JP2003033171A - Method and apparatus for separating oocyte or egg cell - Google Patents
Method and apparatus for separating oocyte or egg cellInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は卵母細胞または卵細
胞を選別する装置及び方法に関する。また、特定の膜電
位を有する卵母細胞または卵細胞集団、及びこれらを販
売又は譲渡する方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an apparatus and method for selecting an oocyte or an egg cell. It also relates to an oocyte or egg cell population having a specific membrane potential, and a method for selling or transferring these.
【０００２】[0002]
【従来の技術】卵母細胞は、遺伝子、色素、蛋白、ペプ
チド、薬物等の試料を導入し、これらの作用の確認、遺
伝子機能の解析、遺伝子産物としての蛋白質の生産など
の目的で広く使用されている。従来の卵母細胞または卵
細胞を選別する基準は、主に卵母細胞または卵細胞の外
観である。たとえばアフリカツメガエル卵母細胞の選別
基準は、直径が1.2ｍｍ、真球形であること、黒面と白
面の境界が明瞭であること、斑点などがないこと、など
である。また選別作業そのものは顕微鏡下の手作業によ
るものであった。2. Description of the Related Art Oocytes are widely used for the purpose of introducing samples of genes, pigments, proteins, peptides, drugs, etc., for confirming their actions, analyzing gene functions, and producing proteins as gene products. Has been done. The traditional criteria for selecting an oocyte or egg cell is mainly the appearance of the oocyte or egg cell. For example, the selection criteria of Xenopus laevis oocytes are 1.2 mm in diameter, true spherical, clear boundary between black surface and white surface, no spots, etc. The sorting operation itself was a manual operation under a microscope.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】上記の外観による卵母
細胞または卵細胞の選別作業は、技術者個人の技量、熟
練度等によって、選別した卵母細胞または卵細胞の質が
変動するという問題があった。これは、選別基準があい
まいで客観化しにくいことが一因である。また上記の従
来技術では、選別した卵母細胞または卵細胞の格付けが
しにくく、生存率や受精率、遺伝子等の試料導入効率な
どが細胞ごとにばらつきがあった。また、生存率や受精
率、遺伝子導入効率などの親ごとの変動の是正は困難で
あった。その結果、生存率や受精率、遺伝子導入効率な
どのばらつきの少ない細胞の入手は偶然に頼っていた。
本発明は卵母細胞または卵細胞の選別基準を数値化する
ことを目的の一つとしている。The task of selecting oocytes or egg cells according to the above-mentioned appearance has a problem that the quality of the selected oocytes or egg cells varies depending on the skill and skill of the individual engineer. It was This is partly because the selection criteria are ambiguous and difficult to objectify. Further, in the above-mentioned conventional technique, it is difficult to rank the selected oocyte or egg cell, and the survival rate, the fertilization rate, the sample introduction efficiency of genes and the like vary from cell to cell. Moreover, it was difficult to correct the variation of each parent such as survival rate, fertilization rate, and gene transfer efficiency. As a result, they had to rely on the chance to obtain cells with little variation in survival rate, fertilization rate, gene transfer efficiency, etc.
One of the objects of the present invention is to quantify the selection criteria for oocytes or egg cells.
【０００４】さらに上記の従来技術では、選別した細胞
の情報を保存することへの配慮がされておらず、選別基
準の情報とその後の細胞反応との相関を得ることが困難
であった。従って本発明の目的はこれらの相関を得るこ
とにある。また、従来は卵母細胞を手作業で選別してい
たため、大量生産は不可能であった。従って本発明の他
の目的は、一定の基準で選別したことを保証した卵母細
胞または卵細胞を、生産・販売及び輸送することにあ
る。Further, in the above-mentioned prior art, no consideration was given to storing the information on the selected cells, and it was difficult to obtain the correlation between the information on the selection criteria and the subsequent cell reaction. Therefore, an object of the present invention is to obtain these correlations. Moreover, since oocytes were conventionally selected manually, mass production was impossible. Therefore, another object of the present invention is to produce, sell and transport oocytes or oocytes which are guaranteed to be selected according to a certain standard.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】本発明は上記課題を解決
するために、卵母細胞または卵細胞を選別するための計
測手段と、計測結果に基づいて前記卵母細胞または卵細
胞を選別する選別手段を有する卵母細胞または卵細胞の
選別装置及び方法を提供するものである。In order to solve the above problems, the present invention provides a measuring means for selecting an oocyte or an egg cell, and a selecting means for selecting the oocyte or the egg cell based on the measurement result. The present invention provides an oocyte or egg cell sorting apparatus and method having the following.
【０００６】すなわち本発明は、複数の卵母細胞または
卵細胞をフィルターなどにより一定の大きさの卵母細胞
を選別する方法または機構と、上記複数の卵母細胞また
は卵細胞の膜電位を計測して一定の膜電位を有するもの
を分別する方法または機構を提供する。これにより、一
定の質を有する卵母細胞または卵細胞を提供することが
可能になった。That is, the present invention provides a method or mechanism for selecting a plurality of oocytes or oocytes of a certain size by a filter or the like, and measuring the membrane potential of the plurality of oocytes or oocytes. Provided is a method or mechanism for fractionating those having a constant membrane potential. This has made it possible to provide oocytes or eggs with a certain quality.
【０００７】まず、本発明は、卵母細胞または卵細胞の
膜電位を計測する計測手段と、前記卵母細胞または卵細
胞を膜電位の計測結果に基づいて選別する選別手段を有
することを特徴とする卵母細胞または卵細胞の選別装置
を提供する。これにより、一定の膜電位を有する卵母細
胞または卵細胞を得ることが可能になった。First, the present invention is characterized by having a measuring means for measuring the membrane potential of an oocyte or an egg cell, and a selecting means for selecting the oocyte or the egg cell based on the measurement result of the membrane potential. An oocyte or egg cell sorting device is provided. This made it possible to obtain oocytes or eggs with a constant membrane potential.
【０００８】本発明者らはアフリカツメガエル卵母細胞
を始めとして種々の卵母細胞及び卵細胞の外観、すなわ
ち形状、黒面及び白面の境界の明瞭さ、斑点などの有無
と膜電位との間に相関があることを見出した。具体的に
は、真球形に近く、境界が明瞭であり、かつ斑点が見ら
れない正常な卵母細胞においては特定の範囲、例えば単
離直後に約−７０ｍＶに保たれている電位が、球形から
外れたり、境界が不明瞭になったりしている細胞、ある
いは斑点などがある細胞においては、その度合いに応じ
て浅く（膜電位の値が大きい、すなわち絶対値が小さ
く）なっていることを見出した。この知見を利用して、
膜電位を計測することにより選別時に外観を観察する作
業を省略することが可能になった。The present inventors have investigated the appearance of various oocytes, including Xenopus laevis oocytes, and the appearance of various oocytes, that is, the shape, the clearness of the boundaries between black and white surfaces, the presence or absence of spots, and the membrane potential. We found that there is a correlation. Specifically, in a normal oocyte that is close to a true sphere, has a clear boundary, and has no spots, a specific range, for example, a potential that is maintained at about −70 mV immediately after isolation is spherical. For cells that are deviated from the boundary or have unclear boundaries, or cells with spots, make sure that they are shallow (the membrane potential value is large, that is, the absolute value is small) depending on the degree. I found it. Utilizing this knowledge,
By measuring the membrane potential, it became possible to omit the work of observing the appearance during sorting.
【０００９】膜電位の計測手段は、細胞内電極法または
膜電位感受性色素法による膜電位計測手段とすることが
好ましい。ここで、膜電位感受性色素法とは、予め細胞
に色素を注入（染色）しておき、細胞の膜電位が変化す
るとこの色素により波長が変化するので、この波長を検
出する方法である。The membrane potential measuring means is preferably a membrane potential measuring means by an intracellular electrode method or a membrane potential sensitive dye method. Here, the membrane potential sensitive dye method is a method of previously injecting (staining) a dye into a cell and detecting the wavelength because the wavelength changes due to the dye when the membrane potential of the cell changes.
