JP2003505087A - Genes and vaccines for Ehrlichiacanis - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 この発明は、E.canisゲノム由来の5,300ヌクレオチドの配列を提供する。ProA、ProB、ORFおよびシトクロムオキシダーゼ同族体の4つのタンパク質と、同じくカルボキシ末端での部分的なリポタンパク質シグナルペプチダーゼ同族体が、このクローンを作られた断片の中でコード化された。これらのタンパク質の抗原性は、ワクチンを作成するためにそれらが使用されることを可能にする。この発明の実施例は、DNAワクチン、組換えワクチンおよびT細胞エピトープワクチンの作成を含む。 (57) Abstract This invention provides a sequence of 5,300 nucleotides from the E. canis genome. Four proteins, ProA, ProB, ORF and a cytochrome oxidase homolog, and a partial lipoprotein signal peptidase homolog, also at the carboxy terminus, were encoded in the cloned fragment. The antigenicity of these proteins allows them to be used to make vaccines. Examples of the invention include the production of DNA vaccines, recombinant vaccines and T cell epitope vaccines.
Description
【０００１】
（発明の技術分野）
この発明は獣医病原体の分野に関する。特に、この発明は、イヌ（犬）の病原
体エーリキア・キャニス（Ehrlichia canis）の特定の遺伝子の配列、およびワ
クチンの開発へのこの技術の適用に関する。TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION This invention relates to the field of veterinary pathogens. In particular, the invention relates to sequences of specific genes of the canine pathogen Ehrlichia canis, and the application of this technology to the development of vaccines.
【０００２】
（発明の背景）
この発明は、E.canisバクテリアからの遺伝子の配列、およびこの有機体に対
するワクチンの開発に関する。
エーリキア・キャニス（Ehrlichia canis）（以下、E.canisと称する）は小さ
なグラム陰性で、絶対的な細胞内のバクテリアである。このバクテリアは、イヌ
の単球のエーリキオシス（ehrlichiosis）(CME)(主にイヌに影響するダニ媒介の
疾病)を引き起こす媒介生物である。E.canisの最多のコモン・キャリアは褐色の
イヌダニであるクリイロコイタマダニ（Rhipicephalus sanguineus）である。そ
の疾病は、1935年にアルジェリアで最初に記述された。それは、1962年にアメリ
カで続いて認識されたが、今では世界の多くの至る所で知られている。160匹の
軍事用のイヌがE.canis伝染で死んだ時、イヌの単球のehrlichiosisはベトナム
戦争中に多くの関心を呼んだ。E.canisに対して現在適用可能な予防接種はない
。引き続き獣医およびペット所有者の両方にとって重要な健康懸念であるのは生
命を脅かす疾病である。イヌの単球のehrlichiosisは伝染性の血液疾病である。BACKGROUND OF THE INVENTION This invention relates to sequences of genes from E. canis bacteria and the development of vaccines against this organism. Ehrlichia canis (hereinafter referred to as E. canis) is a small Gram-negative, absolute intracellular bacterium. This bacterium is a vector that causes canine monocyte ehrlichiosis (CME), a tick-borne disease that primarily affects dogs. The most common carrier of E. canis is the brown dog mite, Rhipicephalus sanguineus. The disease was first described in 1935 in Algeria. It was subsequently recognized in the United States in 1962, but is now known throughout many parts of the world. When 160 military dogs died of an E. canis infection, dog monocyte ehrlichiosis generated much interest during the Vietnam War. There is currently no vaccination available for E. canis. An important health concern for both veterinarians and pet owners continues to be life-threatening illnesses. Canine monocyte ehrlichiosis is a contagious blood disease.
【０００３】
細胞の血液要素の縮小は疾病の主要な特性である。E.canisは生きており、白
血球細胞(白血球)の中で再生する。それは結局全リンパ系に影響し、多数の器官
を荒らす。白血球をターゲットにすることで、これらの細胞は急速に次々に死ん
でいく。これらの死んだ血球は第1に脾臓へ移動し、その結果、それは拡大する
。骨髄は、新しく健康な細胞を形成するために白血球および形成物の損失を認識
する。それは細胞を時期尚早に生成し、これらの未熟な細胞は適切に機能しない
。しばしば、これらの未熟な細胞は、白血病の患者のそれに似ている。したがっ
て、この疾病は白血病として誤診される。イヌの単球のehrlichiosisはイヌを様
々な癌にかかりやすくするかもしれない。[0003] Reduction of cellular blood components is a major characteristic of disease. E. canis is alive and regenerates in white blood cells (white blood cells). It eventually affects the entire lymphatic system and devastates multiple organs. By targeting white blood cells, these cells die rapidly one after another. These dead blood cells first migrate to the spleen, which causes them to enlarge. The bone marrow recognizes the loss of white blood cells and formations to form new and healthy cells. It produces cells prematurely and these immature cells do not function properly. Often, these immature cells resemble those of leukemia patients. Therefore, the disease is misdiagnosed as leukemia. Ehrlichiosis of canine monocytes may predispose the dog to various cancers.
【０００４】
イヌの単球のehrlichiosisには3つの段階がある。第１の急性期は穏やかなウ
ィルス感染に似ている。急性期中は、全てではないにしてもほとんどの損害は取
り返しがつき、動物は回復するであろう。これは処置が最も有効となる段階であ
り、初期の検知の必要性を強調している。しかしながら、処理なしでは、動物が
無症状の第２段階へ、および／または慢性の最終段階に進むであろう。動物が慢
性の段階に達した場合、バクテリアの有機体は骨髄内に定着している。この段階
の多くのイヌは重い内出血に苦しむか、あるいは突然の発作、心臓発作、腎不全
、脾臓の破裂あるいは肝臓不全のような致死の合併症になる。
E.canisは、哺乳類から誘導された細胞ライン(DH82)で生体外で培養することが
できる。主要な単球(骨髄で見つかった白血球)で2週間ごとに細胞培養を補わな
ければならないので、これらの細胞の継続的な維持は困難である。培養は非常に
遅い成長であり、培養媒体は高価である。There are three stages in canine monocyte ehrlichiosis. The first acute phase resembles a mild viral infection. During the acute phase most, if not all, damage will be repayable and the animals will recover. This is the most effective stage of treatment, highlighting the need for early detection. However, without treatment, the animals will progress to the asymptomatic second stage and / or the chronic end stage. When the animal reaches the chronic stage, bacterial organisms colonize the bone marrow. Many dogs at this stage suffer from severe internal bleeding or are fatal complications such as sudden attacks, heart attacks, renal failure, spleen rupture or liver failure. E. canis can be cultured in vitro on a mammalian derived cell line (DH82). The continuous maintenance of these cells is difficult because the major monocytes (white blood cells found in the bone marrow) have to supplement the cell culture every two weeks. The culture is very slow growing and the culture medium is expensive.
【０００５】
E.canisゲノム中の遺伝子に関するデータは第1に16SリボソームRNA遺伝子に集
中していた。以前の研究は、世界的な大多数の有機体と同様に、ehrlichiaファ
ミリーのメンバーの遍在構成要素であるこの遺伝子の配列を決定した。生体界の
至る所でこの遺伝子間の高い配列ホモロジーは、それをワクチン開発のための不
十分な候補にする。この致命的な疾病に対するワクチンへの望みをいつか実現す
ることができるならば、このゲノム内において他の遺伝子を見つけることが必要
である。Data on genes in the E. canis genome were primarily focused on the 16S ribosomal RNA gene. Previous work has sequenced this gene, a ubiquitous member of the ehrlichia family of members, as well as the majority of organisms worldwide. The high sequence homology between this gene throughout the living world makes it a poor candidate for vaccine development. If the hope for a vaccine against this deadly disease could someday be fulfilled, it would be necessary to find other genes within this genome.
【０００６】
16SリボソームRNA遺伝子の配列を決定することは、ヒトehrlichiosisの新しい
病因の媒介生物エーリキア・チャフェンシス（E.chaffeensis）とE.canisに密接
な関係がある(98.2%の相同)ことを示す。3つの種の密接な抗原関係を示す、E.ca
nis、E.chaffeensisおよびE.ewingi（ヒトehrlichiosisの別の原因）に対する抗
血清でプローブされる時、E.canisのウエスタン・ブロットは類似している（Che
n et al.,1994）。Sequencing of the 16S ribosomal RNA gene shows a close relationship (98.2% homology) to E. chaffeensis and E. canis, the novel pathogens of human ehrlichiosis . E.ca, showing close antigenic relationship of three species
Western blots of E. canis are similar when probed with antisera to nis, E. chaffeensis and E. ewingi, another cause of human ehrlichiosis (Che
n et al., 1994).
