JP2002543090A - Peptide homodimer and peptide heterodimer derived from interferon α2 - Google Patents
Peptide homodimer and peptide heterodimer derived from interferon α2Info
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、アミノ酸配列ＷＤＥＴＬＬＫＦＹＴＥＬＹＱＱＬ（モノマーＩ）、ＳＬＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱ（モノマーＩＩ）またはＱＧＶＧＶＴＥＴＰＬＭＫＥＤＳＩＬＡＶ（モノマーＩＩＩ）を有するペプチドモノマーからなるホモダイマーおよびヘテロダイマーまたはそれらのバリアントに関する。ホモダイマーまたはヘテロダイマーは、インターフェロンα２レセプターに結合し、任意に細胞シグナルを誘発しうる。該ダイマーは、免疫系疾患、増大または減少した細胞増殖に関連した疾患、感染過程または炎症過程を治療するか、または例えば、インターフェロンα２レセプターの改変された発現、または高すぎるもしくは低すぎる発現に関連する疾患を検出するのに適切である。 (57) [Summary] The present invention relates to homodimers and heterodimers comprising peptide monomers having the amino acid sequence WDETLLKFYTELYQQL (monomer I), SLFSCLKDRHDDFGFPQEEFGGNQ (monomer II) or QGVGVTETPLMKEDSILAV (monomer III) or variants thereof. Homodimers or heterodimers can bind to the interferon α2 receptor and optionally elicit a cellular signal. The dimer treats an immune system disease, a disease associated with increased or decreased cell proliferation, an infectious or inflammatory process, or is associated with, for example, altered expression of interferon α2 receptor, or too high or too low expression It is suitable for detecting diseases that occur.
Description
【０００１】 本発明は、ＷＤＥＴＬＬＫＦＹＴＥＬＹＱＱＬ（モノマーＩ）、ＳＬＦＳＣＬ
ＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱ（モノマーＩＩ）、またはＱＧＶＧＶＴＥＴ
ＰＬＭＫＥＤＳＩＬＡＶ（モノマーＩＩＩ）のアミノ酸配列、もしくはそれらの
変異配列をもつペプチドモノマーのホモダイマーまたはヘテロダイマーであって
、インターフェロンα２レセプターに結合するとともに、任意に、細胞シグナル
（zellulaeres Signal）を誘発する（ausloesen）ことができるホモダイマーま
たはヘテロダイマーに関する。また、本発明は、これらのホモダイマーまたはヘ
テロダイマーを含む薬剤にも関する。さらに、本発明は、本発明のホモダイマー
またはヘテロダイマー、もしくはこれらに対する抗体を用いる診断用組成物およ
び診断方法に関する。The present invention relates to WDETLKFYTELYQQL (monomer I), SLFSCL
KDRHDDFGFPQEEFGGNQ (monomer II) or QGVGVTET
A homodimer or heterodimer of a peptide monomer having an amino acid sequence of PLMKEDSILAV (monomer III) or a mutant thereof, which binds to an interferon α2 receptor and optionally induces a cell signal (ausloesen). Homodimers or heterodimers that can be used. The present invention also relates to drugs containing these homodimers or heterodimers. Further, the present invention relates to a diagnostic composition and a diagnostic method using the homodimer or heterodimer of the present invention, or an antibody thereto.
【０００２】 腫瘍の治療は、いまだに、手術、化学療法および放射線治療という三本柱に実
質的に基づいている。しかしながら、過去数年の間に、サイトカインを用いる一
次的（すなわち、独占的な）または補助的（支援的）な治療が、頻繁に平均余命
を延長し、しばしば完全な治癒をもたらすという洞察が、一般的に認められるよ
うになった。サイトカインは、さまざまな細胞によって合成された後分泌される
内因的なメッセンジャー物質（Botenstoffe）である。これらサイトカインが果
たす生物学的な役割は多様で、今のところ一部しか分かっていない。いずれの場
合にも、サイトカインは、主に基礎的免疫調節作用を有する。腫瘍治療において
広く使用されているサイトカインはインターフェロンであり、１５６〜１６６ア
ミノ酸、または１７２アミノ酸（ａａ）からなる、少なくとも２３種類のさまざ
まな変種で構成されるファミリーであって、分子量が１９〜２６ｋＤＡであるフ
ァミリーからなる（WeissmanとWeber 、Progr. Nucleic Acid Res. Mol. Biol.
33 (1986), 251-300、およびHenco ら、J. Mol. Biol. 185 (1985), 227-260 ）
。それらは、特異的なレセプターに結合することによって、細胞内を誘発し（Uz
e ら、EMBO J. 4 (1985), 65-70 ）、それにより抗ウイルス作用、細胞分裂の阻
害、および免疫系ＮＫ細胞の活性を上昇させるという、インターフェロンの本質
的な作用を生じさせる（Dolyら、Cell. Mol. Life Sci. 54 (1998), 1109-1121
）。また、そこから、肝炎の治療だけでなく、ヘアリーセル白血病、転移性腎細
胞癌、エイズ関連カポージ肉腫、ならびにさまざまな形態のリンパ腫および黒色
腫の治療という、インターフェロンが適用される重要な分野も生じている。[0002] Treatment of tumors is still substantially based on the three pillars of surgery, chemotherapy and radiation therapy. However, during the past few years, the insight that primary (ie, exclusive) or adjuvant (assistant) treatment with cytokines often prolongs life expectancy and often results in complete healing, It has become generally accepted. Cytokines are endogenous messenger substances (Botenstoffe) that are synthesized and secreted by various cells. The biological roles of these cytokines are diverse and only partially known at this time. In each case, cytokines have a predominantly basal immunomodulatory effect. A cytokine widely used in tumor therapy is interferon, a family of at least 23 different variants consisting of 156-166 amino acids, or 172 amino acids (aa), having a molecular weight of 19-26 kDA. From a family (Weissman and Weber, Progr. Nucleic Acid Res. Mol. Biol.
33 (1986), 251-300, and Henco et al., J. Mol. Biol. 185 (1985), 227-260).
. They trigger intracellularly by binding to specific receptors (Uz
e et al., EMBO J. 4 (1985), 65-70), thereby producing the essential effects of interferon: antiviral action, inhibition of cell division, and increased activity of immune system NK cells (Doly Cell. Mol. Life Sci. 54 (1998), 1109-1121.
). It also raises important areas for the treatment of hepatitis, as well as the treatment of hairy cell leukemia, metastatic renal cell carcinoma, AIDS-related Kaposi's sarcoma, and various forms of lymphoma and melanoma, where interferons are applied. ing.
【０００３】 インターフェロンファミリーの中で、治療に用いられるのは、主に、１６６ア
ミノ酸からなるインターフェロンα２であるが、その理由は、それが、ヒトのイ
ンターフェロンレセプターに対して最大の親和性をもつためである。インターフ
ェロンα２のアミノ酸配列の中には、レセプター結合に関与し、それにより、生
物活性に関与するさまざまなドメインがある。これらは、アミノ酸１−１２、２
５−３８、７０−７４、および１０３−１１３のループである（Raj 、J. Biol.
Chem. 263 (1988), 8943-8952）。[0003] Among the interferon family, the ones used for therapy are mainly interferon α2 consisting of 166 amino acids, because it has the greatest affinity for the human interferon receptor. It is. Within the amino acid sequence of interferon α2, there are various domains involved in receptor binding and thereby biological activity. These are amino acids 1-12, 2
Loops 5-38, 70-74, and 103-113 (Raj, J. Biol.
Chem. 263 (1988), 8943-8952).
【０００４】 所望の細胞性効果（例えば、抗増殖性作用または免疫賦活性作用など）を得る
には、しばしば、レセプターと相互作用する短いインターフェロンドメインを投
与するだけで十分である。しかしながら、インターフェロンα２については、こ
れまでインターフェロンα２の一部に相当する合成ペプチドを用いた研究（Dani
lkovitchら、Hybridoma 16, (1997), 69-75 ）しか行われたことがなく、また、
このペプチドはモノマーとして、インビトロ試験でしか用いられたことがない。
さらに、このペプチドのアミノ酸配列は、Ｃ−末端（ａａ１２４−１４４）の一
部に相当するものであった。残念ながら、所望の結果を得ることはできなかった
。[0004] Often, it is sufficient to administer a short interferon domain that interacts with the receptor to achieve the desired cellular effect (eg, an antiproliferative or immunostimulatory effect). However, as for interferon α2, a study using a synthetic peptide corresponding to a part of interferon α2 (Dani
lkovitch et al., Hybridoma 16, (1997), 69-75)
This peptide has only been used as a monomer in in vitro tests.
Furthermore, the amino acid sequence of this peptide corresponded to a part of the C-terminal (aa124-144). Unfortunately, the desired results could not be obtained.
【０００５】 サイトカインは、一般的には、血清中に極めて少量しか存在しないため、この
媒体から治療上有効な量を単離することはできない。その結果、今までのところ
、治療に使用されるサイトカインは、細菌や酵母の中で遺伝子組換えによって産
生されている。しかしながら、この方法には、数多くの重大な欠点が伴う。[0005] Since cytokines are generally present in very small amounts in serum, it is not possible to isolate a therapeutically effective amount from this medium. As a result, to date, therapeutic cytokines have been produced by genetic recombination in bacteria and yeast. However, this method has a number of significant disadvantages.
【０００６】 （１）準備の段階で、サイトカイン組換え体の製造は時間がかかる上に手間も
かかる。例えば、次のことを明確にしなければならない。宿主細胞は正確に、す
なわち、正確に元通りの立体構造をもつようにタンパク質を発現するか、実際の
ところ、最適な宿主細胞または発現ベクターはどれか、また、どのような条件下
でなら、タンパク質がタンパク質分解を受けないのか。一般的に、組換えによっ
て作出されたタンパク質は本来のタンパク質とは異なった三次元構造をもつため
、ヒトの免疫系によって「異物」であると認識されることに留意すべきである。
これによって誘導される抗体は、サイトカインなどのタンパク質を中和するため
、その有効性が失われる結果になる。(1) In the preparation stage, production of a recombinant cytokine is time-consuming and time-consuming. For example, the following must be clarified: Whether the host cell expresses the protein correctly, i.e., with exactly its original conformation, and, in fact, which host cell or expression vector is optimal, and under what conditions, Does the protein undergo proteolysis? It should be noted that, in general, proteins produced by recombination have a different three-dimensional structure than the original protein and are therefore recognized as "foreign" by the human immune system.