【００１０】ここで細胞内電極法とは、細胞膜の内外の
電位差を測定する方法であり、一方の電極を細胞膜の外
側に、他方の電極を細胞膜の内側におき、これらの電位
差を測定する方法である。この他方の電極については、
電極を０．１μｍから０．５ｍｍ程度細胞表面から挿入
する。更に、膜電位を計測する際に用いる容器の内側に
はアース用の金属がコーティングされていると、計測を
簡便かつ迅速に行うことができる。Here, the intracellular electrode method is a method for measuring the potential difference between the inside and outside of the cell membrane. One electrode is placed outside the cell membrane and the other electrode is placed inside the cell membrane, and the potential difference between these is measured. Is. For this other electrode,
An electrode is inserted from the cell surface of about 0.1 μm to 0.5 mm. Furthermore, when the inside of the container used for measuring the membrane potential is coated with a metal for grounding, the measurement can be performed easily and quickly.
【００１１】更に本発明者等は、卵母細胞に遺伝子を導
入した場合、導入前の卵母細胞の膜電位によって蛋白質
の機能発現効率が異なることを見出した。つまり、卵母
細胞間での蛋白質の機能発現効率のばらつきを抑えるた
めには、同じ膜電位を有する卵母細胞を選別することが
重要となる。本発明は、さらに特定の膜電位を有する卵
母細胞または卵母細胞を選択的に分取する手段を有する
上記卵母細胞または卵細胞の選別装置を提供する。これ
により、特定の膜電位を有する卵母細胞または卵細胞を
選別することが可能になった。Furthermore, the present inventors have found that when a gene is introduced into an oocyte, the functional expression efficiency of the protein differs depending on the membrane potential of the oocyte before the introduction. In other words, it is important to select oocytes having the same membrane potential in order to suppress variations in protein functional expression efficiency among oocytes. The present invention further provides the above-mentioned oocyte or egg cell sorting apparatus having means for selectively sorting an oocyte or an oocyte having a specific membrane potential. This has made it possible to sort out oocytes or eggs having a specific membrane potential.
【００１２】更に、本発明は、卵母細胞または卵細胞の
大きさを計測する計測手段と、前記卵母細胞または卵細
胞を大きさの計測結果に基づいて選別する選別手段を有
することを特徴とする卵母細胞または卵細胞の選別装置
を提供する。これにより、特定の大きさの卵母細胞また
は卵細胞のみを選別することが可能になった。この場
合、卵母細胞または卵細胞の膜電位を記憶するコントロ
ール部を設け、上記選別手段が上記コントロール部の情
報に基づいて選別するように構成することが好ましい。Furthermore, the present invention is characterized by having a measuring means for measuring the size of the oocyte or the egg cell, and a selecting means for selecting the oocyte or the egg cell based on the size measurement result. An oocyte or egg cell sorting device is provided. This made it possible to select only oocytes or oocytes of a specific size. In this case, it is preferable that a control unit that stores the membrane potential of the oocyte or the egg cell is provided, and that the selection unit performs the selection based on the information of the control unit.
【００１３】特定の大きさの卵母細胞または卵細胞を分
取するためには、一定の穴径を持つフィルターを用いる
ことが好ましい。卵母細胞の直径が約１．２ｍｍである
ことから、フィルターの穴径は１．４ｍｍ以下が好まし
い。フィルターは、穴の形状がハニカムでも良いし、円
でも良い。また、１．０ｍｍ以上１．４ｍｍ以下の穴径
のフィルターを複数用いて、所定範囲の直径の卵母細胞
または卵細胞を得るようにしても良い。In order to separate oocytes or egg cells of a specific size, it is preferable to use a filter having a constant pore size. Since the diameter of the oocyte is about 1.2 mm, the hole diameter of the filter is preferably 1.4 mm or less. The shape of the holes of the filter may be honeycomb or circular. Further, a plurality of filters having a hole diameter of 1.0 mm or more and 1.4 mm or less may be used to obtain an oocyte or an egg cell having a diameter within a predetermined range.
【００１４】更に本発明は、一定の大きさの卵母細胞ま
たは卵細胞を選別する手段と、上記卵母細胞または卵細
胞の膜電位を計測する手段を有することを特徴とする、
卵母細胞または卵細胞選別装置を提供する。これによ
り、大きさ及び膜電位の点で特定の範囲内にある卵母細
胞または卵細胞を選別することが可能となる。Further, the present invention is characterized by having means for selecting an oocyte or egg cell of a certain size, and means for measuring the membrane potential of the oocyte or egg cell.
An oocyte or egg cell sorting device is provided. This makes it possible to select oocytes or egg cells within a specific range in terms of size and membrane potential.
【００１５】更に本発明は、卵母細胞または卵細胞を収
容する開口部を有し、前記開口部の内側にアース用の金
属がコーティングされたことを特徴とする卵母細胞また
は卵細胞の膜電位計測用トレイを提供する。さらにまた
本発明は、卵母細胞または卵細胞を選別するための計測
工程を有する卵母細胞または卵細胞の選別方法を提供す
る。Furthermore, the present invention has an opening for accommodating an oocyte or an egg cell, and the inside of the opening is coated with a metal for grounding to measure the membrane potential of the oocyte or the egg cell. To provide a tray. Furthermore, the present invention provides an oocyte or a method for selecting an oocyte having a measuring step for selecting an oocyte or an oocyte.
【００１６】本発明の方法は、卵母細胞または卵細胞の
膜電位を計測する計測工程、または卵母細胞または卵細
胞の大きさを計測する工程、あるいはその双方の工程を
含む。これにより、特定の範囲の膜電位及び／または大
きさを有する卵母細胞または卵細胞のみを選別すること
ができる。The method of the present invention comprises a step of measuring the oocyte or the membrane potential of the egg cell, a step of measuring the size of the oocyte or the egg cell, or both steps. This makes it possible to select only oocytes or egg cells having a specific range of membrane potential and / or size.
【００１７】本発明の方法は、例えば、卵母細胞または
卵細胞を一定の穴径を持つフィルターを用い、一定の大
きさの卵母細胞または卵母細胞を選別する工程と、上記
卵母細胞または卵細胞の膜電位を計測する工程を有する
選別方法として提供することができる。更に本発明は、
選別時の卵母細胞または卵細胞の情報を保存し、その後
の細胞反応との相関を容易に導き出すことを可能にする
ものである。The method of the present invention comprises, for example, a step of selecting oocytes or oocytes of a predetermined size using an oocyte or a filter having a constant pore size, and the above-mentioned oocyte or It can be provided as a selection method having a step of measuring the membrane potential of egg cells. Further, the present invention is
The information of the oocyte or egg cell at the time of selection is preserved, and the correlation with the subsequent cell reaction can be easily derived.
【００１８】上記卵母細胞または卵細胞選別装置または
選別方法の発明により、本発明はさらに膜電位や細胞の
大きさが所定の範囲内にある卵母細胞または卵細胞集団
を提供する。すなわち本発明は、一定の膜電位を有する
ことを特徴とする選別された卵母細胞または卵細胞集団
を提供する。試料導入等の用途を考慮した場合、好適な
膜電位の範囲は、例えば−７０〜−４０ｍＶの範囲であ
る。この範囲の膜電位を有する卵母細胞または卵細胞で
あれば、例えば遺伝子を導入した場合、蛋白質発現効率
が高いことが期待される。本発明においては、好適な卵
母細胞または卵細胞として選別すべき基準をこのように
数値化することができ、予め設定された基準に合う卵母
細胞または卵細胞のみを選別することが可能である。更
に、設定基準を適宜設定することによって、生存率、受
精率、遺伝子導入効率、発現効率等の品質が非常に高い
卵母細胞または卵細胞からなる細胞集団から、上記品質
が非常に劣る細胞のみが除かれた細胞集団まで、得られ
る細胞集団の品質を適宜選択して提供することができ
る。According to the invention of the above-mentioned oocyte or egg cell sorting apparatus or sorting method, the present invention further provides an oocyte or egg cell population in which the membrane potential or the cell size is within a predetermined range. That is, the present invention provides a selected oocyte or egg cell population characterized by having a constant membrane potential. Considering applications such as sample introduction, a suitable membrane potential range is, for example, -70 to -40 mV. With an oocyte or egg cell having a membrane potential in this range, for example, when a gene is introduced, it is expected that the protein expression efficiency will be high. In the present invention, the standard to be selected as a suitable oocyte or egg cell can be quantified in this way, and it is possible to select only an oocyte or an egg cell that meets a preset standard. Furthermore, by appropriately setting the setting criteria, the survival rate, fertilization rate, gene transfer efficiency, from a cell population consisting of egg cells having a very high quality such as expression efficiency, only cells with a very poor quality as described above. The quality of the obtained cell population up to the removed cell population can be appropriately selected and provided.
