JP2003024084A

JP2003024084A - 結晶構造

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Publication number: JP2003024084A
Application number: JP2002104923A
Authority: JP
Inventors: Thorsten Reginald Knoechel; トルステン・レジナルド・クネヒェル; Colin Mark Robinson; コリン・マーク・ロビンソン; Wendy Elaine Taylor; ウェンディ・エレイン・テイラー; Alexander Dunbar Tucker; アレグザンダー・ダンバー・タッカー
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 2001-04-06
Filing date: 2002-04-08
Publication date: 2003-01-28
Also published as: CA2378565A1; EP1247860A1

Abstract

(57)【要約】（修正有）【課題】ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＨ
Ｋ）の結晶及びその高分解構造を提供する。【解決手段】該ＰＤＨＫタンパク質は、特定なアミノ酸
配列で示されるが、そのアミノ酸１６位で開始するよう
なＰＤＨＫ−２アミノ酸配列、またはその同族体、断
片、変異体または誘導体を、また本発明は、生理的およ
び合成リガンドの存在および非存在下で、Ｘ線回折によ
り得られたＰＤＨＫの高解像度三次元構造、およびＰＤ
ＨＫに結合する化合物を同定、デザインまたは選択する
ための、前記構造の使用、さらに本発明は、ＰＤＨＫの
高解像度構造を用いて、同定、デザインまたは選択され
る化合物、また、結晶可能なＰＤＨＫタンパク質を得る
ために用いられるヌクレオチド配列も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ピルビン酸デ
ヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＨＫ）の結晶、そしてよ
り詳細には生理的および合成リガンドの存在下および非
存在下でＸ線回折により得られるＰＤＨＫの高分解構造
に関する。本発明はさらに、ＰＤＨＫに結合する化合物
を同定し、デザインし、または選択するために、そのよ
うに決定された三次元構造の使用に関する。本発明はさ
らに、結晶化可能なＰＤＨＫタンパク質を得るために使
われるＤＮＡ構造物に関する。

【０００２】

【従来の技術】間欠性跛行および骨格筋疲労は、末
梢性血管疾患および他の虚血関連疾患、例えば慢性閉塞
性肺疾患、鬱血性心不全および狭心症の症状である。場
合によっては、十分効力は認められている（Ｗｈｉｔｅ
ｈｏｕｓｅ，Ｓ．ら（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．
１４１、７６１−７７４）が、毒性もある（Ｓｔａｃ
ｐｏｏｌｅ，Ｐ．Ｗ．ら、（１９９８）ＤｒｕｇＭｅ
ｔａｂ．Ｒｅｖ．３０、４９９−５３９；Ｓｔａｃｐ
ｏｏｌｅ，Ｐ．Ｗ．ら（１９９８）Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈ
ｅａｌｔｈＰｅｒｓｐｅｃｔ．１０６（Ｓｕｐｐ
ｌ．４）、９８９−９９４）ピルビン酸デヒドロゲナー
ゼ（ＰＤＨ）の活性化物質であるジクロロ酢酸（ＤＣ
Ａ）の経口投与によって症状の救済が達成されることが
ある（Ｓｔａｃｐｏｏｌｅ，Ｐ．Ｗ．ら（１９８９）Ｍ
ｅｔａｂｏｌｉｓｍ３８、１１２４−１１４４；Ｂｅｒ
ｓｉｎ，Ｒ．Ｍ．ら（１９９７）Ａｍ．Ｈｅａｒｔ
Ｊ．１３４、８４１−８５５；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，
Ｇ．Ｎ．ら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｌ．３７、４１６−４２５）。

【０００３】ＰＤＨは、アセチルＣｏＡおよびＮＡＤＨ
の生成を伴うピルビン酸の脱炭酸を触媒する多酵素複合
体である（総説についてはＭａｔｔｅｖｉ，Ａ．ら（１
９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏ
ｌ．２、８７７−８８７を参照されたい）。ＰＤＨは
ピルビン酸デカルボキシラーゼ（Ｅ₁）、ジヒドロリポ
イル（ｄｉｈｙｄｒｏｌｉｐｏｙｌ）トランスアセチラ
ーゼ（Ｅ₂）およびジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ
（Ｅ₃）成分より成る。ＰＤＨは、生成物阻害およびＰ
ＤＨキナーゼ（ＰＤＨＫ）およびＰＤＨホスファターゼ
による可逆的リン酸化によって調節される（Ｌｉｎｎ，
Ｔ．Ｃ．ら（１９６９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６２、２３４−２４１）。ＤＣＡ
はＰＤＨＫによるＡＴＰ依存性リン酸化を阻害するが、
そのことは、ＰＤＨ活性化物質としてのＤＣＡの作用を
説明している（Ｐｒａｔｔ，Ｍ．Ｌ．およびＲｏｃｈ
ｅ，Ｔ．Ｅ．（１９７９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２５４、７１９１−７１９６）。ＰＤＨのリン酸化は、
ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のジヒドロリポイル
トランスアセチラーゼ（Ｅ₂Ｌ₂）成分のリポイルドメイ
ンへの、ＰＤＨＫの非共有結合により媒介される（Ｒａ
ｖｉｎｄｒａｎ，Ｓ．ら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７１、６５３−６６２；Ｊａｃｋｓｏｎ，
Ｊ．Ｃ．ら（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３
４、７０３−７１１）。

【０００４】低酸素利用性の条件下でＰＤＨを活性化す
ると、クエン酸回路へ進入するための、ピルビン酸から
のアセチルＣｏＡの急速な生成を促進することになる。
加えてそれは、筋肉疲労を起す主要因と考えられている
乳酸および無機リン酸の蓄積の速度を低下させることに
なる（Ｆｉｔｔｓ，Ｒ．Ｈ．（１９９４）Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．Ｒｅｖ．７４、４９−９４）。さらにそれは、主
要エネルギー源として脂肪酸酸化から炭水化物へ代謝を
シフトすることにより、消費される酸素の１分子当りの
ＡＴＰの生産高を増加することになる。

【０００５】ＰＤＨＫ酵素類の結晶化は、自然のままの
当該酵素の三次元構造の決定を可能にすることになる。
さらに、生理的および／または合成リガンドの存在下お
よび非存在下での結晶型の分析は、ＰＤＨＫ酵素類のリ
ガンド結合部位および／またはタンパク質相互作用部位
の同定を可能にすることになる。そのような情報は、Ｐ
ＤＨＫ活性を調整し、そしてＰＤＨキナーゼによるＰＤ
Ｈのリン酸化に干渉する、化合物のデザインに有用であ
る。

【０００６】ＰＤＨキナーゼによるＰＤＨのリン酸化に
干渉するのに、いくつかの方法の使用が可能である、例
えば、・（ａ）ＡＴＰ結合部位への競合的リガンド結合また
は（ｂ）アロステリック調節部位経由、によるキナーゼ
活性の阻害。・Ｅ₂Ｌ₂結合部位への結合によるＰＤＨＫ：Ｅ₂Ｌ₂相
互作用の遮断、またはＰＤＨＫによるＰＤＨ複合体のＡ
ＴＰ依存性リン酸化に随伴しおよび該リン酸化を促進す
る他のタンパク質・タンパク質相互作用の遮断。・ＰＤＨＫ基質、すなわちＰＤＨ複合体のＥ₁成分の
結合の妨害。

【０００７】ＰＤＨＫアイソザイム２（ＰＤＨＫ−
２）、特にヒトＰＤＨＫ−２（ｈＰＤＨＫ−２）のよう
なＰＤＨＫの結晶型をつくる努力が成功しなかったた
め、これらの方法の開発は妨げられてきた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明により対象
とされる技術的問題は、ＰＤＨＫ−２、特にｈＰＤＨＫ
−２のようなＰＤＨＫの結晶型の提供である。

【０００９】本発明はＰＤＨＫ結晶を提供するが、ここ
で該ＰＤＨＫタンパク質は、配列番号２で示されるもの
の、アミノ酸１６位で開始するＰＤＨＫ−２アミノ酸配
列（すなわち該ＰＤＨＫタンパク質は配列番号１０で示
されるＰＤＨＫ−２アミノ酸配列を含む、または、から
成る）、またはその同族体、断片、変異体または誘導体
を含む、または、から成る。

【００１０】本発明は、天然配列のＮ末端アミノ酸配列
の一部が欠如するＰＤＨＫ−２、特にｈＰＤＨＫ−２の
ようなＰＤＨＫの結晶型の提供により、当該技術分野に
おける諸問題の解決に役立つ。

【００１１】

【課題を解決するための手段】操作ヒトＰＤＨＫア
イソザイム２（ＰＤＨＫ−２）のＸ線構造が、生理的お
よび合成リガンドの存在下および非存在下で決定され
た。該構造は、この重要な調節酵素についての最初の詳
細な三次元記述である。該タンパク質は、４ヘリックス
バンドルトポロジーをもつＮ末端調節ドメインおよびＣ
末端触媒ドメインより成り、ＧＨＫＬスーパーファミリ
ーに属する（Ｄｕｔｔａ，Ｒ．およびＩｎｏｕｙｅ，
Ｍ．（２０００）ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃ
ｉ．２５、２４−２８）。

【００１２】ＰＤＨＫには少なくとも四つの異なるリガ
ンド結合部位が確認されており、それらは、触媒ドメイ
ン上のＡＴＰ結合部位、ならびに調節ドメイン上に位置
するＰＤＨ複合体のＥ₂成分のリポイルドメイン（Ｅ₂Ｌ
₂）の推定結合部位、アロステリック結合部位およびＤ
ＣＡ結合部位を、含む。さまざまな部位に結合したリガ
ンドをもつＰＤＨＫの複合体の構造は、構造に基づくリ
ガンドデザインに有用である。

【００１３】最近、ラットＲａｔｔｕｓｎｏｖｅｇｉ
ｃｕｓからのＰＤＨＫ−２（ｒＰＤＨＫ−２）の構造
が、ＡＤＰの存在下２．５Å分解能で決定された（Ｓｔ
ｅｕｓｓｙら（２００１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７６、（４０）、３７４３３−３７４５０）。

【００１４】本発明の一つの態様は、ピルビン酸デヒド
ロゲナーゼキナーゼ（ＰＤＨＫ）の結晶、好ましくはＰ
ＤＨＫ−２、好ましくは哺乳類ＰＤＨＫ−２、なお一層
好ましくはヒトＰＤＨＫ−２、またはそれらの同族体、
断片、変異体、または誘導体の結晶である。

【００１５】本発明の態様において、該ＰＤＨＫ−２タ
ンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列をもつ
もので、好ましくは該ＰＤＨＫタンパク質は、配列番号
２で示されるものの、アミノ酸１６位で開始するＰＤＨ
Ｋ−２アミノ酸配列（すなわち該ＰＤＨＫタンパク質は
配列番号１０で示されるＰＤＨＫ−２アミノ酸配列、を
含む、または、それから成る）、またはその同族体、断
片、変異体または誘導体を含む、または、それから成
る；好ましくは該ＰＤＨＫ−２アミノ酸配列は、配列番
号２の１から１５位におけるアミノ酸配列に相当しない
アミノ酸配列により先行される；より好ましくは該ＰＤ
ＨＫ−２アミノ酸配列は、アフィニティー精製タグであ
るアミノ酸配列および、または特定のタンパク質切断部
位であるアミノ酸配列により先行される；なお一層好ま
しくは該ＰＤＨＫ−２配列は、特定のタンパク質切断部
位が続くアフィニティー精製タグであるアミノ酸配列に
より先行される。好ましくは該アフィニティー精製タグ
は多重ヒスチジンタグで、最も好ましくは６ヒスチジン
（ヘキサＨｉｓ）タグである。好ましくは該特定タンパ
ク質切断部位はトロンビン切断部位である。特に好まし
い態様では、該ＰＤＨＫタンパク質は、トロビン切断部
位が続くヘキサＨｉｓタグにより先行されるＰＤＨＫア
ミノ酸配列より成り、より好ましくは該ＰＤＨＫタンパ
ク質は、Ｎ末端メチオニン残基を加えてもつ。なお一層
好ましくは該ＰＤＨＫ−２が配列番号４で示される配
列、本明細書ではヘキサＨｉｓ−ＰＤＨＫ−２^*と記
す、をもつ結晶である。該ＰＤＨＫ結晶の好ましい態様
では、該ＰＤＨＫタンパク質は、一つまたは二つのアミ
ノ酸により先行されるＰＤＨＫ−２アミノ酸配列より成
る。さらに好ましい態様はＰＤＨＫ結晶で、ここで該Ｐ
ＤＨＫタンパク質が、配列番号５で示されるＰＤＨＫ−
２アミノ酸配列、またはその同族体、断片、変異体また
は誘導体、を含む、または、それから成る；特に好まし
い態様では、該ＰＤＨＫ−２アミノ酸配列は、配列番号
５で示されるＰＤＨＫ−２アミノ酸配列より成るが、こ
の最後の態様は、以下ＰＤＨＫ−２^*と記す。当該発明
の実施態様では、ＰＤＨＫ−２^*は、配列番号４で示さ
れるＰＤＨＫ−２アミノ酸配列のトロンビン切断により
提供される。

【００１６】１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．２−
５．８，５−１０％イソプロパノール，および２５−１
５０ｍＭＭｇＣｌ₂中、好ましくは１００ｍＭ酢酸ナト
リウムｐＨ５．６−５．８，６−９％イソプロパノー
ル，および７５−１２５ｍＭＭｇＣｌ₂中で成長させた
ＰＤＨＫ−２^*の上記結晶は、空間群Ｐ６₄をもつ前記結
晶、またはａ＝ｂ＝１０９Å＋／−３Å，ｃ＝８５Å＋
／−３Åの単位格子次元をもつ前記結晶と同様に、本発
明の実施態様でもある。

【００１７】本発明のもう一つの態様はヘキサＨｉｓ−
ＰＤＨＫ−２^*の結晶で、ここで該結晶は単斜晶系であ
り、またはここで前記結晶は１００ｍＭクエン酸ｐＨ
５．５−５．７，１５％ＰＥＧ４Ｋ，および２００か
ら４００ｍＭの酢酸アンモニウム中で成長させ、または
ここで前記結晶は空間群Ｃ２をもつものであり、または
ａ＝９０Å＋／−３Å，ｂ＝５４Å＋／−３Å，ｃ＝８
３Å＋／−３Å，およびβ＝１０６゜＋／−２゜の単位
格子次元をもつ前記結晶である。

【００１８】さらなる態様は、ソーク・インされた重原
子、好ましくは水銀、イリジウム、およびオスミウムよ
り成る群から選択される重原子をもつ、当該発明に従う
結晶である。

【００１９】本発明のさらなる態様は、ソーク・インさ
れたＰＤＨＫ基質、好ましくはＡＴＰまたはＡＤＰ、お
よび／またはＰＤＨＫリガンドをもつ、ＰＤＨＫ−２，
ＰＤＨＫ−２^*，またはヘキサＨｉｓ−ＰＤＨＫ−２^*の
結晶である。好ましくは該リガンドは、本明細書では化
合物１と記す４−｛（２，５）−ジメチル−４−［３，
３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプ
ロパノイル］ピペラジニル｝カルボニル）ベンゾニトリ
ル、または本明細書では化合物２と記すＮ−｛４−
［（エチルアニリノ）スルフォニル］−２−メチルフェ
ニル｝−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−
２−メチルプロパンアミド、または本明細書では化合物
３と記すＮ−（２−アミノエチル）−２−｛３−クロロ
−４−［（４−イソプロピルベンジル）オキシ］フェニ
ル｝アセタミド、またはＤＣＡ（ジクロロ酢酸）であ
る。

【００２０】本発明のもう一つの態様は、リガンドされ
たＰＤＨＫ、好ましくはリガンドされたＰＤＨＫ−２^*
の結晶である；好ましくは前記結晶は、ＰＤＨＫリガン
ドの存在下に１００ｍＭＭＥＳｐＨ６，１０％イソプロ
パノールおよび２００ｍＭ酢酸カルシウム中で成長させ
る。好ましくは前記ＰＤＨＫリガンドは化合物１であ
る。

【００２１】本発明のもう一つの態様は、上記の任意の
結晶であって、ここで前記結晶は、３．８Åまたはより
良好な解像力で、好ましくは３．２Åまたはより良好な
解像力で、好ましくは２．８Åまたはより良好な解像力
で、さらに好ましくは２．５Åまたはより良好な解像力
で、なお一層好ましくは２．４Åまたはより良好な解像
力で、最も好ましくは２．２Åまたはより良好な解像力
で、Ｘ線を回折する。

【００２２】本発明のさらなる態様は、表３に詳述され
ている原子座標、または任意の基準フレームで発現され
る誘導体セット、をもつＰＤＨＫ−２^*の結晶である。
また本発明は：（ａ）表４に詳述されている原子座標、または任意の基
準フレームで発現される誘導体セット、をもつ化合物１
とのＰＤＨＫ−２^*の共結晶。（ｂ）ソーク・インされたＡＴＰをもち、表５に詳述さ
れている原子座標、または任意の基準フレームで発現さ
れる誘導体セット、をもつ化合物１とのＰＤＨＫ−２^*
の共結晶。（ｃ）表６に詳述されている原子座標、または任意の基
準フレームで発現される誘導体セットをもつ、ソーク・
インされた化合物２とのＰＤＨＫ−２^*の結晶。（ｄ）表７に詳述されている原子座標、または任意の基
準フレームで発現される誘導体セット、をもつソーク・
インされた化合物３とのＰＤＨＫ−２^*の結晶、または（ｅ）表８に詳述されている原子座標、または任意の基
準フレームで発現される誘導体セット、をもつソーク・
インされたＤＣＡおよびＡＤＰとのＰＤＨＫ−２ ^*の結
晶。

