JP2003130823A - Ｒｒｆの分子内ドメイン運動の評価方法とこれに基づくｒｒｆ阻害剤の設計とスクリーニング方法 - Google Patents
Ｒｒｆの分子内ドメイン運動の評価方法とこれに基づくｒｒｆ阻害剤の設計とスクリーニング方法Info
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- JP2003130823A JP2003130823A JP2001325896A JP2001325896A JP2003130823A JP 2003130823 A JP2003130823 A JP 2003130823A JP 2001325896 A JP2001325896 A JP 2001325896A JP 2001325896 A JP2001325896 A JP 2001325896A JP 2003130823 A JP2003130823 A JP 2003130823A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ＲＲＦの分子内ドメイン運動の評価方法とこ
れに基づくＲＲＦ阻害剤の設計とスクリーニング方法を
提供する。 【解決手段】 ＲＲＦ（リボソーム再生因子）のαヘリ
ックス構造のドメインＩを回転軸として、これに連結す
るβシート構造のドメインIIの水平回転の動きを、ＮＭ
Ｒで核磁気緩和時間を測定し、得られるスペクトル密度
関数によって求められる回転拡散テンソルと、ドメイン
ＩとドメインIIの実効回転相関時間の差異とからＲＲＦ
の分子内ドメイン運動を評価する。
れに基づくＲＲＦ阻害剤の設計とスクリーニング方法を
提供する。 【解決手段】 ＲＲＦ（リボソーム再生因子）のαヘリ
ックス構造のドメインＩを回転軸として、これに連結す
るβシート構造のドメインIIの水平回転の動きを、ＮＭ
Ｒで核磁気緩和時間を測定し、得られるスペクトル密度
関数によって求められる回転拡散テンソルと、ドメイン
ＩとドメインIIの実効回転相関時間の差異とからＲＲＦ
の分子内ドメイン運動を評価する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】この出願の発明は、ＲＲＦ
（リボソーム再生因子）の分子内ドメイン運動の評価方
法とこれに基づくＲＲＦ阻害剤の設計とスクリーニング
方法に関するものである。
（リボソーム再生因子）の分子内ドメイン運動の評価方
法とこれに基づくＲＲＦ阻害剤の設計とスクリーニング
方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術と発明の課題】リボソーム再生因子（ＲＲ
Ｆ）は伸長因子Ｇ（ＥＦ−Ｇ）とともにリボソーム再生
過程において中心的な役割を果たす分子量２１ｋＤaの
タンパク質であり、タンパク質の生合成装置であるリボ
ソームに作用して、使用済みリボソームを分解・再生す
る役割を果たしていることが知られている。タンパク質
生合成の終結反応後には、７０Ｓリボソーム、脱アシル
化ＲＮＡ、およびｍＲＮＡからなるポストターミネーシ
ョンコンプレックスが残っている。ＲＲＦは次のタンパ
ク質生合成サイクルにむけてそれを解離・再生するため
に必須である。
Ｆ）は伸長因子Ｇ（ＥＦ−Ｇ）とともにリボソーム再生
過程において中心的な役割を果たす分子量２１ｋＤaの
タンパク質であり、タンパク質の生合成装置であるリボ
ソームに作用して、使用済みリボソームを分解・再生す
る役割を果たしていることが知られている。タンパク質
生合成の終結反応後には、７０Ｓリボソーム、脱アシル
化ＲＮＡ、およびｍＲＮＡからなるポストターミネーシ
ョンコンプレックスが残っている。ＲＲＦは次のタンパ
ク質生合成サイクルにむけてそれを解離・再生するため
に必須である。
【０００３】そして、このＲＲＦは古細菌を除く全ての
生物に存在するが、バクテリアの生存には必須である。
このことから、ＲＲＦの作用を阻害する薬剤は新しい抗
菌剤、抗生物質になる可能性がある。特に、ＲＲＦにつ
いては、ヒトなどの真核生物に副作用を及ぼさず、バク
テリア（原核細菌）にのみ自殺的に働く薬剤を設計し、
スクリーニングするための標的分子になることが注目さ
れている。
生物に存在するが、バクテリアの生存には必須である。
このことから、ＲＲＦの作用を阻害する薬剤は新しい抗
菌剤、抗生物質になる可能性がある。特に、ＲＲＦにつ
いては、ヒトなどの真核生物に副作用を及ぼさず、バク
テリア（原核細菌）にのみ自殺的に働く薬剤を設計し、
スクリーニングするための標的分子になることが注目さ
れている。
【０００４】以上のようなＲＲＦについては、その構造
の解明が大きな課題であったが、最近、Thermotoga mar
itima （高度好熱菌）、Escherichia coli（大腸菌）、
Thermus thermophilus（好熱菌）、およびAquifex aeol
icus（高度好熱菌）由来ＲＲＦの立体構造がＸ線結晶構
造解析法およびＮＭＲ法によって決定された。その結果
ＲＲＦはαヘリックスバンドルからなるドメインＩと、
β／α／βサンドイッチのβシート構造からなるドメイ
ンIIからなっていることが判明した。また、大腸菌ＲＦ
Ｆを除き、ドメインの配置はＬ字型であった。大腸菌Ｒ
ＲＦの結晶構造ではドメイン間の角度が広がっていた(o
pen L-shape)が、これはおそらく結晶化の際に界面活性
剤がドメインを接続している領域に結合してしまってい
るためである。特徴的なＬ字型によってＲＲＦはｔＲＮ
Ａとその形状およびサイズが非常に似たものとなってい
る。このことはＲＲＦがｔＲＮＡのミミックとしてリボ
ソームのＡ部位に結合することを示唆している。そし
て、ＥＦ−ＧはＧＴＰ依存的にＲＲＦをＡ部位からＰ部
位に動かして脱アシル化ｔＲＮＡを脱離させるものと考
えられている。このような機構については、ＲＲＦのド
メインＩとドメインIIをつなぐヒンジ領域の役割が注目
されている。たとえば梶らはT. maritima ＲＲＦが大腸
菌ＲＲＦを阻害することを報告した。彼らはＲＲＦの働
きにドメインの配置が変化することが必須であると仮定
し、T. maritima ＲＲＦの阻害活性の原因として、その
ヒンジ領域は常温で十分な可動性を持たないことを示唆
している。また中村らは大腸菌の系で活性を持たないT.
