JP2003174873A - Method for removing inhibitory substance against enzymatic gene amplification reaction - Google Patents
Method for removing inhibitory substance against enzymatic gene amplification reactionInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、酵素的遺伝子増幅
反応に対する阻害物質の除去方法に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for removing an inhibitory substance for an enzymatic gene amplification reaction.
【０００２】[0002]
【従来の技術】遺伝子複製酵素による試料中の遺伝子増
幅反応を行うにあたっては、試料中に含まれる酵素の阻
害物質の除去、即ち鋳型の核酸の精製が重要である。2. Description of the Related Art In carrying out a gene amplification reaction in a sample by a gene replication enzyme, it is important to remove an inhibitor of the enzyme contained in the sample, that is, to purify a template nucleic acid.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】例えば、ヒト血液中の
ヘモグロビン，糞便中の胆汁酸，土壌のフミン酸（Ｈｕ
ｍｉｃ ａｃｉｄ）は遺伝子複製酵素に対する阻害物質
であり、有機汚泥（アオコ汚染湖水，食品汚泥等）の遺
伝子複製酵素に対する未知の阻害物質を除去することは
極めて作業が煩雑であった。本発明は、上記課題に鑑み
なされたもので、正確性，再現性，迅速性，簡便性，経
済性に優れた酵素的遺伝子増幅反応に対する阻害物質の
除去方法を提供することを目的とする。[Problems to be Solved by the Invention] For example, hemoglobin in human blood, bile acid in feces, humic acid (Hu) in soil (Hu).
mic acid) is an inhibitor of a gene replication enzyme, and it has been extremely troublesome to remove an unknown inhibitor of a gene replication enzyme of organic sludge (blue water contaminated lake water, food sludge, etc.). The present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a method for removing an inhibitory substance for an enzymatic gene amplification reaction, which is excellent in accuracy, reproducibility, rapidity, convenience, and economy.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】発明者は、酵素的ＤＮＡ
増幅反応の阻害物質の除去方法を検討するにあたり、環
境からの混入の可能性が低いと考えられる細菌Ｈｅｌｉ
ｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉの染色体ＤＮＡもしく
は２種類の鋳型合成ＤＮＡ，メチシリン耐性黄色ブドウ
球菌の耐性遺伝子ＤＮＡ（ｍｅｃＡ）とプロティンＡ遺
伝子ＤＮＡ（ｓｐａ）（染色体上）を検出対象とした。
土壌などに含まれる阻害物質としてフミン酸を選び、Ｄ
ＮＡ増幅反応の中からＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を選んでその影響を調
べたところ、反応液０．０５ｍｌ中にフミン酸が１ｎｇ
以上存在するとＰＣＲ反応を阻害することを確認した。
そして、フミン酸を除くために電気泳動法，遠心沈殿法
を組み合わせたカラムクロマト法によるゲル濾過法（Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２０
０）、さらにフィルター法を検討した。有機汚泥１ｍｌ
に鋳型合成ＤＮＡ１０８分子を添加した実験で、遠心操
作を伴う、溶菌作業，除蛋白，アルコール沈殿およびカ
ラムクロマト法によるゲル濾過担体を組み合わせた精製
により、目的の鋳型ＤＮＡの抽出精製およびＰＣＲ阻害
物質の除去を行うことが可能であることが分かった。な
お、電気泳動法による方法では目的の鋳型ＤＮＡの抽出
精製およびＰＣＲ阻害物質の除去を行うことは不可能で
あった。これらの方法を総合的に検討した結果、正確
性，再現性，迅速性，簡便性，経済性に優れた方法とし
て、フィルターによる目的の鋳型ＤＮＡの抽出精製およ
びＰＣＲ阻害物質の除去を行う方法を見いだした。The inventor has found that enzymatic DNA
Heli, which is considered to be unlikely to be contaminated from the environment, when investigating a method for removing an inhibitor of an amplification reaction
Chromosomal DNA of cobacterium pylori or two kinds of template synthetic DNA, methicillin-resistant Staphylococcus aureus resistance gene DNA (mecA) and protein A gene DNA (spa) (on the chromosome) were detected.
Select humic acid as an inhibitor contained in soil etc.
From the NA amplification reaction, PCR (Polymerase)
(Chain Reaction) was selected and its effect was investigated, and 1 ng of humic acid was contained in 0.05 ml of the reaction solution.
