JP2002533055A - 軟骨の変性疾患のためのトランスジェニック動物モデル - Google Patents

軟骨の変性疾患のためのトランスジェニック動物モデル

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、組換えマトリックス−分解酵素（ＭＤＥ）、特にマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を時間的および空間的に制御された様式で発現することができるトランスジェニック動物を含む、軟骨変性疾患のための動物モデル系を提供する。本発明はまた、哺乳類の軟骨変性疾患の表現型指標を産生するための方法、およびある組成物が軟骨変性疾患を中和する可能性を決定するための方法も提供する。本発明は、構成的酵素活性を示すプロＭＭＰポリペプチドをコードする単離された核酸、および単離されたプロＭＭＰポリペプチドをも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】発明の分野 本発明は、時間的かつ空間的に調節された様式で組換えマトリックス分解酵素
を発現するトランスジェニック哺乳類に関する。本発明は更には、治療薬および
治療法を同定するための系を初めとし、変性性間接疾患を調査するためにそうい
ったトランスジェニック哺乳類を導入しているモデル系に関する。発明の背景 例えば変形性関節炎、リューマチ性関節炎、および骨軟骨形成異常のような関
節および椎間板の疾患を初めとする軟骨の変性疾患は特に高齢者に広く見られる
。これらの疾患に共通する初期症状には、関節のプロテオグリカンの消失（異染
性（ｍｅｔａｃｈｒｏｍａｓｉａ）の消失により証拠付けられる）；コラーゲン
変性；軟骨表面の線維化；および最終的には軟骨の消失（関節窩の狭窄として放
射線学的に証拠付けられる）を含む。
【０００２】 こうした疾患により影響を受ける一次標的の内の一つがタイプＩＩコラーゲン
であり、これは関節軟骨に見いだされる主要構成性コラーゲンである。タイプＩ
Ｉコラーゲンと、軟骨および骨の通常のリモデリングの間にタイプＩＩコラーゲ
ンを退化させる分解酵素との間には均衡が保たれている。例えば一例では変性性
関節疾患といった病理学的状態はこの均衡が破られた時に生じるのかもしれない
。
【０００３】 細胞外マトリックス構成成分を退化させる酵素には、マトリックスメタロプロ
テイナーゼ（ＭＭＰ）、亜鉛依存性酵素のファミリー、およびアグレカナーゼが
ある（表１）。
【０００４】
【表１】
【０００５】 ＭＭＰは軟骨細胞により咬合関節で合成され、この軟骨細胞は成熟した咬合軟
骨内にある場合には軟骨特異的マトリックス表現型を維持する最終分化細胞であ
る。内因性ＭＭＰ阻害剤と比較した場合のＭＭＰの過剰発現が変性性関節疾患の
場合に生じており、これが軟骨変性をもたらすかも知れない。例えば、タイプＩ
ＩコラーゲンはＭＭＰ−１３とＭＭＰ−１の基質であり（Ｋｎａｕｐｅｒ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１５４４、１９９６）、そしてＭ
ＭＰ−１蛋白質とＭＭＰ−１３蛋白質の両方をヒト変形性関節炎組織内で免疫組
織科学的に検出することができる。幾つかの事例ではＭＭＰ−１３およびその開
裂産物がＭＭＰ−１よりも高いレベルで見いだされる（Ｂｉｌｌｉｎｇｈｕｒｓ
ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ．９９：１５３４、１９９７）。
従って、ＭＭＰ−１３は変形性関節炎および他の変性性関節疾患に関連する軟骨
変性において重要な役割を担っているかも知れない（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ
ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ．９７：７６１、１９９６）。
【０００６】 変形性関節炎に関連する症候群についての動物モデルは、モルモット（Ｗａｔ
ｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈ．Ｒｈｅｕｍ．３９：１３２７，１９９６）お
よびマウスのＳＴＲ／ＯＲＴ近交系（Ｄａｓ−Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ
ｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈ．７４：６２７、１９９３）に記載されている。モル
モットでは自発的変形性関節炎は発症に長時間かかり（６カ月もしくはそれを上
回る期間）、そしてＳＴＲ／ＯＲＴマウスの所定の亜系のみが一貫して変性性関
節疾患を発症する。従ってこれらのモデルの持続期間および／または可変性がた
めに、これらのモデルは薬物探査調査にはあまり適当ではなくなる。
【０００７】 他の変形性関節炎関連モデルには例えばウサギおよびイヌの前十字靭帯離脱お
よび／または部分半月軟骨切除術のような外科的に誘導させた関節の不安定化（
ｊｏｉｎｔ ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）があり、この操作により軟骨変
性が刺激される（Ｈｕｌｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｃａ
ｎｄ．４１：５２２、１９７０）。他のモデルは、生化学的靭帯切断を誘発する
ために動物の関節内への細菌性コラーゲンの注入を利用する（Ｖａｎ ｄｅｒ
Ｋｒａａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．７１：１９、１９９０
）。（ｉ）個々の動物の外科的もしくは他の操作が必要であるため；（ｉｉ）動
物が大きくかつ高価であるため；および／または（ｉｉｉ）疾患の進行過程に首
尾一貫性が見られないため、これらのモデルは薬剤スクリーニングを初めとする
大規模調査には容易に用いることができない。
【０００８】 トランスジェニック動物モデルは理論的には変性性関節疾患のための再現性の
ある動物モデルに対する機会を提供し得る。しかしながら例えばＭＭＰ−１のよ
うなＭＭＰおよびストロメリシンを発現するトランスジェニック動物を工学的に
作成するこれまでの試みによっては、トランスジェニック動物に観察可能な関節
変性表現型をもたらしてはいない。これは、こうした酵素の構成性発現により引
き起こされる胚性致死のためかもしれない。Ｗｉｔｔｙら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｅｌｌ ６：１２８７、１９９５、は、哺乳類組織においてＭＭＰ−１および
ストロメリシンを構成的に発現するトランスジェニック動物を創出したが、これ
らの動物は変形性関節炎の症状を示さない。Ｄ’Ａｒｍｉｅｎｔｏら、Ｃｅｌｌ
７１：９５５、１９９２、は、肺においてヒト間隙水性（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔ
ｉａｌ）コラーゲナーゼを発現するトランスジェニックマウスを開示している。
Ｌｅｕら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３０：２２７、１９９５、は、突然変異
を生じているタイプＩＩコラーゲンを過剰発現し、その結果、結合組織欠陥は引
き起こすが変形性関節炎はもたらさないトランスジェニック動物を開示している
。これらのトランスジェニック動物系の内のいずれのものも、変形性関節炎に対
する有用な動物モデルを提供していない（Ｋｈｏｋｈａら、Ｃａｎｃｅｒ ａｎ
ｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．１４：９７、１９９５；Ｓｈａｐｉｒｏ、
Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．１５：５２７、１９９７）。
【０００９】 従って、例えば変形性関節炎、リューマチ性関節炎、および軟骨形成不全のよ
うなヒト変性性関節疾患を模倣する動物モデル系についてのニースが当該技術分
野に存在する。発現が軟骨変性をもたらす調節性異種遺伝子を含むトランスジェ
ニック動物は、導入遺伝子の発現のタイミングおよびレベル、ならびにそのこと
による病理学的症状自体の再現的実験性調節を提供するという点で特に有利であ
る。こうした動物を用いて疾患を引き起こすのに必要とされる導入遺伝子の発現
レベルがどのくらいであるかを決定することができ、そして重要なことはこれを
薬剤探索および治療法の至適化に利用することができる。特にこうしたトランス
ジェニック動物を用いて軟骨変性におけるマトリックス分解酵素の役割を更に詳
しく特定することができ、かつインビボスクリーンとして用いてこれらの酵素を
調節する化合物または変性性関節疾患の進行を阻害する化合物を同定することが
できる。発明の要約 本発明は、体細胞および生殖細胞が、酵素的に活性なマトリックス変性酵素（
ＭＤＥ）、好ましくはＭＭＰ、を含むポリペプチドをコードする一つもしくは複
数の異種遺伝子もしくは組換え遺伝子を安定に組み込まれた形態で含むトランス
ジェニック非ヒト動物もしくはその子孫を提供する。本発明で用いられるＭＭＰ
は、一つもしくは複数のＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、Ｍ
ＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−
１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、およびＭＭＰ−１７；好ま
しくは一つもしくは複数のＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、およびＭＭＰ
−１３；そして最も好ましくは一つもしくは複数のＭＭＰ−１およびＭＭＰ１３
を含み；そして酵素的に活性な変異体、断片、およびそれらのポリペプチドの組
み合わせ物を含む。他のマトリックス分解酵素も用いることができ、それには例
えばアグレカナーゼが含まれる。ＭＤＥはいずれかの種、好ましくはヒトに由来
してよい。好ましい態様では、組換えＭＤＥをコードする遺伝子はトランスジェ
ニック動物の関節軟骨細胞内で選択的に発現され、そして発現により変性性関節
疾患に特有の病理学的症状をもたらす。
【００１０】 ある態様では本発明は、体細胞および生殖細胞が、ＭＤＥもしくは酵素的に活
性なその誘導体もしくは変異体、好ましくは配列番号４に記載される配列を含む
構成的に活性なプロＭＭＰ１３変異体（ＭＭＰ−１３＊と表示される）をコード
する安定に組み込まれた第一組換え遺伝子を含む。好ましくは第一組換え遺伝子
が第一調節性プロモーターの制御下に置かれ；一層好ましくは第一調節性プロモ
ーターが例えば一例では配列番号５に示されるプロモーターのようにｔａｔ０７
を含む。このトランスジェニック動物は、第一調節性プロモーターを調節し、そ
して好ましくはｔＴＡポリペプチドであるポリペプチドをコードする第二組換え
遺伝子を更に含んでよい。こうした態様では第二組換え遺伝子は第二調節性プロ
モーター、好ましくは関節特異的プロモーターに由来する配列を含むもの、そし
て最も好ましくは例えば一例では配列番号６に示されるプロモーターのようなタ
イプＩＩコラーゲンプロモーターの制御下に置かれる。従って関節組織内での第
二組換え遺伝子の選択的発現により組換えＭＤＥの調節下関節特異的発現がもた
らされる。
【００１１】 他の態様では本発明は、酵素的に活性なＭＭＰ変異体、好ましくはヒトプロＭ
ＭＰ−１３変異体、および最も好ましくはＭＭＰ−１３＊をコードする単離され
た核酸を提供する。本発明は更に、こうした核酸を含む組換えクローニングベク
ター；そのベクターを含む細胞；その細胞をＭＭＰ−１３発現に適当な条件下で
培養することを含むＭＭＰ−１３由来ポリペプチドを産生するための方法；なら
びに単離されたＭＭＰ−１３由来のポリペプチドを提供する。
【００１２】 更に別の態様では本発明は、哺乳類内で軟骨変性性疾患の特徴となる表現型変
化を作り出すための、本発明のトランスジェニック動物をその導入遺伝子により
コードされるＭＤＥの発現をもたらす条件下に露出することを含む方法を提供す
る。好ましい態様では、操作可能にｔｅｔ０７プロモーターに連結されるＭＭＰ
−１３＊をコードする第一組換え遺伝子およびタイプＩＩコラーゲンプロモータ
ーに操作可能に連結されるｔＴＡ蛋白質をコードする第二組換え遺伝子を含むト
ランスジェニック動物が、テトラサイクリンもしくはテトラサイクリンアナログ
の存在下に維持される。ＭＭＰ−１３＊の発現を誘導することが所望される際に
はテトラサイクリンもしくはテトラサイクリンアナログを除去すれば、ＭＭＰ−
１３＊が選択的に関節組織内で発現され、そして軟骨変性疾患に特有の表現型変
化がもたらされる。
【００１３】 更に別の態様では本発明は、組成物が軟骨変性疾患を中和する可能性を決定す
るための方法を提供する。これらの方法は、軟骨変性疾患の表現型指標をが発症
する前もしくは後のいずれかに本発明のトランスジェニック動物にその組成物の
既知の用量を投与し；その組成物の投与後のあらかじめ決定された期間にその指
標をモニターし；そしてその組成物に対しては露出させていない対照トランスジ
ェニック動物と、その組成物を投与した動物内での指標の程度を比較することに
より実施される。（ｉ）関節変性疾患の表現型指標の性質もしくは程度、（ｉｉ
）指標を発症するのに必要とされる時間、または（ｉｉｉ）他の改善処置の必要
性、におけるいずれかの違いは、その組成物が軟骨変性疾患を中和する可能性を
示す。発明の詳細な説明 本発明は、トランスジェニックマウスの軟骨でのマトリックス分解酵素の調節
下発現が関節および椎間板のマトリックス変性疾患に関連する特徴的な表現型変
化をもたらすという発見に基づく。本発明の動物モデルはマトリックス変性疾患
症候群のための新規モデル系を提供し、このモデル系はヒト関節および椎間板の
病理特性の詳細な特徴決定、ならびに薬剤探索および治療法の至適化に用いるこ
とができる。
【００１４】 本発明に従うトランスジェニックマウスは、出生前（胚）段階で動物もしくは
その動物の祖先に組み込まれた導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。トラ
ンスジェニック動物は例えば、目的の遺伝子を例えばマイクロインジェクション
により受精卵の雄性前核内に組み込ませ、そしてその卵子を疑妊娠した雌の里親
動物内で発育させることにより作成することができる。目的の遺伝子は適切なプ
ロモーター配列に加え、イントロン配列およびポリアデニル化シグナル配列を含
んでよい。トランスジェニック動物を産生するための方法は例えば、米国特許第
４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号、ならびにＨｏｇａｎら、
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８６、に開示されている。トランスジェニッ
ク創始動物（ｆｏｕｎｄｅｒ ａｎｉｍａｌ）を用いてその導入遺伝子を保持す
る追加的動物を繁殖させることができる。２つの導入遺伝子を保持する「二重ト
ランスジェニック」動物を作成する目的で、一つの導入遺伝子を保持するトラン
スジェニック動物を、第二の導入遺伝子を保持する別のトランスジェニック動物
と交配させることもできる。別法では、２つの導入遺伝子を同時にマイクロイン
