JP2003505035A - Diagnosis method - Google Patents
Diagnosis methodInfo
- Publication number
- JP2003505035A JP2003505035A JP2001511214A JP2001511214A JP2003505035A JP 2003505035 A JP2003505035 A JP 2003505035A JP 2001511214 A JP2001511214 A JP 2001511214A JP 2001511214 A JP2001511214 A JP 2001511214A JP 2003505035 A JP2003505035 A JP 2003505035A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- subject
- specific
- tumor
- sequence
- genomic imprinting
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 56
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 49
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims abstract description 45
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 45
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 38
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 38
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 23
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 36
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 34
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 claims description 32
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 claims description 31
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 18
- 101150084041 WT1 gene Proteins 0.000 claims description 16
- 108700020467 WT1 Proteins 0.000 claims description 15
- 102000040856 WT1 Human genes 0.000 claims description 15
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 14
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 11
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 claims description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 10
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 10
- 230000004075 alteration Effects 0.000 claims description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 4
- 102100022748 Wilms tumor protein Human genes 0.000 claims description 2
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 9
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 8
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 7
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 6
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 206010009253 Clear cell sarcoma of the kidney Diseases 0.000 description 6
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 6
- 208000030748 clear cell sarcoma of kidney Diseases 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 4
- 101000855055 Homo sapiens Putative Wilms tumor upstream neighbor 1 gene protein Proteins 0.000 description 4
- 208000033383 Neuroendocrine tumor of pancreas Diseases 0.000 description 4
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 4
- 102100020713 Putative Wilms tumor upstream neighbor 1 gene protein Human genes 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 4
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 4
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 208000029340 primitive neuroectodermal tumor Diseases 0.000 description 4
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 101000621309 Homo sapiens Wilms tumor protein Proteins 0.000 description 3
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 3
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 3
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 3
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- 101001076292 Homo sapiens Insulin-like growth factor II Proteins 0.000 description 2
- 102100025947 Insulin-like growth factor II Human genes 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100028123 Macrophage colony-stimulating factor 1 Human genes 0.000 description 2
- 229910003177 MnII Inorganic materials 0.000 description 2
- 208000009277 Neuroectodermal Tumors Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000008995 epigenetic change Effects 0.000 description 2
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000029795 kidney development Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 231100001221 nontumorigenic Toxicity 0.000 description 2
- 108010017843 platelet-derived growth factor A Proteins 0.000 description 2
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100033029 Carbonic anhydrase-related protein 11 Human genes 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 description 1
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 206010070179 Denys-Drash syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000006402 Ductal Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102100038980 Exosome complex component CSL4 Human genes 0.000 description 1
- 101000867841 Homo sapiens Carbonic anhydrase-related protein 11 Proteins 0.000 description 1
- 101001075218 Homo sapiens Gastrokine-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000615488 Homo sapiens Methyl-CpG-binding domain protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000879758 Homo sapiens Sjoegren syndrome nuclear autoantigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100103014 Homo sapiens WT1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150002416 Igf2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- -1 KTS amino acid Chemical class 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 102100025169 Max-binding protein MNT Human genes 0.000 description 1
- 208000036626 Mental retardation Diseases 0.000 description 1
- 102100021299 Methyl-CpG-binding domain protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 102000007354 PAX6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010032788 PAX6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100037330 Sjoegren syndrome nuclear autoantigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102100030246 Transcription factor Sp1 Human genes 0.000 description 1
- 101710085924 Transcription factor Sp1 Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000008303 aniridia Diseases 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000078 claw Anatomy 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- CYQFCXCEBYINGO-IAGOWNOFSA-N delta1-THC Chemical compound C1=C(C)CC[C@H]2C(C)(C)OC3=CC(CCCCC)=CC(O)=C3[C@@H]21 CYQFCXCEBYINGO-IAGOWNOFSA-N 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000004076 epigenetic alteration Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 102000046004 human WT1 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000037041 intracellular level Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000007855 methylation-specific PCR Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 208000001491 myopia Diseases 0.000 description 1
- 230000004379 myopia Effects 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 210000003458 notochord Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 230000008775 paternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000012783 regulation of antisense RNA transcription Effects 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 1
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 230000004222 uncontrolled growth Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 210000002229 urogenital system Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/118—Prognosis of disease development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Oncology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】 本発明は、変更ゲノムインプリンティングを検出することによる被験者における癌の検出の方法と、長期予後を推定する特定ヌクレオチド配列のメチル化状態の差を用いて、癌と診断された被験者の長期予後を測定する方法とを提供する。 (57) [Summary] The present invention provides a method of detecting cancer in a subject by detecting altered genomic imprinting, and the long-term prognosis of a subject diagnosed with cancer using a difference in methylation status of a specific nucleotide sequence for estimating long-term prognosis. And a method for measuring.
Description
【0001】
本発明は、診断方法と、ウィルムズ腫抑制遺伝子(WT1)アンチセンス制御
領域を含むヌクレオチド配列と、制御領域のメチル化状態に基づいた疾病検出お
よび予後の方法と関する。The present invention relates to a diagnostic method, a nucleotide sequence containing a Wilms tumor suppressor gene (WT1) antisense control region, and a method for disease detection and prognosis based on the methylation status of the control region.
【0002】
ウィルムズ腫(WT)は、腎臓の幹細胞の悪性形質転換から生じる小児期の胚
の腎臓腫瘍である。WTは、10,000人に約1人の子供に生じ、最も一般的
な小児固形腫瘍の内の1つとなっている。Wilms tumor (WT) is a childhood embryonal kidney tumor that results from malignant transformation of renal stem cells. WT occurs in about 1 in 10,000 children, making it one of the most common pediatric solid tumors.
【0003】
ヒトWT1遺伝子は、染色体11p13(Callら、Cell 60巻、5
09−520頁(1990年);Gesslerら、Nature 343巻、
774−778頁(1990年);Callら、米国特許番号第5,350,8
40号(1994年))に存在し、60キロベースの染色体領域に及ぶ10個の
エキソンとしてゲノムで構成される。腫瘍抑制遺伝子WT1の遺伝子内欠失およ
び突然変異は、およそ10%のウィルムズ腫で検出された。The human WT1 gene is located on chromosome 11p13 (Call et al., Cell 60, 5
09-520 (1990); Gessler et al., Nature 343,
774-778 (1990); Call et al., U.S. Pat. No. 5,350,8.
No. 40 (1994)) and is organized in the genome as 10 exons that span a 60 kilobase chromosomal region. Intragenic deletions and mutations of the tumor suppressor gene WT1 were detected in approximately 10% of Wilms tumors.
【0004】
腎形成、すなわち、腎臓発生の間に、WT1遺伝子発現は、非常に特異的な様
式で制御され、後腎の間葉細胞が未熟な上皮細胞に進行するにつれて増加し、細
胞がいっそう表現型で成熟になるにつれて減少する。卵巣および睾丸、並びに脊
椎索および脳における発現の証拠と共に、ヒト白血病細胞のWT1発現と分化状
態の間の反比例は、WT1遺伝子産物の機能が、多様な細胞種における増殖およ
び/または分化にきわめて重要でありうることを強く示唆している。4個の亜鉛
フィンガーを含むWT1タンパク質は、遺伝子における2個の選択的スプライシ
ング部位(IおよびII)から生じる4つのアイソフォームとして発現される。
スプライシングIIは、亜鉛フィンガードメイン内で生じ、それにより亜鉛フィ
ンガー3および4の間の3個のアミノ酸(KTS)が、挿入または削除される。
KTSアミノ酸なしのWT1タンパク質(WT1−KTS)は、EGR部位共通
配列(5’−GCGGGGGCG−3’)に特異的に結合するのに対して、KT
SのあるWT1タンパク質(WT1+KTS)は結合しない。インシュリン様成
長因子II型(IGF−II)、血小板由来の成長因子A(PDGF−A)、コ
ロニー刺激因子−1(CSF−1)、および上皮成長因子レセプター(EGF−
R)のような遺伝子のプロモーター領域における早期成長反応遺伝子(EGR)
型部位に結合させることによって、WT1は、転写レプレッサーとして作用する
(Hastie、Ann.Rev.Genet28巻、523−558頁(19
94年)、およびMenkeら、Int.Rev.Cytol.181巻、15
1−212頁(1998年)に概説)。During nephrogenesis, or kidney development, WT1 gene expression is regulated in a very specific manner, increasing as metanephric mesenchymal cells progress to immature epithelial cells, and cells become more It decreases phenotypically as it matures. The inverse proportion between WT1 expression and differentiation status of human leukemia cells, along with evidence of expression in ovary and testis, and notochord and brain, indicates that WT1 gene product function is crucial for proliferation and / or differentiation in diverse cell types. It strongly suggests that The WT1 protein, which contains four zinc fingers, is expressed as four isoforms resulting from two alternative splicing sites (I and II) in the gene.
Splicing II occurs within the zinc finger domain, thereby inserting or deleting the three amino acids (KTS) between zinc fingers 3 and 4.
The WT1 protein without the KTS amino acid (WT1-KTS) specifically binds to the EGR site consensus sequence (5′-GCGGGGGGCG-3 ′), whereas
The WT1 protein with S (WT1 + KTS) does not bind. Insulin-like growth factor type II (IGF-II), platelet-derived growth factor A (PDGF-A), colony stimulating factor-1 (CSF-1), and epidermal growth factor receptor (EGF-
R) -like genes in the promoter region of early growth response genes (EGR)
By binding to the mold site, WT1 acts as a transcriptional repressor (Hastie, Ann. Rev. Genet 28, 523-558 (19).
1994), and Menke et al., Int. Rev. Cytol. 181, 15
1-212 (1998)).
【0005】
ヒトWT1プロモーター領域が特徴付けられ、転写因子Sp1についての多
応答性部位を有するTATA配列がなく、CCAAT配列がなく、GCが豊富な
プロモーターのファミリーに属することがわかっている。EGR/WT1共通配
列も、主要な転写開始部位の上流および下流において同定され(Hofmann
ら、Oncogene8巻、3123−3132頁(1993年))、これらの
部位がWT1自己抑制をさせる可能性があるという示唆が、ヒトプロモーターを
用いた一過性形質移入アッセイを用いて確認された(Malikら、FEBS
Letters 349巻、75−78頁(1994年))。The human WT1 promoter region has been characterized and has been shown to belong to a family of GC-rich promoters lacking TATA sequences with multiple responsive sites for the transcription factor Sp1, lacking CCAAT sequences. The EGR / WT1 consensus sequence was also identified upstream and downstream of the major transcription start site (Hofmann.
