JP2002522080A

JP2002522080A - プロテアーゼコード配列またはその阻害剤を含むｄｎａ構築物

Info

Publication number: JP2002522080A
Application number: JP2000565143A
Authority: JP
Inventors: グリーンランド，アンドリュー・ジェームズ; ジェプソン，イアン; トマ，ディディエ・ルネ・フィリップ
Original assignee: Syngenta Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1998-08-17
Filing date: 1999-08-16
Publication date: 2002-07-23
Also published as: ID25990A; HUP0103208A3; CA2335647A1; GB9817909D0; AU5432899A; EP1104474A1; CN1313902A; IL141305A0; AR020208A1; BR9913047A; US20010049833A1; HUP0103208A2; WO2000009708A1; AU763069B2; MXPA01001838A

Abstract

(57)【要約】ａ）外因性誘導因子の存在または非存在に反応する誘導性プロモーター配列、あるいは生物の選択された組織において、または発生の選択された段階で、遺伝子発現を開始することが可能な発生遺伝子プロモーターのいずれかを含む、第一のＤＮＡ配列；ｂ）プロテアーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列を含み、（ａ）で特定されたプロモーター配列に作用可能であるように連結されそして該プロモーター配列の調節下にある、第二のＤＮＡ配列；を含み、それにより、（ａ）で特定された外因性誘導因子の存在または非存在あるいは発生遺伝子プロモーターの活性化が、前記プロテアーゼ酵素の発現を生じる，単離ＤＮＡ構築物。これらの構築物は、好ましくは、さらなる要素の存在により、可逆的となる。これらを、細胞機能の混乱、老化の調節および貯蔵タンパク質の代謝の修飾のため、植物または哺乳動物細胞において、用いてもよい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、植物および哺乳動物細胞の形質転換に使用するためのＤＮＡ構築物
に関する。特に、本発明は、細胞機能を乱す（ｄｉｓｒｕｐｔ）ことを可能にす
る、そして所望により細胞機能の混乱（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）を逆転させる（
ｒｅｖｅｒｓｅ）ためのＤＮＡ構築物に関する。本発明はまた、植物において、
老化（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）の過程を遅らせるまたは阻害することを可能にす
るＤＮＡ構築物にも関する。

【０００２】本発明のさらなるＤＮＡ構築物は、植物の出来栄え（ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ
）または収量を改善するため、タンパク質代謝、特に貯蔵タンパク質の代謝の過
程を修飾することを可能にする。こうした構築物を用い、収穫前の出芽（ｓｐｒ
ｏｕｔｉｎｇ）を妨げるのに必要とされるように、種子の発芽（ｇｅｒｍｉｎａ
ｔｉｏｎ）を遅らせることが可能である。

【０００３】本発明のＤＮＡ構築物は、したがって、細胞機能（ｃｅｌｌｆｕｎｃｔｉｏ
ｎ）に必要とされるタンパク質を阻害することが可能である、あるいは老化また
は発芽を調節するおよび／またはタンパク質代謝、特に貯蔵タンパク質の代謝を
調節するＤＮＡ配列を利用する。前駆体タンパク質をコードするものなどのＤＮ
Ａ配列は、本発明において有用である。

【０００４】プレプロ酵素（ｐｒｅ−ｐｒｏ−ｅｎｚｙｍｅ）またはプロ酵素前駆体タンパ
ク質（ｐｒｏ−ｅｎｚｙｍｅｐｒｅｃｕｒｓｏｒｐｒｏｔｅｉｎ）を有する
タンパク質は、本発明において特に有用である。こうした前駆体タンパク質を有
するタンパク質の例には、プロテアーゼ酵素が含まれる。こうしたプロテアーゼ
の１つはシステインプロテアーゼである。システインプロテアーゼ（ＣＰ）は、
植物（Ｐｒａｅｋｅｌｔら、１９８８；Ｇｏｅｔｔｉｎｇ−Ｍｉｎｅｓｋｙおよ
びＭｕｌｌｉｎ、１９９４）、動物（Ｗｉｅｄｅｒａｎｄｅｒｓら、１９９２）
および原生動物（Ｍａｌｌｉｎｓｏｎら、１９９４）における大きな多遺伝子フ
ァミリー（ｍｕｌｔｉｇｅｎｅｆａｍｉｌｙ）のメンバーである。システイン
プロテアーゼは不活性前駆体として合成される（Ｐｒａｅｋｅｌｔら、１９８８
）。プレプロ酵素は、分泌経路（ｓｅｃｒｅｔｏｒｙｐａｔｈｗａｙ）に標的
化され（Ｍａｒｔｔｉｌａら、１９９５）、そしてプロペプチド断片のタンパク
質分解的切断により、液胞において転写後プロセシングされ、活性酵素を生じる
（Ｈａｒａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９９３および１９９４）。

【０００５】植物システインプロテアーゼは、生理学的に重要な、種々の代謝事象に関与す
る。種子発芽中および植物老化中、これらはタンパク質分解に関与し（Ｊｏｎｅ
ｓら、１９９５；Ｖａｌｐｕｅｓｔａら、１９９５；Ｓｍａｒｔら、１９９５）
、そして発芽中の貯蔵タンパク質の動員（ｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ）に重要な
役割を果たす（ＢｏｙｌａｎおよびＳｕｓｓｅｘ、１９８７）。種子発生（ｓｅ
ｅｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）中、システインプロテアーゼは、タンパク質前
駆体のその成熟型への翻訳後プロセシング（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｎａ
ｌｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を触媒する（Ｈａｒａ−Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１
９９５）。その上、いくつかはジベレリン酸（ＫｏｅｈｌｅｒおよびＨｏ、１９
９０；Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９１）またはエチレン（Ｃｅｒｖａｎｔｅｓら
、１９９４；Ｊｏｎｅｓら、１９９５）いずれかによるホルモン制御（ｈｏｒｍ
ｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）に供される。他のものは、外傷（Ｌｉｎｔｈ
ｏｒｓｔら、１９９３；Ｌｉｄｇｅｔｔら、１９９５）、脱水（Ｇｕｅｒｒｅｒ
ｏら、１９９０）、寒気（ＳｃｈａｆｆｅｒおよびＦｉｓｃｈｅｒ、１９８８）
のようなストレスに反応して誘導され、または植物・微生物相互作用（Ｇｏｅｔ
ｔｉｎｇ−ＭｉｎｅｓｋｙおよびＭｕｌｌｉｎ、１９９４）に関連する。

【０００６】発芽特異的システインプロテアーゼは、オオムギ（ｂａｒｌｅｙ）（Ｍａｒｔ
ｔｉｌａら、１９９５）、コメ（ｒｉｃｅ）（Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９１）
、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）（ＤｅｂａｒｒｏｓおよびＬａｒｋｉｎｓ、１９
９４）、ヒヨコマメ（ｃｈｉｃｋ−ｐｅａ）（Ｃｅｒｖａｎｔｅｓら、１９９４
）、ソラマメ属（ｖｅｔｃｈ）（Ｂｅｃｋｅｒら、１９９４）に関し、性質決定
されてきており、そしてシステインプロテアーゼは、アブラナ（ｏｉｌｓｅｅ
ｄｒａｐｅ）（ＣｏｍａｉおよびＨａｒａｄａ、１９８９）に関し、記載され
てきている。

【０００７】Ｔａｙｌｏｒら、１９９５（Ｔａｉｌｏｒｅｔａｌ．，１９９５）は、
タンパク質分解酵素のｉｎｖｉｔｒｏ研究を記述する。システインプロテアー
ゼファミリーのメンバーを含む、いくつかのプロテアーゼが記載されている。大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で産生されたパパインおよびパパイヤ（ｐａｐａｙａ）プ
ロテアーゼＩＶの組換えプロ領域（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｒｅｇｉｏ
ｎｓ）は、４つの天然に存在するパパイヤ・システインプロテアーゼの特異的で
迅速な結合阻害剤として作用することが可能である。プロテアーゼ前駆体におけ
る切断可能な「プロ（ｐｒｏ）」領域は、プロテアーゼ活性を阻害するだけでな
く、フォールディング（ｆｏｌｄｉｎｇ）を補助するよう機能することが証拠に
よって教示されている。大腸菌で発現された組換えプロペプチドは、ナノモル範
囲でその同種の（ｃｏｇｎａｔｅ）プロテアーゼの選択的阻害剤となることが見
出された一方、試験した他のプロテアーゼは、１０マイクロモルまでのプロペプ
チドの存在により、影響を受けなかった（Ｖｏｌｋｅｌら、１９９６）。しかし
、こうしたプロテアーゼのいかなる使用の教示も示唆もなく、かつ本発明のＤＮ
Ａ構築物のいかなる教示もない。

【０００８】生物（ｏｒｇａｎｉｓｍ）において、可逆的な細胞の混乱、老化および貯蔵タ
ンパク質代謝などの機能を調節する方法を提供することが望ましい。したがって、本発明は：ａ）外因性誘導因子（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｉｎｄｕｃｅｒ）の存在または非存
在（ａｂｓｅｎｓｅ）に反応する（ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）誘導性プロモーター
（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｐｒｏｍｏｔｏｒ）配列、あるいは生物の選択された組
織において、または発生の選択された段階で、遺伝子発現を開始することが可能
な発生遺伝子プロモーターのいずれかを含む、第一のＤＮＡ配列；ｂ）プロテアーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列を含み、（ａ）で特定されたプロ
モーター配列に作用可能であるように（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結されそして該プ
ロモーター配列の調節下にある、第二のＤＮＡ配列；を含み、それにより、（ａ）で特定された外因性誘導因子の存在または非存在あるいは発
生遺伝子プロモーターの活性化が、前記プロテアーゼ酵素の発現を生じる、ＤＮＡ構築物を提供する。

【０００９】プロモーター活性を調節するための外因性誘導因子の使用は周知である。プロ
モーターは、多様な要因、例えば環境条件、害虫または病原体の存在あるいは化
学薬品の存在により刺激することが可能である。特に、適切な誘導性プロモータ
ーは、外因性誘導因子が化学薬品であるように、外因性化学薬品刺激（ｅｘｏｇ
ｅｎｏｕｓｃｈｅｍｉｃａｌｓｔｉｍｕｌｕｓ）により誘導される。外因性
化学薬品刺激は、農業上許容しうる化学薬品であり、該化学薬品の使用は農業の
実施（ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｐｒａｃｔｉｃｅ）に適合し、そして植物ま
たは哺乳動物に有害でないことが好ましい。

【００１０】誘導性プロモーターは、最も好ましくは、誘導性スイッチプロモーター系（ｉ
ｎｄｕｃｉｂｌｅｓｗｉｔｃｈｐｒｏｍｏｔｏｒｓｙｓｔｅｍ）、例えば
、我々の国際公開公報第ＷＯ９３／２１３３４号に記載されているａｌｃＡ／
ａｌｃＲ遺伝子スイッチプロモーター系などの二構成要素系（ｔｗｏｃｏｍｐ
ｏｎｅｎｔｓｙｓｔｅｍ）、我々の国際公開公報第ＷＯ９６／３７６０９号
に記載されているようなエクジソン（ｅｃｄｙｓｏｎｅ）スイッチ系または国際
特許出願公開公報第ＷＯ９０／０８８２６号および第ＷＯ９３／０３１２９
４号に記載されているようなＧＳＴプロモーターを含み、前記文献の教示内容は
本明細書に援用される。こうしたプロモーター系は、本明細書において、「スイ
ッチプロモーター（ｓｗｉｔｃｈｐｒｏｍｏｔｏｒｓ）」と称される。スイッ
チプロモーターと関連して用いられるスイッチ化学薬品は、農業上許容しうる化
学薬品であり、本発明の方法において、本系を特に有用にしている。