【００１９】更に本発明においては、予め設定された基
準、すなわち一定の膜電位を有するという条件に合う卵
母細胞または卵細胞のみを選別した後、遺伝子等の試料
を導入した卵母細胞または卵細胞集団を提供することが
できる。従って、例えば−７０〜−４０ｍＶの範囲の膜
電位を有することを条件として選別した後、遺伝子を導
入した卵母細胞または卵細胞集団は、蛋白質発現効率が
高いことが期待される。さらに本発明は、一定の膜電位
を有する複数の卵母細胞または卵細胞をセットにするこ
とを特徴とする、複数の卵母細胞または卵細胞を販売又
は譲渡する方法を提供する。Further, in the present invention, an oocyte or an egg cell population into which a sample such as a gene has been introduced after selecting only an oocyte or an oocyte that meets a preset criterion, that is, a condition of having a constant membrane potential. Can be provided. Therefore, for example, the oocyte or egg cell population into which the gene has been introduced after selection under the condition that the membrane potential is in the range of -70 to -40 mV is expected to have high protein expression efficiency. Furthermore, the present invention provides a method for selling or transferring a plurality of oocytes or egg cells, which comprises setting a plurality of oocytes or egg cells having a constant membrane potential.
【００２０】更に本発明は、選別時の膜電位が一定であ
る複数の卵細胞または卵母細胞を容器に入れ、上記容器
に上記複数の卵母細胞または卵細胞の膜電位等の品質に
関する情報を、例えば情報を記したラベルの形で添付し
て卵母細胞または卵細胞を販売又は譲渡する方法を提供
する。膜電位に関する情報としては、容器に含まれる卵
母細胞または卵細胞の膜電位の範囲、計測の条件、計測
日時等を含むことができる。Further, the present invention puts a plurality of oocytes or oocytes having a constant membrane potential at the time of selection in a container, and puts information on the qualities such as the membrane potential of the plurality of oocytes or oocytes in the container, For example, a method for selling or transferring an oocyte or an egg cell is provided, which is attached in the form of a label with information. The information on the membrane potential can include the range of the membrane potential of the oocyte or egg cell contained in the container, the measurement conditions, the measurement date and time, and the like.
【００２１】更に本発明は、膜電位に関する品質を保証
して複数の卵母細胞または卵細胞を販売又は譲渡する方
法を提供する。よって、本発明により、客観的な基準に
より選別された複数の卵母細胞群または卵細胞群を、そ
れらの情報と共に得ることが可能になった。Furthermore, the present invention provides a method for selling or transferring a plurality of oocytes or oocytes with guaranteed quality related to the membrane potential. Therefore, according to the present invention, it becomes possible to obtain a plurality of oocyte groups or egg cell groups selected by objective criteria together with their information.
【００２２】更に本発明は、卵母細胞の膜電位を計測す
る工程と、前記卵母細胞を膜電位の計測結果に基づいて
選別し、複数の卵母細胞を得る工程と、前記複数の卵母
細胞に、実質的に等しい深度で試料を注入する工程とを
有することを特徴とする卵母細胞製造方法を提供する。Furthermore, the present invention further comprises the step of measuring the membrane potential of the oocyte, the step of selecting the oocyte based on the measurement result of the membrane potential to obtain a plurality of oocytes, and the plurality of eggs. And a step of injecting a sample into the mother cells at substantially equal depths.
【００２３】[0023]
【発明の実施の形態】以下に、図面を参照しながら本発
明を更に説明する。The present invention will be further described below with reference to the drawings.
【００２４】図１に、この方法の原理を示す。ここでは
アフリカツメガエル卵母細胞での例を示すが、必ずしも
アフリカツメガエル卵母細胞に限定するものではない。FIG. 1 shows the principle of this method. Here, an example of Xenopus oocytes is shown, but it is not necessarily limited to Xenopus oocytes.
【００２５】アフリカツメガエル卵母細胞を母体より摘
出し、一つずつ単離するための酵素（コラゲナーゼ等）
処理を行う。その後、適当な溶液で卵母細胞を洗浄す
る。その後、細胞の膜電位を計測する。アフリカツメガ
エル卵母細胞の場合、酵素処理直後（酵素処理から約２
時間後）の膜電位は0〜-70mVの間である。これらのう
ち、膜電位が-10ｍV以上のものは、細胞表面に顕著なし
みがあったり、黒面と白面の境界があいまいであったり
する（図１)。また、膜電位が-20ｍV〜-40mVのものには
形が真球でないものが多く含まれる(図１)。つまり、膜
電位を計測することにより、目視による観察なしに目的
の形状の卵母細胞を得ることができる。Enzymes (collagenase etc.) for extracting Xenopus oocytes from the mother and isolating them one by one
Perform processing. Then, the oocytes are washed with an appropriate solution. Then, the membrane potential of the cell is measured. In the case of Xenopus oocytes, immediately after enzyme treatment (about 2 minutes after enzyme treatment)
After time) the membrane potential is between 0 and -70 mV. Among these, those with a membrane potential of -10 mV or more have marked stains on the cell surface, or the boundary between the black surface and the white surface is ambiguous (Fig. 1). In addition, those having a membrane potential of -20 mV to -40 mV often include those having a non-spherical shape (Fig. 1). That is, by measuring the membrane potential, an oocyte having a desired shape can be obtained without visual observation.
【００２６】また、図２に示すように、例えばアフリカ
ツメガエルの卵母細胞の場合、酵素処理直後の膜電位と
その後の細胞の生存率には相関がある。酵素処理直後の
膜電位が-20ｍV以下のものの、酵素処理後24時間後の生
存率は0％である。以降４日後までの間、酵素処理直後
の膜電位が深いもの（膜電位が小さいもの、すなわち絶
対値が大きいもの）ほど生存率が高くなる。すなわち、
酵素処理直後の膜電位を指標に細胞の生存率を求めるこ
とができる。As shown in FIG. 2, in the case of Xenopus oocytes, for example, there is a correlation between the membrane potential immediately after enzyme treatment and the cell survival rate thereafter. Although the membrane potential immediately after the enzyme treatment was -20 mV or less, the survival rate 24 hours after the enzyme treatment was 0%. During the subsequent 4 days, the survival rate becomes higher as the membrane potential becomes deeper immediately after the enzyme treatment (the membrane potential is smaller, that is, the absolute value is larger). That is,
The cell viability can be determined using the membrane potential immediately after the enzyme treatment as an index.
【００２７】続いて、卵母細胞に試料を注入した例につ
いて説明する。導入する試料としては、遺伝子、色素、
蛋白、ペプチド、薬物等が挙げられる。尚、遺伝子の注
入の場合には、cDNA、cRNA、DNA、RNA、合成したオリゴ
ヌクレオチド等が挙げられる。この試料の注入は、ピペ
ット等の針を用いて行われる。Next, an example of injecting a sample into an oocyte will be described. Samples to be introduced include genes, dyes,
Examples include proteins, peptides and drugs. In the case of gene injection, cDNA, cRNA, DNA, RNA, synthetic oligonucleotides, etc. may be mentioned. The injection of this sample is performed using a needle such as a pipette.