Et al., Oncogene 8, 3123-3132 (1993)), suggesting that these sites may cause WT1 autorepression was confirmed using a transient transfection assay with a human promoter ( Malik et al., FEBS
Letters 349, 75-78 (1994)).
【0006】
ウィルムズ腫になりやすい素因と一緒に腎臓および生殖器の異常によって特徴
付けられる疾病(Coppesら、FASEB J.7巻、886−895頁(
1993年)で検討された)であるWAGR(ウィルムズ腫、無虹彩症、尿生殖
器異常および精神遅滞)症候群およびデニス−ドラッシュ症候群(DDS)で示
されるとおり、WT1機能は、尿性器系の正常な発達に重要である。Diseases characterized by renal and genital abnormalities along with a predisposition to Wilms tumor (Copes et al., FASEB J. 7, 886-895 (
1993)), WT1 function is normal to the urogenital system as demonstrated by WAGR (Wilm's tumor, aniridia, genitourinary disorders and mental retardation) syndrome and Dennis-Drash syndrome (DDS). Important for development.
【0007】
腎臓ではない組織の分化におけるWT1の関与についての証拠が蓄積してきて
いる。造血における役割が、HL60細胞(Sekiyaら、Blood 83
巻、1876−1882頁(1994年))およびK562細胞(Phelan
ら、Cell Growth Differ.5巻、677−686頁(199
4年))の化学的に誘導した分化の間のWT1発現のダウンレギュレーションに
よって示唆される。正常な造血前駆細胞(Inoueら、Blood 89巻、
1405−1412頁(1997年))に対して白血病細胞でWT1発現が増大
すること、および白血病でWT1突然変異が検出(King−Underwoo
dら、Blood 87巻、2171−2179頁(1996年);King−
UnderwoodおよびPritchard−Jones、Blood 91
巻、2961−2968頁(1998年))されることは、白血球形成にWT1
遺伝子が関与していることを強く示す。WT1発現の変化は、胸部癌でも示され
た(Silbersteinら、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 94巻、8132−8137頁(1997年))。There is accumulating evidence for the involvement of WT1 in the differentiation of non-renal tissues. A role in hematopoiesis has been demonstrated by HL60 cells (Sekiya et al., Blood 83).
Vol. 1876-1882 (1994)) and K562 cells (Phelan).
Et al., Cell Growth Differ. Volume 5, pp. 677-686 (199
4 years)) is suggested by down-regulation of WT1 expression during chemically induced differentiation. Normal hematopoietic progenitor cells (Inoue et al., Blood 89:
1405-1412 (1997)), increased WT1 expression in leukemia cells, and WT1 mutations detected in leukemia (King-Underwood).
d et al., Blood 87, 2171-2179 (1996); King-
Underwood and Pritchard-Jones, Blood 91.
Vol. 2961-2968 (1998)), leukocyte formation is associated with WT1.
Strongly indicate that the gene is involved. Altered WT1 expression was also shown in breast cancer (Silberstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US).
A 94, 8132-8137 (1997)).
【0008】
さらに、見かけのオープンリーディングフレームを有しないアンチセンスWT
1mRNA転写産物が、胎児の腎臓およびWTで検出され、それによりこれらの
mRNAについての調節的役割が示唆された(Campbellら、Oncog
ene 9巻、583−595頁(1994年);Ecclerら、Oncog
ene 9巻、2059−2063頁(1994年))。これらのmRNAのこ
のような機能の1つは、センスWT1mRNAとのRNA異種二本鎖の形成であ
り、それにより細胞のWT1タンパク質の限定レベルが調節されうる。先に、発
明者らは、WT1により活性化されるイントロン1に配置されたアンチセンスW
T1プロモーターの同定を報告した。WT1のこの効果は、WT1プロモーター
で観察されるものに反比例であり、それによりアンチセンスプロモーター活性が
、WT1遺伝子調節に関与することが示唆される(Malikら、Oncoge
ne 11巻、1589−1595頁(1995年))。さらに、異所性エキソ
ン1RNAの発現が、インビトロ系におけるWT1の細胞内レベル(Malik
ら、Oncogene 11巻、1589−1595頁(1995年);Moo
rwoodら、J.Pathol 185巻、352−359頁(1998年)
)に影響を及ぼし、それによりアンチセンスWT1RNAについての調節的役割
を支持している。Furthermore, an antisense WT that does not have an apparent open reading frame
1 mRNA transcripts were detected in fetal kidney and WT, suggesting a regulatory role for these mRNAs (Campbell et al., Oncog.
ene 9, 583-595 (1994); Eccler et al., Oncog.
ene 9, 2059-2063 (1994)). One such function of these mRNAs is the formation of RNA heteroduplexes with the sense WT1 mRNA, which may regulate a limited level of cellular WT1 protein. Previously, we found that antisense W located in intron 1 activated by WT1.
The identification of the T1 promoter was reported. This effect of WT1 is inversely proportional to that observed with the WT1 promoter, suggesting that antisense promoter activity is involved in WT1 gene regulation (Malik et al., Oncoge.
ne Vol. 11, pp. 1589-1595 (1995)). In addition, expression of ectopic exon 1 RNA was associated with intracellular levels of WT1 in vitro (Malik).
Et al., Oncogene 11: 1589-1595 (1995); Moo.
rwood et al. Pathol 185, 352-359 (1998)
), Thereby supporting a regulatory role for antisense WT1 RNA.
【0009】
WT1アンチセンス転写産物は、WT1タンパク質のレベルをアップレギュレ
ートし得(Moorwoodら、J.Pathol 185巻、352−359
頁(1998年))、アンチセンスRNA転写の制御機構の異常は、WT1タン
パク質の不適切な一過性および空間的発現を生じ、腫瘍形成に寄与しうる。この
点に関して、WT1は、アデノウイルス形質転換体ラット腎臓細胞の腫瘍成長速
度を増大しうることに注意することは興味深い(Menkeら、Oncogen
e 12巻、537−546頁(1996年))。WT1アンチセンス調節領域
の後成修飾と、WT1過剰発現と、腎臓腫瘍形成との関係は、不明瞭なままであ
るが、予備研究は、WT1アンチセンス調節領域の高メチル化と低WT1タンパ
ク質との間に相関関係があり、低メチル化では逆の関係があることを示した。興
味深くは、WT1アンチセンスプロモーター遺伝子座は、ヒト胸部癌における高
メチル化配列として同定され(Huangら、Cancer Res.57巻、
1030−1034頁(1996年))、胸部癌は、WT1の発現を減少させる
ことが示された(Silbersteinら、Proc.Natl.Acad.
Sci USA94巻、8132−8137頁(1997年))。WT1 antisense transcripts can upregulate levels of WT1 protein (Moorwood et al., J. Pathol 185, 352-359.
(1998)), abnormal regulation of antisense RNA transcription may lead to inappropriate transient and spatial expression of the WT1 protein and contribute to tumorigenesis. In this regard, it is interesting to note that WT1 can increase the tumor growth rate of adenovirus-transformed rat kidney cells (Menke et al., Oncogen.
e 12: 537-546 (1996)). The relationship between epigenetic modification of the WT1 antisense regulatory region, WT1 overexpression, and renal tumorigenesis remains unclear, but preliminary studies have shown that hypermethylation of the WT1 antisense regulatory region and low WT1 protein It was shown that there was a correlation between and that there was an inverse relationship in hypomethylation. Interestingly, the WT1 antisense promoter locus was identified as a hypermethylated sequence in human breast cancer (Huang et al., Cancer Res. 57:
1030-1034 (1996)), breast cancer was shown to reduce WT1 expression (Silberstein et al., Proc. Natl. Acad.
Sci USA 94, 8132-8137 (1997)).
【0010】
発明者らは、WT1アンチセンスプロモーターのアンチセンス調節領域(AR
R)を同定し、ARRが、差分的にメチル化される領域の一部であることを示し
た。発明の基礎として特徴付けおよび利用されたWT1 ARRは、先に記述さ
れたWT1遺伝子配列(例えば、Callら、米国特許番号第5,350,84
0号(1994年))とは構造的にも機能的にも異なっている。さらに、発明者
らは、ARRメチル化のレベルとヒト細胞の病理状態との間の相関関係を見出し
た。特に、多様な癌細胞が、後成的変化に基づけば、その正常対応物と異なるこ
とが示される。The inventors have found that the antisense regulatory region of the WT1 antisense promoter (AR
R) was identified and indicated that the ARR is part of the differentially methylated region. The WT1 ARR, which was characterized and utilized as the basis of the invention, has the WT1 gene sequence described above (eg, Call et al., US Pat. No. 5,350,84).
0 (1994)) is structurally and functionally different. Furthermore, the inventors found a correlation between the level of ARR methylation and the pathological state of human cells. In particular, various cancer cells are shown to differ from their normal counterparts based on epigenetic changes.
【0011】
したがって、本発明の第1の態様は、配列番号1に示される配列の一部を含む
か、配列番号1に示される配列から成るか、塩基置換、欠失および/または付加
による配列番号1の変異型の少なくとも一部を含む、WT1アンチセンス調節領
域をコードするヌクレオチド配列を提供する。Therefore, the first aspect of the present invention includes a part of the sequence shown in SEQ ID NO: 1, consists of the sequence shown in SEQ ID NO: 1, or has a sequence by base substitution, deletion and / or addition. Provided is a nucleotide sequence encoding a WT1 antisense regulatory region, comprising at least a portion of the variant number 1.
【0012】
本発明の第2の態様は、配列番号2に示される配列を含むか、配列番号2に示
される配列から成るか、塩基置換、欠失および/または付加による配列番号2の
変異型の少なくとも一部を含む、WT1アンチセンス調節領域をコードするヌク
レオチド配列を提供する。WT1アンチセンス調節領域は、配列番号2に太字で
示される配列か、塩基置換、欠失および/または付加によるそのような配列の変
異型の一部に限定されうる。A second aspect of the present invention comprises the sequence shown in SEQ ID NO: 2, consists of the sequence shown in SEQ ID NO: 2, or is a mutant form of SEQ ID NO: 2 by base substitution, deletion and / or addition. A nucleotide sequence encoding a WT1 antisense regulatory region is provided that comprises at least a portion of The WT1 antisense regulatory region may be limited to the sequence shown in bold in SEQ ID NO: 2 or part of a variant of such a sequence due to base substitutions, deletions and / or additions.
【0013】
本発明の第3の態様は、配列番号1に示される配列の少なくとも一部を含むか
、塩基置換、欠失および/または付加による配列番号1の変異型の少なくとも一
部を含む、WT1アンチセンス調節領域の負の調節要素(NRE)をコードする
ヌクレオチド配列を提供する。配列番号1で示されるヌクレオチド配列は、数種
のWT1アンチセンス調節領域の負の調節要素を含みうる。The third aspect of the present invention comprises at least a part of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or at least a part of a variant of SEQ ID NO: 1 due to base substitution, deletion and / or addition, A nucleotide sequence encoding the negative regulatory element (NRE) of the WT1 antisense regulatory region is provided. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 may include the negative regulatory elements of several WT1 antisense regulatory regions.
