JP2002519028A - Immune system molecules - Google Patents

Immune system molecules

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JP2002519028A JP2000557361A JP2000557361A JP2002519028A JP 2002519028 A JP2002519028 A JP 2002519028A JP 2000557361 A JP2000557361 A JP 2000557361A JP 2000557361 A JP2000557361 A JP 2000557361A JP 2002519028 A JP2002519028 A JP 2002519028A
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polypeptide
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タング、ワイ・トム
コーレイ、ニール・シー
ゴルゴン、ジーナ・エイ
ゲグラー、カール・ジェイ
パターソン、チャンドラ
ボーグン、マライア・アール
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト免疫系分子(ISMO)及びISMOを同定かつコードするポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、発現ベクタ、宿主細胞、抗体、アゴニスト及びアンタゴニストを提供する。また本発明はISMOの発現に関連する障害を診断、治療或いは予防するための方法も提供する。 (57) SUMMARY The present invention provides human immune system molecules (ISMO) and polynucleotides that identify and encode ISMO. The present invention also provides expression vectors, host cells, antibodies, agonists and antagonists. The present invention also provides a method for diagnosing, treating or preventing a disorder associated with the expression of ISMO.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 技術分野 本発明は、免疫系分子の核酸配列及びアミノ酸配列に関し、免疫系及び細胞増
殖に関連する障害の診断、治療及び予防におけるこれらの配列の使用法に関する
[0001] Technical Field The present invention relates to nucleic acid and amino acid sequences of the immune system molecules, diagnosis of disorders associated with the immune system and cell growth relates to the use of these sequences in the treatment and prevention.

【0002】 背景技術 全ての脊椎動物では、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫感染からの保護するため
の精巧で、複雑な免疫系が発達している。免疫系の重要な特徴は、外来分子と自
己の分子とを明確に区別できることである。外来分子、すなわち抗原は、宿主細
胞の分化、増殖及び伝染を刺激することにより、免疫応答を引き起こす。免疫応
答は、最終的に病原を破壊或いは中和する細胞防御機構の積極的な選択、増幅及
び活性化を調整する。免疫応答は、生存に必要不可欠でないが、炎症、アレルギ
ー及び自己免疫障害のような望ましくない状態を引き起こす場合がある。
BACKGROUND OF THE INVENTION In all vertebrates, a sophisticated and complex immune system has been developed to protect against viral, bacterial, fungal and parasitic infections. An important feature of the immune system is the ability to clearly distinguish between foreign and own molecules. Foreign molecules, or antigens, elicit an immune response by stimulating the differentiation, proliferation and transmission of host cells. The immune response regulates the active selection, amplification and activation of cell defense mechanisms that ultimately destroy or neutralize pathogens. The immune response is not essential for survival, but can cause undesirable conditions such as inflammation, allergies and autoimmune disorders.

【0003】 免疫応答は主に、3つの主な細胞タイプ、すなわちリンパ球、顆粒球及び単核
白血球に分類される白血球によって媒介される。リンパ球は、T細胞及びB細胞
を含み、外来抗原を明確に識別し、応答する。T細胞は、ウイルス感染と闘い、
他の白血球を活性化するために重要であり、一方、B細胞は細菌或いは他の病原
菌を中和する抗体を分泌する。顆粒球及び単核白血球は主に、血流から出て組織
内で感染と闘う移動性の食菌細胞である。好中球は、最も一般的な顆粒球であり
、食菌作用及び細菌の破壊のために特に重要である。
[0003] The immune response is mediated primarily by leukocytes, which are classified into three main cell types: lymphocytes, granulocytes and mononuclear leukocytes. Lymphocytes, including T cells and B cells, clearly identify and respond to foreign antigens. T cells fight viral infections,
Important for activating other leukocytes, while B cells secrete antibodies that neutralize bacteria or other pathogens. Granulocytes and mononuclear leukocytes are mainly migrating phagocytic cells that emerge from the bloodstream and fight infection in tissues. Neutrophils are the most common granulocytes and are particularly important for phagocytosis and bacterial destruction.

【0004】 抗体 抗体、すなわち免疫グロブリン(Ig)は、B細胞によって循環内に分泌され
、微生物細胞の表面上の抗原を認識することができる。原型抗体は、ジスルフィ
ド結合を介して互いに結合される、2つ同一の重鎖ポリペプチド(H鎖)及び2
つの同一の軽鎖ポリペプチド(L鎖)からなる四量体である。この構成は、抗体
分子に特徴的なY形状を付与する。抗体は、H鎖組成物に基づいて分類される。
5つの分類クラス、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMはそれぞれ、α
、δ、ε、γ及びμH鎖タイプによって規定される。2つタイプのL鎖、κ及び
λがあり、そのいずれかが任意のH鎖対と、対として関係する場合もある。Ig
Gは、循環内で見出された最も一般的な抗体のクラスであり、上記のような四量
体であり、一方他の抗体のクラスは一般に、この基本構造の変異体或いは多量体
である。
Antibodies Antibodies, or immunoglobulins (Ig), are secreted into the circulation by B cells and can recognize antigens on the surface of microbial cells. The prototype antibody is composed of two identical heavy chain polypeptides (H chains) and 2 linked together via disulfide bonds.
A tetramer consisting of two identical light chain polypeptides (L chains). This configuration gives the antibody molecule a characteristic Y shape. Antibodies are classified based on heavy chain composition.
The five classification classes, IgA, IgD, IgE, IgG and IgM, are each α
, Δ, ε, γ, and μH chain types. There are two types of light chains, kappa and lambda, either of which may be associated as a pair with any heavy chain pair. Ig
G is the most common class of antibodies found in the circulation and is a tetramer as described above, while other antibody classes are generally variants or multimers of this basic structure .

【0005】 H鎖及びL鎖はそれぞれ、N末端可変領域及びC末端定常領域を含む。定常領
域の配列は、L鎖内の約110アミノ酸とH鎖内の約330或いは440アミノ
酸とからなり、特定のクラスのH鎖或いはL鎖内ではほぼ同一である。しかしな
がら、可変領域の配列は、約110アミノ酸からなり、特定のクラスのH鎖或い
はL鎖内で異なる。各H鎖及びL鎖可変領域内には、それぞれ約5〜10アミノ
酸からなる、広範な配列多様性の3つの高頻度可変領域がある。抗体分子におい
て、H鎖及びL鎖高頻度可変領域は、ともに抗原結合部位を形成するようになる
(Alberts, H. et al. (1994) Molecular Biology of the Cell. Garland Publi
shing, New York, NY, pages 1206-1213 and 1216-1217)。
[0005] The heavy and light chains each include an N-terminal variable region and a C-terminal constant region. The sequence of the constant region consists of about 110 amino acids in the L chain and about 330 or 440 amino acids in the H chain, and is nearly identical in a particular class of H or L chain. However, the sequence of the variable region consists of about 110 amino acids and differs within a particular class of H or L chain. Within each H and L chain variable region are three hypervariable regions of extensive sequence diversity, each consisting of about 5-10 amino acids. In antibody molecules, the H and L chain hypervariable regions together form an antigen-binding site (Alberts, H. et al. (1994) Molecular Biology of the Cell. Garland Publi).
shing, New York, NY, pages 1206-1213 and 1216-1217).

【0006】 組換えDNA技術は、治療及び診断因子として用いるために遺伝子操作された
抗体の生成を可能にしている。例えば、ヒト疾患関連タンパク質に対して作られ
たげっ歯類抗体は、定常領域をヒト抗体からの定常領域と置き換えることにより
「ヒト化」することができる(Joughans. R. P. et al. (1990) Cancer Ret. 50
:1495-1502)。これらのヒト化抗体の可変領域は、ヒト疾患関連タンパク質を認
識し、一方定常領域は、下流エフェクタを活性化し、ヒト宿主において抗体自体
が外来分子として認識されるのを防ぐ。ヒト化抗体は、霊長類モデル系の移植拒
絶の防止、及び乳癌細胞株の抗増殖活性のための有効な治療因子であることが立
証されている(Brown, P. 5. et al. (1991) Proc. NatI. Acad. Sd. USA 88:26
63-2667)。
[0006] Recombinant DNA technology has allowed the generation of engineered antibodies for use as therapeutic and diagnostic agents. For example, a rodent antibody raised against a human disease-related protein can be "humanized" by replacing the constant region with a constant region from a human antibody (Joughans. RP et al. (1990) Cancer Ret. 50
: 1495-1502). The variable regions of these humanized antibodies recognize human disease-related proteins, while the constant regions activate downstream effectors and prevent the antibody itself from being recognized as a foreign molecule in a human host. Humanized antibodies have been demonstrated to be effective therapeutic factors for the prevention of transplant rejection in primate model systems and for the antiproliferative activity of breast cancer cell lines (Brown, P. 5. et al. (1991). Proc. NatI. Acad. Sd. USA 88:26
63-2667).

【0007】 自己免疫 自己免疫障害は、外来分子から自己の分子を区別するための免疫系の障害によ
って引き起こされ、循環内の自己抗体の存在によって特徴付けられる。全身性紅
班性狼瘡(SLE)は、結合組織炎症を引き起こす死に至る可能性のある自己免
疫障害である。SLEの他の症状は、関節痛、顔面発疹、貧血、疲労、発熱、吐
気、腎不全、胸膜炎、関節炎、心膜炎及び神経障害などがある。SLEは特に、
有色人種の20〜40代の若い女性の間に共通している。種々の自己抗体がSL
E患者の循環内において見出されており、全核及び核成分、細胞質成分及び特定
の細胞集団に対する抗体を含む。La抗原は、いくつかのSLE自己抗体によっ
て認識される細胞質タンパク質である(Chambers, J. C. atsd Keene, J. D. (1
985) Proc. NatI. Acad. Sci. USA 82:2115-2119; Chambers. J. C. es al. (19
88) J. Biol. Chem. 263:18043-18051)。Laは、新規に合成されたRNAポリ
メラーゼIII転写物の末端においてポリウリジン路と関連する408アミノ酸
ポリペプチドである。Laは、N末端リボ核タンパク質(RNP)コンセンサス
モチーフ、中央に伸長したα螺旋ドメイン及び親水性C末端ドメインを含む。L
aのC末端及びRPN領域は、特にSLE自己免疫抗体と反応する。Laは、蚊
、ショウジョウバエ、マウス、カエル、酵母及びヒトを含む多様な生物内で保存
される(Pardigon, N. (1996) J. Virol. 70:1173- 1181)。
Autoimmune autoimmune disorders are caused by impairments in the immune system to distinguish self molecules from foreign molecules and are characterized by the presence of autoantibodies in the circulation. Systemic lupus erythematosus (SLE) is a potentially fatal autoimmune disorder that causes connective tissue inflammation. Other symptoms of SLE include joint pain, facial rash, anemia, fatigue, fever, nausea, renal failure, pleurisy, arthritis, pericarditis and neuropathy. SLE, in particular,
It is common among young women in their 20s and 40s of color. Various autoantibodies are SL
It has been found in the circulation of E patients and includes antibodies to the whole nucleus and nuclear components, cytoplasmic components and specific cell populations. The La antigen is a cytoplasmic protein recognized by several SLE autoantibodies (Chambers, JC atsd Keene, JD (1
985) Proc. NatI. Acad. Sci. USA 82: 2115-2119; Chambers. JC es al. (19
88) J. Biol. Chem. 263: 18043-18051). La is a 408 amino acid polypeptide associated with the polyuridine tract at the end of newly synthesized RNA polymerase III transcripts. La contains an N-terminal ribonucleoprotein (RNP) consensus motif, a centrally extended α-helical domain and a hydrophilic C-terminal domain. L
The C-terminal and RPN regions of a react specifically with SLE autoimmune antibodies. La is conserved in a variety of organisms, including mosquitoes, Drosophila, mice, frogs, yeast and humans (Pardigon, N. (1996) J. Virol. 70: 1173-1181).

【0008】 好中球活性 好中球は、種々のタイプのリソソーム及び分泌顆粒を含む食菌細胞である。こ
れらの顆粒は、食菌作用を受けた材料の分解のための消化酵素を含む。1つの顆
粒のタイプは、二次或いは特異性顆粒と呼ばれ、好中球ゼラチナーゼ関連リポカ
リン(lipocalin)(NGAL)を含む(Cowland, J. B. (1997) Genomics 45:1
7-23)。リポカリンは一般に、小さな疎水性の分子を結合し、輸送する。NGA
Lは特に、細菌性リポ多糖体及び、ホルミルペプチドのような走化性ペプチドに
結合することが提案されている。さらに、NGALは炎症のモジュレータとして
機能する場合もある。NGALは、骨髄及び微生物に晒される傾向がある組織内
で発現される。
[0008] Neutrophil activity Neutrophils are phagocytic cells including various types of lysosomes and secretory granules. These granules contain digestive enzymes for the degradation of the phagocytosed material. One type of granules, called secondary or specific granules, contains neutrophil gelatinase-related lipocalin (NGAL) (Cowland, JB (1997) Genomics 45: 1).
7-23). Lipocalins generally bind and transport small hydrophobic molecules. NGA
L is specifically proposed to bind to bacterial lipopolysaccharides and chemotactic peptides such as formyl peptides. In addition, NGAL may function as a modulator of inflammation. NGAL is expressed in bone marrow and tissues that are prone to microbial exposure.

【0009】 種々の免疫系障害は、制御されていない細胞増殖と関連する。例えば、急性及
び慢性骨髄性白血病は、好中球および他の顆粒球の異常な増殖によって引き起こ
され、骨髄腫は、B細胞に由来する抗体分泌腫瘍の形成によって引き起こされる
。さらに、HIVを含む種々の疾患及び因子は、疾患した固体を、ある場合に死
に至る可能性の高い細菌性及びウイルス性を受けやすくする免疫不全を引き起こ
す(Golub, F. S. et al. (1987) Immunolney: A Synthesis, Sinaner Associat
es. Sunderland. MA, pages 481 and 509-530)。
[0009] Various immune system disorders are associated with uncontrolled cell proliferation. For example, acute and chronic myeloid leukemias are caused by abnormal proliferation of neutrophils and other granulocytes, and myeloma is caused by the formation of antibody-secreting tumors derived from B cells. In addition, various diseases and factors, including HIV, cause an immune deficiency that renders diseased individuals susceptible to bacterial and viral properties, which in some cases can be fatal (Golub, FS et al. (1987) Immunolney : A Synthesis, Sinaner Associat
es. Sunderland. MA, pages 481 and 509-530).

【0010】 新規の免疫系分子及びそれをコードするヌクレオチドの発見は、免疫系及び細
胞増殖に関連する障害の診断、治療及び予防において有用な新規の組成物を提供
することができ、当分野における必要性を満足する。
[0010] The discovery of novel immune system molecules and nucleotides encoding them can provide novel compositions useful in the diagnosis, treatment and prevention of disorders related to the immune system and cell proliferation, Satisfies the need.

【0011】 発明の概要 本発明は、新規の免疫系分子、それをコードするヌクレオチド並びに免疫系及
び細胞増殖に関連する障害の診断、治療及び予防において有用な新規の組成物の
使用法に基づいている。
SUMMARY OF THE INVENTION The present invention is based on novel immune system molecules, the nucleotides encoding them, and the use of the novel compositions useful in the diagnosis, treatment and prevention of disorders related to the immune system and cell proliferation. I have.

【0012】 本発明は、集合的に「ISMO」と呼ばれ、個別に「ISMO−1」、「IS
MO−2」、「ISMO−3」及び「ISMO−4」と呼ばれる、実質的に精製
されたポリペプチド、免疫系分子を特徴とする。一態様では、本発明は、SEQ
ID NO:1〜SEQ ID NO:4、及びそのフラグメントからなるグルー
プから選択されるアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチドを提供す
る。
The present invention is collectively referred to as “ISMO”, and separately referred to as “ISMO-1”, “ISMO”.
Substantially purified polypeptides, referred to as "MO-2", "ISMO-3" and "ISMO-4", characterized by immune system molecules. In one aspect, the present invention provides a SEQ.
Provided is a substantially purified polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, and fragments thereof.

【0013】 さらに本発明は、SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:4のアミノ酸配
列或いはこれらの配列いずれかのフラグメントに少なくとも90%アミノ酸配列
同一性を有する実質的に精製された変異体を提供する。また本発明は、SEQ
ID NO:1〜SEQ ID NO:4、及びそのフラグメントからなるグルー
プから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離され、精製
されたポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、SEQ ID NO:1〜S
EQ ID NO:4、及びそのフラグメントからなるグループから選択されるア
ミノ酸配列含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに少なくとも70%
ポリヌクレオチド配列同一性を有する単離され、精製されたポリヌクレオチド変
異配列を含む。
The invention further provides a substantially purified variant having at least 90% amino acid sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, or a fragment of any of these sequences. I do. The present invention also relates to SEQ
An isolated and purified polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, and fragments thereof is provided. In addition, the present invention provides SEQ ID NO: 1 to S
At least 70% for a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of EQ ID NO: 4 and fragments thereof
Includes isolated and purified polynucleotide variant sequences having polynucleotide sequence identity.

【0014】 さらに本発明は、SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:4、及びそのフ
ラグメントからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドに厳密な条件下でハイブリダイズする単離され、精
製されたポリヌクレオチド、並びにSEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:
4、及びそのフラグメントからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含む
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列を有する単離され、
精製されたポリヌクレオチドを提供する。
Further, the present invention hybridizes under stringent conditions to a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, and fragments thereof. An isolated and purified polynucleotide, as well as SEQ ID NO: 1 through SEQ ID NO:
4, and an isolated sequence having a sequence complementary to a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of:
Provide a purified polynucleotide.

【0015】 また本発明は、SEQ ID NO:5〜SEQ ID NO:8、及びそのフラ
グメントからなるグループから選択されるポリヌクレオチド配列を含む単離され
、精製されたポリヌクレオチドを提供する。さらに本発明は、SEQ ID NO
:5〜SEQ ID NO:8、及びそのフラグメントからなるグループから選択
されるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに少なくとも70%ポリヌ
クレオチド配列同一性を有する単離され、精製されたポリヌクレオチド変異配列
、並びにSEQ ID NO:5〜SEQ ID NO:8、及びそのフラグメント
からなるグループから選択されるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
に相補的な配列を有する単離され、精製されたポリヌクレオチドを提供する。
[0015] The present invention also provides an isolated and purified polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8, and fragments thereof. Further, the present invention provides a method according to SEQ ID NO.
: 5. An isolated and purified polynucleotide variant having at least 70% polynucleotide sequence identity to a polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 8, and fragments thereof; and Provided is an isolated and purified polynucleotide having a sequence that is complementary to a polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 5 to 8 and fragments thereof.

【0016】 さらに本発明は、SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:4、及びそのフ
ラグメントからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドの少なくともフラグメントを含む発現ベクタを提供
する。別の態様では、発現ベクタは宿主細胞に含まれる。
Further, the present invention provides an expression vector comprising at least a fragment of a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, and fragments thereof. I do. In another aspect, the expression vector is contained in a host cell.

【0017】 また本発明は、SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:4、及びそのフラ
グメントからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを生
成するための方法を提供し、その方法は、(a)ポリペプチドの発現に適した条
件下で、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの少なくともフラグメ
ントを有する発現ベクタを含む宿主細胞を培養する過程と、(b)その宿主細胞
培養株からポリペプチドを回収する過程とを有する。
The present invention also provides a method for producing a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, and fragments thereof, the method comprising: (A) culturing a host cell containing an expression vector having at least a fragment of a polynucleotide encoding the polypeptide under conditions suitable for expressing the polypeptide; and (b) culturing the polypeptide from the host cell culture. Recovering.

【0018】 また本発明は、適当な医薬品担体とともに、SEQ ID NO:1〜SEQ
ID NO:4、及びそのフラグメントからなるグループから選択されるアミノ
酸配列を有する実質的に精製されたポリペプチドを含む医薬品組成物を提供する
The present invention also relates to a method for preparing a pharmaceutical composition, comprising the steps of:
A pharmaceutical composition comprising a substantially purified polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of ID NO: 4, and fragments thereof.

【0019】 さらに本発明は、SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:4、及びそのフ
ラグメントからなるグループから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに
結合する精製された抗体、並びにそのポリペプチドの精製されたアゴニスト及び
精製されたアンタゴニストを提供する。
Further, the present invention provides a purified antibody that binds to a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, and fragments thereof, and purification of the polypeptide. Provided agonists and purified antagonists.

【0020】 また本発明は、SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:4、及びそのフラ
グメントからなるグループから選択されるアミノ酸配列を有する実質的に精製さ
れたポリペプチドのアンタゴニストの有効量を治療を要する被検者に投与する過
程を含む、免疫系に関連する障害を治療或いは予防するための方法を提供する。
The invention also provides a method of treating an effective amount of an antagonist of a substantially purified polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 through SEQ ID NO: 4, and fragments thereof. Provided is a method for treating or preventing a disorder related to an immune system, including a step of administering to a subject in need thereof.

【0021】 また本発明は、SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:4、及びそのフラ
グメントからなるグループから選択されるアミノ酸配列を有する実質的に精製さ
れたポリペプチドのアンタゴニストの有効量を治療を要する被検者に投与する過
程を含む、細胞増殖に関連する障害を治療或いは予防するための方法を提供する
The invention also provides a method of treating an effective amount of an antagonist of a substantially purified polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 through SEQ ID NO: 4, and fragments thereof. Provided is a method for treating or preventing a disorder associated with cell proliferation, including a step of administering to a subject in need thereof.

【0022】 また本発明は、核酸を含む生物学的サンプルにおいてSEQ ID NO:1〜
SEQ ID NO:4、及びそのフラグメントからなるグループから選択される
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するた
めの方法を提供し、その方法は、(a)SEQ ID NO:1〜SEQ ID N
O:4、及びそのフラグメントからなるグループから選択されるアミノ酸配列を
含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの相補配列を生物学的サンプル
の核酸の少なくとも1つにハイブリダイズさせ、それよりハイブリダイゼーショ
ン複合体を形成する過程と、(b)そのハイブリダイゼーション複合体を検出す
る過程とを有し、ハイブリダイゼーション複合体の存在が生物学的サンプルにお
けるそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在と相関をなしている
。一態様では、生物学的サンプルの核酸は、ハイブリダイズする前にポリメラー
ゼ連鎖反応により増幅される。
[0022] The present invention also provides a biological sample containing nucleic acid, wherein SEQ ID NO: 1
Provided is a method for detecting a polynucleotide encoding a polypeptide having an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 4 and fragments thereof, comprising: (a) SEQ ID NO: 1 SEQ ID N
A hybridizing sequence of a polynucleotide encoding a polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of O: 4 and a fragment thereof is hybridized to at least one of the nucleic acids of the biological sample; And (b) detecting the hybridization complex, wherein the presence of the hybridization complex correlates with the presence of the polynucleotide encoding the polypeptide in the biological sample. I have. In one aspect, the nucleic acids of the biological sample are amplified by the polymerase chain reaction before hybridizing.

【0023】 発明を実施するための形態 本タンパク質、ヌクレオチド配列及び方法を記載する前に、本発明は記載され
る特定の方法、プロトコル、細胞株、ベクタ並びに薬剤に限定されず、変更され
る場合もあることを理解されたい。また本明細書で用いられる専門用語は、特定
の実施例を記載することのみを目的としており、本発明の範囲を制限することを
意図するわけではなく、本発明は添付の請求の範囲によってのみ限定されること
を理解されたい。
[0023] Embodiments of the invention the protein, before describing the nucleotide sequence and method, if the present invention is the particular method described, the protocol is not limited to cell lines, vectors and agents are modified Please understand that there is also. Also, the terminology used herein is for the purpose of describing particular embodiments only, and is not intended to limit the scope of the invention, which is defined solely by the appended claims. It should be understood that it is limited.

【0024】 本明細書で用いられるように、添付の請求の範囲では、単数形の冠詞並びに「
その(前記)」は、文脈において異なるように明確に規定されない限り、複数の
指示物を含むことに注意されたい。従って例えば、「ある宿主細胞」が示すもの
は、複数のそのような宿主細胞を含んでおり、「その抗体」は当業者には既知の
1つ或いはそれ以上の抗体及びその等価物を示しており、他も同様である。
As used herein, in the appended claims, the singular articles "
It is noted that "the" (or above) includes a plurality of indications unless the context clearly dictates otherwise. Thus, for example, reference to "a host cell" includes a plurality of such host cells, and "the antibody" refers to one or more antibodies and their equivalents known to those of skill in the art. And so on.

【0025】 異なるように規定されなければ、本明細書で用いられる科学技術用語は、本発
明が属する分野の当業者に通常理解されているのと同じ意味である。本明細書で
記載される内容と類似或いは等価な任意の方法、装置並びに材料が本発明の検証
に際して用いられてもよいが、好適な方法、装置並びに材料は本明細書中に記載
される。本明細書に記載される全ての発行物は、本発明に関連して用いられる場
合がある発行物において報告される細胞株、ベクタ、方法論を記載及び開示する
ために、参照して本明細書の一部としている。本明細書に記載される内容は、本
発明が、先行発明によるそのような開示に先行して権利を与えられないことを容
認するものと解釈されるべきではない。
Unless defined differently, technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. Although any methods, devices, and materials similar or equivalent to those described herein can be used in the verification of the present invention, the preferred methods, devices and materials are described herein. All publications described herein are hereby incorporated by reference to describe and disclose the cell lines, vectors, and methodologies reported in the publications that may be used in connection with the present invention. And part of it. Nothing herein is to be construed as an admission that the invention is not entitled to antedate such disclosure by prior invention.

【0026】 表1は、特徴付け及び同定するために用いられるプログラム、その説明、参考
文献及び(当てはまる場合には)閾値パラメータを示す。
Table 1 shows the program used for characterization and identification, its description, references and (if applicable) threshold parameters.

【0027】 定義 「ISMO」は自然、合成、半合成或いは組換え体の何れかの任意のソースか
らの任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及び好適にはヒトを含む
哺乳類から得られる実質的に精製されたISMOのアミノ酸配列である。
Definitions "ISMO" refers to any species from any source, whether natural, synthetic, semi-synthetic or recombinant, in particular from mammals, including cows, sheep, pigs, rats, horses and, preferably, humans. 4 is the amino acid sequence of the resulting substantially purified ISMO.

【0028】 「アゴニスト」は、ISMOに結合される際に、ISMOの量を増加するか、
或いは活性の期間を延長する分子のことである。アゴニストはタンパク質、核酸
、炭水化物或いはISMOに結合し、その作用を調節する任意の他の分子を含む
場合がある。
An “agonist” increases the amount of ISMO when bound to ISMO,
Alternatively, it is a molecule that extends the period of activity. Agonists may include proteins, nucleic acids, carbohydrates or any other molecule that binds to and modulates the action of ISMO.

【0029】 「アレル変異配列」はISMOをコードする遺伝子の代替形である。アレルは
、核酸配列における少なくとも1つの突然変異から生じ、変化したmRNA或い
はポリペプチドを生じ、その構造或いは機能は変化する場合もしない場合もある
。任意の所与の遺伝子は、1つ或いは多くのアレル形を有する場合もあれば、全
く有さない場合もある。アレルを引き起こす通常の突然変異は一般に、ヌクレオ
チドの自然の欠失、付加或いは置換に起因する。これらの種類の変化はそれぞれ
単独で、或いは他との組み合わせにおいて、所与の配列において1回或いは2回
以上生じる場合がある。
“Allelic variant” is an alternative form of the gene encoding ISMO. An allele results from at least one mutation in a nucleic acid sequence, resulting in an altered mRNA or polypeptide, with or without altering its structure or function. Any given gene may have one or many allelic forms, or none. Common mutations that cause alleles generally result from natural deletions, additions or substitutions of nucleotides. Each of these types of changes, alone or in combination with others, may occur one or more times in a given sequence.

【0030】 ISMOをコードする「変化した」核酸配列は、同一或いは機能的に等価なI
SMOをコードするポリヌクレオチドをもたらす種々のヌクレオチドの欠失、挿
入或いは置換を含む。本定義には、ISMOをコードするポリヌクレオチドのあ
る特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出することができる場合
もできない場合もある多形性及びISMOをコードするポリヌクレオチド配列に
対する通常の染色体位置とは異なる位置を有する、アレルへの不適当な或いは予
想外のハイブリダイゼーションが含まれる。またコードされたタンパク質は「変
化して」、サイレント変化を生成し、機能的に等価なISMOをもたらすアミノ
酸残基の欠失、挿入或いは置換も含む場合もある。故意のアミノ酸置換は、IS
MOの生物活性が保持される限り、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性
並びにまた両親媒性における類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に
帯電したアミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸を含み、正に帯電したアミ
ノ酸はリジン及びアルギニンを含み、同様の親水値を有する帯電していない極性
頭基(polar head group)有するアミノ酸はロイシン、イソロイシン及びバリン
、グリシン及びアラニン、アスパラギン及びグルタミン、セリン及びスレオニン
、フェニルアラニン及びチロシンを含む。
An “altered” nucleic acid sequence encoding an ISMO may have the same or a functionally equivalent I
Includes deletions, insertions or substitutions of various nucleotides resulting in a polynucleotide encoding SMO. This definition includes polymorphisms that may or may not be readily detectable using a particular oligonucleotide probe of a polynucleotide encoding ISMO and normal chromosomal locations relative to the polynucleotide sequence encoding ISMO. Inappropriate or unexpected hybridization to an allele with a different position than that included. The encoded protein may also include "deletions", insertions or substitutions of amino acid residues that "change" to produce a silent change and result in a functionally equivalent ISMO. Intentional amino acid substitutions are
The determination can be based on similarity in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and also amphipathicity of the residues, as long as the biological activity of the MO is retained. For example, negatively charged amino acids include aspartic acid and glutamic acid, positively charged amino acids include lysine and arginine, and amino acids having an uncharged polar head group with similar hydrophilicity are leucine; Includes isoleucine and valine, glycine and alanine, asparagine and glutamine, serine and threonine, phenylalanine and tyrosine.

【0031】 「アミノ酸」或いは「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペ
プチド或いはタンパク質配列及びそのフラグメント、並びに自然発生或いは合成
分子のことである。ISMOのフラグメントは長さが約5〜約15アミノ酸であ
り、14アミノ酸が最も好ましく、ISMOの生物学的活性或いは免疫学的活性
を保持していることが好ましい。「アミノ酸配列」は自然発生タンパク質分子の
アミノ酸配列を示すものとして表されるが、アミノ酸配列等の用語は、示される
タンパク質分子に関連する完全な自然アミノ酸配列にそのアミノ酸配列を限定す
ることを意味しない。
“Amino acid” or “amino acid sequence” refers to oligopeptide, peptide, polypeptide or protein sequences and fragments thereof, as well as naturally occurring or synthetic molecules. Fragments of ISMO are about 5 to about 15 amino acids in length, most preferably 14 amino acids, and preferably retain the biological or immunological activity of ISMO. "Amino acid sequence" is expressed as indicating the amino acid sequence of a naturally occurring protein molecule, although terms such as amino acid sequence mean that the amino acid sequence is limited to the complete natural amino acid sequence associated with the indicated protein molecule. do not do.

【0032】 「増幅」は、核酸配列のさらなる複製の生成のことであり、一般に当分野にお
いて周知のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術を用いて実行される(例えば、 Dieffenbach, C.W.及びG.S. Dveksler (1995) PCR Primer, a Lab. oratory Ma
nual, Cold Spring Harbor Press,Plainview, NY, pp. 1-5.を参照されたい)。
“Amplification” refers to the generation of additional copies of a nucleic acid sequence and is generally performed using the polymerase chain reaction (PCR) technique well known in the art (eg, Dieffenbach, CW and GS Dveksler (1995). ) PCR Primer, a Lab.oratory Ma
nual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, pp. 1-5.).

【0033】 「アンタゴニスト」は、ISMOに結合される際にISMOの生物学的或いは
免疫学的活性を減少させる分子のことである。アンタゴニストはタンパク質、核
酸、炭水化物或いはISMOに結合し、ISMOの作用を減少させる任意の他の
分子を含む場合がある。
“Antagonist” refers to a molecule that reduces the biological or immunological activity of ISMO when it binds to ISMO. Antagonists may include proteins, nucleic acids, carbohydrates or any other molecule that binds to and reduces the effect of ISMO.

【0034】 「抗体」は、エピトープ決定基を結合することができる、Fa、F(ab′) 2 及びFvのような無傷の分子及びそのフラグメントのことである。ISMOポ
リペプチドを結合する抗体は、免疫性抗原として対象の小さなペプチドを含む無
傷のポリペプチド或いはフラグメントを用いて作製ことができる。動物(例えば
マウス、ラット或いはウサギ)を免疫するために用いられるポリペプチド或いは
オリゴペプチドは、RNAの翻訳に由来するか、或いは化学的に合成され、所望
により担体タンパク質に結合することができる。ペプチドに化学的に結合される
通常用いられる担体は、ウシ血清アルブミン及びサイログロブリン、キーホール
リンペットヘモシアニン(KLH)を含む。その後結合されたペプチドを用いて
動物を免疫する。
An “antibody” is a Fa, F (ab ′) that can bind an epitope determinant. Two And intact molecules such as Fv and fragments thereof. ISMO PO
Antibodies that bind the repeptide are those that contain the small peptide of interest as an immunizing antigen.
It can be prepared using wound polypeptides or fragments. Animals (for example
Polypeptides used to immunize mice, rats or rabbits) or
Oligopeptides can be derived from the translation of RNA or chemically synthesized
Can bind to the carrier protein. Chemically attached to the peptide
Commonly used carriers are bovine serum albumin and thyroglobulin, keyhole
Contains limpet hemocyanin (KLH). Then using the coupled peptide
Immunize the animal.