thermophilus ＲＲＦのヒンジ領域に変異を導入する実
験をおこなったところ、ヒンジ領域の可動性を変化させ
るような変異によってT. thermophilus ＲＲＦが活性を
獲得することを示している。
の解明が大きな課題であったが、最近、Thermotoga mar
itima （高度好熱菌）、Escherichia coli（大腸菌）、
Thermus thermophilus（好熱菌）、およびAquifex aeol
icus（高度好熱菌）由来ＲＲＦの立体構造がＸ線結晶構
造解析法およびＮＭＲ法によって決定された。その結果
ＲＲＦはαヘリックスバンドルからなるドメインＩと、
β／α／βサンドイッチのβシート構造からなるドメイ
ンIIからなっていることが判明した。また、大腸菌ＲＦ
Ｆを除き、ドメインの配置はＬ字型であった。大腸菌Ｒ
ＲＦの結晶構造ではドメイン間の角度が広がっていた(o
pen L-shape)が、これはおそらく結晶化の際に界面活性
剤がドメインを接続している領域に結合してしまってい
るためである。特徴的なＬ字型によってＲＲＦはｔＲＮ
Ａとその形状およびサイズが非常に似たものとなってい
る。このことはＲＲＦがｔＲＮＡのミミックとしてリボ
ソームのＡ部位に結合することを示唆している。そし
て、ＥＦ−ＧはＧＴＰ依存的にＲＲＦをＡ部位からＰ部
位に動かして脱アシル化ｔＲＮＡを脱離させるものと考
えられている。このような機構については、ＲＲＦのド
メインＩとドメインIIをつなぐヒンジ領域の役割が注目
されている。たとえば梶らはT. maritima ＲＲＦが大腸
菌ＲＲＦを阻害することを報告した。彼らはＲＲＦの働
きにドメインの配置が変化することが必須であると仮定
し、T. maritima ＲＲＦの阻害活性の原因として、その
ヒンジ領域は常温で十分な可動性を持たないことを示唆
している。また中村らは大腸菌の系で活性を持たないT.
thermophilus ＲＲＦのヒンジ領域に変異を導入する実
験をおこなったところ、ヒンジ領域の可動性を変化させ
るような変異によってT. thermophilus ＲＲＦが活性を
獲得することを示している。
【０００５】このような状況において、この出願の発明
者らは、先にA. aeolicus ＲＲＦの立体構造をＮＭＲに
よって決定した。そこで得られた立体構造の集団は全て
特徴的なＬ字型構造をとっていたが、一方でドメイン間
の角度とのゆらぎには分布があることが見出されてい
る。このような角度のゆらぎは結晶構造間においてもみ
られている。しかし、これまでのところ実際にドメイン
の配置が揺らいでいるという直接の証拠は報告されてい
ない。
者らは、先にA. aeolicus ＲＲＦの立体構造をＮＭＲに
よって決定した。そこで得られた立体構造の集団は全て
特徴的なＬ字型構造をとっていたが、一方でドメイン間
の角度とのゆらぎには分布があることが見出されてい
る。このような角度のゆらぎは結晶構造間においてもみ
られている。しかし、これまでのところ実際にドメイン
の配置が揺らいでいるという直接の証拠は報告されてい
ない。
【０００６】また、ドメインの配置についての評価方法
も確立されていないし、この配置のゆらぎについての有
意性が判断されていないのが実情である。さらには、Ｒ
ＲＦの作用を阻害する薬剤の開発と、この構造のゆらぎ
についての関連も提示されていない。
も確立されていないし、この配置のゆらぎについての有
意性が判断されていないのが実情である。さらには、Ｒ
ＲＦの作用を阻害する薬剤の開発と、この構造のゆらぎ
についての関連も提示されていない。
【０００７】そこで、この出願の発明は、以上のとおり
の事情に鑑みてなされたものであって、二つのドメイン
間の配置とそのゆらぎについての評価方法と、この評価
の有意性の観点からのＲＲＦ阻害剤の設計とスクリーニ
ングのための方法を提供することを課題としている。
の事情に鑑みてなされたものであって、二つのドメイン
間の配置とそのゆらぎについての評価方法と、この評価
の有意性の観点からのＲＲＦ阻害剤の設計とスクリーニ
ングのための方法を提供することを課題としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】この出願の発明は、上記
の課題を解決するものとして、第１には、ＲＲＦのαヘ
リックス構造のドメインＩを回転軸として、これに連結
するβシート構造のドメインIIの水平回転の動きを、Ｎ
ＭＲによる核磁気緩和時間を測定し、スペクトル密度関
数により求められる回転拡散テンソルと、ドメインＩと
ドメインIIの実効回転相関時間の差異とから評価するこ
とを特徴とするＲＲＦの分子内ドメイン運動の評価方法
を提供する。
の課題を解決するものとして、第１には、ＲＲＦのαヘ
リックス構造のドメインＩを回転軸として、これに連結
するβシート構造のドメインIIの水平回転の動きを、Ｎ
ＭＲによる核磁気緩和時間を測定し、スペクトル密度関
数により求められる回転拡散テンソルと、ドメインＩと
ドメインIIの実効回転相関時間の差異とから評価するこ
とを特徴とするＲＲＦの分子内ドメイン運動の評価方法
を提供する。
【０００９】また、この出願の発明は、第２には、ＲＲ
Ｆ（リボソーム再生因子）のαヘリックス構造のドメイ
ンＩを回転軸として、これに連結するβシート構造のド
メインIIの水平回転の動きを、ＮＭＲによる核磁気緩和
時間を測定し、Ｊ（ωN）／Ｊ（0）（ここで、Ｊ
（ωN）はスペクトル密度関数であり、
Ｆ（リボソーム再生因子）のαヘリックス構造のドメイ
ンＩを回転軸として、これに連結するβシート構造のド
メインIIの水平回転の動きを、ＮＭＲによる核磁気緩和
時間を測定し、Ｊ（ωN）／Ｊ（0）（ここで、Ｊ
（ωN）はスペクトル密度関数であり、
【００１０】
【数３】
【００１１】と定義される。相関時間τjは回転拡散テ
ンソルの主値に依存し、係数Ａjは回転拡散テンソルの
主軸系に対する15Ｎ−1Ｈベクトルの向きに依存す
る。）を観測値とフィットすることでＲＲＦ分子の各ド
メインについて回転拡散テンソルを算出し、ＲＲＦの立
体構造データを用いてドメインの相対配置をドメインご
とに算出された回転拡散テンソルの主軸系に座標変換す
ることでドメインIおよびドメインIIの配置を求め、ス
ペクトル密度関数を次式
ンソルの主値に依存し、係数Ａjは回転拡散テンソルの
主軸系に対する15Ｎ−1Ｈベクトルの向きに依存す
る。）を観測値とフィットすることでＲＲＦ分子の各ド
メインについて回転拡散テンソルを算出し、ＲＲＦの立
体構造データを用いてドメインの相対配置をドメインご
とに算出された回転拡散テンソルの主軸系に座標変換す
ることでドメインIおよびドメインIIの配置を求め、ス
ペクトル密度関数を次式
【００１２】
【数４】
【００１３】で表される拡張モデルフリー関数に当ては
め局所的な速い運動に関するオーダーパラメータＳ2 fの
値を一般的に２次構造領域で観測される値に固定しドメ
イン運動に関するオーダーパラメータＳ2 Sの値は残基ご