【0014】
好ましくは、本発明の第1、第2または第3の態様によるヌクレオチド配列は
、DNAまたはRNA配列である。任意の配列の一部が、好ましくは機能性があ
る。すなわち、それらは、対応の天然配列の生物学的機能を有する。Preferably, the nucleotide sequence according to the first, second or third aspect of the invention is a DNA or RNA sequence. A portion of any sequence is preferably functional. That is, they have the biological function of the corresponding native sequence.
【0015】
本発明の第4の態様は、WT1 ARR領域中のヌクレオチド配列のような特
定のヌクレオチド配列の差分メチル化された状態を用いた、癌に罹っている被験
者における疾病検出、診断または予後の方法を提供する。ゲノムの後成的変化は
、局所的であり、例えばそれにより染色体11p15上の多様な遺伝子座に影響
を及ぼす(Feinberg、Cancer Research(付録)59巻
、1743−1746頁(1999年))。したがって、メチル化による後成的
変化についての標的としての染色体11p13領域の発明者らの同定では、11
p13遺伝子レチクロカルビンおよびPAX6から誘導されたものを含めた11
p13領域から得られる他のDNAプローブ/DNA配列も、本発明による方法
で検出目的のために使用しうることが示唆される。A fourth aspect of the invention is the detection, diagnosis or prognosis of a disease in a subject with cancer using the differentially methylated status of a particular nucleotide sequence, such as the nucleotide sequence in the WT1 ARR region. To provide a method. Epigenetic alterations of the genome are local, for example affecting thereby various loci on chromosome 11p15 (Feinberg, Cancer Research (Appendix) 59, 1743-1746 (1999)). Therefore, in our identification of the chromosome 11p13 region as a target for epigenetic changes due to methylation, we identified 11
11 including those derived from p13 gene reticulocarbin and PAX6
It is suggested that other DNA probes / DNA sequences obtained from the p13 region may also be used for detection purposes in the method according to the invention.
【0016】
特定のヌクレオチド配列は、1つまたはそれ以上の調節要素、好ましくは1つ
またはそれ以上の負の調節要素(NRE)、例えば、ARR内の1つまたはそれ
以上のNREでありうる。1または複数のNRE配列は、WT1遺伝子の一部、
または染色体11p13領域の一部であり得、癌と診断された被験者における疾
病診断および予後の方法が、被験者におけるWT1遺伝子または染色体11p1
3領域DNA配列のNREまたはARRのメチル化状態を測定すること、および
NREのメチル化状態を、被験者の診断および予測された長期回復予後と相関さ
せることを包含する。例えば、急性骨髄性白血病(AML)の場合には、NRE
の高メチル化は、被験者が、正の長期回復予後を示すことを示し、そしてNRE
の低メチル化は、被験者が、治療後に再発しやすくされることを示す。ウィルム
ズ腫の場合には、NREの高メチル化は、被験者が、正の長期回復予後を示すこ
とを示し、そしてNREの低メチル化は、被験者が、治療後に再発しやすくされ
ることを示す。ウィルムズ腫では、低メチル化は、腫瘍で特異的に検出され、そ
して結腸直腸癌細胞系では、低メチル化は、腫瘍形成の可能性と相連する。しか
し、他の癌では、特定の1または複数のヌクレオチド配列の高メチル化は、癌細
胞の存在および/または治療後の再発に対する被験者の素因を示しうるのに対し
て、特定の1または複数ヌクレオチド配列の低メチル化は、癌細胞の不在および
/または被験者が正の長期回復予後を示すことを示しうる。例えば、図1(e)
参照。診断用途は、未分化神経外胚葉性腫瘍(PNET)および腎臓の明細胞肉
腫(CCSK)(図1D参照)のような他の腎臓腫瘍の高メチル化と反対に、W
Tにおける低メチル化により下線付けられる。The particular nucleotide sequence may be one or more regulatory elements, preferably one or more negative regulatory elements (NREs), eg one or more NREs in the ARR. One or more NRE sequences are part of the WT1 gene,
Alternatively, it may be part of the chromosome 11p13 region and the method of disease diagnosis and prognosis in a subject diagnosed with cancer is the WT1 gene or chromosome 11p1 in the subject.
Measuring the NRE or ARR methylation status of the tri-region DNA sequence and correlating the NRE methylation status with the subject's diagnosis and predicted long-term recovery prognosis. For example, in the case of acute myelogenous leukemia (AML), NRE
Hypermethylation indicates that the subject has a positive long-term recovery prognosis, and NRE
Hypomethylation indicates that the subject is susceptible to relapse after treatment. In the case of Wilms tumor, hypermethylation of NRE indicates that the subject exhibits a positive long-term recovery prognosis, and hypomethylation of NRE indicates that the subject is susceptible to relapse after treatment. In Wilms tumor, hypomethylation is specifically detected in tumors, and in colorectal cancer cell lines, hypomethylation correlates with the potential for tumorigenesis. However, in other cancers, hypermethylation of specific one or more nucleotide sequences may indicate the presence of cancer cells and / or a predisposition of the subject to recurrence after treatment, whereas specific one or more nucleotides Sequence hypomethylation may indicate the absence of cancer cells and / or the subject exhibits a positive long-term recovery prognosis. For example, FIG. 1 (e)
reference. Diagnostic applications are contradictory to the hypermethylation of other renal tumors such as undifferentiated neuroectodermal tumors (PNET) and clear cell sarcoma of the kidney (CCSK) (see FIG. 1D)
Underlined by hypomethylation at T.
【0017】
メチル化状態は、Bsh1236I、SpeIおよびKpn1のような酵素を
組み合わせて用いて、WT1アンチセンス調節領域を制限切断することにより決
定されうる。Bsh126Iは、BstUIのアイソシゾマーである。Bsh1
236Iは、CpGメチル化のない時のみ、制限配列CGCGで切断する。メチ
ル化配列は、Bsh1236Iによって制限されない。したがって、Bsh12
36Iで制限されたヌクレオチド配列について得られる制限パターンは、ヌクレ
オチド配列中のBsh1236I部位がメチル化されているかどうかによって、
異なるバンドパターンを示す。他の市販で入手できる酵素も、使用でき、そして
1つまたはそれ以上が、メチル化および未メチル化DNAの間を区別できる。Methylation status can be determined by restriction digestion of the WT1 antisense regulatory region using a combination of enzymes such as Bsh1236I, SpeI and Kpn1. Bsh126I is an isoschizomer of BstUI. Bsh1
236I cuts with the restriction sequence CGCG only in the absence of CpG methylation. The methylation sequence is not restricted by Bsh1236I. Therefore, Bsh12
The restriction pattern obtained for a 36I restricted nucleotide sequence depends on whether the Bsh1236I site in the nucleotide sequence is methylated or not.
The different band patterns are shown. Other commercially available enzymes can also be used, and one or more can distinguish between methylated and unmethylated DNA.
【0018】
メチル化状態は、PCR基本のアッセイシステムを用いて測定されうる。この
ようなPCR基本のアッセイシステムは、メタ重亜硫酸ナトリウムの使用に関与
しうる。これは、全ての未メチル化シトシン残基をウラシル残基に変換する効果
を示す。好ましくは、PCR反応は、WT1アンチセンス調節領域の少なくとも
一部を使用する以下のプライマーを使用する:Methylation status can be measured using a PCR-based assay system. Such PCR-based assay systems can involve the use of sodium metabisulfite. This shows the effect of converting all unmethylated cytosine residues to uracil residues. Preferably, the PCR reaction uses the following primers that use at least a portion of the WT1 antisense regulatory region:
【0019】 Tf:5'-GGGTGGAGAAGAAGGATATATTTAT-3' Tr:5'-TAAATATCAAATTAATTTCTCATCC-3' TfN:5'-GATATATTTATTTATTAGTTTTGGT-3' (入れ子プライマー) TrN:5'-AAACCCCTATAATTTACCCTCTTC-3'(入れ子プライマー)[0019] Tf: 5'-GGGTGGAGAAGAAGGATATATTTAT-3 ' Tr: 5'-TAAATATCAAATTAATTTCTCATCC-3 ' TfN: 5'-GATATATTTATTTATTAGTTTTGGT-3 '(nested primer) TrN: 5'-AAACCCCTATAATTTACCCTCTTC-3 '(nested primer)
【0020】
PCR反応で使用される条件は、本明細書に後に記する条件と同じである。下
に記述されるとおり、その後、PCR反応から得られるPCR産物は、クローニ
ングされ、配列決定されうる。PCR産物は、pGEM−T(プロメガ(Pro
mega))のようなベクターにクローニングされうる。代わりに、PCR産物
を、直接配列決定してもよい。いったん配列決定されると、任意のメチル化シト
シン残基が、ヌクレオチド配列中で「C」として読み取りできるままであるのに
対して、未メチル化シトシンは、その配列でT残基として現れる。The conditions used in the PCR reaction are the same as those described later in this specification. The PCR product resulting from the PCR reaction can then be cloned and sequenced, as described below. The PCR product was pGEM-T (Promega (Pro
mega)). Alternatively, the PCR product may be sequenced directly. Once sequenced, any methylated cytosine residue remains readable as a "C" in the nucleotide sequence, whereas unmethylated cytosine appears as a T residue in that sequence.