It was confirmed that the PCR reaction was inhibited when present above.
Then, in order to remove humic acid, a gel filtration method by a column chromatography method that combines an electrophoresis method and a centrifugal precipitation method (S
ephadex G25, Sephadex G20
0), and further examined the filter method. 1 ml of organic sludge
In the experiment with the addition of template synthesis DNA 10 8 molecules, it involves centrifugation, lysed work, deproteinization, by purification of a combination of gel filtration carrier with alcohol precipitation and column chromatography, extraction, purification and PCR inhibitors object of template DNA It has been found that it is possible to remove It was impossible to extract and purify the target template DNA and remove the PCR inhibitor by the method by electrophoresis. As a result of comprehensively examining these methods, as a method excellent in accuracy, reproducibility, speediness, convenience, and economical efficiency, a method of extracting and purifying a target template DNA by a filter and removing a PCR inhibitor is found. I found it.
【０００５】即ち、本発明に係る請求項１の酵素的遺伝
子増幅反応の阻害物質の除去方法では、酵素的遺伝子増
幅反応の阻害物質をフィルターを使用して除去すること
を特徴としている。また、本発明に係る請求項２の酵素
的遺伝子増幅反応の阻害物質の除去方法では、請求項１
に記載の発明であって、前記フィルターとして、黄色ブ
ドウ球菌等の菌体を捕集・溶菌するフィルター層と凝固
蛋白，酵素的遺伝子増幅反応の阻害物質等の不要物の濾
過・除去するフィルター層を積層させた第１のフィルタ
ーと、ＤＮＡを吸着補助するフィルター層とＤＮＡを吸
着するフィルター層とを積層させた第２のフィルターを
使用することを特徴としている。さらにまた、本発明に
係る請求項３の酵素的遺伝子増幅反応の阻害物質の除去
方法では、請求項２に記載の発明であって、前記黄色ブ
ドウ球菌等の菌体を捕集・溶菌するフィルター層とし
て、ガラス繊維フィルター，ポリエチレン樹脂フィルタ
ー，不織布フィルター等の黄色ブドウ球菌等を立体的に
捕集する特性を備えたものを使用し、前記凝固蛋白，前
記酵素的遺伝子増幅反応の阻害物質等の不要物の濾過・
除去のためのフィルター層として、酢酸セルロース，ポ
リフッ化ビニリデン等の生物学的不活性，低蛋白吸着性
の特性を備えたものを使用し、前記ＤＮＡを吸着補助す
るフィルター層として、微細ホウケイ酸塩ガラス繊維等
の生化学的液体に対して不活性の特性を備えたものを使
用し、前記ＤＮＡを吸着するフィルター層として、シリ
カマトリックス等の水中沈降速度が０．２５ｃｍ／ｍｉ
ｎ以下の特性を備えたものを使用することを特徴として
いる。That is, the method for removing an inhibitor of an enzymatic gene amplification reaction according to claim 1 of the present invention is characterized in that an inhibitor of an enzymatic gene amplification reaction is removed using a filter. The method for removing an inhibitor of an enzymatic gene amplification reaction according to claim 2 according to the present invention provides:
The filter layer for collecting and lysing bacterial cells such as Staphylococcus aureus, and the filter layer for filtering and removing unwanted substances such as coagulation proteins and inhibitors of enzymatic gene amplification reaction as the filter. It is characterized by using a second filter in which a first filter in which is laminated, a filter layer for assisting adsorption of DNA, and a filter layer in which DNA is adsorbed are laminated. Furthermore, in the method for removing an inhibitor of an enzymatic gene amplification reaction according to claim 3 of the present invention, the invention according to claim 2, wherein the filter collects and lyses the bacterial cells such as Staphylococcus aureus. As the layer, a glass fiber filter, a polyethylene resin filter, a non-woven fabric filter, or the like having a characteristic of three-dimensionally collecting Staphylococcus aureus is used, and the coagulation protein, the inhibitor of the enzymatic gene amplification reaction, or the like is used. Filtration of unwanted materials
As the filter layer for removal, a filter layer having properties of biological inactivity and low protein adsorption property such as cellulose acetate and polyvinylidene fluoride is used, and fine borosilicate is used as the filter layer for assisting the adsorption of the DNA. As a filter layer for adsorbing the DNA, a material having an inert property with respect to a biochemical liquid such as glass fiber is used, and the sedimentation rate in water of silica matrix or the like is 0.25 cm / mi.
