JP2003501402A - Gene therapy products - Google Patents

Gene therapy products

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JP2003501402A
JP2003501402A JP2001501258A JP2001501258A JP2003501402A JP 2003501402 A JP2003501402 A JP 2003501402A JP 2001501258 A JP2001501258 A JP 2001501258A JP 2001501258 A JP2001501258 A JP 2001501258A JP 2003501402 A JP2003501402 A JP 2003501402A
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Japan
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product
gene
cells
growth factor
product according
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Japanese (ja)
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クリストファー・ラルフ・フランクス
ルッジェロ・デッラ・ビッタ
ノーマン・ジェイムズ・メイトランド
デイビッド・ジョナサン・ナイト
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バイオイノベイション・リミテッド
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Abstract

(57)【要約】 保護材料と会合した遺伝子材料または核酸材料に連結された増殖活性部分を含む生成物。該増殖活性部分は典型的にはサイトカインまたは成長因子である。該保護材料はミセル、特にリポソームを形成していてもよく、これは核酸材料を封入していてもよいし、あるいは正電荷を持っていてその表面に核酸を保持していてもよい(いわゆるリポプレックス)。従ってある種の保護材料は複合体形成材料を含み、カチオン性リポソームが含まれるだけでなく、その他のカチオン性材料、特にポリマーが含まれる。好適なポリマーとしてはポリリジン(特にポリ-D-リジン)、ポリリジン誘導体(例えば、特にポリ-L-リジンのリン脂質誘導体)およびポリエチレンイミン(PEI)が挙げられる。その他の好適な複合体形成剤としてはデンドリマー、特にポリアミドアミンデンドリマー(カチオン性)がある。遺伝子材料または核酸材料は細胞傷害性遺伝子、欠損修復遺伝子または免疫遺伝子であり得る。好適な細胞傷害性遺伝子は、プロドラッグを毒性薬剤に変換する酵素を発現するためのものである。   (57) [Summary] A product comprising a proliferative active moiety linked to genetic or nucleic acid material associated with a protective material. The proliferatively active moiety is typically a cytokine or a growth factor. The protective material may form micelles, especially liposomes, which may encapsulate the nucleic acid material or may have a positive charge and retain the nucleic acid on its surface (so-called liposome). Plex). Accordingly, certain protective materials include complex-forming materials and include not only cationic liposomes, but also other cationic materials, especially polymers. Suitable polymers include polylysine (especially poly-D-lysine), polylysine derivatives (eg, especially phospholipid derivatives of poly-L-lysine), and polyethyleneimine (PEI). Other suitable complexing agents include dendrimers, especially polyamidoamine dendrimers (cationic). The genetic or nucleic acid material can be a cytotoxic gene, a defect repair gene or an immune gene. Suitable cytotoxic genes are for expressing an enzyme that converts a prodrug into a toxic drug.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】 （発明の分野） 本発明は増殖活性部分をベクターとして用い、増殖細胞に対して核酸材料をタ
ーゲッティングして、標的細胞の増殖を促進する新規なる生成物に関する。本発
明はまた、高親和性レセプター結合活性を有する部分をベクターとして用い、選
択された細胞へ遺伝子材料を送達する生成物に関する。さらに詳しくは、本発明
は、遺伝子治療において細胞に遺伝子材料を送達するのに用いられるその新規な
る組成物に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to novel products that use a proliferatively active moiety as a vector to target nucleic acid material to proliferating cells to promote growth of target cells. The invention also relates to products that deliver genetic material to selected cells using a moiety having high affinity receptor binding activity as a vector. More particularly, the present invention relates to the novel compositions used to deliver genetic material to cells in gene therapy.

【０００２】 （発明の背景） ほとんどの細胞、特に造血細胞や免疫系の細胞の増殖、分化および機能活性は
サイトカインおよび成長因子と呼ばれるタンパク質によって調節されている。こ
の２群の区分は、メカニズムや標的細胞に対する作用がいくつか重複しているの
で難しい。例えば、サイトカインであるインターロイキン-2はＴ細胞成長因子と
しても知られている。サイトカインおよび成長因子はいずれもペプチド性のホル
モンである。BACKGROUND OF THE INVENTION The proliferation, differentiation and functional activity of most cells, especially those of the hematopoietic cells and the immune system, are regulated by proteins called cytokines and growth factors. The division between these two groups is difficult because some mechanisms and actions on target cells overlap. For example, the cytokine interleukin-2 is also known as a T cell growth factor. Both cytokines and growth factors are peptidic hormones.

【０００３】 さらに詳しくは、サイトカインはそれらの標的細胞の機能状態を調節し(すな
わち、量的および質的の双方で刺激または抑制することができる)、一方、成長
因子の方は増殖および分化の促進、調節および維持、ならびに標的細胞系の生存
により焦点を絞っている。[0003] More specifically, cytokines regulate the functional state of their target cells (ie, can be both quantitatively and qualitatively stimulated or suppressed), while growth factors are more proliferative and differentiative. The focus is on promotion, regulation and maintenance, and survival of target cell lines.

【０００４】 サイトカインおよび成長因子はいずれもそれらの標的細胞上の特異的な膜レセ
プターを認識するが、これらは特定のサイトカインまたは成長因子に特異なもの
である。各レセプターは次ぎに生理学的および／または病理学的状態に基づいて
その特異的なサイトカインまたは成長因子に対して劇的な親和性を示し得る。こ
れらのレセプターは低、中、高親和性に分類することができる。中でも最も重要
なのは、高親和性レセプターがそれら関連のサイトカインまたは成長因子しか認
識、捕捉および取り込みしないということである。これらのレセプターおよびそ
れらのリガンドは、サイトカインに関して以下でさらに詳細に論じる。Both cytokines and growth factors recognize specific membrane receptors on their target cells, but these are specific to particular cytokines or growth factors. Each receptor may then exhibit a dramatic affinity for its specific cytokine or growth factor based on physiological and / or pathological conditions. These receptors can be classified as low, medium or high affinity. Most importantly, the high affinity receptors recognize, capture and uptake only their associated cytokines or growth factors. These receptors and their ligands are discussed in more detail below with respect to cytokines.

【０００５】 サイトカインは細胞の機能を刺激または抑制するためにリンパ球で産生され、
免疫系の細胞間へのシグナル伝達に関わる、抗体以外の分子群である。サイトカ
イン活性はしばしば標的細胞上で発現する特異的レセプターによって媒介される
。サイトカインはグリコシル化または非グリコシル化ポリペプチドであり、Ｔ細
胞およびＢ細胞の双方によって分泌され得るが、細胞媒介応答ではＴ細胞が主な
ソースであると考えられる。サイトカイン研究の複雑な点はin vivoにおいて単
独で作動するサイトカインは決してないということによるものである。このこと
は多くのサイトカイン作用が共同作用性であるという観察によって示されている
。重要なサイトカインとしては、インターロイキン(IL)、腫瘍壊死因子(TNF)お
よびインターフェロン(IFN)がある。さらに種々のコロニー刺激因子(CSF)が骨髄
赤血球細胞によって分泌される。Cytokines are produced in lymphocytes to stimulate or suppress the function of cells,
A group of molecules other than antibodies involved in signal transduction between cells of the immune system. Cytokine activity is often mediated by specific receptors expressed on target cells. Cytokines are glycosylated or non-glycosylated polypeptides that can be secreted by both T and B cells, although T cells appear to be the major source of cell-mediated responses. The complexity of cytokine studies is that no single cytokine operates in vivo alone. This is shown by the observation that many cytokine actions are synergistic. Important cytokines include interleukins (IL), tumor necrosis factor (TNF) and interferons (IFN). In addition, various colony stimulating factors (CSF) are secreted by bone marrow red blood cells.

【０００６】 多くのサイトカインのレセプターが現在クローン化されており、それらの構造
(アミノ酸配列)が分析されている。その結果、これらの多くを一次構造の共通相
同領域に基づいてスーパーファミリーに分類することができる。本発明の目的で
は、認識された主要スーパーファミリーとしては、造血レセプター・スーパーフ
ァミリーとも呼ばれることがあるサイトカインレセプター・スーパーファミリー
(CKR-SF)、およびII型サイトカインレセプター・スーパーファミリーとも呼ばれ
るインターフェロンレセプター・スーパーファミリー(IFNR-SF)がある(参照文献
1)。「スーパーファミリー」とは、50%以下のアミノ酸配列相同性しか持たない
タンパク質をいう場合にしか用いてはならない。50%より高いアミノ酸配列相同
性を持つタンパク質は「ファミリー」という用語で表される。Many cytokine receptors are currently being cloned and their structure is
(Amino acid sequence) has been analyzed. As a result, many of these can be classified into superfamilies based on the common homologous region of the primary structure. For the purposes of the present invention, the recognized major superfamily is the cytokine receptor superfamily, which may also be referred to as the hematopoietic receptor superfamily.
(CKR-SF), and the interferon receptor superfamily (IFNR-SF), which is also called the type II cytokine receptor superfamily (references)
1). The term "superfamily" should only be used when referring to proteins that have 50% or less amino acid sequence homology. Proteins with greater than 50% amino acid sequence homology are designated by the term "family".

【０００７】 多くのサイトカインおよび成長因子レセプターは種々のドメインと反復配列の
組合せを有する。ドメインとは個々の構造単位をなし、特異的シグナルを受け取
る、および／または変換することができるタンパク質配列またはタンパク質セグ
メントである。本発明の目的では、注目されるドメインは細胞外領域(所定の標
的細胞系統の表面に位置するもの)である。レセプターの結合に焦点を当てた研
究では、CKR-SF(すなわち、造血レセプター・スーパーファミリー)のいくつかの
メンバーに対して１を超える結合親和性が存在することが明らかとなった。典型
的にはこれらの部位は所定のリガンド(サイトカインまたは成長因子)に対して低
い(例えば1〜10nM)または高い(例えば少なくとも1pM、より通常には10〜100pM)
親和性を有する。これらのレセプター複合体のほとんどでは、高親和性レセプタ
ーの発現に必要とされるさらなるサブ単位が同定されている。これらのサブ単位
(親和性コンバーターまたはコンバーター鎖とも呼ばれる)はしばしば、レセプタ
ーリガンドを通じて所定の活性化刺激または阻害刺激がかけられた後に細胞表面
で発現する。この結果、高親和性レセプターを有する細胞だけでなく、休止細胞
(通常、低活性レセプター複合体を有している)でも作用の増幅が起こり、部位／
領域／全身ネットワークの関わりなくして、パラ分泌性の刺激／阻害の生理学的
基礎となる。Many cytokine and growth factor receptors have a combination of different domains and repeat sequences. A domain is a protein sequence or protein segment that forms an individual structural unit and is capable of receiving and / or converting a specific signal. For purposes of the present invention, the domain of interest is the extracellular region, which is located on the surface of a given target cell lineage. Studies focusing on receptor binding have revealed that there is a binding affinity of greater than 1 for some members of CKR-SF (ie, the hematopoietic receptor superfamily). Typically these sites are low (e.g. 1-10 nM) or high (e.g. at least 1 pM, more usually 10-100 pM) for a given ligand (cytokine or growth factor).
Has an affinity. Most of these receptor complexes have identified additional subunits that are required for the expression of high affinity receptors. These sub-units
Frequently, also called affinity converters or converter chains, are expressed on the cell surface after a given activation or inhibitory stimulus is applied through the receptor ligand. As a result, not only cells having high affinity receptors but also resting cells
Amplification of action also occurs (usually with a low activity receptor complex),
It is the physiological basis for paracrine stimulation / inhibition, independent of the area / systemic network.

【０００８】 このようにして免疫応答を媒介する。Ｔ細胞は休止状態から活性状態へと変化
させなければならない。外来抗原によって刺激されたＴ細胞はIL-2のde novo合
成をもたらす細胞活性化のプログラムに入る。休止中のＴ細胞は高親和性レセプ
ターを発現しないが、活性化された後は速やかに発現する。IL-2とその誘導され
た細胞レセプターとの相互作用によって細胞増殖を誘発して、免疫応答の完全な
発現に必要とされるエフェクターＴ細胞の出現は最高となる。IL-2/IL-2r複合体
を例にとれば、本明細書に記載される疾病の多くにおいてこの生理学的同調が阻
害され(主として腫瘍転換によって、次いでウイルスによって)ているか、あるい
は自己維持され(自己免疫反応／疾患、移植拒絶)ていて、全身性の多臓器不全が
もたらされる。In this way the immune response is mediated. T cells must change from a resting state to an active state. T cells stimulated by foreign antigens enter a program of cell activation leading to de novo synthesis of IL-2. Resting T cells do not express high affinity receptors, but do so rapidly after activation. The interaction of IL-2 with its induced cell receptors induces cell proliferation, maximizing the appearance of effector T cells required for full expression of the immune response. Taking the IL-2 / IL-2r complex as an example, in many of the diseases described herein, this physiological synchronization is either blocked (mainly by tumor conversion, then by the virus) or self-maintained. (Autoimmune reaction / disease, transplant rejection), resulting in systemic multiple organ failure.

【０００９】 サイトカインおよびそれらのレセプターに関してさらに詳しくは、Callard R
E, Gearing A J H, The Cytokine-Factsbook, Academic Press - Harcourt Brac
e & Company, Publishers, 1994, 18-25に見出せる。For more information on cytokines and their receptors, Callard R
E, Gearing AJH, The Cytokine-Factsbook, Academic Press-Harcourt Brac
e & Company, Publishers, 1994, 18-25.

【００１０】 従って高親和性レセプターは親和定数が10-10M以下のもの、さらに特には親和
定数が10-11M以下のものが挙げられる。代表的な高親和性レセプターとしては、
親和定数が10-11Mから10-12Mの間のものが挙げられる。例えば、３形態のインタ
ーロイキン-2(IL-2)のレセプターは、IL-2結合親和性10-11M(高親和性)、10-9M(
中親和性)および10-8M(低親和性)といったように、IL-2に対するそれらの親和性
に基づいて識別できる(参照文献1-4)。IL-2レセプターは先行技術で十分に記載
されている(参照文献5および6)。Therefore, high affinity receptors include those having an affinity constant of 10 −10 M or less, and more particularly those having an affinity constant of 10 −11 M or less. As a typical high affinity receptor,
The affinity constant is between 10 -11 M and 10 -12 M. For example, three forms of interleukin-2 (IL-2) receptors have IL-2 binding affinity of 10 -11 M (high affinity), 10 -9 M (
Discrimination can be based on their affinity for IL-2, such as medium affinity) and 10 −8 M (low affinity) (references 1-4). The IL-2 receptor is well described in the prior art (references 5 and 6).

【００１１】 TNF-αはTNFに対する標的細胞に高い親和性を持つ２つのイソ型のレセプター
を持つと記載されている。これらの標的細胞はマクロファージおよび破骨細胞で
ある(参照文献7)。M-CSF(マクロファージコロニー刺激因子)はマクロファージお
よび破骨細胞に対する高親和性レセプターを有する。この高親和性レセプターは
150Kdaの糖タンパク質である(参照文献8)。TNF-α has been described as having two isoform receptors with high affinity for TNF target cells. These target cells are macrophages and osteoclasts (ref. 7). M-CSF (macrophage colony stimulating factor) has high affinity receptors for macrophages and osteoclasts. This high affinity receptor
It is a glycoprotein of 150 Kda (reference document 8).

【００１２】 高親和性レセプターはIFN(インターフェロン)に関しても記載されている。IFN
-γは高親和性レセプターとして90KDaの糖タンパク質を有する。活性化されたリ
ンパ球、マクロファージ、内皮細胞および繊維芽細胞上に存在する種々のレセプ
ターはIFN-αおよびIFN-βの高親和性レセプターであると認識されている(参照
文献9)。High affinity receptors have also been described for IFN (interferon). IFN
-γ has a 90 KDa glycoprotein as a high affinity receptor. The various receptors present on activated lymphocytes, macrophages, endothelial cells and fibroblasts are recognized as high affinity receptors for IFN-α and IFN-β (reference document 9).

【００１３】 FGF(繊維芽細胞成長因子)の場合、活性化された繊維芽細胞、マクロファージ
、内皮細胞、軟骨細胞、星状細胞、神経膠腫細胞、肝細胞、表皮細胞、ニューロ
ン、卵巣細胞、下垂体細胞およびケラチン生成細胞などの中胚葉および神経外胚
葉系細胞には、140KDaの糖タンパク質である高親和性レセプターが存在している
。FGFの薬理特性は主として脈管形成、卵巣ステロイド形成、骨芽細胞の活性化
、および神経成長(胎児期)に関連している(参照文献10)。In the case of FGF (fibroblast growth factor), activated fibroblasts, macrophages, endothelial cells, chondrocytes, astrocytes, glioma cells, hepatocytes, epidermal cells, neurons, ovary cells, The mesodermal and neuroectodermal cells, such as pituitary cells and keratinocytes, have high affinity receptors that are 140 KDa glycoproteins. The pharmacological properties of FGF are mainly associated with angiogenesis, ovarian steroidogenesis, osteoblast activation, and nerve growth (fetal period) (ref. 10).

【００１４】 ウミヤツメPetromyzon marinus由来の変異体GnRH-III(Glp-His-Trp-Ser-His-A
sp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH2)は、乳癌、前立腺癌および子宮内膜癌細胞の増殖を抑
制するが、癌細胞の増殖に対して有効な濃度では内分泌活性を持たないことが認
められている(参照文献25-28)。Mutant GnRH-III (Glp-His-Trp-Ser-His-A derived from the sea claw Petromyzon marinus
sp-Trp-Lys-Pro-Gly-NH 2 ) suppresses the growth of breast, prostate and endometrial cancer cells, but may not have endocrine activity at concentrations effective against cancer cell growth Accepted (references 25-28).

【００１５】 表皮成長因子(EGF)は53個のアミノ酸のペプチドであり、レセプターによって
媒介されるメカニズムを介して細胞増殖を効果的に刺激する。それはチロシンキ
ナーゼ／SH2ドメインレセプターの標準的な例であり、ここでは細胞外EGF結合が
レセプターの二量化、自己リン酸化および下流シグナル伝達分子と活性化レセプ
ターのSF2ドメインを介する結合を促進する(参照文献29)。EGFのレセプターは多
くの細胞種の表面に多分化能ヘテロ二量体の形態で存在しているので、このレセ
プター種は広く適用できる。Epidermal growth factor (EGF) is a 53 amino acid peptide that effectively stimulates cell proliferation through a receptor-mediated mechanism. It is a standard example of a tyrosine kinase / SH2 domain receptor, where extracellular EGF binding promotes receptor dimerization, autophosphorylation and binding of downstream signaling molecules to the activating receptor via the SF2 domain (see Reference 29). Since the receptor for EGF is present on the surface of many cell types in the form of pluripotent heterodimers, this receptor species is widely applicable.

【００１６】 IGF(インスリン様成長因子)は種々の組織に、また乳腺癌腫に存在するヘテロ
四量複合体に対して高い親和性を有する(参照文献11)。IGF (insulin-like growth factor) has a high affinity for various tissues and for the heterotetrameric complex present in mammary carcinoma (ref. 11).

【００１７】 トランスフォーミング増殖因子β(TGFβ)はIGFに似ている。TGFβは繊維芽細
胞、表皮細胞、血小板、星状細胞、単球、骨細胞および神経膠芽腫細胞によって
分泌される非グリコシル化ホモ二量体タンパク質である。生理学的標的細胞は主
として繊維芽細胞、骨芽細胞、好中球、造血始原細胞、T/Bリンパ球、およびあ
る範囲の腫瘍細胞である。このサイトカインは、パラ分泌性の微少環境刺激に応
じて上記細胞の細胞表面に置かれた標的細胞によって発現される高親和性レセプ
ターと相互作用する。これらは１型または２型レセプター(55および80Kda)であ
り、TGFβ1、2および3と結合することができる。Transforming growth factor β (TGFβ) is similar to IGF. TGFβ is a non-glycosylated homodimeric protein secreted by fibroblasts, epidermal cells, platelets, astrocytes, monocytes, osteocytes and glioblastoma cells. Physiological target cells are primarily fibroblasts, osteoblasts, neutrophils, hematopoietic progenitor cells, T / B lymphocytes, and a range of tumor cells. This cytokine interacts with high affinity receptors expressed by target cells located on the cell surface of the cells in response to paracrine microenvironmental stimuli. These are type 1 or type 2 receptors (55 and 80 Kda) and are capable of binding TGFβ1, 2 and 3.