The antibodies induced thereby neutralize proteins such as cytokines, resulting in a loss of their effectiveness.
【０００７】 （２）どのようにすれば、タンパク質の分解および／または単離後の沈殿を防
止できるかという、原則として、全ての新しい産物に特有の同一の問題が常に生
じるため、組換えタンパク質を分離し、精製するのは困難である。概して、組換
えによって産生されたタンパク質は、プロテアーゼに対して顕著に不安定である
。このことは、頻繁かつ／または大量の投与を必要とし、患者に深刻な負担をか
ける一方で、治療費用を非常に高くしている。(2) In principle, the same problem specific to all new products always arises, how to prevent the degradation of the protein and / or the precipitation after isolation. Are difficult to separate and purify. In general, recombinantly produced proteins are significantly more labile to proteases. This requires frequent and / or large doses and places a serious burden on the patient, while at the same time greatly increasing the cost of treatment.
【０００８】 （３）治療においては、通常、一定期間をおいてサイトカインを投与しなけれ
ばならないため、宿主細胞の成分からの、コンタミネーションが絶対にないこと
が保証されていなければならない。このような理由で、費用に好ましくない影響
を与える複雑な方法が用いられなければならない。(3) In the treatment, usually, cytokines must be administered after a certain period of time, so that it must be guaranteed that there is absolutely no contamination from host cell components. For this reason, complex methods must be used that have a negative effect on costs.
【０００９】 （４）一方では、メッセンジャー物質（例えばサイトカイン）が、レセプター
結合部位をもつだけでなく、さらに、現在のところまだ十分には理解されていな
いが、実際に対象となっているシグナル経路以外のシグナル経路を誘導する可能
性のあるドメインが存在するという推察が広く採用されている。この推察は、と
りわけ、これまでに使用されてきたサイトカインで頻繁に副作用が生じ、その結
果、時によってはそれを用いた治療が不可能になることの説明となる。(4) On the other hand, messenger substances (eg, cytokines) not only have receptor binding sites, but also signal pathways that are not yet fully understood at present, but are of interest The presumption that there is a domain that may induce a signaling pathway other than that has been widely adopted. This speculation accounts, inter alia, for the frequent side effects of previously used cytokines, which in some cases make treatment with them impossible.
【００１０】 従って、本発明の技術的課題は、主に、インターフェロンα２の生物活性を持
つ化合物を提供して、先行技術がもつ前者の欠点を回避すること、すなわち、薬
剤として投与したときに、より少ない副作用、より長い半減期、および強い生物
活性を得ることである。Therefore, the technical problem of the present invention is mainly to provide a compound having the biological activity of interferon α2 to avoid the former disadvantage of the prior art, that is, when administered as a drug, Obtaining fewer side effects, longer half-life, and strong biological activity.
【００１１】 この技術的課題は、本特許請求の範囲において特徴づけられている実施態様を
提供することによって解決された。[0011] This technical problem has been solved by providing the embodiments characterized in the claims.
【００１２】 本発明の実施態様は、ＷＤＥＴＬＬＫＦＹＴＥＬＹＱＱＬ（モノマーＩ）、Ｓ
ＬＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱ（モノマーＩＩ）、またはＱＧＶ
ＧＶＴＥＴＰＬＭＫＥＤＳＩＬＡＶ（モノマーＩＩＩ）のアミノ酸配列を有する
ペプチドモノマーの合成ホモダイマーまたはヘテロダイマーであって、インター
フェロンα２レセプターに結合でき、細胞シグナルを誘発させることのできる合
成ホモダイマーまたはヘテロダイマーに関する。本発明のこれらのダイマーは、
レセプターが細胞内シグナルを誘発させるには２つが一緒になる必要があること
から、ペプチドが生物学的作用をもつためには、二量体化した形で使用される必
要があるという洞察に基づく。また、これらのダイマーには、常法によって簡単
に合成したり精製することができ、必要な試験（例えば、構造研究、生物学的研
究、前臨床研究および臨床研究）に直接用いることができるという長所がある。
これらのペプチドは、それぞれのサイトカインが生物学的な有効性を有するため
に必要とされる最小の構造を表わしている。これによって、副作用を最小にしつ
つ、最大限の特異性と強い生物活性が保証される。ペプチドは非常に小さいため
、マイクロカプセル化して、カプセルの各々の孔径に応じて、さまざまに長期間
にわたる効果をもつ持効性形態を得ることができる。持効性形態（Depotform）
は、局所的に適用され、長期間にわたって所望の部位（例えば、癌の病巣）で、
活性物質の濃度が最大になるのを確実にすることができる。An embodiment of the present invention relates to WDETLKFYTELYQQL (monomer I), S
LFSCLKDRHDFGFPQEEFGGNQ (monomer II), or QGV
The present invention relates to a synthetic homodimer or heterodimer of a peptide monomer having an amino acid sequence of GVTETPLKMKEDSILAV (monomer III), which can bind to an interferon α2 receptor and induce a cell signal. These dimers of the present invention are:
Based on the insight that peptides need to be used in a dimerized form in order for the peptide to have a biological effect, since the receptor needs to come together to trigger an intracellular signal . In addition, these dimers can be easily synthesized and purified by conventional methods, and can be directly used for necessary tests (eg, structural studies, biological studies, preclinical studies and clinical studies). There are advantages.
These peptides represent the minimal structure required for each cytokine to have biological efficacy. This ensures maximum specificity and strong biological activity while minimizing side effects. Because the peptides are very small, they can be microencapsulated to obtain a sustained release form with varying long-term effects, depending on the pore size of each of the capsules. Depotform
Is applied topically and over a long period of time at a desired site (eg, a cancer focus)
It can be ensured that the concentration of the active substance is maximized.
【００１３】 本発明のペプチドは、通常、例えば下記の実施例１に記載するように、既知の
固相合成法にしたがって合成される。生物活性（レセプターへの結合、細胞シグ
ナルの誘発、および増殖刺激作用）は、当業者に親しまれている方法、例えば、
Lewis 、J. Immunol. Methods 185 (1995)、9-17；Grander ら、Eur. J: Cancer
28A (1992) 、815-818 ）などに記載されている方法、または下記の実施例に記
載されている方法によって調査される。The peptide of the present invention is usually synthesized according to a known solid-phase synthesis method, for example, as described in Example 1 below. Biological activity (binding to receptors, triggering cell signals, and stimulating growth) can be determined by methods familiar to those skilled in the art, for example,
Lewis, J. Immunol. Methods 185 (1995), 9-17; Grander et al., Eur. J: Cancer.
28A (1992), 815-818) or the method described in the Examples below.
【００１４】 本発明の好ましい実施態様において、上記ペプチドは、モノマーがＣ末端また
はＮ末端を介して結合してなるか、または一方のモノマーのＮ末端が他方のモノ
マーのＣ末端と結合してなるホモダイマーまたはヘテロダイマーである。好まし
くは、モノマーＩのＣ末端がモノマーＩＩのＮ末端もしくはＣ末端と結合してな
るか、またはモノマーＩのＮ末端がモノマーＩＩのＮ末端もしくはＣ末端と結合
してなる。一例として、所望のＮ末端側ペプチドは、例えばピペリジン処理によ
って保護基（好ましくはＦｍｏｃ）を除去した後の側鎖官能基保護形態において
架橋剤によって活性化され、その生成物はＨＰＬＣで精製される。別の以前に合
成されたモノマーも、結合しているペプチドのＮ末端基とだけ反応する基をもつ
側鎖官能基保護形態で（所望のダイマーに応じて、Ｃ末端かＮ末端で）提供され
る。このモノマーを、活性化されたモノマーに添加した後、側鎖保護基を除去し
てから、溶出挙動に関してモノマーとは顕著に異なるダイマーを常法に従って逆
相ＨＰＬＣによって精製単離する。アミノ酸組成によって可能であるならば、賦
活基および架橋剤も、遊離したモノマーによる二量体化を、側鎖保護基を除去し
た後に溶液の中で直接行なうことができるように選択することができる。あるい
は、側鎖保護基を維持し、水溶液中で二量体化を行なうために、実施例に記載さ
れているようにＨＹＣＨＲＯＮアンカーで合成ストラテジーを行なうことができ
る。[0014] In a preferred embodiment of the present invention, the above-mentioned peptide comprises a monomer linked via a C-terminus or an N-terminus, or the N-terminus of one monomer linked to the C-terminus of another monomer. It is a homodimer or a heterodimer. Preferably, the C-terminus of monomer I is bound to the N-terminus or C-terminus of monomer II, or the N-terminus of monomer I is bound to the N-terminus or C-terminus of monomer II. As an example, the desired N-terminal peptide is activated by a crosslinker in a protected side-chain functional group form after removal of the protecting group (preferably Fmoc), for example by piperidine treatment, and the product is purified by HPLC. . Another previously synthesized monomer is also provided in a protected side-chain functional form (at the C-terminus or N-terminus, depending on the desired dimer), with groups that react only with the N-terminal group of the peptide to which it is attached. You. After adding this monomer to the activated monomer, the side-chain protecting groups are removed, and then the dimer, which differs significantly from the monomer in elution behavior, is purified and isolated by reversed-phase HPLC according to a conventional method. If possible by the amino acid composition, the activator and the crosslinker can also be selected such that dimerization with the released monomers can be carried out directly in solution after removal of the side-chain protecting groups. . Alternatively, synthetic strategies can be performed with HYCHRON anchors as described in the examples to maintain side-chain protecting groups and perform dimerization in aqueous solution.
【００１５】 レセプター対への有効な結合が依然として可能なように二量体化が起きるとい
う事実に注意を払いつつ、この架橋を、例えば下記の実施例に記載されている方
法によって、または別の常法によって行なうことができる。例えば、枝分かれ部
位としてリジン残基を用いて二量体化を行なうことができる（Wrightonら、Natu
re Biotecnology 15 (1997) 、1261-1265 ）。本発明のダイマーの成分は、好ま
しくは、ポリエチレングリコール、ペプチド、活性化ビンゾジアゼピン、オキサ
ゾロン、アザラクトン、アミンイミド（Aminimide ）、ジケトピペラジン、また
は単糖などのリンカーを介して、互いに共有結合的に連結している。同様に行な
うことができる化学反応は当業者に知られており、本分野において実施されてい
る （例えば、サンディエゴにあるアカデミックプレス社刊（Academic Press、
San Diego ）、Hermannson、生体分子結合技術（Bioconjugate Techniques ）（
1996）；Peeters ら、J.Immunol.Methods 120 、（1989）、133-144 ；Imman ら
、Bioconjugate Chem.2 （1991）、458-463 ）。Noting the fact that dimerization occurs so that effective binding to the receptor pair is still possible, this crosslinking can be carried out, for example, by the method described in the examples below, or by another method. It can be performed by a conventional method. For example, dimerization can be performed using lysine residues as branching sites (Wrighton et al., Natu
re Biotecnology 15 (1997), 1261-1265). The components of the dimer of the present invention are preferably covalently linked to each other via a linker such as polyethylene glycol, peptide, activated vinzodiazepine, oxazolone, azalactone, amine imide (Aminimide), diketopiperazine or monosaccharide. ing. Chemical reactions that can also be performed are known to those skilled in the art and are performed in the art (eg, Academic Press, San Diego).