【0021】 入れ子PCR反応は、以下のプライマーを包含する Tf:5'-GGGTGGAGAAGAAGGATATATTTAT-3' Tr:5'-TAAATATCAAATTAATTTCTCATCC-3' TfN:5'-GATATATTTATTTATTAGTTTTGGT-3' (入れ子プライマー) TrN:5'-AAACCCCTATAATTTACCCTCTTC-3' (入れ子プライマー)[0021] The nested PCR reaction involves the following primers Tf: 5'-GGGTGGAGAAGAAGGATATATTTAT-3 ' Tr: 5'-TAAATATCAAATTAATTTCTCATCC-3 ' TfN: 5'-GATATATTTATTTATTAGTTTTGGT-3 '(nested primer) TrN: 5'-AAACCCCTATAATTTACCCTCTTC-3 '(nested primer)
【0022】
本発明の第5の態様は、ゲノムインプリンティングの腫瘍特異的変化の検出か
ら成る、被験者由来の細胞における癌検出の方法を提供する。正常な組織が単対
立遺伝子で遺伝子を発現する場合、腫瘍特異的遺伝子の任意の二つの対立遺伝子
発現は腫瘍形成細胞増殖の存在を示しうる。代わりに、ある種の癌で、正常な組
織は二対立遺伝子で、そして癌は単対立遺伝子でありうる。さらに、メチル化変
化は、遺伝子投与に対する対立遺伝子の寄与と関係なく、サイレントなまたは増
強された遺伝子発現を通じた遺伝子発現の変化を伴いうる(Jones、Can
cer Research 56巻、2463−2467頁(1996年)に概
説)。A fifth aspect of the invention provides a method of detecting cancer in cells from a subject, which comprises detecting tumor-specific changes in genomic imprinting. If normal tissue expresses the gene in a single allele, expression of any two alleles of the tumor-specific gene may indicate the presence of tumorigenic cell proliferation. Alternatively, in some cancers, normal tissue may be biallelic and cancer may be monoallelic. Furthermore, methylation changes can be associated with changes in gene expression through silent or enhanced gene expression, independent of allelic contribution to gene administration (Jones, Can).
cer Research 56, 2463-2467 (1996)).
【0023】
ゲノムのインプリンティングの腫瘍特異的変更は、逆転写PCR(RT−PC
R)によって検出されうる。これは、電気泳動ゲルでのRT−PCR産物の肉眼
分析による変更ゲノムインプリンティングの比較的早い検出を可能にする。Tumor-specific alterations in genomic imprinting are characterized by reverse transcription PCR (RT-PC
R). This allows relatively early detection of altered genomic imprinting by visual analysis of RT-PCR products on electrophoretic gels.
【0024】
上記方法は、被験者におけるWTの検出に使用でき、WT−1遺伝子のような
WT−特異的遺伝子のゲノムインプリンティングの変更を検出しうる。
検出される変更ゲノムインプリンティングは、ゲノムインプリンティングの緩
和、インプリンティングの損失、またはインプリンティングの増加でありうる。The method described above can be used to detect WT in a subject and can detect alterations in genomic imprinting of WT-specific genes such as the WT-1 gene. The altered genomic imprinting detected can be mitigation of genomic imprinting, loss of imprinting, or increased imprinting.
【0025】
RT−PCRは、1つの対立遺伝子のみに制限部位を導入する対立遺伝子の多
型の両側で腫瘍特異的遺伝子配列にアニールするように設計された2つのプライ
マーを使用しうる。例えば、WTの場合には、RT−PCRは、以下のプライマ
ーを使用しうる:RT-PCR may use two primers designed to anneal to tumor-specific gene sequences on either side of the allelic polymorphism introducing a restriction site into only one allele. For example, in the case of WT, RT-PCR can use the following primers:
【0026】
プライマー1:WT18[CTTAGCACTTTCTTCTTGGC]
プライマー2:WITKBF2[TTGCTCAGTGATTGACCAGG]
本発明の第6の態様は、腫瘍特異的遺伝子のゲノムインプリンティングを変更
する工程から成る、特定の癌に罹っている被験者の治療方法を提供する。これは
、ゲノムインプリンティングの緩和、または緩和されたゲノムインプリンティン
グの逆行に関与しうる。Primer 1: WT18 [CTTAGCACTTTCTTCTTGGC] Primer 2: WITBBF2 [TTGCTCAGTGATTGACCAGG] The sixth aspect of the invention comprises the step of altering the genomic imprinting of a tumor-specific gene in a subject suffering from a particular cancer. Provide a treatment method. This may involve mitigation of genomic imprinting or reversal of mitigated genomic imprinting.
【0027】
本発明の第7の態様は、本発明の第5の態様による方法を用いた診断用キット
、アッセイまたは監視方法を提供する。
本発明の第8の態様は、本発明の前述の態様による方法を使用して、ゲノムイ
ンプリンティングにおける腫瘍特異的変更を検出する工程と、ゲノムインプリン
ティングにおける検出変更を、WT1アンチセンス調節領域の差分メチル化と相
関させる工程とから成る、WT1アンチセンス調節領域のメチル化状態の検出方
法を提供する。例えば、ゲノムインプリンティングの緩和は、WT1アンチセン
ス調節領域の低メチル化と相関されうる。A seventh aspect of the invention provides a diagnostic kit, assay or monitoring method using the method according to the fifth aspect of the invention. An eighth aspect of the invention is the step of detecting a tumor-specific alteration in genomic imprinting using the method according to the previous aspect of the invention, wherein the alteration in the genomic imprinting is detected in the WT1 antisense regulatory region. A method of detecting the methylation status of the WT1 antisense regulatory region, which comprises the step of correlating with differential methylation. For example, mitigation of genomic imprinting can be correlated with hypomethylation of the WT1 antisense regulatory region.
【0028】
本発明によるヌクレオチド配列、および疾病診断、検出および予後の方法を、
あくまで例として、添付の図1(A)から3(B)まで、および配列番号1から
配列番号3までを参照しながら説明する。A nucleotide sequence according to the present invention and a method of disease diagnosis, detection and prognosis,
As an example, the description will be given with reference to the attached FIGS. 1A to 3B and SEQ ID NOS: 1 to 3.
【0029】
配列番号1は、WT1 ARRのヌクレオチド配列を示す。
配列番号2は、WT−1をコードする遺伝子の負の調節要素のヌクレオチド配
列を示す。
配列番号3は、WT1アンチセンス領域のヌクレオチド配列(Gessler
,M & Bruns、Genomics 17巻:499−501頁(199
3年))を示す。RT−PCRプライマーは矢印として示され、エキソン配列は
太字で示される。SEQ ID NO: 1 shows the nucleotide sequence of the WT1 ARR. SEQ ID NO: 2 shows the nucleotide sequence of the negative regulatory element of the gene encoding WT-1. SEQ ID NO: 3 is the nucleotide sequence of the WT1 antisense region (Gessler
, M & Bruns, Genomics 17: 499-501 (199
3 years)). RT-PCR primers are shown as arrows and exon sequences are shown in bold.
【0030】
1.WT1ゲノム配列のクローニングおよび特徴付け
WT1cDNAおよびWT1プロモーター領域を、それぞれ、ヒト胎児腎臓c
DNAライブラリー(クローンテック(Clontech))およびヒトB細胞
ゲノムライブラリー(λSha2001、ケンブリッジのメティカル・リサーチ
・カウンシル(Medical Research Council,Camb
ridge)のT.H.Rabbittsによって供給された腎臓)からクロー
ニングした。各ライブラリーについて、プラークスクリーンフィルター(デュポ
ン(Du Pont))を、1×106ファージ(Benton,W.D.およ
びDavis,R.W.、Science、196巻、180−182頁(19
77年))からin situで作成した。フィルターを、65℃で6×SSC
(1×SSC=0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム)、5
×Denhardts溶液、0.5%SDSおよび100μg/mlサケ精子D
NAでハイブリッド形成した。(0.1×SSC、0.5%SDS、65℃)で
高いストリンジェンシーで洗浄を行った。cDNAライブラリーについては、P
CR増幅によって得られた部分的WT1cDNAを、プローブとして使用した。
cDNAライブラリーから単離した全長cDNAのDNA配列を、ジデオキシ鎖
ターミネーター法(Sanger,Fら、Proc.Natl.Sci.USA
、74巻、5463−5467頁(1977年))によって測定し、cDNAの
5’末端から得られる700bp断片を、ゲノムライブラリーをプローブするた
めに使用した。プローブは、ランダム・プライマー法(Feinberg,A.
P.およびVogelstein,B.、Biochem.Biophys.R
es.Commun.、111巻、47−54頁(1983年))により[α− 32
P]dCTP(アマシャム(Amersham))で放射線標識した。[0030]
1. Cloning and characterization of the WT1 genomic sequence
The WT1 cDNA and the WT1 promoter region were respectively replaced by human fetal kidney c
DNA library (Clontech) and human B cells
Genome library (λSha2001, Cambridge Metical Research)
・ Council (Medical Research Council, Camb
ridge) T.W. H. Claws from the kidneys) supplied by Rabbitts)
I learned. For each library, plaque screen filter (Dupo
(Du Pont) 1 x 106Phage (Benton, WD and
And Davis, R.A. W. , Science, 196, 180-182 (19
1977)) created in situ. Filter at 65 ° C with 6 x SSC
(1 × SSC = 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate), 5
X Denhardts solution, 0.5% SDS and 100 μg / ml salmon sperm D
Hybridized with NA. (0.1 x SSC, 0.5% SDS, 65 ° C)
Washes were performed at high stringency. For the cDNA library, see P
The partial WT1 cDNA obtained by CR amplification was used as a probe.
The DNA sequence of the full-length cDNA isolated from the cDNA library was converted to the dideoxy chain.
Terminator method (Sanger, F et al., Proc. Natl. Sci. USA
74, 5463-5467 (1977)).
The 700 bp fragment obtained from the 5'end was used to probe a genomic library.
I used it for. The probe was a random primer method (Feinberg, A .;
P. And Vogelstein, B .; , Biochem. Biophys. R
es. Commun. , 111, 47-54 (1983)) [α- 32
Radiolabeled with P] dCTP (Amersham).
【0031】
WT1遺伝子の5’末端に対応するゲノムクローンを、サブクローニングし、
そして標準方法論による制限分析(Sambrookら、分子クローニング(M
olecular Cloning)、1および2版、コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨ
ーク(1989年))によって特徴付けた。DNA配列を、ジデオキシ鎖ターミ
ネーター法(Sanger,Fら、Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA、74巻、5463−5467頁(1977年))により、および製造業者
(ユーエスビー−アマシャム(USB−Amersham))によって、Δta
qサイクル配列決定により測定した。WT1遺伝子のイントロン1から得られる
DNAの機能性評価を、遺伝子発現を検出する種々のTW1イントロン配列との
レポーター遺伝子構築物の一過性形質移入により行った(Malik,K.ら、
Oncogene、11巻、1589−1595頁(1995年))。A genomic clone corresponding to the 5'end of the WT1 gene was subcloned,
And restriction analysis by standard methodologies (Sambrook et al., Molecular cloning (M
Olecular Cloning), 1st and 2nd Edition, Cold Spring
Characterized by Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)). The DNA sequence was analyzed by the dideoxy chain terminator method (Sanger, F et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.
SA, 74, 5463-5467 (1977)) and by the manufacturer (USB-Amersham).
It was measured by q-cycle sequencing. Functional evaluation of the DNA obtained from intron 1 of the WT1 gene was performed by transient transfection of a reporter gene construct with various TW1 intron sequences that detect gene expression (Malik, K. et al.
Oncogene, Vol. 11, pp. 1589-1595 (1995)).