【００１８】 GM-CSF(顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子)およびSCF(肝細胞因子)は
骨髄の多分化能細胞においては二量体高親和性レセプターを有する（参照文献12
）。G-CSF(顆粒球コロニー刺激因子)もまた、骨髄の多分化能細胞だけに存在す
る高親和性レセプターを有する。GM-CSF (granulocyte / macrophage colony stimulating factor) and SCF (hepatocyte factor) have dimeric high-affinity receptors on pluripotent cells of the bone marrow (ref. 12).
). G-CSF (granulocyte colony stimulating factor) also has a high affinity receptor present only on pluripotent cells of bone marrow.

【００１９】 EPO(エリトロポエチン)は骨髄の赤血球前駆体に存在する多量体高親和性レセ
プターを有する。EPO (erythropoietin) has a multimeric, high affinity receptor present on the erythroid precursors of bone marrow.

【００２０】 IL-6(インターロイキン-6)はα-／β-高親和性レセプターを有する。α鎖はIL
-6と低い親和性で結合し、可溶型で存在する。β鎖は130KDaのタンパク質であり
、IL-6/IL-6rと同時に結合して、標的細胞の刺激を開始する三量複合体となる。
特異的な刺激の後のIL-6の高親和性レセプターの誘導は主としてT/Bリンパ球、
繊維芽細胞、骨髄前駆体、ニューロン、ケラチン形成細胞、および肝細胞などの
活性化された細胞に存在する。さらに、複数の骨髄腫細胞がIL-6を産生し、自己
分泌癌増殖因子として働くIL-6レセプターを発現し、同時に破骨細胞形成(骨分
解部位)を促進する。幹細胞由来のIL-6はまた、種々の腫瘍組織型によって骨転
移部位にも関与している可能性がある。IL-6 (interleukin-6) has an α- / β-high affinity receptor. α chain is IL
It binds to -6 with low affinity and exists in a soluble form. The β chain is a 130 KDa protein that binds simultaneously with IL-6 / IL-6r to form a trimeric complex that initiates stimulation of target cells.
The induction of high affinity receptors for IL-6 after specific stimulation is mainly in T / B lymphocytes,
It is present on activated cells such as fibroblasts, bone marrow precursors, neurons, keratinocytes, and hepatocytes. Furthermore, a plurality of myeloma cells produce IL-6, express the IL-6 receptor that acts as an autocrine cancer growth factor, and at the same time promote osteoclast formation (site of osteolysis). IL-6 derived from stem cells may also be involved in bone metastatic sites by various tumor tissue types.

【００２１】 ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH、Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-G
ly-NH2)は、視床下部−下垂体−性腺軸の中枢レギュレーターである。GnRH類似
体は性ホルモン依存性の乳癌、前立腺癌および卵巣癌を治療するのに使用される
。GnRHレセプターRNAはヒト下垂体、乳房、卵巣、前立腺および子宮内膜で発現
する。Palyi et al(参照文献24)によって記載されているように、ある癌細胞系
統はこれまでの研究者らによって、高および低親和性GnRH結合部位を発現するこ
とが見出されている。従ってGnRHはそれに対する高親和性レセプターが存在する
ペプチドホルモンである。Gonadotropin-releasing hormone (GnRH, Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-G
ly-NH 2 ) is the central regulator of the hypothalamus-pituitary-gonad axis. GnRH analogs are used to treat sex hormone-dependent breast, prostate and ovarian cancers. GnRH receptor RNA is expressed in human pituitary, breast, ovary, prostate and endometrium. Certain cancer cell lines have been found by researchers to express high and low affinity GnRH binding sites, as described by Palyi et al (ref. 24). Therefore, GnRH is a peptide hormone for which a high affinity receptor exists.

【００２２】 WO 92/20364は、細胞の活性を低下させ得る分子である第１の部分(特に細胞毒
)とサイトカインレセプターと特異的に結合し得る分子である第２の部分(特に全
サイトカインまたはサイトカインの結合部分)とを含むハイブリッド分子を記載
している。この第２の部分は第１の部分をサイトカインレセプターにターゲッテ
ィングし、IL-2で例示される。このIL-2部分は、これらの分子が次ぎに標的細胞
の増殖を妨げるので、IL-2活性を欠いていることが好ましい。WO 92/20364 describes a first part (particularly a cytotoxin) that is a molecule that can reduce the activity of cells.
) And a second moiety that is a molecule capable of specifically binding to a cytokine receptor (particularly all cytokines or binding moieties for cytokines). This second part targets the first part to the cytokine receptor and is exemplified by IL-2. This IL-2 portion preferably lacks IL-2 activity, as these molecules in turn prevent the growth of target cells.

【００２３】 Palyi et al(参照文献19)は、リシル側鎖とスペーサー(Gly-Phe-Leu-Gly)を介
してN-ビニルピロリジン-マレイン酸共重合体と連結したヒトGnRHペプチド類似
体を含むゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH)類似体コンジュゲートを記載してい
る。この共役したポリマーはタンパク質分解からペプチドを保護し、おそらくは
ペプチドコンジュゲートとレセプターの外部ドメインおよび隣接する膜構造との
の結合が強まり、かつ／またはレセプターコンジュゲート複合体の取り込みが高
まった結果としてその増殖阻害作用を高める。Palyi et al (Reference 19) contains a human GnRH peptide analogue linked to an N-vinylpyrrolidine-maleic acid copolymer via a lysyl side chain and a spacer (Gly-Phe-Leu-Gly). Gonadotropin releasing hormone (GnRH) analog conjugates are described. This conjugated polymer protects the peptide from proteolysis, presumably as a result of enhanced binding of the peptide conjugate to the ectodomain of the receptor and adjacent membrane structures, and / or as a result of increased uptake of the receptor-conjugated complex. Increases the growth inhibitory effect.

【００２４】 遺伝子治療とは、病状を予防または改変する目的で、遺伝子材料または遺伝子
機能調節因子を患者の標的細胞へ導入することであり、非遺伝的ならびに遺伝的
疾患の治療のためのものであり得る。遺伝子導入はex vivoであってもin vivoで
あってもよい。ex vivo技術には通常、大抵はウイルスベクターの使用による細
胞の遺伝子改変を行った後に、これらを生体組織に移植することを含む。in viv
o遺伝子治療とは、遺伝子材料を直接体内に導入することを意味し、通常は標的
組織に接近しにくいために効率が不十分であるという欠点がある。遺伝子治療用
に提案されるベクターとしては、ウイルス(特にレトロウイルスおよびアデノウ
イルス)、リポソーム、および例えばポリリジンなどのターゲッティング分子と
連結したDNAを用いる、レセプター介在性のエンドサイトーシスが挙げられる。[0024] Gene therapy refers to the introduction of genetic material or a gene function regulator into a target cell of a patient for the purpose of preventing or modifying a medical condition, and is for treating non-genetic as well as genetic diseases. possible. Gene transfer may be ex vivo or in vivo. Ex vivo techniques usually involve genetically modifying the cells, often by use of viral vectors, and then transplanting them into living tissue. in viv
o Gene therapy means the direct introduction of genetic material into the body, which usually has the drawback of being inefficient because it is difficult to access the target tissue. Proposed vectors for gene therapy include viruses (particularly retroviruses and adenoviruses), liposomes, and receptor-mediated endocytosis using DNA linked to targeting molecules such as polylysine.

【００２５】 癌については、造血遺伝子導入、免疫遺伝子療法、有毒遺伝子の送達、例えば
ジーン・ディレクテッド・エンザイム-プロドラッグ療法(GDEPT)、および遺伝子
欠損の修復をはじめ、種々の遺伝子治療戦略が知られている。GDEPTは癌細胞と
それらの対応する正常型のものとの間の遺伝子発現の差を利用して、細胞破壊の
特異性を高めるものである。無害のプロドラッグを細胞傷害性化合物に変換でき
る酵素をコードする外来遺伝子を導入する。この系は腫瘍細胞にしか存在しない
酵素遺伝子が有意に転写されるように計画する。For cancer, various gene therapy strategies are known, including hematopoietic gene transfer, immunogene therapy, toxic gene delivery, such as gene directed enzyme-prodrug therapy (GDEPT), and repair of gene defects. Has been. GDEPTs take advantage of differences in gene expression between cancer cells and their corresponding normal forms to enhance the specificity of cell destruction. A foreign gene encoding an enzyme that can convert a harmless prodrug into a cytotoxic compound is introduced. This system designs significant transcription of enzyme genes that are only present in tumor cells.

【００２６】 遺伝子治療についてさらに詳しいことは、"Textbook of Gene Therapy", K K
Jain, Hogrefe & Huber Publishers, 1998(参照文献24)を参照。For more information on gene therapy, see "Textbook of Gene Therapy", KK
See Jain, Hogrefe & Huber Publishers, 1998 (ref. 24).

【００２７】 遺伝子治療のための最も一般的な候補ベクターはウイルスである。しかしウイ
ルスベクターは、それらの安全性、それらに対する免疫のため、またウイルスベ
クターの大スケール培養が比較的難しいために潜在的には望ましくないと見られ
ている。従ってウイルスベクターの代わりとなる有効なものが強く求められてい
る。The most common candidate vector for gene therapy is a virus. However, viral vectors are viewed as potentially undesirable due to their safety, immunity to them, and the relative difficulty of large-scale culture of viral vectors. Therefore, there is a strong demand for effective alternatives to viral vectors.

【００２８】 出典明示によりその内容が本明細書の一部とされる国際特許出願PCT/GB98/035
09の発明は、一つの態様において、増殖活性プロモーター、例えば活性型IL-2を
含む薬剤が薬理上望ましい種を増殖が望ましくない細胞へ送達するのに有効に使
用できるということに基づくものである。例えば、この発明の薬剤のいくつかは
増殖活性プロモーターを含む分子を用いて増殖を制御または阻害する。好ましい
実施態様は、高親和性レセプター・スーパーファミリーを用い、薬剤または遺伝
子材料を例えば多くの臨床現象にもっぱら関わる特定の細胞系統へ送達すること
ができるという適用に基づくものである。International patent application PCT / GB98 / 035, the contents of which are made a part of this specification by clarification of the source
The invention of 09 is based, in one embodiment, on that a drug containing a growth-active promoter, eg, activated IL-2, can be effectively used to deliver a pharmacologically desirable species to cells where proliferation is not desired. . For example, some of the agents of this invention control or inhibit growth using molecules that include a growth activity promoter. A preferred embodiment is based on the application that the high affinity receptor superfamily can be used to deliver drugs or genetic material to specific cell lineages that are for example involved in many clinical phenomena.

【００２９】 従って国際特許出願PCT/GB98/03509は、薬理活性化合物、例えば従来の薬剤ま
たは遺伝子と連結した増殖活性化合物、特にサイトカインまたは成長因子を含む
ある種の生成物を記載している。増殖活性部分(すなわち好ましい態様ではサイ
トカインまたは成長因子)はその機能的活性を保持し、ひとたびその生成物がそ
のレセプターをターゲッティングすれば働くようになる。増殖活性部分はレセプ
ターと結合し、次ぎに細胞に取り込まれれば、その生成物の各活性ドメイン(増
殖活性部分および生物活性因子)がその個々の機能を実行することができる。市
販の活性生成物において生成物の２つのドメインは細胞内で分かれるが、このこ
とは不可欠ではなく、本発明は細胞内で切断可能な生成物に限定されるものでは
ないと考えられる。好ましい実施態様では、増殖活性部分とレセプターとの結合
に続いて起こる現象としては、典型的には、生成物(典型的には融合化合物)の細
胞質への取り込み(エンドソーム経路による)、エンドソームの酸化(プロトンH+
ポンプ機構による)、ならびに機能的ドメインのレセプタードメイン、増殖活性
ドメインおよび活性作用因子ドメインへの分離がある。レセプタードメインおよ
び増殖活性ドメイン(通常はサイトカインまたは成長因子ドメイン)はそれらの機
能的完全性を保持しているので、増殖活性ドメイン(サイトカインまたは成長因
子)はDNA相互作用による細胞の活性化／分裂を誘発する(G2-M期に豊富)。The international patent application PCT / GB98 / 03509 thus describes certain products containing pharmacologically active compounds, for example growth-active compounds linked to conventional drugs or genes, in particular cytokines or growth factors. The proliferatively active moiety (ie, the cytokine or growth factor in the preferred embodiment) retains its functional activity and becomes functional once its product targets its receptor. If the proliferatively active moiety binds to the receptor and is then taken up by cells, each active domain of the product (proliferatively active moiety and bioactive factor) can perform its individual function. In commercially available active products the two domains of the product are separated intracellularly, but this is not essential and the invention is not considered to be limited to intracellular cleavable products. In a preferred embodiment, the events following binding of the proliferatively active moiety to the receptor are typically the uptake of the product (typically a fusion compound) into the cytoplasm (via the endosomal pathway), the oxidation of the endosome. (Proton H +
(Due to the pumping mechanism), and the separation of functional domains into receptor domains, proliferative active domains and active agent domains. Since the receptor domain and proliferative activity domain (usually a cytokine or growth factor domain) retain their functional integrity, the proliferative activity domain (cytokine or growth factor) causes activation / division of cells by DNA interactions. Trigger (abundant in G2-M phase).

【００３０】 従って国際出願が教示しているように、これらの増殖活性ベクターは遺伝子ト
ランスポーターとして活性があるだけでなく、標的細胞におけるDNA鎖を開環し
た上でDNAの再配列も促進する。従ってそれらはin vitroにおいてもin vivoにお
いても遺伝子を統合することに関して理想的である。利用できるその他の系で、
(現在ベクターとして用いられている)ウイルスが関与する危険性なしに、匹敵す
る二様式の活性を有するものはない。Thus, as the international application teaches, these proliferative activity vectors are not only active as gene transporters, but also open the DNA strands in the target cells and facilitate DNA rearrangement. Therefore, they are ideal for integrating genes both in vitro and in vivo. Other systems available,
No one has comparable bimodal activity without the risk of viral involvement (currently used as a vector).

【００３１】 PCT/GB98/03509はまた、高親和性レセプターを有する、ペプチドホルモンであ
るか、あるいは高親和性レセプターに関してペプチドホルモンと機能上同等な分
子である、部分と連結された生物活性因子を含む生成物を記載および請求してい
る。PCT / GB98 / 03509 also comprises a bioactive factor linked to a moiety, which is a peptide hormone having a high affinity receptor or a molecule functionally equivalent to the peptide hormone with respect to the high affinity receptor. The products containing are described and claimed.

【００３２】 （発明の概要） 本願は特にPCT/GB98/03509に記載、請求された種の新規なる生成物に関する。
さらに詳しくは、本発明は、保護材料と会合した遺伝子材料または核酸材料に連
結された増殖活性部分を含む生成物またはその組成物を提供する。移入遺伝子が
細胞分裂により有効であり、従って増殖活性部分が、その増殖が遺伝子材料また
は核酸材料に対して引き起こされる細胞を活性化するというかなりの証拠がある
。言い換えれば、本発明は、保護された核酸材料のためのベクターとしても、標
的細胞の増殖を刺激するための分裂誘発因子としても増殖活性部分を使用可能と
する生成物に関する。SUMMARY OF THE INVENTION The present application relates in particular to novel products of the type claimed and claimed in PCT / GB98 / 03509.
More particularly, the invention provides a product or composition thereof comprising a proliferatively active moiety linked to genetic or nucleic acid material associated with protective material. There is considerable evidence that the transgene is more effective in cell division, and thus the proliferatively active portion activates cells whose proliferation is triggered against genetic or nucleic acid material. In other words, the present invention relates to products which allow the use of growth-promoting moieties both as a vector for protected nucleic acid material and as a mitogen for stimulating the growth of target cells.

【００３３】 保護材料は遺伝子材料または核酸材料を分解から保護する働きをし、例えば公
知のいずれかの保護材料を含めばよい。特に、遺伝子材料または核酸材料はミセ
ル、特にリポソームに封入することにより、あるいは例えばポリリジンなどの保
護タンパク質と複合化することで保護され得る。The protective material serves to protect the genetic or nucleic acid material from degradation and may include, for example, any known protective material. In particular, the genetic or nucleic acid material may be protected by encapsulation in micelles, especially liposomes, or by conjugation with protective proteins such as polylysine.

【００３４】 本発明は遺伝子材料または核酸材料が会合材料によって保護されている生成物
を含むが、本発明は会合材料が保護的であるか、または単に機能上保護的である
生成物に限定されるものではない。本発明はまた、遺伝子材料または核酸材料が
そうではなくカチオン性DNA結合材料と会合している生成物も含む。Although the present invention includes products in which the genetic or nucleic acid material is protected by the associative material, the invention is limited to products in which the associative material is protective, or simply functionally protective. Not something. The invention also includes products in which the genetic or nucleic acid material is otherwise associated with the cationic DNA binding material.

【００３５】 従って本発明はカチオン性DNA結合材料と会合したヌクレオチドに連結された
増殖活性部分を含む生成物またはその組成物を提供する。The present invention thus provides a product or composition thereof comprising a proliferatively active moiety linked to a nucleotide associated with a cationic DNA binding material.

【００３６】 本発明の上記態様の特徴は、核酸材料または遺伝子材料が増殖活性部分に連結
されていることである。従って単にIL-2のレセプター結合ドメインを含む先行技
術のキメラタンパク質とは異なり、これらの生成物は細胞増殖を誘導し、高親和
性レセプターを有する増殖活性部分の場合には極めて低い用量であっても増殖阻
害剤を極めて有効なものとすることができる。従って本発明は低い全身毒性を達
成することができる。少なくともIL-2の場合のさらなる利点は、IL-2が関連する
抗原が存在する場合には高親和性IL-2レセプターの発現を誘導することである。A feature of the above aspects of the invention is that the nucleic acid material or genetic material is linked to a proliferatively active moiety. Therefore, unlike prior art chimeric proteins that simply contain the receptor-binding domain of IL-2, these products induce cell proliferation and at very low doses in the case of proliferatively active moieties with high affinity receptors. Can also make growth inhibitors extremely effective. Therefore, the present invention can achieve low systemic toxicity. A further advantage, at least in the case of IL-2, is that it induces the expression of the high affinity IL-2 receptor in the presence of the IL-2 related antigen.

【００３７】 例えばIL-2と、レトロウイルス遺伝子をブロッキングするように設計された保
護アンチセンスDNA/RNAからなる構築物では以下の作用が得られる： a. 感染細胞では、IL-2によって与えられた反復刺激はまたウイルスゲノムの
増幅を刺激し、その結果、アンチセンスDNA/RNAによるより強い阻害活性が生じ
る。 b. 非感染リンパ球の免疫刺激は免疫監視の増強という利点を示し得る。For example, a construct consisting of IL-2 and a protected antisense DNA / RNA designed to block retroviral genes has the following effects: a. In infected cells, conferred by IL-2. Repeated stimulation also stimulates amplification of the viral genome, resulting in stronger inhibitory activity by antisense DNA / RNA. b. Immunostimulation of uninfected lymphocytes may show the advantage of enhanced immune surveillance.

【００３８】 好ましい実施態様の特徴としては中でも下記のものが挙げられる： ・該生成物は既存の部分(またはその機能上同等な部分)の組合せであり、その各
々はその機能および所望によりその全構造を保持している(ただし、その他の部
分のいずれかとの共有結合部位は除く) ・該生成物は極めて低い用量で投与して、全身性の有害な結果をほとんどまたは
全くなくすことができる。 ・成長因子／サイトカインは標的系を刺激し、核酸部分が治療効果を誘発する。 ・生体分布が予測可能かつ良好である。 ・ターゲッティングが良好である。 ・免疫原性が低い。Features of preferred embodiments include, among others: The product is a combination of preexisting moieties (or functionally equivalent moieties thereof), each of which is functional and optionally its entirety. Retains structure (but excludes covalent sites for attachment to any of the other moieties) The product can be administered at very low doses with little or no adverse systemic consequences. -Growth factors / cytokines stimulate the target system and the nucleic acid moieties induce therapeutic effects. -Biological distribution is predictable and good.・ Good targeting.・ Low immunogenicity.

【００３９】 本発明の概要は図１に示されており、便宜的に増殖活性部分がIL-2である生成
物に関して本発明を示してある。図１に示されているように、IL-2は、保護され
た(この場合にはポリリジンと複合化)発現ベクター(この場合にはプラスミド)に
結合させるが、好適にはこの結合は、ポリリジンと反応する官能基ならびにIL-2
と反応する官能基を有するリンカーをIL-2に付加させ、次ぎにこのリンカーを、
ポリリジンをプラスミド(発現ベクター)と結合させる前または後にポリリジンと
反応させることによって行われる。A general description of the invention is shown in FIG. 1, which is conveniently shown for products in which the proliferatively active moiety is IL-2. As shown in FIG. 1, IL-2 is ligated to a protected (in this case complexed with polylysine) expression vector (in this case a plasmid), preferably this ligation is done with polylysine. Functional group that reacts with IL-2
A linker having a functional group that reacts with is added to IL-2, and then this linker is added to
It is carried out by reacting polylysine with polylysine before or after binding to the plasmid (expression vector).