It is characterized in that it has a characteristic of n or less.
【０００６】[0006]
【発明の実施の形態】以下に、本発明に係る酵素的遺伝
子増幅反応に対する阻害物質の除去方法を説明する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION A method for removing an inhibitory substance for an enzymatic gene amplification reaction according to the present invention will be described below.
【０００７】この方法では、図１において概念的に示し
た装置を使用している。この装置は、第１フィルターチ
ューブ１１を保持する第１チューブラック１０と、第２
フィルターチューブ２１を保持する第２チューブラック
２０と、第１フィルターチューブ１１および第２フィル
ターチューブ２１を吸引する吸引手段３０を備えてい
る。This method uses the device conceptually shown in FIG. This device includes a first tube rack 10 holding a first filter tube 11 and a second tube rack 10.
The second tube rack 20 holding the filter tubes 21 and the suction means 30 for sucking the first filter tubes 11 and the second filter tubes 21 are provided.
【０００８】第１フィルターチューブ１１は、図２に示
したように円柱状に形成され、そのフランジ部１２にフ
ィルター１３が設けられている。このフィルター１３
は、図３に示したようにトラップフィルター１３ａとメ
ンブランフィルター１３ｂとを層状に重ね合わせたもの
である。The first filter tube 11 is formed in a columnar shape as shown in FIG. 2, and a filter 13 is provided on the flange portion 12 thereof. This filter 13
Is a layered stack of the trap filter 13a and the membrane filter 13b as shown in FIG.
【０００９】トラップフィルター１３ａは、主としてメ
チシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）等の菌体を捕
集し、溶菌するためのフィルター層である。材質として
は、ガラス繊維フィルターやポリエチレン樹脂フィルタ
ーや不織布フィルターが好ましく、菌体を立体的に捕集
する特性を備えていることが好ましい。The trap filter 13a is a filter layer for mainly collecting and lysing bacterial cells such as methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). As a material, a glass fiber filter, a polyethylene resin filter, or a non-woven fabric filter is preferable, and it is preferable that the material has a characteristic of three-dimensionally collecting bacterial cells.
【００１０】メンブランフィルター１３ｂは、主として
凝固蛋白，酵素的遺伝子増幅反応の阻害物質等の濾過・
除去のためのフィルター層である。材質としては、酢酸
セルロース，ポリフッ化ビニリデン等が好ましく、生物
学的不活性，低蛋白吸着性の特性を備えていることが好
ましい。The membrane filter 13b is mainly for filtering coagulation proteins, substances inhibiting enzymatic gene amplification reaction, etc.
It is a filter layer for removal. As a material, cellulose acetate, polyvinylidene fluoride or the like is preferable, and it is preferable that the material has properties of biological inactivity and low protein adsorption.
【００１１】第２フィルターチューブ２１は、図２に示
したように第１フィルターチューブ１１と同一の形状を
成しており、そのフランジ部２２にフィルター２３が設
けられている。このフィルター２３は、図４に示したよ
うに２層のガラス繊維フィルター２３ａ，２３ｂと、ガ
ラスパウダー層２３ｃと、メンブランフィルター２３ｄ
とが積層されたものである。ガラス繊維フィルター２３
ａ，２３ｂは、ＤＮＡを吸着補助するためのフィルター
層であり、材質としては、微細ホウケイ酸塩ガラス繊維
等が好ましく、生化学的液体に対して不活性の特性を備
えていることが好ましい。The second filter tube 21 has the same shape as the first filter tube 11 as shown in FIG. 2, and a filter 23 is provided on the flange portion 22 thereof. As shown in FIG. 4, the filter 23 includes two layers of glass fiber filters 23a and 23b, a glass powder layer 23c, and a membrane filter 23d.
And are laminated. Glass fiber filter 23
Reference numerals a and 23b are filter layers for assisting adsorption of DNA, and the material thereof is preferably fine borosilicate glass fiber or the like, and preferably has a property of being inert to a biochemical liquid.