【0035】 「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の部分(すなわちエピトープ)
のことである。タンパク質或いはそのフラグメントを用いて宿主動物を免疫する
際、タンパク質の多くの領域が、タンパク質上の所与の領域或いは三次元構造体
に特異に結合する抗体の生成を誘発する場合がある。これらの領域或いは構造体
は抗原決定基と呼ばれる。抗原決定基は、抗体に結合するために、無傷の抗原(
すなわち免疫反応を誘発するために用いられるイムノゲン)と競合する場合があ
る。
An “antigenic determinant” is the portion of a molecule that makes contact with a particular antibody (ie, an epitope)
That is. When immunizing a host animal with a protein or fragment thereof, many regions of the protein may trigger the production of antibodies that specifically bind to a given region or three-dimensional structure on the protein. These regions or structures are called antigenic determinants. The antigenic determinant converts the intact antigen (
That is, it may compete with an immunogen used to induce an immune response).

【0036】 「アンチセンス」は、特異なDNA或いはRNA配列に相補的なヌクレオチド
配列を含む任意の組成物である。用語「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖に相
補的な核酸鎖を示すために用いられる。アンチセンス分子はペプチド核酸を含み
、合成或いは転写を含む任意の方法により生成することができる。一度細胞内に
導入されれば、相補ヌクレオチドは細胞により生成される自然配列と結合し、二
重鎖を形成し、転写或いは翻訳のいずれかを遮断する。記号「負(マイナス)」
はアンチセンス鎖を示す際に用いられる場合があり、「正(プラス)」はセンス
鎖を示す場合に用いられることがある。
“Antisense” is any composition that contains a nucleotide sequence that is complementary to a specific DNA or RNA sequence. The term "antisense strand" is used to indicate a nucleic acid strand that is complementary to the "sense" strand. Antisense molecules include peptide nucleic acids and can be produced by any method, including synthetic or transcription. Once introduced into the cell, the complementary nucleotide binds to the native sequence produced by the cell, forms a duplex, and blocks either transcription or translation. Symbol "negative (minus)"
Is sometimes used to indicate an antisense strand, and “positive (plus)” is sometimes used to indicate a sense strand.

【0037】 「生物学的活性」は、自然発生分子の構造的、調節的或いは生化学的機能を有
するタンパク質のことである。同様に「免疫学的活性」は自然、組換え或いは合
成ISMO、又はその任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞において
特異な免疫反応を誘発し、かつ特異な抗体と結合する能力のことである。
“Biological activity” refers to a protein that has structural, regulatory, or biochemical functions of a naturally occurring molecule. Similarly, "immunological activity" refers to the ability of natural, recombinant or synthetic ISMO, or any of its oligopeptides, to elicit a specific immune response in a suitable animal or cell and to bind to a specific antibody. is there.

【0038】 「相補的」或いは「相補性」は、塩基対による許容塩類及び温度条件下でのポ
リヌクレオチドの自然結合のことである。例えば、配列「A−G−T」の場合、
相補配列「T−C−A」に結合する。2つの一本鎖分子間の相補性は、核酸のあ
るものだけが結合する「部分的」であるか、或いは完全な相補性が一本鎖分子間
に存在する場合には「完全」である場合もある。核酸鎖間の相補性の度合いは、
核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に著しく影響する。これは核
酸鎖間の結合に及びペプチド核酸(PNA)分子の設計及び使用に依存する増幅
反応において特に重要である。
“Complementary” or “complementarity” refers to the natural association of polynucleotides under permissive salts and temperature conditions by base pairing. For example, in the case of the sequence "AGT",
It binds to the complementary sequence "TCA". The complementarity between two single-stranded molecules is "partial", where only some of the nucleic acids bind, or "complete" if perfect complementarity exists between the single-stranded molecules In some cases. The degree of complementarity between nucleic acid strands is
It significantly affects the efficiency and strength of hybridization between nucleic acid strands. This is particularly important in amplification reactions that rely on the binding between nucleic acid strands and the design and use of peptide nucleic acid (PNA) molecules.

【0039】 「所与のポリヌクレオチド配列を含む組成物」或いは「所与のアミノ酸配列を
含む組成物」は、所与のポリヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列を含む任意の
組成物に幅広く用いられる。その組成物は乾燥状態或いは水溶液状態を含む。I
SMOをコードするポリヌクレオチド配列或いはそのフラグメントを含む組成物
はハイブリダイゼーションプローブとして用いることもできる。そのプローブは
凍結乾燥状態で保管され、炭水化物のような安定化剤と関連することもできる。
ハイブリダイゼーションでは、そのプローブは塩類(例えばNaCl)、界面活
性剤(例えばSDS)及び他の組成物(例えばデンハート液、粉乳、サケ精子D
NA等)を含む水溶液に分散される場合もある。
“Composition comprising a given polynucleotide sequence” or “composition comprising a given amino acid sequence” is widely used for any composition comprising a given polynucleotide or amino acid sequence. The composition may be in a dry or aqueous solution. I
A composition comprising a polynucleotide sequence encoding SMO or a fragment thereof can also be used as a hybridization probe. The probe is stored lyophilized and may be associated with a stabilizing agent such as a carbohydrate.
For hybridization, the probe may comprise salts (eg, NaCl), detergents (eg, SDS) and other compositions (eg, Denhardt's solution, milk powder, salmon sperm D).
NA).

【0040】 「コンセンサス配列」は、核酸配列のうち、不要な塩基を分解するために再配
列されているもの、或いは5´或いは3´方向にXL-PCR (Perkin Elmer, Norwal
k, CT)を用いて伸長され、再配列されているもの、或いはフラグメント構築用コ
ンピュータプログラム(例えばGELVIEW Fragment Assembly System、GCG, Madis
on WI)を用いて2つ以上のインサイト社クローンの重複配列から構築されてい
るもののことである。ある配列は伸長及び構築のいずれもが施され、コンセンサ
ス配列を生成している。
A “consensus sequence” is a nucleic acid sequence that has been rearranged to decompose unnecessary bases, or XL-PCR (Perkin Elmer, Norwal) in the 5 ′ or 3 ′ direction.
k, CT) or a computer program for constructing fragments (eg, GELVIEW Fragment Assembly System, GCG, Madis
on WI) is constructed from overlapping sequences of two or more Incyte clones. Certain sequences have been both extended and assembled to generate a consensus sequence.

【0041】 「ポリヌクレオチドの発現と相関がある」は、ノーザン分析によるISMOを
コードするポリヌクレオチドに類似のリボ核酸の存在の検出が、サンプルにおい
てISMOをコードするmRNAの存在を示しており、それによりISMOをコ
ードするポリヌクレオチドからの転写物の発現と相関があることを示す。
“Correlated with polynucleotide expression” means that detection of the presence of ribonucleic acid similar to the polynucleotide encoding ISMO by Northern analysis indicates the presence of mRNA encoding ISMO in the sample, Indicates that there is a correlation with expression of transcripts from polynucleotides encoding ISMO.

【0042】 「欠失」は、アミノ酸配列或いはヌクレオチド配列いずれかにおいて変化し、
1つ或いはそれ以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドが欠如することである。
A “deletion” changes in either the amino acid sequence or the nucleotide sequence,
Lack of one or more amino acid residues or nucleotides.

【0043】 「誘導体」は、ISMOをコードする核酸配列或いはISMO又はコードされ
たISMOの相補配列の化学修飾体のことである。そのような修飾の例示は、水
素をアルキル基、アシル基或いはアミノ基に置換することである。核酸誘導体は
、自然分子の生物学的及び免疫学的機能を保持するポリペプチドをコードする。
誘導体ポリペプチドは、グリコシレーション、ポリエチレングリコール形成(pe
gylation)或いは由来したポリペプチドの生物学的或いは免疫学的機能を保持す
る任意の類似のプロセスにより修飾されるポリペプチドである。
“Derivative” refers to a chemical modification of the nucleic acid sequence encoding ISMO or the complementary sequence of ISMO or the encoded ISMO. Illustrative of such modifications are the replacement of hydrogen by an alkyl, acyl or amino group. Nucleic acid derivatives encode polypeptides that retain the biological and immunological functions of the natural molecule.
Derivative polypeptides are glycosylated, polyethylene glycol formed (pe
gylation) or a polypeptide that is modified by any similar process that retains the biological or immunological function of the derived polypeptide.

【0044】 「類似性」は相補性の度合いのことである。部分的な類似性或いは完全類な似
性がある。用語「同一性」を「類似性」の代わりに用いる場合もある。部分的に
相補的な配列は、同一配列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分
的に抑制する配列であり、「実質的に類似性の」が用いられる。完全に類似(同
一)配列の標的配列へのハイブリダイゼーションの抑制は、低い厳密性の条件下
でハイブリダイゼーション検定法(サザンブロット或いはノーザンブロット、溶
液ハイブリダイゼーション等)を用いて検査することができる。実質的に類似的
な配列或いはプローブは、低い厳密性の条件下で完全に類似的な配列及びプロー
ブの標的配列への結合と競合し、それを抑制するであろう。低い厳密性の条件は
非特異な結合が許容されるような条件であることは言うまでもない。低い厳密な
条件は、2つの配列の互いへの結合が特異な(すなわち選択的な)相互作用であ
ることを必要とする。非特異な結合の欠如は、部分的な度合いの相補性さえ存在
しない(例えば約30%同一性より小さい)第2の標的配列の使用により検査さ
れる場合もある。非特異な結合が存在しない場合、そのプローブは第2の非相補
的標的配列にハイブリダイズしないであろう。
“Similarity” refers to the degree of complementarity. There is partial similarity or complete similarity. The term “identity” may be used in place of “similarity”. A partially complementary sequence is a sequence that at least partially inhibits the same sequence from hybridizing to a target nucleic acid, and "substantially similar" is used. Inhibition of hybridization of completely similar (identical) sequences to the target sequence can be tested using hybridization assays (Southern or Northern blot, solution hybridization, etc.) under conditions of low stringency. Substantially similar sequences or probes will compete with and inhibit the binding of completely similar sequences and probes to the target sequence under conditions of low stringency. It goes without saying that low stringency conditions are conditions under which non-specific binding is tolerated. Low stringency conditions require that the binding of the two sequences to each other be a unique (ie, selective) interaction. The lack of non-specific binding may be tested by the use of a second target sequence in which even a partial degree of complementarity is not present (eg, less than about 30% identity). In the absence of non-specific binding, the probe will not hybridize to a second non-complementary target sequence.

【0045】 「パーセント同一性」或いは「%同一性」という表現は、2以上のアミノ酸ま
たは核酸配列を比較する際の配列類似性のパーセンテージである。パーセント同
一性は、例えばMegAlignプログラム(DNASTAR, Inc., Madison WI)を用いるこ
とによって電子工学的に求めることができる。このMegAlignTMプログラムは、異
なる方法、例えばクラスタ法(clustal method)(例えばHiggins, D.G.及びP.M
. Sharp (1988) Gene 73:237-244参照)に従って2以上の配列のアライメントを
作成することができる。このクラスタ法のアルゴリズムでは、配列群を、全ての
配列の対について両配列間の距離を調べることによってクラスタ(集団)にグル
ープ分けする。このクラスタ群について、一対毎にアライメントをとり、次にグ
ループにおいてアライメントをとる。2つのアミノ酸配列、例えば配列Aと配列
Bの間のパーセント類似性は、(配列Aの長さ−配列Aにおけるギャップ残基の
数−配列Bにおけるギャップ残基の数)/(配列Aと配列Bとの間の残基の一致
の総数)×100で計算する。2つのアミノ酸配列の間の類似性の差が低いか無
いケースは、パーセント類似性の計算に含められない。核酸配列間のパーセント
同一性も、他の周知の方法、例えばJotun Hein法(例えばHein J. (1990) Metho
ds Enzymol. 183: 626-645参照)によってカウント即ち計算することができる。
配列間の同一性は、他の周知の方法、例えばハイブリダイゼーション条件を変え
ることによっても決定することができる。
The expression “percent identity” or “% identity” is the percentage of sequence similarity in comparing two or more amino acid or nucleic acid sequences. Percent identity can be determined electronically, for example, by using the MegAlign program (DNASTAR, Inc., Madison WI). The MegAlign program uses different methods, such as the cluster method (eg, Higgins, DG and PM).
Sharp (1988) Gene 73: 237-244) can be used to make an alignment of two or more sequences. In the algorithm of the cluster method, a sequence group is divided into clusters (collections) by checking the distance between both sequences for all pairs of sequences. This cluster group is aligned for each pair, and then the group is aligned. The percent similarity between two amino acid sequences, for example, sequence A and sequence B, is (length of sequence A-number of gap residues in sequence A-number of gap residues in sequence B) / (sequence A and sequence B Total number of residue matches between B) × 100. Cases where the similarity difference between the two amino acid sequences is low or not are not included in the percent similarity calculation. The percent identity between nucleic acid sequences can also be determined by other well-known methods, such as the Jotun Hein method (eg, Hein J. (1990) Metho
ds Enzymol. 183: 626-645).
Identity between sequences can also be determined by other well-known methods, for example, by changing hybridization conditions.

【0046】 「ヒト人工染色体」(HAC)は、大きさが6kbから10MbのDNA配列
を含み、安定した有糸分裂染色体の分離及び保持に必要とされる全ての要素を含
む直鎖状の小染色体である(例えばHarrington, J.J. et al. (1997) Nat Genet.
15:345-355を参照されたい)。
A “human artificial chromosome” (HAC) is a linear, small vector containing a DNA sequence between 6 kb and 10 Mb in size and containing all the elements required for stable mitotic chromosome isolation and retention. Chromosomes (e.g., Harrington, JJ et al. (1997) Nat Genet.
15: 345-355).

【0047】 「ヒト化抗体」は、ヒト抗体により似せるために非抗原結合領域内においてア
ミノ酸が置換されているが、その一方で元の結合能力を保持している抗体分子の
ことである。
“Humanized antibody” refers to an antibody molecule in which amino acids have been substituted in the non-antigen binding region to make it more similar to a human antibody, while retaining the original binding ability.

【0048】 「ハイブリダイゼーション」は、核酸の鎖が塩基対を介して相補鎖と結合する
任意のプロセスのことである。
“Hybridization” refers to any process by which a strand of nucleic acid joins with a complementary strand through base pairing.

【0049】 ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的なGとC塩基との間、並びに相補
的なAとT塩基との間に水素結合を形成することにより2つの核酸配列間に形成
される複合体のことである。これらの水素結合は、塩基スタッキング相互作用に
よりさらに安定化する場合もある。2つの相補的核酸配列は、逆平行形状におい
て水素結合する。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液(例えばC0t或いは
0t分析)内に、又は溶液中に存在する一方の核酸配列と固形支持体(例えば
紙、膜、フィルタ、チップ、ピン、或いはスライドガラス、又は細胞或いはその
核酸が固定されている任意の他の適切な支持体)上に固定化される別の核酸配列
との間に形成することもできる。
A “hybridization complex” is a complex formed between two nucleic acid sequences by forming hydrogen bonds between complementary G and C bases and between complementary A and T bases. It is about the body. These hydrogen bonds may be further stabilized by base stacking interactions. The two complementary nucleic acid sequences hydrogen bond in an antiparallel configuration. The hybridization complex is composed of one nucleic acid sequence and a solid support (eg, paper, membrane, filter, chip, pin, or glass slide) present in or in solution (eg, C 0 t or R 0 t analysis). Or another nucleic acid sequence that is immobilized on a cell or any other suitable support on which the nucleic acid is immobilized.

【0050】 「挿入」或いは「付加」は、自然発生分子に比べて、1つ或いはそれ以上のア
ミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ加わるアミノ酸配列或いはヌクレオチ
ド配列における変化のことである。
“Insertion” or “addition” refers to a change in the amino acid or nucleotide sequence at which one or more amino acid residues or nucleotides are added, respectively, as compared to a naturally occurring molecule.

【0051】 「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫疾患、又は感染症や遺伝病等と関連のある
状態を指すものである。これらの状態は、細胞や全身の防御系を活性化する様々
な因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、及び他のシグナル伝達分子の産生に
よって特徴付けることができる。
“Immune response” refers to a condition associated with inflammation, trauma, immune disease, or infectious or genetic disease. These conditions can be characterized by the production of various factors that activate cells and the system of defense, including cytokines, chemokines, and other signaling molecules.

【0052】 「マイクロアレイ」は、紙、ナイロン或いは他の種類の膜、フィルタ、チップ
、スライドガラス或いは任意の他の適当な固形支持体のような支持体上に配列さ
れる個別のポリヌクレオチド或いはオリゴヌクレオチドからなるアレイのことで
ある。
“Microarray” refers to individual polynucleotides or oligos arranged on a support such as paper, nylon or other types of membranes, filters, chips, glass slides or any other suitable solid support. An array consisting of nucleotides.

【0053】 マイクロアレイに関して用いられる「エレメント」或いは「アレイエレメント
」は、基質の表面上に配列されたハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドのこと
である。
An “element” or “array element” as used in the context of a microarray refers to a hybridizable polynucleotide arranged on the surface of a substrate.

【0054】 「調節」は、ISMOの生物学的活性の変更ことである。例えば調節により、
ISMOのタンパク質活性、結合特性或いは生物学的、機能的或いは免疫学的特
性が増減するようになる。
“Modulation” is an alteration of the biological activity of an ISMO. For example, by adjustment
The protein activity, binding properties or biological, functional or immunological properties of the ISMO may be increased or decreased.

【0055】 「核酸」或いは「核酸配列」はオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド或いはポリ
ヌクレオチド並びにそのフラグメント、一本鎖或いは二本鎖の場合があり、セン
ス鎖或いはアンチセンス鎖を表すゲノム或いは合成起源のDNA或いはRNA、
ペプチド核酸(PNA)或いは任意のDNA様或いはRNA様物質のことである
。「フラグメント」は、翻訳される際に、いくつかの機能的な特徴、例えば抗原
性、或いは構造的な領域の特性、例えば完全長ポリペプチドのATP−結合部位
を保持しているポリペプチドを生成する核酸配列のことである。
The “nucleic acid” or “nucleic acid sequence” may be an oligonucleotide, a nucleotide or a polynucleotide and a fragment thereof, single-stranded or double-stranded, and represents a sense strand or an antisense strand. RNA,
Peptide nucleic acid (PNA) or any DNA-like or RNA-like substance. A “fragment”, when translated, produces a polypeptide that retains some functional characteristics, such as antigenic or structural domain properties, such as an ATP-binding site of a full-length polypeptide. Nucleic acid sequence.

【0056】 本明細書において、用語「機能的に関連する」又は「機能的に結び付いた」は
、機能的に関連する核酸配列を表す。プロモータは、そのプロモータがコードさ
れるポリペプチドの転写を調節している場合、コード配列の機能的に関連又は機
能的に結びついている。機能的に関連した、又は機能的に結びついた核酸配列は
近接して読み枠内に存在することができるが、ある種のゲノムの配列、例えばリ
プレッサー遺伝子は、コードされるポリペプチドに近接していないが、やはりそ
のポリペプチドの発現を調節するオペレーター配列に結合する。
As used herein, the term “functionally related” or “operably linked” refers to a functionally related nucleic acid sequence. A promoter is operably linked or operably linked to a coding sequence if the promoter regulates the transcription of the encoded polypeptide. Functionally related or operably linked nucleic acid sequences can be in close reading frame, but certain genomic sequences, such as repressor genes, are in close proximity to the encoded polypeptide. But also binds to an operator sequence that regulates the expression of the polypeptide.

【0057】 「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも約6ヌクレオチドから60ヌクレオチ
ドの核酸配列、好ましくは約15−30ヌクレオチドの核酸配列、より好ましく
は20−25ヌクレオチドの核酸配列であり、PCR増幅或いはハイブリダイゼ
ーション検定法において用いることができる。ここで用いる場合、オリゴヌクレ
オチドは、一般に当分野において定義されているような用語「アンプリマ」、「
プライマ」、「オリゴマ」及び「プローブ」と実質的に等価である。
An “oligonucleotide” is a nucleic acid sequence of at least about 6 to 60 nucleotides, preferably about 15-30 nucleotides, more preferably 20-25 nucleotides, and is used in PCR amplification or hybridization assays. Method. As used herein, oligonucleotides refer to the terms "amplima,""a" generally as defined in the art.
Substantially equivalent to "primer", "oligomer" and "probe".

【0058】 「ペプチド核酸」(PNA)は、リジンにおいて終端するアミノ酸残基のペプ
チドバックボーンに結合する、長さが少なくとも5ヌクレオチドからなるオリゴ
ヌクレオチドを含むアンチセンス分子或いは抗遺伝因子(anti-gene agent)こ
とである。PNAはポリエチレングリコール化され、細胞の寿命を延長し、その
中で相補一本鎖DNA及びRNAを優先的に結合し、転写延長を停止する(例え
ばNielsen PE 等(1993) Anticancer Drug Des 8:53-63を参照されたい)。
“Peptide nucleic acid” (PNA) is an antisense molecule or anti-gene agent comprising an oligonucleotide consisting of at least 5 nucleotides in length, which binds to the peptide backbone of amino acid residues terminating at lysine. ) That is. PNAs are polyethylene glycolated and extend the lifespan of cells, preferentially binding complementary single-stranded DNA and RNA therein, and stop transcription elongation (eg, Nielsen PE et al. (1993) Anticancer Drug Des 8:53). -63).

【0059】 「サンプル」は幅広い意味に用いられる。ISMOをコードする核酸或いはそ
のフラグメント又はISMO自体を含むと予想される生物学的サンプルは、溶液
中に存在するか、或いは固形支持体、組織、組織転写物(tissue print)等に結
合されている体液、細胞からの抽出物、染色体、細胞器官或いは細胞から単離さ
れた膜、細胞、ゲノムDNA、RNA或いはcDNAを含む。
“Sample” is used in a broad sense. A biological sample suspected of containing the nucleic acid encoding ISMO or a fragment thereof or ISMO itself is present in solution or bound to a solid support, tissue, tissue print, or the like. Body fluids, extracts from cells, chromosomes, organelles or membranes isolated from cells or cells, including genomic DNA, RNA or cDNA.

【0060】 「特異な結合」或いは「特異に結合する」は、タンパク質或いはペプチドとア
ゴニスト、抗体とアンタゴニストとの間の相互作用のことである。その相互作用
は、結合分子により識別されるタンパク質の特定の構造(すなわち抗原決定基或
いはエピトープ)の存在に依存する。例えば、抗体がエピトープ「A」に対して
特異である場合には、標識された「A」を含むある反応におけるエピトープA或
いは遊離し、標識されないA及びその抗体を含むタンパク質の存在が、その抗体
に結合される標識されたAの量を減らすであろう。
“Specific binding” or “specifically binds” refers to the interaction between a protein or peptide and an agonist, or an antibody and an antagonist. The interaction depends on the presence of a particular structure (ie, antigenic determinant or epitope) of the protein identified by the binding molecule. For example, if the antibody is specific for epitope "A", the presence of epitope A or free, unlabeled A and the protein containing the antibody in a reaction involving the labeled "A" will be reflected by the antibody. Will reduce the amount of labeled A bound to

【0061】 「厳密な条件」は、ポリヌクレオチド配列と、特許請求の範囲に記載されたポ
リヌクレオチド配列との間のハイブリダイゼーションを許容する条件のことであ
る。適切なレベルの厳密な条件は、例えば、プレハイブリダイゼーション及びハ
イブリダイゼーション領域における塩又は有機溶剤(例えばホルムアミド)の濃
度、又はハイブリダイゼーション温度によって決定することができ、当分野でよ
く知られている。詳述すると、厳密性は、塩の濃度を低下させること、ホルムア
ミドの濃度を上昇させること、又はハイブリダイゼーション温度を高めることに
よって高めることができる。
“Strict conditions” refer to conditions that permit hybridization between a polynucleotide sequence and a claimed polynucleotide sequence. Appropriate levels of stringent conditions can be determined, for example, by the concentration of salts or organic solvents (eg, formamide) in the prehybridization and hybridization regions, or the hybridization temperature, and are well known in the art. In particular, stringency can be increased by reducing the concentration of salt, increasing the concentration of formamide, or increasing the hybridization temperature.

【0062】 「実質的に精製された」は、自然環境から除去されるか、単離されるか或いは
分離された核酸配列或いはアミノ酸配列のことであり、それらは自然に関連する
他の成分を少なくとも60%、好適には75%、最も好適には90%含まないも
のである。
“Substantially purified” refers to a nucleic acid or amino acid sequence that has been removed, isolated, or separated from the natural environment, which contains at least other components with which it is naturally associated. It does not contain 60%, preferably 75%, and most preferably 90%.

【0063】 「置換」は、1つ或いはそれ以上のヌクレオチド或いはアミノ酸が、それぞれ
異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置き換えられることである。
“Substitution” is the replacement of one or more nucleotides or amino acids with different nucleotides or amino acids, respectively.

【0064】 「形質転換」は、外来DNAが侵入し、受容体細胞を変化させるプロセスを意
味する。それは当分野において周知の種々の方法を用いて自然或いは人工的条件
下で生じさせることができる。形質転換は、外来核酸配列を原核或いは真核宿主
細胞に挿入するための任意の既知の方法に基づく場合がある。その方法は形質転
換される宿主細胞に基づいて選択され、限定はしないが、ウイルス感染、電気穿
孔法、熱ショック、リポフェクション並びに粒子照射を含む場合がある。そのよ
うに「形質転換された」細胞は、安定に形質転換された細胞を含んでおり、その
細胞では挿入されたDNAが、自動的に複製するプラスミド或いはその宿主染色
体の一部の何れかとして複製されることができる。またその細胞は、限られた期
間だけ挿入されたDNA或いはRNAを一時的に発現する細胞も含む。
“Transformation” refers to the process by which foreign DNA enters and changes a recipient cell. It can be generated under natural or artificial conditions using various methods well known in the art. Transformation may be based on any known method for inserting foreign nucleic acid sequences into prokaryotic or eukaryotic host cells. The method is selected based on the host cell to be transformed and may include, but is not limited to, viral infection, electroporation, heat shock, lipofection, and particle irradiation. Such "transformed" cells include those that have been stably transformed, in which the inserted DNA is either an automatically replicating plasmid or part of its host chromosome. Can be duplicated. The cells also include cells that temporarily express DNA or RNA inserted for a limited period.

【0065】 ここで用いるISMOの「変異体」は、1つ或いはそれ以上のアミノ酸により
変更されるアミノ酸配列のことである。変異体は「保存的に」変化する場合があ
り、その場合置換されたアミノ酸は、例えばロイシンをイソロイシンに置き換え
る場合のように、類似の構造的及び化学的特性を有する。さらにまれにではある
が、変異体は、グリシンをトリプトファンに置き換える場合のように「非保存的
に」変化する場合がある。また類似の少数変異体は、アミノ酸欠失或いは挿入、
又はその両方を含む場合もある。生物学的及び免疫学的活性を無くすことなくア
ミノ酸残基が置換、挿入或いは欠失されるかを判定する際の指標は、当業者に周
知のコンピュータプログラム、例えばLASERGENEソフトウエアを用いて見出すこ
とができる。
As used herein, “variants” of ISMO refers to amino acid sequences that are altered by one or more amino acids. A variant may be “conservatively” altered, in which the substituted amino acid has similar structural and chemical properties, eg, when replacing leucine with isoleucine. More rarely, variants may change "non-conservatively", such as when replacing glycine with tryptophan. Similar minor variants include amino acid deletions or insertions,
Or both. Indicators for determining whether an amino acid residue is substituted, inserted or deleted without abolishing biological and immunological activities can be found using a computer program well known to those skilled in the art, for example, LASERGENE software. Can be.

【0066】 用語「変異体」は、ポリヌクレオチド配列に関連して用いられる場合、NHA
Pに近縁なポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義には、例えば、「アレ
ル変異体」(前に定義した)、「スプライスバリアント」、「種変異体」、また
は「多型変異体」も含まれる。スプライスバリアントは、基準の分子と有意な同
一性を有し得るが、mRNAのプロセシングの際にエキソンのスプライシング部
位が変わるためにポリヌクレオチドの数が多いか或いは少ないものである。対応
するポリペプチドは、追加の機能的ドメインを有していたり、或いはドメインが
欠けていることがある。種変異体は、種の間で異なるポリヌクレオチド配列であ
る。これから生ずるポリペプチドは、通常、互いに有意なアミノ酸同一性を有し
ている。多型変異体は、ポリヌクレオチド配列の1箇所の塩基が異なっている「
一塩基多型」(SNPs)も包含している。SNPsが存在することが、例えば
、一定の集団、疾病状態、または疾病状態の性向を示すことがある。
The term “variant”, when used in reference to a polynucleotide sequence, refers to NHA
Polynucleotide sequences related to P may be included. This definition also includes, for example, "allelic variants" (as defined above), "splice variants,""speciesvariants," or "polymorphic variants." A splice variant may have significant identity to a reference molecule, but will have a greater or lesser number of polynucleotides due to a change in the splicing site of an exon during mRNA processing. The corresponding polypeptide may have additional functional domains or may lack domains. Species variants are polynucleotide sequences that differ between species. The polypeptides resulting therefrom usually have significant amino acid identity with each other. Polymorphic variants differ by one base in the polynucleotide sequence.
"Single nucleotide polymorphisms" (SNPs) are also included. The presence of SNPs may indicate, for example, a population, a disease state, or a propensity for a disease state.

【0067】 発明 本発明は、新規の免疫系分子、それをコードするヌクレオチド並びに免疫系及
び細胞増殖に関連する障害の診断、治療及び予防において有用な新規の組成物の
使用法に基づいている。
[0067] This invention relates to novel immune system molecules, diagnosis of disorders associated with nucleotide and the immune system and cellular proliferation coding therefor, are based on the use of useful novel compositions in the treatment and prevention.

【0068】 本発明のISMO−1をコードする核酸は最初に、アミノ酸配列アライメント
のコンピュータ検索、例えばBLASTを用いて、甲状腺腫瘍cDNAライブラ
リ(THYRTUT03)からのインサイト社クローン2192748において
同定された。コンセンサス配列、SEQ ID NO:5は、重複及び/または伸
長した核酸配列、インサイト社クローン2192748H1(THYRTUT0
3)、1384450T1(BRAITUT08)及び1291692T1(P
GANNOT03)に由来した。
The nucleic acid encoding the ISMO-1 of the present invention was first identified in Incyte clone 2192748 from a thyroid tumor cDNA library (THYRTUT03) using a computer search for amino acid sequence alignment, eg, BLAST. The consensus sequence, SEQ ID NO: 5, is a duplicated and / or extended nucleic acid sequence, Insight clone 2192748H1 (THYRTUT0
3), 1384450T1 (BRAITUT08) and 1291692T1 (P
GANNOT03).

【0069】 一実施形態では、本発明は、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドを有する。ISMO−1は長さが153アミノ酸であり、残基S52に
おいて1つの潜在的なプロテインキナーゼCリン酸化部位を、残基M1〜A19
において予測されたシグナルペプチドを有する。BLOCKS及びPRINTS
解析は、R2〜L14、S33〜A49、G109〜F124、C126〜P1
41のISMO−1の領域が、リポカリン配列モチーフと類似であることを示す
。図1に示されるように、ISMO−1は、ヒトNGAL(GI 929657
、SEQ ID NO:9)と化学的及び構造的類似性を有する。具体的には、I
SMO−1とヒトNGALとは、31%同一性を共有する。図1では、NGAL
のアミノ酸119〜154が、明瞭にするためにアライメントから省略されてい
ることに留意されたい。しかしながら完全なNGAL(SEQ ID NO:9)
のアミノ酸配列を用いて、ISMO−1とのアミノ酸同一性を計算した。約ヌク
レオチド64〜約ヌクレオチド96までのSEQ ID NO:5のフラグメント
は、ハイブリダイゼーションプローブとして有用である。ノーザン分析は種々の
ライブラリ、特に疾患した甲状腺と関連するライブラリにおけるこの配列の発現
を示す。
In one embodiment, the invention has a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. ISMO-1 is 153 amino acids in length and has one potential protein kinase C phosphorylation site at residue S52 at residues M1-A19.
Has the signal peptide predicted for BLOCKS and PRINTS
Analysis was performed for R2 to L14, S33 to A49, G109 to F124, and C126 to P1.
It shows that 41 ISMO-1 regions are similar to the lipocalin sequence motif. As shown in FIG. 1, ISMO-1 is a human NGAL (GI 929657).
, SEQ ID NO: 9). Specifically, I
SMO-1 and human NGAL share 31% identity. In FIG. 1, NGAL
Note that amino acids 119-154 of have been omitted from the alignment for clarity. However, complete NGAL (SEQ ID NO: 9)
Was used to calculate the amino acid identity with ISMO-1. Fragments of SEQ ID NO: 5 from about nucleotide 64 to about nucleotide 96 are useful as hybridization probes. Northern analysis shows the expression of this sequence in various libraries, especially those associated with diseased thyroid.