【００４０】 得られた生成物はin vivoまたはin vitroにおいて投与され、IL-2(増殖活性部
分)はIL-2レセプター、特に高親和性レセプターを提示する細胞に該生成物を向
けるベクターとして働く。該生成物が取り込まれた後、IL-2-ポリリジン結合が
切断され(例えば加水分解)、IL-2が分裂を誘発し、発現ベクターが核へ移動する
ようになる。本発明のあまり好ましくない生成物とは、そのレセプターによって
取り込まれない増殖活性部分を持つものであり、この場合、該生成物の残りの部
分との結合は通常細胞外で切断され、発現ベクター(または他のヌクレオチド)が
取り込まれる。The resulting product is administered in vivo or in vitro, and IL-2 (proliferatively active moiety) serves as a vector to direct the product to cells displaying IL-2 receptors, particularly high affinity receptors. . After the product is incorporated, the IL-2-polylysine bond is cleaved (eg, hydrolyzed), IL-2 induces division and the expression vector translocates to the nucleus. A less preferred product of the invention is one that has a proliferatively active moiety that is not taken up by its receptor, in which case the binding to the rest of the product will normally be cleaved extracellularly and the expression vector ( Or other nucleotides) are incorporated.

【００４１】 （好ましい実施態様の説明） 以下、本発明の生成物を各成分について順にさらに詳細に説明する。[0041] (Description of the preferred embodiment)   Hereinafter, the product of the present invention will be described in detail for each component in order.

【００４２】 会合材料 遺伝子材料または核酸材料と会合される材料はある種の生成物では保護的なも
のである。それはミセル、特にリポソームを形成し得る。Association Material Materials associated with genetic or nucleic acid material are protective in certain products. It can form micelles, especially liposomes.

【００４３】 リポソームまたはミセルは核酸材料を封入していてもよいし、あるいは正電荷
を持っていてその表面に核酸を保持していてもよい（いわゆるリポプレックス）
。リポソームはリン脂質および類似の両親媒性脂質により形成され、市販されて
いる。コレステロールがリポソーム製剤に含まれることが多い。遺伝子導入のベ
クターとしてのカチオン性リポソームについての総説は参照文献38に見出すこと
ができる。別の種の封入組成物は人工ウイルス外被を含む（参照文献39参照）。The liposome or micelle may encapsulate a nucleic acid material, or may have a positive charge and retain the nucleic acid on its surface (so-called lipoplex).
. Liposomes are formed by phospholipids and similar amphipathic lipids and are commercially available. Cholesterol is often included in liposome formulations. A review of cationic liposomes as vectors for gene transfer can be found in reference 38. Another species of encapsulation composition comprises an artificial viral coat (see ref. 39).

【００４４】 従って、ある種の保護材料は複合体形成材料を含み、カチオン性リポソームが
含まれるだけでなくその他のカチオン性材料、特に、ポリマーも含まれる。好適
なポリマーとしては、ポリリジン（特に、ポリ-D-リジン）、ポリリジン誘導体
（例えば、特に、ポリ-L-リジンのリン脂質誘導体）およびポリエチレンイミン(
PEI)が挙げられる。その他の好適な複合体形成剤としてはデンドリマー、特に、
ポリアミドアミンデンドリマー（カチオン性）がある。Thus, certain protective materials include complexing materials and include cationic liposomes as well as other cationic materials, especially polymers. Suitable polymers include polylysine (particularly poly-D-lysine), polylysine derivatives (eg, especially phospholipid derivatives of poly-L-lysine) and polyethyleneimine (
PEI). Other suitable complexing agents include dendrimers, especially:
There are polyamidoamine dendrimers (cationic).

【００４５】 会合材料は本発明のすべての生成物において保護的でなくともよいが、もっぱ
ら保護的である。例えば、本発明の範囲にある生成物種では、カチオン性DNA結
合部分は増殖活性生成物と核酸材料（ヌクレオチド）の間に架橋を形成する。好
適なDNA結合部分にはポリリジンまたはPEIなどのカチオン性ポリマーがある。さ
らに、カチオン性またはその他の保護材料であってもよい。The associative material need not be protective in all products of the invention, but is exclusively protective. For example, in product species within the scope of the present invention, the cationic DNA binding moiety forms a bridge between the proliferative active product and the nucleic acid material (nucleotide). Suitable DNA binding moieties include cationic polymers such as polylysine or PEI. Further, it may be a cationic or other protective material.

【００４６】 核酸材料 本発明では核酸または遺伝子材料の特定の独自性または機能は重要ではなく、
本発明は主として送達方法、すなわち、ヌクレオチドの標的細胞への、特に、そ
の核への導入に関する。Nucleic Acid Material The particular identity or function of the nucleic acid or genetic material is not critical to the invention,
The present invention is primarily concerned with delivery methods, ie the introduction of nucleotides into target cells, and in particular into their nucleus.

【００４７】 核酸材料は一般に治療用遺伝子またはアンチセンスヌクレオチド（オリゴまた
はポリヌクレオチド）のいずれかを含む。アンチセンスヌクレオチドとは疾病の
原因となるタンパク質の産生を阻害するために標的mRNAまたはDNAと相補的な配
列を含む一本鎖ヌクレオチドである。アンチセンス治療は治療目的の遺伝子機能
の調節であるので、遺伝子治療の一形態であると考えられることが多い。治療用
ヌクレオチドは好適にはホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)
であるが、これはこれらがヌクレアーゼ耐性であるからである。あるいは、便宜
には、アンチセンスヌクレオチドはタンパク質核酸(PNA)であってもよい。Nucleic acid material generally comprises either therapeutic genes or antisense nucleotides (oligo or polynucleotide). Antisense nucleotides are single-stranded nucleotides that contain a sequence complementary to the target mRNA or DNA to inhibit the production of disease-causing proteins. Antisense therapy is often considered a form of gene therapy because it is the regulation of gene function for therapeutic purposes. The therapeutic nucleotide is preferably a phosphorothioate oligodeoxynucleotide (ODN)
This is because they are nuclease resistant. Alternatively, for convenience, the antisense nucleotide may be a protein nucleic acid (PNA).

【００４８】 アンチセンスヌクレオチドはウイルス疾患および癌の治療に有用であり（参照
文献25参照）、本発明はかかる治療ならびに神経変性疾患および脳血管障害の治
療のためのアンチセンス生成物の使用を含む（参照文献24）。Antisense nucleotides are useful in the treatment of viral diseases and cancer (see ref. 25) and the invention includes the use of antisense products for such treatment as well as for the treatment of neurodegenerative diseases and cerebrovascular disorders. (Reference 24).

【００４９】 本発明の生成物は治療用遺伝子の発現のための発現ベクターを含む材料であっ
てもよい。発現ベクターは制御配列に機能し得る形で連結されたタンパク質をコ
ードする遺伝子を含む。制御配列はプロモーターおよび好ましくは、例えば、免
疫グロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウイルス(CMV)に由来するエンハンサ
ーおよびポリアデニル化配列を含む。ある種の生成物では、発現ベクターはプラ
スミド構築物（組換えプラスミド）を含む。The product of the present invention may be a material containing an expression vector for expressing a therapeutic gene. The expression vector contains a gene encoding a protein operably linked to the control sequences. The control sequences include promoters and preferably, for example, immunoglobulin genes, SV40, enhancers from cytomegalovirus (CMV) and polyadenylation sequences. For certain products, the expression vector contains a plasmid construct (recombinant plasmid).

【００５０】 発現ベクターは好適には組換えプラスミドの形態である。細菌性発現カセット
の使用により、原核系における構築物の大スケール調製が可能となる。例示的プ
ラスミドは線状化された形態で図２、３および４に示されている。例えば図２は
治療用遺伝子を含むプラスミドを示し、この場合には細胞障害性遺伝子であり、
チミジンキナーゼ遺伝子として示される遺伝子特異的酵素プロドラッグ治療遺伝
子として表されている。治療用遺伝子はプロモーター、特にCMVプロモーターと
して示される制御配列に機能し得る形で連結されている。プラスミドはまたポリ
A／終結部位、細菌の開始点および抗生物質耐性遺伝子を含む。The expression vector is preferably in the form of a recombinant plasmid. The use of bacterial expression cassettes allows large scale preparation of constructs in prokaryotic systems. An exemplary plasmid is shown in FIGS. 2, 3 and 4 in linearized form. For example, Figure 2 shows a plasmid containing a therapeutic gene, in this case a cytotoxic gene,
Represented as a gene-specific enzyme prodrug therapeutic gene designated as the thymidine kinase gene. The therapeutic gene is operably linked to a regulatory sequence designated as a promoter, particularly the CMV promoter. The plasmid is also poly
Contains A / termination sites, bacterial origin and antibiotic resistance genes.

【００５１】 図３は図３のものに類似するがさらに細胞染色体外で治療用遺伝子をエピソー
ムとして維持するエピソーム維持配列を含むプラスミドを示す。これによりその
発現が高められ、かつ、異種染色質への挿入による治療用遺伝子の細胞性サイレ
ンシングが阻害される。FIG. 3 shows a plasmid similar to that of FIG. 3 but additionally containing an episomal maintenance sequence that maintains the therapeutic gene as an episome outside the cell chromosome. This enhances its expression and inhibits cellular silencing of the therapeutic gene by insertion into the heterochromatin.

【００５２】 図４の構築物は２つの治療用遺伝子を含み、これもまた細胞障害性遺伝子とし
て表されている。構築物は所望により２つの遺伝子が確実に同一のプロモーター
から同時発現されるようにIRES（内部リボソームエントリー部位）を含んでもよ
い。２つの遺伝子は同一遺伝子の反復コピーであってもよいし、あるいは異なる
機能を有してもよい。The construct of FIG. 4 contains two therapeutic genes, which are also designated as cytotoxic genes. The construct may optionally include an IRES (internal ribosome entry site) to ensure that the two genes are co-expressed from the same promoter. The two genes may be repeated copies of the same gene or may have different functions.

【００５３】 実験目的には、指標遺伝子（例えば、緑色マーカータンパク質を発現させるEG
FP遺伝子）および治療用遺伝子（例えば、発現するとガンシクロビルを活性化す
る単純ヘルペスウイルス(HSV)チミジンキナーゼ遺伝子）を含む構築物を作製す
るのが有用である。該構築物で形質導入処理された細胞は、緑色細胞を検出する
ことにより遺伝子導入が成功したかどうかモニタリングすることができる。次い
で、死滅薬（この場合にはガンシクロビル）を加えることができ、TK遺伝子によ
り緑色細胞をターゲッティングすべきである。このプロセスは好適には経時的に
光学顕微鏡でモニタリングして、該遺伝子で形質導入され、かつ、死滅した集団
における細胞死の効率、ならびに細胞パーセンテージに関する情報を得る。For experimental purposes, an indicator gene (eg, EG expressing a green marker protein
It is useful to make a construct containing the FP gene) and a therapeutic gene (eg, the herpes simplex virus (HSV) thymidine kinase gene that activates ganciclovir when expressed). Cells transduced with the construct can be monitored for successful gene transfer by detecting green cells. The killing agent (in this case ganciclovir) can then be added and the TK gene should target the green cells. The process is preferably monitored by light microscopy over time to obtain information on the efficiency of cell death in the population transduced and killed with the gene, as well as the cell percentage.

【００５４】 該遺伝子は治療機能を有するいずれの遺伝子であってもよく、制限されるもの
ではないが、例としては遺伝子治療の当業者に現在公知である治療用遺伝子が挙
げられる。代表的な遺伝子種としては免疫遺伝子（例えば、サイトカイン遺伝子
治療、DNAに基づく癌ワクチン）、細胞傷害性遺伝子、特に酵素プロドラッグ治
療用遺伝子（例えば、ウイルスチミジンキナーゼ、細菌またはその他のシトシン
デアミナーゼ、シトクロムP-450またはバクテリア・ニトロレダクターゼをコー
ドする遺伝子）および欠損修復遺伝子（例えば、腫瘍抑制遺伝子、特に、p53）
が挙げられる。The gene may be any gene having a therapeutic function, including, but not limited to, therapeutic genes currently known to those skilled in the art of gene therapy. Representative gene species include immune genes (eg, cytokine gene therapy, DNA-based cancer vaccines), cytotoxic genes, especially gene for enzyme prodrug therapy (eg, viral thymidine kinase, bacterial or other cytosine deaminase, cytochrome). Genes encoding P-450 or bacterial nitroreductase) and defective repair genes (eg tumor suppressor genes, especially p53)
Is mentioned.

【００５５】 本発明はまた核酸材料が非特異的および／または非アンチセンス作用を有する
生成物、例えば、ウイルスの吸着、浸透または脱コートを阻害することでウイル
ス感染を阻害する生成物を含む。The present invention also includes products in which the nucleic acid material has a non-specific and / or non-antisense action, eg, products that inhibit viral infection by inhibiting adsorption, penetration or decoating of viruses.

【００５６】 増殖活性部分 本発明は主として核酸の送達技術に関するものであって、特定の疾病の治療に
関するものではないので、本発明の生成物は全く同じもの、すなわち増殖活性部
分の機能に限定されるものではない。しかし、増殖活性部分としては通常、サイ
トカインまたは成長因子である。サイトカインとしてはインターロイキン、例え
ばTNF、例えばM-CSF；IFN、例えばFGF；IGF、TGF、例えばGM-CSF；SCF；G-GSF；
またはEPOであり得る。Proliferatively Active Moieties Since the present invention is primarily concerned with nucleic acid delivery technology and not the treatment of particular diseases, the products of the invention are identical in nature, ie limited to the function of proliferatively active moieties. Not something. However, the proliferatively active moiety is usually a cytokine or growth factor. Cytokines include interleukins such as TNF such as M-CSF; IFN such as FGF; IGF, TGF such as GM-CSF; SCF; G-GSF;
Or it could be the EPO.

【００５７】 サイトカインは好ましくはヒト・サイトカインである。[0057]   The cytokine is preferably a human cytokine.

【００５８】 成長因子は造血またはリンパ球生成成長因子であり得る。それらは成熟したリ
ンパ系造血細胞のいくつかの機能活性に影響を及ぼす他。始原細胞の生存、増殖
および分化を調節する糖タンパク質ホルモンのファミリーであるThe growth factor can be hematopoietic or lymphopoietic growth factor. Others affect some functional activities of mature lymphoid hematopoietic cells. A family of glycoprotein hormones that regulate progenitor cell survival, proliferation, and differentiation

【００５９】 好適な成長因子としては、 エリトロポエチン(Epo)； GM-CSF； G-CSF； SCF(幹細胞因子)； マルチ-CSF(インターロイキン-3としても知られる)； M-CSF； E-CSF(またはインターロイキン-5)； IGF-1(インスリン様成長因子)； PDGF(血小板由来成長因子)； TGFβ2(トランスフォーミング成長因子-β2) が挙げられる。[0059]   Suitable growth factors include   Erythropoietin (Epo);   GM-CSF;   G-CSF;   SCF (Stem Cell Factor);   Multi-CSF (also known as interleukin-3);   M-CSF;   E-CSF (or interleukin-5);   IGF-1 (insulin-like growth factor);   PDGF (platelet-derived growth factor);   TGFβ2 (Transforming growth factor-β2) Is mentioned.

【００６０】 この増殖活性部分または分裂誘発部分は好ましい種の生成物では標的細胞に取
り込まれるが、そうではない種の生成物では取り込まれない。例えば、分裂誘発
部分はチロシンキナーゼ／SH2媒介性のEGFまたはFGFなどの成長因子であり得る
。取り込まれない分裂誘発因子の場合、核酸材料は分裂誘発因子から切断可能で
あり、かつ／または送達材料、例えばリポソームまたはDNA結合材料と会合して
いることが好ましい。This proliferatively active or mitogenic portion is taken up by the target cells in the product of the preferred species, but not in the product of the species that is not. For example, the mitogenic moiety can be a tyrosine kinase / SH2-mediated growth factor such as EGF or FGF. In the case of mitogens that are not incorporated, it is preferred that the nucleic acid material is cleavable from the mitogen and / or associated with a delivery material, such as a liposome or DNA binding material.

【００６１】 FGF生成物の適用としては、固形癌における抗脈管形成因子としての使用、お
よび硬皮症における繊維芽細胞の機能亢進を妨げるための使用が挙げられる。特
に、FGF-2およびFGF-7はいずれも高親和性レセプターを有し、前立腺癌に関連づ
けられている。Applications of FGF products include use as anti-angiogenic factors in solid tumors and to prevent fibroblast hyperactivity in scleroderma. In particular, both FGF-2 and FGF-7 have high affinity receptors and are associated with prostate cancer.

【００６２】 本発明はEGF、FGF-2またはFGF-7レセプター(特に高親和性レセプター)と結合
して増殖を促進する機能を持つドメインと、ヌクレオチド、例えば遺伝子材料と
を含む生成物を提供する。EGF、FGF-2またはFGF-7レセプター結合機能を有する
ドメインまたは部分は、あり得る場合としてEGFレセプター、FGF-2レセプターま
たはFGF-7レセプター、特にはEGF高親和性レセプター、FGF-2高親和性レセプタ
ーまたはFGF-7高親和性レセプターを有する細胞に第２のドメインまたは部分を
向けるためのベクターとして働く。FGF-2またはFGF-7レセプター結合機能を有す
る生成物は、抗癌剤を乳癌、胃癌、食道癌および前立腺癌細胞にターゲッティン
グするのに有用である。The present invention provides a product comprising a domain having a function of binding to EGF, FGF-2 or FGF-7 receptor (particularly high affinity receptor) and promoting proliferation, and nucleotides such as genetic material. . The domain or portion having the binding function of EGF, FGF-2 or FGF-7 receptor may be EGF receptor, FGF-2 receptor or FGF-7 receptor, especially EGF high affinity receptor, FGF-2 high affinity Acts as a vector to direct the second domain or moiety to cells which have the receptor or FGF-7 high affinity receptor. Products with FGF-2 or FGF-7 receptor binding function are useful for targeting anti-cancer agents to breast, gastric, esophageal and prostate cancer cells.

【００６３】 EGFレセプター結合機能を有する生成物は、抗癌剤を大部分の腫瘍種、特には
乳癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌および前立腺癌起源のものにターゲッティングする
のに有用である。Products with EGF receptor binding function are useful for targeting anti-cancer agents to most tumor types, especially those of breast, gastric, ovarian, bladder and prostate cancer origin.

【００６４】 ２つのドメインまたは部分は生理学的に切断可能な結合によって連結され、こ
れがレセプターと結合した生成物において切断されることが好適である。この２
つのドメインまたは部分間の結合は共有結合であってもよいが、共有結合でない
生成物もある。ある種の生成物は上記のような複数箇所の架橋基を有する分子を
含む。Suitably the two domains or moieties are linked by a physiologically cleavable bond which is cleaved in the product bound to the receptor. This 2
The linkage between the two domains or moieties may be covalent, although some products are not. Certain products include molecules with multiple bridging groups as described above.

【００６５】 サイトカインまたは成長因子(または増殖因子)は天然型であっても、１以上の
アミノ酸変異(欠失、付加または置換)によって改変された天然型分子である突然
変異タンパク質であってもよい。本発明で使用できる、かかる突然変異タンパク
質は、レセプターに対する機能的親和性(ある実施態様では高親和性レセプター
に対する機能的親和性)、および多くの例ではレセプターをともなって、レセプ
ターを提示する細胞に取り込まれる生成物を形成し得る能力の双方を有するとい
う点で、天然型タンパク質の生物活性を有するものである。The cytokines or growth factors (or growth factors) may be naturally occurring or muteins that are naturally occurring molecules modified by one or more amino acid mutations (deletion, addition or substitution). . Such muteins that can be used in the present invention are those that have a functional affinity for the receptor (in certain embodiments a functional affinity for the high affinity receptor) and, in many instances, the receptor, in cells presenting the receptor. It has the biological activity of the native protein in that it has both the ability to form an incorporated product.

【００６６】 サイトカインおよび成長因子は組換え分子であるのが好ましいが、サイトカイ
ンまたは成長因子を産生する細胞系統、例えば末梢血リンパ球を培養することで
作製してもよい。Although the cytokines and growth factors are preferably recombinant molecules, they may be produced by culturing cell lines that produce cytokines or growth factors, such as peripheral blood lymphocytes.