とに求め、求められたＳ2 Sの大きさから各ドメインの運
動を評価することを特徴とするＲＲＦの分子内ドメイン
運動の評価方法を提供する。
め局所的な速い運動に関するオーダーパラメータＳ2 fの
値を一般的に２次構造領域で観測される値に固定しドメ
イン運動に関するオーダーパラメータＳ2 Sの値は残基ご
とに求め、求められたＳ2 Sの大きさから各ドメインの運
動を評価することを特徴とするＲＲＦの分子内ドメイン
運動の評価方法を提供する。
【００１４】さらに、この出願の発明は、第３には、Ｒ
ＲＦのαヘリックス構造のドメインＩを回転軸として、
これに連結するβシート構造のドメインIIの水平回転の
動きの阻害の評価からＲＲＦ阻害剤の分子設計もしくは
スクリーニングを行うことを特徴とするＲＲＦの分子内
ドメイン運動の評価に基づくＲＲＦ阻害剤の設計とスク
リーニング方法をも提供する。
ＲＦのαヘリックス構造のドメインＩを回転軸として、
これに連結するβシート構造のドメインIIの水平回転の
動きの阻害の評価からＲＲＦ阻害剤の分子設計もしくは
スクリーニングを行うことを特徴とするＲＲＦの分子内
ドメイン運動の評価に基づくＲＲＦ阻害剤の設計とスク
リーニング方法をも提供する。
【００１５】
【発明の実施の形態】この出願の発明は上記のとおりの
特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態につい
て説明する。
特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態につい
て説明する。
【００１６】この出願の発明の特徴は、発明者によるＮ
ＭＲでの立体構造の解析によりドメインＩとドメインII
の間の角度がはっきりと求められたことと、溶液中のゆ
らぎの解析から、実際にＲＲＦが機能する際には、ドメ
インIIが水平に回転し得ることが明らかにされたことに
基づいている。
ＭＲでの立体構造の解析によりドメインＩとドメインII
の間の角度がはっきりと求められたことと、溶液中のゆ
らぎの解析から、実際にＲＲＦが機能する際には、ドメ
インIIが水平に回転し得ることが明らかにされたことに
基づいている。
【００１７】ＲＲＦには、リボソームでｍＲＮＡの塩基
配列情報を基にタンパク質の翻訳が完了した後に、リボ
ソームをｍＲＮＡから外して次の翻訳に使えるようにす
る働きがあるが、この作用において、ドメインＩを回転
軸としてドメインIIが水平に回転し、リボソームをｍＲ
ＮＡから外すことが判明したのである。このことから、
ＲＲＦ阻害剤を、ドメインIIの水平回転の評価を踏まえ
て開発することが可能になったのである。
配列情報を基にタンパク質の翻訳が完了した後に、リボ
ソームをｍＲＮＡから外して次の翻訳に使えるようにす
る働きがあるが、この作用において、ドメインＩを回転
軸としてドメインIIが水平に回転し、リボソームをｍＲ
ＮＡから外すことが判明したのである。このことから、
ＲＲＦ阻害剤を、ドメインIIの水平回転の評価を踏まえ
て開発することが可能になったのである。
【００１８】たとえば、発明者は、好熱細菌Aquifex ae
olicusのＲＲＦについてＮＭＲによる溶液中の立体構造
を解明し、これを報告している（Biochemistry vol.40,
No.8, pp2387-2396）が、この報告において示されてい
る構造は、たとえば図１にも他の細菌との比較として例
示したように、αヘリックス構造のドメインＩとβシー
ト構造のドメインIIとの間の垂直方向の角度（θ）と、
ドメインIIの水平方向の回転角度（φ）との関係を有し
ている。この図１より、好熱細菌においては、垂直方向
の角度（θ）はほぼ一定であっても、水平回転角度
（φ）には変化（差異）があり、ゆらぎがあることがわ
かる。
olicusのＲＲＦについてＮＭＲによる溶液中の立体構造
を解明し、これを報告している（Biochemistry vol.40,
No.8, pp2387-2396）が、この報告において示されてい
る構造は、たとえば図１にも他の細菌との比較として例
示したように、αヘリックス構造のドメインＩとβシー
ト構造のドメインIIとの間の垂直方向の角度（θ）と、
ドメインIIの水平方向の回転角度（φ）との関係を有し
ている。この図１より、好熱細菌においては、垂直方向
の角度（θ）はほぼ一定であっても、水平回転角度
（φ）には変化（差異）があり、ゆらぎがあることがわ
かる。
【００１９】このようなゆらぎについては、この出願の
発明によって、ＮＭＲの測定から導いて評価することが
可能となる。ＮＭＲ測定では、1Ｈ−15Ｎ−ＨＳＱＣス
ペクトルが観察されることになる。ＨＳＱＣは、タンパ
ク質を構成するアミノ酸一つについて一個のシグナルを
与え、シグナルの位置は対応するタンパク質の各部分の
構造や環境を反映している。
発明によって、ＮＭＲの測定から導いて評価することが
可能となる。ＮＭＲ測定では、1Ｈ−15Ｎ−ＨＳＱＣス
ペクトルが観察されることになる。ＨＳＱＣは、タンパ
ク質を構成するアミノ酸一つについて一個のシグナルを
与え、シグナルの位置は対応するタンパク質の各部分の
構造や環境を反映している。
【００２０】そこで、16Ｎの緩和時間の具体的な算出方
法について例示説明すると、緩和時間は1Ｈ−15Ｎ Ｈ
ＳＱＣ法を応用した２Ｄ−ＮＭＲ法を用いて測定するこ
とができる。後述のＴ1およびＴ2測定に用いられるパル
ス系列中にはパラメータとして待ち時間Ｔがある。つま
りＴ時間分だけ縦（Ｔ1）あるいは横（Ｔ2）緩和した磁
化を測定することができる。従って観測された２Ｄスペ
クトル上でのピーク強度のＴに対する変化が、15Ｎの緩
和の様子を示すことになる。ピーク強度Ｉは、exp（-Ｔ
／Ｔ1）あるいは exp（-Ｔ／Ｔ2）に比例するので、数
点の異なるＴについてＩを測定し、非線型最小自乗法に
よってＴ1あるいはＴ2を求めることができる。
法について例示説明すると、緩和時間は1Ｈ−15Ｎ Ｈ
ＳＱＣ法を応用した２Ｄ−ＮＭＲ法を用いて測定するこ
とができる。後述のＴ1およびＴ2測定に用いられるパル
ス系列中にはパラメータとして待ち時間Ｔがある。つま
りＴ時間分だけ縦（Ｔ1）あるいは横（Ｔ2）緩和した磁
化を測定することができる。従って観測された２Ｄスペ
クトル上でのピーク強度のＴに対する変化が、15Ｎの緩
和の様子を示すことになる。ピーク強度Ｉは、exp（-Ｔ
／Ｔ1）あるいは exp（-Ｔ／Ｔ2）に比例するので、数
点の異なるＴについてＩを測定し、非線型最小自乗法に
よってＴ1あるいはＴ2を求めることができる。
【００２１】そして、このＨＳＱＣのスペクトルからの
スペクトル密度関数により求められる回転拡散テンソル
と、ドメインＩおよびドメインIIの実効回転相関時間の
差異とから、ドメインIIの回転運動やその大きさが評価
されることになる。
スペクトル密度関数により求められる回転拡散テンソル
と、ドメインＩおよびドメインIIの実効回転相関時間の
差異とから、ドメインIIの回転運動やその大きさが評価