【０００７】
間接の蛍光性の抗体テスト(IFA)はイヌの単球のehrlichiosisの検知のために
開発されている。IFAは、イヌの血液に侵入する有機体に対する抗体の存在を発
見する。不運にも、このテストは必ずしも正確だとは限らない。免疫系が抗体を
形成するのが遅れるために、急性期において時々、イヌはテストで陰性反応を示
すであろう。慢性の段階に低いタイターがある場合、別の誤りの陰性反応が生じ
るかもしれない。このテストの更なる欠点は交差反応性である。抗エーリキア・
キャニス・ポリクローナル（anti E.canis polyclonal）抗体は、テストの特異
性を崩して、E.chaffeensisで確かに陽性反応を示す。代替テスト、ジエスマ・
スメア（Giesma smear)はイヌの血液中の実際の有機体の所在を突き止めるため
に使用された。不運にも、適切な染色技術および徹底的なフィルム検査にもかか
わらず、有機体をしばしば捜し出すことができない。これらのテストの誤りやす
さは、この疾病用のよりよい診断ツールの提供を不可欠にする。An indirect fluorescent antibody test (IFA) has been developed for the detection of canine monocyte ehrlichiosis. IFA discovers the presence of antibodies to organisms that invade the blood of dogs. Unfortunately, this test is not always accurate. Sometimes in the acute phase dogs will show a negative test in the test due to the delayed formation of antibodies by the immune system. Another false negative reaction may occur if there is low titer in the chronic stage. A further drawback of this test is cross-reactivity. Anti-Erician
The canis polyclonal (anti E. canis polyclonal) antibody destroys the specificity of the test and shows a positive reaction in E. chaffeensis. Alternative test, Jesma
A smear (Giesma smear) was used to locate the actual organism in the dog's blood. Unfortunately, despite proper dyeing techniques and thorough film inspection, organisms often cannot be sought out. The error proneness of these tests makes it essential to provide better diagnostic tools for this disease.
【０００８】
ダニが刺したことの検知、伝染の初期の分析、ホスト防御物の抑制、および疾
病の執拗な伝染の性質のために、E.canisに対する有効なワクチンは、至急イヌ
のために必要である。Due to the detection of tick stings, early analysis of transmission, suppression of host defenses, and the persistent transmission nature of the disease, an effective vaccine against E. canis is urgently needed for dogs. Is.
【０００９】
（発明の概要）
この発明は、E.canis遺伝子用の斬新な配列データを示す。特に、クローンが
同定され配列が決定された。ProA、ProB、ORF(未知の機能を備えたオープン・リ
ーディング・フレーム)およびシトクロムオキシダーゼホモローグと称される4つ
のタンパク質が、このクローン内で確認された。さらに、リポタンパク質シグナ
ルペプチダーゼホモローグをコード化する部分的な遺伝子が発見された。SUMMARY OF THE INVENTION This invention presents novel sequence data for the E. canis gene. In particular, clones were identified and sequenced. Four proteins, called ProA, ProB, ORF (open reading frame with unknown function) and cytochrome oxidase homologue were identified in this clone. In addition, a partial gene encoding the lipoprotein signal peptidase homolog was discovered.
【００１０】
この発明の実施例は、この配列およびタンパク質情報を備えたワクチンの生成
を含んでいる。この発明で示されたタンパク質は非常に抗原性である。したがっ
て、それらは、ワクチンとして非常に有用な可能性を持っている。この斬新な技
術によって利用可能になったワクチンのタイプはDNAワクチン、組換えのワクチ
ンおよびT細胞エピトープ・ワクチンを含んでいる。Embodiments of the invention include the generation of vaccines with this sequence and protein information. The proteins presented in this invention are highly antigenic. Therefore, they have great potential as vaccines. The types of vaccines made available by this novel technology include DNA vaccines, recombinant vaccines and T cell epitope vaccines.
【００１１】
（最良の実施形態の開示）
E.canisは壊滅的なイヌの疾病を引き起こす。現在のところ、この疫病を予防
することができるワクチンは存在していない。この発明はこのようなワクチンを
開発するために必要とされるツールを提供することにある。より明確には、ProA
、ProB、ORFおよびシトクロムオキシダーゼホモローグと命名された、E.canisの
ゲノム断片から同定された4つの遺伝子に関する。さらに、リポタンパク質シグ
ナルペプチダーゼホモローグをコードする遺伝子断片が発見された。これらタン
パク質のうちのいずれかは、ワクチンを開発するためにこの発明の実施例の中で
利用することができる。Disclosure of the Best Embodiment E. canis causes a devastating canine disease. At present, there is no vaccine that can prevent this plague. The invention is to provide the tools needed to develop such a vaccine. More specifically, ProA
, ProB, ORF and cytochrome oxidase homologues, relating to four genes identified from a genomic fragment of E. canis. In addition, a gene fragment encoding the lipoprotein signal peptidase homolog was discovered. Any of these proteins can be utilized in the examples of this invention to develop vaccines.
【００１２】E.canisライブラリーのスクリーニング
E.canisゲノム中の遺伝子を同定するために、ゲノムのDNA発現ライブラリーが
構築された。イヌehrlichiosisから分離されたE．canis菌株は、従来の技術によ
り、DH82系統のイヌ細胞において成長させ、そして、これは参考文献(Dawson et
al.,1991;Rikihisa,1992)に記載されている。細胞は回収されて、従来の技術(C
hang et al.,1987;Chang et al.,1989a;Chang et al.,1989b;Chang et al.,1993
a;Chang et al.,1993b)に記載されている方法によって、染色体DNAが抽出された
。ライブラリーを構築するために、200μgのDNAは、Sau3Aで部分的に消化された
。3〜8kbのDNA断片が分離されて、プラスミドであるpHG165(Stewart et al.,198
6)に連結させた。このプラスミドは大腸菌（E.coli） TB1(Chang et al.,1987)
に形質転換された。 Screening of the E. canis library To identify genes in the E. canis genome, a genomic DNA expression library was constructed. E. coli isolated from dog ehrlichiosis. The canis strain was grown by conventional techniques in canine cells of the DH82 line, and this is described in the reference (Dawson et al.
al., 1991; Rikihisa, 1992). The cells are harvested and the conventional technique (C
hang et al., 1987; Chang et al., 1989a; Chang et al., 1989b; Chang et al., 1993
Chromosomal DNA was extracted by the method described in a; Chang et al., 1993b). To construct the library, 200 μg of DNA was partially digested with Sau3A. A 3-8 kb DNA fragment was isolated and used as a plasmid pHG165 (Stewart et al., 198).
It was connected to 6). This plasmid is E. coli TB1 (Chang et al., 1987).
Was transformed into.
【００１３】
ライブラリーはE.canisに対するポリクローナル抗体でスクリーニングされた
。ポリクローナル抗体は、E.canisが宿ったマダニに噛まれたイヌから生成され
た。ポリクローナル抗体は、E.coli宿主菌株の溶解産物に前吸収された。ライブ
ラリーは、ユニットを形成する1,000コロニーの濃度でペトリプレート上で培養
された。コロニーはニトロセルロースに転写され、各フィルタは1mlの前吸収さ
れたポリクローナル抗体でプローブされた。陽性のコロニーは、アルカリフォス
ファターゼ結合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンG(Kirkegaard and Perry Laborator
ies、Gaithersburg、MD)を含む第二抗体で同定され、次いでニトロブルーテトラ
ゾリウム(NBT)および5−臭素−4−クロロ−3−インドリルリン酸塩(BCIP)を含有
する基質溶液により発色された。陽性のクローンは、三回再スクリーニングされ
た。The library was screened with a polyclonal antibody against E. canis. Polyclonal antibodies were generated from dogs bitten by ticks harboring E. canis. The polyclonal antibody was preabsorbed into the lysate of the E. coli host strain. The library was cultured on Petri plates at a concentration of 1,000 colonies forming a unit. Colonies were transferred to nitrocellulose and each filter was probed with 1 ml of preabsorbed polyclonal antibody. Positive colonies were treated with alkaline phosphatase-conjugated goat anti-rabbit immunoglobulin G (Kirkegaard and Perry Laborator
ies, Gaithersburg, MD) and then developed with a substrate solution containing nitroblue tetrazolium (NBT) and 5-bromine-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP). . Positive clones were rescreened three times.
【００１４】
3つのクローンがこのスクリーニング方法で分離された(図1)。最長のゲノム断
片(pCH4)は4つの完全な遺伝子および1つの部分的な遺伝子をコード化している。
それは、リポタンパク質シグナルペプチダーゼホモローグの部分的な配列を含ん
でいることと同様に、タンパク質ProA、ProB、ORFおよびシトクロムオキシダー
ゼホモローグを完全にコード化している。ProAとProBは単一のオペロンに位置し
ている。制限エンドヌクレアーゼ消化法によるマッピングおよびDNA塩基配列決
定法は、従来技術に従って行い、そして、これは、参考文献(Chang et. al.,198
7;Chang et. al.,1989a;Chang et. al.,1989b;Chang et. al.,1993a;Chang et.
al.,1993b)によって記載されている。簡潔に、DNA配列は、ABI PRISMモデル377
DNAシステムによるDNA自動塩基配列決定法により決定された。完全なヌクレオチ
ド配列はプライマーウォーキングによって両鎖の上で決定された。シーケンシン
グ反応の反応熱のサイクルはTaq DyeDeoxyTMターミネーター・サイクル・シーケ
ンシング・キットを利用した。米国バイオテクノロジー情報センター(NCBI)(Alt
hchul et al.,1990;Gish et al.,1993)のBLASTネットワーク・サービスの使用を
通じて、ホモローグタンパク質のためにデータベースは検索された。Three clones were isolated by this screening method (FIG. 1). The longest genomic fragment (pCH4) encodes 4 complete genes and 1 partial gene.
It completely encodes the proteins ProA, ProB, ORF and cytochrome oxidase homolog, as well as containing the partial sequence of the lipoprotein signal peptidase homolog. ProA and ProB are located in a single operon. Mapping by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing methods were performed according to the prior art, and this is described in the reference (Chang et. Al., 198).
