【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、式（Ｉ）
【０００２】
【化１】
【０００３】で示される７α，２１−ジヒドロキシ−２
０−メチル−プレグナ−４−エン−３−オンの製造方法
に関する。本発明により製造される７α，２１−ジヒド
ロキシ−２０−メチル−プレグナ−４−エン−３−オン
は、例えば、下式で示されるスクアラミン（ｓｑｕａｌ
ａｍｉｎｅ）などの医薬の合成中間体として有用であ
る。
【０００４】
【化２】
【０００５】スクアラミンは、グラム陽性菌、グラム陰
性菌、真菌などに対する強力な抗菌活性を有するととも
に、抗ガン活性を有することが報告され、新たな抗生物
質として注目されている化合物である［ジャーナル・オ
ブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅ
ｍ．）、６３巻、３７８６頁（１９９８年）；ジャーナ
ル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．
Ｃｈｅｍ．）、６３巻、８５９９頁（１９９８年）；Ｗ
Ｏ ９８／２４８００など参照］。
【０００６】
【従来の技術】従来、スクアラミンはサメの肝臓から抽
出されていたが、その抽出効率が０．００１〜０．００
２重量％と極めて低いため、化学的合成方法の検討が行
われてきた。スクアラミンの化学的合成方法としては、
１）３β−アセトキシ−５−コラン酸を出発原料とする
方法［テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ Ｌｅｔｔ．）、３５巻、８１０３頁（１９９４
年）参照］、２）３β−ヒドロキシ−５−コラン酸を出
発原料とする方法［ジャーナル・オブ・オーガニック・
ケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、６０巻、５
１２１頁（１９９５年）；ＷＯ ９４／１９３６６参
照］、３）２１−ヒドロキシ−２０−メチル−プレグナ
−４−エン−３−オンを出発原料とする方法［ＷＯ ９
８／２４８００；オルガニック・レターズ（Ｏｒｇ．Ｌ
ｅｔｔ．）、２巻、２９２１頁（２０００年）参照］、
４）スティグマステロールを出発原料とする方法［ジャ
ーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ．Ｏｒ
ｇ．Ｃｈｅｍ．）、６３巻、３７８６頁（１９９８
年）；ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー
（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、６３巻、８５９９頁（１
９９８年）；ＷＯ ９８／２４８００参照］が知られて
いる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】上記１）、２）および
３）の方法でそれぞれ出発原料として用いる３β−アセ
トキシ−５−コラン酸、３β−ヒドロキシ−５−コラン
酸、２１−ヒドロキシ−２０−メチル−プレグナ−４−
エン−３−オンはいずれも高価である。また、上記１）
の方法ではスクアラミンを得るまでに１７工程を要し、
２）の方法では１９工程を要するなど反応操作が煩雑で
ある。したがって、これらの方法はスクアラミンの工業
的に有利な製造方法とは言い難い。
【０００８】一方、上記４）の方法では、出発原料とし
て用いるスティグマステロールは安価に入手可能である
が、スクアラミンの合成までには２０工程を要する。ま
た、４）の方法では、３位水酸基を選択的に酸化する工
程で使用する炭酸銀が高価であること、低温下でのオゾ
ン酸化工程を経由するので特殊な反応設備が必要なこ
と、などの問題点が存在しており、この方法も必ずしも
工業的に有利な方法とは言えない。
【０００９】しかして、本発明の目的は、スクアラミン
に工業的に有利に誘導できる７α，２１−ジヒドロキシ
−２０−メチル−プレグナ−４−エン−３−オンを、高
純度で効率よく製造し得る方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために鋭意検討を重ねた結果、式（ＩＩ）
【００１１】
【化３】
【００１２】で示される７α−ヒドロキシ−プレグナ−
４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドを原料とし
て選び、該７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３
−オン−２０−カルバルデヒドに還元剤を作用させるこ
とにより、７α，２１−ジヒドロキシ−２０−メチル−
プレグナ−４−エン−３−オンが高純度で効率よく製造
し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１３】本発明は、７α−ヒドロキシ−プレグナ−
４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドに還元剤を
作用させることを特徴とする７α，２１−ジヒドロキシ
−２０−メチル−プレグナ−４−エン−３−オンの製造
方法である。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明において用いられる還元剤
としては、例えば水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素
ナトリウム、水素化ホウ素カリウム、シアノ水素化ホウ
素リチウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水
素化ホウ素カリウム、水素化トリ−ｓｅｃ−ブチルホウ
素リチウム、水素化トリ−ｓｅｃ−ブチルホウ素ナトリ
ウム、水素化トリ−ｓｅｃ−ブチルホウ素カリウム、水
素化トリエチルホウ素リチウム、水素化トリエチルホウ
素ナトリウム、水素化トリエチルホウ素カリウム、トリ
アセトキシ水素化ホウ素リチウム、トリアセトキシ水素
化ホウ素ナトリウム、トリアセトキシ水素化ホウ素カリ
ウム、テトラブチルアンモニウムボロヒドリド、シアノ
水素化ホウ素テトラブチルアンモニウムなどの水素化ホ
ウ素化合物；水素化ジメチルアルミニウム、水素化ジエ
チルアルミニウム、水素化ジプロピルアルミニウム、水
素化ジイソブチルアルミニウム、ジメトキシ水素化アル
ミニウムナトリウム、トリメトキシ水素化アルミニウム
ナトリウム、水素化ビス（２−メトキシエトキシ）アル
ミニウムナトリウムなどの水素化アルミニウム化合物な
どが挙げられる。還元剤の使用量は、７α−ヒドロキシ
−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒ
ドに対して、還元剤中の水素原子換算で１モル当量以上
となるような量を選択するのが好ましく、１〜５モル当
量の範囲となるような量を選択するのがより好ましい。
【００１５】反応は、溶媒の存在下または不存在下で行
うことができる。溶媒としては、反応に悪影響を与えな
い限り特に制限はなく、例えばメタノール、エタノー
ル、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノ
ール、２−ブタノール、２−メチルプロパノールなどの
アルコール；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテ
ル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタンなどのエー
テル；ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタ
ン、オクタン、石油エーテル、ベンゼン、トルエンなど
の炭化水素などが挙げられる。これらは単独で用いても
よいし、２種以上を混合して用いてもよい。溶媒の使用
量は特に制限されないが、７α−ヒドロキシ−プレグナ
−４−エン−３−オン−２０−カルバルアルデヒドに対
して１〜１００倍重量の範囲であるのが好ましい。
【００１６】反応温度は、−８０〜２００℃の範囲であ
るのが好ましく、−２０〜１８０℃の範囲であるのがよ
り好ましい。
【００１７】反応は、７α−ヒドロキシ−プレグナ−４
−エン−３−オン−２０−カルバルアルデヒドを還元剤
中に添加するか、または還元剤を７α−ヒドロキシ−プ
レグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルアルデヒ
ド中に添加し、所定温度で攪拌して行う。この際、必要
に応じて、７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３
−オン−２０−カルバルアルデヒドおよび還元剤は、上
記した溶媒の溶液として用いてもよい。
【００１８】このようにして得られた７α，２１−ジヒ
ドロキシ−２０−メチル−プレグナ−４−エン−３−オ
ンは、通常の有機化合物の単離・精製に用いられる方法
により単離・精製することができる。例えば、反応混合
物を希塩酸、希硫酸などの希酸；飽和炭酸水素ナトリウ
ム水溶液、希水酸化ナトリウム水溶液などの希アルカリ
水溶液；食塩水または水にあけ、ジエチルエーテル、酢
酸エチル、塩化メチレンなどの有機溶媒で抽出し、抽出
液を、必要に応じて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液など
で洗浄して酸性物質を除去し、次いで、希塩酸、水、食
塩水などで洗浄して塩基性物質および水溶性物質を除去
した後、無水硫酸マグネシウム、無水硫酸ナトリウムな
どで乾燥し、濃縮して得られる粗生成物を必要に応じて
蒸留、クロマトグラフィー、再結晶などにより精製す
る。
【００１９】７α，２１−ジヒドロキシ−２０−メチル
−プレグナ−４−エン−３−オン、例えば（２０Ｓ）−
７α，２１−ジヒドロキシ−２０−メチル−プレグナ−
４−エン−３−オンは、オルガニック・レターズ（Ｏｒ
ｇ．Ｌｅｔｔ．）、２巻、２９２１頁（２０００年）に
記載された方法によりスクアラミンに変換される。
【００２０】なお、本発明の出発原料である７α−ヒド
ロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバ
ルデヒドは、３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン
酸および／またはその塩を基質として、７α−ヒドロキ
シ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデ
ヒドを生産するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属に属する細菌、例えばシュードモナス・プチダＤ
４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ、ＦＥＲＭ
Ｐ−１８３６１）を、３α，７α−ジヒドロキシ−
５β−コラン酸および／またはその塩を含む培地で培養
することにより製造することができる（特願２００１−
２６７０２５明細書参照）。
【００２１】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明は実施例により何ら制限されるもの
ではない。
【００２２】参考例１
シュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａの
取得方法
培地１（普通寒天培地）の斜面培地に一晩生育させたシ
ュードモナス・プチダＤ４０１４（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４、ＦＥＲＭＢＰ−２０
５）菌株の１白金耳を、予め試験管に準備した培地２
（ブイヨン液体培地）の１０ｍｌに植菌し、３０℃、２
００ｒｐｓで一晩振盪培養した。得られた培養液の１ｍ
ｌを予め試験管に準備した培地２（前記のとおり）の１
０ｍｌに植菌し、６時間振盪培養した。得られた培養液
を０．４５μｍのメンブレンフィルターで無菌的に濾過
集菌し、０．１Ｍリン酸緩衝液２０ｍｌで洗浄した後、
同緩衝液２５ｍｌに該フィルターに付着した菌を懸濁さ
せた。得られた菌液のうち４ｍｌに終濃度が５０μｇ／
ｍｌとなるようにＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジンを添加し、３０℃で１０分間振盪するこ
とにより、突然変異処理を行った。突然変異処理を施し
た菌液は、直ちに上記のリン酸緩衝液で１０倍に希釈
し、これを培地１の平板培地に５００〜１０００個のコ
ロニーを出現させるように希釈して塗布した後、３０℃
で一晩静置培養を行った。出現したコロニーをランダム
に培地１の平板培地に釣菌（５０個／プレート）し、翌
日それぞれを培地１（前記のとおり）の斜面培地に植菌
した。こうして得られた生育菌株を、予め滅菌した培地
３（組成：３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸
１０ｇ、水酸化ナトリウム１．１ｇ、硝酸アンモニウム
２ｇ、リン酸二水素一カリウム１ｇ、リン酸水素二カ
リウム６ｇ、硫酸マグネシウム０．５ｇ、ペプトン０．
５ｇ、酵母エキス０．５ｇ、グルコース０．５ｇ、水道
水１Ｌ、ｐＨ７．８）の１０ｍｌを含む試験管に２白金
耳植菌し、３０℃、２００ｒｐｓで２４時間、振盪培養
した。得られたそれぞれの培養液中の生産物を薄層クロ
マトグラフィーにより検定し、目的とする７α−ヒドロ
キシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０α−カルバ
ルデヒドを選択的に蓄積している一菌株を見出し、これ
をシュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４
−Ａ３５７−３Ａ）と命名した。
【００２３】参考例２
（２０Ｓ）−７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−
３−オン−２０−カルバルデヒドの取得
シュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａ
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４
−Ａ３５７−３Ａ）を培地１（前記のとおり）の斜面培
地に植菌し、３０℃で１日間培養した。次に、生育した
菌体の２白金耳を３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コ
ラン酸を含む培地３（前記のとおり）の液体培地１０ｍ
ｌに植菌し、３０℃で一晩振盪培養した後、得られた培
養液を同組成の培地３（前記のとおり）の１００ｍｌが
入った５００ｍｌ容の坂口フラスコに植菌し、３０℃、