【0070】 本発明のISMO−2をコードする核酸は最初に、アミノ酸配列アライメント
のコンピュータ検索、例えばBLASTを用いて、乳癌cDNAライブラリ(B
RSTTUT13)からのインサイト社クローン2849752において同定さ
れた。コンセンサス配列、SEQ ID NO:6は、重複及び/または伸長した
核酸配列、インサイト社クローン2849752H1(BRSTTUT13)、
1821482H1(GBLATUT01)、079552R1(SYNORA
B01)、1540045R1(SINTTUT01)、1517938F6(
BLADTUT04)及びショットガン配列SAWA00101F1に由来した
The nucleic acid encoding the ISMO-2 of the present invention can be obtained by first using a computer search for amino acid sequence alignment, eg, BLAST, using a breast cancer cDNA library (B
RSTTTUT13) was identified in Insights clone 28497752. The consensus sequence, SEQ ID NO: 6, is a duplicated and / or extended nucleic acid sequence, Incyte clone 28497752H1 (BRSTTTUT13),
182482H1 (GBLATUT01), 079552R1 (SYNORA
B01), 1540045R1 (SINTUTUT01), 1517938F6 (
BLADUT04) and the shotgun sequence SAWA00101F1.

【0071】 一実施形態では、本発明は、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドを有する。ISMO−2は長さが470アミノ酸であり、残基N120
及びN320において2つの潜在的なN−グリコシレーション部位、T105、
T232、S290及びS370において4つの潜在的なカゼインキナーゼII
リン酸化部位を、残基S47、S81、T92、S98、S142、S154、
T322、S347及びT460において9つの潜在的なプロテインキナーゼC
リン酸化部位を、残基Y69及びY319において2つの潜在的なチロシンキナ
ーゼリン酸化部位を有する。種々の検索アルゴリズムを用いるタンパク質配列解
析は、ISMO−2の領域が、Igのスーパーファミリタンパク質ドメインに強
い類似性を示すことを示している。BLOCKS解析は、ISMO−2が、S3
87〜Q409及びF446〜S463において2つの保存されたIg/MHC
タンパク質ブロックを含むことを示す。PFAM解析は、ISMO−2が、S3
4〜R116、G160〜V225及びK383〜V450においてIgスーパ
ーファミリタンパク質ドメインに類似性を有する3つの領域を含むことを示す。
BLAST解析は、ISMO−2が、脊椎動物免疫グロブリンγH鎖に著しいア
ミノ酸同一性示すことを示している。2つの個別の検索アルゴリズムは、ISM
O−2のM1〜S19においてシグナルペプチド配列も予測している。約ヌクレ
オチド432〜約ヌクレオチド473までのSEQ ID NO:6のフラグメン
トは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用である。ノーザン分析は種々
のライブラリにおけるこの配列の発現を示しており、少なくともその61%は癌
及び細胞増殖に関連し、少なくともその38%は免疫応答及び外傷に関連する。
具体的には、ISMO−2を発現するライブラリの27%は生殖組織に由来し、
26%は胃腸組織に由来する。
In one embodiment, the invention has a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. ISMO-2 is 470 amino acids in length and comprises residues N120
And two potential N-glycosylation sites at N320, T105,
Four Potential Casein Kinases II at T232, S290 and S370
The phosphorylation site was changed to residues S47, S81, T92, S98, S142, S154,
9 Potential Protein Kinase C at T322, S347 and T460
The phosphorylation site has two potential tyrosine kinase phosphorylation sites at residues Y69 and Y319. Protein sequence analysis using various search algorithms has shown that the region of ISMO-2 shows strong similarity to the Ig superfamily protein domain. BLOCKS analysis shows that ISMO-2 is S3
87-Q409 and two conserved Ig / MHC in F446-S463
Indicates that it contains a protein block. PFAM analysis showed that ISMO-2
4-R116, G160-V225 and K383-V450 contain three regions with similarity to the Ig superfamily protein domain.
BLAST analysis indicates that ISMO-2 shows significant amino acid identity to the vertebrate immunoglobulin gamma heavy chain. The two separate search algorithms are ISM
The signal peptide sequence is also predicted at M1 to S19 of O-2. Fragments of SEQ ID NO: 6 from about nucleotide 432 to about nucleotide 473 are useful as hybridization probes. Northern analysis shows the expression of this sequence in various libraries, at least 61% of which is associated with cancer and cell proliferation, and at least 38% of which is associated with immune response and trauma.
Specifically, 27% of libraries expressing ISMO-2 are derived from reproductive tissues,
26% are from gastrointestinal tissue.

【0072】 本発明のISMO−3をコードする核酸は最初に、アミノ酸配列アライメント
のコンピュータ検索、例えばBLASTを用いて、胎児胸腺cDNAライブラリ
(THYMFET02)からのインサイト社クローン2937262において同
定された。コンセンサス配列、SEQ ID NO:7は、重複及び/または伸長
した核酸配列、インサイト社クローン2937262H1(THYMFET02
)、1807436H1(SINTNOT13)、1900442F6(BLA
DTUT06)、1711092F6(PROSNOT16)、003606R
1(HMC1NOT01)、775024R1(COLNNOT05)及び20
71181F6(ISLTNOT01)に由来した。
The nucleic acid encoding the ISMO-3 of the present invention was first identified in Incyte clone 2937262 from a fetal thymus cDNA library (THYMFET02) using a computer search for amino acid sequence alignment, eg, BLAST. The consensus sequence, SEQ ID NO: 7, is a duplicated and / or extended nucleic acid sequence, Insight clone 2937262H1 (THYMFET02
), 1807436H1 (SINTNOT13), 1900442F6 (BLA)
DTUT06), 1711092F6 (PROSNOT16), 003606R
1 (HMC1NOT01), 775024R1 (COLNNOT05) and 20
71181F6 (ISLTNOT01).

【0073】 一実施形態では、本発明は、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドを有する。ISMO−2は長さが582アミノ酸であり、残基N137
、N245及びN445において3つの潜在的なN−グリコシレーション部位を
、残基S29、T84、S298、S299及びT554において5つの潜在的
なcAMP−及びcGMP−依存プロテインキナーゼリン酸化部位を、残基Sl
39、S161、S261、S286、S298、S299、S337、T33
8、S388、S411、S413、T499及びT559において14個の潜
在的なカゼインキナーゼIIリン酸化部位を、残基T17、T203、S273
、T292、T355、S401及びT554において7つの潜在的なプロテイ
ンキナーゼCリン酸化部位を、残基Y128において潜在的なチロシンキナーゼ
リン酸化部位を有する。一次及び二次構造解析は、ISMO−3が、支配的な親
水性及びα螺旋であることを示している。種々の検索アルゴリズムは、ISMO
−3の領域が、RNA結合モチーフに強い類似性を示すことを示している。特に
BLOCKS及びProFilescanは、ISMO−3が、K166〜F1
73においてRNP−1 RNP結合サインを含むことを示している。さらにB
LOCKS及びPFAM解析は、V127〜I199のISMO−3の領域が、
RNA認識モチーフに類似であることを示している。さらにPRINTS解析は
、Q41〜R58、G67〜K82、A98〜R111、P119〜N135及
びP165〜I183のISMO−3の領域が、種々の狼瘡Laタンパク質サイ
ンに類似であることを示している。図2A及び図2Bに示されるように、ISM
O−3は蚊La(GI 1311676、SEQ ID NO:10)及びヒトL
a(GI 178687、SEQ ID NO:11)と化学及び構造的に類似で
ある。ISMO−3のアミノ酸1〜229は、蚊Laのアミノ酸1〜235及び
ヒトLaのアミノ酸1〜198と20%同一性を共有する。約ヌクレオチド17
1〜約ヌクレオチド209までのSEQ ID NO:7のフラグメントは、ハイ
ブリダイゼーションプローブとして有用である。ノーザン分析は種々のライブラ
リにおけるこの配列の発現を示しており、少なくともその46%は癌及び細胞増
殖に関連し、少なくともその25%は免疫応答及び外傷に関連する。
In one embodiment, the invention has a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. ISMO-2 is 582 amino acids in length and comprises residues N137
, N245 and N445, three potential N-glycosylation sites, and residues S29, T84, S298, S299 and T554, five potential cAMP- and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation sites. Sl
39, S161, S261, S286, S298, S299, S337, T33
8, 14 potential casein kinase II phosphorylation sites at S388, S411, S413, T499 and T559 were added to residues T17, T203, S273.
, T292, T355, S401 and T554 and seven potential tyrosine kinase phosphorylation sites at residue Y128. Primary and secondary structure analysis indicates that ISMO-3 is the predominant hydrophilic and α-helical. Various search algorithms are
-3 region shows strong similarity to the RNA binding motif. In particular, BLOCKS and ProFilescan, ISMO-3, K166-F1
73 shows that it contains the RNP-1 RNP binding signature. Further B
LOCKS and PFAM analysis showed that the region of ISMO-3 from V127 to I199 was
It shows that it is similar to the RNA recognition motif. Further PRINTS analysis shows that the ISMO-3 regions Q41-R58, G67-K82, A98-R111, P119-N135 and P165-I183 are similar to various lupus La protein signatures. As shown in FIGS. 2A and 2B, the ISM
O-3 is mosquito La (GI 131676, SEQ ID NO: 10) and human L
a (GI 178687, SEQ ID NO: 11) is chemically and structurally similar. Amino acids 1-229 of ISMO-3 share 20% identity with amino acids 1-235 of mosquito La and amino acids 1-198 of human La. About nucleotide 17
Fragments of SEQ ID NO: 7 from 1 to about nucleotide 209 are useful as hybridization probes. Northern analysis indicates the expression of this sequence in various libraries, at least 46% of which is associated with cancer and cell proliferation, and at least 25% of which is associated with immune response and trauma.

【0074】 本発明のISMO−4をコードする核酸は最初に、アミノ酸配列アライメント
のコンピュータ検索、例えばBLASTを用いて、卵巣腫瘍cDNAライブラリ
(OVARTUT07)からのインサイト社クローン2995108において同
定された。コンセンサス配列、SEQ ID NO:8は、重複及び/または伸長
した核酸配列、インサイト社クローン2995108H1(OVARTUT07
)、1000491T6(BRSTNOT03)、132994R6(BMAR
NOT02)、1348978F1(LATRTUT02)並びにショットガン
配列SARBOI777F1、SBJA01451F1及びSAEAOI628
F1に由来した。
The nucleic acid encoding the ISMO-4 of the present invention was first identified in Incyte clone 2995108 from an ovarian tumor cDNA library (OVARTUT07) using a computer search for amino acid sequence alignment, eg, BLAST. The consensus sequence, SEQ ID NO: 8, is a duplicated and / or extended nucleic acid sequence, Insight's clone 2995108H1 (OVARTUT07).
), 10000491T6 (BRSTNOT03), 132994R6 (BMAR
NOT02), 148978F1 (LATTUT02) and shotgun sequences SARBOI777F1, SBJA01451F1 and SAEAOI628.
Derived from F1.

【0075】 一実施形態では、本発明は、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリ
ペプチドを有する。ISMO−2は長さが497アミノ酸であり、残基N288
及びN484において2つの潜在的なN−グリコシレーション部位を、残基T1
10、T160、T184、S400及びS425において5つの潜在的なカゼ
インキナーゼIIリン酸化部位を、残基S8、T97、S126、S149、T
193、S310、T369、S400及びT469において9つの潜在的なプ
ロテインキナーゼCリン酸化部位を有する。種々の検索アルゴリズムを用いるタ
ンパク質配列解析は、ISMO−4の領域が、Igスーパーファミリタンパク質
ドメインに強い類似性を示すことを示している。BLOCKS解析は、ISMO
−4が、T391〜Q413及びF455〜T472において2つの保存された
Ig/MHCタンパク質ブロックを含むことを示している。さらにPFAM解析
は、ISMO−4が、S34〜R116、G160〜V225及びK383〜V
450においてIgスーパーファミリタンパク質ドメインに類似性を有する3つ
の領域を含むことを示す。BLAST解析は、ISMO−4が、脊椎動物免疫グ
ロブリンαH鎖に著しいアミノ酸同一性示すことを示している。2つの個別の検
索アルゴリズムは、ISMO−4のM1〜S20においてシグナルペプチド配列
も予測している。約ヌクレオチド266〜約ヌクレオチド295までのSEQ
ID NO:8のフラグメントは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用
である。ノーザン分析は種々のライブラリにおけるこの配列の発現を示しており
、少なくともその61%は癌及び細胞増殖に関連し、少なくともその40%は免
疫応答及び外傷に関連する。具体的には、ISMO−4を発現するライブラリの
28%は生殖組織に由来し、28%は胃腸組織に由来する。
In one embodiment, the invention has a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. ISMO-2 is 497 amino acids in length and comprises residues N288
And two potential N-glycosylation sites at N484 at residue T1
At 10, T160, T184, S400 and S425, five potential casein kinase II phosphorylation sites were identified at residues S8, T97, S126, S149, T149.
There are 9 potential protein kinase C phosphorylation sites at 193, S310, T369, S400 and T469. Protein sequence analysis using various search algorithms has shown that the region of ISMO-4 shows strong similarity to the Ig superfamily protein domain. BLOCKS analysis is based on ISMO
-4 indicates that it contains two conserved Ig / MHC protein blocks in T391-Q413 and F455-T472. Furthermore, PFAM analysis showed that ISMO-4 showed that S34-R116, G160-V225 and K383-V
4 shows that at 450 contains three regions with similarity to the Ig superfamily protein domain. BLAST analysis indicates that ISMO-4 shows significant amino acid identity to the vertebrate immunoglobulin α heavy chain. Two separate search algorithms also predict the signal peptide sequence in M1-S20 of ISMO-4. SEQ ID NO: from about nucleotide 266 to about nucleotide 295
The fragment of ID NO: 8 is useful as a hybridization probe. Northern analysis indicates the expression of this sequence in various libraries, at least 61% of which is associated with cancer and cell proliferation, and at least 40% is associated with immune responses and trauma. Specifically, 28% of the library expressing ISMO-4 is derived from reproductive tissue and 28% is derived from gastrointestinal tissue.

【0076】 また本発明は、ISMO変異体を含む。好適なISMO変異体はISMOアミ
ノ酸配列に少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ま
しいISMO変異体はISMOに少なくとも約95%アミノ酸が同一で、ISM
Oの少なくとも1つの機能的或いは構造的特徴を含む変異体である。
The present invention also includes ISMO variants. A preferred ISMO variant is at least about 80%, more preferably at least about 90%, the most preferred ISMO variant is at least about 95% amino acid identical to the ISMO amino acid sequence and the ISM
A variant comprising at least one functional or structural feature of O.

【0077】 また本発明はISMOをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態
では本発明は、ISMO−1をコードする、SEQ ID NO:5の配列を含む
ポリヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、本発明は、ISMO−
2をコードする、SEQ ID NO:6の配列を含むポリヌクレオチド配列を含
む。さらに別の実施形態では、本発明は、ISMO−3をコードする、SEQ
ID NO:7の配列を含むポリヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態
では、本発明は、ISMO−4をコードする、SEQ ID NO:8の配列を含
むポリヌクレオチド配列を含む。
The present invention also includes a polynucleotide encoding ISMO. In certain embodiments, the invention includes a polynucleotide sequence comprising the sequence of SEQ ID NO: 5, which encodes ISMO-1. In yet another embodiment, the invention provides an ISMO-
2 and a polynucleotide sequence comprising the sequence of SEQ ID NO: 6. In yet another embodiment, the present invention relates to a method for encoding SEQ.
A polynucleotide sequence comprising the sequence of ID NO: 7. In yet another embodiment, the invention includes a polynucleotide sequence that encodes ISMO-4, including the sequence of SEQ ID NO: 8.

【0078】 また本発明は、ISMOをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む
。詳細には、そのようなポリヌクレオチド変異配列は、SEQ ID NO:5〜
SEQ ID NO:8のグループから選択される、ISMOをコードするポリヌ
クレオチド配列に少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、最
も好ましくは少なくとも約95%のポリヌクレオチド配列同一性を有するであろ
う。上記のポリヌクレオチド変異配列の任意の1つが、ISMOの機能的或いは
構造的特徴の少なくとも1つを含むアミノ酸配列をコードすることができる。
The present invention also includes a mutant sequence of the polynucleotide sequence encoding ISMO. In particular, such polynucleotide variant sequences have SEQ ID NOs: 5-5.
Having at least about 80%, more preferably at least about 90%, and most preferably at least about 95% polynucleotide sequence identity to a polynucleotide sequence encoding ISMO selected from the group of SEQ ID NO: 8. Would. Any one of the above-described polynucleotide variant sequences can encode an amino acid sequence that includes at least one of the functional or structural features of ISMO.

【0079】 遺伝子コードの縮重の結果として、ISMOをコードする多数のヌクレオチド
配列が生成され、その中には任意の既知の自然発生遺伝子のヌクレオチド配列に
最低限の相同性を示すものもあることは当業者には理解されよう。このように本
発明は、可能なコドン選択に基いて組み合わせを選択することにより形成される
ようになるヌクレオチド配列のあらゆる可能な変異配列を考慮する。これらの組
み合わせは、自然発生ISMOのヌクレオチド配列に適用されるような標準的な
トリプレット遺伝子コードに従って形成され、全てのそのような変形形態が明確
に開示されているものと考慮されたい。
As a result of the degeneracy of the genetic code, a large number of nucleotide sequences encoding ISMO are generated, some of which exhibit minimal homology to the nucleotide sequence of any known naturally occurring gene. Will be understood by those skilled in the art. Thus, the present invention contemplates all possible variant sequences of the nucleotide sequence that will be formed by selecting combinations based on possible codon choices. These combinations are formed according to the standard triplet genetic code as applied to the nucleotide sequence of naturally occurring ISMO, and all such variations are to be considered as being explicitly disclosed.

【0080】 ISMOをコードするヌクレオチド配列及びその変異配列は、適当に選択され
た厳密な条件下で、自然発生ISMOのヌクレオチド配列にハイブリダイズでき
ることが好ましいが、実質的に異なるコドン使用法を有するISMOをコードす
るヌクレオチド配列或いはその誘導体を生成することが有利な場合もある。コド
ンを選択して、特定のコドンが宿主によって利用される頻度に応じて、ペプチド
の発現が特定の原核或いは真核発現宿主において生じる割合を増加してもよい。
コードされたアミノ酸配列を変更することなくISMOをコードするヌクレオチ
ド配列及びその誘導体を実質的に変更する他の理由は、より長い半減期のような
、自然発生配列から生成された転写物より望ましい特性を有するRNA転写物を
生成することを含む。
The nucleotide sequence encoding ISMO and its mutant sequences are preferably capable of hybridizing to the nucleotide sequence of naturally-occurring ISMO under appropriately selected stringent conditions, but may have substantially different codon usage. It may be advantageous to generate a nucleotide sequence that encodes or a derivative thereof. Codons may be selected to increase the rate at which expression of the peptide occurs in a particular prokaryotic or eukaryotic expression host, depending on how frequently that particular codon is utilized by the host.
Other reasons for substantially altering the nucleotide sequence encoding ISMO and its derivatives without altering the encoded amino acid sequence include properties that are more desirable than transcripts generated from naturally occurring sequences, such as longer half-lives. Generating an RNA transcript having the formula:

【0081】 また本発明は、合成化学的に完全に、ISMO及びその誘導体をコードするD
NA配列或いはそのフラグメントを生成することを含む。生成後、本特許出願の
出願時点で当分野において周知の薬剤を用いて、合成配列を、任意の多くの入手
可能な発現ベクタ及び細胞系に挿入することができる。さらに合成化学的に、I
SMOをコードする配列或いは任意のそのフラグメントに突然変異を導入するこ
ともできる。
The present invention also provides a synthetic chemistry that completely encodes ISMO and its derivatives.
Generating an NA sequence or a fragment thereof. After generation, the synthetic sequences can be inserted into any of the many available expression vectors and cell lines using agents well known in the art at the time of filing this patent application. Further synthetically, I
Mutations can also be introduced into the sequence encoding the SMO or any fragment thereof.

【0082】 また本発明にはに教示されるような種々の厳密性の条件下で請求されるヌクレ
オチド配列、詳細にはSEQ ID NO:5〜SEQ ID NO:8、及びその
フラグメントに示されるヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができるポ
リヌクレオチド配列が含まれる(例えば、Wahl,G.M及びS.L.Berger (1987; Meth
ods Enzymol. Vol. 152:399-407)及びKimmel, A.R.(1987;Methods Enzymol. Vol
152: 507-511)を参照されたい)。例えば、厳密な塩濃度は、通常は約750m
M未満の塩化ナトリウムと約75mM未満のクエン酸三ナトリウムであり、好ま
しくは約500mM未満の塩化ナトリウムと約50mM未満のクエン酸三ナトリ
ウムであり、最も好ましくは約250mM未満の塩化ナトリウムと約25mM未
満のクエン酸三ナトリウムである。例えば、ホルムアミドなどの有機溶剤を使用
しないと、厳密性の低いハイブリダイゼーションになり、約35%以上のホルム
アミド、更に好ましくは50%以上のホルムアミドを使用すると、厳密性の高い
ハイブリダイゼーションになる。温度の厳密条件は、通常は約30℃以上であり
、より好ましくは約37℃以上であり、最も好ましくは約42℃以上である。そ
の他の変更できるパラメーターには、ハイブリダイゼーション時間、ドデシル硫
酸ナトリウム(SDS)などの薬品の濃度、キャリアDNAの含有の有無があり
、当分野の技術者には公知である。必要な様々な条件を組み合わせることで、厳
密性の程度を変えることができる。好適な実施例では、ハイブリダイゼーション
は、温度が30℃で、750mMの塩化ナトリウムと75mMのクエン酸三ナト
リウム、1%のSDSで行う。より好適な実施例では、温度が37℃で、500
mMの塩化ナトリウムと50mMのクエン酸三ナトリウム、1%のSDS、35
%のホルムアミド、100μg/mlの変性サケ精子DNA(ssDNA)で行
う。最も好適な実施例では、温度が42℃で、250mMの塩化ナトリウムと2
5mMのクエン酸三ナトリウム、1%のSDS、50%のホルムアミド、200
μg/mlのssDNAで行う。これらの条件の有用な変更は、当分野の技術者
には明らかである。
The nucleotide sequences claimed under various stringency conditions as taught in the present invention, in particular SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8, and fragments thereof, Polynucleotide sequences that are capable of hybridizing to the sequence are included (eg, Wahl, GM and SLBerger (1987; Meth.
ods Enzymol. Vol. 152: 399-407) and Kimmel, AR (1987; Methods Enzymol.
152: 507-511)). For example, the exact salt concentration is typically about 750 m
M sodium chloride and less than about 75 mM trisodium citrate, preferably less than about 500 mM sodium chloride and less than about 50 mM trisodium citrate, most preferably less than about 250 mM sodium chloride and less than about 25 mM. Of trisodium citrate. For example, the absence of an organic solvent such as formamide results in less stringent hybridization, while the use of about 35% or more formamide, more preferably 50% or more formamide, results in more stringent hybridization. Strict temperature conditions are usually about 30 ° C. or higher, more preferably about 37 ° C. or higher, and most preferably about 42 ° C. or higher. Other parameters that can be varied include hybridization times, concentrations of drugs such as sodium dodecyl sulfate (SDS), and the presence or absence of carrier DNA, and are known to those skilled in the art. By combining various necessary conditions, the degree of strictness can be changed. In a preferred embodiment, the hybridization is performed at a temperature of 30 ° C. with 750 mM sodium chloride and 75 mM trisodium citrate, 1% SDS. In a more preferred embodiment, the temperature is 37 ° C. and 500
mM sodium chloride and 50 mM trisodium citrate, 1% SDS, 35%
% Of formamide, 100 μg / ml denatured salmon sperm DNA (ssDNA). In the most preferred embodiment, at a temperature of 42 ° C., 250 mM sodium chloride and 2 mM
5 mM trisodium citrate, 1% SDS, 50% formamide, 200
Perform with μg / ml ssDNA. Useful alterations of these conditions will be apparent to those skilled in the art.

【0083】 ハイブリダイゼーションの後の洗浄にも、様々な厳密性の程度がある。洗浄の
厳密な条件は、塩濃度と温度によって決められる。上記したように、塩濃度を下
げること或いは温度を上げることで洗浄の厳密性を高めることができる。例えば
、洗浄過程での塩濃度の厳密な条件は、好ましくは約30mM未満の塩化ナトリ
ウムと約3mM未満のクエン酸三ナトリウムであり、更に好ましくは約15mM
未満の塩化ナトリウムと約105mM未満のクエン酸三ナトリウムである。洗浄
過程の温度の厳密な条件は、通常は約25℃以上であり、好ましくは約42℃以
上であり、更に好ましくは約68℃以上である。好適な実施例では、洗浄過程は
、温度が25℃で、30mMの塩化ナトリウムと3mMのクエン酸三ナトリウム
、0.1%SDSで行われる。より好適な実施例では、洗浄過程は、温度が42
℃で、15mMの塩化ナトリウムと1.5mMのクエン酸三ナトリウム、0.1
%SDSで行われる。最も好適な実施例では、洗浄過程は、温度が68℃で、1
5mMの塩化ナトリウムと1.5mMのクエン酸三ナトリウム、0.1%SDS
で行われる。更なるこれらの条件の変更は、当分野の技術者には明らかであろう
Washing after hybridization also has varying degrees of stringency. The exact conditions for washing are determined by salt concentration and temperature. As described above, the stringency of washing can be increased by lowering the salt concentration or raising the temperature. For example, the stringent conditions for the salt concentration during the washing process are preferably less than about 30 mM sodium chloride and less than about 3 mM trisodium citrate, more preferably about 15 mM.
Less than sodium chloride and less than about 105 mM trisodium citrate. Strict conditions for the temperature of the washing process are usually about 25 ° C. or more, preferably about 42 ° C. or more, and more preferably about 68 ° C. or more. In a preferred embodiment, the washing step is performed at a temperature of 25 ° C. with 30 mM sodium chloride and 3 mM trisodium citrate, 0.1% SDS. In a more preferred embodiment, the cleaning process is performed at a temperature of 42.
At 15 ° C., 15 mM sodium chloride and 1.5 mM trisodium citrate, 0.1
Performed in% SDS. In the most preferred embodiment, the cleaning process is performed at a temperature of 68 ° C.
5 mM sodium chloride and 1.5 mM trisodium citrate, 0.1% SDS
Done in Further modifications of these conditions will be apparent to those skilled in the art.

【0084】 DNA塩基配列決定方法は周知のものであり、本発明の任意の実施例においても
利用され得る。その方法は、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、SEQUE
NASE(US Biochemical, Cleveland,OH)、Taqポリメラーゼ(Perkin Elmer)、
耐熱性T7ポリメラーゼ(Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ)、或い
はELONGASE増幅システム(Life Technologies, Gaithersburg MD)に於いて発
見されたようなプルーフリーディングエキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼの組
合せのような酵素を使用する。配列の準備は、Hamilton MICROLAB 2200(Hamilt
on,Reno,NV)、Peltier Thermal Cycler 200(PTC200; MJ Research,Watertown,
MA)及びABI CATALYST 800(Perkin Elmer)のような装置によって自動化するこ
とが好ましい。次に、ABI 373若しくは377 DNAシークエンシングシステム(Perk
in-Elmer)、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム(Molecular Dynamic
s, Sunnyvale CA)、又は他の周知のシステムを用いてシークエンシングを行う
。結果として得られた配列を当業者に周知の種々のアルゴリズムを用いて分析す
る(例えば、Ausubei, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, J
ohn Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7; Meyers, R.A. (1995) Molecular B
iology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NYを参照)。
[0084] DNA sequencing methods are well known and can be used in any of the embodiments of the present invention. The method is based on the Klenow fragment of DNA polymerase I, SEQUE.
NASE (US Biochemical, Cleveland, OH), Taq polymerase (Perkin Elmer),
Use enzymes such as thermostable T7 polymerase (Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ) or a combination of proofreading exonuclease and polymerase as found in the ELONGASE amplification system (Life Technologies, Gaithersburg MD). For sequence preparation, use Hamilton MICROLAB 2200 (Hamilt
on, Reno, NV), Peltier Thermal Cycler 200 (PTC200; MJ Research, Watertown,
It is preferred to automate by equipment such as MA) and ABI CATALYST 800 (Perkin Elmer). Next, use the ABI 373 or 377 DNA sequencing system (Perk
in-Elmer), MEGABACE 1000 DNA Sequencing System (Molecular Dynamic
s, Sunnyvale CA) or other well-known systems. The resulting sequence is analyzed using various algorithms well known to those skilled in the art (eg, Ausubei, FM (1997) Short Protocols in Molecular Biology , J.
ohn Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7; Meyers, RA (1995) Molecular B
iology and Biotechnology , Wiley VCH, New York NY).

【0085】 ISMOをコードする核酸配列は、部分ヌクレオチド配列を利用して、かつプ
ロモータ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当分野において
既知の種々の方法を用いて伸長させることができる。例えば、用いられる場合が
ある1つの方法、「制限部位」PCRは、汎用プライマを用いて既知の位置に隣
接する未知の配列を回収する(例えばSarkar. G (1993) PCR Methods Applic 2:
318-322を参照されたい)。詳細には、ゲノムDNAがリンカー配列に対するプ
ライマ及び既知の領域に特異なプライマの存在下で最初に増幅される。その後増
幅された配列は、同じリンカープライマ及び第1のプライマに内在する別の特異
なプライマを用いて第2巡目のPCRにかけられる。各回のPCRの生成物は、
適当なRNAポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用いて配列決定され
る。また別の方法、すなわち逆PCRを利用して、既知領域に基づく多岐プライ
マを用いて配列を増幅或いは伸長することもできる。そのテンプレートは、既知
のゲノム位置及び周囲をなす配列を含む制限フラグメントに由来する(Triglia
T等(1988) Nucleic Acids Res 16:8186)。第3の方法は、ヒト及び酵母人工染
色体DNAの既知の配列に隣接するDNAフラグメントをPCR増幅することを
伴う捕獲PCR(Lagerstrom M 等(1991) PCR Methods Applic 1:111-19)であ
る。この方法では、多数の制限酵素消化及び連結を用いて、PCRを実行する前
に遺伝子操作された二本鎖配列を未知の配列の領域に挿入することができる。未
知の配列を回収するために用いられることがある別の方法は当分野で公知である
(例えばParker JD 等 (1991; Nucleic Acids Res 19:3055-3060を参照されたい
)。さらにある方法はPCR、入れ子状プライマ及びPromoterFinderライブラリ
を用いて、ゲノムDNAを歩行することができる(Clontech, Palo Alto CA)。
このプロセスによりライブラリをスクリーニングする必要がなくなり、イントロ
ン/エクソン接合部を見つける際に有用である。全てのPCRに基づく方法の場
合、プライマはOLIGO4.06 Primer Analysis Software (National Biosciences I
nc, Plymouth MN)或いは別の適当なプログラムのような市販のソフトウエアを用
いて、長さが22〜30ヌクレオチドになり、50%以上のGC含量を有し、さ
らに約68〜72℃の温度でテンプレートにアニールするように設計することが
できる。
The nucleic acid sequence encoding ISMO can be extended utilizing partial nucleotide sequences and using various methods known in the art for detecting upstream sequences such as promoters and regulatory elements. . For example, one method that may be used, "restriction site" PCR, uses universal primers to recover unknown sequences flanking known positions (eg, Sarkar. G (1993) PCR Methods Applic 2:
318-322). In particular, genomic DNA is first amplified in the presence of a primer for the linker sequence and a primer specific for a known region. The amplified sequence is then subjected to a second round of PCR using the same linker primer and another unique primer internal to the first primer. The product of each round of PCR is:
Transcribed using a suitable RNA polymerase and sequenced using reverse transcriptase. Alternatively, the sequence may be amplified or extended using a divergent primer based on a known region, using inverse PCR. The template is derived from restriction fragments containing known genomic locations and surrounding sequences (Triglia
T (1988) Nucleic Acids Res 16: 8186). A third method is capture PCR (Lagerstrom M et al. (1991) PCR Methods Applic 1: 111-19) which involves PCR amplifying DNA fragments adjacent to known sequences of human and yeast artificial chromosomal DNA. In this way, multiple restriction enzyme digestions and ligation can be used to insert the engineered double-stranded sequence into the region of the unknown sequence before performing the PCR. Other methods that may be used to recover unknown sequences are known in the art (see, eg, Parker JD et al. (1991; Nucleic Acids Res 19: 3055-3060).
). In addition, some methods can walk genomic DNA using PCR, nested primers and PromoterFinder libraries (Clontech, Palo Alto CA).
This process eliminates the need to screen the library and is useful in finding intron / exon junctions. For all PCR-based methods, the primer is OLIGO 4.06 Primer Analysis Software (National Biosciences I
Using commercially available software such as nc, Plymouth MN) or another suitable program, it is 22-30 nucleotides in length, has a GC content of 50% or more, and has a temperature of about 68-72 ° C. Can be designed to anneal to the template.