ジェクションして二重トランスジェニック動物を産生することができる。２つを
上回る数の導入遺伝子を保持する動物も可能である。更には、ヘテロ接合性トラ
ンスジェニック動物、すなわちある導入遺伝子を一コピーを保持する動物を、同
一の導入遺伝子についてヘテロ接合性となっている第二の動物と交配させて、そ
の導入遺伝子を２コピー保持するホモ接合性動物を作成することができる。
【００１５】 本発明は、トランスジェニック動物、好ましくはトランスジェニク哺乳類で、
組換え遺伝子からのＭＤＥ、具体的にはＭＭＰ、そして最も具体的にはコラーゲ
ナーゼ活性を有するＭＭＰを発現するものを包含する。本発明における使用のた
めのＭＤＥは、限定されるものではないが、ＭＭＰおよびアグレカナーゼを含む
。有用なＭＭＰは、限定されるものではないが、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８、およ
びＭＭＰ−１３として表示されるコラーゲナーゼ；ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−１０、
およびＭＭＰ−１１と表示されるストロメリシン；ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９
と表示されるゲラチナーゼ；ＭＭＰ−１２と表示されるメタロエラスターゼ；な
らびにＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、およびＭＭＰ−１７と表示
される膜タイプのＭＭＰを含む（Ｍａｔｒｉｓｉａｎ、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ、１ ４ ：４５５、１９９２）。本明細書で用いられるマトリックス分解活性は、例え
ばコラーゲン、具体的にはタイプＩＩコラーゲン、および最も具体的にはタイプ
ＩＩコラーゲンの三重らせん形態を含むマトリックス構成成分の蛋白質分解性変
性を意味する。既述の酵素の酵素的活性断片を含むマトリックス分解活性を示す
いずれかのポリペプチドを、本発明を実施するのに用いてよい。ＭＭＰ−１３酵
素活性が発現されることが好ましい。本明細書に用いられるＭＭＰ−１３酵素活
性は、タイプＩＩコラーゲンの蛋白質分解性変性を意味する。ＭＭＰ−１３酵素
活性を示すいずれかのＭＭＰ−１３ポリペプチド、またはその断片もしくは誘導
体が用いられてよい。酵素は、限定されるものではないが、ヒト、マウス、ラッ
ト、ウサギ、ブタ、ウシ、もしくは非ヒト霊長類を含むいずれかの動物種または
それらの組み合わせ物に由来してよい。ＭＭＰ−１３もしくはその誘導体がヒト
起源のものであることが好ましい。
【００１６】 通常はＭＭＰは、その酵素活性が潜在的である前駆体（すなわち、チモーゲン
もしくはプロ酵素）として合成され；分泌後のプロ領域の蛋白質分解性除去によ
り酵素的に活性な蛋白質が産生される。本発明の好ましい態様では、蛋白質分解
性プロセシングの必要性は、酵素もしくは開裂されない際にでも酵素的に活性と
なるプロ酵素の使用により回避される。こういった変異体は、部位特異的突然変
異もしくはランダム突然変異のための通常の技術をコラーゲナーゼ酵素活性の分
析（これ以降を参照されたい）と組み合わせて用いることで作成することができ
る。こういった様式で改変（例えば、挿入、欠失、および置換を含む）をプロ酵
素配列、具体的にはプロ領域内もしくはプロ領域開裂部位付近に導入することに
よって、活性化のために蛋白質分解によるプロセシングを必要とはしない構成的
に活性なポリペプチドを作成してよい。別法ではプロ領域は完全に欠失してよい
。更には、天然のシグナルペプチドがシグナルペプチドとして機能する、すなわ
ち分泌を促進させる異種配列により置換される組換え遺伝子が用いられてよい。
そのように改変されたＭＭＰポリペプチドのいずれかをコードする遺伝子の使用
は本発明に包含される。
【００１７】 構成的に活性なＭＭＰ−１３変異体が本発明を実施するのに用いられることが
好ましい。ＭＭＰ−１３変異体が、具体的にはＰｒｏ99からＶａｌへの置換であ
る、ＰＲＣＧＶＰＤＶ領域、つまり配列番号７をコードする配列内の突然変異を
含む配列を含むことが最も好ましく；このポリペプチドの配列は配列番号４に示
されており、そしてこのポリペプチドはＭＭＰ−１３＊と表示される。他の態様
では構成的に活性なＭＭＰ−１３変位体はＶａｌ98からＧｌｙへの置換を含む。
【００１８】 本発明のトランスジェニック動物は調節を受けた様式でＭＭＰ活性を発現する
ことが好ましい。本明細書に用いられる「調節下での発現」は時間的および／ま
たは空間的調節を意味する。時間的調節は、トランンスジェニック動物の発達に
おけるあらかじめ決められた時期まではＭＭＰ活性の発現が抑制される能力を意
味し、そしてその後にはＭＭＰ発現が活性化され、そして所望される期間維持さ
れてよい。ＭＭＰ発現は胚発生を通してずっと抑制され、そして成体動物で活性
化されることが好ましい。空間的調節は、特別な組織内でＭＭＰ活性を選択的に
発現する能力を意味する。好ましくはＭＭＰ活性は関節組織で、最も好ましくは
関節軟骨細胞で選択的に発現される。
【００１９】 ＭＭＰ発現の時間的調節は、ＭＭＰをコードする配列と操作可能に連結するの
に用いられる転写レプレッサー／アクチベーターに敏感に反応するプロモーター
と共に用いられる、転写リプレッサー、転写アクチベーターもしくはエンハンサ
ー、またはそれらの組み合わせ物を含む一つもしくは複数のポリペプチドの使用
により達成される。ある一組の態様では、ＭＭＰ発現の時間的調節は、（ｉ）レ
プレッサー−アクチベーター融合ポリペプチドを作り出す、真核生物細胞内での
転写を直接もしくは関節的に活性化するポリペプチドに操作可能に連結されるレ
プレッサーポリペプチドのトランスジェニック動物内での発現；および（ｉｉ）
転写活性がそのレプレッサー−アクチベーター融合ポリペプチドに対して敏感に
反応するＭＭＰによりコードされる配列に操作可能に連結される標的プロモータ
ーを連動させた状態で使用すること、により達成される。典型的には、レプレッ
サーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、融合蛋白質をコードするキ
メラ遺伝子を作成する目的で、転写アクチベーターポリペプチドをコードする配
列とフレームをずれないようにさせた状態で（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）連結させる。
【００２０】 有用なリプレッサーポリペプチドには、限定されるものではないが、テトラサ
イクリンレプレッサー、ＬａｃＲレプレッサー、ＫＲＡＢドメイン、およびラム
ダレプレッサー（ｃｒｏおよびｃＩ）を含む細菌性リプレッサー、ならびに、限
定されるものではないが、アミノ酸もしくは糖の合成に関与するものを含む真核
生物性リプレッサーに由来する配列を含むポリペプチドを含む。有用な直接的転
写アクチベーターポリペプチドは、限定されるものではないが、単純疱疹ウイル
ス蛋白質１６（ＶＰ１６）；イーストＧＡＬ１４；イーストＳＴＡＴ；例えばプ
ロゲステロンレセプターおよびエストロゲンレセプターのようなステロイドレセ
プター、ならびに例えばｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、およびＳＰ−１のような構成
性アクチベーターを含む。別法ではレプレッサーポリペプチドは、レプレッサー
アクチベーター融合蛋白質と相互作用させる目的では、転写アクチベーターを新
規に補充することにより転写を間接的に活性化するポリペプチドに連結されてよ
く；こういった間接的アクチベーターポリペプチドは、限定されるものではない
が、ＴＡＴＡボックス結合性蛋白質（ＴＡＴＡ Ｂｏｘ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ）（ＴＢＰ）および例えば塩基性転写因子Ｄを含む塩基性転写因子を
含む。
【００２１】 本発明に従うと、各リプレッサー−アクチベーター融合蛋白質は、特別な融合
蛋白質に対して敏感に反応し、そしてＭＤＥをコードする配列の転写を調節する
標的プロモーターと組み合わせて用いられる。典型的にはプロモーターは、真核
生物細胞内での転写を支援する最低限でも一つの最小プロモーターに操作可能に
連結され、レプレッサー−アクチベーター融合ポリペプチドのレプレッサー構成
成分に対して敏感に反応する少なくとも一つのオペレーター配列を含む。適切な
レプレッサー応答性オペレーター配列は、限定されるものではないが、大腸菌（
Ｅ．ｃｏｌｉ）内のＴｎ１０にコードされるテトラサイクリン耐性オペロン、ラ
ムダレプレッサーオペロン、およびイーストＧＡＬレプレッサーオペロンに由来
する配列を含む。最小プロモーターが得られてきてよい適切な真核生物プロモー
ターの例は、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥ
プロモーター、ＰｔＫ−１（チミジンキナーゼ）プロモーター、ＨＳＰ（熱ショ
ック蛋白質）プロモーター、およびＴＡＴＡボックスを含むいずれかの真核生物
性プロモーターを含む。最小プロモーター配列は、（ｉ）通常の方法を用いるこ
とで欠失突然変異を作成すること、および（ｉｉ）得られる配列が細胞株内で転
写を活性化させる能力を検査すること、によりこれらのプロモーターから取得さ
れてよい。米国特許第５，６５０，２９８号は、ｔＴＡと表示され、ＶＰ１６配
列に融合されるテトラサイクリンレプッサー、およびｔｅｔ０７と表示され、Ｃ
ＭＶ ＩＥプロモーターの一部分に連結されるＴｎ１０由来配列を含むｔＴＡ−
応答性プロモーターからなるレプレッサー−アクチベーター融合蛋白質を開示し
ている。
【００２２】 別法では、時間的調節は、（ｉ）異種もしくは組換え転写アクチベーターポリ
ペプチド（単数）もしくはポリペプチド（複数）のトランスジェニック動物内で
の発現、ならびに（ｉｉ）転写活性が異種もしくは組換え転写アクチベーターに
対して敏感に反応するＭＭＰによりコードされる配列に操作可能に連結される標
的プロモーターを連動させた状態で使用することにより達成される。有用な転写
アクチベーターは、限定されるものではないが、グルココルチコイドレセプター
のアミノ末端トランス活性化ドメインに連結されるＶＰ１６トランス活性化ドメ
インがリガンド結合性ドメインおよびエクジソンレセプターのカルボキシ末端配
列に融合されている改変されたエクジソンレセプター（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：３３４６、１９９６）；ＶＰ１６アク
チベーター配列、ＧＡＬ４活性化配列、および突然変異を受けたヒトプロゲステ
ロンレセプターリガンド結合性ドメイン（Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８１８９、１９９４；Ｗａｎｇら、Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４３２、１９９７）を含み、ｐＧＬ−ＶＰと表示されるキ
メラ蛋白質；ならびにエストロゲン（もしくは他のステロイド）結合性ドメイン
（Ｍａｔｔｉｏｎｉら、Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４３：３５５、１９９
４）に融合される転写アクチベーターを含むキメラ蛋白質、を含む。エクジソン
レセプター系はレチノイドＸレセプター（ＲＸＲ）を用いてキメラレセプターと
のヘテロ二量体を形成し、そしてエクジソン、ムリステロン（エクジソンアナロ
グ）、もしくはデキサメサゾンに応答する。ｐＧＬ−ＶＰ系はミフェプリストン
（ＲＵ４８６）に対して反応性を示す。エストロゲン結合性ドメインを含むキメ
ラレセプターはヒドロキシタモキシフェン（エストロゲンアナログ）に対して反
応する。
【００２３】 ＭＤＥ発現の空間的調節は、関節組織内で選択的に転写を指令する転写プロモ
ーターの使用により達成される。本明細書で用いられる関節特異的発現は、他の
細胞よりは関節内で大きくなる発現を意味し；典型的には非関節組織内での発現
のレベルは関節内での発現レベルの１０％を下回る。非関節組織内での発現が検
出不能であることが好ましい。操作可能に連結される配列に関節特異的発現を行
わせる有用なプロモーター配列は、限定されるものではないが、コラーゲンタイ
プＩＩプロモーターに由来する配列を含む。本発明に従う関節特異的プロモータ
ーは特別な配列もしくはサブ配列の一つもしくは複数のコピーを含んでよく、そ
してそれらの配列は互いに正方向もしくは逆方向であり、かつ発現がそのプロモ
ーターにより調節される配列の正方向もしくは逆方向であってよいことが理解さ
れている。
【００２４】 ＭＤＥ発現の空間的および時間的な強調調節は、（ｉ）レプレッサー−アクチ
ベーター融合ポリペプチドもしくは転写アクチベーターの発現を関節特異的プロ
モーターの調節下に置くこと；（ｉｉ）ＭＤＥもしくはその誘導体の発現を、レ
プレッサー−アクチベーター融合ポリペプチドもしくは転写アクチベーターポリ
ペプチドに対して反応するプロモーターの調節下に置くこと；および（ｉｉｉ）
トランスジェニック動物を胎仔発生および生後初期の間はＭＤＥ発現が抑制され
る条件下に維持すること、により達成されることが好ましい。
【００２５】 胎仔および生後初期の発生期の間はＮＤＥ発現が抑制されるようにトランスジ
ェニック動物を維持する方法は、発現される具体的な導入遺伝子しだいで変わっ
てくる。レプレッサー−アクチベーター融合ポリペプチドが用いられる場合には
、抑制はレプレッサー−アクチベーター融合蛋白質に結合する試薬をその動物に
提供することにより達成され、そして標的ＭＤＥ遺伝子の転写の抑制がもたらさ
れる。ｔｅｔレプレッサー配列を含むレプレッサー−アクチベーター融合ポリペ
プチドをコードする導入遺伝子を含む動物では、抑制は、母親および出産後には
その子孫の食糧および飲料水中にテトラサイクリンもしくはテトラサイクリンア
ナログを提供することにより達成される。テトラサイクリンもしくはアナログは
、外科手術により移植された皮下時間放出ペレット（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ
ｔｉｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅ ｐｅｌｌｅｔ）（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．社，Ｓａｒａｓｏｔａ ＦＬ）を
用いて提供されてもよい。この場合には、テトラサイクリンもしくはテトラサイ
クロンアナログのレプレッサー−アクチベーター融合蛋白質への結合により、融
合蛋白質が同種プロモーターへ結合することおよびその転写の活性化を行うこと
を中和するようになる。テトラサイクリンアナログは、Ｋａが少なくとも約１０
6Ｍ-1、好ましくは親和性が約１０9Ｍ-1もしくはそれを上回る値でｔｅｔレプレ
ッサーに結合するテトラサイクリンに密接に関連する化合物である。有用なテト
ラサイクリンアナログは、限定されるものではないが、ドキシサイクリン、アン
ヒドリロテトラサイクリン、クロロテトラサイクリン、およびエピオキシテトラ
サイクリン等を含む。用いられる用量は、ＭＭＰ発現の実質的抑制がもたらされ
るであろうものである。典型的にはテトラサイクリンもしくはテトラサイクリン
アナログは、約１ｍｇ／ｍｌの投与量で動物の飲料水中に投与される。ＭＭＰが
発現されることが所望される場合には、テトラサイクリンもしくはそのアナログ
は除去される。