【００２３】本発明のもう一つの側面は、ＰＤＨＫ−２
の三次元構造を誘導するための当該発明に従うＰＤＨＫ
結晶の原子座標の使用、およびＰＤＨＫ−２との、好ま
しくはＰＤＨＫ−２上の結合部位との、さらに一層好ま
しくはＰＤＨＫ−２上のＡＴＰ結合部位、特にＧｌｕ２
５１，Ｌｅｕ２５２，Ｌｙｓ２５４，Ａｓｎ２５５，Ａ
ｌａ２５６，Ａｒｇ２５８，Ａｌａ２５９，Ｍｅｔ２８
８，Ｓｅｒ２８９，Ａｓｐ２９０，Ｇｌｙ２９２，Ｇｌ
ｙ２９３，Ｇｌｙ２９４，Ｖａｌ２９５，Ｉｌｅ３０
０，Ｌｅｕ３０３，Ｌｅｕ３２３，Ａｌａ３２４，Ｇｌ
ｙ３２５，Ｐｈｅ３２６，Ｇｌｙ３２７，Ｔｙｒ３２
８，Ｇｌｙ３２９，Ｌｅｕ３３０，Ｐｒｏ３３１，Ｌｅ
ｕ３４６，Ｓｅｒ３４８，Ｔｈｒ３５４，Ａｓｐ３５
５，Ａｌａ３５６から選択された残基を非限定的に含む
ＡＴＰ結合部位との、化学化合物の結合相互作用をコン
ピューターによりまたは他の仕方で評価するための、Ｐ
ＤＨＫ−２の前記三次元構造の使用である。また本発明
は、ＰＤＨＫ−２上の推定Ｅ₂Ｌ₂結合部位との、特にＬ
ｅｕ３１，Ｇｌｎ３５，Ｐｈｅ３６，Ａｓｐ３８，Ｐｈ
ｅ３９，Ｔｈｒ４８，Ｓｅｒ４９，Ｐｈｅ５２，Ｌｅｕ
５３，Ｍｅｔ１６７，Ｌｅｕ１６８，Ｇｌｎ１７１，Ｈ
ｉｓ１７２，Ｉｌｅ１７５，Ｐｈｅ１７６から選択され
た残基を非限定的に含むＰＤＨＫ−２上の推定Ｅ₂Ｌ₂結
合部位との、ある化合物の結合相互作用をコンピュータ
ーによりまたは他の仕方で評価するための、ＰＤＨＫ−
２の前記三次元構造の使用を含む。さらに本発明は、Ｌ
ｅｕ７１，Ｐｒｏ７２，Ａｒｇ７４，Ｖａｌ７５，Ｔｈ
ｒ７８，Ｓｅｒ８０，Ｖａｌ８１，Ｍｅｔ１３０，Ｇｌ
ｙ１３３，Ｖａｌ１３４，Ｇｌｕ１３６，Ｔｙｒ１３
７，Ａｓｐ１４４，Ｖａｌ１４６，Ｓｅｒ１４７，Ａｓ
ｎ１５０，Ｉｌｅ１５１，Ｐｈｅ１５４，Ｌｅｕ１５
５，Ｔｙｒ３８２から選択された残基を非限定的に含む
ＰＤＨＫ−２上の結合部位との、ある化合物の結合相互
作用をコンピューターによりまたは他の仕方で評価する
ための、上記のようなＰＤＨＫ−２の三次元構造の使用
を含む。また本発明は、Ｌｅｕ５７，Ｌｅｕ６１，Ｔｙ
ｒ８８，Ｓｅｒ９１，Ｉｌｅ９５，Ｉｌｅ１１９，Ａｒ
ｇ１２０，Ｈｉｓ１２３，Ｓｅｒ１６１，Ａｒｇ１６
２，Ｉｌｅ１６５，Ａｒｇ１６６，Ｉｌｅ１６９から選
択された残基を非限定的に含むＰＤＨＫ−２上の結合部
位との、ある化合物の結合相互作用をコンピューターに
よりまたは他の仕方で評価するための、ＰＤＨＫ−２の
三次元構造の使用を含む。

【００２４】本発明のもう一つの側面は、ある化合物、
特にＰＤＨＫリガンド、好ましくはＰＤＨＫ酵素と会合
できるＰＤＨＫ阻害剤をデザインするための、好ましく
は該酵素の結合部位と会合できる化合物をデザインする
ための、なお一層好ましくは上述酵素上の結合部位の任
意の一つと会合できる化合物をデザインするための、な
お一層好ましくは該酵素のＡＴＰ結合部位と、または該
酵素上の推定Ｅ₂Ｌ₂結合部位と、または記載の第三の結
合部位と、またはＤＣＡ結合部位と、会合できる化合物
をデザインするための、本発明に従うＰＤＨＫ−２の三
次元構造の使用である。

【００２５】本発明のもう一つの態様は、ある化合物、
好ましくはＰＤＨＫリガンド、なお一層好ましくはＰＤ
ＨＫ阻害剤の、該二量体化界面への結合相互作用をコン
ピューターによりまたは他の仕方で評価するための、上
述のＰＤＨＫ−２の三次元構造の使用、ならびに前記二
量体化界面と相互作用可能な化合物をデザインするため
の、前記構造の使用である。

【００２６】また本発明は、このように評価またはデザ
インされた化合物類、好ましくはＰＤＨＫリガンド類，
なお一層好ましくはＰＤＨＫ阻害剤類に関する。本発明
のもう一つの側面は、可能性のあるＰＤＨＫ−２阻害剤
化合物の群からＰＤＨＫ−２阻害剤化合物を選択する方
法であって、下記の工程を含む：ａ）上述のようなＰＤＨＫ−２の構造、または好まし
くは該酵素上の結合部位のいずれかの構造、の三次元表
現を作出する；ｂ）該ＰＤＨＫ−２構造のモデル上に、または該酵素
の結合部位のモデル上に、可能性のあるＰＤＨＫ−２阻
害剤化合物のモデルを表示し、重ねる；そしてｃ）該可能性のあるＰＤＨＫ−２阻害剤化合物のモデ
ルが、該ＰＤＨＫ−２構造のモデルまたは該酵素上の結
合部位のモデルに、ぴったり合うかどうかを査定する。

【００２７】選択的には、前記方法は下記の工程をさら
に含んでもよい：ｄ）該可能性のあるＰＤＨＫ−２阻害剤化合物を、生
体ＰＤＨＫ−２活性分析に取込む；そしてｅ）該可能性のあるＰＤＨＫ−２阻害剤化合物が、こ
の分析においてＰＤＨＫ−２活性を阻害するかどうかを
決定する。

【００２８】また本発明は、上記の方法で選択された化
合物類、特にＰＤＨＫ−２リガンド類、好ましくはＰＤ
ＨＫ−２阻害剤類を含む。本発明のもう一つの側面は、
上記のように評価され、デザインされ、または選択され
た化合物、好ましくはＰＤＨＫリガンド、なお一層好ま
しくはＰＤＨＫ阻害剤を含む、医薬組成物である。

【００２９】本発明のさらなる態様は、上記のように評
価され、デザインされ、または選択された化合物、好ま
しくはＰＤＨＫリガンド、なお一層好ましくはＰＤＨＫ
阻害剤の、ＰＤＨＫの阻害が有益な疾患、鬱血性心不
全、末梢性血管疾患、慢性閉塞性肺疾患、冠動脈疾患、
糖尿病、虚血、内毒素ショック、出血性ショック、乳酸
アシドーシス、または心不全のような、好ましくは虚血
関連疾患の治療用の薬剤の製造における、使用である。

【００３０】本発明のもう一つの側面は、例えば分子交
換または差フーリエ分析によって、ＰＤＨＫ−２の変異
体、同族体、または共複合体の結晶型を解明するため
の、上述のようなＰＤＨＫ−２の原子座標、またはそれ
らの部分の使用である。

【００３１】本発明のさらなる側面は、他のＰＤＨＫア
イソザイム類またはそれらの変異体の模造品、例えば特
に、同定された結合部位における、一ヌクレオチド（塩
基）多型（ＳＮＰｓ）、をデザインするための、ＰＤＨ
Ｋ−２の構造の使用であり；該構造は、部位特異的変異
体類のデザインだけでなく、そうした近縁の酵素類に対
するＰＤＨＫリガンド類の結合をコンピューターにより
（または別の仕方で）査定するのにも、使用可能であ
る。

【００３２】さらに、本発明は、関連タンパク質または
変異体またはそれらの部分の三次元構造のモデルを産生
するための、上述のようなＰＤＨＫ−２の原子座標また
はそれらの部分の使用を含む。そうした関連タンパク質
類は、他のＰＤＨＫアイソザイム類、異なる動物、植
物、バクテリア、またはカビからのＰＤＨＫアイソザイ
ム類、分岐鎖αケト酸デヒドロゲナーゼキナーゼ、およ
びその他を、含む。

【００３３】本発明のさらなる態様は、配列番号３で示
される配列を含むヌクレオチド配列、対立遺伝子変異
体、またはそれらの変異体、または配列番号４で示され
るペプチド配列をコードする配列を含むヌクレオチド配
列、対立遺伝子変異体、またはそれらの変異体；または
配列番号９で示される配列、または対立遺伝子変異体、
またはそれらの変異体；または配列番号２で示される
が、アミノ酸１６位で開始するＰＤＨＫ−２アミノ酸配
列をコードするヌクレオチド配列、または対立遺伝子変
異体またはそれらの変異体；または配列番号８で示され
る配列または対立遺伝子変異体またはそれらの変異体；
または配列番号５で示されるアミノ酸配列をコードする
配列、または対立遺伝子変異体またはそれらの変異体で
ある。（対立遺伝子変異体は、核酸配列に差異がある該
酵素の別の型で、一般には変化したｍＲＮＡおよび恐ら
く変化したタンパク質を産生し、それらの構造または機
能は変化することも、しないこともある。その差異は、
一塩基多型（ＳＮＰ）としばしば言われる単一ヌクレオ
チドでもよいが、もっと大きな変化を含んでもよい。こ
こでの変異体の意味は、部位特異的変異誘発のように、
当業者には周知の方法で故意に産生された該酵素の別の
型である。）好ましくはこのヌクレオチド配列は、所望
の宿主での発現を駆動するのに適した調節配列、特にプ
ロモーター配列に連結される。好ましくは、前記ヌクレ
オチド配列は組換え体バキュロウイルスへ取込まれ、そ
して前記宿主は昆虫細胞系である。

【００３４】結晶化されたＰＤＨＫ配列についての用語
“同族体”、“断片”、“変異体”、または“誘導体”
は、結果として生じるポリペプチドが、ＰＤＨＫのもの
と同様な、特にＰＤＨＫ−２のものと同様な、構造へフ
ォールディングできるという条件で、該配列からのまた
は該配列への、一つまたは一つより多いアミノ酸残基
の、任意の置換、変異、修飾、交換、欠失、または添加
を含む。用語“同族体”は、配列および／または構造お
よび／または機能に関して相同性を包含する。当該発明
に従うタンパク質類における配列相同性に関しては、ヒ
トＰＤＨＫ−２のタンパク質配列（配列番号２）、また
はそれのかなりの部分、例えば配列番号２に示されるよ
うなｈＰＤＨＫ−２アミノ酸配列で、アミノ酸１６位で
開始するもの、に少なくとも６５％、好ましくは８０
％、より好ましくは９０％、なお一層好ましくは９５
％、最も好ましくは９８％の同一性がある。そうした配
列相同性を査定すために使用する適切なコンピューター
プログラムについては、当業者はよく承知しており、そ
れらは、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，
Ｓ．Ｆ．ら（１９９７）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅ
ｓ．２５、３３８９−３４０２），ＦＡＳＴＡまたは
ＦＡＳＴＰ（Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．（１９９０）Ｍ
ｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１８３、６３−９
８）、または、ＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴのようなＧ
ＣＧパッケージ（ウイスコンシン大学；Ｄｅｖｅｒｅｕ
ｘら（１９８４）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１
２、３８７）に含まれるプログラムを、非限定的に含
む。

【００３５】使用略語のリストＡＤＰアデノシン二リン酸ＡＴＰアデノシン三リン酸ＣｏＡ補酵素ＡＤＣＡジクロロ酢酸ＤＮＡデオキシリボ核酸ＥＤＴＡエチレンジアミン四酢酸Ｈｓｐ熱ショックタンパク質ＭＥＳ２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルフォン酸ＭＯＩ感染多重度ＮＡＤニコチンアミドアデニンジヌクレオチドＮＡＤＨニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型ＮＩＨ国立衛生研究所、米国ＰＣＲポリメラーゼ連鎖反応ＰＤＢタンパク質データバンクＰＤＨピルビン酸デヒドロゲナーゼＰＤＨＫＰＤＨキナーゼＰＤＨＫ−１ＰＤＨＫアイソザイム１ＰＤＨＫ−２ＰＤＨＫアイソザイム２ｈＰＤＨＫ−２ホモサピエンス（ヒト）由来のＰＤＨＫアイソザイム２ｒＰＤＨＫ−２ラッツスノルベギクス（Ｒａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ラット）由来のＰＤＨＫアイソザイム２ｈｅｘａ−Ｈｉｓ−ＰＤＨＫ−２^* 結晶化に適したヒ
トＰＤＨＫ−２の操作版；その配列は配列番号４に示すＰＤＨＫ−２^* 結晶化に適したヒトＰＤＨＫ−２の操
作版；その配列は配列番号５に示す；そのタンパク質は
ｈｅｘａ−Ｈｉｓ−ＰＤＨＫ−２^*のトロンビン切断に
より調製可能であるＰＤＨＫ−３ＰＤＨＫアイソザイム３ＰＤＨＫ−４ＰＤＨＫアイソザイム４ＰＥＧポリエチレングリコールｒｍｓｄ平均二乗偏差ｒｐｍ毎分回転数ＳＤＳ−ＰＡＧＥ硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）
ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＳＮＰ一ヌクレオチド（塩基）多型Ｃｏｍｐｏｕｎｄ１（化合物１）４−｛（２，５）
−ジメチル−４−［３，３，３−トリフルオロ−２−ヒ
ドロキシ−２−メチルプロパノイル］ピペラジニル｝カ
ルボニル）ベンゾニトリルＣｏｍｐｏｕｎｄ２（化合物２）Ｎ−｛４−［（エ
チルアニリノ）スルフォニル］−２−メチルフェニル｝
−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メ
チルプロパンアミドＣｏｍｐｏｕｎｄ３（化合物３）Ｎ−（２−アミノ
エチル）−２−｛３−クロロ−４−［（４−イソプロピ
ルベンジル）オキシ］フェニル｝アセタミド

【００３６】

【実施例】本発明は、以下の非限定的実施例および添付
図面により、ここで具体的に説明されるが、そこでは：
配列番号１は、ヒトＰＤＨＫ−２ｃＤＮＡコード配列を
図解する；配列番号２は、ヒトＰＤＨＫ−２タンパク質
配列を図解する；配列番号３は、ｈｅｘａ−Ｈｉｓ−Ｐ
ＤＨＫ−２^*をコードするように操作されたＤＮＡ配列
を図解する；配列番号４は、ｈｅｘａ−Ｈｉｓ−ＰＤＨ
Ｋ−２^*のタンパク質配列を図解する；配列番号５は、
ＰＤＨＫ−２^*のタンパク質配列を図解する；配列番号
６は、配列番号３のＤＮＡ配列を増幅するために使われ
た５´プライマーの配列を示す；配列番号７は、配列番
号３のＤＮＡ配列を増幅するために使われた３´プライ
マー配列の配列を示す；配列番号８は、ＰＤＨＫ−２^*
のＤＮＡ配列を図解する；配列番号９は、完全長ｈＰＤ
ＨＫ−２配列におけるアミノ酸残基Ａｌａ１６に相当す
る位置で開始するヒトＰＤＨＫ−２ＤＮＡ配列を図解す
る；配列番号１０は、完全長ｈＰＤＨＫ配列におけるア
ミノ酸残基Ａｌａ１６に相当する位置で開始するヒトＰ
ＤＨＫ−２タンパク質配列を図解する。

【００３７】図１は、二次構造特徴、リガンドと相互作
用する残基または二量体化界面に位置する残基、および
４種すべてのヒトＰＤＨＫアイソザイム中の保存性残基
を示す注釈付きの、ＰＤＨＫ−２^*のタンパク質配列を
示す。図２は、ＰＤＨＫ−２構造のリボンダイアグラム
を示す。図３は、ＰＤＨＫ−２二量体の二つの視図を示
す。図４は、ＰＤＨＫ−２のＡＴＰ結合部位における配
位水分子とともに、ＡＴＰおよびＭｇ²⁺を示す。図５
は、ＰＤＨＫ−２に結合した（ａ）化合物１および
（ｂ）化合物２の視図、ならびに下部に図解したそれら
の化学構造を示す。図６は、ＰＤＨＫ−２に結合した化
合物３の視図、ならびにその化学構造を示す。図７は、
重ねたＤＣＡのモデルとともに、ｆ_obs（ＡＤＰ，ＤＣ
Ａ）−ｆ_obs（天然）電子密度マップを示す。

【００３８】実施例１：ヒトＰＤＨＫ−２の結晶化を可
能にする構築物のデザイン完全長ヒトＰＤＨＫ−２を結晶化する試みは不成功だっ
たので、ヒトＰＤＨＫ−２の結晶化可能な型を発現する
構築物を特製（遺伝子操作）するための工程を採った。

【００３９】ヒトＰＤＨＫ−２をキモトリプシン部分消
化（３０℃、1時間）に付したところ、両末端で短小化
した主要タンパク質分子種を生じた。該短小化産物のＮ
末端残基は、Ｎ末端シークエンシングによりＬｙｓ１４
と決定され；分子量から、Ｃ末端からも１６残基が除去
されていると、推定された。該酵素のこの短小化型は酵
素活性を保持していたので、該酵素から除去された部分
が、活性あるいは該酵素の構造的完全性に不可欠とは考
えられない。

【００４０】ＰＤＨＫ−２のＮ末端部が短小化した型を
（遺伝子操作）特製したが、それは、メチオニン、６個
のヒスチジン残基から成るタグ、続いてタバコエッチウ
イルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位、続いてＬｙｓ
１４残基で開始するヒトＰＤＨＫ−２配列、をコードす
るＤＮＡ配列を含む発現構築物である。その結果生じる
タンパク質の発現および精製の後、結晶化を試行したと
ころ、ごく小さな結晶が得られただけで；ＭＡＬＤＩ−
ＴＯＦ質量分光測定に付すと、二つの主要タンパク質分
子種、すなわち完全長のものおよびＴＥＶプロテアーゼ
切断部位内で短小化されたもの、が検出された。

【００４１】二次構造予測から、該Ｎ末端部における短
小化は、推定らせん領域の開始点付近で生じているらし
かった。このヘリックスノ開始残基はＡｌａ１６と推定
された。

【００４２】上述のすべてのデータから、該タンパク質
のＮ末端領域は、相当柔軟性があり、結晶格子のパッキ
ングに悪影響を及ぼすらしいこと、該構造のより束縛さ
れた部分は、Ａｌａ１６で開始する推定ヘリックスでス
タートするらしいこと、が示唆された。それ故、ヒトＰ
ＤＨＫ−２配列のＡｌａ１６位で開始する構築物のデザ
インに集中することとした。ヘキサヒスチジンタグは精
製の便宜上包含させ、そして精製中および結晶化前に該
タグを除去できるように、トロンビン切断部位を操作導
入した。