【0086】 完全長cDNAに対してスクリーニングする際に、より長いcDNAを含むよ
うに大きさを選択されたライブラリを用いることが好ましい。またランダムに初
回抗原刺激を受けたライブラリも、それらが遺伝子の5´及び上流領域を含むよ
り大きな配列を含むという点で好ましい。ランダムに初回抗原刺激を受けたライ
ブラリの使用は、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを産生しない状況
では特に好ましい。ゲノムライブラリは5´非転写制御領域に配列を伸長するた
めに有用な場合がある。
When screening for full-length cDNAs, it is preferable to use libraries that have been selected in size to include longer cDNAs. Randomly primed libraries are also preferred in that they contain larger sequences, including the 5 'and upstream regions of the gene. The use of a randomly primed library is particularly preferred in situations where the oligo d (T) library does not produce full-length cDNA. Genomic libraries may be useful for extending sequence into a 5 'non-transcribed control region.

【0087】 市販の毛細管電気泳動系を用いて、配列決定或いはPCR生成物の大きさを解
析したり、或いはそのヌクレオチド配列を確認することもできる。詳細には毛細
管配列決定法は、電気泳動分離のための流動性ポリマ、レーザにより活性化され
る(各ヌクレオチドに対して1種類の)4つの異なる蛍光性染料及びCCDカメ
ラによる放射波長の検出を用いる場合がある。出力/光強度が適当なソフトウエ
ア(例えばGenotyper及びSequence Navigator 、Perkin Elmer)を用いて電気信
号に変換され、サンプルの装填からコンピュータ解析及び電子データ表示までの
全プロセスがコンピュータ制御される。毛細管電気泳動法は、特定のサンプルの
限定された量内に存在する場合があるDNAの小片の配列決定に特に好ましい。
A commercially available capillary electrophoresis system can also be used for sequencing or analyzing the size of the PCR product or confirming its nucleotide sequence. In particular, capillary sequencing involves the detection of emission wavelengths by a flowable polymer for electrophoretic separation, four different fluorescent dyes (one for each nucleotide) activated by a laser, and a CCD camera. May be used. The output / light intensity is converted to electrical signals using appropriate software (eg, Genotyper and Sequence Navigator, Perkin Elmer), and the entire process from sample loading to computer analysis and electronic data display is computer controlled. Capillary electrophoresis is particularly preferred for sequencing small pieces of DNA that may be present within a limited amount of a particular sample.

【0088】 本発明の別の実施例では、ISMOをコードするポリヌクレオチド配列或いは
そのフラグメントが、適当な宿主細胞においてISMO、そのフラグメント或い
はその機能的等価物の発現をもたらすために組換えDNA分子に用いられる場合
がある。ゲノムコードの固有の縮重により、概ね同一か或いは機能的に等価なア
ミノ酸配列をコードする他のDNA配列が生成され、この配列を用いてISMO
を発現することもできる。
In another embodiment of the present invention, a polynucleotide sequence encoding ISMO, or a fragment thereof, is incorporated into a recombinant DNA molecule to effect expression of ISMO, a fragment, or a functional equivalent thereof, in a suitable host cell. May be used. Due to the inherent degeneracy of the genomic code, other DNA sequences encoding substantially identical or functionally equivalent amino acid sequences are generated, which can be used to generate
Can also be expressed.

【0089】 本発明のヌクレオチド配列は、限定はしないが、遺伝子生成物のクローニング
、プロセッシング並びにまた発現を修飾する変更を含む種々の理由によりISM
Oをコードする配列を変更するために、当分野において周知の方法を用いて遺伝
子操作することができる。遺伝子フラグメント及び合成オリゴヌクレオチドのラ
ンダムなフラグメント化及びPCR再構築によるDNA混合を用いて、ヌクレオ
チド配列を遺伝子操作することができる。例えば、位置指定突然変異誘発を用い
て、新しい制限部位の挿入、グリコシレーションパターンの変更、コドン優先度
の変更、スプライシング変異配列の生成或いは突然変異の導入等を行うこともで
きる。
The nucleotide sequences of the present invention can be prepared for a variety of reasons including, but not limited to, cloning, processing, and also modifying the expression of the gene product by ISM.
The sequence encoding O can be genetically engineered using methods well known in the art. Nucleotide sequences can be engineered using random fragmentation of gene fragments and synthetic oligonucleotides and DNA mixing by PCR reassembly. For example, site-directed mutagenesis can be used to insert new restriction sites, alter glycosylation patterns, alter codon preferences, generate splicing variant sequences or introduce mutations.

【0090】 別の実施形態では、当分野で周知の化学的方法を用いて、ISMOをコードす
る配列を、全体的に或いは部分的に合成することができる(例えばCaruthers MH
等 (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23, Horn T等(1980) Nuc Acids Res S
ymp Ser 225-232を参照されたい)。別法では、タンパク質自体が、ISMOの
アミノ酸配列或いは一部を合成するために化学的方法を用いて生成される場合が
ある。例えばペプチド合成は種々の固相技術(例えばRoberge JY 等(1995) Scie
nce 269:202-204を参照されたい)を用いて実行することができ、自動合成は、
例えばABI 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer)を用いることにより実現
することができる。さらにISMOのアミノ酸配列或いはその任意の一部は、直
接合成中に変更されるか、並びにまた他のタンパク質或いはその任意の一部から
の配列を用いる化学的方法により結合され、変異体ポリペプチドを生成すること
もできる。
In another embodiment, the sequence encoding ISMO can be synthesized, in whole or in part, using chemical methods well known in the art (eg, Caruthers MH).
(1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23, Horn T, etc. (1980) Nuc Acids Res S
See ymp Ser 225-232). Alternatively, the protein itself may be produced using chemical methods to synthesize the amino acid sequence or portions of ISMO. For example, peptide synthesis can be performed using various solid-phase techniques (eg, Roberge JY et al. (1995) Scie
nce 269: 202-204).
For example, it can be realized by using ABI 431A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer). Further, the amino acid sequence of ISMO, or any portion thereof, may be altered during direct synthesis, or may also be combined by chemical methods using sequences from other proteins or any portion thereof to produce the mutant polypeptide. It can also be generated.

【0091】 そのペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフィにより実質的に精製される
ことができる(例えばChiez, R.M. and F.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol.
182:392-421を参照されたい)。合成ペプチドの組成物は、アミノ酸分析或いは
配列決定により確認することができる(例えばCreighton, T. (1984) Proteins,
Structures. and. Molecular Prop..erties, WH Freeman and Co., New York,
NYを参照されたい)。
The peptide can be substantially purified by preparative high performance liquid chromatography (eg, Chiez, RM and FZ Regnier (1990) Methods Enzymol.
182: 392-421). The composition of the synthetic peptide can be confirmed by amino acid analysis or sequencing (eg, Creighton, T. (1984) Proteins,
Structures. And. Molecular Prop..erties, WH Freeman and Co., New York,
See NY).

【0092】 生物学的に活性なISMOを発現させるためには、ISMOをコードするヌク
レオチド配列或いはその誘導体を、適切な発現ベクター、即ち適切な宿主内で挿
入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な配列を含むベクターに
挿入する。これらの配列としては、例えば、ベクターにおける、及びISMOを
コードするポリヌクレオチド配列におけるエンハンサー、構成的及び誘導的プロ
モーター、及び5’及び3’末端非翻訳領域のような制御配列が挙げられる。こ
のようなエレメントの作用の強さや特異性は様々に異なったものであり得る。ま
た、ISMOをコードする配列のより効率的な翻訳のためには、特定の開始シグ
ナルも必要である。このようなシグナルとしては、ATG開始コドン及び隣接す
る配列、例えばKozak配列が挙げられる。ISMO及びその開始コドン及び上流
の制御配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合には、他の転写または翻訳
の制御シグナルは不要である。しかし、コーディング配列又はそのフラグメント
のみが挿入される場合には、ATG開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルを与
えなければならない。さらに、全インサートの転写が確実に行われるようにする
ために、開始コドンは正しい読み枠に存在しなければならない。外来転写エレメ
ント及び開始コドンは、天然及び合成両方の様々な起源に由来するものであり得
る。使用される特定の細胞系に適切なエンハンサーを含めることにより、発現の
効率を高めることができる(例えば、Scharf,D.他(1994)Results Probl. Cell
Differ. 20:125-162参照)。
In order to express a biologically active ISMO, the nucleotide sequence encoding ISMO or a derivative thereof is regulated in the transcription and translation of a coding sequence inserted in a suitable expression vector, ie, a suitable host. Into a vector containing the necessary sequence. These sequences include, for example, enhancers, constitutive and inducible promoters, and control sequences such as 5 'and 3' terminal untranslated regions in the vector and in the polynucleotide sequence encoding ISMO. The strength and specificity of the action of such elements can vary. Specific initiation signals are also required for more efficient translation of the sequence encoding ISMO. Such signals include the ATG initiation codon and adjacent sequences, such as the Kozak sequence. If ISMO and its initiation codon and upstream control sequences are inserted into the appropriate expression vector, no other transcriptional or translational control signals are required. However, if only the coding sequence or a fragment thereof is inserted, an exogenous translational control signal, including the ATG start codon, must be provided. In addition, the start codon must be in the correct reading frame to ensure transcription of the entire insert. Exogenous transcriptional elements and initiation codons can be from a variety of sources, both natural and synthetic. Inclusion of appropriate enhancers in the particular cell line used can increase the efficiency of expression (eg, Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell
Differ. 20: 125-162).

【0093】 当業者に周知の方法を用いて、ISMOをコードする配列及び適当な転写或い
は翻訳制御エレメントを含む発現ベクタを作製することができる。これらの方法
は、in vitro組換えDNA技術、合成技術並びにin vivoゲノム
組換えを含む(例えば、Sambrook,等(1989) Molecular Cloning. A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, ch. 4, 8, and 16-17;並
びにAusubel, F.M.等(1995, and periodic supplements) Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, ch. 9, 13, and 16を
参照されたい)。
[0093] Expression vectors containing ISMO-encoding sequences and appropriate transcriptional or translational control elements can be constructed using methods well known to those skilled in the art. These methods include in vitro recombinant DNA techniques, synthetic techniques, as well as in vivo genomic recombination (eg, Sambrook, et al . (1989) Molecular Cloning. A Laboratory ) .
Manual , Cold Spring Harbor Press, Plainview, NY, ch. 4, 8, and 16-17; and Ausubel, FM, etc. (1995, and periodic supplements) Current Protocols in
Molecular Biology , John Wiley & Sons, New York, NY, ch. 9, 13, and 16).

【0094】 種々の発現ベクタ/宿主系を利用して、ISMOをコードする配列を含有し、
発現する場合もある。これらは、限定はしないが、組換えバクテリオファージ、
プラスミド或いはコスミドDNA発現ベクタと形質転換されたバクテリア、酵母
発現ベクタと形質転換された酵母、ウイルス発現ベクタで感染した昆虫細胞系(
例えばバキュロウイルス)、ウイルス発現ベクタと形質転換された植物細胞系(
例えば、カリフラワーモザイクウイルスCaMV、タバコモザイクウイルスTM
V)或いはバクテリア発現ベクタと形質転換された植物細胞系(例えば、Ti或
いはpBR322プラスミド)又は動物細胞系のような微生物を含む。本発明は
用いられる宿主細胞により制限されない。
A variety of expression vector / host systems may be utilized to contain a sequence encoding ISMO,
It may be expressed. These include, but are not limited to, recombinant bacteriophages,
Bacteria transformed with plasmid or cosmid DNA expression vectors, yeast transformed with yeast expression vectors, insect cell lines infected with viral expression vectors (
For example, baculovirus), a viral expression vector and a transformed plant cell line (
For example, cauliflower mosaic virus CaMV, tobacco mosaic virus TM
V) or a microorganism such as a plant cell line (eg, Ti or pBR322 plasmid) or an animal cell line transformed with a bacterial expression vector. The invention is not limited by the host cell used.

【0095】 細菌系では、ISMOをコードするポリヌクレオチドの用途に応じて様々なク
ローニング及び発現ベクターを選択することができる。例えば、ISMOをコー
ドするポリヌクレオチドのルーチンのクローニング、サブクローニング、及び成
長(propagation)を、例えばBLUSCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)やpSPORT1
プラスミド(Life Technologies)のような多機能大腸菌ベクターを用いて達成
することができる。ベクターの様々なクローニング部位にISMOをコードする
配列を組み入れてlacZ遺伝子を壊すことによって、組換え分子を含む形質転換さ
れた細菌を特定するための比色によるスクリーニングを行うことができるように
なる。更に、これらのベクターは、in vitro転写、ジデオキシ法のシークエンシ
ング、ヘルパーファージによる一本鎖レスキュー(single strand rescue)、及
びクローン化した配列における入れ子欠失の生成のために有用であり得る(例え
ばVan Heeke, G.及びS.M. Schuster(1989)J. Biol. Chem. 264:5503-5509)。
例えば抗体産生のために大量のISMOが必要な場合には、ISMOの高レベル
で発現を誘導するベクターを用いることができる。例えば、強い誘導性T5また
はT7バクテリオファージプロモーターを含むベクターを用いることができる。
[0095] In bacterial systems, a variety of cloning and expression vectors may be selected depending upon the use of the polynucleotide encoding ISMO. For example, routine cloning, subcloning, and propagation of a polynucleotide encoding ISMO can be performed, for example, using BLUSCRIPT (Stratagene, La Jolla CA) or pSPORT1.
This can be achieved using a multifunctional E. coli vector such as a plasmid (Life Technologies). Disruption of the lacZ gene by incorporating sequences encoding ISMO into the various cloning sites of the vector allows colorimetric screening to identify transformed bacteria containing the recombinant molecule. In addition, these vectors may be useful for in vitro transcription, dideoxy sequencing, single strand rescue by helper phage, and the generation of nested deletions in cloned sequences (eg, Van Heeke, G. and SM Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509).
For example, when a large amount of ISMO is required for antibody production, a vector that induces high-level expression of ISMO can be used. For example, vectors containing a strong inducible T5 or T7 bacteriophage promoter can be used.

【0096】 ISMOの産生のために、酵母菌発現系を用いることもできる。例えばα因子
、アルコールオキシダーゼ、及びPGHのような構成的または誘導的プロモータ
ーを含む様々なベクターを、酵母菌のサッカロミセスセレビシエ(Saccharomyce
s cerevisiae)やメタノール資化酵母ピチアパストリス(Pichia pastoris)に
おいて用いることができる。更に、そのようなベクターは、発現されたタンパク
質の細胞外への分泌または細胞内での保持の何れかを誘導し、安定的な発現のた
めの外来配列の宿主のゲノムへの組み入れを可能にする(例えばAusubel, 前掲;
及びScorer, C.A.ら (1994) Bio/Technology 12:181-184参照)。
For the production of ISMO, a yeast expression system can also be used. Various vectors containing constitutive or inducible promoters, such as, for example, alpha factor, alcohol oxidase, and PGH, can be transferred to yeast Saccharomycete ( Saccharomyceae).
cerevisiae ) and methanol-assimilating yeast Pichia pastoris . In addition, such vectors induce either the extracellular secretion of the expressed protein or the retention inside the cell, allowing the integration of foreign sequences into the host genome for stable expression. (Eg Ausubel, supra;
And Scorer, CA et al. (1994) Bio / Technology 12: 181-184).

【0097】 植物発現ベクタが用いられる場合には、ISMOをコードする配列の発現は、
いくつかのプロモータの任意のものにより行われる。例えばCaMVの35S及
び19Sプロモータのようなウイルス性プロモータは単独で、或いはTMVから
のω−リーダ配列と共に用いることができる(Takamatsu 等 (1987) EMBO J 6:3
07-311)。別法では、RUBISCOの小サブユニットのような植物プロモータ
或いは熱ショックプロモータ(Coruzzi 等 (1984) EMBO J 3:1671-1680; Brogli
e 等 (1984) Science 224:838-843及びWinter J and Sinibaldi RM (1991) Resu
lts Probl Cell Differ 17:85-105)を用いる場合もある。これらの構成体は、
直接DNA形質転換或いは病原体媒介形質移入により植物細胞内に導入されるこ
とができる。その技術は一般に入手できるいくつかの概説に記載される(例えば
、Hobbs S or Murry LE in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology
(1992) McGraw Hill New York NY, pp. 191-196を参照されたい)。
If a plant expression vector is used, expression of the sequence encoding ISMO
It is performed by any of several promoters. Viral promoters such as the CaMV 35S and 19S promoters can be used alone or with the ω-leader sequence from TMV (Takamatsu et al. (1987) EMBO J 6: 3).
07-311). Alternatively, plant promoters such as the small subunit of RUBISCO or heat shock promoters (Coruzzi et al. (1984) EMBO J 3: 1671-1680; Brogli
e et al. (1984) Science 224: 838-843 and Winter J and Sinibaldi RM (1991) Resu
lts Probl Cell Differ 17: 85-105). These constructs
It can be introduced into plant cells by direct DNA transformation or pathogen-mediated transfection. The technology is described in several generally available reviews (eg, Hobbs S or Murry LE in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology).
(1992) McGraw Hill New York NY, pp. 191-196).

【0098】 哺乳類宿主細胞では、いくつかのウイルス性発現系が利用される場合がある。
アデノウイルスが発現ベクタとして用いられる場合には、ISMOをコードする
配列は、後期プロモータ及び3連のリーダ配列からなるアデノウイルス転写/翻
訳複合体に結合される場合がある。ウイルスゲノムの非必須E1或いはE3領域
内の挿入により、感染した宿主細胞においてISMOを発現することができる生
ウイルスを得ることができる(例えば、Logan and Shenk (1984) Proc Natl Aca
d Sci 81:3655-3659を参照されたい)。さらにラウス肉腫ウイルス(RSV)エ
ンハンサのような転写エンハンサを用いて、哺乳動物宿主細胞内の発現を増加さ
せることができる。SV40或いはEBV系ベクタを用いて、高レベルのタンパ
ク質を発現することもできる。
[0098] In mammalian host cells, a number of viral expression systems may be utilized.
When an adenovirus is used as an expression vector, the sequence encoding ISMO may be ligated to an adenovirus transcription / translation complex consisting of the late promoter and tripartite leader sequence. Insertion within the non-essential E1 or E3 region of the viral genome can result in a live virus capable of expressing ISMO in infected host cells (eg, Logan and Shenk (1984) Proc Natl Aca).
d Sci 81: 3655-3659). In addition, transcription enhancers such as the Rous sarcoma virus (RSV) enhancer can be used to increase expression in mammalian host cells. High levels of protein can also be expressed using SV40 or EBV vectors.

【0099】 またヒト人工染色体(HAC)を用いて、プラスミドに含まれ、発現させるこ
とができるDNAのより大きなフラグメントを送達することもできる。治療のた
め、6kb〜10MbのHACが構成され、従来の送達方法(リポソーム、ポリ
カチオンアミノポリマ或いはベシクル)を用いて送達される。
[0099] Human artificial chromosomes (HACs) can also be used to deliver larger fragments of DNA that can be contained and expressed in a plasmid. For treatment, a 6 kb to 10 Mb HAC is constructed and delivered using conventional delivery methods (liposomes, polycation amino polymers or vesicles).

【0100】 哺乳動物系において長期間組換え体タンパク質を歩留まり高く生産する場合、
安定した発現が望ましい。例えば、ISMOを安定して発現する細胞株は、複製
或いは内性発現エレメントのウイルス起源及び同じ或いは別のベクタにおける選
択可能マーカ遺伝子を含む発現ベクタを用いて形質転換することができる。ベク
タの導入に続いて、細胞を強化培地内で1〜2日間成長させ、その後選択培地に
切り替えるようにする。選択可能マーカの目的は、選択への耐性を与えることで
あり、その存在により、導入された配列を有効に発現する細胞が成長し、回収さ
れるようになる。安定して形質転換された細胞の耐性クローンは、細胞タイプに
適した組織培養技術を用いて増殖させることができる。
For long-term, high-yield production of recombinant proteins in mammalian systems,
Stable expression is desirable. For example, cell lines that stably express ISMO can be transformed with an expression vector that includes the viral origin of the replication or endogenous expression element and a selectable marker gene in the same or another vector. Following the introduction of the vector, the cells are allowed to grow for 1-2 days in an enriched medium before switching to a selective medium. The purpose of a selectable marker is to confer resistance to selection, the presence of which allows cells that effectively express the introduced sequence to grow and be recovered. Resistant clones of stably transformed cells can be propagated using tissue culture techniques appropriate for the cell type.

【0101】 任意の数の選択系を用いて、形質転換された細胞株を回収することができる。
これらは、限定はしないが、それぞれtk-細胞或いはaprt-細胞において用
いることができる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler,M等(1977) C
ell 11:223-32)及びアデニンフォスフォリボシール転換酵素遺伝子(Lowy I等(
1980) Cell 22:817-23)含む。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤耐性を
選択のための基準として用いることができる。例えば、dhfrはメトトレキセ
ートへの耐性を与え(Wigler M等(1980)Proc Natl Acad Sci 77:3567-70)、n
ptはアミノグリコシッドネオマイシン及びG−418への耐性を与え(Colber
e-Garapin F等(1981) J Mol Biol 150:1-14)、als或いはpatはそれぞれ
クロルスルフロン及びホスフィノトリシン(phosphinotricin)アセチル基転移
酵素への耐性を与える(Murry、前掲)。さらに選択可能遺伝子が記載されてお
り、例えば、trpBにより細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用
できるようになり、hisDにより細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール(
histinol)を利用できるようになる(Hartman S.C及びR.C Mulligan(1988)Proc
Natl Acad Sci 85:8047-51)。可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光
タンパク質(green fluorescent protein;GFP; Clonetech, Palo Alto, CA
)、β−グルクロニダーゼ及びその基質であるβ−D−グルクロノシド、または
ルシフェラーゼ及びその基質であるルシフェリンを用いてもよい。これらのマー
カは、転換体を同定するのみならず、特異なベクタ系に起因する一過性或いは安
定したタンパク質発現の量を定量するために幅広く用いられる(Rhodes CA等(19
95) Methods Mol Biol 55:121-131)。
[0101] Any number of selection systems can be used to recover transformed cell lines.
These include, but are not limited to, respectively tk - cells or aprt - herpes simplex virus thymidine kinase that can be used in cells (Wigler, M, etc. (1977) C
ell 11: 223-32) and adenine phosphoribosyl convertase gene (Lowy I et al.
1980) Cell 22: 817-23). Antimetabolites, antibiotics or herbicide tolerance can also be used as criteria for selection. For example, dhfr confers resistance to methotrexate (Wigler M et al. (1980) Proc Natl Acad Sci 77: 3567-70), n
pt confers resistance to aminoglycoside neomycin and G-418 (Colber
e-Garapin F et al. (1981) J Mol Biol 150: 1-14), als or pat confer resistance to chlorsulfuron and phosphinotricin acetyltransferase, respectively (Murry, supra). Further selectable genes have been described, for example, trpB allows cells to utilize indole instead of tryptophan, and hisD allows cells to use histinol (histinol instead of histidine).
histinol) (Hartman SC and RC Mulligan (1988) Proc)
Natl Acad Sci 85: 8047-51). Visible markers such as anthocyanins, green fluorescent protein (GFP); Clonetech, Palo Alto, CA
), Β-glucuronidase and its substrate, β-D-glucuronoside, or luciferase and its substrate, luciferin. These markers are widely used not only to identify transformants, but also to quantify the amount of transient or stable protein expression due to specific vector systems (Rhodes CA et al. (19)
95) Methods Mol Biol 55: 121-131).

【0102】 マーカ遺伝子発現の存否は、対象の遺伝子が存在することを示唆するが、その
存在及び発現は確認される必要がある。例えば、ISMOをコードする配列がマ
ーカ遺伝子配列内に挿入される場合には、ISMOをコードする配列を含む組換
え細胞は、マーカ遺伝子機能の欠如により同定されることができる。別法では、
マーカ遺伝子は、単一のプロモータの制御下でISMOをコードする配列と直列
に配置される。誘導及び選択に応じたマーカ遺伝子の発現は通常、同様に直列型
遺伝子の発現を示す。
The presence or absence of marker gene expression indicates that the gene of interest is present, but its presence and expression need to be confirmed. For example, if a sequence encoding ISMO is inserted within a marker gene sequence, recombinant cells containing the sequence encoding ISMO can be identified by a lack of marker gene function. Alternatively,
The marker gene is placed in tandem with the sequence encoding ISMO under the control of a single promoter. Expression of the marker gene in response to induction and selection usually indicates expression of the tandem gene as well.

【0103】 全般的に、ISMOをコードする核酸配列を含み、ISMOを発現する宿主細
胞は、当業者に知られる種々の手順により同定されることができる。この手順は
、限定はしないが、核酸或いはタンパク質の検出並びにまた定量化のための膜、
溶液或いはチップ系技術を含むDNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダ
イゼーション及びタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイ技術を含む。
In general, host cells that contain a nucleic acid sequence encoding ISMO and that express ISMO can be identified by a variety of procedures known to those of skill in the art. This procedure includes, but is not limited to, membranes for detection and / or quantification of nucleic acids or proteins,
DNA-DNA or DNA-RNA hybridization, including solution or chip-based techniques, and protein bioassay or immunoassay techniques.

【0104】 特異なポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いて、I
SMOの発現を検出し、測定するための免疫学的方法は、当業者には周知である
。例えば酵素結合免疫測定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)
、蛍光標示式細胞分取(FACE)などである。ISMOにおける2つの非干渉
性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる2部位のモノクローナル系
イムノアッセイ(monoclonal-based immunoassay)が好ましいが、結合タンパク
競合測定法が用いられてもよい。これら及び他の検定法は当分野において公知で
ある。(例えば、Hampton,R.等(1990)Serological Methods,a Laboratory Manua
l, APS Press,St Paul. MN, Section IV;Coligan, J. E.等(1997 and periodic
supplements) Current Protocols in Immunology,Greene Pub. Associates and
Wiley-Interscience, New York, NY; and Maddox, D.E.等.(1983) J. Exp. Med.
158:1211-1216を参照されたい)。
Using either specific polyclonal or monoclonal antibodies, I
Immunological methods for detecting and measuring SMO expression are well known to those skilled in the art. For example, enzyme-linked immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA)
And fluorescence-activated cell sorting (FACE). A two-site monoclonal-based immunoassay using monoclonal antibodies reactive to two non-interfering epitopes in ISMO is preferred, but a binding protein competition assay may be used. These and other assays are known in the art. (For example, Hampton, R. et al. (1990) Serological Methods, a Laboratory Manua
l , APS Press, St Paul.MN, Section IV; Coligan, JE et al. (1997 and periodic
supplements) Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and
Wiley-Interscience, New York, NY; and Maddox, DE, etc. (1983) J. Exp. Med.
158: 1211-1216).

【0105】 幅広い標識及び接合技術が当業者には知られており、種々の核酸及びアミノ酸
検定法において用いることができる。ISMOをコードするポリヌクレオチドに
関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーション或いはPCRプロ
ーブを生成するための手段は、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端
標識化或いは標識化ヌクレオチドを用いるPCR増幅を含む。別法では、ISM
Oをコードする配列或いはその任意の一部が、mRNAプローブの生成のために
ベクタ内にクローニングされる場合もある。そのようなベクタが当分野において
知られ、市販されており、T7、T3或いはSP6のような適当なRNAポリメ
ラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えることによりin vitroでRN
Aプローブを合成するために用いることができる。これらの手順は種々の市販の
キット(Pharmacia&upjohn (Kalamazoo,MI)、Promega (Madison WI)及びUS Bioc
hemical Corp (Cleveland OH))を用いて行われる。適当なリポータ分子或いは
標識が用いられる場合もあり、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤或いは色
素生産剤並びに基質、コファクタ、インヒビタ、磁気粒子等を含む。
A wide variety of labels and conjugation techniques are known by those skilled in the art and can be used in various nucleic acid and amino acid assays. Means for generating labeled hybridization or PCR probes for detecting sequences related to the polynucleotide encoding ISMO include oligo-labeling, nick translation, end-labeling or PCR amplification using labeled nucleotides. Including. Alternatively, ISM
The sequence encoding O, or any portion thereof, may be cloned into a vector for the production of an mRNA probe. Such vectors are known in the art, are commercially available, and can be used to generate RN in vitro by adding a suitable RNA polymerase such as T7, T3 or SP6 and labeled nucleotides.
It can be used to synthesize the A probe. These procedures are based on various commercially available kits (Pharmacia & upjohn (Kalamazoo, MI), Promega (Madison WI) and US Bioc.
Chemical Corp (Cleveland OH)). Appropriate reporter molecules or labels may be used, including radionuclides, enzymes, fluorescent agents, chemiluminescent or dye-producing agents, as well as substrates, cofactors, inhibitors, magnetic particles, and the like.

【0106】 ISMOをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、このタ
ンパク質を細胞培地で発現させ、そこから回収するのに適した条件の下で培養す
ることができる。形質転換された細胞により産生されるタンパク質は、用いられ
る配列及び/またはベクターに応じて、分泌されるか、または細胞内に保持され
る。当業者には理解されるように、ISMOをコードするポリヌクレオチドを含
む発現ベクターを、原核細胞か真核細胞の細胞膜を通してのISMO分泌を誘導
するシグナル配列を含むように設計することができる。
A host cell transformed with a nucleotide sequence encoding an ISMO can be cultured under conditions suitable for expressing and recovering the protein from the cell culture medium. Proteins produced by the transformed cells are secreted or retained intracellularly, depending on the sequence and / or vector used. As will be appreciated by those skilled in the art, expression vectors containing a polynucleotide encoding ISMO can be designed to include a signal sequence that directs ISMO secretion through a prokaryotic or eukaryotic cell membrane.

【0107】 さらに宿主細胞株は、挿入された配列の発現を変調したり、発現したタンパク
質を望ましい形にプロセシングする能力ついて選択することができる。このよう
なポリペプチドの修飾としては、限定するものではないが、アセチル化、カルボ
キシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化(lipidation)並びにアシル化が含
まれる。またタンパク質の「プレプロ」部分を切り離す翻訳後プロセシングも、
タンパク質のターゲティング、折り畳み、及び/又は作用を特定するために用い
ることができる。翻訳後の作用のための特定の細胞装置及び特徴的な機構を有し
ている種々の宿主細胞(例えばCHO、HeLa、MDCK、293、及びWI38)はAmerican T
ype Culture Collection(ATCC; Bethesda, MD)より入手でき、導入される外来
タンパク質の正しい修飾やプロセシングが確実に行われるように、このなかから
選択することができる。
In addition, host cell strains can be chosen for their ability to modulate the expression of the inserted sequences or to process the expressed protein in the desired fashion. Such modifications of the polypeptide include, but are not limited to, acetylation, carboxylation, glycosylation, phosphorylation, lipidation, and acylation. Post-translational processing, which separates the “prepro” part of the protein,
It can be used to identify protein targeting, folding, and / or action. A variety of host cells (eg, CHO, HeLa, MDCK, 293, and WI38) that have specific cellular machinery and characteristic mechanisms for post-translational action are available from American T.
It can be obtained from the Ype Culture Collection (ATCC; Bethesda, MD) and can be selected from these to ensure the correct modification and processing of the foreign protein to be introduced.

【0108】 本発明の別の実施例では、ISMOをコードする、天然の、修飾した、或いは
組換えた核酸配列をヘテロの配列に連結して、上述の宿主系の何れかにおける融
合タンパク質の翻訳を生じさせることができる。例えば、市販の抗体によって認
識され得る異種分子を含むキメラISMOタンパク質は、ペプチドライブラリー
からのISMOの活性のインヒビターの選別を促進し得る。そのような分子とし
ては、限定するものではないが、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、
マルトース結合タンパク質(MBP)、チオレドキシン(Trx)、カルモジュリン結
合ペプチド(CBP)、6-His、FLAG、c-myc、及び赤血球凝集素(HA)が挙げられ
る。GST、MBP、Trx、CBP、及び6-Hisによって、それぞれ固定化グルタチオン、
マルトース、酸化フェニルアルシン(phenylarsine oxide)、カルモジュリン、
及び金属キレート樹脂の上でのそれらの同属の融合タンパク質の精製が可能とな
る。FLAG、c-myc、及び赤血球凝集素(HA)によって、それらのエピトープのタ
グを特異的に認識する市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用い
た融合タンパク質のイムノアフィニティ精製が可能となる。融合タンパク質を、
ISMOをコードする配列とへテロのタンパク質配列との間にタンパク分解酵素
による切断部位を含むように組換えることによって、ISMOを、精製の後にヘ
テロの分子から切り離すことができるようになる。融合タンパク質の発現及び精
製のための方法は、Ausubel, F.M.他(1995及び定期的補遺) Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, ch 10に記載されて
いる。融合タンパク質の発現や精製を速やかに行うために、様々な市販のキット
を用いてもよい。
In another embodiment of the present invention, a natural, modified or recombinant nucleic acid sequence encoding ISMO is ligated to a heterologous sequence to translate the fusion protein in any of the host systems described above. Can be caused. For example, a chimeric ISMO protein containing a heterologous molecule that can be recognized by a commercially available antibody can facilitate the selection of inhibitors of ISMO activity from a peptide library. Such molecules include, but are not limited to, glutathione S-transferase (GST),
These include maltose binding protein (MBP), thioredoxin (Trx), calmodulin binding peptide (CBP), 6-His, FLAG, c-myc, and hemagglutinin (HA). GST, MBP, Trx, CBP, and 6-His, respectively, immobilized glutathione,
Maltose, phenylarsine oxide, calmodulin,
And purification of their cognate fusion proteins on metal chelating resins. FLAG, c-myc, and hemagglutinin (HA) allow immunoaffinity purification of fusion proteins using commercially available monoclonal and polyclonal antibodies that specifically recognize their epitope tags. The fusion protein
Recombination to include a proteolytic cleavage site between the sequence encoding the ISMO and the heterologous protein sequence allows the ISMO to be cleaved from the heterologous molecule after purification. Methods for expression and purification of fusion proteins are described in Ausubel, FM et al. (1995 and regular supplements) Current Protocols
in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, ch10. Various commercially available kits may be used to rapidly perform expression and purification of the fusion protein.

