させるのに有効
で、前記溶離が前記ホモ二量体からの前記ヘテロ二量体の分離をもたらす条件下
で実施される、 を含んで成る方法。 - 【請求項１３】 前記ＩＤが約７ｍｍより大きい、請求項１２の方法。
- 【請求項１４】 前記ＩＤが約１０ｍｍより大きい、請求項１２の方法。
- 【請求項１５】 前記ＩＤが約５０ｍｍより大きい、請求項１２の方法。
- 【請求項１６】 前記ＩＤが約５ｍｍ〜約１ｍの範囲内にある、請求項１２
の方法。 - 【請求項１７】 変性マッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー
により、混合物中のヘテロ二量体及びホモ二量体ＤＮＡ分子を分離するための改
良分離カラムであって、混合物が等しい長さをもつ断片を含んで成り、カラムが
ポリマービーズを含有するシリンダーを含んで成り、前記ビーズが１〜１００ミ
クロンの平均直径を有し、前記ビーズが未置換ポリマービーズもしくは、１〜１
，０００，０００炭素を有する炭化水素基で置換されたポリマービーズであり、
そこで、前記ビーズがＤＮＡと自由に結合できる多価カチオンを実質的に含まな
いことを特徴とし、前記カラムが約５ｍｍより大きいＩＤを有する、分離カラム
。 - 【請求項１８】 前記ＩＤが約７ｍｍより大きい、請求項１７のカラム。
- 【請求項１９】 前記ＩＤが約１０ｍｍより大きい、請求項１７のカラム。
- 【請求項２０】 前記ＩＤが約５０ｍｍより大きい、請求項１７のカラム。
- 【請求項２１】 前記ＩＤが約５ｍｍ〜約１ｍの範囲内にある、請求項１７
のカラム。 - 【請求項２２】 前記ＩＤが７．８ｍｍである、請求項１７のカラム。
- 【請求項２３】 請求項１の分離カラムを含んで成る、マッチドイオンポリ
ヌクレオチドクロマトグラフィーによる二本鎖ＤＮＡ断片の混合物を分離するた
めのシステム。
Applications Claiming Priority (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US15461499P | 1999-09-17 | 1999-09-17 | |
| US60/154,614 | 1999-09-17 | ||
| US15874399P | 1999-10-12 | 1999-10-12 | |
| US60/158,743 | 1999-10-12 | ||
| US16751599P | 1999-11-24 | 1999-11-24 | |
| US60/167,515 | 1999-11-24 | ||
| US17717700P | 2000-01-20 | 2000-01-20 | |
| US60/177,177 | 2000-01-20 | ||
| US09/501,775 US6372142B1 (en) | 1996-11-13 | 2000-02-10 | Column for DNA separation by matched ion polynucleotide chromatography |
| US09/501,775 | 2000-02-10 | ||
| PCT/US2000/025532 WO2001019485A1 (en) | 1999-09-17 | 2000-09-18 | Improved column for dna separation by matched ion polynucleotide chromatography |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003509662A true JP2003509662A (ja) | 2003-03-11 |
Family
ID=27538481
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001523107A Pending JP2003509662A (ja) | 1999-09-17 | 2000-09-18 | マッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーによるｄｎａ分離のための改良カラム |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1231993A4 (ja) |
| JP (1) | JP2003509662A (ja) |
| AU (1) | AU7384100A (ja) |
| CA (1) | CA2375746A1 (ja) |
| WO (1) | WO2001019485A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014038113A (ja) * | 2013-11-27 | 2014-02-27 | Daiichi Sankyo Co Ltd | オンライン不純物除去装置及び方法 |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1278584B1 (en) * | 2000-04-21 | 2006-11-15 | TRANSGENOMIC, Inc. | Mipc column cleaning process |
| US7135289B2 (en) | 2001-10-05 | 2006-11-14 | Transgenomic, Inc. | Methods and compositions for mutation analysis of polynucleotides by liquid chromatography |
| EP1565261A1 (en) * | 2002-11-25 | 2005-08-24 | Varian, Inc. | Irregularly-shaped macroporous copolymer particles and methods of using same |
| RU2563277C1 (ru) * | 2014-04-07 | 2015-09-20 | Валерий Геннадьевич Брусов | Способ автоматического управления узлом разгонки отходов брагоректификационной установки |
| GB201610792D0 (en) * | 2016-06-21 | 2016-08-03 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Method for packing chromatography columns |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6066258A (en) * | 1997-12-05 | 2000-05-23 | Transgenomic, Inc. | Polynucleotide separations on polymeric separation media |