２００ｒｐｓで４８時間培養した。なお、培養に供した
３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸の総量は
１．１ｇ（２．８ｍｍｏｌ）である。得られた培養液を
５０００ｒｐｍで３０分間、遠心分離し、得られた菌体
と生成物の混合物に水１００ｍｌを入れて懸濁させた
後、再度、遠心分離処理を行うことにより該混合物を洗
浄した。該混合物にメタノール２００ｍｌを添加して生
成物を溶解した後、濾過して清澄なメタノール溶液を得
た。該メタノール溶液に水３０ｍｌを加えた後、ロータ
リーエバポレーターによりメタノールを一部留去し、次
いで、得られた濃縮液を冷却し、晶析した固形物を濾取
し、乾燥することにより、下記の物性を有する（２０
Ｓ）−７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オ
ン−２０−カルバルデヒド３１０ｍｇ（０．９０ｍｍｏ
ｌ、収率３２％）を得た。
【００２４】得られた（２０Ｓ）−７α−ヒドロキシ−
プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒド
の一部を取り、これにメタノールを加えて１％溶液と
し、この溶液をＯＤＳ−８０ＴＭ（商品名、東ソー株式
会社製、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）カラム（カラム温度
４０℃、カラムオーブン；Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＣＴＯ−
６Ａ 株式会社島津製作所製）を備えた高速液体クロマ
トグラフィー（ポンプ部；モデル５１０ ウォーターズ
社製）に注入した。移動相として水／メタノール＝２７
／７３（リン酸５０μｌ／Ｌ添加）を１ｍｌ／分で流
し、検出を屈折率方式（検出器；Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−
７１ 昭和電工株式会社製）で行った。得られたクロマ
トグラムにおける各ピークの面積比（データ処理；Ｓｈ
ｉｍａｄｚｕＣ−Ｒ７Ａ ｐｌｕｓ 株式会社島津製作
所製）から上記（２０Ｓ）−７α−ヒドロキシ−プレグ
ナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドの純度
を求めたところ、９６％であった。
【００２５】１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（２７０ＭＨｚ、
ＣＤＣｌ３、ＴＭＳ基準、ｐｐｍ）δ：９．５６８（１
Ｈ、ｄ、Ｊ＝３．９５Ｈｚ），５．４２７（１Ｈ、ｄ、
Ｊ＝１．９８Ｈｚ），３．９７−３．９８（１Ｈ、ｂ
ｓ），２．６３５（１Ｈ、ｄｄｄ、Ｊ＝２．９６、２．
９６、１４．８４Ｈｚ），２．３０−２．５５（４Ｈ、
ｍ），１．１０−２．１０（１４Ｈ、ｍ），１，２０５
（３Ｈ、ｓ），１．１３９（３Ｈ、ｄ、Ｊ＝５．９４Ｈ
ｚ），０．７６９（３Ｈ、ｓ）
【００２６】実施例１
（２０Ｓ）−７α，２１−ジヒドロキシ−２０−メチル
−プレグナ−４−エン−３−オンの合成
参考例２と同様にして得られた（２０Ｓ）−７α−ヒド
ロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバ
ルデヒド２．００ｇ（５．８１ｍｍｏｌ）にエタノール
２０ｍｌを加え、攪拌しながら氷冷した。得られた溶液
に、水素化ホウ素ナトリウム０．１１ｇ（２．９１ｍｍ
ｏｌ）を加えた後、氷冷下で１時間撹拌した。得られた
反応液に３％塩酸を加えて中和し、エタノールを減圧下
で留去した。残留物に酢酸エチル１００ｍｌおよび水２
０ｍｌを加え洗浄し、次いで、水層を分離し、有機層を
無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、濾過し、減圧下で濃
縮することにより、下記の物性を有する（２０Ｓ）−７
α，２１−ジヒドロキシ−２０−メチル−プレグナ−４
−エン−３−オン１．７７ｇ（収率８８％）を得た。
【００２７】１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（２７０ＭＨｚ、
ＣＤＣｌ３、ＴＭＳ基準、ｐｐｍ）δ：５．７９６（１
Ｈ、ｓ），３．９６５（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１．９８Ｈ
ｚ），３．６３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９６，１０．
８８Ｈｚ），３．３７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．９２，
１０．８８Ｈｚ），２．６１２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝
２．９７，２．９７，１４．８４Ｈｚ），２．４１５
（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９７，１４．８４Ｈｚ），２．
３−２．５（ｍ，２Ｈ），１．０−２．１（ｍ，１５
Ｈ），１．１９４（３Ｈ，ｓ），１．０５２（３Ｈ，
ｄ，Ｊ＝６．９２Ｈｚ），０．７４０（３Ｈ，ｓ）．
【００２８】
【発明の効果】本発明によれば、スクアラミンなどの医
薬の合成中間体として有用な７α，２１−ジヒドロキシ
−２０−メチル−プレグナ−４−エン−３−オンを高純
度で効率よく製造することができる。Description: BACKGROUND OF THE INVENTION [0001] The present invention relates to a compound of the formula (I) 7α, 21-dihydroxy-2 represented by
The present invention relates to a method for producing 0-methyl-pregna-4-en-3-one. 7α, 21-dihydroxy-20-methyl-pregna-4-en-3-one produced according to the present invention is, for example, squalamine (squaral) represented by the following formula:
Amines) and the like are useful as intermediates for the synthesis of pharmaceuticals. [0004] [0005] Squalamine is a compound that has been reported to have potent antibacterial activity against gram-positive bacteria, gram-negative bacteria, fungi, etc., and also has anticancer activity, and is attracting attention as a new antibiotic [Journal. Of Organic Chemistry (J. Org. Che)
m. 63, 3786 (1998); Journal of Organic Chemistry (J. Org.