【0109】 本発明の更に別の実施例では、放射標識したISMOを、TNTTMウサギ網状赤
血球のライセートまたはコムギ胚芽抽出物系(Promega, Madison, WI)を用いて
in vitroで合成することができる。これらの系は、T7、T3、またはSP6プ
ロモーターに機能的に関連するタンパク質コーディング配列の転写と翻訳を結び
つける。翻訳は、放射標識したアミノ酸前駆体、好ましくは35S-メチオニンの存
在の下で生じる。
In yet another embodiment of the invention, the radiolabeled ISMO is purified using a lysate of TNT rabbit reticulocytes or a wheat germ extract system (Promega, Madison, WI).
It can be synthesized in vitro. These systems couple the transcription and translation of protein coding sequences functionally related to the T7, T3, or SP6 promoter. Translation takes place in the presence of a radiolabeled amino acid precursor, preferably 35 S-methionine.

【0110】 ISMOのフラグメントの作製は、組換え体の産生によって行うのみならず、
固相技術を用いた直接のペプチド合成によっても行うことができる(例えばCrei
ghton, 前出pp.55-60参照)。タンパク質合成は、手作業により、或いは自動的
に行うことができる。合成の自動化は、例えば、Applied Biosystems 431Aペプ
チド合成機 (The Perkin-Elmer) を用いて達成することができる。ISMOの様
々なフラグメントを個別に合成し、それを連結して完全長分子を作り出すことが
できる。
The production of fragments of ISMO is not only performed by production of recombinants,
It can also be performed by direct peptide synthesis using solid phase technology (eg, Crei
ghton, supra, pp. 55-60). Protein synthesis can be performed manually or automatically. Automation of synthesis can be achieved, for example, using an Applied Biosystems 431A peptide synthesizer (The Perkin-Elmer). The various fragments of ISMO can be synthesized separately and ligated together to create the full-length molecule.

【0111】 治療 ISMO−1、ヒトNGAL(GI 929657)及び他のポリカリン関連
タンパク質の領域間には、例えば配列及びモチーフの関連において、部分的に化
学的及び構造的な類似性がある。さらにISMO−2、ISMO−4及びIgス
ーパーファミリタンパク質の領域間には部分的な化学的及び構造的類似性がある
。さらに、ISMO−3、RNA結合タンパク質及び狼瘡関連Laタンパク質、
具体的には、蚊La(GI 1311676)及びヒトLa(GI 17868
7)の領域間には部分的な化学的及び構造的類似性がある。ISMOは、免疫応
答及び細胞増殖と関連する組織において発現される。それゆえ、ISMOは、免
疫応答及び細胞増殖と関連する障害においてある役割を担うものと考えられる。
There are partial chemical and structural similarities between the regions of therapeutic ISMO-1, human NGAL (GI 929657) and other polycarin-related proteins, for example, in the context of sequences and motifs. In addition, there are partial chemical and structural similarities between the regions of the ISMO-2, ISMO-4 and Ig superfamily proteins. Further, ISMO-3, RNA binding protein and lupus-related La protein,
Specifically, mosquito La (GI 131676) and human La (GI 17868)
There are partial chemical and structural similarities between the regions of 7). ISMO is expressed in tissues associated with the immune response and cell proliferation. Therefore, ISMO is thought to play a role in disorders associated with the immune response and cell proliferation.

【0112】 それゆえ一実施形態では、ISMOのアンタゴニストを被検者に投与して、免
疫系に関連する障害を治療或いは予防することができる。そのような障害は、限
定はしないが、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、
アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血
、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚炎、クローン病、アトピ
ー性皮膚炎、皮膚筋炎、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎
、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加
症、過敏性腸症候群、紅班性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心
膜の炎症、変形性関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発筋炎、乾癬、ライター症候群、
リウマチ性関節炎、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシ、全身
性紅班性狼瘡、全身性硬化症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、及び癌、血液
透析、体外循環の合併症、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感染、原
虫感染、及び蠕虫感染;及び外傷のような自己免疫及び炎症性疾患と、ブルトン
伴性無ガンマロブリン血症、後天性免疫グロブリン血症(CVI)、ディ‐ジョ
ージ症候群(胸腺形成不全)、胸腺異形成、Iga単独欠損症、重症複合免疫不
全(SCID)、血小板減少及び湿疹を伴う免疫不全(ウィスコット‐アルドリ
ッチ症候群)、チェディアック‐東症候群、慢性肉芽腫症、遺伝性血管神経性浮
腫、クッシング病関連免疫不全のような免疫欠損症とを含む。一態様では、IS
MOを特異に結合する抗体を、アンタゴニストとして直接、或いはISMOを発
現する細胞或いは組織に医薬品因子を運ぶためのターゲッティング或いは送達機
構として間接的に用いることもできる。
Thus, in one embodiment, an antagonist of ISMO can be administered to a subject to treat or prevent a disorder associated with the immune system. Such disorders include, but are not limited to, Addison's disease, adult respiratory distress syndrome, allergies, ankylosing spondylitis,
Amyloidosis, anemia, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thyroiditis, bronchitis, cholecystitis, contact dermatitis, Crohn's disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes , Emphysema, erythema nodosum, atrophic gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome, gout, Graves' disease, Hashimoto's thyroiditis, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, lupus erythematosus, multiple sclerosis, Myasthenia gravis, inflammation of the myocardium or pericardium, osteoarthritis, osteoporosis, pancreatitis, polymyositis, psoriasis, Reiter's syndrome,
Rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis, ulcerative colitis, Werner syndrome, and cancer, hemodialysis, extracorporeal complications, viral infection, Bacterial, fungal, parasite, protozoan, and helminth infections; and autoimmune and inflammatory diseases such as trauma, Bruton-associated agammaglobulinemia, acquired immunoglobulinemia (CVI), -George syndrome (thymic dysplasia), thymic dysplasia, Iga alone deficiency, severe combined immunodeficiency (SCID), immunodeficiency with thrombocytopenia and eczema (Wiscott-Aldrich syndrome), Chediak-Higashi syndrome, chronic granulation And immunodeficiencies such as hereditary angioedema, Cushing's disease-related immunodeficiency. In one aspect, the IS
An antibody that specifically binds MO can also be used directly as an antagonist or indirectly as a targeting or delivery mechanism for delivering a pharmaceutical agent to cells or tissues that express ISMO.

【0113】 別の実施形態では、ISMOをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現
するベクタを被検者に投与して、限定はしないが、上記障害を含む免疫系に関連
する障害を治療或いは予防することができる。
In another embodiment, a vector expressing the complement of a polynucleotide encoding ISMO is administered to a subject to treat or prevent a disorder associated with the immune system, including, but not limited to, the above disorders. can do.

【0114】 別の実施形態では、ISMOのアンタゴニストを被検者に投与して、細胞増殖
に関連する障害を治療或いは予防することができる。そのような障害は、限定は
しないが、日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、
肝炎、混合型結合組織病(MCTD)、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿
症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、
黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、
乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓
、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌を含む
。一態様では、ISMOを特異に結合する抗体を、アンタゴニストとして直接、
或いはISMOを発現する細胞或いは組織に医薬品因子を運ぶためのターゲッテ
ィング或いは送達機構として間接的に用いることもできる。
[0114] In another embodiment, an antagonist of ISMO can be administered to a subject to treat or prevent a disorder associated with cell proliferation. Such disorders include, but are not limited to, actinic keratosis, arteriosclerosis, atherosclerosis, bursitis, cirrhosis,
Hepatitis, mixed connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia, and adenocarcinoma and leukemia, lymphoma,
Melanoma, myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma, specifically, adrenal gland, bladder, bone, bone marrow, brain,
Includes breast, cervical, gallbladder, ganglion, gastrointestinal tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, uterine cancer. In one aspect, an antibody that specifically binds ISMO is directly used as an antagonist,
Alternatively, it can be used indirectly as a targeting or delivery mechanism for delivering a pharmaceutical agent to cells or tissues expressing ISMO.

【0115】 別の実施形態では、ISMOをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発現
するベクタを被検者に投与して、限定はしないが、上記障害を含む細胞増殖に関
連する障害を治療或いは予防することができる。
In another embodiment, a vector that expresses the complement of a polynucleotide encoding ISMO is administered to a subject to treat or prevent a disorder associated with cell proliferation, including but not limited to the above disorders. can do.

【0116】 他の実施形態では、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト
、相補配列或いはベクタの任意のものが、他の適当な治療薬剤と組み合わせて投
与れる場合もある。併用療法において用いるのに適した薬剤の選択は、従来の製
薬原理に基づいて当業者により行われることができる。治療薬剤の組み合わせは
相互依存的に作用し、上記種々の疾患の治療及び予防に影響を与えるようになる
。このアプローチを用いて、少ない投与量の薬剤で治療有効度を達成し、それに
より有害な副作用に対する危険性を低減することができる。
In other embodiments, any of the proteins, antagonists, antibodies, agonists, complementary sequences or vectors of the invention may be administered in combination with other suitable therapeutic agents. Selection of suitable agents for use in combination therapy can be made by one of ordinary skill in the art based on conventional pharmaceutical principles. The combination of therapeutic agents acts interdependently, affecting the treatment and prevention of the various diseases mentioned above. Using this approach, therapeutic efficacy can be achieved with lower doses of the drug, thereby reducing the risk for adverse side effects.

【0117】 ISMOのアンタゴニストは当業者に広く知られた方法を用いて生成されるこ
とができる。詳細には、精製されたISMOを用いて抗体を生成するか、或いは
医薬品因子のライブラリをスクリーニングし、ISMOと特異に結合するものを
同定することができる。
[0117] Antagonists of ISMO can be produced using methods well known to those skilled in the art. In particular, antibodies can be generated using purified ISMO, or libraries of pharmaceutical agents can be screened to identify those that specifically bind to ISMO.

【0118】 ISMOに対する抗体は当業者に周知の方法を用いて産生することができる。
そのような抗体は、限定はしないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ
、一本鎖、Fabフラグメント及びFab発現ライブラリにより生成されるフラ
グメントを含む場合がある。中和性抗体(ダイマ形成を抑制する抗体)が特に治
療上の使用に適している。
Antibodies to ISMO can be produced using methods well known to those skilled in the art.
Such antibodies may include, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, chimeric, single chain, Fab fragments and fragments produced by a Fab expression library. Neutralizing antibodies (antibodies that inhibit dimer formation) are particularly suitable for therapeutic use.

【0119】 抗体を産生する場合、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト等を含む種々の宿
主を、ISMO或いはその任意のフラグメント又は免疫原特性を有するオリゴペ
プチドを注射することにより免疫することができる。宿主種に応じて、種々のア
ジュバントを用いて免疫学的反応を高めることができる。そのようなアジュバン
トは、限定はしないが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのような
ミネラルゲル、及びリゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプ
チド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン及びジニトロフェノールのよ
うな表面活性物質を含む。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG(カ
ルメット−ゲラン杆菌)及びコリネバクテリウムパルヴムが特に好ましい(抗
体の産生及び解析方法をレビューする場合には、Harlow. E. and Lane, D. (198
8) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, N.Y.)を参照)。
For producing antibodies, various hosts, including goats, rabbits, rats, mice, humans, and the like, can be immunized by injection with ISMO or any fragment thereof or an oligopeptide having immunogenic properties. . Depending on the host species, various adjuvants can be used to enhance the immunological response. Such adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surface actives such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin and dinitrophenol. Contains substances. Among adjuvants used in humans, BCG (bacillus Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum are particularly preferred (when reviewing antibody production and analysis methods, see Harlow. E. and Lane, D. (198
8) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, NY).

【0120】 ISMOに対する抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド
、或いはフラグメントは、少なくとも5アミノ酸からなるアミノ酸配列を有し、
より好ましくは少なくとも10アミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。それら
は自然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり、小さな自然発生分子から
なる完全なアミノ酸配列を含むことが好ましい。ISMOアミノ酸の短い伸展部
はKLMのような別のタンパク質の伸展部及びキメラ分子に対して生成される抗
体と融合されることもできる。
The oligopeptide, peptide or fragment used to elicit antibodies against ISMO has an amino acid sequence consisting of at least 5 amino acids,
More preferably, it has an amino acid sequence consisting of at least 10 amino acids. They are preferably identical to part of the amino acid sequence of the native protein and include the complete amino acid sequence consisting of small naturally occurring molecules. Short stretches of ISMO amino acids can also be fused with stretches of another protein, such as KLM, and antibodies generated against the chimeric molecule.

【0121】 ISMOに対するモノクローナル抗体は、培養中の持続細胞株による抗体分子
の生成を実現する任意の技術を用いて調製することができる。これらの技術は、
限定はしないが、ハイブリドーマ技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術及びEB
V−ハイブリドーマ技術を含む(Koehler等(1975) Nature 256:495-497、Kozbor
等 (1985) J.Immunol Methods 81:31-42、Cote等(1983) Proc Natl Acad Sci 8
0:2026-2030、Cole, S.P 等 (1984) Mol. Cell Biol.62:109-120)。
[0121] Monoclonal antibodies to ISMO can be prepared using any technique that provides for the production of antibody molecules by continuous cell lines in culture. These technologies are
Without limitation, hybridoma technology, human B cell hybridoma technology and EB
Including V-hybridoma technology (Koehler et al. (1975) Nature 256: 495-497, Kozbor
(1985) J. Immunol Methods 81: 31-42, Cote et al. (1983) Proc Natl Acad Sci 8
0: 2026-2030, Cole, SP et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62: 109-120).

【0122】 さらに「キメラ抗体」を生成するために開発された技術、適当な抗原特異性及
び生物活性を有する分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのス
プライシングを用いることができる(Morrison 等(1984) Proc Natl Acad Sci 8
1:6851-6855: Neuberger 等(1984) Nature 312:604-608; Takeda 等(1985) Natu
re 314:452-454)。別法では、一本鎖抗体の生成のために記載される技術を、当
分野で知られた方法を用いて適合して、ISMO特異性一本鎖抗体を生成しても
よい。関連する特異性を有するが、個別のイディオタイプ組成物からなる抗体が
、ランダムに組み合わせた免疫グロビンライブラリからの鎖混合により生成され
ることもできる(Burton D.R.(1991)Proc Natl Acad Sci 88:10134-10137)。
In addition, techniques developed to generate “chimeric antibodies”, splicing of mouse antibody genes into human antibody genes to obtain molecules with appropriate antigen specificity and biological activity can be used (Morrison (1984) Proc Natl Acad Sci 8
1: 6851-6855: Neuberger et al. (1984) Nature 312: 604-608; Takeda et al. (1985) Natu
re 314: 452-454). Alternatively, the techniques described for generating single-chain antibodies may be adapted using methods known in the art to generate ISMO-specific single-chain antibodies. Antibodies with related specificity, but consisting of distinct idiotypic compositions, can also be generated by chain mixing from randomly combined immunoglobin libraries (Burton DR (1991) Proc Natl Acad Sci 88: 10134 -10137).

【0123】 また抗体は、リンパ球集団においてin vivoで生成を誘発することにより、或
いは組換え免疫グロブリンライブラリ又は論文(Orlandi 等(1989, Proc Natl A
cad Sci 86:3833-3837、Winter G and Milstein C (1991; Nature 349:293-299)
に開示されるような非常に特異的な結合剤のパネルをスクリーニングすることに
より生成することもできる。
[0123] Antibodies can also be raised in vivo in lymphocyte populations by inducing production or by using recombinant immunoglobulin libraries or articles (Orlandi et al. (1989, Proc Natl A.
cad Sci 86: 3833-3837, Winter G and Milstein C (1991; Nature 349: 293-299)
Can be generated by screening a panel of highly specific binding agents as disclosed in US Pat.

【0124】 またISMOに対する特異な結合部位を含む抗体フラグメントを発生させるこ
ともできる。例えば、そのようなフラグメントは、限定はしないが、抗体分子の
ペプシン消化により生成することができるF(ab´)2フラグメント及びF(
ab´)2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成すること
ができるFabフラグメントを含む。別法では、Fab発現ライブラリを、所望
の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントを迅速にしかも容易に同定
できるように作製してもよい(Huse WD 等 (1989) Science 256:1275-1281)。
[0124] Antibody fragments which contain specific binding sites for ISMO can also be generated. For example, such fragments include, but are not limited to, F (ab ') 2 fragments and F (
ab ') Fab fragments that can be produced by reducing the disulfide bridges of the two fragments. Alternatively, a Fab expression library may be generated so that monoclonal Fab fragments with the desired specificity can be identified quickly and easily (Huse WD et al. (1989) Science 256: 1275-1281).

【0125】 種々のイムノアッセイを用いて、所望の特異性を有する抗体を同定するために
スクリーニングすることができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗
体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いる結合タンパク競合測定法或いは
免疫放射測定法用の種々のプロトコルが、当分野では周知である。そのようなイ
ムノアッセイは典型的には、ISMOとその特異的抗体との間の複合形成体を測
定することを含む。2つの非干渉性ISMOエピトープに反応するモノクローナ
ル抗体を利用する2部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、結合タ
ンパク質競合測定法を用いることもできる(Maddox、前掲)。
[0125] A variety of immunoassays can be used to screen for antibodies having the desired specificity. Various protocols for binding protein competition assays or immunoradiometric assays using either polyclonal or monoclonal antibodies with established specificity are well known in the art. Such immunoassays typically involve measuring the complex formed between the ISMO and its specific antibody. A two-site monoclonal immunoassay utilizing monoclonal antibodies reactive to two non-interfering ISMO epitopes is preferred, but binding protein competition assays can also be used (Maddox, supra).

【0126】 ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、
ISMO抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは
、平衡状態の下でISMO抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃
度で割ったものである。多数のISMOエピトープに対して親和性が不均一なポ
リクロナール抗体試薬の測定値Kaは、ISMO抗体の平均親和性または結合活
性を表す。特定のISMOエピトープに単一特異的なモノクロナール抗体試薬の
Kaは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が109〜1012L/molの高親
和性抗体試薬は、ISMO抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイム
ノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が106〜107L/molの低親和性
抗体試薬は、ISMOが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫
精製及び類似の処理に用いるのが好ましい。(Catty, D. (1988) Antibodies, Vo
lume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E.
and Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monocional Antibodies, John Wi
ley & Sons, New York NY)。
Using various methods such as Scatchard analysis with radioimmunoassay technology,
Evaluate the affinity of the ISMO antibody. Affinity is represented by the binding constant Ka, which is the molarity of the ISMO antibody complex divided by the molarity of free antibody and free antigen under equilibrium conditions. The measured value Ka of a polyclonal antibody reagent with heterogeneous affinity for multiple ISMO epitopes represents the average affinity or avidity of the ISMO antibody. The Ka of a monoclonal antibody reagent monospecific for a particular ISMO epitope represents a true measure of affinity. High affinity antibody reagents with Ka values of 10 9 to 10 12 L / mol are preferably used for immunoassays in which the ISMO antibody conjugate must withstand severe manipulations. A low affinity antibody reagent with a Ka value of 10 6 to 10 7 L / mol is preferably used for immunopurification and similar treatments where the ISMO must eventually dissociate from the antibody in an activated state. (Catty, D. (1988) Antibodies, Vo
lume I: A Practical Approach .IRL Press, Washington, DC; Liddell, JE
and Cryer, A. (1991) A Practical Guide to Monocional Antibodies , John Wi
ley & Sons, New York NY).

【0127】 ポリクロナール抗体試薬の抗体価及び結合活性を更に評価して、あるダウンス
トリーム適用に対するこのような試薬の品質及び適性を調べる。例えば、少なく
とも1〜2mg/mlの特異的な抗体、好ましくは5〜10mg/mlの特異的
な抗体を含むポリクロナール抗体試薬の使用は、ISMO抗体複合体を沈殿させ
なければならない処理に適している。様々な適用例における抗体の特異性及び抗
体価、結合活性、抗体の品質や使用法の指針は一般に入手可能である。(例えば
、Catty, 前出, 及びColigan 他、前掲を参照)。
The titer and avidity of the polyclonal antibody reagents are further evaluated to determine the quality and suitability of such reagents for certain downstream applications. For example, the use of a polyclonal antibody reagent containing at least 1-2 mg / ml of specific antibody, preferably 5-10 mg / ml of specific antibody, is suitable for processes where the ISMO antibody complex must be precipitated. . Guidance on antibody specificity and titer, avidity, antibody quality and usage in various applications is generally available. (See, eg, Catty, supra, and Coligan et al., Supra).

【0128】 本発明の別の実施例では、ISMOをコードするポリヌクレオチド或いはその
任意のフラグメント又は相補配列を治療のために用いる場合もある。一態様では
、ISMOをコードするポリヌクレオチドに対する相補配列が、mRNAの転写
を遮断することが望ましい状況において用いられる。詳細には、細胞は、ISM
Oをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列と形質転換されることができる
。このように相補分子或いはフラグメントを用いて、ISMO活性を調節するか
、或いは遺伝子機能の調節を実現することができる。そのような技術は当分野で
は周知であり、センス或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド又はより大きなフ
ラグメントを、ISMOをコードする配列のコード化或いは調節領域に沿った種
々の位置から設計することができる。
In another embodiment of the invention, a polynucleotide encoding ISMO, or any fragment or complement thereof, may be used for therapy. In one aspect, a complementary sequence to a polynucleotide encoding ISMO is used in situations where it is desirable to block transcription of mRNA. Specifically, the cells are
It can be transformed with a sequence complementary to the polynucleotide encoding O. As described above, the complementary molecule or fragment can be used to regulate ISMO activity or to regulate gene function. Such techniques are well known in the art, and sense or antisense oligonucleotides or larger fragments can be designed from various locations along the coding or regulatory region of the sequence encoding ISMO.

【0129】 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス或いはワクシニアウイル
スに、また種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクタが、標的となる器官、
組織或いは細胞集団にヌクレオチド配列を送達するために用いられる場合がある
。当業者には周知の方法を用いて、ISMOをコードする遺伝子のポリヌクレオ
チドに相補的な核酸配列を発現するベクタを作製することができる(例えばSamb
rook 等(前掲)及びAusubel 等 (前掲)を参照されたい)。
Organs targeted by retroviruses, adenoviruses, herpes viruses or vaccinia viruses, and expression vectors derived from various bacterial plasmids,
It may be used to deliver a nucleotide sequence to a tissue or cell population. Vectors expressing nucleic acid sequences complementary to the polynucleotide of the gene encoding ISMO can be prepared using methods well known to those skilled in the art (eg, Samb).
See rook et al. (supra) and Ausubel et al. (supra)).

【0130】 ISMOをコードする遺伝子は、細胞或いは組織を、ISMOをコードする高
レベルのポリヌクレオチド或いはそのフラグメントを発現する発現ベクタと形質
転換することにより遮断されるようになる。そのような作製物は、翻訳できない
センス或いはアンチセンス配列を細胞内に導入するために用いられる。DNA内
に統合されない場合であっても、そのようなベクタは、内因性ヌクレアーゼによ
り無能にされるまで、RNA分子を転写し続けることができる。一過性の発現は
、非複製ベクタを用いて一ヶ月或いはそれ以上の間持続し、適当な複製エレメン
トがベクタ系の一部であるならさらに長く持続するようになる。
[0130] The gene encoding ISMO can be turned off by transforming a cell or tissue with an expression vector that expresses high levels of a polynucleotide or fragment thereof encoding ISMO. Such constructs are used to introduce non-translatable sense or antisense sequences into cells. Such vectors, even when not integrated into DNA, can continue to transcribe RNA molecules until disabled by endogenous nucleases. Transient expression may last for a month or more with non-replicating vectors, and will persist longer if the appropriate replication element is part of the vector system.

【0131】 上記のように遺伝子発現の修飾は、ISMOをコードする遺伝子の制御、5´
或いは調節領域(シグナル配列、プロモータ、エンハンサ及びイントロン)に対
する相補配列或いはアンチセンス分子(DNA、RNA或いはPNA)を設計す
ることにより得られるようになる。転写開始部位、例えば開始部位からの位置−
10と+10との間に由来するオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に「三重ら
せん」塩基対技術を用いて抑制を実現することができる。二重らせんの能力の抑
制がポリメラーゼ、転写因子或いは調節分子を結合するのに十分に開放されるよ
うになるため、三重らせん対は有用である。三重DNAを用いる最近の治療の進
歩は、論文(Gee JE 等(1994)In: Huber BE and BI Carr, Molecular and Immun
ologic Approaches, Futura Publishing Co. Mt Kisco NY, pp.163-177)に記載
されている。また相補配列或いはアンチセンス分子は、転写物がリボソームに結
合するのを防ぐことによりmRNAの翻訳を遮断するように設計することができ
る。
As described above, modification of gene expression can be achieved by controlling the gene encoding ISMO, 5 ′
Alternatively, it can be obtained by designing a complementary sequence to a regulatory region (signal sequence, promoter, enhancer, and intron) or an antisense molecule (DNA, RNA or PNA). Transcription start site, eg, position from start site-
Oligonucleotides derived between 10 and +10 are preferred. Similarly, suppression can be achieved using "triple helix" base pairing techniques. Triple helix pairs are useful because inhibition of the ability of the duplex to become sufficiently open to bind polymerases, transcription factors or regulatory molecules. Recent advances in therapy using triple DNA have been described in a paper (Gee JE et al. (1994) In: Huber BE and BI Carr, Molecular and Immun
ologic Approaches , Futura Publishing Co. Mt Kisco NY, pp. 163-177 ). Complementary sequences or antisense molecules can also be designed to block translation of mRNA by preventing transcripts from binding to ribosomes.

【0132】 リボザイム、すなわち酵素RNA分子が、RNAの特異な切断を触媒するため
に用いられる場合がある。リボザイム作用の機構は、相補的標的RNAへのリボ
ザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションを伴い、それにヌクレオチド鎖
切断分割が伴う。用いられる例は、ISMOをコードする配列のヌクレオチド鎖
切断分割に特異にしかも有効に触媒作用することができる遺伝子操作されたハン
マヘッドモチーフリボザイムを含む。
A ribozyme, an enzymatic RNA molecule, may be used to catalyze the specific cleavage of RNA. The mechanism of ribozyme action involves sequence-specific hybridization of the ribozyme molecule to complementary target RNA, which involves nucleotide strand breakage cleavage. Examples used include genetically engineered hammerhead motif ribozymes that can specifically and effectively catalyze nucleotide strand breakage of sequences encoding ISMO.

【0133】 任意の潜在的なRNA標的内の特異なリボザイム切断部位は、配列を含むリボ
ザイム切断部位GUA、GUU及びGUCに対して標的分子を走査することによ
り最初に同定される。一度同定されれば、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対
応する15〜20の間のリボヌクレオチドの短いRNA配列は、オリゴヌクレオ
チドを無能にする副次構造的な特徴に対して評価されることができる。また候補
標的の適合性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレ
オチドとのハイブリダイゼーションに対する容易性を検査することにより評価す
ることができる。
The unique ribozyme cleavage site within any potential RNA target is first identified by scanning the target molecule for ribozyme cleavage sites GUA, GUU and GUC containing sequences. Once identified, short RNA sequences of between 15 and 20 ribonucleotides corresponding to the region of the target gene containing the cleavage site are evaluated for substructural features that render the oligonucleotide inoperable. Can be. The suitability of a candidate target can also be assessed by examining its ease of hybridization to complementary oligonucleotides using a ribonuclease protection assay.

【0134】 本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子の合成に関して当分
野で知られた任意の方法により調製することができる。これらは、固相ホスホラ
ミダイト化学合成のようなオリゴヌクレオチドを化学的に合成するための方法を
含む。別法では、RNA分子は、ISMOをコードするDNA配列のin vitro
in vivo転写により生成することができる。そのようなDNA配列は、T7或
いはSP6のような適当なRNAポリメラーゼプロモータを用いて種々のベクタ
内に組み込むことができる。別法では、これらのcDNA作成物は、相補RNA
を合成し、細胞株、細胞或いは組織内に構成的に或いは誘導的に導入することが
できる。
The complementary ribonucleic acid molecules and ribozymes of the present invention can be prepared by any method known in the art for synthesizing nucleic acid molecules. These include methods for chemically synthesizing oligonucleotides, such as solid phase phosphoramidite chemical synthesis. Alternatively, RNA molecules can be produced by in vitro and in vivo transcription of a DNA sequence encoding ISMO. Such DNA sequences can be incorporated into various vectors using a suitable RNA polymerase promoter, such as T7 or SP6. Alternatively, these cDNA constructs are complemented with complementary RNA
Can be synthesized and introduced constitutively or inducibly into cell lines, cells or tissues.

【0135】 RNA分子を修飾して細胞内安定性及び半減期を改善することもできる。可能
な修飾は、限定はしないが、分子の5´並びにまた3´末端でのフランキング配
列の付加、或いは分子のバックボーンにおけるホスホジエステラーゼ連鎖ではな
くホスホロチオネート或いは2´O−メチルの使用を含む。この概念はPNAの
生成に固有のものであり、イノシン、キュェオシン及びワイブトシン並びにアセ
チル−、メチル−、チオ−、及び内因性エンドヌクレアーゼにより容易には識別
されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンの同様に修飾され
た形成体のような従来にはない塩基を含有することにより、これら分子の全体に
拡張されることができる。
[0135] RNA molecules can also be modified to improve intracellular stability and half-life. Possible modifications include, but are not limited to, the addition of flanking sequences at the 5 'and also 3' ends of the molecule, or the use of phosphorothionate or 2'O-methyl instead of a phosphodiesterase linkage in the backbone of the molecule. . This concept is unique to the production of PNAs and is similar to inosine, cyeosin, and wibutosin, as well as adenine, cytidine, guanine, thymine, and uridine, which are not easily distinguished by acetyl-, methyl-, thio-, and endogenous endonucleases. These molecules can be extended throughout by including unconventional bases, such as modified formers.

【0136】 細胞或いは組織内にベクタを導入するために多くの方法が利用可能であり、in
vivoin vitro及びex vivoで使用するのに同様に適している。ex vivo治療の
場合、ベクタは、患者から取り出された基幹細胞内に導入され、同じ患者に戻さ
れる自家移植物に対してクローンのように繁殖することができる。形質移入、リ
ポソーム注射或いはポリカチオンアミノポリマによる送達は、当分野で周知の方
法を用いて実現することができる(例えばGoldman, C.K. 等(1997)Nature Biot
echnology 15:462-466を参照されたい)。
[0136] Many methods for introducing a vector into cells or within the organization are available, in
Also suitable for use in vivo , in vitro and ex vivo . In the case of ex vivo treatment, the vector can be introduced into stem cells removed from a patient and propagated like a clone against an autograft returned to the same patient. Transfection, liposome injection or delivery by polycation amino polymer can be achieved using methods well known in the art (eg, Goldman, CK et al. (1997) Nature Biot.
echnology 15: 462-466).

【0137】 上記治療方法の任意の方法は、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル
、そして最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む、治療を要する被検体に適用
されることができる。
[0137] Any of the above methods of treatment can be applied to a subject in need of treatment, including, for example, mammals such as dogs, cats, cows, horses, rabbits, monkeys, and most preferably humans.

【0138】 本発明のさらに別の実施例は、上記任意の治療効果のために、製薬的に許容可
能な担体と共に用いられる医薬品組成物の投与に関連する。そのような医薬品組
成物は、ISMO、ISMOに対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト
或いはISMOのインヒビタからなることができる。組成物は単独で、或いは限
定はしないが、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース及び水を含む任意の滅菌の
生体適合性医薬品担体において投与されることがある、安定化化合物のような少
なくとも1つの他の薬剤との組み合わせて投与されることができる。これらの組
成物は単独で、或いは他の薬剤、薬物或いはホルモンと組み合わせて患者に投与
してもよい。
Yet another embodiment of the present invention relates to the administration of a pharmaceutical composition used with a pharmaceutically acceptable carrier for any of the above therapeutic effects. Such pharmaceutical compositions can comprise ISMO, antibodies to ISMO, mimetics, agonists, antagonists or inhibitors of ISMO. The composition may be administered alone or in any sterile biocompatible pharmaceutical carrier including, but not limited to, saline, buffered saline, dextrose and water, at least one such as a stabilizing compound, such as a stabilizing compound. It can be administered in combination with other agents. These compositions may be administered to the patient alone or in combination with other drugs, drugs or hormones.

【0139】 本発明に用いられる医薬品組成物は、限定はしないが、経口、静脈内、筋肉内
、動脈内、骨髄内、クモ膜下、心室内、経皮、皮下、腹膜内、鼻腔内、腸内、局
所、舌下、直腸手段を含む任意の経路により投与されることができる。
Pharmaceutical compositions used in the present invention include, but are not limited to, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, subarachnoid, intraventricular, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, Administration can be by any route, including enteral, topical, sublingual, rectal means.