【0032】
2.差分メチル化アッセイ
ヒトゲノムDNAを、標準フェノール−クロロホルム抽出法(Sambroo
kら、分子クローニング、1および2版、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク(198
9年))により精製する。イントロン領域のDNA配列(図2参照)に基づいて
、制限酵素Bsh1236I(エムビーアイ・フェルメンタス(MBI Fer
mentas))による消化を、イントロン領域のメチル化を試験するために選
択した。この酵素は、CpGメチル化がない時にのみ制限配列CGCGを切断す
る;メチル化配列は限定されない。我々の研究は、差分メチル化が、4つの強力
なBsh1236I部位を含有する850bpのKpnI−SpeI(ニュー・
イングランド・バイオラボズ(New England Biolabs))断
片内で好適に検出されることを確立した(図1参照)。これらの部位が、メチル
化されているか、またはメチル化されていないかによって、特徴付けられたバン
ドパターンは、ゲノムDNAの消化の後にKpnI、SpeI、およびBsh1
236Iの組合せで観察される。ササンブロッティングおよび放射線標識された
DNAプローブを用いたハイブリッド形成(Sambrookら、分子クローニ
ング、1および2版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス
、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク(1989年))は、イント
ロン配列中のKpnIおよびSpeI部位によって定義される(図1および2)
。2. Differential methylation assay Human genomic DNA was assayed using standard phenol-chloroform extraction method (Sambrook
K. et al., Molecular Cloning, 1st and 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (198).
9 years)). Based on the DNA sequence of the intron region (see FIG. 2), the restriction enzyme Bsh1236I (MBI Fermentus (MBI Fer) is used.
mentas)) was chosen to test the methylation of the intron region. This enzyme cleaves the restriction sequence CGCG only in the absence of CpG methylation; the methylation sequence is not restricted. Our study shows that differential methylation contains 850 bp of KpnI-SpeI (new phenotype) containing four strong Bsh1236I sites.
It has been established that it is favorably detected within the New England Biolabs fragment (see Figure 1). Band patterns characterized by whether these sites were methylated or unmethylated showed that KpnI, SpeI, and Bsh1 after digestion of genomic DNA.
Observed with 236I combination. Hybridization using Samsan blotting and radiolabeled DNA probes (Sambrook et al., Molecular Cloning, 1 and 2 editions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) Defined by KpnI and SpeI sites in the intron sequence (FIGS. 1 and 2)
.
【0033】
図1(D)は、適合した正常な腎臓およびウィルムズ腫サンプルのササンブロ
ットを示す。全てのWTサンプルは、異種接合体の損失を示さないと確認された
。さらに、適合した正常な腎臓およびPNETまたはCCSK DNAも示され
ている。FIG. 1 (D) shows a sasan blot of matched normal kidney and Wilms tumor samples. All WT samples were confirmed to show no loss of heterozygotes. In addition, matched normal kidney and PNET or CCSK DNA are also shown.
【0034】
図1(D)で示されるとおり、差分メチル化のパターンは、正常な腎臓DNA
とウィルムズ腫DNA(パネルA)、可変の予後と正常なリンパ球とを有する患
者から得られる白血球細胞(パネルB)、および高度の腫瘍形成および非腫瘍形
成の結腸細胞系(パネルC)との間を首尾よく区別する。パネルCに示された結
果は、この変化が、腫瘍形成過程に関連しうること、したがって、ウィルムズ腫
以外の癌に関連することを示唆する。As shown in FIG. 1 (D), the pattern of differential methylation was
And Wilms tumor DNA (panel A), white blood cells from patients with variable prognosis and normal lymphocytes (panel B), and highly tumorigenic and non-tumorigenic colon cell lines (panel C). Make a successful distinction between the two. The results presented in Panel C suggest that this change may be associated with the oncogenic process and thus with cancers other than Wilms tumor.
【0035】
フィルムズ腫では、特定のヌクレオチド配列の低メチル化が腫瘍状態と相関す
る。しかし、他の癌では、この相関は、特定のヌクレオチド配列の高メチル化が
腫瘍細胞のメチル化状態に対応し、低メチル化は、正常な細胞を示すように逆転
され得る。この例は、図1(E)に、ARRメチル化状態における変化について
の正常な胸部組織DNAおよび胸部腫瘍DNAのサザンブロット分析と共に示さ
れる。攻撃性が種々に変わる4つの湿潤性腺管癌全てで、正常な胸部腫瘍DNA
に比較してWT1 ARRのメチル化が増大されることが示された。したがって
、正常な組織と腫瘍組織を比較する相対的差分メチル化は、診断的に利用されう
る。In filmoma, hypomethylation of specific nucleotide sequences correlates with tumor status. However, in other cancers this correlation can be reversed such that hypermethylation of specific nucleotide sequences corresponds to the methylation status of tumor cells and hypomethylation is indicative of normal cells. This example is shown in Figure 1 (E), along with Southern blot analysis of normal breast tissue DNA and breast tumor DNA for changes in ARR methylation status. Normal breast tumor DNA in all four wet ductal carcinomas with varying aggressiveness
It was shown that the methylation of WT1 ARR was increased compared to. Therefore, relative differential methylation comparing normal and tumor tissue can be diagnostically utilized.
【0036】
3.PCRに基づくアッセイ系
腫瘍細胞および正常細胞は、先に概説したとおりそれらの後成型によって区別
されうる。WT1アンチセンス調節領域のDNA配列の知識は、生物材料をほと
んど必要としない、サンプルのメチル化状態の測定を可能にするPCR基本のア
ッセイ系を開発することを可能にした。この方法は、メタ亜硫酸ナトリウム(メ
ルク)を用いたゲノムDNAサンプルの処理によって制限酵素認識配列の一部で
ないCpGジヌクレオチドを導入し、それにより、全ての未メチル化シトシン残
基をウラシルに変換することに関与する(Paulin,R.ら、Nuclei
c Acids Research 8巻、4777−4790頁(1998年
))。その後、WT1イントロン配列中の目的の特異的領域は、DNAの両方の
鎖に特異的なプライマーを用いて増幅されうる。得られたPCRバンドは、pG
EM−T(プロメガ)のような市販で入手可能なベクターを用いて直接的に配列
決定またはクローニングされ、そしてDNA配列決定によって分析されうる。任
意のメチル化シトシン残基は、DNA配列で「C」として読取可能なままである
のに対して、未メチル化シトシンは、「T」として現れる。3. PCR-based assay system Tumor cells and normal cells can be distinguished by their post-molding as outlined above. Knowledge of the DNA sequence of the WT1 antisense regulatory region has made it possible to develop a PCR-based assay system that allows the measurement of the methylation status of a sample, requiring little biological material. This method introduces a CpG dinucleotide that is not part of the restriction enzyme recognition sequence by treatment of a genomic DNA sample with sodium metasulfite (Merck), thereby converting all unmethylated cytosine residues to uracil. (Paulin, R. et al., Nuclei
c Acids Research 8: 4777-4790 (1998)). The specific region of interest in the WT1 intron sequence can then be amplified using primers specific for both strands of DNA. The PCR band obtained was pG
It can be directly sequenced or cloned using commercially available vectors such as EM-T (Promega) and analyzed by DNA sequencing. Any methylated cytosine residue remains readable as "C" in the DNA sequence, whereas unmethylated cytosine appears as "T".
【0037】
代わりに、亜硫酸ナトリウムで処理されたDNAでのPCRの第一周の後、一
般に差分メチル化されるとして示されたメチル化Bsh1236I部位に特異的
な配列(図2で囲まれた)、または未メチル化Bsh1236I部位に特異的な
配列(すなわち、C→T変換に特異的な)を含めた入れ子プライマーが使用され
、それによりPCR産物の可視化によるメチル化および非メチル化配列の間の区
別が可能となる。すなわち、メチル化Bsh1236I部位に特異的なプライマ
ーが使用される場合、PCR産物は、サンプル中のBsh1236I部位がメチ
ル化される場合にのみ観察されるか、さもなければPCR増幅は起らない。Alternatively, after the first round of PCR with DNA treated with sodium sulfite, a sequence specific for the methylated Bsh1236I site (boxed in FIG. 2) was shown to be generally differentially methylated. , Or a nested primer containing a sequence specific for the unmethylated Bsh1236I site (ie, specific for the C → T conversion) is used, which allows visualization of the PCR product between methylated and unmethylated sequences. The distinction becomes possible. That is, if a primer specific for the methylated Bsh1236I site is used, a PCR product will only be observed if the Bsh1236I site in the sample is methylated, otherwise no PCR amplification will occur.
【0038】
メチル化特異的PCRのために使用されうる代表的プライマーは、以下に示さ
れ、そしてWT1配列に対するそれらのハイブリッド形成の位置は、最上の鎖の
増幅について図2で矢印によって示される。C→T変換について可能にするため
には:Representative primers that can be used for methylation-specific PCR are shown below, and the position of their hybridization to the WT1 sequence is indicated by the arrow in FIG. 2 for amplification of the top strand. To enable C → T conversion:
【0039】 Tf:5'-GGGTGGAGAGAAGGATATATTTAT-3' Tr:5 '-TAAATATCAAATTAATTTCTCATCC-3' TfN:5'-GATATATTTATTTATTAGTTTTGGT-3' (入れ子プライマー) TrN:5'-AAACCCCTATAATTTACCCTCTTC-3'(入れ子プライマー)[0039] Tf: 5'-GGGTGGAGAGAAGGATATATTTAT-3 ' Tr: 5'-TAAATATCAAATTAATTTCTCATCC-3 ' TfN: 5'-GATATATTTATTTATTAGTTTTGGT-3 '(nested primer) TrN: 5'-AAACCCCTATAATTTACCCTCTTC-3 '(nested primer)
【0040】
がある。
代表的な一次増幅は、3mM MgCl2を添加した緩衝液中に亜硫酸ナトリ
ウム処理DNA100ngと共にアンプリタック(Amplitaq)(パーキ
ン−エルマー(Perkin−Elmer))を用いて行われる。増幅条件は、
3分間、94℃で変性され、続いて、30秒間94℃での変性、30秒間50℃
でアニールし、そして90秒間72℃での伸長の35回サイクルが行われる。7
2℃で5分間の最終伸長により、反応を完了させる。入れ子プライマーを用いた
二次PCRは、1/100番目の一次PCR反応および24回サイクルを使用す
る以外は同じ条件を使用する。There is A representative primary amplification is performed using Amplitaq (Perkin-Elmer) with 100 ng of sodium sulfite treated DNA in buffer supplemented with 3 mM MgCl 2 . The amplification conditions are
Denaturation at 94 ° C for 3 minutes, followed by denaturation at 94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 30 seconds
35 cycles of annealing at 90 ° C. and extension at 72 ° C. for 90 seconds. 7
The reaction is completed by a final extension at 2 ° C. for 5 minutes. Secondary PCR with nested primers uses the same conditions except using the 1 / 100th primary PCR reaction and 24 cycles.