7; Chang et.al., 1989a; Chang et.al., 1989b; Chang et.al., 1993a; Chang et.
al., 1993b). Briefly, the DNA sequence is ABI PRISM Model 377.
It was determined by the automatic DNA sequencing method using the DNA system. The complete nucleotide sequence was determined on both strands by primer walking. The reaction heat cycle of the sequencing reaction utilized the Taq DyeDeoxy ™ Terminator Cycle Sequencing Kit. Center for Biotechnology Information (NCBI) (Alt
Databases were searched for homologous proteins through the use of the BLAST network service of hchul et al., 1990; Gish et al., 1993).
【００１５】配列情報
E.canisの遺伝子が配列決定された。クローン化された断片は5,300のヌクレオ
チドを含んでおり、4つのタンパク質をコード化する。カルボキシ末端には1つの
部分的な遺伝子がさらに存在する。配列番号1は全ヌクレオチド配列である。配
列番号2と3は配列番号1の12〜533のヌクレオチドの翻訳であり、シトクロムオキ
シダーゼホモローグをコードしている。シトクロムオキシダーゼは毒性面におい
て重要であり、したがってワクチンで使用するための最も有力な候補である。配
列番号4及び5は配列番号１の939〜2252のヌクレオチドの翻訳であり、ProAをコ
ードする。配列番号6及び7は配列番号１の2,258〜3,664のヌクレオチドの翻訳で
あり、ProBをコードする。予備的な証拠は、ProAとProBがプロテアーゼであるこ
とを示している。配列番号8及び9は配列番号１の4,121〜4,795のヌクレオチドの
翻訳であり、ORF(未知の機能を備えたタンパク質)をコードする。配列番号10及
び11は配列番号１の4,884〜5,300のヌクレオチドの相補的な配列の翻訳であり、
リポタンパク質シグナルペプチダーゼホモローグの部分的な配列をコードする。
リポタンパク質シグナルペプチダーゼは膜タンパク質であり、ワクチンの開発に
とって生来それほど有望ではないかもしれない。しかしながら、このタンパク質
は、まだワクチンの創作で追求する価値を有する。 Sequence Information The gene of E. canis was sequenced. The cloned fragment contains 5,300 nucleotides and encodes four proteins. There is an additional partial gene at the carboxy terminus. SEQ ID NO: 1 is the entire nucleotide sequence. SEQ ID NOs: 2 and 3 are translations of nucleotides 12-533 of SEQ ID NO: 1 and encode a cytochrome oxidase homolog. Cytochrome oxidase is important in terms of toxicity and is therefore the strongest candidate for use in vaccines. SEQ ID NOs: 4 and 5 are translations of nucleotides 939-2252 of SEQ ID NO: 1 and encode ProA. SEQ ID NOs: 6 and 7 are translations of the nucleotides 2,258-3,664 of SEQ ID NO: 1 and encode ProB. Preliminary evidence indicates that ProA and ProB are proteases. SEQ ID NOs: 8 and 9 are translations of nucleotides 4,121 to 4,795 of SEQ ID NO: 1 and encode ORFs (proteins with unknown function). SEQ ID NOs: 10 and 11 are translations of the complementary sequence of nucleotides 4,884 to 5,300 of SEQ ID NO: 1,
It encodes a partial sequence of the lipoprotein signal peptidase homolog.
Lipoprotein signal peptidases are membrane proteins and may be less promising in nature for vaccine development. However, this protein is still worth pursuing in the creation of vaccines.
【００１６】ProA、ProB、ORF、シトクロムオキシダーゼ及びリポタンパク質シグナルペプチ
ターゼホモローグの過剰発現
E.canis抗原はT7プロモータープラスミド内で過剰発現される。T7プロモータ
ーに対する強い親和性を有しているT7RNAポリメラーゼの存在する状態で、pRSET
ベクターは大腸菌（E.coli）中で高いレベルの発現を許す。pRSETベクターへの
抗原遺伝子のサブクローニングの後に、サブクローンはF’大腸菌（E.coli） JM
109系統に形質転換される。最大限のタンパク質発現のために、形質転換株はO.D
.600=0.3まで培養され、1時間IPTG(1mM)に露出された後に、細胞当り5〜10のプ
ラーク形成単位(pfu)の感染多重度(MOI)でM13／T7バクテリオファージにより形
質移入された。タイムコースの研究は、最大の誘導は、誘導から2時間後に到達
することを示している。 ProA, ProB, ORF, cytochrome oxidase and lipoprotein signal peptide
Overexpression of the Tase homologue The E. canis antigen is overexpressed in the T7 promoter plasmid. In the presence of T7 RNA polymerase, which has a strong affinity for the T7 promoter, pRSET
The vector allows high levels of expression in E. coli. After subcloning of the antigen gene into pRSET vector, the subclone is F'E. coli JM
Transformed into line 109. Transformants are OD for maximum protein expression
Transfected with M13 / T7 bacteriophage at a multiplicity of infection (MOI) of 5-10 plaque forming units (pfu) per cell after being cultured to .600 = 0.3 and exposed to IPTG (1 mM) for 1 hour. . Time course studies have shown that maximum induction is reached 2 hours after induction.
【００１７】
ペレットは遠心分離によって回収され、細胞は6Mグアニジニウム(pH7.8)の中
で再懸濁される。細胞はフレンチプレスによって破裂されて、全溶解産物は、従
来の技術によって細胞砕片を分離するために6000rpmで回転され、そして、これ
は参考文献(Chang et al.,1993c)によって記載されている。固定化金属イオンア
フィニティークロマトグラフィー(IMIAC)は、メーカー(Invitrogen,San Diego,C
A)によって述べられている変性する条件の下で、タンパク質の各々を精製するた
めに使用される。タンパク質サンプルはSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(
SDS−PAGE)によって分離され、クーマシーブルーで染色した後に視覚化された。The pellet is harvested by centrifugation and the cells are resuspended in 6M guanidinium (pH 7.8). The cells were ruptured by a French press and the total lysate was spun at 6000 rpm to separate cell debris by conventional techniques, and this is described by a reference (Chang et al., 1993c). Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography (IMIAC) is a manufacturer (Invitrogen, San Diego, C
Used to purify each of the proteins under the denaturing conditions described by A). Protein samples were analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (
SDS-PAGE) and visualized after staining with Coomassie blue.
【００１８】ワクチンの開発
この発明に先立って、E.canisに対するワクチンは開発されていない。E.canis
は、世界中の多くの地域において、イヌ及びイヌの近縁種に固有である。北アメ
リカのイヌはますます危険な状態である。そして、この発明の適用により、潜在
的に毎年何千ものイヌの命を救うことができる。イヌのダニ媒介の疾病に対する
細胞性免疫を誘発することができるE.canisワクチンは、極めて必要とされてい
る。 Vaccine Development Prior to this invention, no vaccine against E. canis has been developed. E.canis
Is endemic to dogs and related dogs in many parts of the world. North American dogs are becoming increasingly dangerous. And the application of this invention can potentially save the lives of thousands of dogs each year. There is a great need for an E. canis vaccine that can elicit cell-mediated immunity against canine-borne disease in dogs.
【００１９】DNAワクチン
DNAワクチンは、真核生物のプラスミドベクターに関係する遺伝子のサブクロ
ーニングにより構築される。候補ベクターは、pcDNA3、pCI、VR1012およびVR102
0を含むが、しかしこれらに制限はされない。この構成がワクチンとして使用さ
れる。 DNA Vaccines DNA vaccines are constructed by subcloning genes related to eukaryotic plasmid vectors. Candidate vectors are pcDNA3, pCI, VR1012 and VR102.
Including but not limited to 0. This composition is used as a vaccine.
【００２０】
新しく同定された遺伝子であるProA、ProB、ORF、シトクロムオキシダーゼホ
モローグの各々、あるいは部分的なリポタンパク質シグナルペプチダーゼホモロ
ーグが、DNAワクチン(reviewed in Robinson,1997)を作成するために使用される
ことができる。さらに、これらのタンパク質の免疫学的に活性なあらゆる部位も
ワクチンに対する潜在的な候補である。発現ベクターで、これらの遺伝子のうち
の1つを含んでいるプラスミドが構築される。遺伝子が真核生物のプロモーター
によるコントロールの下で表現されるために、遺伝子は正確な配向で挿入されな
ければならない。可能なプロモーターは、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プ
ロモーター、ヒト組織プラスミノーゲン活性化(t−PA)遺伝子(characterized in
Degen et al.,1986)およびヒト伸長因子α(EF−1α)(characterized in Uetsuk
i et al.,1989)のプロモーター／エンハンサー領域を含むが、しかし制限されな
い。配向は制限エンドヌクレアーゼによる消化およびDNA配列によって識別され
る。Each of the newly identified genes ProA, ProB, ORF, the cytochrome oxidase homologue, or the partial lipoprotein signal peptidase homologue is used to generate a DNA vaccine (reviewed in Robinson, 1997). be able to. Moreover, any immunologically active site of these proteins is a potential candidate for a vaccine. With the expression vector, a plasmid containing one of these genes is constructed. In order for the gene to be expressed under the control of a eukaryotic promoter, the gene must be inserted in the correct orientation. Possible promoters are cytomegalovirus (CMV) immediate early promoter, human tissue plasminogen activation (t-PA) gene (characterized in
Degen et al., 1986) and human elongation factor α (EF-1α) (characterized in Uetsuk
i et al., 1989), but is not limited to. The orientation is identified by restriction endonuclease digestion and DNA sequence.
