JP2003503056A - Helix polypeptide zalpha29 - Google Patents

Helix polypeptide zalpha29

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JP2003503056A
JP2003503056A JP2001506823A JP2001506823A JP2003503056A JP 2003503056 A JP2003503056 A JP 2003503056A JP 2001506823 A JP2001506823 A JP 2001506823A JP 2001506823 A JP2001506823 A JP 2001506823A JP 2003503056 A JP2003503056 A JP 2003503056A
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JP
Japan
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seq
residues
polypeptide
zalpha29
cells
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Application number
JP2001506823A
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Japanese (ja)
Inventor
シー. コンクリン,ダレル
ガオ,ゼレン
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ザイモジェネティクス,インコーポレイティド
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    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52Cytokines; Lymphokines; Interferons

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Abstract

(57)【要約】 新規なサイトカインポリペプチド、これらを作製するための材料及び方法並びに使用方法を開示する。本発明のポリペプチドは、配列識別番号:2又は配列識別番号:4の少なくとも15個の連続アミノ酸残基を含んでおり、そして異種配列、例えばアフィニティタグを含んでいるポリペプチド融合物として調製することができる。これらをコードしているポリペプチド及びポリヌクレオチドは多様な治療、診断及び研究用途内で使用することができる。 (57) SUMMARY Disclosed are novel cytokine polypeptides, materials and methods for making them, and methods of use. The polypeptides of the invention comprise at least 15 contiguous amino acid residues of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, and are prepared as a polypeptide fusion comprising a heterologous sequence, e.g., an affinity tag. be able to. The polypeptides and polynucleotides encoding them can be used in a variety of therapeutic, diagnostic and research applications.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【0001】 発明の背景 サイトカインは、細胞によって産生され、そしてその細胞または別の細胞の増
殖または代謝に影響するポリペプチドホルモンである。多細胞動物において、サ
イトカインは細胞増殖、移入、分化、および成熟を制御する。サイトカインは正
常な発達、および固体腫瘍の発生を含む病因の両方において役割を果たす。 サイトカインは物理化学的に多様であり、5kDa(TGF-α)〜140kDa(ミュラー擬
態阻害物質)にわたる。それらは、単一のポリペプチド鎖、およびジスルフィド
結合されたホモ2量体およびヘテロ2量体を含む。
BACKGROUND OF THE INVENTION Cytokines are polypeptide hormones produced by cells that affect the growth or metabolism of that cell or another cell. In multicellular animals, cytokines control cell proliferation, transfer, differentiation, and maturation. Cytokines play a role in both normal development and pathogenesis including the development of solid tumors. Cytokines are physicochemically diverse, ranging from 5 kDa (TGF-α) to 140 kDa (Muller mimicry inhibitors). They include single polypeptide chains and disulfide-linked homodimers and heterodimers.

【0002】 サイトカインは、細胞表面受容体に結合することによって細胞事象を影響する
。結合は細胞内の一連のシグナル伝達事象を開始し、これは最終的に細胞分裂、
プロテアーゼ産生、細胞移入、細胞表面タンパク質の発現、およびさらなる増殖
因子の産生のような表現型の変化を生じる。 細胞分化および成熟はまた、サイトカインの制御下にある。例えば、造血因子
のエリスロポエチン、トロンボポエチン、およびG-CSFは、それぞれ、骨髄にお
ける前駆体細胞からの赤血球、血小板、および好中球の産生を刺激する。多能性
前駆体からの成熟細胞の発達は、複数の因子の存在を必要とし得る。
Cytokines affect cellular events by binding to cell surface receptors. Binding initiates a series of signaling events within the cell, which ultimately leads to cell division,
It results in phenotypic changes such as protease production, cell transfer, expression of cell surface proteins, and production of additional growth factors. Cell differentiation and maturation are also under the control of cytokines. For example, the hematopoietic factors erythropoietin, thrombopoietin, and G-CSF each stimulate the production of red blood cells, platelets, and neutrophils from precursor cells in the bone marrow. Development of mature cells from pluripotent precursors may require the presence of multiple factors.

【0003】 細胞プロセスを制御するにおけるサイトカインの役割は、それらを治療的な介
入のための候補または標的にするようであり;実際、多くのサイトカインが臨床
的な使用のために承認されている。インターフェロン−α(IFN-α)は、例えば、
毛様細胞白血病、慢性骨髄白血病、カポジ肉腫、尖圭コンジローム、慢性C型肝
炎、および慢性B型肝炎の処置において使用される(AggarwalおよびPuri、「サイ
トカインおよびサイトカイン受容体の共通および非共通の特徴:概説」、Aggarwa
lおよびPuri編、ヒトサイトカイン:疾患および治療におけるそれらの役割、Blac
kwell Science、Cambridge、MA、1995、3-24)。
The role of cytokines in controlling cellular processes appears to make them candidates or targets for therapeutic intervention; in fact, many cytokines have been approved for clinical use. Interferon-α (IFN-α) is, for example,
Used in the treatment of hairy cell leukemia, chronic myelogenous leukemia, Kaposi's sarcoma, Condyloma acuminata, chronic hepatitis C, and chronic hepatitis B (Aggarwal and Puri, “Common and non-common features of cytokines and cytokine receptors. : Outline ”, Aggarwa
Human cytokines: Diseases and their role in therapy, Blac
kwell Science, Cambridge, MA, 1995, 3-24).

【0004】 血小板由来の増殖因子(PDGF)は、糖尿病患者における皮膚潰瘍の処置について
、米国および他の国において承認されている。造血サイトカインエリスロポエチ
ンは、貧血の処置のために開発された(例えば、EP613,683)。G-CSF、GM-CSF、IF
N-β、IFN-γ、およびIL-2はまた、ヒトにおける使用について承認された(Aggar
walおよびPuri、同書)。実験的な証拠は、サイトカインおよびそれらのインヒビ
ターのさらなる治療学的使用を支持する。PDGF受容体活性の阻害は、傷害された
ヒヒ動脈において内膜過形成を減少することが示された(Gieseら、Restenosis S
ummit VIII、ポスターセッション番号23、1996、米国特許第5,620,687号)。
Platelet-derived growth factor (PDGF) is approved in the United States and other countries for the treatment of skin ulcers in diabetic patients. The hematopoietic cytokine erythropoietin has been developed for the treatment of anemia (eg EP 613,683). G-CSF, GM-CSF, IF
N-β, IFN-γ, and IL-2 have also been approved for use in humans (Aggar
wal and Puri, ibid.). Experimental evidence supports further therapeutic use of cytokines and their inhibitors. Inhibition of PDGF receptor activity has been shown to reduce intimal hyperplasia in injured baboon arteries (Giese et al. Restenosis S
ummit VIII, poster session number 23, 1996, US Pat. No. 5,620,687).

【0005】 血管内皮増殖因子(VEGF)は、虚血性肢において血管の増殖を促進することが示
され(Isnerら、The Lancet 348:370-374、1996)、および創傷治癒剤としての使
用について、歯周病の処置について、血管移植手術における内皮形成を促進する
について、および心筋梗塞後の側枝循環を促進するについて提唱された(WIPO公
開公報第WO95/24473号;米国特許第5,219,739号)。可溶性VEGF受容体(可溶性flt-
1)は,細胞表面受容体へのVEGFの結合をブロックし、そしてインビトロで血管組
織の増殖を阻害することが見出された(Biotechnology News 16(17):5-6、1996)
Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) has been shown to promote blood vessel growth in ischemic limbs (Isner et al., The Lancet 348 : 370-374, 1996), and for use as a wound healing agent. It has been proposed for the treatment of periodontal disease, for promoting endothelium formation in vascular transplant surgery, and for promoting collateral circulation after myocardial infarction (WIPO Publication No. WO 95/24473; US Pat. No. 5,219,739). Soluble VEGF receptor (Soluble flt-
1) was found to block VEGF binding to cell surface receptors and inhibit vascular tissue proliferation in vitro (Biotechnology News 16 (17): 5-6, 1996).
.

【0006】 実験的な証拠は、アンタゴニストの阻害が腫瘍発生をブロックするために使用
され得ること(Biotechnology News、1997年11月13日)、および血管新生が頚ガン
の初期の指標であること(Br.J.Cancer 76:1410-1415、1997)を示唆する。より近
年、トロンボポエチンは、インビボで血小板の産生を刺激することが示され(Kau
shanskyら、Nature 369:568-571、1994)、およびいくつかの臨床治験の主題であ
った(von dem Borneら、Bailliere’s Clin、Haematol.11:427-445、1998によっ
て概説される)。
Experimental evidence indicates that inhibition of antagonists can be used to block tumor development (Biotechnology News, 13 November 1997), and angiogenesis is an early indicator of cervical cancer ( Br. J. Cancer 76: 1410-1415, 1997). More recently, thrombopoietin has been shown to stimulate the production of platelets in vivo (Kau
shansky et al., Nature 369 : 568-571, 1994), and the subject of several clinical trials (reviewed by von dem Borne et al., Bailliere's Clin, Haematol. 11: 427-445, 1998).

【0007】 サイトカインの証明された臨床学的利用性を考慮して、治療剤および研究材料
および試薬の両方としての使用のための、さらなるこのような分子についての必
要性が当該分野においてある。サイトカインは、発生プロセスを研究するために
実験室において、ならびに細胞培養培地の成分として実験室および産業設定にお
いて使用される。
In view of the demonstrated clinical availability of cytokines, there is a need in the art for additional such molecules for use as both therapeutic agents and research materials and reagents. Cytokines are used in the laboratory to study developmental processes, and as components of cell culture media in the laboratory and industrial settings.

【0008】 発明の要旨 本発明の1つの局面において、配列番号2の残基48〜62、配列番号4の残基47
〜61、配列番号2の残基63〜104、配列番号4の残基62〜103、配列番号2の残基
105〜119、配列番号4の残基104〜118、配列番号2の残基120〜137、配列番号4
の残基119〜136、配列番号2の残基138〜152、配列番号4の残基137〜151、配列
番号2の残基153〜170、配列番号4の残基152〜169、配列番号2の残基171〜185
、および配列番号4の残基170〜184からなる群より選択されるアミノ酸残基の配
列を含有する、単離されたポリペプチドが提供される。
SUMMARY OF THE INVENTION In one aspect of the invention, residues 48-62 of SEQ ID NO: 2, residues 47 of SEQ ID NO: 4.
~ 61, residues 63-104 of SEQ ID NO: 2, residues 62-103 of SEQ ID NO: 4, residues of SEQ ID NO: 2
105-119, residues 104-118 of SEQ ID NO: 4, residues 120-137 of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4
Residues 119-136, SEQ ID NO: 2 residues 138-152, SEQ ID NO: 4 residues 137-151, SEQ ID NO: 2 residues 153-170, SEQ ID NO: 4 residues 152-169, SEQ ID NO: 2 Residues 171-185
, And an isolated polypeptide comprising a sequence of amino acid residues selected from the group consisting of residues 170-184 of SEQ ID NO: 4.

【0009】 1つの実施態様において、単離されたポリペプチドは15〜1500アミノ酸残基を
有する。関連される実施態様において、アミノ酸残基の配列は、マルトース結合
タンパク質、免疫グロブリン定常領域、ポリヒスチジンタグ、および配列番号5
において示されるようなペプチドからなる群より選択される第2のポリペプチド
に、ペプチド結合またはポリペプチドリンカーを介して作用可能に連結される。
別の実施態様において、単離されたポリペプチドは、配列番号2または配列番号
4の少なくとも30個の連続的な残基を含有する。他の実施態様において、単離さ
れたポリペプチドは、配列番号6の残基48〜185または配列番号6の残基27〜190
を含有する。さらなる実施態様において、単離されたポリペプチドは、配列番号
2の残基48〜185、配列番号4の残基47〜184、配列番号2の残基27〜190、また
は配列番号4の残基26〜188を含有する。
In one embodiment, the isolated polypeptide has 15 to 1500 amino acid residues. In a related embodiment, the sequence of amino acid residues is maltose binding protein, immunoglobulin constant region, polyhistidine tag, and SEQ ID NO: 5.
To a second polypeptide selected from the group consisting of peptides as shown in 1. above, operably linked via a peptide bond or a polypeptide linker.
In another embodiment, the isolated polypeptide contains at least 30 consecutive residues of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. In other embodiments, the isolated polypeptide comprises residues 48-185 of SEQ ID NO: 6 or residues 27-190 of SEQ ID NO: 6.
Contains. In a further embodiment, the isolated polypeptide comprises residues 48-185 of SEQ ID NO: 2, residues 47-184 of SEQ ID NO: 4, residues 27-190 of SEQ ID NO: 2, or residues of SEQ ID NO: 4. Contains 26-188.

【0010】 本発明の第2の局面において、以下の作用可能に連結されるエレメント:転写
プロモーター;上述で開示されるようなポリペプチドをコードするDNAセグメン
ト;ならびに転写ターミネーターを含有する発現ベクターが提供される。1つの
実施態様において、DNAセグメントは、配列番号7のヌクレオチド79〜570を含有
する。別の実施体ユ緒において、発現ベクターはさらに、DNAセグメントに作用
可能に連結される分泌シグナル配列を含有する。 第3の局面において、本発明は、上述で開示されるような発現ベクターが導入
された培養された細胞が提供され、ここで細胞はDNAセグメントを発現する。1
つの実施態様において、発現ベクターはさらに、DNAセグメントに作用可能に連
結される分泌シグナル配列を含有し、そしてポリペプチドは細胞によって分泌さ
れる。
In a second aspect of the invention there is provided an expression vector containing the following operably linked elements: a transcription promoter; a DNA segment encoding a polypeptide as disclosed above; and a transcription terminator. To be done. In one embodiment, the DNA segment contains nucleotides 79-570 of SEQ ID NO: 7. In another embodiment, the expression vector further contains a secretory signal sequence operably linked to the DNA segment. In a third aspect, the invention provides a cultured cell into which an expression vector as disclosed above has been introduced, wherein the cell expresses a DNA segment. 1
In one embodiment, the expression vector further contains a secretory signal sequence operably linked to the DNA segment, and the polypeptide is secreted by the cell.

【0011】 第4の局面において、本発明は、タンパク質を製造する方法を提供し、以下の
工程:DNAセグメントが発現され、そしてポリペプチドが産生される条件下で上
述で開示されたような発現ベクターを導入され、およびポリペプチドが産生され
る細胞を培養する工程;ならびにポリペプチドを回収する工程、を包含する。発
現ベクターがさらにDNAセグメントに作用可能に連結される分泌シグナル配列を
含有する場合、ポリペプチドは細胞によって分泌され、そして細胞が培養される
培地から回収される。 第5の局面において、本発明は、上述で開示された方法によって産生された、
タンパク質を提供する。
In a fourth aspect, the invention provides a method of producing a protein, comprising the steps of: expression as disclosed above under conditions in which a DNA segment is expressed and a polypeptide is produced. Culturing cells into which the vector has been introduced and which produces the polypeptide; and the step of recovering the polypeptide. If the expression vector further contains a secretory signal sequence operably linked to the DNA segment, the polypeptide is secreted by the cell and recovered from the medium in which the cell is cultured. In a fifth aspect, the invention is produced by the method disclosed above,
Provide protein.

【0012】 本発明の第6の局面において、上述で開示されたポリペプチドに特異的に結合
する抗体が提供される。 本発明の第7の局面において、試験サンプル中で、zalpha29活性のアンタゴニ
ストの存在を検出する方法が提供される。方法は、以下の工程:(a)zalpha29に
応答性である細胞を培養する工程;(b)試験サンプルの存在下および不在下でzal
pha29ポリペプチドに細胞を曝露する工程;(c)試験サンプルの存在下および不在
下で、生物学的または生化学的なアッセイによって、zalpha29ポリペプチドに対
する応答のレベルを比較する工程;ならびに(d)試験サンプル中のzalpha29活性
のアンタゴニストの存在を、比較から決定する工程を包含する。 本発明のこれらのおよび他の局面は、以下の発明の詳細な説明および添付の図
面を参照することによって明白になる。
In a sixth aspect of the invention there is provided an antibody that specifically binds to the above disclosed polypeptide. In a seventh aspect of the invention there is provided a method of detecting the presence of an antagonist of zalpha29 activity in a test sample. The method comprises the following steps: (a) culturing cells responsive to zalpha29; (b) zal in the presence and absence of the test sample.
exposing the cells to the pha29 polypeptide; (c) comparing the level of response to the zalpha29 polypeptide by a biological or biochemical assay in the presence and absence of a test sample; and (d) The step of determining the presence of an antagonist of zalpha29 activity in the test sample from the comparison is included. These and other aspects of the invention will be apparent upon reference to the following detailed description of the invention and the accompanying drawings.

【0013】 発明の詳細な説明 本発明を詳細に記載する前に、以下の用語を規定することは、本発明を理解す
るのに役立ち得る: 本明細書中で使用される用語「親和性タグ」は、第2のポリペプチドの精製も
しくは検出を提供するために、または基質への第2のポリペプチドの接着のため
の部位を提供するために、第2のポリペプチドに接着され得るポリペプチドセグ
メントを示す。主に、抗体または他の特異的な結合因子が利用可能である任意の
ポリペプチドまたはタンパク質が、親和性タグとして使用され得る。
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Before describing the present invention in detail, it may be helpful to the understanding of the present invention to define the following terms: The term "affinity tag" as used herein. "Is a polypeptide that can be attached to a second polypeptide to provide purification or detection of the second polypeptide, or to provide a site for attachment of the second polypeptide to a substrate. Indicates a segment. In principle, any polypeptide or protein for which an antibody or other specific binding agent is available can be used as an affinity tag.

【0014】 親和性タグは、ポリヒスチジントラクト、プロテインA(Nilssonら、EMBO J.4 :1075、1985;Nilssonら、Methods Enzymol、198:3、1991)、グルタミンSトラン
スフェラーゼ(SmithおよびJohonson、Gene 67:31、1988)、マルトース結合タン
パク質(KellermanおよびFerenci、Methods Enzymol.90:459-463、1982;Guanら、
Gene 67:21-30、1987)、Glu-Glu親和性タグ(Grussenmeyerら、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 82:7952-4、1985;配列番号5を参照のこと)、物質P、Flag(商標)ペプチ
ド(Hoppら、Biotechnology 6:1204-10、1988)、ストレプトアビジン結合ペプチ
ド、チオレドキシン、ユビキチン、セルロース結合タンパク質、T7ポリメラーゼ
、または他の抗原性エピトープもしくは結合ドメインを包含する。
Affinity tags include polyhistidine tracts, protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4 : 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol, 198 : 3, 1991), glutamine S transferase (Smith and Johonson, Gene 67). : 31, 1988), maltose binding protein (Kellerman and Ferenc, Methods Enzymol. 90 : 459-463, 1982; Guan et al.
Gene 67 : 21-30, 1987), Glu-Glu affinity tag (Grussenmeyer et al., Proc.Natl.Acad.S.
ci.USA 82 : 7952-4, 1985; see SEQ ID NO: 5), substance P, Flag ™ peptide (Hopp et al., Biotechnology 6 : 1204-10, 1988), streptavidin binding peptide, thioredoxin, ubiquitin. , Cellulose-binding proteins, T7 polymerase, or other antigenic epitopes or binding domains.

【0015】 概して、Fordら、Protein Expression and Purification 2:95-107、1991を参
照のこと。親和性または他の試薬をコードするDNAは市販の供給者(例えば、Phar
macia Biotech、Piscataway、NJ;New England Biolabs、Beverly、MA;およびEas
tman Kodack、New Haven、CT)から入手可能である。
See generally Ford et al., Protein Expression and Purification 2 : 95-107, 1991. DNA encoding affinity or other reagents can be obtained from commercial suppliers (e.g., Phar
macia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA; and Eas
tman Kodack, New Haven, CT).

【0016】 用語「対立遺伝子改変体」は、同じ染色体遺伝子座を占有する遺伝子の任意の
2つ以上のオルタナティブな形態を示すために本明細書中で使用される。対立遺
伝子改変は、変異を解して天然に生じ、および集団内に表現型多型を生じ得る。
遺伝子変異は、サイレント(コードされるポリペプチドにおける変化がない)であ
り得るか、または変化されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る
。用語対立遺伝子改変体はまた、遺伝子の対立遺伝子改変体によってコードされ
るタンパク質を示すために本明細書中で使用される。
The term “allelic variant” is used herein to indicate any two or more alternative forms of a gene occupying the same chromosomal locus. Allelic modifications can occur spontaneously by unraveling mutations and result in phenotypic polymorphisms within the population.
The genetic mutation can be silent (no change in the encoded polypeptide) or can encode a polypeptide having an altered amino acid sequence. The term allelic variant is also used herein to indicate a protein encoded by an allelic variant of a gene.

【0017】 用語「アミノ末端」および「カルボキシ末端」は、ポリペプチド内の位置を示
すために本明細書中で使用される。情況が可能である場合、これらの用語は、近
位のまたは相対的な位置を示すために、ポリペプチドの特定の配列または位置を
参照して使用される。例えば、ポリペプチド内の参照配列のカルボキシ末端に配
置されるある配列は、参照配列のカルボキシ末端に近位に位置されるが、完全な
ポリのカルボキシ末端にでは必ずしもない。
The terms “amino terminus” and “carboxy terminus” are used herein to indicate a position within a polypeptide. Where the context allows, these terms are used with reference to a particular sequence or position of a polypeptide to indicate proximal or relative position. For example, a sequence located within the polypeptide at the carboxy terminus of a reference sequence is located proximal to the carboxy terminus of the reference sequence but not necessarily at the carboxy terminus of the complete poly.

【0018】 「血管新生」は、単独でまたは1つ以上のさらなる化合物と協調して、既存の
管から新規な血管の形成を刺激する化合物の能力を示す。血管新生活性は、内皮
細胞活性化、内皮細胞によるプロテアーゼ分泌の刺激、内皮細胞移入、毛細血管
出芽形成、および内皮細胞増殖として測定可能である。血管新生はまた、本明細
書中で開示されるようないくつかのインビボアッセイのいずれかを使用して測定
され得る。
“Angiogenesis” refers to the ability of a compound to stimulate the formation of new blood vessels from pre-existing vessels, alone or in concert with one or more additional compounds. Angiogenic activity can be measured as endothelial cell activation, stimulation of protease secretion by endothelial cells, endothelial cell transfer, capillary sprouting, and endothelial cell proliferation. Angiogenesis can also be measured using any of a number of in vivo assays as disclosed herein.

【0019】 ポリヌクレオチド分子の「相補体」は、相補的な塩基配列を有するポリヌクレ
オチド分子であり、および参照配列に比較されるように逆方向である。例えば、
配列5’ ATGCACGGG 3’は、5’ CCCGTGCAT 3’に相補的である。 用語「対応する」は、配列中のアミノ酸残基の位置に適用される場合、配列が
至適にアラインされる場合の複数の配列における対応する位置を意味する。
A “complement” of a polynucleotide molecule is a polynucleotide molecule that has a complementary base sequence and is in the opposite orientation as compared to a reference sequence. For example,
The sequence 5 ′ ATGCACGGG 3 ′ is complementary to 5 ′ CCCGTGCAT 3 ′. The term "corresponding", when applied to a position of an amino acid residue in a sequence, means the corresponding position in multiple sequences when the sequences are optimally aligned.

【0020】 用語「縮重ヌクレオチド配列」は、(ポリペプチドをコードする参照ポリヌク
レオチドに比較されるように)1つ以上の縮重コドンを含むヌクレオチド配列を
示す。縮重コドンは、ヌクレオチドの異なるトリプレットを含むが、同じアミノ
酸残基をコードする(すなわち、GAUおよびGACトリプレットはそれぞれAspをコー
ドする)。
The term “degenerate nucleotide sequence” refers to a nucleotide sequence that contains one or more degenerate codons (as compared to a reference polynucleotide that encodes a polypeptide). Degenerate codons contain triplets of different nucleotides but encode the same amino acid residue (ie, GAU and GAC triplets each encode Asp).

【0021】 用語「発現ベクター」は、直鎖状または環状のDNA分子を示すために使用され
、これはその転写を提供するためにさらなるセグメントに作用可能に連結される
目的のポリペプチドをコードするセグメントを含む。このようなさらなるセグメ
ントはプロモーターおよびターミネーター配列を含み、ならびにまた1つ以上の
複製起点、1つ以上の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルな
どを含み得る。発現ベクターは一般に、プラスミドもしくはウイルスDNAに由来
するか、または両方のエレメントを含み得る。
The term “expression vector” is used to refer to a linear or circular DNA molecule, which encodes a polypeptide of interest operably linked to additional segments to provide for its transcription. Contains segments. Such additional segments include promoter and terminator sequences, and may also include one or more origins of replication, one or more selectable markers, enhancers, polyadenylation signals, and the like. Expression vectors are generally derived from plasmid or viral DNA, or may contain elements of both.

【0022】 用語「単離された」は、ポリヌクレオチドに対して適用される場合、ポリヌク
レオチドが、その天然の遺伝子環境から取り出された、および従って、他の余分
なまたは所望されないコード配列がない、および遺伝子操作されたタンパク質産
生系内での使用に適切な形態にあることを示す。このような単離された分子は、
それらの天然の環境から分離され、ならびにcDNAおよびゲノムクローンを含む。
本発明の単離されたDNA分子は、それらが通常会合される他の遺伝子がないが、
プロモーターおよびターミネーターのような天然に存在する5’および3’非翻訳
領域を含み得る。会合された領域の同定は、当業者に明らかである(例えば、Dyn
anおよびTijan、Nature 316:774-78、1985を参照のこと)。
The term “isolated”, when applied to a polynucleotide, has removed the polynucleotide from its natural genetic environment, and thus is free of other extra or undesired coding sequences. , And in a form suitable for use in genetically engineered protein production systems. Such an isolated molecule is
Isolated from their natural environment and includes cDNA and genomic clones.
The isolated DNA molecules of the present invention are free of other genes with which they are normally associated,
It may include naturally occurring 5'and 3'untranslated regions such as promoters and terminators. Identification of associated regions will be apparent to those of skill in the art (e.g., Dyn
See an and Tijan, Nature 316 : 774-78, 1985).

【0023】 「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、血液および動物組織から離
れたようなそのネイティブな環境以外の状況において見出されるポリペプチドま
たはタンパク質である。単離されたポリペプチドは実質的に、他のポリペプチド
、特に動物起源の他のポリペプチドがなくあり得る。ポリペプチドは、高度に精
製された形態で、すなわち95%を超える純度で、または99%を超える純度で調製
され得る。この情況において使用される場合、用語「単離された」は、2量体ま
たはオルタナティブにグリコシル化されたもしくは誘導体化された形態のような
オルタナティブな物理的形態における同じポリペプチドの存在を排除しない。
An “isolated” polypeptide or protein is a polypeptide or protein found in circumstances other than its native environment, such as away from blood and animal tissues. An isolated polypeptide can be substantially free of other polypeptides, particularly other polypeptides of animal origin. The polypeptides can be prepared in highly purified form, ie, greater than 95% pure, or greater than 99% pure. As used in this context, the term "isolated" does not exclude the presence of the same polypeptide in alternative physical forms, such as dimer or alternatively glycosylated or derivatized forms. .

【0024】 「作用可能に連結された」は、2つ以上の実体が、それらがそれらの意図され
る目的のために協調して機能するようにともに結合されることを意味する。DNA
セグメントに言及する場合、句は、例えば、コード配列が正確なリーディングフ
レームにおいて合わされ、そして転写がプロモーターにおいて開始されおよびコ
ードセグメントを介してターミネーターに進行することを意味する。ポリペプチ
ドに言及する場合、「作用可能に連結された」は、共有結合的に(例えば、ジス
ルフィド結合によって)および非共有結合的に(例えば、水素結合、疎水性結合、
または塩架橋相互作用によって)連結される配列の両方を含み、ここでは配列の
所望される機能が保持される。 用語「オルソログ」は、異なる種からのポリペプチドまたはタンパク質の機能
的な対応物である、ある種から得られるポリペプチドまたはタンパク質を示す。
オルソログ間の配列の差異は種分化の結果である。
“Operably linked” means that two or more entities are linked together such that they function cooperatively for their intended purpose. DNA
When referring to a segment, the phrase, for example, means that the coding sequence is aligned in the correct reading frame, and transcription is initiated at the promoter and proceeds through the coding segment to the terminator. "Operably linked" when referring to a polypeptide, is covalently (e.g., by a disulfide bond) and non-covalently (e.g., hydrogen bond, hydrophobic bond,
Or both linked sequences (by salt bridge interactions), where the desired function of the sequences is retained. The term "ortholog" refers to a polypeptide or protein obtained from a species that is a functional counterpart of the polypeptide or protein from a different species.
Sequence differences between orthologs are the result of speciation.

【0025】 「ポリヌクレオチド」は、5’から3’末端に読まれるデオキシリボヌクレオチ
ドまたはリボヌクレオチド塩基の1本鎖または2本鎖ポリマーである。ポリヌク
レオチドはRNAおよびDNAを含み、ならびに天然の供給源から単離され得るか、イ
ンビトロで合成され得るか、または天然分子および合成分子の組み合わせから調
製され得る。ポリヌクレオチドの大きさは、塩基対(「bp」と略される)、ヌクレ
オチド(「nt」)、またはキロベース(「kb」)として表される。
A “polynucleotide” is a single- or double-stranded polymer of deoxyribonucleotide or ribonucleotide bases read at the 5 ′ to 3 ′ end. Polynucleotides include RNA and DNA and can be isolated from natural sources, synthesized in vitro, or prepared from a combination of natural and synthetic molecules. The size of a polynucleotide is expressed as base pairs (abbreviated as "bp"), nucleotides ("nt"), or kilobases ("kb").

【0026】 情況が可能である場合、後者の2つの用語は、1本鎖または2本鎖であるポリ
ヌクレオチドを記載し得る。用語が2本鎖分子に適応される場合、これは全体の
長さを示すために使用され、および用語「塩基対」に等価であることが理解され
る。当業者によって、2本鎖ポリヌクレオチドの2つの鎖は、長さがわずかに異
なり得ること、およびその末端が酵素的切断の結果としてねじられ得ることが認
識され;従って、2本鎖ポリヌクレオチド分子の範囲内の全てのヌクレオチドは
対合されないかもしれない。このような非対合性の末端は一般に、20ntの長さを
超えない。
Where circumstances permit, the latter two terms may describe polynucleotides that are single-stranded or double-stranded. It is understood that when the term applies to double-stranded molecules, it is used to indicate overall length and is equivalent to the term "base pair". It will be appreciated by those skilled in the art that the two strands of a double-stranded polynucleotide may differ slightly in length and that their ends may be twisted as a result of enzymatic cleavage; thus, a double-stranded polynucleotide molecule. All nucleotides within the range may not be matched. Such unpaired ends generally do not exceed 20 nt in length.