【００２６】 他の態様では、抑制は転写アクチベーターポリペプチドの活動に必要とされる
試薬を動物から除去することにより達成される。例えば転写アクチベーターが改
変されたエクジソンレセプターである場合には、動物は胎仔および生後初期の発
育期の間中、エクジソンもしくはエクジソンアナログの非存在下に維持される。
エクジソンアナログは、Ｋａが少なくとも約１０6Ｍ-1で改変されたエクジソン
レセプターに結合するエクジソンに密接に関連する化合物である。有用なエクジ
ソンアナログは、限定されるものではないが、ムリステロンＡを含む。ＭＤＥが
発現されることが所望される場合には、動物には例えばエクジソンもしくはムリ
ステロンＡの腹腔内投与を介し、約１０ｍｇと約２０ｍｇ／動物の間の投与量で
投与する。同様にｐＧＬ−ＶＰが用いられる場合には、活性化はミフェプリスト
ンを提供することにより達成される。
【００２７】 本発明の好ましい態様では、体細胞および生殖細胞が安定な形態で２つの組換
え遺伝子、すなわち：（ｉ）ＭＭＰ−１３＊をコードする配列を含む第一組換え
遺伝子（この場合、この配列はｔｅｔＯ７プロモーターに操作可能に連結される
）；および（ｉｉ）コラーゲンタイプＩＩプロモーターに操作可能に連結される
ｔＴＡ蛋白質をコードする第二組換え遺伝子、を含むトランスジェニック動物が
構築される。この態様では、動物はその遺伝子を抑制する目的で胎仔および生後
初期発生期の間中テトラサイクリンもしくはテトラサイクリンアナログの存在下
に維持される。その後テトラサイクリンもしくはテトラサイクリンアナログを除
去し、そしてＭＭＰ−１３酵素活性が関節組織内で選択的に発現される。軟骨変性疾患のための動物モデル 本発明は、例えば関節もしくは椎間板の疾患のような軟骨変性疾患に特徴的な
表現型変化が再現性よく示される動物モデル系を提供する。こういった疾患は、
制限としてではなく、リューマチ性関節炎、軟骨形成異常、および変性椎間板疾
患を含む。本発明のモデル系はこれらの疾患に共通する一つもしくは複数の表現
型指標を示し、こういった指標は、限定されるものではないが、影響を被ってい
る組織内でのプロテオグリカンの低減（例えばサフラニンＯ（Ｓａｆｒａｎｉｎ
Ｏ）染色の低減により示されるもの）およびタイプＩＩコラーゲンの開裂を含
む。こうした系は先に記載されるトランスジェニック動物を包含し、そのトラン
スジェニック動物内では組換えＭＤＥもしくは異種ＭＤＥ、特にＭＭＰがトラン
スジェニック動物の一生の内のあらかじめ決められた時期に軟骨で発現される。
軟骨変性表示の出現のタイミングは、ＭＤＥ発現を活性化させ、そして軟骨にお
ける効果をモニターすることにより決定される（以下を参照されたい）。好まし
くは一つもしくは複数のＭＤＥは生後に、最も好ましくは動物が成体期に達した
後に発現される。
【００２８】 導入遺伝子の発現は典型的には、異なる組織からｍＲＮＡを抽出し、そして抽
出したｍＲＮＡを以下の一つもしくは複数に供することによりモニターされ、そ
れらは；（ｉ）導入遺伝子と同種のプライマーを用いる逆転写酵素−ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）；（ｉｉ）ＲＮＡａｓｅ保護；および（ｉｉｉ）ノ
ザンブロット（Ｎｏｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）分析、である。別法ではインサイチ
ューハイブリダイゼーションを用いてよい。
【００２９】 関節軟骨でのＭＤＥ発現の生理学的効果を、動物を屠殺し、パラフィン包埋し
た脱灰軟骨を（ｉ）ヘマトキシリンとエオジン（通常の技術を用いる）での染色
およびその後の（ｉｉ）サフラニンＯとファストグリーン（Ｐｅｔｅｒら、Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．７１：１９、１９９０）での二重染色に供することによ
りテスト動物内でモニターする。別法では凍結させた切片を取得し、そしてタイ
プＩＩコラーゲンに由来する開裂断片に特異的な抗体で染色してよい（Ｂｉｌｌ
ｉｎｇｈｕｒｓｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：１５３４、１９９７
）。典型的には少なくとも約７日間のＭＭＰ導入遺伝子（一つもしくは複数）の
発現により検出可能なプロテオグリカンの低減および成長板の形態の変化がもた
らされる（例えば、以下の実施例５を参照されたい）。ＭＤＥ、具体的にはＭＭ
Ｐ、そして最も具体的にはＭＭＰ−１３の酵素的に活性な形態の発現によりプロ
テオグリカンの低減および／またはタイプＩＩコラーゲンの開裂がもたらされる
動物モデルは、本発明の範囲内に含まれる。
【００３０】 本発明に従って作成され、トランスジェニック動物内でモニターすることがで
きる軟骨変性疾患の他の表現型指標は制約としてではなく、関節機能の変化の肉
眼観察、ならびに（ｉ）原繊維形成と関節軟骨の低減および（ｉｉ）骨棘形成の
組織学的証拠を含む。
【００３１】 本発明のトランスジェニック動物が有用なモデルを提供するための症状は、限
定されるものではないが、軟骨の組成、形態、および／または機能の妨害を呈す
るいずれかの病理学的状態を含み、それには変形性関節炎；リューマチ性関節炎
；変形椎間板疾患；例えばニーエスト（Ｋｎｉｅｓｔ）形成異常症、軟骨無形成
、および低フォスファターゼ症を含む軟骨変性症；ならびに例えば短形動物に生
じるプロテオグリカン介在性障害を含む（Ｈａｌｌら、Ｃａｒｔｉｌａｇｅ：Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｓｐｅｃｔｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９９１、ｐｐ．２
０１−２０３）。
【００３２】 本発明の更に別の態様ではトランスジェニック動物を、軟骨変形表示を調節し
、そして／または動物の疾患表現型に例えば特別な疾患に関連するもののような
追加的生理学的効果を補足するための追加的処置に供することができる。例えば
トランスジェニック動物を、コラーゲン分解を増大させ、そして／またはプロテ
オグリカンの低減を誘発するために炎症性媒介物質で更に処理してよい（例えば
、以下の実施例６を参照されたい）。更には、追加的な処理有りもしくは無しで
ＭＤＥ誘発のタイミングおよび程度を特別な疾患もしくは症状の総体的徴候を模
写する目的で適用させることができる。軟骨の変性疾患を調節する薬剤を評価するための方法 本発明は、軟骨の変性疾患、特に変性性関節疾患に対する効果について薬剤お
よび治療法を発見および評価するための方法を包含する。本発明のある態様では
本発明のトランスジェニック動物は、一つもしくは複数のＭＤＥの発現が軟骨変
性疾患の一つもしくは複数の表現型指標をもたらす条件下で維持される。いった
ん症状が発症したら、ある組成物が軟骨変性疾患を中和する可能性を、その化合
物の既知の用量を症状を既に発現している動物に投与し；その組成物の投与後の
あらかじめ決められた期間、表現型指標をモニターし；そしてその組成物が投与
された動物内での表現型指標の程度を対照動物と比較することにより評価するこ
とができる。対照動物は、同一の管理下に維持される（すなわち、導入遺伝子を
発現する）が、その組成物は投与されていない年齢および性別が一致するトラン
スジェニック動物を含む。表現型指標の程度もしくは特性にいずれかの統計学的
に有意な違いがあれば、その組成物が軟骨変性疾患を中和する可能性を示す。本
明細書に用いられる際には「軟骨変性疾患の表現型指標」は、プロテオグリカン
の低減、関節窩の狭窄、コラーゲン変性、および軟骨の破壊を意味する。
【００３３】 本発明の他の態様では、ある化合物が軟骨の変性疾患、特に変形性関節疾患を
中和する可能性は、トランスジェニック動物でのＭＤＥ発現の誘導の前および／
またはそれと同時にその化合物の既知の用量をトランスジェニック動物に投与し
；その化合物の投与およびＭＤＥ誘導の後のあらかじめ決められた期間、軟骨変
性疾患の表現型指標をモニターし；そしてその化合物が投与されている動物での
表現型指標および／または疾患の程度をその化合物に露出されていない対照動物
と比較することにより評価される。この態様では表現型指標および／または疾患
の程度もしくは性質におけるいずれかの統計学的に有意な違い、または表現型指
標もしくは疾患の出現におけるいずれかの統計学的に有意な遅れは、その化合物
が軟骨変性疾患を中和する可能性を示す。
【００３４】 ある組成物が軟骨変性疾患を中和する可能性の別の指標は例えば、その疾患の
症状を緩和するのに用いられる他の治療剤の投与の用量およびタイミングを含む
他の治療法の程度もしくは期間におけるいずれかの低減をその組成物がもたらす
能力である。
【００３５】 抗−軟骨変性疾患の可能性についてテストされてよい化合物は例えば、天然産
物ライブラリー、発酵ライブラリー（植物および微生物を包含する）、コンビナ
トリアルライブラリー、化合物ファイル、合成化合物ライブラリー、および規制
された合理的薬剤設計および合成により得られる化合物内に見いだされてよい。
例えば合成化合物ライブラリーは、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．社（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ社
（Ｐｒｉｎｓｔｏｎ，ＮＪ）、Ｂｒａｄｏｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社（Ｍｅｒ
ｒｉｍａｃｋ，ＮＨ）、およびＭｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ社（Ｎｅｗ Ｍｉｌｆｏ
ｒｄ、ＣＡ）により商品として入手可能である。珍しい化学薬品ライブラリーが
Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．社（Ｍｉｌｗａ
ｕｋｅｅ，ＷＩ）により入手可能である。別法では、細菌、真菌類、植物、およ
び動物の抽出物の形態をとる天然化合物のライブラリーは例えば、Ｐａｎ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）もしくはＭｙｃｏＳｅａｒｃ
ｈ社（ＮＣ）から入手可能であるか、または容易に産生可能である。追加として
、天然および合成産生品のライブラリーおよび化合物は、通常の化学的、物理学
的、および生化学的手法を通して容易に改変される（Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅら、Ｔ
ｉｂＴｅｃｈ １４：６０，１９９６）。トランスジェニック動物 本明細書に用いられるトランスジェニック動物は、一つもしくは複数の異種お
よび／または組換え遺伝子が組み込まれている動物を意味する。導入遺伝子は異
なる種からか、もしくはトランスジェニック動物とは同一種からのものであって
よいが、後者の場合は導入遺伝子により与えられる形状および／または染色体遺
伝子座がその動物では天然には見いだされない。導入遺伝子は外来性ＤＮＡ配列
、すなわち宿主動物のゲノム内には通常は見いだされない配列を含んでよい。別
法もしくは追加として導入遺伝子は、その遺伝子のインビボでの発現パターンを
変化させる目的、もしくはその遺伝子によりコードされる内因性遺伝子産物の生
物学的活性を変化もしくは除去する目的でインビトロで再編成もしくは突然変異
を生じさせてある内因性ＤＮＡ配列を含んでよい。例えばその遺伝子の発現パタ
ーンを変化させるか、もしくはその遺伝子の発現を調節する追加的な手段を提供
する目的で、既存の遺伝子内に組み込まれるＤＮＡ断片も本発明に包含されてよ
い（Ｗａｔｓｏｎら、”Ｔｈｅ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｒｅｉ
ｇｎ Ｇｅｎｅｓ Ｉｎｔｏ Ｍｉｃｅ”，ｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｄ
ＮＡ，２ｄ Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１
９９２，ｐｐ．２５５−２７２；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．Ｗ．，Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．
Ｃｙｔｏｌ，１１５：１７１，１９８９；Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４０：１４５８，１９８９；Ｒｅｓｓａｎｔ，Ｎｅｕｒｏｎ ２：３２３，１
９９０）。
【００３６】 本発明のトランスジェニック非ヒト動物は、非ヒト動物の生殖系内に導入遺伝
子を組み込ませることにより産生される。様々な発達段階にある胚標的細胞を用
いて本発明の導入遺伝子を組み込ませる。胚標的細胞（一つもしくは複数）の発
達段階に依存して異なる方法が用いられる。こういった方法は、限定されるもの
ではないが、接合子のマイクロインジェクション、細菌組込み、および例えば以
下に記載される胚幹細胞の形質転換を含む。
【００３７】 １． 接合子のマイクロインジェクションは導入遺伝子を動物ゲノム内に組み
込むための好ましい方法である。前核融合もしくはその後の細胞分裂を受けてい
ない受精卵である接合子は、トランスジェニックＤＮＡ配列のマイクロインジェ
クションにとっては好ましい標的細胞である。マウス雄前核は約２０マイクロメ
ートルの直径のサイズに達し、この特徴によりトランスジェニックＤＮＡ配列を
含む溶液の１〜２ピコリットルのマイクロインジェクションが再現性よく実施で
きるようになる。導入遺伝子の組込みのために接合子を用いることは、大抵の場
合にはインジェクションされたトランスジェニックＤＮＡ配列が初回細胞分裂以
前に宿主動物のゲノム内に組み込まれるという利点を有する（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４４３８、１９８
５）。その結果、得られたトランスジェニック動物（創始動物）の全ての細胞は
トランスジェニック対立遺伝子として引用される特別な遺伝子座に組み込まれた
導入遺伝子を安定に保持する。このトランスジェニック対立遺伝子はメンデル遺
伝を示し、つまり非トランスジェニック動物とトランスジェニック動物との交配
により得られる子孫の内の半分が任意組み合わせのメンデルの法則に従ってトラ
ンスジェニック対立遺伝子を受け継ぐ。
【００３８】 ２． ウイルス組込みを用いても、動物内に本発明の導入遺伝子を組み込ませ
ることができる。発達途中の胚を未分化胚芽細胞の発達段階にまでインビトロで
培養する。この分割球を適切なレトロウイルスで感染させる（Ｊａｅｎｉｃｈ，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３：１２６０）。分割球の
感染は透明帯を酵素により除去することで亢進させる。導入遺伝子は、典型的に
は複製欠損を有するが、そういったウイルス配列に連結されるトランスジェニッ
クＤＮＡ配列を初めとするウイルス関連性ＤＮＡ配列の組込みに関してはコンピ
テントであるままのウイルスベクターを介して宿主動物ゲノム内に組み込まれる
。トランスフェクションは、トランス遺伝子含有性ウイルスベクターを産生する
細胞の単層上での分割球の培養により簡便かつ効果的に達成される。別法では感
染は、例えば卵割腔のような後期発達段階の細胞を用いて実施されてよい。いず