【0041】
4.長期疾病予後と(NRE)のメチル化状態の相関関係
本発明者らは、癌に罹っている被験者におけるARRのメチル化状態と、診断
および長期疾病予後との間の相関関係を検出した。診断能力は、未分化神経外胚
葉性腫瘍(PNET)および腎臓の明細胞肉腫(CCSK)のような他の腎臓腫
瘍の高メチル化とは対照的に、WTにおける低メチル化によって示される(図1
D参照)。高メチル化ARRを有するAML被験者は、治療に十分に応答し、そ
して完全な回復をなした。しかし、未メチル化NREを示し再発した被験者は、
治療に抵抗性があった。4. Correlation of long-term disease prognosis with (NRE) methylation status. We have detected a correlation between the methylation status of ARR and the diagnostic and long-term disease prognosis in subjects with cancer. Diagnostic capacity is demonstrated by hypomethylation in WT as opposed to hypermethylation in other renal tumors such as undifferentiated neuroectodermal tumors (PNET) and clear cell sarcoma of the kidney (CCSK) (Fig. 1
See D). AML subjects with hypermethylated ARR responded well to treatment and had full recovery. However, recurrent subjects with unmethylated NRE
Resistant to treatment.
【0042】
したがって、NREのメチル化状態は、長期間疾病に罹った予後の強力な早期
指標として使用されうる。未メチル化NREを示す被験者は、再発の早期検出の
ための近視観察下で維持されうる。これは、回復についての彼らの可能性を最大
限にする。しかし、いったん何らかの再発が正常な日常の検査によって検出され
ると、これらの患者は、治療に十分に応答することが予測されるので、治療後の
このような近視観察の費用は、未メチル化NREを有する被験者には必要でない
。Therefore, the methylation status of NREs can be used as a powerful early indicator of the prognosis of long-term disease. Subjects with unmethylated NRE can be maintained under myopic observation for early detection of recurrence. This maximizes their potential for recovery. However, the cost of such myopia observations after treatment is unmethylated because these patients are expected to respond well to treatment once any recurrence is detected by normal routine examination. Not required for subjects with NRE.
【0043】
AMLを用いた試験的研究で、特定のヌクレオチド配列の高メチル化は、AM
Lを示す被験者の推定された正の長期予後に応答し、そして低メチル化は、治療
後に再発する被験者の素因に対応する。しかし、他の癌では、この相関関係は、
特定のヌクレオチド配列の高メチル化が治療後に再発する素因に対応し、低メチ
ル化が回復のための正の長期予後を示しうるように、逆転されうる。In a pilot study with AML, hypermethylation of specific nucleotide sequences was found to be
Responding to an estimated positive long-term prognosis for subjects exhibiting L, and hypomethylation corresponds to a predisposition for subjects to relapse after treatment. But in other cancers, this correlation
It can be reversed so that hypermethylation of specific nucleotide sequences may correspond to a predisposition to relapse after treatment and hypomethylation may indicate a positive long-term prognosis for recovery.
【0044】
したがって、被験者に適する治療の最高の方法に関する決定は、彼らの癌症状
の再発の事象における治療に被験者がいかに応答するよう予想されるかの知識に
基づく予測に照らして行われうる。Accordingly, decisions regarding the best methods of treatment suitable for a subject can be made in the light of knowledge-based predictions of how the subject is expected to respond to treatment in the event of a relapse of their cancer symptoms.
【0045】
したがって、差分メチル化は、癌と診断された被験者についての長期予後を発
生する上での決定因子である。
5.WT1遺伝子のゲノムインプリンティング
正常な腎臓細胞で観察されるWT1対立遺伝子特異的メチル化パターンは、W
T1 ARR/NRE(アンチセンス調節領域/負の調節領域)のゲノムインプ
リンティング、およびウィルムズ腫におけるゲノムインプリンティングの腫瘍特
異的緩和があることを強く示す。Therefore, differential methylation is a determinant in developing a long-term prognosis for subjects diagnosed with cancer. 5. Genomic Imprinting of the WT1 Gene The WT1 allele-specific methylation pattern observed in normal kidney cells is W
It is strongly indicated that there is genomic imprinting of T1 ARR / NRE (antisense regulatory region / negative regulatory region) and tumor-specific relaxation of genomic imprinting in Wilms tumor.
【0046】
ゲノムインプリンティングは、それにより遺伝子の母系または父系のコピーが
、選択的に発現される現象であり、そしてDNAのメチル化は、調節シグナルと
して役割を果す。このようなシグナルの損失は、正常な細胞成長に有害である可
能性のある遺伝子発現の変更投与に至らせる可能性がある。例えば、IGF2遺
伝子は、IGF2のゲノムインプリンティング制御の損失を示し、そしてWTで
過剰発現される(Feinberg,A.P.、Cancer Res.(補足
)、59巻:1743s−1746s頁(1999年))。IGF2が成長因子
である場合、これは、腫瘍形成に関連した未制御増殖に容易に寄与しうる。Genome imprinting is the phenomenon whereby maternal or paternal copies of a gene are selectively expressed, and DNA methylation serves as a regulatory signal. Such loss of signal can lead to altered administration of gene expression that can be detrimental to normal cell growth. For example, the IGF2 gene exhibits loss of genomic imprinting control of IGF2 and is overexpressed in WT (Feinberg, AP, Cancer Res. (Supplement), 59: 1743s-1746s (1999)). ). When IGF2 is a growth factor, it can easily contribute to the uncontrolled growth associated with tumorigenesis.
【0047】
WT1 ARR/NREの分化メチル化が、WT1アンチセンスRNA(WT
1−AS)の対立遺伝子特異的発現を付随するかどうかを決定するために、逆転
写−PCR(RT−PCR)分析は、胎児および正常な腎臓細胞、およびWT細
胞で行われた。アンチセンスWT1 RNAスプライシングのいずれかの側のプ
ライマー(配列3および図3A参照)(Gessler,M.およびBruns
、Genomics、17巻:499−501頁(1993年))は、RT−P
CRのために使用された。Differentiation methylation of WT1 ARR / NRE results in WT1 antisense RNA (WT
Reverse transcription-PCR (RT-PCR) analysis was performed on fetal and normal kidney cells, and WT cells to determine whether they were associated with allele-specific expression of 1-AS). Primers on either side of antisense WT1 RNA splicing (see Sequence 3 and Figure 3A) (Gessler, M. and Bruns).
, Genomics, 17: 499-501 (1993)), RT-P.
Used for CR.
【0048】
プライマー1:WT18 [CTTAGCACTTTCTTCTTGGC]
プライマー2:WITKBF2 [TTGCTCAGTGATTGACCAGG]
RT−PCRに使用された代表的反応条件は、5分間、60℃に加熱して1μ
gの総RNAに逆方向プライマーをアニールし、続いて氷上で急冷し、続いて6
0分間、50℃でスーパーRT(エイチティー・バイオテクノロジーズ(HT
Biotechnologies)、英国ケンブリッジ(Cambridge,
UK))逆転写酵素を用いて行われる逆転写を行うことであった。この後、以下
のPCRサイクリングを行った;Primer 1: WT18 [CTTAGCACTTTCTTCTTGGC] Primer 2: WITKBF2 [TTGCTCAGTGATTGACCAGG] Typical reaction conditions used for RT-PCR were heating at 60 ° C. for 5 minutes to 1 μm.
Reverse primer was annealed to g total RNA, followed by quenching on ice, followed by 6
Super RT (HT Biotechnology (HT
Biotechnologies, Cambridge, United Kingdom
UK)) was to perform reverse transcription performed using reverse transcriptase. This was followed by the following PCR cycling;
【0049】
95℃で3分(1サイクル);
94℃で15秒、60℃で30秒、72℃で60秒(2サイクル);
94℃で15秒、58℃で30秒、72℃で60秒(2サイクル);
94℃で15秒、56℃で30秒、72℃で60秒(10サイクル、アンチセン
ス産物について20サイクル);および
94℃で15秒、56℃で30秒、1サイクル当たり20秒の延長を伴う72℃
で60秒(20サイクル)95 ° C. for 3 minutes (1 cycle); 94 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. for 60 seconds (2 cycles); 94 ° C. for 15 seconds, 58 ° C. for 30 seconds, 72 ° C. 60 seconds (2 cycles); 94 ° C for 15 seconds, 56 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 60 seconds (10 cycles, 20 cycles for antisense product); and 94 ° C for 15 seconds, 56 ° C for 30 seconds, 1 72 ° C with 20 seconds extension per cycle
60 seconds (20 cycles)
【0050】
のPCRサイクルによって行われた。
得られたPCR産物を、制限酵素MnIIを、PCR混合液に直接添加し、3
7℃で60分間インキュベートすることによって消化した。その後、PCR産物
を、2%アガロースゲルで分離し、そしてその後、ハイブリッドN+膜上にアル
カリ性ブロットし、そして32P標識アンチセンスcDNAプローブでハイブリッ
ド形成させた。プローブの配列は、配列3中のWT18とWTTKBP2の間に
太字で示される。以下のプライマーを、DNA対照として使用した:PCR cycle of The obtained PCR product was added with the restriction enzyme MnII directly to the PCR mixture, and 3
Digested by incubation for 60 minutes at 7 ° C. The PCR products were then separated on a 2% agarose gel and then alkaline blotted onto hybrid N + membranes and hybridized with 32 P-labeled antisense cDNA probe. The sequence of the probe is shown in bold between WT18 and WTTKBP2 in Sequence 3. The following primers were used as DNA controls:
【0051】 プライマー1:WITKBF2 [TTGCTCAGTGATTGACCAGG] プライマー2:WITKBR2 [TTGGCTGGAAAGCTTGCAGC][0051] Primer 1: WITKBF2 [TTGCTCAGTGATTGACCAGG] Primer 2: WITKBR2 [TTGGCTGGAAAGCTTGCAGC]
【0052】
利用されたMnII多型性(Grubb,G.R.ら、Oncogene、1
0巻:1677−1681頁(1995年))を、図3Aで星印によって印を付
け、二つの対立遺伝子発現について285および222bpのRT−PCR産物
、または代わりに単対立遺伝子発現について286bpまたは222bpの選択
的に主要な対立遺伝子バンドを得た。The MnII polymorphism utilized (Grubb, GR et al., Oncogene, 1
0: 1677-1681 (1995)), marked with an asterisk in FIG. 3A, RT-PCR products of 285 and 222 bp for two allele expression, or alternatively 286 bp or 222 bp for single allele expression. We obtained selectively allele bands of major.
