JP2002514903A

JP2002514903A - Novel human chromosome 16 genes, compositions, and methods of making and using the same

Info

Publication number: JP2002514903A
Application number: JP50290498A
Authority: JP
Inventors: エム．ランデス，グレゴリー; シー．バーン，ティモシー; ディー．コナーズ，ティモシー; アール．ダクコウスキー，ウィリアム; ライ，テレンスジェイ．バン; ダブリュー．キリンジャー，キャサリン
Original assignee: ジンザイムコーポレイション
Priority date: 1996-06-17
Filing date: 1997-01-16
Publication date: 2002-05-21
Also published as: CA2256486A1; EP0914424A1; WO1997048797A1; AU1831497A

Abstract

(57)【要約】本発明によれば、ヒトネトリン、ヒトATP結合カセット輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、および肝臓再生のヒト増大剤をコードする単離された核酸、ならびにそれによりコードされる単離されたタンパク質生成物が提供される。本発明は、本発明の核酸ならびに第16染色体に位置する独特の遺伝子配列を含む単離された核酸にハイブリダイズする、核酸プローブを提供する。本発明の核酸を含むベクター、本発明のベクターで形質転換された宿主細胞、ならびに本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物がさらに提供される。本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、およびそれらを含む組成物を含む。さらに、本発明は、本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法を提供する。 According to the present invention, there is provided an isolated nucleic acid encoding human netrin, a human ATP binding cassette transporter, a human ribosomal L3 subtype, and a human enhancer of liver regeneration, and a single nucleic acid encoded thereby. An isolated protein product is provided. The present invention provides nucleic acid probes that hybridize to the nucleic acids of the invention as well as to isolated nucleic acids comprising a unique gene sequence located on chromosome 16. Also provided are vectors containing the nucleic acids of the invention, host cells transformed with the vectors of the invention, and transgenic non-human mammals expressing the polypeptides of the invention. The present invention includes antisense oligonucleotides, antibodies, and compositions containing them. Further, the present invention provides a method for identifying a compound that binds to the polypeptide of the present invention.

Description

【発明の詳細な説明】新規のヒト第16染色体遺伝子、組成物、それを作製および使用する方法発明の背景隣接したクローニングゲノム試薬の組み立ては、位置的クローニングアプローチを使用した疾患遺伝子同定のプロセスにおける必要な工程である。多型性の単純な配列反復に基づく高密度遺伝子地図の急速な開発は、配列タグ化部位（STS ）含有量マッピングを用いたコンティグ組み立てを容易にしている。ほとんどのコンティグ構築努力は、酵母人工染色体（YAC）に依存する。なぜなら、それらの大きな挿入物サイズが細菌宿主系より有利に現行のSTS地図密度を使用するからである。このアプローチは複数のヒト染色体について実証され、多くの染色体に対して65〜95％の範囲のYAC適用範囲および11〜36Mbのコンティグが記載されている（Chumakovら、Nature 377(補遺):175-297，1995；Doggettら、Nature 37 7(補遺):335-365，1995b；Gemmillら、Nature 377(補遺):299-319，1995；Kraut erら、Nature 377(補遺):321-333，1995；Shimizuら、Cytogenet.Cell Genet.70 :147-182,1995；van-Heyningenら、Cytogenet.Cell Genet.69:127-158，1995）。多くの成功にもかかわらず、YACクローニング系は、キメラクローン(Greenら、Genomics 11:658-669，1991；Bcllanne-Chantelotら、Cell 70:1059-1068，19 92；Nagarajaら、Nuc.Acids Res.22:3406-3411，1994)、ならびに再配列されるか、欠失されるか、または不安定なクローン（Neilら、Nuc.Acids Res.18:1421- 1428,1990；Wadaら、Am.J.Hum.Genet.46:95-106，1990；Zuoら、Hum.Mol.Genet. 1:149-159，1992；Szepetowskiら、Cytogenet.Cell Genet.69:101-107，1995）の実質的な割合をもたらす本質的な制限のために複雑な生物の全ゲノムをクローニングのための万能薬ではない。これらのクローニング人工物の少なくともいくつかは、哺乳動物DNAにおける種々の型の反復エレメントに作用する酵母の組換え機構の産物である（Neilら、前出、1990；Greenら、前出、1991；Schlessinge rら、Genomics 11:783-793，1991；Lingら、Nuc.Acids Res.21:6045-6046，1993 ；Kou prinaら、Genomics 21:7-17，1994；Larionovら、Nuc.Acids Res.22:4154-4162, 1994）。従って、代替のクローニング系が、局在化YACクローニング欠損を補うために、物理的地図の解像度を増強するために、そして全ゲノムのDNA配列決定のための配列準備供給源を提供するために、YACに基づくアプローチと協力して使用されなければならない。いくつかのエキソントラッピング方法論およびベクターは、ゲノムDNA由来のコード領域の迅速かつ効率的な単離のために記載されている（Auchら、Nuc.Acids Res.18:6743-6744，1990；Duykら、Proc.Natl.Acad.Sci., USA 87:8995-8999，1990；Bucklerら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 88:4005-4009 ，1991；Churchら、Nature Genet.6:98-105，1994）。エキソントラッピングの主な利点は、クローニングされたゲノムDNA（コスミド、P1，またはYAC）の発現が、組織培養細胞において異種プロモーターにより駆動されることである。これは、コード配列がそれらの発現の組織分布または発生段階の前もった知識なく、同定されることを可能にする。エキソントラッピングの第２の利点は、エキソントラッピングが、目的のクローニングされるテンプレートのみに由来するコード配列の同定を可能にし、これは重複遺伝子座由来の高度に保存された転写物を特徴づける危険性を排除することである。これは、cDNA選択の場合でも直接的ライブラリースクリーニングの場合でもない。エキソントラッピングは、ハンチントン病遺伝子座（Ambroseら、Hum.Mol.Gen et.1:697-703，1992；Taylorら、Nature Genet.2:223-227，1992；Duyaoら、Hu m.Mol.Genet.2:673-676，1993）およびBRCA1遺伝子座（Brodyら、Genomics 25:2 38-247，1995；Brownら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 92:4362-4366，1995）における転写配列を同定するために首尾良く使用されてきた。さらに、ハンチントン病の遺伝子（The Huntington's Disease Collaborative Research Group，Cell 72:971-983，1993）、２型神経線維腫症（Trofatterら、Cell 72:791-800，1993 ）、メンケズ病（Vulpeら、Nature Genet.3:7-13，1993）、バッテン病（The In ternational Batten Disease Consortium，Cell 82:949-957，1995）、および大多数の長期QT(Long-QT)症候群症例の原因である遺伝子（Wangら、Nature Genet. 12:17-23，1996）を含む、多数の疾患を引き起こす遺伝子が、エキソントラッピングを用いて同定されている。バンド16p13.3における700kbのCpGリッチ領域は、常染色体優性腎多嚢胞病（P KD1）の約90％の症例の疾患遺伝子（Germinoら、Genomics 13:144-151，1992；S omloら、Genomics 13:152-158，1992；The European Polycystic Kidney Diseas e Consortium，Cell 77:881-894，1994）、ならびに結節硬化症の１形態の原因であるチューブリン遺伝子（TSC2）（The European Chromosome 16 Tuberous Sc lerosis Consortium，Cell 75:1305-1315，1993）を含むことが示されている。推定された20個の遺伝子は、第16染色体のこの領域に存在する（Germinoら、Kid ney Int.Supp.39:S20-S25，1993）。しかし、16p13.3におけるPKD1遺伝子周囲の領域の特徴付けは、16p13.1でのより近位のゲノム間隔の部分の重複により複雑にされてきた（The European Polycystic Kidney Disease Consortium,前出，19 94）。この染色体セグメントは、GCリッチ等容曲線（isochore）(Sacconeら、Proc.N atl.Acad.Sci.,USA 89:4913-4917，1992)に、CpG島（Harrisら、Gcnomics 7:195 -206，1990；Germinoら、前出、1992）、遺伝子（Germinoら、前出、1993）、およびAlu反復配列（Korenbergら、Cell 53:391-400，1988）を豊富に有して存在するので、E.coliおよび酵母における大きな挿入物クローニング系についてのやりがいのある試験として役立つ。第16染色体はまた、他の染色体より低コピーの反復を含み、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（FISH）（Okumuraら、C ytogenet.Cell.Genet.67:61-67，1994）により分析された場合に、そのコスミドコンティグのほぼ25％が１つより多い染色体位置にハイブリダイズする。これらの型の反復および配列重複は、ゲノムDNAの同定のために広く使用される「染色体歩行」技術を妨げ、そしてコンティグ構築のハイブリダイゼーションに基づく方法に対する課題を提示する。これは、これらの技術がゲノムDNAの重複フラグメントを含むクローンを同定するためのハイブリダイゼーションに依存するからであり；従って、真正の遺伝子に由来するクローンの代わりに相同物に由来するクローンへの「歩行」の高い可能性がある。同様の様式で、配列重複および第16 染色体特異的反復はまた、対応するタンパク質をコードする完全なcDNA配列の明白な決定を妨げる。さらに、低コピー反復は、細菌、酵母、および高等真核生物におけるこの間隔の不安定性を導き得る。従って、第16染色体の高度に反復した部分に存在する真正の遺伝子、ならびに他の染色体に同様に位置する遺伝子に対応するゲノム配列およびcDNA配列の正確な同定を可能にする方法および組成物についての当該分野における必要性がある。本発明はこの必要性を満たし、そして関連する利点もまた提供する。発明の要旨本発明によれば、ヒトネトリン、ヒトATP結合カセット輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、および肝臓再生のヒト増大剤（augmenter）をコードする、単離された核酸が提供される。本発明は、ヒトネトリン遺伝子、ヒトATP結合カセット輸送体遺伝子、ヒトリボソームL3遺伝子、および肝臓再生のヒト増大剤遺伝子によりコードされる、単離されたタンパク質産物をさらに提供する。従って、本発明は、本発明の核酸ならびに第16染色体に位置する独特の遺伝子配列を含む単離された核酸にハイブリダイズする、核酸プローブを提供する。本発明の核酸を含むベクターならびに本発明のベクターで形質転換された宿主細胞がさらに提供される。本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物が本発明により提供される。本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、抗体、およびそれを含む組成物を含む。さらに、本発明は、本発明のポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法を提供する。このような化合物は、本発明のポリペプチドの活性を調節するのに有用である。図面の簡単な説明図１は、P1コンティグおよびトラップされたエキソンの模式図を示す。図2Aおよび2Bは、データベースにおける配列との選択されたエキソントラップのアラインメントを示す。図3A〜3Cは、P1クローン53.8B由来の6803bpのhNETゲノム配列（配列番号19）を示す。図4Aおよび4Bは、ニワトリネトリン遺伝子のヒト相同物をコードする、1743bp のhNET cDNAおよび推定アミノ酸配列（配列番号20および21）を示す。図4Cおよび4Dは、5'および3'両方のUTRを含む1.9kb hNET cDNAのヌクレオチド配列（配列番号78）を示す。図５は、ニワトリネトリン-1（配列番号22）、ニワトリネトリン-2（配列番号 23）、およびhNET（配列番号21）間のアミノ酸比較を示す。陰をつけた囲みは同一の相同性の領域を示す。ラミニンドメインＶおよびVIならびにＣ末端ドメイン（Ｃ）は矢印により示され、ドメインＶは３つの亜成分（V-1〜V-3）に分けられる。星印は、接着／シグナリングレセプターのモチーフを同定する。図６は、ニワトリネトリン-1、ニワトリネトリン-2、およびhNETのドメイン間の相同性のグラフ表示を示す。図７は、ABCgt.1クローン由来のエキソントラップ、RT-PCR産物、およびcDNA を示す。エキソントラップは先に記載されている。ABCgt.1 DNAは、エキソントラップの下に示され、Genetrapper選択（Ｓ）および修復（Ｒ）オリゴヌクレオチドの位置が示されている。RT-PCRクローンの位置はcDNAの下に示される。図8A〜8Gは、ABCgt.1クローンをコードする5.8kbのcDNAおよび推定アミノ酸配列（配列番号24および25）を示す。図9A〜9Dは、クローンABCgt.1（配列番号25）と共にマウスABC1（配列番号26 ）およびABC2（配列番号27）のアミノ酸アラインメントを示す。ハイフンはギャップを示す；星印は同一の残基を示し、一方ピリオドは保存的置換を示す。ATP 結合カセットの位置は、囲んだ領域により示される。右の数字は、タンパク質の相対位置を示す。図10は、P1クローン49.10D、109.8C、および47.2Hが単離された、PKD1遺伝子座の転写マップの領域を示す。白色の囲みはトラップされたエキソンを示し、それらの相対位置はRPL3L(SEM L3)遺伝子の下に示される。ｃ、ｒ、およびｈは、それぞれ、捕捉オリゴヌクレオチド、修復オリゴヌクレオチド、およびハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチドの位置を示す。図11A〜11Bは、ここでRPL3Lと呼ばれるSEM L3 cDNAのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列（配列番号28および29）を示す。5'上流のインフレーム停止コドンには下線が付され、そして矢印は、２つのより短いcDNAクローン（これらもまた単離された）のポリＡ域（tract）の部位を示す。図12は、ヒト（配列番号30）、ウシ（配列番号31）、マウス（配列番号32）、およびRPL3L（SEML3）（配列番号29）遺伝子由来の推定アミノ酸配列の比較を示す。ダッシュは、ヒトL3遺伝子に対する配列同一性を示す。Ｎ末端の核標的化配列には陰を付し、そして２部に別れたモチーフは箱で囲まれる。図13は、hALR cDNAのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列（配列番号33および34）を示す。図14は、それぞれ、ラットALRおよびヒトALR由来の推定アミノ酸配列（配列番号35および34）の比較を示す。図15A〜15Jは、完全長hABC3 cDNAのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列（配列番号74および75）を示す。図16は、hABC3遺伝子を含む領域の物理的地図を示す。図17Aは、マウスABC1（配列番号26）およびABC2（配列番号27）配列(LUCiani ら、Genomics 21:150-159，1994)ならびにC.elegansコスミドC.48B4.4によりコードされると予測される配列（配列番号77）(Wilsonら、Nature 368.32-38，199 4)に対して整列された、hABC3の推定アミノ酸配列（配列番号75）を示す。配列同一性は文字で示され、ミスマッチはピリオドで示される。アラインメント間に挿入されるギャップもまた示される（＝）。ABC1、ABC2、およびC.48B4.4について、第１のATP結合ドメインに含まれ、そしてそれに対してＣ末端側の配列のみが示される。囲みは、ATP結合カセット（ＩおよびIII）ならびにHH1ドメイン（I I）を示す。図17Bは、膜貫通（TM）ドメイン、ATP結合カセット（ABC）ドメイン、リンカーおよびHH1ドメインを示すABC3タンパク質の模式図を示す。図18は、ヒトネトリン遺伝子周囲のゲノム間隔の地図を示す。図19Aは、53.8B P1由来の6.8kbゲノム配列におけるコード配列のGRAIL2分析を示す。図19Bは、ゲノム配列をニワトリネトリン-2と比較した、Pustell DNA/タンパク質マトリクスの結果を示す。図20Aは、ヒトネトリンとニワトリネトリン-1、ニワトリネトリン-2、およびU NC-6(配列番号79)とのアラインメントを示す。図20Bは、ゲノム配列の模式図を示し、囲みはエキソンを示し、そして線はイントロンを示す。非翻訳領域は黒で示され、開始コドンの位置は矢印で示される。ヒトネトリンタンパク質のドメイン構造は、遺伝子構造の下に示される。Dros ophilaネトリン遺伝子におけるイントロンの位置は矢印で示され、非保存的イントロンは白抜き矢印で示される。発明の詳細な説明本願で引用される全ての特許出願、特許、および文献参考は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。コンフリクトまたは不一致の場合、定義を含む本発明の説明は調整する。定義：１．「相補的DNA（cDNA）」は、真正の遺伝子に由来し、そしてその配列またはその相補物がタンパク質をコードする、１本鎖または２本鎖のイントロンのないDNA分子と本明細書中で定義される。２．本明細書中で言及する「コンティグ」は、DNAまたはDNA配列の連続したストレッチであり、これは複数の重複するクローンまたは配列により示され得る。３．本明細書中で言及する「コスミド」は、細菌細胞において複製し得、そして長さが約30〜約51kbの大きなDNA挿入物を収容し得る、DNAプラスミドである。４．用語「P1クローン」は、P1ファージ複製機構に基づくベクターにクローニングされたゲノムDNAをいう。これらのベクターは、一般的に、約70〜約105kbの挿入物を収容する（Pierceら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，89:2056-2060，1992 ）。５．本明細書中で使用する用語「エキソントラッピング」は、RNAプロセシングのためのドナーおよびアタセプタースプライス部位に隣接される、ゲノムDNA 配列を単離するための方法をいう。６．本明細書中で使用するDNAの「増幅」は、混合物またはDNA配列内の特定の DNA配列の濃度を増大させるために働く反応を示す。増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）（Saikiら、Science，239:487，1988）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、核酸に特異的に基づく増幅（NSBA）、または当該分野で公知の任意の方法を用いて行われ得る。７．本明細書中で使用する「RT-PCR」は、共役した逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応をいう。この増幅方法は、特定のオリゴヌクレオチド、オリゴdT、またはランダムプライマーの混合物を用いて、RNAから１本鎖cDNAへの逆転写をプライムする最初の工程を使用し；次いで、このcDNAは、標準的な増幅技術（例えば、PCR）を用いて増幅される。 PKD1およびTSC2遺伝子周囲の約700kbのDNAを含むP1コンティグは、３ゲノム等価P1ライブラリー（Shepherdら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 91:2629-2633，1994 ）を15の異なるプローブでスクリーニングすることにより得られた、12の独特の第16染色体に由来するP1クローンのセットから組み立てられた。エキソントラッピングは、16p13.3におけるこの領域に由来する転写配列を同定するために使用された。この間隔における最低18の遺伝子に由来する配列を含む96の新規のエキソントラップが得られた。この18の同定された遺伝子は、この間隔に由来する５つの以前に報告された遺伝子、およびその位置が未知であった以前に特徴付けられた遺伝子を含む（表Ｉ）。さらなるエキソントラップが、cDNA、PT-PCR産物におけるそれらの存在、またはノーザンブロット上での異なるmRNA種へのそれらのハイブリダイゼーションに基づいて遺伝子にマップされた。エキソントラッピングは、改善されたトラッピングベクター（Burnら、Gene 1 61:183-187，1995）を用いて行われ、得られたエキソントラップはDNA配列分析により特徴付けられた。エキソントラッピング手順の相対的な効率を決定するために、エキソントラップは、PKD1遺伝子周囲の間隔にあることが知られている遺伝子のcDNA配列と比較された（図１）。単一のエキソントラップは、ERV1（Liso wskyら、Genomics 29:690-697，1995）およびATP6Cプロトンポンプ遺伝子（Gill espieら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 88:4289-4293，1991）のヒト相同物から得られた。図１の上部の水平線は、目盛りの付いた（キロベース）関連DNAマーカーの位置を示す。NotI部位の位置は、水平線の下に示される。既知の遺伝子の位置および方向は矢印で示され、各遺伝子から得られたエキソントラップの数は括弧内に示される。この報告に記載される転写単位（ＡからＭ）の位置は、既知遺伝子の下に示される。対応するエキソントラップのGenbank受託番号は、各転写単位の下に示される。P1クローンは重複線により示され、クローンの名称はこの線の上に示される。特徴付けられた転写物にマップしないトラップされたエキソンの位置は、P1コンティグの下に示される。垂直線は、ハイブリダイゼーション研究においてエキソントラップにより検出されたP1クローン（単数または複数）内の間隔を示す。対照的に、８つの個々のエキソントラップがTSC2遺伝子から単離され、10の個々のエキソントラップがCCNF遺伝子から単離された（The European Chromosome 16 Tuberous Sclerosis Consortium，前出、1993；Krausら、Genomics 24:27-33 ，1994）。PKD1遺伝子に存在するエキソンのうちの３つからトラップされた配列が得られた（The American PKD1 Consortium，Hum.Mol.Genet.4:575-582，1995 ；The International Polycystic Kidney Disease Consortium，Cell 81:289-29 8，1995；Hughesら、Nature Genet.10.151-160，1995）。109.8Cおよび47.2H P1 クローンから16のさらなるエキソントラップもまた得られた。 96.4Bと64.12C P1クローンとの間の重複領域に局在する、２つのエキソントラップ（Genbank受託番号L75926およびL75927）に存在する配列は、Ｓ期優勢なDNA /RNA結合タンパク質（Schmidtら、Biochim.Biophys.Acta 1216:317-320，1993）をコードする、マウスRNPS1遺伝子（Genbank受託番号L37368）に対する以前に記載されたヒト相同物由来の配列を含むことが示された。dbESTデータベースに対するこれらのエキソントラップの比較は、それらがまたI.M.A.G.E．Consortium( Lennonら、Genomics 33:151-152，1996)からのcDNA 52161に含まれることを示した。これらのデータに基づいて、hRNPS1遺伝子は、DNAマーカーD16S291近くの16 p13.3にマップされ得る（図１の転写物Ｇ）。 1.8F P1クローン由来の２つのエキソントラップは、ジンクフィンガー含有転写因子をコードする以前に記載されたマウスΦAP3（Fognaniら、EMBO J.12:4985 -4992，1993）に対して、高レベルの相同性を有することが見出された。ジンクフィンガー含有転写因子であるmΦAP3タンパク質は、細胞周期の阻害を担うタンパク質をコードする遺伝子に対する負のレギュレーターとして機能すると信じられている（Fognaniら、前出）。２つのエキソントラップはPCRにより連結され、得られた1.2kbのPCR産物は、マウスΦAP3cDNAに対してヌクレオチドレベルで85 ％同一であった。ΦAP3様エキソントラップのドットブロットされたP1コンティグに対するハイブリダイゼーションは、この遺伝子株がDNAマーカーKLH7とGGG12 との間の1.8F P1の非重複領域にあることを示した（図１の転写物Ｈ）。有意な相同性はまた、97.10G P1および小胞輸送の調節に関与するras関連GTP 結合タンパク質をコードするラットRab26遺伝子（Nuofferら、Ann.Rev.Biochem. 63:949-990，1994；Wagnerら、Biochem.Biophys.Res.Comm.207:950-956，1995）から得られた２つのエキソントラップ間で観察された。Rab26様エキソントラップは、RT-PCTにより連結され（図１の転写物Ｊ）、コード配列はRab26に対してタンパク質レベルで94％（83/88）同一であった。例えば、以下の選択されたエキソントラップとデータベースにおける配列とのアラインメントを示す図２を参照のこと。エキソントラップL48741によりコードされる配列（配列番号１）ならびにC.Elegans（配列番号２）、E.coli（配列番号３）、およびHaemophilus（配列番号４）に由来するN-アセチルグルコサミン-6-リン酸デアセチラーゼのアラインメント。翻訳されたネトリン様エキソントラップの１つ（Genbank受託番号L 75917）（配列番号５）に対して整列された、ネトリン-1（配列番号７）、ネトリン-2（配列番号６）、およびUNC-6（配列番号８）に由来するEGF反復が示される。第２のネトリン様エキソントラップ（Genbank受託番号L75916）（配列番号９）、ネトリン-1（配列番号11）、およびネトリン-2（配列番号10）に由来する配列のアラインメントが示される。翻訳されるRab26様RT-PCR産物（Genbank受託番号L48770-L48771）（配列番号12）およびラットRab26（配列番号13）のアラインメント。Neisseria gonorrhoeae由来のpilB転写リプレッサー由来の配列（配列番号15）、C.elegans由来のコスミドF44E2.6によりコードされるコンピューター分析により予測された配列（配列番号17）、酵母由来のYCL33C遺伝子産物（Ge nbank受託番号P25566）（配列番号16）、およびHaemophilus由来の転写リプレッサー（配列番号18）に対して整列された、エキソントラップL48792によりコードされる配列（配列番号14）が示される。ピリオドは、ギャップがアラインメントを維持するためにタンパク質配列に挿入された位置を示す。エキソントラップと個々の転写物とを相関させるために、cDNAライブラリースクリーニングおよびPCRに基づくアプローチを使用して、選択されたエキソントラップを含む転写配列をクローニングした。RT-PCRを使用して、２つのエキソントラップがデータベースにおける類似した配列に対して相同性を有する場合に、個々のエキソントラップを共に連結させた。単一のエキソントラップのみが利用可能な場合、3'RACEまたはcDNAライブラリースクリーニングを使用して、さらなる配列を得た。