San Diego), Hermannson, Bioconjugate Techniques (
1996); Peeters et al., J. Immunol. Methods 120, (1989), 133-144; Imman et al., Bioconjugate Chem. 2 (1991), 458-463).
【００１６】 本発明は、また、モノマーが、対応する出発物質のモノマーＩ、ＩＩおよびＩ
ＩＩに１個以上のアミノ酸の欠失、付加、または置換および／または修飾アミノ
酸をもつ点に特徴があるホモダイマーまたはヘテロダイマーに関する。これに関
連して、（ａ）本来の形態と比較すると、同様またはより良好な様式でインター
フェロンα２レセプターに結合し、および／または細胞シグナルを誘発すること
ができるホモダイマーまたはヘテロダイマー、または（ｂ）インターフェロンα
２レセプターに結合することはできるが、投与された際に、生物学的活性形態が
、レセプターへの結合後に細胞シグナルを誘発しないこの形態により置き換えら
れるというアンタゴニスト作用を有するホモダイマーまたはヘテロダイマーが得
られる。下の実施例に記載されている方法、または上記の方法によって、どの程
度まで、これらの改変ホモダイマーまたはヘテロダイマーが所望の生物学的特性
をもつのかを調べることができる。アミノ酸置換または付加においては、修飾ア
ミノ酸を除外することはないが、天然のアミノ酸を導入するのが好適である。好
適な修飾には、セリン、スレオニン、およびアスパラギンの単糖または二糖によ
るグリコシル化、システインのファルネシル化およびパルミトイル化、スレオニ
ン、セリン、およびチロシンのリン酸化、中心アミノ酸に関する修飾で、通常、
アンタゴニスト形態をもたらすものなどが含まれる。本発明の上記修飾ホモダイ
マーまたはヘテロダイマーの欠失、付加、置換、および／または修飾は、モノマ
ー当たり、多くとも１０個、好ましくは、多くとも７個、さらに好ましくは、多
くとも３個、もっとも好ましくは、多くとも１個のアミノ酸である。改変モノマ
ーからなる、本発明のホモダイマーまたはヘテロダイマーは、レセプター結合に
関与するドメイン以外には、天然のサイトカインに特徴的なドメインを含まない
。The present invention also provides that the monomers are represented by the corresponding starting monomers I, II and I
II relates to homodimers or heterodimers characterized by having one or more amino acid deletions, additions or substitutions and / or modified amino acids. In this context, (a) a homodimer or heterodimer capable of binding to and / or eliciting a cellular signal to the interferon α2 receptor in a similar or better manner when compared to its native form, or (b) Interferon alpha
Homodimers or heterodimers which can bind to the 2 receptor but which, when administered, have an antagonistic effect whereby the biologically active form is replaced by this form which does not elicit a cellular signal after binding to the receptor . The methods described in the Examples below, or the methods described above, allow one to determine to what extent these modified homodimers or heterodimers have the desired biological properties. Amino acid substitutions or additions do not exclude modified amino acids, but preferably introduce natural amino acids. Suitable modifications include glycosylation of serine, threonine, and asparagine with mono- or disaccharides, farnesylation and palmitoylation of cysteine, phosphorylation of threonine, serine, and tyrosine, modifications of central amino acids, and are usually
And those that result in an antagonistic form. The deletion, addition, substitution, and / or modification of the above-mentioned modified homodimer or heterodimer of the present invention is at most 10, preferably at most 7, more preferably at most 3, and most preferably per monomer. Is at most one amino acid. The homodimer or heterodimer of the present invention comprising a modified monomer does not contain a domain characteristic of a natural cytokine other than a domain involved in receptor binding.
【００１７】 本発明のホモダイマーまたはヘテロダイマーは、それだけで利用することもで
きるが、例えば（ポリ）ペプチドなど、別の化合物と結合させることもできる。
例えば、身体によって異物と認識されないトランスフェリンやアルブミンなどの
キャリアタンパク質が、そのような（ポリ）ペプチドに含まれる。また、本発明
のホモダイマーまたはヘテロダイマーは、例えば、本発明のペプチドが細胞の中
に貫入するのを可能にするかまたは支持するリーダーペプチドなどの他の（ポリ
）ペプチドと融合させることもできる。このようなリーダーペプチドの例は、シ
ョウジョウバエのペネトラトリン（Penetratrin ）である。The homodimer or heterodimer of the present invention can be used by itself, or can be bound to another compound such as a (poly) peptide.
For example, carrier proteins such as transferrin and albumin that are not recognized as foreign by the body are included in such (poly) peptides. The homodimers or heterodimers of the invention can also be fused to other (poly) peptides, such as, for example, a leader peptide that allows or supports the peptide of the invention to penetrate cells. An example of such a leader peptide is Drosophila penetratrine.
【００１８】 さらに別の実施態様において、本発明は、１個以上のアミノ酸が、脂肪酸、単
糖、および／またはオリゴ糖によって共有結合的に修飾されているという特徴を
さらにもつ上記のホモダイマーまたはヘテロダイマーに関する。これは、例えば
、上記の修飾が既になされているアミノ酸を用いたモノマー合成など、公知の方
法によって行なうことができる。修飾は、後で行なうこともできる。これらの修
飾によって、例えば、タンパク質分解に対する抵抗性を高めたり、それによって
、さらに生物学的半減期を長くしたりすることができる。In yet another embodiment, the present invention relates to the aforementioned homodimer or heterodimer, further characterized in that one or more amino acids is covalently modified by a fatty acid, a monosaccharide, and / or an oligosaccharide. About dimer. This can be performed by a known method such as, for example, monomer synthesis using an amino acid that has already been modified as described above. Modifications can also be made later. These modifications can, for example, increase resistance to proteolysis and thereby increase biological half-life.
【００１９】 本発明は、また、本発明の上記ダイマーに対する抗体またはその断片にも関す
る。これらの抗体は、例えば、診断アッセイ法に用いることもできる。The present invention also relates to an antibody against the above dimer of the present invention or a fragment thereof. These antibodies can also be used, for example, in diagnostic assays.
【００２０】 抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または合成抗体、もしく
は、それらの断片でもよい。これに関して、「断片」という用語は、完全な抗体
のエピトープ特異性と同一の特異性をもつモノクローナル抗体のすべての部分
（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、または単鎖Ｆｖ断片）を意味する。当業者は、このよ
うな断片の製造には慣れている。本発明の抗体は、好ましくは、モノクローナル
抗体である。本発明の抗体は、本発明のホモダイマーまたはヘテロダイマーを免
疫原として使用し、常法にしたがって製造することができる。モノクローナル抗
体を取得する方法は、当業者に知られている。[0020] The antibody may be a monoclonal, polyclonal, or synthetic antibody, or a fragment thereof. In this regard, the term "fragment" refers to any portion of a monoclonal antibody that has the same specificity as the epitope specificity of a complete antibody.
(Eg, Fab, Fv, or single chain Fv fragment). Those skilled in the art are accustomed to producing such fragments. The antibodies of the present invention are preferably monoclonal antibodies. The antibody of the present invention can be produced by a conventional method using the homodimer or heterodimer of the present invention as an immunogen. Methods for obtaining monoclonal antibodies are known to those skilled in the art.
【００２１】 特に好適な実施態様において、本発明のモノクローナル抗体は、動物（例えば
マウス）由来の抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体、もしくはそれらの断片で
ある。キメラヒト抗体またはヒト化抗体に類似した抗体は、潜在的な抗原性が低
下している。しかし、標的に対するそれらの親和性は低下していない。キメラ抗
体およびヒト化抗体の製造、またはヒト抗体に類似した抗体の製造については、
詳述されている（例えば、Queen ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (19
89) 、10029 、およびVerhoeyan ら、Science 239 (1988)、1534）。ヒト化免疫
グロブリンには、実質的にヒト免疫グロブリンに由来する多様なフレームワーク
領域（アクセプター免疫グロブリンと呼ばれる）、および非ヒト（例えばマウス
）免疫グロブリンに実質的に由来する相補性決定領域（ドナー免疫グロブリンと
呼ばれる）がある。定常領域が存在する場合には、実質的にヒト免疫グロブリン
にも由来する。人間の患者に投与する場合には、ヒト化（およびヒト）抗体は、
マウスや他の動物種の抗体に対して、次のようないくつかの長所がある。（ａ）
ヒトの免疫系は、ヒト化抗体のフレームワークまたは定常領域を異物であるとは
認識しないので、注射されたこのような抗体に対する抗体反応は、全くの外来マ
ウス抗体、または部分的な外来キメラ抗体に対する抗体反応よりも小さいはずで
ある。（ｂ）ヒト化抗体のエフェクター領域はヒト由来であるため、ヒト免疫系
の他の部分と良好な相互作用をする。（ｃ）注射されたヒト化抗体は、天然のヒ
ト抗体と実質的に等しい半減期を有するため、他の生物種に由来する抗体に較べ
て、少量かつ少ない頻度で投与することが可能になる。本発明は、また、上記モ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。In a particularly preferred embodiment, the monoclonal antibody of the present invention is an antibody derived from an animal (eg, a mouse), a humanized antibody, or a chimeric antibody, or a fragment thereof. Antibodies similar to chimeric human or humanized antibodies have reduced potential antigenicity. However, their affinity for the target has not been reduced. For the production of chimeric and humanized antibodies, or for the production of antibodies similar to human antibodies,
Acad. Sci. USA 86 (19, for example, Queen et al., Proc. Natl. Acad.