【００６７】 ある実施態様では、該生成物は、サイトカインまたは成長因子高親和性レセプ
ターとの高い親和性を有し、ある種の生成物ではレセプターを提示する細胞に取
り込まれるようなレセプターと複合体を形成する機能を持つ分子に連結された保
護材料および／またはDNA結合材料と会合したヌクレオチドを含む。特定の種の
生成物では、この分子は天然もしくは突然変異タンパク質サイトカイン、または
その断片であり得る。別の種の生成物では、この分子は天然もしくは突然変異タ
ンパク質成長因子、またはその断片であり得る。In some embodiments, the product has a high affinity for the cytokine or growth factor high affinity receptor and in certain products is complexed with the receptor such that it is taken up by cells presenting the receptor. A nucleotide associated with a protective material and / or a DNA binding material linked to a molecule that has the function of forming In the product of a particular species, this molecule may be the native or mutein cytokine, or a fragment thereof. In another species of product, the molecule can be a native or mutein growth factor, or a fragment thereof.

【００６８】 特に好ましいのはサイトカインのインターロイキン-2(IL-2)である。IL-2は正
常な末梢血リンパ球によって産生されるリンホカインであり、植物レクチン、抗
原またはその他の刺激に曝された後に抗原または分裂誘発因子により刺激された
Ｔ細胞の増殖を促進する。IL-2は最初にMorgan, D.A., et al., Science (1976)
, 193: 1007-1008により記載された。その後、刺激されたＴリンパ球の増殖を促
進するその能力のためにＴ細胞成長因子と呼ばれ、現在ではその成長因子特性の
他、in vitroおよびin vivoで種々の免疫系の機能を調節するものと認識され、
インターロイキン-2(IL-2)と命名し直された。Particularly preferred is the cytokine interleukin-2 (IL-2). IL-2 is a lymphokine produced by normal peripheral blood lymphocytes that promotes the proliferation of antigen- or mitogen-stimulated T cells after exposure to plant lectins, antigens or other stimuli. IL-2 was first identified by Morgan, DA, et al., Science (1976).
, 193: 1007-1008. It is subsequently called T cell growth factor because of its ability to promote the proliferation of stimulated T lymphocytes, which now regulates its growth factor properties as well as the functions of various immune systems in vitro and in vivo. Recognized as
It was renamed Interleukin-2 (IL-2).

【００６９】 インターロイキン-2は、例えば米国特許第4,401,756号に記載されるように、
ヒト末梢血リンパ球(PBL)を培養することで作製することができる。また好まし
い別法として、IL-2は組換え体であってもよい。Taniguchi, T. et al., Nature
(1983), 302:305-310およびDevos, R., Nucleic Acids Research (1983), 11:4
307-4323はヒトIL-2遺伝子をクローニングし、微生物内でそれを発現させること
を報告している。Interleukin-2 is described in, for example, US Pat. No. 4,401,756,
It can be prepared by culturing human peripheral blood lymphocytes (PBL). As a preferred alternative, IL-2 may be recombinant. Taniguchi, T. et al., Nature
(1983), 302: 305-310 and Devos, R., Nucleic Acids Research (1983), 11: 4.
307-4323 reported that the human IL-2 gene was cloned and expressed in a microorganism.

【００７０】 米国特許第4,518,584号は、野生型すなわち天然型分子の125位に通常存在する
システインが、セリンまたはアラニンなどの中性アミン酸に置き換わったIL-2突
然変異タンパク質を記載および請求している。生物活性を持つIL-2の酸化耐性突
然変異タンパク質が製造でき、ここでは突然変異タンパク質が由来するタンパク
質の各メチオニン残基をアラニンなどの保存的アミノ酸に置換する(メチオニン
残基はクロラミンＴまたは過酸化物酸化を受けやすい)。これらのIL-2突然変異
タンパク質は天然型IL-2の生物活性を有する。米国特許第4,530,787号および同
第4,569,790号は、天然型IL-2とその突然変異タンパク質との組換え体、ならび
に純粋型のIL-2を精製する方法を記載および請求している。これら前記の米国特
許は出典明示して本明細書の一部とみなす。US Pat. No. 4,518,584 describes and claims an IL-2 mutein in which the cysteine normally present at position 125 of the wild type or naturally occurring molecule is replaced by a neutral amine acid such as serine or alanine. There is. A biologically active IL-2 oxidation-resistant mutein can be produced, in which each methionine residue of the protein from which the mutein is derived is replaced by a conservative amino acid such as alanine (methionine residue may be chloramine T or a Susceptible to oxide oxidation). These IL-2 muteins have the biological activity of native IL-2. US Pat. Nos. 4,530,787 and 4,569,790 describe and claim recombinants of native IL-2 and its muteins, as well as methods for purifying pure IL-2. These aforementioned U.S. patents are expressly incorporated herein by reference.

【００７１】 IL-2突然変異タンパク質desala1-IL-2ser125(アルデスロイキン)はChiron B.V
., Amsterdam, Netherlandsからプロロイキン(Proleukin)の商標で市販されてい
る。IL-2 mutein desala 1 -IL-2ser 125 (aldesleukin) is Chiron BV
., Amsterdam, Netherlands under the trademark Proleukin.

【００７２】 増殖活性部分と核酸間の結合 増殖活性部分と核酸材料間の結合の性質は本発明にとって重要ではない。いく
つかの例では、架橋基が共有結合によってそれら両者に直接結合している。また
他のいくつかの例では、架橋基が増殖活性部分と会合材料の間を直接共有結合し
ている。この架橋基は公知のヘテロ二官能基リンカーまたはホモ二官能基リンカ
ーを含んでもよいし、あるいは２つのヘテロ二官能基リンカーの内部結合によっ
て形成してもよい。いくつかの例では、例えば増殖活性部分とリポソーム外被の
間にはペプチドリンカーが用いられる(例えば参照文献19を参照)。Binding between Proliferatively Active Moiety and Nucleic Acid The nature of the binding between the proliferatively active moiety and the nucleic acid material is not critical to the invention. In some cases, the bridging groups are directly attached to them both by covalent bonds. In some other examples, the bridging group provides a direct covalent bond between the growth-active moiety and the associative material. The bridging group may comprise a known heterobifunctional or homobifunctional linker, or may be formed by the internal attachment of two heterobifunctional linkers. In some examples, a peptide linker is used, eg, between the proliferatively active moiety and the liposomal envelope (see eg ref. 19).

【００７３】 増殖活性部分は通常ペプチドであり、核酸または会合材料と共有結合した好ま
しい種の生成物中に存在している。このペプチド部分は、その第一級アミン残基
を介してペプチドに結合し、さらにその官能基を介して他の物質に結合している
架橋部分によって核酸または会合材料に共有結合し得る。例えば、ポリリジンま
たはPEI複合体形成部分はそのアミン基の１つを介して架橋基に結合することが
でき、核酸はその水酸基の１つを介して架橋基に結合することができる。The proliferatively active moiety is usually a peptide and is present in the product of a preferred species covalently linked to nucleic acid or associated material. The peptide moiety may be covalently attached to the nucleic acid or associated material by a cross-linking moiety that is attached to the peptide via its primary amine residue and to other substances via its functional groups. For example, the polylysine or PEI complexing moiety can be attached to the bridging group via one of its amine groups and the nucleic acid can be attached to the bridging group via one of its hydroxyl groups.

【００７４】 分子の２つの活性ドメイン(増殖活性部分と核酸または遺伝子材料)は、増殖活
性部分および第２のヘテロ二官能性架橋基(次ぎに核酸または会合材料と結合す
る)と結合した第１のヘテロ二官能性架橋残基を含む架橋部分を介して互いに結
合した好ましい種の分子中に存在する。The two active domains of the molecule (the proliferatively active portion and the nucleic acid or genetic material) are linked to the proliferatively active portion and a second heterobifunctional bridging group, which in turn binds the nucleic acid or associated material Present in molecules of a preferred species linked to each other via a bridging moiety containing a heterobifunctional bridging residue of.

【００７５】 その他の特徴 本発明はまた、もう１つの態様において、特にサイトカインまたは成長因子に
対する高親和性レセプターを有する細胞に関わる疾病または疾患の予防または治
療処置法を含み、該細胞内で該サイトカインまたは成長因子と結合した際に生物
活性を持つ作用因子を含む生成物の有効量を患者に投与することを含む。なお、
かかる生成物およびそれらを含有する製剤は本発明のさらなる態様をなす。Other Features The present invention also includes, in another aspect, a method for the prophylactic or therapeutic treatment of a disease or disorder involving cells having, in particular, high affinity receptors for cytokines or growth factors, in which the cytokines. Alternatively, it comprises administering to the patient an effective amount of a product that includes an agent that has biological activity when bound to a growth factor. In addition,
Such products and formulations containing them form a further aspect of the invention.

【００７６】 さらに、本発明には、医薬として、特に該生成物の増殖活性因子、サイトカイ
ンまたは成長因子に対する高親和性レセプターを有する細胞に該生物活性因子を
取り込ませる際に用いられる本発明の生成物が含まれる。Furthermore, the present invention provides the preparation of the invention for use as a medicament, in particular for incorporating the bioactive factor into cells having a high affinity receptor for the proliferative activator, cytokine or growth factor of the product. Things are included.

【００７７】 本発明のもう１つの態様は、該生成物の増殖活性因子、サイトカインまたは成
長因子に対する高親和性レセプターを有する細胞に該生物活性因子を取り込ませ
、さらに所望によりリンパ球増殖を刺激する薬剤の製造のための本発明の生成物
の使用にある。Another aspect of the invention is to incorporate the bioactive factor into cells having a high affinity receptor for the product's growth activating factor, cytokine or growth factor, and optionally to stimulate lymphocyte proliferation. In the use of the product according to the invention for the manufacture of a medicament.

【００７８】 以下、ある特定のサイトカイン、成長因子、生物活性因子および疾病に関して
例を示すことで本発明を説明する。もちろん本発明はこれらの特定の特徴に限定
されるものではない。The invention will now be described by showing examples with respect to certain cytokines, growth factors, bioactive factors and diseases. Of course, the invention is not limited to these particular features.

【００７９】 本発明の生成物はサイトカインまたは成長因子に対する高親和性レセプターを
提示する細胞のみで機能することが好ましく、それは典型的にはリンパ球または
免疫応答に関わるその他の細胞である。その標的細胞における本発明の生成物の
作用は活性因子の機能によるものである。The products of the invention preferably function only on cells which present high affinity receptors for cytokines or growth factors, which are typically lymphocytes or other cells involved in the immune response. The action of the product of the invention on the target cell is due to the function of the activator.

【００８０】 本発明の生成物における活性因子：核酸材料の分子比は重要ではない。従って
本発明は1:1以下の比を含むが、ある実施態様ではその比は1:1より大きく、例え
ば1:1000以上であり、すなわち複数の活性因子分子／原子が各々の増殖活性部分
に結合されてもよい。The molecular ratio of active agent: nucleic acid material in the products of the invention is not critical. Thus the invention includes ratios of 1: 1 or less, but in some embodiments the ratio is greater than 1: 1 such as 1: 1000 or more, i.e. more than one activator molecule / atom in each proliferative active moiety. May be combined.

【００８１】 以下、例示的な生成物および生成物種に関して例を示すことで本発明の生成物
をさらに詳細に説明する。The products of the invention are described in further detail below by giving examples with respect to exemplary products and product species.

【００８２】 インターロイキン-2／アンチセンス生成物 IL-2／アンチセンス融合生成物は、IL-2レセプターを有するリンパ球に特異的
なアンチセンス配列(オリゴヌクレオチド)を導入するのに有用である。Interleukin-2 / Antisense Products IL-2 / antisense fusion products are useful for introducing antisense sequences (oligonucleotides) specific for lymphocytes carrying the IL-2 receptor. .

【００８３】 標的細胞に取り込ませるサイトカイン(例えばIL-2)を用いれば、所定の一連の
HIVゲノム(例えば、外被タンパク質または転写酵素をコードするゲノム)に対す
るアンチセンス化合物が、例えば静脈投与などの薬理学的方法論を用いて所定の
患者のリンパ球に特異的に導入され得る。Using a cytokine (eg, IL-2) that is taken up by target cells, a given series of
Antisense compounds directed against the HIV genome (eg, a genome encoding a coat protein or a transcriptase) can be specifically introduced into lymphocytes of a given patient using pharmacological methodologies such as intravenous administration.

【００８４】 IL-2／アンチセンス生成物はまた、遺伝子変異または癌遺伝子の過剰発現が知
られている腫瘍転換によって影響を受けたＴ細胞系統にアンチセンス化合物また
はアンチ癌遺伝子を導入するのに使用してもよい。IL-2 / antisense products may also be used to introduce antisense compounds or anti-oncogenes into T cell lines affected by oncotransformation where known gene mutations or oncogene overexpression is known. May be used.

【００８５】 治療可能な疾病 IL-2／有効化合物融合生成物は、リンパ球が主として組織損傷に関わり、結果
としてその疾病の本質が発症するという疾病に有用である。Treatable Diseases IL-2 / active compound fusion products are useful in diseases in which lymphocytes are primarily involved in tissue damage, resulting in the essence of the disease.

【００８６】 本質において、インターロイキン-2高親和性レセプターによって方向付けられ
る免疫抑制療法は、薬理学的に、しかし、最近では細胞膜上にこの構造を有する
活性化リンパ球(特にＴ細胞)でのみ働く。この活性化シグナルは休止中のＴ細胞
やその他いずれの非リンパ組織の表面にも存在しない。サイトカイン／核酸の用
量が極めて少なくともターゲッティング可能である。In essence, immunosuppressive therapies directed by interleukin-2 high affinity receptors are pharmacologically, but recently only on activated lymphocytes (particularly T cells) that have this structure on the cell membrane. work. This activation signal is not present on the surface of resting T cells or any other non-lymphoid tissue. The cytokine / nucleic acid dose is very at least targetable.

【００８７】 リンパ球が抗原刺激(自己免疫疾患の場合は自己抗原、移植の場合は異種抗原)
に応答すると、レセプターは短い増殖期の間に一時的に発現するだけであるので
、活性化リンパ球だけに向けた選択的in vivo免疫抑制(オリゴクローナル免疫抑
制)が達成できる。この薬理作用は従来の免疫抑制剤によって発揮される一般の
免疫抑制作用とは総体的に異なるものである。Lymphocyte antigen stimulation (self antigen in case of autoimmune disease, xenoantigen in case of transplantation)
In response to, the receptor is only transiently expressed during the short growth phase, so that selective in vivo immunosuppression directed only to activated lymphocytes (oligoclonal immunosuppression) can be achieved. This pharmacological action is totally different from the general immunosuppressive action exerted by conventional immunosuppressive agents.

【００８８】 このアプローチから利益を受け得る疾病としては、自己免疫疾患、移植拒絶、
HIV感染およびリンパ組織増殖性疾患が挙げられる。Diseases that could benefit from this approach include autoimmune diseases, transplant rejection,
HIV infection and lymphoproliferative disorders are included.

【００８９】 自己免疫疾患 自己免疫疾患は、免疫系、特にＴリンパ球による組織抗原および／または細胞
抗原の異常な認識による標的器官への免疫攻撃という、共通の病因経路を有する
広範な疾患である(17)。Autoimmune Disease Autoimmune diseases are widespread diseases with a common etiological pathway of immune attack on target organs by abnormal recognition of tissue and / or cellular antigens by the immune system, especially T lymphocytes. (17).

【００９０】 この免疫攻撃はＴ細胞により媒介される細胞傷害性、Ｂリンパ球によって産生
された体液性自己免疫抗体、補体の活性化および消費のネットワーク、ならびに
最後には組織損傷により実行される。自己免疫疾患におけるＴリンパ球系統の異
常な活性化の中心的な役割はよく認識されている。This immune attack is carried out by T cell-mediated cytotoxicity, humoral autoimmune antibodies produced by B lymphocytes, a network of complement activation and consumption, and finally by tissue damage. . The central role of aberrant activation of the T lymphocyte lineage in autoimmune diseases is well recognized.

【００９１】 本項の臨床疾患およびそれらの標的器官としては以下のようなものがある： 1. 自己免疫性真性糖尿病(Ｉ型糖尿病)→内分泌系膵臓 2. 自己免疫性甲状腺炎(Hashimotoその他)→甲状腺 3. 自己免疫性肝炎(慢性活動性肝炎)→肝臓 4. 慢性関節リウマチ→滑膜／関節／内臓 5. 自己免疫性腎炎(糸球体腎炎)→腎臓 6. ブドウ膜炎(ベーチェット症候群)→眼 7. 多発性硬化症→CNS/PNS 8. シェーグレン症候群→唾液腺 9. 硬皮症→皮膚／内臓 10. 皮膚多発性筋炎→皮膚／筋肉／内臓 11. 全身性紅斑性狼瘡(SLE)→内臓／皮膚／造血系／粘膜 12. 自己免疫性溶血性貧血→赤血球 13. 特発性血小板減少性紫斑病(ITP)→血小板 14. 自己免疫性好中球減少症→好中球 15. 脈管炎→脈管 16. クローン病→腸 17. 潰瘍性大腸炎→腸 18. 腹腔病→腸 19. 乾癬→皮膚／関節／内臓 20. 類肉腫炎→肺／内臓／皮膚 21. アトピー症候群[0091]   The clinical diseases in this section and their target organs include the following: 1. Autoimmune diabetes mellitus (Type I diabetes) → endocrine pancreas 2. Autoimmune thyroiditis (Hashimoto and others) → Thyroid 3. Autoimmune hepatitis (chronic active hepatitis) → liver 4. Rheumatoid arthritis-> synovium / joint / visceral 5. Autoimmune nephritis (glomerulonephritis) → kidney 6. Uveitis (Bechet's syndrome) → eye 7. Multiple sclerosis → CNS / PNS 8. Sjogren's syndrome → salivary glands 9. Scleroderma → skin / visceral 10. Polymyositis cutaneum → skin / muscle / visceral 11. Systemic lupus erythematosus (SLE) -visceral / skin / hematopoietic system / mucosa 12. Autoimmune hemolytic anemia → red blood cells 13. Idiopathic thrombocytopenic purpura (ITP) → platelets 14. Autoimmune neutropenia → Neutrophils 15. Vasculitis → Vascular 16. Crohn's disease → intestine 17. Ulcerative colitis → intestine 18. Celiac disease → intestine 19. Psoriasis → skin / joint / visceral 20. Sarcomatitis → lung / visceral / skin 21. Atopic syndrome

【００９２】 これらの病徴の大部分には、病的なリンパ球媒介性の反応および細胞傷害性が
存在する。Most of these symptoms are pathological lymphocyte-mediated reactions and cytotoxicity.

【００９３】 特定の疾病の病因および標的とされる組織の損傷の進行におけるＴ細胞の役割
を支持する証拠は確固としたものである。上記の疾病の大部分において、標的組
織で優勢なＴ細胞の表現型はCD4細胞(Ｔ細胞の細胞傷害性サブセット)である。
Ｔ細胞はいくつかの活性化マーカーを発現する。Evidence supporting the role of T cells in the pathogenesis of specific diseases and the progression of targeted tissue damage is solid. In most of the above diseases, the predominant T cell phenotype in the target tissue is CD4 cells (cytotoxic subset of T cells).
T cells express several activation markers.

【００９４】 実験的には、胸管ドレナージ、全リンパ系照射およびシクロスポリンの投与の
ようにＴ細胞を標的とした介入がなされた場合には、自己免疫疾患は改善すると
いう証拠がある。さらに、活性型の自己免疫疾患は一般に、CD4血球減少が起こ
っているAIDS患者ではあまり重篤でない。Experimentally, there is evidence that autoimmune disease is ameliorated when T-cell targeted interventions such as thoracic drainage, total lymphatic system irradiation and administration of cyclosporine. In addition, active forms of autoimmune disease are generally less severe in AIDS patients with CD4 cytopenias.

【００９５】 ほとんどの自己免疫疾患は免疫抑制剤および抗炎症剤を用いて免疫系の機能を
減退させることを試みることで治療される。この治療の方法論は非特異的に行わ
れるので、時には医原毒性が生じたり、また疾病過程全体が管理することができ
なくなったりすることがある。Most autoimmune diseases are treated by trying to reduce the function of the immune system with immunosuppressive and anti-inflammatory agents. The methodology of this treatment is non-specific and can sometimes lead to iatrogenic toxicity and even loss of control over the entire disease process.

【００９６】 ある自己免疫攻撃の急性期に関わるリンパ球はすべて膜上に高親和性IL-2レセ
プターを有している。それらはIL-2に高い親和性を有し、抗原により活性化され
るか、あるいはサイトカインにより活性化されるリンパ球である。All lymphocytes involved in the acute phase of an autoimmune attack have high affinity IL-2 receptors on their membranes. They are lymphocytes that have a high affinity for IL-2 and are either antigen-activated or cytokine-activated.