【００４３】実施例２：結晶化可能なＰＤＨＫ−２のク
ローニングおよび発現ヒトＰＤＨＫ−２の配列に基づき、所望配列のポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅に使用するため、オリゴヌ
クレオチドプライマー類をデザインした（Ｇｕｄｉ，
Ｒ．ら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
０、２８９８９−２８９９４，ＧｅｎＢａｎｋアクセス
番号Ｌ４２４５１）。該５´プライマーは、ＡＴＧ開始
コドンの後に、６個のヒスチジン残基、続いてトロンビ
ン切断部位をコードし、それから残基Ａｌａ１６でスタ
ートするヒトＰＤＨＫ−２とインフレームでリンキング
する、ＤＮＡ配列を含むようにデザインした。両プライ
マーは、所望のベクター中へ該ＰＣＲ産物を挿入し易く
するために、制限エンドヌクレアーゼ部位を含んでい
る：５´プライマー：ＰＤＨＫ−２Ｆａｓｔ５´ＨｉｓＴｈ
ｒ（配列番号６）：５´−ＣＧＴＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣ
ＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣＣＴＴＣＴＧＧＴ
ＴＣＣＧＣＧＴＧＧＡＴＣＴＧＣＧＣＣＣＡＡＧＴＡＣ
ＡＴＡＧＡＧＣＡＣＴＴＣ−３´ ３´プライマー：ＰＤＨＫ−２Ｆａｓｔ３´（配列番号
７）：ＣＧＴＴＣＴＡＧＡＣＴＡＴＣＡＣＧＴＧＡＣＧ
ＣＧＧＴＡＣＧＴＣＧＡＣＧ−３´ ＤＮＡ断片類は、完全長ヒトＰＤＨＫ−２を含むクロー
ンからＰＣＲ増幅により作製した。ＧｅｎＢａｎｋアク
セスＬ４２４５１に示される公開ヒトＰＤＨＫ−２配列
と異なり、いくつかのサイレント単一ヌクレオチド差異
を含むことは別として、コドン８０は、公開配列中のト
レオニンに代ってセリンをコードする（配列番号１）。

【００４４】ＰＣＲ反応は、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂，
０．２ｍＭｄＮＴＰｓ，５０ｐｍｏｌの各プライマー、
５μl １０x反応緩衝液（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓ
ｔｉｃｓ），０．２μｌ鋳型（１ｎｇ）（完全長ヒトＰ
ＤＨＫ−２ｃＤＮＡを含むプラスミド）、および２．５
単位ＥｘｐａｎｄＤＮＡポリメラーゼ（ＲｏｃｈｅＤ
ｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含む溶液の全容量５０μｌ
中、３０サイクルを実施した。各サイクルは、９４℃１
分間、５０℃1分間および７２℃２分間より成る。増幅
されたＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動で分離
し、所望のＰＣＲ産物をＱＩＡクイックゲル抽出キット
（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。次に、該精製ＰＣ
Ｒ産物を、Ｍｕｌｔｉｃｏｒｅ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）を用い３７℃２時間、ＥｃｏＲ１およびＸｂａ１に
より消化した。次いで該消化断片は、やはりＥｃｏＲ１
／Ｘｂａ１により消化したｐＦａｓｔｂａｃ１（Ｌｉｆ
ｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中へ、製造会社の取扱
説明に従ってＤＮＡリガーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い
て１２℃１２時間、ライゲーションした。そのライゲー
ション混合物は、ＢｉｏＲａｄＧｅｎｅＰｕｌｓｅ
ｒ（キャパシタンス２５μＦＤ、電圧２．５Ｖ、抵抗２
００Ω）を用いて、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ（ＴＯＰ１０）
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中へエレクトロポレーション
した。

【００４５】所望の挿入断片を含むクローンを、１００
μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ＹＴプレートを用いる
ことにより選択し、そしてエンドヌクレアーゼ消化を用
い、続いてアガロースゲル電気泳動により、正しいサイ
ズの挿入断片の存在についてチェックした。ＤＮＡ配列
分析はＬａｒｋ（Ｓａｆｆｒｏｎ，Ｗａｌｄｏｎ，英
国）により実施した。該ＤＮＡ挿入断片の配列を配列番
号３として示す。

【００４６】組換え体バックミド（ｂａｃｍｉｄ）ＤＮ
Ａを、上記の組換え体ｐＦａｓｔｂａｃ１プラスミドＤ
ＮＡで、大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１０ＢＡＣ^TMを形質転
換することにより産生した。これは、ＢａｃｔｏＢ
ａｃバキュロウイルス発現マニュアル（ＬｉｆｅＴｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の方法に従って、行った。該
バックミドへの転位の成功を確認するために、ｐＵＣ／
Ｍ１３増幅プライマーを用いるＰＣＲ分析によった（Ｌ
ｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。

【００４７】一次バキュロウイルス株の作製は、Ｓｆ−
９昆虫細胞を用いるトランスフェクションにより行っ
た。正しい挿入断片を含むバックミドＤＮＡを、ＣＥＬ
ＬＦＥＣＴＩＮ^TMトランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合し、ＳＦ−９００
ＩＩ無血清培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ）を用い、単層のＳｆ−９昆虫細胞へ添加した。２７
℃で７２時間インキュベーション後、その上清を初期バ
キュロウイルス株として収穫した。この株は、三角フラ
スコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中のＳｆ−９昆虫細胞の懸濁液
へ該初期バキュロウイルス株を加え、２７℃１２５ｒｐ
ｍの撹拌で、増幅した。後期感染の６日後、その上清を
遠心分離により収穫し、作業ウイルス株として４℃に貯
蔵した。この株の力価は、ＢａｃｔｏＢａｃバキュ
ロウイルス発現マニュアル（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ）にある通常のプラークアッセイ分析により測
定した。

【００４８】タンパク質発現は、感染多重度（ＭＯＩ）
および収穫時間を種々変えながら、Ｓｆ−９およびＴ．
ｎｉＨｉ−５昆虫細胞培養を用い、三角フラスコ培養で
最適化し、次いで見い出された最適条件をファーメンタ
ーへスケールアップした。使用したファーメンターは、
Ａｐｐｌｉｋｏｎ１０３０バイオコントローラーを用い
て制御されたオートクレーブ可能なＡｐｐｌｉｋｏｎ３
リットル容撹拌式容器である。Ｔ．ｎｉＨｉ−５細胞の
接種物は、最初、震盪フラスコ培養体として調製され
た。Ｅｘｃｅｌ４０５無血清培地（ＪＲＨＢｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅｓ）中で作られた５ｘ１０⁵細胞／ｍｌを
該ファーメンターに接種した。温度は２７℃に制御し、
溶存酸素濃度は６０％に制御し、そしてｐＨは測定した
が、制御はしなかった。酸素濃度は、当初、ヘッドスペ
ースへの空気流に酸素を加え、次いで該培養物に純酸素
を散布することにより、制御した。培養液内のマリンイ
ンペラーと液体／ヘッドスペース界面のラッシトンイン
ペラーとの二重インペラーシステムで、撹拌を１５０ｒ
ｐｍにセットした。通気は０．５ｌ／分でヘッドスペ
ースへ連続して行った。

【００４９】生細胞密度が２ｘ１０⁶細胞／ｍｌに達し
た時点で、該培養体を、力価を測定したバキュロウイル
ス作業株からの２のＭＯＩを用いて感染した。該培養体
の収穫時間は、感染後７２時間であった。これは、２０
００ｇで１５分間の遠心分離により行い；次いで該昆虫
細胞ペレットを精製用に−８０℃で貯蔵した。

【００５０】実施例３：Ｈｅｘａ−Ｈｉｓ−ＰＤＨＫ−
２^*の精製および該ヘキサ・ヒスチジンタグの除去配列番号５で示される配列をもつＰＤＨＫ−２^*を５工
程で精製した：（１）該発酵からのペレットを、湿細胞
重量１ｇ当り１０ｍｌの溶解緩衝液中に再懸濁し、Ｃｏ
ｎｓｔａｎｔＳｙｓｔｅｍｓ連続細胞破砕器を用い、
２０ｋｐｓｉの圧力で機械的に粉砕した。該溶解緩衝液
は、５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８），１５０ｍＭ
塩化ナトリウム，１０ｍＭイミダゾール，５ｍＭ β−
メルカプトエタノールより成り、無ＥＤＴＡプロテアー
ゼインヒビターカクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ）を含んでい
た。該溶解物を冷却し、１４，０００ｇで４５分間遠心
分離して、細胞残渣を除去した。（２）該上清を集め、
２０ｍｌドリップカラムおよび３ｍｌ樹脂ベッド容量を
用い、Ｎｉｃｋｅｌ−ＮＴＡＳｕｐｅｒｆｌｏｗキレ
ート（Ｑｉａｇｅｎ）に適用した。該樹脂は、最初、１
０カラム容量の溶解緩衝液で洗い、そして１００ｍＭイ
ミダゾールを含む溶解緩衝液で溶離した。（３）該溶離
画分は、次いで、７５ｍｌＧ−２５ｆｉｎｅ脱塩カラム
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、７．５ｍｌ／分の流速
で、トロンビン切断緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ
（ｐＨ８），１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよび２．５ｍ
ＭＣａＣｌ₂）へ緩衝液交換を行った。該脱塩タンパ
ク質画分をプールし、トロンビン（ＳｉｇｍａＴ−１０
６３）を、溶液中５ＮＩＨ単位／ｍｇタンパク質の終濃
度になるように添加した。室温で３時間インキュベーシ
ョンし、次いでヘキサ・ヒスチジンタグの除去を可能に
する処理をした。（４）トロンビン切断後、該試料を、
３ｍｌＮｉｃｋｅｌ−ＮＴＡＳｕｐｅｒｆｌｏｗカ
ラム（Ｑｉａｇｅｎ）に付し、そして通過液を集めた。
切断されたＰＤＨＫ−２^*の残りは、１０ｍＭイミダゾ
ールを含むトロンビン切断緩衝液を用いる溶離により、
該カラムから外した。（５）通過液および１０ｍＭイミ
ダゾール画分を合一し、１０ｋＤａ遠心濃縮器（Ｖｉｖ
ａｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて２ｍｇ／ｍｌに濃縮して、
Ａｋｔａ−Ｅｘｐｌｏｒｅｒ精製システム（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）により、
２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８），１５０ｍＭ塩化
ナトリウムおよび１ｍＭＤＬ−ジチオスレイトールで
予め平衡化したＳｅｐｈａｃｙｌ−２００ｐｒｅｐｇ
ｒａｄｅ１６／６０カラムへ、０．７５ｍｌ／分で負
荷した。溶離された画分群をＴｒｉｓ−グリシンＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲルに掛け、ＰＤＨＫ−２^*を含む画分をプ
ールした。次いでそれらは、結晶化まで−８０℃に貯蔵
した。

【００５１】実施例４：Ｈｅｘａ−Ｈｉｓ−ＰＤＨＫ−
２^*の精製Ｈｅｘａ−Ｈｉｓ−ＰＤＨＫ−２^*、すなわち配列番号
４で示される配列をもつ、実施例２で作られた構築体の
発現産物を、トロンビン切断材料（ＰＤＨＫ−２^*）に
ついて、上の実施例３に記載のような工程（１）および
（２）により精製した。次に、その１００ｍＭイミダゾ
ール画分をプールし、１０ｋＤａ遠心濃縮器（Ｖｉｖａ
ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて２ｍｇ／ｍｌに濃縮し、そし
てＡｋｔａ−Ｅｘｐｌｏｒｅｒ精製システム（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）によ
り、２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８），１５０ｍＭ
塩化ナトリウムおよび１ｍＭＤＬ−ジチオスレイトー
ルで予め平衡化したＳｅｐｈａｃｙｌ−２００ｐｒｅｐ
ｇｒａｄｅ１６／６０カラムへ、０．７５ｍｌ／分
で負荷した。溶離された画分群をＴｒｉｓ−グリシンＳ
ＤＳＰＡＧＥゲルに掛け、ｈｅｘａ−Ｈｉｓ−ＰＤＨ
Ｋ−２^*を含む画分をプールした。次いでそれらは、結
晶化まで−８０℃に貯蔵した。

【００５２】実施例５：ＰＤＨＫ−２^*，リガンドされ
たＰＤＨＫ−２^*、およびｈｅｘａ−Ｈｉｓ−ＰＤＨＫ
−２^*の結晶化（ａ）ＰＤＨＫ−２^*の結晶化実施例３の記載のようにして得られた最終ゲル濾過カラ
ムからのＰＤＨＫ−２ ^*画分を、１０ｋＤａ遠心濃縮器
（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて３，０００ｒｐ
ｍ、４℃で、１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。結晶化試行
は、４℃での懸垂滴蒸気拡散（ｈａｎｇｉｎｇｄｒｏ
ｐｖａｐｏｕｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）を用いて、設
定した。ＰＤＨＫ−２^*は、１００ｍＭ酢酸ナトリウム
ｐＨ５．２−５．８，５−１０％イソプロパノールおよ
び２５−１５０ｍＭ塩化マグネシウムを用いる条件の範
囲で結晶化した。結晶化に先立って、１０ｍｇ／ｍｌで
のＰＤＨＫ−２^*を、エッペンドルフ遠心機中１４，０
００ｒｐｍで２分間遠心分離した。９５０μｌの溜（ｒ
ｅｓｅｒｖｏｉｒ）容量を用い、２μｌの溜試薬および
２μｌのＰＤＨＫ−２^*の滴液をカバースリップ上、該
溜の上に吊り下げた。ＰＤＨＫ−２^*のより大型の結晶
は、６−９％イソプロパノールおよび７５−１２５ｍＭ
塩化マグネシウムでｐＨ５．６−５．８において得られ
た。それらの結晶は、格子次元ａ＝ｂ＝１０９．３Å，
ｃ＝８５．１Åで空間群Ｐ６₄に属する。それらは１非
対称単位当り１分子を含み（Ｍ_W＝４４．６ｋＤａ）、
６２％の溶媒含量であった（Ｖ_M＝３．２９；Ｍａｔｔ
ｈｅｗｓ，Ｂ．Ｗ．（１９６８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．３３、４９１−４９７）。結晶は一晩で現れ、最
長２週間成長を続けた。

【００５３】（ｂ）化合物１とのＰＤＨＫ−２^*の共結
晶化共結晶化研究については、ＰＤＨＫ−２^*を、モル比で
３倍過剰に化合物１（４−｛（２，５）−ジメチル−４
−［３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−
メチルプロパノイル］ピペラジニル｝カルボニル）ベン
ゾニトリル；Ａｉｃｈｅｒ，Ｔ．ら（１９９９）Ｊ．Ｍ
ｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２、２７４１−２７４６）と混合
してから、１０ｍｇ／ｍｌへ濃縮し、結晶化試行に使用
した。このリガンドされたＰＤＨＫ−２^*は、リガンド
されないＰＤＨＫ−２^*と同様な条件で結晶化した。そ
のリガンドされたＰＤＨＫ−２^*は、１００ｍＭＭＥ
ＳｐＨ６，１０％イソプロパノールおよび２００ｍＭ酢
酸カルシウム中でも、良い結晶を生じた。

【００５４】（ｃ）Ｈｅｘａ−Ｈｉｓ−ＰＤＨＫ−２^*
の結晶化前記ｈｅｘａ−Ｈｉｓ−ＰＤＨＫ−２^*貯蔵液を、１０
ｋＤａ遠心濃縮器（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、
３，０００ｒｐｍ４℃で１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。Ｈ
ｅｘａ−Ｈｉｓ−ＰＤＨＫ−２^*の単斜晶系結晶は、１
００ｍＭクエン酸ｐＨ５．６，１５％ＰＥＧ４Ｋおよ
び２００から４００ｍＭの間の酢酸アンモニウムから、
４℃で懸垂滴蒸気拡散により成長した。該結晶は、２−
３週間にわたり凝結物から薄板として成長し、単位格子
次元ａ＝９０．８Å，ｂ＝５３．８Å，ｃ＝８３．３
Å，β＝１０５．６４゜をもち空間群Ｃ２に属した。

【００５５】実施例６：ＰＤＨＫ−２^*のデータ収集、
構造決定および精製組換え体ヒトＰＤＨＫ−２^*の構造は、三つの重原子誘
導体を用い、多重同形置換（ＭＩＲ）により解明した
（Ｄｒｅｎｔｈ，Ｊ．（１９９４）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ
ｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎＸ−ｒａｙｃｒｙｓｔａ
ｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ，ニューヨーク）。水銀、イリジウムおよびオスミウ
ム重原子誘導体は、１ｍＭチオサリチル酸エチル水銀，
５ｍＭＫ₂ＩｒＣｌ₆，または１０ｍＭＫ₂ＯｓＣｌ₆
をそれぞれ含む安定化溶液（１００ｍＭ酢酸ナトリウム
緩衝液ｐＨ５．８中９％イソプロパノール）中に１６−
１８時間結晶を浸漬（ソーキング）することにより調製
した。

【００５６】データ収集のために、安定化溶液および３
０−３５％グリセロールから成る低温保護緩衝液（ｃｒ
ｙｏ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ）を用い、
タンパク質結晶を１００Ｋでフラッシュ凍結した。天然
物のＸ線回折データ、すなわち重原子をもたないＰＤＨ
Ｋ−２＊結晶については、英国Ｓ．Ｒ．Ｓ．Ｄａｒｅｓ
ｂｕｒｙの、ステーション９．６（λ＝０．８７００
Å）でのＡＤＳＣＱｕａｎｔｕｍ４ＣＣＤ検出器に
より１００Ｋで収集した。重原子誘導体についての回折
データは、ＣｕＫα放射線を使用し、実験回転陽極発振
器上、ＲｉｇａｋｕＲＡＸＩＳ−２またはＲＡＸＩＳ
−４イメージプレート検出器により、１００Ｋで収集し
た。すべてのデータはＨＫＬパッケージを用いて処理し
た（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．およびＭｉｎｏｒ，
Ｗ．（１９９７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．
２７６、３０７−３２６）。データ収集統計値は、表１
に要約してある（実施例の節末を参照されたい）。