【００１１】同様に、発生特異的プロモーター（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｐｅｃｉｆｉ
ｃｐｒｏｍｏｔｏｒｓ）もまた周知である。例えばいくつかのプロモーター、
例えばリンゴ酸シンターゼ（ＭＳ）プロモーター（Ｇｒａｈａｍら，１９９０
，ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ．１５，５３９−５４９、Ｃｏｍａｉら
，１９９２，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．，９８，５３−６１を参照
されたい）は植物において、初期実生発生（ｅａｒｌｙｓｅｅｄｌｉｎｇｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）中、活性である。さらなる例には、ＷＯ９７／３５９
８３に記載されるもののようなシステインプロテアーゼプロモーター自体のプロ
モーターが含まれる。あるいは、グリオキシソーム（ｇｌｙｏｘｙｓｏｍｅ）中
の遺伝子、例えばイソクエン酸リアーゼ由来の植物発生プロモーター、およびア
リューロン層（ａｌｅｕｒｏｎｅｌａｙｅｒ）中の遺伝子、例えばα−アミラ
ーゼ類由来のプロモーター（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅら（１９８７）Ｍｏｌ．＆ＧｅｎＧｅｎｅｔ．２０９，３３−４０）がある。胚盤遺伝子プロモータ
ー（ｓｃｕｔｅｌｌｕｍｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｏｒｓ）、例えばカルボキシ
ペプチダーゼのものまたはジャーミン（ｇｅｒｍｉｎ）遺伝子由来のプロモータ
ー（Ｌａｎｅら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１０４６
１）もまた、植物の発生における特定の段階で活性であるプロモーターを含む可
能性がある。

【００１２】発生の選択された時期に活性であるプロモーターはまた、慣用法を用い、例え
ば選択された発生段階で生物から採取したＲＮＡに対し逆転写酵素ポリメラーゼ
連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）戦略を適用し、そしてＲＮＡブロット解析を用い、異
なる発生段階の細胞から採取したＲＮＡとこれらを比較することにより、単離し
てもよい。これらの配列をその後、慣用的に同定し、そして配列決定し、そして
プロモーター配列を決定してもよい。本発明の特定の適用に関しては、以下に記
載されるように、老化で誘導されるプロモーターを用いる。

【００１３】組織特異的プロモーターもまた、当該技術分野において公知であり、または類
似の方法を用い、単離することが可能である。既知の組織特異的プロモーターの
例には、葯および／またはタペータム（ｔａｐｅｔｕｍ）特異的プロモーターま
たは花粉特異的プロモーターが含まれる。他のこうしたプロモーターは、特に、
国際特許出願公開公報第ＷＯ９０／０８８２６号に記載されている技術を用い
ることにより、単離することが可能である。

【００１４】本明細書において用いられている「プロテアーゼ酵素（ｐｒｏｔｅａｓｅｅ
ｎｚｙｍｅ）」という用語は、プロテアーゼ活性を有するという条件で、天然に
存在するプロテアーゼ酵素またはその断片あるいはこれらのいずれかの変異体を
指す。

【００１５】本明細書において用いられている「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は
、本明細書において、実験的に生成された変異体または分子遺伝学的技術により
同定することが可能であるような、天然に存在する関連するペプチドのファミリ
ーのメンバーを含む。こうした技術は、例えば、米国特許第５，６０５，７９３
号、米国特許第５，８１１，２３８号および米国特許第５，８３０，７２１号に
記載され、前記特許の内容は本明細書に援用される。本質的に、本技術は、大腸
菌などの微生物発現系における親遺伝子（ｐａｒｅｎｔａｌｇｅｎｅ）の発現
を伴う。選択される特定の系は、生物学的に活性があるペプチドが発現されてい
ることを確実にするため、立証し、そして較正しなければならず、これはｉｎｖｉｖｏバイオアッセイを用い、容易に達成することが可能である。遺伝子、ま
たは好ましくは異なる種由来の関連遺伝子のコレクションは、当該技術分野にお
いて公知であるような、突然変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｉｃ）ポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）を受けやすいかもしれない。ＰＣＲを用いた産物の断片化および
それに続く修復は、親変異体から再構築される一連のキメラ遺伝子を生じる。こ
れらのキメラをその後、微生物系において発現し、該系を通常の方法でスクリー
ニングし、活性突然変異体を決定することができ、その後、該変異体を単離しそ
して配列決定してもよい。この分子進化ＤＮＡシャッフリング周期（ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎＤＮＡｓｈｕｆｆｌｉｎｇｃｙｃｌｅ）の
反復は、望ましい遺伝子特性の進行性の亢進（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｅｎｈ
ａｎｃｅｍｅｎｔ）を導くことが可能である。この性質の技術の利点は、該技術
が多突然変異ブロック交換（ｍｕｌｔｉ−ｍｕｔａｔｉｏｎｂｌｏｃｋｅｘ
ｃｈａｎｇｅｓ）を含む、広い範囲の異なる突然変異を産生しそしてスクリーニ
ングするのを可能にすることである。

【００１６】他の変異体は、例えば分子進化技術（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｏｌｕｔｉｏ
ｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）を用い、実験的に生成されるものである。好ましく
は、こうした変異体は、天然の配列に比べ、改善された活性または機能を有する
であろう。適切な改善は、タンパク質の固有の比活性に関連する可能性があり、
または安定性などの物理的特性を改変することによる可能性がある。

【００１７】他の変異体は、バイオインフォマティクス系（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ
ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、同定しまたは定義することが可能である。こうした
系の例は、Ｗ．Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＤ．Ｊ．ＬｉｐｍａｎＰＮＡＳ
（１９８８）８５：２４４４−２４８８のＦＡＳＴＡ法である。本方法は、タン
パク質配列を比較し、類似性のレベルを検出する迅速でかつ容易な方法を提供し
、そして分子生物学者により用いられる、標準的なツールである。こうした類似
配列は、天然配列から、分子進化を通じ、または合成法により、得ることが可能
であり、そして本方法を用い、比較を行い、タンパク質の間の類似性のレベルの
指標である「選択スコア（ｏｐｔｓｃｏｒｅｓ）」に到達することが可能であ
る。

【００１８】これらの制約を念頭に置き、当業者は、例えば、天然に存在するプロテアーゼ
酵素に基づくが、ＦＡＳＴＡ選択スコア範囲の制限内で修飾されたプローブまた
はプライマーを設計することにより、ペプチドのファミリーの他のメンバーを単
離することが可能であろう。その後、これらのプローブを用い、類似の活性を持
つ他の酵素を単離するため、慣用法を用い、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノム
ライブラリーなどのライブラリーをスクリーニングしてもよい。これらのスクリ
ーニング実験中に、用いられるハイブリダイゼーション条件は、低または高スト
リンジェンシーいずれかであり、好ましくは当該技術分野において日常的に用い
られるような高ストリンジェンシー条件である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋらによ
る“ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａ
ｎｕａｌ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，ニューヨークを参照されたい）。一般的な条件において、低スト
リンジェンシー条件は、約室温ないし約６５℃での３ｘＳＳＣと定義し、そ
して高ストリンジェンシー条件は、約６５℃での０．１ｘＳＳＣと定義して
もよい。ＳＳＣは、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸三ナト
リウムの緩衝液の名称である。例えば、３ｘＳＳＣは１ｘＳＳＣより３
倍強い。

【００１９】他のファミリーメンバーを発見したら、これもまた、その特性を改善するため
、本明細書に記載されるような分子進化技術またはＤＮＡシャッフリングに供し
てもよい。この方法で得られたすべてのペプチドは、変異体と見なすべきである
。

【００２０】第二の側面において、本発明は、上述のようなＤＮＡ構築物を含む植物生殖質
（ｐｌａｎｔｇｅｒｍｐｌａｓｍ）を提供する。調節可能な方式でのプロテアーゼ酵素の発現は、多様な目的のため、用いても
よい。例えば、これらを用い、細胞機能を乱してもよく、これは例えばＷＯ９
０／０８８３０において記載されるように、例えば雄性不稔植物（ｍａｌｅｓ
ｔｅｒｉｌｅｐｌａｎｔｓ）の産生に適用を見出す可能性がある。好ましくは
、このような場合、細胞機能の混乱は可逆性である。これは、この場合、プロテ
アーゼ酵素を乱すタンパク質を調節可能に発現することにより、タンパク質レベ
ルで達成することが可能である。

【００２１】したがって、本発明の第三の側面にしたがい：ａ）外因性誘導因子の存在または非存在に反応する誘導性プロモーター配列、あ
るいは生物の選択された組織において、または発生の選択された段階で、遺伝子
発現を開始することが可能な発生遺伝子プロモーター（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ａｌｇｅｎｅｐｒｏｍｏｔｏｒ）のいずれかを含む、第一のＤＮＡ配列；ｂ）細胞機能を乱すことが可能なプロテアーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列を含
み、（ａ）で特定されたプロモーター配列に作用可能であるように連結されそし
て該プロモーター配列の調節下にある、第二のＤＮＡ配列；ｃ）外因性誘導因子の存在または非存在に反応するプロモーター配列、あるいは
生物の選択された組織において、または発生の選択された段階で、遺伝子発現を
開始することが可能な発生遺伝子プロモーターを含む、第三のＤＮＡ配列；およ
びｄ）その産物が（ｂ）で特定されたタンパク質を阻害することが可能である、Ｄ
ＮＡ配列を含み、（ｃ）で特定されたプロモーター配列に作用可能であるように
連結されそして該プロモーター配列の調節下にある、第四のＤＮＡ配列を含み、それにより、（ａ）で特定された外因性誘導因子の存在または非存在あるいは発
生遺伝子プロモーターの発現が、細胞機能を乱すことを可能にし、そしてそれに
より（ｃ）で特定された外因性誘導因子の存在または非存在あるいは発生遺伝子
プロモーターの発現が、細胞機能の混乱を妨げるまたは減少させるＤＮＡ構築物が提供される。

【００２２】上記の（ｃ）で有用な外因性誘導因子の存在または非存在に反応するプロモー
ター配列あるいは発生遺伝子プロモーターの例には、（ｂ）に関連して上に定義
されるものが含まれる。

【００２３】本発明の第四の側面にしたがい、上に定義された通りのＤＮＡ構築物を含む植
物を含む植物生殖質が提供される。本発明の第五の側面にしたがい、上に定義された通りのＤＮＡ構築物を含む哺
乳動物細胞が提供される。

【００２４】本発明の第六の側面にしたがい、細胞機能を乱すための、そして所望により前
記の細胞の混乱を逆転させるための、上に定義された通りのＤＮＡ構築物の使用
が提供される。

【００２５】好ましくは、細胞機能を可逆的に乱すことが可能なＤＮＡ構築物の第一のＤＮ
Ａ配列は、外因性誘導因子の存在または非存在に反応する誘導性プロモーター配
列を含む第六のＤＮＡ配列に作用可能であるように連結されそして該配列の調節
下にある、第五のＤＮＡ配列内に含まれるＤＮＡ配列によりコードされるリプレ
ッサータンパク質に反応するオペレーター配列をさらに含む。第六のＤＮＡ配列
として使用するのに適したプロモーターの例には、第二のＤＮＡ配列として使用
するため、上に列挙されるものが含まれる。

【００２６】好ましくは、細胞機能を可逆的に乱すことが可能なＤＮＡ構築物の第四のＤＮ
Ａ配列は、（ｂ）で特定されたＤＮＡ配列と天然に関連しているタンパク質のフ
ァミリーのメンバーをコードするＤＮＡ配列を含む。第四のＤＮＡ配列は、好ま
しくは、プロテアーゼプロペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。あるいは、
該タンパク質は、酵素阻害剤、または前記の第二のＤＮＡ配列の産物に対して作
成された抗体であってもよい。