【0140】 活性処方成分に加えて、これらの医薬品組成物は、製薬的に用いることができ
るプレパラートへの活性化合物の処理を容易にする医薬品添加物及び補助剤を含
む適当な製薬的に許容可能な担体を含む場合もある。さらに製剤及び投与に関す
る技術についての詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publis
hing Co. Easton PA)の最新版に見出される。
In addition to the active ingredient, these pharmaceutical compositions may contain a suitable pharmaceutically-acceptable excipient and adjuvants that facilitate the processing of the active compound into pharmaceutically usable preparations. In some cases. Further details on formulation and administration techniques can be found in Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publis
hing Co. Easton PA).

【0141】 経口投与の場合の医薬品組成物は、経口投与に適した投与量の当分野で周知の
製薬的に許容可能な担体を用いて調剤することができる。そのような担体により
、医薬品組成物は、患者が経口摂取するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤
、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤等として調剤されることができ
る。
Pharmaceutical compositions for oral administration can be formulated using pharmaceutically acceptable carriers well known in the art in dosages suitable for oral administration. With such carriers, the pharmaceutical compositions can be formulated as tablets, pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions, and the like, for oral ingestion by a patient. .

【0142】 経口投与するための医薬品調剤は、活性化合物と固形の医薬品添加物とを混合
して、選択的にはその混合物を細かく砕いて、さらに所望に応じて、錠剤或いは
糖衣剤コアを得るために適当な補助剤を加えた後、顆粒剤の混合物を処理して得
られるようになる。適当な医薬品添加物は、ラクトース、スクロース、マンニト
ール或いはソルビトールを含む糖、トウモロコシ、小麦、米、じゃがいも或いは
他の植物からのデンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロ
ース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、及び
アラビアゴム及びトラガカントゴムを含むゴム、並びにゼラチン及びコラーゲン
のようなタンパク質を含む炭水化物或いはタンパク質賦形剤である。必要なら、
架橋結合されたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸或いはアルギン酸ナト
リウムのようなその塩を含む、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられてもよい。
Pharmaceutical preparations for oral administration are prepared by mixing the active compound with a solid excipient and, optionally, grinding the mixture to give a tablet or dragee core, if desired. After the addition of suitable auxiliaries, the mixture of granules is obtained by processing. Suitable excipients are sugars including lactose, sucrose, mannitol or sorbitol, corn, wheat, rice, potato or other plants, cellulose such as methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose or sodium carboxymethylcellulose, and gum arabic. And gums including tragacanth and carbohydrates or protein excipients including proteins such as gelatin and collagen. If necessary
Disintegrating or solubilizing agents may be added, including cross-linked polyvinyl pyrrolidone, agar, alginic acid or a salt thereof such as sodium alginate.

【0143】 糖衣剤コアは濃縮糖液のような適当なコーティングと共に用いられ、その濃縮
糖液はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル(carbop
ol gel)、ポリエチレングリコール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び
適当な有機溶剤或いは溶剤混合物を含む場合もある。染料或いは色素が製品識別
、或いは活性化合物の量、すなわち投与量を特徴付けるために、錠剤或いは糖衣
錠コーティングに加えられる場合もある。
Dragee cores are used with suitable coatings, such as concentrated sugar solutions, which are prepared from gum arabic, talc, polyvinylpyrrolidone, carboporgel (carbopol gel).
ol gel), polyethylene glycol and also titanium dioxide, lacquer solutions and suitable organic solvents or solvent mixtures. Dyestuffs or pigments may be added to the tablets or dragee coatings for product identification or to characterize the amount of active compound, ie, dosage.

【0144】 経口投与される医薬品製剤は、ゼラチンからなる押込嵌合式のプッシュフィッ
トカプセル剤、並びにゼラチン及びグリコール或いはソルビトールのようなコー
ティングからなる軟らかく封止されたソフトシールカプセル剤を含む。プッシュ
フィットカプセル剤は、ラクトース或いはデンプンのような賦形剤或いは結合剤
、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、さらに選択的に安定
化剤と混合された活性処方成分を含むことができる。ソフトカプセル剤では、活
性化合物は、脂肪油、パラフィン油、或いは安定化剤を用いる場合も用いない場
合があるが液体ポリエチレングリコールのような適当な溶液内に溶解或いは懸濁
される場合がある。
Pharmaceutical preparations for oral administration include push-fit capsules made of gelatin, as well as soft, sealed soft seal capsules made of gelatin and a coating, such as glycol or sorbitol. Push-fit capsules can contain the active ingredient in admixture with excipients or binders such as lactose or starch, lubricants such as talc or magnesium stearate, and optionally, stabilizers. In soft capsules, the active compounds may be dissolved or suspended in suitable solutions, such as fatty oils, paraffin oils, or with or without stabilizers, such as liquid polyethylene glycols.

【0145】 非経口投与のための医薬品製剤は、活性化合物の水溶液を含む。注射するため
に、本発明の医薬品組成物は、水溶液内で、好ましくはハンクス溶液、リンガー
溶液或いは生理緩衝食塩水のような生体適合性緩衝液内で調製される。水性の注
入懸濁液は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール或いはデ
キストランのように、懸濁液を増粘する物質を含む場合がある。さらに活性化合
物の懸濁液は、適当な油性の注射懸濁液として調製される場合もある。適当な親
油性溶剤或いは溶媒は、ゴマ油のような脂肪油、或いはオレイン酸エチル又はト
リグリセリドのような合成脂肪酸エステル、或いはリポソームを含む。選択に応
じて懸濁液は、高濃縮の溶液の調製を可能とするために化合物の可溶性を増加さ
せる適当な安定化剤或いは薬剤を含む場合もある。
Pharmaceutical formulations for parenteral administration include aqueous solutions of the active compounds. For injection, the pharmaceutical compositions of the invention are prepared in aqueous solutions, preferably in biocompatible buffers such as Hanks's solution, Ringer's solution, or physiological saline buffer. Aqueous injection suspensions may contain substances that thicken the suspension, such as sodium carboxymethyl cellulose, sorbitol, or dextran. Additionally, suspensions of the active compounds may be prepared as appropriate oily injection suspensions. Suitable lipophilic solvents or solvents include fatty oils such as sesame oil, or synthetic fatty acid esters such as ethyl oleate or triglycerides, or liposomes. Optionally, the suspension may also contain suitable stabilizers or agents that increase the solubility of the compounds to allow for the preparation of highly concentrated solutions.

【0146】 局所或いは鼻腔投与の場合、特定の障壁を浸透させるのに適した浸透剤が調製
において用いられる。そのような浸透剤は当分野で一般に知られている。
For topical or nasal administration, penetrants appropriate to the particular barrier to be permeated are used in the preparation. Such penetrants are generally known in the art.

【0147】 本発明の医薬品組成物は、当分野において知られた、例えば、従来の混合、溶
解、顆粒化、糖衣形成、微粒子化、乳状化、カプセル化、封入(entrapping)或
いは凍結乾燥処理による方法で製造される。
The pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared by means of conventional mixing, dissolving, granulating, sugar-coating, microparticulating, emulsifying, encapsulating, entrapping or lyophilizing processes known in the art. Manufactured by the method.

【0148】 医薬品組成物は塩類として提供され、限定はしないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳
酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸等の多くの酸を用いて形成することができる。塩
類は、対応する遊離塩基形の場合より、水性或いはプロトン性溶剤において可溶
性を有する傾向がある。他の場合に好ましい製剤は、使用前に緩衝剤と結合され
たpH範囲4.5〜5.5の1mM−50mMヒスチジン、0.1%〜2%スク
ロース、2%〜7%マンニトールの任意のもの或いは全てを含む凍結乾燥粉末で
ある。
The pharmaceutical compositions are provided as salts and can be formed with a number of acids, including but not limited to hydrochloric, sulfuric, acetic, lactic, tartaric, malic, succinic, and the like. Salts tend to be more soluble in aqueous or protic solvents than in the corresponding free base form. In other cases, a preferred formulation is any of 1 mM-50 mM histidine, 0.1% -2% sucrose, 0.1% -2% sucrose, 2% -7% mannitol, combined with a buffer prior to use. Lyophilized powder containing all or all.

【0149】 医薬品組成物が調製された後、それらは適当な容器に入れられ、指示された条
件の治療のためにラベルを貼付される。ISMOの投与の場合、そのようなラベ
ル貼付は、投与の量、頻度並びに方法を含むであろう。
After the pharmaceutical compositions have been prepared, they can be placed in an appropriate container and labeled for treatment of an indicated condition. In the case of administration of an ISMO, such labeling will include the amount, frequency and manner of administration.

【0150】 本発明に用いるために適した医薬品組成物は、活性処方成分が目的を果たすた
めの有効な量だけ含まれる組成物を含む。有効な量を投与することは、当業者の
能力内で果たすことができる。
Pharmaceutical compositions suitable for use in the present invention include compositions wherein the active ingredients are contained in an effective amount to serve the purpose. Administering an effective amount can be accomplished within the ability of those skilled in the art.

【0151】 任意の化合物の場合、製薬的に有効な量は、例えば腫瘍性細胞の細胞培養アッ
セイ、或いは通常マウス、ウサギ、イヌ或いはブタの動物標本のいずれかにおい
て最初に見積もられる。また動物標本を用いて、所望の濃縮範囲及び投与の経路
が確定される。その後その情報を用いて、ヒトに投与するための有効な量及び経
路を確定することができる。
For any compound, the pharmaceutically effective amount is initially estimated, for example, in any of the cell culture assays for neoplastic cells, or usually in mouse, rabbit, dog or pig animal specimens. The desired enrichment range and route of administration are also determined using animal specimens. The information can then be used to determine effective doses and routes for administration to humans.

【0152】 製薬的に有効な量は、症状或いは状態を改善する、例えばISMO或いはその
フラグメント、ISMOの抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、或いはISMO
のインヒビタの主成分の量である。そのような化合物の治療に対する有効度及び
毒性は、細胞培養或いは実験動物における標準的な製薬的手順、例えばED50
集団の50%において製薬的に有効な量)及びLD50(集団の50%が致死する
量)により確定することができる。治療効果と毒性効果の投与量比が治療指数で
あり、比LD50/ED50として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬品
組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータは、ヒト
に投与するための量の範囲を処方する際に用いられる。そのような化合物の投与
量は、毒性が非常に少ないか或いは全くなくED50を含む血中濃度の範囲内にあ
ることが好ましい。投与量は、用いられる投与形態、患者の感度及び投与経路に
よりこの範囲内で変化する。
A pharmaceutically effective amount is one that ameliorates a symptom or condition, eg, ISMO or a fragment thereof, an antibody, agonist, antagonist, or ISMO of ISMO.
Is the amount of the main component of the inhibitor. The therapeutic efficacy and toxicity of such compounds is determined by standard pharmaceutical procedures in cell culture or experimental animals, such as ED 50 (
It can be determined by the pharmaceutically effective amount in 50% of the population) and the LD 50 (the amount that kills 50% of the population). Dose ratio between therapeutic and toxic effects is the therapeutic index and it can be expressed as the ratio LD 50 / ED 50. Pharmaceutical compositions that exhibit large therapeutic indices are desirable. The data obtained from cell culture assays and animal studies is used in formulating a range of dosage for human administration. The dosage of such compounds lies preferably toxicity within a range of circulating concentrations that include very little or absolutely no ED 50. Dosage will vary within this range depending upon the dosage form employed, sensitivity of the patient and the route of administration.

【0153】 厳密な投与量は、治療を要する患者に関連する要因により医師によって確定さ
れるであろう。量及び投与を調整して、十分なレベルの活性成分を与えたり、或
いは所望の効果を維持することもある。考慮される場合がある要因は疾患状態の
重症度、被検者の健康状態、患者の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び
頻度、薬物の組み合わせ、反応への敏感度、並びに治療に対する耐性/反応を含
む。特定の製剤の半減期及びクリアランス率に応じて、3〜4日毎、毎週或いは
2週間毎に一度、長時間作用性の医薬品組成物が投与される場合もある。
The exact dosage will be determined by a physician, depending on factors related to the patient requiring treatment. The amount and administration may be adjusted to provide sufficient levels of the active ingredient or to maintain the desired effect. Factors that may be considered are the severity of the disease state, the health of the subject, the age, weight and sex of the patient, diet, time and frequency of administration, drug combinations, sensitivity to response, and Includes resistance / response. Long-acting pharmaceutical compositions may be administered every 3 to 4 days, every week or once every two weeks depending on the half-life and clearance rate of the particular formulation.

【0154】 通常の投与量は0.1μg〜100,000μgまで変化し、投与の経路にも
よるが、全投与量は約1gまでである。詳細な投与量及び送達の方法に関する手
引きは文献に与えられており、一般に当分野の開業医が利用できる。当業者は、
タンパク質或いはそのインヒビタの場合とは異なる製剤を、ヌクレオチドの場合
に用いるであろう。同様にポリヌクレオチド或いはポリペプチドの送達は特定の
細胞、状態、位置等に対して特異であろう。
Normal dosage amounts may vary from 0.1 μg to 100,000 μg, with a total dosage up to about 1 g, depending on the route of administration. Guidance on detailed dosages and methods of delivery is provided in the literature and is generally available to practitioners in the art. Those skilled in the art
Different formulations will be used for nucleotides than for proteins or their inhibitors. Similarly, delivery of a polynucleotide or polypeptide will be specific to a particular cell, condition, location, etc.

【0155】 診断 別の実施例では、ISMOを特異に結合する抗体を、ISMOの発現により特
徴付けられる状態或いは疾患の診断のために、又はISMO、アゴニスト、アン
タゴニスト或いはインヒビタを用いて治療中の患者をモニタするための検定法に
おいて用いることができる。診断のために有用な抗体は、治療の場合に上記した
方法と同様の方法で調製することができる。ISMOに対する診断検定法は、抗
体及び標識を用いて、ヒト体液或いは細胞又は組織の抽出物においてISMOを
検出する方法を含む。抗体は、修飾しても修飾しなくても用いることができ、リ
ポータ分子と共有結合或いは非共有結合の何れかで結合することにより標識され
ることができる。当分野において知られる種々のリポータ分子を用いることがで
き、そのいくつかが上記される。
Diagnosis In another embodiment, an antibody that specifically binds ISMO may be used to diagnose a condition or disease characterized by the expression of ISMO, or to treat a patient being treated with an ISMO, agonist, antagonist or inhibitor. Can be used in assays to monitor Antibodies useful for diagnosis can be prepared in the same way as described above for therapy. Diagnostic assays for ISMO include methods that use antibodies and labels to detect ISMO in human body fluids or extracts of cells or tissues. The antibodies can be used with or without modification, and can be labeled by binding, either covalently or non-covalently, to a reporter molecule. Various reporter molecules known in the art can be used, some of which are described above.

【0156】 ISMOを測定するためのELISA、RIA及びFACSを含む種々のプロ
トコルが当分野において知られており、ISMO発現の変更されたレベル或いは
異常なレベルを診断するための方法を提供する。ISMO発現のための正常或い
は標準的な値は、正常な哺乳動物被検者、好ましくはヒトから取り出された体液
或いは細胞抽出物を複合体形成に適した条件下でISMOに対する抗体と結合す
ることにより確立される。標準的な複合体形成量は種々の方法により定量するこ
とができるが、光計測による手段が好ましい。被検者において発現したISMO
の量、制御及び疾患、生検組織からのサンプルが標準値と比較される。標準値と
被検者値との間の偏差が疾患を診断するためのパラメータを確立する。
A variety of protocols are known in the art, including ELISA, RIA and FACS for measuring ISMO, and provide methods for diagnosing altered or abnormal levels of ISMO expression. A normal or standard value for ISMO expression is to bind a body fluid or cell extract from a normal mammalian subject, preferably a human, to an antibody against ISMO under conditions suitable for complex formation. Is established by The standard complex formation amount can be quantified by various methods, but a means by optical measurement is preferable. ISMO expressed in the subject
Quantities, controls and diseases, samples from biopsy tissue are compared to standard values. Deviation between standard and subject values establishes parameters for diagnosing disease.

【0157】 本発明の別の実施例では、ISMOをコードするポリヌクレオチドを診断のた
めに用いることができる。用いられるポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチド配
列、アンチセンスRNA及びDNA分子及びPNAを含む。ポリヌクレオチドを
用いて、ISMOの発現が疾患と相関をなす可能性がある生検組織の遺伝子発現
を検出かつ定量することができる。診断検定法を用いて、ISMOの存否及び過
剰発現を識別することができ、さらに治療処置中のISMOレベルの調節をモニ
タすることができる。
In another embodiment of the present invention, a polynucleotide encoding ISMO can be used for diagnosis. Polynucleotides used include oligonucleotide sequences, antisense RNA and DNA molecules and PNA. The polynucleotides can be used to detect and quantify gene expression in biopsy tissues where ISMO expression may correlate with disease. Diagnostic assays can be used to discriminate the presence and overexpression of ISMO and to monitor modulation of ISMO levels during therapeutic treatment.

【0158】 一態様では、ISMO或いは密接に関連する分子をコードするゲノム配列を含
むポリヌクレオチド配列を検出することができるPCRプローブを用いるハイブ
リダイゼーションにより、ISMOをコードする核酸配列を同定することができ
る。非常に特異な領域、例えば5´調節領域内の10個の特有のヌクレオチド、
或いは特異性の低い領域、例えば特に3´コード化領域の何れかからなるプロー
ブの特異性及びそのハイブリダイゼーション或いは増幅の厳密性(最大、高、中
間或いは低)が、そのプローブがISMOをコードする自然発生配列、アレル変
異配列のみを同定するか、或いは関連する配列を同定するかを確定するであろう
In one aspect, nucleic acid sequences encoding ISMO can be identified by hybridization using a PCR probe capable of detecting a polynucleotide sequence comprising a genomic sequence encoding ISMO or a closely related molecule. . A very specific region, for example 10 unique nucleotides in the 5 'regulatory region,
Alternatively, the specificity of a probe consisting of a region of low specificity, for example, particularly any of the 3 'coding regions, and the stringency of its hybridization or amplification (maximum, high, intermediate, or low) may indicate that the probe encodes ISMO It will be determined whether to identify only naturally occurring sequences, allelic variants, or related sequences.

【0159】 またプローブは関連する配列の検出に用いることもでき、ISMOをコードす
る配列の任意のものからのヌクレオチドの少なくとも50%を含むことが好まし
い。本発明のハイブリダイゼーションプローブはDNA或いはRNAであり、S
EQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或いはSE
Q ID NO:8の配列に、或いはプロモータ、エンハンサエレメント及び自然
発生ISMOのイントロンを含むゲノム配列に由来する。
Probes can also be used to detect related sequences, and preferably include at least 50% of the nucleotides from any of the sequences encoding ISMO. The hybridization probe of the present invention is DNA or RNA.
EQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 or SE
It is derived from the sequence of Q ID NO: 8 or from a genomic sequence containing promoters, enhancer elements and introns of naturally occurring ISMO.

【0160】 ISMOをコードするDNAのための特異なハイブリダイゼーションプローブ
を生成するための手段は、ISMO或いはISMO誘導体をコードする核酸配列
を、mRNAプローブの生成のためにベクタにクローニングする過程を含む。そ
のようなベクタは当分野では周知で、市販されており、適当なRNAポリメラー
ゼ及び適当な標識化ヌクレオチドを加えることによりin vitroでRNAプローブ
を合成するために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブは、種
々のリポータ群、例えば32P或いは35Sのような放射性核種、又はアビジン/ビ
オチン結合系等を介してプローブに結合されるアルカリ性フォスファターゼのよ
うな酵素標識により標識されることができる。
[0160] Means for generating a specific hybridization probe for DNA encoding ISMO involves cloning a nucleic acid sequence encoding ISMO or an ISMO derivative into a vector for the production of an mRNA probe. Such vectors are well known in the art and are commercially available, and can be used to synthesize RNA probes in vitro by adding an appropriate RNA polymerase and appropriate labeled nucleotides. Hybridization probes can be labeled with various reporters, for example, radionuclides such as 32 P or 35 S, or enzyme labels such as alkaline phosphatase, which are bound to the probe via an avidin / biotin binding system or the like. it can.

【0161】 ISMOをコードするポリヌクレオチド配列はISMOの発現に関連する障害
の診断のために用いることができる。そのような障害には、限定はしないが、ア
ジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧
血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状
腺炎、気管支炎、胆嚢炎、接触性皮膚炎、クローン病、アトピー性皮膚炎、皮膚
筋炎、糖尿病、肺気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャ
ー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候
群、紅班性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜の炎症、変形性
関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発筋炎、乾癬、ライター症候群、リウマチ性関節炎
、強皮症、シェーグレン症候群、全身性アナフィラキシ、全身性紅班性狼瘡、全
身性硬化症、潰瘍性大腸炎、ウェルナー症候群、及び癌、血液透析、体外循環の
合併症、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、寄生虫感染、原虫感染、及び蠕虫
感染;及び外傷のような自己免疫及び炎症性疾患と、ブルトン伴性無ガンマロブ
リン血症、後天性免疫グロブリン血症(CVI)、ディ‐ジョージ症候群(胸腺
形成不全)、胸腺異形成、Iga単独欠損症、重症複合免疫不全(SCID)、
血小板減少及び湿疹を伴う免疫不全(ウィスコット‐アルドリッチ症候群)、チ
ェディアック‐東症候群、慢性肉芽腫症、遺伝性血管神経性浮腫、クッシング病
関連免疫不全のような免疫欠損症と、日光性角化症、動脈硬化、アテローム性動
脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病(MCTD)、骨髄線維症、
発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺
癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副
腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝
臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精
巣、胸腺、子宮の癌を含む細胞増殖に関連する障害とがある。ISMOをコード
するポリヌクレオチド配列は、サザン分析或いはノーザン分析、ドットブロット
、又は他の膜系技術において、又はPCR技術において、又は変更されたISM
O発現を検出するために患者生検からの体液或いは組織を利用するディップステ
ィック、pin、ELISA検定法或いはマイクロアレイにおいて用いることが
できる。そのような定性的或いは定量的方法は当分野において周知である。
[0161] The polynucleotide sequence encoding ISMO can be used for diagnosis of a disorder associated with the expression of ISMO. Such disorders include, but are not limited to, Addison's disease, adult respiratory distress syndrome, allergy, ankylosing spondylitis, amyloidosis, anemia, asthma, atherosclerosis, autoimmune hemolytic anemia, autoimmunity Thyroiditis, bronchitis, cholecystitis, contact dermatitis, Crohn's disease, atopic dermatitis, dermatomyositis, diabetes, emphysema, erythema nodosum, atrophic gastritis, glomerulonephritis, Goodpasture's syndrome, gout, Graves' disease , Hashimoto thyroiditis, hypereosinophilia, irritable bowel syndrome, lupus erythematosus, multiple sclerosis, myasthenia gravis, myocardial or pericardial inflammation, osteoarthritis, osteoporosis, pancreatitis, polymyositis, Psoriasis, Reiter's syndrome, rheumatoid arthritis, scleroderma, Sjogren's syndrome, systemic anaphylaxis, systemic lupus erythematosus, systemic sclerosis, ulcerative colitis, Werner syndrome, and cancer, Fluid dialysis, complications of extracorporeal circulation, viral, bacterial, fungal, parasite, protozoan, and helminth infections; and autoimmune and inflammatory diseases such as trauma, and Breton-associated agammaglobulinemia Acquired immunoglobulinemia (CVI), Di-George syndrome (thymic dysplasia), thymic dysplasia, Iga alone deficiency, severe combined immunodeficiency (SCID),
Immunodeficiency such as immunodeficiency with thrombocytopenia and eczema (Wiscott-Aldrich syndrome), Chediak-Higashi syndrome, chronic granulomatosis, hereditary angioedema, Cushing's disease-related immunodeficiency, and solar horn Keratosis, arteriosclerosis, atherosclerosis, bursitis, cirrhosis, hepatitis, mixed connective tissue disease (MCTD), myelofibrosis,
Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, polycythemia vera, psoriasis, primary thrombocythemia, and adenocarcinoma and leukemia, lymphoma, melanoma, myeloma, sarcoma, and teratocarcinoma, specifically, adrenal gland, bladder, bone , Bone marrow, brain, breast, cervix, gallbladder, ganglion, digestive tract, heart, kidney, liver, lung, muscle, ovary, pancreas, parathyroid, penis, prostate, salivary gland, skin, spleen, testis, thymus, uterus There are disorders associated with cell proliferation, including cancer. A polynucleotide sequence encoding an ISMO may be used in Southern or Northern analysis, dot blot, or other membrane-based techniques, or in PCR techniques, or in a modified ISM.
It can be used in dipstick, pin, ELISA assays or microarrays utilizing body fluids or tissues from patient biopsies to detect O expression. Such qualitative or quantitative methods are well known in the art.

【0162】 特定の態様では、ISMOをコードするヌクレオチド配列は、種々の癌、特に
上記したような癌の活性化或いは誘発を検出する検定法において有用である。I
SMOをコードするヌクレオチド配列は標準的な方法において標識され、ハイブ
リダイゼーション複合体の形成に適した条件下で患者からの体液或いは組織サン
プルに加えられることができる。適当な時間インキュベートした後、サンプルは
洗浄され、そのシグナルが定量され、標準値と比較される。生検された或いは抽
出されたサンプルのシグナルの量が比較制御サンプルのシグナルの量から著しく
変更されている場合には、そのヌクレオチド配列はサンプル内のヌクレオチド配
列とハイブリダイズされており、サンプル内のISMOをコードするヌクレオチ
ド配列の変更レベルの存在が関連する疾患の存在を示す。またそのような検定法
を用いて、動物実験、臨床試験或いは個々の患者の治療をモニタする際に特定の
治療措置の有効度を評価することができる。
In certain embodiments, nucleotide sequences encoding ISMO are useful in assays to detect activation or induction of various cancers, particularly those cancers as described above. I
The nucleotide sequence encoding the SMO can be labeled in a standard manner and added to a body fluid or tissue sample from the patient under conditions suitable for forming a hybridization complex. After incubation for an appropriate time, the sample is washed, its signal is quantified and compared to a standard value. If the amount of signal in the biopsied or extracted sample is significantly altered from the amount of signal in the comparative control sample, then the nucleotide sequence has been hybridized to the nucleotide sequence in the sample and The presence of altered levels of the nucleotide sequence encoding ISMO indicates the presence of the associated disease. Such assays can also be used to evaluate the effectiveness of a particular treatment regimen in monitoring animal studies, clinical trials, or treatment of an individual patient.

【0163】 ISMOの発現に関連する疾患を診断する基準を与えるために、発現に対する
正常或いは標準値が確立される。これは、動物或いはヒトいずれかの正常な被検
者から取り出された体液或いは細胞抽出物を、当分野で周知の複合体形成に適し
た条件下でISMOをコードする配列或いはそのフラグメントと結合することに
より与えられる。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被検者から得られ
た値を、既知の量の実質的に精製されたポリヌクレオチドが用いられる実験から
得られた値と比較することにより定量することができる。正常サンプルから得ら
れた標準値が、疾患の症状がある被検者のサンプルから得られた値と比較される
。標準値と被検者値との間の偏差を用いて、疾患状態の存在を立証する。
Normal or standard values for expression are established to provide a basis for diagnosing a disease associated with ISMO expression. It binds a body fluid or cell extract taken from a normal subject, either an animal or a human, to a sequence encoding ISMO or a fragment thereof under conditions suitable for complex formation, well known in the art. Given by Standard hybridization can be quantified by comparing the value obtained from a normal subject to a value obtained from an experiment in which a known amount of a substantially purified polynucleotide is used. . Standard values obtained from normal samples are compared to values obtained from samples of subjects with symptoms of the disease. Deviation between standard and subject values is used to establish the presence of a disease state.

【0164】 一度疾患が確定され、治療プロトコルが開始されれば、その患者の発現のレベ
ルが正常な患者において観測されるレベルに接近し始めるか否かを評価するため
に、ハイブリダイゼーション検定法が規則的に繰り返される。継続的な検定法か
ら得られる結果を用いて、数日から数ヶ月の期間に渡る治療の有効度を示すこと
ができる。
[0164] Once the disease is confirmed and the treatment protocol is initiated, hybridization assays are performed to assess whether the patient's expression levels begin to approach those observed in normal patients. It is repeated regularly. Results from continuous assays can be used to indicate the efficacy of treatment over a period of days to months.

【0165】 癌の場合、個々の患者からの生検組織内の異常な量の転写物の存在が、疾患の
発生に対する素因を示すか、或いは実際の臨床的な症状が発生する前に疾患を検
出するための手段を提供する。この種のより決定的な診断により、専門医は、予
防措置或いは初期段階での積極的な治療を行うことができ、それにより癌の発生
を予防したり、或いは進行するのを防ぐこともできる。
In the case of cancer, the presence of abnormal amounts of transcripts in biopsy tissue from individual patients may be indicative of a predisposition to the development of the disease, or the disease may be detected before actual clinical symptoms occur. A means for detecting is provided. This more definitive diagnosis allows the physician to take precautionary measures or aggressive treatment in the early stages, thereby preventing or preventing the development of cancer.

【0166】 ISMOをコードする配列から設計されるオリゴヌクレオチドに対するさらな
る診断上の使用は、PCRの使用を含む場合がある。そのようなオリゴマは化学
的に合成されるか、酵素的に生成されるか、或いはin vitroで生成されてもよい
。オリゴマは、ISMOをコードするポリヌクレオチドのフラグメント、或いは
ISMOをコードするポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドのフラグメ
ントを含み、特異な遺伝子或いは条件の同定のために最適化された条件下で用い
られることが好ましい。同一の2つのオリゴマ、入れ子状の組のオリゴマ、或い
はオリゴマの縮重プールであっても、密接に関連するDNA或いはRNA配列を
検出並びにまた定量するために低い厳密な条件下で用いることができる。
Further diagnostic uses for oligonucleotides designed from sequences encoding ISMO may include the use of PCR. Such oligomers may be chemically synthesized, produced enzymatically, or produced in vitro . Oligomers, including fragments of a polynucleotide encoding ISMO or polynucleotides complementary to a polynucleotide encoding ISMO, may be used under conditions optimized for the identification of specific genes or conditions. Is preferred. Two identical oligomers, nested sets of oligomers, or degenerate pools of oligomers can be used under low stringent conditions to detect and / or quantify closely related DNA or RNA sequences. .

【0167】 またISMOの発現を定量するために用いることができる方法は、ヌクレオチ
ドの放射標識或いはビオチン標識、或いは制御核酸の相互増幅並びに実験結果が
書き込まれる標準曲線を含む(Melby, P.C. 等 (1993) J. Immunol. Methods, 1
59:235-244; Duplaa, C. 等 (1993) Anal. Blochem. 229-236)。多数サンプル
を定量する速度は、ELISAフォーマットの検定法を実行することにより加速
することができ、その際対象のオリゴマは種々の希釈法において表され、スペク
トル光計測反応或いは色計測反応が迅速な定量化がもたらされる。
Methods that can be used to quantify ISMO expression also include radiolabeled or biotinylated nucleotides, or cross-amplification of control nucleic acids and standard curves on which experimental results are written (Melby, PC et al. (1993). ) J. Immunol. Methods, 1
59: 235-244; Duplaa, C. et al. (1993) Anal. Blochem. 229-236). The rate of quantification of large numbers of samples can be accelerated by performing an ELISA format assay, in which the oligomers of interest are expressed in various dilutions, and the spectral photometric or colorimetric reaction is rapidly quantified. Is brought about.

【0168】 さらに別の実施例では、ここで記載されたポリヌクレオチド配列の任意のもの
に由来するオリゴヌクレオチド或いはその長寸のフラグメントをマイクロアレイ
の標的として用いることもできる。マイクロアレイを用いて、多数の遺伝子の発
現レベルを同時にモニタし(転写画像を生成するために)、遺伝子変異配列、突
然変異及び多形性を同定することができる。この情報は、遺伝子機能を確定し、
疾患の遺伝的基礎を理解し、かつ疾患を診断し、また治療薬剤の活性を発生及び
モニタするために用いることができる。
In yet another embodiment, oligonucleotides or long fragments thereof from any of the polynucleotide sequences described herein can be used as targets in a microarray. Microarrays can be used to simultaneously monitor the expression levels of a large number of genes (to generate a transcript image) and identify gene mutation sequences, mutations and polymorphisms. This information determines gene function,
It can be used to understand the genetic basis of the disease, to diagnose the disease, and to generate and monitor the activity of therapeutic agents.

【0169】 当分野で周知の方法を用いてマイクロアレイが準備、使用及び解析される(例
えばBrennan, T.M. et al. (1995) U.S. Patent NO. 5,474,796; Schena, M. et
al. (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. 93:10614-10619; Baldeschweiler et al.
(1995) PCT applicationWO95/251116; Shalon, D. et al. (1995) PCT applicat
ion WO95/35505; Heller, R.A. et al.(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150
-2155; and Heller, M.J. et al. (1997) U.S. Patent No.5,605,662を参照され
たい)。
Microarrays are prepared, used, and analyzed using methods well known in the art (eg, Brennan, TM et al. (1995) US Patent No. 5,474,796; Schena, M. et.
al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619; Baldeschweiler et al.
(1995) PCT application WO95 / 251116; Shalon, D. et al. (1995) PCT applicat
ion WO95 / 35505; Heller, RA et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 2150
-2155; and Heller, MJ et al. (1997) US Patent No. 5,605,662).