【００５７】重原子誘導体データは、ＳＣＡＬＥＩＴ
（ＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＣｏｍｐｕｔａｔｉｏ
ｎａｌＰｒｏｊｅｃｔＮｕｍｂｅｒ４（１９９
４）ＡｃｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５０，７
６０−７６３：ＣＣＰ４ｓｕｉｔｅ）で、天然データに
目盛り合せを行った。差パターソンおよび差フェーリエ
分析により、初期重原子位置を同定した。該重原子パラ
メーターおよび位相計算の精製は、ＳＨＡＲＰ（ｄｅ
ＬａＦｏｒｔｅｌｌｅ，Ｅ．およびＢｒｉｃｏｇｎ
ｅ，Ｇ．（１９９７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏ
ｌ．２７６、４７２−４９４）により実施した。位相
は、ＳＯＬＯＭＯＮ（Ａｂｒａｈａｍｓ，Ｊ．Ｐ．およ
びＬｅｓｌｉｅ，Ａ（１９９６）ＡｃｔａＣｒｙｓｔ
ａｌｌｏｇｒ．Ｄ５２、３０−４２）により、溶媒偏平
率について１２０サイクルで改善された。その結果得ら
れたマップは、高品質であり、ＱＵＡＮＴＡ（Ｑｕａｎ
ｔａ９８（１９９８）バージョン９８．１１１１；Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌａｔｉｏｎｓＩｎｃ．，
サンディエゴ、カリフォルニア９２１２１−３７５２）
を用いて、該構造の約７５％をトレースするのに使用し
た。

【００５８】該原子座標は表３に示す（実施例の節末を
参照されたい）。該モデルは、実験天然（Ｆ_P）および
誘導体（Ｆ_PH）構造因子類の組合せからＳＨＡＲＰによ
って得られた天然構造因子類（Ｆ_P−ｃａｌｃ）のセッ
トに対して、それぞれの重原子の寄与（Ｆ_H）を差引い
て、精製した。精製は、“ｍｌｈｌ”最尤標的関数によ
りＣＮＸ（Ｂｒuｎｇｅｒ，Ａ．ら（１９９８），Ａｃ
ｔａＣｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４、９０５−９
２１）を用いて、解像度範囲３０−２．２Åで行った。
精製の際、モデル位相は、ＳＨＡＲＰにより提供された
実験位相確率分布と組合せた。平坦バルク溶媒モデルお
よび異方性Ｂ因子補正からの部分構造因子類は、該精製
を通じて供給した。現行モデルについてのＲ因子は、解
像度範囲３０−２．２Åにおけるすべてのデータについ
て０．２６７（フリーＲ因子、データの５％、０．２９
７）である。該精製統計値は表２に要約してある（実施
例の節末を参照されたい）。

【００５９】該現行モデルは、該構築体中に存在する３
９４残基のうち３５５残基を含み、該ポリペプチド鎖の
大部分の領域で、鮮明に解像されている。電子密度は、
残基４０−４３、７３−７９、１０５−１０９、３１０
−３１２および３７５−３９２で弱い。残基１７８−１
８５、３１３−３２６および３９３−４０７については
説明可能な電子密度は観察されなかった。後者は、該モ
デルには含まれず、そして残基３８６−３８７はアラニ
ンとモデルされている。

【００６０】実施例７：ＰＤＨＫ−２^*タンパク質／リ
ガンド複合体の調製、データ収集、構造決定および精製化合物１との複合体でのＰＤＨＫ−２^*の結晶は、上の
実施例５（ｂ）に記載のような共結晶化によって得た。
化合物２（Ｎ−｛４−［（エチルアニリノ）スルフォニ
ル］−２−メチルフェニル｝−３，３，３−トリフルオ
ロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパンアミド；特許
出願ＷＯ９９／６２８７３の実施例１２）および化合物
３（Ｎ−（２−アミノエチル）−２−｛３−クロロ−４
−［（４−イソプロピルベンジル）オキシ］フェニル｝
アセタミド；実施例１０を参照）との複合体でのＰＤＨ
Ｋ−２^*の結晶は、１ｍＭ濃度に前記阻害剤を含む安定
化溶液中に、アポ結晶、すなわち上の実施例５に記載の
ようにリガンドされないＰＤＨＫ−２^*で調製された結
晶を、浸漬（ソーク）することにより調製した。ＡＴＰ
との複合体でのＰＤＨＫ−２^*の結晶は、１０ｍＭＡＴ
Ｐを含む安定化溶液中に化合物１の存在下に成長させた
結晶をソークすることにより得た。ＡＤＰおよびＤＣＡ
との複合体でのＰＤＨＫ−２^*の結晶は、それぞれ１０
ｍＭおよび１００ｍＭの濃度にＡＤＰおよびＤＣＡを含
む安定化溶液中に、アポ結晶をソークすることにより得
た。

【００６１】データ収集のために、安定化溶液および３
０−３５％グリセロールから成る低温保護緩衝液を用
い、タンパク質結晶を１００Ｋでフラッシュ凍結した。
化合物１、化合物２、およびＡＴＰと化合物１の両者と
の複合体でのＰＤＨＫ−２^*の回折データは、フラン
ス、グルノーブル、ＥｕｒｏｐｅａｎＳｙｎｃｈｉｏ
ｔｒｏｎＲａｄｉａｔｉｏｎＦａｃｉｌｉｔｙ（Ｅ
ＳＲＦ）の、ビームラインＩＤ１４−２（λ＝０．９３
２６Å）でのＡＤＳＣＱｕａｎｔｕｍ４ＣＣＤ検出
器上、１００Ｋで収集した。化合物３との複合体でＰＤ
ＨＫ−２^*の回折データは、ＣｕＫα放射線を使用し、
実験回転陽極発振器を備えたＲｉｇａｋｕＲＡＸＩＳ−
２イメージプレート検出器上、１００Ｋで収集した。Ａ
ＤＰおよびＤＣＡ両者との複合体でのＰＤＨＫ−２^*の
回折データは、英国、Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ，Ｓｙｎｃｈ
ｉｏｔｒｏｎＲａｄｉａｔｉｏｎＳｏｕｒｃｅ（Ｓ
ＲＳ）の、ステーション９．６（λ＝０．８７Å）での
ＡＤＳＣＱｕａｎｔｕｍ４ＣＣＤ検出器上、１００Ｋ
で収集した。データ処理は、ＨＫＬプログラムパッケー
ジで行った（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．およびＭｉｎ
ｏｒ，Ｗ（１９９７）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏ
ｌ．２７６、３０７−３２６）。データ収集統計値は
表１に要約してある（実施例の節末を参照されたい）。

【００６２】それらの構造は、モデル位相を計算するた
めに、リガンドされないＰＤＨＫ−２^*を用いて差フェ
ーリエ法により決定し、それからＣＮＸを用いて精製し
た（Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ．ら（１９９８），Ａｃｔａ
Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５４、９０５−９２１）。
相互作用グラフィックモデル構築はＱＵＡＮＴＡ（Ｑｕ
ａｎｔａ（１９９８）バージョン９８．１１１１；Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＳｉｍｕｌａｔｉｏｎｓＩｎｃ．，
サンディエゴ、カリフォルニア９２１２１−３７５２）
により行った。すべての構造において、それぞれのリガ
ンドは、初期電子密度マップにより明瞭に解像された。
精製統計値の要約については、表２を参照されたい（実
施例の節末を参照）。ＰＤＨＫ−２上のＤＣＡの結合部
位は、係数として［ｆ_obs（ＡＤＰ／ＤＣＡ）−ｆ
_obs（天然）］ｅｘｐｉα_calc（天然）を用いて差フェ
ーリエマップを計算することにより同定したが、ここで
ｆ_obs（ＡＤＰ／ＤＣＡ）はＡＤＰおよびＤＣＡの両者
とともにソークされたＰＤＨＬ−２^*の実測された構造
因子振幅、ｆ_obs（天然）はリガンドされないＰＤＨＫ
−２^*の測定された構造因子振幅、そしてα_calc（天
然）はリガンドされないＰＤＨＫ−２^*の精製モデルに
由来する位相である（実施例６）。該原子座標は、表
４、５、６、７および８に示す（実施例の節末を参照さ
れたい）。

【００６３】実施例８：ＰＤＨＫ−２の構造ＰＤＨＫ−２^*の構造は図１に要約されており、それ
は、下記の本文中の引用のように表示される、観察され
た二次構造特徴（Ｈを付したボックスはαヘリックスに
関与する残基を示し、Ｓを付したボックスはβ鎖に関与
する残基を示す）を注釈した、ＰＤＨＫ−２^*のペプチ
ド配列を示している。太字の残基は、四つのヒトＰＤＨ
Ｋアイソザイムすべてで保存されているものである（全
体で４９％、調節ドメインで４５％、触媒ドメインで５
２％）。（＊）で標識された残基は化合物１と直接接触
（すなわち、４Åの距離内）しており；ＡＴＰと直接接
触する残基は（‡）で標識され；同定された第三の部位
に結合する化合物（化合物３）と直接接触する残基は
（†）で標識され；二量体界面に関与する残基は（・）
で標識され；ＤＣＡ結合ポッケトを形成する残基は
（♯）で標識されている。小文字で示した残基は天然酵
素の構造中では順序が異なる（実施例６）。ヒトＰＤＨ
Ｋ−２の配列は、残基Ａｌａ１６で開始する。二つの先
行残基（ＧｌｙおよびＳｅｒ）は、操作されたトロンビ
ン切断部位から生じ、該ｐＤＨＫ−２配列をＮ末端ヘキ
サ・ヒスチジンタグへ連結している。

【００６４】（ａ）天然構造および二量体集合の説明実施例３に記載のように調製され、実施例５（ａ）に記
載のように結晶化され、上の実施例６に記載のように解
明されたＰＤＨＫ−２^*の構造は、以下のように説明で
きる：ＰＤＨＫ−２は二つのドメインから構成されてい
る（図２参照）。その図はＰＤＨＫ−２構造のリボンダ
イアグラムを示す。Ｎ末端調節ドメインは暗灰色で、Ｃ
末端触媒ドメインは淡灰色で示されている。さまざまな
部位に結合するリガンドは、玉と棒のモデルとして示さ
れており：ＡＴＰ−Ｍｇ²⁺は暗灰色、化合物１は白、化
合物２は黒、化合物３は中間的灰色、ＤＣＡ（ヘリック
スα６の後ろに隠れている）は淡灰色である。末端およ
び二次構造エレメントは標識されている。ヘリックスα
１３はヘリックスα３とα５の後ろに隠れている。基質
タンパク質のヘリックスのための可能性ある結合部位を
含む、調節および触媒ドメイン間のグルーブの位置は、
矩形で示してある。

【００６５】Ｎ末端ドメイン（残基１４−１７７）の構
造は、ゆがんだ逆平行４ヘリックスバンドルコアをもつ
８ヘリックスから成る。該コアはヘリックスα３、α
５、α６＋α７およびα８により形成されている。ヘリ
ックスα１およびα２は、中央の４ヘリックスバンドル
に先行するが、一方短いヘリックスα４はヘリックスα
３およびα５を接続する。該ＰＤＨＫ−２Ｎ末端ドメイ
ンとＰＤＢとのトポロジー比較からは、該４ヘリックス
バンドル以外は、他の既知タンパク質との追加すべき顕
著な相同性は認められなかった。

【００６６】ＰＤＨＫ−２のＣ末端ドメイン（残基１８
６−４０７）は、５つのヘリックスと８本の鎖から成
る。それは、該結晶構造中では乱れている８残基により
調節ドメインに接続されている。その中央モチーフは、
開いた５本鎖混合βシートで、右方に約４０゜ねじれて
いる。それは、鎖β３、β５、β６、β８およびβ７
（方向＋＋−＋−）により形成され、ヘリックス（α
９、α１０、α１１およびα１２）の層により片側が隣
接されている。同じ側だが、中央βシートに垂直に配向
して、鎖β１、β２、およびβ４が別の逆平行βシート
を形成する。

【００６７】ＰＤＨＫ−２のＣ末端ドメインは、ＧＨＫ
Ｌスーパーファミリー（総説についてはＤｕｔｔａ，
Ｒ．およびＩｎｏｕｙｅ，Ｍ．（２０００）Ｔｒｅｎｄ
ｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５、２４−２８を参
照されたい）に属し、その名は、ジャイレース（Ｇｙｒ
ａｓｅ）Ｂ（Ｗｉｇｌｅｙ，Ｄ．Ｂ．ら（１９９１）Ｎ
ａｔｕｒｅ３５１、６２４−６２９；Ｂｒｉｎｏ，
Ｌ．ら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
５、９４６８−９４７５），Ｈｓｐ９０（Ｏｂｅｒｍａ
ｎｎ，Ｗ．Ｍ．Ｊ．ら（１９９８）Ｊ．ＣｅｌｌＢｉ
ｏｌ．１４３、９０１−９１０），細菌のヒスチジン
キナーゼ類（ｋｉｎａｓｅｓ）（Ｔａｎａｋａ，Ｔ．
ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９６、８８−９２：Ｂ
ｉｌｗｅｓ，Ａ．Ｍ．ら（１９９９）Ｃｅｌｌ９６、
１３１−１４１）、およびＭｕｔＬ（Ｂａｎ，Ｃ．ら
（１９９９）Ｃｅｌｌ９７、８５−９７）の原型的Ａ
ＴＰ結合ドメインに因む。相同性ドメイン類の重ね合せ
により、保存性構造モチーフとして、５本鎖混合βシー
ト（ＰＤＨＫ−２の鎖β４、β５、β６、β８およびβ
７に相当）および４ヘリックス（ＰＤＨＫ−２のα９、
α１０、α１１およびα１２に相当）が同定された。Ｐ
ＤＨＫとヒスチジンキナーゼ類は同じトポロジーをもつ
が、中央βシートの第１鎖および先行ヘリックス（ＰＤ
ＨＫ−２におけるβ４およびα９）は、ＧｙｒＢ，Ｈｓ
ｐ９０，およびＭｕｔＬのＣ末端へ転置している。後者
はまた、保存性βシートの第５および第４鎖の間に二つ
の逆平行β鎖の挿入を含む。

【００６８】ヘリックスα１３を含むＰＤＨＫ−２の４
０個のＣ末端残基は、前記調節ドメインおよび対称関連
分子（下記参照）と相互作用する球状ＡＴＰ結合ドメイ
ンの延長である。ＰＤＨＫ−２のＮ末端およびＡＴＰ結
合ドメイン間の相互作用は、次のように要約できる：ル
ープα１−α２はループβ８−α１３と相互作用する。
ヘリックスα２は鎖β１およびβ２と相互作用する。ヘ
リックスα３のＣ末端部分は、ループβ８−α１３およ
びヘリックスα１３と相互作用する。ヘリックスα７は
ループα１１−α１２と相互作用する。ヘリックスα８
は、ループα１１−α１２、ヘリックスα１２およびヘ
リックスα１３と相互作用する。

【００６９】調節および触媒ドメインの間に、長さ２５
Åおよび径１０Åのおよその寸法をもつ大きい真直ぐな
グルーブがある（図２参照）。そのグルーブの大きさな
らびにＡＴＰ結合部位に近接していることから、該基質
タンパク質のヘリックスに対する結合部位の可能性が示
唆される。しかし、ラットのＸ線構造およびラットのリ
ポイルドメイン（Ｌ２）のモデルに基づき、調節および
触媒ドメインの間のグローブは、ＰＤＨ複合体のリポイ
ルドメイン（Ｌ２）に対する結合部位であると提案され
ている（Ｓｔｅｕｓｓｙら（２００１），Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（４０）、３７４３３−３７４５
０）。二量体集合：該結晶構造では、ＰＤＨＫ−２の二
つの分子が、二倍結晶回転軸（ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ
ａｐｈｉｃｔｗｏ−ｆｏｌｄｒｏｔａｔｉｏｎａ
ｘｉｓ）（白で単量体Ａを、黒で単量体Ｂを示し、紙面
に垂直な該二倍結晶回転軸から見た図（上図）および該
二つ折り回転軸に沿って見た図（下図）を示す図３を参
照されたい。両単量体の末端は、電子密度マップで見え
る限り、表示してある）によりつながれている。それに
対応する界面は、各分子の表面積の２０４０Å²を占め
ることから、それは生体的に適切な分子二量体界面であ
ることを示唆している（Ｊａｎｉｎ，Ｊ．（１９９７）
Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．４、９７３−９７
４）。ＰＤＨＫが二量体集合している可能性に対する別
の証拠は、ウシ腎臓およびラット心臓から精製された場
合、該タンパク質がアイソザイム１および２のヘテロダ
イマーになっているという知見により、提供される（Ｓ
ｔｅｐｐ，Ｌ．Ｒ．ら（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２５８、９４５４−９４５８；Ｐｏｐｏｖ，
Ｋ．Ｍ．ら（１９９１）ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎＰｕｒｉｆ．２、２７８−２８６；Ｐｏｐｏ
ｖ，Ｋ．Ｍ．ら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６９、２９７２０−２９７２４；Ｌｉｕ，Ｓ．、Ｂ
ａｋｅｒ，Ｊ．Ｃ．およびＲｏｃｈｅ，Ｔ．Ｅ．（１９
９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、７９３−８
００）。

【００７０】主な接触は、該触媒ドメイン類の中央βシ
ートにより形成される。加えて、ＰＤＨＫの（ヘリック
スα１３を含む）４０個Ｃ末端残基は、（この領域の弱
い電子密度に示されるように）高度に柔軟なアームを形
成し、一つの単量体の触媒ドメインから対称関連分子へ
と伸びている。下記の残基類が二量体相互作用に関与す
る（すなわち、対称関連単量体の４Å以内の距離にあ
る）：ループα１−α２の残基２８および３０；ヘリッ
クスα８の残基１５３、１５７、および１６０；鎖β３
およびループβ３−β４の残基２２７および２２９；鎖
β５の残基２７６；ループβ５−β６の残基２８０−２
８２；鎖β６の残基２８３、２８５および２８７；ルー
プβ６−α１１およびヘリックスα１１の残基２９６−
２９８；鎖β７の残基３４３、３４７および３４８；ル
ープβ７−８の残基３４９−３５２；鎖β８の残基３５
５および３５９；ループβ８−α１３の残基３７０−３
７３；ヘリックスα１３の残基３７５、３７７、３７８
および３８０；柔軟なＣ末端二量体化アームの残基３８
１、３８５および３８８−３９２。

【００７１】本明細書に報告された結晶構造は、前記の
提示された二量体化界面で結合するリガンドをデザイン
するのに、使用可能である。ＰＤＨＫの二量体形成が効
果的なＰＤＨ複合体不活性化に必要であれば、ＰＤＨＫ
二量体化の量を調節することにより、ＰＤＨ複合体活性
を調整することができるであろう。