エキソントラップおよびクローニング産物由来の配列を使用して、対応する転写単位の位置、および可能であればその方向をマップした。少なくとも８つのエキソン由来の配列を含む６つの独特のエキソントラップは、最も動原体性のP1クローン、94.10Hにおいて転写単位に由来することが示された（図１の転写物Ａ）。６つのエキソントラップを連結する２kbのcDNAは単離され、そして８kbの転写物にハイブリダイズすることが示された。さらなるハイブリダイゼーション研究は、この遺伝子が動原体からテロメアに指向され、少なくとも６kbの転写物がP1コンティグの動原体側の配列に由来することを示した。広範な相同性は、翻訳されたcDNAと種々のタンパク質キナーゼとの間に観察された；しかし、エキソントラップL48734においてコードされる保存HRDLKPENモチーフ（配列番号71）ならびに部分的cDNAの存在は、それがセリン／スレオニンキナーゼをコードすることを示唆する（van-der-Geerら、Ann.Rev.Cell Bio.10:251-33 7，1994）。 cDNAは、異なる94.10Hエキソントラップ（Genbank受託番号L48738）に由来する配列を用いて単離され、そして対応する転写単位の位置および方向が決定された。２つのcDNA種は、プローブとしてエキソントラップL48738を用いて得られ、２つの種間の相同性は、エキソントラップに含まれる109の塩基から生じるもののみであった。オリゴヌクレオチドプローブを用いて、転写単位は、テロメア方向から動原体方向へ26-6DIS DNAマーカー近くの位置にマップされた；しかし、c DNA種のうち１つしかP1コンティグにマップされなかった（図１の転写物Ｂ）。これらのデータに基づいて、第２のcDNA種は、P1コンティグの外側の領域、恐らく16p13.3のさらに動原体側に位置する重複26-6PROXマーカーに由来したようである（Gillespieら、Nuc.Acids Res.18:7071-7075，1990）。 110.1F P1クローンは、ATP6C遺伝子に加えて少なくとも２つの遺伝子を含む。タンパク質データベースを調べるためにBLASTXを用いて、有意な相同性が、エキソントラップL48741によりコードされる配列と、C.elegans(Wilsonら、前出、19 94)、E.coli(Plumbridge，Mol.Microbiol.3:505-515，1989)、およびHaemophilu s(Flelschmannら、Science 269:496-512，1995)に由来するN-アセチルグルコサミン-6-リン酸デアセチラーゼ(nagA)タンパク質との間で観察された。nagAタンパタ質の翻訳されるエキソントラップに対するアラインメントは、複数の保存される領域の存在を明らかにし（図２）、これはエキソントラップがヒトnagA遺伝子由来の配列を含むことを示唆する。nagA様転写物由来の付加的配列は3'RACEを用いてクローニングされ、そして転写単位は、図１のNotI部位２と３との間の領域にマップされた。この遺伝子はテロメアから動原体に配向され、NotI部位２は RACEクローンの3'UTRに存在する（図１の転写物Ｃ）。 110.1F P1クローンと53.8B P1クローン（図１の転写物Ｄ）との間の重複領域にマップする、２つのさらなるエキソントラップ（Genbank受託番号L75916およびL75917）は、ニワトリネトリン（Kennedyら、Cell 78:425-435，1994；Serafi niら、Cell 78:409-424，1994）およびC.elegans UNC-6タンパク質（IShiiら、N euron 9:873-881，1992）と相同性を有することが示された（図２および20A)。エキソントラップL75917によりコードされる配列は、ネトリンおよびUNC-6タンパク質に見出されるＣ末端のほとんどの上皮増殖因子（EGF）反復と有意な相同性を有することが示された（図２および20A）。エキソントラップL75917は、ニワトリネトリン-2の第３の上皮増殖因子（EGF）反復に由来する配列と98％同一の配列、およびネトリン-1の同じ領域に由来する配列と90％同一の配列をコードする。ネトリン様トラップL75916は、ネトリン-1およびネトリン-2のＣ末端ドメインに含まれる配列と43％同一の、ネトリンのより分岐したＣ末端ドメインに由来する配列をコードする（図２および20A）。この領域は、UNC-6とネトリンとの間で最も保存されておらず、配列はネトリン-1とネトリン-2との間で63％保存され、そしてネトリン-2とUNC-6との間で29％保存される（Serafiniら、前出）。ネトリンは、軸索誘導において中心的な役割を果たすことが示されている化学屈性因子ファミリーを定義する。軸索成長円錐は、細胞外マトリクスまたは細胞表面に存在する局所的キュー(cue)、ならびに拡散性の化学誘因物質および化学忌避物質の形態における長期のキューの両方によりそれらの標的に誘導される（ GoodmanおよびShatz、Cell 72:77-98，1993；KeynesおよびCook、Curr.Opin.Neu robiol.5:75-82，1995）。ニワトリネトリン-1およびネトリン-2は、脊髄交連軸索を発達させるための化学誘因物質として機能し（Serafiniら、Cell 78:409-424，1994；Kennedyら、Ce ll 78.425-435，1994）、ネトリン-1はまた滑車運動性軸索に対する化学忌避物質として作用する（ColamarinoおよびTessier-Lavigne，Cell 81:621-629，1995 ）ことが示されている。比較分析は、ニワトリネトリンと、環状(circumferenti al)細胞遊走および軸索誘導に必要とされるC.elegans UNC-6タンパク質との間の広範な相同性の存在を明らかにした（Hedgecockら、Neuron 4:61-85，1990；Ish iiら、Neuron 9:873-881，1992）。より最近では、２つのDrosophilaネトリン、 NETAおよびNETBが記載され、そして滑車軸索誘導ならびに運動性ニューロンのそれらの標的筋肉への誘導に必要とされることが示されている（Harrisら、Cell 1 7:217-228，1996；Mitchellら、Cell 17:203-215，1996）。これらの研究は、化学誘因性および化学忌避性タンパク質のネトリンファミリーが無脊椎動物と脊椎動物との間で保存されることを示す。ネトリン様エキソントラップを含むゲノム間隔は、この遺伝子からのさらなる配列情報を得、そしてエキソントラップが偽遺伝子に由来する可能性を除外するために配列決定された。53.8BゲノムP1クローンを用いた予備研究において、ネトリン様エキソントラップは、６kbのXhoIフラグメントにマップされた。例えば、関連DNAマーカーが水平線の上に示され、NotI部位（Ｎ）がこの線の下に示される、図18を参照のこと。ATP6C、CCNF、およびnagA転写単位の位置および方向は、以前に記載され（Gillespieら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 88:4289-4293，1 991；Krausら、Genomics 24:27-33，1994；Burnら、Genome Research 6:525-537 ，1996)、そしてゲノム間隔の下に示される。ネトリン遺伝子を含む２つのP1クローンは、この間隔の模式図の下に示される。6.8kbのゲノム配列の位置は、P1 クローンの下で拡大される。6.8kbのゲノム配列における２つのエキソントラップの位置もまた示される。６kbフラグメントおよび隣接する3.5kbのXhoIフラグメントはサブクローニングされ、そしてこれを使用して、53.8B P1クローンからランダムショットガンライブラリーをスクリーニングした。ハイブリダイゼーションにより陽性であったサブクローンは、正および逆ベクタープライマーを用いて配列決定された。計88 のサブクローンがこの様式で配列決定された。さらなる配列が、内部プライマーならびに親XhoIフラグメント由来の末端配列を用いて得られた。７倍の全重複性を有する計6.8kbのゲノム配列が配列決定された。配列決定された領域のGC含有量は68.9％であると見出され、これは350kb さらにテロメア側に位置する、PKD1遺伝子に由来する53kbのゲノム配列について観察された62.8％よりわずかに高い（The American PKD1 Consortium，1995,前出；Burnら、1996、前出）。コンピューター分析は、推定エキソンを同定するために行われた。GRAIL2分析は、データベース分析を用いて6.8kbのゲノム配列内に６つのエキソンを予測し、１つのエキソン（エキソン１）以外の全てが、ニワトリネトリンに対して相同性を有する配列をコードすることを示した。図19Aは、53.8B P1に由来する6.8kb のゲノム配列におけるコード配列のGRAIL2分析を示し、灰色の目盛りはGC含有量を示し（白から薄い灰色はGCリッチであり、そして灰色から黒はATリッチである）、垂直の囲みは予測されたエキソンの相対的な質(quality)を示す。推定されたエキソンの図は垂直の囲みの上に示され、薄く着色した囲みは「優秀」（＞80 ％の確率）のスコアを有するエキソンを示し、そして濃く着色した囲みは「良」（＞ 60％の確率）のスコアを有するエキソンを示す。エキソントラップL75917および L75916(それぞれ、左から右）の位置は、GRAIL2予測エキソンの上に示される。R T-PCR産物およびゲノム配列の比較に基づく遺伝子の構造は上段に示され、ゲノム配列におけるエキソンの位置は、エキソンの上の数により示される。5'および 3'非翻訳領域もまた示される。さらに、6.8kbのゲノム配列は、Pustell DNA/タンパク質マトリクスを用いてニワトリネトリンのタンパク質配列と比較された。ゲノム配列（６つ全てのフレームに翻訳される）は、最小相同性が50％にセットされ、そしてウインドウ(win dow)が20にセットされた、RAM250マトリクスを用いて図19Bのニワトリネトリン- 2と比較された。相同性領域は太い斜線により示される。５つのエキソンはこの分析により予測され、第１のGRAIL2予測エキソンのみが真実であると思われなかった。２つのエキソントラップ由来の配列もまたGRAIL2により予測された；しかし、注目すべき差異があった（図19Aを比較のこと）。エキソントラップL75917 に存在する配列の予測において、GRAIL2は、エキソンの5'末端に付加的55bpを含んだ。エキソントラップL75916に存在する２つのエキソンのうち第１のエキソンはGRAIL2により予測されなかったが、一方GRAIL2は、このエキソントラップに存在する第２のエキソンの5'および3'末端に付加的塩基を付加した。発現配列タグ(Expressed Sequence Tag)(EST)データベースの検索は、ヒトネトリン遺伝子に由来するいずれのESTの存在も明らかにしなかった。ヒトネトリンメッセージもまた、50を超える異なる成人および胎児組織由来のmRNAを用いたノーザンおよび／またはRNAドットブロット分析により検出されなかった。これはhNETが極端に制限された発現パターンを有し、発現する場合、低い発生量で存在することを示唆する。しかし、hNETに対して有意な相同性を有する２つのマウスESTが、脳ライブラリーおよび全胎児ライブラリー（それぞれ、Genbank受託番号W59766およびAA048205）から同定された。このマウスESTは、計477bpの隣接配列が示される重複配列を含む。この477bpの隣接配列は、ヒトネトリンcDNAの5' 末端に整列し、そして47bpの5'UTRおよびＮ末端143アミノ酸をコードする配列を含む。推定ヒトおよびマウスタンパク質配列の比較は、２つのタンパク質が89. 5％（128/143）同一であることを示した。ヒトネトリン転写物の特徴づけネトリン遺伝子の構造を確認するために、RT-PCRは、予測されたエキソンから設計されたプライマーを用いて行われた。予測されたヒトネトリンはネトリン-1 よりネトリン-2に対してわずかにより相同性であると思われ（それぞれ、57％対 54％）、そしてネトリン-2はニワトリの脊髄において発現されるので、成人ヒト脊髄ポリA＋RNAはテンプレートとして利用された。RT-PCR産物は、プライマー対の一部のみで得られた；しかし、これでさえもネスティドプライマーおよび２回のPCRの使用を必要とし、低い収率は、ハイブリダイゼーションおよび産物を視覚化するための放射性標識プローブを使用することを必要とした。いくつかの場合におけるRT-PCR産物の低い収率および欠如は、産物の高GC含有量（70〜80％）に起因した。PCT反応物中最終濃度2.5Mまでのベタインの添加は、劇的にRT-PCR 産物の収率および純度を改善することが見出された（国際公開第WO 96/12041；R eevesら、（1994）Am.J.Hum.Genet.55:A238；Baskaranら、（1996）Genome Rese arch 6:633-638）。 RT-PCR産物の組み立ては、提案された開始メチオニンの上流にインフレームの停止コドンを有する1743bpのオープンリーディングフレーム（ORF）を明らかにした。開始コドンおよび停止コドンの確認において、209bpの5'UTRおよび22bpの 3'UTRがクローニングされた。しかし、それぞれのUTR由来の付加的配列はクローニングされなかった。なぜならRT-PCR実験の目的は、予測されたタンパク質配列を確認することだけであり、そして完全長cDNAを組み立てることではないからである。イントロン-エキソン境界の位置は、ゲノム配列およびRT-PCRクローンの比較に基づいて決定された（図19A）。 1.9kbのcDNAであるhNETは、テンプレートとして脊髄cDNAおよびベタインを加えた標準的PCR条件を用いたネスティッドPCRを行うことによりクローニングされた。ヒトネトリンタンパク質は、サイズが580アミノ酸であると予測され、ネトリンファミリーの共通のドメイン構造は保存されていた。図20Aにおいて、ニワトリネトリンおよびUNC-6配列がヒト配列とマッチする位置はピリオドにより示され、一方アラインメント間に導入されるギャップはハイフンにより示される。配列アラインメント上の矢印は、記載されたような（Serafiniら、Cell 78:409- 424，1994）ラミニンVIおよびＶドメインならびにＣ末端領域（Ｃ）の境界を示す。シグナル配列（Ｓ）もまた示される。V-1、V-2、およびV-3は、ドメインＶを構成するEGFドメインのそれぞれを表す。hNETコード配列およびその予測されたタンパク質産物は、図4Aおよび4Bに示される。図4Cおよび4Dは、5'および3'UT R配列を含む完全長hNET cDNAを示す。いくつかの方面の証拠は、本明細書中に記載されるヒトネトリン遺伝子が偽遺伝子である可能性に対して不利な決定を下す。第１に、コード領域におけるいずれのエキソンも停止コドンを含まない。第２に、記載された全遺伝子構造は、ネトリン／UNC-6ファミリーの他のメンバーと比較した場合に、高度に保存されている。第３に、ノーザンおよびRNAブロット分析におけるシグナルの欠如にもかかわらず、成熟転写物はRT-PCRにより単離された。最後に、高度に保存される、マウスESTデータベースにおける配列が同定されている。ひとまとめにして考えると、これらのデータは、制限された発現パターンを有する新規のヒトネトリン遺伝子が同定されたことを示す。ヒトネトリンは、神経再生において著しい役割を有し得る。ネトリンはそれ自体で軸索成長を促進しないが、それらは軸索成長の方向付けにおいて役割を果たす。成長促進活性と軸索誘導キューとの組み合わせは、指向された神経再生に必要な要件である。このような制限された発現パターンを有する遺伝子をクローニングする能力は、ネトリン遺伝子がcDNA選択または直接的ライブラリースクリーニングを用いて同定されるようではないので、エクソントラッピング手順の長所のうちの１つを示す。これらの結果は、大きなゲノムコンティグ由来の配列を同定し、そしてクローニングするために、種々のアプローチを使用する必要性を強調する。エキソントラッピング結果は、動原体からテロメア方向でLCNIとD16S291マーカーとの間に位置する、PKD1遺伝子座における新規のATP結合カセット（ABC）輸送体が存在することをさらに示す。エキソントラップ配列を用いたデータベース検索は、マウスABC1およびABC2遺伝子に対する相同性を示す（Lucianiら、前出、 1994）。マウスABC1およびABC2のヒト相同体はクローニングされ、そしてヒト第９染色体にマップされた（Lucianiら、前出、1994）。cDNA選択およびSAmple SE quencing(SASE)からの配列と共に、トラップされたエキソンに由来する配列を使用して、重複部分的cDNAクローンを回収した。 ABC輸送体に対する相同性を有する７つのエキソントラップは、P1クローン30. 1F、64.12C、および96.4Bから単離された。ABC3遺伝子によりコードされる付加的配列は、エキソントラップから設計されたカスタムプライマー（表IIおよびII I）を用いて、RT-PCR（胎盤および脳RNAをテンプレートとして）ならびにライブラリーPCR（市販の肺cDNAライブラリーをテンプレートとして用いて）により得られた。３つのエキソントラップ（L48758、L48759、およびL48760）は、30.1F 、64.12C、および96.4BのP1クローン間の重複領域から得（転写物Ｆ、図１）、一方第４のエキソン（L48753）は、排他的に、79.2A P1クローンにマップする（図１の転写物Ｅ）。転写物ＦによりコードされるhABC3輸送体に由来するエキソントラップは、マウスABC1およびABC2遺伝子のＲドメインに対する相同性を有する配列をコードする。Ｒドメインは、CFTRにおける保存領域に対する比較に基づいて調節的な役割を果たすと考えられる。現在までのところ、ABC1、ABC2、およびCFTRのみが、Ｒドメインを含むことが示されている（Lucianiら、前出、1994）。さらに、転写物Ｆ由来の３つのエキソントラップを連結する1.1kbのRT-PCR産物（このRT-PCR産物はノーザンブロットにおいて７kbメッセージを検出する）が得られた。dbESTデータベースの検索に基づいて、この領域に由来するcDNAが得られ、エキソントラップL75924およびL75925に由来する配列はI.M.A.G.E．Conso rtium（Lennonら、前出）からのcDNA 49233に含まれた。同じ転写単位における両方のクローニング試薬の存在は、RT-PCRを用いて確認された。 ATP結合カセット（ABC）輸送体または輸送ATPは、原核生物および真核生物両方の細胞における、広範な種々の基質の細胞膜を横切った輸送を担う100を超えるタンパク質ファミリーを含む（Higgins，C.F.，Annu.Rev.Cell.Biol.8:67-113 ，1992；Higgins，C.F．Cell 82:693-696，1995）。ABC輸送体スーパーファミリーに属するタンパク質は、強力な構造類似性により連結される。代表的には、AB C輸送体は、４つの保存ドメイン、基質特異性を与え得る２つの疎水性ドメイン（Payneら、Mol.Gen.Genet.200:493-496，1985；Footcら、Naturc 345:255-258 ，1990；Andersonら、Science 253:202-205，1991；Shustikら、Br.J.Haematol. 79:50-56，1991；Covitzら、EMBO J.13:1752-1759，1994）、ならびにATP結合および加水分解に関連する２つの高度に保存されたドメイン（Higgins、前出、199 2）を有する。ABC輸送体は、細胞内外へのおよび亜細胞性膜を通した分子の一方向性輸送を支配する（Higgins、前出、1992）。それらの基質は、重金属（Ouell etteら、Res.Microbiol.142:737-746 1991）からペプチドおよび完全サイズのタンパク質（Gartnerら、Nature Genet.16-23 1992）に及ぶ。真核生物細胞において、ABC輸送体は、４つ全てのドメインを含む単一の大きな対称的タンパク質、または疎水性およびATP結合ドメインをそれぞれ含む２つのより小さなポリペプチドの会合から生じたダイマーのいずれかとして存在する。このマルチマー構造形態の例は、ヒトTAPタンパク質（Kellyら、Nature 355:6 41 -644，1992）および機能的PMP70タンパク質（Kamijoら、J.Biol.Chem.265:4534- 40 1990）である。このマルチマー構造はまた、非常に多くの原核生物ABC輸送体において見出される。疎水性領域は、６つまでの膜貫通にわたるセグメントからなる。各ATP結合ドメインは独立して操作し、そして機能的に等価であってもなくてもよい（Keremら、Science 245:1073-80 1989；Mimmackら、Proc.Natl.Acad .Sci.,USA 86:8257-61 1989；Cuttingら、Nature 346:366-369 1990；Kerppola ら、J.Biol.Chem.266:9857-65，1991）。現在までにヒトにおいて同定されたABC輸送体のいくつかは、臨床的に重要であることが示された。例えば、P-糖タンパク質の過剰発現は、腫瘍における複数の薬物耐性の原因である（Gottesmanら、Ann.Rev.Biochem.62:385-427 1993）。古典的な嚢胞性線維症（CF）ならびに精管の両側性先天的疾患（CBAVD）の大きな割合の症例は、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター（CFTR）、 ABC輸送体における変異により引き起こされる（Keremら、前出；Cuttingら、前出）。ABC輸送体における欠損はまた、ツエルヴェーガー症候群（Gartnerら、前出）および副腎脳灰白質ジストロフィー（Mosserら、Nature 361:726-730 1993 ）に関与した。新規のABC輸送体サブグループの２つのメンバー（マウスABC1およびABC2）は、CFTRの調節Ｒドメインに類似したドメインを含むことが示された（Lucianiら、前出、1994）。機能的に、マウスABC1タンパク質は、アポトーシス細胞のマクロファージの飲み込みにおいて役割を果たすことが示されたが（Lucianiら、EMB O J.16:226-235，1996）、一方ABC2の機能は未知のままである。３つ全てのタンパク質は、いくつかの潜在的なリン酸化部位を含む大きな荷電領域を含む（Kere mら、前出；Lucianiら、前出、1994）。この領域内の荷電アミノ酸残基は、正および負の電荷を交替させたブロックにおいて連続的に配置される。これらの特定のABC輸送体（hABC3を含む）の共通の特性は、２つのATP結合カセット間の大きなリンカードメインの存在である。リンカードメインにおける非常に多くの極性残基および潜在的なリン酸化部位の存在は、この領域がCFTRのＲドメインのものに恐らく類似した調節的役割を果たし得ることを示唆する(Kerem ら、前出）。さらに、この４つのタンパク質はまた、保存リンカードメイン内に疎水性領域であるHH1ドメイン（Lucianiら、前出、1994）を含む。hABC3およびマウスABCのHH1ドメイン間での配列レベルの相同性はほとんどないが、それらは構造的に保存されていると思われ、各ドメインがβシートコンホメーションを有すると予測される。これらのタンパク質の類似性は、それらが全て、最初にAB C1およびABC2により定義された同じABCサブファミリーに属することを示唆する（Lucianiら、前出、1994）。ABC1およびABC2のヒト相同物をコードする遺伝子は、それぞれ、q22〜q31およびq34でヒト第９染色体にマップされた（Lucianiら、前出、1994）。同じサブファミリーのメンバーであるにもかかわらず、ABC1、ABC2、およびhA BC3は異なる機能的役割を有するようである。ABC1、ABC2、およびhABC3の膜貫通およびリンカードメインに存在する差異は、独特の基質特異性をそれぞれ与え得る。例えば、原核生物および真核生物両方のABC輸送体の膜貫通ドメインにおける変化および変異は、基質特異性を変えることが示された（Payneら、前出；Foo teら、前出；Covitzら、前出）、一方CFTRのＲドメインに対する変化はそのイオン選択性を変えることが示された（Andersonら、前出；Richら、Science 253:20 5-207 1991）。ABC1、ABC2、およびhABC3の発現パターンにおける差異はまた、これらのタンパク質が機能的に異なり得ることを示唆する。マウスABC1およびAB C2は、広範な種々の成体および胚の組織において種々のレベルで発現されることが示され、ABC1発現の最も高いレベルは妊娠した子宮および単球細胞に富んだ領域において示されたが、一方ABC2発現の最も高いレベルは脳において示された（ Lucianiら、前出、1994；Lucianiら、前出、1996）。対照的に、hABC3は、肺において優先的に発現され、著しく低いレベルの発現が脳、心臓、および膵臓において示される。 ABC1、ABC2、およびhABC3間の構造的差異を除けば、３つのタンパク質が異なる細胞集団において類似した機能的役割を果たすことは常に可能である。現在までに、マウスABC2についての機能は提案されていない。しかし、最近のデータは、ABC1がアポトーシスを受ける細胞の飲み込みに必要とされることを示すが、AB C1機能の基礎となる分子機構は知られていない（Lucianiら、前出、1996）。hAB C3がABC1に類似した様式で機能する場合、宿主防御に関与する肺性マクロファージにより発現され得る。 ABC輸送体は、小さなイオンから大きな多糖およびタンパク質に及ぶ基質について記載された。肺における高レベルの発現に基づいて、hABC3の基質は、肺機能（イオンまたは多糖輸送を含む）において絶対必要な役割を果たし得る。さらなる手がかりは、肺におけるhABC3発現のより精密な試験により提供され得る。これらの研究は、hABC3発現を担う肺細胞の同定ならびにhABC3の亜細胞性局在の決定を含む。hABC3 cDNAの同定およびクローニングは、それが潜在的なＲドメインを含みそして肺において最も高いレベルで発現されるので、嚢胞性線維症についての関与を有し得る。hABC3が肺機能において絶対必要な役割を果たすのであれば、hABC3基質特異性の調節または変化は、CFに対する著しい治療的関与を有し得る。いくつかのcDNAは、GeneTrapper直接選択システムおよびABC1に対して相同性を有する最も5'側のトラップされたエキソンコード配列（トラップされたエキソンL48747）から設計されたオリゴを用いてクローニングされた。最も5'側のエキソントラップから設計されたカスタムオリゴヌクレオチドを用いて、正常ヒト肺 cDNAライブラリーからGeneTrapperシステムで単離された最も長いクローンは、長さが5719bpであった（ABCgt.1）。さらなるcDNAクローン（ABC.5）は、プローブとして放射性標識された1.1kbのRT-PCR産物（ABC3-12）を用いて単離された（図15）。ABC3 cDNAの5'末端は5'RACEを用いてさらに特徴付けられ、いくつかのR ACE産物は、開始メチオニンの上流に複数のインフレーム停止コドンを含んだ。従って、本発明は、マウスABC1およびABC2遺伝子に対して相同性を有する新規のヒトABC遺伝子、ならびにC.elegansに由来するコスミドC48B4.4（Wilsonら、前出）によりコードされると予測される配列を提供する。6.4kbのcDNAは、hABC3 輸送体について組み立てられた。組み立てられたcDNAは、1705アミノ酸をコードする5116ヌクレオチド長オープンリーディングフレームを含み、予測されたタンパク質は191kDaの分子量を有した。提案された開始メチオニンは、クローンABCg t.1の5'末端の50bp上流である。 P1クローン109.8Cおよび47.2Hに由来する５つのトラップされたエキソンは、ヒトリボソームタンパク質L3 cDNAに対する相同性を有する配列を含むことが示され、ハイブリダイゼーション研究は、L3様遺伝子が動原体からテロメアに指向されることを示した（図１の転写物Ｌ）。リボソームL3遺伝子産物は、大リボソームサブユニットにおけるペプチジルトランスフェラーゼ活性に必須の５つのタンパク質のうちの１つである（SchulzeおよびNierhaus、EMBO J.1:609-613，198 2）。驚くべきことではないが、L3アミノ酸配列は、種間で高度に保存されている。約98％のタンパク質配列同一性を示す哺乳動物L3遺伝子は、ヒト（Genbank 受託番号X73460）、マウス（Peckhamら、Genes Dev.3:2062-2071，1989）、ラット（KuwanoおよびWool、Biochim.Biophys.Res.Comm.187:58-64，1992）、およびウシ（Simonicら、Biochem.Biophys.Acta 1219:706-710，1994）から特徴付けられた。トラップされたエキソンと報告されたヒトリボソームタンパク質L3 cDNA との間の累積パーセント同一性は、ヌクレオチドレベルで74％(537/724)であった。新規のリボソームL3タンパク質サブタイプ、SEM L3をコードする完全長cDNAが単離および配列決定された（図11）。この遺伝子は現在RPL3Lと呼ばれ、そしてG enbank受託番号U65581と指定されている。推定タンパク質配列は407アミノ酸長であり、そしてこれら自体が高度に保存されている、他の公知の哺乳動物L3タンパク質に対して77％の同一性を示す。ヒトゲノムDNAのハイブリダイゼーション分析は、この新規の遺伝子が単一コピーであり、そして組織特異的発現パターンを有することを示唆する。以前に同定されたヒトL3遺伝子および新規のヒトRPL3Lの発現パターンは、複数の組織ノーザンブロットを用いて決定された。ヒトL3遺伝子は、膵臓における最も高い発現と共に全ての組織において偏在的な発現パターンを示した。対照的に、本明細書中に記載される新規の遺伝子は、膵臓における低い発現レベルと共に、骨格筋および心臓組織において強力に発現される。この新規の遺伝子RPL3L （リボソームタンパク質L3様）は、染色体16p13.3上のPKD1およびTSC2遺伝子近くの遺伝子が豊富な領域に位置する。 RPL3Lタンパク質は、以前に記載された核コードミトコンドリアタンパク質より上記の細胞質性リボソームタンパク質に密接に関連する(Graackら、Eur.J.Bio chem.206:373-380，1992)。RPL3Lにおける高度に保存された核局在配列の存在は、これが新規の細胞質性L3リボソームタンパク質サブタイプを示し、そして核コードミトコンドリアタンパク質を示さないという仮説をさらに支持する。さらに、L3様遺伝子のテロメア側に位置する遺伝子由来のエキソントラップ（ Genbank受託番号L48792）が得られた（図１の転写物Ｍ）。