【００１２】ガラスパウダー層２３ｃは、主としてＤＮ
Ａ吸着のための層であり、材質としては、シリカマトリ
ックス等が好ましく、水中沈降速度０．２５ｃｍ／ｍｉ
ｎ以下の特性を備えていることが好ましい。また、メン
ブランフィルター２３ｄの機能，材質は、上記第１フィ
ルターチューブ１１のものと同じである。The glass powder layer 23c is mainly composed of DN.
A layer for adsorbing A, and the material is preferably a silica matrix or the like, and the sedimentation rate in water is 0.25 cm / mi.
It is preferable to have characteristics of n or less. The function and material of the membrane filter 23d are the same as those of the first filter tube 11.
【００１３】また、吸引手段３０は、廃液バット３１を
有しており、該廃液バットの内部は、廃水トラップ３２
を介して真空ポンプ３３に接続されている。Further, the suction means 30 has a waste liquid vat 31, and the inside of the waste liquid vat has a waste water trap 32.
Is connected to the vacuum pump 33 via.
【００１４】そして、上記第１フィルターチューブ１１
は、第１チューブラック１０に保持され、第２フィルタ
ーチューブ２１は第２チューブラック２０に保持され、
第１チューブラック１０は第２チューブラック２０の上
に重ね合わされ、第２チューブブラック２０は吸引手段
３０の廃液バット３１上に重ね合わされる。The first filter tube 11
Is held in the first tube rack 10, the second filter tube 21 is held in the second tube rack 20,
The first tube rack 10 is superposed on the second tube rack 20, and the second tube black 20 is superposed on the waste liquid vat 31 of the suction means 30.
【００１５】このような装置を使用して、本発明に係る
酵素的遺伝子増幅反応に対する阻害物質の除去方法が以
下のように実施される。
酵素的遺伝子増幅反応に対する阻害物質が混入した
対象菌懸濁液を第１フィルターチューブ１１のトラップ
フィルター１３ａに３ｍｌ注加し、−６２０ｍｍＨｇで
十分吸引し、溶液部分が残らないことを確認した後、吸
引を終了する。
２００〜４００μｌの溶菌用試薬を第１フィルター
チューブ１１のトラップフィルター１３ａに添加し、室
温にて１０分間放置して溶菌させ、ＤＮＡを細胞外に溶
出する。同時に溶菌用試薬によって不用なＲＮＡを消化
する。溶菌酵素としては、リゾチーム（ｌｙｓｏｚｙｍ
ｅ）等を含み、ＲＮＡ分解酵素として、リボヌクレアー
ゼＡ等を含むものを使用する。
第１フィルターチューブ１１のトラップフィルター
１３ａに試料の完全可溶化処理のための試薬を添加す
る。そして、室温にて５分間放置することにより、試料
の完全可溶化を行う。試料の完全可溶化処理のための試
薬としては、０．２Ｎ水酸化ナトリウム・１％ラウリル
硫酸ナトリウム溶液を４００μｌ使用した。
３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ４．８）を第１フィルター
チューブ１１のトラップフィルター１３ａに３００μｌ
を添加し、室温にて５分間放置し、塩基性溶液を中和す
るとともに、細胞構成蛋白質および酵素的遺伝子増幅反
応の阻害物質を凝固処理する。
８Ｍヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）または１０Ｍチオ
シアン酸ナトリウム（ＮａＳＣＮ）を第１フィルターチ
ューブ１１に添加する。そして、第１フィルターチュー
ブ１１を第２フィルターチューブ２１に連設し、真空ポ
ンプ３３にて第２フィルターチューブ２１を１０分間吸
引する。すると、第１フィルターチューブ１１から第２
フィルターチューブ２１へＤＮＡ抽出液が回収される。
そして、ＤＮＡは第２フィルターチューブ２１のガラス
パウダー層２３に吸着される。Using such an apparatus, the method for removing an inhibitory substance for the enzymatic gene amplification reaction according to the present invention is carried out as follows. 3 ml of the target bacterial suspension mixed with an inhibitor against the enzymatic gene amplification reaction was added to the trap filter 13a of the first filter tube 11, and sufficiently sucked at -620 mmHg, and after confirming that no solution portion remained, Finish suction. 200 to 400 μl of the lysis reagent is added to the trap filter 13a of the first filter tube 11 and left at room temperature for 10 minutes to lyse the cells, and the DNA is eluted outside the cells. At the same time, unwanted RNA is digested with a lysis reagent. Lysozyme (lysozym) is used as a lytic enzyme.
e) and the like, and those containing ribonuclease A etc. as the RNA degrading enzyme are used. A reagent for completely solubilizing the sample is added to the trap filter 13a of the first filter tube 11. Then, the sample is completely solubilized by leaving it at room temperature for 5 minutes. As a reagent for completely solubilizing the sample, 400 μl of 0.2N sodium hydroxide / 1% sodium lauryl sulfate solution was used. 300 μl of 3M potassium acetate (pH 4.8) was added to the trap filter 13a of the first filter tube 11.