【００２８】また図３に示すように、例えばアフリカツ
メガエルの卵母細胞の場合、酵素処理直後の膜電位と遺
伝子導入による蛋白質機能発現率には相関がある。ここ
で蛋白質機能発現率が高いほど電流変化量は大きい。な
お、ここではアフリカツメガエル卵母細胞にヒスタミン
受容体遺伝子を導入し、ヒスタミン反応を計測した結果
を例とするが、必ずしもヒスタミン受容体遺伝子やヒス
タミン反応に限定されるべきものではない。ヒスタミン
受容体遺伝子導入後、3日間培養した細胞を1μMヒスタ
ミンにて刺激し、その電気的反応を計測すると、酵素処
理直後の膜電位が深いものほど電気的反応が大きい。す
なわち、酵素処理直後の膜電位を指標に、一定の蛋白質
機能発現量の細胞を選別することができる。このように
して蛋白がほぼ均等に発現した細胞を複数得ることによ
り、これらの複数の卵母細胞各々に異なるリガンド等を
反応させることでその結果を比較して、高精度にスクリ
ーニングを行うことが可能となる。Further, as shown in FIG. 3, in the case of Xenopus oocytes, for example, there is a correlation between the membrane potential immediately after enzyme treatment and the protein function expression rate by gene transfer. Here, the higher the protein function expression rate, the larger the current change amount. In addition, here, an example is shown in which the histamine receptor gene is introduced into Xenopus oocytes and the histamine reaction is measured, but the present invention is not necessarily limited to the histamine receptor gene and the histamine reaction. After the introduction of the histamine receptor gene, cells cultured for 3 days were stimulated with 1 μM histamine, and the electrical response was measured. The deeper the membrane potential immediately after the enzyme treatment, the greater the electrical response. That is, cells having a certain protein function expression level can be selected using the membrane potential immediately after enzyme treatment as an index. In this way, by obtaining a plurality of cells in which the protein is almost evenly expressed, by reacting different ligands or the like with each of these plurality of oocytes, the results are compared, and highly accurate screening can be performed. It will be possible.
【００２９】さらに、この原理を元に卵母細胞または卵
細胞を選別する装置を作製することができる。ここでは
アフリカツメガエル卵母細胞を選別するための装置につ
いて図４に基づいて記述するが、本装置構成はアフリカ
ツメガエル卵母細胞選別に限定されるべきものではな
い。酵素処理直後のアフリカツメガエル卵母細胞群1の中
には完全に単離されていないものも多く含まれる。そこ
で例えば直径1ｍｍのハニカム構造を有するフィルター2
にて細胞群をろ過することによって、まず細胞を特定の
大きさの細胞を選別する。この際、適度な圧力をかける
ことにより、スピードアップを図ることができる。単離
した細胞を25°〜90°の傾斜を有し、楔形または半球で
半径が1〜2ｍｍの水路3に流す。この水路には緩衝液を満
たす。緩衝液の構成は、例えば以下の組成のものを好適
に使用することができる。この溶液のｐＨは７．５であ
る。
NaCl ９６ｍＭ
KCl ２ｍＭ
CaCl2 １．８ｍＭ
MgCl2 １ｍＭ
HEPES ５ｍＭ
硫酸ゲンタマイシン ５０μｇ／ｍｌ
ピルビン酸ナトリウム ２．５ｍＭ
ペニシリン １０Ｕ／ｍｌ
ストレプトマイシン １０μｇ／ｍｌFurthermore, an apparatus for selecting oocytes or egg cells can be produced based on this principle. Here, an apparatus for selecting Xenopus oocytes is described based on FIG. 4, but the configuration of this apparatus should not be limited to Xenopus oocyte selection. Many Xenopus oocyte groups 1 immediately after enzyme treatment include many that have not been completely isolated. Therefore, for example, a filter 2 having a honeycomb structure with a diameter of 1 mm
First, cells having a specific size are selected by filtering the cell group with. At this time, speed can be increased by applying an appropriate pressure. The isolated cells are flowed into a water channel 3 having a 25 ° -90 ° inclination, a wedge or hemisphere and a radius of 1-2 mm. This channel is filled with buffer solution. As for the constitution of the buffer solution, for example, those having the following compositions can be preferably used. The pH of this solution is 7.5. NaCl 96 mM KCl 2 mM CaCl 2 1.8 mM MgCl 2 1 mM HEPES 5 mM Gentamicin sulfate 50 μg / ml Sodium pyruvate 2.5 mM Penicillin 10 U / ml Streptomycin 10 μg / ml
【００３０】水路の途中に卵母細胞を保持し、その状態
で膜電位を計測するための歯車4を設ける。予め歯車4の
内側にはアース用金属をコーティングしておく。ここで
は膜電位の測定する際に用いる容器が歯車としても機能
するものとなっているが、特に限定するものではない。
図５に１個の卵母細胞または卵細胞を含有する容器の内
側に金属コーティングした構成について拡大して示す。A gear 4 for holding an oocyte in the waterway and measuring the membrane potential in that state is provided. The inside of the gear 4 is coated beforehand with a metal for grounding. Here, the container used when measuring the membrane potential also functions as a gear, but it is not particularly limited.
FIG. 5 shows an enlarged view of the structure in which the inside of a container containing one oocyte or an egg cell is metal-coated.
【００３１】歯車4は定点で回転を止め、垂直方向から3
M KClを満たしたガラス電極5を刺すことにより、細胞
の膜電位を計測する。水路6に設けた弁7を予め入力して
おいた膜電位基準によって開閉し、膜電位基準を満たす
細胞8と、そうでない細胞9を別々の水路10に流す。この
ようにして膜電位基準を満たす細胞8のみを分取する。The gear 4 stops rotating at a fixed point and is rotated from the vertical direction to 3
The cell membrane potential is measured by piercing the glass electrode 5 filled with M KCl. The valve 7 provided in the water channel 6 is opened and closed according to the membrane potential reference that has been input in advance, and the cells 8 that satisfy the membrane potential reference and the cells 9 that do not flow into the different water channels 10. In this way, only cells 8 satisfying the membrane potential standard are sorted.
【００３２】膜電位を計測する手段としてガラス電極5
を例としているが、このような情報を得るために必要な
手段は、ガラス電極法に限定されるものではない。例え
ば、膜電位感受性色素、金属電極により、これらの情報
を基に細胞の膜電位を計測することができる。A glass electrode 5 is used as a means for measuring the membrane potential.
However, the means necessary for obtaining such information is not limited to the glass electrode method. For example, a membrane potential sensitive dye or a metal electrode can be used to measure the cell membrane potential based on these information.
【００３３】本発明の装置の別の例として、図６に示す
例を挙げることができる。本実施例においては、卵母細
胞または卵細胞は各々複数のウェルを有するプレートの
各ウェルに１個ずつ入れられ、各ウェルはアドレス情報
によって特定することが可能である。個々の卵母細胞ま
たは卵細胞について膜電位を計測した後、その情報は該
細胞が位置するアドレス情報と共にコンピュータ（コン
トロール部）に記録することができる。予め設定した膜
電位基準を満たす細胞は、その後、または計測直後に、
記録された情報に基づき、例えばポンプ等を使用して分
取される。Another example of the device of the present invention is shown in FIG. In this example, one oocyte or egg cell is placed in each well of a plate having a plurality of wells, and each well can be specified by address information. After measuring the membrane potential of an individual oocyte or egg cell, the information can be recorded in a computer (control section) together with the address information at which the cell is located. Cells that meet the preset membrane potential criteria are then, or immediately after measurement,
Based on the recorded information, it is sorted using, for example, a pump.
【００３４】本発明の方法および装置を使用することに
より、客観的な選別基準を有する複数の卵母細胞または
卵細胞を販売又は譲渡することが初めて可能になったの
である。従って別の観点において、本発明は特定の選別
基準が保証された卵母細胞または卵細胞を提供する。ま
た、特定の膜電位を有する卵母細胞または卵細胞のみを
収集し、販売又は譲渡することができる。販売又は譲渡
の際には、複数個の卵母細胞をパッケージングし、膜電
位に関する条件等の情報を記載したラベルを付すことが
できる。The use of the method and apparatus of the present invention makes it possible for the first time to sell or transfer a plurality of oocytes or egg cells having objective selection criteria. Therefore, in another aspect, the present invention provides an oocyte or egg cell in which a specific selection criterion is guaranteed. Also, only oocytes or egg cells having a specific membrane potential can be collected, sold, or transferred. At the time of sale or transfer, a plurality of oocytes can be packaged and labeled with information such as conditions regarding membrane potential.