転写物Ｍによりコードされる配列は、Neisseria gonorrhoeaeに由来するpilB（Tahaら、EMBO J.7:43 67-4378，1988）、ならびにコンピューターにより予測された、C.elegansに由来するコスミドF44E2.6によりコードされる17.2kDaタンパク質（Wilsonら、前出）に対して相同性を有することが示された。エキソントラップL48792由来の配列を用いて、600bpの部分的cDNAが単離され、そして対応遺伝子が動原体からテロメアへ指向されることが決定された。1.3k bのメッセージは、ノーザンブロットにおいてこのcDNAにより検出された。部分的cDNAと仮定17.2kDaタンパク質との間に保存される配列はまた、Neisseria gon orrhoeaeに由来するpilBタンパク質(Tahaら、前出）、酵母に由来する仮定的19. 3kDaタンパク質（Genbank受託番号P25566）、およびHaemophilusに由来する線毛転写調節リプレッサー（Fleischmannら、Science 269:496-512 1995）において保存された（図２）。pilBタンパク質は、ヒスチジンキナーゼセンサーに対して相同性を有し、そしてNeisseria gonorrhoeaeにおけるピリン産生の抑制において役割を果たすことが示された（Tahaら、前出、1988；Tahaら、Mol.Microbiol. 5:137-148，1991）。しかし、pilB、転写物Ｍ、ならびにC.elangans、酵母、およびHaemophilusの配列間で保存される残基は、pilBに由来する保存ヒスチジンキナーゼドメインを含まない（Tahaら、前出、1991）。これらの知見は、転写物Ｍにおける保存領域がpilBの提案されたヒスチジンキナーゼセンサー活性と独立した機能を有することを示唆する。 109.8Cクローンと47.2H P1クローンとの間の重複領域に由来するさらなるエキソントラップは、ヒトLLRep3配列（Slynnら、Nuc.Acids Res.18:681，1990）を含むことが示された。ハイブリダイゼーション研究は、LLRep3配列（図１の転写物Ｋ）がsazDとL3様遺伝子との間に位置することを示した。最も高い遺伝子密度の領域は、このクローニングされた間隔のテロメア末端、特に、TSC2とD16S84との間の領域にあるようであり、最低５つの遺伝子（転写単位Ｋ、Ｌ、およびＭ、 sazDおよびhERV1）がこの領域にマップする。以前に記載された肝臓再生のラット増大剤（Hagiyaら、Proc.Natl.Acad.Sci., USA 91:8142-8146，1994）に対してヌクレオチドレベルで86％の同一である（17 0/197）エキソントラップもまた、この領域にマップされた。ALRは、損傷した肝臓組織の増殖を増大させるが、休止している肝臓に対して効果がない増殖因子である。研究は、ラットALRが肝切除後に肝細胞再生を増大させ得ることを実証した。このALR様エキソントラップはまた、最近記載されたhERV1遺伝子（これは、酵母ERV1(Lisowskyら、前出)に対する機能的相同物をコードする）に由来する配列を含むことが示された。 468bpのcDNAであるhALRは、ヒトALR遺伝子から得られている（図13）。ALR配列は、ラットALRタンパク質に対して84.8％同一であり、そして94.1％類似する、119アミノ酸のタンパク質をコードする（図14）。ヒトALRのクローニングは、変性性肝臓疾患の処置に著しく関与する。例えば、生物学的に活性なラットALRは、ラットALR cDNAを発現するCOS-7細胞から産生されている（Hagiyaら、前出）。従って、組換えhALRは、損傷した肝臓の処置に使用され得た。さらに、hALRを発現する構築物は、慢性肝臓疾患を処置するための遺伝子治療において使用され得る。 43のトラップされたエキソンは、タンパク質またはDNAデータベースにおける配列に対して有意な相同性を有さず、dbESTにおいて観察されたエキソントラップに由来する配列を含むEST（発現配列タグ）でもなかった。これらの新規のエキソントラップに由来する配列を含むESTが存在しないことは、さらなる分析のためのエキソントラップを選択するための基準のうちの１つがこのデータベースにおけるESTの存在であったので、驚くべきことではない。これらのトラップされたエキソンは、真実の産物を示すようである。なぜなら、多くの場合、それらは、異なるP1クローンからおよび隣接エキソンとの組み合わせにおいて複数回トラップされたからである。本発明は、第16染色体に由来する独特のエキソン配列を含む単離された核酸である新規のヒト遺伝子を含む。本明細書中に記載された配列は、転写マッピングのための価値のある資源を提供し、そして少なくとも２つの遺伝性疾患の原因である遺伝子に富む間隔についての配列準備テンプレートのセットを作成する。従って、本発明は、ヒトネトリン(hNET)、ヒトATP結合カセット輸送体(hABC3) 、ヒトリボソームL3(RPL3L)、および肝臓再生のヒト増大剤（hALR）ポリペプチドをコードする、単離された核酸を提供する。本発明は、第16染色体に由来する独特のエキソン配列を含む単離された核酸をさらに提供する。用語「核酸」（ポリヌクレオチドとも呼ばれる）は、RNAならびに１本鎖および２本鎖DNA、cDNAならびにオリゴヌクレオチドを含む。本明細書中で使用する、句「単離された」は、天然に生じない形態のポリヌクレオチドを意味する。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するという１つの意味は、当該分野で周知の方法を用いてヒト組織特異的ライブラリーを天然または人工的に設計されたDNAプローブでプローブすることである。ヒトネトリン遺伝子（hNET）、ヒトABC輸送体遺伝子（hABC3）、ヒトリボソームタンパク質L3遺伝子（RPL3L）、または肝臓再生のヒト増大剤遺伝子（hALR）に由来するDNAプローブは、特にこの目的に有用である。本発明のポリペプチドをコードするDNAおよびcDNA分子を使用して、以下により詳細に記載される方法により、ヒト、哺乳動物、または他の動物供給源に由来する相補的ゲノムDNA、cDNA、またはRNAを得るか、あるいはcDNAまたはゲノムライブラリーのスクリーニングにより関連する cDNAクローンまたはゲノムクローンを単離し得る。本発明は、図３、４、８、11および15に示される配列に由来する単離された核酸配列（センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を含む）を含む。hN ET、hABC3、PRL3L(SEM L3)、およびhALRに由来する配列はまた、異種配列（プロモーター、エンハンサー、応答エレメント、シグナル配列、ポリアデニル化配列などを含む）と結合され得る。さらに、核酸は、安定性、可溶性、結合親和性、および特異性を変えるように改変され得る。例えば、本発明に由来する配列は、ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート、ホスホロアミデートおよびメチルホスホネート誘導体、ならびにNielsenら、Science，254:1497，1991に記載されるように塩基をアミノ酸骨格に共役させることにより形成される「タンパク質核酸(PNA )」をさらに含み得る。核酸は、α-アノマーヌクレオチドの連結によるか、あるいはメチルホスホトリエステルもしくはエチルホスホトリエステルまたはアルキルホスホールデート連結の形成により誘導体化され得る。さらに、本発明の核酸配列はまた、検出可能なシグナルを直接的または間接的のいずれかで提供し得る標識で改変され得る。例示的な標識は、放射性同位体、蛍光分子、ビオチンなどを含む。一般的に、本発明による核酸操作は、例えば、Sambrookら、Molecular Clonin g，A Laboratory Manual第２版(Cold Spring Harbor，NY，1989)またはAusubel ら、Current Protocols in Molecular Biology(Greene Assoc.,Wiley Interscie nce，NY，NY，1992)に開示されるような当該分野で周知の方法を使用する。核酸の例は、ヒトネトリン、ヒトABC輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドをコードするRNA、cDNA、またはゲノムDNAである。このような核酸は、それぞれ図３、４、８、11および15に示されるコード配列と実質的に同じコード配列を有し得る。本発明は、hNET、hABC3、PRL3L(以前はSEM L3)、hALR遺伝子内の、またはそれぞれのcDNA内の配列に対応する単離されたオリゴヌクレオチドをさらに提供し、これらは単独でまたは共に、真正の発現遺伝子と相同物または他の反復配列とを区別するために使用され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、長さが約12〜約 60ヌクレオチド、好ましくは約18ヌクレオチドであり得、１本鎖または２本鎖であり得、そして以下に記載のように標識または改変され得る。本発明はまた、図３、４、８、11および15に示される核酸と異なるが、同じ表現型を有する（すなわち、それぞれ図３、４、８、11および15に示される同じアミノ酸配列を実質的にコードする）核酸を含む。表現型的に類似した核酸はまた、「機能的に等価な核酸」と呼ばれる。本明細書中で使用する句「機能的に等価な核酸」は、本明細書中に開示される核酸と同じタンパク質産物（単数または複数）を生成する実質的に同じ様式で機能する、わずかでかつ重大でない配列変異により特徴付けられる核酸を含む。特に、機能的に等価な核酸は、本明細書中に開示されるかまたは保存的アミノ酸変異を有するタンパク質と同じタンパク質をコードする。例えば、保存的変異は、非極性残基の別の非極性残基での置換、または荷電残基の類似した荷電残基での置換を含む。これらの変異は、タンパク質の３次構造を実質的に変えない変異として当業者により認識される変異を含む。遺伝コードの縮重により特定のハイブリダイゼーション条件下で本発明の核酸に必ずしもハイブリダイズしない、ヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、および肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドをコードする核酸がさらに提供される。本発明のポリペプチドをコードする好ましい核酸は、図４、８、11および15に示される実質的に同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチドからなる。あるいは、本発明のポリペプチド（単数または複数）をコードする好ましい核酸は、高いストリンジェンシー条件下で、図３、４、８、11および15 にそれぞれ示される核酸配列の実質的に完全な配列または実質的な部分（すなわち、代表的には、少なくとも12〜60ヌクレオチド）にハイブリダイズする。本明細書中で使用するハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ポリヌクレオチドハイブリッドが安定な条件をいう。当業者には公知なように、ハイブリッドの安定性は、ナトリウムイオン濃度および温度の関数である（例えば、 Sambrookら、前出を参照のこと）。本発明は、RNA転写のプロモーターならびに他の調節配列に作動可能に連結された単離されたポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用する句「作動可能に連結された」は、ポリヌクレオチドとヌクレオチドの調節およびエフェクター配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳停止部位、ならびに他のシグナル配列）との機能的関係をいう。例えば、ポリヌクレオチドのプロモーターへの作動的連結は、DNA転写がプロモーターを特異的に認識および結合するRNAポリメラーゼによりプロモーターから開始され、そしてここでプロモーターがポリヌクレオチドからのRNAの転写を指向するような、ポリヌクレオチドとプロモーターとの間の物理的および機能的関係をいう。プロモーター領域は、RNAポリメラーゼ認識、結合、および転写開始に十分な特定の配列を含む。さらに、プロモーター領域は、RNAポリメラーゼの認識、結合、および転写開始活性を調節する配列を含む。このような配列は、シス作用し得るか、またはトランス作用因子に対して応答性であり得る。調節の性質に依存して、プロモーターは、構成的であり得か、または調節され得る。プロモーターの例は、SP6、T4、T7、SV40初期プロモーター、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（MMTV）ステロイド誘導性プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（MMLV）プロモーターなどである。ポリヌクレオチドが作動可能に連結され得る、プロモーターおよびクローニング部位の両方を含むベクターは、当該分野で周知である。このようなベクターは、インビトロおよびインビボでRNAを転写し得、そしてStratagene(La Jolla，CA )およびPromega Biotech(Madison，WI)のような供給源から市販されている。発現および／またはインビトロ転写を最適化するために、余分な、潜在的な、不適切な、代替の翻訳開始コドンまたは転写または翻訳レベルのいずれかで発現を妨害もしくは低減し得る他の配列を排除するために、クローンの5'および／または 3'非翻訳部分を除去するか、付加するか、または変えることは必要であり得る。あるいは、コンセンサスリボソーム結合部位は、発現を増強するために開始コドンのすぐ5'側に挿入され得る。同様に、同じアミノ酸をコードする代替コドンは、転写を増強するために、ヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドのコード配列の代わりに置換される（例えば、宿主細胞のコドン優先が採用され得、G-Cリッチドメインの存在が低減され得るなどである）。ベクターの例は、種々の真核生物および原核生物宿主における発現のために記載され、そして遺伝子治療ならびに単純なタンパク質発現のために使用され得る、当該分野で代表的に使用される、ウイルス（例えば、バキュロウイルスおよびレトロウイルス）、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、および他の組換えビヒクルである。ポリヌクレオチドは、当該分野で周知の方法を用いてベクターゲノムに挿入される。例えば、挿入物およびベクターDNAは、互いに対形成し、そしてリガーゼを用いて共に接合され得る、各分子上の相補的末端を作成するために、適切な条件下で制限酵素と接触され得る。あるいは、合成核酸リンカーは、制限酵素処理されたポリヌクレオチド末端に連結され得る。これらの合成リンカーは、ベクターDNA中の特定の制限部位に対応する核酸配列を含む。さらに、終止コドンおよび適切な制限部位を含むオリゴヌクレオチドは、挿入のために、例えば以下のいくつかまたは全てを含むベクターに連結され得る：選択マーカー遺伝子（例えば、哺乳動物細胞における安定または一過性トランスフェクタントの選択のためのネオマイシン遺伝子）；高レベル転写のためのヒトCMVの即時初期遺伝子に由来するエンハンサー配列／プロモーター配列；mRNA安定性のためのSV40に由来する転写終結およびRNAプロセシングシグナル；適切なエピソーム複製のためのSV40ポリオーマ複製起点およびColE1；多方面のマルチクローニングサイト；ならびにセンスおよびアンチセンスRNAのインビトロ転写のためのT7およびSP6 RNAプロモーター。他の手段は周知であり、そして当該分野で利用可能である。細菌細胞、酵母細胞、両生類細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、および他の動物細胞における発現用に適合した、ヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、および肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターもまた提供される。ベクターは、その発現を可能にするように、ヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関して位置する、細菌、酵母、両生類、哺乳動物、または動物細胞におけるポリヌクレオチドの発現に必要な調節エレメントをさらに含む。本明細書中で使用する「発現」は、ポリヌクレオチドがmRNAに転写され、そしてペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスをいう。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、発現は、適切な真核生物宿主が選択されるのであれば、mRNAのスプライシングを含み得る。発現に必要とされる調節エレメントは、RNAポリメラーゼを結合するプロモーター配列およびリボソーム結合のための転写開始配列を含む。例えば、細菌性発現ベクターは、lacプロモーターのようなプロモーターおよび転写開始のためのシャイン-ダルガノ配列および開始コドンAUGを含む（Sa mbrookら、前出）。同様に、真核生物発現ベクターは、RNAポリメラーゼIIの異種または同種プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンAUG、およびリボソームの分離のための終止コドンを含む。このようなベクターは、商業的に得られるか、または当該分野で周知の方法（例えば、一般的なベクターを構築するための上記の方法）において記載される配列により組み立てられ得る。発現ベクターは、本発明のレセプターを発現する細胞を生成するのに有用である。本発明は、ヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドを組換え的に発現する、形質転換宿主細胞を提供する。本発明の宿主細胞は、ヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換されている。例は、哺乳動物細胞における発現用に適合したプラスミドを含む哺乳動物細胞である。プラスミドは、ヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および本発明のタンパク質の発現に必要な調節エレメントを含む。適切な宿主細胞は、細菌、古細菌、真菌、特に酵母、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞、特に哺乳動物細胞を含む。E.coli、B.Subtilis、Saccharomyces cerevisiae、SF9細胞、C129細胞、293細胞、Neurospora、およびCHO細胞、COS細胞、HeLa細胞、ならびに不死化哺乳動物骨髄性およびリンパ性細胞株が特に興味深い。好ましい複製系は、M13、ColE1、SV40、バキュロウイルス、λ、アデノウイルス、人工染色体などを含む。多数の転写開始および終結調節領域が単離され、そして種々の宿主における異種タンパク質の転写および翻訳に効果的であることが示されている。これらの領域、単離方法、操作様式などの例は当該分野で公知である。適切な発現条件下で、宿主細胞は、組換え生成されるhNET、hABC3、R PL 3L（以前はSEM L3）、および／またはhALRの供給源として使用され得る。本発明のポリペプチドをコードする核酸（ポリヌクレオチド）はまた、組換え事象によりレシピエント細胞のゲノムに取り込まれ得る。例えば、このような配列は細胞にマイクロインジェクションされ、それによりhNET、hABC3、RPL3L（以前はSEM L3）、および／またはhALRをコードする内因性遺伝子、そのアナログまたは偽遺伝子、あるいはhNET、hABC3、RPL3L（SEM L3）、またはhALRコード遺伝子に対して実質的な同一性を有する配列の部位での相同組換えをもたらし得る。他の組換えに基づく方法（例えば、非相同的組換え）または特に、多能性細胞における相同組換えによる内因性遺伝子の欠失もまた使用され得る。本発明は、本発明の核酸によりコードされる単離されたペプチド、ポリペプチド（単数または複数）、および／またはタンパク質（単数または複数）を提供する。本発明はまた、hNET、hABC3、RPL3L（SEM L3）、およびhALR遺伝子によりコードされる配列を有する単離されたポリペプチド、ならびにそれらに由来する６以上のアミノ酸のペプチドを含む。ポリペプチド（単数または複数）は、生検または剖検により得られたヒト組織から単離され得るか、または本明細書中に記載される組換えDNA方法により異種細胞において産生され得る。本明細書中で使用する用語「単離された」は、細胞成分および／または天然のインビボ臭境と通常関連する夾雑物を含まないタンパク質分子を意味する。本発明のポリペプチドおよび／またはタンパク質は、任意の天然に生じる対立遺伝子変異体ならびにその組換え形態を含む。本発明のポリペプチドは、当業者に周知の種々の方法を用いて単離され得る。本発明のタンパク質の単離および精製に利用可能な方法は、沈殿、ゲル濾過、およびクロマトグラフィー方法（分子ふるい、イオン交換、および例えば、hNET 、hABC3、RPL3L（SEM L3）、および／またはhALR特異的抗体もしくはリガンドを用いたアフィニティクロマトグラフィーを含む）を含む。他の周知の方法は、De utscherら、Guide to Protein Purification:Methods in Enzymology第182巻（A cademic Press，1990）に記載される。精製される本発明のポリペプチドが組換え系において生成される場合、組換え発現ベクターは、付加的アミノ末端またはカルボキシ末端アミノ酸をコードする付加的配列を含み得；これらの余分なアミノ酸は、固定化抗体を用いたイムノアフィニティー精製または固定化リガンドを用いたアフィニティー精製のための「タグ」として働く。 hNET、hABC3、RPL3L（SEM L3）、またはhALR特異的配列を含むペプチドは、タンパク質分解切断を用いた（例えば、当該分野で周知のトリプシンのようなプロテアーゼおよび臭化シアンのような化学的処理により）、上記の単離された大きなhNET、hABC3、RPL3L（SEM L3）、またはhALRポリペプチドに由来し得る。あるいは、長さが60残基までのペプチドは、市販のペプチド合成機を用いてミリグラム量で日常的に合成され得る。本発明のポリペプチド（単数または複数）を調製するための手段の例は、当該分野で周知の方法を用いて適切な宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母細胞、両生類細胞（すなわち、卵母細胞）、昆虫細胞（すなわち、Drosophila）、または哺乳動物細胞）において、hNET、hABC3、RPL3L（SEM L3）、および／またはhALRをコードするポリヌクレオチドを発現し、そして周知の方法を再度用いて発現されたポリペプチドを回収することである。本発明のポリペプチドは、以下に詳細に記載される発現ベクターで形質転換された細胞から直接単離され得る。本発明のポリペプチド、生物学的に活性なフラグメント、およびその機能的等価物はまた、化学合成により生成され得る。本明細書中で使用する「生物学的に活性なフラグメント」は、活性タンパク質に組み立て得る、図４、８、11、および15におけるアミノ酸配列により示されるポリペプチドの任意の部分をいう。合成ポリペプチドは、製造者により提供される化学を使用するApplied Biosystems，Inc.モデル430Aまたは431A自動ペプチド合成機（Foster City，CA）を用いて生成され得る。以下の句：「組換え的に発現された／生成された」、「単離された」、または「実質的に純粋な」を有する、本発明の核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質の改変は、人の手によりこのような形態に生成され、従ってそれらの天然のインビボ細胞環境から分離されている、核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質を含む。この人の介入の結果として、本発明の組換え核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質は、対応する天然に生じる分子が選択性薬物または化合物の同定のように有用でない点で有用である。「実質的な配列相同性」を有する配列は、本発明の核酸と少なくとも約90％の同一性を共有するヌクレオチド配列；および本発明のポリペプチドと少なくとも約95％のアミノ酸同一性を代表的に共有するアミノ酸配列、をいうことが意図される。しかし、スプライス変異体として生じる上記のレベル未満の相同性を含むか、または保存的アミノ酸置換により、もしくは縮重コドンの置換により改変されるポリペプチドまたは核酸もまた、本発明の範囲内に含まれることが認識される。本発明は、ヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドをコードする核酸配列内に含まれる配列（例えば、図３、４、８、11、および15にそれぞれ示されるヌクレオチド配列内に含まれるコード配列）と特異的にハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを含む核酸プローブを提供する。本明細書中で使用する「核酸プローブ」は、図３、４、８、11、および15に示される約12〜約60の隣接塩基、好ましくは約18ヌクレオチドを含み、１本鎖または２本鎖であり得、そして本明細書中に記載されるように標識または改変され得るヌクレオチド配列であり得る。構築プローブが由来する好ましい領域は、5'および／または3'コード配列、膜貫通ドメインをコードすると予測される配列、細胞質ループをコードすると予測される配列、シグナル配列、リガンド結合部位などを含む。 cDNAクローンの完全長またはフラグメントはまた、関連遺伝子の検出および単離のためのプローブとして使用され得る。フラグメントがプローブとして使用される場合、好ましくはcDNA配列は、cDNAのカルボキシ末端コード部分に由来し、最も好ましくはcDNA配列の予測された膜貫通ドメインコード部分を含む。膜貫通ドメイン領域は、例えば、KyteおよびDoolittle(J.Mol.Biol.157:105，1982)の方法を用いた推定アミノ酸配列の疎水性親水性指標分析に基づいて予測され得る。本明細書中で使用する句「特異的にハイブリダイズする」は、ポリヌクレオチドが、それに相補的な核酸配列を認識し、そして相補的塩基対間の水素結合を介して二重らせんセグメントを形成する能力を含む。核酸プローブ技術は、当業者に周知であり、そして当業者は、このようなプローブが長さにおいて非常に変化し得、そしてプローブの検出を容易にするために検出可能な薬剤（例えば、放射性同位体、蛍光色素など）で標識され得ることを容易に認識する。本発明のプローブは、ヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドをコードする核酸の存在を検出するのに有用である。例えば、プローブは、本発明の遺伝子が発現される生物学的組織を位置付けるためのインサイチュハイブリダイゼーションのために使用され得る。さらに、ヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸に相補的な合成されたオリゴヌクレオチドは、本発明の遺伝子、それらの関連するmRNAを検出するための、またはゲノムもしくはcDNAライブラリーの相同性スクリーニングを用いた関連遺伝子の単離のための、または当業者に周知の増幅技術を用いることによるプローブとして有用である。ヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドをコードするmRNAの任意の部分と特異的に結合して、mRNAの翻訳を妨げ得る配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドをコードするcDNA配列の任意の部分と特異的に結合し得る配列を有し得る。本明細書中で使用する句「特異的に結合する」は、核酸配列が相補的核酸配列を認識し、そして相補的塩基対間で水素結合を介してそれと二重らせんセグメントを形成する能力を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、ヌクレオチドの化学的アナログを含むアンチ七ンスオリゴヌクレオチド（すなわち、合成アンチセンスオリゴヌクレオチド、SAO）である。細胞膜を通過させ、そしてヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3 サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドをコードするmRNAと特異的に結合させて、その翻訳および細胞膜を通過し得る受容可能な疎水性キャリアを妨げることにより、ヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、またはヒト増大剤ポリペプチドの発現を低減させるのに有効な、アンチセンスオリゴヌクレオチド（SAOC）の量を含む組成物もまた、本明細書中で提供される。細胞膜を通過し得る受容可能な疎水性キャリアはまた、選択された細胞型に特異的なレセプターに結合し、そしてそれにより選択された細胞型の細胞により吸収される構造を含み得る。この構造は、細胞型特異的レセプターに結合することが知られているタンパク質の一部であり得る。本発明は、これらのポリペプチドをコードするmRNAの翻訳を阻害する、合成アンチセンスオリゴヌクレオチド組成物（SAOC）の使用により本発明のポリペプチドの発現レベルを調節する手段を提供する。mRNAを認識し、そして特異的に結合するように設計された、合成オリゴヌクレオチドまたは他のアンチセンス化学構造は、DNA、RNA、または化学的に改変された人工核酸の、図３、４、８、11、および15に示されるヌクレオチド配列の部分に相補的であるように構築される。SA OCは、注射による被験体への投与のために血流において、または研究室での細胞培養条件において安定であるように設計される。SAOCは、細胞膜を通過させ得る SAOCの物理的および化学的特性により（例えば、小さな疎水性SAOC化学構造を設計することにより）、またはSAOCを認識しこれを細胞に輸送する細胞の特異的輸送系により、細胞膜を通過して、細胞の細胞質に進入し得るように設計される。さらに、SAOCは、選択された細胞集団内のみでSAOCを結合および吸収する特異的細胞取り込み機構により認識されるようにSAOCを標的化することにより、特定の選択された細胞集団のみへの投与のために設計され得る。例えば、SAOCは、前出で議論されるような特定の細胞型のみに見出されるレセプターに結合するように設計され得る。