Is added, and the mixture is allowed to stand at room temperature for 5 minutes to neutralize the basic solution and coagulate the cell constituent protein and the inhibitor of the enzymatic gene amplification reaction. Add 8M sodium iodide (NaI) or 10M sodium thiocyanate (NaSCN) to the first filter tube 11. Then, the first filter tube 11 is connected to the second filter tube 21, and the second filter tube 21 is sucked by the vacuum pump 33 for 10 minutes. Then, from the first filter tube 11 to the second
The DNA extract is collected in the filter tube 21.
Then, the DNA is adsorbed on the glass powder layer 23 of the second filter tube 21.
【００１６】[0016]
【実施例】プラスミド精製装置（株式会社トミー精工製
ＤＰ−４８０）を使用し、本発明の方法を実施した。こ
の装置は、上記実施の形態で説明したように、第１フィ
ルターチューブ１１および第２フィルターチューブ２１
を備え、第１チューブラック１０および第２チューブラ
ック２０にそれぞれ保持される。そして、第１フィルタ
ーチューブ１１には上記したトラップフィルター１３ａ
およびメンブランフィルター１３ｂが積層されたフィル
ター１３が配設され、また第２フィルターチューブ２０
には上記した２層のガラス繊維フィルター２３ａ，２３
ｂと、ガラスパウダー層２３ｃとメンブランフィルター
２３ｄが積層されたフィルター２３が配設されている。
植菌
大腸菌ベロ毒素遺伝子（ＶＴ１，ＶＴ２）ＤＮＡ（プラ
スミド上），黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性遺伝子
（ｍｅｃＡ）ＤＮＡ，プロティンＡ遺伝子（ｓｐａ）Ｄ
ＮＡ（染色体上）の必要量３ｍｌの液体培地へ白金線接
種を行った。
菌数計測
トリプトソイ寒天培地の作成，菌液の希釈系列（１０〜
１０８倍希釈）の作成または各希釈液より１００μｌプ
レートに塗布し、寒天培地表面に広げ、３５℃で一晩培
養し、コロニーをカウントした。
上記（原液）または上記（希釈列）の菌液１ｍ
ｌを集菌し、６０００ｒｐｍで５分間遠心処理し、上清
を除いて沈渣（菌体）だけにする。
上記で得られた菌体に被検物（血液，フミン酸，
食品汚泥など）を１ｍｌ加えて、菌を再浮遊させる。
上記装置（フィルタシステム）にかけて上記した一
連の操作を行う。そして、回収した回収体積を目視によ
って確認てＤＮＡ量を測定する。
常法のプロトコールに従い、ＰＣＲ酵素的ＤＮＡ増
幅反応と引続きＭＰＨ（マルチウェルハイブリ）を行な
い、回収した溶液の中の目的ＤＮＡを検出した。[Example] The method of the present invention was carried out using a plasmid purification apparatus (DP-480 manufactured by Tommy Seiko Co., Ltd.). As described in the above embodiment, this device has the first filter tube 11 and the second filter tube 21.
And is held by the first tube rack 10 and the second tube rack 20, respectively. The first filter tube 11 has the trap filter 13a described above.