89), 10029, and Verhoeyan et al., Science 239 (1988), 1534). Humanized immunoglobulins include various framework regions (termed acceptor immunoglobulins) substantially derived from human immunoglobulins, and complementarity determining regions (donors) substantially derived from non-human (eg, mouse) immunoglobulins. Called immunoglobulin). When the constant region is present, it is substantially derived from human immunoglobulins. When administered to a human patient, the humanized (and human) antibody
There are several advantages over antibodies from mice and other animal species, including: (A)
Since the human immune system does not recognize the framework or constant region of the humanized antibody as foreign, the antibody response to such injected antibodies can be entirely foreign mouse antibodies or partially foreign chimeric antibodies. Should be smaller than the antibody response to (B) Since the effector region of the humanized antibody is of human origin, it interacts well with other parts of the human immune system. (C) The injected humanized antibody has a half-life substantially equal to that of a natural human antibody, so that it can be administered in a smaller amount and less frequently than antibodies derived from other species. . The present invention also relates to a hybridoma producing the above monoclonal antibody.
【００２２】 また、本発明は、本発明のホモダイマーおよび／またはヘテロダイマーを含む
薬剤、および、それらを、免疫系の疾患、例えば、癌疾患などの細胞増殖の増加
に関連する疾患、感染または炎症過程を治療するために使用することに関する。
これらの癌疾患には、例えば、ヘアリーセル白血病、転移性腎細胞癌、エイズ関
連カポージ肉腫、リンパ腫、および肉腫が含まれる。本発明のダイマーの所定の
改変形態はまた、アンタゴニスト作用を有しうる。すなわち、本発明は、本発明
のホモダイマーまたはヘテロダイマーを含む薬剤、および、それらを、関節炎過
程、アレルギー反応、および、乾癬などの所定の形態の皮膚疾患など、インター
フェロン産生の増加、またはインターフェロンレセプターの発現増加に関連する
疾患を治療するために使用することに関する。The present invention also relates to an agent containing the homodimer and / or heterodimer of the present invention, and a method for treating the disease associated with an increase in cell proliferation such as a disease of the immune system, for example, a cancer disease, infection or inflammation. It relates to its use for treating a process.
These cancer diseases include, for example, hairy cell leukemia, metastatic renal cell carcinoma, AIDS-related Kaposi's sarcoma, lymphoma, and sarcoma. Certain modified forms of the dimers of the invention may also have antagonism. That is, the present invention relates to an agent containing the homodimer or heterodimer of the present invention, and an arthritis process, an allergic reaction, and a predetermined form of a skin disease such as psoriasis, an increase in interferon production, or an interferon receptor. For use in treating diseases associated with increased expression.
【００２３】 本発明の薬剤は、任意的に、適切な薬剤担体とともに利用することができる。
適切な担体、およびかかる薬剤の処方は当業者に知られている。適切な担体は、
例えば、リン酸によって緩衝された通常の塩溶液、水、例えば、油／水エマルジ
ョンなどのエマルジョン、湿潤剤、滅菌溶液などである。本発明の薬剤は、注射
用溶液、錠剤、軟膏、懸濁剤、エマルジョン、坐薬などの形で利用することがで
きる。また、持効性形態（マイクロカプセル、亜鉛塩、リポソームなど）で投与
することもできる。薬剤の投与法は、とりわけ、含まれている活性物質の形態が
どのようなものであるかにより、経口または非経口で投与することができる。非
経口投与する方法には、局所的、動脈内（例えば、直接腫瘍に対して）、筋肉内
、髄内、髄腔内（intrathekale）、脳室内、静脈内、腹腔内、経皮的、または経
粘膜（鼻、膣、直腸、舌下からの）投与が含まれる。適当な投薬量は主治医が決
定するが、例えば、患者の年齢、性別、および体重、病気の種類および段階、投
薬方法など、さまざまな要因に依存する。The agents of the present invention can optionally be utilized with a suitable drug carrier.
Suitable carriers, and the formulation of such agents are known to those skilled in the art. Suitable carriers are
For example, normal salt solutions buffered with phosphoric acid, water, emulsions such as oil / water emulsions, wetting agents, sterile solutions and the like. The medicament of the present invention can be used in the form of solutions for injection, tablets, ointments, suspensions, emulsions, suppositories and the like. It can also be administered in a depot form (microcapsules, zinc salts, liposomes, etc.). The manner of administration of the drug can be oral or parenteral, depending, inter alia, on the form of the active substance involved. Parenteral methods include topical, intraarterial (eg, for direct tumor), intramuscular, intramedullary, intrathecal, intraventricular, intravenous, intraperitoneal, transdermal, or Transmucosal (nasal, vaginal, rectal, sublingual) administration is included. The appropriate dosage will be determined by the attending physician, but will depend on various factors, including, for example, the age, sex, and weight of the patient, type and stage of the illness, and manner of administration.
【００２４】 本発明は、また、本発明のホモダイマーまたはヘテロダイマー、もしくは本発
明の抗体を含み、修飾されたインターフェロンα２レセプター、過剰または不十
分に発現したインターフェロンα２、もしくは過度に高い濃度か低い濃度のイン
ターフェロンα２に関連する疾患を診断するために使用することができる診断用
組成物にも関わる。これに関連して、本発明のホモダイマーまたはヘテロダイマ
ーは、普通一般的なアッセイ方式において（抗体と同じように）、診断検出を行
なうために利用することができる。この検出法は、例えば、（ａ）患者から細胞
試料を採集すること、（ｂ）集めた細胞試料を本発明のホモダイマーまたはヘテ
ロダイマーまたは抗体をプローブとして、標的に特異的に結合できる条件下で接
触させること、および（ｃ）標的への結合を検出することを含む。この検出法は
、当業者に既知の標準的な技術を用いて実施することができる。これに関連して
、本発明の化合物は、例えば、液相内で、または固形担体に結合し得、さまざま
な方法で標識することができる。適当なマーカーおよび標識方法は、当業者に知
られている。当業者は、インターフェロンα２またはそのレセプターが、本発明
の抗体またはホモダイマーまたはヘテロダイマーと特異的に接触することができ
るような細胞破砕法にも精通している。The present invention also includes a homodimer or heterodimer of the present invention, or an antibody of the present invention, wherein the modified interferon α2 receptor, over- or under-expressed interferon α2, or excessively high or low concentration. Also, the present invention relates to a diagnostic composition that can be used for diagnosing a disease associated with interferon α2. In this context, the homodimers or heterodimers of the invention can be used to perform diagnostic detection, usually in common assay formats (like antibodies). This detection method includes, for example, (a) collecting a cell sample from a patient, and (b) using the collected cell sample as a probe with the homodimer or heterodimer or antibody of the present invention under conditions capable of specifically binding to a target. Contacting and (c) detecting binding to the target. This detection method can be performed using standard techniques known to those skilled in the art. In this context, the compounds of the invention can be labeled in various ways, for example, in the liquid phase or attached to a solid carrier. Suitable markers and labeling methods are known to those skilled in the art. Those skilled in the art are also familiar with cell disruption methods such that interferon α2 or its receptor can specifically contact an antibody or homodimer or heterodimer of the invention.
【００２５】 レセプター数を測定するために、ダイマーにビオチン化された別のリンカーを
持たせることができる（Foxallら、Anal. Biochem. 231 (1995) 、266-373 ）。
ダイマーのリンカーを、アルカリホスファターゼ（Ishikawaら、J. Immunoassay
4 (1983) 、209-327 ）またはホースラディッシュ・パーオキシダーゼ（Imagaw
a ら、J. Appl. Biochem. 4 (1982)、41-75 ）で直接標識することも可能で、そ
れぞれ、さらに、ＥＬＩＳＡ法やスポットブロット法によって発色させることが
できる（Paffard ら、J. Immunol. Meth. 192 (1992)、133-136 ）。ダイマーの
結合は、調査対象の細胞（例えば、患者の血液から単離した後の免疫系細胞）を
、この構築物とインキュベーションした後、さらに、ストレプトアビジンフルオ
レセインイソチオシアネート結合体とともにインキュベートすることによって、
例えば、フローサイトメトリーの中で間接的に定量することができる。To determine the number of receptors, the dimer can have another biotinylated linker (Foxall et al., Anal. Biochem. 231 (1995), 266-373).
The linker of the dimer is linked to alkaline phosphatase (Ishikawa et al., J. Immunoassay).
4 (1983), 209-327) or horseradish peroxidase (Imagaw
a., et al., J. Appl. Biochem. 4 (1982), 41-75), and each can be further developed by ELISA or spot blotting (Paffard et al., J. Immunol. Meth. 192 (1992), 133-136). Dimer binding is achieved by incubating the cells under investigation (e.g., cells of the immune system after isolation from the patient's blood) with this construct, followed by further incubation with streptavidin fluorescein isothiocyanate conjugate.
For example, it can be quantified indirectly in flow cytometry.
【００２６】 最後に、本発明は、上記診断法を実施するための診断用キットで、本発明のダ
イマー、または本発明の抗体もしくはその断片を含むものに関する。診断用キッ
トの開発に応じて、ダイマー、または抗体もしくはその断片を固定することがで
きる。Finally, the present invention relates to a diagnostic kit for performing the above-mentioned diagnostic method, which comprises the dimer of the present invention or the antibody of the present invention or a fragment thereof. Depending on the development of the diagnostic kit, dimers, or antibodies or fragments thereof, can be immobilized.
【００２７】 以下、実施例によって本発明を説明する。Hereinafter, the present invention will be described with reference to examples.