SAOCはまた、標的mRNA配列を認識し、そして選択的に結合するように設計され、これは図３、４、８、11および15に示される配列内に含まれる配列に対応し得る。SAOCは、標的mRNAに結合し、mRNAの分解（例えば、RNaseI消化により）を誘導するか、あるいは翻訳調節因子もしくはリボソームの結合の妨害、または標的mRNAを分解もしくは化学的に修飾するかのいずれかの他の化学構造（例えば、リボザイム配列もしくは反応性化学基）の含有によりmRNA標的の翻訳を阻害するかのいずれかにより標的mRNA配列を不活化するように設計される。 SAOCは、mRNA標的に対して指向される場合、このような特性が可能であることが示されている（Cohenら、TIPS，10:435，1989およびWeintraub，Sci.American， January 40頁、1990を参照のこと）。本発明は、受容可能なキャリアならびに単離された精製ヒトネトリン、ヒトAB C3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチド、その活性フラグメント、または精製された成熟タンパク質およびその活性フラグメント、単独または互いの組み合わせを含む組成物をさらに提供する。これらのポリペプチドまたはタンパク質は、組換え的に得られるか、化学的に合成されるか、または天然供給源から精製され得る。本明細書中で使用する用語「受容可能なキャリア」は、標準的な薬学的キャリア（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水溶液、水、およびエマルジョン（例えば、油／水または水／油エマルジョン）、および種々の型の湿潤剤）のいずれかを含む。本発明のヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドと特異的反応性を有する抗体もまた提供される。抗体の活性フラグメントは、「抗体」の定義内に含まれる。本発明の抗体は、抗原として本発明のタンパク質またはその部分を用いて当該分野で公知の方法により生成され得る。例えば、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体は、例えば、HarlowおよびLane、Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Har bor Laboratory 1988)に記載されるように、当該分野で周知の方法により生成され得る。本発明のポリペプチドは、このような抗体の作製における免疫原として使用され得る。あるいは、合成ペプチドは（市販の合成機を用いて）調製され、そして免疫原として使用され得る。天然または合成のhNET、hABC3、RPL3L(SEM L3)、および／またはhALRに由来するペプチドを使用して、hNET、hABC3、RPL3L(SEM L3) 、および／またはhALR特異的免疫応答を誘導する場合、このペプチドは適切なキャリア（例えば、KLH）に簡便に結合され、そして適切なアジュバント（例えば、フロイントのアジュバント）において投与され得る。好ましくは、選択されたペプチドは、Tam，Proc.Natl.Acad.Sci,USA．85:5409-5413，1988の方法に実質的に従ってリジンコアキャリアに結合される。得られた抗体は、一価形態（例えば、Fab、Fab₂、FAB'、FV）に改変され得る。抗イディオタイプ抗体もまた、公知の方法を用いて調製され得る。１つの実施態様において、正常または変異hNET、hABC3、RPL3L(SEM L3)、またはhALRポリペプチドは、マウスを免疫し、この後それらの脾臓を取り出し、そして脾細胞を使用して、当該分野で標準的な技術に従ってミエローマ細胞との細胞ハイブリッドを形成し、そして抗体分泌細胞のクローンを得るために使用される。得られたモノクローナル抗体は、hNET、hABC3、RPL3L(SEM L3)、および／またはhALRタンパク質あるいはhNET、hABC3、RPL3L(SEM L3)、および／またはhALR関連ペプチドへの特異的な結合についてスクリーニングされる。別の実施態様において、抗体は、正常または変異hNET、hABC3、RPL3L(SEM L3) 、またはhALR配列への選択的な結合についてスクリーニングされる。hNET、hABC 3、RPL3L(SEM L3)、またはhALRの正常形態と変異形態とを区別する抗体は、ELIS A、EMIT、CEDIA、SLIFAなどを使用する診断試験（以下を参照のこと）において使用され得る。抗hNET、hABC3、RPL3L(SEM L3)、またはhALR抗体はまた、亜細胞および組織化学的局在研究を行うために使用され得る。最後に、抗体は、正常または変異のいずれでも、hNET、hABC3、RPL3L(SEM L3)、および／またはhALRポリペプチドの機能をブロックするか、あるいは合理的薬物設計研究を行って、（例えば、抗イディオタイプ抗体アプローチを用いて）インヒビター機能を同定および試験するために使用され得る。アミノ酸配列は、それらが対応するポリペプチドの疎水性または親水性ドメインをコードするか否かを決定するために当該分野で周知の方法により分析され得る。変化された抗体（例えば、キメラ、ヒト化、CDR接合、または二機能性抗体）もまた、当該分野で周知の方法により生成され得る。このような抗体はまた、例えば、Sambrookら、前出ならびにHarlowおよびLane、前出に記載されるハイブリドーマ、化学合成、または組換え法により生成され得る。抗ペプチドおよび抗融合タンパク質抗体の両方が使用され得る（例えば、Bahouthら、Trends Pharma col.Sci.12:338，1991；Ausubelら、前出を参照のこと）。本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを単離するために使用され得る。従って、抗体は、本発明のポリペプチドの存在の検出、ならびにポリペプチドの局在、組成、および機能ドメインの構造の分析に有用である。ヒトネトリン、ヒトAB C3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドの存在を検出するための方法は、抗体のポリペプチドへの結合を可能にする条件下で細胞とポリペプチドに特異的に結合する抗体とを接触させる工程、細胞に結合した抗体の存在を検出する工程、およびそれにより細胞における本発明のポリペプチドの存在を検出する工程を包含する。このようなポリペプチドの検出に関して、抗体は、インビトロ診断またはインビボ画像化方法に使用され得る。サンプル中の標的ヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドのインビトロ検出に有用な免疫学的手順は、検出可能な抗体を使用するイムノアッセイを含む。このようなイムノアッセイは、当該分野で周知の、例えば、ELISA、Pandex微量蛍光測定アッセイ、凝集アッセイ、フローサイトメトリー、血清診断アッセイ、および免疫組織化学的染色手順を含む。抗体は、当該分野で周知の種々の手段により検出可能にされ得る。例えば、検出可能なマーカーは、抗体に直接的または間接的に結合され得る。有用なマーカーは、例えば、放射性核種、酵素、蛍光原(fluorogen)、色素原、および化学発光標識を含む。インビボ画像化方法について、検出可能な抗体は被験体に投与され得、そして抗体の本発明のポリペプチドへの結合は、当該分野で周知の画像化技術により検出され得る。適切な画像化剤は公知であり、そして例えば、米国特許第4,647,44 7号に記載される、γ線放射放射性核種（例えば、¹¹¹In、^99mTc、⁵¹Crなど）ならびに常磁性金属イオンを含む。放射性核種は、γ線シンチレーション光度測定、陽電子放射断層撮影法、単一光子放射型コンピューター断層撮影法、およびγ 線カメラ全身画像化により組織画像化を可能にするが、一方常磁性金属イオンは磁気共鳴画像化による視覚化を可能にする。本発明は、ヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドをコードする核酸を発現し得るトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。正常活性が不可能である（すなわち、天然タンパク質を発現しない）ように変異された、ヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドをコードする核酸を発現し得るトランスジェニック非ヒト哺乳動物もまた提供される。本発明はまた、ヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドをコードするmRNAに相補的なアンチセンスmRNA（これは、mRNAにハイブリダイズし、それによりその翻訳を低減する）に転写されるように配置された、ヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドをコードする核酸に相補的なアンチセンス核酸を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。ポリヌクレオチドは、発現が誘導されるか、または特定の細胞型に制限され得るように、誘導性プロモーターおよび／または組織特異的調節エレメントをさらに含み得る。ポリヌクレオチドの例は、図３、４、８、11、および15に示されるコード配列と実質的に同じコード配列を有するDNAまたはcDNA である。非ヒトトランスジェニック哺乳動物の例は、トランスジェニックウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウサギ、ラット、およびマウスである。組織特異性決定エレメントの例は、メタロチオネインプロモーターおよびT7プロモーターである。本発明のポリペプチドの生理学的および行動的役割を解明する動物モデル系は、ポリペプチド発現が種々の技術を用いて変えられるトランスジェニック動物の作成により作製される。このような技術の例は、トランスジェニック動物を作製するための、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染、または当業者に周知の他の手段による、適切な受精胚へのヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドをコードする核酸の正常または変異バージョンの挿入を含む。例えば、Carverら、Bio/Techno logy 11:1263-1270，1993；Carvcrら、Cytotechnology 9:77-84，1992；Clarkら、Bio/Technology 7:487-492，1989；Simonsら、Bio/Technology 6:179-183，19 88；Swanson，Bio/Technology 10:557-559，1992；Velanderら、Proc.Natl.Acad .Sci.,USA 89:12003-12007，1992；Hammerら、Nature 315:680-683，1985；Krim penfortら、Bio/Technology 9:844-847，1991；Ebertら、Bio/Technology 9:835 -838，1991；Simonsら、Nature 328:530-532，1987；Pittiusら、Proc.Natl.Aca d.Sci.,USA 85:5874-5878，1988；Greenbergら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 88:8 327-8331，1991；Whitelawら、Transg.Res.1:3-13，1991；Gordonら、Bio/Techn ology 5:1183-1187，1987；Grosveldら、Cell 51:975-985，1987；Brinsterら、 Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 88:478-482．1991；Brinsterら、Proc.Natl.Acad.Sci .,USA 85:836-840，1988；Brinstcrら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 82:4438-4442 ，1985；A1-Shawiら、Mol.Cell.Biol.10(3):1192-1198，1990；Van Der Putten ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 82:6148-6152，1985；Thompsonら、Cell 56:313- 321，1989；Gordonら、Science 214:1244-1246，1981；およびHoganら、Manipul ating the Mouce Embryo:A Laboratry Manual(Cold Spring Harbor Laboratory ，1986)を参照のこと。別の技術、トランスジェニック動物においてこれらの遺伝子の変異または正常バージョンと天然の遺伝子座との相同組換えは、本発明のポリペプチドの発現調節または構造を変えるために使用され得る（Capecchiら、Science244:1288，198 9；Zimmerら、Nature 338:150，1989を参照のこと）。相同組換え技術は、当該分野で周知である。相同組換えは、天然（内因性）遺伝子を組換え遺伝子または変異遺伝子と置換して、天然（内因性）タンパク質を発現し得ないが、例えば、ヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドの変化した発現を生じる変異タンパク質を発現し得る動物を作製する。相同組換えとは対照的に、マイクロインジェクションは、宿主遺伝子を除去することなく宿主ゲノムに遺伝子を付加する。マイクロインジェクションは、内因性および外因性両方のヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドを発現し得るトランスジェニック動物を作製し得る。誘導性プロモーターは、トランスジーンの発現を調節するための手段を提供するために核酸のコード領域に連結され得る。組織特異的調節エレメントは、トランスジーンの組織特異的発現を可能にするためにコード領域に連結され得る。トランスジェニック動物モデル系は、ポリペプチド応答を活性化または阻害するリガンド（すなわち、アゴニストおよびアンタゴニスト）の同定のための化合物のインビボスクリーニングに有用である。本発明の核酸、オリゴヌクレオチド（アンチセンスを含む）、それを含むベクター、形質転換宿主細胞、ポリペプチド、ならびに抗体は、インビトロで化合物をスクリーニングして、化合物が本発明のタンパク質に対する潜在的なアゴニストまたはアンタゴニストとして機能するか否かを決定するために使用され得る。これらのインビトロスクリーニングアッセイは、本発明のタンパク質の機能および活性に関する情報を提供し、これは本発明のタンパク質との特異的な相互作用が可能な化合物の同定および設計を導き得る。本発明のさらに別の実施態様によれば、ヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドに結合する化合物を同定するための方法が提供される。本発明のタンパク質は、競合的結合アッセイにおいて使用され得る。このようなアッセイは、多数の化合物の迅速なスクリーニングに適合し、どの化合物が本発明のポリペプチドに結合し得るかを、いくらかでもあれば、決定し得る。その後、より詳細なアッセイは、このような化合物が本発明のポリペプチドのモジュレーター、アゴニスト、またはアンタゴニストとして作用するか否かをさらに決定するために、結合することが見出されたそれらの化合物を用いて行われ得る。本発明の別の実施態様によれば、本発明のポリペプチドを組換え的に発現する形質転換宿主細胞は試験化合物と接触され得、次いで、その調節効果は、試験化合物の存在下および非存在下でのヒトネトリン、ヒトABC3輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチド媒介応答を比較することにより、あるいは試験細胞またはコントロール細胞（すなわち、本発明のポリペプチドを発現しない細胞）の化合物の存在に対する応答を比較することにより評価され得る。本明細書中で使用する、本発明のポリペプチドの「活性を調節する」化合物またはシグナルは、本発明のポリペプチドの活性が化合物またはシグナルの非存在下より化合物またはシグナルの存在下で異なるように、ヒトネトリン、ヒトABC3 輸送体、ヒトリボソームL3サブタイプ、または肝臓再生のヒト増大剤ポリペプチドの活性を変える化合物またはシグナルをいう。特に、このような化合物またはシグナルは、アゴニストおよびアンタゴニストを含む。アゴニストは、ポリペプチド機能を活性化する化合物またはシグナルを含む。あるいは、アンタゴニストは、ポリペプチド機能を妨げる化合物またはシグナルを含む。代表的には、アンタゴニストの効果は、アゴニスト誘導タンパク質活性化のブロッキングとして観察される。アンタゴニストは、競合的および非競合的アンタゴニストを含む。競合的アンタゴニスト（または競合的ブロッカー）は、アゴニスト結合に特異的な部位でまたはその近くで相互作用する。非競合的アンタゴニストまたはブロッカーは、アゴニスト相互作用部位以外の部位で相互作用することにより、ポリペプチドの機能を不活化する。以下の実施例は、本発明の範囲を制限することなく本発明を例示することが意図される。実施例Ｉ：コンティグ組み立てＡ．コスミド複数のコスミドを、YACおよびP1ライブラリーにおける歩行を開始するための試薬として使用した。クローン16-166N（D16S277）、16-191N(D16S279)、16-198 N(D16S280)、および16-140N(D16S276)を、コスミドライブラリーから以前に単離した（Lernerら、Mamm.Genome 3:92-100，1992）。コスミドcCMM65(D16S84)、c2 91(D16S291)、cAJ42(ATP6C)、およびcKG8を、プローブとしてクローニング挿入物（CMM65）または配列特異的オリゴヌクレオチドのいずれかで用いて、総ヒトコスミドライブラリー（社内で作られたかまたはStratagene，La Jolla，CAによる）から回収した。c326コスミドコンティグおよびクローン413C12は、フロー選別（flow-sorted）第16染色体ライブラリーから生じた（Stallingsら、Genomics 13(4):1031-1039，1992）。c326コンティグは、クローン2H2、77E8、325A11、および325B10からなった。Ｂ．YAC コスミド特異的IRSプローブでのグリッド化（gridded）散在性反復配列(Mark I、Mark II、およびMega-YACライブラリー由来のIRSプール)のスクリーニングは、以前に記載された（Liuら、Genomics 26:178-191，1995）とおりであった。IR Sプローブをコスミド16-166N、16-191N、cAJ42、16-198N、325A11、cCMM65、および16-140Nから作った。ビオチン化YACプローブを、各YACに由来するIRS産物のニック翻訳(nick-translating)複合体混合物により作製した。十分な複雑度の混合物は、種々のAluプライマーを用いた全酵母DNAの独立したDNA増幅を行い（Lic hterら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 87:6634-6638，1990）、次いで最も多様な産物を含む適切な反応物を組み合せることにより達成した。Ｃ．P1 染色体歩行実験を、グリッド化P1ライブラリープールを含む単一セットのメンブレンを用いて行った（Shepherdら、前出、1994）。グリッド化フィルターは、 Dr.Mark Leppertおよびユタ大学the Utah Center for Human Genome Researchの the Technology Access Sectionにより親切に提供された。P1グリッド化メンブレンを、１セットの第16染色体コスミド（上記を参照のこと）およびそれらが同定されたようなP1クローンに由来する末端プローブを用いてスクリーニングした。RNA転写物およびバブル-PCR産物の両方を、末端プローブとして利用した。Ｄ．プローブ放射性標識転写物を、ファージRNAポリメラーゼT3、T7、およびSP6に対するテンプレートとして制限酵素消化コスミドまたはP1（AluI、HaeIII、RsaI、TaqI）を用いて作製した。T3およびT7プロモーターエレメントは、コスミド由来テンプレートに存在したが、一方T7およびSP6プロモーター配列は、P1に基づくテンプレートに含まれた。転写反応を、[αP³²]-ATP(Amersham，Arlington Heights，I L)の存在下で製造者（Stratagene，La Jolla，CA）により推奨されるように行った。バブル-PCR産物を、制限酵素消化P1(AluI、HaeIII、RsaI、TaqI)から合成した。適切な突出およびリン酸化5'末端を有するバブルアダプターを、本質的にYAC について記載されるように（Rileyら、Nuc.Acids Res.18:2887-2890，1990）、消化P1 DNAに連結した。バブルアダプター配列に由来するユニバーサルベクトレット(vectorette)プライマーの配列は、5'-GTTCGTACGAGAATCGCT-3'（配列番号67 ）であり、そして12のより少ない5'ヌクレオチドを有するRileyおよび協力者のものとは異なった。短縮されたベクトレットプライマーのTmは、ベクターに由来するプロモーター配列(SP6、T7)に由来する対形成アンプリマー（amplimer）のそれとより密接にマッチした。所望のバブル-PCR産物を、放射性標識前にゲル精製した（Feinbergら、Anal.Biochem.132:6-13，1983；FeinbergおよびVogelstei n、Anal.Biochem.137:266-267，1984）。全ての末端プローブの特異性を、単一セットのグリッド化P1フィルター配列上でのそれらの使用前に決定した。放射性標識プローブを、推奨されるように（Li fe Tcchnologies Inc.,Gaithersburg，MD）Cot1 DNAに予めアニールし、次いで1 0〜20ngの以下の各DNA：プローブを作成するために使用されたクローニングされたゲノムテンプレート；１つ以上の非関連のクローニングされたゲノムDNA；クローニングされたベクター（挿入物なし）；およびヒトゲノムDNAが結合した、ナイロンメンブレンの小片にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションを、CAK溶液（５×SSPE、１％SDS、５×デンハルト溶液、100mg/mLのトルラRNA）中で65℃で一晩行った。個々の末端プローブは、５ ×10⁵cpm/mLの濃度で存在した。ハイブリダイズされたメンブレンを、0.1×SSC/ 0.1％SDSの最終ストリンジェンシーまで65℃で洗浄した。ハイブリダイゼーション結果は、オートラジオグラフィーにより視覚化された。それらのそれぞれのクローニングされたテンプレートに強固にハイブリダイズされたが、一方非関連のクローニングされたDNA、ベクターDNA、またはゲノムDNAにハイブリダイズしないプローブを同定し、そしてこれを使用してグリッド化P1フィルターをスクリーニングした。配列されたP1プールに対するハイブリダイセーションを、複数のプローブが同時に使用されたことを除いて、ナイロンメンブレン小片について記載（上記）されたように行った。陽性クローンを同定し、100mmプレート（LB＋25mg/mLカナマイシン）あたり200〜500cfuの密度でプレートし、82mm HATFメンブレン(Millipo re，Bedford，MA)に釣り上げ、ハイブリダイゼーションのために処理し（Sambro okら、前出）、次いで複合体プローブ混合物で再スクリーニングした。各プール由来の単一の陽性クローンを選択し、そしてマスタープレートに再度プレートした。コロニー精製されたゲノムP1クローンおよびその対応するプローブを同定するために、複数のP1 DNAドットブロットを調製し、そして個々の放射性標識プローブにそれぞれハイブリダイズさせた。全てのハイブリダイゼーションは、染色体16p13.3参照プローブ（例えば、cAJ42）ならびに独自に標識された P1 DNAプローブを含んだ。実施例II：エキソントラッピングゲノムP1クローンを、PstIでの消化、BamHI/BglIIでの二重消化、または限定量のSau3AIでの部分的消化によりエキソントラッピング実験のために調製した。消化されたP1DNAをBamHI切断し、そして脱リン酸化したベクター、pSPL3Bに連結したが、一方PstI消化P1 DNAをPstI切断した脱リン酸化ベクター、pSPL3Bにサブクローニングした。連結を、50ngのベクターDNAおよび消化P1 DNAの１、３、または６質量等価物を用いて３連で行った。形質転換を、一晩の16℃でのインキュベーション後に行い、形質転換物の1/10および1/2をLB（アンピシリン）プレートにプレートした。37℃で一晩の増殖後、コロニーを、最も高い形質転換効率（「挿入物なし」連結コントロールとの比較に基づいて）を有するプレートをこそぎ、そしてアルカリ溶解法を用いてミニプレップした。挿入物を含むpSPL3Bの比率を調べるために、ミニプレップの小部分をHindIII（これはマルチクローニングサイトの各側でp SpL3Bを切断する）で消化した。実施例III：RNA調製約10μgの残存ミニプレップDNAをエタノール沈殿し、100μlの滅菌PBSに再懸濁し、そしてBioRad GenePulserエレクトロポレーターを用いて約２×10⁶個のCO S-7細胞（0.7mlの氷冷PBS中）にエレクトロポレーションした（1.2kV、25μFおよび200Ω）。エレクトロポレーションされた細胞を、氷上で10分間インキュベートした後、10mlの予め暖めた完全DMEMを含む100mm組織培養ディッシュへそれらを添加した。細胞質RNAを、トランスフェクションの48時間後に単離した。トランスフェクトされたCOS-7細胞を、0.25％トリプシン/１mM EDTA(Life Technologies Inc.,G aithersburg，MD)を用いて組織培養ディッシュから取り出した。トリプシン処理細胞をDMEM/10％FCSで洗浄し、そして１μlのRNAsin(Promega，Madison，WI)を補充した400μlの氷冷TKM（10mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM KCl、１mM MgCl₂）に再懸濁した。20μlの10％Triton X-100を添加した後、細胞を氷上で５分間インキュベートした。核を、４℃で５分間l200rpmでの遠心分離により除去した。30 マイクロリットルの５％SDSを上清に添加し、細胞質RNAをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール(24:24:1)を用いた３回の抽出によりさらに精製した。細胞質RNAをエタノール沈殿させ、そして50μlのH₂Oに再懸濁した。逆転写およびPCRを、市販のエキソントラッピングオリゴヌクレオチド（LifeT echnologies Inc.,Gaithersburg，MD）を用いて記載されたように（Churchら、前出、1994）、上記で調製した細胞質RNAで行った。得られたCUA尾部化(tailed) 産物を、製造者（Life Technologies Inc.,）により推奨されるようにpAMP10にショットガンサブクローニングした。各連結由来のランダムクローンを、２次PC Rプライマー（Life Technologies Inc.,）を用いたコロニーPCRにより分析した。 pAMP10/エキソントラップを含むミニプレップDNAを、製造者の説明書に従って EasyPrep集合体またはQIAwell８システム（それぞれ、Pharmacia，Pistcataway ，NJおよびQiagen Inc.,Chatsworth，CA）を用いたアルカリ溶解により一晩培養物から調製した。トラップされたエキソンを含むDNA産物を、177bpの「ベクターのみ」のDNA産物との比較に基づいて、配列決定のために選択した。実施例IV：配列決定 DNA配列決定を、Pharmacia ALFおよびApplied Biosystems 377PRISM自動化DNA シーケンサー（Piscataway，NJおよびFoster City，CA）を用いて行った。DNA配列をSequencher DNA分析ソフトウェア（Genecodes，Ann Arbor，MI）を用いて整列した。DNAおよびタンパク質データベース検索を、BLASTN(Altschulら、J.Mol. Biol.215:403-410，1990)およびBLASTX(Altschulら、前出、1990；Gishら、Nat. Genet.3266-272，1993)プログラムを用いて行った。SASE配列を、BLAST(Alts ch ulら、前出、1990；Gishら、前出、1993)およびFASTA(Lipmanら、Science 227:1 435-1441，1985)検索を処理することにより分析した。タンパク質配列を、MacVe ctor(Oxford Molecular Group，Cambell，CA)、BCM Launcher(Smithら、Genome Research 6:454-462，1996)、ClustalW(Thompsonら、Nucleic Acids Res.22:467 3-4680，1994)、およびPSORT(Nakniら、Genomics 14:897-911，1992)を用いて分析した。実施例Ｖ：RT-PCR、RACE、SASE、およびcDNA単離（上記で）決定された配列に基づいて、２つのオリゴヌクレオチドプライマー（表II）を、Oligo4.0(National Bioscienccs Inc.,Plymouth，MN)を用いて各エキソントラップのために設計した。どの組織特異的ライブラリーを転写物またはcDNAについてスクリーニングすべきか決定するために、RT-PCR反応および／またはPCR反応を、各エキソントラップのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（上記）を用いて、異なる組織由来RNAおよび／またはcDNAライブラリーをそれぞれテンプレートとして用いて行った。次いで、エキソンから設計したオリゴヌクレオチド（表II）を、１つ以上の以下の陽性選択フォーマットにおいて使用して、対応する組織特異的cDNAライブラリーをスクリーニングした。 RT-PCR実験について、第１のオリゴヌクレオチドをセンスプライマーとして使用し、そして第２のオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーとして使用した。