Chem. ), 63, 8599 (1998); W.
O 98/24800, etc.]. Conventionally, squalamine has been extracted from shark liver, but its extraction efficiency is 0.001 to 0.00.
Due to the extremely low content of 2% by weight, a chemical synthesis method has been studied. As a chemical synthesis method of squalamine,
1) Method using 3β-acetoxy-5-cholanic acid as a starting material [Tetrahedron Letters (Tetrahedr)
on Lett. ), 35, 8103 (1994)
2) Method using 3β-hydroxy-5-cholanic acid as a starting material [Journal of Organic
Chemistry (J. Org. Chem.), 60 volumes, 5
121 (1995); see WO 94/19366], 3) Method using 21-hydroxy-20-methyl-pregna-4-en-3-one as starting material [WO 9
8/24800; Organic Letters (Org. L
ett. ), Vol. 2, p. 2921 (2000)],
4) Method using stigmasterol as a starting material [Journal of Organic Chemistry (J. Or.)
g. Chem. ), 63, 3786 (1998).
Year); Journal of Organic Chemistry (J. Org. Chem.), 63, 8599 (1
998); see WO 98/24800]. [0007] 3β-acetoxy-5-cholanic acid, 3β-hydroxy-5-cholanic acid, 21-hydroxy used as a starting material in each of the above methods 1), 2) and 3) -20-methyl-pregna-4-
En-3-ones are all expensive. The above 1)
Method requires 17 steps to obtain squalamine,
In the method 2), the reaction operation is complicated such that 19 steps are required. Therefore, these methods cannot be said to be industrially advantageous methods for producing squalamine. On the other hand, in the above method 4), stigmasterol used as a starting material is available at low cost, but it requires 20 steps to synthesize squalamine. In the method 4), silver carbonate used in the step of selectively oxidizing the hydroxyl group at the 3-position is expensive, and special reaction equipment is required because it passes through the ozone oxidation step at a low temperature. However, this method is not necessarily an industrially advantageous method. Thus, an object of the present invention is to provide a method for producing 7α, 21-dihydroxy-20-methyl-pregna-4-en-3-one which can be industrially advantageously derived into squalamine with high purity and high efficiency. It is to provide a method. Means for Solving the Problems The present inventors have made intensive studies to achieve the above object, and as a result, the formula (II) 7α-hydroxy-pregna represented by the formula:
4-en-3-one-20-carbaldehyde was selected as a starting material, and the 7α-hydroxy-pregna-4-en-3 was selected.
By reacting a reducing agent on 1-one-20-carbaldehyde, 7α, 21-dihydroxy-20-methyl-
The present inventors have found that pregn-4-en-3-one can be efficiently produced with high purity, and have completed the present invention. The present invention relates to 7α-hydroxy-pregna-
A method for producing 7α, 21-dihydroxy-20-methyl-pregna-4-en-3-one, which comprises reacting 4-en-3-one-20-carbaldehyde with a reducing agent. DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The reducing agent used in the present invention includes, for example, lithium borohydride, sodium borohydride, potassium borohydride, lithium cyanoborohydride, sodium cyanoborohydride, cyanohydrogen Potassium borohydride, lithium tri-sec-butyl borohydride, sodium tri-sec-butyl borohydride, potassium tri-sec-butyl borohydride, lithium triethyl borohydride, sodium triethyl borohydride, triethyl boron hydride Boron hydrides such as potassium, lithium triacetoxyborohydride, sodium triacetoxyborohydride, potassium triacetoxyborohydride, tetrabutylammonium borohydride, tetrabutylammonium cyanoborohydride Compounds: hydrogenation of dimethyl aluminum hydride, diethyl aluminum hydride, dipropyl aluminum hydride, diisobutyl aluminum hydride, sodium dimethoxy aluminum hydride, sodium trimethoxy aluminum hydride, sodium bis (2-methoxyethoxy) aluminum hydride, etc. Aluminum compounds and the like can be mentioned. The amount of the reducing agent to be used is selected so as to be not less than 1 molar equivalent in terms of hydrogen atoms in the reducing agent with respect to 7α-hydroxy-pregna-4-en-3-one-20-carbaldehyde. Is preferable, and it is more preferable to select an amount so as to be in the range of 1 to 5 molar equivalents. [0015] The reaction can be carried out in the presence or absence of a solvent. The solvent is not particularly limited as long as it does not adversely affect the reaction. For example, alcohols such as methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, 2-butanol and 2-methylpropanol; diethyl ether, diisopropyl ether, tetrahydrofuran And ethers such as dimethoxyethane; and hydrocarbons such as pentane, hexane, cyclohexane, heptane, octane, petroleum ether, benzene, and toluene. These may be used alone or as a mixture of two or more. The amount of the solvent used is not particularly limited, but is preferably in the range of 1 to 100 times the weight of 7α-hydroxy-pregna-4-en-3-one-20-carbalaldehyde. [0016] The reaction temperature is preferably in the range of -80 to 200 ° C, more preferably in the range of -20 to 180 ° C. The reaction is carried out by reacting 7α-hydroxy-pregna-4