されることになる。
【００２２】ここで回転拡散テンソルについて説明する
と以下のとおりである。すなわちまず、球状物体の回転
拡散は等方的でありその大きさを一つの回転拡散係数で
表すことができる。しかし一般的には回転が３次元的な
現象であり角速度がベクトル量になることに対応して、
回転拡散の大きさを記述するためには２階のテンソル量
Ｄが必要となる。これを回転拡散テンソルという。回転
拡散テンソルは対称テンソルなので、適当な座標系で対
角化できる。そのような座標系のｘ，ｙ，ｚ軸を主軸と
呼び、残った３つの対角成分（Ｄｘｘ，Ｄｙｙ，Ｄｚ
ｚ）を主値という。後述の表１のτｃ，ｅｆｆは実効回
転相関時間であり、０．５／（Ｄｘｘ＋Ｄｙｙ＋Ｄｚ
ｚ）に等しい。Ｎは独立な観測値の数である。またＥは
フィッティングの平均残差である。Ｆはフィッティング
の有意さを検定するＦ検定でもちいられる統計量であ
り、Ｎ，Ｅから計算される。パラメータ数を増やしたこ
とによる残差の減少が偶然起こる確立ｐをＦ値から計算
することができる。
と以下のとおりである。すなわちまず、球状物体の回転
拡散は等方的でありその大きさを一つの回転拡散係数で
表すことができる。しかし一般的には回転が３次元的な
現象であり角速度がベクトル量になることに対応して、
回転拡散の大きさを記述するためには２階のテンソル量
Ｄが必要となる。これを回転拡散テンソルという。回転
拡散テンソルは対称テンソルなので、適当な座標系で対
角化できる。そのような座標系のｘ，ｙ，ｚ軸を主軸と
呼び、残った３つの対角成分（Ｄｘｘ，Ｄｙｙ，Ｄｚ
ｚ）を主値という。後述の表１のτｃ，ｅｆｆは実効回
転相関時間であり、０．５／（Ｄｘｘ＋Ｄｙｙ＋Ｄｚ
ｚ）に等しい。Ｎは独立な観測値の数である。またＥは
フィッティングの平均残差である。Ｆはフィッティング
の有意さを検定するＦ検定でもちいられる統計量であ
り、Ｎ，Ｅから計算される。パラメータ数を増やしたこ
とによる残差の減少が偶然起こる確立ｐをＦ値から計算
することができる。
【００２３】回転拡散テンソルの求め方としては、前記
の数式などに登場するＡｊは、回転拡散テンソルの主軸
系におけるＮ−Ｈベクトルの向きに依存している。また
τｊは回転拡散テンソルの主値に依存する。つまり、理
論的には回転拡散テンソルをパラメータとして計算する
ことによって、観測データを再現することができる。従
って、Simplex 法やPowell法などの最適化アルゴリズム
を使用して、回転拡散テンソルの主軸および主値を変化
させ、観測データともっとも適合する値を求めることが
できる。
の数式などに登場するＡｊは、回転拡散テンソルの主軸
系におけるＮ−Ｈベクトルの向きに依存している。また
τｊは回転拡散テンソルの主値に依存する。つまり、理
論的には回転拡散テンソルをパラメータとして計算する
ことによって、観測データを再現することができる。従
って、Simplex 法やPowell法などの最適化アルゴリズム
を使用して、回転拡散テンソルの主軸および主値を変化
させ、観測データともっとも適合する値を求めることが
できる。
【００２４】また、ドメインの配置の決定方法に関連し
て、回転拡散テンソルをそれぞれのドメインに属するデ
ータのみを使って求めることができる。回転拡散テンソ
ルは本来分子全体について一つだけ定義されているもの
であるから、使用した座標データが正しければ、どちら
のドメインのデータを用いても同じ主軸を与えるはずで
ある。もし使用したドメインによって得られた主軸の向
きが異なっていれば、それは使用した座標データにおい
て、ドメインの配置が実際と異なっていることを示して
いる。その場合、得られた主軸の向きを一致させるよう
にドメインの配置を決定することができる。
て、回転拡散テンソルをそれぞれのドメインに属するデ
ータのみを使って求めることができる。回転拡散テンソ
ルは本来分子全体について一つだけ定義されているもの
であるから、使用した座標データが正しければ、どちら
のドメインのデータを用いても同じ主軸を与えるはずで
ある。もし使用したドメインによって得られた主軸の向
きが異なっていれば、それは使用した座標データにおい
て、ドメインの配置が実際と異なっていることを示して
いる。その場合、得られた主軸の向きを一致させるよう
にドメインの配置を決定することができる。
【００２５】そして、ドメインIIの運動の範囲について
は、ドメイン運動を、制限された円錐内での自由拡散(d
iffusion in cone)とみなすと、前記数式におけるオー
ダーパラメータＳS 2は円錐の頂角の1/2であるcone semi
-angle θによってＳ3 2＝｛(0.5cos θ（１＋cos θ）)
と表せる。この式に従い、ＳS 2からθを求めることがで
きる。
は、ドメイン運動を、制限された円錐内での自由拡散(d
iffusion in cone)とみなすと、前記数式におけるオー
ダーパラメータＳS 2は円錐の頂角の1/2であるcone semi
-angle θによってＳ3 2＝｛(0.5cos θ（１＋cos θ）)
と表せる。この式に従い、ＳS 2からθを求めることがで
きる。
【００２６】ＲＲＦ阻害剤は、本来的なＲＲＦの回転運
動を阻害、たとえば停止、縮小等の働きの有無により、
実際に阻害効果を有するかどうかが評価されることにな
る。このことにより、ＨＳＱＣスペクトルによる構造解
析の結果との対応から、ＲＲＦ阻害剤の分子設計が可能
となり、またＲＲＦ阻害剤のスクリーニングが可能とな
る。
動を阻害、たとえば停止、縮小等の働きの有無により、
実際に阻害効果を有するかどうかが評価されることにな
る。このことにより、ＨＳＱＣスペクトルによる構造解
析の結果との対応から、ＲＲＦ阻害剤の分子設計が可能
となり、またＲＲＦ阻害剤のスクリーニングが可能とな
る。
【００２７】そこで以下に実施例を示し、さらに詳しく
この出願の発明について説明する。もちろん、以下の例
によって発明が限定されることはない。
この出願の発明について説明する。もちろん、以下の例
によって発明が限定されることはない。
【００２８】
【実施例】この出願の発明の実施例として、ドメインII
の運動の評価方法の手順の流れ図について図２に示す。 （試料調製）大腸菌ＲＲＦおよびT. maritima ＲＲＦ
を、ｐＥＴベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）
株内で発現させた。15Ｎ標識のために15Ｎ塩化アンモニ
ウムのみを窒素源とするＭ９最小培地で大腸菌を培養し
た。大腸菌ＲＲＦの精製は公知の方法に従った。また、
T. maritima ＲＲＦの精製は次のようにおこなった。回
収した菌体をバッファーＡ（２０ｍＭトリス−塩酸，ｐ
Ｈ８．０，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，２ｍＭ ２−merca
ptoethanol ，１ｍＭ ＰＭＳＦ）に懸濁し、超音波破