RT-PCRを、成人脳および胎盤由来のポリA⁺RNAを用いて記載されたように（K awasaki、In PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications，Innisら編、Academic Press，San Diego，CA，21-27頁、1990)行った。全てのPCR産物を、製造者(Promega，Madison，WI)により記載されるようにpGEM-Tベクターを用いてクローニングした。配列を選択されたエキソントラップの3'側にクローニングするために、cDNA末端の迅速な増幅（RACE）を、記載されるように（Frohman，PCR Met.Appl.4:S40- S58，1994）行った。3'RACE実験において、第１のオリゴヌクレオチドを、外部プライマーとして使用し、そして第２のオリゴヌクレオチドを内部プライマーとして使用した。 Genetrapper cDNA陽性選択システムのために、第１のオリゴヌクレオチドプライマーをビオチン化し、そして直接選択に使用し、一方第２のオリゴヌクレオチドは修復に使用した。エキソントラッピングに加えて、クローニングコンティグもまた、この間隔に由来するゲノムP1クローン（Dackowskiら、Genome Res.6:515-524，1996）を用いて、本質的に記載されるような（Parimooら、Anal.Biochem.228:1-17 1995）c DNA選択を用いてスクリーニングした。他のコーディング配列を、SAmple SEquen cing(SASE)により得た。 SASEを、遺伝子同定のための機能的ゲノム方法として行った。簡単には、個々のP1に由来するDNAをSau3Aで部分的に消化し、そして3kbフラグメントをpBluesc riptKS⁺プラスミド（Stratagene，La Jolla，CA）にサブクローニングした。サブクローンを両端から配列決定して、P1クローンに半分ランダムに由来する配列を作製した。実施例VI：ヌクレオチド配列分析 hNET：ランダムショットガンライブラリーを、本質的に記載されるように（Ande rssonら、(1994)Anal.Biochem.218:300-308）、ランダムに剪断したP1 DNAをpAM P10ベクター（Life Technologies Inc.,Gaithersburg，MD）にサブクローニングすることにより、53.8B P1クローン（図18）から調製した。P1 DNAを、噴霧器（Hudson RCI，Temecula，CA）を用いてランダムに剪断した。ライブラリーを６ kbのXhoIフラグメント（これは、ネトリンコードエキソントラップを含むことが示された（図18））で最初にスクリーニングした。その後、ライブラリーを、配列決定のためのさらなるクローンを得るために、隣接3.5kbのXhoIフラグメントでスクリーニングした。陽性クローンを、以前に記載されたように（The Americ an PKD1 Consortium(1995)Hum.Mol.Genet.4:575-582）、正および逆ベクタープライマーを用いて配列決定した。ゲノム配列を、Sequencher(GeneCodes，Ann Arbor，MI)を用いて編集し、そして組み立てた。コード領域を、ゲノム配列（全てのリーディングフレームにおいて翻訳される）とニワトリネトリンとを比較する、GRAIL2プログラム（Uberbach erおよびMural(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 88:11261-11265；Xuら、（1994 ）Genet.Eng.N.Y.16:241-253）のワールドワイドウェブバージョンおよびMacVec tor(Oxford Molecular Group，Cambell，CA)Pustell DNA/タンパク質マトリクス分析を用いて予測した。データベース検索を、BLASTN(Altschulら(1990)J.Mol.B iol.215:403-410)およびBLASTX(Altschulら、1990、前出；GishおよびStates(19 93)Nat.Genet.3:266-272)を用いて行った。 RT-PCR：成人（脳、心臓、腎臓、白血球、肝臓、肺、リンパ芽球腫細胞株、胎盤、脾臓、および精巣）および胎児（腎臓および脳）の両方のcDNAライブラリーを、記載されたように（Van Raayら、1996、前出）、PCRによりネトリンcDNAの存在について予めスクリーニングした。ネスティッドRT-PCRを利用して、ネトリン遺伝子に由来する転写配列をクローニングした。簡単には、脊髄ポリA⁺RNA（C lontech，Palo Alto，CA）を、記載されたように（Kawasaki，1990「PCR Protoc ols:A Guide to Methods and Appllcations」(M.A.Innis、D.H.Gelfand、J.J.Sn insky、およびT.J.White編)、21-27頁、Academic Press，Inc.,San Diego）ランダムプライマーを用いて逆転写した。 PCRのためのプライマー（表IV）を、ゲノム配列分析から予測されたエキソンに基づいて設計し、そしてこれを用いて脊髄RNAを増幅した。なぜなら脊髄は、低レベルのニワトリネトリンを発現することが以前に示されているからである（ Serafiniら、前出）。ネスティッドPCRは、ヒト脊髄RNAからRT-PCR産物を検出することが必要とされた。脊髄RNAをランダムプライマーを用いて逆転写し、そして１次PCRを、遺伝子モデルから設計されたプライマー（表IV）を用いて、2.5 Mベタイン（Sigma Chemical Co.,St.Louis，MO）の存在下で行った。次いで、１次PCR反応物をI:20に希釈し、そして２次PCRを、再度ベタインの存在下でネスティッドプライマー（これも遺伝子モデルから設計された）を用いて、１μLの希釈１次反応物で行った。PCR反応物における最終濃度2.5Mのベタインの含有は、ヒトネトリンRT-PCR産物の純度および収率を劇的に増大させた（例えば、国際公開WO 96/12041；Reevesら、（1994）Am.J.Hum.Genet.55.A238；Baskaranら、（1 996）Genome Rcsearch 6:633-638を参照のこと）。 RT-PCR産物を、製造者により推奨されるようにpGEM-T(Promega，Madison，WI) を用いてサブクローニングした。得られたRT-PCRクローンを、ABIダイターミネーター化学（Perkin Elmer，Foster City，CA）およびABI 377自動化シーケンサー（Perkin Elmer，Foster City，CA）を用いてベクタープライマーおよび内部プライマーを用いて配列決定した。複数の配列アラインメントを、ClustalW(Tho mpsonら、（1994）Nucleic Acids Res.22:4673-4680)を用いて行った。 RT-PCR産物の配列分析は、hNETが少なくとも６つのエキソンを含むことを示した。RT-PCRデータは、４番目の予測されたエキソンがヒトネトリン遺伝子においてイントロンにより実際に裂かれ、そして２つのエキソンとして存在することを示す。RT-PCRエキソンのうち３つは、最初のエキソントラップと同一であることが示された。余分なエキソンを除いて、この遺伝子モデルは、RT-PCR産物とほぼ同一である。cDNAコード配列、推定タンパク質産物、および完全長配列は、それぞれ、図4A〜4Cに示される。ノーザンブロット分析：ゲノムおよびRT-PCRプローブを放射性標識し（Feinbe rgおよびVogelstein，Anal.Biochem.132:6-13，1983）、そしてこれを使用して、脊髄を含む異なる神経組織由来のRNAの一団を含む、種々の成人組織由来のRNA を含むノーザンブロット（Clontech，Palo Alto，CA）をプローブした。さらに、50の異なる成人および胎児組織に由来するRNAを含むヒトRNA Master Blot（Cl ontech，Palo Alto，CA）を、製造者により推奨されるようにスクリーニングした。 hABC3：ヒト肺cDNAライブラリー（LTI，Gaithersburg，MD）を、マウスABC1に対して相同性を有する最も5'側のトラップされたエキソンであるトラップされたエキソンL48757から設計された、捕獲および修復オリゴヌクレオチド（それぞれ、 5'-CATTGCCCGTGCTGTCGTG-3'(配列番号52)および5'-CATCGCCGCCTCCTTCATG-3'(配列番号53)）を用いて、GeneTrapperシステム（LTI，Gaithersburg，MD）でスクリーニングした。直接的cDNAライブラリースクリーニングもまた、プローブとしてRT-PCRクローンを用いて行った。5'RACE（Frohman，M.A．in Methods Enzymol ．(J.N.AbelsonおよびM.I.Simon編)340-356頁，Academic Press，San Diego，CA 1993）を使用して、ABC3転写物からさらなる5'配列を単離した。ノーザンブロット分析：ABC3 cDNAの3'非翻訳領域（UTR）に由来する679bpフラグメントを、ランダムプライミング（Feinbergら、前出、1983）により放射性標識し、そしてこれを用いて、製造者により推奨される条件下で複数の組織ノーザンブロット（Clontech，Palo Alto，CA）をプローブした。新規のABC輸送体のコード配列の同定：ABC3と呼ばれる、新規のATP結合カセット（ABC）輸送体の遺伝子は、16番染色体上のPKDI遺伝子座にマップされた（Bur nら、Genome Res.6:525-537，1996）。hABC3遺伝子に由来する８つのエキソンを、エキソントラッピングを用いて30.1F、64.12C、および96.4B P1クローンから得た。これは、図16を参照のこと。上部にhABC3遺伝子周辺のゲノム間隔を示し、NotI部位、DNAマーカー、およびキロベース（kb）での距離また示す。hABC3遺伝子由来の配列を含む間隔に由来するゲノムP1クローンを、ゲノムマップの下に示す。hABC3 cDNAの相対位置をP1クローンの下に提供し、選択されたcDNA、トラップされたエキソン、RT-PCRクローン、およびcDNAを示す。付加的hABC3配列の単離に使用されるトラップされたエキソンおよびRT-PCRクローンを標識した。クローンABCgt.1の列における不連続性は、別にスプライシングされるエキソンの不在を示す。これらのトラップされたエキソンのうち７つは、BLASTX解析（Altschulら、前出、1990；Gishら、前出、1993）に基づいてマウスABC1およびABC2に対して相同性を有する配列をコードし、トラップされたエキソンL48758、L48759、およびL4 8760に由来する配列が最も高い相同性を有した。トラップされたエキソンL48760 によりコードされる配列はまた、ゲノム配列から予測されるCaenorhabditis ele gans ABC輸送体に対して相同性を有した（Wilsonら、前出）。 cDNA選択は、ABC3遺伝子の5'末端近くにマップされる単一の261bp cDNAクローンを生じた。L48760と同様に、このクローンは、仮定C.elegansABC輸送体に対して相同性を有する配列をコードした。30.1F P1クローンからのSASE結果の最初の分析は、164反応物のうち４つがABC1およびABC2に対して相同性を有する配列をコードすることを示した。SASEデータと最後のhABC3cDNAとの後の比較は、さらなる７つの配列決定反応物がABC3遺伝子に由来するコード配列を含むことを示した。計1.6kbのABC3コード配列を、SASEデータと整列させた。hABC3遺伝子の5'末端由来の3.5kbのみのコード配列が30.1F P1クローンにマップする点で、これはS ASE分析の45％適用範囲レベルを示す。新規のABC輸送体のcDNAの組み立ておよび分析：２つの相補的アプローチを使用して、完全長hABC3 cDNAを組み立てた。第１に、RT-PCRを利用して、トラップされたエキソン、選択されたcDNA、およびSASEデータを連結した。第２に、cDNA ライブラリースクリーニングを、直接選択ならびに放射性標識されたプローブを用いて行った。トラップされたエキソンL48757、L48758、L48760、およびL75924から設計されたプライマーを用いて、3.3kbのコード配列を含む３つのRT-PCR産物をクローニングした（表Ｉおよび図16）。さらなるRT-PCRプライマーを、選択されたcDNAと SASEデータとの間の同一性領域から設計した（表I）。900bpのRT-PCRクローンを、トラップされたエキソンに由来するプライマーと共に後者のプライマーを用いて得た。全部で、4.2kbのコード配列を、RT-PCRを用いて得た。いくつかのcDNAを、GeneTrapper直接選択システムおよびABC1に対して相同性を有する配列をコードする最も5'側のトラップされたエキソン（トラップされたエキソンL48747）から設計されたオリゴを用いてクローニングした。GeneTrappe rシステムで単離された最も長いクローンは長さが5719bpであった（ABCgt.1）（図８）。このcDNAは、コンセンサスポリアデニル化−ポリＡ尾部の20bp上流に切断部位を有する792bpの3'非翻訳領域を含む。さらなるcDNAクローン（ABC.5）を、放射性標識された1.1kbのRT-PCR産物（ABC3-12）をプローブとして用いて単離した（図16）。ABC3 cDNAの5'末端を5'RACEを用いてさらに特徴付け、いくつかのRACE産物は、開始メチオニンの上流に複数のインフレーム停止コドンを含んだ。配列分析は、クローンABCgt.1がRT-PCRクローンおよびcDNAクローンABC.5において見出される147bpの配列を欠くことを示した。付加的な147bpセグメントは、これがオープンリーディングフレームを中断しない点で、別のスプライシングの結果のようである。両方の転写集団の存在は、別のスプライシングされるエキソンに隣接するプライマーを用いたPCRにより確認された。 6.4kbのcDNAは、hABC3輸送体について組み立てられた。組み立てられたcDNAは、1705アミノ酸をコードする5116ヌクレオチド長のオープンリーディングフレームを含み、予測されたタンパク質は191kDaの分子量を有する。提案された開始メチオニンは、クローンABCgt.1の5'末端の50bp上流である。開始メチオニン周囲の配列は10位置のうち６位置のみでKozak配列とマッチするが(Kozak，J.Cell Bi ol.115:887-903，1991)、機能に重要であることが示されている２つの位置（-3 のＡおよび+4のＧ）は、hABC3において保存される。hABC3 cDNAは、コンセンサスポリアデニル化/ポリＡ域の20bp上流の切断部位を有する792bpの3'UTRを含む。 6.8kbの転写物をノーザンブロットにおいて3'UTR cDNAプローブにより検出し、最も高レベルの発現が肺において、より少ない量が脳、心臓、および膵臓において検出される。有意に低いレベルの発現が、より長い暴露時間後に胎盤および骨格筋において観察された。ABC3転写物は、肝臓でも腎臓でも検出されなかった。 RPL3L(SEM L3)：最も長いcDNAは、長さが1548ヌクレオチドである（図11）。３つ全てのcDNAは、48ヌクレオチドの5'非翻訳領域を含む最も長いcDNAを有する12 24ヌクレオチドのオープンリーディングフレーム（ORF）を有する。７位のインフレーム停止コドンの後に、Kozak開始配列CCACCATGT（配列番号68）(Kozak,前出)が続く。３つのcDNAの各3'UTRは長さが異なり、そしてコンセンサスポリアデニル化切断部位を欠く。最も長いcDNAを、ヒト、ウシ、およびマウスリボソームL3遺伝子と比較した。ヌクレオチドレベルで、RPL3L(SEM L3)cDNAとこれらの他のリボソームL3 cDNA由来のコンセンサスとの間で74％しか同一性がない。これは、ヒト、ウシ、およびマウスL3ヌクレオチド配列間で共有される98％の同一性とははっきりと対照的である。ここで単離されたcDNAの3'UTRと他のL3遺伝子との間で類似性はない。 hALR：配列を、エキソントラップから設計されたプライマー（例えば、外部5'-T GGCCCAGTTCATACATTTA-3'（配列番号69）および内部5'-TTACCCCTGTGAGGAGTGTG-3' （配列番号70））を用いて3'RACEによってヒトALR遺伝子からクローニングした。計468bpがヒトALR遺伝子から得られた（図13）。実施例VII：アミノ酸配列分析 hNET：hNET cDNAは、少なくとも210bpの5'非翻訳配列、5'開始メチオニンコドン、3'停止コドン（TGA）を有し、そして長さが580アミノ酸であると予測され（図４）、ネトリンファミリーの共通ドメイン構造が保存されている（図20A）。全体的にみて、ヒトネトリンは、ネトリン-1よりニワトリネトリン-2に対してより高い相同性を有することが見出された（すなわち、56.3％対53.9％）。ネトリンファミリーの他のメンバーにあるように、最も大きな保存領域は３つのEGF反復を含むが、一方Ｃ末端ドメインはあまり良く保存されない（図20A）。EGF反復は、ヒトネトリンならびにニワトリネトリン-1およびネトリン-2間で、それぞれ78 .7％および82.2％同一であり、そしてUNC-6と比較した場合66.3％同一である。ヒトネトリンならびにニワトリネトリン-1および-2のＣ末端ドメインは、それぞれ41.9％および42.5％同一であり、UNC-6の同じドメインはヒトネトリンに対して29.4％しか同一でなかった。全体的にみて、ヒトネトリンは、NETBがVIおよび V-1ドメインにおいて付加的配列を含む場合、NETAがＣドメインにおいて広がりを含むので（Harrisら、1996、前出；Mitchellら、1996、前出）、Drosophila N ETAおよびNETBよりニワトリネトリンおよびUNC-6とより密接に似ている。ネトリン遺伝子の構造はDrosophilaとヒトとの間で保存されているヒト遺伝子におけるイントロンの位置を、ネトリン/UNC-6ファミリーの全体の遺伝子構造が保存されているかどうかを決定するためにコードタンパク質と比較した（図20B）。この分析は、Drosophilaネトリン遺伝子とヒトネトリン遺伝子との間の著しい類似性を明らかにした。ヒト遺伝子において、エキソン１は、シグナルペプチド、ドメインVI、および第１のEGFドメイン（ドメインV-1）を含むが、一方エキソン２および３はそれぞれ、EGF反復、ドメインV-2およびV-3をそれぞれ含む。エキソン４、５、および６は、Ｃドメイン部分を含む。Ｃドメインにおける付加的イントロンを除いて、このモチーフ／エキソン配置は、Drosop hilaネトリン遺伝子において保存されている。２つのDrosophilaネトリン遺伝子のコード領域は高度に保存されていることが示され、各々が相同部位で生じる６つのイントロンにより分裂される（Harrisら、1996、前出）。６つのDrosophila イントロンのうち５つの位置は、ヒト遺伝子において保存されることが見出された（図20B）。UNC-6遺伝子はコード領域において12のイントロンを含み（Ishii ら、1992、前出）、これらの５つの位置はヒト遺伝子におけるイントロンの位置と相関する。興味深いことに、６番目のDrosophilaイントロンは、ヒト遺伝子において対応物を有さず、そしてUNC-6遺伝子において保存されないDrosophila由来の唯一のイントロンである。 hABC3：データベース検索は、ABC3ならびにマウスABC1およびABC2間の相同性を明らかにした（Lucianiら、前出、1994）。マウスABC1およびABC2タンパク質に加えて、ABC3タンパク質もまた、C48B4.4のコスミド配列によりコードされる推定C.elegansタンパク質（Wilsonら、前出）に対して相同性を示す。全体的にみて、ABC3、ABC1、ABC2、およびC.elegansコスミドC48B4.4によりコードされる配列は、ATP結合カセット周囲の領域において最も高い相同性を有する（図17）。しかし、リンカードメイン（Lucianiら、前出、1994）と呼ばれる、第１のATP結合カセットと第２の膜貫通ドメインとの間の配列を比較する場合、ABC3は、上記に列挙されたこれらの同じ３つのタンパク質に対して非常に低い相同性を共有する（図17のABC3におけるアミノ酸765〜1044）。ABC3のリンカードメインは、ABC 1およびABC2に存在するリンカードメインより短い約200残基である。結果的に、最適タンパク質アラインメントは、ABC3の917〜959位に位置する、保存HH1疎水性ドメイン（Lucianiら、前出、1994）のすぐＣ末端側のABC3配列にギャップを配置する（図17）。さらなる比較は、ABC3リンカードメインがC.elegansコスミドC48B4.4によりコードされるリンカードメインに対してサイズにおいてほぼ同一であることを示す。ABC1およびABC2にあるように、ABC3のリンカードメインは、非常に多くの極性残基およびいくつかの潜在的なリン酸化部位を含む。推定ABC3タンパク質配列のさらなる分析は、ABC1/ABC2サブファミリーに対するさらなる類似性を明らかにした。PSORT分析（Nakaiら、前出）に基づいて、AB C3タンパク質は、Ｎ末端シグナル配列を含まないようであり、そしてIII型膜タンパク質（Singer，Annu.Rev.Cell Biol.6:247-296 1990）のようであり、第１の膜貫通ドメインの配列Ｎ末端は細胞質に位置する（図17）。同様の形態がABC1 について記載され（Lucianiら、前出、1994）、そして輸送される全ての他のABC が記載されている（Higgins、前出、1992）。上記のように、マウスABC1およびA BC2は、保存リンカードメイン内に新規の疎水性領域であるHH1を含むことが示された。HH1ドメインはABC3においてアミノ酸レベルであまり保存されないが、HH1 ドメインは、親水性分析に基づいてリンカー領域内に存在するようである。同様のHH1ドメインもまた、C.elegans由来のコスミドC48B4.4によりコードされる配列において見出される。全てのこれらの場合において、HH1ドメインは、βシートコンホメーションを有すると予測される。 RPL3L(SEM L3)：RPL3L(SEM L3)cDNAオープンリーディングフレームは、46.3kDa の407アミノ酸ポリペプチドを予測する（図11）。RPL3L(SEM L3)cDNAのインビトロ転写−翻訳は、46.3kDの予測量と密接に一致した、46kDの見かけの分子量を有するタンパク質産物をもたらした。２つの核標的化配列（これは、ヒト、マウス、およびウシの間で100％保存される）は、RPL3L(SEM L3)アミノ酸配列においてわずかに分岐した。第１の標的化部位は21アミノ酸のＮ末端オリゴペプチドである。ヒト、ウシ、およびマウス L3の13および19位にそれぞれ存在するセリンおよびアルギニンは、RPL3L(SEM L3 )のヒスチジンで置換される（図12）。第２の潜在的核標的化部位は、２部に分かれたモチーフである。ここでヒト、ウシ、およびマウスタンパク質は、341〜3 58位でKKR-(aa)₁₂-KRRを有するが、一方SEM L3遺伝子は341〜358位でKKR-(aa)₁₀ -HHSRQを有する。この２部に分かれたモチーフの第２の半分は、塩基性のままであったが、他の核標的化モチーフに見出されるものとマッチしない（Simonicら、前出、1994）。全体的にみて、RPL3L(SEM L3)と他の哺乳動物L3リボソーム遺伝子由来のコンセンサスとの間で77.2％アミノ酸同一性があり、RPL3L(SEM L3) とヒトL3との間のヌクレオチド差異の56％がサイレントである。 hALR：hALRcDNA配列は、ラットALRタンパク質に対して84.8％同一および94.1％類似している119アミノ酸配列タンパク質をコードする（図13および14を参照のこと）。本発明は開示された実施態様に対する参考として記載されたが、種々の改変は本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は、配列表に続く請求項によりのみ限定される。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Novel human chromosome 16 genes, compositions, and methods of making and using the same Background of the Invention Assembly of adjacent cloning genomic reagents requires a positional cloning approach. This is a necessary step in the process of identifying a disease gene using H. Polymorphism simply The rapid development of high-density genetic maps based on pure sequence repeats has led to the development of sequence tagging sites (STS ) Facilitating contig assembly using content mapping. Most Contig construction efforts rely on the yeast artificial chromosome (YAC). Because those Large Insert Sizes Use Current STS Map Density Over Bacterial Host Systems? It is. This approach has been demonstrated for multiple human chromosomes, YAC coverage in the range of 65-95% and contigs of 11-36Mb are described (Chumakov et al., Nature 377 (Supplement): 175-297, 1995; Doggett et al., Nature 37). 7 (Supplement): 335-365, 1995b; Gemmill et al., Nature 377 (Supplement): 299-319, 1995; Kraut. er et al., Nature 377 (supplement): 321-333, 1995; Shimizu et al., Cytogenet. Cell Genet. 70. : 147-182, 1995; van-Heyningen et al., Cytogenet. Cell Genet. 69: 127-158, 1995). . Despite many successes, the YAC cloning system uses chimeric clones (Green et al.). Genomics 11: 658-669, 1991; Bcllanne-Chantelot et al., Cell 70: 1059-1068,19. 92; Nagaraja et al., Nuc. Acids Res. 22: 3406-3411, 1994), and rearranged. Or deleted or unstable clones (Neil et al., Nuc. Acids Res. 18: 1421- 1428, 1990; Wada et al., Am. J. Hum. Genet. 46: 95-106, 1990; Zuo et al., Hum. Mol. Genet. 1: 149-159, 1992; Szepetowski et al., Cytogenet. Cell Genet. 69: 101-107, 1995). Clones the entire genome of complex organisms due to intrinsic limitations that result in a substantial proportion of Not a panacea for ning. At least some of these cloning artifacts In some cases, yeast recombination acts on various types of repetitive elements in mammalian DNA. (Neil et al., Supra, 1990; Green et al., Supra, 1991; Schlessinge r et al., Genomics 11: 783-793, 1991; Ling et al., Nuc. Acids Res. 21: 6045-6046, 1993. ; Kou prina et al., Genomics 21: 7-17, 1994; Larionov et al., Nuc. Acids Res. 22: 4154-4162, 1994). Therefore, alternative cloning systems may be needed to compensate for the localized YAC cloning deficiency. To increase the resolution of physical maps, and for whole-genome DNA sequencing Used in conjunction with a YAC-based approach to provide a source of array preparation Must be done. Some exon trapping methodologies and vectors are Described for rapid and efficient isolation of coding regions from genomic DNA (Auch et al., Nuc. Acids Res. 18: 6743-6744, 1990; Duyk et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87: 8995-8999, 1990; Buckler et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 4005-4009. 1991; Church et al., Nature Genet. 