【００２１】
これらの遺伝子産物の発現は、一時的に形質移入したCOS細胞の間接的な免疫
蛍光染色法により確認される。これらの遺伝子を有していない同じプラスミドは
コントロールとして使用される。プラスミドDNAは大腸菌（Escherichia coli）
DH5αに形質転換される。DNAはセシウム塩化物濃度勾配によって精製される。そ
の濃度は、従来の技術として知られている標準的な方法によって決定され、そし
て、これは参考文献(Nyika et al.,1998)に記載されている。Expression of these gene products is confirmed by indirect immunofluorescence staining of transiently transfected COS cells. The same plasmid without these genes is used as a control. Plasmid DNA is Escherichia coli
Transformed into DH5α. DNA is purified by a cesium chloride gradient. Its concentration is determined by standard methods known in the art and is described in the reference (Nyika et al., 1998).
【００２２】
一旦ベクターが精製されれば、DNAを含んでいるベクターはリン酸塩バッファ
ー溶液で懸濁されることができ、直接イヌに注入される。接種は、針を使用して
筋肉を通じてあるいは静脈を通じて行うことができる。二者択一的に、遺伝子銃
は、従来技術によって細胞に金ビード被覆DNAを輸送するために使用することが
でき、そして、ここに、参考文献(Fynan et al.,1993)に記載されている。この
種のワクチンの理論的根拠は、接種を受けたホストがその細胞でプラスミドDNA
を発現するということで、免疫反応を向上させるタンパク質を生産することであ
る。新しく同定された遺伝子の各々は、この技術によってワクチンを作成するた
めに使用することができる。Once the vector has been purified, the vector containing the DNA can be suspended in phosphate buffer solution and directly injected into the dog. Inoculation can be done via the muscle using a needle or intravenously. Alternatively, the gene gun can be used to deliver gold bead coated DNA to cells by conventional techniques, and is described herein in (Fynan et al., 1993). There is. The rationale for this type of vaccine is that the inoculated host is able to
Is to produce a protein that enhances the immune response. Each of the newly identified genes can be used to make a vaccine by this technique.
【００２３】
CpG分子はワクチンにおいてアジュバンドとして使用することができる。この
技術は、従来の技術として知られてり、ここに参考文献(Klinman et al.,1997)
に記載されている。アジュバンドは抗原を助けるか、抗原に対する免疫反応を増
加させる物質である。モチーフは、二つの5’プリンと二つの3’ピリミジンによ
って隣接したメチル化されていないCpGジヌクレオチドから構成される。CpGモチ
ーフを含んでいるオリゴヌクレオチドは免疫系を活性化すると示されており、そ
のために、抗原に特異的な免疫反応を追加免疫する。この結果は、DNAワクチン
とCpGオリゴヌクレオチドを混合することによって、あるいはCpGモチーフをプラ
スミドDNAに物理的に連結することによって、この発明で利用することができる
。The CpG molecule can be used as an adjuvant in vaccines. This technique is known as the prior art and is referred to here (Klinman et al., 1997).
It is described in. Adjuvants are substances that help the antigen or increase the immune response to the antigen. The motif is composed of unmethylated CpG dinucleotides flanked by two 5'purines and two 3'pyrimidines. Oligonucleotides containing the CpG motif have been shown to activate the immune system and therefore boost the immune response specific for the antigen. This result can be utilized in this invention by mixing the DNA vaccine with the CpG oligonucleotide or by physically linking the CpG motif to the plasmid DNA.
【００２４】組換えワクチン
組換えワクチンを開発するために、遺伝子の各々を個々に過剰発現ベクターへ
サブクローニングした後に、ワクチン開発のために精製した。ProA、ProB、ORF
、シトクロムオキシダーゼホモローグあるいは部分的なリポタンパク質シグナル
ペプチダーゼホモローグは、tac、T5あるいはT7プロモーターのような強力なプ
ロモーターとともにプラスミドの中で発現される。二者択一的に、これらのタン
パク質の免疫学的に活性な断片はワクチン開発で使用される。これらの遺伝子の
各々は、プラスミドへサブクローニングされて、上述のような大腸菌（E.coli）
系統に形質転換される。[0024] In order to develop a recombinant vaccine recombinant vaccine, after subcloned into overexpression vector individually each gene were purified for vaccine development. ProA, ProB, ORF
, The cytochrome oxidase homolog or the partial lipoprotein signal peptidase homolog is expressed in plasmids with strong promoters such as the tac, T5 or T7 promoters. Alternatively, immunologically active fragments of these proteins are used in vaccine development. Each of these genes was subcloned into a plasmid and transformed into E. coli as described above.
Transformed into the line.
【００２５】
組換えタンパク質は強力なプロモーターを備えるベクターを使用して過剰発現
される。この技術で使用されるベクターは、pREST(Invitrogen Inc.,CA)、pKK23
3−3(Pharmacia,CA)およびpETシステム(Promega,WI)を含んでいるが、他の強力
なプロモーターを備えているあらゆるベクターを使用することができる。過剰発
現の後に、タンパク質は精製されて、アジュバンドと混合される。潜在的なアジ
ュバンドは、水酸化アルミニウム、QuilAあるいはMontamideを含んでいるが、し
かし制限されない。精製されたタンパク質は、従来の技術によって、イヌに予防
注射をするための免疫原として使用され、そして、参考文献(Chang et al.,1993
c;Chang et al.,1995)に記載されている。簡潔に、個々のタンパク質は発現し、
E.coli.から精製される。その後、イヌは、精製された組換えワクチンおよびア
ジュバンドを筋肉内にあるいは皮下に注射される。この注射は免疫反応を誘発す
る。Recombinant proteins are overexpressed using vectors with strong promoters. The vectors used in this technology are pREST (Invitrogen Inc., CA), pKK23
Any vector containing 3-3 (Pharmacia, CA) and the pET system (Promega, WI) but with other strong promoters can be used. After overexpression, the protein is purified and mixed with the adjuvant. Potential adjuvants include, but are not limited to, aluminum hydroxide, QuilA or Montamide. The purified protein is used by conventional techniques as an immunogen for vaccination of dogs, and reference (Chang et al., 1993).
c; Chang et al., 1995). Briefly, individual proteins are expressed,
Purified from E. coli. The dog is then injected intramuscularly or subcutaneously with the purified recombinant vaccine and adjuvant. This injection elicits an immune response.
【００２６】Ｔ細胞エピトープワクチン
ＣＤ８＋Ｔリンパ球(ＣＴＬ)によってもたらされる直接細胞傷害性は、細胞内
病原体に対する防御の主なメカニズムである。これらのエフェクターリンパ球は
、細胞表面上のＭＨＣクラスＩの分子と結合した短いペプチドの認識により感染
細胞を除去する。外因性抗原はエンドソーム経路に入り、内因性の合成抗原がＭ
ＨＣクラスＩの分子に関連したＣＤ８＋Ｔ細胞に提供されるのに対して、クラス
ＩＩの分子に関連したＣＤ４＋Ｔ細胞に提供される。E.canisは単球とマクロフ
ァージに存在する細胞内病原体である。本発明は、感染動物の単球やマクロファ
ージから有機体を除去するE.canisに特有のＣＴＬ反応を生成する新しい方法を
開発する。Direct cytotoxicity mediated by the T cell epitope vaccine CD8 + T lymphocytes (CTL) is the main mechanism of defense against intracellular pathogens. These effector lymphocytes eliminate infected cells by recognizing short peptides bound to MHC class I molecules on the cell surface. Exogenous antigen enters the endosomal pathway and endogenous synthetic antigen is M
It is provided to CD8 + T cells associated with HC class I molecules, whereas it is provided to CD4 + T cells associated with class II molecules. E. canis is an intracellular pathogen present in monocytes and macrophages. The present invention develops a new method of generating an E. canis-specific CTL response that removes organisms from monocytes and macrophages of infected animals.
【００２７】
タンパク質ワクチンの保護反応を増加させるための戦略は、タンパク質の選択
的なエピトープに免疫性を与えることである。この論理的根拠は、エピトープワ
クチンが無関係の部分を除く最も適切な免疫原性ペプチド成分を含むということ
である。したがって、捜索は新しく同定されたタンパク質の最も高等な抗原性の
部分のために実行される。A strategy for increasing the protective response of protein vaccines is to immunize selective epitopes of the protein. The rationale for this is that the epitope vaccine contains the most relevant immunogenic peptide components excluding irrelevant parts. Therefore, the search is carried out for the most highly antigenic part of the newly identified protein.