【0170】 本発明の別の実施例では、ISMOをコードする核酸配列を用いて、自然発生
ゲノム配列をマッピングするために有用なハイブリダイゼーションプローブを生
成することもできる。その配列は特定の染色体に或いは染色体の特異領域に、又
は例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母菌人工染色体(YAC)、細菌性人工
染色体(BAC)、細菌性P1構造体或いは単一染色体cDNAライブラリのよ
うな人工染色体構造にマッピンクされてもよい(例えばPrice, C.M. (1993) Blo
od Rev. 7:127-134; and Trask, B.J. (1991) Trends Genet.7:149-154を参照さ
れたい)。
In another embodiment of the invention, nucleic acid sequences encoding ISMO can be used to generate hybridization probes useful for mapping naturally occurring genomic sequences. The sequence can be on a specific chromosome or on a specific region of the chromosome, or for example, a human artificial chromosome (HAC), a yeast artificial chromosome (YAC), a bacterial artificial chromosome (BAC), a bacterial P1 construct, or a single chromosomal cDNA library. May be mapped to an artificial chromosome structure such as, for example, Price, CM (1993) Blo
od Rev. 7: 127-134; and Trask, BJ (1991) Trends Genet. 7: 149-154).

【0171】 蛍光in situハイブリダイゼーションは、他の物理的な染色体マッピング技術
及び遺伝マップデータと相関をなす(例えばHeinz-Ulrich, et al.(1995) in Me
yers, R.A. (ed.) Molecular.Biology and Biotechnology, VCH Publishers New
York, NY, pp. 965-968を参照されたい)。遺伝子マップデータの例は種々の科
学雑誌或いはOnline Mendelian Inheritance in Man(OMIM)に見出すこと
ができる。物理的染色体マップ上のISMOをコードする遺伝子の位置と特定の
疾患或いは特定の疾患に対する素因との間の相関は、その遺伝的疾患に関連する
DNAの領域の境界を定めることを可能にする。本発明のヌクレオチド配列を用
いて、正常者と保菌者、すなわち感染した個体との間の遺伝子配列の差を検出す
ることができる。
Fluorescence in situ hybridization correlates with other physical chromosome mapping techniques and genetic map data (eg, Heinz-Ulrich, et al. (1995) in Me
yers, RA (ed.) Molecular.Biology and Biotechnology, VCH Publishers New
York, NY, pp. 965-968). Examples of genetic map data can be found in various scientific journals or in Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Correlation between the location of the gene encoding ISMO on the physical chromosome map and a particular disease or predisposition to a particular disease makes it possible to demarcate the region of DNA associated with that genetic disease. The nucleotide sequences of the present invention can be used to detect differences in gene sequences between normal and carrier, ie, infected individuals.

【0172】 染色体標本のin situハイブリダイゼーション及び確立された染色体マーカを
用いる連鎖分析のような物理的マッピング技術が、遺伝子マップを拡張するため
に用いることができる。マウスのような別の哺乳動物種の染色体上の遺伝子の配
置が、特定のヒト染色体の数或いは腕が未知であっても、関連するマーカを明ら
かにできる場合もある。新規の配列は、物理的なマッピングにより染色体腕或い
はその一部に割り当てることができる。これは、位置クローニング或いは他の遺
伝子発見技術を用いる疾患遺伝子を検索する研究者に貴重な情報を与える。一度
疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えばATから11q22−23まで
への遺伝子連鎖により自然のまま局在されていれば、その領域に対する任意の配
列マッピングが、さらなる研究のための関連或いは調節遺伝子を表すことができ
る(例えばGatti等(1998) Nature 336:577-580を参照されたい)。また本発明のヌ
クレオチド配列を用いて、正常個体と保菌者、すなわち感染個体との間における
転座、逆位等により染色体位置内の差を検出することができる。
[0172] Physical mapping techniques, such as in situ hybridization of chromosomal preparations and linkage analysis using established chromosomal markers, can be used to extend the genetic map. In some cases, the arrangement of genes on the chromosome of another mammalian species, such as the mouse, may reveal relevant markers even if the number or arm of a particular human chromosome is unknown. New sequences can be assigned to chromosome arms or parts thereof by physical mapping. This provides valuable information to researchers searching for disease genes using positional cloning or other gene discovery techniques. Once the disease or syndrome is naturally located by genetic linkage from a particular genomic region, for example, from AT to 11q22-23, any sequence mapping to that region may be relevant or regulated for further study. Genes can be represented (see, for example, Gatti et al. (1998) Nature 336: 577-580). Using the nucleotide sequence of the present invention, differences in chromosomal positions can be detected by translocation, inversion, and the like between normal individuals and carriers, that is, infected individuals.

【0173】 本発明の別の実施例では、ISMO、その触媒作用或いは免疫原性フラグメン
ト又はオリゴペプチドを用いて、種々の薬物スクリーニング技術の任意のものに
おいて化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。そのようなスク
リーニングにおいて用いられるフラグメントは溶液中に遊離するか、固形支持体
に付着するか、細胞表面上に支持されるか、或いは細胞内に配置されてもよい。
ISMOと被試験因子との間に形成される結合複合体が測定される場合もある。
In another embodiment of the invention, a library of compounds can be screened in any of a variety of drug screening techniques using ISMO, its catalytic or immunogenic fragments or oligopeptides. The fragments used in such a screen may be free in solution, attached to a solid support, supported on a cell surface, or located intracellularly.
In some cases, the binding complex formed between the ISMO and the agent under test is measured.

【0174】 薬物スクリーニングに用いる場合がある別の技術は、対象のタンパク質への適
当な結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングを実現する(例
えばGeysen, 等(1984) PCT application WO84/03564を参照されたい)。この方
法では、ISMOに適用されるような、多数の異なる小さな検査化合物がプラス
チックピン或いはある他の表面のような固体支持体上で合成される。検査化合物
はISMO或いはそのフラグメントと反応し、洗浄される。その後結合されたI
SMOが当分野で周知の方法により検出される。また精製されたISMOは、上
記の薬物スクリーニング技術において用いるためのプレート上に直接コーティン
グされることもできる。別法では、非中和性抗体を用いて、ペプチドを捕捉し、
それを固体支持体上に固定化することもできる。
Another technique that may be used for drug screening provides for high-throughput screening of compounds with appropriate binding affinity for the protein of interest (see, eg, Geysen, et al. (1984) PCT application WO84 / 03564). I want to.) In this method, a number of different small test compounds, as applied to ISMO, are synthesized on a solid support such as a plastic pin or some other surface. The test compound reacts with the ISMO or a fragment thereof and is washed. I then combined
SMO is detected by methods well known in the art. The purified ISMO can also be coated directly on a plate for use in the drug screening techniques described above. Alternatively, the peptide is captured using a non-neutralizing antibody,
It can also be immobilized on a solid support.

【0175】 別の実施例では、ISMOを特異に結合することができる中和性抗体がISM
Oを結合するための検査化合物と競合する、競合薬物スクリーニングアッセイを
使用する。このようにして、抗体を用いて、ISMOと1つ或いはそれ以上の抗
原決定基を共有するあらゆるペプチドの存在を検出することができる。
In another example, a neutralizing antibody capable of specifically binding ISMO is an ISM
A competitive drug screening assay is used that competes with the test compound for binding O. In this way, antibodies can be used to detect the presence of any peptide that shares one or more antigenic determinants with ISMO.

【0176】 さらに別の実施例では、その新規の技術が、限定はしないがトリプレット遺伝
子コード及び特異な塩基対相互作用のような特性を含む現在知られているヌクレ
オチド配列の特性に依存する場合には、ISMOをコードするヌクレオチド配列
を、将来開発されるあらゆる分子生物学技術において用いることができる。
In yet another embodiment, where the novel technology relies on properties of currently known nucleotide sequences, including but not limited to triplet genetic code and properties such as specific base pairing interactions. Can use the nucleotide sequence encoding ISMO in any molecular biology technology that will be developed in the future.

【0177】 以下に実施例は、単に本発明を例示するものであって、本発明を限定するもの
ではない。
The following examples are merely illustrative of the present invention and do not limit the present invention.

【0178】[0178]

【実施例】【Example】

1 cDNAライブラリの作製 THYRTUT03ライブラリは、甲状腺切除中の17歳白人女性から除去さ
れた良性甲状腺腫瘍組織から単離されたRNAを用いて構築された。病理学的に
は、限局性の塊を形成する被包性小胞状腺腫を示した。
1 Preparation of cDNA Library The THYRTUT03 library was constructed using RNA isolated from benign thyroid tumor tissue removed from a 17-year-old white female undergoing thyroidectomy. Pathologically, it showed encapsulated follicular adenoma forming a localized mass.

【0179】 BRSTTUT13ライブラリは、乳房復興術とともに片側性拡大単純乳房切
除中の46歳白人女性の右胸から除去された乳癌組織から単離されたRNAを用
いて構築された。病理学的には、アポクリンの特徴を有し、50%以上の管内成
分を有する管型の浸潤グレード3腺癌を示した。患者の病歴には乳癌があった。
The BRSTTTUT13 library was constructed using RNA isolated from breast cancer tissue removed from the right breast of a 46-year-old Caucasian woman undergoing unilateral magnified mastectomy with mastectomy. Pathologically, it showed a tubular invasive grade 3 adenocarcinoma with the characteristics of apocrine and more than 50% of the intraluminal components. The patient's medical history was breast cancer.

【0180】 THYMFET02ライブラリは、妊娠17週で無脳症のため死亡した白人女
児から除去された胸腺組織から単離されたRNAを用いて構築された。
The THYMFET02 library was constructed using RNA isolated from thymus tissue removed from a white girl who died of encephalopathy at 17 weeks gestation.

【0181】 OVERTUT07ライブラリは、両側性卵管卵巣摘出、所属リンパ節切除、
腹膜組織の破壊、膀胱瘤修復、皮膚修復中の58歳白人女性から除去された右卵
巣腫瘍組織から単離されたRNAを用いて構築された。左骨盤側壁は、微視的に
見て転移性の腺癌の病巣を示した。患者の病歴には、高脂血症、血栓性静脈炎、
子宮頚内原位置で腺癌があった。家族の病歴には、脳血管障害、乳癌、高脂血症
、動脈硬化症冠動脈疾患及び心不全があった。
The OVERTUT07 library contains bilateral salpingo-oophorectomy, regional lymphadenectomy,
Constructed using RNA isolated from right ovarian tumor tissue removed from a 58-year-old white woman undergoing peritoneal tissue destruction, cystocele repair, and skin repair. The left pelvic sidewall showed microscopically a focus of metastatic adenocarcinoma. Patient history includes hyperlipidemia, thrombophlebitis,
There was adenocarcinoma in situ in the cervix. Family history included cerebrovascular disease, breast cancer, hyperlipidemia, atherosclerosis coronary artery disease and heart failure.

【0182】 THYRTUT03cDNAライブラリ構築の場合、冷凍組織をBrinkmann Ho
mogenizer Polytron-PT 3000(Brinkmann Instruments, INC., Westbury, NJ)
を用いて、グアニジウムイソチオシアネート溶液内でホモジナイズし溶解した。
この溶解産物をCsClクッション上で遠心分離し、RNAを単離した。そのR
NAを、フェノールで抽出し、酢酸ナトリウム及びエタノールで沈殿させた。B
RSTTUT13、THYMFET02及びOVERTUT07cDNAライブ
ラリ構築の場合、凍結組織をTrizol reagent (1gm組織/10mlTrizol、Life Techn
ologies)、フェノールの単形質性溶液及びグアニジウムイソチオシアネートの中
でホモジナイズし溶解した。氷上で短時間インキュベートした後、クロロフォル
ムが加えられ(1.5v/v)、この混合物を遠心分離して相を分離した。上澄
みの層が新しい管に除去され、イソプロパノールを加えてRNAを沈殿させた。
全てのRNA調整物をRNアーゼのない水に再懸濁し、DNアーゼ処理し、必要
に応じて酸性フェノールで再抽出し、酢酸ナトリウム及びエタノールを用いて沈
殿させた。
For the construction of the THYRTUT03 cDNA library, the frozen tissue was
mogenizer Polytron-PT 3000 (Brinkmann Instruments, INC., Westbury, NJ)
And homogenized and dissolved in a guanidium isothiocyanate solution.
The lysate was centrifuged on a CsCl cushion and RNA was isolated. That R
NA was extracted with phenol and precipitated with sodium acetate and ethanol. B
In the case of constructing the RSTTUT13, THYMFET02 and OVERTUT07 cDNA libraries, the frozen tissue was prepared using Trizol reagent (1 gm tissue / 10 ml Trizol, Life Techn.
), homogenized and dissolved in a phenol monoplasmic solution and guanidium isothiocyanate. After a brief incubation on ice, chloroform was added (1.5 v / v) and the mixture was centrifuged to separate the phases. The supernatant layer was removed to a new tube and isopropanol was added to precipitate the RNA.
All RNA preparations were resuspended in RNase-free water, DNase treated, re-extracted with acidic phenol if necessary, and precipitated using sodium acetate and ethanol.

【0183】 ポリ(A+)RNAはcDNA合成のために用いられ、SuperScriptTM plasmi
d system (Life Technologies, Inc.).の推奨プロトコルに従ってライブラリを
構築した。cDNAをSepharose CL4Bカラム(Cat. #275105, Pharmacia)上で
分画化し、400bpを越えるサイズのcDNAをplNCY (Incyte Pharmaceutic
als, Inc., Palo Alto, CA)にリゲートした。次いで、プラスミドplNCYをDH5αT M コンピテント細胞(Cat. #18258-012, Life Technologies, Inc.)に形質転換
した。
[0183] Poly (A +) RNA was used for cDNA synthesis, and SuperScript ™ plasmi
The library was constructed according to the recommended protocol of d system (Life Technologies, Inc.). The cDNA was fractionated on a Sepharose CL4B column (Cat. # 275105, Pharmacia), and the cDNA having a size of more than 400 bp was converted to plNCY (Incyte Pharmaceutic).
als, Inc., Palo Alto, CA). The plasmid plNCY was then transformed into DH5α T M competent cells (Cat. # 18258-012, Life Technologies, Inc.).

【0184】 2 cDNAクローンの単離 プラスミドDNAは細胞から放出され、REAL Prep 96 Plasmid Kit(Catalog
#26173,QIAGEN, Inc.)を用いて精製した。推奨プロトコルを用いたが、以下の
点を変更した。1)25mg/Lのカルベニシリン及び0.4%のグリセロールと共
に1mlの滅菌Terrific Broth(Catalog#22711, Life Technologies, Gaithersbu
rg, MD)において細菌を培養した。2)植菌の後、培地を19時間インキュベー
トし、インキュベーション終了時に、細胞を0.3mlの溶解バッファに溶解した
。3)イソプロパノール沈殿の後、プラスミドDNAペレットを0.1mlの蒸留
水に再懸濁した。サンプルを96穴ブロックに移し4℃で保管した。
2 Isolation of cDNA clones Plasmid DNA was released from the cells, and the REAL Prep 96 Plasmid Kit (Catalog
# 26173, QIAGEN, Inc.). The recommended protocol was used, with the following changes. 1) 1 ml of sterile Terrific Broth with 25 mg / L carbenicillin and 0.4% glycerol (Catalog # 22711, Life Technologies, Gaithersbu
rg, MD). 2) After inoculation, the medium was incubated for 19 hours, and at the end of the incubation, the cells were lysed in 0.3 ml of lysis buffer. 3) After isopropanol precipitation, the plasmid DNA pellet was resuspended in 0.1 ml of distilled water. The samples were transferred to a 96-well block and stored at 4 ° C.

【0185】 3 cDNAクローン及びそれらの類推されるタンパク質の相同性検索 ABI Catalyst 800()またはHamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, NV
)をPeltier Thermal Cyclers (MJ Research, Watertown, MA製のPTC200)と組
み合わせて用いて配列決定するためにcDNAを調製した。このcDNAの配列
決定は、標準的なABIプトロコル、塩基呼出し(base-calling)ソフトウェア及
びキットを用いて、Sanger及びA.R. Coulsonの方法(1975, J. Mol. Biol.94:44
1-448)によりABI 373または377 DNA Sequencing System(Perkin Elmer)にお
いて行った。或いは、Amersham Pharmacia Biotech製の溶液及び色素を用いてc
DNAを配列決定した。リーディングフレームは、標準的な方法(Ausubel. 前
出)を用いて決定した。cDNA配列のいくつかは、実施例5に開示される技術
を用いて伸長のために選択された。
3 Homology search for cDNA clones and their analogous proteins ABI Catalyst 800 () or Hamilton Micro Lab 2200 (Hamilton, Reno, NV
) Was used in combination with Peltier Thermal Cyclers (PTC200 from MJ Research, Watertown, Mass.) To prepare cDNA for sequencing. Sequencing of this cDNA was performed using the standard ABI protocol, base-calling software and kit, according to the method of Sanger and AR Coulson (1975, J. Mol. Biol. 94:44).
1-448) in an ABI 373 or 377 DNA Sequencing System (Perkin Elmer). Alternatively, using a solution and dye from Amersham Pharmacia Biotech,
The DNA was sequenced. Reading frames were determined using standard methods (Ausubel. Supra). Some of the cDNA sequences were selected for extension using the technique disclosed in Example 5.

【0186】 cDNA、伸長物及びショットガンに由来するポリヌクレオチド配列は、当業
者によく知られたアルゴリズムを用いるソフトウエアプログラムの組み合わせを
用いて構築され、解析された。表1は、用いられるソフトウエアプログラム、対
応するアルゴリズム、参考文献、利用可能な場合に用いられるカットオフパラメ
ータを示す。表1の第3欄に記載される参考文献は、ここで参照して本明細書の
一部としている。配列アライメントも、MACDNASIS PRO software (Hitachi Soft
ware Engineering Co., Ltd. San Bruno, CA)及び LASERGENE software (DNASTA
R bc, Madison WI)を用いて、解析かつ生成された。
The polynucleotide sequences from the cDNA, extension and shotgun were constructed and analyzed using a combination of software programs using algorithms well known to those skilled in the art. Table 1 shows the software programs used, the corresponding algorithms, references and cut-off parameters used where available. The references listed in the third column of Table 1 are hereby incorporated by reference. Sequence alignment is also performed using MACDNASIS PRO software (Hitachi Soft
ware Engineering Co., Ltd. San Bruno, CA) and LASERGENE software (DNASTA
R bc, Madison WI).

【0187】 ポリヌクレオチド配列は、ベクタ、リンカー及びポリA末端配列を除去するこ
とにより、かつBLASTに基づくアルゴリズム及びプログラム、動的なプログ
ラミング、及びジヌクレオチド最近接解析(dinucleotide nearest neighbor an
alysis)を用いて、不明瞭な塩基をマスクすることにより有効にされた。その配
列は、BLAST、FASTA及びBLIMPSに基づくプログラムを用いて、
注釈を取得するために、GenBank霊長類、齧歯類、哺乳類、脊椎動物及び
真核生物データベース、並びにBLOCKSのような公的なデータベースの選択
に対して問い合わせられた。その配列は、Phred、Phrap及びCons
edに基づくプログラムを用いて完全長のポリヌクレオチド配列に構築され、G
enBank、BLAST及びFASTAに基づくプログラムを用いて、オープ
ンリーディングフレームのためのスクリーニングされた。この後、完全長ポリヌ
クレオチド配列を翻訳し、対応する完全長アミノ酸配列を導出した、その後、こ
れらの完全長ポリヌクレオチド配列及びアミノ酸配列は、上記のGenBank
及びSwissProt、BLOCKS、PRINTS、FRAM及びPros
iteのようなデータベースに対して問い合わせを行うことにより再解析された
[0187] Polynucleotide sequences can be obtained by removing vectors, linkers and poly A-terminal sequences, and by using BLAST-based algorithms and programs, dynamic programming, and dinucleotide nearest neighbor analysis.
alysis) and was enabled by masking out ambiguous bases. Using BLAST, FASTA and BLIMPS-based programs,
To obtain annotations, we were queried against a selection of public databases such as GenBank primates, rodents, mammals, vertebrates and eukaryotes, and BLOCKS. The sequences are Phred, Prap and Cons
constructed into a full-length polynucleotide sequence using a program based on ed
Screened for open reading frames using programs based on enBank, BLAST and FASTA. This was followed by translating the full-length polynucleotide sequence and deriving the corresponding full-length amino acid sequence, after which these full-length polynucleotide and amino acid sequences were obtained using the GenBank described above.
And SwissProt, BLOCKS, PRINTS, FRAM and Pros
It was re-analyzed by querying a database like item.

【0188】 4 ノーザン分析 ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技術
であり、標識されたヌクレオチド配列と特定の細胞タイプまたは組織に由来する
RNAが結合した膜とのハイブリダイゼーションを行う(例えば、Sambrook, 前
掲, ch. 7及びAusubel, F.M.等 前掲, ch. 4 and 16を参照されたい)。
4 Northern Analysis Northern analysis is an experimental technique used to detect the presence of gene transcripts, in which a labeled nucleotide sequence is bound to a membrane to which RNA from a particular cell type or tissue is bound. Hybridization is performed (see, eg, Sambrook, supra, ch. 7 and Ausubel, FM, supra, ch. 4 and 16).

【0189】 BLAST(Altschul, S.F. 1993及び1990, 前出)を用いる類似のコンピュータ技
術を用いて、GenBank又はLIFESEQTMデータベース(Incyte Pharmaceuticals)の
ようなデータベースにおける同一或いは関連する分子を検索した。この分析は、
多くの膜系ハイブリダイゼーションと比較して非常に高速である。さらにコンピ
ュータ検索の感度を変更して、ある一致が正確な一致か、相同的であるかの分類
を決定することができる。
Similar computer techniques using BLAST (Altschul, SF 1993 and 1990, supra) were used to search for identical or related molecules in databases such as the GenBank or LIFESEQ database (Incyte Pharmaceuticals). This analysis
Very fast compared to many membrane-based hybridizations. In addition, the sensitivity of the computer search can be altered to determine whether a match is an exact match or homologous.

【0190】 検索の基準値は、積スコア(product score)であり、これは以下の式で定義
されるものである。 (配列の一致率(%)×最大BLASTスコア(%))/100 この積スコアは、2つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致の両方を
考慮している。例えば、積スコアが40の場合は、一致は誤差が1〜2%の範囲
で正確であり、スコアが70の場合は正確に一致している。相同な分子は、通常
積スコアとして15〜40を示すものを選択することにより同定されるが、スコ
アの低いものも関連する分子として同定することもできる。
The reference value of the search is a product score, which is defined by the following equation. (% Sequence identity x maximum BLAST score (%)) / 100 This product score takes into account both the degree of similarity between the two sequences and the length match of the sequences. For example, if the product score is 40, the match is accurate within an error of 1-2%, and if the score is 70, the match is exact. Homologous molecules are usually identified by selecting those that show a product score of 15-40, but those with low scores can also be identified as related molecules.

【0191】 ノーザン分析の結果は、ISMOをコードする転写物が発生するライブラリの
リストとして報告される。配列の存在量(abundance)及び存在率(percent abu
ndance)のリストも報告される。存在量は、特定の転写物の検出回数を直接反映
し、存在率は、存在量をcDNAライブラリ内で検出された配列の総数で割った
値である。
The results of the Northern analysis are reported as a list of libraries in which transcripts encoding ISMO are generated. Abundance and abundance of sequence (percent abu
ndance) list is also reported. Abundance directly reflects the number of detections of a particular transcript, and abundance is the abundance divided by the total number of sequences detected in the cDNA library.

【0192】 5 ISMOをコードする配列の延長 本発明において開示された構成成分フラグメントの伸長部によって、完全長核
酸配列が生成された。構成成分フラグメントの少なくとも1つから設計されたオ
リゴヌクレオチドプライマ対を用いて、センス及びアンチセンスポリヌクレオチ
ド鎖の伸長を開始した。プライマを用いて、対象の領域に対する新規で未知のヌ
クレオチド配列を含むアンプリコンを「外側に」発生させる既知の配列の伸長を
容易にした。初期プライマが、OLIGO 4.06 (National Biosciences)或いは他の
適当なプログラムを用いてcDNAから設計され、長さが約22〜30のヌクレ
オチドになり、50%以上のGC含有物を有し、約68〜72℃の温度で標的配
列にアニーリングするようにした。ヘアピン構造及びプライマ−プライマ2量体
化をもたらすことになるヌクレオチドの伸展は避けられた。
5 Extension of the Sequence Encoding the ISMO The full length nucleic acid sequence was generated by extension of the component fragments disclosed in the present invention. Extension of the sense and antisense polynucleotide chains was initiated using a pair of oligonucleotide primers designed from at least one of the component fragments. Primers were used to facilitate extension of a known sequence to generate an "outside" amplicon containing a new, unknown nucleotide sequence for the region of interest. Initial primers are designed from cDNA using OLIGO 4.06 (National Biosciences) or other suitable program, are approximately 22-30 nucleotides in length, have a GC content of 50% or more, and Anneal to the target sequence at a temperature of 72 ° C. Extension of nucleotides that would result in hairpin structure and primer-primer dimerization was avoided.

【0193】 選択されたヒトcDNAライブラリ(Gibco/BRL)を用いて配列を伸長した。
2つ以上の伸長が必要或いは望まれる場合には、既知領域をさらに伸長させるた
めに、追加のプライマの組が設計される。
The sequence was extended using a selected human cDNA library (Gibco / BRL).
If more than one extension is needed or desired, an additional set of primers is designed to further extend the known region.

【0194】 XL-PCR kit (Perkin Elmer)の取扱説明書に従って、酵素及び反応混合物を完
全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られた。各プライマを40pm
olかつキット全ての他の成分を推奨された濃度で開始する場合、PCRがPelt
ier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown MA)を用いて、 ステップ1 1分間94℃(初期変性) ステップ2 1分間65℃ ステップ3 6分間68℃ ステップ4 15秒間94℃ ステップ5 1分間65℃ ステップ6 7分間68℃ ステップ7 さらに15サイクル間ステップ4−6の繰返し ステップ8 15秒間94℃ ステップ9 1分間65℃ ステップ10 7分15秒間68℃ ステップ11 12サイクル間ステップ8−10の繰返し ステップ12 8分間72℃ ステップ13 4℃(保持) のパラメータで実行された。
High fidelity amplification was obtained by thoroughly mixing the enzyme and reaction mixture according to the instructions for the XL-PCR kit (Perkin Elmer). 40 pm for each primer
If all other components of the kit are started at the recommended concentrations, PCR
Step 1 1 minute 94 ° C (initial denaturation) Step 2 1 minute 65 ° C Step 3 6 minutes 68 ° C Step 4 15 seconds 94 ° C Step 5 1 minute 65 ° C using ier Thermal Cycler (PTC200; MJ Research, Watertown MA) Step 6 7 minutes 68 ° C Step 7 Repeat Steps 4-6 for another 15 cycles Step 8 15 seconds 94 ° C Step 9 1 minute 65 ° C Step 10 7 minutes 15 seconds 68 ° C Step 11 12 cycles repeat Step 8-10 Step The procedure was performed at a parameter of 72 ° C. for 128 minutes and a step of 134 ° C. (hold).

【0195】 反応混合物の5−10μl部分標本が低濃度(約0.6−0.8%)アガロー
スミニゲル上で電気泳動法により分析され、どの反応物が配列の伸長に成功した
かを判定した。最も大きな生成物を含むと考えられる帯がゲルから切除され、QI
A QuickTM (QIAGEN Inc.Chatsworth, CA)を用いて精製され、再結合及びクロー
ニングを容易にするためにクレノウ酵素を用いて、オーバーハングから切除され
た。
A 5-10 μl aliquot of the reaction mixture was analyzed by electrophoresis on a low concentration (approximately 0.6-0.8%) agarose minigel to determine which reaction was successful in extending the sequence. . The band believed to contain the largest product was excised from the gel and QI
Purified using A Quick (QIAGEN Inc. Chatsworth, CA) and excised from overhangs using Klenow enzyme to facilitate recombination and cloning.

【0196】 エタノール沈殿後、その生成物は13μlの連結緩衝液中に再溶解され、1μ
lT4−DNAリガーゼ(15ユニット)及び1μlT4ポリヌクレオチドキナ
ーゼが加えられ、その混合物は2〜3時間室温で、或いは16℃で一晩の間イン
キュベートされた。コンピテントcoli細胞(40μlの適当な媒質内に
ある)が3μlの連結混合物と形質転換され、80μlのSOC媒質内で培養さ
れた(例えばSambrook、前掲、付録A p.2を参照されたい)。37℃で1時間イ
ンキュベートした後、coli混合物が、2xCarbを含むLuria Bertan
i (LB)-agar (Sambrook、前掲、付録A p.1を参照されたい)上に蒔かれた。翌日
、いくつかのコロニーが各プレートから無作為に選び取られ、適当な市販の滅菌
96穴微量定量プレートの個々のウエル内に置かれた150μlの液体LB/2
xCarb媒質内で培養された。その翌日、各5μlの一晩おいた培養株が有菌
の96穴プレートに移され、水で1:10に希釈された後、5μlの各サンプル
がPCRアレイに移された。
After ethanol precipitation, the product was redissolved in 13 μl ligation buffer and 1 μl
1T4-DNA ligase (15 units) and 1 μl T4 polynucleotide kinase were added and the mixture was incubated for 2-3 hours at room temperature or at 16 ° C. overnight. Competent E. E. coli cells (in 40 μl of the appropriate medium) were transformed with 3 μl of the ligation mixture and cultured in 80 μl of SOC medium (see, eg, Sambrook, supra, Appendix A, page 2). After incubation for 1 hour at 37 ° C., E. E. coli mixture contains 2xCarb Luria Bertan
i (LB) -agar (see Sambrook, supra, Appendix A, page 1). The next day, several colonies were picked at random from each plate and placed in individual wells of a suitable commercially available sterile 96-well microtiter plate with 150 μl of liquid LB / 2.
Cultured in xCarb medium. The following day, 5 μl each of the overnight cultures were transferred to a sterile 96-well plate, diluted 1:10 with water, and then 5 μl of each sample was transferred to a PCR array.

【0197】 PCR増幅の場合、4ユニットのrTthDNAポリメラーゼ、ベクタプライ
マ及び伸長反応のために用いられる1つ或いは両方の遺伝子特異的プライマを含
む18μlの濃縮PCR反応混合物(3.3x)が各ウエルに加えられた。増幅
は、 ステップ1 60秒間94℃ ステップ2 20秒間94℃ ステップ3 30秒間55℃ ステップ4 90秒間72℃ ステップ5 さらに29サイクルの間ステップ2−4の繰返し ステップ6 180秒間72℃ ステップ7 4℃(保持) の条件で実行された。
For PCR amplification, 18 μl of the enriched PCR reaction mixture (3.3 ×) containing 4 units of rTth DNA polymerase, the vector primer and one or both gene-specific primers used for the extension reaction were added to each well. Added. Amplification: Step 1 94 ° C for 60 seconds Step 2 94 ° C for 20 seconds Step 3 55 ° C for 30 seconds Step 4 72 ° C for 90 seconds Step 5 Repeat step 2-4 for an additional 29 cycles Step 6 72 ° C for 180 seconds Step 74 ° C (Retained).

【0198】 PCR反応物の部分標本が、分子重量マーカと共にアガロースゲル上で処理さ
れた。PCR生成物の大きさが、元の部分cDNAと比較され、適当なクローン
が選択され、プラスミドに結合され、そして配列決定された。
An aliquot of the PCR reaction was run on an agarose gel with molecular weight markers. The size of the PCR product was compared to the original partial cDNA, the appropriate clone was selected, ligated into a plasmid and sequenced.

【0199】 同様にして、SEQ ID NO:5〜SEQ ID NO:8のヌクレオチド配
列を用いて、上記手順、5´伸長用に設計されたオリゴヌクレオチド及び適当な
ゲノムライブラリを用いて5´調節配列を得る。
Similarly, using the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8, the above procedure, using oligonucleotides designed for 5 ′ extension and 5 ′ regulatory sequences using appropriate genomic libraries Get.

【0200】 6 個々のハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 SEQ ID NO:5〜SEQ ID NO:8に基づくハイブリダイゼーショ
ンプローブを用いて、cDNA、mRNA並びにゲノムDNAをスクリーニング
する。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載される
が、より大きなcDNAフラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いる。オリゴ
ヌクレオチドをOLIGO 4.06(National Bioscience)のような最新のソフトウェ
アを用いてデザインし、50pmolの各オリゴマと、250μCiの[γ‐32
P]アデノシン三リン酸(Amersham)及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPon
t NEN、Boston MA)とを組み合わせて用いることにより標識する。標識されたオ
リゴヌクレオチドを、Sephadex G-25超精細樹脂カラム(Pharmacia & Upjohn)
を用いて精製する。毎分107カウントの標識されたプローブを含むアリコット
を、エンドヌクレアーゼ(AseI,Bgl II,EcoRI,Pst I,Xba1或いはPvuII;DuP
ont NEN, Boston, MA)の1つを用いて切断したヒトゲノムDNAの典型的な膜
系ハイブリダイゼーション分析において用いる。
6 Labeling and Use of Individual Hybridization Probes cDNA, mRNA and genomic DNA are screened using hybridization probes based on SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8. Although specifically described for labeling oligonucleotides of about 20 base pairs, the same procedure is used for larger cDNA fragments. Oligonucleotides were designed using state-of-the-art software such as OLIGO 4.06 (National Bioscience), and 50 pmol of each oligomer and 250 μCi of [γ- 32
P] adenosine triphosphate (Amersham) and T4 polynucleotide kinase (DuPon
tNEN, Boston MA). The labeled oligonucleotide is transferred to a Sephadex G-25 ultra-fine resin column (Pharmacia & Upjohn)
Purify using An aliquot containing probes labeled per minute 10 7 counts endonuclease (AseI, Bgl II, EcoRI, Pst I, Xba1 or PvuII; DuP
ont NEN, Boston, Mass.) in a typical membrane-based hybridization analysis of human genomic DNA cleaved with one.