【００３５】図７に、選別工程をとらないアフリカツメ
ガエル卵母細胞集団の場合における静止膜電位の分布を
示す。上記したように、アフリカツメガエル卵母細胞の
場合、酵素処理直後の膜電位は0〜-70mVの間であるが、
膜電位が-55mV以下(-60)、-55〜-45mV(-50)、-45〜-35mV
(-40)、-35〜-25mV(-30)、-25〜-15mV(-20)、及び-15mVを
超えるもの(-10)に分けてその全集団に占める割合を算
出した結果、それぞれ約２６％、約２０％、約１５％、
約１０％、約６％、約２２％であった。この分布は、細
胞の種類や採取条件によっても変動するが、選別基準と
なる膜電位の範囲を設定することによって、細胞集団か
らどの程度の割合で細胞が選別され得るかが理解され
る。図７から明らかなように、選別基準を高くすれば、
品質が非常に高い細胞のみが得られるものの、得られる
細胞数は少なくなり、販売を考慮した場合には価格が非
常に高いものとならざるを得ない。一方、選別基準をよ
り低く設定した場合には、選別される細胞群の品質の幅
が広くなるものの、細胞数が比較的多くなるため、価格
を低く設定することも可能となる。FIG. 7 shows the distribution of the resting membrane potential in the case of a population of Xenopus oocytes that does not undergo the sorting step. As described above, in the case of Xenopus oocytes, the membrane potential immediately after enzyme treatment is between 0 and -70 mV,
Membrane potential is -55 mV or less (-60), -55 to -45 mV (-50), -45 to -35 mV
(-40), -35 to -25 mV (-30), -25 to -15 mV (-20), and those exceeding -15 mV (-10) were divided into the total population, and the results were calculated. About 26%, about 20%, about 15%,
It was about 10%, about 6%, and about 22%. This distribution varies depending on the type of cells and the collection conditions, but it is understood by setting the range of the membrane potential that serves as a selection criterion, at what rate the cells can be selected from the cell population. As is clear from FIG. 7, if the selection criterion is increased,
Although only cells of very high quality can be obtained, the number of cells obtained is small, and the price is inevitably high in consideration of sales. On the other hand, when the selection standard is set lower, the quality of the selected cell group is wide, but the number of cells is relatively large, so that the price can be set low.
【００３６】次に、本発明に係る膜電位を計測した卵母
細胞または卵細胞を輸送する方法について、図８に従っ
て記載する。上記の卵母細胞を販売・輸送する際には、
該当する生物の卵母細胞または卵細胞用に通常使用され
る緩衝液に、例えば硫酸ゲンタマイシン、ペニシリン、
ストレプトマイシン等の抗生物質を加えた溶液を満たし
た容器11に卵母細胞または卵細胞12を入れ、発泡スチロ
ール等の梱包材13を使用し、衝撃を避けながら、輸送す
ることが好ましい。Next, the method for transporting an oocyte or egg cell whose membrane potential has been measured according to the present invention will be described with reference to FIG. When selling and shipping the above oocytes,
Buffers commonly used for oocytes or egg cells of the organism of interest, such as gentamicin sulfate, penicillin,
It is preferable to put the oocytes or the egg cells 12 in a container 11 filled with a solution containing an antibiotic such as streptomycin, use a packing material 13 such as styrofoam, and transport while avoiding an impact.
【００３７】販売・輸送のために好適な容器としては、
容器11内で細胞が比較的自由に移動でき、開閉できる蓋
のある密閉可能なものであれば特に限定されるものでは
なく、その容積の９割５分程度まで上記の溶液を満たす
ことが好ましい。例えば50mlのコニカルチューブの場合
には、約100〜200個の細胞、好ましくは約130〜180個の
細胞を入れることが好ましい。この割合は細胞１個に対
して約0.3〜0.5ml程度に相当するが、細胞の種類、容器
の種類等によって変動し得る。Suitable containers for sale / transport include:
It is not particularly limited as long as cells can be relatively freely moved in the container 11 and can be opened and closed with a lid, and it is preferable to fill the above solution up to about 90% of its volume. . For example, in the case of a 50 ml conical tube, it is preferable to put about 100 to 200 cells, preferably about 130 to 180 cells. This ratio corresponds to about 0.3 to 0.5 ml per cell, but can vary depending on the type of cell, the type of container, and the like.
【００３８】この方法により卵母細胞または卵細胞の機
能を損なうことなく購入先まで運搬することができる。
また、販売・譲渡の際には選別時の膜電位の情報を一緒
に提供する。その方法としては例えばそれらの情報を記
載した紙面を添付またはラベルを複数の卵母細胞を有す
る容器11に添付すること等がある。[0038] By this method, it is possible to carry to the purchaser without impairing the function of the oocyte or the egg cell.
Also, when selling or transferring, information on the membrane potential at the time of selection is also provided. As a method for this, for example, a paper surface describing the information is attached or a label is attached to the container 11 having a plurality of oocytes.
【００３９】卵母細胞または卵細胞の膜電位は、単離直
後から時間が経過するにつれて、次第に浅くなり、それ
と共に試料導入などの種々の用途に適さないものとなっ
ていくことが判明している。具体的には、細胞の膜電位
の平均値を算出したところ、以下の表１に示すような傾
向が見られた。尚、４日目以降は死んだ細胞も多く見ら
れ、生存している細胞のみで算出した。It has been found that the membrane potential of the oocyte or egg cell becomes gradually shallower as time elapses immediately after isolation, and at the same time, becomes unsuitable for various uses such as sample introduction. . Specifically, when the average value of the cell membrane potential was calculated, the tendencies shown in Table 1 below were observed. In addition, many dead cells were observed on and after the 4th day, and the calculation was performed using only the surviving cells.
【００４０】[0040]
【表１】 [Table 1]
【００４１】このように、膜電位は時間が経過すると共
に変化することから、酵素処理から２４時間以内、好ま
しくは１２時間以内に膜電位を測定すると良い。従っ
て、アフリカツメガエル卵母細胞に遺伝子を導入する場
合には、酵素処理後40時間まで、特に36時間までの導入
が望ましい。それに対応して導入が有効である期間を明
示するために「○月○日までの使用が望ましい」等の記
載をすることが好ましい。Since the membrane potential changes with the passage of time as described above, it is advisable to measure the membrane potential within 24 hours, preferably within 12 hours after the enzyme treatment. Therefore, when the gene is introduced into Xenopus oocytes, it is desirable to introduce the gene up to 40 hours, especially up to 36 hours after the enzyme treatment. Correspondingly, in order to clearly indicate the period during which the introduction is effective, it is preferable to make a description such as "use by xx month is desirable".
【００４２】次に、膜電位計測後の卵母細胞に引き続き
自動注入装置を用いて試料を注入する例を、図面を参照
しながら説明する。Next, an example of injecting a sample into an oocyte after measurement of the membrane potential using an automatic injection device will be described with reference to the drawings.
【００４３】図９に示す自動注入装置において、卵母細
胞を整列配置させるトレイは、例えば水平方向に12個、
直行方向に8個の計96個の深さ及び形状が均一な穴の開
いたトレイが使用できるが、トレイの穴数は必ずしも96
個には限定しない。卵母細胞を整列させるための穴の形
状は、底面が円形の平面であって底面から開口部までの
底面に平行な断面形状が一定である円筒形、又は底部が
円錐形の形が好ましい。上記穴の開口部の直径は、用い
る卵母細胞の直径以上である必要がある。また生理食塩
水等を満たした上記穴中で卵母細胞が回転できる程度の
余地があることが望ましく、具体的には用いる卵母細胞
直径の１０５−１５０％を穴の最大直径とすることが望
ましい。例えばアフリカツメガエルの卵母細胞の直径が
約1.3mm程度であることから、穴の直径を1.4〜2mm程度
とすることにより、細胞を傷つけることなく、特定の方
向に固定することが可能になる。In the automatic injection device shown in FIG. 9, the trays for arranging the oocytes in an array are, for example, 12 trays in the horizontal direction,
A total of 96 trays with holes of uniform depth and shape can be used, but the number of tray holes is not necessarily 96.