【００２８】実施例１：ＷＤＥＴＬＬＫＦＹＴＥＬＹＱＱＬ（モノマーＩ）、ＳＬＦＳＣＬＫ ＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱ（モノマーＩＩ）、およびＱＧＶＧＶＴＥＴＰ ＬＭＫＥＤＳＩＬＡＶ（モノマーＩＩＩ）の固相合成 標準的な固相合成法にしたがってモノマーＩ〜ＩＩＩを作製した（Seitz ら、
Angew. Chem. 107 (1995) 、901 ）。この合成は、ＨＹＣＨＲＯＮアンカーにお
いて、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸を用いて行われ、Ｃ末端を経由して出発した
。グルタミン酸およびアスパラギン酸のカルボキシキル基は、第三ブチルエステ
ルの形で保護されていた。Ｔｙｒの側鎖の保護基は、テトラヒドロピラニル基、
第三ブチル基（Ｂｏｃ）、およびトリチル基を含んでいた。セリンおよびスレオ
ニンの側鎖保護基は、アセチル基、ベンゾイル基、およびベンジルオキシカルボ
ニル基（＝Ｃｂｚ）を含んでいた。アルギニンの側鎖保護基は、Ｃｂｚ、メシチ
レン−２−スルホニル基（＝Ｍｔｓ）、または第三ブチルオキシカルボニル基（
＝Ｂｏｃ）を含んでいた。リジンの側鎖は、トシル基（＝Ｔｏｓ）またはＢｏｃ
で保護されていた。α−アミノ保護基を除去して、関連する洗浄工程を終えた後
、次のアミノ酸のカルボキシル基の活性化を行なってから、後者を前のアミノ酸
に連結させた。この順序で完全なモノマーを合成した。パラジウム（０）触媒に
よるアリル基転移によって、側鎖の保護基を維持しつつ、調製したモノマーをカ
ラムから取り出した。その後、Ｆｍｏｃ基をモルホリンによって除去し、残りの
保護基をＴＦＡで処理して切断した。 Example 1 Solid Phase Synthesis of WDETLKFYTELYQQL (Monomer I), SLFSCLK DRHDDFGFPQEEFGGNQ (Monomer II), and QGVGVTETP LMKEDSILAV (Monomer III) Monomers I to III were prepared according to a standard solid phase synthesis method (Seitz et al. ,
Angew. Chem. 107 (1995), 901). The synthesis was carried out on a HYCHRON anchor using Fmoc protected amino acids and started via the C-terminus. The carboxyl groups of glutamic acid and aspartic acid were protected in the form of tert-butyl ester. The protecting group for the side chain of Tyr is a tetrahydropyranyl group,
It contained a tertiary butyl group (Boc) and a trityl group. Serine and threonine side chain protecting groups included acetyl, benzoyl, and benzyloxycarbonyl groups (= Cbz). The side chain protecting group for arginine is Cbz, mesitylene-2-sulfonyl group (= Mts), or tert-butyloxycarbonyl group (
= Boc). The side chain of lysine is a tosyl group (= Tos) or Boc
Was protected. After removal of the α-amino protecting group and the completion of the relevant washing step, the activation of the carboxyl group of the next amino acid was carried out before linking the latter to the previous amino acid. Complete monomers were synthesized in this order. The prepared monomer was removed from the column by palladium (0) -catalyzed allyl transfer while maintaining the side chain protecting group. Thereafter, the Fmoc group was removed with morpholine and the remaining protecting groups were treated with TFA and cleaved.
【００２９】実施例２：モノマーＩのポリエチレングリコールによる二量体化 ２５ｍｇの活性化二機能性ポリエチレングリコール（ＰＥＧスクシンイミジル
プロピオン酸、分子量約３，４００；ドイツのトーフキルヒェン（Taufkirchen
、Germany ）にあるシグマ社（Sigma ）製）を４ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ値７．５に
溶解し、それから、３倍モル濃度過剰のモノマーを１ｍｌの０．１％トリフルオ
ロ酢酸に溶解して加え、モノマーＩを二量体化した。氷上で３時間インキュベー
トした後、凍結乾燥したモノマーを再び加え、１モルのＰＥＧに対して３．５ｍ
ｏｌのモノマーという最終比率にした。混合液を氷上でさらに１７時間インキュ
ベートした。１Ｍのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ値７．５を加えて（最終濃度：５０ｍ
Ｍトリス）（インキュベーション：氷上１時間）ＰＥＧを不活性化させた。この
混合液に分析用ＨＰＬＣと調製用ＨＰＬＣを行なった（実施例８を参照）。 Example 2 Dimerization of Monomer I with Polyethylene Glycol 25 mg of activated bifunctional polyethylene glycol (PEG succinimidylpropionic acid, molecular weight approx. 3,400; Taufkirchen, Germany)
Sigma, Germany) was dissolved in 4 ml of PBS, pH 7.5, and a 3-fold molar excess of the monomer was added by dissolving in 1 ml of 0.1% trifluoroacetic acid. , Monomer I was dimerized. After incubation on ice for 3 hours, the lyophilized monomer was added again and 3.5 m / mol PEG was added.
ol monomer. The mixture was incubated on ice for a further 17 hours. Add 1 M Tris / HCl, pH 7.5 (final concentration: 50 m
M Tris) (Incubation: 1 hour on ice) PEG was inactivated. This mixture was subjected to analytical HPLC and preparative HPLC (see Example 8).
【００３０】実施例３：モノマーＩＩのポリエチレングリコールによる二量体化 ２５ｍｇの活性化二機能性ポリエチレングリコール（ＰＥＧスクシンイミジル
プロピオン酸、分子量約３，４００；トーフキルヒェン（Taufkirchen ）にある
シグマ社（Sigma ）製）を４ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ値７．５に溶解し、それから、
３倍モル濃度過剰のモノマーを１ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸に溶解して加
え、モノマーＩＩを二量体化した。氷上で３時間インキュベートした後、凍結乾
燥したモノマーを再び加え、１モルのＰＥＧに対して３．５ｍｏｌのモノマーと
いう最終比率にした。混合液を氷上でさらに１７時間インキュベートした。１Ｍ
のトリス／ＨＣｌ、ｐＨ値７．５を加えて（最終濃度：５０ｍＭトリス）（イン
キュベーション：氷上１時間）ＰＥＧを不活性化させた。この混合液に分析用Ｈ
ＰＬＣと調製用ＨＰＬＣを行なった（実施例８を参照）。 Example 3 Dimerization of Monomer II with Polyethylene Glycol 25 mg of activated bifunctional polyethylene glycol (PEG succinimidyl propionic acid, molecular weight approx. 3,400; Sigma, Taufkirchen (Taufkirchen) Sigma) is dissolved in 4 ml of PBS, pH 7.5, and then
A three-fold molar excess of the monomer was added dissolved in 1 ml of 0.1% trifluoroacetic acid to dimerize monomer II. After incubation on ice for 3 hours, the lyophilized monomer was added again to a final ratio of 3.5 mol monomer to 1 mol PEG. The mixture was incubated on ice for a further 17 hours. 1M
Of Tris / HCl, pH 7.5 (final concentration: 50 mM Tris) (incubation: 1 hour on ice) to inactivate the PEG. The mixture for analysis is added to H
PLC and preparative HPLC were performed (see Example 8).
【００３１】実施例４：モノマーＩＩＩのポリエチレングリコールによる二量体化 ２５ｍｇの活性化二機能性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−スクシンイミジ
ルプロピオン酸、分子量約３，４００；トーフキルヒェン（Taufkirchen ）にあ
るシグマ社（Sigma ）製）を４ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ値７．５に溶解し、その後、
３倍モル濃度過剰のモノマーを１ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸に溶解して加
え、モノマーＩＩＩを二量体化した。氷上で３時間インキュベートした後、凍結
乾燥したモノマーを再び加え、１モルのＰＥＧに対して３．５ｍｏｌのモノマー
という最終比率にした。混合液を氷上でさらに１７時間インキュベートした。１
Ｍのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ値７．５を加えて（最終濃度：５０ｍＭトリス）（イ
ンキュベーション：氷上１時間）ＰＥＧを不活性化させた。この混合液に分析用
ＨＰＬＣと調製用ＨＰＬＣとを行なった（実施例８を参照）。 Example 4 Dimerization of Monomer III with Polyethylene Glycol 25 mg of activated bifunctional polyethylene glycol (PEG-succinimidylpropionic acid, molecular weight approx. 3,400; Sigma, Taufkirchen) (Manufactured by Sigma) in 4 ml of PBS, pH 7.5, and then
A three-fold molar excess of the monomer was added dissolved in 1 ml of 0.1% trifluoroacetic acid to dimerize monomer III. After incubation on ice for 3 hours, the lyophilized monomer was added again to a final ratio of 3.5 mol monomer to 1 mol PEG. The mixture was incubated on ice for a further 17 hours. 1
The PEG was inactivated by the addition of M Tris / HCl, pH 7.5 (final concentration: 50 mM Tris) (incubation: 1 hour on ice). This mixture was subjected to analytical HPLC and preparative HPLC (see Example 8).
【００３２】 これらのモノマーは、１：１の比率で使用し、逆相ＨＰＬＣによって分離する
。These monomers are used in a 1: 1 ratio and are separated by reverse phase HPLC.
【００３３】実施例５：モノマーＩＩとＩのポリエチレングリコールによる二量体化 ２５ｍｇの活性化二機能性ポリエチレングリコール（ＰＥＧスクシンイミジル
プロピオン酸、分子量約３，４００；トーフキルヒェン（Taufkirchen ）にある
シグマ社（Sigma ）製）を４ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ値７．５に溶解し、それから、
３倍モル濃度過剰のモノマーを１ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸に溶解して加
え、これらモノマーを二量体化した。氷上で３時間インキュベートした後、凍結
乾燥したモノマーを再び加え、１モルのＰＥＧに対して３．５ｍｏｌのモノマー
という最終比率にした。混合液を氷上でさらに１７時間インキュベートした。１
Ｍのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ値７．５を加えて（最終濃度：５０ｍＭトリス）（イ
ンキュベーション：氷上１時間）ＰＥＧを不活性化させた。この混合液に分析用
ＨＰＬＣと調製用ＨＰＬＣを行なった（実施例８を参照）。 Example 5 Dimerization of Monomers II and I with Polyethylene Glycol 25 mg of activated bifunctional polyethylene glycol (PEG succinimidylpropionic acid, molecular weight approx. 3,400; Sigma at Taufkirchen) (Sigma) in 4 ml of PBS, pH 7.5, and then
A three-fold molar excess of the monomers was added dissolved in 1 ml of 0.1% trifluoroacetic acid to dimerize these monomers. After incubation on ice for 3 hours, the lyophilized monomer was added again to a final ratio of 3.5 mol monomer to 1 mol PEG. The mixture was incubated on ice for a further 17 hours. 1
The PEG was inactivated by the addition of M Tris / HCl, pH 7.5 (final concentration: 50 mM Tris) (incubation: 1 hour on ice). This mixture was subjected to analytical HPLC and preparative HPLC (see Example 8).
【００３４】 これらのモノマーは、１：１の比率で使用し、逆相ＨＰＬＣによって分離する
。These monomers are used in a 1: 1 ratio and are separated by reverse phase HPLC.