【0027】 「ポリペプチド」は、天然にまたは合成的に産生されるペプチド結合によって
合わされるアミノ酸残基のポリマーである。約10アミノ酸残基未満のポリペプチ
ドは一般に「ペプチド」として言及される。 用語「プロモーター」は、その当該分野で認識される意味について、RNAポリ
メラーゼの結合および転写の開始を提供するDNA配列を含有する遺伝子の一部分
を示すために本明細書中で使用される。プロモーター配列は一般に、遺伝子の5
’非コード領域において見出されるが、常にではない。
A “polypeptide” is a polymer of amino acid residues joined by peptide bonds that are naturally or synthetically produced. Polypeptides of less than about 10 amino acid residues are commonly referred to as "peptides." The term "promoter" is used herein in its art-recognized sense to refer to the portion of a gene containing a DNA sequence that provides for the binding of RNA polymerase and initiation of transcription. Promoter sequences are generally genes 5
Found in the'non-code domain, but not always.

【0028】 「タンパク質」は、1つ以上のポリペプチド鎖を含有する高分子である。タン
パク質はまた、炭水化物基のような、非ペプチド成分を含有し得る。炭水化物お
よび他の非ペプチドの置換体は、タンパク質が産生される細胞によってタンパク
質に付加され得、および細胞のタイプとともに変化する。タンパク質は、それら
のアミノ酸骨格構造に関して本明細書中で規定され;炭水化物基のような置換体
は一般に特定されないが、それにもかかわらず存在し得る。 「分泌シグナル配列」は、より大きなポリペプチドの成分として、より大きな
ポリペプチドをそれが合成される細胞の分泌経路を介して導くポリペプチド(「
分泌ペプチド」)をコードするDNA配列である。より大きなポリペプチドは一般に
、分泌経路を介する移行の間に分泌ペプチドを除去するために切断される。
A “protein” is a macromolecule containing one or more polypeptide chains. Proteins may also contain non-peptide components such as carbohydrate groups. Carbohydrate and other non-peptide substitutes can be added to the protein by the cell in which it is produced, and will vary with cell type. Proteins are defined herein in terms of their amino acid backbone structure; substitutions such as carbohydrate groups are generally not specified, but may be present nonetheless. A "secretory signal sequence" is a component of a larger polypeptide that directs the larger polypeptide through the secretory pathways of the cell in which it is synthesized ("
Is a DNA sequence encoding a secretory peptide "). Larger polypeptides are generally cleaved to remove the secretory peptide during transit through the secretory pathway.

【0029】 「セグメント」は、特定された特性を有するより大きな分子(例えば、ポリヌ
クレオチドまたはポリペプチド)の一部分である。例えば、特定されたポリペプ
チドをコードするDNAセグメントは、5’から3’方向に読まれる場合、特定され
たポリペプチドのアミノ酸の配列をコードするプラスミドまたはプラスミドフラ
グメントのようなより長いDNA分子の1部分である。 不正確な分析法(例えば、ゲル電気泳動)によって決定される分子量およびポリ
マーの長さは、およその値であることが理解される。このような値が「約」Xま
たは「およそ」Xとして表される場合、Xの言及される値は±10%に正確である
ことが理解される。 本明細書中に引用される全ての参考文献はそれらの全体が参考として援用され
る。
A “segment” is a portion of a larger molecule (eg, polynucleotide or polypeptide) that has specified properties. For example, a DNA segment encoding a specified polypeptide, when read in the 5'to 3'direction, is one of the longer DNA molecules such as plasmids or plasmid fragments encoding the sequence of amino acids of the specified polypeptide. It is a part. It is understood that the molecular weights and polymer lengths determined by inaccurate analytical methods (eg, gel electrophoresis) are approximate values. When such a value is expressed as "about" X or "approximately" X, it is understood that the stated value of X is accurate to ± 10%. All references cited herein are incorporated by reference in their entirety.

【0030】 本発明は新規なサイトカインポリペプチドおよびタンパク質を提供する。この
新規なサイトカインは、「zalpha29」と呼ばれ、4つのへリックス束のサイトカ
イン(例えば、エリスロポエチン、トロンボポエチン、G-CSF、IL-2、IL-4、レプ
チン、および増殖ホルモン)に特徴的なポリペプチドおよびポリヌクレオチドの
特徴の存在によって同定された。配列番号2において示されるヒトzalpha29アミ
ノ酸配列の解析は、4つの両親媒性の、アルファへリックス領域の存在を示す。
これらの領域は、少なくともアミノ酸残基48〜62(へリックスA)、105〜119(へリ
ックスB)、138〜152(へリックスC)、および171〜185(へリックスD)を含む。
The present invention provides novel cytokine polypeptides and proteins. This novel cytokine is called "zalpha29" and is a poly-protein characteristic of four helix bundle cytokines (eg, erythropoietin, thrombopoietin, G-CSF, IL-2, IL-4, leptin, and growth hormone). It was identified by the presence of peptide and polynucleotide features. Analysis of the human zalpha29 amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 shows the presence of four amphipathic, alpha helix regions.
These regions contain at least amino acid residues 48-62 (helix A), 105-119 (helix B), 138-152 (helix C), and 171-185 (helix D).

【0031】 これらのへリックス領域内で4つのへリックス束のコア内にあることが予測さ
れる残基は、配列番号2の48位、51位、52位、55位、58位、59位、62位、105位
、108位、109位、112位、115位、116位,119位,138位、141位、142位、145位、14
8位、149位、152位、171位、174位、175位、178位、181位、182位、および185位
で生じる。残基49、50、53、54、56、57、60、61、106、107、110、111、113、1
14、117、118、139、140、143、144、146、147、150、151、172、173、176、177
、179、180、および184は束の曝露された表面上にあることが予測される。
Residues predicted to be within the core of the four helix bundles within these helix regions are positions 48, 51, 52, 55, 58 and 59 of SEQ ID NO: 2. , 62nd, 105th, 108th, 109th, 112th, 115th, 116th, 119th, 138th, 141st, 142nd, 145th, 14th
It occurs at positions 8, 149, 152, 171, 174, 175, 178, 181, 182, and 185. Residues 49, 50, 53, 54, 56, 57, 60, 61, 106, 107, 110, 111, 113, 1
14, 117, 118, 139, 140, 143, 144, 146, 147, 150, 151, 172, 173, 176, 177
, 179, 180, and 184 are expected to be on the exposed surface of the fascicles.

【0032】 内部−へリックスループは、およそ残基63〜104(ループA-B)、120〜137(ルー
プB-C)、および153〜170(ループC-D)を含む。ヒトzalpha29 cDNA(配列番号1)は
、190アミノ酸残基のポリペプチドをコードする。理論によって束縛されること
を望まないが、この配列は26残基の分泌ペプチドを含むことが予測される。残基
26の後ろの切断は、18,558Daの算定される分子量(グリコシル化の排除)を有する
成熟ポリペプチド(配列番号2の残基27〜190)を生じる。
The internal-helix loop contains approximately residues 63-104 (loop AB), 120-137 (loop BC), and 153-170 (loop CD). Human zalpha29 cDNA (SEQ ID NO: 1) encodes a polypeptide of 190 amino acid residues. Without wishing to be bound by theory, this sequence is predicted to include a 26 residue secretory peptide. residue
Cleavage after 26 results in a mature polypeptide (residues 27-190 of SEQ ID NO: 2) with a calculated molecular weight of 18,558 Da (elimination of glycosylation).

【0033】 しかし、当業者は、いくつかのサイトカイン(例えば、内皮細胞増殖因子、塩
基性FGF、およびIL-1β)は従来の分泌ペプチドを含まず、および理解されていな
い機構によって分泌されることを認識する。配列番号2において残基111〜113に
て、単一のコンセンサスN-結合型グリコシル化部位がある。cDNAはまた、明らか
なポリアデニル化シグナルを含む。
However, those skilled in the art will appreciate that some cytokines (eg, endothelial cell growth factor, basic FGF, and IL-1β) do not contain conventional secretory peptides and are secreted by mechanisms that are not understood. Recognize. There is a single consensus N-linked glycosylation site at residues 111-113 in SEQ ID NO: 2. The cDNA also contains a clear polyadenylation signal.

【0034】 マウスzalpha29ポリペプチド(配列番号4)は、類似の位置にてへリックスおよ
びループを含むことが予測され、残基47〜61、104〜118、137〜151、および170
〜184でのへリックス;および残基62〜103、119〜136、および152〜169でのルー
プを含む。図2を参照のこと。 当業者は、予測されるドメイン境界がいくらかあいまいであり、および±5ア
ミノ酸残基まで変化し得ることを認識する。
The mouse zalpha29 polypeptide (SEQ ID NO: 4) was predicted to contain helices and loops at similar positions, residues 47-61, 104-118, 137-151, and 170.
A helix at ~ 184; and a loop at residues 62-103, 119-136, and 152-169. See FIG. One of skill in the art will recognize that the predicted domain boundaries are somewhat ambiguous and can vary by ± 5 amino acid residues.

【0035】 本発明のポリペプチドは、配列番号2の少なくとも15個の連続的なアミノ酸残
基を含む。本発明のある実施態様において、ポリペプチドは、完全な予測される
成熟ポリペプチド(配列番号2の残基27〜190)または1次転写産物(配列番号2の
残基1〜190)まで、配列番号2の20、30、40、50、100、またはそれ以上の連続的
な残基を含む。対応するマウスzalpha29ポリペプチド(配列番号4)はまた、本発
明によって提供される。以下により詳細に開示されるように、これらのポリペプ
チドはさらに、さらなる、非zalpha29、ポリペプチド配列を含み得る。
The polypeptide of the invention comprises at least 15 consecutive amino acid residues of SEQ ID NO: 2. In one embodiment of the invention, the polypeptide has a sequence of up to the complete predicted mature polypeptide (residues 27-190 of SEQ ID NO: 2) or primary transcript (residues 1-190 of SEQ ID NO: 2). It comprises 20, 30, 40, 50, 100 or more consecutive residues of number 2. The corresponding mouse zalpha29 polypeptide (SEQ ID NO: 4) is also provided by the present invention. As disclosed in more detail below, these polypeptides may further comprise additional, non-zalpha29, polypeptide sequences.

【0036】 本発明のポリペプチドは、配列番号2または配列番号4において示されるよう
なタンパク質のエピトープ保有部分を含有する。「エピトープ」は、抗体が結合
し得るタンパク質の領域である。例えば、Geysenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8 1 :3998-4002,1984を参照のこと。エピトープは、直鎖状または立体配置的であり
、後者はタンパク質の折り畳みの際にエピトープを形成するタンパク質の不連続
な領域から構成される。直鎖状エピトープは一般に、少なくとも6アミノ酸残基
の長さである。タンパク質配列の部分を模倣する比較的短い合成ペプチドは、日
常的に部分的に模倣されるタンパク質と反応する抗血清を誘発し得る。Sutcliff
eら、Science 219:660-666、1983を参照のこと。
The polypeptides of the present invention contain an epitope-bearing portion of a protein as set forth in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. An "epitope" is a region of a protein to which an antibody can bind. See, for example, Geysen et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8 1: 3998-4002,1984 reference. Epitopes can be linear or conformational, the latter composed of discrete regions of the protein that form the epitope upon protein folding. Linear epitopes are generally at least 6 amino acid residues in length. Relatively short synthetic peptides that mimic portions of protein sequences can elicit antisera that routinely react with partially mimicked proteins. Sutcliff
See e et al., Science 219 : 660-666, 1983.

【0037】 短い、直鎖状のエピトープを認識する抗体は特に、ウェスタンブロッティング
(Tobin、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4350-4356、1979)のような変性されたタン
パク質を用いる分析的なおよび診断的な適用において、または固定化された細胞
または組織サンプルの分析において有用である。直鎖状エピトープに対する抗体
はまた、体液または採用培養培地中に生じ得るようなzalpha29のフラグメントを
検出するために有用である。
Antibodies that recognize short, linear epitopes are especially suitable for Western blotting.
(Tobin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 4350-4356, 1979) in analytical and diagnostic applications with denatured proteins or in the analysis of fixed cell or tissue samples. Is useful in. Antibodies directed against linear epitopes are also useful for detecting fragments of zalpha29 as they may occur in body fluids or the culture medium employed.

【0038】 本発明の抗原性の、エピトープ保有ポリペプチドは、zalpha29タンパク質に特
異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体を惹起するために有用である。抗
原性の、エピトープ保有ポリペプチドは、zalpha29タンパク質(配列番号2)の少
なくとも6つの、しばしば少なくとも9つの、一般に約15〜約30個の連続したア
ミノ酸残基を含む。zalpha29タンパク質のより長い部分、すなわち、30〜50残基
から完全な配列までを含むポリペプチドが含まれる。
The antigenic, epitope-bearing polypeptides of the present invention are useful for raising antibodies, including monoclonal antibodies, that specifically bind to the zalpha29 protein. An antigenic, epitope-bearing polypeptide comprises at least 6, often at least 9, generally about 15 to about 30, contiguous amino acid residues of the zalpha29 protein (SEQ ID NO: 2). Included are polypeptides that contain longer portions of the zalpha29 protein, from 30 to 50 residues up to the complete sequence.

【0039】 エピトープ保有ポリペプチドのアミノ酸配列は、水性溶媒中での実質的な可溶
性を提供するように選択されることが好ましく、すなわち、配列は比較的親水性
の残基を含み、および疎水性残基は実質的に回避される。このような残基は、za
lpha29の内部ドメインループおよびそのフラグメント、特に、ループB-C(配列番
号2の残基120〜137)を含み、これは顕著に親水性である(図1Cを参照のこと)。
これに関してポリペプチドは、配列番号2の残基99〜104、129〜134、および162
〜167を含むポリペプチドである。
The amino acid sequence of the epitope-bearing polypeptide is preferably selected to provide substantial solubility in an aqueous medium, ie the sequence contains relatively hydrophilic residues and is hydrophobic. Residues are substantially avoided. Such residues are za
It contains the inner domain loop of lpha29 and fragments thereof, in particular loop BC (residues 120-137 of SEQ ID NO: 2), which is significantly hydrophilic (see Figure 1C).
In this regard, the polypeptide has residues 99-104, 129-134, and 162 of SEQ ID NO: 2.
Is a polypeptide comprising ~ 167.

【0040】 本発明の範囲内の得に重要なものは、zalpha29ポリペプチドの完全な4つのへ
リックス束(配列番号2の残基48〜185)を含むポリペプチドである。このような
ポリペプチドはさらに、ネイティブなzalpha29アミノ末端(配列番号2の残基27
〜47)およびカルボキシル末端(配列番号2の残基186〜190)領域の一方または両
方の全てまたは部分、ならびに非zalpha29アミノ酸残基または以下により詳細に
開示されるようなポリペプチド配列をさらに含み得る。
Of particular interest within the scope of the present invention is a polypeptide containing the complete four helix bundle of the zalpha29 polypeptide (residues 48-185 of SEQ ID NO: 2). Such a polypeptide further comprises the native zalpha29 amino terminus (residue 27 of SEQ ID NO: 2).
~ 47) and all or part of one or both of the carboxyl-terminal (residues 186-190 of SEQ ID NO: 2) regions, and non-zalpha29 amino acid residues or polypeptide sequences as disclosed in more detail below. .

【0041】 本発明のポリペプチドは、配列番号2に比較されるように1つ以上のアミノ酸
の置換、欠失、または付加を伴って調製され得る。これらの変化は通常、小さな
性質、すなわち保存的なアミノ酸置換およびタンパク質またはポリペプチドの折
り畳みまたは活性を有意に影響しない他の変化であり、ならびにアミノ末端メチ
オニン残基、マレイミド活性化キーホールリンペットヘモシアニンへのその後の
連結を容易にするためのアミノもしくはカルボキシル−末端システイン残基、約
20〜25残基までの小さなリンカーペプチドのような、アミノ−もしくはカルボキ
シル−末端伸長、または上述で開示されるような精製を容易にする伸長(親和性
タグ)を含む。2つ以上の親和性タグが、組み合わせて使用され得る。親和性タ
グを含むポリペプチドはさらに、zalpha29ポリペプチドと親和性タグとの間にポ
リペプチドリンカーおよび/またはタンパク質分解性切断部位を含み得る。例示
的な切断部位は、トロンビン切断部位および第Xa因子切断部位を含む。
The polypeptides of the present invention may be prepared with one or more amino acid substitutions, deletions, or additions as compared to SEQ ID NO: 2. These changes are usually of small nature, ie, conservative amino acid substitutions and other changes that do not significantly affect protein or polypeptide folding or activity, as well as amino-terminal methionine residues, maleimide-activated keyhole limpet hemocyanin. An amino or carboxyl-terminal cysteine residue, to facilitate subsequent ligation to
Include amino- or carboxyl-terminal extensions, such as small linker peptides of up to 20-25 residues, or extensions that facilitate purification (affinity tags) as disclosed above. Two or more affinity tags can be used in combination. Polypeptides that include an affinity tag can further include a polypeptide linker and / or a proteolytic cleavage site between the zalpha29 polypeptide and the affinity tag. Exemplary cleavage sites include thrombin cleavage sites and factor Xa cleavage sites.

【0042】 本発明はさらに、多様な他のポリペプチド融合物を提供する。例えば、zalpha
29ポリペプチドは、米国特許第5,155,027号および同第5,567,584号において開示
されるような2量体化タンパク質への融合として調製され得る。これに関して適
切な2量体化タンパク質は、免疫グロブリン定常領域ドメインを含む。免疫グロ
ブリン−zalpha29ポリペプチド融合物は、多様な多量体zalpha29アナログを生成
するために遺伝子操作された細胞において発現され得る。さらに、zalpha29ポリ
ペプチドは、多機能性分子を提供するために、サイトカインのような別の生体活
性分子に結合され得る。
The present invention further provides a variety of other polypeptide fusions. For example, zalpha
The 29 polypeptide can be prepared as a fusion to a dimerization protein as disclosed in US Pat. Nos. 5,155,027 and 5,567,584. Suitable dimerization proteins in this regard include immunoglobulin constant region domains. Immunoglobulin-zalpha29 polypeptide fusions can be expressed in cells that have been genetically engineered to produce a variety of multimeric zalpha29 analogs. In addition, the zalpha29 polypeptide can be linked to another bioactive molecule such as a cytokine to provide a multifunctional molecule.

【0043】 zalpha29ポリペプチドの1つ以上のへリックスは、その生物学的特性を増強す
るかまたはそうでなければ改変するために別のサイトカインに結合され得る。補
助的なドメインは、zalpha29ポリペプチドに、それらを特異的な細胞、組織、ま
たは高分子(例えば、コラーゲン)に標的するために融合され得る。例えば、zalp
ha29ポリペプチドまたはタンパク質は、zalpha29ポリペプチドを標的細胞の表面
上の受容体に特異的に結合するリガンドに融合することによって、予め決定され
た細胞型に標的され得る。
One or more helices of the zalpha29 polypeptide may be linked to another cytokine to enhance or otherwise modify its biological properties. Ancillary domains can be fused to zalpha29 polypeptides to target them to specific cells, tissues, or macromolecules such as collagen. For example, zalp
The ha29 polypeptide or protein can be targeted to a predetermined cell type by fusing the zalpha29 polypeptide to a ligand that specifically binds to a receptor on the surface of the target cell.

【0044】 この方法において、ポリペプチドおよびタンパク質は治療または診断の目的の
ために標的され得る。zalpha29ポリペプチドは、精製のためにおよびドメインを
標的化するために、親和性タグのような2つ以上の部分に結合され得る。ポリペ
プチド融合物はまた、1つ以上の切断部位を、特にドメイン間で含み得る。Tuan
ら、Connective Tissue Research 34:1-9、1996を参照のこと。
In this way, polypeptides and proteins can be targeted for therapeutic or diagnostic purposes. The zalpha29 polypeptide can be attached to more than one moiety, such as an affinity tag, for purification and targeting of the domain. Polypeptide fusions may also include one or more cleavage sites, particularly between domains. Tuan
Et al., Connective Tissue Research 34 : 1-9, 1996.

【0045】 本発明のポリペプチド融合物は一般に、約1,500を超えないアミノ酸残基、し
ばしば1,200を超えない残基、通常1,000を超えない残基を含み、および多くの場
合においてかなりより小さい。例えば、164残基のzalpha29ポリペプチド(配列番
号2の残基27〜190)は、E.coli β−ガラクトシダーゼ(1,021残基;Casadabanら
、J.Bacteriol.143:971-980,1980を参照のこと)、10残基のスペーサー、および
4残基の第Xa因子切断部位に融合されて、1,199残基のポリペプチドを生じ得る
。第2の例において、配列番号2の残基27-190は、マルトース結合部位(およそ3
70残基)、4残基の切断部位、および6-残基のポリヒスチジンタグに融合され得
る。
The polypeptide fusions of the present invention generally comprise no more than about 1,500 amino acid residues, often no more than 1,200 residues, usually no more than 1,000 residues, and in many cases are much smaller. For example, a 164 residue zalpha29 polypeptide (residues 27-190 of SEQ ID NO: 2) is described in E. coli β-galactosidase (residues 1,021; Casadaban et al., J. Bacteriol. 143 : 971-980,1980). , And can be fused to a 10-residue spacer and a 4-residue Factor Xa cleavage site to yield a 1,199-residue polypeptide. In a second example, residues 27-190 of SEQ ID NO: 2 are maltose binding sites (approximately 3
70 residues), a 4-residue cleavage site, and a 6-residue polyhistidine tag.

【0046】 上述で開示されるように、本発明のポリペプチドは、配列番号2または配列番
号4の少なくとも15個の連続的な残基を含む。これらのポリペプチドはさらに、
配列番号2、配列番号2の改変体、または本明細書中に開示されるような別のタ
ンパク質において示されるようにさらなる残基を含み得る。「配列番号2の改変
体」は、配列番号2の対応する領域に対して少なくとも85%、少なくとも90%、ま
たは少なくとも95%同一であるポリペプチドを含む。配列同一性のパーセントは
、従来の方法によって決定される。
As disclosed above, the polypeptides of the invention comprise at least 15 consecutive residues of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. These polypeptides are further
Additional residues may be included as set forth in SEQ ID NO: 2, variants of SEQ ID NO: 2, or another protein as disclosed herein. A "variant of SEQ ID NO: 2" comprises a polypeptide that is at least 85%, at least 90%, or at least 95% identical to the corresponding region of SEQ ID NO: 2. The percent sequence identity is determined by conventional methods.

【0047】 例えば。Altschulら、Bull.Math.Bio.48:603-616、1986およびHenikoffおよび
Henikoff、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919、1992を参照のこと。簡潔
には、2つのアミノ酸配列は、表1(アミノ酸残基が標準的な1文字コードによ
って示される)において示されるように、10のギップオープニングペナルティー
および1のギャップ伸長ペナルティー、ならびにHenikoffおよびHenikoff(同書)
の「BLOSUM62」スコアリングマトリックスを使用してアラインメントスコアを至
適化するようにアラインされる。次いで、同一性のパーセントが以下のように算
定される:
For example: Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48 : 603-616, 1986 and Henikoff and
See Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 10915-10919, 1992. Briefly, the two amino acid sequences are shown in Table 1 (where amino acid residues are indicated by the standard one-letter code), with 10 Gip opening penalties and 1 gap extension penalties, and Henikoff and Henikoff ( (Ibid)
Aligned to optimize the alignment score using the "BLOSUM62" scoring matrix of. The percent identity is then calculated as follows:

【0048】[0048]

【数1】 [Equation 1]

【0049】[0049]

【表1】 [Table 1]

【0050】 アミノ酸配列間の同一性レベルはピアソンとリップマン(Pearson and Lipman,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988)が、またピアソン(Pearson, Meth
. Enzymol. 183:63, 1990)が開示している“FASTA”類似性検索アルゴリズムに
より決定することができる。簡単に説明すると、FASTAは先ず同類アミノ酸置換
、挿入または欠失を無視して、疑問となる配列を分け持つ領域(例えば、配列番
号2)と同一性の最も高い密度(もしktup可変が1ならば)または同一性の対(もしk
tup=2なら)を有するテスト配列を同定することにより配列の類似性を評価する。
The level of identity between amino acid sequences is determined by Pearson and Lipman,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988), but Pearson, Meth
. Enzymol. 183: 63, 1990) disclosed by the "FASTA" similarity search algorithm. Briefly, FASTA first ignores conservative amino acid substitutions, insertions or deletions, and has the highest density of identity (if ktup variable is 1 if the ktup variable is 1) with the region sharing the questionable sequence (eg, SEQ ID NO: 2) ) Or a pair of identities (if k
Sequence similarity is assessed by identifying test sequences with (if tup = 2).

【0051】 同一性の最も高い密度を有する10の領域を次いでアミノ酸マトリックスにより
すべての対となったアミノ酸の類似性を比較することにより再配点し、該領域の
末端を平滑断端として最高得点に寄与する残基のみを含めるようにする。もし“
カットオフ”値よりも大きな得点をもつ幾つかの領域があるならば(配列の長さ
とktup値に基き予め定められた式により計算)、その場合には平滑断端とした最
初の領域を検討して、当該領域が結合してギャップをもつ適切な配列を形成し得
るか否かを決定する。最後に、2つのアミノ酸配列の内、高い方の得点領域をニ
ードルマン−ブンシュ−セラーズ・アルゴリズム(Needleman and Wunsch, J. Mo
l. Biol. 48:444, 1970; Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787, 1974)の改良
法により整列させるが、これによりアミノ酸の挿入および欠失が可能となる。
The ten regions with the highest densities of identity were then re-pointed by comparing the similarities of all paired amino acids by the amino acid matrix, with the ends of the regions being the highest score with blunt ends. Try to include only the contributing residues. if"
If there are some regions with scores greater than the "cutoff" value (calculated by a predetermined formula based on the length of the array and the ktup value) then consider the first region with a smooth edge. To determine if the regions can combine to form an appropriate sequence with gaps.Finally, the higher scoring region of the two amino acid sequences is assigned to the Needleman-Bunsch-Sellers algorithm. (Needleman and Wunsch, J. Mo
l. Biol. 48: 444, 1970; Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787, 1974), which allows for the insertion and deletion of amino acids.

【0052】 FASTA分析の好適なパラメーターは以下のとおりである:ktup=1、ギャップオー
プニングペナルティ=10、ギャップ伸長ペナルティ=1、および置換マトリックス=
BLOSUM62。これらのパラメーターはピアソンの補遺2、1990(上記)に説明のある
ように、スコアリング・マトリックス・ファイル(“SMATRIX”)を改変すること
によりFASTAプログラムに導入することが可能である。
Suitable parameters for FASTA analysis are as follows: ktup = 1, gap opening penalty = 10, gap extension penalty = 1, and substitution matrix =
BLOSUM62. These parameters can be introduced into the FASTA program by modifying the scoring matrix file (“SMATRIX”) as described in Pearson Addendum 2, 1990 (supra).

【0053】 FASTAはまた上記の比率を用いて核酸分子の配列同一性を決めるのにも使用す
ることができる。ヌクレオチド配列比較のために、ktup値は1ないし6の範囲と
し、好ましくは3ないし6、最も好ましくは3とし、他のパラメーターは無いも
のとする。
FASTA can also be used to determine the sequence identity of nucleic acid molecules using the above ratios. For nucleotide sequence comparisons, ktup values range from 1 to 6, preferably 3 to 6, most preferably 3, with no other parameters.

【0054】 本発明は、配列番号2のアミノ酸配列と比較した場合に、1個以上の保存アミ
ノ酸の変化を有するポリペプチドを包含する。BLOSUM62マトリックス(表1)は
、タンパク質配列セグメントの約2,000の局部的多重配列から誘導されるアミノ
酸置換マトリックスであり、500群を超える関連タンパク質の高度保存領域を表
している(Henikoff and Henikoff, ibid)。このようにして、BLOSUM62置換頻度
を用い、本発明のアミノ酸配列に導入し得る保存アミノ酸置換を定義することが
できる。
The present invention includes a polypeptide having one or more conservative amino acid changes when compared to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. The BLOSUM62 matrix (Table 1) is an amino acid substitution matrix derived from approximately 2,000 locally multiplex sequences of protein sequence segments, representing highly conserved regions of over 500 related proteins (Henikoff and Henikoff, ibid). . In this way, the BLOSUM62 substitution frequency can be used to define conservative amino acid substitutions that can be introduced into the amino acid sequences of the invention.

【0055】 本明細書にて使用する場合、用語“保存アミノ酸置換”とは−1より大きいBLO
SUM62値により表される置換をいう。例えば、アミノ酸置換はもしその置換が0
、1、2または3のBLOSUM62値により特徴づけられるならば、保存的である。好
適な保存アミノ酸置換は少なくとも1(例えば、1、2または3)のBLOSUM62値
により特徴づけられるが、より好適な保存アミノ酸置換は少なくとも2(例えば
、2または3)のBLOSUM62値により特徴づけられる。
As used herein, the term “conservative amino acid substitution” refers to BLO greater than −1.
Refers to the substitution represented by the SUM62 value. For example, if an amino acid substitution is 0
It is conservative if it is characterized by a BLOSUM62 value of 1, 2 or 3. Preferred conservative amino acid substitutions are characterized by a BLOSUM62 value of at least 1 (eg 1, 2 or 3), while more preferred conservative amino acid substitutions are characterized by a BLOSUM62 value of at least 2 (eg 2 or 3).

【0056】 本発明のタンパク質は非天然産のアミノ酸残基を含んでいてもよい。非天然産
のアミノ酸とは、以下に限定するものではないが、trans-3-メチルプロリン、2,
4-メタノプロリン、cis-4-ヒドロキシプロリン、trans-4-ヒドロキシプロリン、
N-メチルグリシン、allo-スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシ
ステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミ
ン、ピペコリン酸、tert-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-
アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、およち4-フルオロフェニルア
ラニンを包含する。非天然産のアミノ酸残基をタンパク質に包含させる幾つかの
方法が技術上既知である。
The protein of the present invention may contain non-naturally occurring amino acid residues. Non-naturally occurring amino acids include, but are not limited to, trans-3-methylproline, 2,
4-methanoproline, cis-4-hydroxyproline, trans-4-hydroxyproline,
N-methylglycine, allo-threonine, methylthreonine, hydroxyethylcysteine, hydroxyethylhomocysteine, nitroglutamine, homoglutamine, pipecolic acid, tert-leucine, norvaline, 2-azaphenylalanine, 3-
Includes azaphenylalanine, 4-azaphenylalanine, and 4-fluorophenylalanine. Several methods are known in the art for incorporating non-naturally occurring amino acid residues into proteins.

【0057】 例えば、インビトロ系を採用し、化学的にアミノアシル化したサプレッサーtR
NAによりナンセンス突然変異が抑制されるようにすることができる。アミノ酸の
合成法およびtRNAのアミノアシル化法は技術上既知である。ナンセンス突然変異
を含むプラスミドの転写と翻訳は大腸菌E.coli S30抽出物と市販入手し得る系お
よび他の試薬類を含んでなる無細胞系中で実施する。タンパク質はクロマトグラ
フィーにより精製する。
For example, an in vitro system was employed to chemically suppress the aminoacylated suppressor tR.
NA can be used to suppress nonsense mutations. Methods of amino acid synthesis and tRNA aminoacylation are known in the art. Transcription and translation of the plasmid containing the nonsense mutation is performed in a cell-free system comprising E. coli S30 extract and commercially available systems and other reagents. The protein is purified by chromatography.