れの場合にもウイルス組込みにより産生される大半のトランスジェニック創始動
物はトランスジェニック対立遺伝子についてモザイクとなり；これはすなわち、
その導入遺伝子はトランスジェニック創始動物を形成する全ての細胞の、あるサ
ブセットのみの中に組み込まれたということである。その上、複数のウイルス組
換え現象が単一の創始動物内で生じて、将来の子孫世代の作成の際には分離する
複数の導入遺伝子対立遺伝子を生じてよい。この方法により生殖細胞系内への導
入遺伝子の組換えは可能であるものの、恐らく低頻度で起こるであろう。しかし
ながら一旦導入遺伝子がこの方法により生殖細胞系内に組み込まれれば、そのト
ランスジェニック対立遺伝子が動物細胞の全てに存在する、すなわち体細胞と生
殖細胞の両方に存在する子孫が作成されてよい。
【００３９】 ３． 胚幹（ＥＳ）細胞も、本発明の導入遺伝子の動物内への組込みのための
標的細胞として役に立ち得る。ＥＳ細胞は、インビトロで培養される移植前胚か
ら取得される（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４、１９８１）。導
入遺伝子で形質転換させてあるＥＳ細胞を動物の未分化胚芽細胞と組み合わせる
ことができ、その後にはそのＥＳ細胞はその胚にコロニー形成し、そして得られ
る動物の生殖系に寄与する（得られた動物はキメラであり、これはすなわち二つ
もしくはそれを上回る数の動物に由来する細胞からなる）。再度記載することに
なるが、一旦導入遺伝子がこの方法により生殖細胞内に組み込まれれば、トラン
スジェニック対立遺伝子が動物の細胞全てに存在する、すなわち体細胞と生殖細
胞の両方に存在する子孫が作成されてよい。
【００４０】 ある導入遺伝子の初期組込みはラマルク（Ｌａｍａｒｋｉａｎ）（非メンデル
）現象であるものの、本発明の導入遺伝子は生殖系細胞内に安定に組み込まれ、
そしてメンデル遺伝子座としてトランスジェニック動物の子孫に伝達されてよい
。他のトランスジェニック技術によりモザイクトランスジェニック動物がもたら
され、そこでは幾つかの細胞が導入遺伝子を保持し、そして他のものは導入遺伝
子を保持していない。生殖系細胞が導入遺伝子を保持していないモザイクトラン
スジェニック動物では導入遺伝子の子孫への伝達は起こらない。それにもかかわ
らずモザイクトランスジェニック動物は導入遺伝子に関連する表現型を決定する
ことができる。
【００４１】 本発明の実施の際にはトランスジェニック維持系の動物を、導入遺伝子の発現
が軟骨変性疾患の症状をもたらす遺伝的背景を有する動物と交差させる。本発明
の導入遺伝子を受け継いでいる子孫は、本発明の導入遺伝子に由来する核酸配列
の存在についての子孫からの遺伝物質の分析により、導入遺伝子を受け継いでい
ない同腹仔とは区別される。例えば本発明の導入遺伝子により非反復の形態で（
ｕｎｉｑｕｅｌｙ）コードされるポリペプチドを含む生物学的液体を、そのポリ
ペプチドの存在についての免疫アッセイにかけてよい。トランスジェニック子孫
を同定する簡便かつ一層信頼性の高い手法は、例えば尾のような動物の末端から
の組織試料を取得し、そしてその試料を本発明の導入遺伝子の非反復部分（一つ
もしくは複数）のＤＮＡ配列に対応する核酸配列の存在について分析することを
含む。そういった核酸配列の存在は例えば、導入遺伝子の内の非反復部分に対応
するＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーション（「サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）」
）分析、基質として試料中のＤＮＡ配列、および導入遺伝子ＤＮＡ配列に由来す
るオリゴヌクレオチド等を用いるＰＣＲ反応の産物の分析により決定されてよい
。核酸、ベクター、発現系、およびポリペプチド 本発明は、ＭＤＥ、特にＭＭＰ、およびそれらに由来する酵素的に活性な断片
、ならびに構成的に活性なＭＭＰ変異体およびそれらに由来する酵素的に活性な
断片をコードする単離された核酸を包含する。本発明は更には、既述の核酸の構
成成分；それらの核酸を含有するベクター；それらのベクターを含有する細胞；
およびそれらの核酸によりコードされる単離されたポリペプチドをも包含する。
【００４２】 例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；ＤＮＡ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａ
ｎｄ ＩＩ，１９８５（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４，（Ｍ．Ｌ．Ｇａｉｔ ｅｄ．）
；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，１９８４
（Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．）；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｓｅｒｉ
ｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；およびＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｐ
ｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏ
ｎ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．）に説明されるもののような、
分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および蛋白質生化学における多くの技術
が本発明の実施の際には用いられる。
【００４３】 本明細書に用いられる「核酸」もしくは「ポリヌクレオチド」は、いずれかの
長さのプリン−およびピリミジン−含有性ポリマーであって、ポリリボヌクレオ
チドもしくはポリデオキシリボヌクレオチド、または混合されたポリリボ−ポリ
デオキシリボヌクレオチドのいずれかを意味する。これは、例えばＤＮＡ−ＤＮ
Ａ、ＤＮＡ−ＲＮＡ、およびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのような一本鎖および
二本鎖分子、ならびにアミノ酸主鎖に対して塩基を共役結合させることにより形
成される「蛋白質核酸」（ＰＮＡ）を含む。これは更には、改変させた塩基を含
む核酸を含む。
【００４４】 「コーディング配列」もしくは「蛋白質コーディング配列」は、ｍＲＮＡに転
写され得る、および／またはポリペプチドに翻訳され得るポリヌクレオチド配列
である。コーディング配列の境界は典型的には、５’−末端の翻訳開始コドンお
よび３’−末端の翻訳停止コドンにより決定される。
【００４５】 本明細書に用いられる核酸配列の「相補物」は、もともとの配列とのワトソン
−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−ｃｌｉｃｋ）塩基対にかかわる「アンチセンス」配
列を意味する。
【００４６】 本明細書に用いられる「単離された」核酸もしくはポリペプチドは、もともと
の環境（例えば、天然に得られるものである場合には天然の環境）から取り出さ
れた構成成分を意味する。単離された核酸もしくはポリペプチドは典型的には、
もともと会合していた細胞性構成成分の約５０％を下回る率、好ましくは約７５
％を下回る率、そして最も好ましくは約９０％を下回る率を含む。
【００４７】 指定された配列「に由来する」核酸もしくはポリペプチド配列は、指定された
配列の、ある領域に対応する配列を意味する。核酸配列についてはこれは、その
配列と相同もしくは相補的な配列、ならびに「配列保存変異体」および「機能保
存変異体」を包含する。ポリペプチド配列については、これは「機能保存変異体
」を包含する。配列保存変異体は、ある所定のコドン位置内の一つもしくは複数
のヌクレオチドの変化がその位置にコードされるアミノ酸の変化を全くもたらさ
ないものである。機能保存変異体は、ポリペプチド内の所定のアミノ酸残基が天
然のポリペプチドの全体的形状および機能を変化させることなしに変化させられ
ているものであり、制約される訳ではないが、類似の物理化学特性（例えば、酸
性、塩基性、および疎水性等）を有するものでの一つのアミノ酸の置換を含む。
「機能保存」変異体は更には、指定されるポリペプチドに特異的な抗体を誘導す
る能力を有するいずれかのポリペプチドをも含む。
【００４８】 本明細書に開示される配列もしくはそれらのサブ配列の内のいずれかを含む核
酸は通常の方法により調製し得る。例えばＤＮＡは、一例ではＭａｔｔｅｕｃｃ
ｉら、１９８１，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５、のホスホル
アミダイト固相支持体法、Ｙｏｏらの方法、１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
／７６４：１７０７８、もしくは他のよく知られる方法を用いて化学的に合成す
ることができる。これは、対になっている合成オリゴヌクレオチドを含む一連の
オリゴヌクレオチドカセットを順次連結させることにより実施することができる
。
【００４９】 遺伝子コードの縮重により多くの異なるヌクレオチド配列が、本明細書に特定
されるアミノ酸配列もしくはそれらのサブ配列を有するポリペプチドをコードす
ることができる。これらのコドンは、原核生物系もしくは真核生物系内での至適
発現について選択することができる。こうした縮重変異体も本発明により包含さ
れる。
【００５０】 核酸は、当該技術分野に知られる多くの手法により改変されていてもよい。こ
うした改変の非制限的例は、メチル化、「キャップ」、アナログでの一つもしく
は複数の天然に存在するヌクレオチドの置換、例えば非荷電結合でのもの（一例
では、メチルホスファネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダイト、カル
バメート等）、および荷電結合でのもの（一例では、ホスホロチオエート、ホス
ホロジチオエート等）のようなヌクレオチド間改変を含む。核酸は、一つもしく
は複数の追加的な共有結合により連結された部分を含んでよく、その例は例えば
蛋白質（一例では、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−
Ｌ−リシン等）、インターカレート剤（一例では、アクリジン、ソラレン等）、
キレート剤（一例では、金属、放射性金属、鉄、酸化性金属（ｏｘｉｄａｔｉｖ
ｅ ｍｅｔａｌ）等）、およびアルキル化剤である。ＰＮＡも、用語「核酸」に
より包含される。この核酸は、メチルもしくはエチルホスホトリエステル、また
はアルキルホスホルアミデート連結の形成により誘導化されてよい。更には、本
発明の核酸配列は、直接もしくは間接的のいずれかで検出可能なシグナルを提供
することができるラベルで改変されていてもよい。例示的ラベルは、放射性同位
元素、蛍光分子、およびビオチンなどを含む。
【００５１】 本発明のポリペプチドは、例えばｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド（Ｎｏ
ｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．社，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のような多くの既知のベクタ
ー、またはｐＲＳＥＴもしくはｐＲＥＰプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，
Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、および多くの適切な宿主細胞を用い、本明細書に
開示もしくは引用されるか、またはそうでなければ当業者に知られている方法を
用いることにより発現されてよい。ベクター／宿主の具体的な選択は、本発明の
実施については重要ではない。組換えクローニングベクターはしばしば、クロー
ニングもしくは発現のための一つもしくは複数の複製系；例えば抗生物質耐性の
ような宿主内での選択のための一つもしくは複数のマーカー；ならびに一つもし
くは複数の発現カセットを含む。挿入されたコーディング配列は、標準方法によ
るか、天然の源より単離されるか、もしくはハイブリッドとして調製されるなど
により合成されてよい。転写調節要素および／または他のアミノ酸コーディング
配列へのコーディング配列の連結は既知の方法により達成されてよい。適切な宿
主細胞は、電気穿孔法、ＣａＣｌ2により媒介されるＤＮＡ取り込み、真菌感染
、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊ
ｅｃｔｉｌｅ）を初めとするいずれかの適切な方法か、もしくは他の確立された
方法により適切であらば形質転換／トランスフェクション／感染させてよい。
【００５２】 適切な宿主細胞は、細菌、始原細菌、真菌類、イースト、植物、および動物の
細胞、ならびに特に哺乳類細胞を含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．アウレウ
ス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サッカロ
ミセス セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）
、サッカロミセス カルルスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａ ｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ ）、スキゾサッカロミセス ポンビイ（Ｓｃｈｉｚｏ ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｉ）、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９
３細胞、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、
ＨｅＬａ細胞、および不滅化させた哺乳類骨髄性およびリンパ性細胞株は特に重
要である。好ましい複製系は、Ｍ１３、ＣｏｌＥｌ、ＳＶ４０、バキュロウイル
ス、ラムダー、アデノウイルス、およびサイトメガロウイルス等を含む。多数の
転写開始および停止調節領域が単離されており、そして様々な宿主内での異種蛋
白質の転写および翻訳に有効である。これらの領域の例、単離方法、操作様式等
は当該技術分野に知られている（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈ
ｎ Ｗｉｌｅｙ、１９９７）。適切な発現条件下では宿主細胞を、組換え法によ
り産生されるペプチドおよびポリペプチドの源として用いることができる。
【００５３】 機能保存変異体を含む本発明のＭＤＥは、蛋白質コーディング配列が組み込ま
れておりかつ発現される天然もしくは異種生物もしくは細胞（制約される訳では
ないが、細菌、真菌類、昆虫、植物、および哺乳類細胞を含む）から単離されて
よい。別法では、これらのポリペプチドは、プレプロコラーゲナーゼのグリコシ
ル化およびシグナルペプチドプロセシングを達成する目的でミクロソーム膜が追
加的に補足されてよい無細胞性蛋白質合成系内で産生されてよい。更にはポリペ