【００７２】（ｂ）ＡＴＰ結合部位の説明：競合阻害の
標的ＰＤＨＫ−２^*の構造は、触媒ドメインのＡＴＰ結合部
位に結合したＡＴＰおよび合成リガンドの存在下でを決
定した（ＰＤＨＫ−２のＡＴＰ結合部位に配位している
水分子とともにＡＴＰ（太線）およびＭｇ²⁺イオンを示
す図４を参照されたい。このモデルは、該モデル中のＡ
ＴＰ：Ｍｇ²⁺複合体の取込み前に計算された２．４Åで
のｆ_obs−ｆ_calc差密度マップ（等高線レベル：２．５
σ）上に重ねてある。）。該結合ポケットは、中央βシ
ートとヘリックスの隣接層との間に位置する。それは、
ヘリックスα１０（Ｇｌｕ２５１，Ｌｅｕ２５２，Ｌｙ
ｓ２５４，Ａｓｎ２５５，Ａｌａ２５６，Ａｒｇ２５
８，Ａｌａ２５９）、鎖β７（Ｍｅｔ２８８，Ｓｅｒ２
８９，Ａｓｐ２９０）、ループβ７α１１（Ｇｌｙ２９
２，Ｇｌｙ２９３，Ｇｌｙ２９４，Ｖａｌ２９５）、ヘ
リックスα１１（Ｉｌｅ３００，Ｌｅｕ３０３）、ルー
プα１１α１２（Ｌｅｕ３２３，Ａｌａ３２４，Ｇｌｙ
３２５，Ｐｈｅ３２６）、ヘリックスα１２（Ｇｌｙ３
２７，Ｔｙｒ３２８，Ｇｌｙ３２９，Ｌｅｕ３３０，Ｐ
ｒｏ３３１）、鎖β７（Ｌｅｕ３４６，Ｓｅｒ３４８）
および鎖β９（Ｔｈｒ３５４，Ａｓｐ３５５，Ａｌａ３
５６）により形成されている。（ヘリックスα１１およ
びα１２の間に位置する）残基３１３から３２７は、い
わゆるＡＴＰリッドの主要部分を構成する。ＡＴＰの非
存在下では、それらは構造的に混乱している。残基３２
３から３２７にＡＴＰが結合すると、整頓され、ＡＴＰ
のβおよびγリン酸基とのバックボーン相互作用が形成
する。

【００７３】ＡＴＰがＰＤＨＫ−２に結合するモード
は、ジャイレースＢ（Ｗｉｇｌｅｙ，Ｄ．Ｂ．ら（１９
９１）Ｎａｔｕｒｅ３５１、６２４−６２９；Ｂｒｉ
ｎｏ，Ｌ．ら（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７５、９４６８−９４７５），Ｈｓｐ９０（Ｏｂｅｒ
ｍａｎｎ，Ｗ．Ｍ．Ｊ．ら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．１４３、９０１−９１０）およびＭｕｔＬ
（Ｂａｎ，Ｃ．ら（１９９９）Ｃｅｌｌ９７、８５−
９７）へＡＴＰまたはＡＤＰが結合するモードによく似
ている。その結合部位は二つの部分に分けられる；ヌク
レオチドのリン酸リボース成分を結合する表面の極性グ
ローブ、およびアデニン塩基を収容する、極性床をもつ
広い疎水性ポケットである。残基Ｖａｌ２９５，Ｌｅｕ
３０３，Ｌｅｕ３４６およびＴｈｒ３５４がアデニン環
の一面に並び、そしてＡｓｎ２５５，Ａｌａ２５６およ
びＡｌａ２５９が反対面に隣接する。Ａｓｐ２９０は、
ＧＨＫＬスーパーファミリー内でＡＴＰのために保存さ
れた重要な認識特徴である。そのカルボン酸塩基は、ア
デニン環の６−アミノ基に対する水素結合受容体として
働く。それ以外の水媒介水素結合が、アデニン環とタン
パク質との間の相互作用を完成する（図４）。

【００７４】該リボースおよび三リン酸は、触媒ドメイ
ンの表面にあるグローブに結合し、当該タンパク質と直
接的および間接的相互作用を形成する。リボース環の４
´酸素原子はＬｅｕ３０３とファン・デル・ワールス接
触をしており、一方、２´および３´水酸基はＡｒｇ２
５８の側鎖に直接または水を介する水素結合をしてい
る。その３´水酸基は、βリン酸基へ分子内水素結合を
形成することにより、該ヌクレオチドのコンホメーショ
ンを安定化する。ＡＴＰの結合はＭｇ²⁺イオンの結合を
伴う。各リン酸基は、１酸素原子をＭｇ²⁺イオンの８面
体配位に寄与するが、それはＡｓｎ２５５のＯδ１原子
と二つの水分子により完成する（図４）。ヘリックスα
１２のＮ末端に近接しているため、該三リン酸の負電荷
は、このヘリックスの正の双極子モーメントにより、さ
らに補償される。

【００７５】ＰＤＨＫ−２^*の結晶中へ浸透されたＡＴ
Ｐが加水分解されないことは、注目に値する。それに対
して、ＧｙｒＢ，Ｈｓｐ９０およびＭｕｔＬは、少なく
とも中程度のＡＴＰアーゼ活性を示す（Ｗａｎｇ，Ｊ．
Ｃ．（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
６５、６３５−６９２；Ｏｂｅｒｍａｎｎ，Ｗ．Ｍ．
Ｊ．ら（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４
３、９０１−９１０；Ｂａｎ，ＣおよびＹａｎｇ，Ｗ．
（１９９８）Ｃｅｌｌ９５、５４１−５５２）。それ
らの触媒性質およびトポロジーにおける相違から、ＧＨ
ＫＬスーパーファミリー内で、ＡＴＰアーゼ類（Ｇｙｒ
Ｂ，Ｈｓｐ９０およびＭｕｔＬ、ＧＨＬサブグループと
しても分類される）とキナーゼ類（ヒスチジンキナーゼ
類およびＰＤＨＫ）との区別が可能である（Ｂａｎ，
Ｃ．ら（１９９９）Ｃｅｌｌ９７、８５−９７；Ｄｕ
ｔｔａ，Ｒ．およびＩｎｏｕｙｅ，Ｍ．（２０００）Ｔ
ｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５、２４−
２８）。

【００７６】（ｃ）推定Ｅ₂Ｌ₂結合部位の説明合成ＰＤＨＫ阻害剤類、化合物１（４−｛（２，５）−
ジメチル−４−［３，３，３−トリフルオロ−２−ヒド
ロキシ−２−メチルプロパノイル］ピペラジニル｝カル
ボニル）ベンゾニトリル；Ａｉｃｈｅｒ，Ｔ．ら（１９
９９）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２，２７４１−２７
４６）および化合物２（Ｎ−｛４−［（エチルアニリ
ノ）スルフォニル］−２−メチルフェニル｝−３，３，
３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロパ
ンアミド；特許出願ＷＯ９９／６２８７３中の実施例１
２）、との複合体でＰＤＨＫ−２＊の構造を決定し、そ
してそれらの結合部位を同定した（図１、２および５を
参照されたい）。それは、ＰＤＨＫの調節ドメイン上に
あり、そしてヘリックスα２および先行ループα１α２
の残基Ｌｅｕ３１，Ｇｌｎ３５，Ｐｈｅ３６，Ａｓｐ３
８，およびＰｈｅ３９、ヘリックスα３の残基Ｔｈｒ４
８，Ｓｅｒ４９，Ｐｈｅ５２およびＬｅｕ５３ならびに
ヘリックスα８の残基Ｍｅｔ１６７，Ｌｅｕ１６８，Ｇ
ｌｎ１７１，Ｈｉｓ１７２，Ｉｌｅ１７５，およびＰｈ
ｅ１７６、により形成されている。ループα１α２、ヘ
リックスα２およびヘリックスα３は、三角形をつく
り、その底にヘリックスα８のＣ末端部分が並んでい
る。

【００７７】外因性のＥ₂Ｌ₂と同様に、両化合物はＰＤ
Ｈ複合体のＡＴＰ依存性阻害を阻止するが（Ｊａｃｋｓ
ｏｎ，Ｊ．Ｃ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３
３４、７０３−７１１）、それらは、ＰＤＨＫ特異的基
質ペプチドを用いた場合には、ＰＤＨＫのキナーゼ活性
を阻害しない（データは示してない）。ＰＤＨＫ−２の
構造は、化合物１および２の結合ポケットが圧倒的に疎
水性であることを示しており、そのことは、ＰＤＨ複合
体のＥ₂成分のリポイルドメイン（Ｅ₂Ｌ₂）の部位につ
いても提案されている（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｊ．Ｃ．（１
９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３４、７０３−７１
１）。それ故、化合物１および２の結合部位は、ＰＤＨ
ＫのＥ₂Ｌ₂結合部位と同一またはその一部と考えられ
る。従って、このクラスの化合物は、ＰＤＨＫとＰＤＨ
複合体のＥ₂Ｌ₂成分との間の会合を遮断することによっ
て、ＰＤＨ複合体のＡＴＰ依存性リン酸化を阻害するの
であろう。

【００７８】ＰＤＨＫの天然および複合体結晶構造の比
較から、コンホメーションの違いが明らかになった。リ
ガンドの存在下で、ヘリックスα２は、Ｍｅｔ３３のＣ
α位の周りのヒンジ運動によってシフトする。これによ
って結合ポケットが開き、その部位におけるリガンドの
収容が可能になる。そのコンホメーションの相違は、残
基Ｐｈｅ３９について最も大きい。リガンドがない場
合、Ｐｈｅ３９のベンゼン環は、リガンドがある場合に
それの中心部分が充たしていたスペースを占めている。
リガンド結合は、そのＣα位の２−２．５Åシフトおよ
び側鎖のフリッピングを誘導する。ループα２−α３
（残基４２−４５）は、これまで決定されたすべての構
造で、極めて柔軟性に富むことが見い出されている。そ
れは、ヘリックスα２のヒンジ運動を容易にするのに、
必要なのであろう。

【００７９】両結晶構造において、該リガンド類の
（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−
２−メチルプロピオニル部分は、同様な仕方で結合する
（図５ａおよび５ｂを参照されたい）。基幹認識特徴
は、Ｓｅｒ４９の側鎖水酸基と該リガンドの２−水酸基
との間の水素結合である。該２−メチル基は、残基Ｐｈ
ｅ３９，Ｓｅｒ４９，Ｇｌｎ１７１，Ｈｉｓ１７２，Ｉ
ｌｅ１７５およびＰｈｅ１７６によって囲まれる小さな
疎水性サブポケット中へ、伸びている。該トリフルオロ
メチル基は、残基Ｐｈｅ５２，Ｌｅｕ５３，Ｐｈｅ３
６，Ｌｅｕ１６８およびＧｌｎ１７１の側鎖とファン・
デル・ワールス相互作用を形成する。化合物１との構造
では、化合物２とは異なり、その２，６−ジメチルピペ
ラジン基による立体衝突のため、Ｌｅｕ３１の側鎖も、
該トリフルオロメチル基と接触している。化合物２のア
ミド酸素は、Ｐｈｅ３６のバックボーンカルボニルとＧ
ｌｎ１７１の原子Ｎε２とを架橋する、埋没水分子へ水
素結合を形成する。しかしこの水分子は、化合物１およ
びこのクラスの他の阻害剤の存在下では検出できないの
で（データは示していない）、それはリガンド結合に必
須でないことを示している。該リガンドの中央部分は、
（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−
２−メチルプロピオニル結合ポッケットを該タンパク質
表面と接続する、残基Ｌｅｕ３１，Ｇｌｎ３５，Ｐｈｅ
３９，Ｓｅｒ４９およびＰｈｅ５２から成る、短い疎水
性のチャンネル中に位置している。化合物１の２，６−
ジメチルピペラジン部分および化合物２の対応するメチ
ルベンジル基は、該タンパク質との疎水性の相互作用を
形成する。化合物１の４−シアノフェニルケトンおよび
化合物２のＮ−ベンジル−Ｎ−エチルスルフォンアミド
は、溶媒方向に向いており、結晶構造において一部乱れ
ていることから、それらの柔軟性を示している。

【００８０】４種の該ＰＤＨＫアイソザイムのアライン
ド（位置合せ）配列の分析から、推定リポイル結合部位
における、アイソザイム４に関してＰＤＨＫアイソザイ
ム１−３との残基差が明らかになった（Ｒｏｗｌｅｓ，
Ｊ．ら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
１、２２３７６−８２；ＧｅｎＢａｎｋアクセスＵ
５４６１７）。ＰＤＨＫ−２は３６位にフェニルアラニ
ンを示し、ＰＤＨＫ−１およびＰＤＨＫ−３も相当位置
は同様だが、ＰＤＨＫ−４は相当位置にロイシン（Ｌｅ
ｕ４０）をもつ。この残基交換は、ＰＤＨＫ−２および
ＰＤＨＫ−４に対する化合物１の類似体に観察された効
力差の原因であることが、明らかにされた（データは示
していない）。さらに、一塩基多型（ＳＮＰ）が個人に
よっては確認され、それによりＰＤＨＫ−４でＰｈｅ４
３Ｌｅｕ交換が生じた。ここで提出したデータは、ＰＤ
ＨＫ−２における相当残基（Ｐｈｅ３９）が、化合物１
および２の結合に直接関与することを示している。それ
故、このＳＮＰは、影響を受けるＰＤＨＫ−４変異体の
推定Ｅ₂Ｌ₂結合部位への天然または合成リガンドの結合
親和性に、少なからぬ影響を及ぼすものと結論される。
この分析は、リガンド結合に重要な残基を同定し、そし
てその情報を使って、任意の他のＰＤＨＫアイソザイム
の模倣用にデザインされる、ＰＤＨＫ−２の部位特異的
変異体を遺伝子操作するために、ＰＤＨＫ−２の前記構
造を使用することの潜在力を明白にしている。

【００８１】（ｄ）新たなリガンド結合部位の説明もう一つのリガンド（化合物３）とＰＤＨＫ結晶をソー
キングしたところ、ＰＤＨＫ−２の調節ドメイン上に新
たな別のリガンド結合部位（第三結合部位とも称する）
が確認された（該酵素に結合した化合物３の視図および
化合物３の構造を示す図６を参照されたい）。該天然タ
ンパク質中に前形成されているその部位は、ループα３
−α４およびヘリックスα４のＬｅｕ７１，Ｐｒｏ７
２，Ａｒｇ７４，Ｖａｌ７５，ループα４−α５および
ヘリックスα５のＴｈｒ７８，Ｓｅｒ８０，Ｖａｌ８
１，ヘリックスα７のＭｅｔ１３０，Ｇｌｙ１３３，Ｖ
ａｌ１３４，Ｇｌｕ１３６，Ｔｙｒ１３７，ループα７
−α８およびヘリックスα８のＡｓｐ１４４，Ｖａｌ１
４６，Ｓｅｒ１４７，Ａｓｎ１５０，Ｉｌｅ１５１，Ｐ
ｈｅ１５４，Ｌｅｕ１５５，ならびにヘリックスα１３
のＣ末端におけるＴｙｒ３８２で構成されている。

【００８２】（ｅ）ＤＣＡ結合部位の確認および説明ＰＤＨＫ−２上のＤＣＡの結合部位は、［ｆ_obs（ＡＤ
Ｐ／ＤＣＡ）−ｆ_obs（天然）］ｅｘｐｉα_calc（天
然）を係数として、差フーリエマップを計算することに
より、確認されたが、ここでｆ_obs（ＡＤＰ／ＤＣＡ）
はＡＤＰおよびＤＣＡの両者とソークされたＰＤＨＫ−
２^*の構造因子振幅の実測値、ｆ_obs（天然）はリガンド
されていないＰＤＨＫ−２^*の構造因子振幅の実測値、
およびα_calc（天然）はリガンドされていないＰＤＨＫ
−２^*の精製モデル由来の位相である（実施例６）。

【００８３】得られたｆ_obs（ＡＤＰ，ＤＣＡ）−ｆ_obs
（天然）電子密度マップは、ＰＤＨＫ−２の調節ドメイ
ンの小さなポケット中に５．５σより大きなピークを含
む（図７）。図７はＰＤＨＫ−２の新たに確認された結
合部位に結合したＤＣＡの精製モデルを示す。該モデル
は、４σ（淡灰色）および５σ（暗灰色）で等高線を描
いた２．５Åｆ_obs（ＡＤＰ，ＤＣＡ）−ｆ_obs（天然）
差密度マップに、重ね合せてある。ＤＣＡとＡｒｇ１６
２との間に水素結合が示されている。該ポケットは、残
基Ｌｅｕ５７，Ｌｅｕ６１，Ｔｙｒ８８，Ｓｅｒ９１，
Ｉｌｅ９５，Ｉｌｅ１１９，Ａｒｇ１２０，Ｈｉｓ１２
３，Ｓｅｒ１６１，Ａｒｇ１６２，Ｉｌｅ１６５，Ａｒ
ｇ１６６，およびＩｌｅ１６９で形成されている。ＤＣ
Ａのカルボン酸基はＡｒｇ１６２と塩橋を形成するのに
対し、その二つの塩素置換基は該ポケットの疎水性部分
に深く埋没している。該結合ポケットは、ＰＤＨＫ−２
の触媒および調節ドメインの間のグルーブの表面近くで
（図２参照）、保存されたアルギニン残基類（Ａｒｇ１
２０，Ａｒｇ１６２，Ａｒｇ１６６）のクラスターの付
近にある。該ｆ_obs（ＡＤＰ，ＤＣＡ）−ｆ_obs（天然）
マップは、ＡＤＰのβリン酸の位置に４σより大きな別
のピークならびに結合ＡＤＰ分子の他の部分についての
もっと目立たないピーク類とを含む。４σ以上のピーク
はＧｌｕ２５１の側鎖についても観察され、それはＭｇ
²⁺イオンを伴うＡＤＰの配位に関与し、ＡＤＰ／Ｍｇ²⁺
の欠如下では、そのコンホメーションに関係してぶらぶ
らしている。該ｆ_obs（ＡＤＰ，ＤＣＡ）−ｆ_obs（天
然）電子密度マップは、それ以外に顕著なピークは含ま
ないので、上記のＤＣＡ結合ポケットは、ＰＤＨＫ−２
上の唯一の、または少なくとも主要な、ＤＣＡの結合部
位と結論される。

【００８４】該グローブの形（実施例８参照）および電
荷分布ならびにその表面に保存性残基が多いことから、
それは例えば、ＰＤＨ複合体のサブユニットまたはドメ
インへのＰＤＨＫの結合のために、機能的に重要なこと
を示唆している。それ故、ＤＣＡは、ＰＤＨＫへのその
成分の一つの結合を妨害することにより、ＰＤＨ複合体
のリン酸化を阻害する可能性が考えられる。