-En-3-one-20-carbalaldehyde is added to the reducing agent, or the reducing agent is added to 7α-hydroxy-pregna-4-en-3-one-20-carbalaldehyde and Stir at temperature. At this time, if necessary, 7α-hydroxy-pregna-4-en-3
-On-20-carbalaldehyde and the reducing agent may be used as a solution in the above-mentioned solvent. The thus-obtained 7α, 21-dihydroxy-20-methyl-pregna-4-en-3-one is isolated and purified by a method generally used for isolating and purifying organic compounds. be able to. For example, the reaction mixture is diluted with a dilute acid such as dilute hydrochloric acid or dilute sulfuric acid; a dilute alkali aqueous solution such as a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution or dilute sodium hydroxide aqueous solution; and poured into a saline solution or water and an organic solvent such as diethyl ether, ethyl acetate, or methylene chloride. The extract is washed with a saturated aqueous solution of sodium bicarbonate as necessary to remove acidic substances, and then washed with diluted hydrochloric acid, water, saline, etc. to remove basic substances and water-soluble substances. After that, the resultant is dried over anhydrous magnesium sulfate, anhydrous sodium sulfate, or the like, and concentrated, and the obtained crude product is purified by distillation, chromatography, recrystallization, or the like, if necessary. 7α, 21-dihydroxy-20-methyl-pregna-4-en-3-one, such as (20S)-
7α, 21-dihydroxy-20-methyl-pregna-
4-en-3-one is obtained from Organic Letters (Or
g. Lett. ), 2, 2921 (2000). The starting material of the present invention, 7α-hydroxy-pregna-4-en-3-one-20-carbaldehyde, uses 3α, 7α-dihydroxy-5β-cholanic acid and / or a salt thereof as a substrate. Pseudomona, which produces 7α-hydroxy-pregna-4-en-3-one-20-carbaldehyde
s) Bacteria belonging to the genus, such as Pseudomonas putida D
4014-A357-3A (Pseudomonas
putida D4014-A357-3A, FERM
P-18361), 3α, 7α-dihydroxy-
It can be produced by culturing in a medium containing 5β-cholanic acid and / or its salt (Japanese Patent Application No. 2001-2001).
267025). EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to the examples. Reference Example 1 Method for Obtaining Pseudomonas putida D4014-A357-3A Pseudomonas putida D4014 (Pseudomon) grown overnight on a slant medium of Medium 1 (normal agar medium).
as putida D4014, FERMBP-20
5) One platinum loop of the strain was added to a medium 2 previously prepared in a test tube.
(Bouillon liquid medium) at 30 ° C, 2
Shaking culture was performed at 00 rps overnight. 1 m of the obtained culture solution
of medium 2 (as described above) previously prepared in a test tube
0 ml was inoculated and cultured with shaking for 6 hours. The resulting culture was aseptically filtered and collected with a 0.45 μm membrane filter, washed with 20 ml of 0.1 M phosphate buffer,
Bacteria attached to the filter were suspended in 25 ml of the same buffer. A final concentration of 50 μg /
Mutation treatment was performed by adding N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine to a volume of 10 ml and shaking at 30 ° C for 10 minutes. The bacterial solution subjected to the mutation treatment was immediately diluted 10-fold with the above-mentioned phosphate buffer, and diluted and applied to the plate 1 of the medium 1 so that 500 to 1000 colonies appeared. 30 ° C
For overnight culture. Appearing colonies were randomly picked (50 cells / plate) on a plate medium of Medium 1, and the following day, each was inoculated on a slant medium of Medium 1 (as described above). The growing strain thus obtained was cultured in a previously sterilized medium 3 (composition: 3α, 7α-dihydroxy-5β-cholanic acid 10 g, sodium hydroxide 1.1 g, ammonium nitrate 2 g, monopotassium dihydrogen phosphate 1 g, dihydrogen hydrogen phosphate). Potassium 6g, magnesium sulfate 0.5g, peptone 0.
Two platinum loops were inoculated into a test tube containing 10 g of 5 g, yeast extract 0.5 g, glucose 0.5 g, tap water 1 L, pH 7.8), and cultured with shaking at 30 ° C. and 200 rps for 24 hours. The product in each of the obtained culture solutions was assayed by thin-layer chromatography, and the desired 7α-hydroxy-pregna-4-en-3-one-20α-carbaldehyde was selectively accumulated. A strain was identified and this was identified as Pseudomonas putida D4014-A357-3A.
(Pseudomonas putida D4014
-A357-3A). Reference Example 2 (20S) -7α-hydroxy-pregna-4-ene-
Acquisition of 3-one-20-carbaldehyde Pseudomonas putida D4014-A357-3A
(Pseudomonas putida D4014
-A357-3A) was inoculated on a slant medium of Medium 1 (as described above) and cultured at 30 ° C for 1 day. Next, two platinum loops of the grown cells were placed in a liquid medium 10 m of medium 3 (as described above) containing 3α, 7α-dihydroxy-5β-cholanic acid.