| US5772889A (en) * | 1995-11-13 | 1998-06-30 | Transgenomic, Inc. | System and method for performing nucleic acid separations using liquid chromatography |
| JP2000516638A (ja) * | 1997-06-10 | 2000-12-12 | トランスジエノミツク・インコーポレーテツド | 液体クロマトグラフィーを使用するポリヌクレオチド分離を実施するための系および方法 |
| JP2001512702A (ja) * | 1997-08-05 | 2001-08-28 | トランスジエノミツク・インコーポレーテツド | 突然変異を検出するための変性マルチイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー |
-
2000
- 2000-09-18 JP JP2001523107A patent/JP2003509662A/ja active Pending
- 2000-09-18 WO PCT/US2000/025532 patent/WO2001019485A1/en not_active Application Discontinuation
- 2000-09-18 CA CA002375746A patent/CA2375746A1/en not_active Abandoned
- 2000-09-18 EP EP00961961A patent/EP1231993A4/en not_active Withdrawn
- 2000-09-18 AU AU73841/00A patent/AU7384100A/en not_active Abandoned
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2014038113A (ja) * | 2013-11-27 | 2014-02-27 | Daiichi Sankyo Co Ltd | オンライン不純物除去装置及び方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1231993A4 (en) | 2003-04-16 |
| CA2375746A1 (en) | 2001-03-22 |
| EP1231993A1 (en) | 2002-08-21 |
| AU7384100A (en) | 2001-04-17 |
| WO2001019485A1 (en) | 2001-03-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6652745B2 (en) | Column for DNA separation by matched ion polynucleotide chromatography | |
| US6475388B1 (en) | Method and system for RNA analysis by matched ion polynucleotide chromatography | |
| US6066258A (en) | Polynucleotide separations on polymeric separation media | |
| US20040035793A1 (en) | Methods, systems, and kits for analysis of polynucleotides | |
| US6419824B1 (en) | Apparatus and method for separating and purifying polynucleotides | |
| US6024878A (en) | Method for high resolution liquid chromatographic separation of polynucleotides | |
| US6576133B2 (en) | Method and system for RNA analysis by matched ion polynucleotide chromatography | |
| US20020022224A1 (en) | Method for isolating single-stranded DNA | |
| US6355791B1 (en) | Polynucleotide separations on polymeric separation media | |
| US6177559B1 (en) | Process for separation of polynucleotide fragments | |
| JP2003509662A (ja) | マッチドイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーによるｄｎａ分離のための改良カラム | |
| AU777251B2 (en) | Polynucleotide separations on polymeric separation media | |
| WO2001002418A1 (en) | Method and system for rna analysis by matched ion polynucleotide chromatography | |
| WO2001066216A1 (en) | Method and system for rna analysis by matched ion polynucleotide chromatography | |
| US6482317B2 (en) | Polynucleotide separations on polymeric separation media | |
| WO2001066218A1 (en) | Chromatographic method for rna stabilization | |
| JP2003530868A (ja) | Ｍｉｐｃカラム洗浄系及び方法 | |
| WO2002040130A1 (en) | Liquid chromatographic separation of polynucleotides | |
| US7138518B1 (en) | Liquid chromatographic separation of polynucleotides | |
| WO2001092510A1 (en) | Apparatus and method for separating and purifying polynucleotides | |
| Gjerde | Douglas T. Gjerde, Christopher P. Hanna, David Hornby |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040113 |