【００３５】実施例６：モノマーＩＩＩとＩのポリエチレングリコールによる二量体化 ２５ｍｇの活性化二機能性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−スクシンイミジ
ルプロピオン酸、分子量約３，４００；トーフキルヒェン（Taufkirchen ）にあ
るシグマ社（Sigma ）製）を４ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ値７．５に溶解し、それから
、３倍モル濃度過剰のモノマーを１ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸に溶解して
加え、モノマーを二量体化した。氷上で３時間インキュベートした後、凍結乾燥
したモノマーを再び加え、１モルのＰＥＧに対して３．５ｍｏｌのモノマーとい
う最終比率にした。混合液を氷上でさらに１７時間インキュベートした。１Ｍの
トリス／ＨＣｌ、ｐＨ値７．５を加えて（最終濃度：５０ｍＭトリス）（インキ
ュベーション：氷上１時間）ＰＥＧを不活性化させた。この混合液に分析用ＨＰ
ＬＣと調製用ＨＰＬＣを行なった（実施例８を参照）。 Example 6: Dimerization of monomers III and I with polyethylene glycol 25 mg of activated bifunctional polyethylene glycol (PEG-succinimidylpropionic acid, molecular weight approx. 3,400; in Taufkirchen) Sigma) was dissolved in 4 ml of PBS, pH 7.5, then a 3-fold molar excess of the monomer was dissolved in 1 ml of 0.1% trifluoroacetic acid and the monomer was diluted with Embodied. After incubation on ice for 3 hours, the lyophilized monomer was added again to a final ratio of 3.5 mol monomer to 1 mol PEG. The mixture was incubated on ice for a further 17 hours. PEG was inactivated by adding 1 M Tris / HCl, pH 7.5 (final concentration: 50 mM Tris) (incubation: 1 hour on ice). This mixture is added to the HP for analysis.
LC and preparative HPLC were performed (see Example 8).
【００３６】 これらのモノマーは、１：１の比率で使用し、逆相ＨＰＬＣによって分離する
。These monomers are used in a 1: 1 ratio and are separated by reverse phase HPLC.
【００３７】実施例７：モノマーＩＩＩとＩＩのポリエチレングリコールによる二量体化 ２５ｍｇの活性化二機能性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−スクシンイミジ
ルプロピオン酸、分子量約３，４００；トーフキルヒェン（Taufkirchen ）にあ
るシグマ社（Sigma ）製）を４ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ値７．５に溶解し、それから
、３倍モル濃度過剰のモノマーを１ｍｌの０．１％トリフルオロ酢酸に溶解して
加え、これらモノマーを二量体化した。氷上で３時間インキュベートした後、凍
結乾燥したモノマーを再び加え、１モルのＰＥＧに対して３．５ｍｏｌのモノマ
ーという最終比率にした。混合液を氷上でさらに１７時間インキュベートした。
１Ｍのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ値７．５を加えて（最終濃度：５０ｍＭトリス）
（インキュベーション：氷上１時間）ＰＥＧを不活性化させた。この混合液に分
析用ＨＰＬＣと調製用ＨＰＬＣを行なった（実施例８を参照）。 Example 7: Dimerization of monomers III and II with polyethylene glycol 25 mg of activated bifunctional polyethylene glycol (PEG-succinimidylpropionic acid, molecular weight approx. 3,400; in Taufkirchen) Sigma) were dissolved in 4 ml of PBS, pH 7.5, then a 3-fold molar excess of the monomer was added by dissolving in 1 ml of 0.1% trifluoroacetic acid, and these monomers were added. It was made into a monomer. After incubation on ice for 3 hours, the lyophilized monomer was added again to a final ratio of 3.5 mol monomer to 1 mol PEG. The mixture was incubated on ice for a further 17 hours.
Add 1 M Tris / HCl, pH 7.5 (final concentration: 50 mM Tris)
(Incubation: 1 hour on ice) PEG was inactivated. This mixture was subjected to analytical HPLC and preparative HPLC (see Example 8).
【００３８】 これらのモノマーは、１：１の比率で使用し、逆相ＨＰＬＣによって分離する
。The monomers are used in a 1: 1 ratio and separated by reverse phase HPLC.
【００３９】実施例８：分析用および調製用ＨＰＬＣ 上記実施例で説明したダイマー形成を分析用逆相ＨＰＬＣによってチェックし
た。Ｖｙｄａｃ−ｃ１８タンパク質ペプチドカラム（０．４６×２５ｃｍ）（米
国、セパレーショングループ（Separation Group、U. S. A.））、バイオラド
（BioRad）ＨＰＣＬ装置、およびパーキン−エルマー社（Perkin-Elmer）製の二
波長検出装置によって分析を行なった。蒸留水中０．１％ＴＦＡを用いてカラム
を平衡し、１０分後に試料（原則として６ｍｌ）を注入し、０．１％ＴＦＡを含
むアセトニトリルの４５分の直線勾配（０〜１００）にした。流速を１ｍｌ／分
という速度に連続的に保った。これらの条件下で、架橋剤が流下液の中に現れた
。反応生成物は、３７分後に溶出されたが、未結合のモノマーは既に３２分後に
溶出されていたので、これによって、ダイマーから明確に分離することができた
。このダイマーを、同じＨＰＬＣ装置によって、調製用逆相ＨＰＬＣカラム （
２．２×２５ｃｍ）上でさらに精製した。８０：２０の蒸留水：アセトニトリル
（どちらも０．１％ＴＦＡを含む）を用い、８ｍｌ／分の一定流速でカラムを平
衡させた。２０分後に試料（６ｍｌ）を注入し、１００％アセトニトリル／０．
１％ＴＦＡの６０分の直線勾配にした。主要ピークを回収して、凍結乾燥させた
。モノマーＩＩには、よりなだらかな勾配（６０％を超える、２０〜８０％アセ
トニトリル／０．１％ＴＦＡ）を用いて、より良好な分離を得た。単離されたダ
イマーと本来のモノマーを結合実験（実施例１０参照）、および増殖テスト（実
施例１１参照）に用いた。 Example 8: Analytical and Preparative HPLC Dimer formation as described in the above example was checked by analytical reverse phase HPLC. Vydac-c18 protein peptide column (0.46 × 25 cm) (Separation Group, USA), Biorad
Analysis was performed on a (BioRad) HPCL instrument and a dual wavelength detector from Perkin-Elmer. The column was equilibrated with 0.1% TFA in distilled water, and after 10 minutes the sample (in principle, 6 ml) was injected, giving a linear gradient (0-100) of acetonitrile containing 0.1% TFA for 45 minutes. The flow rate was maintained continuously at a rate of 1 ml / min. Under these conditions, the crosslinker appeared in the effluent. The reaction product eluted after 37 minutes, but unbound monomer had already eluted after 32 minutes, which allowed it to be clearly separated from the dimer. This dimer was converted to a preparative reverse phase HPLC column (
(2.2 × 25 cm). The column was equilibrated at a constant flow rate of 8 ml / min using 80:20 distilled water: acetonitrile (both containing 0.1% TFA). After 20 minutes, a sample (6 ml) was injected, and 100% acetonitrile / 0.1% was added.
A 60 minute linear gradient of 1% TFA was used. The major peak was collected and lyophilized. For monomer II, a better separation was obtained using a gentler gradient (greater than 60%, 20-80% acetonitrile / 0.1% TFA). The isolated dimer and the native monomer were used in binding experiments (see Example 10) and in proliferation tests (see Example 11).
【００４０】実施例９：ダイマーの放射活性標識 以下に記載したように、ダイマーをヨード化した。２０μｌのクロラミンＴ
（０．５ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌのＮａ125 Ｉ（２ｍＣｉ、ドイツのブラウンシ
ュバイク（Braunschweig、Germany ）にあるアマーシャム・ブハラー（Amersham
Buchler））に加え、２分後、この混合液を５０μｌのダイマー（ＰＢＳ中５μ
ｇ）に加えて、１５秒間インキュベートした。反応を完了させるために、３０μ
ｌのメタ重亜硫酸ナトリウム（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ）と、３０秒後に５０μｌ
のＫＩ（ＰＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌ）を加えた。ゼラチン（５０μｌ、蒸留水中１
ｍｇ／ｍｌ）を担体として加え、該溶液をＰＢＳ中０．２５％ゼラチン／０．０
２％アジ化ナトリウムによって平衡化したＢｉｏＳｉｌ ＳＥＣ１２５−５カラ
ム（BioRad、１０ｍｌ）上に直ちに注入した。放射性生成物を含む画分を合わせ
て、実施例８で説明したようにして、逆相ＨＰＬＣカラム上でさらに精製・単離
した。精製したダイマーは、５０〜１００μＣｉ／μｇの特異的放射活性を示し
、トリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一のバンドを回収し、９５〜１００％の放射
活性をクロロホルム／メタノール法で沈殿させることができた（Wesselら、Anal
. Biochem. 138 (1984) 、141-143 ）。これらの結果は、放射性標識生成物が純
粋なダイマーからなり、放射活性が専らダイマーだけに帰属しうることを示して
いる。 Example 9: Radioactive labeling of the dimer The dimer was iodinated as described below. 20 μl of chloramine T
(0.5 mg / ml) with 20 μl of Na 125 I (2 mCi, Amersham, Braunschweig, Germany).
Buchler)) and after 2 minutes, the mixture was mixed with 50 μl of dimer (5 μl in PBS).
In addition to g), incubated for 15 seconds. 30 μl to complete the reaction
l of sodium metabisulfite (1 mg / ml in PBS) and 50 μl after 30 seconds
Of KI (10 mg / ml in PBS) was added. Gelatin (50 μl, 1 in distilled water)
mg / ml) as a carrier and the solution was added to 0.25% gelatin / 0.0
Immediate injection onto a BioSil SEC125-5 column (BioRad, 10 ml) equilibrated with 2% sodium azide. The fractions containing the radioactive product were combined and further purified and isolated on a reverse phase HPLC column as described in Example 8. The purified dimer shows a specific radioactivity of 50-100 μCi / μg, a single band can be collected by Tricine-SDS-PAGE, and 95-100% radioactivity can be precipitated by the chloroform / methanol method. (Wessel et al., Anal
Biochem. 138 (1984), 141-143). These results indicate that the radiolabeled product consists of a pure dimer and that the radioactivity can be attributed exclusively to the dimer.