【００８５】本明細書で同定されたＰＤＨＫ−２のＤＣ
Ａ結合ポケットは、ＰＤＨ複合体のリン酸化を阻害する
合成リガンドのデザインに利用可能である。

【００８６】実施例９：化合物がＰＤＨＫ活性を阻害す
るかどうかを測定するための検定化合物類は、Ｅｓｐｉｎａｌ，Ｊ．ら（１９９５）Ｄｒ
ｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＲｅｓ．３５、１３
０−１３６から採用した検定法でＰＤＨＫの阻害につい
て査定した。該検定の第1部では、化合物類をブタＰＤ
Ｈ（ＳｉｇｍａＰ−７０３２）およびＭｇＡＴＰととも
にインキュベートし、その反応を所定の間隔で停止させ
た。該検定の第２部では、その残存ＰＤＨ活性を、３４
０ｎｍでＮＡＤの還元の速度をモニターすることにより
測定した。

【００８７】該検定は、第1部（キナーゼ反応）につい
ては５０μｌの終容量を、そしてＰＤＨ反応については
２５０μｌを用いて、平底９６ウエルマイクロタイタ
ープレート中で実施した。まず、適当な希釈液中の１０
μｌ試験化合物、２０μｌキナーゼ緩衝液（２０ｍＭリ
ン酸カリウム，ｐＨ７．０，４ｍＭＭｇＣｌ₂，４ｍＭ
ジチオスレイトール）および１０μｌＰＤＨ（Ｓｉｇｍ
ａ，Ｐ−７０３２，終濃度１．８３ｍｇ／ｍｌに水で希
釈）を混合し、１０分間インキュベートした；次いで１
０μｌＡＴＰ溶液（キナーゼ緩衝液中１２５μＭ）を加
え、反応を開始した。インキュベーションは３０℃で行
った。キナーゼ反応は、所定の時間間隔（通常は、０、
１０、２０、３０、６０、および９０分）後に、ＰＤＨ
反応を開始させることにより、終了させた。その反応開
始は、２００μｌのＰＤＨ基質溶液（１ｍＭチアミンピ
ロリン酸、０．５ｍＭＮＡＤ，０．５ｍＭ補酵素Ａ，
１２ｍＭピルビン酸、５ｍＭジチオスレイトール）の添
加によった。次いで動力学の読み取りは、Ｓｐｅｃｔｒ
ａＭａｘプレートリーダー中、各読み取り前に1秒間震
盪し、１２秒間隔で２０分間３４０ｎｍで実施した。そ
のデータはＳｐｅｃｔｒａｍａｘソフトウエアを用いて
処理した。

【００８８】実施例１０：化合物３の合成（ａ）メチル｛３−クロロ−４−［（４−イソプロピル
ベンジル）オキシ］フェニル｝アセテート乾燥テトラヒドロフラン（１００ｍｌ）中４−イソプロ
ピルベンジルアルコール（４．５ｍｌ，２９．１ミリモ
ル）、３−クロロ−４−ヒドロキシベンゼン酢酸、メチ
ルエステル（ＣＡＳ登録番号５７０１７−９５−５）お
よびトリフェニルホスフィン（８．８ｇ，３３．６ミリ
モル）の撹拌溶液を、０℃に冷却した。ジイソプロピル
アゾカルボン酸（５．７ｍｌ，２９．１ミリモル）を１
０分間以上かけて滴状に添加し、その反応物を室温でさ
らに３時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、該産物を
シリカゲル上、ペンタン：酢酸エチル（４：１）で溶出
し、無色の油として標記化合物を得た（２．２ｇ，３０
％）。¹ ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃） δ１．２５
（６Ｈ，ｄ），２．９０（１Ｈ，ｍ），３．５５（２
Ｈ，ｓ），３．７０（３Ｈ，ｓ），５．１０（２Ｈ，
ｓ），６．９５（１Ｈ，ｄ），７．１０（１Ｈ，ｄ），
７．２２（２Ｈ，ｄ），７．３０（１Ｈ，ｓ），７．３
８（２Ｈ，ｄ）。ｍｓ３５０，３５２（両Ｃｌ同位体についてのＭＮＨ
₄ ⁺）。実測値：Ｃ，６７．９５；Ｈ，６．４７。Ｃ₁₉Ｈ₂₁Ｃ
ｌＯ₃。０．２酢酸エチル理論値Ｃ，６７．８６；
Ｈ，６．５０。

【００８９】（ｂ）３−クロロ−４−［（４−イソプロ
ピルベンジル）オキシ］フェニル｝酢酸水酸化ナトリウム水溶液（１Ｍ，２０ｍｌ）中のメチル
｛３−クロロ−４−［（４−イソプロピルベンジル）オ
キシ］フェニル｝酢酸（２．２ｇ，６．６ミリモル）お
よびジオキサン（２０ｍｌ）の混合物を、室温で1時間
撹拌した。次いでジオキサンを減圧下で除去し、残った
水溶液を塩酸水溶液（１Ｍ，２５ｍｌ）で酸性化し、そ
して生じた白色固体を濾過により分離した。次いでその
固体をエタノールと共沸させ、白色固体として標記化合
物を得た（１．９ｇ，９０％）。 ¹ ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ２．１５
（６Ｈ，ｄ），２．９５（１Ｈ，ｍ），３．５７（２
Ｈ，ｓ），５．１０（２Ｈ，ｓ），６．９５（１Ｈ，
ｄ），７．１０（１Ｈ，ｄ），７．２２（２Ｈ，ｄ），
７．３０（１Ｈ，ｓ），７．３８（２Ｈ，ｄ）。ｍｓ３３６（ＭＮＨ₄ ⁺）実測値：Ｃ，６６．８７；Ｈ，６．２３。Ｃ₁₈Ｈ₁₉Ｃ
ｌＯ₃。０．４エタノール理論値Ｃ，６６．９６；
Ｈ，６．４０。

【００９０】（ｃ）ｔｅｒｔ−ブチル２−［（｛３−ク
ロロ−４−［（４−イソプロピルベンジル）オキシ］フ
ェニル｝アセチル）アミノ］エチルカルバメート３−クロロ−４−［（４−イソプロピルベンジル）オキ
シ］フェニル｝酢酸（０．２４０ｇ，０．７５ミリモ
ル），Ｎ−メチルモルフォリン（０．２４０ｍｌ，２．
５ミリモル）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１
−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ´Ｎ´−テトラメチルウロニウム
ヘキサフルオロフォスフェート（０．３２ｇ，０．８５
ミリモル）およびＮ−ＢＯＣ−エチレンジアミン（０．
１２ｍｌ，０．７５ミリモル）を、アセトニトリル中、
室温で７２時間撹拌した。溶媒は減圧下で溜去した。ペ
ンタン：酢酸エチル（１：２）で溶出するシリカ上のフ
ラッシュクロマトグラフィーを用いる精製により、標記
化合物を得（０．１８５ｇ，５４％），それはさらに精製せずに使用した。¹ ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ１．２１
（６Ｈ，ｄ），１．３７（９Ｈ，ｓ），２．８７（１
Ｈ，ｍ），３．１８（２Ｈ，ｍ），３．２７（２Ｈ，
ｍ），３．４１（２Ｈ，ｓ），４．８０（１Ｈ，ｓ），
５．０４（２Ｈ，ｓ），６．０８（１Ｈ，ｓ），６．９
０（１Ｈ，ｄ），７．０４（１Ｈ，ｍ），７．２４（３
Ｈ，ｍ），７．３５（２Ｈ，ｄ）。ｍｓ４８３（ＭＮａ⁺）

【００９１】（ｄ）Ｎ−（２−アミノエチル）−２−
｛３−クロロ−４−［（４−イソプロピルベンジル）オ
キシ］フェニル｝アセタミドｔｅｒｔ−ブチル２−［（｛３−クロロ−４−［（４−
イソプロピルベンジル）オキシ］フェニル｝アセチル）
アミノ］エチルカルバミン酸（０．１８５ｇ，０．４１
ミリモル）をジクロロメタンに溶解した。該溶液をガス
状の塩化水素で飽和にし、該反応物を室温で1時間撹拌
した。溶媒は減圧下で溜去した。その残渣をジクロロメ
タンに溶解し、飽和の炭酸水素ナトリウムで洗い、乾燥
し（硫酸マグネシウム）、そして溶媒を減圧下で溜去し
た。ジクロロメタン：メタノール：０．８８０アンモニ
ア（９０：１０：１）で溶出する、シリカ上のフラッシ
ュクロマトグラフィーを用いる精製で、白色固体として
標記化合物を得た（０．０３５ｇ，２４％）。¹ ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）δ１．２４
（６Ｈ，ｄ），２．７８（２Ｈ，ｔ），２．９２（１
Ｈ，ｍ），３．２４（２Ｈ，ｍ），３．４６（２Ｈ，
ｓ），５．１０（２Ｈ，ｓ），５．８８（１Ｈ，ｓ），
６．９４（１Ｈ，ｄ），７．０７（１Ｈ，ｍ），７．２
３（２Ｈ，ｍ），７．３０（１Ｈ，ｓ），７．３７（２
Ｈ，ｄ）。ｍｓＥＳ−３５９（Ｍ−１）実測値：Ｃ，６３．４６；Ｈ，７．１０；Ｎ，７．３
０：Ｃ₂₀Ｈ₂₅ＣｌＮ₂Ｏ₂。０．２４ＣＨ₂Ｃｌ₂理論値
Ｃ，６３．７６；Ｈ，６．７４；Ｎ，７．３５。