【００９７】 IL-2／免疫抑制核酸を極めて低用量で非経口投与すれば、IL-2を薬理活性核酸
のベクターとして用いて免疫抑制を発揮させることができる。IL-2／免疫抑制核
酸生成物はIL-2の高親和性レセプターを有する細胞にのみ選択的に結合してそれ
と相互作用する。これは組織の損傷および疾病の進行に関わる免疫細胞が選択的
に不活性化され、慢性疾患患者を治癒させ得るか、あるいはそれらの再発率を小
さくし得ることを意味する。When IL-2 / immunosuppressive nucleic acid is administered parenterally at an extremely low dose, IL-2 can be used as a vector for pharmacologically active nucleic acid to exert immunosuppression. The IL-2 / immunosuppressive nucleic acid product selectively binds to and interacts only with cells which have a high affinity receptor for IL-2. This means that immune cells involved in tissue damage and disease progression can be selectively inactivated to cure chronically ill patients or reduce their recurrence rate.

【００９８】 組換えタンパク質、例えば組換えIL-2およびその他の組換えサイトカインおよ
び成長因子は通常、免疫原性が低く、組織分布も良好である。非経口投与後は、
あらゆるリンパ球(循環リンパ球、組織のリンパ球およびリンパ節のリンパ球)を
はじめ体内のあらゆる組織コンパートメントが曝される。Recombinant proteins such as recombinant IL-2 and other recombinant cytokines and growth factors are usually less immunogenic and have a better tissue distribution. After parenteral administration,
All tissue compartments in the body are exposed, including all lymphocytes (circulating lymphocytes, tissue lymphocytes and lymph node lymphocytes).

【００９９】 移植 移植器官の急性または慢性拒絶は、宿主のＴ細胞を提示する異種抗原(移植器
官のドナーに特異的な抗原)に関するものである。抗原提示と認識の後、IL-2に
対する高親和性レセプターが発現している間、免疫細胞は増殖期に入る。これに
より細胞傷害プロセスの活性化、さらには移植器官の損傷、次いで起こる不全が
もたらされる。Transplantation Acute or chronic rejection of transplanted organs refers to xenoantigens presenting host T cells (antigens specific to the donor of the transplanted organ). After antigen presentation and recognition, immune cells enter the proliferative phase while the high affinity receptor for IL-2 is expressed. This results in activation of the cytotoxic process, as well as damage to the transplanted organ and subsequent failure.

【０１００】 免疫抑制核酸をターゲッティングするためにベクターとしてIL-2を用いると、
従来の免疫抑制療法(急性、遅延および長期)の毒性を伴わずに移植器官の延命を
達成する。Using IL-2 as a vector to target immunosuppressive nucleic acids,
Achieve survival of transplanted organs without the toxicity of conventional immunosuppressive therapies (acute, delayed and long-term).

【０１０１】 白血病(リンパ性および骨髄性とも)、サラセミアおよび固形癌を治療および治
癒するには同種異系骨髄移植(ABMT)が用いられる。本発明の生成物は、(移植片
起源の)全免疫系に欠陥を生じることなく、宿主の組織抗原に対するドナー免疫
系の反応である移植片対宿主病(GVHD)の発病率を下げる可能性を持つ。その結果
、GVHDによる死亡率(現在40%を超える)を引き下げ、感染合併症および最小残存
疾病に対する積極的な抗腫瘍作用(いわゆる移植片対白血病作用)を軽減すること
ができる。Allogeneic bone marrow transplant (ABMT) is used to treat and cure leukemia (both lymphoid and myeloid), thalassemia and solid cancer. The products of the present invention may reduce the incidence of graft-versus-host disease (GVHD), a reaction of the donor immune system to host tissue antigens, without compromising the entire immune system (of graft origin). have. As a result, it is possible to reduce the mortality rate (currently more than 40%) due to GVHD and reduce the positive antitumor effect (so-called graft-versus-leukemia effect) against infectious complications and minimal residual disease.

【０１０２】 HIV感染 低用量のIL-2／HIVゲノム画分特異的アンチセンスヌクレオチドの投与はin vi
voにおいて高親和性レセプターを有するHIV陰性リンパ球に対して免疫刺激作用
を発揮する。アンチセンスヌクレオチドはHIVに感染したリンパ球(CD4細胞)の細
胞質に導入され、刺激されている正常な反応性リンパ球に影響を及ぼさずに感染
細胞の選択的破壊をもたらす。HIV infection Administration of low doses of IL-2 / HIV genomic fraction-specific antisense nucleotides was performed in vitro.
It exerts an immunostimulatory action on HIV-negative lymphocytes having a high affinity receptor in vo. Antisense nucleotides are introduced into the cytoplasm of HIV-infected lymphocytes (CD4 cells) and lead to the selective destruction of infected cells without affecting the normal reactive lymphocytes being stimulated.

【０１０３】 リンパ組織増殖性疾患(リンパ球芽性白血病およびリンパ腫) IL-2／細胞傷害性遺伝子構築物を用い、非リンパ系コンパートメントに対する
著しい全身毒性を誘導することなく、高親和性IL-2レセプターを発現する腫瘍性
リンパ系を選択的に死滅させることができる。Lymphoid tissue proliferative disorders (lymphoblastic leukemia and lymphoma) The IL-2 / cytotoxic gene construct was used to induce the high affinity IL-2 receptor without inducing significant systemic toxicity to non-lymphoid compartments. It is possible to selectively kill the neoplastic lymphoid system that expresses.

【０１０４】 成長因子またはIL-2以外のサイトカインを含む生成物を以下に記載の療法に用
いてもよい。 TNF-αはマクロファージおよび破骨細胞をその標的細胞とする。TNF-α／阻害
性化合物生成物はマクロファージへ阻害性ヌクレオチド(細胞の機能を阻害し、
かつ／または細胞を死滅させる)を挿入するのに使用できる。かかる生成物はい
くつかの病状、例えばマクロファージの過剰な刺激や活性化が悪液質および腫瘍
の進行に関わる進行した固形癌、単球-マクロファージ腫瘍症(例えば組織球増殖
症)、移植拒絶およびGVHD、自己免疫、および神経変性疾患(その細胞外ドメイン
のTNFレセプターが神経成長因子レセプターと類似している)における重要な手段
を提供することができる。Products containing growth factors or cytokines other than IL-2 may be used in the therapies described below. TNF-α targets macrophages and osteoclasts as its target cells. The TNF-α / inhibitory compound product is an inhibitory nucleotide (which inhibits the function of cells
And / or killing the cells). Such products are associated with several pathological conditions, such as advanced solid tumors in which hyperstimulation and activation of macrophages are associated with cachexia and tumor progression, monocyte-macrophage neoplasia (e.g. histiocytosis), transplant rejection and It can provide important tools in GVHD, autoimmunity, and neurodegenerative diseases, whose extracellular domain TNF receptors are similar to nerve growth factor receptors.

【０１０５】 M-CSF(マクロファージコロニー刺激因子)は、TNF-α／阻害性ヌクレオチド生
成物と同じ種の症状を治療するのに有用な阻害性ヌクレオチドを含む生成物を形
成するのに使用できる。M-CSF (Macrophage Colony Stimulating Factor) can be used to form products containing inhibitory nucleotides that are useful in treating conditions of the same species as TNF-α / inhibitory nucleotide products.

【０１０６】 M-CSFはまた、CNSにおける小神経膠細胞の増殖にも関わる。従って他の可能性
のある適用としては、アルツハイマー症候群などのCNSの変性疾患および骨の疾
患におけるものがある。M-CSF is also involved in the proliferation of microglial cells in the CNS. Thus, other potential applications are in CNS degenerative and bone disorders such as Alzheimer's syndrome.

【０１０７】 INF／核酸生成物(IFN-α、βまたはγ)は活性化されたリンパ球、マクロファ
ージ、内皮細胞および繊維芽細胞の機能を改変するため、あるいはHIV感染症(AI
DS)などの種々の病状、および硬皮症などの繊維芽細胞関連の疾患においてそれ
らの能力を失わせるために使用できる。The INF / nucleic acid product (IFN-α, β or γ) is used to modify the function of activated lymphocytes, macrophages, endothelial cells and fibroblasts, or for HIV infection (AI
It can be used to abolish their ability in various medical conditions such as DS) and in fibroblast-related diseases such as scleroderma.

【０１０８】 FGF生成物の可能性のある適用としては、固形癌における抗脈管形成因子とし
ての使用、硬皮症において繊維芽細胞の機能亢進を阻害することが挙げられる。
本発明によれば、本明細書の最初に活性化された際にFGF高親和性レセプターを
有するとして挙げられた細胞種に対してアンタゴニストとして作用し得るFGF生
成物の製造が可能となる。Potential applications of FGF products include use as anti-angiogenic factors in solid tumors, inhibiting fibroblast hyperactivity in scleroderma.
The present invention allows the production of FGF products which, when activated herein, can act as antagonists to the cell types listed as having FGF high affinity receptors.

【０１０９】 IGF生成物は乳癌の治療に使用できる。CNS(神経膠細胞)には高親和性レセプタ
ーが存在するので、いくつかの神経変性疾患にも使用できる。The IGF product can be used to treat breast cancer. Due to the presence of high affinity receptors in the CNS (glial cells) it can also be used in some neurodegenerative diseases.

【０１１０】 TGFβ生成物はFGFおよびIGF構築物と同様の適用がある。[0110]   The TGFβ product has similar applications as the FGF and IGF constructs.

【０１１１】 GM-CSF構築物は骨髄性白血病に関わる骨髄芽球を選択的に死滅させるのに使用
できる。G-CSF生成物はGM-CSF生成物と同様の薬理活性を有するが、骨髄中の多
分化能幹細胞にのみ存在する、異なる高親和性レセプターに結合する。The GM-CSF construct can be used to selectively kill myeloblasts involved in myeloid leukemia. The G-CSF product has similar pharmacological activity to the GM-CSF product, but binds to different high-affinity receptors present only on pluripotent stem cells in bone marrow.

【０１１２】 Epo融合生成物は例えば多血症および赤白血球などの疾病に使用できる。[0112]   Epo fusion products can be used for diseases such as polycythemia and red leukocytes.

【０１１３】 DNA画分がヘモグロビンβ鎖の正常な遺伝子であるEpo遺伝子配列融合生成物は 、β-サラセミアに侵された患者の赤血球系統に正常な遺伝子を導入するのに使 用できる。この遺伝病では、骨髄中の赤血球芽始原細胞に機能のないヘモグロビ ンβ鎖をコードする異常な遺伝子が存在する。エリトロポエチンベクターによっ て骨髄の赤血球芽系統に選択的に正常な遺伝子を挿入することはまさにこの疾病 を持つ患者を治癒させる可能性があるin vivo遺伝子治療である。同じ考え方が 他の遺伝的ヘモグロビン疾患である鎌形赤血球貧血症にも当てはまる。[0113]   The Epo gene sequence fusion product, in which the DNA fraction is the normal gene for the hemoglobin β chain, , Used to introduce normal genes into the erythroid lineage of patients with β-thalassemia. Can be used. In this genetic disease, erythroblast progenitor cells in the bone marrow have non-functional hemoglobin. There is an abnormal gene that encodes the β chain. With erythropoietin vector The selective insertion of a normal gene into the erythroblast lineage of bone marrow is exactly this disease. In vivo gene therapy that may cure patients with. Same idea The same applies to sickle cell anemia, another genetic hemoglobin disorder.

【０１１４】 IL-6構築物は、多発性骨髄腫、破骨機能亢進(骨の転移)、癌関連の骨病巣およ
び骨粗鬆症に関連する、IL-6高親和性レセプターを有する細胞を阻害するのに使
用できる。IL-6 constructs are used to inhibit cells with IL-6 high affinity receptor, which are associated with multiple myeloma, hyperosteosis (metastasis of bone), cancer-related bone lesions and osteoporosis. Can be used.

【０１１５】 数種の特異的ベクター／遺伝子の組合せおよび関連する疾病標的を以下に示す： 1. サラセミアにおけるEpo／機能的Hb-β-遺伝子 2. 鎌形赤血球貧血(または鎌形赤血球症)におけるEpo／SS野生型遺伝子 3. 慢性骨髄性白血病(CML) フィラデルフィア+(Ph+)およびその急性期(分芽発
症)におけるGM-CSF／ABL BCR遺伝子 4. 慢性骨髄性白血病(CML) フィラデルフィア+(Ph+)およびその急性期(分芽発
症)におけるG-CSF／ABL BCR遺伝子 5. 慢性骨髄性白血病(CML) フィラデルフィア+(Ph+)およびその急性期(分芽発
症)ならびにAML Ph+(AMLのまれな亜型)におけるSCF／ABL BCR遺伝子 6. 乳腺癌におけるIGF-1／P53腫瘍抑制遺伝子 7. 乳腺癌におけるIGF-1／アンチセンスHER-2Neu 8. 先天性免疫不全におけるIL-2またはIL-3またはGM-CSF／機能的遺伝子(通常
、これらの免疫不全はポリジーン欠損として遺伝する：重症複合型免疫不全、デ
ィ・ジョージ症候群、ネゼロフ症候群、毛細血管拡張性運動失調、Ｘ染色体性γ
グロブリン血症) 9. 遺伝性プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損(PNP症候群)などのＴリンパ
球機能の選択的欠損におけるIL-2／機能的遺伝子 10. リソソーム貯蔵疾患に通常存在する先天性マクロファージ酵素一遺伝子欠
損におけるM-CSF／機能的遺伝子。リソソーム貯蔵疾患には、ほとんどの脂質貯
蔵疾患、ムコ多糖沈着症、および一遺伝子欠損を特徴とする糖タンパク質貯蔵疾
患(ゴシェ病におけるβ-ガラクトシダーゼ、β-グルコセレブロシダーゼ欠損、
フコース蓄積症におけるα-フコシダーゼ欠損、ファーバー病におけるセラミダ
ーゼ欠損およびテイ・サックス症候群におけるヘキソサミニダーゼ-A欠損)が含
まれる。これらすべての重症性の先天性症状は乳児期、若年期および成人期に発
症する。 M-CSF／特定の欠損に基づいて選択された機能的酵素をコードする野生型遺伝
子はひとたびマクロファージに組み込まれ、タンパク質に転写されると、機能の
ないタンパク質と競合してin vivoで欠損を修復する。 11. ニーマン・ピック病における単球／マクロファージの酸スフィンゴミエリ
ナーゼ欠損におけるM-CSF、SCFまたはGM-CSF／機能的遺伝子。Several specific vector / gene combinations and associated disease targets are shown below: 1. Epo / Thalassemia / functional Hb-β-gene 2. Epo / in sickle cell anemia (or sickle cell disease) SS wild-type gene 3. Chronic myelogenous leukemia (CML) Philadelphia + (Ph +) and its acute phase (sprouting onset) GM-CSF / ABL BCR gene 4. Chronic myelogenous leukemia (CML) Philadelphia + (Ph +) ) And its acute phase (sprouting onset) 5. Chronic myeloid leukemia (CML) Philadelphia + (Ph +) and its acute phase (sprouting onset) and AML Ph + (rare onset of AML) Subtype) SCF / ABL BCR gene 6. IGF-1 / P53 tumor suppressor gene in breast adenocarcinoma 7. IGF-1 / antisense HER-2Neu in breast adenocarcinoma 8. IL-2 or IL-3 in congenital immunodeficiency Or GM-CSF / functional genes (usually these immunodeficiencies are polygene deficient Inherited: severe combined immunodeficiency, DiGeorge syndrome, Nezerofu syndrome, ataxia telangiectasia, X-chromosomal γ
Globulinemia) 9. IL-2 / functional gene in selective loss of T lymphocyte function such as hereditary purine nucleoside phosphorylase deficiency (PNP syndrome) 10. Congenital macrophage enzyme single gene deficiency usually present in lysosomal storage diseases M-CSF / functional gene in. Lysosomal storage disorders include most lipid storage disorders, mucopolysaccharidosis, and glycoprotein storage disorders characterized by a single gene defect (β-galactosidase, β-glucocerebrosidase deficiency in Gaucher disease,
Α-fucosidase deficiency in fucose storage disease, ceramidase deficiency in Faber's disease and hexosaminidase-A deficiency in Tay-Sachs syndrome). All of these severe congenital symptoms occur in infancy, juvenile and adulthood. A wild-type gene encoding a functional enzyme selected based on M-CSF / specific deficiency, once integrated into macrophages and transcribed into a protein, competes with the nonfunctional protein to repair the deficiency in vivo. To do. 11. M-CSF, SCF or GM-CSF / functional genes in monocyte / macrophage acid sphingomyelinase deficiency in Niemann-Pick disease.

【０１１６】 本発明は機能的酸スフィンゴミエリナーゼ遺伝子に連結されたM-CSF、SCFまた
はGM-CSF機能を有する部分を含む生成物を含む。The present invention includes a product comprising a moiety having M-CSF, SCF or GM-CSF function linked to a functional acid sphingomyelinase gene.

【０１１７】 アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損 ADA欠損はその大部分の重症型において重症複合型免疫不全症(SCID)症候群を
引き起こし、ＴおよびＢリンパ球双方の減少ならびに機能異常として現れる。重
症性の低い疾病は通常Ｔ細胞不全およびＢ細胞機能のより変動的な損失が伴う。
現在、ADA欠損は遅進行性の免疫不全を引き起こし、出生児だけでなく青年期や
成人期にも現れる。Adenosine Deaminase (ADA) Deficiency ADA deficiency causes Severe Combined Immunodeficiency (SCID) syndrome in most of its severe forms, manifested as a loss and dysfunction of both T and B lymphocytes. Less severe diseases are usually associated with T cell failure and a more variable loss of B cell function.
Currently, ADA deficiency causes late-stage immunodeficiency, which is present not only in offspring but also in adolescence and adulthood.

【０１１８】 すべてのSCID患者のうち約20%がADA遺伝子変異を持っている。常染色体劣性遺
伝性SCID患者の約50%はADA遺伝子異常を持っており、残りは他の遺伝性異常を持
っている。ADA遺伝子は染色体20qに位置する。酵素活性の欠損につながるコード
領域内の25を超える一塩基変異、ならびにいくつかの欠損およびスプライシング
変異が確認されている。ADAはアデノシンからイノシンへ、また2-デオキシアデ
ノシンから2-デオキシイノシンへの不可逆的な脱アミノ化を触媒する。About 20% of all SCID patients carry the ADA gene mutation. Approximately 50% of patients with autosomal recessive SCID have ADA gene abnormalities and the rest have other inherited abnormalities. The ADA gene is located on chromosome 20q. Over 25 single nucleotide mutations in the coding region that lead to loss of enzymatic activity have been identified, as well as several deletions and splicing mutations. ADA catalyzes the irreversible deamination of adenosine to inosine and 2-deoxyadenosine to 2-deoxyinosine.

【０１１９】 現在のところ同種異系骨髄移植がADA欠損SCIDの治療の選択肢であるが、HLAが
一致するドナーは少数の患者にしか得られない。代替治療としてはPEG-ADA注射
がある(毎日の酵素置換)。Although allogeneic bone marrow transplantation is currently the treatment of choice for ADA-deficient SCID, HLA-matched donors are available in only a few patients. An alternative treatment is PEG-ADA injection (daily enzyme replacement).

【０１２０】 ADA遺伝子は配列決定され、その酵素構造が同定されている。レトロウイルスベ
クターを用いてADA-cDNAがex vivoで導入された自己のＴリンパ球を用いて治療
された患者も何人かいる(参照文献26-36)。結果は十分なものではなく、有効な
遺伝子治療にとっての主要な障壁のため、レトロウイルスベクターによる幹細胞
への導入効率はなお低い。The ADA gene has been sequenced and its enzymatic structure has been identified. Some patients have been treated with autologous T lymphocytes ex vivo introduced with ADA-cDNA using a retroviral vector (references 26-36). The results are not satisfactory and the efficiency of introduction into stem cells by retroviral vectors is still low due to the major barriers to effective gene therapy.

【０１２１】 組換えIL-2はSCIDおよびADA-SCID患者に低用量で用いられてきた(参照文献37)
。低用量rIL-2を用いた治療は、明らかな臨床改善ならびにＴ細胞の機能向上を
もたらした。さらにIL-2は通常、レトロウイルスベクターでADA-cDNAをトランス
フェクションする前にADA-SCID患者由来のＴ細胞をin vitroで拡張するのに用い
られる。Recombinant IL-2 has been used at low doses in patients with SCID and ADA-SCID (ref 37)
. Treatment with low dose rIL-2 resulted in clear clinical improvement as well as enhanced T cell function. Moreover, IL-2 is commonly used to expand T cells from ADA-SCID patients in vitro prior to transfection of ADA-cDNA with retroviral vectors.