Not limited to individual pieces. The shape of the holes for aligning the oocytes is preferably a cylindrical shape having a circular bottom surface and a constant cross-sectional shape parallel to the bottom surface from the bottom surface to the opening, or a shape having a conical bottom portion. The diameter of the opening of the hole must be equal to or larger than the diameter of the oocyte used. Further, it is desirable that there is room for the oocyte to rotate in the hole filled with physiological saline or the like, and specifically, 105-150% of the diameter of the oocyte used is the maximum diameter of the hole. desirable. For example, since the diameter of oocytes of Xenopus laevis is about 1.3 mm, setting the diameter of the hole to about 1.4 to 2 mm makes it possible to fix the cells in a specific direction without damaging them.
【００４４】遺伝子等の試料を導入するための針は、ピ
ペット様の針であることが好ましいが、特に限定するも
のではない。また、卵母細胞の向き等の細胞情報を収得
するためにデジタルカメラ28を、導入針26が卵母細胞表
面が接触したことを検知するための手段として、CCDカ
メラ27を通した視覚情報を例としているが、これらの情
報を得るために必要な手段はデジタルカメラ28やCCDカ
メラ27に限定されるものではない。例えば、圧力、温
度、電気、湿度、ｐＨ等の変化を感知するセンサーを導
入装置にとりつけることで、これらの情報を基に細胞表
面を検知することができる。The needle for introducing a sample such as a gene is preferably a pipette-like needle, but is not particularly limited. Further, a digital camera 28 for acquiring cell information such as the orientation of the oocyte, visual information through the CCD camera 27 as a means for detecting that the introduction needle 26 has contacted the surface of the oocyte. As an example, the means necessary for obtaining this information are not limited to the digital camera 28 and the CCD camera 27. For example, a cell surface can be detected based on such information by attaching a sensor that detects changes in pressure, temperature, electricity, humidity, pH, etc. to the introduction device.
【００４５】トレイ29の穴に膜電位計測後で試料導入前
の卵母細胞を並べ、トレイ29に生理食塩水34を満たした
後、直交移動台31と水平移動台32の上に設置する。この
直交移動台31と水平移動台32の移動を制御装置21により
Ｘ軸方向及びＹ軸方向に制御することによって、導入針
26から試料を導入する卵母細胞33の位置を決定すること
が好ましいが、図９の構成と逆に、トレイ29を固定し、
導入針26を移動可能な構成とすることもできる。トレイ
29が破線の位置にあるとき、デジタルカメラ28で卵母細
胞を撮影し、制御装置21にその撮影データを送ることに
より、卵母細胞の良否及び向きなどの情報を蓄積するこ
とができる。After the membrane potential is measured and before the sample is introduced into the holes of the tray 29, the oocytes are lined up, the tray 29 is filled with the physiological saline 34, and then the tray 29 is placed on the orthogonal moving table 31 and the horizontal moving table 32. By controlling the movements of the orthogonal moving table 31 and the horizontal moving table 32 in the X-axis direction and the Y-axis direction by the control device 21, the introduction needle is introduced.
It is preferable to determine the position of the oocyte 33 into which the sample is introduced from 26, but conversely to the configuration of FIG. 9, the tray 29 is fixed,
The introduction needle 26 may be movable. tray
When 29 is at the position of the broken line, the digital camera 28 captures an image of the oocyte, and by sending the captured data to the control device 21, information such as the quality and orientation of the oocyte can be accumulated.
【００４６】水平移動台32と直交移動台31を制御装置21
の指示で動作し、トレイ29に並べられた卵母細胞のうち
所定の位置にある最初の卵母細胞33の中心を遺伝子導入
針26の下方位置に移動する。ここで導入針のＺ軸方向の
移動のために導入針移動台24が制御装置21の指示で動作
し、導入装置25に装着された導入針26の先端を卵母細胞
の表面よりわずかに離れた位置、例えば数100mm手前ま
で下降させる。ここで、CCDカメラ27で撮影された画像
をモニター23で観察しながら、制御補助装置22で指令を
出し、導入針移動台24を低速で下降させる。視覚情報、
圧力変化、温度変化、電気変化、湿度変化、pH変化等で
卵母細胞33の表面に導入針26の先端が接触したことを検
知し、この位置で導入針移動台24を止める。この位置が
以降の遺伝子導入操作の基準点となる。この位置を制御
装置21に記憶させ、以下の操作を実施する。すなわち、
上記基準点から試料を導入する位置までの、トレイの置
かれている面に対して垂直方向の導入針の移動距離、深
度を設定し、上記設定された深度で導入針26を刺入して
試料を一定量吐出させる。試料導入のためには、例えば
上記の卵母細胞33表面に導入針26が接触した位置から0.
2mm下方に導入針を下げるといったＺ軸制御を行うこと
ができる。細胞への導入針26の最適な導入深度は、導入
する試料の種類や導入の目的により異なり、適宜設定す
ることができる。試料は導入深度が浅すぎると細胞中に
広がらず、又深すぎると核を傷つけたり細胞を傷める確
率が高くなる。よって、試料の導入にはほぼ一定の深度
に導入することが発現効率の点からも望ましい。例え
ば、細胞質内にmRNAを導入し、蛋白質を発現させたい場
合には、細胞表面から0.02〜0.1mmの深度に針を刺入す
ることが望ましい。一方、核内にDNAを導入し、蛋白質
を発現させたい場合には、細胞表面から0.05〜0.2mmの
深度に針を刺入することが望ましい。但し、導入時に卵
母細胞の形状が針の接触によりわずかにゆがむため、実
際には設定した深度よりも浅い位置に試料が導入され
る。試料導入のための時間は、細胞への注入量等に応じ
て、針が細胞内に注入されている時間を設定することに
より制御する。尚、導入効率を更に向上させるために、
導入針26は複数個にすることもできる。この場合、装置
の駆動部は、導入針とトレイの相対的位置を１次元又は
２次元方向に移動させることで十分とすることもでき
る。The horizontal moving table 32 and the orthogonal moving table 31 are controlled by the control device 21.
Of the oocytes arranged on the tray 29, the center of the first oocyte 33 at a predetermined position is moved to the position below the gene introduction needle 26. Here, in order to move the introduction needle in the Z-axis direction, the introduction needle moving table 24 operates according to the instruction of the control device 21, and the tip of the introduction needle 26 attached to the introduction device 25 is slightly separated from the surface of the oocyte. Position, for example, a few hundred mm before. Here, while observing the image captured by the CCD camera 27 on the monitor 23, the control auxiliary device 22 issues a command to lower the introduction needle moving table 24 at a low speed. Visual information,
The contact of the tip of the introduction needle 26 with the surface of the oocyte 33 due to pressure change, temperature change, electric change, humidity change, pH change, etc. is detected, and the introduction needle moving table 24 is stopped at this position. This position serves as a reference point for the subsequent gene introduction operation. This position is stored in the control device 21, and the following operation is performed. That is,
From the reference point to the position for introducing the sample, the moving distance of the introducing needle in the direction perpendicular to the surface on which the tray is placed, the depth is set, and the introducing needle 26 is inserted at the set depth. Discharge a fixed amount of sample. For sample introduction, for example, from the position where the introduction needle 26 contacts the surface of the oocyte 33 described above, 0.
It is possible to perform Z-axis control by lowering the introduction needle 2 mm downward. The optimum introduction depth of the introduction needle 26 into the cell varies depending on the type of the sample to be introduced and the purpose of introduction, and can be set appropriately. If the sample is introduced too shallowly, it will not spread into the cells, and if it is too deep, the probability of damaging the nucleus or cells will be high. Therefore, from the viewpoint of expression efficiency, it is desirable to introduce the sample at a substantially constant depth. For example, when it is desired to introduce mRNA into the cytoplasm and express a protein, it is desirable to insert a needle at a depth of 0.02 to 0.1 mm from the cell surface. On the other hand, when it is desired to introduce DNA into the nucleus and express a protein, it is desirable to insert a needle at a depth of 0.05 to 0.2 mm from the cell surface. However, since the shape of the oocyte is slightly distorted due to the contact of the needle during the introduction, the sample is actually introduced at a position shallower than the set depth. The time for introducing the sample is controlled by setting the time during which the needle is injected into the cells according to the amount of injection into the cells and the like. In order to further improve the introduction efficiency,
There can be a plurality of introducing needles 26. In this case, it may be sufficient for the drive unit of the apparatus to move the relative position of the introducing needle and the tray in one-dimensional or two-dimensional directions.