The filter 13 in which the membrane filter 13b and the membrane filter 13b are laminated is disposed, and the second filter tube 20
Is the above-mentioned two-layer glass fiber filters 23a, 23
b, a filter 23 in which a glass powder layer 23c and a membrane filter 23d are laminated is provided. Inoculated E. coli verotoxin gene (VT1, VT2) DNA (on plasmid), methicillin resistance gene (mecA) DNA of Staphylococcus aureus, protein A gene (spa) D
Platinum rays were inoculated into a liquid culture medium containing 3 ml of NA (on the chromosome). Preparation of tryptosoy agar medium, dilution series of bacterial solution (10 to 10)
(10 8 -fold dilution) or each dilution was applied to a 100 μl plate, spread on the surface of the agar medium, and cultured overnight at 35 ° C., and colonies were counted. 1m of the above (stock solution) or the above (dilution column) bacterial solution
1 is collected and centrifuged at 6000 rpm for 5 minutes to remove the supernatant and leave only the precipitate (bacteria). The test substance (blood, humic acid,
1 ml of food sludge) to resuspend the bacteria. The above-described series of operations is performed on the above-mentioned device (filter system). Then, the recovered volume is visually confirmed to measure the DNA amount. According to a conventional protocol, PCR enzymatic DNA amplification reaction and subsequent MPH (multi-well hybrid) were performed to detect the target DNA in the recovered solution.
【００１７】その結果は以下のとおりであった。
ａ） 大腸菌１．９５×１０２／ｍｌ菌液以上の濃度で
上記フィルターシステムを通すと、大腸菌ベロ毒素遺伝
子ＶＴ１ＤＮＡ（プラスミド上），ＶＴ２ＤＮＡ（プラ
スミド上）を検出することができた。
ｂ） 大腸菌を３５℃で一晩培養した菌液にフミン酸を
加えると、ＰＣＲ反応が阻害されたが、大腸菌液３ｍｌ
にフミン酸６００μｇ以下の添加量では、上記フィルタ
ーシステムを通すと、フミン酸を除くことができ、ＰＣ
Ｒ反応が進み、ベロ毒素遺伝子ＶＴ１ＤＮＡ，ＶＴ２Ｄ
ＮＡを検出できた。
ｃ） ６．３６×１０４／ｍｌ個以上のＭＲＳＡ菌体を
上記フィルターシステムに通し、ｓｐａ遺伝子ＤＮＡと
ｍｅｃＡ遺伝子ＤＮＡを検出できた。
ｄ） ＭＲＳＡ菌体を遠心分離で集菌し、食品汚泥で再
懸したものを上記フィルターシステムに通し、阻害物質
を除くと、ｓｐａ遺伝子ＤＮＡとｍｅｃＡ遺伝子ＤＮＡ
を遺伝子増幅反応（ＰＣＲ）で検出可能であった。ま
た、Ａ型，Ｂ型血液によるＰＣＲ阻害も除去できること
が明らかになった。陽性コントロールに溶血液を加えた
場合には、ＰＣＲを阻害することも分かった。
ｅ） 黄色ブドウ球菌原液（５，２１×１０８／ｍｌ）
に食品汚泥，５倍溶血液を加え、上記フィルターシステ
ムを通過させると、阻害物質を除くことができ、遺伝子
増幅産物（ｍｅｃＡ，ｓｐａ）を得ることができた。The results were as follows. a) E. coli verotoxin genes VT1DNA (on the plasmid) and VT2DNA (on the plasmid) could be detected by passing through the above filter system at a concentration of E. coli 1.95 × 10 2 / ml or more. b) When humic acid was added to the bacterial solution obtained by culturing Escherichia coli at 35 ° C. overnight, the PCR reaction was inhibited.
Humic acid can be removed by passing through the above filter system when the amount of humic acid added is 600 μg or less.
R reaction progresses, and verotoxin gene VT1DNA, VT2D
NA could be detected. c) 6.36 × 10 4 / ml or more MRSA cells were passed through the above filter system, and spa gene DNA and mecA gene DNA could be detected. d) MRSA bacterial cells were collected by centrifugation, resuspended with food sludge, passed through the above filter system, and if the inhibitory substances were removed, spa gene DNA and mecA gene DNA were removed.
Was detectable by gene amplification reaction (PCR). Further, it was revealed that the PCR inhibition by blood of A type and B type can be eliminated. It was also found that the addition of hemolysate to the positive control inhibited PCR. e) Staphylococcus aureus stock solution (5,21 × 10 8 / ml)
When food sludge and 5-fold hemolyzed blood were added to the above and passed through the above filter system, the inhibitory substance could be removed and the gene amplification product (mecA, spa) could be obtained.
【図１】本発明に係る方法を実施するための装置の概念
図である。1 is a schematic diagram of an apparatus for performing the method according to the present invention.
【図２】その装置で使用されるフィルターチューブの断
面図である。FIG. 2 is a cross-sectional view of a filter tube used in the device.