プチドは、限定されるものではないが、排他的（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ）固相合成
法、部分固相法、断片縮合、もしくは古典的溶液合成を含む市販品として入手可
能な自動手法により化学的に合成されてよい。
【００５４】 ポリペプチド精製の方法は当該技術分野でよく知られており、これには限定さ
れるものではないが、調製用ディスクゲル電気泳動、等電点電気泳動、ＨＰＬＣ
、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過、イオン交換および分配クロマトグラフィー、ならび
に向流分配を含む。目的によっては、限定されるものではないが例えばポリヒス
チジン配列の精製を亢進させる追加的配列タグを蛋白質が含む組換え系でポリペ
プチドを産生することが好ましい。その後にこのポリペプチドを宿主細胞の未精
製溶解物から適切な固相マトリックス上でのクロマトグラフィーにより精製する
ことができる。別法では、それに由来する蛋白質もしくはペプチドに対して作成
された抗体を精製試薬として用いることができる。他の精製法も可能である。
【００５５】 酵素活性、および好ましくは構成的酵素活性を示すＭＭＰ変異体および誘導体
の構築および分析は通常の方法の日常的な適用により達成することができる。ま
ずＭＭＰをコードする核酸を、部位特異的もしくはランダム突然変異誘発のいず
れかにより改変させるか、または融合遺伝子の一セグメントとして構築計画で用
いられる。この手順によりプロ領域をコードする配列内か、もしくはプロ領域開
裂部位付近のいずれかに含まれる改変がもたらされることが好ましく；この改変
にはプロ領域全体の欠失が含まれる。別法では、酵素的に活性なＭＭＰドメイン
と他のポリペプドとの間か、もしくは異なるＭＭＰの間のいずれかの融合蛋白質
をコードする配列が構築されてよい。その後には、改変された核酸を無細胞系内
でか、未処理細胞内でか（浸透性をもたせた細胞を含む）、トランスジェニック
動物内かのいずれかで変異体ＭＭＰのプログラムに用いられる。無細胞系もしく
は細胞培養系のいずれかを用いてＭＭＰ変異体もしくは誘導体を発現することが
好ましい。プロ領域開裂の程度は、代謝ラベルおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＭ
ＭＰ産物の分離により評価される。最後には、ＭＭＰ酵素活性が例えばＷｅｉｎ
ｇａｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：６７３０，１９８５；Ｗ
ｏｅｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１６９１
８，１９８８、およびＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．，
２９６：２６３，１９９２、に開示されるような天然の基質もしくはモデルペプ
チドの開裂を例えば定量することによる通常のアッセイを用いて測定される。こ
の様式では例えばＭＭＰ−１３＊の機能保存変異体を初めとする大量のＭＭＰ変
異体および誘導体を日常的に作成し、そしてＭＭＰ酵素活性についてアッセイす
ることができる。好ましい態様の既述 以下の例は制約としてではなく本発明を詳細に説明することを意図する。 実施例１：改変させた構成的に活性なプロＭＭＰ−１３をコードする遺伝子の構
築 以下の実験は、プロ領域開裂の非存在下で酵素的に活性なＭＭＰ−１３に由来
するプロコラーゲナーゼをコードする遺伝子を作成するために実施した。このプ
ロＭＭＰ−１３変異体（ＭＭＰ１３＊と表示される）の配列が配列番号４に示さ
れる。
【００５６】 ＭＭＰ−１３ ｃＤＮＡを改変するための部位特異的突然変異誘発 プロＭＭＰをコードするｃＤＮＡ断片をプラスミドｐＮｏｔ３Ａ（Ｆｒｅｉｊ
ｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１６７６６，１９９４；
ＧＥＮＢＡＮＫ 受託番号Ｘ７５３０８）をＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消
化させ、そして得られる約１５１５ｂｐ断片を精製することにより取得した。こ
の断片を、ＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化させてあるＴｅｔ−耐性／Ａｍ
ｐ−感受性ｐＡｌｔｅｒプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ
）内にサブクローン化させた。
【００５７】 部位特異的突然変異誘発は、アルタレッドサイトＩＩ インビトロミュータジ
ェネシスシステム（Ａｌｔｅｒｅｄ Ｓｉｔｅｓ ＩＩ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍ
ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩ）を用いて実施した。簡潔に記載すると、プラスミド一本鎖ＤＮＡを、ヘル
パーファージＲ４０８（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を含む培養物から精製した。Ａｍｐ
修復−Ｔｅｔノックアウト反転オリゴ（Ａｍｐ ｒｅｐａｉｒ−Ｔｅｔ ｋｎｏ
ｃｋ−ｏｕｔ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｌｉｇｏｓ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に
加え、配列5'-AAGCCAAGATGCGGGGTTGTCGATGTGGGTGAATACAAT-3'、配列番号８、を
有するオリゴヌクレオチドをリン酸化し、そして一本鎖ＤＮＡにアニールさせ、
その後に突然変異鎖合成を行ったた。次には、この反応混合物を用いて修復マイ
ナスの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＳ１３０１ｍｕｔＳを形質転換させ、そして
この培養物をアンピシリン選択培地中で増殖させた。プラスミドＤＮＡを、単離
したクローンから単離し、そしてＪＭ１０９細胞中に形質転換させ、これを次に
は１２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレートでプレート培養した。
【００５８】 先の手順によりアミノ酸９９でのプロリン−バリン置換がもたらされた。改変
させたプロＭＭＰをＭＭＰ１３＊と表示した（配列番号４）。
【００５９】 類似の技術を用いる部位特異的突然変異誘発を用いてアミノ酸９８でのバリン
からグリシンへの突然変異も誘発させた。配列5'-GAAAAAGCCAAGATGCGGGGGTCCTGA
TGTGGGTGAATAC-5'、配列番号９、を有する突然変異性オリゴヌクレオチドは先に
記載する要領で用いた。この手順によりアミノ酸９８でのバリンからグリシンへ
の置換がもたらされた。
【００６０】 直接配列決定により先の突然変異を確認した後にはＭＭＰ１３＊ ｃＤＮＡを
コードするｃＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの消化によりｐＡｌｔ
ｅｒ−ＭＭＰ１３＊ベクターから切り出した。 実施例２：ＭＭＰ−１３＊の酵素活性の決定 材料および方法 ＭＭＰ１３および野生型ＭＭＰ−１３の突然変異体形態を両方ともコードする
ｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーター（ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ）とＳＶ４０スプライ
スポリ（Ａ）ｎ（ＸｂａＩ−ＮｃｏＩ）を含むＢＳ（ＳＫ−）ベクター（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ社）内にサブクローン化した。ＨｅＬａ細胞の重複培養物（１０
ｃｍディッシュ）を、ＣａＰＯ4沈降法（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてこれらプ
ラスミドの５０μｇ分でトランスフェクトした。５時間後には細胞を、同容量の
２Ｘ ＨＢＳ＋３０％グリセロールを含む溶液を用いる１分間のグリセロールシ
ョックに供した。この手順はＰｒｏｆｅｃｔｉｏｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｒ
ａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ技術マニュアル（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に記
載されている。
【００６１】 トランスフェクションの２４時間後には、この培養培地（１０％ウシ胎仔血清
を含むＤ−ＭＥＭ）を、無血清でかつ１０μＭ ＣＧＳ−２７０２３Ａ（Ｃｉｂ
ａ−Ｇｅｉｇｙ社）（これはＭＭＰ阻害剤である）を含むＤ−ＭＥＭに置き換え
た。ＭＭＰ阻害剤を添加しない場合には、ＭＭＰは培養物の自己消化により産生
されると考えられ；従って培養培地へのＭＭＰ阻害剤の添加により検出可能なＭ
ＭＰ１３バンドがもたらされた。
【００６２】 ＭＭＰ阻害剤を含む無血清培地の添加後４８時間目には１０ｍｌの上清を回収
し、そしてＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０およびＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０濃縮機
（Ａｍｉｃｏｎ社）を用いて約２００倍に濃縮し、その後に同容量の２Ｘ トリ
ス（Ｔｒｉｓ）−グリシンＳＤＳ泳動用緩衝液を各試料に添加した。その後にこ
れらの試料を４〜１６％の予備染色したベータカゼインチモグラムＳＤＳポリア
クリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ社）にかけた。電気泳動後、これらのゲルを復元
用緩衝液（Ｎｏｖｅｘ社）中、室温で３０分間おくことで再生させ、その後にチ
モグラム展開用緩衝液（Ｎｏｖｅｘ社）中で一晩インキュベートした。
【００６３】 結果 通常ＭＭＰは、その酵素活性が潜在的となる前駆体（すなわち、プロコラーゲ
ナーゼもしくはチモーゲン）として合成され；分泌後にプロ領域が蛋白質分解に
より除去されることで酵素的に活性な蛋白質が産生される。蛋白質分解によるプ
ロセシングの必要性は、未開裂であったとしても酵素的に活性なプロコラーゲナ
ーゼ変異体の使用により回避される。導入遺伝子として用いられる構成的に活性
なＭＭＰ１３変異体は、ＭＭＰの中で高度に保存され、かつ酵素潜在性を調節す
るのに重要となるＰＲＣＧＶＰＤＶ（配列番号７）領域をコードする配列内にプ
ロリンからバリンへの置換を含んでいる。
【００６４】 改変させたＭＭＰ１３蛋白質の活性をカゼインチモグラムで決定した（データ
非公開）。３つのＭＭＰ種が対照ＨｅＬａ細胞から分泌される。一つのものは９
２ｋＤａ ＭＭＰ９酵素についての正しい分子量に遊走し、ゲラチナーゼＢとし
ても引用される。酵素活性化中のＭＭＰのプロドメインの開裂により約１０ｋＤ
ａ分の低減がもたらされる。第二バンドの分子量はゲラチナーゼＢのプロセシン
グを受けた形態に一致する。ストロメリシン−１（ＭＭＰ３）およびストロメリ
シン−２（ＭＭＰ１０）は両方とも５４ｋＤａであり、そして片一方もしくは両
方ともが第４番目のバンドを表すのかもしれない。プロ−ＭＭＰ１３は、未開裂
組換えＭＭＰ１３を含むレーン１に観察され、約６０ｋＤａに遊走すると予想さ
れる。ＨｅＬａ細胞を、親ＭＭＰ１３および突然変異体ＭＭＰ１３の両方を発現
する構築物でトランスフェクトした。約６０ｋＤａのプロ−ＭＭＰ１３形態のみ
が両方の構築物を発現する細胞から検出され、このことによりプロ酵素の成熟型
への自己蛋白質分解は外来性の系では生じないらしいことが示される。これらの
結果により、プロリンからバリンへの置換は本来のＭＭＰ１３活性もしくは基質
特異性を妨げないことが示された。
【００６５】 この方法により、ＭＭＰ１３酵素活性を保持するＭＭＰ１３変異体のための迅
速なスクリーニングが提供される。 実施例３：トランスジェニックベクターの構築 ｔｅｔ０７に連結されたＭＭＰ１３＊の構築 更に進んだ段階では、ＭＭＰ−１３＊をコードするｃＤＮＡが、以下のｔｅｔ
０７プロモーターに由来する転写調節配列に操作可能に連結した： ＢＳ（ＳＫ−）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をＫｐｎＩおよびＮｏｔ Ｉで消化した。以下の配列を有する合成二重らせんオリゴヌクレオチドをＫｐｎ ＩおよびＮｏｔＩで消化し、そしてベクターに連結した：5'-GGTACCACTAGTAAGCT
TAGATCTCATATGGTCGACCCCGGGGAATTCCTGCAGGGATCCTCTAGAAGTACTCCATGGGTATACATCGA
TGCGGCCGC-3'、配列番号１０。
【００６６】 先の要領で改変させたＢＳ（ＳＫ−）ベクターをＸｂａＩおよびＮｃｏＩで消
化した。ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、
ＣＡ）をＸｂａＩおよびＮｃｏＩで消化することにより取得され、ＳＶ４０スプ
ライス部位およびポリアデニル化シグナルを含む７４５ｂｐの断片をこのベクタ
ーに連結させた。
【００６７】 得られるベクターをＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩでの消化により直線化させ、ｐ
ＵＨＤ１０−３（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８９：５５４７，１９９２）からのｔｅｔＯ７プロモーター領域を含む
４６０ｂｐのＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片に連結させた。このベクターを次にはＳ ｐｅ Ｉで消化し、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリメラーゼで平滑末端にし、そし
てＥｃｏＲＩで消化した。ｐＡｌｔｅｒ−ＭＭＰ１３＊をＨｉｎｄＩＩＩで消化
し、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）ポリメラーゼで平滑末端にし、そしてＥｃｏＲＩ
で消化してＭＭＰ−１３＊をコードする断片を取得した。このＭＭＰ１３＊Ｅｃ
ｏＲＩ断片を、先に取得されたＥｃｏＲＩ消化ベクター内にクローン化した。
【００６８】 ２７９２ｂｐの導入遺伝子、配列番号１１（図２Ｂ）、をＸｈｏＩおよびＮｏ ｔ Ｉでの消化により切り出し、そしてＣｓＣｌ密度勾配遠心分離を用いて精製し
てから受精卵内へのマイクロインジェクションを行った。
【００６９】 コラーゲンタイプＩＩプロモーターに連結されるｔＴａ遺伝子の構築 ｔＴＡレプレッサー−アクチベーター融合蛋白質をコードする遺伝子を、関節
特異的（タイプＩＩコラーゲン）プロモーターに操作可能に連結させた。
【００７０】 先の実施例１に記載されるＳＶ４０スプライス部位およびポリアデニル化シグ
ナルを含む改変させたＢＳ（ＳＫ−）ベクターをＮｄｅＩおよびＳｍａＩで消化
し、そしてコラーゲンＩＩプロモーターおよびエンハンサーを含む１８９７ｂｐ
断片に連結させた。この断片はプラスミドＰＢＳΔＨ１をＨｉｎｄＩＩＩで消化