【0058】 例えば、以下を参照:Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991;
Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 25
9:806-809, 1993; and Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-1
0149, 1993。第二の方法では、変異したmRNAおよび化学的にアミノアシル化した
サプレッサーtRNAをマイクロインジェクションすることによりアフリカツメガエ
ル(Xenopus) 卵母細胞中で翻訳を実施する(Turcatti et al., J. Biol. Chem. 2
71:19991-19998, 1996)。
See, for example: Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991;
Ellman et al., Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chung et al., Science 25
9: 806-809, 1993; and Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10145-1
0149, 1993. In the second method, translation is performed in Xenopus oocytes by microinjecting mutated mRNA and chemically aminoacylated suppressor tRNA (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 2
71: 19991-19998, 1996).

【0059】 第三の方法では、大腸菌細胞を、置換すべき天然アミノ酸(例えば、フェニル
アラニン)の不存在下、かつ所望の非天然産アミノ酸(例えば、2-アザフェニルア
ラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、または4-フルオロ
フェニルアラニン)の存在下に培養する。非天然産アミノ酸はその天然対応物の
代りにタンパク質に取込まれる。参照:Koide et al., Biochem. 33:7470-7476,
1994。天然産アミノ酸残基はインビトロでの化学的修飾により非天然産の種に変
換し得る。化学修飾は部位特異的突然変異と組合わせてさらに置換の範囲を拡張
することができる(Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993)。
In a third method, E. coli cells are used in the absence of the natural amino acid to be replaced (eg, phenylalanine) and the desired non-naturally occurring amino acid (eg, 2-azaphenylalanine, 3-azaphenylalanine, 4- Culture in the presence of azaphenylalanine or 4-fluorophenylalanine). Non-naturally occurring amino acids are incorporated into proteins instead of their natural counterparts. Reference: Koide et al., Biochem. 33: 7470-7476,
1994. Naturally occurring amino acid residues can be converted to non-naturally occurring species by chemical modification in vitro. Chemical modifications can be combined with site-directed mutagenesis to further extend the range of substitutions (Wynn and Richards, Protein Sci. 2: 395-403, 1993).

【0060】 アミノ酸配列の変化はzalpha29ポリペプチドにおいて生物活性に必須の高次構
造の崩壊を最少とするようにする。例えば、アミノ酸残基の変化が該タンパク質
ファミリーの4-ヘリックス束の特徴を崩壊させないようにする。アミノ酸配列変
化の影響は、上記開示のようにコンピューターモデリングにより予測するか、ま
たは結晶構造の分析により決定し得る(参照例:Lapthorn et al., ibid.)。配列
番号2の親水性プロフィールを図1A〜1Dに示す。当業者はzalpha29ポリペプチド
のアミノ酸配列における変更を設計する際に、全体のプロフィールを壊さないよ
うにこの親水性を考慮するであろう。
Changes in the amino acid sequence minimize the disruption of higher order structures essential for biological activity in the zalpha29 polypeptide. For example, prevent changes in amino acid residues from disrupting the features of the 4-helix bundle of the protein family. The effects of amino acid sequence changes can be predicted by computer modeling as disclosed above, or determined by crystal structure analysis (see eg Lapthorn et al., Ibid.). The hydrophilicity profile of SEQ ID NO: 2 is shown in Figures 1A-1D. One of skill in the art will consider this hydrophilicity when designing changes in the amino acid sequence of the zalpha29 polypeptide so as not to disrupt the overall profile.

【0061】 4-ヘリックス束コア内の残基は配列番号6に示したように他の残基と置換え得
る。4-ヘリックス束の露呈した表面上に存在すると予測される残基は置換に対し
比較的非耐性である。ヒト・zalpha29内の他の候補アミノ酸置換は、図2に示し
たヒト配列(配列番号2)およびマウス配列(配列番号4)を整列することにより示
唆されるが、両配列は全体として約85%同一である。配列番号2の160位(配列番
号4の159位)のシステイン残基はループC-Dにあり、鎖間のジスルフィド結合に
関与していることを示唆する。従って、この残基は置換に対して比較的非耐性で
あると予測される。
Residues within the 4-helix bundle core can be replaced with other residues as shown in SEQ ID NO: 6. Residues predicted to be on the exposed surface of the 4-helix bundle are relatively resistant to substitution. Other candidate amino acid substitutions in human zalpha29 are suggested by aligning the human sequence (SEQ ID NO: 2) and mouse sequence (SEQ ID NO: 4) shown in Figure 2, but both sequences together represent approximately 85%. It is the same. The cysteine residue at position 160 of SEQ ID NO: 2 (at position 159 of SEQ ID NO: 4) is in loop CD, suggesting that it is involved in interchain disulfide bonds. Therefore, this residue is predicted to be relatively intolerant to substitution.

【0062】 当業者は多くの周知の技術をそれぞれに、または組合わせて使用し、変異タン
パク質またはポリペプチドの折りたたみに影響する構造的特徴を分析し、標準の
分子に比較し、かかる修飾が有意であるかどうかを決定することができる。折り
たたみを測定する周知の容認された一方法は円二色性(CD)である。修飾した分子
と標準分子により生じるCDスペクトルを測定し、比較することは技術的常套手段
である(Johnson, Proteins 7:205-214, 1990)。結晶解析は折りたたみと構造を
分析するためのもう一つのよく知られた容認された方法である。核磁気共鳴(NMR
)、消化ペプチドマッピングおよびエピトープマッピングは、タンパク質とポリ
ペプチド間の折りたたみと構造類似性を分析するための他の既知方法である(Sch
aanan et al., Science 257:961-964, 1992)。
One skilled in the art will use many well-known techniques, either individually or in combination, to analyze the structural features that affect the folding of the mutant protein or polypeptide and compare them to standard molecules to determine that such modifications are significant. Can be determined. One well-known and accepted method for measuring folding is circular dichroism (CD). Measuring and comparing the CD spectra generated by the modified and standard molecules is a technical routine (Johnson, Proteins 7: 205-214, 1990). Crystallography is another well-accepted and accepted method for analyzing folding and structure. Nuclear magnetic resonance (NMR
), Digestive peptide mapping and epitope mapping are other known methods for analyzing folding and structural similarities between proteins and polypeptides (Sch
aanan et al., Science 257: 961-964, 1992).

【0063】 本発明ポリペプチドの必須アミノ酸は、部位特異的突然変異またはアラニン走
査突然変異などの技術的に既知の手法に従い同定することができる(Cunningham
and Wells, Science 244, 1081-1085, 1989; Bass et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88:4498-4502, 1991)。後者の技法では、単一のアラニン突然変異が該
分子の残基ごとに導入されており、得られる突然変異分子は以下に開示の生物活
性につき調べ、分子の活性に決定的なアミノ酸残基を同定する。
Essential amino acids of the polypeptides of the present invention can be identified according to techniques known in the art such as site-directed mutagenesis or alanine scanning mutagenesis (Cunningham).
and Wells, Science 244, 1081-1085, 1989; Bass et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88: 4498-4502, 1991). In the latter technique, a single alanine mutation is introduced for each residue of the molecule, and the resulting mutant molecule is examined for biological activity as disclosed below, identifying amino acid residues critical for the activity of the molecule. Identify.

【0064】 多重アミノ酸置換を実施し、既知の突然変異誘発とスクリーニング、例えば、
ライドハール−オルソンおよびサウア(Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241
:53-57, 1988) またはボウイーおよびサウア(Bowie and Sauer, Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 86:2152-2156, 1989) が開示した方法を用い検討する。簡単に説
明すると、これらの著者は、ポリペプチドの2つ以上の位置を同時にランダム化
し、機能的ペプチドを選択し、次いで突然変異を受けたポリペプチドの配列を決
定し、各位置での可能な置換のスペクトルを決定する方法を開示している。使用
し得る他の方法はファージ提示法(例えば、Lowman et al., Biochem. 30:10832-
10837, 1991; Ladner et al., 米国特許5,223,409; Huse, WIPO公開WO92/06204)
および領域特異的突然変異(Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Ner et al
., DNA 7:127, 1988)などである。
Multiple amino acid substitutions may be performed and known mutagenesis and screening, eg,
Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241
: 53-57, 1988) or Bowie and Sauer, Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989). Briefly, these authors randomize two or more positions of a polypeptide simultaneously, select functional peptides, and then sequence the mutated polypeptide to determine possible mutations at each position. A method of determining the spectrum of substitution is disclosed. Other methods that can be used are phage display methods (eg Lowman et al., Biochem. 30: 10832-
10837, 1991; Ladner et al., U.S. Patent 5,223,409; Huse, WIPO Publication WO92 / 06204).
And region-specific mutations (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al.
., DNA 7: 127, 1988).

【0065】 開示されたzalpha29DNAとポリペプチド配列の変異体はすでに開示されているD
NAシャフリングを経て生成させ得る(Stemmer, Nature 370:389-391, 1994 and S
temmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751, 1994)。簡単に説明する
と、変異体遺伝子は、親遺伝子をランダム断片形成によりインビトロ相同性組換
えし、次いでPCRにより再構築し、ランダムに導入された点突然変異に至らしめ
生成させる。この技法は対立遺伝子変異体などの親遺伝子などのファミリーまた
は異なる種からの遺伝子を用いて修飾し、さらなる変異性を該工程に導入する。
所望活性の選択またはスクリーニングと、引続く突然変異誘発とアッセイのさら
なる反復が、所望の突然変異を選択する一方、同時に有害な変化に対し選択する
ことにより、配列の急速な“進化”をもたらす。
The disclosed variants of zalpha29 DNA and polypeptide sequences have already been disclosed D
Produced via NA shuffling (Stemmer, Nature 370: 389-391, 1994 and S
temmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751, 1994). Briefly, mutant genes are generated by in vitro homologous recombination of the parental gene by random fragmentation, followed by PCR reassembly, leading to randomly introduced point mutations. This technique modifies with a gene such as a parental gene such as an allelic variant or a gene from a different species to introduce additional variability into the process.
Selection or screening for the desired activity, followed by further iterations of mutagenesis and assay results in rapid "evolution" of the sequence by selecting for the desired mutation while simultaneously selecting for deleterious changes.

【0066】 多くの場合、最終ポリペプチド産物の構造は宿主細胞による発生期ポリペプチ
ド鎖のプロセシングから生じるものであり、宿主細胞が産生するzalpha29ポリペ
プチドの最終配列は必ずしも発現されたポリヌクレオチドによりコードされる全
配列に相当するものではない。例えば、培養哺乳動物細胞内の完全zalpha29配列
の発現は、少なくとも分泌ペプチドの除去に至ると期待され、一方原核宿主内で
産生する同じポリペプチドは切断されることが期待されない。個々鎖の差別プロ
セシングが発現されたポリペプチドの異質性を生じる。
In many cases, the structure of the final polypeptide product will result from processing of the nascent polypeptide chain by the host cell, and the final sequence of the zalpha29 polypeptide produced by the host cell will not necessarily be encoded by the expressed polynucleotide. It does not correspond to all sequences that are processed. For example, expression of the complete zalpha29 sequence in cultured mammalian cells is expected to result in the removal of at least the secretory peptide, whereas the same polypeptide produced in the prokaryotic host is not expected to be cleaved. Differential processing of individual chains results in heterogeneity of the expressed polypeptide.

【0067】 本発明のzalpha29タンパク質はその活性、すなわち、増殖の変調、分化、移動
、付着、または応答性細胞型の代謝を特徴とする。zalpha29タンパク質の生物活
性は、細胞の増殖、分化、移動または付着、または細胞性代謝の変化(例えば、
他の増殖因子または他の巨大分子の産生)を検出するように設計したインビトロ
またはインビボのアッセイ法を用いアッセイする。多くの適当なアッセイ法が技
術的に既知であり、代表的なアッセイ法を本明細書に開示する。培養細胞を用い
るアッセイ法は、例えば、アミノ酸の置換、欠失または挿入の効果を決定するな
どのスクリーニングにとって最も簡便である。
The zalpha29 proteins of the present invention are characterized by their activity, ie modulation of proliferation, differentiation, migration, adhesion, or metabolism of responsive cell types. The biological activity of the zalpha29 protein is the change in cell proliferation, differentiation, migration or attachment, or changes in cellular metabolism (e.g.,
Assayed using in vitro or in vivo assays designed to detect production of other growth factors or other macromolecules). Many suitable assays are known in the art and representative assays are disclosed herein. Assays using cultured cells are most convenient for screening, eg, to determine the effects of amino acid substitutions, deletions or insertions.

【0068】 しかし、発生過程(例えば、血管形成、外傷治癒)が複雑であるため、インビボ
・アッセイ法は一般に生物活性を確認し、さらに評価するために採用する。ある
種のインビトロ・モデル、例えば、ペッパーら(Pepper et al., Biochem. Bioph
ys. Res. Comm. 189:824-831, 1992) の3次元コラーゲン・ゲルマトリックス・
モデルなどは組織学的効果をアッセイするのに十分に複雑である。アッセイは外
来産生タンパク質を用いて実施してもよいし、または対象のポリペプチドを発現
する細胞を用いてインビボまたはインビトロで実施し得る。アッセイはzalpha29
タンパク質単独または他の増殖因子と組合わせて、例えば、VEGFファミリーまた
は造血サイトカインのメンバー(例えば、EPO、TPO、G-CSF、幹細胞因子)などと
組合わせて実施することができる。代表的なアッセイ法を以下に開示する。
However, due to the complexity of developmental processes (eg, angiogenesis, wound healing), in vivo assays are generally employed to confirm and further assess biological activity. Certain in vitro models, such as Pepper et al., Biochem. Bioph
ys. Res. Comm. 189: 824-831, 1992) 3D collagen gel matrix
Models etc. are complex enough to assay for histological effects. The assay may be carried out with a foreign produced protein or may be carried out in vivo or in vitro with cells expressing the polypeptide of interest. Assay is zalpha29
The protein can be performed alone or in combination with other growth factors, eg, in combination with members of the VEGF family or hematopoietic cytokines (eg EPO, TPO, G-CSF, stem cell factor) and the like. Representative assay methods are disclosed below.

【0069】 上記の突然変異誘発法は、zalpha29変異ポリペプチドの生物活性を検出する高
容量または高処理能力スクリーニング法と組合わせることができる。高処理能力
のためにスケールアップし得るアッセイは突然変異誘発アッセイであり、これは
96穴のフォーマットで遂行し得る。活性zalpha29ポリペプチドをコードする突然
変異誘発DNA分子は宿主細胞から回収し、最新の装置により迅速に配列決定する
ことができる。これらの方法は対象ポリペプチド個々のアミノ酸残基の重要性を
迅速に決定することを可能とし、未知構造のポリペプチドに適用することができ
る。
The mutagenesis methods described above can be combined with high capacity or high throughput screening methods to detect biological activity of zalpha29 mutant polypeptides. An assay that can be scaled up for high throughput is the mutagenesis assay, which
It can be performed in a 96-well format. Mutagenized DNA molecules that encode active zalpha29 polypeptides can be recovered from host cells and rapidly sequenced by state-of-the-art equipment. These methods allow the importance of individual amino acid residues of the polypeptide of interest to be determined rapidly and can be applied to polypeptides of unknown structure.

【0070】 先に検討した方法により、当業者は野生型zalpha29の活性を保持する配列番号
2または配列番号4の多様なポリペプチドフラグメントまたは変異体を調製する
ことげできる。
The methods discussed above allow one of skill in the art to prepare various polypeptide fragments or variants of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 that retain the activity of wild-type zalpha29.

【0071】 本発明はまた上記開示のzalpha29ポリペプチドをコードする、DNAおよびRNA分
子を包含するポリヌクレオチド分子を提供する。配列番号2のアミノ酸配列をコ
ードする代表的なDNA配列は配列番号1に示すものであり、配列番号4のアミノ
酸配列をコードする代表的なDNA配列は配列番号3に示すものである。当業者は
遺伝子コードの縮重の観点で、かなりの配列変異がこれらポリヌクレオチド分子
内で可能であることを容易に認めるであろう。配列番号7は配列番号2のzalpha
29ポリペプチドをコードするDNAすべてを包含する縮重DNA配列である。当業者は
配列番号7の縮重配列がTをUに置換えることにより配列番号2をコードするRN
A配列すべてをも提供することを認めるであろう。
The present invention also provides polynucleotide molecules, including DNA and RNA molecules, that encode the zalpha29 polypeptides disclosed above. A representative DNA sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is shown in SEQ ID NO: 1, and a representative DNA sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is shown in SEQ ID NO: 3. One of skill in the art will readily recognize that considerable sequence variation is possible within these polynucleotide molecules in view of the degeneracy of the genetic code. SEQ ID NO: 7 is zalpha of SEQ ID NO: 2
A degenerate DNA sequence that includes all of the DNA encoding the 29 polypeptides. Those skilled in the art will appreciate that the degenerate sequence of SEQ ID NO: 7 encodes SEQ ID NO: 2 by replacing T with U.
It will be appreciated that it also provides the entire A sequence.

【0072】 このように、配列番号7のヌクレオチド1〜534またはヌクレオチド52〜534を
含んでなるzalpha29ポリペプチド−コードポリヌクレオチドは、本明細書に開示
した他のzalpha29ポリペプチドをコードする配列番号7のセグメント同様に、本
発明の意図するものである。表2は配列番号7で使用される1文字コードを示し
、縮重ヌクレオチドの位置を示す。“解”はコード文字で示したヌクレオチドで
ある。“相補体”は相補性ヌクレオチドのコードを示す。例えば、コードYはC
またはTを意味し、その補体RはAまたはGを意味し、AはTに相補的であり、
GはCに相補的である。
Thus, a zalpha29 polypeptide-encoding polynucleotide comprising nucleotides 1 to 534 or nucleotides 52 to 534 of SEQ ID NO: 7 is SEQ ID NO: 7 encoding another zalpha29 polypeptide disclosed herein. Segments of the invention are also contemplated by the present invention. Table 2 shows the one-letter code used in SEQ ID NO: 7 and indicates the position of the degenerate nucleotide. "Solution" is the nucleotide indicated by the code letter. "Complement" indicates the code for the complementary nucleotide (s). For example, code Y is C
Or T, the complement R of which means A or G, where A is complementary to T,
G is complementary to C.

【0073】[0073]

【表2】 [Table 2]

【0074】 配列番号7に使用される縮重コドンは所定のアミノ酸の可能なコドンすべてを
包含し、以下の表3に示すとおりである。
The degenerate codons used in SEQ ID NO: 7 include all possible codons for a given amino acid and are as shown in Table 3 below.

【0075】[0075]

【表3】 [Table 3]

【0076】 当業者は各アミノ酸をコードする可能なコドンすべての代表として、縮重コド
ンを決定する際にある種の曖昧さが入り込むことを認めるであろう。例えば、セ
リン(WSN)の縮重コドンは場合によりアルギニン(AGR)をコードし、アルギニン(M
GN)の縮重コドンは場合によりセリン(AGY)をコードし得る。同様の関連性はフェ
ニルアラニンとロイシンをコードするコドン間にも存在する。このように、縮重
配列により包含される一部ポリヌクレオチドは変異アミノ酸配列をコードし得る
が、当業者は配列番号2のアミノ酸配列を参照してかかる変異配列を容易に同定
することができる。変異配列は本明細書に記載のように機能性について容易に試
験し得る。
One of ordinary skill in the art will recognize that as a representation of all possible codons encoding each amino acid, certain ambiguities are introduced in determining degenerate codons. For example, the degenerate codon of serine (WSN) optionally encodes arginine (AGR) and arginine (MGR
The degenerate codon (GN) may optionally encode serine (AGY). A similar relationship exists between the codons encoding phenylalanine and leucine. Thus, some polynucleotides encompassed by degenerate sequences can encode variant amino acid sequences, but one of skill in the art can readily identify such variant sequences by reference to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. Variant sequences can be easily tested for functionality as described herein.

【0077】 当業者はまた異なる種が優先的コドンを使用し得ることを認めるであろう。一
般的参照文献:Grantham et al., Nuc. Acids Res. 8:1893-912, 1980; Haas et
al., Curr. Biol. 6:315-24, 1996; Wain-Hobson et al., Gene 13:355-64, 198
1; Grosjean and Fiers, Gene 18:199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14:3
075-87, 1986; and Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573-97, 1982。組換えDNAに対
する好適なコドン配列の導入は、例えば、特定の細胞型または種内でタンパク質
の翻訳をより効率的とすることによりタンパク質の産生を上昇させることができ
る。従って、配列番号7に開示した縮重コドン配列は、技術上一般的に使用され
、また本明細書に開示された種々の細胞型と種において、ポリヌクレオチドの発
現を最適化するための鋳型として作用する。
One of ordinary skill in the art will also recognize that different species may use preferential codons. General reference: Grantham et al., Nuc. Acids Res. 8: 1893-912, 1980; Haas et
al., Curr. Biol. 6: 315-24, 1996; Wain-Hobson et al., Gene 13: 355-64, 198.
1; Grosjean and Fiers, Gene 18: 199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3
075-87, 1986; and Ikemura, J. Mol. Biol. 158: 573-97, 1982. Introduction of suitable codon sequences into recombinant DNA can increase protein production, for example, by making protein translation more efficient within a particular cell type or species. Accordingly, the degenerate codon sequence disclosed in SEQ ID NO: 7 is commonly used in the art and as a template for optimizing expression of polynucleotides in the various cell types and species disclosed herein. To work.

【0078】 本発明の一部態様において、単離したポリヌクレオチドは緊縮条件下において
配列番号1の同様サイズ領域またはその相補性配列にハイブリダイズする。一般
に、緊縮条件は一定のイオン強度とpHにおいて特異配列に対する熱融解点(Tm)よ
りも約5℃低く選択する。Tmは標的配列の50%が完全にマッチするプローブにハ
イブリダイズする温度(一定のイオン強度とpHのもとで)である。典型的な緊縮条
件は、塩濃度がpH7で約0.03Mまでであり、温度が少なくとも約60℃である条件で
ある。
In some aspects of the invention, the isolated polynucleotide hybridizes under stringent conditions to the similarly sized region of SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence. In general, stringent conditions are chosen to be about 5 ° C. below the thermal melting point (T m ) for a specific sequence at constant ionic strength and pH. The T m is the temperature (under constant ionic strength and pH) at which 50% of the target sequence hybridizes to a perfectly matched probe. Typical stringent conditions are those in which the salt concentration is up to about 0.03M at pH 7 and the temperature is at least about 60 ° C.

【0079】 すでに示したように、本発明の単離したポリヌクレオチドはDNAとRNAを包含す
る。DNAとRNAを調製する方法は技術上周知である。一般に、RNAは大量のzalpha2
9RNAを産生する組織または細胞から単離する。zalpha29転写物は以下に開示する
ように多数の組織に検出されている。総RNAはグアニジンHClでの抽出と、引続く
CsCl勾配での遠心分離による単離により調製することができる(Chirgwin et al.
, Biochemistry 18:52-94, 1979)。ポリ(A)+RNAはアヴィヴおよびレダーの方法
により調製する(Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-1412,
1972)。相補性DNA(cDNA)は既知方法によりポリ(A)+RNAから調製する。別法とし
ては、ゲノムDNAを単離する。zalpha29ポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを次いで同定し、例えば、ハイブリダイゼーションまたはPCRにより単離す
る。
As indicated previously, the isolated polynucleotides of the present invention include DNA and RNA. Methods for preparing DNA and RNA are well known in the art. In general, RNA is a large amount of zalpha2
9 Isolated from tissues or cells that produce RNA. The zalpha29 transcript has been detected in a number of tissues as disclosed below. Total RNA is extracted with guanidine HCl, followed by
It can be prepared by isolation by centrifugation on a CsCl gradient (Chirgwin et al.
, Biochemistry 18: 52-94, 1979). Poly (A) + RNA is prepared by the method of Aviv and Leder (Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-1412,
1972). Complementary DNA (cDNA) is prepared from poly (A) + RNA by known methods. Alternatively, genomic DNA is isolated. The polynucleotide encoding the zalpha29 polypeptide is then identified and isolated, eg, by hybridization or PCR.

【0080】 zalpha29をコードする全長クローンは常套のクローニング手法により得ること
ができる。相補性DNA(cDNA)クローンはタンパク質産生システム内で一般に使用
されるが、ある適用では(例えば、トランスジェニック動物での発現)、ゲノム・
クローンを使用するか、または少なくとも1つのゲノム・イントロンを含むcDNA
クローンを修飾することが好ましい。部分的なヒトゲノム・zalpha29配列を配列
番号14に示す。この配列はヌクレオチド1885からヌクレオチド2112までのエキソ
ンからなる(配列番号1のヌクレオチド483〜710に相当する)。
The full-length clone encoding zalpha29 can be obtained by a conventional cloning method. Complementary DNA (cDNA) clones are commonly used within protein production systems, but in some applications (e.g., expression in transgenic animals), genomic
CDNA using clones or containing at least one genomic intron
It is preferred to modify the clone. The partial human genome zalpha29 sequence is shown in SEQ ID NO: 14. This sequence consists of the exons from nucleotide 1885 to nucleotide 2112 (corresponding to nucleotides 483-710 of SEQ ID NO: 1).

【0081】 部分的マウスのゲノム配列を配列番号15および配列番号16に示す。配列番号15
において、ヌクレオチド6〜165は配列番号3のヌクレオチド40〜199に対応する
エキソンである。配列番号16において、ヌクレオチド175〜295は配列番号3のヌ
クレオチド200〜320に対応するエキソンである。cDNAとゲノム・クローンの調製
方法は周知かつ通常の熟練技術範囲内のものであり、ライブラリーをプローブま
たはプライムするために本明細書に開示した配列またはその一部を使用する。発
現ライブラリーはzalpha29、レセプターフラグメントまたは他の特異的結合パー
トナーに対する抗体でプローブすることができる。
Partial mouse genomic sequences are shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16. SEQ ID NO: 15
In, nucleotides 6 to 165 are the exons corresponding to nucleotides 40 to 199 of SEQ ID NO: 3. In SEQ ID NO: 16, nucleotides 175 to 295 are exons corresponding to nucleotides 200 to 320 of SEQ ID NO: 3. Methods for preparing cDNA and genomic clones are well known and within the ordinary skill in the art, and use the sequences disclosed herein or portions thereof to probe or prime the library. Expression libraries can be probed with antibodies to zalpha29, receptor fragments or other specific binding partners.

【0082】 本明細書に開示したzalpha29ポリペプチド配列はプローブまたはプライマーと
して使用し、zalpha29遺伝子の5’非コード化領域をクローン化することもでき
る。zalpha29遺伝子からのプロモーター・エレメントは、例えば、遺伝子療法に
より治療するトランスジェニック動物または患者で非相同遺伝子の発現を目的と
して使用することができる。5’フランキング配列のクローニングは米国特許5,6
41,670に開示された“遺伝子活性化”によりzalpha29タンパク質の産生をも容易
にする。
The zalpha29 polypeptide sequences disclosed herein can also be used as probes or primers to clone the 5'non-coding region of the zalpha29 gene. The promoter element from the zalpha29 gene can be used, for example, for the expression of heterologous genes in transgenic animals or patients treated by gene therapy. Cloning of 5'flanking sequences is described in US Pat.
The "gene activation" disclosed in 41,670 also facilitates production of the zalpha29 protein.

【0083】 簡単に説明すると、細胞内での内在性zalpha29遺伝子発現を、zalpha29遺伝子
座に、少なくとも標的配列、調節配列、エキソン、および不対スプライス供与部
位を含んでなるDNA構築物を導入することにより変える。目的とする配列はzalph
a29の5’非コード配列であって、該構築物と外来性zalpha29遺伝子座との相同組
換えを可能とするものであり、それによって構築物内の配列が外来性zalpha29コ
ード配列と操作可能に結合し得る。この方式で、内在性zalpha29プロモーターが
他の調節配列と置換えるか、またはそれを補足し、組織特異的発現またはさもな
くば調節発現を増強させる。
Briefly, endogenous zalpha29 gene expression in cells was introduced by introducing into the zalpha29 locus a DNA construct comprising at least a target sequence, a regulatory sequence, an exon, and an unpaired splice donor site. Change. The target array is zalph
The 5'non-coding sequence of a29, which enables homologous recombination of the construct with the exogenous zalpha29 locus, whereby the sequences within the construct are operably linked to the exogenous zalpha29 coding sequence. obtain. In this manner, the endogenous zalpha29 promoter replaces or complements other regulatory sequences, enhancing tissue-specific or otherwise regulated expression.

【0084】 当業者は配列番号1〜2および3〜4に開示した配列がそれぞれヒトおよびマ
ウス・zalpha29の単一対立遺伝子を表すことを認知し得る。これら配列の対立遺
伝子変異体は標準的な手法に従い、異なる個体からのcDNAもしくはゲノム・ライ
ブラリーをプローブすることによりクローン化することが可能である。
Those skilled in the art will recognize that the sequences disclosed in SEQ ID NOS: 1-2 and 3-4 represent human and mouse zalpha29 single alleles, respectively. Allelic variants of these sequences can be cloned by probing cDNA or genomic libraries from different individuals according to standard techniques.

【0085】 本発明はさらに他の種(“オーソローガス”)からの対応ポリペプチドとポリヌ
クレオチドを提供する。特に興味深いのは、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ
、ネコ、ウマ、およびその他の霊長類ポリペプチドを含む哺乳動物種からのzalp
ha29ポリペプチドである。ヒト・zalpha29のオーソローガスは本発明により提供
される情報と組成物を用い、簡便なクローニング技法と組合わせてクローン化す
ることができる。例えば、cDNAは上記開示のzalpha29を発現する組織または細胞
型から得られるmRNAを用いクローン化することができる。
The present invention further provides corresponding polypeptides and polynucleotides from other species (“Orthologues”). Of particular interest are zalp from mammalian species including mouse, pig, sheep, cow, dog, cat, horse, and other primate polypeptides.
ha29 polypeptide. Orthologs of human zalpha29 can be cloned using the information and compositions provided by the invention, in combination with convenient cloning techniques. For example, cDNA can be cloned using mRNA obtained from a tissue or cell type expressing zalpha29 disclosed above.

【0086】 次いで、陽性の組織または細胞系のmRNAからライブラリーを調製する。zalpha
29をコードするcDNAを次いで様々な方法、例えば、完全なもしくは部分的ヒトcD
NAによるプロービング、または開示された配列に基く1セット以上の縮重プロー
ブによるプロービングにより単離する。また、cDNAは本明細書に開示された代表
的ヒトおよびマウスのzalpha29配列から設計したプライマーを用いるポリメラー
ゼ連鎖反応(またはPCR)(Mullis、米国特許4,683,202)によりクローン化すること
もできる。さらなる方法において、cDNAライブラリーを用いて宿主細胞に形質転
換または移入することが可能であり、対象cDNAの発現はzalpha29ポリペプチドに
対する抗体により検出することができる。同様の技法はゲノム・クローンの単離
にも適用し得る。
A library is then prepared from the mRNA of the positive tissue or cell line. zalpha
The cDNA encoding 29 is then transformed by various methods, such as full or partial human cDNA.
Isolate by probing with NA or with one or more sets of degenerate probes based on the disclosed sequences. The cDNA can also be cloned by the polymerase chain reaction (or PCR) using primers designed from the representative human and mouse zalpha29 sequences disclosed herein (Mullis, US Pat. No. 4,683,202). In a further method, a cDNA library can be used to transform or transfer into a host cell and expression of the cDNA of interest can be detected by an antibody to the zalpha29 polypeptide. Similar techniques can be applied to the isolation of genomic clones.