【0053】
図2Bで示されるとおり、1つのメチル化および1つの未メチル化対立遺伝子
を有する正常な腎臓サンプルでのWT1−ASの発現は、一つの対立遺伝子から
起るのみであり、それによりゲノムインプリンティングが確認される。しかし、
WTは、WT1−ASの二つの対立遺伝子発現を示し、したがって、WTでのイ
ンプリンティング制御の緩和が示される。したがって、両方のWT1−AS対立
遺伝子の発現から生じる正味の増加は、ウィルムズ腫で検出される差分メチル化
パターンの追加のマーカーとしての役割を果たしうる。As shown in FIG. 2B, the expression of WT1-AS in normal kidney samples with one methylated and one unmethylated allele only originates from one allele, Genome imprinting is confirmed. But,
WT exhibits biallelic expression of WT1-AS, thus indicating relaxation of imprinting control in WT. Therefore, the net increase resulting from the expression of both WT1-AS alleles may serve as an additional marker of the differential methylation pattern detected in Wilms tumor.
【0054】
この変更インプリンティングは、WT以外の癌で存在する可能性がある。した
がって、特定の遺伝子の変更インプリンティング制御は、患者における種々の癌
型の検出または診断のためのマーカーを提供しうる。さらに、DNAの後成性修
飾が可逆である場合、変更されたインプリンティング制御の検出および/または
メチル化変化の診断は、DNAメチルトランスフェラーゼおよびデメチラーゼの
ような酵素に基づく、または化合物による(Jones P.A.およびLai
rd P.W.、Nature Genetics、21巻、163−167頁
(1999年))、治療上の戦略をも促進するにちがいない。これは、遺伝子発
現の制御を可能にし、そして適切な遺伝子制御次第である治療を許す。This modified imprinting may be present in cancers other than WT. Thus, altered imprinting control of specific genes may provide markers for the detection or diagnosis of various cancer types in patients. Furthermore, if the epigenetic modification of DNA is reversible, the detection of altered imprinting control and / or diagnosis of methylation changes is based on enzymes such as DNA methyltransferases and demethylases or by compounds (Jones P. A. and Lai
rd P. W. , Nature Genetics, 21: 163-167 (1999)), should also promote therapeutic strategies. This allows regulation of gene expression and allows treatments which depend on proper gene regulation.
【0055】[0055]
【図1】図1(A)は、サザンブロッティングについてのメチル化の検出の
ために使用されたプローブを示し、図(B)は、3つの急性骨髄性白血病(AM
L)DNAおよび正常な末梢血リンパ球DNAのサザンブロットを示し、図1(
C)は、非腫瘍形成性および高度に腫瘍形成性の結腸直腸細胞系から得られるD
NAのサザンブロットを示し、図1(D)は、適合した正常な腎臓およびWTサ
ンプル、適合した正常な腎臓およびPNETまたはCCSK DNAおよび胎児
腎臓対照のサザンブロットを示し、図1(E)は、ARRメチル化状態における
変化についての胸部腫瘍DNAのサザンブロット分析を示す。FIG. 1 (A) shows the probe used for the detection of methylation for Southern blotting, and FIG. 1 (B) shows three acute myelogenous leukemias (AM).
L) shows a Southern blot of DNA and normal peripheral blood lymphocyte DNA.
C) is a D obtained from a non-tumorigenic and highly tumorigenic colorectal cell line
Southern blots of NA are shown, Figure 1 (D) shows Southern blots of matched normal kidney and WT samples, matched normal kidney and PNET or CCSK DNA and fetal kidney controls, Figure 1 (E). 4 shows Southern blot analysis of breast tumor DNA for changes in ARR methylation status.
【図2】WT1 ARRのヌクレオチド配列を示す。プライマーハイブリッ
ド形成部位は、矢印によって示される。FIG. 2 shows the nucleotide sequence of WT1 ARR. Primer hybridization sites are indicated by arrows.
【図3】図3(A)は、RT−PCRについて使用されるアンチセンスWT
1RNAスプライシングのいずれかの側でのプライマーを示す模式図であり、図
3(B)は、アンチセンスWT1RNA RT−PCR産物のサザンブロットを
示す。FIG. 3 (A) Antisense WT used for RT-PCR.
FIG. 3B is a schematic showing primers on either side of 1 RNA splicing, and FIG. 3 (B) shows a Southern blot of antisense WT1 RNA RT-PCR products.
【0056】[0056]
【配列表1】 [Sequence list 1]
【0057】[0057]
【配列表2】 [Sequence listing 2]
【0058】[0058]
【配列表3】 [Sequence list 3]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) G01N 33/53 G01N 33/566 33/566 33/574 D 33/574 C12N 15/00 ZNAA (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG ,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD, RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM,AT, AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,BZ,C A,CH,CN,CR,CU,CZ,DE,DK,DM ,DZ,EE,ES,FI,GB,GD,GE,GH, GM,HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,K E,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS ,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN, MW,MX,MZ,NO,NZ,PL,PT,RO,R U,SD,SE,SG,SI,SK,SL,TJ,TM ,TR,TT,TZ,UA,UG,US,UZ,VN, YU,ZA,ZW (72)発明者 ブラウン、キース イギリス国 BS8 1TD ブリストル ユニバーシティー ウォーク スクール オブ メディカル サイエンシズ デパ ートメント オブ パソロジー クリック ユニット Fターム(参考) 4B024 AA01 AA12 AA20 CA01 CA09 CA11 CA20 HA09 HA11 HA12 HA17 HA20 4B063 QA01 QA13 QA17 QA19 QQ42 QQ52 QR08 QR14 QR32 QR35 QR40 QR42 QR56 QR62 QS16 QS25 QS34 QX02 4C084 AA13 AA17 NA14 ZB26 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) G01N 33/53 G01N 33/566 33/566 33/574 D 33/574 C12N 15/00 ZNAA (81) designation Country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG) , CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW) ), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, BZ, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS , JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, MZ, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Brown , Keith BS8 1TD Bristol University Walk School of Medical Sciences Department of Pathology Click Unit F Term (Reference) 4B024 AA01 AA12 AA20 CA01 CA09 CA11 CA20 HA09 HA11 HA12 HA17 HA20 4B063 QA01 QA13 QA17 QA19 QQ42 QQ52 QR08 QR14 QR32 QR35 QR40 QR42 QR56 QR62 QS16 QS25 QS34 QX02 4C084 AA13 AA17 NA14 ZB26
Claims (38)
換、欠失および/または付加による配列番号1に示される配列の変異型の少なく
とも一部を包む、WT1アンチセンス調節領域をコードするヌクレオチド配列。1. A WT1 antisense comprising at least a part of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 or including at least a part of a variant of the sequence shown in SEQ ID NO: 1 by base substitution, deletion and / or addition. A nucleotide sequence that encodes a regulatory region.
ドする請求項1に記載のヌクレオチド配列。2. The nucleotide sequence according to claim 1, which encodes a negative regulatory element (NRE) of the WT1 antisense regulatory region.
換、欠失および/または付加による配列番号2で示されるヌクレオチド配列の変
異型の少なくとも一部を含む、WT1アンチセンス調節領域の負の調節要素(N
RE)。3. A WT1 anti-comprising at least a part of the sequence shown in SEQ ID NO: 2 or at least a part of a variant of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 by base substitution, deletion and / or addition. Negative regulatory element (N
RE).
塩基置換、欠失および/または付加によるそのような配列の変異型を含む請求項
3に記載のWT1アンチセンス調節領域NRE。4. The WT1 antisense according to claim 3, wherein the NRE comprises the sequence shown in bold in SEQ ID NO: 2 or a variant of such sequence by base substitution, deletion and / or addition. Regulatory region NRE.
か一項に記載のヌクレオチド配列またはNRE。5. The nucleotide sequence or NRE according to any one of claims 1 to 3, wherein the nucleotide sequence is a DNA sequence.
ってコードされるRNA配列。6. An RNA sequence encoded by the nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 5.
後の方法であって、被験者における、またはその被験者に由来するサンプルにお
ける、特定の1または複数のヌクレオチド配列の差分メチル化状態を測定する工
程から成る方法。7. A method of disease diagnosis and prognosis in a subject diagnosed with Wilms tumor cancer, comprising determining the differential methylation status of a specific nucleotide sequence or nucleotides in the subject or in a sample derived from the subject. A method comprising the steps of measuring.
ス調節領域(ARR)の部分を形成する請求項7に記載の方法。8. The method of claim 7, wherein the particular one or more nucleotide sequences form part of a WT1 antisense regulatory region (ARR).
素(NRE)またはARRのメチル化状態を測定する工程と、NREまたはAR
Rのメチル化状態を、被験者の診断および予想される長期回復予後と相関させる
工程とから成る請求項7または請求項8に記載の方法。9. A step of measuring the methylation status of the negative regulatory element (NRE) or ARR of the WT1 gene in a sample isolated from a subject, and NRE or AR.
9. Correlating the methylation status of R with the subject's diagnosis and expected long-term recovery prognosis.
予後を示すことを示し、NREまたはARRの低メチル化は、被験者が治療後の
再発になりやすい素因であることを示す請求項9に記載の方法。10. Hypermethylation of NRE or ARR indicates that a subject exhibits a positive long-term recovery prognosis, and hypomethylation of NRE or ARR indicates that the subject is predisposed to relapse after treatment. The method according to claim 9, wherein:
験者が正の長期回復予後を示すことを示し、特定の1または複数のヌクレオチド
配列の高メチル化は、被験者が治療後の再発になりやすい素因であることを示す
請求項7または請求項8に記載の方法。11. A hypomethylation of a specific nucleotide or nucleotides indicates that the subject has a positive long-term recovery prognosis, and a hypermethylation of a specific nucleotide or nucleotides indicates that the subject is post-treatment. 9. The method according to claim 7 or 8, which indicates that the patient is predisposed to recurrence.
チド配列である請求項7乃至11のいずれか一項に記載の方法。[12] The method according to any one of [7] to [11], wherein the NRE is the nucleotide sequence according to any one of [1] to [6].
乃至12のいずれか一項に記載の方法。13. The methylation status is detected by restriction digest analysis.
13. The method according to any one of items 1 to 12.
に使用される請求項13に記載の方法。14. The method of claim 13, wherein at least the enzyme Bsh1236I is used to limit NRE.
される請求項7乃至12のいずれか一項に記載の方法。15. The method of any of claims 7-12, wherein the methylation status is detected using a PCR-based assay system.