6: 98-105, 1994). Exon trapping The main advantage is the expression of cloned genomic DNA (cosmid, P1, or YAC) Is driven by a heterologous promoter in tissue culture cells. this Means that the coding sequences have no prior knowledge of the tissue distribution or developmental stage of their expression, Allow to be identified. The second advantage of exon trapping is that Code where the trapping is only from the desired cloned template Sequence identification, which identifies highly conserved transcripts from overlapping loci. The elimination of the danger that it does. This is a direct line even for cDNA selection. Not even in the case of Bally screening. Exon trapping is performed at the Huntington's disease locus (Ambrose et al., Hum. Mol. Gen. et. 1: 697-703, 1992; Taylor et al., Nature Genet. 2: 223-227, 1992; Duyao et al., Hu. m.Mol.Genet. 2: 673-676, 1993) and the BRCA1 locus (Brody et al., Genomics 25: 2). 38-247, 1995; Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 92: 4362-4366, 1995). Has been successfully used to identify transcribed sequences in Huntington Disease genes (The Huntington's Disease Collaborative Research Group, Cell 72: 971-983, 1993) Neurofibromatosis type 2 (Trofatter et al., Cell 72: 791-800, 1993). ), Menkes disease (Vulpe et al., Nature Genet. 3: 7-13, 1993), Batten disease (The In ternational Batten Disease Consortium, Cell 82: 949-957, 1995), and Genes responsible for a number of long-term QT (Long-QT) syndrome cases (Wang et al., Nature Genet. 12: 17-23, 1996). Ping has been identified. The 700 kb CpG-rich region in band 16p13.3 shows autosomal dominant polycystic kidney disease (P Disease gene (Germino et al., Genomics 13: 144-151, 1992; S) omlo et al., Genomics 13: 152-158, 1992; The European Polycystic Kidney Diseas e Consortium, Cell 77: 881-894, 1994), and one cause of tuberous sclerosis Tubulin gene (TSC2) (The European Chromosome 16 Tuberous Sc lerosis Consortium, Cell 75: 1305-1315, 1993). The estimated 20 genes are located in this region of chromosome 16 (Germino et al., Kid ney Int. Supp. 39: S20-S25, 1993). However, around 16p13.3 the PKD1 gene Region characterization is complicated by overlap of parts of the more proximal genomic interval at 16p13.1 (The European Polycystic Kidney Disease Consortium, supra, 19 94). This chromosome segment is represented by a GC-rich isochore (Saccone et al., Proc. N atl.Acad.Sci., USA 89: 4913-4917, 1992), CpG islands (Harris et al., Gcnomics 7: 195). -206, 1990; Germino et al., Supra, 1992), genes (Germino et al., Supra, 1993), and And rich in Alu repeats (Korenberg et al., Cell 53: 391-400, 1988) Therefore, there is a need for a large insert cloning system in E. coli and yeast. Useful as a rewarding test. Chromosome 16 also has a lower copy Fluorescence in situ hybridization (FISH), including repetition (Okumura et al., C ytogenet.Cell.Genet.67: 61-67, 1994), the cosmid Approximately 25% of contigs hybridize to more than one chromosomal location. these Types of repeats and sequence duplication are commonly used for the identification of genomic DNA Prevents 'walking' technology and is based on hybridization of contig constructs Present challenges for the method. This is because these technologies are used to flag genomic DNA duplication. Because it depends on hybridization to identify clones containing the Therefore, from the homologue instead of the clone from the authentic gene There is a high likelihood of "walking" to the clone. In a similar manner, the sequence duplication and 16th Chromosome-specific repeats also reveal the complete cDNA sequence encoding the corresponding protein. Prevent white decisions. In addition, low copy repeats are used in bacteria, yeast, and higher eukaryotes. May lead to the instability of this interval at. Thus, a genuine gene present in a highly repeated portion of chromosome 16, and Exact genomic and cDNA sequences corresponding to genes similarly located on other chromosomes There is a need in the art for methods and compositions that enable accurate identification . The present invention fulfills this need, and also provides related advantages. Summary of the Invention According to the present invention, human netrin, human ATP binding cassette transporter, human ribosomal Encoding the human L3 subtype and a human augmenter of liver regeneration An isolated nucleic acid is provided. The present invention relates to a human netrin gene, a human ATP binding cassette transporter gene, The ribosome L3 gene and the human enhancer gene for liver regeneration Further providing an isolated protein product. Thus, the present invention provides nucleic acids of the invention as well as unique genes located on chromosome 16. A nucleic acid probe is provided that hybridizes to an isolated nucleic acid comprising a sequence. Vector containing nucleic acid of the present invention and host transformed with vector of the present invention Cells are further provided. The transgenic non-human mammal expressing the polypeptide of the present invention is Provided by The present invention relates to antisense oligonucleotides, antibodies, and compositions containing the same. including. Further, the present invention provides a method for identifying a compound that binds to the polypeptide of the present invention. Provide a way. Such compounds modulate the activity of the polypeptide of the invention Useful for BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 shows a schematic diagram of the P1 contig and the trapped exons. Figures 2A and 2B show selected exon traps with sequences in the database FIG. 3A-3C show the 6803 bp hNET genomic sequence from P1 clone 53.8B (SEQ ID NO: 19). Is shown. FIGS.4A and 4B show the 1743 bp encoding the human homolog of the chicken netrin gene. 1 shows the hNET cDNA and the deduced amino acid sequence (SEQ ID NOs: 20 and 21). 4C and 4D show nucleotides of a 1.9 kb hNET cDNA containing both 5 ′ and 3 ′ UTRs. Shows the sequence (SEQ ID NO: 78). FIG. 5 shows chicken netrin-1 (SEQ ID NO: 22) and chicken netrin-2 (SEQ ID NO: 23) and amino acid comparison between hNET (SEQ ID NO: 21). The shaded box is the same One region of homology is shown. Laminin domains V and VI and C-terminal domain (C) is indicated by an arrow, and domain V is divided into three subcomponents (V-1 to V-3). You. The asterisk identifies the adhesion / signaling receptor motif. Figure 6 shows the interdomain between chicken netrin-1, chicken netrin-2 and hNET 2 shows a graphical representation of the homology of. FIG. 7 shows exon traps, RT-PCR products, and cDNAs derived from ABCgt.1 clones. Is shown. Exon traps have been described previously. ABCgt.1 DNA is an exont Shown below the wrap, Genetrapper selection (S) and repair (R) oligonucleotides The position of the tide is indicated. The location of the RT-PCR clone is shown below the cDNA. 8A-8G show a 5.8 kb cDNA encoding the ABCgt.1 clone and the predicted amino acid sequence. The columns (SEQ ID NOs: 24 and 25) are shown. 9A-9D show mouse ABC1 (SEQ ID NO: 26) along with clone ABCgt.1 (SEQ ID NO: 25). 7) and Amino acid alignment of ABC2 (SEQ ID NO: 27). Hyphen is a gya Asterisks indicate identical residues, while periods indicate conservative substitutions. ATP The location of the binding cassette is indicated by the enclosed area. The number on the right is Indicates the relative position. FIG. 10 shows the PKD1 gene from which the P1 clones 49.10D, 109.8C, and 47.2H were isolated. 2 shows the region of the locus transcription map. White boxes indicate trapped exons, Their relative positions are shown below the RPL3L (SEM L3) gene. c, r, and h are The capture oligonucleotide, repair oligonucleotide, and hybrid Shows the position of the hybridization oligonucleotide. FIGS.11A-11B show the nucleotides and deduced nucleotides of the SEM L3 cDNA, referred to herein as RPL3L. The amino acid sequence (SEQ ID NO: 28 and 29) is shown. 5 'upstream in-frame stop codon Are underlined, and the arrows point to two shorter cDNA clones (also (Isolated) shows the site of the poly A tract. FIG. 12 shows human (SEQ ID NO: 30), bovine (SEQ ID NO: 31), mouse (SEQ ID NO: 32), 2 shows a comparison of deduced amino acid sequences derived from RPL3L (SEML3) (SEQ ID NO: 29) gene You. Dashes indicate sequence identity to the human L3 gene. N-terminal nuclear targeting arrangement Rows are shaded, and motifs divided into two parts are boxed. FIG. 13 shows the nucleotide and deduced amino acid sequence of the hALR cDNA (SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 33). And 34). FIG. 14 shows the deduced amino acid sequences (SEQ ID NO :) derived from rat ALR and human ALR, respectively. No. 35 and 34) are shown. FIGS. 15A-15J show the nucleotide and deduced amino acid sequences of the full-length hABC3 cDNA Column numbers 74 and 75). FIG. 16 shows a physical map of the region containing the hABC3 gene. FIG. 17A shows the mouse ABC1 (SEQ ID NO: 26) and ABC2 (SEQ ID NO: 27) sequences (LUCiani Et al., Genomics 21: 150-159, 1994) and C. elegans cosmid C.48B4.4. Sequence (SEQ ID NO: 77) (Wilson et al., Nature 368.32-38, 199) 4 shows the predicted amino acid sequence of hABC3 (SEQ ID NO: 75), aligned to 4). Array Identity is indicated by letters and mismatches are indicated by periods. Between alignments The gap to be inserted is also indicated (=). ABC1, ABC2, and C.48B4.4 And contained only in the first ATP-binding domain, and only the sequence at the C-terminal side thereof. Is shown. Boxes indicate ATP binding cassettes (I and III) and HH1 domain (I I) is shown. Figure 17B shows transmembrane (TM) domain, ATP binding cassette (ABC) domain, linker 1 shows a schematic diagram of an ABC3 protein showing the H- and HH1 domains. FIG. 18 shows a map of the genomic interval around the human netrin gene. FIG.19A shows a GRAIL2 analysis of the coding sequence in the 6.8 kb genomic sequence from 53.8B P1. Show. FIG.19B shows Pustell DNA / protein comparison of genomic sequence to chicken netrin-2. The results of the quality matrix are shown. FIG.20A shows human netrin and chicken netrin-1, chicken netrin-2, and U Fig. 7 shows an alignment with NC-6 (SEQ ID NO: 79). FIG.20B shows a schematic of the genomic sequence, boxes indicate exons, and lines indicate Intron. The untranslated region is shown in black and the position of the start codon is shown by an arrow . The domain structure of the human netrin protein is shown below the gene structure. Dros The positions of the introns in the ophila netrin gene are indicated by arrows, and the non-conserved Tron is indicated by an open arrow. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION All patent applications, patents, and literature references cited in this application are incorporated by reference in their entirety. It is incorporated herein by reference. In case of conflict or mismatch, define The description of the present invention, including that it is tailored. Definition: 1. “Complementary DNA (cDNA)” is derived from a genuine gene and has the sequence or Is a single- or double-stranded intron whose complement encodes a protein. DNA molecules are defined herein. 2. A "contig" as referred to herein is a contiguous stream of DNA or DNA sequences. Tretch, which can be represented by multiple overlapping clones or sequences. 3. "Cosmids" as referred to herein are capable of replicating in bacterial cells and A DNA plasmid capable of accommodating a large DNA insert of about 30 to about 51 kb in length. 4. The term "P1 clone" refers to a clone based on a P1 phage replication machinery-based vector. Genomic DNA. These vectors generally have a size of about 70 to about 105 kb. House insert (Pierce et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89: 2056-2060, 1992). ). 5. As used herein, the term “exon trapping” refers to RNA processing Genomic DNA flanked by donor and ataseceptor splice sites for Refers to a method for isolating a sequence. 6. As used herein, "amplification" of DNA refers to a particular mixture or mixture of DNA sequences. Figure 3 shows a reaction that works to increase the concentration of a DNA sequence. Amplification is the polymerase chain Reaction (PCR) (Saiki et al., Science, 239: 487, 1988), ligase chain reaction (LCR) Using nucleic acid specific amplification (NSBA) or any method known in the art Can be performed. 7. As used herein, “RT-PCR” refers to coupled reverse transcription and polymerase Refers to the chain reaction. This amplification method is specific oligonucleotide, oligo dT, or Implements reverse transcription of RNA into single-stranded cDNA using a mixture of random primers. The cDNA is then used in standard amplification techniques (eg, , PCR). P1 contig containing about 700 kb DNA around PKD1 and TSC2 genes P1 library (Shepherd et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91: 2629-2633, 1994). ) With 15 different probes, resulting in 12 unique It was assembled from a set of P1 clones derived from chromosome 16. Exon truck Ping used to identify transcribed sequences from this region in 16p13.3 Was done. 96 new exons containing sequences from at least 18 genes in this interval Wrap was obtained. The 18 identified genes account for less than 5 genes from this interval. Previously reported genes and previously characterized remains whose location was unknown Including genes (Table I). Additional exon traps in cDNA, PT-PCR products Their presence, or their hive to different mRNA species on Northern blots Genes were mapped on the basis of redidation. Exon trapping is an improved trapping vector (Burn et al., Gene 1 61: 183-187, 1995), and the obtained exon trap was used for DNA sequence analysis. Was characterized by: Determine the relative efficiency of the exon trapping procedure For example, exon traps are known to be located around the PKD1 gene. It was compared with the cDNA sequence of the gene (FIG. 1). A single exon trap, ERV1 (Liso wsky et al., Genomics 29: 690-697, 1995) and the ATP6C proton pump gene (Gill espie et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 4289-4293, 1991). Was done. The horizontal line at the top of Figure 1 is a graduated (kilobase) related DNA marker Indicates the position of the key. The location of the NotI site is indicated below the horizontal line. Known gene positions The positions and directions are indicated by arrows, and the number of exon traps obtained from each gene is rounded. Shown in an arc. The locations of the transcription units (AM) described in this report are known Shown below the gene. The corresponding exon trap Genbank accession number is Shown below the unit. P1 clones are indicated by overlapping lines, and the name of the clone is Shown above the line. Trapped exo does not map to characterized transcripts Position is indicated below the P1 contig. Vertical line shows hybridization P1 clone (s) detected by exon trap in study Indicates the interval within In contrast, eight individual exon traps were isolated from the TSC2 gene and 10 Exon traps were isolated from the CCNF gene (The European Chromosome 16 Tuberous Sclerosis Consortium, supra, 1993; Kraus et al., Genomics 24: 27-33. , 1994). Sequences trapped from three of the exons present in the PKD1 gene (The American PKD1 Consortium, Hum. Mol. Genet. 