【００４１】実施例１０：細胞結合試験 これらの実験は、本発明のダイマーがインターフェロンα２レセプターを発現
する細胞に特異的に結合するか否かを明らかにするものである。本実施例では、
モノマーＩＩからなる実施例３のホモダイマーを用いた。実験の一日前に、対数
増殖期にあるＤａｕｄｉ細胞（１×１０5 細胞／ｍｌ）２００μｌを、２４ウェ
ルプレートの中に入れた１５％ＦＣＳ入りのＲＰＭＩ１６４０培地の中に接種し
た。細胞の平均分裂速度が２１時間であるため、対数増殖している細胞を、約４
×１０4 の細胞密度を用いて実験を行なった。２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ値７
．３でさらに緩衝した培養培地２００μｌの中で、二重バッチで結合実験を行な
った。飽和濃度のヨード化ダイマーを、４℃で４時間インキュベートした。イン
キュベートした後、１．５ｍｌのＰＢＳ／１０ｍＭ ＭＧＣｌ2 、１ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ2 、０．２５％ゼラチンを用いて、細胞を４℃で２回洗浄した。この後、同
一のバッファーであるが、ゼラチンを含まないバッファーで洗浄工程を行なった
。洗浄した細胞を、６０℃で３０分間、０．５ｍｌの１Ｎ ＮａＯＨの中で可溶
化し、シンチレーションカウンターで、可溶化物を計測した。１００倍濃度のイ
ンターフェロンα２存在下で、標識ホモダイマーとインターフェロンα２を同時
に細胞に加えて、非特異的結合の程度を測定した。結果を表１に示す。 Example 10 Cell Binding Tests These experiments demonstrate whether the dimers of the present invention specifically bind to cells expressing the interferon α2 receptor. In this embodiment,
The homodimer of Example 3 consisting of monomer II was used. One day prior to the experiment, 200 μl of logarithmic Daudi cells (1 × 10 5 cells / ml) were inoculated into RPMI 1640 medium with 15% FCS in a 24-well plate. Due to the average cell division rate of 21 hours, exponentially growing cells are reduced to about 4 hours.
Experiments were performed using a cell density of × 10 4 . 25 mM HEPES, pH 7
. Binding experiments were performed in duplicate batches in 200 μl of culture medium further buffered in 3. Saturated concentrations of the iodinated dimer were incubated at 4 ° C. for 4 hours. After incubation, 1.5 ml of PBS / 10 mM MGCl 2 , 1 mM Ca
Cells were washed twice at 4 ° C. using Cl 2 , 0.25% gelatin. This was followed by a washing step with the same buffer but without gelatin. The washed cells were solubilized in 0.5 ml of 1N NaOH at 60 ° C. for 30 minutes, and the lysate was counted with a scintillation counter. In the presence of 100-fold concentration of interferon α2, a labeled homodimer and interferon α2 were simultaneously added to cells, and the degree of non-specific binding was measured. Table 1 shows the results.
【００４２】[0042]
【表１】 [Table 1]
【００４３】実施例１１：増殖実験 これらの実験は、本来のインターフェロンα２と同じように、本発明のダイマ
ーが抗増殖作用をもつか否かを明らかにするはずである。これらの実験も、Ｄａ
ｕｄｉ細胞を用いて行なわれ、モノマーＩＩからなる実施例３のホモダイマーに
ついて一例として、ここに記載する。微量滴定用プレート中２００μｌの１５％
ＦＣＳ入りＲＰＭＩ１６４０の中に１×１０4 個の細胞を接種した。２４時間後
に、ホモダイマーを１０―4 から１０-7まで１０倍希釈して加え、７２時間後に
コールターカウンター（Coulter-Counter ）で細胞数を計測した。測定値を、イ
ンターフェロンα２（１０-7Ｍ）のＩＤ５０を１００％としたときの活性割合に
して表２に示す。 Example 11: Proliferation experiments These experiments should demonstrate whether the dimer of the invention has an antiproliferative effect, similar to the native interferon α2. These experiments are also based on Da
The homodimer of Example 3 carried out using udi cells and consisting of monomer II is described here by way of example. 200 μl of 15% in microtiter plate
1 × 10 4 cells were inoculated into RPMI1640 with FCS. After 24 hours, it added 10-fold dilution from 10-4 to 10-7 homodimer, and the cells were counted with a Coulter Counter (Coulter-Counter) after 72 hours. The measured values are shown in Table 2 as the activity ratio when the ID50 of interferon α2 (10 −7 M) is 100%.
【００４４】[0044]
【表２】 [Table 2]
【００４５】実施例１２：本発明の抗体の製造と検出 実施例５で製造されたヘテロダイマーに対して１８％ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動を行なった。４Ｍの酢酸ナトリウムを用いてゲルを染色した後、
約７ｋＢのバンドをゲルから切り出して、リン酸緩衝した通常の塩溶液の中でイ
ンキュベートした。このダイマーを電気溶出装置（Electroelutors ）（BioRad
）によって、ゲルから溶出し、一晩ｋＢ透析してから凍結乾燥する。濃度５ｍｇ
／ｍｌのＰＢＳの中にペプチドを取り出し、全部で２ｍｌのＰＢＳにおいて、担
体タンパク質であるアルブミンと１ｍｏｌペプチド／０．０２ｍｏｌ担体という
比率になるよう混合した。混合液を撹拌しながら、２ｍｌのグルタルジアルデヒ
ド（ＰＢＳ中０．２％）を一滴ずつ添加し、室温で１時間インキュベートする。
そして、混合物を２０ｋＢ透析ホースに入れて、ＰＢＳに対して１２時間のバッ
ファーサイクルで４８時間透析してから凍結乾燥した。１００μｇ（ウサギとニ
ワトリ）または３０μｇ（マウス）のダイマーとＢＳＡの複合体、ＢＳＡ−ＢＳ
Ａ複合体、およびダイマー複合体からなる混合液で動物を免疫する。 Example 12 Production and Detection of Antibody of the Present Invention The heterodimer produced in Example 5 was subjected to 18% SDS polyacrylamide gel electrophoresis. After staining the gel with 4M sodium acetate,
A band of approximately 7 kB was excised from the gel and incubated in phosphate buffered normal salt solution. This dimer is electroeluted (Electroelutors) (BioRad
), Elute from the gel, dialyze overnight with kB and freeze-dry. Concentration 5mg
The peptide was taken out in 1 / ml PBS, and mixed in a total of 2 ml of PBS so as to have a ratio of albumin as a carrier protein to 1 mol peptide / 0.02 mol carrier. While the mixture is being stirred, 2 ml of glutardialdehyde (0.2% in PBS) is added dropwise and incubated for 1 hour at room temperature.
The mixture was then placed in a 20 kB dialysis hose, dialyzed against PBS for 12 hours with a 12 hour buffer cycle, and lyophilized. 100 μg (rabbit and chicken) or 30 μg (mouse) of dimer and BSA complex, BSA-BS
The animal is immunized with a mixture consisting of the A complex and the dimer complex.
【００４６】 ウサギにおけるポリクローナル抗体のための免疫プロトコル ０．７ｍｌのＰＢＳ中１００μｇのゲル精製したヘテロダイマー、および０．７
ｍｌの完全または不完全なフロイントアジュバントを各免疫毎に用いた： ０日目：初回免疫（フロイント完全アジュバント） １４日目：第２回目免疫（フロイント不完全アジュバント；ｉｃＦＡ） ２８日目：第３回目免疫（ｉｃＦＡ） ５６日目：第４回目免疫（ｉｃＦＡ） ８０日目：失血死Immunization Protocol for Polyclonal Antibodies in Rabbits 100 μg gel purified heterodimer in 0.7 ml PBS, and 0.7
ml of complete or incomplete Freund's adjuvant was used for each immunization: Day 0: First immunization (Complete Freund's adjuvant) Day 14: Second immunization (Incomplete Freund's adjuvant; icFA) Day 28: Third Second immunization (icFA) Day 56: Fourth immunization (icFA) Day 80: Blood loss
【００４７】 免疫ブロットでウサギ血清を試験した。この目的のため、本発明の実施例４の
ヘテロダイマーについて、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ない、ニ
トロセルロース膜に移した（Khyse-Andersen, J.、J. Biochem. Biophys. Meth.
10 (1984)、203-209 ）。Ｂｏｃｋ，Ｃ．−Ｔ．ら、Virus Genes 8 、(1994)、
215-229 に記載されているとおりにウエスタンブロット解析を行なった。この目
的のため、３７℃で１時間、一次抗体とともにニトロセルロース膜をインキュベ
ートした。この抗体はウサギ血清であった（ＰＢＳ中１：１００００）。ＰＢＳ
を用いて数回洗浄工程を繰り返した後、二次抗体とともにニトロセルロース膜を
インキュベートした。この抗体は、ＰＢＳ中でアルカリホスファターゼを結合し
たヤギの抗ウサギＩｇＧモノクローナル抗体（ダイアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ社）
）（１：５０００）であった。３７℃で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳ
で何度か洗浄工程を繰り返し、その後、バンドが見えるまで室温で展開液（３６
μＭの５’−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸、４００μＭのニトロ
ブルーテトラゾリウム、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ）を用いてアルカリホスファターゼ検出反応
を行なった。Rabbit sera was tested on immunoblots. For this purpose, the heterodimer of Example 4 of the present invention was subjected to SDS polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a nitrocellulose membrane (Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth.
10 (1984), 203-209). Bock, C.I. -T. Et al., Virus Genes 8, (1994),
Western blot analysis was performed as described in 215-229. For this purpose, the nitrocellulose membrane was incubated with the primary antibody for 1 hour at 37 ° C. This antibody was rabbit serum (1: 10000 in PBS). PBS
After repeating the washing step several times using, the nitrocellulose membrane was incubated with the secondary antibody. This antibody was a goat anti-rabbit IgG monoclonal antibody conjugated to alkaline phosphatase in PBS (Dianova).
) (1: 5000). After incubating at 37 ° C for 30 minutes, PBS
The washing step was repeated several times at room temperature, and then the developing solution (36
μM 5′-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, 400 μM nitroblue tetrazolium, 100 mM Tris-HCl, pH 9.5, 100 m
M NaCl, 5 mM MgCl 2 ) to perform an alkaline phosphatase detection reaction.
【００４８】 本発明のポリクローナル抗体が調製できることが明らかになった。It has been found that the polyclonal antibody of the present invention can be prepared.
【００４９】 ニワトリにおけるポリクローナル抗体のための免疫プロトコル ０．８ｍｌのＰＢＳ中１００μｇのゲル精製したヘテロダイマー、および０．８
ｍｌの完全または不完全なフロイントアジュバントを各免疫毎に用いた。Immunization Protocol for Polyclonal Antibodies in Chickens 100 μg of gel-purified heterodimer in 0.8 ml of PBS, and 0.8
ml of complete or incomplete Freund's adjuvant was used for each immunization.