【０１２２】 ADA-SCID患者およびADA-SCID動物モデル(ADA-SCIDマウス)由来のリンパ球およ
びリンパ芽球はin vitroでもin vivoでも低用量のIL-2刺激に応答する。言い換
えれば、SCIDにおいて、IL-2メカニズムおよびその細胞内事象のカスケード(高
親和性レセプター結合後の細胞質取り込み、取り込みおよびＴ細胞の増殖)が維
持される。Lymphocytes and lymphoblasts from ADA-SCID patients and ADA-SCID animal models (ADA-SCID mice) respond to low doses of IL-2 stimulation both in vitro and in vivo. In other words, in SCID, the IL-2 mechanism and its cascade of intracellular events (cytoplasmic uptake after high affinity receptor binding, uptake and T cell proliferation) is maintained.

【０１２３】 従って本発明は、高親和性IL-2レセプターによって認識され、機能的ADA遺伝
子を含む第２のドメインに結びついた増殖を誘導する機能を持つIL-2配列を含む
第１のドメインを含む生成物を含む。この遺伝子は通常、上記のような保護材料
、例えばポリリジンと会合されている。本発明にはまた、機能的ADA遺伝子を含
む発現ベクターに連結された機能的IL-2を含む生成物が含まれる。The present invention thus provides a first domain comprising an IL-2 sequence which is recognized by a high affinity IL-2 receptor and which is linked to a second domain comprising a functional ADA gene and which has the function of inducing proliferation. Including products containing. This gene is usually associated with a protective material as described above, eg polylysine. The present invention also includes products containing functional IL-2 linked to an expression vector containing a functional ADA gene.

【０１２４】 製法 組換えポリヌクレオチド 当業者ならば機能的核酸を含む種々のクローンを容易に構築することができる
。これらの目的を達成するクローニング法、および核酸の配列を確認するための
配列決定法は当技術分野で十分公知である。適当なクローニングおよび配列決定
技術の例、ならびに当業者に多くのクローニング実践を教えるに十分な説明はSa
mbrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed., Vols. 1
-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)), Methods in Enzymology, Vol. 1
52: Guide to Molecular Cloning Techniques (Berger and Kimmel (eds.), San
Diego: Academic Press. Inc. (1987))、またはCurrent Protocols in Molecul
ar Biology, (Ausubel, et al. (eds.), Greene Publishing and Wiley-Intersc
ience, New York (1987))に見出せる。Process Recombinant Polynucleotides One skilled in the art can readily construct various clones containing functional nucleic acids. Cloning methods that achieve these ends, and sequencing methods for confirming the sequence of nucleic acids, are well known in the art. Examples of suitable cloning and sequencing techniques, and a sufficient description to teach one of ordinary skill in the art many cloning practices, can be found in Sa.
mbrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 nd Ed., Vols. 1
-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)), Methods in Enzymology, Vol. 1
52: Guide to Molecular Cloning Techniques (Berger and Kimmel (eds.), San
Diego: Academic Press. Inc. (1987)), or Current Protocols in Molecul
ar Biology, (Ausubel, et al. (eds.), Greene Publishing and Wiley-Intersc
ience, New York (1987)).

【０１２５】 生物試薬および実験器具の製造者から得られる生成物の情報はまた、公知の生
物学的方法に有用な情報を提供する。かかる製造者としては、SIGMA Chemical c
ompany(Saint Louis, MO)、R&Dシステム(Minneapolis, MN)、Pharmacia LKB Bio
technology (Piscataway, NJ)、CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA)
、Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Resea
rch, Inc., GIBCO BRL Life Technology, Inc. (Gaithersberg, MD)、Fluka Che
mica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland)、Invitro
gen, San Diego, CAおよびApplied Biosystems (Foster City, CA)、ならびに当
業者に公知の他の多くの商業ソースが挙げられる。The product information obtained from manufacturers of biological reagents and laboratory equipment also provides useful information for known biological methods. As such a manufacturer, SIGMA Chemical c
ompany (Saint Louis, MO), R & D system (Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Bio
technology (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA)
, Chem Genes Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Resea
rch, Inc., GIBCO BRL Life Technology, Inc. (Gaithersberg, MD), Fluka Che
mica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Buchs, Switzerland), Invitro
gen, San Diego, CA and Applied Biosystems (Foster City, CA), as well as many other commercial sources known to those of skill in the art.

【０１２６】 所望の遺伝子を含むポリヌクレオチドは、例えば上記で論じた適当な配列のク
ローニングおよび制限処理をはじめとするいずれかの好適な方法によって、ある
いはNarang et al. Meth. Enzymol. 68: 90-99 (1979)のホスホトリエステル法
、Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109-151 (1979)のホスホジエステル法、B
eaucage et al., Tetra. Lett., 22: 1859-1862 (1981)のジエチルホスホルアミ
ダイト法、Beaucage and Caruthers (1981), Tetrahedron Letts., 22(20): 185
9-1862により記載されている固相ホスホルアミダイトトリエステル法(例えばNee
dham-VanDevanter et al. (1984) Nucleic Acids Res., 12:6159-6168に記載さ
れている自動シンセサイザーを用いるものなど)、および米国特許第4,458,066号
の固相支持体法などの方法による直接化学合成によって製造することができる。
化学合成では一本鎖オリゴヌクレオチドが得られる。これは相補配列とのハイブ
リダイゼーションによって、あるいは一本鎖を鋳型として用いてDNAポリメラー
ゼによる重合によって二本鎖DNAとすることができる。当業者ならば、DNAの化学
合成は約100塩基の配列に限られるが、短い配列を連結することでより長い配列
も得られることを認識しているであろう。Polynucleotides containing the desired gene can be prepared by any suitable method, including, for example, cloning and restriction of the appropriate sequences discussed above, or by Narang et al. Meth. Enzymol. 68: 90- 99 (1979) phosphotriester method, Brown et al., Meth. Enzymol. 68: 109-151 (1979) phosphodiester method, B.
eaucage et al., Tetra. Lett., 22: 1859-1862 (1981) diethyl phosphoramidite method, Beaucage and Caruthers (1981), Tetrahedron Letts., 22 (20): 185
9-1862 describes the solid-state phosphoramidite triester method (e.g., Nee
dham-VanDevanter et al. (1984) Nucleic Acids Res., 12: 6159-6168) and the direct chemistry by methods such as the solid support method of U.S. Pat.No. 4,458,066. It can be produced synthetically.
Chemical synthesis yields single-stranded oligonucleotides. It can be made into double-stranded DNA by hybridization with a complementary sequence or by polymerization with a DNA polymerase using a single strand as a template. Those skilled in the art will recognize that chemical synthesis of DNA is limited to sequences of about 100 bases, although longer sequences can be obtained by joining short sequences.

【０１２７】 当技術分野で十分公知であるように、核酸は位置指定突然変異誘発によって改
変することができる。天然型またそれ以外の核酸もin vitro法で増幅することが
できる。増幅法としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)
、転写に基づく増幅系(TAS)、自律的配列複製系(SSR)が挙げられる。広範なクロ
ーニング法、宿主細胞およびin vitro増幅法が当業者に十分公知である。Nucleic acids can be modified by site-directed mutagenesis, as is well known in the art. Natural or other nucleic acids can also be amplified by the in vitro method. Amplification methods include polymerase chain reaction (PCR), ligase chain reaction (LCR)
, A transcription-based amplification system (TAS), and an autonomous sequence replication system (SSR). A wide range of cloning methods, host cells and in vitro amplification methods are well known to those of skill in the art.

【０１２８】 保護材料／DNA結合材料 ミセルまたはカチオン性材料、例えばカチオン性ポリマーは市販されており、
遺伝子治療におけるリポソームの使用はLasic and Templeton (Lasic D D. Temp
leton D S (1996) Advanced Drug Reviews 20:221-226に総説されている。Protective / DNA binding materials Micelle or cationic materials such as cationic polymers are commercially available,
The use of liposomes in gene therapy is described by Lasic and Templeton (Lasic D D. Temp.
Leton DS (1996) Advanced Drug Reviews 20: 221-226.

【０１２９】 連結 増殖活性部分、ならびに核酸材料および保護／DNA結合材料の１つは、２成分
の反応性官能基と反応する多官能性(例えば二官能性)リンカーを用いて内部結合
されているのが好適である。いくつかの実施態様では、この２つの構成部分は細
胞内で切断可能な結合によって連結されている。他の実施態様では、この結合は
細胞内で安定である。Linking The proliferative active moiety and one of the nucleic acid material and the protective / DNA binding material are internally linked using a polyfunctional (eg bifunctional) linker that reacts with the reactive functional groups of the two components. Is preferred. In some embodiments, the two components are linked intracellularly by a cleavable bond. In another embodiment, the bond is intracellularly stable.

【０１３０】 この結合は、本願と同日に「新規な構築物」の名称で出願された本発明者らの
米国仮特許出願に記載される、２つのヘテロ二官能性架橋基の内部結合残基を含
む架橋基を含み得る。この技術の可能性ある利点としては、(i)活性部分-リンカ
ー構築物および(ii)核酸-リンカー構築物、または保護材料もしくはDNA結合材料
-リンカー構築物を個別に製造し、次いで構築物(i)と(ii)を反応させてそれら個
々のリンカーを連結させることにより、二量体の形成を避ける助けをするという
ことである。これらのリンカーは明らかに互いに、かつ、構築物(i)または(ii)
の残基を形成する材料と反応するように選択される。[0130] This linkage involves the internal linkage of two heterobifunctional bridging groups described in our US provisional patent application, which was filed on the same date as the present application under the name "Novel Construct". May include a bridging group that includes. Possible advantages of this technique include (i) active moiety-linker constructs and (ii) nucleic acid-linker constructs, or protective or DNA binding materials.
-The linker constructs are manufactured separately and then the constructs (i) and (ii) are reacted to ligate their respective linkers to help avoid dimer formation. These linkers are clearly relative to each other and to construct (i) or (ii)
Is selected to react with the material forming the residue.

【０１３１】 例えば融合タンパク質の場合など、別の部分に結合したポリペプチドを含む生
成物の製造は十分公知であるので、当業者には製造技術を説明する必要はないで
あろう。一般的にいえば、好適なリンカーはポリペプチドおよびヌクレオチドと
反応し得る多官能性、特に二官能性化合物である。The production of products comprising a polypeptide linked to another moiety, such as in the case of fusion proteins, is well known in the art and it will not be necessary for the person skilled in the art to explain the production technique. Generally speaking, suitable linkers are polyfunctional, especially bifunctional, compounds capable of reacting with polypeptides and nucleotides.

【０１３２】 技術の一例としては、２つのポリペプチドを内部連結する酸切断が可能な試薬
を用いることである。オルトエステル、アセタールおよびケタール官能基に基づ
く該酸切断性リンカー試薬はこれまでに記載されており(参考文献18)、pHの低下
につれ加水分解定数が高くなる二官能性化合物である。これらの架橋基はヘテロ
二官能基(例えばマレイミドもしくはN-ヒドロキシスクシンイミドエステル)また
はホモ二官能基(例えばビス-マレイミドもしくはビス-スクシンイミジル)を介し
てタンパク質と反応する。One example of a technique is to use an acid cleavable reagent that internally links two polypeptides. The acid-cleavable linker reagent based on orthoester, acetal and ketal functional groups has been previously described (reference 18) and is a bifunctional compound whose hydrolysis constant increases with decreasing pH. These bridging groups react with the protein via a heterobifunctional group (eg maleimide or N-hydroxysuccinimide ester) or a homobifunctional group (eg bis-maleimide or bis-succinimidyl).

【０１３３】 使用することができる３つの特定の架橋剤は下記の通り： 1. ジスクシンイミジルスベレート。これはNヒドロキシスクシンイミド("NHS")
エステル反応基を含むホモ二官能性架橋試薬であり、アミノ基に対して反応する
。この架橋試薬鎖は切断することができない。 2. エチレングリコビス[スクシンイミジルスクシネート]。これもNHSエステル
反応基を含むホモ二官能性架橋試薬であり、アミノ基に対して反応する。この架
橋試薬鎖は切断可能である。 3. スクシンイミジル6-[3-(2-ピリジルチオ)-プロピオンアミド]ヘキサノエー
ト。これはピリジルジチオとNHSエステル反応基を含むヘテロ二官能性架橋試薬
であり、スルフヒドリル基とアミノ基に対して反応する。この架橋試薬鎖は切断
可能である。Three particular crosslinkers that can be used are: 1. Disuccinimidyl suberate. This is N-hydroxysuccinimide ("NHS")
It is a homobifunctional cross-linking reagent containing ester reactive groups and reacts with amino groups. This cross-linking reagent chain cannot be cleaved. 2. Ethylene glycobis [succinimidyl succinate]. This is also a homobifunctional cross-linking reagent containing NHS ester reactive groups and reacts with amino groups. This cross-linking reagent chain is cleavable. 3. Succinimidyl 6- [3- (2-pyridylthio) -propionamido] hexanoate. It is a heterobifunctional cross-linking reagent containing a pyridyldithio and an NHS ester reactive group, which reacts with sulfhydryl and amino groups. This cross-linking reagent chain is cleavable.

【０１３４】 以下にこれらの架橋基およびその他の好適な候補についてのさらなる情報を含
む表を示す。Below is a table containing additional information about these bridging groups and other suitable candidates.

【表１】 [Table 1]

【表２】 （続き） [Table 2] (continued)

【０１３５】 増殖活性部分（特にサイトカインまたは成長因子）およびヌクレオチドが酸切
断可能なように連結している生成物は、該生成物がエンドソームで切断されて遊
離形態のヌクレオチドを放出するという可能性ある利点のために有益である。A product in which a proliferatively active moiety (particularly a cytokine or growth factor) and a nucleotide are acid cleavably linked is likely that the product will be endosomally cleaved to release the free form of the nucleotide. Beneficial for benefits.

【０１３６】 物質をタンパク質に連結するための、典型的には二官能性リンカーキレート剤
を用いることによる、いくつかの技術が文献に記載されている。例えば、テキス
ト"Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Volume
19, R. H. BurdonおよびP. H. van Knippenberg編, Elsevier出版およびM. H.
V. Van Regenmortelらによるテキスト"Sythetic Polypeptides as antigens", E
lscvier出版(1988) Chapter 3（"Peptide-Carrier Conjugation"）を参照。Several techniques have been described in the literature for linking agents to proteins, typically by using bifunctional linker chelators. For example, the text "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Volume
19, edited by RH Burdon and PH van Knippenberg, published by Elsevier and MH
Text by V. Van Regenmortel et al. "Sythetic Polypeptides as antigens", E
See lscvier Publishing (1988) Chapter 3 ("Peptide-Carrier Conjugation").

【０１３７】 サイトカインおよび成長因子を生物活性因子に結合させるのに好適なヘテロ二
官能性リンカーはPierce & Warner (UK) Limited，44 Upper Northgate Street,
Chester CH1 4EF, UKまたはPierce Chemical Company, PO Box 117, Rockford,
IL 61105, USAから入手でき、それらの文献がさらなる情報を提供している。Suitable heterobifunctional linkers for linking cytokines and growth factors to bioactive factors are described by Pierce & Warner (UK) Limited, 44 Upper Northgate Street,
Chester CH1 4EF, UK or Pierce Chemical Company, PO Box 117, Rockford,
Available from IL 61105, USA, which documents provide further information.

【０１３８】 投与 IL-2およびその他のサイトカインまたは成長因子生成物は、例えば、極めて低
い血漿濃度（組換えタンパク質が1μgから0.1mg未満）となるよう、10,000-1,00
0,000国際単位の所定量で非経口投与、好適には静脈投与、筋肉投与または皮下
注射できる。例えば、この血漿IL-2濃度は50%のIL-2高親和性レセプターイソ型
を満たすIL-2濃度の解離定数(KD)に近似し得る。さらに、この範囲の用量は一般
に全身性の副作用を伴わない。Administration of IL-2 and other cytokines or growth factor products can be performed, for example, at 10,000-1,00 to obtain very low plasma concentrations (1 μg to less than 0.1 mg recombinant protein).
It can be administered parenterally, preferably intravenously, intramuscularly or subcutaneously in a predetermined amount of 0,000 international units. For example, this plasma IL-2 concentration can approximate the dissociation constant (KD) of the IL-2 concentration that satisfies 50% of the IL-2 high affinity receptor isoform. Furthermore, doses in this range are generally free of systemic side effects.

【０１３９】 本発明の生成物は実施上、医薬上許容される希釈剤、担体または賦形剤を含む
ヒト医薬製剤または獣医薬製剤として処方することができる。The products of the present invention may in practice be formulated as human or veterinary formulations containing pharmaceutically acceptable diluents, carriers or excipients.

【０１４０】 これらの製剤は溶液または懸濁液の形態であってよい。製剤は非経口（例えば
、静脈内または皮下）投与に好適であるが、経口製剤を除外するものではない。These formulations may be in the form of solutions or suspensions. The formulations are suitable for parenteral (eg intravenous or subcutaneous) administration, but oral formulations are not excluded.

【実施例】【Example】

【０１４１】 実施例 以下、IL-2突然変異タンパク質アルデスロイキンで例示される、ヌクレオチド
材料とペプチドを架橋する好適なプロトコールを記載する。特定の反応条件はも
ちろん記載されるものと異なってもよい。EXAMPLES Below, a suitable protocol for crosslinking peptides with nucleotide material, exemplified by the IL-2 mutein Aldesleukin, is described. The particular reaction conditions may, of course, differ from those described.

【０１４２】 LC-SPDPを用いるタンパク質の改変 LC-SPDP=スクシンイミジル6-[3'(2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキ
サノエート 材料： A: LC-SPDP保存液：DMSO中20mMのLS-SPDP。注：使用直前に調製。 B: 反応バッファー：20mMのリン酸ナトリウム、150mMの塩化ナトリウム、1mMの
EDTA、pH7.5。 C: 酢酸バッファー：100mMの酢酸ナトリウム、100mMの塩化ナトリウム、pH4.5
。 D: BioRad Micro Bio-Spin脱塩カラム。 E: ジチオスレイトール(DTT)：100mMの酢酸ナトリウムpH4.5、100mMの塩化ナト
リウム中24mg/ml。 F: アルデスロイキン保存液：反応バッファーに1.53mg/ml(0.1mM)で溶解したも
の。Modification of proteins using LC-SPDP LC-SPDP = succinimidyl 6- [3 '(2-pyridyldithio) -propionamide] hexanoate Materials: A: LC-SPDP stock: 20 mM LS-SPDP in DMSO. Note: Prepared just before use. B: Reaction buffer: 20 mM sodium phosphate, 150 mM sodium chloride, 1 mM
EDTA, pH 7.5. C: Acetate buffer: 100 mM sodium acetate, 100 mM sodium chloride, pH 4.5
. D: BioRad Micro Bio-Spin desalting column. E: Dithiothreitol (DTT): 100 mg sodium acetate pH 4.5, 24 mg / ml in 100 mM sodium chloride. F: Aldesleukin stock solution: dissolved in reaction buffer at 1.53 mg / ml (0.1 mM).

【０１４３】 方法： 1. 9μlのアルデスロイキン保存液に1μlの20mM LC-SPDP保存液を加える。 2. 室温で30分間インキュベートする。 3. 結合していない架橋剤を除去するために、サンプルにBioRad Micro Bio-Spi
n脱塩カラム（100mMの酢酸ナトリウム、100mMの塩化ナトリウム、pH4.5中で予め
平衡化した）を適用し、回転させてその濾液を次のDTT処理に用いる。 4. DTT（適当なバッファーに前記のように溶解した）を8mg/mlの最終濃度とな
るよう加える。 5. 室温で30分間インキュベートする。 6. DTTを除去するために、サンプルに別のBio-Rad Micro Bio-Spin脱塩カラム
（結合バッファー：20mMのリン酸ナトリウムpH7.5、150mMの塩化ナトリウム、1m
MのEDTA中で予め平衡化した）を適用し、回転させて濾液を最終結合反応（下記
参照）に使用する。Method: 1. Add 1 μl of 20 mM LC-SPDP stock to 9 μl of Aldesleukin stock. 2. Incubate for 30 minutes at room temperature. 3. Add BioRad Micro Bio-Spi to the sample to remove unbound crosslinker.
An n desalting column (100 mM sodium acetate, 100 mM sodium chloride, pre-equilibrated in pH 4.5) is applied and spun to use the filtrate for the next DTT treatment. 4. Add DTT (dissolved as above in appropriate buffer) to a final concentration of 8 mg / ml. 5. Incubate for 30 minutes at room temperature. 6. To remove DTT, the sample was loaded onto another Bio-Rad Micro Bio-Spin desalting column (binding buffer: 20 mM sodium phosphate pH 7.5, 150 mM sodium chloride, 1 mM).
Pre-equilibrated in M EDTA), spin and use the filtrate for the final binding reaction (see below).