【0087】 変異体および融合タンパク質を含むzalpha29ポリペプチドについて、当業者は
上記の表3および4に示した情報を用い、当該ポリペプチドをコードする完全な縮
重ポリヌクレオチドを容易に生成させることができる。さらに、当業者は標準の
ソフトウエアを用い、本明細書に記載のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列に
基きzalpha29変異体を考案することができる。このように、本発明は以下の配列
の少なくとも1つを提供するデータ構造により暗号化(コード)したコンピュータ
可読媒体を提供する:配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列
番号6、配列番号7、およびその部分。コンピュータ解読手段の適切な形状は磁
気媒体および光可読媒体である。
For zalpha29 polypeptides, including variants and fusion proteins, one of skill in the art can readily use the information provided in Tables 3 and 4 above to generate fully degenerate polynucleotides encoding the polypeptides. it can. Moreover, one of skill in the art can use standard software to devise zalpha29 variants based on the nucleotide and amino acid sequences described herein. Thus, the invention provides a computer-readable medium encoded with a data structure that provides at least one of the following sequences: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, sequence No. 6, SEQ ID No. 7 and parts thereof. Suitable forms of computer decryption means are magnetic media and light readable media.

【0088】 磁気媒体の例は、ハードまたは固定ドライブ、ランダム・アクセス・メモリー
(RAM)チップ、フロッピー(登録商標)ディスク、ディジタル・リニアテープ(DL T)、ディスクキャッシュ、およびZIPディスクである。光可読媒体はコンパクト ・ディスク(例えば、CD-読み出し専用メモリー(ROM)、CD-書換え可能(RW)、およ びCD-記録可能)およびディジタル多用途/ビデオディスク(DVD)(例えば、DVD-RO M、DVD-RAM、およびDVD+RW)である。
Examples of magnetic media are hard or fixed drives, random access memory
(RAM) chips, floppy disks, digital linear tape (DLT), disk cache, and ZIP disks. Optically readable media include compact discs (eg CD-read only memory (ROM), CD-rewritable (RW), and CD-recordable) and digital versatile / video discs (DVD) (eg DVD-ROM). , DVD-RAM, and DVD + RW).

【0089】 本発明のzalpha29ポリペプチドは全長ポリペプチド、生物活性フラグメント、
および融合ポリペプチドをも含み、該ポリペプチドをコードする発現ベクターを
導入した細胞を用い、常套技法に従って産生させることができる。本明細書にて
使用する場合、“発現ベクターを導入した細胞”とは外来DNA分子の導入により
直接操作した細胞および導入したDNAを含むその子孫の双方を包含する。
The zalpha29 polypeptide of the invention is a full-length polypeptide, bioactive fragment,
And a fusion polypeptide, and can be produced according to a conventional technique using a cell into which an expression vector encoding the polypeptide has been introduced. As used herein, "cells into which an expression vector has been introduced" includes both cells that have been directly manipulated by the introduction of foreign DNA molecules and their progeny that contain the introduced DNA.

【0090】 適切な宿主細胞は外来DNAで形質転換し、またはそれを移入し、培養増殖し得
る細胞型であって、細菌、真菌細胞、および培養した高等真核細胞を包含する。
クローン化DNA分子を操作し、外来DNAを様々な宿主細胞に導入する技法はサムブ
ルークらが開示している(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor
, NY, 1989, and Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Bio
logy, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987)。
Suitable host cells are cell types that can be transformed with or transferred to foreign DNA and grown in culture, including bacteria, fungal cells, and cultured higher eukaryotic cells.
Techniques for manipulating cloned DNA molecules and introducing foreign DNA into various host cells have been disclosed by Sambrook et al. (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory.
Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor
, NY, 1989, and Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Bio
logy, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987).

【0091】 一般に、zalpha29ポリペプチドをコードするDNA配列は、発現ベクター内にそ
の発現に必要な他の遺伝子要素、一般には転写プロモーターおよびターミネータ
ーを含む要素に操作可能に結合する。該ベクターは1種以上の選択可能なマーカ
ーおよび1種以上の複製起源を共通に含むが、当業者は、一定のシステム内に選
択可能なマーカーを別個のベクター上に提供し、かつ外来DNAの複製を宿主細胞
ゲノムに組込むことで提供し得ることを認めるであろう。プロモーター、ターミ
ネーター、選択可能マーカー、ベクターおよび他の要素の選択は、通常の技術レ
ベル内での常套的設計の問題である。多くのかかる要素は文献に記載されており
、市販供給業者を介して入手可能である。
Generally, a DNA sequence encoding a zalpha29 polypeptide is operably linked to other genetic elements necessary for its expression in an expression vector, generally elements including transcriptional promoters and terminators. Although the vector commonly contains one or more selectable markers and one or more origins of replication, one of skill in the art would provide the selectable markers within a given system on separate vectors and It will be appreciated that replication may be provided by integrating into the host cell genome. The choice of promoter, terminator, selectable marker, vector and other elements is a matter of routine design within the level of ordinary skill. Many such elements are described in the literature and are available through commercial suppliers.

【0092】 zalpha29ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向かわせるために、分泌シグナ
ル配列(リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られる)を発現ベ
クターに備える。分泌シグナル配列はzalpha29のものであってもよいし、または
他の分泌タンパク質(例えば、t-PA;米国特許5,641,655参照)から誘導してもよく
、または新たに合成してもよい。分泌シグナル配列はzalpha29DNA配列に操作可
能に結合させる、すなわち、2つの配列を正しいリーディング・フレームに結合
し、適切に配置し、新たに合成したポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に指し向
ける。分泌シグナル配列は一般に対象のポリペプチドをコードするDNA配列に対
し5’側に配置するが、一部のシグナル配列は対象DNA配列の他の場所に配置して
もよい(参照:Welch et al., 米国特許5,037,743; Holland et al., 米国特許5,1
43,830)。
To direct the zalpha29 polypeptide into the secretory pathway of a host cell, a secretory signal sequence (also known as a leader sequence, prepro sequence or pre sequence) is provided in the expression vector. The secretory signal sequence may be that of zalpha29, or may be derived from another secreted protein (eg, t-PA; see US Pat. No. 5,641,655), or may be newly synthesized. The secretory signal sequence is operably linked to the zalpha29 DNA sequence, ie, the two sequences are linked in the correct reading frame, properly positioned, and the newly synthesized polypeptide is directed into the secretory pathway of the host cell. Secretory signal sequences are generally placed 5'to the DNA sequence encoding the polypeptide of interest, although some signal sequences may be placed elsewhere in the DNA sequence of interest (see: Welch et al. , US Patent 5,037,743; Holland et al., US Patent 5,1
43,830).

【0093】 宿主細胞の分泌経路を経るzalpha29ポリペプチドの発現は、多量体タンパク質
の産生に至ると期待される。かかる多量体はホモ多量体とヘテロ多量体の双方を
含み、後者はzalpha29ポリペプチドのみを含んでなるタンパク質およびzalpha29
と非相同ポリペプチド(例えば、第二4-ヘリックス束サイトカインポリペプチド)
を含むタンパク質を包含する。もしタンパク質の混合物が発現から生じたもので
あれば、個々の種類は常套の方法により単離する。単量体、二量体、および高次
多量体は、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーにより分離する。
Expression of zalpha29 polypeptides via the secretory pathway of host cells is expected to lead to the production of multimeric proteins. Such multimers include both homomultimers and heteromultimers, the latter including proteins and zalpha29 comprising only zalpha29 polypeptides.
A heterologous polypeptide (e.g., second 4-helix bundle cytokine polypeptide)
Including proteins containing If the mixture of proteins results from expression, the individual species are isolated by conventional methods. Monomers, dimers, and higher order multimers are separated by, for example, size exclusion chromatography.

【0094】 ヘテロ多量体は個々の二量体に対し特異的な抗体を用いる免疫アフィニティク
ロマトグラフィーにより、または個々の要素ポリペプチドに対し特異的な抗体を
用いる連続的な免疫アフィニティ工程によりホモ多量体から分離することができ
る。一般的には、米国特許5,094,941を参照されたい。多量体は適切な条件下に
成分ポリペプチドのインキュベーションによりインビトロで構築してもよい。一
般に、インビトロでの構築は、変性および還元条件下にタンパク質混合物をイン
キュベートし、次いで該ポリペプチドの再生と再酸化によりホモ二量体とヘテロ
二量体を形成する。細菌胞内で発現されたタンパク質の回収と集積は以下に記載
のとおりである。
Heteromultimers are homomultimers by immunoaffinity chromatography using antibodies specific for individual dimers or by sequential immunoaffinity steps using antibodies specific for individual element polypeptides. Can be separated from. See generally US Pat. No. 5,094,941. Multimers may be constructed in vitro by incubation of the component polypeptides under suitable conditions. Generally, in vitro construction involves incubating the protein mixture under denaturing and reducing conditions, followed by refolding and reoxidation of the polypeptide to form homodimers and heterodimers. The recovery and accumulation of proteins expressed in bacterial cells are as described below.

【0095】 培養哺乳動物細胞は本発明において宿主として使用し得る。哺乳動物宿主細胞
に外来性DNAを導入する方法は、リン酸カルシウムによるトランスフェクション(
Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Gene
tics 7:603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973)、エレク
トロポレーション(Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982)、DEAE-デキスト
ランによるトランスフェクション(Ausubel et al., ibid.)、およびリポソーム
によるトランスフェクション(Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Cicc
arone et al., Focus 15:80, 1993)などである。
Cultured mammalian cells may be used as hosts in the present invention. A method for introducing exogenous DNA into a mammalian host cell is transfection with calcium phosphate (
Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Gene
tics 7: 603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), electroporation (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845, 1982), DEAE-dextran transfection (Ausubel). et al., ibid.), and transfection with liposomes (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Cicc
arone et al., Focus 15:80, 1993).

【0096】 培養哺乳動物細胞における組換えポリペプチドの産生については、例えば、レ
ビンソン(Levinson)らが米国特許4,713,339に、ハーゲン(Hagen)らが米国特許4,
784,950に、パルミター(Palmiter)らが米国特許4,579,821に、またリンゴールド
(Ringold)が米国特許4,656,134に開示している。適切な培養哺乳動物細胞は、CO
S-1(ATCC No.CRL1650)、COS-7(ATCC No.CRL1651)、BHK(ATCC No.CRL1632)、BHK5
70(ATCC No.CRL10314)、293(ATCC No.CRL1573; Graham et al., J. Gen. Virol.
36:59-72, 1977) およびチャイニーズ・ハムスター卵巣(例えば、CHO-K1、ATCC
No.CCL61;またはCHO DG44、Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12:555
, 1986)細胞系である。
For the production of recombinant polypeptides in cultured mammalian cells, see, for example, Levinson et al. In US Pat. No. 4,713,339 and Hagen et al. In US Pat.
784,950, Palmiter et al. In U.S. Pat.
(Ringold) in U.S. Pat. No. 4,656,134. Suitable cultured mammalian cells are CO
S-1 (ATCC No.CRL1650), COS-7 (ATCC No.CRL1651), BHK (ATCC No.CRL1632), BHK5
70 (ATCC No.CRL10314), 293 (ATCC No.CRL1573; Graham et al., J. Gen. Virol.
36: 59-72, 1977) and Chinese hamster ovaries (e.g. CHO-K1, ATCC).
No. CCL61; or CHO DG44, Chasin et al., Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555.
, 1986) Cell line.

【0097】 そのたの適切な細胞系も技術的に既知であり、アメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション、マナサス、VAなどの公的寄託機関から入手することができる
。培養哺乳動物細胞にて使用するプロモーターはSV-40もしくはサイトメガロウ
イルスからのプロモーター(参照例:米国特許4,956,288)、メタロチオネイン遺伝
子プロモーター(米国特許4,579,821および4,601,978)、およびアデノウイルス主
要後期プロモーターなどである。哺乳動物細胞にて使用する発現ベクターはpZP-
1およびpZP-9であり、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナサ
ス、VA、USAにそれぞれ寄託番号98669と98668として寄託されているもの、また
その誘導体である。
Other suitable cell lines are also known in the art and are available from public depository institutions such as the American Type Culture Collection, Manassas, VA. Promoters used in cultured mammalian cells include SV-40 or promoters from cytomegalovirus (reference example: US Pat. No. 4,956,288), metallothionein gene promoters (US Pat. Nos. 4,579,821 and 4,601,978), and adenovirus major late promoter. The expression vector used in mammalian cells is pZP-
1 and pZP-9, which have been deposited under deposit numbers 98669 and 98668 with the American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA, respectively, and their derivatives.

【0098】 薬物による選択は一般に外来DNAを挿入した培養哺乳動物細胞の選択に使用す
る。かかる細胞は共通して“形質導入体”という。選択剤の存在下に培養して、
その子孫に対象の遺伝子を渡すことのできる細胞を“安定な形質導入体”という
。一例としての選択可能マーカーは抗生物質ネオマイシンに耐性をコードする遺
伝子である。選択はG-418などのネオマイシン型薬物の存在下に実施する。選択
系を使用し、対象遺伝子の発現レベルを上昇させることができるが、この工程を
“増幅”という。増幅は形質導入体を低レベルの選択剤の存在下に培養し、次い
で選択剤の量を増加し、導入した遺伝子産物を高レベルで産生する細胞を選択す
ることにより実施する。模範となる増幅可能な選択可能マーカーはジヒドロ葉酸
レダクターゼであり、このものはメトトレキセートに耐性を付与する。他の薬物
耐性遺伝子(例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピュロマイシン・アセ
チルトランスフェラーゼ)も使用可能である。
Drug selection is generally used to select cultured mammalian cells that have inserted foreign DNA. Such cells are commonly referred to as "transductants." Cultured in the presence of a selective agent,
Cells that can pass the gene of interest to their progeny are called "stable transductants." An exemplary selectable marker is the gene encoding resistance to the antibiotic neomycin. Selection is performed in the presence of a neomycin type drug such as G-418. A selection system can be used to increase the expression level of the gene of interest, a process called "amplification". Amplification is carried out by culturing the transductants in the presence of low levels of selection agent and then increasing the amount of selection agent and selecting for cells which produce high levels of the introduced gene product. An exemplary amplifiable selectable marker is dihydrofolate reductase, which confers resistance to methotrexate. Other drug resistance genes (eg hygromycin resistance, multidrug resistance, puromycin acetyltransferase) can also be used.

【0099】 アデノウイルス系(以下により詳細に開示)もインビトロでのタンパク質生産に
使用することができる。アデノウイルス感染非-293細胞を、細胞が急速に分裂し
ない条件下で培養することにより、細胞は長期間タンパク質を産生することがで
きる。例えば、BHK細胞は細胞工場にて集密に増殖し、次いで対象の分泌タンパ
ク質をコードするアデノウイルス・ベクターに露呈される。次いで細胞は無血清
条件下で増殖するが、この条件では有意な細胞分裂なしに感染細胞を数週間生存
させることが可能である。
The adenovirus system (disclosed in more detail below) can also be used for protein production in vitro. By culturing adenovirus-infected non-293 cells under conditions in which the cells do not divide rapidly, the cells can produce the protein for long periods of time. For example, BHK cells are grown to confluency in cell factories and then exposed to an adenovirus vector encoding a secreted protein of interest. The cells then grow under serum-free conditions, which allow infected cells to survive for several weeks without significant cell division.

【0100】 代替法において、アデノウイルス・ベクター感染293細胞は粘着細胞として、
または比較的高細胞密度での懸濁培養で増殖し、相当量のタンパク質を産生する
(参照:Garnier et al., Cytotechnol. 15:145-55, 1994)。いずれかのプロトコ
ールで発現・分泌された異種タンパク質は、細胞上清、溶解物または膜分画から
、細胞内に発現されたタンパク質の状況に応じて繰返し分離することができる。
感染293細胞生産プロトコール内で、非分泌タンパク質も効果的に入手し得る。
In an alternative method, the adenovirus vector-infected 293 cells are adherent cells,
Or grows in suspension culture at relatively high cell densities and produces significant amounts of protein
(Ref: Garnier et al., Cytotechnol. 15: 145-55, 1994). The heterologous protein expressed and secreted by any of the protocols can be repeatedly separated from the cell supernatant, lysate or membrane fraction depending on the situation of the protein expressed in the cell.
Non-secreted proteins can also be effectively obtained within infected 293 cell production protocols.

【0101】 昆虫細胞は、技術上既知の方法に従い、オートグラファ・カリフォルニカ(Aut
ographa californica)の核多角体病ウイルス(AcNPV)から一般に誘導される組換
えバキュロウイルスに感染させることができる。1方法では、組換えバキュロウ
イルスをラッコウら(Luckow et al., J. Viol. 67:4566-4579, 1993)記載のトラ
ンスポゾン基本系を使用して製造する。転移ベクターを利用するこの系はキット
の形状で市販入手可能である(Bac-to-BacTMキット;ライフ・テクノロジーズ、ロ
ックビル、MD)。転移ベクター(例えば、pFastBac1TM;ライフ・テクノロジーズ)
はTn7トランスポゾンを含み、対象のタンパク質をコードするDNAを、“バクミド
(bacmid)”と呼ぶ大型のプラスミドとして大腸菌に保持されたバキュロウイルス
・ゲノムに移動させる。
Insect cells are prepared according to methods known in the art from Autographa californica (Aut.
can be infected with a recombinant baculovirus commonly derived from the nuclear polyhedrosis virus (AcNPV) of Ographa californica). In one method, recombinant baculovirus is produced using the transposon basic system described by Luckow et al., J. Viol. 67: 4566-4579, 1993. This system utilizing transfer vectors is commercially available in kit form (Bac-to-Bac kit; Life Technologies, Rockville, MD). Transfer vectors (eg pFastBac1 ; Life Technologies)
Contains the Tn7 transposon, and encodes the DNA encoding the protein of interest as "bacmid
It is transferred to the baculovirus genome retained in E. coli as a large plasmid called "bacmid".

【0102】 参照:Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71:971-976, 1990; Bonning
et al., J. Gen. Virol. 75:1551-1556, 1994; and Chazenbalk and Rapoport,
J. Biol. Chem. 270:1543-1549, 1995。さらに、移入ベクターはポリペプチド
拡張をコードするDNAとの枠内融合または上記開示の親和性標識を含む。技術上
既知の技法を用い、zalpha29コード配列を含む移入ベクターは大腸菌宿主細胞に
形質転換し、該細胞は組換えバキュロウイルスの指標となる中断されたlacZ遺伝
子を含むバクミドについてスクリーニングする。組換えバキュロウイルス・ゲノ
ムを含むバクミドDNAは一般的な技法で単離し、Sf9細胞などのスポドプテラ・フ
ルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞を移入するのに使用する。zalpha29タ
ンパク質を発現する組換えウイルスが引続き産生される。組換えウイルス株は一
般的に使用される技術の方法により創生される。
Reference: Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol. 71: 971-976, 1990; Bonning.
et al., J. Gen. Virol. 75: 1551-1556, 1994; and Chazenbalk and Rapoport,
J. Biol. Chem. 270: 1543-1549, 1995. In addition, the transfer vector contains an in-frame fusion with DNA encoding the polypeptide extension or an affinity tag disclosed above. Using techniques known in the art, transfer vectors containing the zalpha29 coding sequence are transformed into E. coli host cells, which are screened for bacmids containing an interrupted lacZ gene indicative of recombinant baculovirus. Bacmid DNA containing the recombinant baculovirus genome is isolated by standard techniques and used to transfer Spodoptera frugiperda cells such as Sf9 cells. Recombinant virus expressing the zalpha29 protein is subsequently produced. Recombinant virus strains are created by methods of commonly used techniques.

【0103】 タンパク質生産のために、組換えウイルスを用いて宿主細胞を感染させるが、
その代表例はアメリカ行列毛虫ヨウトウガ幼虫[スポドプテラ・フルギペルダ(Sp
odoptera frugiperda)](例、Sf9またはSf21細胞)またはトリコプルシア・ナイ(T
richoplusia ni)(例、ハイ・ファイブ(High FiveTM);インビトロゲン、カールス
バッド、CA)由来の細胞系である。参照例:米国特許5,300,435。無血清培地を用
いて細胞を増殖させ、維持する。適切な培地処方は既知であり、市場の供給業者
から入手することができる。細胞は約2〜5×105細胞の接種密度から1〜2×1
06細胞の密度まで増殖させるが、この時点で組換えウイルス株を0.1ないし10の
感染多重度(MOI)、より典型的には3のMOIで添加する。用いられる手法は一般に
技術上既知である。
For protein production, recombinant viruses are used to infect host cells,
A typical example of this is the American procession caterpillar, Pleurotus spp. [Spodoptera frugiperda (Sp
odoptera frugiperda)] (eg, Sf9 or Sf21 cells) or Trichopurcia nai (T
cell lines derived from richoplusia ni) (eg, High Five ; Invitrogen, Carlsbad, CA). Reference Example: U.S. Patent 5,300,435. Cells are grown and maintained using serum-free medium. Suitable media formulations are known and can be obtained from commercial suppliers. The cells are about 2-5 × 10 5 and the inoculum density is 1-2 × 1
Grow to a density of 0 6 cells, at which time the recombinant virus strain is added at a multiplicity of infection (MOI) of 0.1 to 10, more typically a MOI of 3. The techniques used are generally known in the art.

【0104】 他の高等真核細胞、植物細胞および鳥類細胞なども宿主として使用し得る。植
物細胞中で遺伝子を発現するベクターとしてアグロバクテリウム・リゾゲネス(A
grobacterium rhizogenes)を使用することは、シンカーらが概説している(Sinka
r et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987)。
Other higher eukaryotic cells, plant cells, avian cells and the like may also be used as hosts. As a vector to express genes in plant cells, Agrobacterium rhizogenes (A
The use of grobacterium rhizogenes has been reviewed by Sinka et al. (Sinka
r et al., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987).

【0105】 真菌類細胞は酵母細胞も含め、本発明にて使用し得る。この点で特に興味のあ
る酵母種はサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピチア・
パストリス(Pichia pastoris)およびピチア・メタノリカ(Pichia methanolica)
である。サッカロミセス・セレビシエ細胞を外来性DNAで形質転換し、それから
組換えポリペプチドを産生させる方法は、例えば、カワサキ(Kawasaki;米国特許
4,599,311)、カワサキら(Kawasaki et al.; 米国特許4,931,373)、ブレーキ(Bra
ke; 米国特許4,870,008)、ウエルヒら(Welch et al. 米国特許5,037,743)、およ
びマーレイら(Murray et al., 米国特許4,845,075)が開示している。形質転換細
胞は選択可能なマーカー、一般的な薬物耐性、または特定の栄養(例えば、ロイ
シン)不在下に増殖する能力により決定される表現型により選択する。
Fungal cells, including yeast cells, can be used in the present invention. Yeast species of particular interest in this regard are Saccharomyces cerevisiae, Pichia
Pastoris (Pichia pastoris) and Pichia methanolica
Is. Methods for transforming Saccharomyces cerevisiae cells with exogenous DNA and producing recombinant polypeptides therefrom include, for example, Kawasaki (US Pat.
4,599,311), Kawasaki et al .; U.S. Pat.
ke; US Pat. No. 4,870,008), Welch et al. (Welch et al. US Pat. No. 5,037,743), and Murray et al. (Murray et al., US Pat. No. 4,845,075). Transformed cells are selected by a phenotype determined by a selectable marker, general drug resistance, or the ability to grow in the absence of a particular nutrient (eg leucine).

【0106】 サッカロミセス・セレビシエに使用するベクター系の代表例は、カワサキら(K
awasaki et al.; 米国特許4,931,373)が開示しているPOTIベクター系であり、こ
の系は形質転換細胞をグルコース含有培地での増殖により選択することを可能と
する。酵母で使用するのに適したプロモーターとターミネーターは解糖系酵素遺
伝子(参照例:カワサキ(Kawasaki;米国特許4,599,311);キングスマンら(Kingsman
et al., 米国特許4,615,974);およびビッター(Bitter, 米国特許4,977,092))お
よびアルコール脱水素酵素などからのものである。以下の米国特許も参照:4,990
,446;5,063,154;5,139,936;および4,661,454。
Representative examples of vector systems used in Saccharomyces cerevisiae include Kawasaki et al.
awasaki et al .; U.S. Pat. No. 4,931,373), which is a POTI vector system, which allows transformed cells to be selected by growth in glucose-containing medium. Suitable promoters and terminators for use in yeast include glycolytic enzyme genes (see eg Kawasaki; U.S. Patent 4,599,311); Kingsman et al.
et al., U.S. Pat. No. 4,615,974); and Bitter, U.S. Pat. No. 4,977,092)) and alcohol dehydrogenase. See also US patents: 4,990
, 446; 5,063,154; 5,139,936; and 4,661,454.

【0107】 ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、シゾサッカロミセス・ポ
ンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyberomy
ces lactis)、クルイベロミセス・フラジリス(Kluyberomyces fragillis)、ウス
チラゴ・メイディス(Ustilago maydis)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)
、ピチア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピチア・ギレルモンディ(Pichia
guillermondii)、およびカンジダ・マルトーサ(Candida maltosa)などを含む他
の酵母用形質転換系が技術上知られている。参照例:Gleeson et al., J. Gen. M
icrobiol. 132:3459-3465, 1986; Cregg, 米国特許4,882,279;および Raymond e
t al., Yeast 14, 11-23, 1998。アスペルギルス(Aspergillus)細胞はマックナ
イト(McKnight)ら(米国特許4,935,349)の方法に従い使用し得る。
Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyberomys
ces lactis), Kluyberomyces fragillis, Ustilago maydis, Pichia pastoris
, Pichia methanolica, Pichia Guillermon di (Pichia
guillermondii), and other yeast transformation systems are known in the art, including Candida maltosa. Reference example: Gleeson et al., J. Gen. M
icrobiol. 132: 3459-3465, 1986; Cregg, U.S. Patent 4,882,279; and Raymond e.
t al., Yeast 14, 11-23, 1998. Aspergillus cells may be used according to the method of McKnight et al. (US Pat. No. 4,935,349).

【0108】 アクレモニウム・クリソゲナム(Acremonium chrysogenum)を形質転換する方法
はスミノ(Sumino)らが米国特許5,162,228に開示している。ニューロスポラ(Neur
ospora) を形質転換する方法はランボウィッツ(Lambowitz)が米国特許4,486,533
に開示している。ピチア・メタノリカ(Pichia methanolica)中での組換えタンパ
ク質生産は米国特許5,716,808、5,736,383、5,854,039、および5,888,768に開示
されている。
Methods for transforming Acremonium chrysogenum are disclosed by Sumino et al. In US Pat. No. 5,162,228. Neurospora (Neur
The method of transforming ospora is described by Lambowitz in U.S. Patent 4,486,533.
It is disclosed in. Recombinant protein production in Pichia methanolica is disclosed in US Patents 5,716,808, 5,736,383, 5,854,039, and 5,888,768.

【0109】 原核宿主細胞としては細菌のエシェリキア・コリ(Escherichia coli)(大腸菌)
、バシラス(Bacillus)および他の属の菌株を含むが、これらは本発明範囲内の有
用な宿主細胞でもある。これらの宿主を形質転換し、そこにクローン化した外来
DNA配列を発現させる技法は技術的に周知である(参照例:Sambrook et al., ibid
.)。大腸菌などの細菌中でzalpha29ポリペプチドを発現させる場合、該ポリペプ
チドは、一般には不溶性の顆粒として細胞質内に保持させるか、または細菌の選
択配列により細胞周辺腔に差し向ける。
Prokaryotic host cells include the bacterial Escherichia coli (E. coli)
, Strains of Bacillus and other genera, which are also useful host cells within the scope of the present invention. Aliens transformed into these hosts and cloned there
Techniques for expressing DNA sequences are well known in the art (see eg Sambrook et al., Ibid.
.). When the zalpha29 polypeptide is expressed in bacteria such as E. coli, it is generally retained in the cytoplasm as insoluble granules or is directed into the periplasmic space by bacterial selection sequences.

【0110】 前者の場合、細胞を溶解し、顆粒を回収し、例えば、グアニジン・イソチオシ
アン酸、または尿素により変性する。変性したポリペプチドは次いで再生し、例
えば、尿素溶液と酸化還元グルタチオンの組み合わせに対して透析し、次いで緩
衝化塩溶液に対し透析すなど、変性剤を希釈することによって二量化する。後者
の場合には、該ポリペプチドは可溶性の機能的形状で細胞周辺腔から回収するが
、その際、細胞を破砕(例えば、超音波処理または浸透ショック)することにより
細胞周辺腔の内容物を放出させ、タンパク質を回収する。それによって変性と再
生の必要性を排除する。
In the former case, the cells are lysed and the granules are harvested and denatured with, for example, guanidine isothiocyanate or urea. The denatured polypeptide is then renatured and dimerized by diluting the denaturant, eg, dialyzing against a combination of urea solution and redox glutathione, then dialyzing against a buffered salt solution. In the latter case, the polypeptide is recovered from the periplasmic space in a soluble, functional form, in which case the periplasmic contents are disrupted by disrupting the cells (e.g., sonication or osmotic shock). Release and recover protein. Thereby eliminating the need for denaturation and regeneration.

【0111】 形質転換または移入宿主細胞を、選択した宿主細胞の増殖に必要な栄養と他の
成分を含む培地中で通常の手法に従い培養する。規格化された培地および複雑な
培地を含め、様々な適切な培地が技術上既知であり、一般に、炭素源、窒素源、
必須アミノ酸、ビタミン類および無機質を含む。培地は要すれば増殖因子または
血清などの成分を含んでもよい。増殖用培地は一般に、外部から添加されたDNA
を含む細胞のために、例えば、発現ベクター上に担持されたまたは宿主細胞に同
時移入された選択可能なマーカーを補足する必須の栄養物における薬物選択また
は欠損により選択する。液体培養では簡便な方法、例えば、小フラスコの振盪ま
たは醗酵槽の攪拌などにより空気を十分に供給する。
Transformed or transfected host cells are cultured according to conventional techniques in a medium containing nutrients and other components required for the growth of the selected host cells. A variety of suitable media are known in the art, including standardized media and complex media, and generally include carbon sources, nitrogen sources,
Contains essential amino acids, vitamins and minerals. The medium may optionally contain components such as growth factors or serum. Growth medium is generally DNA added from the outside.
, For example, by drug selection or deficiency in essential nutrients that complement the selectable marker carried on the expression vector or co-transfected into the host cell. In liquid culture, air is sufficiently supplied by a simple method such as shaking of a small flask or stirring of a fermentor.