【００５０】 ０日目：初回免疫（フロイント完全アジュバント） ２８日目：第２回目免疫（フロイント不完全アジュバント；ｉｃＦＡ） ５０日目：第３回目免疫（ｉｃＦＡ）Day 0: First immunization (Complete Freund's adjuvant) Day 28: Second immunization (Incomplete Freund's adjuvant; icFA) Day 50: Third immunization (icFA)
【００５１】 抗体は、卵黄から抽出し、ウエスタンブロットで試験した。本発明のポリクロ
ーナル抗体が検出された。Antibodies were extracted from egg yolk and tested on Western blots. The polyclonal antibody of the present invention was detected.
【００５２】 マウスにおけるモノクローナル抗体のための免疫プロトコル ０．２５ｍｌのＰＢＳ中３０μｇのゲル精製した融合タンパク質、および０．２
５ｍｌの完全または不完全なフロイントのアジュバントを各免疫毎に用いた。４
回目に免疫するときに、融合タンパク質を０．５ｍｌに（アジュバントなしで）
溶解した。Immunization Protocol for Monoclonal Antibodies in Mice 30 μg of gel purified fusion protein in 0.25 ml of PBS, and 0.2
5 ml of complete or incomplete Freund's adjuvant was used for each immunization. 4
At the second immunization, make the fusion protein 0.5 ml (without adjuvant)
Dissolved.
【００５３】 ０日目：初回免疫（フロイント完全アジュバント） ２８日目：第２回目免疫（フロイント不完全アジュバント；ｉｃＦＡ） ５６日目：第３回目免疫（ｉｃＦＡ） ８４日目：第４回目免疫（ＰＢＳ） ８７日目：融合Day 0: First immunization (complete Freund's adjuvant) Day 28: Second immunization (Incomplete Freund's adjuvant; icFA) Day 56: Third immunization (icFA) Day 84: Fourth immunization (icFA) PBS) Day 87: Fusion
【００５４】 ハイブリドーマの上清をウエスタンブロットで試験した。本発明のモノクロー
ナル抗体を同定した。The hybridoma supernatant was tested on a Western blot. The monoclonal antibodies of the present invention have been identified.
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書[Procedural Amendment] Submission of translation of Article 34 Amendment
【提出日】平成１３年６月１８日（２００１．６．１８）[Submission date] June 18, 2001 (2001.6.18)
【手続補正１】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】特許請求の範囲[Correction target item name] Claims
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正の内容】[Contents of correction]
【特許請求の範囲】[Claims]
【手続補正２】[Procedure amendment 2]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】００４２[Correction target item name] 0042
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正の内容】[Contents of correction]
【００４２】[0042]
【表１】 [Table 1]
【手続補正３】[Procedure amendment 3]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】００４４[Correction target item name] 0044
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正の内容】[Contents of correction]
【００４４】[0044]
【表２】 [Table 2]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/02 Ａ６１Ｐ 35/04 35/04 37/02 37/02 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 1/06 Ｃ０７Ｋ 1/06 16/24 16/24 17/08 17/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/531 Ａ 33/531 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08 BA18 BA23 CA53 DA50 NA14 ZB072 ZB112 ZB262 ZB272 ZB322 ZC022 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA17 BA62 DA16 EA28 FA33 FA58 FA81 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 35/02 A61P 35/04 35/04 37/02 37/02 43/00 111 43/00 111 C07K 1 / 06 C07K 1/06 16/24 16/24 17/08 17/08 G01N 33/53 D G01N 33/53 33/531 A 33/531 A61K 37/02 F term (reference) 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA08 BA18 BA23 CA53 DA50 NA14 ZB072 ZB112 ZB262 ZB272 ZB322 ZC022 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA17 BA62 DA16 EA28 FA33 FA58 FA81
Claims (16)
Ｉ）、ＳＬＦＳＣＬＫＤＲＨＤＦＧＦＰＱＥＥＦＧＮＱ（モノマーＩＩ）または
ＱＧＶＧＶＴＥＴＰＬＭＫＥＤＳＩＬＡＶ（モノマーＩＩＩ）またはそれらのバ
リアントを有してなり、インターフェロンα２レセプターに結合する、ペプチド
モノマーの合成のホモダイマーまたはヘテロダイマー。1. A homodimer or heterodimer for the synthesis of a peptide monomer comprising the amino acid sequence WDETLKFYTELYQL (monomer I), SLFSCLKDRHDDFGFPQEEFGGNQ (monomer II) or QGVGVTETPLMMKEDSILAV (monomer III) or a variant thereof and binding to the interferon α2 receptor. .
なるか、または一方のモノマーのＮ末端が他方のモノマーのＣ末端と結合してな
る、請求項１記載のホモダイマーまたはヘテロダイマー。2. The homodimer according to claim 1, wherein the monomers are linked via their C-terminus or N-terminus, or the N-terminus of one monomer is linked with the C-terminus of the other monomer. Heterodimer.
と結合してなるか、またはモノマーＩのＮ末端がモノマーＩＩのＮ末端もしくは
Ｃ末端と結合してなることを特徴とする、請求項２記載のヘテロダイマー。3. The method according to claim 1, wherein the C-terminal of the monomer I is bonded to the N-terminal or the C-terminal of the monomer II, or the N-terminal of the monomer I is bonded to the N-terminal or the C-terminal of the monomer II. The heterodimer according to claim 2,
ンゾジアゼピン、オキサゾロン、アザラクトン、アミンイミド、ジケトピペラジ
ン、または単糖を介して互いに共有結合してなることを特徴とする、請求項１〜
３いずれかに記載のホモダイマーまたはヘテロダイマー。4. The method according to claim 1, wherein the monomers are covalently bonded to one another via a polyethylene glycol, a peptide, an activated benzodiazepine, an oxazolone, an azalactone, an amine imide, a diketopiperazine, or a monosaccharide.
3. The homodimer or heterodimer according to any one of 3.
たは置換および／または修飾アミノ酸を有してなり、ホモダイマーまたはヘテロ
ダイマーが本来の形態と比較して同様のまたはより良好な様式で（ａ）インター
フェロンα２レセプターに結合し、および／または（ｂ）細胞シグナルを誘発し
うることを特徴とする、請求項１〜４いずれかに記載のホモダイマーまたはヘテ
ロダイマー。5. A monomer comprising one or more amino acid deletions, additions or substitutions and / or modified amino acids, wherein the homodimer or heterodimer is similar or better than the original form. The homodimer or heterodimer according to any one of claims 1 to 4, wherein the homodimer or heterodimer is capable of (a) binding to the interferon α2 receptor and / or (b) eliciting a cell signal in a desired manner.
たは置換および／または修飾アミノ酸を有してなり、ホモダイマーまたはヘテロ
ダイマーがインターフェロンα２レセプターに結合しうるが、アンタゴニスト効
果を有することを特徴とする、請求項１〜４いずれかに記載のホモダイマーまた
はヘテロダイマー。6. A monomer comprising one or more amino acid deletions, additions or substitutions and / or modified amino acids, wherein the homodimer or heterodimer can bind to the interferon α2 receptor, but has an antagonistic effect. The homodimer or heterodimer according to any one of claims 1 to 4, wherein
たはオリゴ糖により共有結合的に修飾されてなることを特徴とする、請求項１〜
６いずれかに記載のホモダイマーまたはヘテロダイマー。7. The method according to claim 1, wherein one or more amino acids are covalently modified with fatty acids, monosaccharides and / or oligosaccharides.
6. The homodimer or heterodimer according to any of 6.
イマーに特異的に結合する抗体またはそのフラグメント。8. An antibody or a fragment thereof that specifically binds to the homodimer or heterodimer according to claim 1.
記載の抗体。9. A monoclonal antibody or a fragment thereof.
The described antibody.
求項１〜７記載のホモダイマーまたはヘテロダイマーの製造方法。10. The method for producing a homodimer or heterodimer according to claim 1, comprising a solid phase synthesis of a monomer and subsequent dimerization.
は炎症過程を治療するための、請求項１〜５および７いずれかに記載のホモダイ
マーもしくはヘテロダイマーまたは請求項１０記載の方法により製造されたホモ
ダイマーもしくはヘテロダイマーの使用。11. The homodimer or heterodimer according to claim 1 or claim 10 for treating an immune system disease, a disease associated with increased cell proliferation, an infection or an inflammatory process. Use of a homodimer or heterodimer produced by the method.
関連カポージ肉腫、リンパ腫または肉腫である請求項１２記載の使用。13. The use according to claim 12, wherein the cancer disease is hairy cell leukemia, metastatic renal cell carcinoma, AIDS-related Kaposi's sarcoma, lymphoma or sarcoma.
はインターフェロンレセプターの増大した発現に関連する疾患を治療するための
、請求項１〜４、６および７いずれかに記載のホモダイマーもしくはヘテロダイ
マーまたは請求項１０記載の方法により製造されたホモダイマーもしくはヘテロ
ダイマーの使用。14. The homodimer or heterodimer according to any one of claims 1 to 4, 6, and 7, for treating an immune system disease or a disease associated with increased synthesis of interferon or increased expression of interferon receptor. Use of a homodimer or heterodimer produced by the method according to claim 10.
もしくは不十分に発現したインターフェロンα２レセプターまたは過剰に高いも
しくは過剰に低いインターフェロンα２濃度に関連する疾患の診断のための、請
求項１〜７いずれかに記載のホモダイマーもしくはヘテロダイマーまたは請求項
１０記載の方法により製造されたホモダイマーもしくはヘテロダイマーまたは請
求項８もしくは９記載の抗体またはそのフラグメントの使用。15. The method according to claim 1, for diagnosing a disease associated with a modified interferon α2 receptor or an excessively or insufficiently expressed interferon α2 receptor or an excessively high or excessively low interferon α2 concentration. Use of the homodimer or heterodimer according to any one of claims 1 to 3, or the homodimer or heterodimer produced by the method according to claim 10, or the antibody or a fragment thereof according to claim 8 or 9.
ダイマー、請求項１０記載の方法により製造されたホモダイマーまたはヘテロダ
イマー、または請求項８もしくは９記載の抗体またはそのフラグメントを含んで
なる、請求項１５記載の診断方法を行なうためのキット。16. A homodimer or heterodimer according to any one of claims 1 to 7, a homodimer or heterodimer produced by the method according to claim 10, or the antibody or fragment thereof according to claim 8 or 9. A kit for performing the diagnostic method according to claim 15.
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