4: 575-582, 1995 ; The International Polycystic Kidney Disease Consortium, Cell 81: 289-29 8, 1995; Hughes et al., Nature Genet.10.151-160, 1995). 109.8C and 47.2H P1 Sixteen additional exon traps were also obtained from the clone. Two exon tigers located in the overlap region between the 96.4B and 64.12C P1 clones Sequence (Genbank Accession Nos. L75926 and L75927) contains S-phase predominant DNA / RNA binding protein (Schmidt et al., Biochim. Biophys. Acta 1216: 317-320, 1993) Previously described for the mouse RNPS1 gene (Genbank accession number L37368) It was shown to contain sequences from the listed human homologs. For dbEST database Comparison of these exon traps shows that they are also I.M.A.G.E. Consortium ( Lennon et al., Genomics 33: 151-152, 1996). Was. Based on these data, the hRNPS1 gene was expressed in 16 cells near the DNA marker D16S291. p13.3 (transcript G in FIG. 1). The two exon traps from the 1.8F P1 clone are A previously described mouse ΦAP3 encoding a transcription factor (Fognani et al., EMBO J. 12: 4985). -4992, 1993) with a high level of homology. Zinc MΦAP3 protein, a finger-containing transcription factor, is a protein responsible for cell cycle inhibition. Believed to function as a negative regulator for the gene encoding protein (Fognani et al., Supra). The two exon traps are linked by PCR, The resulting 1.2 kb PCR product is 85 nucleotides at the nucleotide level relative to the mouse ΦAP3 cDNA. % Identical. Dot blotted P1 conti of ΦAP3-like exon trap Hybridization to DNA was performed using this gene strain as DNA markers KLH7 and GGG12. And in the non-overlapping region of 1.8 F P1 (transcript H in FIG. 1). Significant homology is also associated with 97.10GP1 and ras-related GTP involved in regulation of vesicle trafficking Rat Rab26 gene encoding the binding protein (Nuoffer et al., Ann. Rev. Biochem. 63: 949-990, 1994; Wagner et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 207: 950-956, 1995). Was observed between the two exon traps obtained from E. Exon truck like Rab26 Are linked by RT-PCT (transcript J in FIG. 1) and the coding sequence is relative to Rab26. 94% (83/88) identical at the protein level. For example, the following selected See FIG. 2, which shows the alignment of the exon trap with the sequence in the database. Teru. For the sequence encoded by exon trap L48741 (SEQ ID NO: 1) C. Elegans (SEQ ID NO: 2), E. coli (SEQ ID NO: 3), and Haemophilus (SEQ ID NO: 3) N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylase derived from column No. 4) Intention. One of the translated netrin-like exon traps (Genbank accession number L 75917), netrin-1 (SEQ ID NO: 7), neto aligned to (SEQ ID NO: 5) EGF repeats from phosphorus-2 (SEQ ID NO: 6) and UNC-6 (SEQ ID NO: 8) are shown You. Second netrin-like exon trap (Genbank accession number L75916) (SEQ ID NO: 9), derived from netrin-1 (SEQ ID NO: 11), and netrin-2 (SEQ ID NO: 10) The sequence alignment is shown. Translated Rab26-like RT-PCR products (Genbank contract) Nos. L48770-L48771) (SEQ ID NO: 12) and rat Rab26 (SEQ ID NO: 13) Statement. Neisseria gonorrhoeae-derived pilB transcription repressor-derived sequence Column no. 15), computer encoded by cosmid F44E2.6 from C. elegans -Sequence predicted by analysis (SEQ ID NO: 17), YCL33C gene product from yeast (Ge nbank accession number P25566) (SEQ ID NO: 16), and transcriptional repress from Haemophilus Coded by exon trap L48792, aligned against sir (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 14) is shown. Period is gap aligned Indicates the position inserted into the protein sequence to maintain. CDNA libraries to correlate exon traps with individual transcripts Selected exons using a cleaning and PCR-based approach The transcribed sequence containing the wrap was cloned. Two exons using RT-PCR If the trap has homology to a similar sequence in the database, Individual exon traps were connected together. Only a single exon trap is used If possible, use 3'RACE or cDNA library screening to further Sequence was obtained. Using sequences from exon traps and cloning products , The location of the corresponding transcription unit and, if possible, its direction. Six unique exon traps containing sequences from at least eight exons Shown to be derived from the transcription unit in the most centromeric P1 clone, 94.10H (Transcript A in FIG. 1). A 2 kb cDNA linking the six exon traps was isolated. And was shown to hybridize to an 8 kb transcript. More hive Redidation studies have shown that this gene is directed from centromeres to telomeres and Both showed that the 6 kb transcript was derived from the centromere sequence of the P1 contig. Wide Extensive homology was observed between the translated cDNA and various protein kinases However, the conserved HRDLKPEN motif encoded in exon trap L48734 (SEQ ID NO: 71) as well as the presence of the partial cDNA indicates that it is a serine / threonine kinase. (Van-der-Geer et al., Ann. Rev. Cell Bio. 10: 251-33). 7, 1994). The cDNA is derived from a different 94.10H exon trap (Genbank accession number L48738) And the position and orientation of the corresponding transcription unit are determined. Was. Two cDNA species were obtained using exon trap L48738 as a probe, The homology between the two species arises from 109 bases in the exon trap Was only. Using an oligonucleotide probe, the transcription unit is telomeric Mapped to a position near the 26-6DIS DNA marker in the eccentric to centromeric direction; however, c Only one of the DNA species mapped to the P1 contig (transcript B in FIG. 1). Based on these data, the second cDNA species was identified as a region outside the P1 contig, presumably It seems to be derived from the overlapping 26-6PROX marker located further on the centromere side of 16p13.3 (Gillespie et al., Nuc. Acids Res. 18: 7071-7075, 1990). The 110.1F P1 clone contains at least two genes in addition to the ATP6C gene. Using BLASTX to search the protein database, significant homology The sequence encoded by Sontrap L48741 and C. elegans (Wilson et al., Supra, 19 94), E. coli (Plumbridge, Mol. Microbiol. 3: 505-515, 1989), and Haemophilu N-acetylglucosa from s (Flelschmann et al., Science 269: 496-512, 1995). It was observed between the min-6-phosphate deacetylase (nagA) protein. nagA tongue Alignments to puta translated exon traps can be (Figure 2), which indicates that exon traps It suggests that it contains sequences from offspring. Additional sequences from nagA-like transcripts have 3'RACE And the transcription unit is located in the region between NotI sites 2 and 3 in FIG. Mapped to the area. This gene is oriented from telomere to centromere and NotI site 2 Present in the 3'UTR of the RACE clone (transcript C in FIG. 1). Overlap region between 110.1F P1 clone and 53.8B P1 clone (transcript D in FIG. 1) Two additional exon traps (Genbank accession number L75916 and And L75917) are from chicken netrin (Kennedy et al., Cell 78: 425-435, 1994; Serafi). ni et al., Cell 78: 409-424, 1994) and C. elegans UNC-6 protein (IShii et al., N euron 9: 873-881, 1992) (FIGS. 2 and 20A). The sequence encoded by exon trap L75917 contains netrin and UNC-6 Significant phase with most C-terminal epidermal growth factor (EGF) repeats found in proteins It was shown to be homosexual (FIGS. 2 and 20A). Exon trap L75917 is 98% identical to the sequence from the third epidermal growth factor (EGF) repeat of chicken netrin-2 One sequence and a sequence 90% identical to a sequence from the same region of netrin-1. Do. Netrin-like trap L75916 is the C-terminal domain of netrin-1 and netrin-2. To the more branched C-terminal domain of netrin, 43% identical to the sequence contained in the main Encodes the derived sequence (FIGS. 2 and 20A). This area contains UNC-6 and netrin Is the least conserved between the two, and the sequence is 63% conserved between netrin-1 and netrin-2 And is 29% conserved between netrin-2 and UNC-6 (Serafini et al., Supra). . Netrin has been shown to play a central role in axonal guidance Define the tropism factor family. The axonal growth cone is the extracellular matrix or cell Local cues present on surfaces, as well as diffusible chemoattractants and chemistries Both long-term cues in the form of repellents are directed to their targets ( Goodman and Shatz, Cell 72: 77-98, 1993; Keynes and Cook, Curr. Opin. Neu robiol. 5: 75-82, 1995). Chicken Netrin-1 and Netrin-2 Are Modified to Develop Spinal Commissural Axons Functions as an academic inducer (Serafini et al., Cell 78: 409-424, 1994; Kennedy et al., Ce) ll 78.425-435, 1994), netrin-1 is also a chemical repellent for trochlear axons Acts as a quality (Colamarino and Tessier-Lavigne, Cell 81: 621-629, 1995 ) Is shown. Comparative analysis was performed with chicken netrin and a circular (circumferenti al) between C. elegans UNC-6 protein required for cell migration and axon guidance Revealed the existence of extensive homology (Hedgecock et al., Neuron 4: 61-85, 1990; Ish ii et al., Neuron 9: 873-881, 1992). More recently, two Drosophila netrins, NETA and NETB have been described, and pulley axon guidance and motor neuron It has been shown to be required for induction into these target muscles (Harris et al., Cell 1 7: 217-228, 1996; Mitchell et al., Cell 17: 203-215, 1996). These studies are Netrin family of aspiratory and chemo-repellent proteins invertebrates and vertebrae Indicates that it is preserved between animals. Genomic intervals that include netrin-like exon traps may Obtain sequence information and rule out the possibility that exon traps are derived from pseudogenes Was sequenced for. In a preliminary study using the 53.8B genomic P1 clone, The Trin-like exon trap mapped to a 6 kb XhoI fragment. For example , The relevant DNA marker is shown above the horizontal line and the NotI site (N) is shown below this line See FIG. Location and orientation of ATP6C, CCNF, and nagA transcription units Has been described previously (Gillespie et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 4289-4293, 1). 991; Kraus et al., Genomics 24: 27-33, 1994; Burn et al., Genome Research 6: 525-537. , 1996), and shown below the genome interval. Two P1 cells containing the netrin gene The loan is shown below the schematic of this interval. The position of the 6.8 kb genome sequence is P1 Expanded below the clone. Two exon tracks in a 6.8 kb genomic sequence The position of the loop is also indicated. The 6 kb fragment and the adjacent 3.5 kb XhoI fragment were subcloninin And use this to create random shotgun shots from the 53.8B P1 clone. The library was screened. Positive by hybridization Subclones were sequenced using forward and reverse vector primers. Total 88 Subclones were sequenced in this manner. Additional sequences are internal primers as well as terminal sequences from the parent XhoI fragment. Obtained using A total 6.8 kb genomic sequence with 7-fold total redundancy was sequenced. Was. The GC content of the sequenced region was found to be 68.9%, which is 350 kb Further about the genomic sequence of 53 kb derived from the PKD1 gene located on the telomere side Slightly higher than the observed 62.8% (The American PKD1 Consortium, 1995, before (Burn et al., 1996, supra). Computer analysis was performed to identify putative exons. GRAIL2 analysis Predicts six exons within a 6.8 kb genomic sequence using database analysis. All but one exon (exon 1) are homologous to chicken netrin It encodes a sequence that has sex properties. Figure 19A shows 6.8 kb from 53.8B P1. Shows the GRAIL2 analysis of the coding sequence in the genomic sequence of, the gray scale is the GC content (White to light gray is GC rich, and gray to black is AT rich ), The vertical box indicates the relative quality of the predicted exon. Estimated The exon figure is shown above the vertical box, and the lightly colored box is "excellent" (> 80 %of Exons with a score of (probability), and the dark colored box is "good" (> Exon with a score of 60% probability). Exon trap L75917 and The position of L75916 (respectively from left to right) is shown above the GRAIL2 predicted exon. R The structure of the gene based on the comparison of the T-PCR product and the genomic sequence is shown at the top, The position of the exon in the sequence is indicated by the number above the exon. 5 'and The 3 'untranslated region is also shown. Furthermore, a 6.8 kb genomic sequence can be obtained using Pustell DNA / protein matrix. The protein sequence of chicken netrin was compared. Genome sequence (all six frames Translated into a homolog), the minimum homology is set to 50% and the window (win dow) was set to 20, using a RAM250 matrix chicken chicken netrin-FIG. Compared to 2. The regions of homology are indicated by heavy diagonal lines. The five exons are Analytical predicted that only the first GRAIL2 predicted exon appears to be true Was. Sequences from two exon traps were also predicted by GRAIL2; However, there were notable differences (compare FIG. 19A). Exon trap L75917 GRAIL2 contains an additional 55 bp at the 5 'end of the exon in predicting the sequence present in I do. First exon of two exons present in exon trap L75916 Was not predicted by GRAIL2, while GRAIL2 was not present in this exon trap. Additional bases were added to the 5 'and 3' ends of the existing second exon. Searching the Expressed Sequence Tag (EST) database It did not reveal the presence of any ESTs derived from the Trin gene. Human netori Also used mRNA from over 50 different adult and fetal tissues. Not detected by Northern and / or RNA dot blot analysis. this HNETs have extremely restricted expression patterns and, when expressed, are present at low abundance. Implies that However, two mice with significant homology to hNET The EST is a brain library and a whole fetal library (Genbank accession numbers, respectively). Nos. W59766 and AA048205). This mouse EST has a total of 477 bp The column contains the indicated duplicate sequence. This 477 bp flanking sequence is 5 ′ of the human netrin cDNA. Aligned to the ends and the sequence encoding the 47 bp 5 'UTR and the N-terminal 143 amino acids Including. A comparison of the deduced human and mouse protein sequences shows that the two proteins are 89. 