After shaking culture at 30 ° C. overnight, the obtained culture solution was inoculated into a 500 ml Sakaguchi flask containing 100 ml of Medium 3 (as described above) having the same composition, and then inoculated at 30 ° C.
The cells were cultured at 200 rps for 48 hours. The total amount of 3α, 7α-dihydroxy-5β-cholanic acid used in the culture was 1.1 g (2.8 mmol). The obtained culture solution is centrifuged at 5000 rpm for 30 minutes, 100 ml of water is added to the obtained mixture of the cells and the product, and the mixture is again centrifuged to wash the mixture. did. 200 ml of methanol was added to the mixture to dissolve the product, and then filtered to obtain a clear methanol solution. After adding 30 ml of water to the methanol solution, a part of methanol was distilled off by a rotary evaporator, and then the obtained concentrated liquid was cooled, and the crystallized solid was collected by filtration and dried to obtain the following. Has physical properties (20
S) -7α-Hydroxy-pregna-4-en-3-one-20-carbaldehyde 310 mg (0.90 mmol
1, yield 32%). The obtained (20S) -7α-hydroxy-
A part of Pregna-4-en-3-one-20-carbaldehyde is taken, and methanol is added thereto to make a 1% solution. This solution is ODS-80TM (trade name, manufactured by Tosoh Corporation, 4.6 mm × 150mm) column (column temperature 40 ° C, column oven; Shimadzu CTO-
6A (manufactured by Shimadzu Corporation) (pump section; model 510, manufactured by Waters). Water / methanol = 27 as mobile phase
/ 73 (50 μl / L of phosphoric acid) was flowed at 1 ml / min.
71 Showa Denko KK). Area ratio of each peak in the obtained chromatogram (data processing; Sh
The purity of the above (20S) -7α-hydroxy-pregna-4-en-3-one-20-carbaldehyde was determined from imadzu C-R7A plus (manufactured by Shimadzu Corporation) to be 96%. 1 H-NMR spectrum (270 MHz,
CDCl 3 , TMS standard, ppm) δ: 9.568 (1
H, d, J = 3.95 Hz), 5.427 (1H, d,
J = 1.98 Hz), 3.97-3.98 (1H, b
s), 2.635 (1H, ddd, J = 2.96, 2.
96, 14.84 Hz), 2.30-2.55 (4H,
m), 1.10-2.10 (14H, m), 1,205
(3H, s), 1.139 (3H, d, J = 5.94H
z), 0.769 (3H, s) Example 1 Synthesis of (20S) -7α, 21-dihydroxy-20-methyl-pregna-4-en-3-one 20 ml of ethanol was added to 2.00 g (5.81 mmol) of (20S) -7α-hydroxy-pregna-4-en-3-one-20-carbaldehyde thus obtained, and the mixture was ice-cooled with stirring. 0.11 g (2.91 mm) of sodium borohydride was added to the obtained solution.
ol), and the mixture was stirred for 1 hour under ice cooling. The obtained reaction solution was neutralized by adding 3% hydrochloric acid, and ethanol was distilled off under reduced pressure. The residue contains 100 ml of ethyl acetate and water 2
After washing with 0 ml, the aqueous layer was separated, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure to give the following properties (20S) -7:
α, 21-dihydroxy-20-methyl-pregna-4
1.77 g (yield 88%) of -en-3-one was obtained. 1 H-NMR spectrum (270 MHz,
CDCl 3 , TMS standard, ppm) δ: 5.796 (1
H, s), 3.965 (1H, brd, J = 1.98H
z), 3.632 (1H, dd, J = 2.96, 10.
88 Hz), 3.371 (1H, dd, J = 6.92,
10.88 Hz), 2.612 (1H, ddd, J =
2.97, 2.97, 14.84 Hz), 2.415
(1H, dd, J = 2.97, 14.84 Hz), 2.
3-2.5 (m, 2H), 1.0-2.1 (m, 15
H), 1.194 (3H, s), 1.052 (3H,
d, J = 6.92 Hz), 0.740 (3H, s). According to the present invention, 7α, 21-dihydroxy-20-methyl-pregna-4-en-3-one, which is useful as an intermediate for the synthesis of pharmaceuticals such as squalamine, can be produced efficiently with high purity. Can be manufactured.