【００２８】
新しく発見されたタンパク質からのＴ細胞エピトープを同定するために、Ｔ細
胞エピトープを知るためのホモローグの配列の最初の電子捜索が行われる。さら
に、広範囲のＴ細胞エピトープマッピングが実行される。タンパク質、つまりPr
oA、ProB、ORF、シトクロムオキシダーゼホモローグおよび部分的なリポタンパ
ク質シグナルペプチダーゼホモローグの各々は、免疫原性ペプチド断片をテスト
される。従来技術として知られている技術によるＴ細胞エピトープのマッピング
は、文献（Launois et al.,1994 ; Lee and Horwitz, 1999）に記載されている
。要するに、短い、重なり合っているペプチド配列（9-20のアミノ酸）は、当該
タンパク質の全長以上に合成される。これらの短いペプチド断片は注目タンパク
質で免疫抗原性を与えられている健康なイヌを使用してテストされる。イヌから
の末梢血液単核細胞はＴ細胞刺激特性およびIFN-γ誘導特性をテストされる。最
も強い反応を誘発するこれらの断片はＴ細胞エピトープワクチンとして最良の候
補である。To identify T cell epitopes from newly discovered proteins, an initial electronic search of the homologous sequence to identify T cell epitopes is performed. In addition, extensive T cell epitope mapping is performed. Protein, Pr
Each of the oA, ProB, ORF, the cytochrome oxidase homolog and the partial lipoprotein signal peptidase homolog are tested for immunogenic peptide fragments. Mapping of T cell epitopes by techniques known as the prior art is described in the literature (Launois et al., 1994; Lee and Horwitz, 1999). In short, short, overlapping peptide sequences (9-20 amino acids) are synthesized over the full length of the protein. These short peptide fragments are tested using healthy dogs that have been immunoantigenic with the protein of interest. Peripheral blood mononuclear cells from dogs are tested for T cell stimulatory properties and IFN-γ inducing properties. Those fragments that elicit the strongest response are the best candidates for T cell epitope vaccines.
【００２９】
一度最良のエピトープを作る断片が同定されると、気管支敗血症菌（Bordetel
la bronchiseptica）の組換えアデニレートシクラーゼが、E.canis ＣＤ８＋Ｔ
細胞エピトープを運んで構築される。気管支敗血症菌のアデニレートシクラーゼ
トキシン（CyaA）は、イヌの疾病の原因となり、免疫反応を誘発する。さらに、
CyaAは、細胞質内を目標とすることに十分に適している。1,706-残基の長いタン
パク質のN-末端400のアミノ酸残基に対応するその触媒領域（ＡＣ）は、免疫シ
ステムの細胞を含む多くの真核細胞に与えられることができる。また、トキシン
内部移行は受容体伝達エンドサイトーシスに依存せず、触媒領域が細胞質膜を通
ってターゲット細胞の細胞質ゾルに直接与えられることを示唆している。緑膿菌
（Peucedomonas aeruginosa）エキソトキシンＡ（ＰＥ）は、従来技術として知
られており、文献（Donnelly et al., 1993）に記載されている技術によって、
細胞へペプチドやタンパク質を与えるためにこの過程で使用することができる別
のトキシンである。Once the fragment that produces the best epitope has been identified, the B.
La bronchiseptica) recombinant adenylate cyclase is E. canis CD8 + T
It is constructed by carrying cell epitopes. The bronchial septicemia adenylate cyclase toxin (CyaA) causes disease in dogs and elicits an immune response. further,
CyaA is well suited for targeting in the cytoplasm. Its catalytic region (AC), which corresponds to the N-terminal 400 amino acid residues of a 1,706-residue long protein, can be conferred on many eukaryotic cells, including cells of the immune system. In addition, toxin internalization is independent of receptor-mediated endocytosis, suggesting that the catalytic domain is directly translocated to the cytosol of target cells through the cytoplasmic membrane. Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A (PE) is known as a prior art, and by the technique described in the literature (Donnelly et al., 1993),
It is another toxin that can be used in this process to deliver peptides and proteins to cells.
【００３０】
異質のペプチド（１６塩基）はその安定性又は触媒作用やカルモジュリン結合
特性を変更せずに、CyaAのＡＣ領域の様々なサイトに挿入されている。したがっ
て、タンパク質工学は、特にＣＴＬを刺激する抗原の設計および付与を許可する
。特定のＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導は、単球中のE.canisの細胞内持続性によりイヌe
hrlichiosisコントロールに重要な役割を果たすことができる。A heterologous peptide (16 bases) is inserted at various sites in the AC region of CyaA without altering its stability or catalysis or calmodulin binding properties. Thus, protein engineering permits the design and delivery of antigens that specifically stimulate CTL. Induction of specific CD8 + T cells is induced by intracellular persistence of E. canis in monocytes in dog e
can play an important role in hrlichiosis control.
【００３１】
気管支敗血症菌のアデニレートシクラーゼ（ＡＣ）トキシン（cya）遺伝子は
クローンとして生成される。一方のProA、ProB、ORF、シトクロムオキシダーゼ
ホモローグ又は部分的リポタンパク質シグナルペプチダーゼホモローグのどれか
の９から２０のアミノ酸クラスＩのＴ細胞エピトープをコード化している合成二
重らせん構造のオリゴヌクレオチドは、気管支敗血症菌コドン使用法によって設
計されている。補足的なオリゴヌクレオチドは、cyaのクローンとして生成され
たＡＣをコード化する配列の過度に変動する領域に挿入される。この技術は他の
システムでの従来技術で知られており、文献（Sebo et al., 1995 ; Guermonpre
z et al., 1999）に記載されている。The adenylate cyclase (AC) toxin (cya) gene of B. bronchiseptica is cloned. One of the ProA, ProB, ORF, cytochrome oxidase homologues or partial lipoprotein signal peptidase homologues is a synthetic double helix oligonucleotide encoding a 9 to 20 amino acid class I T cell epitope. Designed by sepsis codon usage. Complementary oligonucleotides are inserted in the hypervariable regions of the cloned AC encoding sequence of cya. This technique is known in the prior art for other systems and is described in the literature (Sebo et al., 1995; Guermonpre
z et al., 1999).
【００３２】
キメラcya遺伝子を運ぶ組換えプラスミドは挿入されたエピトープのコピー数
および定位を限定するために配列を決定される。正確な定位中にあるＴ細胞エピ
トープ（ＣＤ８＋）を指定する挿入の完全なコピーを備えたプラスミドは、配列
が決定したプラスミドから選択される。真核細胞に入る新しいキメラタンパク質
の能力はエピトープの細胞内にターゲティングを確実にするために必要である（
Fayolle et al., 1996）。Recombinant plasmids carrying the chimeric cya gene are sequenced to limit the copy number and orientation of the inserted epitope. A plasmid with a complete copy of the insert that specifies the T cell epitope (CD8 + ) in the correct orientation is selected from the sequenced plasmids. The ability of the new chimeric protein to enter eukaryotic cells is necessary to ensure intracellular targeting of the epitope (
Fayolle et al., 1996).
【００３３】
ワクチンは２つの方法のうちの１つで作ることができる。組換えキメラタンパ
ク質は精製され、イヌに予防接種するために使用することができる。あるいはま
た、アデニレートシクラーゼへのインフレーム挿入によってＴ細胞エピトープや
E.canis遺伝子を運ぶ弱まった気管支敗血症菌株は対立交換によってつくられる
。対立交換は従来技術で知られている技術であり、文献（Cotter and Miller, 1
994）に記載されている。Vaccines can be made in one of two ways. The recombinant chimeric protein is purified and can be used to vaccinate dogs. Alternatively, in-frame insertion into adenylate cyclase may lead to T cell epitope or
A weakened B. bronchiseptica strain carrying the E. canis gene is created by allelic exchange. Conflict exchange is a technique known in the prior art and is described in the literature (Cotter and Miller,
994).
【００３４】
最後に、アデニレートシクラーゼ-ProA、ProB、ORF、シトクロムオキシダーゼ
ホモローグ又はリポタンパク質シグナルペプチダーゼホモローグキメラタンパク
質の予防接種をしたイヌのE.canis感染に対する保護が限定される。野生タイプ
と組換えＡＣおよびＣｙＡはＰＢＳの実用的な濃度に希釈され、キメラタンパク
質はイヌの筋肉内か皮下に注入される。あるいはまた、Ｔ細胞エピトープはフレ
ーム中の、弱まった気管支敗血症菌株のアデニレートシクラーゼ遺伝子に挿入さ
れ、イヌは生きたバクテリアを与えられる。Finally, there is limited protection against E. canis infection in dogs vaccinated with adenylate cyclase-ProA, ProB, ORF, cytochrome oxidase homologs or lipoprotein signal peptidase homologue chimeric proteins. Wild type and recombinant AC and CyA are diluted to a working concentration in PBS and the chimeric protein is injected intramuscularly or subcutaneously in dogs. Alternatively, the T cell epitope is inserted in frame into the weakened B. bronchiseptica adenylate cyclase gene and the dog is fed with live bacteria.
【００３５】
組換え抗原は様々な病原体に対する人間や動物の予防接種のための有望な候補
である。しかしながら、重大な欠点は在来の抗原と比較して組換え抗原の不充分
な免疫抗原性である。それ故に新しい組換えワクチン開発の主な試みは、抗原の
免疫抗原性を増加する新しいアジュバントのシステムを持つことである。サイト
カインは強力な免疫調整分子である。本発明でアジュバントとして使用されるサ
イトカインはIL-12（インターロイキン-12）、GM-CSF（顆粒球・マクロファージ
・コロニー刺激因子）、IL-1β（インターロイキン-1β）及びγ-IFN（ガンマイ
ンターフェロン）を含むが制限はされない。Recombinant antigens are promising candidates for vaccination of humans and animals against various pathogens. However, a significant drawback is the poor immunogenicity of recombinant antigens compared to native antigens. Therefore, a major challenge in developing new recombinant vaccines is to have a new system of adjuvants that increase the immunogenicity of the antigen. Cytokines are powerful immunomodulatory molecules. Cytokines used as an adjuvant in the present invention include IL-12 (interleukin-12), GM-CSF (granulocyte / macrophage / colony stimulating factor), IL-1β (interleukin-1β) and γ-IFN (gamma interferon). ), But is not limited.