【００２７】好ましくは、プロテアーゼは、標的化または非標的化システインプロテアーゼ
酵素である。天然に存在するシステインプロテアーゼ酵素およびそれらをコード
する核酸配列の例は、例えばＷＯ９７／３５９８３に記載されている。

【００２８】好ましくは、発生遺伝子プロモーターは、初期実生／種子プロモーターである
。あるいは該プロモーターは、病原体誘導プロモーターであってもよい。好ましくは、ＤＮＡ構築物は、植物細胞または哺乳動物細胞において、細胞機
能を乱すことが可能である。

【００２９】本発明の第七の側面にしたがい：（ａ）外因性誘導因子の存在または非存在に反応する誘導性プロモーター配列、
あるいは植物の選択された組織において、または発生の選択された段階で、遺伝
子発現を開始することが可能な発生遺伝子プロモーターのいずれかを含む、第一
のＤＮＡ配列；（ｂ）その産物が植物において老化を調節することが可能なタンパク質を阻害す
ることが可能である、ＤＮＡ配列を含み、（ａ）で特定されたプロモーター配列
に作用可能であるように連結されそして該プロモーター配列の調節下にある、第
二のＤＮＡ配列それにより、外因性誘導因子の存在または非存在あるいは発生遺伝子プロモータ
ーの活性が、老化を調節することが可能な該タンパク質の合成を下方制御し、ま
たは該タンパク質の活性を実質的に減少させ、それにより、老化の過程を遅らせ
ることを可能にする、ＤＮＡ構築物が提供される。

【００３０】本発明の第八の側面にしたがい、老化を調節することが可能なタンパク質の合
成を下方制御する、または該タンパク質の活性を実質的に減少させるための、上
に定義された通りのＤＮＡ構築物の使用が提供される。

【００３１】本発明の第九の側面にしたがい、上に定義される第七の側面のＤＮＡ構築物を
含む植物を含む、植物生殖質が提供される。好ましくは、老化の過程を遅らせることが可能なＤＮＡ構築物の第二のＤＮＡ
配列は、老化を調節することが可能なタンパク質と天然に関連しているタンパク
質のファミリーのメンバーをコードするＤＮＡ配列を含む。好ましくは、第二の
ＤＮＡ配列は、プロテアーゼプロペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。ある
いは該ＤＮＡ配列は、プロテアーゼ部分的センスＲＮＡまたはプロテアーゼ部分
的アンチセンスＲＮＡをコードする。さらなる代替物において、ＤＮＡ配列は、
第二のＤＮＡ配列の産物に対して作成され、そしてその活性を阻害することが可
能な抗体をコードする。

【００３２】好ましくは、老化を調節することが可能なタンパク質はプロテアーゼ酵素であ
る。プロテアーゼは、植物、真菌、細菌または動物由来であってもよいし、ある
いはプロテアーゼ活性を有するその断片またはこれらのいずれかの変異体であっ
てもよい。最も好ましくは、プロテアーゼは植物、真菌、細菌または動物由来で
ある。

【００３３】好ましくは、プロテアーゼは、上に定義されるように、標的化または非標的化
（ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｅｄ）システインプロテアーゼ酵素である。好ましくは、発生遺伝子プロモーターは老化で誘導されるプロモーター（ｓｅ
ｎｅｓｃｅｎｅｃ−ｉｎｄｕｃｅｄｐｒｏｍｏｔｏｒ）である。

【００３４】好ましくは、ＤＮＡ構築物は、植物細胞において、老化を調節することが可能
なタンパク質を下方制御する、または該タンパク質の活性を実質的に減少させる
ことが可能である。

【００３５】本発明の第１０の側面にしたがい：（ａ）外因性誘導因子の存在または非存在に反応する誘導性プロモーター配列、
あるいは植物の選択された組織において、または発生の選択された段階で、遺伝
子発現を開始することが可能な発生遺伝子プロモーターのいずれかを含む、第一
のＤＮＡ配列；（ｂ）その産物が植物において貯蔵タンパク質の代謝を調節することが可能なタ
ンパク質を下方制御する、または阻害することが可能である、ＤＮＡ配列を含み
、（ａ）で特定されたプロモーター配列に作用可能であるように連結されそして
該プロモーター配列の調節下にある、第二のＤＮＡ配列、それにより、（ａ）で特定された外因性誘導因子の存在または非存在あるいは発
生遺伝子プロモーターの発現が、貯蔵タンパク質の代謝を調節することが可能な
該タンパク質の合成を下方制御し、または該タンパク質の活性を実質的に減少さ
せ、それにより、植物において貯蔵産物の性質、動員および／または分布を改変
することを可能にする、ＤＮＡ構築物が提供される。

【００３６】特に、こうした構築物を用い、植物の発芽を遅らせることにより、収穫前の出
芽を妨げることが可能である。本発明の第１１の側面にしたがい、第１０の側面において、上に定義された通
りのＤＮＡ構築物を含む、植物、植物種子または植物細胞が提供される。

【００３７】本発明の第１２の側面にしたがい、例えば発芽中に起こるように、貯蔵タンパ
ク質の代謝を調節することが可能なタンパク質の合成を下方制御する、または該
タンパク質の活性を実質的に減少させるための、上に定義された通りのＤＮＡ構
築物の使用が提供される。

【００３８】好ましくは、貯蔵タンパク質の代謝を調節することが可能なＤＮＡ構築物の第
一のＤＮＡ配列は、外因性誘導因子の存在または非存在に反応する誘導性プロモ
ーター配列をさらに含む第四のＤＮＡ配列に作用可能であるように連結されそし
て該配列の調節下にある、第三のＤＮＡ配列内に含まれるＤＮＡ配列によりコー
ドされるリプレッサータンパク質に反応するオペレーター配列を含み、それによ
り該リプレッサータンパク質の発現が、貯蔵タンパク質の代謝の修飾を妨げる。

【００３９】この方式で、貯蔵タンパク質の代謝に対する構築物の影響を逆転させることが
可能である。あるいはまたは好ましくはさらに、ＤＮＡ構築物はまた、外因性誘導因子の存
在または非存在に反応する誘導性プロモーターを含む第六のＤＮＡ配列に作用可
能であるように連結されそして該配列の調節下にある、異種タンパク質をコード
するＤＮＡ配列を含む第五のＤＮＡ配列も含み、それにより該異種遺伝子の発現
が、貯蔵タンパク質の代謝の修飾を停止する。

【００４０】好ましくは、植物において、ＤＮＡ構築物内に含まれるＤＮＡ配列によってコ
ードされる産物により阻害されることが可能な、貯蔵タンパク質の代謝を調節す
ることが可能なタンパク質は、プロテアーゼ酵素、適切には内因性プロテアーゼ
酵素である。好ましくは、該タンパク質は、上に定義された通りの、標的化また
は非標的化システインプロテアーゼ酵素である。

【００４１】好ましくは、植物において貯蔵タンパク質の代謝を修飾することが可能なＤＮ
Ａ構築物の第二のＤＮＡ配列は、貯蔵タンパク質の代謝を修飾することが可能な
タンパク質と天然に関連している産物をコードするＤＮＡ配列を含む。

【００４２】好ましくは、第二のＤＮＡ配列は、プロテアーゼプロペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列を含む。好ましくは、第二のＤＮＡ配列は、プロテアーゼセンスＲＮＡまたは部分的セ
ンスＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、あるいはプロテアーゼアンチセンスＲＮＡ
をコードするＤＮＡ配列を含む。あるいは、該配列は、貯蔵タンパク質の代謝を
修飾することが可能なタンパク質に特異的でありそして該タンパク質を阻害する
抗体をコードしてもよい。

【００４３】プロテアーゼは、植物、真菌、細菌または動物由来であってもよいし、あるい
はプロテアーゼ活性を有するその断片またはこれらのいずれかの変異体であって
もよい。最も好ましくは、プロテアーゼは植物、真菌、細菌または動物由来であ
る。

【００４４】好ましくは、第二のＤＮＡ配列は、システインプロテアーゼセンス、部分的セ
ンスまたはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む。好ましくは、異種タンパク質はプロテアーゼである。

【００４５】好ましくは、この場合、発生遺伝子プロモーターは初期実生プロモーターであ
る。好ましくは、ＤＮＡ構築物は、植物において、貯蔵タンパク質の代謝を修飾す
ることが可能なタンパク質の合成を下方制御する、または該タンパク質の活性を
実質的に減少させることが可能である。

【００４６】本発明の好ましい態様にしたがい、上に定義された通りの、細胞機能を可逆的
に乱すことが可能なＤＮＡ構築物が提供され、ここで細胞機能を乱すことが可能
なタンパク質はシステインプロテアーゼ酵素であり、そして前記システインプロ
テアーゼ酵素を阻害することが可能なタンパク質はプロテアーゼプロペプチドで
ある。

【００４７】本発明のさらなる好ましい態様にしたがい、上に定義された通りの、老化を遅
らせるまたは阻害することが可能なＤＮＡ構築物が提供され、ここで老化を調節
することが可能なタンパク質は成熟システインプロテアーゼ酵素であり、そして
前記システインプロテアーゼ酵素を阻害することが可能なタンパク質はシステイ
ンプロテアーゼプロペプチドである。

【００４８】本発明の別の好ましい態様にしたがい、上に定義された通りの、貯蔵タンパク
質の代謝を修飾することが可能なＤＮＡ構築物が提供され、ここで貯蔵タンパク
質の代謝を修飾することが可能なタンパク質はシステインプロテアーゼ酵素であ
り、そして前記システインプロテアーゼ酵素は前記システインプロテアーゼ酵素
の全長または部分的アンチセンスまたは部分的センスＲＮＡのいずれかをコード
するＤＮＡ配列により阻害される。

【００４９】「ＤＮＡ構築物（ＤＮＡｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」という用語は、「カセット
（ｃａｓｓｅｔｔｅ）」、「ハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）」または「結合体（
ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」などの用語と同義であり、カセットを形成するように、
互いに直接または間接的に結合しているＤＮＡ配列を含む。間接的結合の例は、
各ＤＮＡ配列に介在する、イントロン配列などの適切なスペーサー基の提供であ
る。ＤＮＡ配列はさらに、異なるベクター上にあってもよく、したがって、必ず
しも同一ベクター上に位置しない。

【００５０】「天然に関連している（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」とい
う用語は、目的のタンパク質またはｉｎｖｉｖｏで目的のタンパク質に結合す
るであろうタンパク質の、完全または部分的前駆体タンパク質を含む。これらは
天然に存在するであってもまたは合成であってもよい。

【００５１】「前駆体タンパク質（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｐｒｏｔｅｉｎ）」という用語は
、特定の目的のタンパク質の前に形成されそして該タンパク質に変換されるタン
パク質を含み、そしてプレプロタンパク質およびプロタンパク質構造、すなわち
成熟酵素領域（ｍａｔｕｒｅｅｎｚｙｍｅｒｅｇｉｏｎ）、プロペプチド領
域および／または標的領域を含むタンパク質を含む。

【００５２】「タンパク質」という用語は、ペプチド結合を通じ共有結合している１つまた
はそれ以上のアミノ酸鎖、ペプチド結合を通じ共有結合している３つまたはそれ
以上のアミノ酸を含むオリゴペプチドおよびペプチド結合を通じ共有結合してい
る２つまたはそれ以上のアミノ酸からなるペプチドを含む。

【００５３】「プロテアーゼ」という用語は、タンパク質およびペプチド中のペプチド結合
を加水分解することが可能なプレプロ酵素、プロ酵素または成熟酵素を含む。こ
うしたプロテアーゼは、植物、真菌、細菌または動物由来であってもよい。本発
明に有用なプロテアーゼの例は、システインプロテアーゼ（ＣＰ）である。