【０１４４】 PMPIを用いるヌクレオチド材料の改変 PMPI=N-(p-マレイミドフェニル)イソシアネート 材料： A: PMPI保存液：使用前に新たに調製。無水DMSO中50mM。 B: 反応バッファー：20mMのTris-HCl pH8.5、100mMのNaCl。 C: BioRad Micro Bio-Spin脱塩カラム。[0144] Modification of nucleotide material using PMPI   PMPI = N- (p-maleimidophenyl) isocyanate material: A: PMPI preservation solution: Prepared fresh before use. 50 mM in anhydrous DMSO. B: Reaction buffer: 20 mM Tris-HCl pH 8.5, 100 mM NaCl. C: BioRad Micro Bio-Spin desalting column.

【０１４５】 方法： 1: 遺伝子材料に1μlの無水DMSO中50mMのPMPIを加える。十分に混合する。 2: 室温で60分間インキュベートする。 3: 結合バッファー（20mMのリン酸ナトリウムpH7.5、150mMの塩化ナトリウム、
1mMのEDTA）中で予め平衡化したBioRad Micro Bio-Spin脱塩カラムを用いて過剰
な未反応架橋試薬を除去する。濾液を最終結合反応（以下を参照）に用いる。Method: 1: Add 1 μl of 50 mM PMPI in anhydrous DMSO to the genetic material. Mix well. 2: Incubate at room temperature for 60 minutes. 3: Binding buffer (20 mM sodium phosphate pH 7.5, 150 mM sodium chloride,
Excess unreacted crosslinking reagent is removed using a BioRad Micro Bio-Spin desalting column pre-equilibrated in 1 mM EDTA). The filtrate is used for the final coupling reaction (see below).

【０１４６】 結合反応： 脱塩したLC-SPDPで活性化したアルデスロイキンおよび脱塩したPMPIで活性化
した遺伝子材料を等比で混合し、室温で24時間インキュベートする。次いで、結
合反応を活性化反応から得られたサンプルとともにSDS-PAGEで分析して結合効率
を評価する。その後、結合した生成物はサイズ排除クロマトグラフィーで精製す
ることができる。Binding reaction: Desalted LC-SPDP activated aldesleukin and desalted PMPI activated genetic material are mixed in equal proportions and incubated for 24 hours at room temperature. The binding reaction is then analyzed by SDS-PAGE with the sample obtained from the activation reaction to assess the binding efficiency. The bound product can then be purified by size exclusion chromatography.

【０１４７】 実施例１ 改変アルデスロイキンの製造 7反応を室温で0、10、20、30、40、50および60分間実施したこと以外は、前記
で示されるプロトコールに従ってアルデスロイキンの改変を行った。反応混合物
をプロトコールのように（製造者のプロトコールに従って用いる、BioRad Micro
Bio-Spin P6脱塩カラム用いて）脱塩した。SDS-PAGE[12%のアクリルアミドゲル
、Laemmliの方法(Laemmli UK: Cleavage of structural proteins during the a
ssembly of the head of bacteriophage T4, Nature 1970 Aug 15 227:259 680-
5)に従って実施]による分析のために各濾駅から1μlのサンプルを採取した。次
いで、ゲルをゲルコードブルー (Pierce:製造者のプロトコールにしたがって使
用) を用いて染色した。Example 1 Preparation of Modified Aldesleukin Aldesleukin was modified according to the protocol set forth above, except that the 7 reactions were carried out at room temperature for 0, 10, 20, 30, 40, 50 and 60 minutes. The reaction mixture was used as per the protocol (used according to the manufacturer's protocol, BioRad Micro
Desalted (using a Bio-Spin P6 desalting column). SDS-PAGE [12% acrylamide gel, Laemmli method (Laemmli UK: Cleavage of structural proteins during the a
ssembly of the head of bacteriophage T4, Nature 1970 Aug 15 227: 259 680-
Performed according to 5)] and 1 μl of sample was taken from each filtration station for analysis. The gel was then stained with Gelcode Blue (Pierce: used according to manufacturer's protocol).

【０１４８】 60分間泳動したゲルが図５に示されている。写真はLC-SPDPによるアルデスロ
イキンの改変後の見かけ分子量の増大を示し、すべてのアルデスロイキンが共有
結合により改変されていることを示す。 実施例２ 増殖アッセイ 実施例１由来のカラム濾液を標準HT-2培養培地（10%のウシ胎児血清、20μMの
2-メルカプトエタノールを添加したIscoveの改変ダルベッコ培地）に約0.20μg/
mlとなるよう再懸濁し、以下に示されるプロトコールに従って増殖アッセイに用
いた。A gel run for 60 minutes is shown in FIG. The photographs show an increase in apparent molecular weight after modification of aldesleukins by LC-SPDP, indicating that all aldesleukins are covalently modified. Example 2 Proliferation Assay The column filtrate from Example 1 was loaded with standard HT-2 culture medium (10% fetal bovine serum, 20 μM).
0.20 μg / in Iscove's modified Dulbecco's medium supplemented with 2-mercaptoethanol
Resuspended to make up to ml and used for proliferation assay according to the protocol shown below.

【０１４９】 アッセイサンプルは20ng/mlの改変アルデスロイキン種を含むよう準備し（各
反応生成物から1セットのサンプル）、96ウェルプレートにプレーティングした
。最終列は保存細胞培養株に由来する組換えIL-2のみを含むようプレーテｋィン
グした。Assay samples were prepared containing 20 ng / ml modified aldesleukin species (one set of samples from each reaction product) and plated in 96 well plates. The last row was plated to contain only recombinant IL-2 from the stock cell culture.

【０１５０】 （HT-2細胞がＴリンパ球の増殖の誘導を測定するための標準細胞である。Wats
on J Continuous proliferation of murine antigen-specific helper T lympho
cytes in culture, J Exp Med 1979 Dec 1 150:6 1510-9参照。）(HT-2 cells are a standard cell for measuring the induction of proliferation of T lymphocytes. Wats
on J Continuous proliferation of murine antigen-specific helper T lympho
See cytes in culture, J Exp Med 1979 Dec 1 150: 6 1510-9. )

【０１５１】 増殖アッセイのプロトコール A:アッセイの設定 1. 同一のマスター細胞保存株から8×2mlアリコートのHT-2細胞を滅菌容器内に
入れ、Iscoveの改変ダルベッコ培地（10%のFCS、20μMのβ-メルカプトエタノー
ル、101U/mlの組換えヒトIL-2または同等物を添加）中に20,000から30,000/mlの
間の細胞密度で準備する。 2. 各々に所望の濃度の共試IL-2を加える。 3. 図６に示されるように細胞懸濁液を96ウェルプレートに150μl/ウェルでプレ
ーティングする。4日間インキュベーター中で増殖させ、毎日細胞を計数する。 4. 滅菌容器の残りの細胞懸濁液を基底細胞密度を設定するための細胞計数用に
プールする（計数についてはn=3を用いる）。Proliferation Assay Protocol A: Assay Setup 1. 8 × 2 ml aliquots of HT-2 cells from the same master cell stock were placed in sterile containers and modified with Iscove's modified Dulbecco's Medium (10% FCS, 20 μM). β-mercaptoethanol, supplemented with 101 U / ml recombinant human IL-2 or equivalent) at a cell density between 20,000 and 30,000 / ml. 2. Add co-test IL-2 at the desired concentration to each. 3. Plate the cell suspension in 96 well plates at 150 μl / well as shown in FIG. Grow for 4 days in an incubator and count cells daily. 4. Pool the remaining cell suspension in the sterile container for cell counting to set the basal cell density (use n = 3 for counting).

【０１５２】 B:細胞の計数 1. 毎日、比較的正常な形態（丸または丸に近い）であり、かつ、トリパンブル
ーを排除すると認められる細胞を血球計算板を用いて計数する。細胞の計数を行
った時間を記す。 2. 各試験条件について1日に3個のウェルを計数して結果を平均する。B: Cell Counts 1. Daily, cells with a relatively normal morphology (circles or near circles) and found to exclude trypan blue are counted using a hemocytometer. Note the time at which the cells were counted. 2. Count 3 wells per day for each test condition and average the results.

【０１５３】 実施例３ 細胞活性 実施例２からの一次培養物における細胞密度を血球計算板を用いて評価し、生
存細胞をトリパンブルー排除により評価した。これらを3回計数し、アッセイ期
間を通じてすべてのサンプルについて同様にした。平均細胞密度が以下の表１に
示されている：Example 3 Cellular Activity Cell density in the primary cultures from Example 2 was assessed using a hemocytometer and viable cells were assessed by trypan blue exclusion. These were counted in triplicate and repeated for all samples throughout the assay. Average cell densities are shown in Table 1 below:

【表３】 [Table 3]

【０１５４】 結果は図７のデータチャートに示されている。 アルデスロイキン（プロロイキン（商標））、天然ヒトIL-2および組換えヒト
IL-2を含む種々のIL-2組成物の比較増殖応答が図８に示されており、これらのIL
-2のいずれもが好適な分裂誘発ベクターであることを示している。The results are shown in the data chart of FIG. Aldesleukin (Proleukin ™), natural human IL-2 and recombinant human
The comparative proliferative response of various IL-2 compositions, including IL-2, is shown in FIG.
Both of -2 are shown to be suitable mitogenic vectors.

【０１５５】 実施例４ pEGP-1のHT-2細胞へのトランスフェクション トランスフェクタム(Promega)を用いてpEGFP-1をHT-2細胞へトランスフェクト
した。EGTPを発現した細胞数が表２に示されている。4:1のカチオン性脂質：DNA
比でDfx20またはDfx50のいずれかを用いて最高のトランスフェクション効率（約
0.08%）が認められた。トランスフェクトされた細胞数は0.2ng/ml RhIL-2に比べ
、1.0ng/ml RhIL-2で培養した場合に相当多かった。これはこれらの細胞はより
速く増殖しており、細胞周期の際の核分解の結果として、プラスミドが核に入り
それらの遺伝子を発現することがより容易であるということを反映している。こ
の理論の裏づけは、多数のEGFP発現細胞が対で認められ、それらが最近分裂した
可能性があるということを示唆するという観察結果から得られる。これらの結果
はIL-2およびその他の増殖活性部分が遺伝子材料または核酸材料に向けて細胞を
活性化するということを示す。Example 4 Transfection of pEGP-1 into HT-2 Cells pEGFP-1 was transfected into HT-2 cells using transfectum (Promega). The number of cells expressing EGTP is shown in Table 2. 4: 1 cationic lipid: DNA
The highest transfection efficiency (approx.
0.08%) was observed. The number of transfected cells was significantly higher when cultured with 1.0 ng / ml RhIL-2 than with 0.2 ng / ml RhIL-2. This reflects that these cells are growing faster and it is easier for plasmids to enter the nucleus and express their genes as a result of nuclear degradation during the cell cycle. Support for this theory comes from the observation that a large number of EGFP-expressing cells were found in pairs, suggesting that they may have recently divided. These results indicate that IL-2 and other proliferatively active moieties activate cells towards genetic or nucleic acid material.

【表４】 [Table 4]

【０１５６】 実施例５ ポリエチレンイミン(25k)の同定 800kのPEIと対照的に25kのPEIはポリマー長の点でより均質であり、毒性作用
が少ないと報告されている。より均質な生成物は架橋生成物の解釈をより単純に
すると考えられるので、25kのPEIを本研究の可能性ある候補カチオン性ポリマー
として調べた。最初に、25kのPEIをカラムに流してサイズ特性を調べた。800kの
特性と比較して、PEIは同等の不均一範囲を持つ種であることが明らかになった
。Example 5 Identification of Polyethyleneimine (25k) In contrast to 800k PEI, 25k PEI is more homogenous in terms of polymer length and is reported to have less toxic effects. A 25 k PEI was investigated as a potential candidate cationic polymer for this study, as a more homogeneous product would simplify the interpretation of cross-linked products. First, 25 k PEI was run through the column for size characterization. It was found that PEI is a species with an equivalent heterogeneity range compared to the 800k property.

【０１５７】 1.0、0.5および0.2ng/ml RhIL-2で培養したHT-2細胞に加えた25kのPEIの希釈
シリーズを用いる毒性アッセイを行い、細胞活性を3日間評価した（図9a-c参照
）。1.0または0.5ng/mlのRhIL-2で増殖させた細胞では、2μg/mlの25k PEIで細
胞活性に低下があったが、0.2mg/mlのRhIL-2で培養したものは1μg/mlの25k PEI
で活性の低下を示した。HT-2細胞については、その他の細胞系統について公開さ
れている結果と対照的であるが、25kのPEIは800kのPEIよりも若干毒性が高かっ
た。A toxicity assay was performed using a dilution series of 25 k PEI added to HT-2 cells cultured at 1.0, 0.5 and 0.2 ng / ml RhIL-2 to assess cell activity for 3 days (see Figures 9a-c). ). Cells grown with 1.0 or 0.5 ng / ml RhIL-2 had a decrease in cell activity at 2 μg / ml 25 k PEI, whereas cells grown with 0.2 mg / ml RhIL-2 had 1 μg / ml. 25k PEI
Showed a decrease in activity. For HT-2 cells, in contrast to published results for other cell lines, 25k PEI was slightly more toxic than 800k PEI.

【０１５８】 実施例６ ポリエチレンイミンを用いるPEGFP.CATのHT-2細胞へのトランスフェクション ポリエチレンイミン(PEI)がHT-2細胞をトランスフェクトできるリポータープ
ラスミドと複合体を形成し得るかどうかを決定するためアッセイを行った。種々
の比のPEI:DNAを用いて確実に最適なDNAコンパクションを得た。さらにDNA:PEI
複合体の適用に先立って細胞を1.0ng/mlのRhIL-2で24時間増殖させ、その後、2
枚のプレートに分割し、一方は1.0ng/mlのRhIL-2、他方は0.2ng/mlのRhIL-2とし
た。次いで、トランスフェクション複合体を細胞に適用して500rpmで5分間遠心
分離した。1時間インキュベーションした後、すべての細胞を1.0ng/mlのRhIL-2
を含有する完全培地で覆った。トランスフェクション20時間後にEGFPを発現する
細胞数を表３に示している。Example 6 Transfection of PEGFP.CAT into HT-2 Cells with Polyethyleneimine To determine whether polyethyleneimine (PEI) can form a complex with a reporter plasmid capable of transfecting HT-2 cells. Therefore, an assay was performed. Using various ratios of PEI: DNA ensured to obtain the optimal DNA compaction. Further DNA: PEI
Cells were grown for 24 hours in 1.0 ng / ml RhIL-2 prior to application of the conjugate, then 2
The plate was divided into plates, one of which was 1.0 ng / ml of RhIL-2 and the other of which was 0.2 ng / ml of RhIL-2. The transfection complex was then applied to the cells and centrifuged at 500 rpm for 5 minutes. After incubation for 1 hour, all cells were treated with 1.0 ng / ml RhIL-2.
Was covered with complete medium containing. The number of cells expressing EGFP 20 hours after transfection is shown in Table 3.

【表５】 [Table 5]

【０１５９】 以下の結論を導くことができる。 ・トランスフェクトされた細胞数はIL-2濃度とともに増加した。 ・25kDのPEIは800kDのPEIよりも遺伝子送達においてかなり効率がよい。 ・25kDのPEIは市販のトランスフェクション試薬トランスフェクタムよりも2〜3
倍効率がよい（比較データは示されていない）。 ・250ng PEI:500ng DNAの比率が最も効率がよい。 ・クロロキノンが存在するとトランスフェクション効率が向上した。The following conclusions can be drawn. -The number of transfected cells increased with IL-2 concentration. 25kD PEI is significantly more efficient in gene delivery than 800kD PEI. 25kD PEI is 2-3 than commercial transfection reagent Transfectam
Double efficiency (comparative data not shown).・ The ratio of 250ng PEI: 500ng DNA is the most efficient. -The presence of chloroquinone improved transfection efficiency.

【０１６０】 完全培地（血清を含有）添加前の25kD PEI:DNA複合体のインキュベーションの
長さの作用を調べるため第２のアッセイを行った。PEI:DNAの比をさらに検討し
、クロロキノンの作用をさらに調べた。トランスフェクション18時間後にEGFPを
発現する細胞数を以下の表４に示している：A second assay was performed to examine the effect of length of incubation of the 25 kD PEI: DNA complex prior to addition of complete medium (containing serum). The PEI: DNA ratio was further investigated to further investigate the effect of chloroquinone. The number of cells expressing EGFP 18 hours after transfection is shown in Table 4 below:

【表６】 [Table 6]

【０１６１】 以下の結論を導くことができる。 ・クロロキノンの存在下、200ngのPEIと500ngのDNAが最高のトランスフェクショ
ン効率を示した。 ・クロロキノンの不在下では、最高のトランスフェクション効率はこれまでのア
ッセイの結果とは対照的に100ngのPEIを用いた場合であった。 ・クロロキノンは高PEI濃度でトランスフェクション効率を3〜6倍高めた。 ・インキュベーション時間を1時間から2時間に延長した場合、トランスフェクシ
ョン効率の有意な上昇はなかった。 ・マーカー遺伝子産物の毒性作用から、トランスフェクション18時間後が遺伝子
発現の試験に最も適当であると考えられた。The following conclusions can be drawn. -In the presence of chloroquinone, 200 ng PEI and 500 ng DNA showed the highest transfection efficiency. In the absence of chloroquinone, the highest transfection efficiency was with 100 ng of PEI, in contrast to previous assay results.・ Chloroquinone increased transfection efficiency 3 to 6 times at high PEI concentration. -There was no significant increase in transfection efficiency when the incubation time was extended from 1 hour to 2 hours. 18 hours post-transfection was considered to be the most appropriate test for gene expression because of the toxic effect of the marker gene product.

【０１６２】 要約すれば、軽い遠心分離（データは示されていない）、クロロキノンの使用
および25kDのPEIの使用はいずれもマーカー遺伝子のHT-2細胞への送達の向上に
役立った。In summary, light centrifugation (data not shown), use of chloroquinone and use of 25 kD PEI both helped to improve delivery of the marker gene to HT-2 cells.

【０１６３】 本明細書で「含む」は他を排するものではない、すなわち、この動詞の対象は
その対象のみである必要はなく、この動詞の対象および1以上のさらなる要素を
含み得る。派生表現もしかるべく解釈すべきである。As used herein, “comprising” does not exclude the other, that is, the subject of this verb need not be the only subject, but may include the subject of this verb and one or more additional elements. Derivative expressions should be interpreted accordingly.

【０１６４】 参照文献[0164] References

【表７】 [Table 7]

【表８】 [Table 8]

【表９】 [Table 9]

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】 IL-2-発現ベクター構築物に関して本発明の生成物の構造および
機能を示した概要。FIG. 1 Schematic showing the structure and function of the products of the invention with respect to an IL-2-expression vector construct.

【図２】 本発明のプラスミド構築物の図（環を線状化）。Figure 2: Diagram of the plasmid construct of the invention (circular linearization).

【図３】 本発明のプラスミド構築物の図（環を線状化）。Figure 3: Diagram of the plasmid construct of the invention (circular linearization).

【図４】 本発明のプラスミド構築物の図（環を線状化）。Figure 4: Diagram of the plasmid construct of the invention (circular linearization).

【図５】 アルデスロイキンとLC-SPDP間の反応生成物を用いたSDS-PAGEゲ
ル泳動。FIG. 5: SDS-PAGE gel electrophoresis using the reaction product between aldesleukin and LC-SPDP.

【図６】 増殖アッセイで用いられる96ウェルプレートを示す。FIG. 6 shows a 96-well plate used in the proliferation assay.

【図７】 HT-2細胞を改変アルデスロイキンとインキュベーションした結果
の細胞密度のデータチャート。FIG. 7 is a data chart of cell density as a result of incubating HT-2 cells with modified aldesleukin.

【図８】 種々のIL-2組成物に対するHT-2細胞の増殖応答を示すデータチャ
ート。FIG. 8 is a data chart showing the proliferative response of HT-2 cells to various IL-2 compositions.