【００３６】
これらのサイトカインは、予防接種を受けたホストの中で発熱性及び／又は扇
動的徴候を含む反副作用を持つことができる。したがって、全サイトカインタン
パク質の副作用を避けるために、交互のアプローチは強く望まれた免疫調整特性
を備えた合成ペプチド断片を使用することである。IL-1βのノナペプチド配列VQ
GEESNDKは強力な免疫増加特性を授けられ、免疫抗原性の増加のためのサイトカ
インの使用を例証するためにここで論じられる。These cytokines can have adverse side effects, including febrile and / or inflammatory signs in the vaccinated host. Therefore, in order to avoid the side effects of total cytokine proteins, an alternative approach is to use synthetic peptide fragments with highly desirable immunomodulatory properties. IL-1β nonapeptide sequence VQ
GEES NDK is endowed with potent immunopotentiating properties and is discussed here to illustrate the use of cytokines for increased immunogenicity.
【００３７】
このノナペプチドは、ProA、ProB、ORF、シトクロムオキシダーゼホモローグ
、又は部分的なリポタンパク質シグナルペプチダーゼホモローグタンパク質に挿
入され、そしてその免疫抗原性は在来のタンパク質のそれと比較される。伝えら
れるところによると、不充分な免疫原性組換え抗原の中へのこの配列の挿入は、
予防接種の後に強い保護免疫反応の機会を増加させる。このペプチドは、T-依存
抗原とT-非依存抗原の両方に対する生体内の免疫反応を高めることができた。イ
ヌのIL-1β配列は、見たところでは、その不適当な扇動的支持特性の多くを欠い
ている間、IL-1βの全体分子の多くの免疫調整活動を模倣するかもしれない。こ
の戦略はProA、ProB、ORF、シトクロムオキシダーゼ、部分的なリポタンパク質
シグナルペプチダーゼホモローグおよび他のE.canis抗原の免疫抗原性を増加さ
せるために使用される。This nonapeptide is inserted into ProA, ProB, ORF, cytochrome oxidase homologue, or partial lipoprotein signal peptidase homologue protein, and its immunogenicity is compared to that of the native protein. Insertion of this sequence into an insufficiently immunogenic recombinant antigen reportedly resulted in:
Increases the chance of a strong protective immune response after vaccination. This peptide was able to enhance the in vivo immune response to both T-dependent and T-independent antigens. The canine IL-1β sequence may apparently mimic many of the immunomodulatory activities of the entire molecule of IL-1β, while lacking many of its inadequate inflammatory supporting properties. This strategy is used to increase the immunogenicity of ProA, ProB, ORFs, cytochrome oxidase, partial lipoprotein signal peptidase homologs and other E. canis antigens.
【００３８】
プラスミドpYFC199は、E.canisからのProA、ProB、ORF、シトクロムオキシダ
ーゼホモローグ、又は部分的なリポタンパク質シグナルペプチダーゼタンパク質
を含んでいる断片の挿入に基づいてpBR322プラスミドに由来する。このプラスミ
ドは、外因的配列をコード化するインフレーム挿入が挿入されることができる独
特のHindIIIサイトを含んでいる。イヌのIL-1β 163-171ペプチドをコード化す
る補足的な２つのオリゴヌクレオチド
AGGCTTGTTCAGGGTGAAGAAGAATCCAACGACAAAAGCTT
およびAAGCTTTTGTCGTTGGATTCTTCACCCTGAACTTGCCAはアニールされ、HindIIIで切
断され、pYFC199 HindIIIサイトに挿入される。キメラIL-1βを運ぶ組換えプラ
スミドは挿入されたエピトープの定位を決定するために配列が決定される。The plasmid pYFC199 is derived from the pBR322 plasmid based on insertion of a fragment containing ProA, ProB, ORF, cytochrome oxidase homolog, or partial lipoprotein signal peptidase protein from E. canis. This plasmid contains a unique HindIII site into which an in-frame insert encoding an exogenous sequence can be inserted. Two complementary oligonucleotides, AGGCTTGTTCAGGGTGAAGAAGAATCCAACGACAAAAGCTT and AAGCTTTTGTCGTTGGATTCTTCACCCTGAACTTGCCA, which encode the canine IL-1β 163-171 peptide, are annealed, cleaved with HindIII, and inserted into the pYFC199 HindIII site. The recombinant plasmid carrying the chimeric IL-1β is sequenced to determine the orientation of the inserted epitope.
【００３９】
ワクチンとしての組換えタンパク質の有効性はイヌでテストされる。精製タン
パク質は、イヌの腹腔内に注入される。特定病原体除去（ＳＰＦ）イヌは５つの
グループに分類される。：１つのグループは、ProA、ProB、ORF、シトクロムオ
キシダーゼホモローグ、又は部分的なリポタンパク質シグナルペプチダーゼホモ
ローグに由来するE.canis ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープを運ぶ気管支敗血症菌の組
換えアデニレートシクラーゼを与えられる。１つのグループは、コントロールと
して気管支敗血症菌の組換えアデニレートシクラーゼを与えられる。１つのグル
ープはProA、ProB、ORF、シトクロムオキシダーゼホモローグ、又は部分的なリ
ポタンパク質シグナルペプチダーゼホモローグタンパク質に加えてイヌのIL-1β
163-171挿入を与えられる。１つのグループは、ProA、ProB、ORF、シトクロム
オキシダーゼホモローグ、又は部分的なリポタンパク質シグナルペプチダーゼホ
モローグ単独に由来するＴ細胞エピトープを与えられる。最後のグループはネガ
ティブコントロールとしてＰＢＳを与えられる。The effectiveness of the recombinant protein as a vaccine is tested in dogs. Purified protein is injected intraperitoneally in dogs. Specific pathogen-free (SPF) dogs are divided into five groups. One group gave recombinant adenylate cyclase of B. bronchiseptica carrying an E. canis CD8 + T cell epitope derived from ProA, ProB, ORF, cytochrome oxidase homolog, or partial lipoprotein signal peptidase homolog To be One group receives the recombinant adenylate cyclase of B. bronchiseptica as a control. One group is ProA, ProB, ORF, cytochrome oxidase homologue, or partial lipoprotein signal peptidase homologue protein plus canine IL-1β.
163-171 Given the insertion. One group is endowed with T cell epitopes derived from ProA, ProB, ORFs, cytochrome oxidase homologs, or partial lipoprotein signal peptidase homologs alone. The last group receives PBS as a negative control.
【００４０】
全ての動物は、４回予防接種を受ける（各々30-40μgずつ）。イヌは、１０７
E.canisの最後の予防接種の１０日後に試される。５回のポストチャレンジで各
イヌからのおよそ１mlの血液がＥＤＴＡチューブに集められる。予防接種を受け
たグループがコントロールのグループと比較して有機体を除去するかどうかは、
培養とＰＣＲによってテストされる。クローンを作られた遺伝子に由来する２つ
のプライマーはこれらのイヌからの組織または血液サンプルからの遺伝生成物を
増幅するために使用することができる。内部プライマーもＰＣＲ遺伝生成物を交
配させるためにオリゴヌクレオチドプローブとして使用のために設計することが
できる。All animals receive four vaccinations (30-40 μg each). Dogs are tested 10 days after the last vaccination with 10 7 E. canis. Approximately 1 ml of blood from each dog is collected in EDTA tubes with 5 post-challenge. Whether the vaccinated group removes organisms compared to the control group
Tested by culture and PCR. Two primers derived from the cloned gene can be used to amplify the genetic product from tissue or blood samples from these dogs. Internal primers can also be designed for use as oligonucleotide probes to hybridize PCR genetic products.
【００４１】
本発明は、E.canisバクテリアに対してとても必要とされるワクチンを提供す
る。そのワクチンはイヌの単球のエーリキオシスから世界中のイヌを保護するた
めに使用することができる。The present invention provides a much needed vaccine against E. canis bacteria. The vaccine can be used to protect dogs around the world from canine monocyte erythosis.
【００４２】
従って、ここに記述された発明の実施例が、単に発明の法則の適用の例証であ
ることが理解されるであろう。実施例を詳しく述べるための本文中の文献は、請
求項の範囲を限定するものではなく、それ自身本発明にとって不可欠なものとみ
なされるその特徴を説明する。Accordingly, it will be appreciated that the embodiments of the invention described herein are merely illustrative of the application of the principles of the invention. The documents in the text which describe the embodiments in detail do not limit the scope of the claims, but rather describe the features themselves regarded as essential to the invention.
【配列表】 [Sequence list]
【図１】 ライブラリー・スクリーンの中で識別された3つのクローンを示す。[Figure 1] The three clones identified in the library screen are shown.