砕した。それを８０℃で１５分処理した後遠心した。上
澄をバッファーＡで平衡化したＨｉＴｒａｐＯカラムに
流し、T. maritima ＲＲＦを含む通りぬけ画分を集めて
セントリプラスを用いて濃縮した。その後Superdex７５
ｐｇカラムによるゲルろ過をおこない精製ＲＲＦを得
た。ＮＭＲ測定用試料は１０％重水を含む１０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４，５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ）に溶解し、タンパク質濃度は０．５ｍＭとした。 （ＮＭＲ測定）ＮＭＲ実権にはバリアン社製ＩＮＯＶＡ
６００を用いた。測定温度は３０℃とし、標準メタノー
ル及びグリコールで校正した。1Ｈおよび15Ｎの観測中
心は４．７６および１１９．０ｐｐｍとした。１Ｈの化
学シフトはＤＳＳによって校正した。15Ｎの化学シフト
は磁気回転比に従って間接的に校正した。
の運動の評価方法の手順の流れ図について図２に示す。 （試料調製）大腸菌ＲＲＦおよびT. maritima ＲＲＦ
を、ｐＥＴベクターを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）
株内で発現させた。15Ｎ標識のために15Ｎ塩化アンモニ
ウムのみを窒素源とするＭ９最小培地で大腸菌を培養し
た。大腸菌ＲＲＦの精製は公知の方法に従った。また、
T. maritima ＲＲＦの精製は次のようにおこなった。回
収した菌体をバッファーＡ（２０ｍＭトリス−塩酸，ｐ
Ｈ８．０，１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ，２ｍＭ ２−merca
ptoethanol ，１ｍＭ ＰＭＳＦ）に懸濁し、超音波破
砕した。それを８０℃で１５分処理した後遠心した。上
澄をバッファーＡで平衡化したＨｉＴｒａｐＯカラムに
流し、T. maritima ＲＲＦを含む通りぬけ画分を集めて
セントリプラスを用いて濃縮した。その後Superdex７５
ｐｇカラムによるゲルろ過をおこない精製ＲＲＦを得
た。ＮＭＲ測定用試料は１０％重水を含む１０ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４，５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ）に溶解し、タンパク質濃度は０．５ｍＭとした。 （ＮＭＲ測定）ＮＭＲ実権にはバリアン社製ＩＮＯＶＡ
６００を用いた。測定温度は３０℃とし、標準メタノー
ル及びグリコールで校正した。1Ｈおよび15Ｎの観測中
心は４．７６および１１９．０ｐｐｍとした。１Ｈの化
学シフトはＤＳＳによって校正した。15Ｎの化学シフト
は磁気回転比に従って間接的に校正した。
【００２９】主鎖15Ｎの緩和データはＨＳＱＣタイプの
パルス系列を用いて測定した。緩和時間Ｔ1 は（３
０，１０８，２０４，４２０，７２０，１０５０ｍｓ）
の６点をサンプルした。Ｔ1 ρはスピンロック磁場強
度を２．４ｋＨｚとし、（１２，２４，３６，４８，６
０，７２ｍｓ）の６点をサンプルした。15Ｎ−（1Ｈ）
ＮＯＥは３．５秒間アミド 1Ｈを飽和した場合として
いない場合について測定した２スペクトルから求めた。
NOE (Nuclear Overhauser Effect)とは、磁気的な相互
作用がある２つの核スピンのうち、片方の核スピンの遷
移を飽和させると、もう片方の核スピン由来のNMRシグ
ナルの強度が変化する現象であり、核間ベクトルの距
離、およびその方向揺らぎを表すスペクトル密度関数に
依存する。ここでは、その距離が固定されている1H-15N
についてNOEを測定し、その方向揺らぎに関する情報を
得ている。装置のドリフトの影響を抑えるため、データ
はインターリーブモードで測定した。全ての実権は再現
性を確認するため２回おこなった。データはNmrPipe を
用いて処理し、ＰＩＰＰ及び自作プログラムを用いて解
析した。Ｔ1およびＴ1ρの値はピーク強度を指数関数に
非線型最小自乗法でフィットすることによって求めた。
誤差はモンテカルロ法によって算出した。緩和時間Ｔ2
の値はＴ1 、Ｔ1ρ、化学シフト及びスピンロック磁
場強度から計算した。ピークの帰属は文献に従った。 （緩和時間の解析）スペクトル密度関数をＴ1，Ｔ2，Ｎ
ＯＥ値から求めた。15ＮのＣＳＡ値としては１７０ｐｐ
ｍを用いた。ＲＲＦ分子は非等方的な形状をしているた
め、スペクトル密度関数の値は回転拡散テンソルの主軸
系に対する15Ｎ−1Ｈスペクトルの向きとその揺らぎに
依存する。分子内運動が無い非対称的な分子の場合スペ
クトル密度関数は次のようになる。
パルス系列を用いて測定した。緩和時間Ｔ1 は（３
０，１０８，２０４，４２０，７２０，１０５０ｍｓ）
の６点をサンプルした。Ｔ1 ρはスピンロック磁場強
度を２．４ｋＨｚとし、（１２，２４，３６，４８，６
０，７２ｍｓ）の６点をサンプルした。15Ｎ−（1Ｈ）
ＮＯＥは３．５秒間アミド 1Ｈを飽和した場合として
いない場合について測定した２スペクトルから求めた。
NOE (Nuclear Overhauser Effect)とは、磁気的な相互
作用がある２つの核スピンのうち、片方の核スピンの遷
移を飽和させると、もう片方の核スピン由来のNMRシグ
ナルの強度が変化する現象であり、核間ベクトルの距
離、およびその方向揺らぎを表すスペクトル密度関数に
依存する。ここでは、その距離が固定されている1H-15N
についてNOEを測定し、その方向揺らぎに関する情報を
得ている。装置のドリフトの影響を抑えるため、データ
はインターリーブモードで測定した。全ての実権は再現
性を確認するため２回おこなった。データはNmrPipe を
用いて処理し、ＰＩＰＰ及び自作プログラムを用いて解
析した。Ｔ1およびＴ1ρの値はピーク強度を指数関数に
非線型最小自乗法でフィットすることによって求めた。
誤差はモンテカルロ法によって算出した。緩和時間Ｔ2
の値はＴ1 、Ｔ1ρ、化学シフト及びスピンロック磁
場強度から計算した。ピークの帰属は文献に従った。 （緩和時間の解析）スペクトル密度関数をＴ1，Ｔ2，Ｎ
ＯＥ値から求めた。15ＮのＣＳＡ値としては１７０ｐｐ
ｍを用いた。ＲＲＦ分子は非等方的な形状をしているた
め、スペクトル密度関数の値は回転拡散テンソルの主軸
系に対する15Ｎ−1Ｈスペクトルの向きとその揺らぎに
依存する。分子内運動が無い非対称的な分子の場合スペ
クトル密度関数は次のようになる。
【００３０】
【数５】
【００３１】ここで相関時間τjは回転拡散テンソルの
主値に依存し、係数Ａjは回転拡散テンソルの主軸系に
対する15Ｎ−1Ｈベクトルの向きに依存する。Ｊ（ωN）
／Ｊ（0）は良い近似で分子内運動に依存しない。結晶
構造から計算されるＪ（ωN）／Ｊ（0）を観測値とフィ
ットすることによって、ＲＲＦ分子の各ドメインについ
て回転拡散テンソルを求めた。構造の座標としてT. mar