【００５４】「産物（ｐｒｏｄｕｃｔ）」という用語は、指定される機能を実行することが
可能なタンパク質、前駆体タンパク質およびＤＮＡ配列に対するアンチセンスま
たは部分的センスＲＮＡを含む。

【００５５】本発明のＤＮＡ配列は、単離型であり、そして好ましくは、天然に関連してい
ないＤＮＡ配列に作用可能であるように連結しているゲノムＤＮＡ配列であって
もよいし、あるいは該ＤＮＡは合成ＤＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。

【００５６】本発明はまた、本発明のＤＮＡ構築物を、生物のゲノム内に組み入れている、
好ましくは安定して組み入れている、細胞プロトプラストおよび種子などの、植
物およびその一部などの、遺伝的に形質転換されている生物も提供する。したが
って、本発明は、適切な発生段階で、その細胞を可逆的に阻害することが可能な
生物であって、上に定義された通りの組換えＤＮＡ構築物を含む、好ましくはゲ
ノム内に安定して組み込んでいる該生物を提供する。この点で、細胞機能を乱す
ことが可能なタンパク質は、分解されてもよい（すなわち細胞溶解性（ｃｙｔｏ
ｓｏｌｉｃ）になってもよい）し、または細胞の特定の領域、例えばミトコンド
リアまたは葉緑体に再標的化されてもよい。細胞機能の混乱はその後、細胞機能
を乱すタンパク質を特異的に阻害するタンパク質の発現により、逆転させること
が可能である。

【００５７】本発明の利点は、細胞機能を乱すことが可能なタンパク質が、本発明のＤＮＡ
構築物内に含まれるＤＮＡ配列にコードされるタンパク質により、特異的に阻害
されることである。さらに、２つの適用に関しては、阻害は、ＤＮＡレベルより
むしろタンパク質レベルで起こる。したがって、抑制開始前に合成されそして集
積している、いかなる細胞毒性タンパク質もやはり阻害されるであろう。

【００５８】本発明はまた、老化を調節することが可能なタンパク質の合成が、該タンパク
質を特異的に阻害するタンパク質の発現により下方制御されている、植物も提供
する。

【００５９】本発明の老化を遅らせるかまたは阻害することが可能なＤＮＡ構築物の利点は
、そうすることにより、該構築物が組み入れられている植物の収量が増加するこ
とである。老化の制御に関するさらなる詳細は、我々の国際特許出願国際公開第
ＷＯ９５／０７９９３号に記載され、該出願は本明細書に援用される。

【００６０】老化に関与するタンパク質の抑制は、「アンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）
」または「部分的センス（ｐａｒｔｉａｌ−ｓｅｎｓｅ）」技術いずれかの使用
により、調節することが可能である。

【００６１】本発明にしたがったＤＮＡ構築物は、「アンチセンス」ＲＮＡを生じる「アン
チセンス」構築物であってもまたは「部分的センス」ＲＮＡを生じる「部分的セ
ンス」構築物（機能的遺伝子産物の少なくとも一部をコードする）であってもよ
い。

【００６２】「アンチセンスＲＮＡ」は、対応するｍＲＮＡの塩基配列に相補的なＲＮＡ配
列である：相補的は、アンチセンス配列（３’から５’方向に読んだもの）の各
塩基（または塩基の大部分）が、５’から３’方向に読んだｍＲＮＡ配列の対応
する塩基（ＧとＣ、ＡとＵ）と対形成することが可能であるという意味である。
こうしたアンチセンスＲＮＡは、適切な遺伝子のコード鎖（またはそれと実質的
な相同性を示すＤＮＡ配列）の少なくとも一部に相補的な配列の少なくとも一部
を含む転写物（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を生成するよう用意された適切なＤＮＡ
構築物を用いた形質転換により、細胞において産生してもよい。

【００６３】「部分的センスＲＮＡ（ｐａｒｔｉａｌ−ｓｅｎｓｅＲＮＡ）」は、対応す
るｍＲＮＡ配列の少なくとも一部に実質的に相同なＲＮＡ配列である。こうした
部分的センスＲＮＡは、機能的タンパク質をコードする能力を持たない、適切な
遺伝子のコード鎖（またはそれと実質的な相同性を示すＤＮＡ配列）の少なくと
も一部と同一の配列を含む転写物を生成するよう正常な方向で用意された適切な
ＤＮＡ構築物を用いた形質転換により、細胞において産生してもよい。適切な部
分的センス構築物を用い、遺伝子発現を阻害することが可能である（国際特許出
願公開公報ＷＯ９１／０８２９９に記載されたい）。

【００６４】老化に関与するタンパク質の抑制は、あるいは、老化過程に関与するプロテア
ーゼのプロペプチドの使用により調節することができる。プロペプチドのみの過
剰発現は、成熟プロテアーゼを阻害し、したがって老化を遅らせるであろう。

【００６５】利用可能なまたは利用可能となる他のアプローチもまた、用いてもよい。本発明のＤＮＡ構築物を好都合に用い、植物の出来栄えおよび収量を最適化す
ることが可能である。

【００６６】植物における貯蔵タンパク質含量、性質または局在を修飾する手段として、わ
れわれは植物全体のシステインプロテアーゼなどのタンパク質の選択的下方制御
（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を提唱する（Ｍｉｎ
ｏおよびＩｎｏｕｅ、１９８８）。これは「センス」または「アンチセンス」技
術の使用を通じ、達成することが可能である。したがって、有益な効果は、種子
、子葉、根または茎における、これらのプロテアーゼの部分的センスまたはアン
チセンス下方制御を通じ、得られる可能性があるといってよい。いくつかの他の
重要な酵素もまた、貯蔵タンパク質動員および／または転位置（ｔｒａｎｓｌｏ
ｃａｔｉｏｎ）に役割を果たすことが記載されている。同じ部分的センスまたは
アンチセンス戦略を用いたこれらの遺伝子の下方制御もまた、植物の出来栄えを
改善するため、本発明において有用である可能性があるといってよい。

【００６７】これらのタンパク質の阻害はまた、阻害されるべきタンパク質の前駆体タンパ
ク質の使用によっても、達成することが可能である。改変されるべき貯蔵タンパク質代謝を妨げるまたは逆転させるため、部分的セ
ンスまたはアンチセンスの合成を、誘導性プロモーターと組み合わせたリプレッ
サー／オペレーター戦略を用い、抑制することもできよう。あるいは、内因性プ
ロテアーゼ遺伝子と十分に異なる配列の異種プロテアーゼ遺伝子を、誘導性プロ
モーターの調節下で発現させてもよい。これは部分的センスまたはアンチセンス
によるいかなる下方制御の発生も回避するであろう。

【００６８】種子成熟および貯蔵中、種子プロモーターは、例えばシステインプロテアーゼ
に対する部分的センスをドライブし、そしてしたがってタンパク質分解を阻害し
、そしてしたがって貯蔵タンパク質の損失および収穫前出芽の発生を減少させる
であろう。

【００６９】本発明の発生遺伝子プロモーターの使用は、該プロモーターが作用可能である
ように連結されている配列の発現を、植物発生の適切な段階に制限し、そしてま
た植物に外因性誘導因子を、その一生を通じ適用しつづける必要がないことを意
味することが認識されるであろう。これは経済的および生態学的両方の利益を有
する。

【００７０】システインプロテアーゼは、成熟酵素に融合しているプロペプチドを含む不活
性前駆体として合成される。このプロペプチドは、成熟酵素上にフォールディン
グすることにより、該酵素を阻害するようである。さらに、大腸菌で発現され、
そして精製されたプロペプチドのみで、ｉｎｖｉｔｒｏで成熟酵素の阻害を示
す（Ｔａｙｌｏｒら、１９９５）。システインプロテアーゼの阻害は、したがっ
て、誘導性または段階特異的調節下で、プロペプチドを発現させることにより行
い、タンパク質損失の減少を生じることが可能である。生理学的影響は、リプレ
ッサー／オペレーター戦略を用い、プロペプチドの合成を下方制御することによ
り、またはプロペプチドのいかなる結合も回避するため、配列が内因性のものと
十分に異なる異種プロテアーゼを発現させることにより、逆転させることが可能
である。

【００７１】細胞死／阻害系を得るためのさらなる戦略として、再標的化システインプロテ
アーゼ、例えばミトコンドリアまたは葉緑体に標的化されているものを発現させ
てもよい。異なる細胞区画におけるシステインプロテアーゼの発現は、阻害性効
果を有する可能性がある。このプロテアーゼを葉緑体またはミトコンドリア標的
化配列、例えばニコチアナ・プルンバギニフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｐｌ
ｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）由来のプレＢ（Ｂｏｕｔｒｙら（１９８７）Ｎａ
ｔｕｒｅ，３２８，３４１）に融合させ、その結果これらの感受性細胞小器
官（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ）におけるタンパク質分解を達
成することもできよう。ＣＰはまた、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔ
ｉｃｕｌｕｍ）保持シグナルに融合しまたはせず、細胞質または小胞体に再標的
化することもできよう。

【００７２】ＣＰは植物における細胞自己消化と関連することが示されている（Ｍｉｎａｍ
ｉおよびＦｕｋｕｄａ、１９９５）ため、代替アプローチは、標的配列を持たな
いシステインプロテアーゼを発現させ、こうした細胞質ゾル発現を達成すること
であろう。これもやはり、タンパク質分解および細胞死を引き起こすかもしれな
い。

【００７３】本発明のＤＮＡ構築物は、形質転換により植物に導入する。植物細胞の形質転
換に使用される方法は、本発明に特に密接な関係はなく、そして標的植物に適し
たいかなる方法を使用してもよい。トランスジェニック植物は、形質転換細胞か
らの再生により得られる。多くの形質転換法が文献から公知であり、例えばいく
つかのみを述べると、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはそのＴｉプラスミドを用いたア
グロ感染（ａｇｒｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、植物細胞およびプロトプラストのマイクロインジェ
クション、微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）形質転換がある。既知
の方法の完全な詳細に関しては、文献を参照してもよい。

【００７４】ＤＮＡ構築物を挿入する植物種も本発明に特に密接な関係はない。双子葉およ
び単子葉植物を形質転換することができる。本発明は、形質転換技術が利用可能
であるまたは利用可能になる、いかなる植物に適用してもよい。本発明のＤＮＡ
構築物はしたがって、多様な遺伝的に修飾される植物で用いてもよく、カノラ（
ｃａｎｏｌａ）、ヒマワリ（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ）、タバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）
、テンサイ（ｓｕｇａｒｂｅｅｔ）およびワタ（ｃｏｔｔｏｎ）などの多栽培
作物（ｆｉｅｌｄｃｒｏｐｓ）；コムギ（ｗｈｅａｔ）、オオムギ、コメ、ト
ウモロコシおよびモロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ）などの穀物；トマト（ｔｏｍａｔ
ｏｅｓ）、マンゴー（ｍａｎｇｏｅｓ）、モモ（ｐｅａｃｈｅｓ）、リンゴ（ａ
ｐｐｌｅｓ）、セイヨウナシ（ｐｅａｒｓ）、イチゴ（ｓｔｒａｗｂｅｒｒｉｅ
ｓ）、バナナ（ｂａｎａｎａｓ）およびメロン（ｍｅｌｏｎｓ）などの果物；お
よびニンジン（ｃａｒｒｏｔ）、レタス（ｌｅｔｔｕｃｅ）、キャベツ（ｃａｂ
ｂａｇｅ）およびタマネギ（ｏｎｉｏｎ）などの野菜が含まれる。プロモーター
はまた、根、葉、茎および生殖組織を含む、多様な組織における使用にも適して
いる。