下のプライマー: Tf:5'-GGGTGGAGAAGAAGGATATATTTAT-3' Tr:5'-TAAATATCAAATTAATTTCTCATCC-3' TfN:5'-GATATATTTATTTATTAGTTTTGGT-3' (入れ子プライマー) TrN:5'-AAACCCCTATAATTTACCCTCTTC-3'(入れ子プライマー) の内の少なくとも1つを使用する請求項15に記載の方法。16. A PCR assay system for amplifying a region of a nucleotide sequence, comprising the following primers: Tf: 5′-GGGTGGAGAAGAAGGATATATTTAT-3 ′ Tr: 5′-TAAATATCAAATTAATTTCTCATCC-3 ′ TfN: 5′-GATATATTTATTTATTAGTTTTGGT-3 ′ (nested. 16. The method according to claim 15, wherein at least one of TrN: 5′-AAACCCCTATAATTTACCCTCTTC-3 ′ (nested primer) is used.
る請求項16に記載の方法。17. The method of claim 16, wherein the amplified nucleotide sequence is cloned and sequenced.
包含するプローブ。18. A probe comprising the nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 6.
または請求項18に記載のプローブを用いた診断用キット、アッセイまたは監視
方法。19. A nucleotide sequence according to any one of claims 1 to 6,
Alternatively, a diagnostic kit, assay or monitoring method using the probe according to claim 18.
用キット、アッセイまたは監視方法。20. A diagnostic kit, assay or monitoring method using the method according to any one of claims 7 to 17.
出する工程から成る、被験者における、または被験者から単離されるサンプルに
おける、癌検出の方法。21. A method of cancer detection in a subject or in a sample isolated from the subject, comprising the step of detecting the methylation status of a particular nucleotide or nucleotide sequences.
被験者における癌細胞の存在または不在と相関させる工程から成る、請求項21
に記載の方法。22. The methylation status of a specific one or more nucleotide sequences,
22. Correlating with the presence or absence of cancer cells in a subject.
The method described in.
験者における癌細胞の存在を示す請求項22に記載の方法。23. The method of claim 22, wherein hypomethylation of a specific nucleotide or nucleotide sequences is indicative of the presence of cancer cells in the subject.
から成る、被験者に由来する細胞における癌検出の方法。24. A method for detecting cancer in cells derived from a subject, which comprises the step of detecting a tumor-specific alteration in genomic imprinting.
って、ゲノムインプリンティングの腫瘍特異的緩和を検出する工程から成る、請
求項24に記載の方法。25. The method of claim 24, comprising detecting tumor-specific alleviation of genomic imprinting by measuring the methylation status of specific nucleotide sequences.
CR(RT−PCR)によって検出される請求項24または請求項25に記載の
方法。26. The tumor-specific alteration of genomic imprinting is reverse transcription-P.
The method according to claim 24 or 25, which is detected by CR (RT-PCR).
ずれか一項に記載の方法。27. The method according to any one of claims 24 to 26, wherein the cancer is Wilms tumor (WT).
グの緩和を検出する工程から成る、請求項27に記載の方法。28. The method of claim 27, comprising detecting the relaxation of genomic imprinting of the antisense WT-1 RNA sequence.
る対立遺伝子の多型性の両側で腫瘍特異的遺伝子配列にアニールするように設計
された2つのプライマーを使用する請求項28に記載の方法。29. RT-PCR uses two primers designed to anneal to a tumor-specific gene sequence on both sides of the allelic polymorphism introducing a restriction site into only one allele. Item 29. The method according to Item 28.
程から成る、特定の癌に罹っている被験者を治療する方法。31. A method of treating a subject having a particular cancer, comprising altering the genomic imprinting of a tumor-specific gene.
クレオチド配列のメチル化状態を変更することによって変更される請求項31に
記載の方法。32. The method of claim 31, wherein the genomic imprinting of a tumor-specific gene is altered by altering the methylation status of specific nucleotide sequences.
ンプリンティングを緩和するために変更される請求項31または請求項32に記
載の方法。33. The method of claim 31 or claim 32, wherein the genomic imprinting is modified to mitigate genomic imprinting of tumor-specific genes.
ンプリンティングの緩和を逆転させるために変更される請求項31または請求項
32に記載の方法。34. The method of claim 31 or claim 32, wherein the genomic imprinting is modified to reverse the relaxation of genomic imprinting of tumor-specific genes.
断用キット、アッセイまたは監視方法。35. A diagnostic kit, assay or monitoring method using the method according to any one of claims 24 to 30.
ゲノムインプリンティングの腫瘍特異的変更を検出する工程と、緩和したゲノム
インプリンティングにおいて検出された変更を、WT1アンチセンス調節領域の
差分メチル化と相関させる工程とから成る、WT1アンチセンス調節領域のメチ
ル化状態の検出方法。36. Using the method according to any one of claims 21 to 30,
Methylation of the WT1 antisense regulatory region, comprising detecting a tumor-specific alteration of genomic imprinting and correlating the alteration detected in relaxed genomic imprinting with differential methylation of the WT1 antisense regulatory region Detection method.
ンティングにおける緩和である請求項36に記載の方法。37. The method of claim 36, wherein the alteration in genomic imprinting is a relaxation in genomic imprinting.
記載の方法の結果に基づいて、治療の特別の経過を選択することから成る治療方
法。38. A method of treatment comprising selecting a particular course of treatment based on the results of the method according to any one of claims 7-17, 21-34, 36, 37.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB9916669.6 | 1999-07-15 | ||
GBGB9916669.6A GB9916669D0 (en) | 1999-07-15 | 1999-07-15 | Diagnostic method |
GBGB9926293.3A GB9926293D0 (en) | 1999-11-05 | 1999-11-05 | Diagnostic method |
GB9926293.3 | 1999-11-05 | ||
PCT/GB2000/002741 WO2001006005A2 (en) | 1999-07-15 | 2000-07-17 | Diagnostic method comprising wt1 sequences |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2003505035A true JP2003505035A (en) | 2003-02-12 |
Family
ID=26315771
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2001511214A Pending JP2003505035A (en) | 1999-07-15 | 2000-07-17 | Diagnosis method |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1200623A2 (en) |
JP (1) | JP2003505035A (en) |
AU (1) | AU6000600A (en) |
WO (1) | WO2001006005A2 (en) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1352089B1 (en) * | 2000-08-25 | 2006-12-06 | Lovelace Respiratory Research Institute | Nested methylation-specific polymerase chain reaction cancer detection method |
JP2005514956A (en) * | 2002-01-18 | 2005-05-26 | ジェンザイム・コーポレーション | Methods for detection of fetal DNA and quantification of alleles |
GB0209776D0 (en) * | 2002-04-29 | 2002-06-05 | Univ Bristol | Diagnostic method |
FR2854903A1 (en) * | 2003-05-13 | 2004-11-19 | Centre Nat Rech Scient | In vitro diagnosis of cancer, based on detecting hypomethylation of deoxycytidine in CpG doublets present in specific sequences from the B melanoma antigen locus |
EP3194624B1 (en) | 2014-09-15 | 2022-02-16 | Garvan Institute of Medical Research | Methods for diagnosis, prognosis and monitoring of breast cancer and reagents therefor |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0453560B1 (en) * | 1989-11-13 | 1999-05-26 | Massachusetts Institute Of Technology | Localization and characterization of the wilms' tumor gene |
AU8381698A (en) * | 1997-07-03 | 1999-01-25 | Case Western Reserve University | Compositions and methods for detection of genomic imprinting disorders |
-
2000
- 2000-07-17 WO PCT/GB2000/002741 patent/WO2001006005A2/en not_active Application Discontinuation
- 2000-07-17 EP EP20000946122 patent/EP1200623A2/en not_active Withdrawn
- 2000-07-17 JP JP2001511214A patent/JP2003505035A/en active Pending
- 2000-07-17 AU AU60006/00A patent/AU6000600A/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2001006005A2 (en) | 2001-01-25 |
EP1200623A2 (en) | 2002-05-02 |
WO2001006005A3 (en) | 2001-05-25 |
AU6000600A (en) | 2001-02-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7510707B2 (en) | PAR, a novel marker gene for breast and prostate cancers | |
EP0390323B1 (en) | Detection of loss of the wild-type p53 gene | |
AU699183B2 (en) | Laminin chains: diagnostic and therapeutic use | |
EP2740742B1 (en) | Fusion gene of kif5b gene and ret gene, and method for determining effectiveness of cancer treatment targeting fusion gene | |
JP5861244B2 (en) | Detection method of novel ROS1 fusion | |
Patterson et al. | Abnormalities of the p53 MDM2 and DCC genes in human leiomyosarcomas | |
WO2010011642A2 (en) | Methods and compositions using splicing regulatory proteins involved in tumor suppression | |
Perotti et al. | Germline mutations of the POU6F2 gene in Wilms tumors with loss of heterozygosity on chromosome 7p14 | |
Maeda et al. | Relationship between p53 pathway and estrogen receptor status in endometrioid-type endometrial cancer | |
Manderson et al. | Molecular genetic analysis of a cell adhesion molecule with homology to L1CAM, contactin 6, and contactin 4 candidate chromosome 3p26pter tumor suppressor genes in ovarian cancer | |
JP2003505035A (en) | Diagnosis method | |
US20190161807A1 (en) | RAD51C as a Human Cancer Susceptibility Gene | |
US20020115094A1 (en) | Liver tumor marker sequences | |
CA2827506A1 (en) | Bap1 mutational analysis in determining susceptibility to, prognosis of, and treatment of melanocytic neoplasia | |
Qin et al. | Methylation pattern of preferentially expressed antigen of melanoma in acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndromes | |
US20040241682A1 (en) | Cancer | |
KR100763902B1 (en) | A breast cancer related protein a gene encoding the same and a method for diagnosing a breast cancer using the protein and gene | |
WO2011131128A1 (en) | Marker for colon cancer and method for detecting colon cancer | |
CA2357073C (en) | Nucleic acid molecules comprising the promoter for the prostate cancer marker pca3 and uses thereof | |
US6929910B2 (en) | Diagnostic and therapeutic methods using the H37 tumor suppressor gene | |
JP2002521062A (en) | Genetic polymorphisms in the human neurokinin 1 receptor gene and their use in diagnosis and treatment of disease | |
JP4426549B2 (en) | Diagnosis method of gastric cancer using methylation of novel gene ACMG1 as an index | |
KR20030043721A (en) | Gene associated with cancer | |
Patrone | Prognostic value of specific chromosome imbalances, mutation profile, and BAP1 expression in uveal melanoma | |
WO2000015795A2 (en) | Genes from human chromosome 11p15.5 |