itima ＲＲＦについてはＰＤＢ中の１ＤＤ5を用いた。
報告されている大腸菌ＲＲＦの結晶構造である１ＥＫ８
は界面活性剤との複合体構造であり、ドメインIIの構造
が変化している可能性があるため、代わりに大腸菌ＲＲ
ＦのＲ１３２Ｇ変異体の結晶構造を用いた。計算には２
次構造をとっている部位のデータを用いた。ドメインの
相対配置は、各ドメインを算出した回転拡散テンソルの
主軸系に座標変換することによって得た。
主値に依存し、係数Ａjは回転拡散テンソルの主軸系に
対する15Ｎ−1Ｈベクトルの向きに依存する。Ｊ（ωN）
／Ｊ（0）は良い近似で分子内運動に依存しない。結晶
構造から計算されるＪ（ωN）／Ｊ（0）を観測値とフィ
ットすることによって、ＲＲＦ分子の各ドメインについ
て回転拡散テンソルを求めた。構造の座標としてT. mar
itima ＲＲＦについてはＰＤＢ中の１ＤＤ5を用いた。
報告されている大腸菌ＲＲＦの結晶構造である１ＥＫ８
は界面活性剤との複合体構造であり、ドメインIIの構造
が変化している可能性があるため、代わりに大腸菌ＲＲ
ＦのＲ１３２Ｇ変異体の結晶構造を用いた。計算には２
次構造をとっている部位のデータを用いた。ドメインの
相対配置は、各ドメインを算出した回転拡散テンソルの
主軸系に座標変換することによって得た。
【００３２】次に各ドメインの運動を見積もるため、ス
ペクトル密度関数を以下のようなモデルに当てはめた。
ペクトル密度関数を以下のようなモデルに当てはめた。
【００３３】
【数６】
【００３４】この解析においては先に求めたドメインの
相対配置に会わせて変換した座標を用いた。分子全体の
回転拡散に関する相関時間は分子全体で一組のパラメー
タを使用した。それぞれのドメインは全体としてτ5で
表されるタイムスケールで運動していると考えた。局所
的な速い運動に関するオーダーパラメータＳ2 fの値は一
般的に２次構造領域で観測される値である０．８５に固
定した。ドメイン運動に関するオーダーパラメータＳ2 S
の値は残基ごとに求めた。 （結果）1Ｈ−15ＮＨＳＱＣスペクトル上ではほとんど
全てのピークが期待通り観測されていた。大腸菌ＲＲＦ
については９２残基のピークを、またT. maritima ＲＲ
Ｆについては７１残基のピークを解析に用いた。得られ
たスペクトル密度関数のグラフを図３に示す。スペクト
ル密度関数はA. aeolicus ＲＲＦの際に観測されたのと
同様に明確な二峰性の分布を示していた。これは大腸菌
ＲＲＦおよびT. maritima ＲＲＦが溶液中において２ド
メイン構造をとっており、さらに各ドメインが固有の運
動性を持っていることを示している。 （ドメインの配置）表１は求められた回転拡散テンソル
である。
相対配置に会わせて変換した座標を用いた。分子全体の
回転拡散に関する相関時間は分子全体で一組のパラメー
タを使用した。それぞれのドメインは全体としてτ5で
表されるタイムスケールで運動していると考えた。局所
的な速い運動に関するオーダーパラメータＳ2 fの値は一
般的に２次構造領域で観測される値である０．８５に固
定した。ドメイン運動に関するオーダーパラメータＳ2 S
の値は残基ごとに求めた。 （結果）1Ｈ−15ＮＨＳＱＣスペクトル上ではほとんど
全てのピークが期待通り観測されていた。大腸菌ＲＲＦ
については９２残基のピークを、またT. maritima ＲＲ
Ｆについては７１残基のピークを解析に用いた。得られ
たスペクトル密度関数のグラフを図３に示す。スペクト
ル密度関数はA. aeolicus ＲＲＦの際に観測されたのと
同様に明確な二峰性の分布を示していた。これは大腸菌
ＲＲＦおよびT. maritima ＲＲＦが溶液中において２ド
メイン構造をとっており、さらに各ドメインが固有の運
動性を持っていることを示している。 （ドメインの配置）表１は求められた回転拡散テンソル
である。
【００３５】
【表１】
【００３６】大腸菌ＲＲＦの場合完全非対称モデルが軸
対称モデルに対して統計的に有意であることがＦ検定の
結果示された。よってドメインの相対配置を各ドメイン
の主軸を一致させることで求めることができた。数学的
には４通りの解が存在するが、立体的な制限からそのう
ちの１つのみが可能な配置である（図４）。この配置は
大腸菌ＲＲＦのＲ１３２Ｇ変異体の結晶構造に似てお
り、報告されている大腸菌ＲＲＦの結晶構造である１Ｅ
Ｋ８（図５）とは大きく異なっている。つまり大腸菌Ｒ
ＲＦは他のＲＲＦと同様に溶液中ではｔＲＮＡをミミッ
クする特徴的なＬ字型構造をとっている。ドメインＩお
よびドメインIIの実効回転相関時間はそれぞれ１７．７
ｎｓ及び１３．０ｎｓであった。両者の比が１ではない
ということは、溶液中で２つのドメインが一体となって
振舞っているのではなく、ドメインごとにナノ秒オーダ
ーの時間スケールで運動していることを示唆している。
一方T. maritima ＲＲＦの場合、ドメインＩについては
Ｆ検定の結果から完全非対称モデルの有意性を示すこと
ができなかった。従ってドメインの相対配置は１軸につ
いてのみ決定できた。ＲＲＦのドメインＩはヘリックス
バンドルであるため、 15Ｎ−1Ｈベクトルの角度分布が
狭い。よってドメインＩの回転拡散テンソルの非対称性
を決定することが容易ではない。T. maritima ＲＲＦで
は大腸菌ＲＲＦに比べて解析に用いることができたデー
タが少なく、またT. maritima ＲＲＦの結晶構造はその
温度因子が大きいといった困難があったため、ドメイン
Ｉの回転拡散テンソルを完全非対称モデルで決定するこ
とができなかったと考えられる。ドメインＩおよびドメ
インIIの実効回転相関時間の比は１．２６であった。こ
の値は大腸菌ＲＲＦのそれに比べて小さく、このことは
大腸菌ＲＲＦと比べてT. maritima ＲＲＦのほうがドメ
インどうしの束縛が大きいことを示唆している。 （ドメインの運動）各ドメインでの実効回転相関時間の
違いは、それぞれのドメインが運動していると仮定すれ
ば説明できる。Clore らによって導入された拡張スペク
トル密度関数に分子の非等方性による補正を加えたもの
でドメイン運動を解釈することを試みた。その結果は図
６に示している。このモデルでは分子全体の実効回転相
関時間として２０ｎｓ程度の値が、またドメイン運動の
相関時間として２ｎｓ程度の値が得られた。ドメイン運
動に関するオーダーパラメータＳ2 5の平均値はドメイン
Ｉについては大腸菌ＲＲＦ、T. maritima ＲＲＦともに
０．９であった。これはドメインＩが分子全体に対して
ほとんど固定されていることを示している。ドメインII
のＳ2 5の平均値はドメインＩより小さかった。これはド
メインIIがドメインＩよりフレキシブルであることを示
している。またドメインＩの場合と異なり、ドメインII
では大腸菌ＲＲＦのＳ2 5はT. maritima ＲＲＦのＳ2 5よ
り０．１小さい値を示した。つまり大腸菌ＲＲＦのドメ
インIIはT. maritima ＲＲＦのドメインIIに比べて動き