【００４７】この後、最初の卵母細胞の3次元的な位置
情報を基に、自動制御によりトレイ29内の二つ目以降の
任意の数の卵母細胞に、指示された時間と速度及び導入
深度で試料を自動的に導入する。また、卵母細胞の大き
さにばらつきがある場合があるため、導入の都度表面位
置検出を行う機能も備えさせることもできる。また、卵
母細胞の細胞情報をコンピュータに記憶させ、必要時に
それを引き出すこともできる。After this, based on the three-dimensional position information of the first oocyte, automatic control is performed on the second and subsequent arbitrary numbers of oocytes in the tray 29 to indicate the designated time, velocity and The sample is automatically introduced at the introduction depth. In addition, since the size of the oocyte may vary, a function of detecting the surface position each time it is introduced can be provided. It is also possible to store the cell information of the oocyte in a computer and retrieve it when needed.
【００４８】更に、試料導入時の上記導入針26及び卵母
細胞33の動きや、導入時の卵母細胞の視覚情報等をコン
ピュータに記憶させ、導入操作終了後に試料導入位置、
深度、細胞の特徴等を読み出すように設定することもで
きる。この場合、各卵母細胞に関する視覚情報は番号を
付す等することによって上記トレイ上の位置と関連付け
て行うことが望ましい。Furthermore, the movement of the introduction needle 26 and the oocyte 33 at the time of introducing the sample, the visual information of the oocyte at the time of introduction, etc. are stored in the computer, and after the introduction operation, the sample introduction position,
It is also possible to set to read out the depth, the characteristics of cells and the like. In this case, it is desirable that the visual information relating to each oocyte be associated with the position on the tray by giving a number or the like.
【００４９】上記の構成の装置を使用することにより、
卵母細胞の特定位置及び深度に試料を導入することがで
き、導入された試料の機能発現効率（導入効率）がほぼ
同品質の卵母細胞を、迅速に、かつ大量に生産すること
ができる。従って、本発明は、本発明の装置を使用して
所定範囲の膜電位を有する卵母細胞の特定の位置及び深
度に試料を導入する方法も提供する。By using the apparatus having the above structure,
A sample can be introduced into a specific position and depth of an oocyte, and an oocyte with substantially the same function expression efficiency (introduction efficiency) of the introduced sample can be rapidly and mass-produced. . Therefore, the present invention also provides a method for introducing a sample into a specific position and depth of an oocyte having a membrane potential in a predetermined range by using the device of the present invention.
【００５０】従って、上記自動注入装置を使用すること
により、操作者の技量に依存することなく、約80〜90％
の導入効率が達成され、所定範囲の膜電位を有すると共
に試料導入条件の制御された複数の卵母細胞を販売又は
譲渡することが可能になるのである。従って別の観点に
おいて、本発明は所定範囲の膜電位を有すると共に、特
定の位置及び深度への試料の導入が保証された両生類卵
母細胞を提供する。Therefore, by using the above automatic injection device, it is possible to obtain about 80-90% without depending on the skill of the operator.
It is possible to sell or transfer a plurality of oocytes having a membrane potential within a predetermined range and having controlled sample introduction conditions. Thus, in another aspect, the invention provides amphibian oocytes that have a range of membrane potentials and that are guaranteed to introduce a sample at a particular location and depth.
【００５１】このような自動注入装置を用いて試料を注
入すると、所定範囲の膜電位を有する卵母細胞に、ほぼ
均等な条件で試料を注入しているため、特に、蛋白発現
量等がほぼ均等な卵母細胞集団が得られることとなる。
これは、ほとんど均質な卵母細胞集団であるため、特に
スクリーニングに有用である。When a sample is injected using such an automatic injection device, the sample is injected under substantially equal conditions into oocytes having a membrane potential within a predetermined range. An even population of oocytes will be obtained.
This is particularly useful for screening as it is an almost homogeneous population of oocytes.
【００５２】[0052]
【発明の効果】本発明により、客観的な選別基準を有す
る卵母細胞または卵細胞を得ることができる。また細胞
の選別基準を情報として保存しておくことにより、生存
率や受精率、遺伝子導入効率などとの相関を得ることが
できる。また本発明の方法によって得られた、特定の膜
電位を有する卵母細胞または卵細胞のみを回収し、販売
又は譲渡することが可能である。INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, an oocyte or egg cell having an objective selection criterion can be obtained. By storing the cell selection criteria as information, it is possible to obtain a correlation with the survival rate, fertilization rate, gene transfer efficiency, or the like. Further, it is possible to collect, sell, or transfer only the oocytes or egg cells having a specific membrane potential obtained by the method of the present invention.
【図１】膜電位と細胞の形状の関係を示す。FIG. 1 shows the relationship between membrane potential and cell shape.
【図２】膜電位と細胞の生存率の関係を示す。FIG. 2 shows the relationship between membrane potential and cell viability.
【図３】膜電位と細胞反応の一例を示す。FIG. 3 shows an example of membrane potential and cell reaction.
【図４】本発明の装置の一例を示す。FIG. 4 shows an example of the device of the present invention.
【図５】卵母細胞または卵細胞を含有する容器の内側に
金属コーティングした構成の一例を拡大して示す。FIG. 5 is an enlarged view showing an example of a structure in which a container containing an oocyte or an egg cell is metal-coated inside.
【図６】本発明の装置の別の一例を示す。FIG. 6 shows another example of the device of the present invention.
【図７】選別していない卵母細胞集団における特定の膜
電位を有する細胞の割合を示す。FIG. 7 shows the percentage of cells with a specific membrane potential in the unsorted oocyte population.
【図８】卵母細胞または卵細胞の輸送方法を示す。FIG. 8 shows a method for transporting an oocyte or an egg cell.
【図９】本発明に使用する自動注入装置の一例を示す。FIG. 9 shows an example of an automatic injection device used in the present invention.
1：卵母細胞群、2：フィルター、3：水路、4：歯車、
5：ガラス電極、6：水路、7：弁、8：基準を満たす細
胞、9：基準を満たさない細胞、10：水路、11：容器、1
2：卵母細胞または卵細胞群、13：梱包材、21：制御装
置、22：制御補助装置、23：モニター、24：導入針移動
台、25：導入装置、26：導入針、27：CCDカメラ、28：
デジタルカメラ、29：トレイ、30：光源、31：直交移動
台、32：水平移動台、33：卵母細胞、34：生理食塩水、
Ａ：電流計、ＰＣ：コンピュータ、Ｐ：ポンプ1: Oocyte group, 2: Filter, 3: Channel, 4: Gear,
5: Glass electrode, 6: Water channel, 7: Valve, 8: Cells that meet the criteria, 9: Cells that do not meet the criteria, 10: Water channel, 11: Container, 1
2: Oocyte or egg cell group, 13: Packing material, 21: Control device, 22: Control auxiliary device, 23: Monitor, 24: Introduction needle moving table, 25: Introduction device, 26: Introduction needle, 27: CCD camera , 28:
Digital camera, 29: Tray, 30: Light source, 31: Orthogonal transfer table, 32: Horizontal transfer table, 33: Oocyte, 34: Saline solution,
A: Ammeter, PC: Computer, P: Pump
─────────────────────────────────────────────────────
─────────────────────────────────────────────────── ───
【手続補正書】[Procedure amendment]
【提出日】平成１３年８月３１日（２００１．８．３
１）[Submission date] August 31, 2001 (2001.8.3)
1)
【手続補正１】[Procedure Amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】特許請求の範囲[Name of item to be amended] Claims
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction content]
【特許請求の範囲】[Claims]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 大友 純 東京都千代田区神田駿河台四丁目６番地 株式会社日立製作所ライフサイエンス推進 事業部内 (72)発明者 松波 正吉 埼玉県比企郡鳩山町赤沼2520番地 株式会 社日立製作所基礎研究所内 Ｆターム(参考） 4B029 AA09 BB11 HA10 4B063 QQ08 QR01 QS10 QX05 4B065 AA90X BA24 CA60 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued front page (72) Inventor Jun Otomo 4-6 Kanda Surugadai, Chiyoda-ku, Tokyo Hitachi, Ltd. Life Science Promotion Within the business unit (72) Inventor Masayoshi Matsunami 2520 Akanuma, Hatoyama-cho, Hiki-gun, Saitama Prefecture Stock Association Hitachi Research Laboratory F-term (reference) 4B029 AA09 BB11 HA10 4B063 QQ08 QR01 QS10 QX05 4B065 AA90X BA24 CA60
Claims (20)
計測手段と、計測結果に基づいて前記卵母細胞または卵
細胞を選別する選別手段を有することを特徴とする卵母
細胞または卵細胞の選別装置。1. An oocyte or egg cell sorting device comprising: an oocyte or an egg cell sorting means; and a sorting means for sorting the oocyte or egg cell based on a measurement result. .