【0201】 各消化物からのDNAを、0.7%アガロースゲル上で分画して、ナイロン膜
(Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH)に転写する。ハイブリダイ
ゼーションは40℃で16時間行われる。非特異的シグナルを取り除くため、ブ
ロットを、0.1xクエン酸ナトリウム食塩水及び0.5%ドデシル硫酸ナトリ
ウムまでの徐々に厳密性が増す条件で順次室温にて洗浄する。XOMAT ARTMフィル
ム(Kodak, Rochester, NY)を、Phosphoimager cassette(Molecular Dynamics
, Sunnyvale, CA)においてブロットに数時間露光した後、ハイブリダイゼーシ
ョンパターンを視覚的に比較する。
[0201] DNA from each digest is fractionated on a 0.7% agarose gel and transferred to a nylon membrane (Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH). Hybridization is performed at 40 ° C. for 16 hours. To remove non-specific signals, blots are washed sequentially at room temperature under increasingly stringent conditions up to 0.1x sodium citrate and 0.5% sodium dodecyl sulfate. XOMAT AR TM film (Kodak, Rochester, NY) is transferred to a Phosphoimager cassette (Molecular Dynamics
Hybridization patterns are visually compared after exposure to the blots for several hours in Sunnyvale, CA).

【0202】 7 マイクロアレイ 化学的な結合手順及びインクジェット装置を用いて、基質の表面上にアレイエ
レメントを合成することができる(例えば前掲のBaldeschweilerを参照されたい
)。ドット或いはスロットブロットに類似のアレイを用いてエレメントを配列し
、熱的、UV、機械的或いは化学的結合手順、又は真空システムによりエレメン
トを基質表面に結合することもできる。典型的なアレイは手作業で、或いは利用
可能な方法及び機械を用いて作製し、任意の適当な数のエレメントを含むことが
できる。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイを洗浄してハイブリダイズ
していないプローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターン
を決定する。走査画像を調べて、マイクロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列
の相補性の程度及び相対的な量を求める。
7 Using microarray chemical coupling procedures and inkjet devices, array elements can be synthesized on the surface of a substrate (see, eg, Baldeschweiler, supra). Elements can be arranged using arrays similar to dot or slot blots, and the elements can be bound to the substrate surface by thermal, UV, mechanical or chemical bonding procedures, or vacuum systems. A typical array is made by hand or using available methods and machines, and may include any suitable number of elements. After hybridization, the microarray is washed to remove unhybridized probes and the level and pattern of fluorescence is determined using a scanner. The scanned images are examined to determine the degree of complementarity and the relative amount of each oligonucleotide sequence on the microarray.

【0203】 完全長cDNA或いは発現した配列タグ(Expressed Sequence Tag:EST)
はマイクロアレイのエレメントを含む。本発明のヌクレオチド配列の1つに対応
するか、或いは本発明に関連するcDNAライブラリから無作為に選択された完
全長cDNA或いはESTが、適当な基質、例えばスライドガラス上に配列され
る。cDNAは、例えばUV架橋結合を用いて、熱及び化学的に、それを乾燥す
ることによりスライドガラスに固定される(Schena, M. et al. (1995) Science
270:467-470, and Shalon, D. et al. (1996) Genome Res. 6:639-645を参照さ
れたい)。基質上のエレメントにハイブリダイズさせるために、蛍光プローブが
準備され、使用される。その基質が上記の手順により解析される。
[0203] Full-length cDNA or Expressed Sequence Tag (EST)
Contains the elements of the microarray. A full-length cDNA or EST corresponding to one of the nucleotide sequences of the present invention or randomly selected from a cDNA library related to the present invention is arranged on a suitable substrate, for example, a glass slide. The cDNA is immobilized on a glass slide by drying it thermally and chemically, for example using UV cross-linking (Schena, M. et al. (1995) Science).
270: 467-470, and Shalon, D. et al. (1996) Genome Res. 6: 639-645). A fluorescent probe is prepared and used to hybridize to an element on the substrate. The substrate is analyzed according to the procedure described above.

【0204】 8 相補的ポリヌクレオチド ISMOをコードする配列或いはその任意の一部に対して相補的な配列は、自
然発生のISMOの発現を低減又は阻害するために用られる。約15〜約30個
の塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について特に記載されるが、より小さ
な配列或いはより大きな配列フラグメントの場合でも概ね同じ方法を用いること
ができる。Oligo4.06ソフトウェア及びISMOのコーディング配列を用いて、
適切なオリゴヌクレオチドを設計することができる。転写を阻害するためには、
最も固有の5′配列から相補的なオリゴヌクレオチドをデザインし、これを用い
てプロモータがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するため
には、相補的なオリゴヌクレオチドをデザインして、リボソームがISMOをコ
ードする転写物に結合するのを防ぐ。
8 Complementary Polynucleotides Sequences encoding the ISMO, or sequences complementary to any portion thereof, are used to reduce or inhibit the expression of naturally occurring ISMO. Although the use of oligonucleotides containing about 15 to about 30 base pairs is specifically described, generally the same approach can be used for smaller sequences or larger sequence fragments. Using Oligo 4.06 software and the coding sequence of ISMO,
Appropriate oligonucleotides can be designed. To inhibit transcription,
A complementary oligonucleotide is designed from the most unique 5 'sequence and used to inhibit the promoter from binding to the coding sequence. To inhibit translation, a complementary oligonucleotide is designed to prevent the ribosome from binding to the transcript encoding ISMO.

【0205】 9 ISMOの発現 ISMOの発現及び精製は、細菌またはウイルスを基にした発現系を用いて行
うことができる。細菌でISMOが発現するために、抗生物質耐性及びcDNA
の転写レベルを高める誘導性のプロモーターを含む好適なベクターにcDNAを
サブクローニングする。このようなプロモーターには、lacオペレーター調節エ
レメントに関連するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及びtrp-la
c(tac)ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定されるものではな
い。組換えベクターを、BL21(DE3)などの好適な細菌宿主に形質転換する。抗生
物質耐性をもつ細菌が、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘
発されるとHLORを発現する。真核細胞でのISMOの発現は、昆虫細胞株ま
たは哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイスルスとして知られているAutographi
ca californica核多面性ウイルス(AcMNPV)を感染させて行う。バキュロウイルス
の非必須ポリヘドリン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う
細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、ISMOをコードするcDN
Aと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強いポリヘドリンプロモータによ
って高いレベルのcDNAの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多く
の場合はSpodoptera frugiperda (Sf9)昆虫細胞に感染に用いられるが、ヒト肝
細胞の感染にも用いられることもある。後者の感染の場合は、バキュロウイルス
の更なる遺伝的変更が必要になる。(例えば、Engelhard. E. K.他 (1994) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227; Sandig, V. 他 (1996) Hum. Gene Ther.
7:1937-1945.を参照)。
9 Expression of ISMO Expression and purification of ISMO can be performed using a bacterial or virus-based expression system. Due to the expression of ISMO in bacteria, antibiotic resistance and cDNA
The cDNA is subcloned into a suitable vector containing an inducible promoter to increase the transcription level of the cDNA. Such promoters include T5 or T7 bacteriophage promoters associated with the lac operator regulatory element and trp-la.
Includes, but is not limited to, the c (tac) hybrid promoter. The recombinant vector is transformed into a suitable bacterial host, such as BL21 (DE3). Bacteria with antibiotic resistance express HLOR when induced with isopropyl β-D thiogalactopyranoside (IPTG). Expression of ISMO in eukaryotic cells has been demonstrated in insect or mammalian cell lines by Autographi , commonly known as baculovirus.
Ca californica is carried out by infecting the nuclear pleiotropic virus (AcMNPV). The non-essential polyhedrin gene of the baculovirus is transformed into cDNA encoding ISMO by either homologous recombination or bacterial mediated gene transfer with transfer plasmid mediated.
Replace with A. The virus's infectivity is maintained and the strong polyhedrin promoter drives high levels of cDNA transcription. Recombinant baculovirus is often used to infect Spodoptera frugiperda (Sf9) insect cells, but may also be used to infect human hepatocytes. In the latter case, further genetic modification of the baculovirus is required. (For example, Engelhard.EK et al. (1994) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-3227; Sandig, V. et al. (1996) Hum. Gene Ther.
7: 1937-1945.).

【0206】 ほとんどの発現系では、ISMOが、例えばグルタチオンSトランスフェラー
ゼ(GST)、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識で合成された融合タ
ンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性
ベースの精製が素早く1回で行うことができる。Schistosoma japonicumからの
26キロダルトンの酵素であるGSTによって、タンパク質の活性及び抗原性を
維持した状態で固定されたグルタチオンで融合タンパク質の精製が可能となる。
(Pharmacia, Piscataway, N J)。精製の後、GST部分を特定の操作部位でHL
ORからタンパク分解的に切断できる。アミノ酸8個のペプチドであるFLAG
で、市販のモノクロナール及びポリクロナール抗FLAG抗体を用いた免疫親和性の
精製が可能となる。6個のヒスチジン残基が連続して伸展した6-Hisによって、
金属キレート樹脂(QIAGEN Inc, Chatsworth, CA)で精製が可能となる。タンパク
質の発現及び精製の方法は、Ausubel. F. M. 他による(1995年、及び定期的に補
足された) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New
York, NY, ch 10, 16)に記載されている。これらの方法で精製したISMOを
直接用いて以下のアッセイを行うことができる。
In most expression systems, the ISMO will be a fusion protein synthesized with, for example, glutathione S-transferase (GST), or a peptide epitope tag such as FLAG or 6-His, resulting in a set of unpurified cell lysates. Affinity-based purification of the recombinant fusion protein can be performed quickly and in one go. GST, a 26 kilodalton enzyme from Schistosoma japonicum, allows purification of the fusion protein with immobilized glutathione while maintaining protein activity and antigenicity.
(Pharmacia, Piscataway, NJ). After purification, the GST moiety was
It can be proteolytically cleaved from OR. FLAG, a peptide of 8 amino acids
Thus, immunoaffinity purification using commercially available monoclonal and polyclonal anti-FLAG antibodies becomes possible. By 6-His in which 6 histidine residues are continuously extended,
Purification is possible with metal chelating resins (QIAGEN Inc, Chatsworth, CA). Methods for protein expression and purification are described in Ausubel. FM et al. (1995, and periodically supplemented) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York).
York, NY, ch 10, 16). The following assays can be performed directly using ISMO purified by these methods.

【0207】 10 ISMOの活性の実証 ISMO活性は、血清から抗原を認識し、沈殿させる免疫グロブリンの活性に
よって例示される。定量的な沈殿反応は、この活性によって測定される(Golub.
E. S. etal. (1987) lmmunoloev: A Synthesis, Sinauer Associates. Sunderl
and, MA, pages 113-115)。ISMOは当分野において知られている方法を用い
て同位体的に標識される。標識された一定量のISMOに、種々の濃度の血清が
加えられる。ISMO抗原複合体は溶液から沈殿され、遠心分離によって回収さ
れる。沈殿可能なISMO抗原複合体の量が、沈殿において検出される放射性同
位元素の量に比例する。沈殿可能なISMO抗原複合体の量は、血清濃度に対し
てプロットされる。種々の血清濃度の場合に、特性沈殿曲線が得られ、その中で
は、沈殿可能なISMO抗原複合体の量は最初に血清濃度に比例して増加し、等
量点においてピーク値に達し、その後、血清濃度がさらに増加すると、それに比
例して減少する。従って、沈殿可能なISMO抗原複合体の量は、抗原の制限量
及び過剰量の両方への応答性によって特徴付けられるISMO活性の指標である
10 Demonstration of ISMO activity ISMO activity is exemplified by the activity of immunoglobulins that recognize and precipitate antigen from serum. Quantitative precipitation reactions are measured by this activity (Golub.
ES etal. (1987) lmmunoloev: A Synthesis, Sinauer Associates. Sunderl
and, MA, pages 113-115). ISMO is isotopically labeled using methods known in the art. Various concentrations of serum are added to a fixed amount of labeled ISMO. The ISMO antigen complex precipitates out of solution and is recovered by centrifugation. The amount of ISMO antigen complex that can be precipitated is proportional to the amount of radioisotope detected in the precipitate. The amount of ISMO antigen complex that can be precipitated is plotted against serum concentration. At different serum concentrations, a characteristic precipitation curve is obtained, in which the amount of the precipitable ISMO antigen complex initially increases in proportion to the serum concentration, reaches a peak value at the equivalence point, and thereafter As the serum concentration further increases, it decreases proportionally. Thus, the amount of ISMO antigen complex that can be precipitated is an indicator of ISMO activity that is characterized by responsiveness to both limiting and excess amounts of antigen.

【0208】 11 機能的アッセイ ISMOの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベル
でのISMOをコードする配列の発現によって評価する。cDNAを、cDNA
を高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブク
ローニングする。このようなベクターには、pCMV SPORTTM (Life Technologies.
Gaithersburg. MD)及びpCRTM 3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA)が含まれ、どち
らもサイトメガロウイルスプロモーターを含んでいる。5〜10μgの組換えベ
クターを、好ましくは内皮由来か造血由来のヒト細胞株にリポソーム製剤或いは
電気穿孔法によって一過性に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする
配列を含む1〜2μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発
現により、形質移入された細胞と形質移入されていない細胞とを区別できる。ま
た、標識タンパク質の発現によって、cDNAの組換えベクターからの発現を正
確に予想できる。このような標識タンパク質には、緑色蛍光タンパク質(GFP) (C
lontech, Palo Alto, CA)、及びCD64またはCD64-GFP融合タンパク質が含まれる
。レーザー光学に基づいた技術を利用した自動流動細胞計測法(FCM)を用いて、G
FPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、アポトーシスの状態
などの特性を評価する。また、FCMで、先行した或いは同時の細胞死の現象を
診断する蛍光分子の取り込みを検出して計量する。これらの現象には、プロピジ
ウムヨウ化物でのDNAの染色によって計測される核DNA内容物の変化と、ブ
ロモデオキシウリジンの取り込み量の低下によって計測されるDNA合成の下方
調節と、特異的な抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内のタン
パンク質の発現の変化と、蛍光複合アネキシンVタンパク質の細胞表面への結合
によって計測される原形質膜組成の変化とが含まれる。流動細胞計測法は、Orme
rod, M. G.による (1994) Flow Cytometry ( Oxford, New York, NY.)に記載さ
れている。
11 Functional Assays The function of ISMO is assessed by expression of sequences encoding ISMO at physiologically elevated levels in mammalian cell culture systems. cDNA is replaced with cDNA
Is subcloned into a mammalian expression vector containing a strong promoter that expresses high levels. Such vectors, pCMV SPORT TM (Life Technologies.
Gaithersburg. MD) and pCR 3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), both containing the cytomegalovirus promoter. 5-10 μg of the recombinant vector is preferably transiently transfected into human cell lines, preferably of endothelial or hematopoietic origin, by liposome preparation or electroporation. In addition, 1-2 μg of plasmid containing the sequence encoding the labeled protein is co-transfected. Expression of the labeled protein allows one to distinguish between transfected and non-transfected cells. Further, the expression of the cDNA from the recombinant vector can be accurately predicted by the expression of the labeled protein. Such labeled proteins include green fluorescent protein (GFP) (C
lontech, Palo Alto, CA), and CD64 or CD64-GFP fusion proteins. Using automatic flow cytometry (FCM), which uses laser optics-based technology,
Transfected cells expressing FP or CD64-GFP are identified and characterized such as apoptotic status. In addition, the FCM detects and measures the incorporation of a fluorescent molecule that diagnoses the phenomenon of preceding or simultaneous cell death. These phenomena include changes in nuclear DNA content as measured by staining DNA with propidium iodide, down-regulation of DNA synthesis as measured by reduced uptake of bromodeoxyuridine, and specific antibody and And changes in plasma membrane composition as measured by the binding of the fluorescent complex annexin V protein to the cell surface, as measured by the reactivity of E. coli. Flow Cell Counting Method
rod, MG (1994) Flow Cytometry (Oxford, New York, NY.).

【0209】 遺伝子発現におけるISMOの影響は、ISMOをコードする配列とCD64また
はCD64-GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価
することができる。CD64またはCD64-GFPは形質転換された細胞表面で発現し、ヒ
ト免疫グロブリンG(IgG)の保存された領域と結合する。形質転換された細胞と形
質転換されない細胞とは、ヒトIgGかCD64に対する抗体のどちらかで被覆された
磁気ビードを用いて分離することができる。(DYNAL. Lake Success. NYを参照)
。mRNAは、当分野で公知の方法で細胞から精製することができる。ISMO
及び目的の他の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン分析やマイクロ
アレイ技術で分析することができる。
The effect of ISMO on gene expression can be assessed using a highly purified cell population transfected with the sequence encoding ISMO and either CD64 or CD64-GFP. CD64 or CD64-GFP is expressed on the transformed cell surface and binds to a conserved region of human immunoglobulin G (IgG). Transformed and non-transformed cells can be separated using magnetic beads coated with either human IgG or an antibody against CD64. (See DYNAL. Lake Success. NY)
. mRNA can be purified from cells by methods known in the art. ISMO
The expression of mRNA encoding another gene of interest can be analyzed by Northern analysis or microarray technology.

【0210】 12 ISMO特異的抗体の産生 標準的なプロトコルを用いたウサギの免疫化及び抗体の産生には、PAGE電
気泳動法(例えばHarrington, M.G. (1990) Methods Enzymol. 182:488-495を参
照されたい)または他の精製技術を用いて実質的に精製されたISMOを用いる
12 Production of ISMO-Specific Antibodies For immunization of rabbits and production of antibodies using standard protocols, PAGE electrophoresis (see, eg, Harrington, MG (1990) Methods Enzymol. 182: 488-495). Or use an ISMO that is substantially purified using other purification techniques.

【0211】 別法では、ISMOアミノ酸配列をLASERGENETM software(DNASTAR社)を用
いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを当業者が
周知の手段により合成して、当業者に周知の方法で抗体を産生するために用いる
。C末端付近或いは隣接する親水性領域内のエピトープのような、適切なエピト
ープの選択方法は当分野において周知である(例えばAusubel等. 前掲, ch. 11
を参照されたい.)。
[0211] Alternatively, the ISMO amino acid sequence is analyzed using LASERGENETM software (DNASTAR) to determine a region with high immunogenicity, and the corresponding oligopeptide is synthesized by a person skilled in the art by well-known means. Used to raise antibodies by methods well known to those skilled in the art. Methods for selecting appropriate epitopes, such as those in the hydrophilic region near or adjacent to the C-terminus, are well known in the art (eg, Ausubel et al., Supra, ch. 11).
See.).

【0212】 典型的にはオリゴペプチドは長さ15残基で、fmoc(フルオレニルメトキ
シカルボニル)化学作用を用いるApplied Biosystems Peptide Synthesizer Mod
el 431Aを用いて合成され、M-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester(
MBS: Ausubel等、前掲)と反応することによりキーホールリンペットヘモシアニ
ン(KLH, Sigma, St.Louis, MO)に結合される。ウサギは、完全なフロイントアジ
ュバント内でオリゴペプチド−KLH複合体で免疫される。その結果生じる抗血
清は、例えば、プラスチックにペプチドを結合し、1%BSAで遮断し、ウサギ
抗血清と反応させ、洗浄し、さらに放射ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGと
反応させることにより、抗ペプチド活性に対して検査される。
Typically, oligopeptides are 15 residues in length, using Applied Biosystems Peptide Synthesizer Mod using fmoc (fluorenylmethoxycarbonyl) chemistry.
It is synthesized using el 431A, and M-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (
MBS: bound to keyhole limpet hemocyanin (KLH, Sigma, St. Louis, MO) by reacting with Ausubel et al., Supra. Rabbits are immunized with the oligopeptide-KLH complex in complete Freund's adjuvant. The resulting antiserum can be prepared, for example, by binding the peptide to plastic, blocking with 1% BSA, reacting with rabbit antiserum, washing, and reacting with radioiodine-labeled goat anti-rabbit IgG. Tested for peptide activity.

【0213】 13 特異的抗体を用いる自然発生ISMOの精製 自然発生或いは組換えISMOは、ISMOに対して特異な抗体を用いる免疫
親和性クロマトグラフィにより実質的に精製される。免疫親和性カラムが、IS
MO抗体を、CnBr-activated Sepharose (Pharmacia&Upjohn)のような活性化さ
れたクロマトグラフ樹脂に共有結合させることにより構成される。結合後、製造
者の取扱説明書に従って樹脂は遮断及び洗浄される。
13 Purification of naturally occurring ISMO using specific antibodies Naturally occurring or recombinant ISMO is substantially purified by immunoaffinity chromatography using antibodies specific for ISMO. If the immunoaffinity column is IS
MO antibodies are constructed by covalently linking them to an activated chromatographic resin such as CnBr-activated Sepharose (Pharmacia & Upjohn). After bonding, the resin is blocked and washed according to the manufacturer's instructions.

【0214】 ISMOを含む培地を免疫親和性カラム上を通過させ、カラムは、ISMOを
選択吸収させる条件下(例えば洗浄剤中に高イオン強度緩衝剤を入れたもの)で
洗浄される。カラムは、抗体/ISMO結合を分裂させる条件下(pH2〜3の
緩衝剤或いは尿素或いはチオシアネートイオンのような高濃度のカオトロープ)
で溶出され、ISMOが回収される。
The medium containing ISMO is passed over the immunoaffinity column, and the column is washed under conditions that allow selective absorption of ISMO (eg, high ionic strength buffer in detergent). The column is used under conditions that disrupt the antibody / ISMO binding (pH 2-3 buffer or high concentration of chaotrope such as urea or thiocyanate ions).
And the ISMO is recovered.

【0215】 14 ISMOと相互作用する分子の同定 ISMO或いはその生物学的活性フラグメントが、125I Bolton-Hunter試薬(B
olton AE 等(1973) Biochem J 133:529)を用いて標識される。多穴プレートのウ
エル内に以前に配列された候補分子が、標識されたISMOでインキュベートさ
れ、洗浄され、標識されたISMO複合体を有する任意のウエルが検定される。
種々のISMO濃度から得られたデータを用いて、数、親和性及びISMOと候
補分子との関係を示す値を計算する。
14 Identification of Molecules Interacting with ISMO The ISMO or a biologically active fragment thereof was prepared using 125 I Bolton-Hunter reagent (B
olton AE et al. (1973) Biochem J 133: 529). Candidate molecules previously sequenced in the wells of the multiwell plate are incubated with labeled ISMO, washed, and any wells with labeled ISMO complexes are assayed.
Using the data obtained from the various ISMO concentrations, values indicating the number, affinity and relationship between the ISMO and the candidate molecule are calculated.

【0216】 上記明細書中に記載された全ての特許出願及び特許は参照して本明細書の一部
としている。記載された本発明の方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は
、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明らかとなろう。本発
明は特定の好適な実施例に関連して記載されてきたが、請求される本発明はその
ような特定の実施例に不当に制限されるべきでないことを理解されたい。実際に
、本発明を実施するために記載された形態の種々の変更例は、分子生物学或いは
関連する分野の当業者には明らかであり、以下の請求の範囲内に入るものと考慮
されたい。
All patent applications and patents mentioned in the above specification are herein incorporated by reference. Various modifications and variations of the described method and system of the invention will be apparent to those skilled in the art without departing from the scope and spirit of the invention. Although the present invention has been described with reference to certain preferred embodiments, it should be understood that the invention as claimed should not be unduly limited to such specific embodiments. Indeed, various modifications of the described modes for carrying out the invention which are obvious to those skilled in molecular biology or related fields are intended to be considered within the scope of the following claims. .

【配列表】[Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図1】 ISMO−1(2192748、SEQ ID NO:1)とNGAL(GI
929657、SEQ ID NO:9)との間のアミノ酸配列アライメントを示
す。そのアライメントはLASERGENE software (DNASTAR Inc, Madison WI)のマル
チシーケンスアライメントプログラムを用いて作成された。
FIG. 1. ISMO-1 (2192748, SEQ ID NO: 1) and NGAL (GI
929657, SEQ ID NO: 9). The alignment was created using a multi-sequence alignment program from LASERGENE software (DNASTAR Inc, Madison WI).

【図2A】 ISMO−3(2937262、SEQ ID NO:3)、蚊La(GI 1
311676、SEQ ID NO:10)及びヒトLa(GI 178687、
SEQ ID NO:11)の間のアミノ酸配列アライメントを示す。
FIG. 2A: ISMO-3 (2937262, SEQ ID NO: 3), mosquito La (GI 1
311676, SEQ ID NO: 10) and human La (GI 178687,
The amino acid sequence alignment between SEQ ID NO: 11) is shown.

【図2B】 ISMO−3(2937262、SEQ ID NO:3)、蚊La(GI 1
311676、SEQ ID NO:10)及びヒトLa(GI 178687、
SEQ ID NO:11)の間のアミノ酸配列アライメントを示す。
FIG. 2B: ISMO-3 (2937262, SEQ ID NO: 3), mosquito La (GI 1
311676, SEQ ID NO: 10) and human La (GI 178687,
The amino acid sequence alignment between SEQ ID NO: 11) is shown.

【表1】 [Table 1]

【表2】 [Table 2]

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 43/00 111 C07K 16/18 C07K 14/47 C12N 1/15 16/18 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 C12Q 1/68 A 1/21 C12N 15/00 ZNAA 5/10 A61K 37/02 C12Q 1/68 C12N 5/00 A (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML, MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K E,LS,MW,SD,SL,SZ,UG,ZW),E A(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ,BA,BB ,BG,BR,BY,CA,CH,CN,CU,CZ, DE,DK,EE,ES,FI,GB,GD,GE,G H,GM,HR,HU,ID,IL,IS,JP,KE ,KG,KP,KR,KZ,LC,LK,LR,LS, LT,LU,LV,MD,MG,MK,MN,MW,M X,NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE ,SG,SI,SK,SL,TJ,TM,TR,TT, UA,UG,US,UZ,VN,YU,ZW (72)発明者 コーレイ、ニール・シー アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・ マウンテンビュー・#30・デールアベニュ ー 1240 (72)発明者 ゴルゴン、ジーナ・エイ アメリカ合衆国カリフォルニア州95006・ ボールダークリーク・パインクレストドラ イブ 1253 (72)発明者 ゲグラー、カール・ジェイ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・オークランドアベニュー 1048 (72)発明者 パターソン、チャンドラ アメリカ合衆国カリフォルニア州94025・ メンロパーク・#1・シャーウッドウェイ 490 (72)発明者 ボーグン、マライア・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94577・ サンレアンドロ・サンティアゴロード 14244──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 43/00 111 C07K 16/18 C07K 14/47 C12N 1/15 16/18 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 C12Q 1/68 A 1/21 C12N 15/00 ZNAA 5/10 A61K 37/02 C12Q 1/68 C12N 5/00 A (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, R , TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN , MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Korey, Neil Sea, USA 40940, Mountain View, CA # 30, Dale Avenue 1240 (72) Inventor Gorgon, Gina A, 95006, California, United States Ball Dark Creek Pine Crest Live 1253 (72) Inventor Gegler, Carl Jay, Menlo Park Oakland Ave, 94025, California, United States 1048 (72) Inventor Patterson, Chandra 94025, Menlo Park, California, United States 94025, Menlo Park # 1 Sherwood Way 490 (72) Inventor, Bogun , Mariah Earl, San Leandro Santiago Road, 94577, California, USA 14244

Claims (20)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】 SEQ ID NO:1〜SEQ ID NO:4からなるグル
ープから選択されたアミノ酸配列或いはそのフラグメントを含む実質的に精製さ
れたポリペプチド。
1. A substantially purified polypeptide comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4, or a fragment thereof.
【請求項2】 請求項1の配列に少なくとも90%アミノ酸配列同一性を有
する実質的に精製された変異体。
2. A substantially purified variant having at least 90% amino acid sequence identity to the sequence of claim 1.
【請求項3】 請求項1のポリペプチドをコードする単離され、精製された
ポリヌクレオチド。
3. An isolated and purified polynucleotide encoding the polypeptide of claim 1.
【請求項4】 請求項3のポリヌクレオチドに少なくとも70%ポリヌクレ
オチド配列同一性を有する単離され、精製されたポリヌクレオチド変異配列。
4. An isolated and purified polynucleotide variant having at least 70% polynucleotide sequence identity to the polynucleotide of claim 3.
【請求項5】 請求項3のポリヌクレオチドに厳密な条件でハイブリダイズ
する単離され、精製されたポリヌクレオチド。
5. An isolated and purified polynucleotide which hybridizes under stringent conditions to the polynucleotide of claim 3.
【請求項6】 請求項3のポリヌクレオチド配列に相補的な配列を有する単
離され、精製されたポリヌクレオチド。
6. An isolated and purified polynucleotide having a sequence complementary to the polynucleotide sequence of claim 3.
【請求項7】 SEQ ID NO:5〜SEQ ID NO:8からなるグル
ープから選択されたポリヌクレオチド配列或いはそのフラグメントを含む単離さ
れ、精製されたポリヌクレオチド。
7. An isolated and purified polynucleotide comprising a polynucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8 or a fragment thereof.
【請求項8】 請求項7のポリヌクレオチドに少なくとも70%ポリヌクレ
オチド配列同一性を有する単離され、精製されたポリヌクレオチド変異配列。
8. An isolated and purified polynucleotide variant having at least 70% polynucleotide sequence identity to the polynucleotide of claim 7.
【請求項9】 請求項7のポリヌクレオチドに相補的な配列を有する単離さ
れ、精製されたポリヌクレオチド。
9. An isolated and purified polynucleotide having a sequence complementary to the polynucleotide of claim 7.
【請求項10】 請求項3のポリヌクレオチドの少なくともフラグメントを
含む発現ベクタ。
10. An expression vector comprising at least a fragment of the polynucleotide of claim 3.
【請求項11】 請求項10の発現ベクタを含む宿主細胞。11. A host cell comprising the expression vector according to claim 10. 【請求項12】 ポリペプチドを生成するための方法であって、 (a)ポリペプチドの発現に適した条件下で請求項11の宿主細胞を培養する
過程と、 (b)前記宿主細胞培養株から前記ポリペプチドを回収する過程とを有するこ
とを特徴とする方法。
12. A method for producing a polypeptide, comprising: (a) culturing the host cell of claim 11 under conditions suitable for expression of the polypeptide; and (b) said host cell culture. Recovering said polypeptide from said polypeptide.
【請求項13】 適当な医薬品担体とともに請求項1のポリペプチドを含む
医薬品組成物。
13. A pharmaceutical composition comprising the polypeptide of claim 1 together with a suitable pharmaceutical carrier.
【請求項14】 請求項1のポリペプチドに特異に結合する精製された抗体
14. A purified antibody that specifically binds to the polypeptide of claim 1.
【請求項15】 請求項1のポリペプチドの精製されたアゴニスト。15. A purified agonist of the polypeptide of claim 1. 【請求項16】 請求項1のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。16. A purified antagonist of the polypeptide of claim 1. 【請求項17】 請求項16のアンタゴニストの有効量を治療を要する被検
者に投与する過程を含む、免疫系に関連する障害を治療或いは予防するための方
法。
17. A method for treating or preventing a disorder associated with the immune system, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the antagonist of claim 16.
【請求項18】 請求項16のアンタゴニストの有効量を治療を要する被検
者に投与する過程を含む、細胞増殖に関連する障害を治療或いは予防するための
方法。
18. A method for treating or preventing a disorder associated with cell proliferation, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of the antagonist of claim 16.
【請求項19】 生物学的サンプルにおいてポリヌクレオチドを検出するた
めの方法であって、 (a)前記生物学的サンプルの核酸の少なくとも1つに請求項6のポリヌクレ
オチドをハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と
、 (b)前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを有し、前記ハイ
ブリダイゼーション複合体の存在が前記生物学的サンプルにおけるポリヌクレオ
チドの存在と相関をなすことを特徴とする方法。
19. A method for detecting a polynucleotide in a biological sample, comprising: (a) hybridizing the polynucleotide of claim 6 to at least one of the nucleic acids of the biological sample; Forming a complex; and (b) detecting the hybridization complex, wherein the presence of the hybridization complex correlates with the presence of a polynucleotide in the biological sample. And how to.
【請求項20】 前記ハイブリダイゼーション過程の前に前記ポリヌクレオ
チドを増幅する過程をさらに含むことを特徴とする請求項19に記載の方法。
20. The method of claim 19, further comprising amplifying the polynucleotide before the hybridization.
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