【００９２】

【表１】

【００９３】

【表２】

【００９４】

【表３】

【００９５】

【００９６】

【００９７】

【００９８】

【００９９】

【０１００】

【０１０１】

【０１０２】

【０１０３】

【０１０４】

【０１０５】

【０１０６】

【０１０７】

【０１０８】

【０１０９】

【０１１０】

【０１１１】

【０１１２】

【０１１３】

【０１１４】

【０１１５】

【０１１６】

【０１１７】

【０１１８】

【０１１９】

【０１２０】

【０１２１】

【０１２２】

【０１２３】

【０１２４】

【０１２５】

【０１２６】

【０１２７】

【０１２８】

【０１２９】

【０１３０】

【０１３１】

【０１３２】

【０１３３】

【０１３４】

【０１３５】

【表４】

【０１３６】

【０１３７】

【０１３８】

【０１３９】

【０１４０】

【０１４１】

【０１４２】

【０１４３】

【０１４４】

【０１４５】

【０１４６】

【０１４７】

【０１４８】

【０１４９】

【０１５０】

【０１５１】

【０１５２】

【０１５３】

【０１５４】

【０１５５】

【０１５６】

【０１５７】

【０１５８】

【０１５９】

【０１６０】

【０１６１】

【０１６２】

【０１６３】

【０１６４】

【０１６５】

【０１６６】

【０１６７】

【０１６８】

【０１６９】

【０１７０】

【０１７１】

【０１７２】

【０１７３】

【０１７４】

【０１７５】

【０１７６】

【０１７７】

【０１７８】

【表５】

【０１７９】

【０１８０】

【０１８１】

【０１８２】

【０１８３】

【０１８４】

【０１８５】

【０１８６】

【０１８７】

【０１８８】

【０１８９】

【０１９０】

【０１９１】

【０１９２】

【０１９３】

【０１９４】

【０１９５】

【０１９６】

【０１９７】

【０１９８】

【０１９９】

【０２００】

【０２０１】

【０２０２】

【０２０３】

【０２０４】

【０２０５】

【０２０６】

【０２０７】

【０２０８】

【０２０９】

【０２１０】

【０２１１】

【０２１２】

【０２１３】

【０２１４】

【０２１５】

【０２１６】

【０２１７】

【０２１８】

【０２１９】

【０２２０】

【０２２１】

【表６】

【０２２２】

【０２２３】

【０２２４】

【０２２５】

【０２２６】

【０２２７】

【０２２８】

【０２２９】

【０２３０】

【０２３１】

【０２３２】

【０２３３】

【０２３４】

【０２３５】

【０２３６】

【０２３７】

【０２３８】

【０２３９】

【０２４０】

【０２４１】

【０２４２】

【０２４３】

【０２４４】

【０２４５】

【０２４６】

【０２４７】

【０２４８】

【０２４９】

【０２５０】

【０２５１】

【０２５２】

【０２５３】

【０２５４】

【０２５５】

【０２５６】

【０２５７】

【０２５８】

【０２５９】

【０２６０】

【０２６１】

【０２６２】

【０２６３】

【表７】

【０２６４】

【０２６５】

【０２６６】

【０２６７】

【０２６８】

【０２６９】

【０２７０】

【０２７１】

【０２７２】

【０２７３】

【０２７４】

【０２７５】

【０２７６】

【０２７７】

【０２７８】

【０２７９】

【０２８０】

【０２８１】

【０２８２】

【０２８３】

【０２８４】

【０２８５】

【０２８６】

【０２８７】

【０２８８】

【０２８９】

【０２９０】

【０２９１】

【０２９２】

【０２９３】

【０２９４】

【０２９５】

【０２９６】

【０２９７】

【０２９８】

【０２９９】

【０３００】

【０３０１】

【０３０２】

【０３０３】

【０３０４】

【０３０５】

【０３０６】

【表８】

【０３０７】

【０３０８】

【０３０９】

【０３１０】

【０３１１】

【０３１２】

【０３１３】

【０３１４】

【０３１５】

【０３１６】

【０３１７】

【０３１８】

【０３１９】

【０３２０】

【０３２１】

【０３２２】

【０３２３】

【０３２４】

【０３２５】

【０３２６】

【０３２７】

【０３２８】

【０３２９】

【０３３０】

【０３３１】

【０３３２】

【０３３３】

【０３３４】

【０３３５】

【０３３６】

【０３３７】

【０３３８】

【０３３９】

【０３４０】

【０３４１】

【０３４２】

【０３４３】

【０３４４】

【０３４５】

【０３４６】

【０３４７】

【０３４８】

【０３４９】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Pfizer Ltd. (EP (GB) only), Pfizer Inc (US, JP, CA, EP except GB) <120> Crystal structure <130> PCS10938#RFB <160> 10 <170> FastSEQ for Windows（登録商標） Version 4.0 <210> 1 <211> 1224 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgcgctggg tgtgggcgct gctgaagaat gcgtccctgg caggggcgcc caagtacata 60 gagcacttca gcaagttctc cccgtccccg ctgtccatga agcagtttct ggacttcgga 120 tccagcaatg cctgtgagaa aacctccttc accttcctca ggcaggagct gcctgtgcgc 180 ctggccaaca tcatgaaaga gatcaacctg cttcccgacc gagtgctgag cacaccctct 240 gtgcagctgg tgcagagctg gtatgtccag agcctcctgg acatcatgga gttcctggac 300 aaggatcccg aggaccatcg caccctgagc cagttcactg acgccctggt caccatccgg 360 aaccggcaca acgacgtggt gcccaccatg gcacaaggcg tgcttgagta caaggacacc 420 tacggcgatg accccgtctc caaccagaac atccagtact tcctggaccg cttctacctc 480 agccgcatct ccatccgcat gctcatcaac cagcacaccc tcatctttga tggcagcacc 540 aacccagccc atcccaaaca catcggcagc atcgacccca actgcaacgt ctctgaggtg 600 gtcaaagatg cctacgacat ggctaagctc ctgtgtgaca agtattacat ggcctcacct 660 gacctggaga tccaggagat caatgcagcc aactccaaac agccgattca catggtctac 720 gtcccctccc acctctacca catgctcttt gagctcttca agaatgccat gagggcgact 780 gtggaaagcc atgagtccag cctcattctc ccacccatca aggtcatggt ggccttgggt 840 gaggaagatc tgtccatcaa gatgagtgac cgaggtgggg gtgttccctt gaggaagatt 900 gagcgactct tcagctacat gtactccaca gcacccaccc cccagcctgg caccggggga 960 acgccgctgg ctggctttgg ttatgggctc cccatttccc gcctctacgc caagtacttc 1020 cagggagacc tgcagctctt ctccatggaa ggctttggga ccgatgctgt catctatctc 1080 aaggccctgt ccacggactc ggtggagcgc ctgcctgtct acaacaagtc agcctggcgc 1140 cactaccaga ccatccagga ggccggcgac tggtgtgtgc ccagcacgga gcccaagaac 1200 acgtccacgt accgcgtcac gtaa 1224 <210> 2 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Trp Val Trp Ala Leu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Ala Gly Ala 1 5 10 15 Pro Lys Tyr Ile Glu His Phe Ser Lys Phe Ser Pro Ser Pro Leu Ser 20 25 30 Met Lys Gln Phe Leu Asp Phe Gly Ser Ser Asn Ala Cys Glu Lys Thr 35 40 45 Ser Phe Thr Phe Leu Arg Gln Glu Leu Pro Val Arg Leu Ala Asn Ile 50 55 60 Met Lys Glu Ile Asn Leu Leu Pro Asp Arg Val Leu Ser Thr Pro Ser 65 70 75 80 Val Gln Leu Val Gln Ser Trp Tyr Val Gln Ser Leu Leu Asp Ile Met 85 90 95 Glu Phe Leu Asp Lys Asp Pro Glu Asp His Arg Thr Leu Ser Gln Phe 100 105 110 Thr Asp Ala Leu Val Thr Ile Arg Asn Arg His Asn Asp Val Val Pro 115 120 125 Thr Met Ala Gln Gly Val Leu Glu Tyr Lys Asp Thr Tyr Gly Asp Asp 130 135 140 Pro Val Ser Asn Gln Asn Ile Gln Tyr Phe Leu Asp Arg Phe Tyr Leu 145 150 155 160 Ser Arg Ile Ser Ile Arg Met Leu Ile Asn Gln His Thr Leu Ile Phe 165 170 175 Asp Gly Ser Thr Asn Pro Ala His Pro Lys His Ile Gly Ser Ile Asp 180 185 190 Pro Asn Cys Asn Val Ser Glu Val Val Lys Asp Ala Tyr Asp Met Ala 195 200 205 Lys Leu Leu Cys Asp Lys Tyr Tyr Met Ala Ser Pro Asp Leu Glu Ile 210 215 220 Gln Glu Ile Asn Ala Ala Asn Ser Lys Gln Pro Ile His Met Val Tyr 225 230 235 240 Val Pro Ser His Leu Tyr His Met Leu Phe Glu Leu Phe Lys Asn Ala 245 250 255 Met Arg Ala Thr Val Glu Ser His Glu Ser Ser Leu Ile Leu Pro Pro 260 265 270 Ile Lys Val Met Val Ala Leu Gly Glu Glu Asp Leu Ser Ile Lys Met 275 280 285 Ser Asp Arg Gly Gly Gly Val Pro Leu Arg Lys Ile Glu Arg Leu Phe 290 295 300 Ser Tyr Met Tyr Ser Thr Ala Pro Thr Pro Gln Pro Gly Thr Gly Gly 305 310 315 320 Thr Pro Leu Ala Gly Phe Gly Tyr Gly Leu Pro Ile Ser Arg Leu Tyr 325 330 335 Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Asp Leu Gln Leu Phe Ser Met Glu Gly Phe 340 345 350 Gly Thr Asp Ala Val Ile Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Thr Asp Ser Val 355 360 365 Glu Arg Leu Pro Val Tyr Asn Lys Ser Ala Trp Arg His Tyr Gln Thr 370 375 380 Ile Gln Glu Ala Gly Asp Trp Cys Val Pro Ser Thr Glu Pro Lys Asn 385 390 395 400 Thr Ser Thr Tyr Arg Val Thr 405 <210> 3 <211> 1224 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgcatcatc atcatcatca ccttctggtt ccgcgtggat ctgcgcccaa gtacatagag 60 cacttcagca agttctcccc gtccccgctg tccatgaagc agtttctgga cttcggatcc 120 agcaatgcct gtgagaaaac ctccttcacc ttcctcaggc aggagctgcc tgtgcgcctg 180 gccaacatca tgaaagagat caacctgctt cccgaccgag tgctgagcac accctctgtg 240 cagctggtgc agagctggta tgtccagagc ctcctggaca tcatggagtt cctggacaag 300 gatcccgagg accatcgcac cctgagccag ttcactgacg ccctggtcac catccggaac 360 cggcacaacg acgtggtgcc caccatggca caaggcgtgc ttgagtacaa ggacacctac 420 ggcgatgacc ccgtctccaa ccagaacatc cagtacttcc tggaccgctt ctacctcagc 480 cgcatctcca tccgcatgct catcaaccag cacaccctca tctttgatgg cagcaccaac 540 ccagcccatc ccaaacacat cggcagcatc gaccccaact gcaacgtctc tgaggtggtc 600 aaagatgcct acgacatggc taagctcctg tgtgacaagt attacatggc ctcacctgac 660 ctggagatcc aggagatcaa tgcagccaac tccaaacagc cgattcacat ggtctacgtc 720 ccctcccacc tctaccacat gctctttgag ctcttcaaga atgccatgag ggcgactgtg 780 gaaagccatg agtccagcct cattctccca cccatcaagg tcatggtggc cttgggtgag 840 gaagatctgt ccatcaagat gagtgaccga ggtgggggtg ttcccttgag gaagattgag 900 cgactcttca gctacatgta ctccacagca cccacccccc agcctggcac cgggggaacg 960 ccgctggctg gctttggtta tgggctcccc atttcccgcc tctacgccaa gtacttccag 1020 ggagacctgc agctcttctc catggaaggc tttgggaccg atgctgtcat ctatctcaag 1080 gccctgtcca cggactcggt ggagcgcctg cctgtctaca acaagtcagc ctggcgccac 1140 taccagacca tccaggaggc cggcgactgg tgtgtgccca gcacggagcc caagaacacg 1200 tccacgtacc gcgtcacgtg atag 1224 <210> 4 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Hexa-histidine tag <223> Thrombin cleavage site <400> 4 Met His His His His His His Leu Leu Val Pro Arg Gly Ser Ala Pro 1 5 10 15 Lys Tyr Ile Glu His Phe Ser Lys Phe Ser Pro Ser Pro Leu Ser Met 20 25 30 Lys Gln Phe Leu Asp Phe Gly Ser Ser Asn Ala Cys Glu Lys Thr Ser 35 40 45 Phe Thr Phe Leu Arg Gln Glu Leu Pro Val Arg Leu Ala Asn Ile Met 50 55 60 Lys Glu Ile Asn Leu Leu Pro Asp Arg Val Leu Ser Thr Pro Ser Val 65 70 75 80 Gln Leu Val Gln Ser Trp Tyr Val Gln Ser Leu Leu Asp Ile Met Glu 85 90 95 Phe Leu Asp Lys Asp Pro Glu Asp His Arg Thr Leu Ser Gln Phe Thr 100 105 110 Asp Ala Leu Val Thr Ile Arg Asn Arg His Asn Asp Val Val Pro Thr 115 120 125 Met Ala Gln Gly Val Leu Glu Tyr Lys Asp Thr Tyr Gly Asp Asp Pro 130 135 140 Val Ser Asn Gln Asn Ile Gln Tyr Phe Leu Asp Arg Phe Tyr Leu Ser 145 150 155 160 Arg Ile Ser Ile Arg Met Leu Ile Asn Gln His Thr Leu Ile Phe Asp 165 170 175 Gly Ser Thr Asn Pro Ala His Pro Lys His Ile Gly Ser Ile Asp Pro 180 185 190 Asn Cys Asn Val Ser Glu Val Val Lys Asp Ala Tyr Asp Met Ala Lys 195 200 205 Leu Leu Cys Asp Lys Tyr Tyr Met Ala Ser Pro Asp Leu Glu Ile Gln 210 215 220 Glu Ile Asn Ala Ala Asn Ser Lys Gln Pro Ile His Met Val Tyr Val 225 230 235 240 Pro Ser His Leu Tyr His Met Leu Phe Glu Leu Phe Lys Asn Ala Met 245 250 255 Arg Ala Thr Val Glu Ser His Glu Ser Ser Leu Ile Leu Pro Pro Ile 260 265 270 Lys Val Met Val Ala Leu Gly Glu Glu Asp Leu Ser Ile Lys Met Ser 275 280 285 Asp Arg Gly Gly Gly Val Pro Leu Arg Lys Ile Glu Arg Leu Phe Ser 290 295 300 Tyr Met Tyr Ser Thr Ala Pro Thr Pro Gln Pro Gly Thr Gly Gly Thr 305 310 315 320 Pro Leu Ala Gly Phe Gly Tyr Gly Leu Pro Ile Ser Arg Leu Tyr Ala 325 330 335 Lys Tyr Phe Gln Gly Asp Leu Gln Leu Phe Ser Met Glu Gly Phe Gly 340 345 350 Thr Asp Ala Val Ile Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Thr Asp Ser Val Glu 355 360 365 Arg Leu Pro Val Tyr Asn Lys Ser Ala Trp Arg His Tyr Gln Thr Ile 370 375 380 Gln Glu Ala Gly Asp Trp Cys Val Pro Ser Thr Glu Pro Lys Asn Thr 385 390 395 400 Ser Thr Tyr Arg Val Thr 405 <210> 5 <211> 394 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Gly Ser Ala Pro Lys Tyr Ile Glu His Phe Ser Lys Phe Ser Pro Ser 1 5 10 15 Pro Leu Ser Met Lys Gln Phe Leu Asp Phe Gly Ser Ser Asn Ala Cys 20 25 30 Glu Lys Thr Ser Phe Thr Phe Leu Arg Gln Glu Leu Pro Val Arg Leu 35 40 45 Ala Asn Ile Met Lys Glu Ile Asn Leu Leu Pro Asp Arg Val Leu Ser 50 55 60 Thr Pro Ser Val Gln Leu Val Gln Ser Trp Tyr Val Gln Ser Leu Leu 65 70 75 80 Asp Ile Met Glu Phe Leu Asp Lys Asp Pro Glu Asp His Arg Thr Leu 85 90 95 Ser Gln Phe Thr Asp Ala Leu Val Thr Ile Arg Asn Arg His Asn Asp 100 105 110 Val Val Pro Thr Met Ala Gln Gly Val Leu Glu Tyr Lys Asp Thr Tyr 115 120 125 Gly Asp Asp Pro Val Ser Asn Gln Asn Ile Gln Tyr Phe Leu Asp Arg 130 135 140 Phe Tyr Leu Ser Arg Ile Ser Ile Arg Met Leu Ile Asn Gln His Thr 145 150 155 160 Leu Ile Phe Asp Gly Ser Thr Asn Pro Ala His Pro Lys His Ile Gly 165 170 175 Ser Ile Asp Pro Asn Cys Asn Val Ser Glu Val Val Lys Asp Ala Tyr 180 185 190 Asp Met Ala Lys Leu Leu Cys Asp Lys Tyr Tyr Met Ala Ser Pro Asp 195 200 205 Leu Glu Ile Gln Glu Ile Asn Ala Ala Asn Ser Lys Gln Pro Ile His 210 215 220 Met Val Tyr Val Pro Ser His Leu Tyr His Met Leu Phe Glu Leu Phe 225 230 235 240 Lys Asn Ala Met Arg Ala Thr Val Glu Ser His Glu Ser Ser Leu Ile 245 250 255 Leu Pro Pro Ile Lys Val Met Val Ala Leu Gly Glu Glu Asp Leu Ser 260 265 270 Ile Lys Met Ser Asp Arg Gly Gly Gly Val Pro Leu Arg Lys Ile Glu 275 280 285 Arg Leu Phe Ser Tyr Met Tyr Ser Thr Ala Pro Thr Pro Gln Pro Gly 290 295 300 Thr Gly Gly Thr Pro Leu Ala Gly Phe Gly Tyr Gly Leu Pro Ile Ser 305 310 315 320 Arg Leu Tyr Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Asp Leu Gln Leu Phe Ser Met 325 330 335 Glu Gly Phe Gly Thr Asp Ala Val Ile Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Thr 340 345 350 Asp Ser Val Glu Arg Leu Pro Val Tyr Asn Lys Ser Ala Trp Arg His 355 360 365 Tyr Gln Thr Ile Gln Glu Ala Gly Asp Trp Cys Val Pro Ser Thr Glu 370 375 380 Pro Lys Asn Thr Ser Thr Tyr Arg Val Thr 385 390 <210> 6 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 cgtgaattca tgcatcatca tcatcatcac cttctggttc cgcgtggatc tgcgcccaag 60 tacatagagc acttc 75 <210> 7 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 cgttctagac tatcacgtga cgcggtacgt cgacg 35 <210> 8 <211> 1188 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ggatctgcgc ccaagtacat agagcacttc agcaagttct ccccgtcccc gctgtccatg 60 aagcagtttc tggacttcgg atccagcaat gcctgtgaga aaacctcctt caccttcctc 120 aggcaggagc tgcctgtgcg cctggccaac atcatgaaag agatcaacct gcttcccgac 180 cgagtgctga gcacaccctc tgtgcagctg gtgcagagct ggtatgtcca gagcctcctg 240 gacatcatgg agttcctgga caaggatccc gaggaccatc gcaccctgag ccagttcact 300 gacgccctgg tcaccatccg gaaccggcac aacgacgtgg tgcccaccat ggcacaaggc 360 gtgcttgagt acaaggacac ctacggcgat gaccccgtct ccaaccagaa catccagtac 420 ttcctggacc gcttctacct cagccgcatc tccatccgca tgctcatcaa ccagcacacc 480 ctcatctttg atggcagcac caacccagcc catcccaaac acatcggcag catcgacccc 540 aactgcaacg tctctgaggt ggtcaaagat gcctacgaca tggctaagct cctgtgtgac 600 aagtattaca tggcctcacc tgacctggag atccaggaga tcaatgcagc caactccaaa 660 cagccgattc acatggtcta cgtcccctcc cacctctacc acatgctctt tgagctcttc 720 aagaatgcca tgagggcgac tgtggaaagc catgagtcca gcctcattct cccacccatc 780 aaggtcatgg tggccttggg tgaggaagat ctgtccatca agatgagtga ccgaggtggg 840 ggtgttccct tgaggaagat tgagcgactc ttcagctaca tgtactccac agcacccacc 900 ccccagcctg gcaccggggg aacgccgctg gctggctttg gttatgggct ccccatttcc 960 cgcctctacg ccaagtactt ccagggagac ctgcagctct tctccatgga aggctttggg 1020 accgatgctg tcatctatct caaggccctg tccacggact cggtggagcg cctgcctgtc 1080 tacaacaagt cagcctggcg ccactaccag accatccagg aggccggcga ctggtgtgtg 1140 cccagcacgg agcccaagaa cacgtccacg taccgcgtca cgtgatag 1188 <210> 9 <211> 1182 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gcgcccaagt acatagagca cttcagcaag ttctccccgt ccccgctgtc catgaagcag 60 tttctggact tcggatccag caatgcctgt gagaaaacct ccttcacctt cctcaggcag 120 gagctgcctg tgcgcctggc caacatcatg aaagagatca acctgcttcc cgaccgagtg 180 ctgagcacac cctctgtgca gctggtgcag agctggtatg tccagagcct cctggacatc 240 atggagttcc tggacaagga tcccgaggac catcgcaccc tgagccagtt cactgacgcc 300 ctggtcacca tccggaaccg gcacaacgac gtggtgccca ccatggcaca aggcgtgctt 360 gagtacaagg acacctacgg cgatgacccc gtctccaacc agaacatcca gtacttcctg 420 gaccgcttct acctcagccg catctccatc cgcatgctca tcaaccagca caccctcatc 480 tttgatggca gcaccaaccc agcccatccc aaacacatcg gcagcatcga ccccaactgc 540 aacgtctctg aggtggtcaa agatgcctac gacatggcta agctcctgtg tgacaagtat 600 tacatggcct cacctgacct ggagatccag gagatcaatg cagccaactc caaacagccg 660 attcacatgg tctacgtccc ctcccacctc taccacatgc tctttgagct cttcaagaat 720 gccatgaggg cgactgtgga aagccatgag tccagcctca ttctcccacc catcaaggtc 780 atggtggcct tgggtgagga agatctgtcc atcaagatga gtgaccgagg tgggggtgtt 840 cccttgagga agattgagcg actcttcagc tacatgtact ccacagcacc caccccccag 900 cctggcaccg ggggaacgcc gctggctggc tttggttatg ggctccccat ttcccgcctc 960 tacgccaagt acttccaggg agacctgcag ctcttctcca tggaaggctt tgggaccgat 1020 gctgtcatct atctcaaggc cctgtccacg gactcggtgg agcgcctgcc tgtctacaac 1080 aagtcagcct ggcgccacta ccagaccatc caggaggccg gcgactggtg tgtgcccagc 1140 acggagccca agaacacgtc cacgtaccgc gtcacgtgat ag 1182 <210> 10 <211> 392 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ala Pro Lys Tyr Ile Glu His Phe Ser Lys Phe Ser Pro Ser Pro Leu 1 5 10 15 Ser Met Lys Gln Phe Leu Asp Phe Gly Ser Ser Asn Ala Cys Glu Lys 20 25 30 Thr Ser Phe Thr Phe Leu Arg Gln Glu Leu Pro Val Arg Leu Ala Asn 35 40 45 Ile Met Lys Glu Ile Asn Leu Leu Pro Asp Arg Val Leu Ser Thr Pro 50 55 60 Ser Val Gln Leu Val Gln Ser Trp Tyr Val Gln Ser Leu Leu Asp Ile 65 70 75 80 Met Glu Phe Leu Asp Lys Asp Pro Glu Asp His Arg Thr Leu Ser Gln 85 90 95 Phe Thr Asp Ala Leu Val Thr Ile Arg Asn Arg His Asn Asp Val Val 100 105 110 Pro Thr Met Ala Gln Gly Val Leu Glu Tyr Lys Asp Thr Tyr Gly Asp 115 120 125 Asp Pro Val Ser Asn Gln Asn Ile Gln Tyr Phe Leu Asp Arg Phe Tyr 130 135 140 Leu Ser Arg Ile Ser Ile Arg Met Leu Ile Asn Gln His Thr Leu Ile 145 150 155 160 Phe Asp Gly Ser Thr Asn Pro Ala His Pro Lys His Ile Gly Ser Ile 165 170 175 Asp Pro Asn Cys Asn Val Ser Glu Val Val Lys Asp Ala Tyr Asp Met 180 185 190 Ala Lys Leu Leu Cys Asp Lys Tyr Tyr Met Ala Ser Pro Asp Leu Glu 195 200 205 Ile Gln Glu Ile Asn Ala Ala Asn Ser Lys Gln Pro Ile His Met Val 210 215 220 Tyr Val Pro Ser His Leu Tyr His Met Leu Phe Glu Leu Phe Lys Asn 225 230 235 240 Ala Met Arg Ala Thr Val Glu Ser His Glu Ser Ser Leu Ile Leu Pro 245 250 255 Pro Ile Lys Val Met Val Ala Leu Gly Glu Glu Asp Leu Ser Ile Lys 260 265 270 Met Ser Asp Arg Gly Gly Gly Val Pro Leu Arg Lys Ile Glu Arg Leu 275 280 285 Phe Ser Tyr Met Tyr Ser Thr Ala Pro Thr Pro Gln Pro Gly Thr Gly 290 295 300 Gly Thr Pro Leu Ala Gly Phe Gly Tyr Gly Leu Pro Ile Ser Arg Leu 305 310 315 320 Tyr Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Asp Leu Gln Leu Phe Ser Met Glu Gly 325 330 335 Phe Gly Thr Asp Ala Val Ile Tyr Leu Lys Ala Leu Ser Thr Asp Ser 340 345 350 Val Glu Arg Leu Pro Val Tyr Asn Lys Ser Ala Trp Arg His Tyr Gln 355 360 365 Thr Ile Gln Glu Ala Gly Asp Trp Cys Val Pro Ser Thr Glu Pro Lys 370 375 380 Asn Thr Ser Thr Tyr Arg Val Thr 385 390

【図面の簡単な説明】

【図１】二次構造特徴、リガンドと相互作用する残基
または二量体化界面に位置する残基、および４種すべて
のヒトＰＤＨＫアイソザイム中の保存性残基を示す注釈
付きの、ＰＤＨＫ−２^*のタンパク質配列を示す。

【図２】ＰＤＨＫ−２構造のリボンダイアグラムを示
す。

【図３】ＰＤＨＫ−２二量体の二つの視図を示す。

【図４】ＰＤＨＫ−２のＡＴＰ結合部位における配位
水分子とともに、ＡＴＰおよびＭｇ²⁺を示す。

【図５】ＰＤＨＫ−２に結合した（ａ）化合物１およ
び（ｂ）化合物２の視図、ならびに下部に図解したそれ
らの化学構造を示す。

【図６】ＰＤＨＫ−２に結合した化合物３の視図、な
らびにその化学構造を示す。

【図７】重ねたＤＣＡのモデルとともに、ｆ_obs（Ａ
ＤＰ，ＤＣＡ）−ｆ_o _bs（天然）電子密度マップを示
す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/04 Ａ６１Ｐ 9/10 9/10 11/00 11/00 31/04 31/04 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｎ 9/12 9/99 9/99 Ｃ１２Ｑ 1/48 ＺＣ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者コリン・マーク・ロビンソンイギリス国ケントシーティー13・９エヌジェイ，サンドウィッチ，ラムズゲート・ロード，ファイザー・グローバル・リサーチ・アンド・ディベロプメント (72)発明者ウェンディ・エレイン・テイラーイギリス国ケントシーティー13・９エヌジェイ，サンドウィッチ，ラムズゲート・ロード，ファイザー・グローバル・リサーチ・アンド・ディベロプメント (72)発明者アレグザンダー・ダンバー・タッカーイギリス国ケントシーティー13・９エヌジェイ，サンドウィッチ，ラムズゲート・ロード，ファイザー・グローバル・リサーチ・アンド・ディベロプメント