【図９】 25k PEI希釈シリーズを、1.0、0.5および0.2ng/ml RhIL-2で培養
したHT-2細胞に加えた場合の毒性アッセイの結果および3日間アッセイした細胞
活性を示したデータチャート。FIG. 9 is a data chart showing the results of toxicity assay and cell activity assayed for 3 days when the 25k PEI dilution series was added to HT-2 cells cultured at 1.0, 0.5 and 0.2 ng / ml RhIL-2.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/22 Ａ６１Ｋ 47/42 38/27 47/48 38/43 Ａ６１Ｐ 1/02 38/46 1/04 47/24 1/16 47/42 3/10 47/48 5/14 Ａ６１Ｐ 1/02 7/00 1/04 7/04 1/16 7/06 3/10 13/12 5/14 17/00 7/00 17/06 7/04 21/00 7/06 25/28 13/12 27/02 17/00 29/00 １０１ 17/06 31/12 21/00 31/14 25/28 31/18 27/02 35/00 29/00 １０１ 35/02 31/12 37/04 31/14 37/06 31/18 37/08 35/00 43/00 １０１ 35/02 １０５ 37/04 １１１ 37/06 １２３ 37/08 Ａ６１Ｋ 37/02 43/00 １０１ 37/48 １０５ 37/36 １１１ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ １２３ Ａ６１Ｋ 37/24 Ｃ１２Ｎ 15/09 37/54 // Ａ６１Ｋ 38/44 37/52 38/45 37/50 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ルッジェロ・デッラ・ビッタ イタリア、イ−20122ミラン、コルソ・ポ ルタ・ロマーナ74番 (72)発明者 ノーマン・ジェイムズ・メイトランド イギリス、ワイオー１・５ワイダブリュ ー、ヨーク、ザ・ユニバーシティ・オブ・ ヨーク、バイオロジー・デパートメント、 キャンサー・リサーチ・ユニット (72)発明者 デイビッド・ジョナサン・ナイト イギリス、ワイオー１・５ワイダブリュ ー、ヨーク、ザ・ユニバーシティ・オブ・ ヨーク、バイオロジー・デパートメント、 キャンサー・リサーチ・ユニット Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 BA21 BA27 EA04 FA02 GA11 HA17 4C076 AA17 AA19 AA95 CC01 CC07 CC10 CC11 CC14 CC16 CC17 CC26 CC27 CC29 CC35 CC42 DD06 DD63 EE25 EE41 4C084 AA02 AA13 AA14 BA03 BA44 CA18 CA53 DA01 DA13 DA14 DA15 DA17 DA18 DA19 DA21 DA22 DA23 DA24 DA25 DB52 DB54 DB56 DB58 DC01 DC23 MA05 MA22 MA24 NA05 NA06 NA13 ZA15 ZA33 ZA53 ZA55 ZA66 ZA67 ZA75 ZA81 ZA94 ZA96 ZA97 ZB02 ZB08 ZB09 ZB13 ZB15 ZB21 ZB26 ZB27 ZB33 ZC02 ZC19 ZC35 ZC55 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA02 MA03 MA04 MA05 MA22 MA24 NA05 NA06 NA13 NA15 ZA15 ZA16 ZA31 ZA33 ZA53 ZA55 ZA66 ZA67 ZA75 ZA81 ZA94 ZA96 ZA97 ZB02 ZB08 ZB09 ZB13 ZB15 ZB21 ZB26 ZB27 ZB33 ZC02 ZC19 ZC35 ZC55─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI theme code (reference) A61K 38/22 A61K 47/42 38/27 47/48 38/43 A61P 1/02 38/46 1/04 47/24 1/16 47/42 3/10 47/48 5/14 A61P 1/02 7/00 1/04 7/04 1/16 7/06 3/10 13/12 5/14 17/00 7 / 00 17/06 7/04 21/00 7/06 25/28 13/12 27/02 17/00 29/00 101 17/06 31/12 21/00 31/14 25/28 31/18 27 / 02 35/00 29/00 101 35/02 31/12 37/04 31/14 37/06 31/18 37/08 35/00 43/00 101 35/02 105 37/04 111 37/06 123 37 / 08 A61K 37/02 43/00 101 37/48 105 37/36 111 C12N 15/00 A 123 A61K 37/24 C12N 15/09 37/54 // A61K 38/44 37/52 38/45 37/50 ( 81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH , GM, KE, LS, MW, MZ, SD, SL, SZ, TZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AG, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CR, CU, CZ, DE, DK, DM, DZ, EE, ES, FI, GB, GD , GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, MN, MW, MX, MZ, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, S , SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, TZ, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Ruggello della Bitta Italy, 2012-12 Milan , Corso Porta Romana No. 74 (72) Inventor Norman James Maitland United Kingdom, Wyower 1.5 WW, York, The University of York, Biology Department, Cancer Research Unit (72) Inventor David Jonathan Knight UK, Wyower 1.5 Wender, York, The University of York, Biology Department, Cancer Research Unit F-term (reference) 4B024 AA01 BA07 BA21 BA27 EA04 FA02 GA11 HA17 4C076 AA17 AA19 AA95 CC01 CC07 CC10 CC11 CC14 CC16 CC17 CC26 CC27 CC29 CC35 CC42 D D06 DD63 EE25 EE41 4C084 AA02 AA13 AA14 BA03 BA44 CA18 CA53 DA01 DA13 DA14 DA15 DA17 DA18 DA19 DA21 DA22 DA23 DA24 DA25 DB52 DB54 DB56 DB58 DC01 DC23 MA05 MA22 MA24 NA05 NA06 NA13 ZA55 ZA75B97 ZA75 ZA75 ZA75 ZA65 ZA66 ZA66 ZA67 ZA65 ZA65 ZA66 ZA66 ZA66 ZB13 ZB15 ZB21 ZB26 ZB27 ZB33 ZC02 ZC19 ZC35 ZC55 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA02 MA03 MA04 MA05 MA22 MA24 NA05 NA06 NA13 NA15 ZA15 ZA16 ZA31 ZZAB ZBZBZB15BZB15BZB15BZB15BZB15BZB15BZBZB15BZB15BZB15B97B97B97B97B97B97B97B97B97B97B97B97B97B97B75BZABZABZABZABZABZABZABZABZABZABZAB ZC55

Claims (48)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 保護材料と会合した遺伝子材料または核酸材料に連結された
増殖活性部分を含む生成物。1. A product comprising a proliferatively active moiety linked to genetic or nucleic acid material associated with protective material. 【請求項２】 該保護材料がミセル形成または複合体形成材料を含む、請求
項１に記載の生成物。2. The product of claim 1, wherein the protective material comprises a micelle forming or complex forming material. 【請求項３】 該複合体形成材料がポリリジンを含む、請求項２に記載の生
成物。3. The product of claim 2, wherein the complexing material comprises polylysine. 【請求項４】 該ミセル形成材料が１以上のリン脂質を含む、請求項２に記
載の生成物。4. The product of claim 2, wherein the micelle forming material comprises one or more phospholipids. 【請求項５】 該遺伝子材料が、タンパク質をコードする遺伝子を含んでい
て、機能し得る形で制御配列に連結された発現ベクターを含む、請求項１から４
のいずれか一項に記載の生成物。5. The genetic material comprises a gene encoding a protein and comprises an expression vector operably linked to regulatory sequences.
The product according to any one of 1. 【請求項６】 該遺伝子が細胞傷害性遺伝子、欠損修復遺伝子または免疫遺
伝子である、請求項５に記載の生成物。6. The product according to claim 5, wherein the gene is a cytotoxic gene, a defect repair gene or an immune gene. 【請求項７】 該細胞傷害性遺伝子が、プロドラッグを有毒薬剤へ変換する
酵素を発現するためのものである、請求項６に記載の生成物。7. The product of claim 6, wherein the cytotoxic gene is for expressing an enzyme that converts a prodrug into a toxic drug. 【請求項８】 該酵素がチミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、シトク
ロムP-450またはバクテリア・ニトロレダクターゼである、請求項７に記載の生
成物。8. The product of claim 7, wherein the enzyme is thymidine kinase, cytosine deaminase, cytochrome P-450 or bacterial nitroreductase. 【請求項９】 該制御配列がCMVプロモーターを含む、請求項５から８のい
ずれか一項に記載の生成物。9. A product according to any one of claims 5 to 8 wherein the control sequence comprises the CMV promoter. 【請求項１０】 該遺伝子材料がエピソーム維持配列を含む、請求項５から
９のいずれか一項に記載の生成物。10. The product according to any one of claims 5 to 9, wherein the genetic material comprises episomal maintenance sequences. 【請求項１１】 該遺伝子材料が２以上の遺伝子を含み、第２およびそれ以
上の遺伝子が各々機能し得る形で内部リボゾームエントリー部位と連結されてい
る、請求項５から１０のいずれか一項に記載の生成物。11. The method according to claim 5, wherein the genetic material contains two or more genes, and the second and more genes are operably linked to an internal ribosome entry site. The product described in. 【請求項１２】 該遺伝子材料がプラスミド構築物を含む、請求項１から１
１のいずれか一項に記載の生成物。12. The method of claims 1 to 1, wherein the genetic material comprises a plasmid construct.
The product according to any one of 1. 【請求項１３】 該核酸材料がアンチセンス配列を含む、請求項１から４の
いずれか一項に記載の生成物。13. A product according to any one of claims 1 to 4, wherein the nucleic acid material comprises an antisense sequence. 【請求項１４】 該作用因子と該部分との連結が細胞内で切断可能である、
請求項１から１３のいずれか一項に記載の生成物。14. The link between the agent and the moiety is cleavable intracellularly,
A product according to any one of claims 1 to 13. 【請求項１５】 該連結が酸加水分解によって切断可能である、請求項１４
に記載の生成物。15. The method of claim 14, wherein the linkage is cleavable by acid hydrolysis.
The product described in. 【請求項１６】 該増殖活性部分の標的細胞がそれに対する高親和性レセプ
ターを有する、請求項１から１５のいずれか一項に記載の生成物。16. The product according to any one of claims 1 to 15, wherein the target cells of the proliferatively active portion have high affinity receptors for them. 【請求項１７】 該増殖活性部分がサイトカインもしくは成長因子またはそ
れと機能上同等な分子である、請求項１６に記載の生成物。17. The product of claim 16, wherein the proliferatively active moiety is a cytokine or growth factor or a molecule functionally equivalent thereto. 【請求項１８】 該部分がサイトカインまたはサイトカインと機能上同等な
分子である、請求項１７に記載の生成物。18. The product of claim 17, wherein the moiety is a cytokine or a molecule functionally equivalent to a cytokine. 【請求項１９】 該サイトカインがIL、TNF、およびM-CSF、IFN、FGF、IGF
、TGF、GM-CSF、SCF、G-CSFまたはEpoである、請求項１８に記載の生成物。19. The cytokines are IL, TNF, and M-CSF, IFN, FGF, IGF.
19. The product of claim 18, which is, TGF, GM-CSF, SCF, G-CSF or Epo. 【請求項２０】 該ILがIL-2またはIL-6であり、該TNFがTNF-αであり、該I
FNがIFN-α、INF-βまたはIFN-γであり、該TGFがTGFβである、請求項１９に記
載の生成物。20. The IL is IL-2 or IL-6, the TNF is TNF-α, and the I
20. The product of claim 19, wherein the FN is IFN-α, INF-β or IFN-γ and the TGF is TGFβ. 【請求項２１】 該部分が成長因子または成長因子と機能上同等な分子であ
る、請求項１７に記載の生成物。21. The product of claim 17, wherein the moiety is a growth factor or a molecule functionally equivalent to a growth factor. 【請求項２２】 該成長因子が エリトロポエチン(Epo)； GM-CSF； G-CSF； SCF(幹細胞因子)； マルチ-CSF(インターロイキン-3としても知られる)； M-CSF； E-CSF(またはインターロイキン-5)； IGF-1(インスリン様成長因子)； PDGF(血小板由来成長因子)； TGFβ2(トランスフォーミング成長因子-β2) である、請求項２１に記載の生成物。22. The growth factor is   Erythropoietin (Epo);   GM-CSF;   G-CSF;   SCF (Stem Cell Factor);   Multi-CSF (also known as interleukin-3);   M-CSF;   E-CSF (or interleukin-5);   IGF-1 (insulin-like growth factor);   PDGF (platelet-derived growth factor);   TGFβ2 (Transforming growth factor-β2) 22. The product of claim 21, which is 【請求項２３】 該サイトカインまたは成長因子がヒトサイトカインまたは
成長因子であって、該部分がそれと機能上同等なものである、請求項１７に記載
の生成物。23. The product of claim 17, wherein the cytokine or growth factor is a human cytokine or growth factor and the moiety is functionally equivalent thereto. 【請求項２４】 該部分が所望により１以上のアミノ酸変異によって改変さ
れた組換えヒトサイトカインまたは成長因子である、請求項１７から２２のいず
れか一項に記載の生成物。24. The product according to any one of claims 17 to 22, wherein said portion is a recombinant human cytokine or growth factor optionally modified by one or more amino acid mutations. 【請求項２５】 該組換えヒトサイトカインが組換えIL-2である、請求項２
４に記載の生成物。25. The recombinant human cytokine is recombinant IL-2.
The product according to 4. 【請求項２６】 該組換えIL-2がdesala1-IL-2ser125である、請求項２５に
記載の生成物。26. The product of claim 25, wherein the recombinant IL-2 is desala 1 -IL-2ser 125 . 【請求項２７】 保護材料とともに提供され、サイトカインまたは成長因子
またはそれと機能上同等な分子に連結された生物活性因子を含み、該生物活性因
子は遺伝子材料およびアンチセンスヌクレオチド配列からなる群から選択され、
かつ、該サイトカインまたは成長因子はそれに対する高親和性レセプターを提供
し得る標的細胞を有する生成物。27. A bioactive factor provided with a protective material and linked to a cytokine or growth factor or a molecule functionally equivalent thereto, wherein the bioactive factor is selected from the group consisting of genetic material and antisense nucleotide sequences. ,
And a product having target cells to which the cytokine or growth factor can provide a high affinity receptor for it. 【請求項２８】 請求項２から１０、１９、２０または２２から２６の１以
上に記載の特徴をさらに含む、請求項２７に記載の生成物。28. The product of claim 27, further comprising the features of one or more of claims 2-10, 19, 20 or 22-26. 【請求項２９】 高親和性IL-2レセプターによって認識されて増殖を促進す
る機能を持つIL-2配列を含む第１のドメインを、アンチセンスヌクレオチド配列
および遺伝子材料からなる群から選択される生物活性因子を含む第２のドメイン
と連結して含む生成物。29. An organism in which the first domain containing an IL-2 sequence recognized by a high-affinity IL-2 receptor and having a function of promoting proliferation is selected from the group consisting of antisense nucleotide sequences and genetic material. A product comprising a second domain comprising an activator linked thereto. 【請求項３０】 請求項２から１２の１以上に記載の特徴をさらに含む、請
求項２９に記載の生成物。30. The product of claim 29, further comprising the features of one or more of claims 2-12. 【請求項３１】 カチオン性DNA結合材料と会合したヌクレオチドに連結さ
れた生物活性部分を含む生成物。31. A product comprising a bioactive moiety linked to a nucleotide associated with a cationic DNA binding material. 【請求項３２】 該DNA結合材料がポリマー、リポソームまたはデンドリマ
ーを含む、請求項３１に記載の生成物。32. The product of claim 31, wherein the DNA binding material comprises a polymer, liposome or dendrimer. 【請求項３３】 該ポリマーがポリリジン、ポリリジン誘導体、またはポリ
エチレンイミンを含む、請求項３２に記載の生成物。33. The product of claim 32, wherein the polymer comprises polylysine, polylysine derivative, or polyethyleneimine. 【請求項３４】 該DNA結合材料が活性部分とヌクレオチドとの間に架橋を
形成する、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の生成物。34. The product according to any one of claims 31 to 33, wherein the DNA binding material forms a bridge between the active moiety and the nucleotide. 【請求項３５】 該DNA結合材料がヌクレオチドと複合体を形成する、請求
項３１から３４のいずれか一項に記載の生成物。35. The product according to any one of claims 31 to 34, wherein the DNA binding material forms a complex with nucleotides. 【請求項３６】 該ヌクレオチドが、請求項５から１２のいずれか一項で定
義された遺伝子材料、またはアンチセンス配列を含む、請求項３１から３５のい
ずれか一項に記載の生成物。36. The product according to any one of claims 31 to 35, wherein said nucleotide comprises a genetic material as defined in any one of claims 5 to 12, or an antisense sequence. 【請求項３７】 請求項１４から２６の１以上に記載の特徴をさらに含む、
請求項３１から３６のいずれか一項に記載の生成物。37. Further comprising the features of one or more of claims 14-26.
A product according to any one of claims 31 to 36. 【請求項３８】 高親和性IL-2レセプターによって認識されて増殖を促進す
る機能を持つIL-2配列を含む第１のドメインを、機能的ADA遺伝子(なお、該遺伝
子は所望により保護材料に会合されていてもよい)を含む第２のドメインと連結
して含む生成物。38. A first domain containing an IL-2 sequence that is recognized by a high-affinity IL-2 receptor and has a function of promoting proliferation is provided with a functional ADA gene (the gene is optionally used as a protective material). A product comprising in association with a second domain comprising (which may be associated). 【請求項３９】 機能的ADA遺伝子を含む発現ベクターに連結された機能的I
L-2を含む生成物。39. A functional I linked to an expression vector containing a functional ADA gene.
Product containing L-2. 【請求項４０】 医薬として用いられる、請求項１から３９のいずれか一項
に記載の生成物。40. A product according to any one of claims 1 to 39 for use as a medicament. 【請求項４１】 増殖活性部分に対する高親和性レセプターを有する細胞を
含む疾病または疾患の治療または予防処置する薬剤の製造のための、請求項１か
ら４０のいずれか一項に記載の生成物の使用。41. A product according to any one of claims 1 to 40 for the manufacture of a medicament for the therapeutic or prophylactic treatment of a disease or disorder comprising cells having high affinity receptors for proliferatively active moieties. use. 【請求項４２】 該生成物が、IL-2機能を有する増殖活性部分を含み、該疾
病または疾患が自己免疫疾患、移植拒絶、移植片対宿主病、レトロウイルス疾患
またはリンパ球増殖性疾患である、請求項４１に記載の使用。42. The product comprises a proliferatively active moiety having IL-2 function and the disease or disorder is an autoimmune disease, transplant rejection, graft-versus-host disease, retroviral disease or lymphoproliferative disease. 42. The use according to claim 41. 【請求項４３】 医薬用に処方された請求項１から４０のいずれか一項に記
載の生成物を含む、医薬製剤。43. A pharmaceutical formulation comprising a product according to any one of claims 1 to 40 formulated for use in medicine. 【請求項４４】 請求項１から４０のいずれか一項に記載の生成物と医薬上
許容される希釈剤、賦形剤または担体を含む、医薬組成物。44. A pharmaceutical composition comprising a product according to any one of claims 1 to 40 and a pharmaceutically acceptable diluent, excipient or carrier. 【請求項４５】 該生成物の増殖活性部分、サイトカインまたは成長因子に
対する高親和性レセプターを有する細胞内に生物活性因子を取り込ませ、さらに
所望によりリンパ球の増殖を刺激する薬剤の製造のための、請求項１から４０の
いずれか一項に記載の生成物の使用。45. For the production of a drug which incorporates a bioactive factor into a cell having a high affinity receptor for a growth-active portion of the product, a cytokine or a growth factor, and further optionally stimulates the proliferation of lymphocytes. 41. Use of a product according to any one of claims 1 to 40. 【請求項４６】 増殖活性部分に対する高親和性レセプターを有する細胞を
含む疾病または疾患を治療または予防処置する方法であって、請求項１から４０
のいずれか一項に記載の有効量の生成物(なお、該生成物は該レセプターに対し
て高い親和性を有する増殖活性部分を含む)を患者に投与することを含む方法。46. A method of treating or preventing a disease or disorder involving cells having high affinity receptors for proliferatively active moieties, the method comprising:
13. A method comprising administering to a patient an effective amount of a product according to any one of claims 1 to 3, wherein the product comprises a proliferatively active moiety having a high affinity for the receptor. 【請求項４７】 発現ベクターおよびアンチセンス配列からなる群から選択
される封入または複合体形成核酸材料に連結された、増殖的に活性な部分を含む
生成物。47. A product comprising a proliferatively active moiety linked to an encapsulating or complexing nucleic acid material selected from the group consisting of expression vectors and antisense sequences. 【請求項４８】 機能的酸スフィンゴミエリナーゼ遺伝子に連結された、M-
CSF、SCFまたはGM-CSF機能を有する部分を含む生成物。48. An M- linked to a functional acid sphingomyelinase gene.
A product comprising a moiety having CSF, SCF or GM-CSF function.
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