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成１４年２月１２日（２００２．２．１２）[Submission date] February 12, 2002 (2002.2.12)
【手続補正１】[Procedure Amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】特許請求の範囲[Name of item to be amended] Claims
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正の内容】[Contents of correction]
【特許請求の範囲】[Claims]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｈ０４５ Ａ６１Ｐ 31/04 １７１ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 37/04 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ０７Ｋ 14/47 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 33/566 37/66 Ｇ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 FB03 4B024 AA01 BA31 CA01 DA02 GA11 HA20 4B064 AG31 CA10 CA19 CC24 DA01 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA17 BA41 BA44 DA13 DA19 DA24 DA33 DC22 MA02 MA65 MA66 NA14 ZB09 ZB35 ZC61 4C085 AA03 AA05 AA38 BA15 BB11 CC04 CC07 CC21 CC24 CC31 DD62 DD86 EE01 EE03 FF02 FF12 FF14 GG02 GG03 4H045 AA11 AA30 BA10 CA11 DA86 EA31 FA74 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) A61K 48/00 C07K 14/47 4H045 A61P 31/04 171 C12P 21/02 C 37/04 G01N 33/15 Z C07K 14/47 33/50 Z C12P 21/02 33/53 D G01N 33/15 33/566 33/50 C12N 15/00 ZNAA 33/53 A61K 37/02 33/566 37/66 G (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW ), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, BZ, C A, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, MZ, NO, NZ, PL, PT, RO , RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, UZ, VN, YU, ZA, ZWF F terms (reference) 2G045 AA40 DA36 FB03 4B024 AA01 BA31 CA01 DA02 GA11 HA20 4B064 AG31 CA10 CA19 CC24 DA01 4C084 AA02 AA07 AA13 BA01 BA08 BA17 BA41 BA44 DA1 3 DA19 DA24 DA33 DC22 MA02 MA65 MA66 NA14 ZB09 ZB35 ZC61 4C085 AA03 AA05 AA38 BA15 BB11 CC04 CC07 CC21 CC24 CC31 DD62 DD86 EE01 EE03 FF02 FF12 FF14 GG02 GG03 4H045 AA11 AA30 BA31 CA74 DA86 EA
Claims (46)
る組換えDNA ｂ）配列番号５で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化す
る組換えDNA ｃ）配列番号７で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化す
る組換えDNA ｄ）配列番号９で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化す
る組換えDNA ｅ）配列番号１１で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化
する組換えDNA、および ｆ）E.canisに対する免疫反応を誘発するタンパク質をコード化する、上述のDNA
の任意の部分1. A recombinant DNA comprising a DNA selected from the following group. a) Recombinant DNA encoding a protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3 b) Recombinant DNA encoding a protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 5 c) SEQ ID NO: 7 Recombinant DNA encoding a protein having an amino acid sequence as shown d) Recombinant DNA encoding a protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 9 e) Amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 11 DNA encoding a protein having: and f) the above DNA encoding a protein that induces an immune response to E. canis
Any part of
とを特徴とする請求項1に記載の組換えDNA。2. Recombinant DNA according to claim 1, characterized in that said DNA encodes at least one immunogenic epitope.
いることを特徴とする請求項３に記載の組換えタンパク質。4. Recombinant protein according to claim 3, characterized in that said protein comprises at least one immunogenic epitope.
るようなベクターに挿入された組換えDNAを発現することができるベクター、及
び ｂ）前記DNAが以下の群から選択されることを特徴とする前記ベクターが挿入さ
れた組換えDNA i．配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化する組換
えDNA ii．配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化する組換
えDNA iii．配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化する組
換えDNA iv．配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化する組換
えDNA v．配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化する組
換えDNA、および vi．E.canisに対する免疫反応を誘発するタンパク質をコード化する前記DNAの任
意の部分6. The vaccine according to claim 5, which comprises the following constitution. a) a vector capable of expressing recombinant DNA inserted into the vector such that the recombinant protein is expressed when the vector is provided in a suitable host, and b) the DNA is selected from the following group Recombinant DNA having the vector inserted therein, i. Recombinant DNA encoding a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 ii. Recombinant DNA encoding a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 iii. Recombinant DNA encoding a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 iv. Recombinant DNA encoding a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 v. Recombinant DNA encoding a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11, and vi. Any portion of said DNA that encodes a protein that elicits an immune response against E. canis
徴とする請求項６に記載のワクチン。7. The vaccine according to claim 6, wherein the DNA further comprises a DNA encoding a CpG motif.
とを特徴とする請求項６に記載のワクチン。 ａ）サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター ｂ）ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(t−PA)、及び ｃ）ヒト伸長因子α(EF−1α)のプロモーター／エンハンサー領域8. The vaccine according to claim 6, wherein the DNA further contains a promoter selected from the following group. a) cytomegalovirus (CMV) immediate early promoter b) human tissue plasminogen activator (t-PA), and c) promoter / enhancer region of human elongation factor α (EF-1α)
６に記載のワクチン。 ａ）pcDNA3 ｂ）pC1 ｃ）VR1012、及び ｄ）VR10209. The vaccine according to claim 6, wherein the vector is selected from the following group. a) pcDNA3 b) pC1 c) VR1012, and d) VR1020
トに投与されることを特徴とする請求項６に記載のワクチン。 ａ）筋肉注射 ｂ）静脈注射、及び ｃ）遺伝子銃による注射10. The vaccine according to claim 6, wherein the vaccine is administered to the host by a method selected from the following group. a) intramuscular injection b) intravenous injection, and c) gene gun injection
のワクチン。11. Vaccine according to claim 10, characterized in that the host is a dog.
分12. The vaccine according to claim 5, which comprises the following constitution. a) Recombinant protein selected from the following groups i. A protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3 ii. A protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 5 iii. A protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 7 iv. A protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 9 v. A protein having an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 11, and vi. Any part of the above proteins that elicit an immune response against E. canis
含むことを特徴とする請求項１２に記載のワクチン。 ａ）水酸化アルミニウム ｂ）QuilA、および ｃ）Montamide13. The vaccine according to claim 12, wherein the vaccine further comprises an adjuvant selected from the following group. a) Aluminum hydroxide b) Quil A, and c) Montamide
に含むことを特徴とする請求項１２に記載のワクチン。14. The vaccine of claim 12, further comprising a cytokine effectively associated with the recombinant protein.
請求項１４に記載のワクチン。 ａ）インターロイキン−1β(IL−1β) ｂ）顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子(GM−CSF) ｃ）γ−インターフェロン(γ−IFN) ｄ）IL−1βタンパク質由来のアミノ酸であるVQGEESNDK、および ｅ）E.canisに対する改善された免疫原性反応を誘発する、上述のサイトカイン
のうちの任意の部分15. The vaccine according to claim 14, wherein the cytokine is selected from the following group. a) interleukin-1β (IL-1β) b) granulocyte / macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) c) γ-interferon (γ-IFN) d) VQGEESNDK, which is an amino acid derived from the IL-1β protein, and e) any part of the above mentioned cytokines which elicits an improved immunogenic response to E. canis.
投与されることを特徴とする請求項１２に記載のワクチン。 ａ）筋肉注射、および ｂ）静脈注射16. The vaccine according to claim 12, wherein the vaccine is administered to the host by a method selected from the following group. a) intramuscular injection, and b) intravenous injection
ワクチン。17. The vaccine according to claim 16, wherein the host is a dog.
ノ酸ペプチド断片を含むことを特徴とする、T細胞エピトープを含有する組換え
タンパク質を含む請求項５に記載のワクチン。 ａ）配列番号３で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質 ｂ）配列番号５で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質 ｃ）配列番号７で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質 ｄ）配列番号９で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質 ｅ）配列番号１１で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質 ｆ）E.canisに対する免疫反応を誘発する、上記のタンパク質の任意の部分。18. The vaccine according to claim 5, comprising a recombinant protein containing a T cell epitope, characterized in that the T cell epitope comprises an amino acid peptide fragment of a protein selected from the following group. a) a protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3 b) a protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 5 c) a protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 7 d) SEQ ID NO: 9 Protein having an amino acid sequence as shown in e) Protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 11 f) Any part of the above protein which induces an immune response against E. canis.
徴とする請求項１８に記載のワクチン。19. The vaccine according to claim 18, wherein the amino acid peptide fragment contains 9 to 20 amino acids.
パク質をコード化する組換えDNAをさらに含む、請求項１８に記載のワクチン。20. The vaccine of claim 18, further comprising recombinant DNA encoding a protein capable of internalizing into eukaryotic cells, including cells of the immune system.
核細胞へ内部移行することができることを特徴とする請求項２０に記載のワクチ
ン。 ａ）気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）のアデニル酸シクラーゼの
組換え体、及び ｂ）緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のエキソトキシンA(PE)組換え体21. The vaccine according to claim 20, wherein the protein is capable of internalization into a eukaryotic cell containing a toxin selected from the following group. a) a recombinant adenylate cyclase of Bordetella bronchiseptica, and b) an exotoxin A (PE) recombinant of Pseudomonas aeruginosa
に投与されることを特徴とする請求項１８に記載のワクチン。 ａ）筋肉注射、および ｂ）皮下注射22. The vaccine of claim 18, wherein the vaccine is administered to the host by a method selected from the group below. a) intramuscular injection, and b) subcutaneous injection
ワクチン。23. The vaccine of claim 22, wherein the host is a dog.