やすいということを示している。
対称モデルに対して統計的に有意であることがＦ検定の
結果示された。よってドメインの相対配置を各ドメイン
の主軸を一致させることで求めることができた。数学的
には４通りの解が存在するが、立体的な制限からそのう
ちの１つのみが可能な配置である（図４）。この配置は
大腸菌ＲＲＦのＲ１３２Ｇ変異体の結晶構造に似てお
り、報告されている大腸菌ＲＲＦの結晶構造である１Ｅ
Ｋ８（図５）とは大きく異なっている。つまり大腸菌Ｒ
ＲＦは他のＲＲＦと同様に溶液中ではｔＲＮＡをミミッ
クする特徴的なＬ字型構造をとっている。ドメインＩお
よびドメインIIの実効回転相関時間はそれぞれ１７．７
ｎｓ及び１３．０ｎｓであった。両者の比が１ではない
ということは、溶液中で２つのドメインが一体となって
振舞っているのではなく、ドメインごとにナノ秒オーダ
ーの時間スケールで運動していることを示唆している。
一方T. maritima ＲＲＦの場合、ドメインＩについては
Ｆ検定の結果から完全非対称モデルの有意性を示すこと
ができなかった。従ってドメインの相対配置は１軸につ
いてのみ決定できた。ＲＲＦのドメインＩはヘリックス
バンドルであるため、 15Ｎ−1Ｈベクトルの角度分布が
狭い。よってドメインＩの回転拡散テンソルの非対称性
を決定することが容易ではない。T. maritima ＲＲＦで
は大腸菌ＲＲＦに比べて解析に用いることができたデー
タが少なく、またT. maritima ＲＲＦの結晶構造はその
温度因子が大きいといった困難があったため、ドメイン
Ｉの回転拡散テンソルを完全非対称モデルで決定するこ
とができなかったと考えられる。ドメインＩおよびドメ
インIIの実効回転相関時間の比は１．２６であった。こ
の値は大腸菌ＲＲＦのそれに比べて小さく、このことは
大腸菌ＲＲＦと比べてT. maritima ＲＲＦのほうがドメ
インどうしの束縛が大きいことを示唆している。 （ドメインの運動）各ドメインでの実効回転相関時間の
違いは、それぞれのドメインが運動していると仮定すれ
ば説明できる。Clore らによって導入された拡張スペク
トル密度関数に分子の非等方性による補正を加えたもの
でドメイン運動を解釈することを試みた。その結果は図
６に示している。このモデルでは分子全体の実効回転相
関時間として２０ｎｓ程度の値が、またドメイン運動の
相関時間として２ｎｓ程度の値が得られた。ドメイン運
動に関するオーダーパラメータＳ2 5の平均値はドメイン
Ｉについては大腸菌ＲＲＦ、T. maritima ＲＲＦともに
０．９であった。これはドメインＩが分子全体に対して
ほとんど固定されていることを示している。ドメインII
のＳ2 5の平均値はドメインＩより小さかった。これはド
メインIIがドメインＩよりフレキシブルであることを示
している。またドメインＩの場合と異なり、ドメインII
では大腸菌ＲＲＦのＳ2 5はT. maritima ＲＲＦのＳ2 5よ
り０．１小さい値を示した。つまり大腸菌ＲＲＦのドメ
インIIはT. maritima ＲＲＦのドメインIIに比べて動き
やすいということを示している。
【００３７】ドメインIIが円錐状の領域を拡散運動して
いるとすると、その範囲は大腸菌ＲＲＦで２８度、T. m
aritima ＲＲＦで２２度となる。前記の式（２）のスペ
クトル密度関数は度運動の異方性を考慮していないの
で、運動の向きについての情報を得ることは困難であ
る。さらに、式（２）では分子全体の回転拡散とドメイ
ン運動が独立と仮定しているが、両者のタイムスケール
はそれほど大きく異なっていないので、この仮定は厳密
ではない部分もある。しかしながら、見積もられたドメ
イン運動の範囲は、A. aeolicus ＲＲＦの溶液構造や結
晶構造間においてもみられているドメイン配置の揺らぎ
とよく一致している。
いるとすると、その範囲は大腸菌ＲＲＦで２８度、T. m
aritima ＲＲＦで２２度となる。前記の式（２）のスペ
クトル密度関数は度運動の異方性を考慮していないの
で、運動の向きについての情報を得ることは困難であ
る。さらに、式（２）では分子全体の回転拡散とドメイ
ン運動が独立と仮定しているが、両者のタイムスケール
はそれほど大きく異なっていないので、この仮定は厳密
ではない部分もある。しかしながら、見積もられたドメ
イン運動の範囲は、A. aeolicus ＲＲＦの溶液構造や結
晶構造間においてもみられているドメイン配置の揺らぎ
とよく一致している。
【００３８】ＲＲＦのドメイン運動は生物学的に重要な
意味を持つものである。興味深いことにT. maritima Ｒ
ＲＦは大腸菌のリボソームに結合することができるが、
結合した大腸菌のリボソームをリサイクルすることはで
きない。この事実は、ドメインIIの運動性がＲＲＦのリ
ボソームリサイクル活性に重要であることを示唆してい
る。したがって、ＲＲＦはｔＲＮＡミミックとしてリボ
ソームのＡ部位に結合すると考えられる。
意味を持つものである。興味深いことにT. maritima Ｒ
ＲＦは大腸菌のリボソームに結合することができるが、
結合した大腸菌のリボソームをリサイクルすることはで
きない。この事実は、ドメインIIの運動性がＲＲＦのリ
ボソームリサイクル活性に重要であることを示唆してい
る。したがって、ＲＲＦはｔＲＮＡミミックとしてリボ
ソームのＡ部位に結合すると考えられる。
【００３９】以上より、ドメインIIの動きはリボソーム
結合後に起こる現象に必要なものであると考えられ、こ
の出願の発明であるＲＲＦの分子内ドメイン運動の評価
方法によりドメインIIの運動性を把握することは、ＲＲ
Ｆ阻害剤の設計に大いに役立つものと期待される。
結合後に起こる現象に必要なものであると考えられ、こ
の出願の発明であるＲＲＦの分子内ドメイン運動の評価
方法によりドメインIIの運動性を把握することは、ＲＲ
Ｆ阻害剤の設計に大いに役立つものと期待される。
【００４０】
【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願の
発明によって、ＲＲＦのドメインＩとドメインIIの構造
において、ドメインIIの回転運動としてのゆらぎを適切
に評価することが可能とされ、またこれによって、ＲＲ
Ｆ阻害剤の分子設計とスクリーニングが効果的に進めら
れることになる。
発明によって、ＲＲＦのドメインＩとドメインIIの構造
において、ドメインIIの回転運動としてのゆらぎを適切
に評価することが可能とされ、またこれによって、ＲＲ
Ｆ阻害剤の分子設計とスクリーニングが効果的に進めら
れることになる。
【図１】細菌ＲＲＦについてのドメインＩとドメインII
との間の垂直方向の角度（θ）と、ドメインIIの水平方
向の回転角度（φ）との関係を例示した図である。
との間の垂直方向の角度（θ）と、ドメインIIの水平方
向の回転角度（φ）との関係を例示した図である。
【図２】この出願の発明の実施例において、この出願の
発明であるＲＲＦの分子内ドメイン運動の評価方法の手