【００７５】我々はまた、新規システインプロテアーゼをコードする核酸配列を単離し、そ
して性質決定してきており、そしてこれらは我々の同時係属国際特許出願第ＷＯ
９７／３５９８３号に記載されている。

【００７６】本発明はここで、付随する図と関連し、限定しない例としてのみ記載されるで
あろう。

【００７７】

【実施例】

実施例１−阻害性遺伝子としてのその可能性を立証するための、トウモロコシ
カルスにおけるＣＰの過剰発現目的本実験の目的は、培養ＢＭＳトウモロコシ細胞における脱標的化または再標的
化プロテアーゼの発現が、阻害性カセットを含まないベクターで形質転換された
カルスの確立と比較した際、形質転換後のトランスジェニックカルスの確立によ
り測定されるように、細胞生存能力の減少を生じることを示し、それにより細胞
質ゾルまたはミトコンドリアにおけるプロテアーゼの発現が細胞増殖を阻害して
いることを示すことである。例として、我々は、カリカ・パパイヤ（Ｃａｒｉｃ
ａｐａｐａｙａ）由来のシステインプロテアーゼ（ＥＭＢＬ：Ｘ６６０６０）
、カリカイン（ｃａｒｉｃａｉｎ）（またはプロテイナーゼオメガ）を選択した
。プレプロ酵素の標的化配列は、分泌経路への侵入を妨げるため除去した。その
結果、該プロテアーゼは、プロ酵素（ｐＦＰＡＴ−プロカリカイン（ｐＦＰＡＴ
−Ｐｒｏｃａｒｉｃａｉｎ））または成熟酵素（ｐＦＰＡＴ−カリカイン（ｐＦ
ＰＡＴ−Ｃａｒｉｃａｉｎ））として細胞質で発現されるはずである。さらに、
該プロテアーゼを、再びプロ酵素（ｐＦＰＡＴ−β−プロカリカイン（ｐＦＰＡ
Ｔ−β−Ｐｒｏｃａｒｉｃａｉｎ））または成熟酵素（ｐＦＰＡＴ−β−カリカ
イン（ｐＦＰＡＴ−β−Ｃａｒｉｃａｉｎ））としてミトコンドリアに再標的化
した。

【００７８】トウモロコシ形質転換ベクターの構築ｐＦＰＡＴ−カリカイン、ｐＦＰＡＴ−β−カリカイン、ｐＦＰＡＴ−プロカ
リカインおよびｐＦＰＡＴ−β−プロカリカインは、カリカインの部分的または
全長ｃＤＮＡの発現が、そのイントロン（ＵＢ−ｉｎｔ）に融合しているトウモ
ロコシ・ユビキチンプロモーター（Ｕｂ−ｐｒｏ）およびアグロバクテリウム・
ツメファシエンス・ノパリンシンターゼ（ｎｏｐａｌｉｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ
）遺伝子のターミネーターの調節下にある、植物形質転換ベクターである。さら
に、該ベクターは、形質転換細胞に、除草剤バスタ（Ｂａｓｔａ）に対する抵抗
性を与える、「ＰＡＴカセット」を含む。トウモロコシ形質転換ベクター、ｐＦ
ＰＡＴ−カリカイン、ｐＦＰＡＴ−β−カリカイン、ｐＦＰＡＴ−プロカリカイ
ンおよびｐＦＰＡＴ−β−プロカリカインの構築の図式的概略は、図１−６に記
載されている。

【００７９】「ＰＡＴカセット」は、ｐＩＧ−ＰＡＴからＡｓｃＩ断片として切除し、そし
てクレノウポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用い埋め込
んだ。その後、ＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し（２つのＦｓｅＩ部位の
１つを除去するため）、そしてクレノウポリメラーゼを用い埋め込んだｐＦＳＥ
２ベクターに、「ＰＡＴカセット」を挿入することにより、一般的なトウモロコ
シ形質転換ベクター、ｐＦＳＥ−ＰＡＴを生成した（図１）。エフェクターカセ
ットは、唯一のＦｓｅＩ部位を用い、挿入することができる。

【００８０】植物ミトコンドリアに関する標的化配列は、ニコチアナ・プルンバギニフォリ
アから単離したＡＴＰアーゼ遺伝子のβ−サブユニットをコードするｃＤＮＡク
ローンから得た（Ｃｈａｕｍｏｎｔら、１９９４）。標的化配列断片は、まず該
ｃＤＮＡクローンをＮｃｏＩで消化し、クレノウポリメラーゼを用い埋め込み反
応（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）を行い、そして続いてＢａｍＨ
Ｉで消化することにより、得た。その後、ＫｐｎＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリ
メラーゼを用い平滑末端化（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄｅｄ）し、そして続いてＢａｍ
ＨＩで消化したｐＦＵＮベクターに、該配列を連結し、ｐＦＵＮ−βを生成した
（図２）。

【００８１】成熟カリカインコード断片は、成熟配列の５’端にＢａｍＨＩ部位および最適
化翻訳開始を導入するため修飾されている、順方向オリゴヌクレオチド、Ｍａｔ
Ｃａｒｉｃ（５’ＧＴＴＴＡＴＴＡＡＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＧ
ＣＣＣＧＡＧＡＡＴ３’）、および逆方向オリゴヌクレオチド、ＭａｔＣａｒｉ
ｃ−Ｒ（５’ＧＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＴＴＴＴＴＡ３’）を
用い、ｐＥＴ−ＷＴ−カリカインに対するＰＣＲにより得た。その後、ＰＣＲ断
片をＢａｍＨＩで消化し、そしてやはりＢａｍＨＩで消化したｐＦＵＮおよびｐ
ＦＵＮ−βベクターに連結し、それぞれｐＦＵＮ−カリカイン（図３）およびｐ
ＦＵＮ−β−カリカイン（図４）を生成した。

【００８２】プロカリカインコード断片は、ｐＥＴ−ＷＴ−カリカインをＮｄｅＩで消化し
、クレノウポリメラーゼを用い埋め込み反応を行い、そしてＢａｍＨＩでさらに
消化することにより、得た。その後、ＫｐｎＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラ
ーゼを用い平滑末端化し、そしてさらにＢａｍＨＩで消化したｐＦＵＮベクター
に、該ＤＮＡ断片を連結し、ｐＦＵＮ−プロカリカインを生成した（図５）。

【００８３】さらに、プロカリカインコード断片は、ｐＥＴ−ＷＴ−カリカインをＮｄｅＩ
およびＢａｍＨＩで同時に消化した後、クレノウポリメラーゼを用い埋め込み反
応を行うことにより、得た。その後、ＳｍａＩで消化したｐＦＵＮ−βベクター
に、該ＤＮＡ断片を連結し、ｐＦＵＮ−β−プロカリカイン（図６）を生成した
。

【００８４】トウモロコシ・ポリユビキチンプロモーター（ＵＢＩ）およびそのイントロン
によりドライブされるプロカリカインまたは成熟カリカインＤＮＡおよびその後
にｎｏｓ３’ターミネーターを含む、ＦｓｅＩカセットを、ｐＦＵＮ−カリカイ
ン、ｐＦＵＮ−β−カリカイン、ｐＦＵＮ−プロカリカインおよびｐＦＵＮ−β
−プロカリカインから切除した。その後、ＦｓｅＩカセットを、ｐＦＳＥ−ＰＡ
ＴのＦｓｅＩ部位にクローン化し、それぞれ、植物形質転換ベクター、ｐＦＰＡ
Ｔ−カリカイン、ｐＦＰＡＴ−β−カリカイン、ｐＦＰＡＴ−プロカリカインお
よびｐＦＰＡＴ−β−プロカリカインを生成した（図７）。

【００８５】ＢＭＳトウモロコシ細胞の形質転換ｐＦＰＡＴ−カリカイン、ｐＦＰＡＴ−β−カリカイン、ｐＦＰＡＴ−プロカ
リカインおよびｐＦＰＡＴ−β−プロカリカインをトウモロコシＢＭＳ細胞に形
質転換した。二重コントロールは、ＰＡＴ選択カセットのみを含むｐＦＳＥ−Ｐ
ＡＴ、およびｐＪＩＴＦＳＥｎｘでＢＭＳ細胞を同時形質転換することにより、
得た。ベクターｐＪＩＴＦＳＥｎｘは、ＧＵＳリポーター遺伝子をドライブする
二重亢進（ｄｏｕｂｌｅｅｎｈａｎｃｅｄ）ＣＡＭＶ３５Ｓプロモーターか
らなり、そしていかなるＰＡＴ選択カセットも含まない。

【００８６】このベクターの組み合わせは、カルス形成（ｃａｌｌｉｆｏｒｍａｔｉｏｎ
）を阻害しないはずであるため、該組み合わせを陰性コントロールとして用いた
。ｐＪＩＴＦＳＥｎｘのみで形質転換された細胞は、バイアロフォス（ｂｉａｌ
ｏｐｈｏｓ）上で再生しないであろうため、これはまた、同時形質転換コントロ
ールとしても用いられる。ＢＭＳウィスカー（ｗｉｓｋｅｒ）形質転換を用い達
成することが可能な同時形質転換の頻度は、続く実験（実施例２）にとって重要
であり、そして該頻度は、ＧＵＳもまた発現する再生カルス（二重形質転換体）
の比率を計測することにより概算した。

【００８７】陽性コントロールは、ＰＡＴ選択カセットに続き、ＣＡＭＶ３５Ｓプロモー
ターによりドライブされる、強力な細胞毒性リボヌクレアーゼ遺伝子バーナーゼ
（ｂａｒｎａｓｅ）を含むｐバーナーゼ（ｐＢａｒｎａｓｅ）により提供された
。本構築物は、トランスジェニックカルスの確立を強力に減少させると期待され
た。

【００８８】すべての形質転換実験は、三つ組で（ｉｎｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）行い、そ
して結果を共にプールした。形質転換ベクターを、以下のような炭化ケイ素繊維仲介形質転換技術を用い、
培養ＢＭＳ細胞に導入した：炭化ケイ素ウィスカーの調製乾いたウィスカーは、吸入および肺損傷の可能性を妨げるため、常にガス排出
キャビネット（ｆｕｍｅｃａｂｉｎｅｔ）で扱った。これらのウィスカーは、
アスベストと類似の特性を有するため、発癌性である可能性がある。Ｓｉｌａｒ
ＳＣ−９ウィスカーは、ＡｄｖａｎｃｅｄＣｏｍｐｏｓｉｔｅＭａｔｅｒ
ｉａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国サウスカロライナ州グリアにより提供さ
れた。無菌ウィスカー懸濁物は、以下のようにあらかじめ調製した。およそ５０
ｍｇのウィスカーを、あらかじめ重量測定した１．５ｍｌエッペンドルフチ
ューブ中に置き、ふたをし、そして再度重量測定し、ウィスカーの重量を決定し
た。チューブのふたに注射針で穴を開け、そして二層のアルミニウムホイルで覆
った。チューブをオートクレーブし（１２１℃、１５ｐｓｉ、２０分間）、そ
して乾燥させた。新鮮な懸濁物を用いた際のＤＮＡ形質転換のレベルは、比較的
古い懸濁物のレベルより高いことが報告されてきていたため、各実験に関し、新
鮮なウィスカー懸濁物を調製した。無菌脱イオン水を用い、５％（重量／体積）
ウィスカー懸濁物を調製した。これを数秒ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）し、使
用直前にウィスカーを懸濁した。