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１４年７月１日（２００２．７．１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１５】反応は、溶媒の存在下または不存在下で行
うことができる。溶媒としては、反応に悪影響を与えな
い限り特に制限はなく、例えばメタノール、エタノー
ル、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノ
ール、２−ブタノール、２−メチルプロパノールなどの
アルコール；ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテ
ル、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタンなどのエー
テル；ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタ
ン、オクタン、石油エーテル、ベンゼン、トルエンなど
の炭化水素などが挙げられる。これらは単独で用いても
よいし、２種以上を混合して用いてもよい。溶媒の使用
量は特に制限されないが、７α−ヒドロキシ−プレグナ
−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドに対して
１〜１００倍重量の範囲であるのが好ましい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１７】反応は、７α−ヒドロキシ−プレグナ−４
−エン−３−オン−２０−カルバルデヒドを還元剤中に
添加するか、または還元剤を７α−ヒドロキシ−プレグ
ナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデヒド中に添
加し、所定温度で攪拌して行う。この際、必要に応じ
て、７α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン
−２０−カルバルデヒドおよび還元剤は、上記した溶媒
の溶液として用いてもよい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２０】なお、本発明の出発原料である７α−ヒド
ロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバ
ルデヒドは、３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン
酸および／またはその塩を基質として、７α−ヒドロキ
シ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０−カルバルデ
ヒドを生産するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属に属する細菌、例えばシュードモナス・プチダＤ
４０１４−Ａ３５７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４−Ａ３５７−３Ａ、ＦＥＲＭ
ＢＰ−８０７０）を、３α，７α−ジヒドロキシ−５
β−コラン酸および／またはその塩を含む培地で培養す
ることにより製造することができる（特願２００２−１
８８８４９明細書参照）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】参考例１
シュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５７−３Ａの
取得方法
培地１（普通寒天培地）の斜面培地に一晩生育させたシ
ュードモナス・プチダＤ４０１４（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ４０１４、ＦＥＲＭＢＰ−２０
５）菌株の１白金耳を、予め試験管に準備した培地２
（ブイヨン液体培地）の１０ｍｌに植菌し、３０℃、２
００ｒｐｓで一晩振盪培養した。得られた培養液の１ｍ
ｌを予め試験管に準備した培地２（前記のとおり）の１
０ｍｌに植菌し、６時間振盪培養した。得られた培養液
を０．４５μｍのメンブレンフィルターで無菌的に濾過
集菌し、０．１Ｍリン酸緩衝液２０ｍｌで洗浄した後、
同緩衝液２５ｍｌに該フィルターに付着した菌を懸濁さ
せた。得られた菌液のうち４ｍｌに終濃度が５０μｇ／
ｍｌとなるようにＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジンを添加し、３０℃で１０分間振盪するこ
とにより、突然変異処理を行った。突然変異処理を施し
た菌液は、直ちに上記のリン酸緩衝液で１０倍に希釈
し、これを培地１の平板培地に５００〜１０００個のコ
ロニーを出現させるように希釈して塗布した後、３０℃
で一晩静置培養を行った。出現したコロニーをランダム
に培地１の平板培地に釣菌（５０個／プレート）し、翌
日それぞれを培地１（前記のとおり）の斜面培地に植菌
した。こうして得られた生育菌株を、予め滅菌した培地
３（組成：３α，７α−ジヒドロキシ−５β−コラン酸
１０ｇ、水酸化ナトリウム１．１ｇ、硝酸アンモニウム
２ｇ、リン酸二水素一カリウム１ｇ、リン酸水素二カリ
ウム６ｇ、硫酸マグネシウム０．５ｇ、ペプトン０．５
ｇ、酵母エキス０．５ｇ、グルコース０．５ｇ、水道水
１Ｌ、ｐＨ７．８）の１０ｍｌを含む試験管に２白金耳
植菌し、３０℃、２００ｒｐｓで２４時間、振盪培養し
た。得られたそれぞれの培養液中の生産物を薄層クロマ
トグラフィーにより検定し、目的とする（２０Ｓ）−７
α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３−オン−２０
−カルバルデヒドを選択的に蓄積している一菌株を見出
し、これをシュードモナス・プチダＤ４０１４−Ａ３５
７−３Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｄ
４０１４−Ａ３５７−３Ａ）と命名した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（２７０ＭＨｚ，
ＣＤＣｌ３ ，ＴＭＳ基準，ｐｐｍ）δ：９．５６８
（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．９５Ｈｚ），５．４２７（１Ｈ，
ｄ，Ｊ＝１．９８Ｈｚ），３．９７−３．９８（１Ｈ，
ｂｓ），２．６３５（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝２．９６，
２．９６，１４．８４Ｈｚ），２．３０−２．５５（４
Ｈ，ｍ），１．１０−２．１０（１４Ｈ，ｍ），１．２
０５（３Ｈ，ｓ），１．１３９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝５．９
４Ｈｚ），０．７６９（３Ｈ，ｓ）
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（２７０ＭＨｚ，
ＣＤＣｌ３ ，ＴＭＳ基準，ｐｐｍ）δ：５．７９６
（１Ｈ，ｓ），３．９６５（１Ｈ，ｂｒｄ，Ｊ＝１．９
８Ｈｚ），３．６３２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９６，１
０．８８Ｈｚ），３．３７１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．９
２，１０．８８Ｈｚ），２．６１２（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ
＝２．９７，２．９７，１４．８４Ｈｚ），２．４１５
（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．９７，１４．８４Ｈｚ），２．
３−２．５（ｍ，２Ｈ），１．０−２．１（ｍ，１５
Ｈ），１．１９４（３Ｈ，ｓ），１．０５２（３Ｈ，
ｄ，Ｊ＝６．９２Ｈｚ），０．７４０（３Ｈ，ｓ）
────────────────────────────────────────────────── ───
[Procedure amendment]
[Submission date] July 1, 2002 (2002.7.1)
[Procedure amendment 1]
[Document name to be amended] Statement
[Correction target item name] 0015
[Correction method] Change
[Correction contents]
The reaction is carried out in the presence or absence of a solvent.
I can. As a solvent, do not adversely affect the reaction.
There is no particular limitation as far as it is concerned, for example methanol, ethanol
, N-propanol, isopropanol, n-butano
, 2-butanol, 2-methylpropanol, etc.
Alcohol; diethyl ether, diisopropyl ether
, Tetrahydrofuran, dimethoxyethane, etc.
Ter; pentane, hexane, cyclohexane, hepta
, Octane, petroleum ether, benzene, toluene, etc.