【図３】第１フィルターチューブに配設されるフィルタ
ーの構成図である。FIG. 3 is a configuration diagram of a filter arranged in a first filter tube.
【図４】第２フィルターチューブに配設されるフィルタ
ーの構成図である。FIG. 4 is a configuration diagram of a filter arranged in a second filter tube.
１０ 第１チューブラック １１ 第１フィルターチューブ １２ フランジ部 １３ フィルター １３ａ トラップフィルター １３ｂ メンブランフィルター ２０ 第２チューブラック ２１ 第２フィルターチューブ ２２ フランジ部 ２３ フィルター ２３ａ，２３ｂ ガラス繊維フィルター ２３ｃ ガラスパウダー層 ２３ｄ メンブランフィルター ３０ 吸引手段 ３１ 廃液バット ３２ 廃液トラップ ３３ 真空ポンプ 10 First tube rack 11 1st filter tube 12 Flange 13 filters 13a Trap filter 13b membrane filter 20 Second Tube Rack 21 Second filter tube 22 Flange 23 filters 23a, 23b glass fiber filter 23c glass powder layer 23d membrane filter 30 suction means 31 waste liquid vat 32 Waste liquid trap 33 vacuum pump
Claims (3)
ルターを使用して除去することを特徴とする酵素的遺伝
子増幅反応の阻害物質の除去方法。1. A method for removing an inhibitor of an enzymatic gene amplification reaction, which comprises removing an inhibitor of an enzymatic gene amplification reaction using a filter.
等の菌体を捕集・溶菌するフィルター層と凝固蛋白，酵
素的遺伝子増幅反応の阻害物質等の不要物の濾過・除去
するフィルター層を積層させた第１のフィルターと、Ｄ
ＮＡを吸着補助するフィルター層とＤＮＡを吸着するフ
ィルター層とを積層させた第２のフィルターを使用する
ことを特徴とする請求項１に記載の酵素的遺伝子増幅反
応の阻害物質の除去方法。2. As the filter, a filter layer for collecting and lysing bacterial cells such as Staphylococcus aureus and a filter layer for filtering and removing unwanted substances such as coagulation proteins and inhibitors of enzymatic gene amplification reaction are laminated. The first filter and D
The method for removing an inhibitor of an enzymatic gene amplification reaction according to claim 1, wherein a second filter in which a filter layer for assisting NA adsorption and a filter layer for adsorbing DNA are laminated is used.
菌するフィルター層として、ガラス繊維フィルター，ポ
リエチレン樹脂フィルター，不織布フィルター等の黄色
ブドウ球菌等を立体的に捕集する特性を備えたものを使
用し、前記凝固蛋白，前記酵素的遺伝子増幅反応の阻害
物質等の不要物の濾過・除去のためのフィルター層とし
て、酢酸セルロース，ポリフッ化ビニリデン等の生物学
的不活性，低蛋白吸着性の特性を備えたものを使用し、
前記ＤＮＡを吸着補助するフィルター層として、微細ホ
ウケイ酸塩ガラス繊維等の生化学的液体に対して不活性
の特性を備えたものを使用し、前記ＤＮＡを吸着するフ
ィルター層として、シリカマトリックス等の水中沈降速
度が０．２５ｃｍ／ｍｉｎ以下の特性を備えたものを使
用することを特徴とする請求項２に記載の酵素的遺伝子
増幅反応の阻害物質の除去方法。3. The filter layer for collecting and lysing bacterial cells such as Staphylococcus aureus has a characteristic of three-dimensionally collecting Staphylococcus aureus such as a glass fiber filter, a polyethylene resin filter and a non-woven fabric filter. Used as a filter layer for filtering / removing unnecessary substances such as the coagulation protein and the inhibitor of the enzymatic gene amplification reaction, as a biologically inactive substance such as cellulose acetate and polyvinylidene fluoride, low protein adsorption Use something with sexual characteristics,
As the filter layer for adsorbing the DNA, a filter layer having a property of being inactive against a biochemical liquid such as fine borosilicate glass fiber is used, and as the filter layer for adsorbing the DNA, a silica matrix or the like is used. The method for removing an inhibitor of an enzymatic gene amplification reaction according to claim 2, wherein a material having a characteristic that the sedimentation rate in water is 0.25 cm / min or less is used.
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Cited By (3)
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