【００８９】細胞へのＤＮＡ形質転換すべての処理は、無菌条件下で、層気流（ｌａｍｉｎａｒａｉｒｆｌｏｗ
）キャビネット中で行った。ＤＮＡは以下のアプローチを用い、細胞に形質転換
した。本方法に対する特定の修飾は、本文中に示す。

【００９０】細胞およびウィスカー懸濁物は、切り落としたＧｉｌｓｏｎピペットチップを
用い、ピペッティングした。１００μｌの新鮮ＢＭＳ培地を、無菌エッペンドル
フチューブに測り入れた。これに、４０μｌの５％（ｗ／ｖ）ウィスカー懸濁物
および１０μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）のプラスミドＤＮＡを添加し、デスクトップ
ボルテックス装置（ＶｏｒｔｅｘＧｅｎｉｅ２ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩ
ｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用い、最高速度で６０秒間ボルテックスし
た。このボルテックス直後、５００μｌの細胞懸濁物を２５０μｌの充填細胞に
添加した。その後、エッペンドルフチューブにふたをし、そして垂直の位置で最
高速度で６０秒間ボルテックスした。同じ処理を用い、他の細胞株を形質転換し
た。

【００９１】結果図８に示すように、すべてのプロテアーゼ構築物は、バイアロフォスを含む培
地上でのカルス再生数の減少を生じ、もしかするとＣＰが細胞増殖に有害である
可能性があることを示す。ミトコンドリアにＣＰ前駆体を標的化するｐＦＰＡＴ
−β−プロカリカインは、該実験の条件において、バーナーゼと同じくらい強力
であり、そしてトウモロコシカルス定着を完全に妨げる。同様にＢＭＳ細胞ゲノ
ムへのｐＦＰＡＴ−プロカリカイン、ｐＦＰＡＴ−カリカインおよびｐＦＰＡＴ
−β−カリカインの組み込みは、形質転換６週間後、合計で、それぞれコントロ
ールの９．１％、２７．３％、および４５．５％、カルス再生数の減少を生じる
。

【００９２】成熟酵素に比較して前駆体酵素構築物の活性がより高いことは、前駆体タンパ
ク質が活性化されるために、そのプロペプチドを解放したに違いないため、興味
深い。しかし、カリカインは、そのプロペプチドが非常に不安定であり、そして
そのかなりの比率が、中性ｐＨであっても自己触媒反応において切断されると考
えられる（ＧｏｏｄｅｎｏｕｇｈＰＷ、個人的な通信）ため、例示のため特
に選択された。成熟酵素構築物の活性がより低いことは、アミノ末端プロペプチ
ドが、成熟酵素がその正しいコンホメーションを取ることを可能にするであろう
足場（ｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ）として作用すると考えられるため、フォールデ
ィング問題に起因する可能性がある（Ｔａｙｌｏｒら、１９９５）。

【００９３】これらの結果は予備的であるが、これらはすでに、現在開示することが不可能
なコムギ細胞懸濁物系に対し行った同様の実験により、確認されてきている。す
べての実験を今繰り返しているところである。

【００９４】実施例２−対応する成熟酵素を阻害するその可能性を立証するための、トウモ
ロコシカルスにおけるシステインプロテアーゼプロペプチドの過剰発現目的本実験の目的は、培養ＢＭＳトウモロコシ細胞におけるプロテアーゼおよびそ
の同族プロペプチドの同時発現が、形質転換後のトランスジェニックカルスの定
着により測定されるように、プロテアーゼのみの発現と比較し、細胞生存能力の
増加を生じることを示し、それによりプロペプチドの発現が、植物において成熟
酵素を阻害していることを示すことである。

【００９５】トウモロコシ形質転換ベクター、ｐＦＵＮプロペプチドおよびｐＦＵＮ−β−
プロペプチドの構築新規分子の両端にＢａｍＨＩ部位を導入する修飾プライマーを用いた、ｐＥＴ
−ＷＴ−プロカリカインに対するＰＣＲにより、プロペプチド領域をコードする
、カリカインｃＤＮＡの５’−末端領域を増幅した。ＰＣＲ断片をＢａｍＨＩで
消化し、そしてやはりＢａｍＨＩ（ポリユビキチンイントロンおよびｎｏｓ３
’ターミネーターの間）により消化したｐＦＵＮおよびｐＦＵＮ−βベクター両
方にサブクローン化し、それぞれｐＦＵＮ−プロペプチドおよびｐＦＵＮ−β−
プロペプチドを生成した。

【００９６】ＢＭＳトウモロコシ細胞の形質転換ｐＦＰＡＴ−カリカインＤＮＡベクターおよびｐＦＰＡＴ−プロカリカインＤ
ＮＡベクターを、それぞれ、増加する量のｐＦＵＮ−プロペプチドＤＮＡベクタ
ーと共に培養ＢＭＳ細胞に同時形質転換した。同様に、ｐＦＰＡＴ−β−カリカ
インＤＮＡベクターおよびｐＦＰＡＴ−β−プロカリカインＤＮＡベクターを、
それぞれ、増加する量のｐＦＵＮ−β−プロペプチドＤＮＡベクターと共に培養
ＢＭＳ細胞に同時形質転換した。すべての形質転換は、実施例１に記載される炭
化ケイ素繊維仲介形質転換技術を用い、行った。実施例１に記載される、陽性、
陰性および同時形質転換コントロールもまた、実験に含んだ。