【0112】 意図した用途により、本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、≧80%の純
度、≧90%の純度、≧95%の純度、または医薬的に純粋な状態、すなわち、巨大分
子、特に他のタンパク質および核酸の汚染に関して99.9%を超える純度に、また
感染性および発熱性作因を含まないように精製することができる。精製したポリ
ペプチドまたはタンパク質は、他のポリペプチドまたはタンパク質、取分け動物
起源のものを実質的に含まないように調製することができる。
Depending on the intended use, the polypeptides and proteins of the invention may be ≧ 80% pure, ≧ 90% pure, ≧ 95% pure, or in a pharmaceutically pure state, ie macromolecules, especially others. Can be purified to> 99.9% purity with respect to protein and nucleic acid contamination and free of infectious and pyrogenic agents. Purified polypeptides or proteins can be prepared that are substantially free of other polypeptides or proteins, especially those of animal origin.

【0113】 発現された組換えzalpha29タンパク質(キメラタンパク質および多量体タンパ
ク質を含む)は、常套のタンパク質精製法、典型的にはクロマトグラフ技法の組
み合わせにより精製する。一般参照文献:アフィニティ・クロマトグラフィー:原
理と方法、ファルマシアLKBバイオテクノロジー、ウプサラ、スゥエーデン、198
8;およびスコープス(Scopes)、タンパク質精製:原理と実際、スプリンガー−フ
ェルラグ(Springer-Verlag)、ニューヨーク、1994。
Expressed recombinant zalpha29 proteins (including chimeric and multimeric proteins) are purified by conventional protein purification methods, typically a combination of chromatographic techniques. General References: Affinity Chromatography: Principles and Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 198.
8; and Scopes, Protein Purification: Principles and Practices, Springer-Verlag, New York, 1994.

【0114】 ポリヒスチジン・アフィニティ・タグ(一般には約6個のヒスチジン残基)を含
んでなるタンパク質はニッケル・キレート樹脂上アフィニティ・クロマトグラフ
ィーにより精製する。参照例:Houchuli et al., Bio/Technol. 6:1321-1325, 19
88。glu-gluタグを含んでなるタンパク質は常套の手法に従い、免疫アフィニテ
ィ・クロマトグラフィーにより精製することができる。参照例:Grussenmeyer et
al., ibid.。マルトース結合タンパク質融合物は技術上既知の方法に従い、ア
ミロース・カラム上で精製する。
A protein comprising a polyhistidine affinity tag (generally about 6 histidine residues) is purified by affinity chromatography on a nickel chelate resin. Reference example: Houchuli et al., Bio / Technol. 6: 1321-1325, 19
88. A protein containing a glu-glu tag can be purified by immunoaffinity chromatography according to a conventional method. Reference example: Grussenmeyer et
al., ibid .. The maltose binding protein fusion is purified on an amylose column according to methods known in the art.

【0115】 zalpha29ポリペプチドは、排他固相合成、部分固相法、フラグメント縮合また
は古典的な溶液合成などの技術上既知の方法に従い、化学合成を介して調製する
ことができる。参照例:Merrifield, J. Am. Chem. 85:2149, 1963; Stewart et
al., Solid Phase Peptide Synthesis (固相ペプチド合成)(2nd edition), Pier
ce Chemical Co., Rockford, IL, 1984; Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3
:3, 1986; and Atherton et al., Soli Phase Peptide Synthesis: A Practical
Approach, IRL Press, Oxford, 1989。インビトロでの合成は小型のポリペプチ
ド調製にとって取分け有利である。
Zalpha29 polypeptides can be prepared via chemical synthesis according to methods known in the art such as exclusive solid phase synthesis, partial solid phase methods, fragment condensation or classical solution synthesis. Reference Example: Merrifield, J. Am. Chem. 85: 2149, 1963; Stewart et
al., Solid Phase Peptide Synthesis (2nd edition), Pier
ce Chemical Co., Rockford, IL, 1984; Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3
: 3, 1986; and Atherton et al., Soli Phase Peptide Synthesis: A Practical
Approach, IRL Press, Oxford, 1989. In vitro synthesis is particularly advantageous for small polypeptide preparation.

【0116】 技術上既知の方法を用い、zalpha29タンパク質は単量体または多量体として調
製してもよく;グリコシル化または非グリコシル化してもよく;ぺジル化または非
ぺジル化してもよく;また最初のメチオニンアミノ酸残基を含んでいても含まな
くてもよい。 zalpha29の活性検定に使用する標的細胞は、これらに限定されるものではない
が、血管細胞(取分け内皮細胞と平滑筋細胞)、造血細胞(骨髄とリンパ細胞)、肝
臓細胞(肝実質細胞、有窓性内皮細胞、クップファー(Kupffer)細胞、および伊東
細胞を含む)、線維芽細胞(ヒト皮膚線維芽細胞および肺線維芽細胞を含む)、胎
児肺細胞、関節滑液細胞、血管周囲細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、および前立腺上
皮細胞などである。内皮細胞および造血細胞は共通の先祖細胞、血管芽細胞から
誘導される(Choi et al., Development 125:725-732, 1998)。
The zalpha29 protein may be prepared as a monomer or multimer using methods known in the art; it may be glycosylated or non-glycosylated; it may be pegylated or non-pegylated; The first methionine amino acid residue may or may not be included. Target cells used for zalpha29 activity assay include, but are not limited to, vascular cells (particularly endothelial cells and smooth muscle cells), hematopoietic cells (bone marrow and lymphoid cells), liver cells (hepatic parenchymal cells, Fenestrated endothelial cells, including Kupffer cells, and Ito cells), fibroblasts (including human skin fibroblasts and lung fibroblasts), fetal lung cells, synovial fluid cells, perivascular cells, cartilage Such as cells, osteoblasts, and prostate epithelial cells. Endothelial cells and hematopoietic cells are derived from a common progenitor cell, the hemangioblasts (Choi et al., Development 125: 725-732, 1998).

【0117】 zalpha29タンパク質の活性は、培養細胞を用いてインビトロで、または請求発
明の分子を適切な動物モデルに投与することによりインビボで測定することがで
きる。細胞の増殖または分化を測定するアッセイ法は技術上周知である。例えば
、増殖を測定するアッセイ法は中性赤色色素に対する化学的感受性などのアッセ
イ法(Cavanaugh et al., Invesigational New Drugs 8:347-354, 1990)、放射標
識ヌクレオチドの取込み(例えば、以下の開示:Raines and Ross, Methods Enzym
ol. 109:749-773, 1985; Wahl et al., Mol. Cell Biol. 8:5016-5025, 1988; a
nd Cook et al., Analytical Biochem. 179;1-7, 1989)、増殖細胞のDNAに5-ブ
ロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)の取込み(Porstmann et al., J. Immunol. Met
hods 82:169-179, 1985)、およびテトラゾリウム塩の使用(Mosmann, J. Immunol
. Methods 65:55-63, 1983; Alley et al., Cancer Res. 48:589-601, 1988; Ma
rshall et al., Growth Reg. 5:69-84, 1995; and Scudiero et al., Cancer Re
s. 48:4827-4833, 1988)などである。
The activity of the zalpha29 protein can be measured in vitro using cultured cells or in vivo by administering the molecules of the claimed invention to a suitable animal model. Assays that measure cell proliferation or differentiation are well known in the art. For example, assays that measure proliferation include assays such as chemosensitivity to neutral red dye (Cavanaugh et al., Invesigational New Drugs 8: 347-354, 1990), incorporation of radiolabeled nucleotides (e.g., the disclosure below. : Raines and Ross, Methods Enzym
ol. 109: 749-773, 1985; Wahl et al., Mol. Cell Biol. 8: 5016-5025, 1988; a.
nd Cook et al., Analytical Biochem. 179; 1-7, 1989), incorporation of 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) into the DNA of proliferating cells (Porstmann et al., J. Immunol. Met.
hods 82: 169-179, 1985), and the use of tetrazolium salts (Mosmann, J. Immunol.
Methods 65: 55-63, 1983; Alley et al., Cancer Res. 48: 589-601, 1988; Ma.
rshall et al., Growth Reg. 5: 69-84, 1995; and Scudiero et al., Cancer Re
s. 48: 4827-4833, 1988).

【0118】 分化はより成熟した表現型に分化するよう誘発し得る適切な前駆体細胞を用い
てアッセイすることができる。分化を測定するアッセイ法は、例えば、組織の発
生段階特異的発現と関連する細胞表面マーカーの測定、酵素活性測定、機能的活
性測定または形態的変化測定などである(Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Franc
is, Differentiation 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol.
Bioprocesses, 161-171, 1989; これらすべてを出典明示により本明細書の一部
とする)。
Differentiation can be assayed using appropriate progenitor cells that can be induced to differentiate into a more mature phenotype. Assays for measuring differentiation include, for example, measurement of cell surface markers associated with developmental stage-specific expression of tissues, enzyme activity measurement, functional activity measurement or morphological change measurement (Watt, FASEB, 5: 281). -284, 1991; Franc
is, Differentiation 57: 63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol.
Bioprocesses, 161-171, 1989; all of which are incorporated herein by reference.

【0119】 zalpha29の活性は、1種以上のさらなる増殖因子または他の巨大分子のzalpha
29による誘発産生を測定するように設計したアッセイ法により検出することもで
きる。かかるアッセイ法は、肝細胞増殖因子(HGF)、表皮増殖因子(EGF)、形質転
換増殖因子アルファ(TGFα)、インターロイキン-6(IL-6)、VEGF、酸性線維芽細
胞増殖因子(aFGF),アンギオゲニン、および肝臓が産生するその他の巨大分子の
存在を定量するアッセイ法である。適切なアッセイ法は、対象の巨大分子に応答
する標的細胞を用いる有糸分裂誘発アッセイ、レセプター結合アッセイ、競合結
合アッセイ、免疫学的アッセイ(例えば、ELISA)、および技術上既知の他の方式
である。
The activity of zalpha29 is that of one or more additional growth factors or other macromolecules zalpha29.
It can also be detected by assays designed to measure 29-induced production. Such assay methods include hepatocyte growth factor (HGF), epidermal growth factor (EGF), transforming growth factor alpha (TGFα), interleukin-6 (IL-6), VEGF, acidic fibroblast growth factor (aFGF). , An angiogenin, and an assay to quantify the presence of other macromolecules produced by the liver. Suitable assays include mitogenic assays, target binding assays, competitive binding assays, immunological assays (e.g., ELISA) using target cells that respond to macromolecules of interest, and other formats known in the art. is there.

【0120】 メタロプロテアーゼの分泌は処理した一次ヒト皮膚線維芽細胞、滑液細胞およ
び軟骨細胞から測定される。zalpha29タンパク質存在下の培養に応答して産生さ
れるコラゲナーゼ、ゲラチナーゼおよびストロマリシンの相対レベルはザイモグ
ラムにより測定する(Loita and Stetler-Stevenson, Cancer Biology 1:96-106,
1990)。試験タンパク質に応答する皮膚線維芽細胞と軟骨細胞によるプロコラー
ゲン/コラーゲンは、発生期分泌コラーゲンに3H-プロリンを取込ませることに
より測定する。
Secretion of metalloproteases is measured from treated primary human dermal fibroblasts, synovial cells and chondrocytes. Relative levels of collagenase, gelatinase and stomalysin produced in response to culture in the presence of zalpha29 protein are measured by zymogram (Loita and Stetler-Stevenson, Cancer Biology 1: 96-106,
1990). Procollagen / collagen by skin fibroblasts and chondrocytes in response to test proteins is measured by incorporating 3 H-proline into nascent secretory collagen.

【0121】 3H-標識コラーゲンはSDS-PAGEにより可視化し、オートラジオグラフィに付す(
Unemori and Amento, J. Biol. Chem. 265:10681-10685, 1990)。皮膚線維芽細
胞と軟骨細胞からのグリコサミノグリカン(GAG)分泌は1,9-ジメチルメチレン・
ブルー色素結合アッセイにより測定する(Farndale et al., Biochim. Biophys.
Acta 883:173-177, 1986)。コラーゲンおよびGAGのアッセイもまたzalpha29タン
パク質の能力を試験するためにIL-1βまたはTGF-βの存在下に実施し、これらサ
イトカインに対する応答を確立する。
3 H-labeled collagen was visualized by SDS-PAGE and subjected to autoradiography (
Unemori and Amento, J. Biol. Chem. 265: 10681-10685, 1990). Glycosaminoglycan (GAG) secretion from skin fibroblasts and chondrocytes is 1,9-dimethylmethylene
Measured by the blue dye binding assay (Farndale et al., Biochim. Biophys.
Acta 883: 173-177, 1986). Collagen and GAG assays are also performed in the presence of IL-1β or TGF-β to test the ability of the zalpha29 protein to establish responses to these cytokines.

【0122】 単球活性化アッセイは、(1)zalpha29タンパク質の能力を探究し、単球活性化
をさらに促進するために、また(2)zalpha29タンパク質の能力を試験し、付着誘
発または内毒素誘発の単球活性化を調節するために実施する(Fuhlbrigge et al.
, J. Immunol. 138:3799-3802, 1987)。活性化に応答して産生されるIL-1βおよ
びTNFαレベルはELISAにより測定する(バイオソース・インク(Biosource, Inc.)
、カマリロ、CA)。単球/マクロファージ細胞は、CD14(LPSレセプター)により、
内毒素に対し鋭敏であり、中程度レベルの内毒素様活性をもつタンパク質はこれ
らの細胞を活性化する。
The monocyte activation assay explored the ability of (1) zalpha29 protein, to further promote monocyte activation, and (2) tested the ability of zalpha29 protein, to induce adhesion or endotoxin induction. To regulate monocyte activation in Fuhlbrigge et al.
, J. Immunol. 138: 3799-3802, 1987). IL-1β and TNFα levels produced in response to activation are measured by ELISA (Biosource, Inc.).
, Camarillo, CA). Monocytes / macrophage cells are activated by CD14 (LPS receptor)
Proteins that are sensitive to endotoxin and have moderate levels of endotoxin-like activity activate these cells.

【0123】 zalpha29タンパク質の造血活性は種々の造血細胞上の培養によって検定するこ
とができる。適切なアッセイは一次骨髄コロニーアッセイおよび後期直系制限コ
ロニーアッセイであり、技術上既知である(例えば、Holly et al.、WIPO公開WO9
5/21920)。適切な半固形培地(例えば、15%ウシ胎児血清、10%ウシ血清アルブミ
ンおよび0.6%PSN抗生物質混合物を含む50%メチルセルロース)上に塗布した骨髄
細胞を試験ポリペプチドの存在下にインキュベートし、次いで顕微鏡下にコロニ
ーの形成を検査する。既知造血因子をコントロールとして使用する。造血細胞系
上zalpha29ポリペプチドの分裂促進活性は上記開示のように測定し得る。
The hematopoietic activity of the zalpha29 protein can be assayed by culturing on various hematopoietic cells. Suitable assays are the primary bone marrow colony assay and the late lineage restricted colony assay, which are known in the art (eg Holly et al., WIPO Publication WO9.
5/2 1920). Bone marrow cells plated on a suitable semi-solid medium (e.g., 50% methylcellulose with 15% fetal bovine serum, 10% bovine serum albumin and 0.6% PSN antibiotic mixture) were incubated in the presence of the test polypeptide, then Inspect for colony formation under a microscope. Known hematopoietic factors are used as controls. The mitogenic activity of zalpha29 polypeptides on hematopoietic cell lines can be measured as disclosed above.

【0124】 細胞の遊走は実質的にケーラーらが開示のように検定する(Kehler et al., Ar
teriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 17:932-939, 1997)。タン
パク質が低タンパク質濃度の領域から高タンパク質濃度の領域に細胞の遊走を誘
導するならば、そのタンパク質は走化性であると考える。典型的なアッセイ法は
2つのチャンバーを隔てるポリスチレン膜を備えた改良ボイデン(Boyden)チャン
バーを用い実施する(例えば、トランスウエル(Transwell)(登録商標);コーニン
グ・コースター・コープ(Corning Costar Corp.))。試験サンプルを1%BSA含有培
地に希釈し、24穴プレートを含むトランスウエルの下部チャンバーに加える。
Cell migration is assayed essentially as disclosed by Kehler et al. (Kehler et al., Ar.
teriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 17: 932-939, 1997). A protein is considered to be chemotactic if it induces cell migration from regions of low protein concentration to regions of high protein concentration. A typical assay is performed using a modified Boyden chamber with a polystyrene membrane separating the two chambers (eg, Transwell®; Corning Coaster Corp.). ). Test samples are diluted in medium containing 1% BSA and added to the lower chamber of transwells containing 24-well plates.

【0125】 次いで、0.2%ゼラチンで前処理したトランスウエルの挿入断片上に細胞を置く
。37℃培養の4時間後に細胞の遊走を測定する。非遊走細胞をトランスウエル膜
の上部から拭き取り、膜の下部面に付着した細胞を固定して0.1%クリスタルバイ
オレットで染色する。次いで、染色した細胞を10%酢酸で抽出し、吸光度を600nm
で測定する。次いで、遊走を標準校正曲線から計算する。細胞遊走はグラントら
のマトリゲル(matrigel)法によっても測定し得る(Grant et al.、“上皮−間葉
相互作用の組成としての血管形成”、ゴールドベルグおよびローゼン(Goldberg
and Rosen)、癌における上皮−間葉相互作用、バークハオゼル・フェルラグ(Bir
kheuser Verlag)、1995、235〜248; Baatout, Anticancer Research 17:451-456
, 1997)。
Cells are then plated on transwell inserts pretreated with 0.2% gelatin. Cell migration is measured after 4 hours of incubation at 37 ° C. Non-migrated cells are wiped from the top of the transwell membrane, cells attached to the bottom surface of the membrane are fixed and stained with 0.1% crystal violet. The stained cells were then extracted with 10% acetic acid and the absorbance at 600 nm.
To measure. The migration is then calculated from the standard calibration curve. Cell migration can also be measured by the Matrigel method of Grant et al. (Grant et al., "Angiogenesis as a composition of epithelial-mesenchymal interactions", Goldberg and Rosen (Goldberg).
and Rosen), Epithelial-Mesenchymal Interactions in Cancer, Birkhaozel Ferlag (Bir
kheuser Verlag), 1995, 235-248; Baatout, Anticancer Research 17: 451-456.
, 1997).

【0126】 細胞付着性活性は実質的にラフルールらの開示に従い検定する(LaFleur et al
., J. Biol. Chem. 272:32798-32803, 1997)。簡単に説明すると、マイクロタイ
タープレートに試験タンパク質を塗布し、非特異部位をBSAでブロックし、細胞(
平滑筋細胞、白血球細胞、または内皮細胞など)を約104〜105細胞/ウエルの密
度で塗布する。ウエルを37℃で(典型的には約60分間)インキュベートし、次いで
非付着細胞を緩やかな洗浄により除去する。付着した細胞を常套の方法(例えば
、クリスタルバイオレットでの染色、細胞の溶解、および溶解細胞の光学密度測
定)により定量する。対照ウエルにはフィブロネクチンまたはビトロネクチンな
どの既知付着タンパク質を塗布する。
Cell-adhesive activity is assayed substantially as disclosed by Lafleur et al. (LaFleur et al.
., J. Biol. Chem. 272: 32798-32803, 1997). Briefly, test proteins were applied to microtiter plates, non-specific sites were blocked with BSA, cells (
Smooth muscle cells, white blood cells, or endothelial cells, etc.) are plated at a density of about 10 4 -10 5 cells / well. The wells are incubated at 37 ° C (typically about 60 minutes), then non-adherent cells are removed by gentle washing. Attached cells are quantified by conventional methods (eg, staining with crystal violet, cell lysis, and optical density measurement of lysed cells). Control wells are coated with a known adhesion protein such as fibronectin or vitronectin.

【0127】 zalpha29タンパク質の活性は、レセプター結合と引続く生理的細胞応答と関連
する細胞外酸性化率またはプロトン排出を測定するシリコン−ベースのバイオセ
ンサ、ミクロフィジオメーターにより測定することができる。かかる装置の典型
例は、モレキュラー・ディバイス(Molecular Devices)、サニーベイル(Sunyvale
)、CAが製造するサイトセンサ(CytosensorTM)ミクロフィジオメーターである。
様々な細胞応答、例えば、細胞増殖、イオン輸送、エネルギー産生、炎症性応答
、調節とレセプター活性化などは、この方法により測定することができる。参照
:McConnell et al., Science 257:1906−1912, 1992; Pitchford et al., Meth
. Enzymol. 228:84−108, 1997; Arimilli et al., J. Immunol. Meth. 212:49
−59, 1998; and Van Liefde et al., Eur. J. Pharmacol. 346:87−95, 1998。
The activity of the zalpha29 protein can be measured by a microphysiometer, a silicon-based biosensor that measures extracellular acidification rate or proton excretion associated with receptor binding and subsequent physiological cellular responses. Typical examples of such devices are Molecular Devices, Sunyvale.
), A Cytosensor microphysiometer manufactured by CA.
A variety of cellular responses such as cell proliferation, ion transport, energy production, inflammatory response, regulation and receptor activation can be measured by this method. References: McConnell et al., Science 257: 1906-1912, 1992; Pitchford et al., Meth.
Enzymol. 228: 84-108, 1997; Arimilli et al., J. Immunol. Meth. 212: 49.
-59, 1998; and Van Liefde et al., Eur. J. Pharmacol. 346: 87-95, 1998.

【0128】 ミクロフィジオメーターは付着性または非付着性真核または原核細胞のアッセ
イに使用することができる。細胞媒体における細胞外酸性化変化を経時的に測定
することにより、ミクロフィジオメーターは種々の刺激、例えば、zalpha29タン
パク質、そのアゴニストおよびアンタゴニストなどに対する細胞応答を直接測定
する。ミクロフィジオメーターを使用し、zalpha29応答性真核細胞の応答を、za
lpha29ポリペプチドに応答しない対照の真核細胞と比較して測定することが可能
である。zalpha29応答性真核細胞は、zalpha29レセプターを移入してzalpha29に
応答性とした細胞、並びにzalpha29に本来応答する細胞からなる。
The microphysiometer can be used to assay adherent or non-adherent eukaryotic or prokaryotic cells. By measuring extracellular acidification changes in the cell media over time, the microphysiometer directly measures the cellular response to various stimuli, such as the zalpha29 protein, its agonists and antagonists. Using a microphysiometer, zalpha29-responsive eukaryotic cell response
It can be measured relative to control eukaryotic cells that do not respond to the lpha29 polypeptide. Zalpha29-responsive eukaryotic cells consist of cells that have become responsive to zalpha29 by transfecting the zalpha29 receptor, as well as cells that are naturally responsive to zalpha29.

【0129】 zalpha29ペプチドに露呈した細胞の応答性をzalpha29に露呈していない対照と
比較して、その差を細胞外酸性化の変化により測定するとき、その差はzalpha29
調節応答の直接の測定値である。さらに、かかるzalpha29調節応答は様々な刺激
のもとで検定することができる。本発明はこのようにアゴニストとアンタゴニス
トを同定する方法を提供するが、該方法はzalpha29ポリペプチドに応答する細胞
を供給し、試験化合物の不存在下に細胞の第一部分を培養し、試験化合物の存在
下に細胞の第二部分を培養し、そして細胞の第二部分における細胞性応答の変化
を細胞の第一部分と比較して検出することを含んでなる。
When the responsiveness of cells exposed to zalpha29 peptide was compared to controls not exposed to zalpha29, the difference was measured by changes in extracellular acidification, the difference was zalpha29.
It is a direct measure of the regulatory response. Furthermore, such zalpha29 regulatory response can be assayed under various stimuli. The invention thus provides a method of identifying agonists and antagonists, which method comprises supplying cells responsive to a zalpha29 polypeptide, culturing a first portion of the cells in the absence of the test compound, Culturing a second part of the cell in the presence and detecting an alteration of the cellular response in the second part of the cell as compared to the first part of the cell.

【0130】 細胞性応答の変化は細胞外酸性化率の測定可能な変化として示される。zalpha
29タンパク質の存在下で、かつ試験化合物不存在下での細胞の第三部分の培養は
、zalpha29応答性細胞に対する陽性対照および試験化合物のアゴニスト活性とza
lpha29ポリペプチドのアゴニスト活性とを比較する対照を提供する。zalpha29の
アンタゴニストは、試験化合物の存在下および不存在下に該細胞をzalpha29タン
パク質に露呈することにより同定することが可能であり、その場合、zalpha29刺
激活性の減少は試験化合物におけるアンタゴニスト活性の表示である。
Changes in the cellular response are shown as measurable changes in extracellular acidification rate. zalpha
Culturing the third part of the cells in the presence of 29 protein and in the absence of the test compound resulted in a positive control and test compound agonist activity and z
A control is provided to compare the agonist activity of the lpha29 polypeptide. Antagonists of zalpha29 can be identified by exposing the cells to zalpha29 protein in the presence and absence of the test compound, where a decrease in zalpha29 stimulating activity is an indication of antagonist activity in the test compound. is there.

【0131】 動物におけるzalpha29ポリヌクレオチドの発現は、インビボにおけるタンパク
質活性の過剰生産または阻害の生物的効果のさらなる研究のためのモデルを提供
する。zalpha29をコードするポリヌクレオチドおよびアンチセンス・ポリヌクレ
オチドは、ウイルスベクターまたは裸のDNAを用い、マウスなどの試験動物に導
入することが可能であり、また形質転換動物を生成させることができる。
Expression of zalpha29 polynucleotides in animals provides a model for further study of the biological effects of overproduction or inhibition of protein activity in vivo. Polynucleotides encoding zalpha29 and antisense polynucleotides can be introduced into test animals, such as mice, using viral vectors or naked DNA, and transformed animals can be generated.

【0132】 本発明のタンパク質を検定するインビボ方法の一つではウイルス送達システム
を利用する。この目的に適うウイルスの代表例は、アデノウイルス、ヘルペスウ
イルス、レトロウイルス、ワクチニアウイルス、およびアデノウイルス伴生ウイ
ルス(AAV)である。二本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスは外来核酸送達用の
現在最もよく研究された遺伝子運搬体である。参照総説:Becker et al., Meth.
Cell Biol. 43:161−89, 1994; and Douglas and Curiel, Science & Medicine
4:44−53, 1997。
One of the in vivo methods of assaying the proteins of the present invention utilizes a viral delivery system. Representative examples of viruses suitable for this purpose are adenovirus, herpesvirus, retroviruses, vaccinia virus, and adenovirus-associated virus (AAV). Adenovirus, a double-stranded DNA virus, is currently the most well-studied gene carrier for foreign nucleic acid delivery. Reference Review: Becker et al., Meth.
Cell Biol. 43: 161-89, 1994; and Douglas and Curiel, Science & Medicine
4: 44-53, 1997.

【0133】 アデノウイルス系は幾つかの利点を提供する。アデノウイルスは(i)比較的大
型のDNA挿入断片を収容可能である;(ii)高力価に増殖可能である;(iii)広範な
哺乳動物細胞型に感染し得る;そして(iv)多くの異なるプロモーター、例えば、
遍在性の組織特異、調整可能なプロモーターと共に使用し得る。アデノウイルス
は血流中で安定であるため、静脈注射することができる。
The adenovirus system offers several advantages. Adenovirus can (i) accommodate relatively large DNA inserts; (ii) can grow to high titers; (iii) can infect a wide range of mammalian cell types; and (iv) many. Different promoters, for example,
It can be used with ubiquitous tissue-specific, regulatable promoters. Adenovirus is stable in the bloodstream and can be injected intravenously.

【0134】 アデノウイルス・ゲノムの一部を除去することにより、外来DNAの大型挿入断
片(7kbまで)を収容可能である。これらの挿入断片は直接の結合により、または
共移入したプラスミドでの相同組換えによりウイルスDNA中に取込ませることが
できる。代表的な系では、必須のE1遺伝子がウイルス・ベクターから削除され、
該ウイルスは宿主細胞(例えば、ヒト293細胞系)がE1遺伝子を提供しない限り複
製しない。アデノウイルスは未処置動物に静脈内投与したとき、主として肝臓を
標的とする。もしアデノウイルス送達系がE1遺伝子を欠失しているならば、該ウ
イルスは宿主細胞中で複製し得ない。しかし、宿主の組織(例えば、肝臓)は異種
タンパク質を発現し、処理加工する(そして、もしシグナル配列が存在するなら
、分泌する)。分泌されたタンパク質は高度に血管化した肝臓内の循環に入り、
感染した動物での効果を決定し得る。
By removing a portion of the adenovirus genome, large inserts of foreign DNA (up to 7 kb) can be accommodated. These inserts can be incorporated into the viral DNA by direct ligation or by homologous recombination with the cotransfected plasmid. In a typical system, the essential E1 gene was deleted from the viral vector,
The virus does not replicate unless the host cell (eg, human 293 cell line) provides the E1 gene. Adenovirus primarily targets the liver when administered intravenously to naive animals. If the adenovirus delivery system lacks the E1 gene, the virus is unable to replicate in the host cell. However, the host tissue (eg, liver) expresses and processes the heterologous protein (and secretes the signal sequence if present). The secreted proteins enter the circulation in the highly vascularized liver,
The effect on infected animals can be determined.

【0135】 遺伝子送達の代替法は、身体から細胞を取出し、その細胞に裸のDNAプラスミ
ドとしてベクターを細胞に導入することからなる。次いで、形質転換した細胞を
身体に再移植する。裸のDNAベクターは技術上既知の方法、例えば、トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、
細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、または
DNAベクター輸送体の使用などにより宿主細胞に導入する。参照:Wu et al., J.
Biol. Chem. 263:14621−14624, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963−9
67, 1992; and Johnston and Tang, Meth. Cell Biol. 43:353−365, 1994。
An alternative to gene delivery consists of removing cells from the body and introducing the vector into the cells as a naked DNA plasmid in the cells. The transformed cells are then reimplanted into the body. Naked DNA vectors can be prepared by methods known in the art, such as transfection, electroporation, microinjection, transduction,
Cell fusion, DEAE dextran, calcium phosphate precipitation, use of gene gun, or
It is introduced into a host cell by using a DNA vector transporter. Reference: Wu et al., J.
Biol. Chem. 263: 14621-14624, 1988; Wu et al., J. Biol. Chem. 267: 963-9.
67, 1992; and Johnston and Tang, Meth. Cell Biol. 43: 353-365, 1994.