順について示した流れ図である。
発明であるＲＲＦの分子内ドメイン運動の評価方法の手
順について示した流れ図である。
【図３】スペクトル密度関数の結果を例示した図であ
る。
る。
【図４】ドメインの相対配置として可能なものを例示し
た図である。
た図である。
【図５】報告されている大腸菌ＲＲＦの結晶構造である
１ＥＫ８について示した図である。
１ＥＫ８について示した図である。
【図６】拡張スペクトル密度関数に分子の非等方性によ
る補正を加えた結果を例示した図である。
る補正を加えた結果を例示した図である。
Claims (3)
- 【請求項１】 ＲＲＦ（リボソーム再生因子）のαヘリ
ックス構造のドメインＩを回転軸として、これに連結す
るβシート構造のドメインIIの水平回転の動きを、ＮＭ
Ｒで核磁気緩和時間を測定し、得られるスペクトル密度
関数によって求められる回転拡散テンソルと、ドメイン
ＩとドメインIIの実効回転相関時間の差異とから評価す
ることを特徴とするＲＲＦの分子内ドメイン運動の評価
方法。 - 【請求項２】 ＲＲＦ（リボソーム再生因子）のαヘリ
ックス構造のドメインＩを回転軸として、これに連結す
るβシート構造のドメインIIの水平回転の動きを、ＮＭ
Ｒで核磁気緩和時間を測定し、Ｊ（ωN）／Ｊ（0）（こ
こで、Ｊ（ωN）はスペクトル密度関数であり、 【数１】 と定義される。相関時間τjは回転拡散テンソルの主値
に依存し、係数Ａjは回転拡散テンソルの主軸系に対す
る15Ｎ−1Ｈベクトルの向きに依存する。）を観測値と
フィットすることでＲＲＦ分子の各ドメインについて回
転拡散テンソルを算出し、ＲＲＦの立体構造データを用
いてドメインの相対配置をドメインごとに算出された回
転拡散テンソルの主軸系に座標変換することでドメイン
IおよびドメインIIの配置を求め、スペクトル密度関数
を次式 【数２】 で表される拡張モデルフリー関数に当てはめ局所的な速
い運動に関するオーダーパラメータＳ2 fの値を一般的に
２次構造領域で観測される値に固定しドメイン運動に関
するオーダーパラメータＳ2 Sの値は残基ごとに求め、求
められたＳ2 Sの大きさから各ドメインの運動を評価する
ことを特徴とするＲＲＦの分子内ドメイン運動の評価方
法。 - 【請求項３】 ＲＲＦ（リボソーム再生因子）のαヘリ
ックス構造のドメインＩを回転軸として、これに連結す
るβシート構造のドメインIIの水平回転の動きの阻害の
評価からＲＲＦ阻害剤の分子設計もしくはスクリーニン
グを行うことを特徴とするＲＲＦの分子内ドメイン運動
の評価に基づくＲＲＦ阻害剤の設計とスクリーニング方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001325896A JP3936855B2 (ja) | 2001-10-24 | 2001-10-24 | Ｒｒｆの分子内ドメイン運動の評価方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001325896A JP3936855B2 (ja) | 2001-10-24 | 2001-10-24 | Ｒｒｆの分子内ドメイン運動の評価方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003130823A true JP2003130823A (ja) | 2003-05-08 |
| JP3936855B2 JP3936855B2 (ja) | 2007-06-27 |
Family
ID=19142371
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001325896A Expired - Fee Related JP3936855B2 (ja) | 2001-10-24 | 2001-10-24 | Ｒｒｆの分子内ドメイン運動の評価方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3936855B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006317311A (ja) * | 2005-05-13 | 2006-11-24 | Hitachi Ltd | 緩和時間特定およびスペクトル帰属決定方法および計測結果表示方法 |
| JPWO2005052620A1 (ja) * | 2003-11-28 | 2007-06-21 | 株式会社日立製作所 | 核磁気共鳴法を用いた、標的タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法、およびこの方法に用いるプログラム。 |
| CN102323408A (zh) * | 2011-05-31 | 2012-01-18 | 上海师范大学 | 快速检测阪崎肠杆菌的方法 |
-
2001
- 2001-10-24 JP JP2001325896A patent/JP3936855B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2005052620A1 (ja) * | 2003-11-28 | 2007-06-21 | 株式会社日立製作所 | 核磁気共鳴法を用いた、標的タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法、およびこの方法に用いるプログラム。 |
| JP2010169694A (ja) * | 2003-11-28 | 2010-08-05 | Hitachi Ltd | 核磁気共鳴法を用いた、標的タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法、およびこの方法に用いるプログラム |
| US7904252B2 (en) | 2003-11-28 | 2011-03-08 | Hitachi, Ltd. | Method for measuring a structural change in a protein |
| JP2006317311A (ja) * | 2005-05-13 | 2006-11-24 | Hitachi Ltd | 緩和時間特定およびスペクトル帰属決定方法および計測結果表示方法 |
| CN102323408A (zh) * | 2011-05-31 | 2012-01-18 | 上海师范大学 | 快速检测阪崎肠杆菌的方法 |
| CN102323408B (zh) * | 2011-05-31 | 2014-01-15 | 上海师范大学 | 快速检测阪崎肠杆菌的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3936855B2 (ja) | 2007-06-27 |
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