する方法。 ａ）タンパク質が以下の群から選択されることを特徴とする、タンパク質の全長
に渡る重複タンパク質断片の合成 i．配列番号３で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質 ii．配列番号５で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質 iii．配列番号７で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質 iv．配列番号９で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質 v．配列番号１１で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質 vi．E.canisに対する免疫反応を誘発する上述のタンパク質の任意の部分 ｂ）前記ペプチド断片がホスト動物内において免疫反応を誘発するかどうかを決
定するためのペプチド断片の測定、及び ｃ）前記断片が免疫反応を誘発するかどうかをE.canisの前記T細胞エピトープと
しての前記ペプチド断片の同定24. A method for identifying a T cell epitope against E. canis, which comprises the following constitution. a) Synthesis of overlapping protein fragments over the entire length of the protein, characterized in that the protein is selected from the group i. A protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3 ii. A protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 5 iii. A protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 7 iv. A protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 9 v. A protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 11 vi. Any portion of the above proteins that elicit an immune response against E. canis b) measurement of the peptide fragment to determine whether the peptide fragment elicits an immune response in a host animal, and c) the fragment is immune. Identification of the peptide fragment as the T cell epitope of E. canis whether it elicits a response
る請求項２４に記載の方法。25. The method of claim 24, wherein the peptide fragment comprises 9-20 amino acids.
。 ａ）ベクター内に挿入された組換えDNAを発現することができるベクターの選択
ｂ）前記DNAが以下の群から選択されることを特徴とする、前記ベクターが適切
なホスト内に供給された場合に、組換えタンパク質として発現する前記ベクター
への組換えDNAの挿入 i．配列番号３で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化す
る組換えDNA ii．配列番号５で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化す
る組換えDNA iii．配列番号７で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化
する組換えDNA iv．配列番号９で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化す
る組換えDNA ｖ．配列番号１１で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化
する組換えDNA vi．E.canisに対する免疫反応を誘発するタンパク質をコード化する上述のDNAの
任意の部分26. A method for producing a vaccine against E. canis having the following constitution. a) selection of a vector capable of expressing the recombinant DNA inserted in the vector b) when the vector is provided in a suitable host, characterized in that the DNA is selected from the following group Inserting the recombinant DNA into the vector, which is expressed as a recombinant protein, i. Recombinant DNA encoding a protein having an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 3 ii. Recombinant DNA encoding a protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 5 iii. Recombinant DNA encoding a protein having an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 7 iv. Recombinant DNA encoding a protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 9 v. Recombinant DNA encoding a protein having an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 11 vi. Any part of the above DNA encoding a protein that elicits an immune response against E. canis
を特徴とする請求項２６に記載の方法。27. The method of claim 26, wherein the DNA further comprises DNA encoding a CpG motif.
ことを特徴とする請求項２６に記載の方法。 ａ）サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター ｂ）ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子(t−PA）、及び ｃ）ヒト伸長因子α(EF−1α)のプロモーター／エンハンサー領域28. The method according to claim 26, wherein the DNA further comprises a promoter selected from the following group. a) Cytomegalovirus (CMV) immediate early promoter b) Human tissue plasminogen activator (t-PA), and c) Human elongation factor α (EF-1α) promoter / enhancer region
求項２６に記載の方法。 ａ）pcDNA3 ｂ）pC1 ｃ）VR1012、及び ｄ）VR102029. The method according to claim 26, characterized in that the vector is selected from the following group: a) pcDNA3 b) pC1 c) VR1012, and d) VR1020
入されることを特徴とする請求項２６に記載の方法 ａ）筋肉注射 ｂ）静脈注射、及び ｃ）遺伝子銃による注射30. The method according to claim 26, wherein the virus is inserted into the host by a method selected from the following group: a) intramuscular injection, b) intravenous injection, and c) by gene gun. injection
方法。31. The method of claim 30, wherein the host is a dog.
ａ）ベクター内に挿入された組換えタンパク質を発現することができるベクター
の選択 ｂ）DNAが以下の群から選択されることを特徴とする、前記ベクターが細菌株内
で形質転換する場合に、組換えタンパク質が発現するような組換えDNAの前記ベ
クター内への挿入 i．配列番号３で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化す
る組換えDNA ii．配列番号５で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化す
る組換えDNA iii．配列番号７で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化
する組換えDNA iv．配列番号９で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化す
る組換えDNA ｖ．配列番号１１で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質をコード化
する組換えDNA vi．E.canisに対する免疫反応を誘発するタンパク質をコード化する上記DNAの任
意の部分 ｃ）前記細菌株からの組換えタンパク質の回収32. A method for producing a vaccine against E. canis, which comprises the following constitution.
a) selection of a vector capable of expressing the recombinant protein inserted in the vector b) DNA is selected from the following group, when said vector is transformed in a bacterial strain, Insertion of recombinant DNA into the vector such that the recombinant protein is expressed i. Recombinant DNA encoding a protein having an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 3 ii. Recombinant DNA encoding a protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 5 iii. Recombinant DNA encoding a protein having an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 7 iv. Recombinant DNA encoding a protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 9 v. Recombinant DNA encoding a protein having an amino acid sequence as set forth in SEQ ID NO: 11 vi. Any portion of the above DNA encoding a protein that elicits an immune response against E. canis c) Recovery of recombinant protein from the bacterial strain
含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。 ａ）水酸化アルミニウム ｂ）QuilA、および ｃ）Montamide33. The method of claim 32, wherein the vaccine further comprises an adjuvant selected from the following group. a) Aluminum hydroxide b) Quil A, and c) Montamide
含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。 ａ）tac ｂ）T5、および ｃ）T734. The method of claim 32, wherein the vaccine further comprises a promoter selected from the group: a) tac b) T5, and c) T7
求項３２に記載の方法。35. The method according to claim 32, wherein the bacterial strain is E. coli.
項３２に記載の方法。 ａ）pREST ｂ）pET ｃ）pKK233−336. The method of claim 32, wherein the vector is selected from the group: a) pREST b) pET c) pKK233-3
をさらに含むことを特徴とする請求項３２に記載の方法。37. The method of claim 32, wherein the vaccine further comprises an engineered cytokine associated with the vaccine.
請求項３７に記載の方法。 ａ）インターロイキン−1β(IL−1β) ｂ）顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子(GM−CSF) ｃ）γ−インターフェロン(γ−IFN) ｄ）IL−1βタンパク質由来のアミノ酸であるVQGEESNDK、および ｅ）E.canisに対する改善された免疫原性反応を誘発する、上述のサイトカイン
のうちの任意の部分38. The method of claim 37, wherein the cytokine is selected from the group: a) interleukin-1β (IL-1β) b) granulocyte / macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) c) γ-interferon (γ-IFN) d) VQGEESNDK, which is an amino acid derived from the IL-1β protein, and e) any part of the above mentioned cytokines which elicits an improved immunogenic response to E. canis.
入されることを特徴とする請求項３２に記載の方法。 ａ）筋肉注射 ｂ）静脈注射39. The method of claim 32, wherein the vaccine is injected into the host in a method selected from the group below. a) intramuscular injection b) intravenous injection
方法。40. The method of claim 39, wherein the host is a dog.
むことを特徴とする、T細胞エピトープを含む組換えタンパク質の選択 i．配列番号３で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質 ii．配列番号５で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質 iii．配列番号７で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質 iv．配列番号９で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質 v．配列番号１１で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質 vi．E.canisに対する免疫反応を誘発する上述のタンパク質の任意の部分 ｂ）前記タンパク質からの前記T細胞エピトープの同定 ｃ）前記エピトープをタンパク質として発現することができる構築物内への前記
T細胞エピトープの取り込み ｄ）前記タンパク質の回収41. A method for producing a T cell epitope vaccine, which comprises the following constitution. a) Selection of recombinant proteins containing T cell epitopes, characterized in that the T cell epitopes comprise peptide fragments of proteins selected from the following group i. A protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3 ii. A protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 5 iii. A protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 7 iv. A protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 9 v. A protein having an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 11 vi. Any portion of the above proteins that elicits an immune response against E. canis b) Identification of the T cell epitopes from the protein c) The above into a construct capable of expressing the epitope as a protein
Uptake of T cell epitope d) Recovery of the protein
特徴とする請求項４１に記載の方法42. The method of claim 41, wherein said amino acid peptide fragment comprises 9 to 20 amino acids.
の細胞を含む真核生物の細胞内に内部移行することができるタンパク質をコード
化する組換えDNAを含むことを特徴とする請求項４１に記載の方法。43. The construct capable of expressing the epitope comprises recombinant DNA encoding a protein capable of internalizing into cells of eukaryotes, including cells of the immune system. 42. The method of claim 41, wherein
が以下の群から選択されるトキシンを含むことを特徴とする請求項４３に記載の
方法。 ａ）気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）のアデニル酸シクラーゼの
組換え、および ｂ）緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）のエキソトキシンA(PE)組換え体44. The method of claim 43, wherein the protein capable of internalizing into a eukaryotic cell comprises a toxin selected from the group below. a) Recombination of adenylate cyclase of Bordetella bronchiseptica, and b) Exotoxin A (PE) recombinant of Pseudomonas aeruginosa
入されることを特徴とする請求項４１に記載の方法。 ａ）筋肉注射、および ｂ）静脈注射45. The method of claim 41, wherein the vaccine is injected into the host by a method selected from the group consisting of: a) intramuscular injection, and b) intravenous injection
方法。46. The method of claim 45, wherein the host is a dog.
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