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＰＤＨＫタンパク質が、配列番号２で
示されるがアミノ酸１６位で開始するＰＤＨＫ−２アミ
ノ酸配列、またはその同族体、断片、変異体または誘導
体を含む、ピルビン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ（ＰＤ
ＨＫ）結晶。
【請求項２】ＰＤＨＫ−２タンパク質が、配列番号
２で示されるがアミノ酸１６位で開始するＰＤＨＫ−２
アミノ酸配列、またはその同族体、断片、変異体または
誘導体から成る、請求項１に記載のＰＤＨＫ結晶。
【請求項３】ＰＤＨＫ結晶であって、該ＰＤＨＫ−
２アミノ酸配列が、配列番号２の１から１５位における
アミノ配列に相当しないアミノ酸配列により先行され
る、請求項１または請求項２に記載の。
【請求項４】ＰＤＨＫ−２アミノ酸配列が、アフィ
ニティー精製タグであるアミノ酸配列により先行され
る、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＰＤＨＫ結
晶。
【請求項５】ＰＤＨＫ−２アミノ酸配列が、特異的
タンパク質切断部位であるアミノ酸配列により先行され
る、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＰＤＨＫ配
列。
【請求項６】ＰＤＨＫ−２アミノ酸配列が、特異的
タンパク質切断部位が続くアフィニティー精製タグであ
るアミノ酸配列により先行される、請求項１〜５のいず
れか１項に記載のＰＤＨＫ結晶。
【請求項７】アフィニティー精製タグが多重ヒスチ
ジン残基タグである、請求項４または請求項６に記載の
ＰＤＨＫ結晶。
【請求項８】多重ヒスチジン残基タグがＨｅｘａ−
Ｈｉｓタグである、請求項７に記載のＰＤＨＫ結晶。
【請求項９】特異的タンパク質切断部位がトロンビ
ン切断部位である、請求項５または６に記載のＰＤＨＫ
結晶。
【請求項１０】アフィニティー精製タグがＨｅｘａ
−Ｈｉｓタグであり、特異的タンパク質切断部位がトロ
ンビン切断部位である、請求項６に記載のＰＤＨＫ結
晶。
【請求項１１】ＰＤＨＫタンパク質が、トロンビン
切断部位が続くＨｅｘａ−Ｈｉｓタグにより先行される
ＰＤＨＫアミノ酸配列から成る、請求項１０に記載のＰ
ＤＨＫ結晶。
【請求項１２】ＰＤＨＫタンパク質が、Ｎ末端メチ
オニンアミノ酸残基をさらにもつ、請求項１１に記載の
ＰＤＨＫ結晶。
【請求項１３】ＰＤＨＫ−２アミノ酸配列が、配列
番号４で示される、請求項１２に記載のＰＤＨＫ結晶。
【請求項１４】ＰＤＨＫタンパク質が、配列番号５
で示されるようなＰＤＨＫ−２アミノ酸配列、またはそ
の同族体、断片、変異体または誘導体を含む、ＰＤＨＫ
結晶。
【請求項１５】ＰＤＨＫタンパク質が、一つまたは
二つのアミノ酸残基に先行されるＰＤＨＫ−２アミノ酸
配列から成る、請求項１に記載のＰＤＨＫ結晶。
【請求項１６】ＰＤＨＫタンパク質が、配列番号５
で示されるＰＤＨＫ−２アミノ酸配列、またはその同族
体、断片、変異体または誘導体から成る、請求項１４ま
たは１５に記載のＰＤＨＫ結晶。
【請求項１７】ＰＤＨＫタンパク質が、配列番号５
で示されるＰＤＨＫアミノ酸配列から成る、請求項１６
に記載のＰＤＨＫ結晶。
【請求項１８】ＰＤＨＫ−２アミノ酸配列が、配列
番号４で示されるＰＤＨＫ−２アミノ酸配列のトロンビ
ン切断により提供される、請求項１５〜１７のいずれか
１項に記載のＰＤＨＫ結晶。
【請求項１９】１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．
２−５．８，５−１０％イソプロパノール、および２５
−１５０ｍＭＭｇＣｌ₂中で成長される、請求項１４〜
１８のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項２０】１００ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．
６−５．８，６−９％イソプロパノール、および７５−
１２５ｍＭＭｇＣｌ₂中で成長される、請求項１４〜１
９のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項２１】空間群Ｐ６₄をもつ、請求項１４〜
２０のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項２２】ａ＝ｂ＝１０９Å＋／−３Å，ｃ＝
８５Å＋／−３Åの単位格子次元をもつ、請求項１４〜
２１のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項２３】単斜晶系である、請求項１１〜１３
の１項に記載の結晶。
【請求項２４】１００ｍＭクエン酸ｐＨ５．５−
５．７，１５％ＰＥＧ４Ｋ、および２００から４００ｍ
Ｍの酢酸アンモニウムを用いて成長される、請求項１１
〜１３、または請求項２３のいずれか１項に記載の結
晶。
【請求項２５】空間群Ｃ２をもつ、請求項１１〜１
３、２３または２４のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項２６】ａ＝９０Å＋／−３Å，ｂ＝５４Å
＋／−３Å，ｃ＝８３Å＋／−３Å，およびβ＝１０６
゜＋／−２゜の単位格子次元をもつ、請求項１１〜１
３、または２３〜２５のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項２７】ソーク・インされた重原子をもつ、
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項２８】重原子が水銀、イリジュウム、およ
びオスミウムから選択される、請求項２７に記載の結
晶。
【請求項２９】ソーク・インされたＰＤＨＫリガン
ドおよび／またはＡＴＰまたはＡＤＰをもつ、請求項１
〜２６のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項３０】ＰＤＨＫリガンドとのＰＤＨＫ−２
共結晶。
【請求項３１】ＰＤＨＫ−２アミノ酸配列が、配列
番号５の配列を含む、または該配列から成る、請求項３
０に記載の結晶。
【請求項３２】ＰＤＨＫリガンドの存在下１００ｍ
ＭＭＥＳｐＨ６，１０％イソプロパノールおよび２
００ｍＭ酢酸カルシウム中で成長される、請求項３１に
記載のの結晶。
【請求項３３】リガンドが、４−｛（２，５）−ジ
メチル−４−［３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロ
キシ−２−メチルプロパノイル］ピペラジニル｝カルボ
ニル）ベンゾニトリルである、請求項３０〜３２のいず
れか１項に記載の結晶。
【請求項３４】ＡＴＰがソーク・インされる、請求
項３０〜３３のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項３５】リガンドが、Ｎ−｛４−［（エチル
アニリノ）スルフォニル］−２−メチルフェニル｝−
３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチ
ルプロパンアミドである、請求項２９に記載の結晶。
【請求項３６】リガンドが、Ｎ−（２−アミノエチ
ル）−２−｛３−クロロ−４−［（４−イソプロピルベ
ンジル）オキシ］フェニル｝アセタミドである、請求項
２９に記載の結晶。
【請求項３７】ＰＤＨＫリガンドがＤＣＡであり、
そしてＡＤＰがソーク・インされる、請求項２９に記載
の結晶。
【請求項３８】３．８Åまたはそれより良好な解像
度にＸ線を回折する、請求項１〜３７のいずれか１項に
記載の結晶。
【請求項３９】３．２Åまたはそれより良好な解像
度にＸ線を回折する、請求項３８に記載の結晶。
【請求項４０】２．８Åまたはそれより良好な解像
度にＸ線を回折する、請求項３８に記載の結晶。
【請求項４１】２．５Åまたはそれより良好な解像
度にＸ線を回折する、請求項３８に記載の結晶。
【請求項４２】２．４Åまたはそれより良好な解像
度にＸ線を回折する、請求項３８に記載の結晶。
【請求項４３】２．２Åまたはそれより良好な解像
度にＸ線を回折する、請求項３８に記載の結晶。
【請求項４４】表３に詳述される原子座標、または
任意の基準フレームで発現される誘導体セットをもつ、
請求項１４〜２２のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項４５】表４に詳述される原子座標、または
任意の基準フレームで発現される誘導体セットをもつ、
請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の結晶。
【請求項４６】表５に詳述される原子座標、または
任意の基準フレームで発現される誘導体セットをもつ、
請求項３４に記載の結晶。
【請求項４７】表６に詳述される原子座標、または
任意の基準フレームで発現される誘導体セットをもつ、
請求項３５に記載の結晶。
【請求項４８】表７に詳述される原子座標、または
任意の基準フレームで発現される誘導体セットをもつ、
請求項３６に記載の結晶。
【請求項４９】表８に詳述される原子座標、または
任意の基準フレームで発現される誘導体セットをもつ、
請求項３７に記載の結晶。
【請求項５０】ＰＤＨＫ−２の三次元構造を誘導す
るための、請求項１〜４９のいずれか１項に記載した結
晶の原子座標の使用。
【請求項５１】ＰＤＨＫ−２とある化合物との結合
相互作用をコンピュ−タ−によりまたは他の仕方で評価
するための、請求項５０で誘導されるＰＤＨＫ−２の三
次元構造の使用。
【請求項５２】ＰＤＨＫ−２上の結合部位とある化
合物との結合相互作用をコンピュ−タ−によりまたは他
の仕方で評価するための、請求項５０で誘導されるＰＤ
ＨＫ−２の三次元構造の使用。
【請求項５３】Ｇｌｕ２５１，Ｌｅｕ２５２，Ｌｙ
ｓ２５４，Ａｓｎ２５５，Ａｌａ２５６，Ａｒｇ２５
８，Ａｌａ２５９，Ｍｅｔ２８８，Ｓｅｒ２８９，Ａｓ
ｐ２９０，Ｇｌｙ２９２，Ｇｌｙ２９３，Ｇｌｙ２９
４，Ｖａｌ２９５，Ｉｌｅ３００，Ｌｅｕ３０３，Ｌｅ
ｕ３２３，Ａｌａ３２４，Ｇｌｙ３２５，Ｐｈｅ３２
６，Ｇｌｙ３２７，Ｔｙｒ３２８，Ｇｌｙ３２９，Ｌｅ
ｕ３３０，Ｐｒｏ３３１，Ｌｅｕ３４６，Ｓｅｒ３４
８，Ｔｈｒ３５４，Ａｓｐ３５５，Ａｌａ３５６から選
択される残基を非限定的に含むＰＤＨＫ−２上のＡＴＰ
結合部位とある化合物との結合相互作用を、コンピュ−
タ−によりまたは他の仕方で評価するための、請求項５
０で誘導されるＰＤＨＫ−２の三次元構造の使用。
【請求項５４】Ｌｅｕ３１，Ｇｌｎ３５，Ｐｈｅ３
６，Ａｓｐ３８，Ｐｈｅ３９，Ｔｈｒ４８，Ｓｅｒ４
９，Ｐｈｅ５２，Ｌｅｕ５３，Ｍｅｔ１６７，Ｌｅｕ１
６８，Ｇｌｎ１７１，Ｈｉｓ１７２，Ｉｌｅ１７５，Ｐ
ｈｅ１７６から選択される残基を非限定的に含むＰＤＨ
Ｋ−２上の推定Ｅ₂Ｌ₂結合部位とある化合物との結合相
互作用を、コンピュ−タ−によりまたは他の仕方で評価
するために、請求項５０で誘導されるＰＤＨＫ−２の三
次元構造の使用。
【請求項５５】Ｌｅｕ７１，Ｐｒｏ７２，Ａｒｇ７
４，Ｖａｌ７５，Ｔｈｒ７８，Ｓｅｒ８０，Ｖａｌ８
１，Ｍｅｔ１３０，Ｇｌｙ１３３，Ｖａｌ１３４，Ｇｌ
ｕ１３６，Ｔｙｒ１３７，Ａｓｐ１４４，Ｖａｌ１４
６，Ｓｅｒ１４７，Ａｓｎ１５０，Ｉｌｅ１５１，Ｐｈ
ｅ１５４，Ｌｅｕ１５５，Ｔｙｒ３８２から選択される
残基を非限定的に含むＰＤＨＫ−２上の結合部位とある
化合物との結合相互作用を、コンピュ−タ−によりまた
は他の仕方で評価するための、請求項５０で誘導される
ＰＤＨＫ−２の三次元構造の使用。
【請求項５６】Ｌｅｕ５７，Ｌｅｕ６１，Ｔｙｒ８
８，Ｓｅｒ９１，Ｉｌｅ９５，Ｉｌｅ１１９，Ａｒｇ１
２０，Ｈｉｓ１２３，Ｓｅｒ１６１，Ａｒｇ１６２，Ｉ
ｌｅ１６５，Ａｒｇ１６６，Ｉｌｅ１６９から選択され
る残基を非限定的に含む、ＰＤＨＫ−２上の結合部位と
ある化合物との結合相互作用をコンピュ−タ−によりま
たは他の仕方で評価するために、請求項５０で誘導され
るようなＰＤＨＫ−２の三次元構造の使用。
【請求項５７】ＰＤＨＫ−２と会合できる化合物を
デザインするための、請求項５０で誘導されるＰＤＨＫ
−２の三次元構造の使用。
【請求項５８】ＰＤＨＫ−２の結合部位と会合でき
る化合物をデザインするための、請求項５０で誘導され
るＰＤＨＫ−２の三次元構造の使用。
【請求項５９】請求項５３〜５６のいずれか１項で
規定されるようなＰＤＨＫ−２の結合部位と会合できる
化合物をデザインするための、請求項５０で誘導される
ＰＤＨＫ−２の三次元構造の使用。
【請求項６０】化合物がＰＤＨＫ−２の阻害剤であ
る、請求項５０〜５９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６１】ＰＤＨＫ−２への結合について評価
された、または請求項５１〜６０のいずれか１項の使用
によりデザインされる、化合物。
【請求項６２】可能性のあるＰＤＨＫ−２阻害剤化
合物の群からＰＤＨＫ−２阻害剤化合物を選択する方法
であって、下記の工程：ａ）請求項５０の使用で誘導されるＰＤＨＫ−２の構
造の三次元表現を作出する；ｂ）該ＰＤＨＫ−２構造のモデル上に、可能性のある
ＰＤＨＫ−２阻害剤化合物のモデルを表示し、重ねる；ｃ）該可能性のあるＰＤＨＫ−２阻害剤化合物のモデ
ルが、該ＰＤＨＫ−２構造のモデルに、ぴったり合うか
どうかを査定することを含む、前記方法。
【請求項６３】可能性のあるＰＤＨＫ−２阻害剤化
合物の群からＰＤＨＫ−２阻害剤化合物を選択する方法
であって、下記の工程：ａ）適切なコンピュータープログラムで、請求項５０
の使用で誘導されるＰＤＨＫ−２の結合部位のいずれか
一つの三次元表現を作出する；ｂ）該結合部位のモデル上に、可能性のあるＰＤＨＫ
−２阻害剤化合物のモデルを表示し、重ねる；ｃ）該可能性のあるＰＤＨＫ−２阻害剤化合物のモデ
ルが、該結合部位モデルに、ぴったり合うかどうかを査
定することを含む、前記方法。
【請求項６４】請求項６２または６３に記載の方法
であって、下記の工程：ｄ）可能性のあるＰＤＨＫ−２阻害剤化合物を、生物
学的ＰＤＨＫ−２活性分析に取込む；ｅ）該可能性のあるＰＤＨＫ−２阻害剤化合物が、こ
の分析においてＰＤＨＫ−２活性を阻害するかどうかを
決定することをさらに含む、前記方法。
【請求項６５】請求項６２、６３または６４に記載
の方法により選択される化合物。
【請求項６６】ＰＤＨＫ−２の二量体化界面で結合
する、または他の仕方でその二量体化を妨害するため
に、請求項５１〜６０に記載されたように評価され、ま
たはデザインされ、または６２〜６４に記載の方法によ
り選択された、化合物。
【請求項６７】請求項６１、６５または６６に記載
の化合物を含む、医薬組成物。
【請求項６８】ＰＤＨＫの阻害が有益な疾患の治療
用の薬剤の製造における、請求項６１、６５または６６
に記載の化合物の使用。
【請求項６９】疾患が、鬱血性心不全、末梢性血管
疾患、慢性閉塞性肺疾患、または冠動脈疾患のような虚
血関連疾患である、請求項６８に記載の使用。
【請求項７０】疾患が、糖尿病、虚血、内毒素ショ
ック、出血性ショック、乳酸アシドーシス、または心不
全である、請求項６８に記載の使用。
【請求項７１】例えば分子交換または差フーリエ分
析によって、ＰＤＨＫ−２の変異体、同族体、または共
複合体の結晶型を解明するための、請求項４４〜４９で
規定されたＰＤＨＫ−２の原子座標、またはそれらの部
分、の使用。
【請求項７２】関連タンパク質の三次元構造のモデ
ルを作製するために、請求項４４から４９で規定される
ようなＰＤＨＫ−２の原子座標、またはそれらの部分、
の使用。
【請求項７３】他のＰＤＨＫアイソザイムまたはそ
れらの変異体を模倣する部位特異的変異体をデザインす
るための、請求項５０の使用で誘導されるＰＤＨＫ−２
の三次元構造の使用。
【請求項７４】（ａ）配列番号３で示される配列、
またはその対立遺伝子変異体、またはそれらの変異体；
または（ｂ）配列番号４で示されるペプチド配列をコー
ドする配列、またはその対立遺伝子変異体、またはそれ
らの変異体；または（ｃ）配列番号９で示される配列、
またはその対立遺伝子変異体、またはそれらの変異体；
または（ｄ）配列番号２で示されるが、アミノ酸１６位
で開始するＰＤＨＫ−２アミノ酸配列をコードする配
列、またはその対立遺伝子変異体またはそれらの変異
体；または（ｅ）配列番号８で示される配列またはその
対立遺伝子変異体、またはそれらの変異体；または
（ｆ）配列番号５で示されるアミノ酸配列をコードする
配列、またはその対立遺伝子変異体またはそれらの変異
体、を含むヌクレオチド配列。
【請求項７５】請求項７４に記載したヌクレオチド
配列が、宿主細胞中で前記ＰＤＨＫタンパク質の発現を
駆動するのに適した調節配列に連結されている、発現ベ
クター。
【請求項７６】請求項７４に記載したヌクレオチド
配列を含む、組換え体バキュロウイルス。