る計測手段と、前記卵母細胞または卵細胞を膜電位の計
測結果に基づいて選別する選別手段を有することを特徴
とする卵母細胞または卵細胞の選別装置。2. An oocyte, comprising: an oocyte or a measuring means for measuring the membrane potential of the egg cell; and a selecting means for selecting the oocyte or the egg cell based on the measurement result of the membrane potential. Egg cell sorter.
憶するコントロール部を有し、前記選別手段は前記コン
トロール部の情報に基づいて選別することを特徴とする
請求項２に記載の選別装置。3. The sorting apparatus according to claim 2, further comprising a control unit that stores the membrane potential of the oocyte or the egg cell, and the sorting unit sorts based on information of the control unit. .
にアース用の金属がコーティングされていることを特徴
とする請求項２または３に記載の選別装置。4. The sorting apparatus according to claim 2 or 3, wherein a metal used for grounding is coated on the inside of the container used for measuring the membrane potential.
または卵細胞を、選択的に分取する分取手段を有するこ
とを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項に記載の選
別装置。5. The sorting apparatus according to claim 2, further comprising a sorting unit that selectively sorts the oocytes or egg cells sorted by the sorting unit. .
る計測手段と、前記卵母細胞または卵細胞を大きさの計
測結果に基づいて選別する選別手段を有することを特徴
とする卵母細胞または卵細胞の選別装置。6. An oocyte, comprising: an oocyte or a measuring means for measuring the size of the oocyte; and a selecting means for selecting the oocyte or the oocyte based on the size measurement result. Egg cell sorter.
胞を分取するためのフィルターを有することを特徴とす
る請求項６に記載の選別装置。7. The sorting apparatus according to claim 6, further comprising a filter for sorting oocytes or egg cells having a size within a predetermined range.
を有し、前記開口部の内側にアース用の金属がコーティ
ングされたことを特徴とする卵母細胞または卵細胞の膜
電位計測用トレイ。8. A tray for measuring a membrane potential of an oocyte or an egg cell, which has an opening for accommodating the oocyte or the egg cell, and a metal for grounding is coated on the inside of the opening.
る計測工程と、前記卵母細胞または卵細胞を膜電位の計
測結果に基づいて選別する工程を有することを特徴とす
る卵母細胞または卵細胞の選別方法。9. An oocyte or egg cell comprising a measuring step of measuring the membrane potential of the oocyte or the egg cell and a step of selecting the oocyte or the egg cell based on the measurement result of the membrane potential. Selection method.
電位感受性色素法を用いた計測工程であることを特徴と
する請求項９に記載の選別方法。10. The sorting method according to claim 9, wherein the measuring step is a measuring step using an intracellular electrode method or a membrane potential sensitive dye method.
り、前記複数の卵母細胞または卵細胞の膜電位及びアド
レス情報をコントロール部で記憶し、前記記憶した情報
に基づいて卵母細胞または卵細胞を選別することを特徴
とする請求項９または１０に記載の選別方法。11. The oocyte or the plurality of oocytes, wherein the control unit stores the membrane potential and address information of the plurality of oocytes or the oocyte, and selects the oocyte or the oocyte based on the stored information. The sorting method according to claim 9, wherein the sorting method is performed.
を分取する工程を有することを特徴とする請求項９〜１
１のいずれか１項に記載の選別方法。12. The method according to claim 9, further comprising a step of sorting the selected oocyte or egg cell.
The selection method according to any one of 1.
下の前記卵母細胞または卵細胞を選別することを特徴と
する請求項９〜１２のいずれか１項に記載の選別方法。13. The sorting method according to claim 9, wherein the oocyte or egg cell having a membrane potential of −70 mV or more and −40 mV or less is sorted.
行う工程と、前記酵素処理から２４時間以内に、前記卵
母細胞の膜電位を計測する工程と、膜電位が−７０ｍＶ
以上−４０ｍＶ以下の卵母細胞を選択的に採取する工程
と、を有することを特徴とする、卵母細胞の選別方法。14. A step of performing an enzyme treatment for isolating an oocyte, a step of measuring a membrane potential of the oocyte within 24 hours after the enzyme treatment, and a membrane potential of −70 mV.
And a step of selectively collecting oocytes of -40 mV or less, the method for selecting oocytes.
として選別された卵母細胞または卵細胞集団。15. An oocyte or egg cell population selected on the condition that it has a membrane potential within a predetermined range.
上−４０ｍＶ以下であることを特徴とする請求項１５に
記載の卵母細胞または卵細胞集団。16. The oocyte or egg cell population according to claim 15, wherein the membrane potential in the predetermined range is −70 mV or more and −40 mV or less.
電位を有することを条件として選別した後、試料を導入
した卵母細胞または卵細胞集団。17. An oocyte or egg cell population into which a sample has been introduced after selection under the condition of having a membrane potential in the range of −70 mV to −40 mV.
する工程と、膜電位が−７０ｍＶ以上−４０ｍＶ以下の
卵母細胞または卵細胞を選択的に採取する工程と、前記
選択的に採取した前記卵母細胞または卵細胞に試料を導
入する工程と、前記試料を導入した卵母細胞または卵細
胞をセットとして、販売または譲渡を行うことを特徴と
する、卵母細胞または卵細胞の販売、譲渡方法。18. A step of measuring a membrane potential of an oocyte or an egg cell, a step of selectively collecting an oocyte or an egg cell having a membrane potential of −70 mV or more and −40 mV or less, and the selectively collected sample A method of selling or transferring an oocyte or an egg cell, comprising selling or transferring the set of the oocyte or the egg cell into which the sample has been introduced and the oocyte or the egg cell into which the sample has been introduced as a set.
として選別された複数の卵母細胞または卵細胞を容器に
入れ、前記卵母細胞または卵細胞の品質に関する情報を
添付して、販売または譲渡を行うことを特徴とする卵母
細胞または卵細胞の販売、譲渡方法。19. Putting a plurality of oocytes or oocytes selected on the condition that they have a membrane potential within a predetermined range in a container, and attaching the information regarding the quality of said oocytes or oocytes to them for sale or transfer. A method of selling and transferring an oocyte or an egg cell, which is characterized by carrying out.
前記卵母細胞を膜電位の計測結果に基づいて選別し、複
数の卵母細胞を得る工程と、前記複数の卵母細胞に、実
質的に等しい深度で試料を注入する工程とを有すること
を特徴とする卵母細胞製造方法。20. A step of measuring a membrane potential of an oocyte,
Selecting the oocytes based on the measurement result of the membrane potential, obtaining a plurality of oocytes, and a step of injecting a sample into the plurality of oocytes at substantially equal depth, A method for producing an oocyte, which is characterized.
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- 2001-07-30 JP JP2001230081A patent/JP3519707B2/en not_active Expired - Fee Related
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