【００９７】本発明の範囲から逸脱しない、本発明の他の修飾は、当業者に明らかであるで
あろう。

【００９８】参考文献ＡｓｃｅｎｚｉＰ，ＡｄｕｃｃｉＰ，ＴｏｒｒｏｎｉＡ，Ａｍｉｃ
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ｕｒｏｎｉｄａｓｅｇｅｎｅａｓａｇｅｎｅｆｕｓｉｏｎｍａｒｋ
ｅｒｆｏｒｓｔｕｄｉｅｓｏｆｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎ
ｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ− ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｍ
ｏｔｅｒｃｌｏｎｉｎｇｖｅｃｔｏｒｐｌａｓｍｉｄｐＴＡＫＩａｎ
ｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｂｙｆｌ
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ｓｔｅｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｓｉｎｂａｒｌｅｙａｌｅｕｒｏｎｅｌａｙｅｒｓ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ２（８）：７６９−７８４（１９９０
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ｌａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｏｆａｃ
ＤＮＡｅｎｃｏｄｉｎｇａｃａｔｈｅｐｓｉｎＢ−ｌｉｋｅｐｒｏｔ
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ｏｌＢｉｏｌ２９（２）：３７９−３８４（１９９５）．ＬｉｎＥ；ＢｕｒｎｓＤＪＷ；ＧａｒｄｎｅｒＲＣ：Ｆｒｕｉｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｋｉｗｉ
ｆｒｕｉｔａｃｔｉｎｉｄｉｎｐｒｏｍｏｔｅｒｉｓｃｏｎｓｅｒｖｅ
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ＫａｎＪＡＬ，ＢｏｌＪＦ：Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅ
ｎｃｅｏｆａｃｄｎａｃｌｏｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｔｏｍａｔｏＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍｃｙｓｔｅｉｎｅｐｒｏ
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ｓｉｏｎａｎｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎｂｙｗｏｕｎｄｉｎｇｏｆｔａ
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ｐｒｅａｄ．Ｎａｔｕｒｅ３８０：３１（７Ｍａｒｃｈ１９９６）．ＭａｒｔｔｉｌａＳ，ＰｏｒａｌｉＩ，ＨｏＴ−ＨＤ，Ｍｉｋｋ
ｏｎｅｎＡ：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅ３０ｋｄｃｙｓｔｅｉ
ｎｅｅｎｄｏｐｒｏｔｅａｓｅｂｉｎｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇｂａｒ
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ｅｕｍｖｕｌｇａｒｅ）ｓｅｅｄ．ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉａＰｌａｎｔ
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ｆｔｗｏｃｙｓｔｅｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｓｆｒｏｍｐａｗ−ｐａ
ｗ（ｃａｒｉｃａ−ｐａｐａｙａ）．ＢｉｏｃｈｅｍＪ２３７（１）：１
０５−１１０１（１９８６）．ＭｉｎａｍｉＡａｎｄＦｕｋｕｄａＨ：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｃｙｓｔｅｉｎｅｅｎ
ｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈａｕｔｏｌｙｓｉ
ｓｄｕｒｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＺｉｎｎｉａｍ
ｅｓｏｐｈｙｌｌｃｅｌｌｓｉｎｔｏｔｒａｈｅａｒｙｅｌｅｍｅｎｔ
ｓ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ３６（８）：１５９９−１６０
６（１９９５）．ＭｉｎｏＭ，ＩｎｏｕｅＭ：Ｈｙｂｒｉｄｖｉｇｏｒｉｎｒｅｌａ
ｔｉｏｎｔｏｌｉｐｉｄａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ
ｉｎｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇｍａｉｚｅｋｅｒｎｅｌｓ．ＪｐｎＪ
Ｂｒｅｅｄ３８（４）：４２８−４３６（１９８８）．ＮｏｎｇＶＨ，ＢｅｃｋｅｒＣ，ＭｕｅｎｔｚＫ：ｃＤＮＡｃｌｏ
ｎｉｎｇｆｏｒａｐｕｔａｔｉｖｅｃｙｓｔｅｉｎｅｐｒｏｔｅａｓ
ｅｆｒｏｍｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｓｅｅｄｓｏｆｓｏｙｂｅａｎ．ＢｉｏｃｈｉｍｅｔＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ１２６１（３）：４３５−
４３８（１９９５）．ＯｋａｙａｍａＨ，ＫａｗａｉｃｈｉＭ，ＢｒｏｗｎｓｔｅｉｎＭ，
ＬｅｅＦ，ＹｏｋｏｔａＴ，ＡｒａｉＫ：Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉ
ｅｎｃｙｃｌｏｎｉｎｇｏｆｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡ：ｃｏｎ
ｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｃＤＮＡｅｘｐｒ
ｅｓｓｉｏｎｌｉｂｒａｒｉｅｓｆｒｏｍｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌ
ｓ．Ｍｅｔｈ．ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１５４：３−２７（１９８７
）．ＰａｕｔｏｔＶ，ＢｒｚｅｚｉｎｓｋｉＲ，ＴｅｐｆｅｒＭ：Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｍｏｕｓｅｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎｇ
ｅｎｅｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｔｉｓｓｕｅｓ．Ｇｅｎ
ｅ７７：１３３−１４０（１９８９）．ＰｌａｄｙｓＤ，ＶａｎｃｅＣＰ：Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓｄｕｒｉ
ｎｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｏｆｅｆｆ
ｅｃｔｉｖｅａｎｄｐｌａｎｔｇｅｎｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｉｎｅ
ｆｆｅｃｔｉｖｅａｌｆａｌｆａｎｏｄｕｌｅｓ．Ｐｌａｎｔｐｈｙｓ
ｉｏｌ１０３（２）：３７９−３８４（１９９３）．ＰｒａｅｋｅｌｔＵＭ，ＭｃｋｅｅＲＡ，ＳｍｉｔｈＨ：Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｃｔｉｎｉｄｉｎｔｈｅｃｙｓ
ｔｅｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｏｆＡｃｔｉｎｉｄｉａｃｈｉｎｅｎｓｉ
ｓ．ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ１０（３）：１９３−２０２（１９８８
）．ＲｅｖｅｌｌＤＦ，ＣｕｍｍｉｎｇｓＮＪ，ＢａｋｅｒＫＣ，
ＣｏｌｌｉｎｓＭＥ，ＴａｙｌｏｒＭＡＪ，ＳｕｍｍｅｒＩ
Ｇ，ＰｉｃｋｅｒｓｇｉｌｌＲＷ，ＣｏｎｎｅｒｔｏｎＩＦ，ＧｏｏｄｅｎｏｕｇｈＰＷ：ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｏ
ｆｃＤＮＡｅｎｃｏｄｉｎｇｐａｐａｙａｐｒｏｔｅａｓｅｏｍｅｇ
ａｆｒｏｍＣａｒｉｃａｐａｐａｙａ．Ｇｅｎｅ１２７（２）：２２
１−２２５（１９９３）．ＳａｍｂｒｏｏｋＪ，ＦｒｉｔｓｃｈＥＦ，ＭａｎｉａｔｉｓＴ：
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ，ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕ
ａｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）．ＳａｎｇｅｒＦ，ＭｉｌｋｉｎＳ，ＣｏｕｌｓｏｎＡＲ：ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗｉｔｈｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇｉｎ
ｈｉｂｉｔｏｒｓ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ７４：
５４６３−５４６７（１９７７）．ＳｃｈａｆｆｅｒＭＡ，ＦｉｓｃｈｅｒＲＬ：Ａｎａｌｙｓｉｓｏ
ｆｍＲＮＡｓｔｈａｔａｃｃｕｍｕｌａｔｅｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓａｔｈｉ
ｏｌｐｒｏｔｅａｓｅｇｅｎｅｉｎｔｏｍａｔｏ．ＰｌａｎｔＰｈ
ｙｓｉｏｌ８７：４３１−４３６（１９８８）．ＳｈｉｍａｄａＴ，ＨｉｒａｉｗａＮ，ＮｉｓｈｉｍｕｒａＭ，Ｈ
ａｒａ−ＮｉｓｈｉｍｕｒａＩ：Ｖａｃｕｏｌａｒｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｅｎｚｙｍｅｏｆｓｏｙｂｅａｎｔｈａｔｃｏｎｖｅｒｔｓｐｒｏｐ
ｒｏｔｅｉｎｓｔｏｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｍａｔｕｒｅｆｏｒｍｓ．ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ３５（４）：７１３−
７１８（１９９４）．ＳｈｉｎｔａｎｉＡ，ＹａｍａｕｃｈｉＤ，ＭｉｎａｍｉｋａｗａＴ
：ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｃＤＮＡｆｏｒａｐ
ｕｔａｔｉｖｅｃｙｓｔｅｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｆｒｏｍｒｉｃｅｓｅｅｄｓ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ１０７（３）：１０２５（１９９
５）．ＳｈｕｔｏｖＡＤ，ＶａｉｎｔｒａｕｂＩＡ：Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏ
ｎｏｆｓｔｏｒａｇｅｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ
ｓｅｅｄｓ．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２６（６）：１５５７−１５
６６（１９８７）．ＳｍａｒｔＣＭ，ＨｏｓｋｅｎＳＥ，ＴｈｏｍａｓＨ，Ｇｒｅ
ａｖｅｓＪＡ，ＢｌａｉｒＢＧ，ＳｃｈｕｃｈＷ：Ｔｈｅｔｉ
ｍｉｎｇｏｆｍａｉｚｅｌｅａｆｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅａｎｄｃｈ
ａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎｏｆｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ｒｅｌａｔｅｄ
ｃＤＮＡｓ．ＰｈｙｓｉｏｌＰｌａｎｔ９３（４）：６７３−６８２（
１９９５）．ＴａｋｅｄａＯ，ＭｉｕｒａＹ，ＭｉｔｔａＭ，Ｍａｔｓｕｓｈｉ
ｔａＨ，ＫａｔｏＩ，ＡｂｅＹ，ＹｏｋｏｓａｗａＨ，Ｉｓｈ
ｉｉＳ−Ｉ：ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃＤＮ
ＡｅｎｃｏｄｉｎｇａｐｒｅｃｕｒｓｏｒｏｆＣａｎａｖａｌｉａ
ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓａｓｐａｒａｇｉｎｙｌｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（Ｌｅｇｕｍａｉｎ）．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
１６（３）：５４１−５４６（１９９４）．ＴａｙｌｏｒＭＡＪ，ＢａｋｅｒＫＣ，ＢｒｉｇｇｓＧＳ，
ＣｏｎｎｅｒｔｏｎＩＦ，ＣｕｍｍｉｎｇｓＮＪ，ＰｒａｔｔＫＡ，ＲｅｖｅｌｌＤＦ，ＦｒｅｅｄｍａｎＲＢ，Ｇｏｏｄｅ
ｎｏｕｇｈＰＷ：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏ−ｒｅｇｉｏｎｓｆｒ
ｏｍｐａｐａｉｎａｎｄｐａｐａｙａｐｒｏｔｅａｓｅＩＶａｒｅ
ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｈｉｇｈａｆｆｉｎｉｔｙｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｆｔｈｅｍａｔｕｒｅｐａｐａｙａｅｎｚｙｍｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉ
ｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ８（１）：５９−６２（１９９５）．ＴｅｒｒａｓＲＧ，ＴｏｒｒｅｋｅｎｓＳ，ＶａｎＬｅｕｖｅｎＦ，ＯｓｂｏｒｎＲＷ，ＶａｎｄｅｒｌｅｙｄｅｎＪ，Ｃａｍｍｕ
ｅＢＰＡ，ＢｒｏｅｋａｅｒｔＷＦ：Ａｎｅｗｆａｍｉｌｙｏｆｂａｓｉｃｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈｐｌａｎｔａｎｔｉｆｕｎ
ｇａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍＢｒａｓｓｉｃａｃｅａｅｓｐｅｃｉ
ｅｓ．ＦＥＢＳＬｅｔｔ３１６（３）：２３３−２４０（１９９３）．ＴｈｏｍａｓＭＰ，ＴｏｐｈａｍＣＭ，ＫｏｗｌｅｓｓｕｒＤ，
ＭｅｌｌｏｒＧＷ，ＴｈｏｍａｓＥＷ，ＷｈｉｔｆｏｒｄＤ，
ＢｒｏｃｋｌｅｈｕｒｓｔＫ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｃｈｙｍｏｐａ
ｐａｉｎＭｔｈｅｌａｔｅ−ｅｌｕｔｅｄｃｈｙｍｏｐａｐａｉｎｄ
ｅｄｕｃｅｄｂｙｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓａｎｄａｃｔｉｖｅ−ｃｅｎｔｒｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓ
ｔｉｃｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｐＨ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎｅ
ｔｉｃｓｏｆｃａｔａｌｙｓｉｓａｎｄｒｅａｃｔｉｏｎｓｗｉｔｈ
ｔｉｍｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ＴｈｅＣｙｓ−２
５−Ｈｉｓ−１５９ｉｏｎ−ｐａｉｒｉｓｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔｆ
ｏｒｃａｔａｌｙｔｉｃｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅｉｎｂｏｔｈｃｈｙｍ
ｏｐａｐａｉｎＭａｎｄｐａｐａｉｎ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏ
ｕｒｎａｌ３００（３）：８０５−８２０（１９９４）．ＶａｌｐｕｅｓｔａＶ，ＬａｎｇｅＮＥ，ＧｕｅｒｒｅｒｏＣ，ＲｅｉｄＭＳ：Ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｃｙｓｔｅｉｎｅ
ｐｒｏｔｅａｓｅａｃｃｏｍｐａｎｉｅｓｔｈｅｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｉ
ｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅｏｆｄａｙｌｉｌｙ（Ｈｅｍ
ｅｒｏｃａｌｌｉｓ）ｆｌｏｗｅｒｓ．ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ２
８（３）：５７５−５８２（１９９５）．ＶｅｒｎｅｔＴ，ＢｅｒｔｉＰＪ，ＤｅＭｏｎｔｉｇｎｙＣ，ＭｕｓｉｌＲ，ＴｅｓｓｉｅｒＤＣ，ＭｅｎａｒｄＲ，Ｍａｇｎ
ｙＭ−Ｃ，ＳｔｏｒｅｒＡＣ，ＴｈｏｍａｓＤＹ：Ｐｒｏｃｅｓ
ｓｉｎｇｏｆｔｈｅｐａｐａｉｎｐｒｅｃｕｒｓｏｒ：ｔｈｅｉｏｎ
ｉｚａｔｉｏｎｓｔａｔｅｏｆａｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｍｉｎｏａ
ｃｉｄｍｏｔｉｆｗｉｔｈｉｎｔｈｅＰｒｏｒｅｇｉｏｎｐａｒｔ
ｉｃｉｐａｔｅｓｉｎｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｒａｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２７０
（１８）：１０８３８−１０８４６（１９９５）．ＶｏｌｋｅｌＨ，ＫｕｒｚＵ，ＬｉｎｄｅｒＪ，ＫｌｕｍｐｐＳ
，ＧｎａｕＶ，ＪｕｎｇＦａｎｄＳｃｈｕｌｔｚＪＥ：Ｃａｔ
ｈｅｐｓｉｎＬｉｓａｎｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅａｓ
ｅｉｎＰａｒａｍｅｃｉｕｍｔｅｔｒａｕｒｅｌｉａ．Ｐｕｒｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ，ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇａｎｄｓｐｅｃｉ
ｆｉｃｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｉｔｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｐｒｏｐ
ｅｐｔｉｄｅ．ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ２３８：１９８−２０６（１９
９６）．ＷａｔａｎａｂｅＨ，ＡｂｅＫ，ＥｍｏｒｉＹ，Ｈｏｓｏｙａｍａ
Ｈ，ＡｒａｉＳ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｇｉｂ
ｂｅｒｅｌｌｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉ
ｐｌｅｃｙｓｔｅｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｏｆｒｉｃｅｓｅｅｄｓ（
ｏｒｙｚａｉｎｓ）．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６６（２５）：１６８９７
−１６９０２（１９９１）．ＷｉｅｄｅｒａｎｄｅｒｓＢ，ＢｒｏｅｍｍｅＤ，ＫｉｒｓｃｈｋｅＨ，ＶｏｎＦｉｇｕｒａＫ，ＳｃｈｍｉｄｔＢ，ＰｅｔｅｒｓＣ
：Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｃｙｓｔｅｉ
ｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｓｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｃＤＮＡｃｏｄｉｎｇｆｏｒｈｕｍａｎｃａｔｈｅｐｓｉｎ
ｓ．ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ２６７（１９）：１３７０８−１３７１３（１
９９２）．ＹａｍａｕｃｈｉＤ，ＡｋａｓｏｆｕＨ，ＭｉｎａｍｉｋａｗａＴ：
ＣｙｓｔｅｉｎｅｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅｆｒｏｍＶｉｇｎａｍｕ
ｎｇｏ：ｇｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｐ
ｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．３３（６）：７８９−７９７（１９９
２）．

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、トウモロコシ形質転換ベクター、ｐＦＳＥ−ＰＡＴの構
築の図式的概略を示す。

【図２】図２は、ベクター、ｐＦＵＮ−βの構築の図式的概略を示す。

【図３】図３は、トウモロコシ形質転換ベクター、ｐＦＵＮ−カリカイン
の構築の図式的概略を示す。

【図４】図４は、トウモロコシ形質転換ベクター、ｐＦＵＮ−β−カリカ
インの構築の図式的概略を示す。

【図５】図５は、トウモロコシ形質転換ベクター、ｐＦＵＮ−プロカリカ
インの構築の図式的概略を示す。

【図６】図６は、トウモロコシ形質転換ベクター、ｐＦＵＮ−β−プロカ
リカインの構築の図式的概略を示す。

【図７】図７は、トウモロコシ形質転換ベクター、ｐＦＰＡＴ−カリカイ
ン、ｐＦＰＡＴ−β−カリカイン、ｐＦＰＡＴ−プロカリカインおよびｐＦＰＡ
Ｔ−β−プロカリカインの構築の図式的概略を示す。