【0136】 zalpha29遺伝子を発現するように作製したトランスジェニック・マウス、また
zalpha29遺伝子機能を完全に失ったマウス、これは“ノックアウト・マウス”と
いうが(Snouwaert et al., Science 257:1083, 1992)、これらもまた生成させる
ことができる(Lowell et al., Nature 366:740−742, 1993)。これらのマウスを
採用してzalpha29遺伝子とそれによってコードされるタンパク質をインビボの系
で研究することができる。トランスジェニック・マウスは初期発生時におけるza
lpha29タンパク質の役割を研究するのに特に有用であり、そこでは発生異常の同
定または特異因子の過剰もしくは過少発現から生じる遮断を可能とする。参照:M
aisonpierre et al., Science 277:55−60, 1997 and Hanahan, Science 277:48
−50, 1997。トランスジェニック発現のためのプロモーターはメタロチオネイン
およびアルブミン遺伝子からのプロモーターである。
Transgenic mice engineered to express the zalpha29 gene, and
Mice that have completely lost zalpha29 gene function, referred to as “knockout mice” (Snouwaert et al., Science 257: 1083, 1992), can also be generated (Lowell et al., Nature 366: 740-742, 1993). These mice can be employed to study the zalpha29 gene and the proteins encoded by it in an in vivo system. Transgenic mice show za during early development
It is particularly useful for studying the role of the lpha29 protein, where it allows the identification of developmental abnormalities or blockages resulting from over or under expression of specific factors. Reference: M
aisonpierre et al., Science 277: 55-60, 1997 and Hanahan, Science 277: 48.
-50, 1997. The promoter for transgenic expression is the promoter from the metallothionein and albumin genes.

【0137】 アンチセンスの方法論を用い、zalpha29遺伝子転写を阻害してかかる阻害の効
果をインビボで検討することができる。zalpha29をコードするポリヌクレオチド
(例えば、配列番号1に示したポリヌクレオチド)のセグメントに相補的なポリヌ
クレオチドは、zalpha29をコードするmRNAに結合し、かかるmRNAの翻訳を阻害す
るように設計する。かかるアンチセンス・オリゴヌクレオチドを用い、細胞培養
中のzalpha29ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を阻害することもできる。
Antisense methodology can be used to inhibit zalpha29 gene transcription and study the effects of such inhibition in vivo. Polynucleotide encoding zalpha29
A polynucleotide complementary to a segment (eg, the polynucleotide set forth in SEQ ID NO: 1) is designed to bind to the mRNA encoding zalpha29 and inhibit translation of such mRNA. Such antisense oligonucleotides can also be used to inhibit expression of genes encoding zalpha29 polypeptides in cell culture.

【0138】 殆どの4ヘリックス束サイトカイン並びに活性化リンパ球により産生される他
のタンパク質は、細胞の分化、活性化、リクルート、および全身にわたる細胞の
恒常性において重要な生物学的役割を果たす。zalpha29およびzalpha29活性のイ
ンヒビターには様々な治療応用が期待される。これらの応用は免疫調節を必要と
する疾患の治療、例えば、リューマチ性関節炎、多発性硬化症、重症筋無力症、
全身性エリテマトーデス、および糖尿病の治療である。
Most 4-helix bundle cytokines, as well as other proteins produced by activated lymphocytes, play important biological roles in cell differentiation, activation, recruitment, and systemic homeostasis throughout the body. Various therapeutic applications are expected for inhibitors of zalpha29 and zalpha29 activity. These applications have applications in the treatment of diseases that require immunomodulation, such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, myasthenia gravis,
Treatment of systemic lupus erythematosus and diabetes.

【0139】 zalpha29は炎症の調節において重要であり、従って、リューマチ性関節炎、喘
息および敗血症の治療に有用である。腫瘍形成の仲介にzalpha29の役割が存在す
る可能性があり、その場合にはzalpha29アンタゴニストが癌の治療に有用であろ
う。zalpha29は免疫系を調節するのに有用であり、その場合にはzalpha29および
zalpha29アンタゴニストが移植片拒絶の低減、移植片−宿主間の疾患の予防、感
染性疾患に対する免疫性の増強、免疫無防備状態の患者(例えば、HIV陽性患者)
の治療、またはワクチンの改良に使用し得る。
Zalpha29 is important in the regulation of inflammation and is therefore useful in the treatment of rheumatoid arthritis, asthma and sepsis. There may be a role for zalpha29 in mediating tumorigenesis, in which case zalpha29 antagonists would be useful in treating cancer. zalpha29 is useful in regulating the immune system, in which case zalpha29 and
zalpha29 antagonists reduce graft rejection, prevent graft-host disease, enhance immunity to infectious diseases, immunocompromised patients (e.g. HIV positive patients)
Can be used for the treatment of, or for the improvement of vaccines.

【0140】 zalpha29ポリペプチドは単独で、またはVEGFなどの他の脈管形成または血管形
成剤との組合わせで投与することができる。zalpha29を付加的薬剤と併用する場
合、2つの化合物は治療すべき特定の症状に適応させて同時にまたは連続的に投
与し得る。
The zalpha29 polypeptide can be administered alone or in combination with other angiogenic or angiogenic agents such as VEGF. When zalpha29 is used in combination with an additional drug, the two compounds may be administered simultaneously or sequentially, depending on the particular condition to be treated.

【0141】 医薬用途としてのzalpha29タンパク質は常套の方法に従って局所または非経口
送達用に、取分け静脈内または皮下投与用に製剤化する。一般に、製剤処方はza
lpha29ポリペプチドと医薬的に許容し得るビークル、例えば、塩類液、緩衝化塩
類液、5%デキストロース水溶液などとの組合わせからなる。製剤処方はさらに1
種以上の添加剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面上でのタンパク質損
失を防止するアルブミンなどを含んでもよい。製剤処方の方法は技術上周知であ
り、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed
., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th ed., 1995 に開示されている。
The zalpha29 protein for pharmaceutical use is formulated according to conventional methods for topical or parenteral delivery, especially for intravenous or subcutaneous administration. In general, pharmaceutical formulations are za
It consists of a combination of the lpha29 polypeptide and a pharmaceutically acceptable vehicle such as saline, buffered saline, 5% dextrose in water and the like. 1 more formulation
It may also include one or more additives, preservatives, solubilizers, buffers, albumin and the like to prevent protein loss on the vial surface. Methods of formulation are well known in the art and are described, for example, in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed.
., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th ed., 1995.

【0142】 zalpha29は、好ましくは、約10ないし100μg/mlの総容量の濃度で使用するが
、1ng/mlないし1000μg/mlの範囲の濃度が用いられてもよい。局所投与、例え
ば、外傷治癒の促進のためには、0.1〜10μg/cm2外傷面積の範囲で該タンパク
質を塗布するが、正確な用量は処置すべき症状の性質と重篤度、患者の特性など
を考慮して、許容されている基準に従い、医師が決定する。用量の決定は通常の
技術レベル内のことである。投与は治療期間の毎日または間隔を置いて実施する
。静脈内投与は1時間ないし数時間の一般的な時間で大容量注射または注入によ
り実施する。徐放性製剤を採用してもよい。一般に、zalpha29の治療有効量は治
療した症状に臨床的に有意な変化、例えば、造血性または免役機能の臨床的に有
意な変化、病的状態の有意な減少、または有意に増大した組織学的得点などを生
じるのに十分な量である。
Zalpha29 is preferably used at a concentration of about 10 to 100 μg / ml total volume, although concentrations ranging from 1 ng / ml to 1000 μg / ml may be used. For local administration, for example for promoting wound healing, the protein is applied in the range of 0.1-10 μg / cm 2 trauma area, but the exact dose will depend on the nature and severity of the condition to be treated, the characteristics of the patient. The doctor decides according to the accepted standard, taking into consideration the above. Dose determination is within the level of ordinary skill. Administration is daily or at intervals of treatment. Intravenous administration is accomplished by large volume injection or infusion over a typical period of 1 hour to several hours. Sustained-release preparations may be adopted. Generally, a therapeutically effective amount of zalpha29 is a clinically significant change in the treated condition, such as a clinically significant change in hematopoietic or immune function, a significant decrease in morbidity, or a significantly increased histological The amount is sufficient to give a score and the like.

【0143】 zalpha29タンパク質、アゴニストおよびアンタゴニストは応答性細胞型の拡大
、増殖、活性化、分化、移動、または代謝を調節するのに有用であり、該細胞型
は一次細胞および培養細胞系の両方を含む。この点で特に興味深いのは、造血細
胞(幹細胞および成熟骨髄細胞とリンパ系細胞を含む)、内皮細胞、平滑筋細胞、
線維芽細胞、および肝実質細胞である。zalpha29ポリペプチドはこれらの細胞型
に対し約10pg/mlないし約100ng/mlの濃度で組織培養培地に加える。当業者はz
alpha29タンパク質が培地中で他の増殖因子と有利に組合わせ得ることを認知す
るであろう。
The zalpha29 proteins, agonists and antagonists are useful in modulating the expansion, proliferation, activation, differentiation, migration, or metabolism of responsive cell types, which cell types affect both primary and cultured cell lines. Including. Of particular interest in this regard are hematopoietic cells (including stem cells and mature bone marrow cells and lymphoid cells), endothelial cells, smooth muscle cells,
Fibroblasts and hepatocytes. The zalpha29 polypeptide is added to the tissue culture medium at a concentration of about 10 pg / ml to about 100 ng / ml for these cell types. Those skilled in the art z
It will be appreciated that the alpha29 protein can be advantageously combined with other growth factors in culture.

【0144】 実験室での研究分野では、zalpha29タンパク質は分子量の基準として、または
タンパク質の循環レベルを測定するためのアッセイ法、例えば、zalpha29タンパ
ク質の過剰または過少生産を特徴とする疾患の診断または細胞表現型の分析にお
ける試薬としても使用することができる。
In the field of laboratory research, the zalpha29 protein is used as a measure of molecular weight or in assays for measuring circulating levels of the protein, eg diagnosis of diseases or cells characterized by excessive or underproduction of the zalpha29 protein. It can also be used as a reagent in phenotypic analysis.

【0145】 zalpha29タンパク質はその活性のインヒビターを同定するのにも使用し得る。
試験化合物を上記のアッセイ系に加え、zalpha29タンパク質の活性を阻害する化
合物を同定する。上記これらのアッセイに加え、サンプルはレセプター結合また
はzalpha29依存細胞性応答の促進/阻害を測定するために設計された様々なアッ
セイ系内でzalpha29活性の阻害を試験することができる。例えば、zalpha29応答
性細胞系にはzalpha29刺激細胞経路に応答するレポーター遺伝子構築物を移入す
る。この型のレポーター遺伝子構築物は技術上既知であり、一般に、ルシフェラ
ーゼなどのアッセイ可能なタンパク質をコードする遺伝子に操作可能に結合した
zalpha29活性化血清応答要素(SRE)を含んでなる。候補化合物、溶液、混合物ま
たは抽出物は、レポーター遺伝子発現のzalpha29による促進の増大により証明さ
れるように、標的細胞上のzalpha29活性を阻害する能力につて試験する。
The zalpha29 protein may also be used to identify inhibitors of its activity.
Test compounds are added to the assay system described above to identify compounds that inhibit the activity of zalpha29 protein. In addition to these assays described above, samples can be tested for inhibition of zalpha29 activity in various assay systems designed to measure the promotion / inhibition of receptor binding or zalpha29 dependent cellular responses. For example, a zalpha29 responsive cell line is transfected with a reporter gene construct that responds to the zalpha29 stimulated cell pathway. This type of reporter gene construct is known in the art and is generally operably linked to a gene encoding an assayable protein such as luciferase.
It comprises the zalpha29 activated serum response element (SRE). Candidate compounds, solutions, mixtures or extracts are tested for their ability to inhibit zalpha29 activity on target cells, as evidenced by the increased stimulation by zalpha29 of reporter gene expression.

【0146】 このタイプのアッセイ法では、細胞表面レセプターにzalpha29が結合するのを
直接遮断する化合物、並びにレセプター−リガンド結合に続く細胞経路の過程を
遮断する化合物を検出する。別個の方法においては、検出可能な標識(例えば、1 25 I、ビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、FITCなど)で標識したzalpha29を
用い、化合物または他のサンプルについてzalpha29がレセプターに結合するのを
直接遮断するか、試験することができる。このタイプのアッセイ法では、標識し
たzalpha29がレセプターに結合するのを阻害する試験サンプルの能力が阻害活性
の表示であり、この活性は二次的アッセイ法を経て確認することができる。結合
アッセイに使用するレセプターは細胞性レセプターまたは分離固相化したレセプ
ターであってもよい。
This type of assay detects compounds that directly block zalpha29 binding to cell surface receptors, as well as compounds that block the process of the cellular pathway following receptor-ligand binding. In a separate method, a detectable label (e.g., 1 25 I, biotin, horseradish peroxidase, FITC, etc.) using zalpha29 labeled with, for compounds or other samples zalpha29 to block binding to the receptor directly Or you can test. In this type of assay, the ability of the test sample to inhibit labeled zalpha29 from binding to the receptor is an indication of inhibitory activity, which activity can be confirmed via secondary assays. The receptor used in the binding assay may be a cellular receptor or a separate solid-phased receptor.

【0147】 本明細書にて使用する場合、“抗体”とはポリクローナル抗体、モノクローナ
ル抗体、その抗原結合フラグメント、例えば、F(ab')2およびFabフラグメント、
1本鎖抗体などであり、遺伝子工学的に調製した抗体を含む。非ヒト抗体は非ヒ
トCDRをヒト骨格および不変部領域に移植することにより、または非ヒト可変ド
メイン全体を取込ませることによりヒト化することができる(選択肢としては、
露出残基の置換によりそれらをヒト様表面で“蔽う”が、その場合、結果として
“被覆”抗体となる)。場合により、ヒト化抗体はヒト可変領域骨格ドメイン内
に非ヒト化残基を保存し、適当な結合特性を上昇させてもよい。抗体のヒト化を
経て、生物学的半減期が延長され、ヒトへの投与による不利な免疫反応の可能性
が減少する。
As used herein, “antibody” refers to polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, antigen-binding fragments thereof, such as F (ab ′) 2 and Fab fragments,
It is a single-chain antibody or the like, and includes an antibody prepared by genetic engineering. Non-human antibodies can be humanized by grafting non-human CDRs into the human skeleton and constant region, or by incorporating whole non-human variable domains (optional,
Substitution of exposed residues "masks" them at the human-like surface, which then results in "coated" antibodies). In some cases, humanized antibodies may preserve non-humanized residues within the human variable region scaffold domain to enhance appropriate binding properties. Through the humanization of antibodies, the biological half-life is extended, reducing the potential for adverse immune reactions upon administration to humans.

【0148】 当業者は特異的な異なる不変ドメインをもつヒト化抗体(すなわち、異なるIg
サブクラス)を生成させ、特定の抗体不変ドメインと関連する種々の免疫機能を
促進するかまたは阻害することができる。抗体は、もしそれらが(非zalpha29)ポ
リペプチドまたはタンパク質を制御する結合親和性よりも少なくとも10倍大きな
親和性をもつzalpha29ポリペプチドまたはタンパク質に結合するなら、特異的に
結合すると定義する。モノクローナル抗体の親和性は当業者が容易に決定するこ
とができる(参照例:Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949)。
Those skilled in the art will appreciate that humanized antibodies with different specific constant domains (ie different Ig
Subclass) can be generated to promote or inhibit various immune functions associated with a particular antibody constant domain. Antibodies are defined as specifically binding if they bind a zalpha29 polypeptide or protein with an affinity that is at least 10 times greater than the binding affinity that controls the (non-zalpha29) polypeptide or protein. The affinity of a monoclonal antibody can be easily determined by those skilled in the art (reference example: Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949).

【0149】 ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の調製方法は技術上周知である
(参照例:Hurrell, J.G.R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniqu
es and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982; 出典明示によ
り本明細書の一部とする)。当業者には明らかなように、ポリクローナル抗体は
種々の温血動物、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ
、マウス、およびラットから生成させることができる。zalpha29ポリペプチドの
免疫原性はアジュバント、例えば、ミョウバン(水酸化アルミニウム)またはフロ
イント完全または不完全アジュバントなどを使用して上昇させてもよい。
Methods for preparing polyclonal and monoclonal antibodies are well known in the art.
(Reference example: Hurrell, JGR, Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniqu
es and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982; incorporated herein by reference. As will be appreciated by those in the art, polyclonal antibodies can be generated from a variety of warm-blooded animals, such as horses, cows, goats, sheep, dogs, chickens, rabbits, mice, and rats. The immunogenicity of zalpha29 polypeptides may be increased using an adjuvant, such as alum (aluminum hydroxide) or Freund's complete or incomplete adjuvant.

【0150】 免疫化に有用なポリペプチドは、融合ポリペプチド、例えば、zalpha29ポリペ
プチドまたはその一部と免疫グロブリン・ペプチドとまたはマルトース結合タン
パク質との融合物なども包含する。ポリペプチド免疫原は完全長分子またはその
一部であってもよい。該ポリペプチドタンパク質が“ハプテン様”である場合に
は、かかる部分は、有利には免疫化用の巨大分子担体(キーホール・リンペット
・ヘモシアニン(KLH)、ウシ血清アルブミン(BSA)、または破傷風毒素など)に連
結または結合するとよい。
Polypeptides useful for immunization also include fusion polypeptides, such as fusions of a zalpha29 polypeptide or a portion thereof with an immunoglobulin peptide or a maltose binding protein. The polypeptide immunogen may be a full length molecule or a portion thereof. When the polypeptide protein is "hapten-like", such moieties are advantageously macromolecular carriers for immunization (keyhole limpet hemocyanin (KLH), bovine serum albumin (BSA), or tetanus. Toxins).

【0151】 抗体を生成させるかまたは選択する別の技法は、リンパ球をzalpha29ポリペプ
チドにインビトロで露呈すること、そしてファージまたは同類のベクターにて抗
体展示ライブラリーを選択することからなる(例えば、固相化または標識したzal
pha29ポリペプチドの使用を介して)。ヒト抗体はトランスジェニック非ヒト動物
に産生させることができるが、該動物はWIPO公開WO98/24893に開示されているよ
うに、ヒト免疫グロブリンを含むように作製する。これらの動物における内因性
免疫グロブリン遺伝子は相同的組換えによるなどで不活性化または除去すること
が好ましい。
Another technique for generating or selecting antibodies consists of exposing lymphocytes to zalpha29 polypeptides in vitro and selecting antibody display libraries with phage or like vectors (eg, Immobilized or labeled zal
via the use of the pha29 polypeptide). Human antibodies can be produced in transgenic non-human animals, which are made to contain human immunoglobulins, as disclosed in WIPO Publication WO98 / 24893. The endogenous immunoglobulin genes in these animals are preferably inactivated or removed, such as by homologous recombination.

【0152】 当業者既知の様々なアッセイ法を利用してzalpha29ポリペプチドに特異的に結
合する抗体を検出することができる。模範となるアッセイ法は、Antibodies: A
Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1988 に詳細に記載されている。かかるアッセイ法の代表例は以下のと
おりである:同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、放射免疫沈降、固相酵
素免疫検定法(ELISA)、ドットブロットアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ
、阻害または競合アッセイ、およびサンドイッチアッセイ。
Various assays known to those of skill in the art can be utilized to detect antibodies that specifically bind to zalpha29 polypeptides. An exemplary assay method is Antibodies: A
Laboratory Manual, Harlow and Lane (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory
See Press, 1988 for details. Representative examples of such assays are: coimmunoelectrophoresis, radioimmunoassay, radioimmunoprecipitation, solid phase enzyme immunoassay (ELISA), dot blot assay, western blot assay, inhibition or competition assay, and sandwich. Assay.

【0153】 zalpha29に対する抗体は、該タンパク質の循環レベルを測定する診断アッセイ
内で、タンパク質のアフィニティ精製に;基本的な病理または疾患のマーカーと
して可溶性zalpha29ポリペプチドを検出または定量するために;免疫診断での応
用など、動物全体または組織切片内での免疫局在に;免疫組織化学に;およびイ
ンビトロおよびインビボでのタンパク質活性を遮断するアンタゴニストとして;
使用することができる。zalpha29に対する抗体は、zalpha29を発現する細胞を標
識するために;zalpha29ポリペプチドおよびタンパク質のアフィニティ精製に;
FACSを使用する分析方法に;発現ライブラリーのスクリーニングに;および抗イ
ディオタイプ抗体の生成に;使用することもできる。
Antibodies to zalpha29 can be used in affinity assays for proteins in diagnostic assays that measure circulating levels of the protein; to detect or quantify soluble zalpha29 polypeptides as markers of underlying pathology or disease; immunodiagnosis For immunolocalization within whole animals or within tissue sections, such as for applications in; immunohistochemistry; and as antagonists that block protein activity in vitro and in vivo;
Can be used. Antibodies to zalpha29 for labeling cells expressing zalpha29; for affinity purification of zalpha29 polypeptides and proteins;
It can also be used for analytical methods using FACS; for screening expression libraries; and for producing anti-idiotype antibodies.

【0154】 抗体は、zalpha29のレセプターを発現する細胞にこれら化合物を標的とさせる
既知方法により、治療薬および診断薬などの他の化合物に結合させることができ
る。インビトロおよびインビボでの診断用途などある種の応用では、標識した抗
体を採用することが有利である。適切な直接のタグまたは標識は放射性核種、酵
素、基質、補助因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒
子などであり;間接的なタグまたは標識は中間体としてビオチン−アビジンまた
は他の補体/抗補体ペアの使用を特徴としてもよい。本発明の抗体は直接または
間接に薬物、毒素、放射性核種などに接合してもよく、またこれらの接合体はイ
ンビボ診断または治療応用(例えば、細胞増殖の阻害)に使用し得る。一般的参照
文献:Ramakrishnan et al., Cancer Res. 56:1324-1330, 1996。
Antibodies can be conjugated to other compounds such as therapeutics and diagnostics by known methods of targeting these compounds to cells expressing the zalpha29 receptor. For certain applications, such as in vitro and in vivo diagnostic applications, it is advantageous to employ a labeled antibody. Suitable direct tags or labels are radionuclides, enzymes, substrates, cofactors, inhibitors, fluorescent markers, chemiluminescent markers, magnetic particles, etc .; indirect tags or labels include biotin-avidin or other supplements as intermediates. The use of body / anti-complement pairs may be featured. The antibodies of the invention may be conjugated directly or indirectly to drugs, toxins, radionuclides, etc., and these conjugates may be used for in vivo diagnostic or therapeutic applications (eg, inhibition of cell proliferation). General reference: Ramakrishnan et al., Cancer Res. 56: 1324-1330, 1996.

【0155】 本発明のポリペプチド及びタンパク質を使用してレセプターを同定しそして単
離することができる。zalpha29レセプターは肝臓、血管形成及び他の発生プロセ
スの増殖調節に関与している。例えば、zalpha29タンパク質及びポリペプチドを
カラム上に固定し、そしてこのカラムに膜調製物を流すことができる(固定化ア
フィニティリガンド技術(Immobilized Affinity Ligand Techniques)、Hermanso
n等編集、Academic Press、カリフォルニア州サンジエゴ、1992年、195〜202頁
に一般的に開示されているようにして)。
The polypeptides and proteins of the present invention can be used to identify and isolate receptors. The zalpha29 receptor is involved in the growth regulation of liver, angiogenesis and other developmental processes. For example, zalpha29 proteins and polypeptides can be immobilized on a column and the column can be run with a membrane preparation (Immobilized Affinity Ligand Techniques, Hermanso.
n. et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1992, p.195-202).

【0156】 タンパク質及びポリペプチドはまた、放射性標識し(Methods Enzymol.、182巻
、「タンパク質精製の手引き(Guide to Protein Purification)」、M. Deutsche
r編集、Academic Press、サンジエゴ、1990年、721〜737)又はフォトアフィニテ
ィ標識することができ(Brunner等、Ann. Rev. Biochem. 62:483〜514、1993年及
びFedan等、Biochem. Pharmacol. 33:1167〜1180、1984年)、そして特異的な細
胞表面タンパク質にタグを付けるために使用することができる。同様にして、放
射標識したzalpha29タンパク質及びポリペプチドを使用して、発現cDNAライブラ
リーでトランスフェクションした細胞を使用する結合アッセイで同系レセプター
をクローン化することができる。
Proteins and polypeptides have also been radiolabeled (Methods Enzymol., Volume 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutsche.
r Edit, Academic Press, San Diego, 1990, 721-737) or photoaffinity labeling (Brunner et al., Ann. Rev. Biochem. 62: 483-514, 1993 and Fedan et al., Biochem. Pharmacol. 33). 1167-1180, 1984), and can be used to tag specific cell surface proteins. Similarly, radiolabeled zalpha29 proteins and polypeptides can be used to clone cognate receptors in a binding assay using cells transfected with an expression cDNA library.

【0157】 本発明はまた、診断適用に使用される試薬も提供する。例えば、zalpha29遺伝
子、zalpha29 DNA若しくはRNAを含んでいるプローブ又はこれらのサブ配列を使
用して染色体2p15のzalpha29座位又はその近位における突然変異の存在を決定す
ることができる。zalpha29遺伝子座における検出可能な染色体異常には異数性、
遺伝子コピー数の変化、挿入、欠失、制限部位変化及び転位が含まれるが、これ
らに限定されない。これらの異常はコード化配列内、イントロン内、又は上流プ
ロモーター及び調節領域を含むフランキング配列内で生起する可能性があり、そ
してコード化配列内の物理的改変又は遺伝子発現レベルの変化として現れること
がある。
The present invention also provides reagents for use in diagnostic applications. For example, a probe containing the zalpha29 gene, zalpha29 DNA or RNA, or subsequences thereof, can be used to determine the presence of a mutation at or near the zalpha29 locus on chromosome 2p15. Aneuploidy for detectable chromosomal aberrations at the zalpha29 locus,
These include, but are not limited to, gene copy number alterations, insertions, deletions, restriction site alterations and transpositions. These abnormalities can occur within the coding sequence, within introns, or within flanking sequences containing upstream promoters and regulatory regions, and manifest as physical alterations or changes in gene expression levels within the coding sequence. There is.

【0158】 分析用プローブは、幾分より短いプローブ(14〜17ヌクレオチド)を使用するこ
ともできるが、一般的には少なくとも20ヌクレオチド長であろう。PCRプライマ
ーは少なくとも5ヌクレオチド長、しばしば15又はそれより長いヌクレオチド、
そして頻繁には20〜30ヌクレオチドである。遺伝子の小さな領域を分析用に標的
化するとき、短いポリヌクレオチドを使用することができる。遺伝子を全体的に
分析するために、ポリヌクレオチドプローブはエキソン全体又はそれ以上を含ん
でいることができる。プローブは一般的に、放射性ヌクレオチドのようなシグナ
ル発生部分と結合したポリヌクレオチドを含んでいるであろう。
Analytical probes will generally be at least 20 nucleotides in length, although somewhat shorter probes (14-17 nucleotides) can be used. PCR primers are at least 5 nucleotides long, often 15 or more nucleotides,
And often 20-30 nucleotides. Short polynucleotides can be used when targeting small regions of a gene for analysis. For global analysis of the gene, the polynucleotide probe can include whole exons or more. The probe will generally include a polynucleotide associated with the signal-generating moiety, such as a radionucleotide.

【0159】 一般的に、これらの診断方法は、(a)患者から遺伝子試料を取得し;(b)この遺
伝子試料を上記で開示されているようなポリヌクレオチドプローブ又はプライマ
ーと共に、このポリヌクレオチドが相補的ポリヌクレオチド配列とハイブリッド
を形成する条件下でインキュベートして第1の反応産生物を産生させ;そして(c)
この第1の産生物を対照の反応産生物と比較する、段階を含んでいる。上記第1の
産生物と上記対照反応産生物間の差異は患者の遺伝子異常を示している。本発明
の範囲内で使用される遺伝子試料にはゲノムDNA、cDNA及びRNAが含まれる。
Generally, these diagnostic methods involve (a) obtaining a genetic sample from a patient; (b) combining this genetic sample with a polynucleotide probe or primer as disclosed above. Incubating under conditions that hybridize to the complementary polynucleotide sequence to produce a first reaction product; and (c)
A step is included that compares this first product to the control reaction product. The difference between the first product and the control reaction product is indicative of a genetic abnormality in the patient. Genetic samples used within the scope of the present invention include genomic DNA, cDNA and RNA.

【0160】 上記ポリヌクレオチドプローブ又はプライマーはRNA又はDNAであることができ
、そして配列識別番号:1の1部分、配列識別番号:1の相補体又はこれらのRN
A等価物を含んでいるであろう。この点に関する適当なアッセイ方法には当該技
術分野の者に既知の分子遺伝子技術、例えば制限フラグメント長多型(RFLP)分析
、PCR技術を使用する短い縦列反復配列(STR)分析、連結連鎖反応(Barany、PCR M
ethods and Applications 1:5〜16、1991年)、リボヌクレアーゼ保護アッセイ及
び当該技術分野で既知の他の遺伝子結合分析技術(Sambrook等、同上;Ausubel等
、同上;A.J. Marian、Chest 108:255〜265、1995年)が含まれる。
The polynucleotide probe or primer can be RNA or DNA, and can be a portion of SEQ ID NO: 1, the complement of SEQ ID NO: 1 or RNs thereof.
Would include the A equivalent. Suitable assay methods in this regard include molecular genetic techniques known to those of skill in the art, such as restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis, short tandem repeat (STR) analysis using PCR technology, ligation chain reaction ( Barany, PCR M
ethods and Applications 1: 5-16, 1991), ribonuclease protection assays and other gene binding assay techniques known in the art (Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra; AJ Marian, Chest 108: 255-265, 1995) is included.

【0161】 リボヌクレアーゼ保護アッセイ(例えば、Ausubel等、同上、4章参照)は患者R
NA試料に対するRNAプローブのハイブリダイゼーション、そしてその後この反応
産生物(RNA-RNAハイブリッド)をRNアーゼに暴露することを含んでいる。RNAのハ
イブリッド形成領域は消化から保護される。PCRアッセイでは、患者の遺伝子試
料は1対のポリヌクレオチドプライマーと共にインキュベートされ、そしてこれ
らプライマー間の領域は増幅されそして回収される。回収された産生物の大きさ
又は量の変化は患者の突然変異を示している。使用できるもう1つのPCRに基づ
く技術は一本鎖立体配座多型(SSCP)分析(Hayashi、PCR Methods and Applicatio
ns 1:34〜38、1991年)である。
Ribonuclease protection assays (see, eg, Ausubel et al., Ibid., Section 4) are based on patient R
Hybridization of the RNA probe to the NA sample, and then exposing the reaction product (RNA-RNA hybrid) to RNase. The hybridizing region of RNA is protected from digestion. In a PCR assay, a patient gene sample is incubated with a pair of polynucleotide primers and the region between these primers is amplified and recovered. Changes in the size or quantity of the recovered product are indicative of patient mutations. Another PCR-based technique that can be used is single-stranded conformational polymorphism (SSCP) analysis (Hayashi, PCR Methods and Applicatio
ns 1: 34-38, 1991).

【0162】 本発明のポリペプチド、核酸及び/又は抗体は細胞損失又は異常細胞増殖(癌
を含む)に関連した疾患の診断又は治療で使用することができる。標識したzalph
a29ポリペプチドは腫瘍又は他の異常細胞増殖部位の画像化に使用することがで
きる。
The polypeptides, nucleic acids and / or antibodies of the present invention can be used in the diagnosis or treatment of diseases associated with cell loss or abnormal cell proliferation (including cancer). Labeled zalph
The a29 polypeptide can be used to image tumors or other sites of abnormal cell growth.