することにより取得し、その後にはこれをクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）で平滑末端
にし、そしてＮｄｅＩで消化した。
【００７１】 その後にプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてＥｃｏＲ
ＩおよびＢａｍＨＩを用いてｐＵＨＧ１５−１プラスミド（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ
ａｌ．，上述）からあらかじめ切り出してあるテトラサイクリン／ＶＰ１６レ
プレッサー−アクチベーター融合蛋白質をコードする１０２５ｂｐの断片に連結
させた。このプラスミドをＢｇｌＩＩでの消化により直線化させ、ウシ腸のホス
ファターゼを用いて脱リン酸化し、そしてプラスミドＰＢＳΔＨ１から取得した
１５５４ ＢａｍＨＩエンハンサー断片に連結させた。
【００７２】 最後に５２７６ｂｐの導入遺伝子、配列番号１２（図２Ａ）をＫｐｎＩおよび
ＮｏｔＩでの消化によりベクターから切り出し、ゲル精製し、ＣｓＣｌ密度勾配
遠心分離により精製し、マイクロインジェクション緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ ｐＨ７．４、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）に対して透析し、そ
してマイクロインジェクションに使用した。
【００７３】 タイプＩＩコラーゲンプロモーター−β−ガラクトシダーゼ遺伝子 タイプＩＩコラーゲンプロモーターにより付与される組織特異的発現を評価す
るのに適するリポーター遺伝子を、タイプＩＩコラーゲンプロモーターに操作可
能に連結した。
【００７４】 β−グロブリンスプライス配列に融合されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子およ
びポリアデニル化シグナルを含む４１７９ｂｐのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片を
プラスミドｐＵＧＨ１６−３（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，上述）から切り出
し、そして非改変のＢＳ（ＳＫ−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＢａｍＨＩ部
位内にクローン化した。このプラスミドをＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し
、そして先に記載されるプラスミドから切り出したタイプＩＩコラーゲンプロモ
ーター配列を含む６５５ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片に連結させた。
その後にこのプラスミドをＥｃｏＲＩで消化し、そして先に記載されるタイプＩ
Ｉコラーゲンプロモータープラスミドからあらかじめ切り出してある２８０７ｂ
ｐのＥｃｏＲＩ断片に連結させた。制限地図を用いて各挿入断片の向きを確認し
た。７６６４ｂｐの導入遺伝子、配列番号１３（図３Ａ）、をＨｉｎｄＩＩＩと
ＮｏｔＩでの消化により切り出し、ゲル精製し、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離によ
り精製し、マイクロインジェクション緩衝液（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
７．４、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）に対して透析し、そしてマウス胚
へのマイクロインジェクションに使用した。
【００７５】 結果 図２Ａおよび２Ｂは、軟骨細胞内でのＭＭＰ１３の制御下発現を達成するため
に作成された合成遺伝子の概略図を示す。導入遺伝子の誘導性発現は、テトラサ
イクリン調節性遺伝子発現系を用いて達成した（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，
上述；Ｆｕｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，９１：９３０２−９３０６，１９９４）。図２Ａに示される第一構築物で
は、テトラサイクリンによる制御を受けるＶＰ１６トランスアクチベーター融合
蛋白質の発現はタイプＩＩコラーゲン遺伝子プロモーターの制御下におかれてい
る。この構築物は軟骨細胞に対し、ＶＰ１６融合蛋白質の発現を指令する。図２
Ｂに示される第二構築物ではＭＭＰ１３蛋白質の改変変異体（ＭＭＰ１３＊）を
コードするｃＤＮＡの発現はＶＰ１６融合蛋白質の制御下におかれている。飲料
水内に提供されるテトラサイクリンアナログであるドキシサイクリンの存在下で
は、ＶＰ１６融合蛋白質は合成ＭＭＰ１３＊遺伝子のＴｅｔ０７プロモーターに
は結合せず、その遺伝子はサイレントとなる。ドキシサイクリンを除去すれば、
トランスアクチベーターがヒトＭＭＰ１３＊ ｃＤＮＡの転写および改変蛋白質
産物の産生を刺激する。
【００７６】 ＭＭＰ１３＊活性を確認することに加え、マイクロインジェクション前には図
２Ａおよび２Ｂに示される両方の導入遺伝子構築物を初期ウシ軟骨細胞およびマ
ウズ胚繊維芽細胞でテストした。結果により、コラーゲンＩＩプロモーターがＴ
ｅｔ０７−ルシフェラーゼもしくはＴｅｔ０７−ＭＭＰ１３＊のいずれかを含む
第二構築物の発現を誘導する能力が示された（データ非公開）。
【００７７】 図３Ａは、タイプＩＩコラーゲンプロモーターにより付与された組織特異的調
節を評価するための導入遺伝子の概略図である。この核酸構築物は：（ｉ）タイ
プＩＩ等級（ｒａｔｅ ｔｙｐｅ ＩＩ）のコラーゲンプロモーターに由来する
配列；（ｉｉ）細菌性β−ガラクトシダーゼ（Ｌａｃ Ｚ）をコードする配列；
および（ｉｉｉ）β−グロビンスプライスおよびポリアデニル化シグナルを含む
配列、を含む。 実施例４：関節組織内でテトラサイクリンにより調節されるＬａｃ Ｚもしくは
ＭＭＰ−１３＊を発現するトランスジェニックマウスの産生および特徴決定 以下の実験は、ＭＭＰ−１３＊もしくはＬａｃ Ｚ（β−ガラクトシダーゼ）
レポーター遺伝子を発現するトランスジェニックマウスを産生するために実施さ
れた。
【００７８】 材料および方法 トランスジェニックマウスの調製およびテスト。テトラサイクリン調節下でＭ
ＭＰ−１３＊を発現するマウスを産生するため、約２７８４塩基対からなるＸｈ
ｏＩ−ＮｏｔＩ ｔｅｔ０７−ＭＭＰ１３＊ ＤＮＡ断片（図２Ｂ）および約５
２６５塩基対からなるＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ ＣＰＥ−ｔＴＡ ＤＮＡ断片（図２
Ａ）を等モル量でマウス受精卵内に同時にマイクロインジェクションした。レポ
ーター遺伝子を発現するマウスを産生するため、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ Ｌ
ａｃＺ ７６４１塩基対断片（図３Ａ）を、記載される要領で（Ｈｏｇａｎ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１９９６
）（ＦＶＢ／Ｎ）受精卵に注入した。（制限断片のサイズは実施例３に記載され
る導入遺伝子よりは小さく、なぜならエンドヌクレアーゼ開裂部位がその導入遺
伝子内に存在するためである。） 創始動物をまず以下の要領でのＰＣＲにより同定した。ｔＴＡをコードする導
入遺伝子は、ｔＴＡ配列（5'-CGAGGGCCTGCTCGATCTCC-3'、配列番号１４）に対応
するプライマーおよび３’非翻訳配列（5'-GGCATTCCACCACTGCTCCC-3'、配列番号
１５）に対応するプライマーを用いて同定した。得られるＰＣＲ産物のサイズは
５８４ｂｐであった。ＭＭＰ−１３＊をコードする導入遺伝子は、ＭＭＰ１３＊
（5'-GAGCACCCTTCTCATGACCTC-3'配列番号１６）および３’非翻訳領域をそれぞ
れコードする配列に対応するプライマーを用いて同定した。得られるＰＣＲ産物
のサイズは７３１ｂｐであった。
【００７９】 Ｌａｃ Ｚをコードする導入遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の核局在
化シグナル（5'-GTTGGTGTAGATGGGCGCATCG-3'、配列番号１７）およびコラーゲン
プロモーター（5'-GCGGGGTCTCAGGTTACAGCC-3'、配列番号１８）に対応するプラ
イマーを用いて同定した。得られるＰＣＲ産物のサイズは６７３ｂｐであった。
【００８０】 ＢａｍＨＩ／ＮｃｏＩもしくはＰｖｕＩＩ／ＮｃｏＩで消化し、そして高緊縮
性条件下で３’非翻訳領域に対してハイブリッドさせたテイルＤＮＡのサザンブ
ロット分析を、ＰＣＲを用いて取得された結果を立証するために実施した。ゲノ
ム内に組み込まれた導入遺伝子ＤＮＡのコピー数は、注入された同一のＤＮＡの
１０および１００ゲノム等量を含む対照ＤＮＡを用いて取得されたものと、トラ
ンスジェニックマウスからのハイブリダイゼーションシグナルの相対強度を比較
することにより決定した。
【００８１】 コピー数は、製造業者の仕様書に従ってＴａｑｍａｎ定量的ＰＣＲ（Ｐｅｒｋ
ｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて確認した。トランスジェニック株は、創始動物を
ＦＶＢ／Ｎ野生型マウスと交配させ、そしてその後の世代をＰＣＲにより同定す
ることにより作成した。
【００８２】 全てのマウスに、５０％エタノール中の１００ｍｇ／ｍｌ保存溶液として調製
され、酸性飲料水で１．０ｍｇ／ｍｌの最終濃度に希釈されたドキシサイクリン
（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）を投与
し、この溶液は基本的に毎日交換した（Ｓｃｈｕｌｔｚｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：４９９、１９９６）。
【００８３】 β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）活性のための全胚染色。野生型の雌を、Ｃ
ＰＥ−ｌａｃＺを宿すトランスジェニック雄と交配させた。胚生１６日目（Ｅ１
６）には雌を屠殺し、そして胚を記載される要領で（Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．
，上述、１９９６）β−ガラクトシダーゼについて染色した。固定以前に、Ｅ１
６胚からの尾を取り出し、消化させ、そしてＰＣＲにより導入遺伝子伝達につい
て分析した。
【００８４】 ＲＴ−ＰＣＲによる発現分析。導入遺伝子発現を、ＲＴ−ＰＣＲによりアッセ
イした。全ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）
内での均一化の後に組織から単離した。まず鎖合成を、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬによ
るＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔプレ増幅キットを用いて実施した。簡潔に記載すると
、５μｇの全ＲＮＡをＤＮａｓｅ Ｉで室温で１５分間処理し、その後に２μｌ
の２５ｍＭ ＥＤＴＡの添加により不活化させ、そして６５℃になるまで１５分
間加熱した。その後、このＲＮＡを０．５μｇのオリゴｄＴに対してアニールさ
せ、そして製造業者の仕様書に従って逆転写した。このｃＤＮＡのＰＣＲ分析は
以下のプライマーセット（５’から３’方向の配列）を用いて実施した：ｔｅｔ
アクチベーター：CGCCCAGAAGCTAGGTGTAGAG（配列番号１９）およびCGGCCATATCCA
GAGCGCCG（配列番号２０）；ＭＭＰ１３＊：GCCCTCTGGCCTGCTGGCTCATG（配列番
号２１）およびCAGGAGAGTCTTGCCTGTATCCTC（配列番号２２）。得られるＰＣＲ産
物は各々８５９ｂｐおよび６４８ｂｐである。ｍＲＮＡの完全性および逆転写酵
素の効果をテストするため、各ＰＣＲ反応も以下のｃ−ｆｏｓプライマーセット
を含んでいた：5'-AGGAGGGAGCTGACAGATACACTCC-3'（配列番号２３）および5'-AG
GCCACAGACATCTCCTCTGG-3'（配列番号２４）。ＰＣＲ分析は、そのｃＤＮＡにつ
き、Ｔａｑ−ゴールド（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を９５℃で１０分間用い
、その後には９６℃で６０秒、６７℃で９０秒、および７２℃で６０秒を３５周
期繰り返すことで実施した。最後の１２分間の伸長は７２℃で実施した。反応産
物を２．０％アガロースゲルに遊走させ、そして臭化エチジウム染色により可視
化させた。
【００８５】 胚繊維芽細胞／ＲＴ−ＰＣＲ。Ｔｅｔ０７−ｌａｃＺ雌を、ＣＰＥ−ｔＴＡ導
入遺伝子とＴｅｔ０７−ＭＭＰ１３＊導入遺伝子との両方を宿すトランスジェニ
ック雄と交配させた。Ｅ１５でこれらの雌を屠殺し、そして胚から繊維芽細胞を
調製した（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６，１
９７３；Ｌｏｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２ ：５７０７，１９８４）。この繊維芽細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲ
Ｌ社）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社）内で培養した。その後に繊維芽
細胞を、所望される発現プラスミドで、リン酸カルシウム沈降法を介してトラン
スフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、全ＲＮＡを、トリゾール
（Ｔｒｉｚｏｌ）法（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社）を用いてトランスフェクトさせた
細胞から調製した。第一鎖ｃＤＮＡ合成は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔプレ増幅系
（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社）を用いて行った。ＭＭＰ１３＊発現を、ヒトＭＭＰ１
３に特異的なプライマー（GCCCTCTGGCCTGCTGGCTCATG）（配列番号２１）と（CAG
GAGAGTCTTGCCTGTATCCTC）（配列番号２２）を用いて同定した。得られるＰＣＲ
は６４８ｂｐのサイズであった。
【００８６】 免疫組織化学。二重トランスジェニック株内でのＭＭＰ１３＊の発現を、ＭＭ
Ｐ−１３に由来するタイプＩＩコラーゲン開裂断片に特異的な抗体を用いる免疫
組織化学法により更に詳しく分析した。この目的のためには関節を室温で６０分
間、中性ｐＨのＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド中に固定した。その後にこ
れらをＰＢＳで二度すすぎ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，４中で一晩
インキュベートし、そして中性ｐＨでの０．２Ｍ ＥＤＴＡ中で部分的に清澄化