【図８】図８は、システインプロテアーゼが植物細胞再生を阻害すること
が可能であることを例証する。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１０月１９日（２０００．１０．１９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人Ｆｅｒｎｈｕｒｓｔ，Ｈａｓｌｅｍｅｒｅ，ＳｕｒｒｅｙＧＵ27 ３ＪＥ，ＵｎｉｔｅｄＫｉｎｇｄｏｍ (72)発明者ジェプソン，イアンイギリス国バークシャーアールジー42 ６イーティー，ブラックネル，ジェロッツ・ヒル・リサーチ・ステーション (72)発明者トマ，ディディエ・ルネ・フィリップイギリス国バークシャーアールジー42 ６イーティー，ブラックネル，ジェロッツ・ヒル・リサーチ・ステーションＦターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB03 CD03 CD07 CD09 CD17 4B024 AA08 BA14 BA41 CA02 CA11 DA02 EA04 FA02 GA11 GA17 4B050 CC03 DD13 EE10 LL10 4B065 AA88Y AA89X AA90X AB01 AC14 BA02 CA33 CA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）外因性誘導因子の存在または非存在に反応する誘導性
プロモーター配列、あるいは生物の選択された組織において、または発生の選択
された段階で、遺伝子発現を開始することが可能な発生遺伝子プロモーターのい
ずれかを含む、第一のＤＮＡ配列；ｂ）プロテアーゼ酵素をコードするＤＮＡ配列を含み、（ａ）で特定されたプロ
モーター配列に作用可能であるように連結されそして該プロモーター配列の調節
下にある、第二のＤＮＡ配列；を含み、それにより、（ａ）で特定された外因性誘導因子の存在または非存在あるいは発
生遺伝子プロモーターの活性化が、前記プロテアーゼ酵素の発現を生じる、単離ＤＮＡ構築物。
【請求項２】ａ）外因性誘導因子の存在または非存在に反応する誘導性
プロモーター配列、あるいは生物の選択された組織において、または生物の発生
の選択された段階で、遺伝子発現を開始することが可能な発生遺伝子プロモータ
ーのいずれかを含む、第一のＤＮＡ配列；ｂ）細胞機能を乱す（ｄｉｓｒｕｐｔ）ことが可能なプロテアーゼ酵素をコード
するＤＮＡ配列を含み、（ａ）で特定されたプロモーター配列に作用可能である
ように連結されそして該プロモーター配列の調節下にある、第二のＤＮＡ配列；ｃ）外因性誘導因子の存在または非存在に反応するプロモーター配列、あるいは
生物の選択された組織において、または生物の発生の選択された段階で、遺伝子
発現を開始することが可能な発生遺伝子プロモーターを含む、第三のＤＮＡ配列
；およびｄ）その産物が（ｂ）で特定されたタンパク質を阻害することが可能である、Ｄ
ＮＡ配列を含み、（ｃ）で特定されたプロモーター配列に作用可能であるように
連結されそして該プロモーター配列の調節下にある、第四のＤＮＡ配列を含み、それにより、（ａ）で特定された外因性誘導因子の存在または非存在あるいは発
生遺伝子プロモーターの発現が、細胞機能を乱すことを可能にし、そしてそれに
より（ｃ）で特定された外因性誘導因子の存在または非存在あるいは発生遺伝子
プロモーターの発現が、細胞機能の混乱を妨げるまたは減少させる、ＤＮＡ構築物。
【請求項３】第一のＤＮＡ配列が、外因性誘導因子の存在または非存在
に反応する誘導性プロモーター配列を含む第六のＤＮＡ配列に作用可能であるよ
うに連結されそして該配列の調節下にある、第五のＤＮＡ配列内に含まれるＤＮ
Ａ配列によりコードされるリプレッサータンパク質に反応するオペレーター配列
をさらに含み、それにより該リプレッサータンパク質の発現が、細胞機能の混乱
を妨げるかまたは減少させる、請求項２記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４】第四のＤＮＡ配列が、（ｂ）で特定されたＤＮＡ配列と天
然に関連しているタンパク質のファミリーのメンバーをコードするＤＮＡ配列を
含む、請求項２または請求項３記載のＤＮＡ構築物。
【請求項５】第四のＤＮＡ配列が、プロテアーゼプロペプチド、プロテ
アーゼ阻害剤または細胞機能を乱すことが可能なタンパク質に対して向けられる
抗体を含む、請求項４記載のＤＮＡ構築物。
【請求項６】プロテアーゼが、標的化または非標的化システインプロテ
アーゼ酵素である、請求項１ないし５のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項７】発生遺伝子プロモーターが、初期実生（ｓｅｅｄｌｉｎｇ
）／種子プロモーターまたは病原体誘導プロモーターである、請求項１ないし６
のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項８】植物細胞または哺乳動物細胞において、細胞機能を乱すこ
とが可能な、請求項１ないし７のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項９】請求項１ないし８のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物を含
む植物を含む、植物生殖質。
【請求項１０】請求項１ないし８のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物を
含む、植物、植物種子または植物細胞。
【請求項１１】請求項１ないし８のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物を
含む、哺乳動物細胞。
【請求項１２】細胞機能を乱すための、請求項１ないし８のいずれか１
項に定義された通りのＤＮＡ構築物の使用。
【請求項１３】（ａ）外因性誘導因子の存在または非存在に反応する誘
導性プロモーター配列、あるいは植物の選択された組織において、または植物の
発生の選択された段階で、遺伝子発現を開始することが可能な発生遺伝子プロモ
ーターのいずれかを含む、第一のＤＮＡ配列；（ｂ）その産物が植物において老化を調節することが可能なタンパク質を阻害す
ることが可能である、ＤＮＡ配列を含み、（ａ）で特定されたプロモーター配列
に作用可能であるように連結されそして該プロモーター配列の調節下にある、第
二のＤＮＡ配列、それにより、外因性誘導因子の存在または非存在あるいは発生遺伝子プロモータ
ーの活性が、老化を調節することが可能な該タンパク質の合成を下方制御し、ま
たは該タンパク質の活性を実質的に減少させ、それにより、老化の過程を遅らせ
ることを可能にする、ＤＮＡ構築物。
【請求項１４】第二のＤＮＡ配列が、老化を調節することが可能なタン
パク質と天然に関連しているタンパク質のファミリーのメンバーをコードするＤ
ＮＡ配列を含む、請求項１３記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１５】第二のＤＮＡ配列が、プロテアーゼプロペプチドあるい
は部分的センスＲＮＡまたは部分的アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ配列
を含む、請求項１３または請求項１４記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１６】老化を調節することが可能なタンパク質がプロテアーゼ
酵素である、請求項１３ないし１７のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１７】プロテアーゼが、標的化または非標的化システインプロ
テアーゼである、請求項１５または請求項１６記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１８】発生遺伝子プロモーターが老化で誘導されるプロモータ
ーである、請求項１３ないし１７のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１９】植物細胞において、老化を調節することが可能なタンパ
ク質の活性を下方制御するか、または該タンパク質の活性を実質的に減少させる
ことが可能な、請求項１３ないし１８のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２０】請求項１ないし１９のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物
を含む植物を含む、植物生殖質。
【請求項２１】請求項１ないし１９のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物
を含む、植物、植物種子または植物細胞。
【請求項２２】老化を調節することが可能なタンパク質の合成を下方制
御する、または該タンパク質の活性を実質的に減少させるための、請求項１３な
いし１９のいずれか１項に定義された通りのＤＮＡ構築物の使用。
【請求項２３】（ａ）外因性誘導因子の存在または非存在に反応する誘
導性プロモーター配列、あるいは植物の選択された組織において、または植物の
発生の選択された段階で、遺伝子発現を開始することが可能な発生遺伝子プロモ
ーターのいずれかを含む、第一のＤＮＡ配列；（ｂ）その産物が植物において貯蔵タンパク質の代謝を調節することが可能なタ
ンパク質の合成を下方制御する、または該タンパク質を阻害することが可能であ
る、ＤＮＡ配列を含み、（ａ）で特定されたプロモーター配列に作用可能である
ように連結されそして該プロモーター配列の調節下にある、第二のＤＮＡ配列、
それにより、（ａ）で特定された外因性誘導因子の存在または非存在あるいは発
生遺伝子プロモーターの発現が、貯蔵タンパク質の代謝を調節することが可能な
該タンパク質の合成を下方制御し、または該タンパク質の活性を実質的に減少さ
せ、それにより、植物における貯蔵産物の性質、動員（ｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏ
ｎ）および／または分布を改変することを可能にする、ＤＮＡ構築物。
【請求項２４】第一のＤＮＡ配列が、さらに、第四のＤＮＡ配列内に含
まれるＤＮＡ配列によりコードされ、外因性誘導因子の存在に反応する誘導性プ
ロモーター配列に作用可能であるように連結されそして該配列の調節下にある、
第三のＤＮＡ配列内に含まれるＤＮＡ配列によりコードされるリプレッサータン
パク質に反応するオペレーター配列を含み、それにより該リプレッサータンパク
質の発現が、貯蔵タンパク質の代謝の改変を妨げる、請求項２３記載のＤＮＡ構
築物。
【請求項２５】外因性誘導因子の存在または非存在に反応する誘導性プ
ロモーターを含む第六のＤＮＡ配列に作用可能であるように連結されそして該配
列の調節下にある、異種タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第五のＤＮＡ
配列をさらに含み、それにより該異種タンパク質遺伝子の発現が、貯蔵タンパク
質の代謝の改変を妨げる、請求項２３または請求項２４記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２６】植物において、貯蔵タンパク質の代謝を修飾することが
可能なタンパク質がプロテアーゼ酵素である、請求項２３ないし２５のいずれか
１項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２７】貯蔵タンパク質の代謝を修飾することが可能なタンパク
質が、標的化または非標的化システインプロテアーゼ酵素である、請求項２６記
載のＤＮＡ構築物。
【請求項２８】第二のＤＮＡ配列が、貯蔵タンパク質の代謝を修飾する
ことが可能なタンパク質と天然に関連している産物をコードするＤＮＡ配列を含
む、請求項２３ないし２７のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項２９】第二のＤＮＡ配列が、プロテアーゼプロペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列を含む、請求項２３ないし２８のいずれか１項記載のＤＮＡ構
築物。
【請求項３０】第二のＤＮＡ配列が、プロテアーゼセンスＲＮＡまたは
部分的センスＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項２３ないし２９のい
ずれか１項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３１】第二のＤＮＡ配列が、プロテアーゼアンチセンスＲＮＡ
をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項２３ないし２９のいずれか１項記載のＤ
ＮＡ構築物。
【請求項３２】第二のＤＮＡ配列が、システインプロテアーゼセンス／
部分的センスまたはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、請求項
３０または請求項３１記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３３】異種タンパク質がプロテアーゼである、請求項２３ない
し３２のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３４】発生遺伝子プロモーターが初期実生プロモーターである
、請求項２３ないし３３のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３５】植物において、貯蔵タンパク質の代謝を修飾することが
可能なタンパク質の合成を下方制御する、または該タンパク質の活性を実質的に
減少させることが可能な、請求項２３ないし３４のいずれか１項記載のＤＮＡ構
築物。
【請求項３６】請求項２３ないし３５のいずれか１項記載のＤＮＡ構築
物を含む、植物、植物種子または植物細胞。
【請求項３７】貯蔵タンパク質の代謝を修飾することが可能なタンパク
質の合成を下方制御する、または該タンパク質の活性を実質的に減少させるため
の、請求項２３ないし３５のいずれか１項に定義された通りのＤＮＡ構築物の使
用。