【0163】 zalpha29活性の阻害剤(zalpha29アンタゴニスト)には抗zalpha29抗体及び可溶
性zalpha29レセプター、並びに他のペプチド及び非ペプチド作用剤(リボザイム
を含む)が含まれる。このようなアンタゴニストを使用して、細胞又は組織に対
するzalpha29の影響を遮断することができる。特に重要なことは、癌治療法にお
いてzalpha29活性のアンタゴニストを使用することである。初期検出方法が改善
されると、腫瘍発生のより早い時期に介在することが可能になり、増殖因子阻害
剤を使用して細胞増殖、血管形成及び腫瘍発生や転移につながる他の事象を遮断
することが実現可能となる。阻害剤はまた、残存している癌細胞の増殖を阻害す
るために手術後の補助療法で有用であることも期待される。阻害剤はまた、他の
癌治療剤と組み合わせて使用することもできる。
Inhibitors of zalpha29 activity (zalpha29 antagonists) include anti-zalpha29 antibodies and soluble zalpha29 receptors, as well as other peptide and non-peptide agonists (including ribozymes). Such antagonists can be used to block the effects of zalpha29 on cells or tissues. Of particular importance is the use of antagonists of zalpha29 activity in cancer therapy. Improved early detection methods could mediate earlier in tumorigenesis and use growth factor inhibitors to block cell proliferation, angiogenesis, and other events that lead to tumorigenesis and metastasis Can be realized. Inhibitors are also expected to be useful in post-surgical adjunct therapy to inhibit the growth of residual cancer cells. Inhibitors can also be used in combination with other cancer therapeutics.

【0164】 zalpha29阻害剤には、抗体に加えて、zalpha29ポリペプチドの小分子阻害剤及
び不活性のレセプター結合フラグメントが含まれる。阻害剤は、阻害剤の正確な
化学的及び物理的性質並びに治療すべき状態を考慮して、上記で一般的に開示さ
れたようにして製薬的用途用に処方される。関連する決定事項は処方化技術分野
の通常の技倆レベルの範囲内である。
Zalpha29 inhibitors include, in addition to antibodies, small molecule inhibitors of zalpha29 polypeptides and inactive receptor-binding fragments. The inhibitor is formulated for pharmaceutical use as generally disclosed above, taking into account the exact chemical and physical properties of the inhibitor and the condition to be treated. Relevant decisions are within the level of ordinary skill in the formulation art.

【0165】 zalpha29ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、zalpha29活性を
高めるか又は阻害することが望ましい遺伝子治療適用の範囲内で有用である。哺
乳動物が突然変異したzalpha29遺伝子を有しているか又は該遺伝子を欠いている
場合、zalpha29遺伝子を上記哺乳動物の細胞内に導入することができる。1つの
実施態様では、zalpha29ポリペプチドをコードしている遺伝子をウイルスベクタ
ー内にインビボで導入する。このようなベクターには弱毒化又は欠損DNAウイル
ス、例えば、ヘルペス単純ウイルス(HSV)、パピローマウイルス、エプスタイン
・バー・ウイルス(EBV)、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス(AAV)等が含まれ
るが、これらに限定されない。
Polynucleotides encoding zalpha29 polypeptides are useful within gene therapy applications where it is desirable to enhance or inhibit zalpha29 activity. When the mammal has a mutated zalpha29 gene or lacks the gene, the zalpha29 gene can be introduced into the cells of the mammal. In one embodiment, the gene encoding the zalpha29 polypeptide is introduced in vivo into a viral vector. Such vectors include attenuated or defective DNA viruses, such as herpes simplex virus (HSV), papilloma virus, Epstein-Barr virus (EBV), adenovirus, adeno-associated virus (AAV), etc. Not limited to.

【0166】 ウイルス遺伝子を完全に、又はほぼ完全に欠いている欠損ウイルスが好ましい
。欠損ウイルスは細胞内への導入後に感染性ではない。欠損ウイルスベクターを
使用することによって、該ベクターが他の細胞を感染する懸念無しに、特定の局
在化領域の細胞への投与が可能となる。特定のベクターの例には欠損ヘルペス単
純ウイルス1(HSV1)ベクター(Kaplitt等、Molec. Cell. Neurosci. 2:320〜330、
1991年);弱毒化アデノウイルスベクター、例えばストラトフォード−ペリコーデ
ット(Stratford-Perricaudet)等、J. Clin. Invest. 90:626〜630、1992年によ
って記載されているベクター;及び欠損アデノ関連ウイルスベクター(Samulski等
、J. Virol. 61:3096〜3101、1987年;Samulski等、J. Virol. 63:3822〜3888、1
989年)が含まれるが、これらに限定されない。
Defective viruses that completely or almost entirely lack viral genes are preferred. Defective viruses are not infectious after introduction into cells. The use of defective viral vectors allows for administration to cells in a particular localized region without the risk of the vector infecting other cells. Examples of specific vectors include deficient herpes simplex virus 1 (HSV1) vector (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2: 320-330,
1991); attenuated adenovirus vectors, such as those described by Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90: 626-630, 1992; and defective adeno-associated virus vectors. (Samulski et al., J. Virol. 61: 3096-3101, 1987; Samulski et al., J. Virol. 63: 3822-3888, 1
989), but is not limited to these.

【0167】 もう1つの実施態様では、zalpha29遺伝子を、例えば、アンダーソン(Anderso
n)等、米国特許第5,399,346号;マン(Mann)等、Cell、33:153、1983年;テミン(Te
min)等、米国特許第4,650,764号;テミン等、米国特許第4,980,289号;マルコヴィ
ッツ(Markowitz)等、J. Virol. 62:1120、1988年;テミン等、米国特許等第5,124
,263号;ダウアーティ(Dougherty)等、WIPO公開WO 95/07358;及びクオ(Kuo)等、B
lood 82:845、1993年によって記載されているようなレトロウイルスベクター内
に導入することができる。或いは、上記ベクターはリポソーム介在トランスフェ
クション(「リポフェクション」)によって導入することができる。
In another embodiment, the zalpha29 gene is cloned into, for example, Anderso (Anderso
n) et al., U.S. Pat.No. 5,399,346; Mann et al., Cell, 33: 153, 1983; Temin (Te
min) et al., U.S. Pat.No. 4,650,764; Temin et al., U.S. Pat.No. 4,980,289; Markowitz et al., J. Virol. 62: 1120, 1988; Temin et al. U.S. Pat.
, 263; Dougherty et al., WIPO published WO 95/07358; and Kuo et al., B
can be introduced into a retroviral vector as described by Lood 82: 845, 1993. Alternatively, the vector can be introduced by liposome-mediated transfection (“lipofection”).

【0168】 合成陽イオン脂質を使用して、マーカーをコードしている遺伝子のインビボト
ランスフェクション用リポソームを調製することができる(Felgner等、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 84:7413〜7417、1987年;Mackey等、Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 85:8027〜8031、1988年)。インビボで特定の器官に外来遺伝子を導入する
ためにリポフェクションを使用することは、特定の細胞に対するリポソームの分
子標的化を含む或る実用的な利点を有している。
Synthetic cationic lipids can be used to prepare liposomes for in vivo transfection of a gene encoding a marker (Felgner et al., Proc. Na.
tl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417, 1987; Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85: 8027-8031, 1988). The use of lipofection to introduce foreign genes into specific organs in vivo has certain practical advantages, including molecular targeting of liposomes to specific cells.

【0169】 トランスフェクションを特定の細胞型に指令することは細胞不均一性を有する
組織、例えば膵臓、肝臓、腎臓及び脳で特に有利である。標的化の目的で、脂質
を他の分子と化学的に結合させることができる。ペプチド及び非ペプチド分子は
リポソームと化学的に結合させることができる。もう1つの実施態様では、細胞
を身体から取り出し、ベクターをネーキドDNAプラスミドとして該細胞内に導入
し、そしてこれら形質転換細胞を上記で開示されたようにして上記身体内に再移
植する。 アンチセンス方法を使用して、上記で一般的に開示されているような患者のza
lpha29遺伝子転写を阻害することができる。
Directing transfection to specific cell types is particularly advantageous in tissues with cell heterogeneity, such as pancreas, liver, kidney and brain. Lipids can be chemically linked to other molecules for the purpose of targeting. Peptide and non-peptide molecules can be chemically linked to liposomes. In another embodiment, the cells are removed from the body, the vector is introduced into the cells as a naked DNA plasmid, and the transformed cells are reimplanted into the body as disclosed above. Using the antisense method, patient za as generally disclosed above.
It can inhibit lpha29 gene transcription.

【0170】 zalpha29ポリペプチド及び抗zalpha29抗体は、医薬品、トキシン、放射性核種
等と直接又は間接的に複合化させることができ、そしてこれら複合体はインビボ
診断又は治療適用に使用することができる。例えば、本発明のポリペプチド又は
抗体を使用して、対応する抗相補的分子(例えば、それぞれレセプター又は抗原)
を発現する組織又は器官を同定し又は治療することができる。更に詳細には、za
lpha29ポリペプチド若しくは抗zalpha29抗体、又はこれらの生物活性フラグメン
ト若しくは部分を、検出可能であるか又は細胞毒性の分子と結合させ、そして上
記抗相補的分子を発現する細胞、組織、又は器官を有する哺乳動物に送達するこ
とができる。
The zalpha29 polypeptides and anti-zalpha29 antibodies can be conjugated directly or indirectly with pharmaceutical agents, toxins, radionuclides, etc., and these conjugates can be used for in vivo diagnostic or therapeutic applications. For example, using a polypeptide or antibody of the invention, the corresponding anti-complementary molecule (e.g., receptor or antigen, respectively)
Can be identified or treated. More specifically, za
a lpha29 polypeptide or anti-zalpha29 antibody, or a biologically active fragment or portion thereof, conjugated to a detectable or cytotoxic molecule, and having a cell, tissue, or organ that expresses the anti-complementary molecule. It can be delivered to an animal.

【0171】 適当な検出可能な分子は上記ポリペプチド又は抗体と直接又は間接的に結合し
ていることができ、そしてこのような分子には放射性核種、酵素、基質、補因子
、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子等が含まれる。適
当な細胞毒性分子は上記ポリペプチド又は抗体と直接又は間接的に結合している
ことができ、そしてこのような分子には細菌又は植物トキシン(例えば、ジフテ
リアトキシン、シュードモナスエキソトキシン、リシン、アブリン、サポリン等
)、並びに治療用放射性核種、例えばヨウ素-131、ルテニウム-188又はイットリ
ウム-90が含まれる。
Suitable detectable molecules can be directly or indirectly bound to the above-described polypeptides or antibodies, and such molecules include radionuclides, enzymes, substrates, cofactors, inhibitors, fluorescent markers. , Chemiluminescent markers, magnetic particles and the like. Suitable cytotoxic molecules can be linked directly or indirectly to the polypeptide or antibody, and such molecules include bacterial or plant toxins (e.g., diphtheria toxin, pseudomonas exotoxin, ricin, abrin, Saporin, etc.
), As well as therapeutic radionuclides such as iodine-131, ruthenium-188 or yttrium-90.

【0172】 これらは上記ポリペプチド若しくは抗体に直接結合することができるか、又は
既知の方法に従って、例えばキレート化部分によって間接的に結合することがで
きる。ポリペプチド又は抗体はまた、細胞毒性医薬品、例えばアドレアマイシン
と複合化させることができる。検出可能な又は細胞毒性の分子の間接的な結合で
は、この検出可能な又は細胞毒性の分子は相補的/抗相補的対の1つのメンバー
と複合化させることができ、その際もう一方のメンバーは上記ポリペプチド又は
抗体部分と結合させる。これらの目的で、ビオチン/ストレプトアビジンは代表
的な相補的/抗相補的対である。
These can be linked directly to the above-mentioned polypeptides or antibodies, or indirectly according to known methods, eg by chelating moieties. The polypeptide or antibody can also be conjugated to a cytotoxic drug, such as adreamycin. For indirect binding of a detectable or cytotoxic molecule, the detectable or cytotoxic molecule can be complexed with one member of a complementary / anti-complementary pair, the other member Binds to the polypeptide or antibody portion. For these purposes, biotin / streptavidin is a typical complementary / anti-complementary pair.

【0173】 ポリペプチド−トキシン融合タンパク質又は抗体/フラグメント−トキシン融
合タンパク質を、標的化した細胞又は組織を阻害又は除去するために、例えば癌
治療法において使用することができる。この点に関して特に重要なものはzalpha
29ポリペプチドとサイトトキシンの複合体であり、そしてこれらを使用してサイ
トトキシンを、望ましくない血管形成又は血管新生を受けている腫瘍又は他の組
織に標的化することができる。標的細胞(即ち、zalpha29レセプターを示してい
るもの)はzalpha29-トキシン複合体と結合し、そしてこの複合体はその後内在化
され、細胞を殺害する。
The polypeptide-toxin fusion protein or antibody / fragment-toxin fusion protein can be used to inhibit or eliminate targeted cells or tissues, for example in cancer therapy. Of particular importance in this regard is zalpha
Complexes of 29 polypeptides with cytotoxins and can be used to target cytotoxins to tumors or other tissues undergoing unwanted angiogenesis or angiogenesis. Target cells (ie, those displaying the zalpha29 receptor) bind to the zalpha29-toxin complex, which is then internalized and kills the cell.

【0174】 レセプター特異的細胞殺害(標的除去)の効果は動物全体の生理学的変化又は組
織学的試験によって明らかにされる。それ故、リガンド依存性の、レセプター指
向細胞毒性を使用してタンパク質リガンドの生理学的重要性の理解を高めること
ができる。このようなトキシンの1つはサポリンである。哺乳動物細胞はサポリ
ンのレセプターを有していないので、サポリンが細胞外に残存しているときでも
非毒性である。
The effects of receptor-specific cell killing (target ablation) are revealed by whole animal physiological changes or histological examination. Therefore, ligand-dependent, receptor-directed cytotoxicity can be used to enhance understanding of the physiological importance of protein ligands. One such toxin is saporin. Mammalian cells do not have the receptor for saporin and are therefore non-toxic even when saporin remains extracellularly.

【0175】 もう1つの実施態様では、zalpha29-サイトカイン融合タンパク質又は抗体/
フラグメント−サイトカイン融合タンパク質は、インビトロ細胞毒性(例えば、
腫瘍標的のモノクローナル抗体によって介在されるもの)を高めるために、そし
て標的組織(例えば、血液及び骨髄癌)のインビボ殺害を高めるために使用するこ
とができる。一般的には、ホーニック(Hornick)等、Blood 89:4437〜4447、1997
年参照。一般的に、サイトカインは全身的に投与された場合に、毒性である。記
載された融合タンパク質は所望の作用部位、例えばzalpha29用の結合部位を有す
る細胞にサイトカインを標的化し、そしてそれによってサイトカインの局所濃度
を高めることができる。
In another embodiment, the zalpha29-cytokine fusion protein or antibody /
Fragment-cytokine fusion proteins are labeled with in vitro cytotoxicity (e.g.,
It can be used to enhance tumor targeting monoclonal antibody mediated) and to enhance in vivo killing of target tissues (eg, blood and bone marrow cancer). In general, Hornick et al., Blood 89: 4437-4447, 1997.
See year. Cytokines are generally toxic when administered systemically. The described fusion proteins can target the cytokine to cells having the desired site of action, eg the binding site for zalpha29, and thereby increase the local concentration of the cytokine.

【0176】 この目的のためのサイトカインには、例えば、インターロイキン-2及び顆粒球
−マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)が含まれる。このような融合タンパ
ク質を使用して、血管形成又は血管新生を受けている腫瘍及び他の組織のサイト
カイン誘導性殺害を引き起こすことができる。 本明細書に記載した生物活性ポリペプチド又は抗体複合体は静脈内、動脈内又
は導管内に送達することができるか、又は意図された作用部位に局所的に導入す
ることができる。 本発明は以下の非限定的な実施例によって更に説明される。 実施例実施例1. zalpha29のノーザンブロット分析は、ヒトRNAの商業的に製造されたブロット(
ヒト多組織ノーザンブロット(Human Multiple Tissue Northern Blot)I、II及び
III;ヒト胎児多組織ノーザンブロット(Human Fetal Multiple Tissue Northern
Blot)II;並びにヒトRNAマスターブロット(Human RNA Master Blot);Clontech La
boratories, Inc.、カリフォルニア州パロアルト)を使用して実施した。
Cytokines for this purpose include, for example, interleukin-2 and granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF). Such fusion proteins can be used to cause cytokine-induced killing of tumors and other tissues undergoing angiogenesis or angiogenesis. The bioactive polypeptide or antibody conjugates described herein can be delivered intravenously, intraarterially or intraductally, or can be locally introduced at the intended site of action. The present invention is further described by the following non-limiting examples. EXAMPLES Example 1. Northern blot analysis of zalpha29 was performed on commercially produced blots of human RNA (
Human Multiple Tissue Northern Blot I, II and
III; Human Fetal Multiple Tissue Northern Blot
Blot) II; and Human RNA Master Blot; Clontech La
boratories, Inc., Palo Alto, Calif.).

【0177】 zalpha29のハイブリダイゼーションプローブはゲル精製PCR増幅産生物として
生じさせた。この増殖産生物は、PCRプライマーとしてオリゴヌクレオチドZC21,
720(配列識別番号:8)及びZC21,721(配列識別番号:9)を使用し、そして鋳型とし
てクローン化zalpha29 cDNA(配列識別番号:1参照)を使用して作製した。PCR増幅
は次のようにして実施した:zalpha29 cDNA 1μl(約2ng)並びにオリゴヌクレオチ
ドプライマーZC21,720及びZC21,721各40pmolを、商業的に入手可能な試薬(Advan
tage(商標)KlenTaq Polymerase Kit、Clontech Laboratories, Inc.)を含有して
いる反応混合物に製造者の推奨プロトコルに従って加えた。
The zalpha29 hybridization probe was generated as a gel-purified PCR amplification product. This growth product was labeled with the oligonucleotide ZC21, as a PCR primer.
720 (SEQ ID NO: 8) and ZC21,721 (SEQ ID NO: 9) were used and made using the cloned zalpha29 cDNA (see SEQ ID NO: 1) as template. PCR amplification was carried out as follows: 1 μl of zalpha29 cDNA (about 2 ng) and 40 pmol each of the oligonucleotide primers ZC21,720 and ZC21,721 were prepared using commercially available reagents (Advan
tage ™ KlenTaq Polymerase Kit, Clontech Laboratories, Inc.) was added according to the manufacturer's recommended protocol.

【0178】 この反応は次のようにして行った:94℃で30秒間、94℃で5秒、55℃で5秒及
び68℃で1分間を25サイクル、続いて68℃で3分間、そして4℃での維持。422b
pのPCR増幅フラグメントをゲル精製し、そしてシリカゲル粒子(QIAEX(登録商標)
IIゲル抽出キット;Qiagen、カリフォルニア州バレンシア)を製造者の推奨プロト
コルに従って使用して回収した。
The reaction was carried out as follows: 94 ° C. for 30 seconds, 94 ° C. for 5 seconds, 55 ° C. for 5 seconds and 68 ° C. for 1 minute for 25 cycles, followed by 68 ° C. for 3 minutes, and Maintain at 4 ° C. 422b
The PCR amplified fragment of p was gel purified and silica gel particles (QIAEX®).
II gel extraction kit; Qiagen, Valencia, Calif.) Was used according to the manufacturer's recommended protocol.

【0179】 上記プローブを商業的に入手可能なキット(Rediprime(商標)IIランダム−プラ
イム標識化システム;Amersham Corp.、イリノイ州アーリントンハイツ)を製造者
のプロトコルに従って使用して放射性標識した。このプローブを、商業的に入手
可能なプッシュカラム(NucTrap(登録商標)カラム;Stratagene、カリフォルニア
州ラホラ;米国特許第5,336,412号参照)を使用して精製した。ハイブリダイゼー
ション溶液(ExpressHyb(商標)Hybridization Solution;Clontech Laboratories,
Inc.)をノーザンブロットのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼー
ション溶液用に使用した。
The probe was radiolabeled using a commercially available kit (Rediprime ™ II random-prime labeling system; Amersham Corp., Arlington Heights, IL) according to the manufacturer's protocol. The probe was purified using a commercially available push column (NucTrap® column; Stratagene, La Jolla, Calif .; see US Pat. No. 5,336,412). Hybridization Solution (ExpressHybTM Hybridization Solution; Clontech Laboratories,
Inc.) was used for Northern blot prehybridization and hybridization solutions.

【0180】 ハイブリダイゼーションは65℃で一夜行った。ハイブリダイゼーション後、ブ
ロットを2×SSC、0.1%SDS中室温で洗浄し、続いて0.1×SSC及び0.1%SDS中50℃
で洗浄した。これらのブロットをフィルム(BIOMAX、Eastman Kodak、コネティカ
ット州ニューヘブン)に暴露した。 一夜暴露することによって全てのブロットの各レーンに概ね870塩基のバンド
が示された。RNAマスターブロットの各RNA試料は陽性であり、一方陰性対照は陰
性であった。
Hybridization was carried out at 65 ° C. overnight. After hybridization, the blots were washed in 2 × SSC, 0.1% SDS at room temperature, then in 0.1 × SSC and 0.1% SDS at 50 ° C.
Washed with. The blots were exposed to film (BIOMAX, Eastman Kodak, New Haven, CT). Overnight exposure showed a band of approximately 870 bases in each lane of all blots. Each RNA sample on the RNA master blot was positive, while the negative control was negative.

【0181】 ノーザン法で陽性の組織には心臓、卵巣、胎児肺、脳、小腸、胎児肝臓、胎盤
、結腸(粘膜内張り)、胎児腎臓、肺、末梢血白血球、肝臓、胃、骨格筋、甲状腺
、腎臓、脊髄、膵臓、リンパ節、脾臓、気管、胸腺、副腎、前立腺、骨髄、精巣
、胎児脳が含まれていた。 RNAマスターブロットで陽性であったがノーザン法ではそうでなかった組織に
は扁桃体、大動脈、尾状核、膀胱、小脳、子宮、大脳皮質、下垂体、前頭葉、唾
液腺、海馬、乳腺、延髄、盲腸、後頭葉、気管、被殻、胎児心臓、黒質、胎児脾
臓、視床、胎児胸腺及び視床下部核が含まれていた。
Tissues positive by Northern method include heart, ovary, fetal lung, brain, small intestine, fetal liver, placenta, colon (mucosal lining), fetal kidney, lung, peripheral blood leukocytes, liver, stomach, skeletal muscle, thyroid gland. , Kidney, spinal cord, pancreas, lymph node, spleen, trachea, thymus, adrenal gland, prostate, bone marrow, testis, fetal brain. Tissues that were positive by RNA master blot but not Northern were amygdala, aorta, caudate, bladder, cerebellum, uterus, cerebral cortex, pituitary, frontal lobe, salivary gland, hippocampus, mammary gland, medulla oblongata, cecum. , Occipital lobe, trachea, putamen, fetal heart, substantia nigra, fetal spleen, thalamus, fetal thymus and hypothalamic nucleus.

【0182】 これらノーザンブロットはヒトトランスフェリンレセプターについてプローブ
で再度検査した。トランスフェリンレセプタープローブから発生して得られたシ
グナルを使用してzalpha29シグナルを標準化した。zalpha29シグナル対トランス
フェリンレセプターシグナルの比率が最大の組織は心臓、肝臓及び精巣であった
These Northern blots were probed again for the human transferrin receptor. The signal obtained from the transferrin receptor probe was used to normalize the zalpha29 signal. The tissues with the highest ratio of zalpha29 signal to transferrin receptor signal were heart, liver and testis.

【0183】実施例2. zalpha29を、スタンフォードG3ラディエーションハイブリッドマッピングパネ
ル(Stanford G3 Radiation Hybrid Mapping Panel)(Research Genetics, Inc.、
アラバマ州ハンツビル)の商業的に入手可能なものを使用して染色体2にマップし
た。このパネルは全ヒトゲノムの83個の照射ハイブリッドクローンの各々から得
られたPCR可能なDNAと2個の対照DNA(RMドナー及びA3レシピエント)を含有してい
る。公に入手可能なWWWサーバー(http://shgc-www.stanford.edu)によってマー
カーの染色体位置を決定することができる。
Example 2. zalpha29 was added to Stanford G3 Radiation Hybrid Mapping Panel (Research Genetics, Inc.,
Mapped to Chromosome 2 using commercially available ones from Huntsville, AL). This panel contains PCR-capable DNA from each of the 83 irradiated hybrid clones of the entire human genome and two control DNAs (RM donor and A3 recipient). The chromosomal location of the marker can be determined by publicly available WWW servers (http://shgc-www.stanford.edu).

【0184】 スタンフォードG3RHパネルを使用してzalpha29をマップするために、反応混合
物20μlをPCR可能な96ウエル微量滴定プレート(Stratagene、カリフォルニア州
ラホラ)に入れ、そして熱サイクラー(RoboCycler(登録商標)Gradient 96;Strata
gene)中で使用した。85個のPCR反応物は各々、緩衝液(10×KlenTaq PCR反応緩衝
液;Clontech Laboratories, Inc.、カリフォルニア州パロアルト)2μl、dNTPミ
ックス(各2.5mM、Perkin-Elmer、カリフォルニア州フォスターシティ)1.6μl、
センスプライマーZC22,737(配列識別番号:10)1μl、アンチセンスプライマーZC2
2,738(配列識別番号:11)1μl、密度増加剤及びトラッキング染料(RediLoad、Res
earch Genetics, Inc.、アリゾナ州ハンツビル)2μl、商業的に入手可能なDNAポ
リメラーゼ/抗体ミックス(50×Advantage(商標)KlenTaq Polymerase Mix;Clont
ech Laboratories, Inc.)0.4μl、個々のハイブリッドクローン又は対照から得
られるDNA 25ng、並びにddH2O xμlの総容量20μlからなっていた。
To map zalpha29 using the Stanford G3RH panel, 20 μl of the reaction mixture was placed in a PCR-able 96-well microtiter plate (Stratagene, La Jolla, Calif.) And a thermocycler (RoboCycler® Gradient 96 ; Strata
gene). Each of the 85 PCR reactions was 2 μl of buffer (10 × KlenTaq PCR reaction buffer; Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, Calif.), DNTP mix (2.5 mM each, Perkin-Elmer, Foster City, Calif.) 1.6 μl. ,
Sense primer ZC22,737 (SEQ ID NO: 10) 1 μl, antisense primer ZC2
2,738 (SEQ ID NO: 11) 1 μl, density increasing agent and tracking dye (RediLoad, Res
earch Genetics, Inc., Huntsville, Ariz.) 2 μl, commercially available DNA polymerase / antibody mix (50 × Advantage ™ KlenTaq Polymerase Mix; Clont
ech Laboratories, Inc.) 0.4 μl, 25 ng of DNA from individual hybrid clones or controls, and a total volume of 20 μl of ddH 2 O x μl.

【0185】 これらの混合物に等量の鉱物油を積層しそして密封した。PCRサイクラー条件
は次のとおりであった:94℃で5分の初期変性、94℃で45秒の変性、64℃で45秒
のアニーリング及び72℃で75秒の伸長を35サイクル;続いて72℃で7分間の最終
伸長。これらの反応物を2%アガロースゲル(Life Technologies、メリーランド州
ガイザースバーグから得た)での電気泳動で分離した。 これらの結果は、zalpha29が染色体2フレームワークマーカーSHGC-30949と>1
1のLODスコアでそして上記マーカーから0cR 10000の距離での結合を示した。物
理的にマップされている周辺遺伝子を使用してzalpha29を染色体2の2p16-p15領
域に位置づける。
Equal amounts of mineral oil were laminated to these mixtures and sealed. The PCR cycler conditions were as follows: 5 cycles of initial denaturation at 94 ° C for 5 minutes, denaturation at 94 ° C for 45 seconds, annealing at 64 ° C for 45 seconds and extension at 72 ° C for 75 seconds for 35 cycles; followed by 72 Final extension for 7 minutes at ° C. The reactions were separated by electrophoresis on a 2% agarose gel (obtained from Life Technologies, Gaithersburg, MD). These results show that zalpha29 is> 1 with chromosome 2 framework marker SHGC-30949.
0cR with LOD score of 1 and from the above marker It showed binding at a distance of 10000. Localizes zalpha29 to the 2p16-p15 region of chromosome 2 using a physically mapped peripheral gene.

【0186】実施例3. マウスzalpha29のタンパク質コード化領域は、FseI及びAscI制限部位をそれぞ
れ5’及び3’末端に加えたプライマーを使用してPCRで増幅した。PCRプライマー
ZC23019(配列識別番号:12)及びZC23018(配列識別番号:13)は、全長マウスzalpha
29 cDNAを含有する鋳型プラスミド(pT7T3D-Pac)と共にPCR反応で次のようにして
使用した:95℃で5分間を1サイクル;続いて95℃で0.5分間、58℃で0.5分間及び72
℃で0.5分間を15サイクル;続いて72℃で7分間;続いて4℃で浸漬。このPCR反応産
生物をTAE緩衝液(0.04M トリス−アセテート、0.001M EDTA)中1.2%の(低溶融)ア
ガロース(SeaPlaque(登録商標)GTG;FMC Corp.、メイン州ロックランド)ゲル上に
負荷した。zalpha29PCR産生物を上記ゲルから切り出した。
Example 3. The protein coding region of mouse zalpha29 was amplified by PCR using primers with FseI and AscI restriction sites added to the 5'and 3'ends, respectively. PCR primer
ZC23019 (SEQ ID NO: 12) and ZC23018 (SEQ ID NO: 13) are full-length mouse zalpha
Used in a PCR reaction with a template plasmid containing 29 cDNA (pT7T3D-Pac) as follows: 1 cycle of 95 ° C for 5 minutes; followed by 95 ° C for 0.5 minutes, 58 ° C for 0.5 minutes and 72
15 cycles of 0.5 min at ℃; then 7 min at 72 ℃; then soak at 4 ℃. The PCR reaction product was loaded onto 1.2% (low melting) agarose (SeaPlaque® GTG; FMC Corp., Rockland, ME) gel in TAE buffer (0.04M Tris-acetate, 0.001M EDTA). did. The zalpha29 PCR product was excised from the gel.

【0187】 このゲルスライスを65℃で溶融し、そしてDNAをフェノールで2回抽出し、そ
してエタノールで沈殿させた。次いで、PCR産生物をFseI+AscIで消化し、フェノ
ール/クロロホルムで抽出し、EtOHで沈殿させ、そしてTE(トリス/EDTA pH8)20
μl中で再度水和化させた。次に、567bpのzalpha29フラグメントを修飾pAdTrack
CMV(He等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509〜2514、1998年)のFseI-AscI
部位に結合させた。この構築物はグリーン蛍光タンパク質(GFP)マーカー遺伝子
も含有していた。GFP発現を行わせるCMVプロモーターをSV40プロモーターで置換
し、そしてSV40ポリアデニル化シグナルはヒト成長ホルモンポリアデニル化シグ
ナルで置換した。加えて、天然のポリリンカーはFseI、EcoRV及びAscI部位で置
換した。
The gel slice was melted at 65 ° C. and the DNA was extracted twice with phenol and ethanol precipitated. The PCR product was then digested with FseI + AscI, phenol / chloroform extracted, EtOH precipitated, and TE (Tris / EDTA pH8) 20.
Rehydrated in μl. Next, modify the 567 bp zalpha29 fragment with pAdTrack.
CMV (He et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2509-2514, 1998) FseI-AscI
Bound to the site. This construct also contained the green fluorescent protein (GFP) marker gene. The CMV promoter driving GFP expression was replaced with the SV40 promoter, and the SV40 polyadenylation signal was replaced with the human growth hormone polyadenylation signal. In addition, the natural polylinker was replaced with FseI, EcoRV and AscI sites.