And the like. These can be used alone
Or a mixture of two or more. Use of solvent
Although the amount is not particularly limited, 7α-hydroxy-pregna
-4-en-3-one-20-carbaRudeAgainst the hide
The weight is preferably in the range of 1 to 100 times the weight.
[Procedure amendment 2]
[Document name to be amended] Statement
[Correction target item name] 0017
[Correction method] Change
[Correction contents]
The reaction is carried out by reacting 7α-hydroxy-pregna-4
-En-3-one-20-carbaRudeHyd in reducing agent
Add or reduce agent to 7α-hydroxy-preg
Na-4-en-3-one-20-carbaRudeAttached to the hide
And stirring at a predetermined temperature. At this time, if necessary
7α-hydroxy-pregna-4-en-3-one
-20-carbaRudeThe hide and the reducing agent are the same as those described above.
May be used as a solution.
[Procedure amendment 3]
[Document name to be amended] Statement
[Correction target item name] 0020
[Correction method] Change
[Correction contents]
The starting material of the present invention, 7α-hydrid
Roxy-pregna-4-en-3-one-20-carba
Aldehyde is 3α, 7α-dihydroxy-5β-choran
Using an acid and / or a salt thereof as a substrate, 7α-hydroxy
Seapregna-4-en-3-one-20-carbarde
Pseudomona producing hides
s) Bacteria belonging to the genus, such as Pseudomonas putida D
4014-A357-3A (Pseudomonas
putida D4014-A357-3A, FERM
BP-8070) With 3α, 7α-dihydroxy-5
culturing in a medium containing β-cholanic acid and / or a salt thereof
Can be manufactured by applying2002-1
88849See specification).
[Procedure amendment 4]
[Document name to be amended] Statement
[Correction target item name] 0022
[Correction method] Change
[Correction contents]
Reference Example 1
Of Pseudomonas putida D4014-A357-3A
Acquisition method
A medium grown overnight on a slant of Medium 1 (normal agar)
Pseudomonas putida D4014 (Pseudomon
as putida D4014, FERMBP-20
5) One platinum loop of the strain was added to a medium 2 previously prepared in a test tube.
(Bouillon liquid medium) at 30 ° C, 2
Shaking culture was performed at 00 rps overnight. 1 m of the obtained culture solution
of medium 2 (as described above) previously prepared in a test tube
0 ml was inoculated and cultured with shaking for 6 hours. Obtained culture solution
Is aseptically filtered through a 0.45 μm membrane filter
After collecting and washing with 20 ml of 0.1 M phosphate buffer,
The bacteria adhering to the filter are suspended in 25 ml of the same buffer.
I let you. A final concentration of 50 μg /
ml of N-methyl-N'-nitro-N-nitro
Add rosoguanidine and shake at 30 ° C for 10 minutes.
And the mutation was performed. Mutation
Immediately diluted 10-fold with the above phosphate buffer
And put 500 to 1000 cells on a plate medium of Medium 1.
After diluting and applying so that Ronny appears, 30 ° C
For overnight culture. Randomly appear colonies
Then, in the plate 1 of culture medium, the bacteria were picked (50 cells / plate).
Inoculate each day on the slant of Medium 1 (as described above)
did. The growing strain thus obtained is cultured in a previously sterilized medium.
3 (composition: 3α, 7α-dihydroxy-5β-cholanic acid
10 g, sodium hydroxide 1.1 g, ammonium nitrate
2 g, monopotassium dihydrogen phosphate 1 g, dipotassium hydrogen phosphate
6g, magnesium sulfate 0.5g, peptone 0.5
g, yeast extract 0.5 g, glucose 0.5 g, tap water
Two platinum loops in a test tube containing 10 ml of 1L, pH 7.8)
Inoculate, shake culture at 30 ° C, 200 rpm for 24 hours.
Was. The product in each of the resulting cultures is
Test by torography and target(20S)-7
α-hydroxy-pregna-4-en-3-one-20
-Find a strain that selectively accumulates carbaldehyde
And put this into Pseudomonas putida D4014-A35
7-3A (Pseudomonas putida D)
4014-A357-3A).
[Procedure amendment 5]
[Document name to be amended] Statement
[Correction target item name] 0025
[Correction method] Change
[Correction contents]
[0025]1H-NMR spectrum (270 MHz,
CDCl3 ,TMS standard,ppm) δ: 9.568
(1H,d,J = 3.95 Hz), 5.427 (1H,
d,J = 1.98 Hz), 3.97-3.98 (1H,
bs), 2.635 (1H,ddd,J = 2.96,
2.96,14.84 Hz), 2.30-2.55 (4
H,m), 1.10-2.10 (14H,m),1.2
05(3H,s), 1.139 (3H,d,J = 5.9
4Hz), 0.769 (3H,s)
[Procedure amendment 6]
[Document name to be amended] Statement
[Correction target item name] 0027
[Correction method] Change
[Correction contents]
[0027]1H-NMR spectrum (270 MHz,
CDCl3 ,TMS standard,ppm) 5.796
(1H,s), 3.965 (1H, brd, J = 1.9)
8Hz), 3.632 (1H, dd, J = 2.96, 1)
0.88 Hz), 3.371 (1H, dd, J = 6.9)
2,10.88 Hz), 2.612 (1H, ddd, J
= 2.97, 2.97, 14.84 Hz), 2.415
(1H, dd, J = 2.97, 14.84 Hz), 2.
3-2.5 (m, 2H), 1.0-2.1 (m, 15
H), 1.194 (3H, s), 1.052 (3H,
d, J = 6.92 Hz), 0.740 (3H, s))