させた。この試料をＴＯＣ培地に移し、そして６ｍｍの凍結切片をＨａｃｋｅｒ
／Ｂｒｉｇｈｔクリオスタットを用いて取得した。これらの切片を、タイプＩＩ
コラーゲンの変性産物中、特に３／４断片としても表示されるＴＣA変性産物中
に存在するエピトープを認識する抗体で染色した。Ｂｉｌｌｉｎｇｈｕｒｓｔら
、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：１５３４，１９９７。
【００８７】 結果 テトラサイクリンおよびそのアナログはＭＭＰ活性の阻害剤として知られてい
る。その結果、我々は飲料水に１ｍｇ／ｍｌが添加される際のＤＯＸの血清レベ
ルおよびインビトロＩＣ50を比較した。ＭＣＡ蛍光アッセイではＩＣ50＝５９．
１μＭであった一方で、血清レベルは阻害アッセイの領域（ｚｏｎｅ）を用いた
ところ２．６４μＭと測定された。これらのデータにより、血清中のＤＯＸの量
は５０％のＭＭＰ活性を阻害することができるレベルより２２．４倍低かった。
従って、ＤＯＸによる有意な阻害は存在しそうにもなかった。
【００８８】 図３Ｂは、図３Ａに説明される導入遺伝子を発現する胚生１６日目のトランス
ジェニックマウス胚のβ−ガラクトシダーゼ活性についての全載染色の写真説明
である。青色染色（矢印）がトランスジェニック動物の身体全部の関節で明らか
である一方で、非トランスジェニック野生型同腹仔では染色は全く観察されなか
った。特に、足首、膝、腰、指節骨、手首、肘、肩を含む関節および脊椎骨が導
入遺伝子の発現を示した。関節の軟骨に加え、この発生段階では骨化していない
軟骨、すなわち顔面、頭蓋、および肋の骨の内の幾つかも青色に染まった。図３
Ｃは肘と前足の腫大を示す。これらのデータにより、タイプＩＩコラーゲンプロ
モーターの発現能力が立証され、そしてこれらのデータはＭＭＰ１３＊導入遺伝
子を発現する組織（関節）を決定するのに有用である。
【００８９】 図２Ａおよび２Ｂに示される構築物を受精させたマウス胚に同時にマイクロイ
ンジェクションした。１１２匹の新生仔マウスの内、両方の導入遺伝子を宿す７
匹のトランスジェニック創始動物が同定されたが、これらのトランスジェニック
株の内の４つのみが繁殖可能であった。これらの導入遺伝子をＰＣＲにより同定
し、そして導入遺伝子特異的プローブを用いるサザンブロット（Ｓｏｕｔｈｅｒ
ｎ ｂｌｏｔ）分析により確認した（データ非公開）。Ｔａｑｍａｎ定量的ＰＣ
Ｒを用いて４つのトランスジェニック動物各々についてのコピー数に更に厳密に
評価した（データ非公開）。簡潔に述べると、導入遺伝子コピー数は、アクチベ
ーターおよびＭＭＰ１３＊については各々１〜３２および１〜２０の範囲であっ
た。特にライン６は約８コピーのｔｅｔアクチベーターおよび約３コピーのＭＭ
Ｐ１３＊導入遺伝子を含んでいた。
【００９０】 ＴＡおよびＭＭＰ１３＊導入遺伝子の発現は、まず４カ月令のマウス（ライン
６）の後ろ膝関節内で評価した。ｃ−ｆｏｓ内在性ｃＤＮＡの増幅を、各反応の
公立を立証するための対照として用いた。図４は、ＴＡ−特異的プライマーセッ
トから得られる８９０ｂｐ断片の増幅を示す。ＲＴ−ＰＣＲによりＴＡ導入遺伝
子はＤＯＸがオンおよびオフの両方でトランスジェニックマウス内で発現される
が、非トランスジェニック対照では発現されないことが示された（レーン４〜５
）。ＴＡの構成性発現が予測され、なぜならＴＡは構成的に活性なプロモーター
により稼働させられているためである。その上、ＴＡの発現は関節に限定されて
おり、そして脳、心臓、肝臓、腎臓、脾臓、もしくは骨格筋を初めとする他の組
織内ではＲＴ−ＰＣＲによってはＴＡ発現は観察されなかった（データ非公開）
。
【００９１】 図４Ｂは、ＭＭＰ１３＊特異的プライマーセットから得られる６４５ｂｐ断片
の増幅を示す。ＭＭＰ１３＊プライマーセットはヒトＭＭＰ１３に特異的であり
、そして内因性マウス相同体であるコラーゲナーゼ−１とは反応しないことに留
意されたい。ＲＴ−ＰＣＲは、ＭＭＰ１３＊が非トランスジェニック対照内では
発現されないことを示していた（レーン４〜５）。レーン６〜７は、ＤＯＸ上に
維持されるマウス内ではＭＭＰ１３＊導入遺伝子が発現されることを示す。飲料
水からＤＯＸを除去することにより有意量の発現が誘導される（レーン８〜９）
。我々は５〜１０倍の誘導であると推定している。更に、ゲル電気泳動の後、Ｐ
ＣＲ断片をナイロン膜に移し、そしてＴＡもしくはＭＭＰ１３＊特異的プローブ
にハイブリダイズさせてＰＣＲ産物の素性を確認した（データ非公開）。
【００９２】 幾つかのトランスジェニック株からの繊維芽細胞（例えば、レーン８および４
２）は、予想サイズのＰＣＲ産物の出現により証拠付けられるようにＭＭＰ１３
＊を発現することができた。ＭＭＰ１３＊ ＲＴ−ＰＣＲバンドは担体のみでト
ランスフェクトさせた細胞からは全く検出されなかった。これらの結果により、
これらのマウスではＭＭＰ１３＊導入遺伝子が染色質の転写活性領域内に組み込
まれたことが示された。
【００９３】 ドキシサイクリンからマウスを取り出して早３日目にＭＭＰ−１３開裂産物を
免疫学的に検出することができた。ドキシサイクリン無しの状態で３０日経った
後、増殖用プレートおよび関節軟骨内での染色に有意な増加が見られたが（図５
）、結果は様々なマウス株間では異なっていた（以下の表１を参照されたい）。
【００９４】
【表１】
【００９５】 実施例５：ＭＭＰ１３＊トランスジェニックマウスの表現型 材料および方法 成体トランスジェニック動物の軟骨におけるＭＭＰ１３＊活性の効果を調査す
るため、マウスを増加時間でドキシサイクリンから取り出し、この後にそのマウ
スを屠殺した。脱灰させた軟骨のパラフィン包埋ホルムアルデヒド固定切片を標
本として切り出し、そして（ｉ）ヘマトキシリンとエオジン（Ｈ＆Ｅ）、そして
（ｉｉ）サフラニン（Ｓａｆｒａｎｉｎ） Ｏの後にファストグリーンで染色し
た（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｉｓｔｏ Ｌａｂｓ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ
ＭＤ）。関節軟骨内での染色技術が記載されている（Ｐｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．
，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．７１：１９，１９９０）。
【００９６】 結果 ＭＭＰ１３＊発現を欠く対照トランスジェニック動物は、関節軟骨および膝蓋
の成長板の両方で有意量のサフラニン Ｏ染色を保持する（図６Ａ）。それとは
対照的に、ライン８からのトランスジェニック動物はドキシサイクリン除去の後
には関節でサフラニンＯ染色の有意な低減を示す。７日後、サフラニンＯ染色の
緩和な減少が膝蓋の関節軟骨に観察され（図６Ｂ）、この状態は１４日目まで進
行して行き、関節軟骨および成長板の中程度の低減にまで至る（図６Ｃ）。サフ
ラニンＯ染色の有意な低減は、足首および大腿の軟骨、ならびに手首や指節背面
を初めとする他の関節にも観察され、対照と比較するとこれらの領域ではプロテ
オグリカン濃度が減少していることが示される。
【００９７】 導入遺伝子発現に起因する関節軟骨内でのいずれかの変化を評価するためには
、ライン６からのマウスを１１４日間ＤＯＸ中で維持するかもしくはＤＯＸから
取り出すかし、そしてその関節の切片標本を作成し、そしてＨ＆Ｅで染色した。
年齢が一致する同腹仔対照と比較した際、ＤＯＸから取り出したトランスジェニ
ック動物は変形性関節炎を暗示させる病状を示した。図７Ａに示されるように対
照動物は病変もしくは他の変形関節炎症状は一切示さなかった一方で、トランス
ジェニック動物は関節軟骨に病変形成を示す（図７Ｂ）。一層具体的にはＨ＆Ｅ
切片標本は、軟骨の顕著な低減、局所侵食、骨にまで進展する侵食、および炎症
性滑膜を示す。滑膜内では、線維性壊死、異形成、滑膜細胞過形成の証拠が存在
する。変形性関節炎のこれらの症状に加え、観察された幾つかの変化はリューマ
チ性関節炎の特徴を一層強く示している。これらの変化には、赤血球細胞、単球
、およびマクロファージの浸潤により観察される血管新生が含まれる。図７Ｃお
よび７Ｄは高倍率での滑膜を示す。
【００９８】 議論 成体動物の関節軟骨で構成的に活性なヒトＭＭＰ１３を発現するトランスジェ
ニックマウスの作成が成功裏に行われている。我々は、技術のユニークな組み合
わせ、すなわちテトラサイクリン調節性遺伝子発現系と構成的に活性なＭＭＰ蛋
白質の軟骨細胞特異的発現の組み合わせにより、我々は病変形成および他の変形
性関節炎症状をもたらすトランスジェニックモデルを開発することができるよう
になったことを記載した。調節性／誘導性系を用いることにより、我々は有害な
胚効果を回避することができた一方でその成体動物内での有意なｈＭＭＰ１３＊
発現が可能となった。図３に示されるＬａｃ Ｚ染色により、タイプＩＩコラー
ゲン発現がだいたい段階Ｅ１６での発達段階中に生じ、そしてタイプＩＩコラー
ゲンが骨格の形成中に必要となることが示される。タイプＩＩコラーゲンならび
にタイプＩコラーゲンはＭＭＰ１３による蛋白質分解開裂の基質となることが知
られている。従って我々は、胚形成中のＭＭＰ１３の制御を受けない発現は致死
的となるだろうと予測した。
【００９９】 両方の導入遺伝子を含む４つのトランスジェニック株が樹立された。ｈＭＭＰ
１３＊を発現した２つの株の内一つは非常に低レベルで発現したが、一方でもう
一つの株はｈＭＭＰ１３＊を有意な量で発現した。導入遺伝子を下限に近い量で
のみ発現した株はプロテオグリカン低減の組織学的証拠を示した。しかしながら
ＤＯＸから取り出した６カ月後には病変は全く観察されなかった。ｈＭＭＰ１３
＊を有意に高い量で発現したライン６は、ＤＯＸから取り出した４カ月後には病
変形成、軟骨変性、および炎症性滑膜を示した。更に、ライン６でのｈＭＭＰ１
３＊の発現は制御可能であり、これはすなわち研究者によりスイッチオンおよび
オフの切り替えが可能であるということである。この結果により、表現型はｈＭ
ＭＰ１３＊の発現に起因し、そして染色質内での組込み部位の結果ではないこと
の追加的証拠が提供される。
【０１００】 ライン６に観察されるように、関節変性／侵食、病変、線維性壊死、異形性、
滑膜細胞過形成、および炎症性滑膜（Ｔ細胞の非存在下で）は変形性関節炎を患
う患者に観察される病状の中に含まれる。しかしながらこのトランスジェニック
動物に観察される病状全てが変形性関節炎を暗示する訳ではない。例えば、血管
新生および単球とマクロファージの浸潤は、リューマチ性関節炎に関連する炎症
過程の最中に観察される病状である。好中球が滑液内に非存在であることに留意
されたい。炎症部位への好中球の遊走はリューマチ性関節炎の顕著な特徴である
。
【０１０１】 この文書に示されるデータは、ＭＭＰ１３が変形性関節炎の発症の際の決定的
要員であることの直接的証拠を提供する。更に、この文書に記載されるトランス
ジェニック動物は、治療剤の力価を検査するための動物モデルを提供する。ＭＭ
Ｐ１３の活性を調節するか、もしくは変形性関節炎の進行を阻害する化合物を、
その疾患の進行中の様々な時期に病変形成および他のＯＡ（変形性関節炎）病状
を決定することによりモニターすることができる。ｈＭＭＰ１３＊発現のスイッ
チをオンにしたりオフにしたりする能力、従って病変産生／病変形成のタイミン
グを制御する能力は化合物力価を決定するのに有利であろう。
【０１０２】 このＯＡ様トランスジェニックモデルを用いても、連なる生物学的疑問に答え
ることができる。ＭＭＰ１３に加え、腸コラーゲナーゼ（ＭＭＰ１）および好中
球コラーゲナーゼ（ＭＭＰ８）がタイプＩＩコラーゲンを開裂することが示され
ている。従って、構成的に活性なＭＭＰ１もしくはＭＭＰ８を発現するトランス
ジェニクマウスは、その関節軟骨に類似の表現型を示すものと予想される。 実施例６：関節変性の症状の進展の増幅 ＭＭＰ−１３トランスジェニックマウスにおける疾患 以下の処置は、本発明のトランスジェニック動物により示される関節変性の症
状を増幅するために実施される。
【０１０３】 一群のトランスジェニックマウスを処理して、４〜１２週令での導入遺伝子の
発現を誘導する。誘導後２〜６週間目でマウスに、制約としてではなく、リポポ
リサッカライド（１０〜１００μｇ）、チモーザン（１〜１０ｍｇ）、スーパー
抗体ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシンＢ（Ｅｎｔ
ｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｂ）（１〜１００μｇ）、もしくはＴＧＦ−β（１〜１０μ
ｇ）を含む炎症剤を腹膜内注射する。別法では動物に、制約としてではなく、リ
ポポリサッカライド（１〜１００ｎｇ）、チモーザン（５０〜２５０μｇ）、パ
パイン（１０〜１００μｇ）、ＴＧＦ−β（０．０１〜１βｇ）、骨形態発生蛋
白質−２（Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ−２）（２〜１
０００ｎｇ）、ＩＬ−１（１〜１００ｎｇ）、ＴＧＦ−α（１０〜２００ｎｇ）
、ＩＧＦ（０．０１〜１μｇ）、もしくはＦＧＦ（０．０１〜１μｇ）を含む炎
症性もしくは軟骨細胞機能調節剤を関節内注射する。導入遺伝子が発現されない
治療法下で維持される年齢および性別が一致するトランスジェニックマウスに同
様の処理を施し、そして対照として用いる。
【０１０４】 変性性関節疾患の症状の発症を、炎症剤への露出の後の選択された時点での関
節膨張および機能の肉眼的観察により、そして関節の組織学的評価によりモニタ
ーする。
【０１０５】 これらの試薬は１週間を下回る期間の内に急性炎症応答および／またはプロテ
オグリカンの一過性低減を誘発する。急性炎症応答および／または一過性軟骨変
化は軟骨細胞中の遺伝子発現の正方向への調節を行い、導入遺伝子の発現を亢進
させ、そして産生されるＭＭＰ−１３のレベルを増大させる。
【０１０６】 先に記載される全ての特許、適用法、記事、刊行物、および検査法は、その全
体が引用により本明細書に取り込まれる。
【０１０７】 先の詳細な記述を参照することで本発明の多くの変法が当業者には自明となる
であろう。こうした明らかな変法は添付される特許請求項の範囲に含まれる。
【０１０８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１Ａおよび１Ｂ】 （Ａ）ヒトＭＭＰ−１３（コラーゲナーゼ−３）の構造の簡略図。最初の四角
（アミノ末端の先端に対応する）は、分泌のための、未完成プロＭＭＰ−１３を
標的とするプレドメイン（シグナルペプチド）を表す。二番目の四角はプロトメ
インを表し、これは酵素の潜伏性の維持にかかわる。酵素の潜伏性を維持するの
に重要となるプロドメイン内の保存配列（配列番号１）が示される。三番目の四
角は１７０アミノ酸からなる触媒ドメインを表し、これは触媒活性にとって重要
となる保存領域（配列番号２に示される）を含む。四番目の四角は２００アミノ
酸からなるカルボキシル末端ドメインを表す。（Ｂ）ＭＭＰ−１３＊と表示され
るヒトプロＭＭＰ−１３の構成的に活性な変異体をコードする核酸配列（配列番
号３）およびＭＭＰ−１３＊のアミノ酸配列（配列番号４）の詳細な説明。野生
型ＭＭＰ−１３と比較すると突然変異を受けており、大きめの活字で示してある
残基はヌクレオチド位置２９９〜３０１のＧＴＣである。
【図２Ａおよび２Ｂ】 軟骨細胞に特異的でドキシサイクリン（ＤＯＸ）により調節を受けるＭＭＰ−