【0188】 pAdTrack CMVのこの修飾形態はpZyTrackと命名した。結合はDNA結合及びスク
リーニングキット(Fast-Link(商標);Epicentre Technologies、ウィスコンシン
州マディソン)を使用して行った。zalpha29 cDNAを含有するクローンは標準的な
ミニ−プレプ方法で同定した。プラスミドを線状化するために、pZyTrack zalph
a29プラスミド約5μgをPmeIで消化した。線状化したプラスミド約1μgを超コイ
ル化したpAdEasy(He等、同上)200ngと共にBJ5183細胞内にコトランスフォームし
た。このコトランスフォーメーションは2.5kV、200オーム及び25μFaのエレクト
ロポレーター(Gene Pulser(登録商標);Bio-Rad Laboratories, Inc.、カリフォ
ルニア州ハーキュールズ)を使用して実施した。
This modified form of pAdTrack CMV was named pZyTrack. Binding was performed using a DNA binding and screening kit (Fast-Link ™; Epicentre Technologies, Madison, WI). Clones containing the zalpha29 cDNA were identified by standard mini-prep methods. To linearize the plasmid, pZyTrack zalph
About 5 μg of a29 plasmid was digested with PmeI. Approximately 1 μg of the linearized plasmid was cotransformed into BJ5183 cells with 200 ng of supercoiled pAdEasy (He et al., Ibid.). This cotransformation was performed using a 2.5 kV, 200 ohm and 25 μFa electroporator (Gene Pulser®; Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, Calif.).

【0189】 コトランスフォーメーション混合物全体を、カナマイシン25μg/mlを含有す
る4LBプレートに播種した。最小コロニーを取り出してLB/カナマイシン中で拡
張させ、そして組換えアデノウイルスDNAを標準的なDNAミニプレプ方法で同定し
た。FseI+AscIによる組換えアデノウイルスDNAの消化でzalpha29配列の存在が確
認された。組換えアデノウイルスミニプレプDNAを大腸菌宿主細胞(DH10B(商標);
Life Technologies、メリーランド州ガイザースバーグ)中に形質転換し、そして
DNAは商業的に入手可能なプラスミド単離キット(QIAGEN(登録商標)Plasmid Maxi
Kit;Qiagen, Inc.、カリフォルニア州バレンシア)を供給者によって指示されて
いるようにして使用して調製した。
The entire cotransformation mixture was plated on 4LB plates containing 25 μg / ml kanamycin. Minimal colonies were picked, expanded in LB / kanamycin, and recombinant adenovirus DNA was identified by standard DNA miniprep methods. Digestion of recombinant adenovirus DNA with FseI + AscI confirmed the presence of the zalpha29 sequence. Recombinant adenovirus miniprep DNA was added to E. coli host cells (DH10BTM;
Life Technologies, Gaithersburg, Md.) And
DNA is a commercially available plasmid isolation kit (QIAGEN® Plasmid Maxi
Kit; Qiagen, Inc., Valencia, CA) was used as directed by the supplier.

【0190】 約5μgの組換えアデノウイルスDNAは、PacI酵素(New England Biolabs)を使用
して、20〜30UのPacIを含有する100μlの反応容量中37℃で3時間消化した。消
化したDNAを等量のフェノール/クロロホルムで2回抽出しそしてエタノールで沈
殿させた。このDNAペレットを蒸留水5μl中に再度懸濁した。前日に接種しそし
て60〜70%の集密度まで増殖させたQBI-293A細胞(Quantum Biotechnologies, Inc
.、カナダ国モントリオール)のT25フラスコをPacI消化DNAでトランスフェクショ
ンした。このPacI消化DNAは滅菌HBS(150mMのNaCl、20mMのヘペス)を使用して50
μlの総容量にまで希釈した。
About 5 μg of recombinant adenovirus DNA was digested with PacI enzyme (New England Biolabs) in a reaction volume of 100 μl containing 20-30 U of PacI for 3 hours at 37 ° C. The digested DNA was extracted twice with an equal volume of phenol / chloroform and ethanol precipitated. This DNA pellet was resuspended in 5 μl of distilled water. QBI-293A cells seeded the day before and grown to 60-70% confluence (Quantum Biotechnologies, Inc.
, Montreal, Canada) T25 flasks were transfected with PacI digested DNA. This PacI-digested DNA was prepared using sterile HBS (150 mM NaCl, 20 mM Hepes).
Diluted to a total volume of μl.

【0191】 別の管に、1mg/mlのN-[1-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメ
チル−アンモニウム塩(DOTAP)(Boehringer Mannheim、インディアナ州インディ
アナポリス)25μlを、HBSを用いて100μlの総容量にまで希釈した。このDOTAPに
DNAを加え、ピペットで上下させて静かに混合し、そして室温で15分間放置した
。培地を293A細胞から除去し、そしてこれらの細胞を、1mMのピルビン酸ナトリ
ウム、0.1mMのMEM非必須アミノ酸及び25mMヘペス緩衝液を含有する血清不含MEM
アルファ5mlで洗浄した(培地構成成分はLife Technologies、メリーランド州ガ
イザースバーグから得た)。
In a separate tube, 1 mg / ml of N- [1- (2,3-dioleoyloxy) propyl] -N, N, N-trimethyl-ammonium salt (DOTAP) (Boehringer Mannheim, Indiana, Ind. 25 μl of police) was diluted with HBS to a total volume of 100 μl. To this DOTAP
DNA was added, gently pipetted up and down, and left at room temperature for 15 minutes. Media was removed from 293A cells, and these cells were serum free MEM containing 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM MEM non-essential amino acids and 25 mM Hepes buffer.
Washed with 5 ml alpha (medium components were obtained from Life Technologies, Gaithersburg, MD).

【0192】 血清不含MEM 5mlを293A細胞に加え、そして37℃で維持した。DNA/脂質混合物
を293A細胞のT25フラスコに滴下して加え、静かに混合し、そして37℃で4時間イ
ンキュベートした。4時間後、DNA/脂質混合物を含有する培地を吸引除去し、
そして5%ウシ胎児血清を含有する完全MEM 5mlで置き換えた。トランスフェクシ
ョンされた細胞はGFP発現及びフォーカス(ウイルスプラーク)形成についてモニ
ターした。
5 ml of serum-free MEM was added to 293A cells and maintained at 37 ° C. The DNA / lipid mixture was added drop-wise to a T25 flask of 293A cells, mixed gently and incubated at 37 ° C for 4 hours. After 4 hours, aspirate the medium containing the DNA / lipid mixture,
Then replaced with 5 ml of complete MEM containing 5% fetal bovine serum. Transfected cells were monitored for GFP expression and foci (viral plaque) formation.

【0193】 組換えアデノウイルスDNAで293A細胞をトランスフェクションして7日後に、
細胞はGFPを発現しそしてフォーカスを形成し始めた。この粗製のウイルス溶解
物を細胞スクレイパーで集め、そして50mlの円錐管に移した。これら細胞から大
部分のウイルス粒子を放出させるために、ドライアイス/エタノール浴及び37℃
の水浴中で冷凍/解凍サイクルを3回行った。
Seven days after transfection of 293A cells with recombinant adenovirus DNA,
The cells expressed GFP and began to form foci. The crude viral lysate was collected with a cell scraper and transferred to a 50 ml conical tube. Dry ice / ethanol bath and 37 ° C to release most viral particles from these cells
The freeze / thaw cycle was performed 3 times in the water bath.

【0194】 上記の粗製溶解物を増幅させて(最初(1°)の増幅)、zalpha29組換えアデ
ノウイルス(rAdV)溶解物の有効な「ストック」を得た。ほぼ集密な(80〜90%)293
A細胞の10cmプレートを20時間前にセットした。粗製rAdV溶解物200mlを各10cmプ
レートに加え、そしてこれらのプレートをCPE(細胞変性効果)について白色光顕
微鏡下で、そしてGFPの発現について蛍光顕微鏡下で48〜72時間モニターした。2
93A細胞が全てCPEを示したとき、1°のストック溶解物を集め、そして冷凍/解
凍サイクルを上記のようにして行った。
The above crude lysate was amplified (first (1 °) amplification) to yield an effective “stock” of zalpha29 recombinant adenovirus (rAdV) lysate. Nearly congested (80-90%) 293
A 10 cm plate of A cells was set 20 hours before. 200 ml of crude rAdV lysate was added to each 10 cm plate and these plates were monitored under a white light microscope for CPE (cytopathic effect) and under a fluorescence microscope for expression of GFP for 48-72 hours. 2
When 93A cells all showed CPE, 1 ° stock lysates were collected and freeze / thaw cycles were performed as described above.

【0195】 2度目(2°)の増幅では、293A細胞の20個の15cm組織培養皿を、細胞が80〜
90%集密になるように調製した。5%MEM培地は20mlを除いて全て除去し、そして各
皿に1°の増幅rAdv溶解物300〜500mlを接種した。48時間後、これらの細胞はウ
イルス産生によって溶解された。この溶解物を250mlのポリプロピレン遠心分離
瓶中に集めた。
In the second round (2 °) amplification, 20 15 cm tissue culture dishes of 293A cells were plated with 80-80 cells.
It was prepared to be 90% confluent. All but 20 ml of 5% MEM medium was removed and each dish was inoculated with 300-500 ml of 1 ° amplified rAdv lysate. After 48 hours, these cells were lysed by virus production. The lysate was collected in a 250 ml polypropylene centrifuge bottle.

【0196】 rAdVを精製するために、NP-40洗浄剤を上記の粗製溶解物の瓶に0.5%の最終濃
度になるまで加えて全ての細胞を溶解させた。瓶は回転プラットフォーム上に、
瓶を倒さないでできるだけ速く撹拌しながら10分間置いた。20,000×Gで15分間
遠心分離して破砕屑をペレット化した。上清液を250mlのポリカーボネート遠心
分離瓶に移し、そして0.5容量の20%PEG-8000/2.5M NaCl溶液を加えた。瓶を氷
上で一夜振とうした。これらの瓶を20,000×Gで15分間遠心分離し、そして上清
液を漂白溶液中に廃棄した。滅菌細胞スクレイパーを使用して、2個の瓶から得
られた沈殿物を2.5mlのPBSに再度懸濁した。
To purify rAdV, NP-40 detergent was added to the above crude lysate bottle to a final concentration of 0.5% to lyse all cells. The bottle is on a rotating platform,
The bottle was left for 10 minutes with stirring as fast as possible without tipping. The debris was pelleted by centrifugation at 20,000 x G for 15 minutes. The supernatant was transferred to a 250 ml polycarbonate centrifuge bottle and 0.5 volume of 20% PEG-8000 / 2.5M NaCl solution was added. The bottle was shaken on ice overnight. The bottles were centrifuged at 20,000 x G for 15 minutes and the supernatant was discarded in bleach solution. The precipitate from the two bottles was resuspended in 2.5 ml PBS using a sterile cell scraper.

【0197】 このウイルス溶液を2mlの微量遠心分離管に入れ、そして14,000×Gで10分間遠
心分離して更なる細胞屑を全て除去した。2mlの微量遠心分離管から得られた上
清液を15mlのポリプロピレンスナップキャップ管に移し、そしてCsClで1.34g/m
lの密度に調節した。ウイルス溶液の容量を概算し、そして0.55g/mlのCsClを加
えた。CsClを溶解し、そしてこの溶液1mlは1.34gの重量であった。この溶液をポ
リカーボネート厚壁遠心分離管(3.2ml;Beckman #362305)に移し、そしてTLA-100
.4ローターを使用してベックマンオプチマ(Beckman Optima)TLX微量超遠心分離
機中25℃、348,000×Gで3〜4時間回転させた。このウイルスは白色バンドを形成
した。大きな内腔のピペット先端部を使用して、このウイルスバンドを集めた。
The virus solution was placed in a 2 ml microcentrifuge tube and centrifuged at 14,000 × G for 10 minutes to remove any additional cell debris. Transfer the supernatant from a 2 ml microcentrifuge tube to a 15 ml polypropylene snap cap tube and 1.34 g / m 2 with CsCl.
The density was adjusted to l. The volume of virus solution was estimated and 0.55 g / ml CsCl was added. CsCl was dissolved, and 1 ml of this solution weighed 1.34 g. Transfer this solution to a polycarbonate thick-wall centrifuge tube (3.2 ml; Beckman # 362305) and TLA-100.
Spin at 348,000 x G for 3-4 hours in a Beckman Optima TLX microcentrifuge using a .4 rotor at 25 ° C. The virus formed a white band. The viral band was collected using a large lumen pipette tip.

【0198】 上記ウイルス調製物は、商業的に入手可能なカラム及び交差結合デキストラン
培地(Sephadex(登録商標)G-25Mを予めパックしたPD-10カラム;Pharmacia、ニュ
ージャージー州ピスカッタウェイ)を使用してゲルろ過によって脱塩した。カラ
ムをPBS 20mlで平衡化させた。上記ウイルスを負荷し、そしてウイルスがカラム
を流れるようにする。このカラムにPBS 5mlを加え、そして8〜10滴のフラクシ
ョンを集めた。各フラクションの1:50希釈物の光学密度を分光光度計で260nmで
測定した。
The above virus preparations used commercially available columns and cross-linked dextran medium (PD-10 columns pre-packed with Sephadex® G-25M; Pharmacia, Piscataway, NJ). Desalted by gel filtration. The column was equilibrated with 20 ml PBS. Load the virus and allow the virus to flow through the column. 5 ml PBS was added to the column and 8-10 drops of fractions were collected. The optical density of the 1:50 dilution of each fraction was measured spectrophotometrically at 260 nm.

【0199】 明確な吸光度ピークはフラクション7〜12間に存在していた。これらのフラク
ションを集め、そして1:25希釈物の光学密度(OD)を測定した。ウイルス濃度は次
式によって決定した:(250nmでのOD)(25)(1.1×1012)=ビリオン/ml。zalpha29 r
AdVの1:25希釈物のODは0.059であり、3.3×1012ビリオン/mlのウイルス濃度が
得られた。 ウイルスを保存するために、グリセリンを15%の最終濃度になるまで上記精製
ウイルスに加え、静かにではあるが効果的に混合し、そして小分けして-80℃で
保存した。
A clear absorbance peak was present between fractions 7-12. These fractions were collected and the optical density (OD) of the 1:25 dilution was measured. Virus concentrations were determined by the following formula: (OD at 250nm) (25) (1.1 × 10 12) = virions / ml. zalpha29 r
The OD of the 1:25 dilution of AdV was 0.059, resulting in a virus concentration of 3.3 × 10 12 virions / ml. To preserve the virus, glycerin was added to the purified virus to a final concentration of 15%, gently but effectively mixed and aliquoted and stored at -80 ° C.

【0200】 クウォンタム・バイオテクノロジーズ、インク.(Quantum Biotechnologies In
c.)(カナダ国モントリオール)が開発したプロトコルに従って組換えウイルスの
感染性を測定した。簡単に述べると、2個の96ウエル組織培養プレートに、アッ
セイすべき各組換えウイルスに対して、2%ウシ胎児血清を含有するMEM中で1ウ
エル当たり1×104個の293A細胞を播種した。24時間後、1×10-2から1×10-14 までの各ウイルス10倍希釈物を2%ウシ胎児血清含有MEM中で作製した。各希釈物1
00μlを20ウエルの各々に入れた。37℃で5日後、ウエルはCPEについて陽性であ
るのか又は陰性であるのかを読み取り、そしてプラーク形成単位/ml(PFU)の値
を計算した。
Quantum Biotechnologies Ink.
c.) (In Montreal, Canada) The infectivity of the recombinant virus was measured according to the protocol developed. Briefly, two 96-well tissue culture plates were seeded with 1 × 10 4 293A cells per well in MEM containing 2% fetal bovine serum for each recombinant virus to be assayed. did. After 24 hours, a 10-fold dilution of each virus from 1 × 10 −2 to 1 × 10 −14 was made in MEM containing 2% fetal bovine serum. Each dilution 1
00 μl was placed in each of 20 wells. After 5 days at 37 ° C, the wells were read as positive or negative for CPE and plaque forming unit / ml (PFU) values were calculated.

【0201】 使用したTCID50の公式化は上記クウォンタム・バイオテクノロジーズ、インク
.に従った。力価(T)は、使用したウイルスが10-2から10-14まで希釈されている
プレートから測定し、そして感染して5日後に読み取った。各希釈で、総ウエル
数当たりのCPE陽性ウエルの比率(R)を測定した。 非希釈ウイルス試料の力価を計算するために:ファクター、「F」=1+d(S-0.5);
式中、「S」は比率(R)の合計であり;そして「d」は希釈シリーズのLog10であ
る、例えば、「d」は10倍希釈シリーズでは1に等しい。非希釈試料の力価はT=1
0(1+F)=TCID50/mlである。TCID50/mlをpfu/mlに変換するためには、力価(T)
の計算におけるべき指数から0.7を差し引く。
The TCID 50 used was formulated by Quantum Biotechnology, Inc.
According to. Titers (T) were measured from plates in which the virus used was diluted from 10 −2 to 10 −14 and read 5 days after infection. At each dilution, the ratio (R) of CPE positive wells to the total number of wells was measured. To calculate the titer of undiluted virus sample: Factor, "F" = 1 + d (S-0.5);
Where "S" is the sum of the ratios (R); and "d" is Log10 of the dilution series, eg "d" is equal to 1 in the 10-fold dilution series. T = 1 for undiluted sample
0 (1 + F) = TCID 50 / ml. To convert TCID 50 / ml to pfu / ml, titer (T)
Subtract 0.7 from the exponent in the calculation of.

【0202】 zalpha29アデノウイルスは1.3×1010pfu/mlの力価を有していた。 上記から、本発明の特定の実施態様は説明の目的で本明細書に記載されている
が、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく種々の修正を行い得ることが理
解されよう。従って、本発明は上記特許請求の範囲による場合を除いて限定され
ない。
The zalpha29 adenovirus had a titer of 1.3 × 10 10 pfu / ml. From the foregoing, it will be appreciated that while particular embodiments of the invention have been described herein for purposes of illustration, various modifications can be made without departing from the spirit and scope of the invention. Accordingly, the invention is not limited except as by the following claims.

【配列表】 [Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図1A】 図1Aは、配列番号2において示されるアミノ酸配列のHopp/Woods親水性プロフ
ィールである。プロフィールは、スライディングする6残基ウインドウに基づく
。包埋されるG、S、およびT残基、ならびに曝露されるH、Y、およびW残基
は無視された。これらの残基は、小文字によって図中に示される。
FIG. 1A is a Hopp / Woods hydrophilicity profile of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. The profile is based on a sliding 6 residue window. Embedded G, S, and T residues and exposed H, Y, and W residues were ignored. These residues are indicated in the figure by lower case letters.

【図1B】 図1Bは、配列番号2において示されるアミノ酸配列のHopp/Woods親水性プロフ
ィールである。プロフィールは、スライディングする6残基ウインドウに基づく
。包埋されるG、S、およびT残基、ならびに曝露されるH、Y、およびW残基
は無視された。これらの残基は、小文字によって図中に示される。
FIG. 1B is the Hopp / Woods hydrophilicity profile of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. The profile is based on a sliding 6 residue window. Embedded G, S, and T residues and exposed H, Y, and W residues were ignored. These residues are indicated in the figure by lower case letters.

【図1C】 図1Cは、配列番号2において示されるアミノ酸配列のHopp/Woods親水性プロフ
ィールである。プロフィールは、スライディングする6残基ウインドウに基づく
。包埋されるG、S、およびT残基、ならびに曝露されるH、Y、およびW残基
は無視された。これらの残基は、小文字によって図中に示される。
FIG. 1C is a Hopp / Woods hydrophilicity profile of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. The profile is based on a sliding 6 residue window. Embedded G, S, and T residues and exposed H, Y, and W residues were ignored. These residues are indicated in the figure by lower case letters.

【図1D】 図1Dは、配列番号2において示されるアミノ酸配列のHopp/Woods親水性プロフ
ィールである。プロフィールは、スライディングする6残基ウインドウに基づく
。包埋されるG、S、およびT残基、ならびに曝露されるH、Y、およびW残基
は無視された。これらの残基は、小文字によって図中に示される。
FIG. 1D is a Hopp / Woods hydrophilicity profile of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. The profile is based on a sliding 6 residue window. Embedded G, S, and T residues and exposed H, Y, and W residues were ignored. These residues are indicated in the figure by lower case letters.

【図2】 図2は、典型的なヒト(配列番号2)およびマウス(配列番号4)のzalpha29アミ
ノ酸配列のアラインメントである。
FIG. 2 is an alignment of typical human (SEQ ID NO: 2) and mouse (SEQ ID NO: 4) zalpha29 amino acid sequences.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) C12N 1/21 C12P 21/02 C 5/10 C12Q 1/02 C12P 21/02 C12N 15/00 ZNAA C12Q 1/02 5/00 A (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ,UG ,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD, RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM,AT, AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,C H,CN,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DZ ,EE,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM, HR,HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,K G,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT ,LU,LV,MA,MD,MG,MK,MN,MW, MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,S E,SG,SI,SK,SL,TJ,TM,TR,TT ,TZ,UA,UG,UZ,VN,YU,ZA,ZW (72)発明者 ガオ,ゼレン アメリカ合衆国,ワシントン 98052,レ ッドモンド,ワンハンドレッドセブンティ ーナインス プレイス ノースイースト 9502 #3 Fターム(参考) 4B024 AA01 AA11 BA21 BA44 CA04 DA02 DA06 EA04 FA02 FA18 GA11 HA01 HA12 HA15 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ20 QR59 QR77 QR80 QS24 QS28 4B064 AG02 AG27 AG31 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 BA41 CA40 DA01 DA76 DA86 EA22 EA27 EA28 EA50 FA74 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) C12N 1/21 C12P 21/02 C 5/10 C12Q 1/02 C12P 21/02 C12N 15/00 ZNAA C12Q 1 / 02 5/00 A (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE) , OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, MZ, SD) , SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU , ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72 ) Inventor Gao, Zelen United States, Washington 98052, Redmond, One Hundred Seventeenth Place Northeast 9502 # 3 F Term (reference) 4B024 AA01 AA11 BA21 BA44 CA04 DA02 DA06 EA04 FA02 FA18 GA11 HA01 HA12 HA15 4B063 QA01 QA18 QA19 QA19 QA19 QA19 QA19 QA19 QQ QR77 QR80 QS24 QS28 4B064 AG02 AG27 AG31 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA93X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 BA10 BA41 CA40 DA01 DA76 DA86 EA22 EA27 EA28 EA50 FA74

Claims (16)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】 配列番号2の残基48〜62、配列番号4の残基47〜61、配列番
号2の残基63〜104、配列番号4の残基62〜103、配列番号2の残基105〜119、配
列番号4の残基104〜118、配列番号2の残基120〜137、配列番号4の残基119〜1
36、配列番号2の残基138〜152、配列番号4の残基137〜151、配列番号2の残基
153〜170、配列番号4の残基152〜169、配列番号2の残基171〜185、および配列
番号4の残基170〜184からなる群より選択されるアミノ酸残基の配列を含有する
単離されたポリペプチド。
1. Residues 48 to 62 of SEQ ID NO: 2, residues 47 to 61 of SEQ ID NO: 4, residues 63 to 104 of SEQ ID NO: 2, residues 62 to 103 of SEQ ID NO: 4, the rest of SEQ ID NO: 2. Groups 105-119, residues 104-118 of SEQ ID NO: 4, residues 120-137 of SEQ ID NO: 2, residues 119-1 of SEQ ID NO: 4
36, residues 138 to 152 of SEQ ID NO: 2, residues 137 to 151 of SEQ ID NO: 4, residues of SEQ ID NO: 2
153 to 170, residues 152 to 169 of SEQ ID NO: 4, residues 171-185 of SEQ ID NO: 2, and residues 170 to 184 of SEQ ID NO: 4 containing a sequence of amino acid residues selected from the group consisting of: Separated polypeptide.
【請求項2】 15〜1500アミノ酸残基の長さである、請求項1に記載の単離
されたポリペプチド。
2. The isolated polypeptide of claim 1, which is 15 to 1500 amino acid residues long.
【請求項3】 請求項2に記載の単離されたポリペプチドであって、ここで
前記アミノ酸残基の配列が、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリン定常領
域、ポリヒスチジンタグ、および配列番号5において示されるようなペプチドか
らなる群より選択される第2のポリペプチドに、ペプチド結合またはポリペプチ
ドリンカーを介して作用可能に連結されている、単離されたポリペプチド。
3. The isolated polypeptide of claim 2, wherein the sequence of amino acid residues is shown in maltose binding protein, immunoglobulin constant region, polyhistidine tag, and SEQ ID NO: 5. An isolated polypeptide operably linked to a second polypeptide selected from the group consisting of such peptides via a peptide bond or a polypeptide linker.
【請求項4】 配列番号2または配列番号4の少なくとも30個の連続的な残
基を含有する、請求項1に記載の単離されたポリペプチド。
4. The isolated polypeptide of claim 1, containing at least 30 consecutive residues of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4.
【請求項5】 配列番号6の残基48〜185または配列番号6の残基27〜190を
含有する、請求項1に記載の単離されたペプチド。
5. The isolated peptide of claim 1, containing residues 48-185 of SEQ ID NO: 6 or residues 27-190 of SEQ ID NO: 6.
【請求項6】 配列番号2の残基48〜185、配列番号4の残基47〜184、配列
番号2の残基27〜190、または配列番号4の残基26〜188を含有する、請求項1に
記載の単離されたペプチド。
6. Containing residues 48-185 of SEQ ID NO: 2, residues 47-184 of SEQ ID NO: 4, residues 27-190 of SEQ ID NO: 2, or residues 26-188 of SEQ ID NO: 4. Item 2. The isolated peptide according to Item 1.
【請求項7】 以下の作用可能に連結されるエレメント: 転写プロモーター; 配列番号2の残基48〜62、配列番号4の残基47〜61、配列番号2の残基63〜10
4、配列番号4の残基62〜103、配列番号2の残基105〜119、配列番号4の残基1
04〜118、配列番号2の残基120〜137、配列番号4の残基119〜136、配列番号2
の残基138〜152、配列番号4の残基137〜151、配列番号2の残基153〜170、配列
番号4の残基152〜169、配列番号2の残基171〜185、および配列番号4の残基17
0〜184からなる群より選択されるアミノ酸残基の配列を含有するポリペプチドを
コードするDNAセグメント;ならびに 転写ターミネーター、を含有する、発現ベクター。
7. The following operably linked elements: transcription promoter; residues 48-62 of SEQ ID NO: 2, residues 47-61 of SEQ ID NO: 4, residues 63-10 of SEQ ID NO: 2.
4, residues 62-103 of SEQ ID NO: 4, residues 105-119 of SEQ ID NO: 2, residue 1 of SEQ ID NO: 4
04-118, residues 120-137 of SEQ ID NO: 2, residues 119-136 of SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2
Residues 138-152, SEQ ID NO: 4 residues 137-151, SEQ ID NO: 2 residues 153-170, SEQ ID NO: 4 residues 152-169, SEQ ID NO: 2 residues 171-185, and SEQ ID NO: Residue 4 of 17
An expression vector comprising a DNA segment encoding a polypeptide containing a sequence of amino acid residues selected from the group consisting of 0 to 184; and a transcription terminator.
【請求項8】 請求項7に記載の発現ベクターであって、ここでDNAセグメ
ントが、配列番号7のヌクレオチド79〜570を含有する、発現ベクター。
8. The expression vector of claim 7, wherein the DNA segment comprises nucleotides 79-570 of SEQ ID NO: 7.
【請求項9】 請求項7に記載の発現ベクターであって、ここでポリペプチ
ドが、配列番号6の残基48〜185または配列番号6の残基27〜190を含有する、発
現ベクター。
9. An expression vector according to claim 7, wherein the polypeptide comprises residues 48-185 of SEQ ID NO: 6 or residues 27-190 of SEQ ID NO: 6.
【請求項10】 請求項7に記載の発現ベクターであって、ここでポリペプ
チドが、配列番号2の残基48〜185、配列番号4の残基47〜184、配列番号2の残
基27〜190、または配列番号4の残基26〜188を含有する、発現ベクター。
10. The expression vector of claim 7, wherein the polypeptide is residues 48-185 of SEQ ID NO: 2, residues 47-184 of SEQ ID NO: 4, residues 27 of SEQ ID NO: 2. ~ 190, or residues 26-188 of SEQ ID NO: 4, an expression vector.
【請求項11】 請求項7に記載の発現ベクターであって、DNAセグメント
に作用可能に連結される分泌シグナル配列を含有する、発現ベクター。
11. An expression vector according to claim 7, which contains a secretory signal sequence operably linked to the DNA segment.
【請求項12】 請求項7〜11のいずれかに記載の発現ベクターが導入され
た培養された細胞であって、ここで細胞がDNAセグメントを発現する、細胞。
12. A cultured cell into which the expression vector according to any one of claims 7 to 11 has been introduced, wherein the cell expresses a DNA segment.
【請求項13】 ポリペプチドを製造する方法であって、以下の工程: DNAセグメントが発現され、そしてポリペプチドが産生される条件下で、請求
項12に記載の細胞を培養する工程;および ポリペプチドを回収する工程、 を含む、方法。
13. A method of producing a polypeptide comprising the steps of: culturing the cell of claim 12 under conditions in which the DNA segment is expressed and the polypeptide is produced; and Recovering the peptide.
【請求項14】 請求項13に記載の方法によって産生された、ポリペプチド
14. A polypeptide produced by the method of claim 13.
【請求項15】 請求項14に記載のポリペプチドに特異的に結合する、抗体
15. An antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 14.
【請求項16】 試験サンプル中で、zalpha29活性のアンタゴニストの存在
を検出するの方法であって、以下の工程: zalpha29に応答性である細胞を培養する工程; 試験サンプルの存在下および不在下でzalpha29ポリペプチドに細胞を曝露する
工程; 試験サンプルの存在下および不在下で、生物学的または生化学的なアッセイに
よって、zalpha29ポリペプチドに対する応答のレベルを比較する工程、 前記比較から試験サンプル中のzalpha29活性のアンタゴニストの存在を決定す
る工程、 を含む方法。
16. A method of detecting the presence of an antagonist of zalpha29 activity in a test sample comprising the steps of: culturing cells responsive to zalpha29; in the presence and absence of the test sample. exposing the cells to the zalpha29 polypeptide; comparing the level of response to the zalpha29 polypeptide by a biological or biochemical assay in the presence and absence of the test sample; determining the presence of an antagonist of zalpha29 activity.
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