１３＊発現を取得するための二元戦略。（Ａ）第一構築物は、ＳＶ４０スプライ
スおよびポリアデニル化シグナルがその後に続いているテトラサイクリンレプレ
ッサー−ＶＰ１６アクチベーター融合蛋白質（ＴＡ）の発現を稼働させるラット
タイプＩＩコラーゲンプロモーターを説明する（この構築物はＣＰＥ−ＴＡとし
て引用される）。（Ｂ）第二構築物は、ＳＶ４０スプライスおよびポリアデニル
化シグナルがその後に続いていて、構成的に活性なヒトＭＭＰ１３蛋白質の発現
を稼働させるＴｅｔ０７プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ ａｎｄ Ｂｕｊａｒｄ、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７、１９９２）
を説明する（この構築物はＴｅｔ０７−ＭＭＰ１３＊として引用される）。これ
ら２つの独立した導入遺伝子構築物を受精させたマウス胚内に同時にマイクロイ
ンジェクションにより注入して両方の遺伝子を宿す二重トランスジェニックを作
成した。ＤＯＸの存在下では導入遺伝子発現スイッチはオフになっており；ＤＯ
Ｘを除去する際に導入遺伝子発現のスイッチが入る。矢印は転写開始部位を示し
、一方で星印はＭＭＰ１３導入遺伝子内の構成的に活性な突然変異を示す。
【図３Ａおよび３Ｂ】 タイプＩＩコラーゲン遺伝子プロモーターは、ラットのタイプＩＩコラーゲン
プロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼを発現する試験用トランスジェニ
ックマウスの関節に対する発現を指令する。（Ａ）ＣＰＥ−ｌａｃＺ構築物の略
図。ラットのタイプＩＩコラーゲンプロモーター（最初の四角）はβ−ガラクト
シダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子（二番目の四角）の発現を指令し、この遺伝子の後
にβ−グロビンスプライスおよびポリアデニル化シグナル（スプライス記号で接
続されている最後の四角）が続く。（Ｂ）Ｅ１６胚でのβ−ガラクトシダーゼに
ついての全載染色。左側の胚は、野生型胚と比較したトランスジェニックマウス
の染色状態（矢印）を示す。（Ｃ）トランスジェニックマウスの肘および前足を
高倍率で示す；β−ｇａｌ染色が肉眼で確認できる（矢印）。図３Ｂおよび３Ｃ
はカラー表示にすると一層明白に本発明を説明するが、白黒表示でも本発明を理
解するには十分である。
【図４Ａおよび４Ｂ】 ＲＴ−ＰＣＲによるＴＡおよびＭＭＰ１３ＲＮＡの発現の概略。（Ａ）全ＲＮ
ＡからのＴＡ ｃＤＮＡの増幅。（Ｂ）全ＲＮＡからのＭＭＰ１３＊ ｃＤＮＡ
の増幅。レーン１：φｘ１６４ＨａｅＩＩＩＭＷマーカー；レーン２：トランス
ジェニックマウスの（レーン６）ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅；レーン３：非トラ
ンスジェニックマウスのゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅；レーン４：ＤＯＸ存在下に
維持した野生型マウス；レーン５：ＤＯＸを除去したした野生型マウス；レーン
６〜７；ＤＯＸ存在下に維持するトランスジェニックマウス（〜４カ月）；レー
ン８〜９：出生時にＤＯＸから取り出したトランスジェニックマウス（〜４カ月
）。矢印１ａおよび１ｂは６４８ｋｂのＭＭＰ１３＊特異的断片および８５９ｂ
ｐの特異的断片をそれぞれ示す。各反応は内部対照としてのｃ−ｆｏｓプライマ
ーを用いて行い、スプライシングを受けたｍＲＮＡからは１８７ｂｐ（矢印３）
が、そしてスプライシングを受けないｍＲＮＡからは３０３ｂｐ（矢印２）がも
たらされた。ＲＴでの処理を行わなかったＰＣＲについてはＲＮＡを含む対応レ
ーン内にバンドは検出されなかった（データ非公開）。
【図５Ａおよび５Ｂ】 図２に示される導入遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの成長板と関
節軟骨内でのタイプＩＩコラーゲン開裂産物の免疫組織化学的局在化の写真によ
る説明。これらの組織はタイプＩＩコラーゲンの開裂産物を認識する抗体で染色
した。（Ａ）ＭＭＰ−１３＊発現を抑制するようにドキシサイクリン存在下に維
持してあるマウスに由来する組織。（Ｂ）３カ月令で３０日間、ドキシサイクリ
ンから取り出してＭＭＰ−１３＊の発現を行わせたマウスに由来する組織。図５
ＡおよびＢはカラー表示にすると一層明白に本発明を説明するが、白黒表示でも
本発明を理解するには十分である。
【図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃ】 二重トランスジェニックマウスの膝蓋骨の関節軟骨および成長板のサフラニン
（Ｓａｆｒａｎｉｎ）Ｏ染色のカラー写真による説明。（Ａ）ドキシサイクリン
存在下に維持したマウスに由来する組織。（Ｂ）ドキシサイクリンから取り出し
た後７日目のマウスに由来する組織。（Ｃ）ドキシサイクリンから取り出した後
１４日目のマウスに由来する組織。図６Ａ−Ｃはカラー表示にすると一層明白に
本発明を説明するが、白黒表示でも本発明を理解するには十分である。
【図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、および７Ｄ】 後膝関節（ＡとＢ）および滑膜（ＣおよびＤ）を通過する縦方向切片。（Ａと
Ｃ）同年齢同腹仔対照、および（ＢとＤ）ＤＯＸから取り出したライン６。略語
：Ｌ、病変；ＡＣ、関節軟骨；ＡＧ、血管新生、ＩＨ、浸潤性過形成；ＢＭ、骨
髄；およびＰＬ、膝蓋靭帯。大腿と膝蓋とに図ではラベルをつけてある。図７Ａ
−Ｄはカラー表示にすると一層明白に本発明を説明するが、白黒表示でも本発明
を理解するには十分である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年１月１８日（２０００．１．１８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/10 9/64 Ｚ 9/64 5/00 Ａ 15/09 ＺＮＡ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA07 BA14 CA04 DA02 EA04 FA02 GA11 GA18 HA12 4B050 CC03 DD11 LL03 4B065 AA90X AA90Y AB01 AC14 BA02 BA04 CA24 CA43 4C084 AA17 MA01 NA14 ZA962 ZB152

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 酵素的に活性なマトリックス分解酵素を含むポリペプチドを
    コードする組換え遺伝子を安定に組み込んだ形態で含む体細胞および生殖細胞を
    有するトランスジェニック非ヒト哺乳類もしくはその子孫であって、前記組換え
    遺伝子が前記哺乳類の軟骨細胞で選択的に発現され、そして前記発現により軟骨
    変性疾患に特有の病理学的症状がもたらされるトランスジェニック非ヒト哺乳類
    もしくはその子孫。
  2. 【請求項２】 ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ
    −８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５
    、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１７、および酵素的に活性なそれらの変異体からなる
    群より選択されるポリペプチドをコードする安定に組み込まれた第一組換え遺伝
    子を含む体細胞および生殖細胞を有するトランスジェニック動物もしくはその子
    孫。
  3. 【請求項３】 前記第一組換え遺伝子が前記動物の滑膜軟骨細胞で選択的に
    発現される請求項２に記載されるトランスジェニック動物。
  4. 【請求項４】 前記第一組換え遺伝子がＭＭＰ−１３をコードする、請求項
    ２に記載されるトランスジェニック動物。
  5. 【請求項５】 前記ＭＭＰ−１３がヒトである、請求項４に記載されるトラ
    ンスジェニック動物。
  6. 【請求項６】 前記第一組換え遺伝子が酵素的に活性なプロＭＭＰ−１３を
    含む変異体ＭＭＰ−１３ポリペプチドをコードする、請求項４に記載されるトラ
    ンスジェニック動物。
  7. 【請求項７】 前記組換え遺伝子が配列番号１に示されるＭＭＰ−１３をコ
    ードする配列を含む、請求項６に記載されるトランスジェニック動物。
  8. 【請求項８】 前記動物が、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ヤギ
    、およびブタからなる群より選択される、請求項２に記載されるトランスジェニ
    ック動物。
  9. 【請求項９】 前記動物がマウスである、請求項８に記載されるトランスジ
    ェニック動物。
  10. 【請求項１０】 前記組換え遺伝子の発現が第一調節性プロモーターの調節
    下におかれる、請求項２に記載されるトランスジェニック動物。
  11. 【請求項１１】 前記第一調節性プロモーターがｔｅｔＯ７を含む、請求項
    １０に記載されるトランスジェニック動物。
  12. 【請求項１２】 前記プロモーターが配列番号２に記載される配列を有する
    、請求項１１に記載されるトランスジェニック動物。
  13. 【請求項１３】 前記第一プロモーターを調節するポリペプチドをコードす
    る第二組換え遺伝子を更に含む、請求項１０に記載されるトランスジェニック動
    物。
  14. 【請求項１４】 前記第二組換え遺伝子が第二調節性プロモーターの制御下
    におかれる、請求項１２に記載されるトランスジェニック動物。
  15. 【請求項１５】 前記第二調節性プロモーターが、関節組織内での前記第二
    組換え遺伝子の選択的発現をもたらすタイプＩＩコラーゲンプロモーターに由来
    する配列を含む、請求項１３に記載されるトランスジェニック動物。
  16. 【請求項１６】 （ｉ）ＭＭＰ−１３＊を含む変異体ＭＭＰ−１３ポリペプ
    チドをコードする配列を含む第一組換え遺伝子（ここで、前記配列はｔａｔＯ７
    プロモーターに操作可能に連結されている）；および （ｉｉ）タイプＩＩコラーゲンプロモーターに由来する配列に操作可能に連結
    されているｔＴＡ蛋白質をコードする第二組換え遺伝子、 を安定に組み込まれた形態で含む体細胞および生殖細胞を有するトランスジェニ
    ックマウスもしくはその子孫。
  17. 【請求項１７】 関節組織内での前記組換え遺伝子の発現が関節変性疾患に
    特有の病理学的症状をもたらす、請求項１６に記載されるトランスジェニックマ
    ウス。
  18. 【請求項１８】 酵素的に活性なプロＭＭＰ−１３をコードする単離された
    核酸であって、前記核酸が、配列番号１に記載される配列、その配列保存性突然
    変異体、およびその機能保存性突然変異体からなる群より選択される配列を有す
    る核酸。
  19. 【請求項１９】 請求項１８に記載される核酸を含む組換えクローニングベ
    クター。
  20. 【請求項２０】 請求項１９に記載されるベクターを含む宿主細胞。
  21. 【請求項２１】 請求項２０に記載される細胞を、前記酵素的に活性なプロ
    ＭＭＰ−１３の発現に適する条件下で培養することを含む、ポリペプチドを産生
    するための方法。
  22. 【請求項２２】 ある哺乳類において軟骨変性疾患に関連する表現型変化を
    もたらすための方法であって、請求項１に記載される哺乳類を、前記組換え遺伝
    子が前記哺乳類の関節組織内で選択的に発現される条件下で維持することを含む
    方法。
  23. 【請求項２３】 ある哺乳類において軟骨変性疾患に関連する表現型変化を
    もたらすための方法であって、請求項２に記載される哺乳類を、前記組換え遺伝
    子が前記哺乳類の関節組織内で選択的に発現される条件下で維持することを含む
    方法。
  24. 【請求項２４】 あるマウスにおいて軟骨変性疾患に関連する表現型変化を
    もたらすための方法であって、請求項１６に記載されるマウスを、テトラサイク
    リンもしくは生物学的に活性なそのアナログの非存在下であらかじめ決定された
    時間維持することを含む方法。
  25. 【請求項２５】 ある組成物が軟骨変性疾患を中和する可能性を決定するた
    めの方法であって、 （ｉ）その組成物の既知の用量を請求項１に記載されるトランスジェニック動
    物に、軟骨変性疾患に関連する表現型指標が発現される条件下で投与すること； （ｉｉ）軟骨変性疾患の表現型指標の発症を、その組成物の投与の後のあらか
    じめ決定された時間モニターすること；および （ｉｉｉ）その組成物を投与した動物内での表現型指標の程度を、その組成物
    に対して露出されていない対照トランスジェニック動物と比較すること（ここで
    、表現型指標の性質もしくは程度におけるいずれかの違い、または表現型指標が
    発症するのに必要とされる時間のいずれかの違いは、その組成物が軟骨変性疾患
    を中和する可能性を示すものである）： を含む方法。
  26. 【請求項２６】 ある組成物が軟骨変性疾患を中和する可能性を決定するた
    めの方法であって、 （ｉ）請求項１６に記載されるトランスジェニック動物をあらかじめ決定され
    た時間、テトラサイクリンもしくはテトラサイクリンアナログの非存在下で維持
    すること（ここで、前記維持することが前記動物内での軟骨変性疾患の一つもし
    くは複数の表現型指標の出現をもたらすものである）； （ｉｉ）その動物に前記組成物の既知の用量を投与すること； （ｉｉｉ）前記表現型指標の発症を、その組成物の投与後のあらかじめ決定さ
    れた時間モニターすること；および （ｉｉｉ）その組成物を投与した動物内での表現型指標の程度を、その組成物
    に対して露出されていない対照トランスジェニック動物と比較すること（ここで
    、表現型指標の性質もしくは程度におけるいずれかの違いは、その組成物が軟骨
    変性疾患を中和する可能性を示すものである）： を含む方法。
  27. 【請求項２７】 ある組成物が軟骨変性疾患を中和する可能性を決定するた
    めの方法であって、 （ｉ）請求項１６に記載され、前記第一組換え遺伝子の発現を抑制するための
    テトラサイクリンもしくはテトラサイクリンアナログの存在下で維持されている
    トランスジェニック動物を提供すること； （ｉｉ）実質的に同時に（ａ）前記動物に前記組成物の既知の用量を投与し、
    そして（ｂ）前記テトラサイクリンを回収すること； （ｉｉｉ）軟骨変性疾患の表現型指標の程度を、その組成物の投与後のあらか
    じめ決められた時間モニターすること；および （ｉｖ）その組成物を投与した動物内での表現型指標の程度を、その組成物に
    対して露出されていない対照トランスジェニック動物と比較すること（ここで、
    表現型指標の性質もしくは程度におけるいずれかの違い、または表現型指標が発
    症するのに必要とされる時間のいずれかの違いは、その組成物が軟骨変性疾患を
    中和する可能性を示すものである）： を含む方法。
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