5% (128/143) showed the same. Characterization of human netrin transcript To confirm the structure of the netrin gene, RT-PCR was performed from the predicted exon This was performed using the designed primers. Predicted human netrin is netrin-1 Appear to be slightly more homologous to netrin-2 (57% vs. respectively) 54%), and since netrin-2 is expressed in the chick spinal cord, Spinal cord poly A + RNA was used as a template. RT-PCR product is a primer pair Of nested primers and even twice Requires the use of PCR and low yields It required the use of a radiolabeled probe to visualize. Some places Low yield and lack of RT-PCR product in the assay is due to high GC content of the product (70-80%) Due to. Addition of betaine to a final concentration of 2.5 M in the PCT reaction dramatically increases RT-PCR It has been found to improve the yield and purity of the product (WO 96/12041; R eeves et al., (1994) Am. J. Hum. Genet. 55: A238; Baskaran et al., (1996) Genome Rese. arch 6: 633-638). Assembly of the RT-PCR product is performed in-frame upstream of the proposed starting methionine. Reveals 1743bp open reading frame (ORF) with stop codon did. Confirmation of start and stop codons resulted in a 209 bp 5 'UTR and a 22 bp The 3'UTR has been cloned. However, additional sequences from each UTR It was not done. Because the purpose of RT-PCR experiments is to Because it's just to make sure, and not to assemble a full-length cDNA. is there. The location of the intron-exon boundary is determined by the genomic sequence and RT-PCR clones. Determined based on comparison (FIG. 19A). HNET, a 1.9 kb cDNA, adds spinal cord cDNA and betaine as templates. Cloned by nested PCR using standard PCR conditions Was. The human netrin protein is predicted to be 580 amino acids in size, The common domain structure of the phosphorus family was conserved. In FIG. Positions where the trinetrin and UNC-6 sequences match the human sequence are indicated by periods. While gaps introduced between alignments are indicated by hyphens. Arrows on the sequence alignment are as described (Serafini et al., Cell 78: 409- 424, 1994) shows the boundaries of the laminin VI and V domains and the C-terminal region (C). You. The signal sequence (S) is also shown. V-1, V-2, and V-3 are domains V Represents each of the EGF domains. hNET code sequence and its predicted The resulting protein products are shown in FIGS. 4A and 4B. Figures 4C and 4D show the 5 'and 3'UT 3 shows the full-length hNET cDNA including the R sequence. Several lines of evidence suggest that the human netrin gene described herein is fake. Make an adverse decision on the possibility of being a child. First, in the code area These exons also do not contain a stop codon. Second, the entire gene structure described is Highly conserved when compared to other members of the Trin / UNC-6 family I have. Third, lack of signal in Northern and RNA blot analyses. Nevertheless, the mature transcript was isolated by RT-PCR. Finally, it is highly stored, Sequences in the mouse EST database have been identified. Think together Thus, these data provide a novel human netrin with restricted expression pattern. Indicates that the gene was identified. Human netrin may have a significant role in nerve regeneration. Netrin is itself Does not promote axonal growth in the body, but they play a role in directing axonal growth You. The combination of growth-promoting activity with axon guidance cues is essential for directed nerve regeneration. It is a necessary requirement. The ability to clone genes with such restricted expression patterns is The netrin gene can be cloned using cDNA selection or direct library screening. Since it does not seem to be identified, one of the advantages of the exon trapping procedure is Show. These results identify sequences from large genomic contigs and It emphasizes the need to use various approaches to roam. Exon-trapping results show LCNI and D16S291 markers in centromeric to telomere direction. A new ATP binding cassette (ABC) at the PKD1 locus Further indicates that the sender is present. Database using exon trap sequences Searches show homology to mouse ABC1 and ABC2 genes (Luciani et al., Supra. , 1994). The human homologs of mouse ABC1 and ABC2 have been cloned and Mapped to 9 chromosomes (Luciani et al., Supra, 1994). cDNA selection and SAmple SE Use the sequence from the trapped exon along with the sequence from quencing (SASE). Was used to recover overlapping partial cDNA clones. Seven exon traps with homology to the ABC transporter are found in P1 clone 30. Isolated from 1F, 64.12C, and 96.4B. Addition encoded by ABC3 gene The specific sequence was determined using custom primers designed from exon traps (Tables II and II). I) using RT-PCR (placental and brain RNA as template) and live Rally PCR (using commercially available lung cDNA library as template) Was done. Three exon traps (L48758, L48759 and L48760) are 30.1F , 64.12C, and 96.4B from the overlapping region between the P1 clones (transcript F, FIG. 1); On the other hand, the fourth exon (L48753) maps exclusively to the 79.2A P1 clone ( Transcript E of FIG. 1). Exon traps derived from the hABC3 transporter encoded by transcript F Encodes a sequence having homology to the R domain of the mouse ABC1 and ABC2 genes You. R domain plays a regulatory role based on comparison to conserved regions in CFTR It is thought to fulfill. To date, only ABC1, ABC2, and CFTR have R It has been shown to contain domains (Luciani et al., Supra, 1994). In addition, linking three exon traps from transcript F 1. 1kb RT-PCR production (This RT-PCR product detects a 7kb message in the Northern blot) Obtained. Based on a search of the dbEST database, cDNA derived from this region was obtained. The sequences from exon traps L75924 and L75925 are M. A. G. E. Conso contained in cDNA 49233 from rtium (Lennon et al., supra). In the same transcription unit The presence of both cloning reagents was confirmed using RT-PCR. The ATP binding cassette (ABC) transporter or transport ATP is available in both prokaryotic and eukaryotic organisms. > 100 responsible for transport of a wide variety of substrates across cell membranes in other cells Protein family (Higgins, C. F. , Annu. Rev. Cell. Biol. 8: 67-113 , 1992; Higgins, C. F. Cell 82: 693-696, 1995). ABC Carrier Super Family Proteins are linked by strong structural similarity. Typically, AB The C transporter has four conserved domains, two hydrophobic domains that can confer substrate specificity (Payne et al., Mol. Gen. Genet. 200: 493-496, 1985; Footc et al., Naturalc 345: 255-258. , 1990; Anderson et al., Science 253: 202-205, 1991; Shustik et al., Br. J. Haematol. 79: 50-56, 1991; Covitz et al., EMBO J. 13: 1752-1759, 1994), and ATP binding and And two highly conserved domains involved in hydrolysis (Higgins, supra, 199). 2) having. ABC transporters are one of the molecules that enter and exit the cell and across subcellular membranes. Dominates directional transport (Higgins, supra, 1992). Their substrates are heavy metals (Ouell ette et al., Res. Microbiol. 142: 737-746 1991) from peptide and full size Protein (Gartner et al., Nature Genet. 16-23 1992). In eukaryotic cells, the ABC transporter is a single size containing all four domains. Symmetric proteins or two each containing hydrophobic and ATP binding domains Exists as any of the dimers resulting from the association of smaller polypeptides . An example of this multimeric structural form is the human TAP protein (Kelly et al., Nature 355: 6). 41 -644, 1992) and a functional PMP70 protein (Kamijo et al., J. Mol. Biol. Chem. 265: 4534- 40 1990). This multimeric structure also results in numerous prokaryotic ABC transporters Found in The hydrophobic region consists of up to six transmembrane segments Become. Each ATP binding domain operates independently and may not be functionally equivalent. (Kerem et al., Science 245: 1073-80 1989; Mimmack et al., Proc. Natl. Acad . Sci. , USA 86: 8257-61 1989; Cutting et al., Nature 346: 366-369 1990; Kerppola. J. Biol. Chem. 266: 9857-65, 1991). To date, some of the ABC transporters identified in humans are clinically important. It was shown that there is. For example, overexpression of P-glycoprotein is Cause drug resistance (Gottesman et al., Ann. Rev. Biochem. 62: 385-427 1993). Classic cystic fibrosis (CF) and bilateral congenital vas deferens disease (CBAVD) A large percentage of cases are cystic fibrosis transmembrane conductance regulators (CFTR), Caused by mutations in the ABC transporter (Kerem et al., Supra; Cutting et al., Supra) Out). Deficiencies in the ABC transporter are also associated with Zuerweger syndrome (Gartner et al., Supra). Ex) and adrenal brain gray matter dystrophy (Mosser et al., Nature 361: 726-730 1993) ) Involved. Two members of the new ABC transporter subgroup (mouse ABC1 and ABC2) Contain a domain similar to the regulatory R domain of CFTR (Luciani et al. Supra, 1994). Functionally, mouse ABC1 protein is a macromolecule of apoptotic cells. Have been shown to play a role in the swallowing of lophages (Luciani et al., EMB O J. 16: 226-235, 1996), while the function of ABC2 remains unknown. All three tongues The protein contains a large charged region that contains several potential phosphorylation sites (Kere m et al., supra; Luciani et al., supra, 1994). Charged amino acid residues in this region And in the block where the negative charges are alternated. A common property of these particular ABC transporters (including hABC3) is that There is a large linker domain between the sets. Non-linker domain The presence of always many polar residues and potential phosphorylation sites suggests that this region Suggests that it may play a regulatory role probably similar to that of the domain (Kerem Et al., Supra). In addition, the four proteins are also in a conserved linker domain Contains an HH1 domain, which is a hydrophobic region (Luciani et al., Supra, 1994). hABC3 and Sequence-level homology between the HH1 domains of Appear to be structurally conserved, and each domain has a β-sheet conformation. Expected to have. The similarity of these proteins indicates that they all Suggests belonging to the same ABC subfamily defined by C1 and ABC2 (Luciani et al., Supra, 1994). Genes encoding human homologs of ABC1 and ABC2 Mapped to human chromosome 9 at q22-q31 and q34, respectively (Luciani et al. Supra, 1994). ABC1, ABC2, and hA despite being members of the same subfamily BC3 appears to have a different functional role. ABC1, ABC2, and hABC3 transmembrane And the differences present in the linker domains can confer unique substrate specificities, respectively. You. For example, in the transmembrane domain of both prokaryotic and eukaryotic ABC transporters Changes and mutations have been shown to alter substrate specificity (Payne et al., Supra; Foo te et al., supra; Covitz et al., supra), while changes to the R domain of CFTR are (See Anderson et al., Supra; Rich et al., Science 253: 20.) 5-207 1991). Differences in the expression patterns of ABC1, ABC2, and hABC3 also It suggests that these proteins can be functionally different. Mouse ABC1 and AB C2 is expressed at various levels in a wide variety of adult and embryonic tissues The highest levels of ABC1 expression were found in pregnant uterus and in monocyte-rich areas. Area, while the highest levels of ABC2 expression were shown in the brain ( Luciani et al., Supra, 1994; Luciani et al., Supra, 1996). In contrast, hABC3 is In the brain, heart, and pancreas. Is shown. Except for the structural differences between ABC1, ABC2, and hABC3, the three proteins differ It is always possible to perform similar functional roles in different cell populations. Until now No function has been proposed for mouse ABC2. However, recent data Shows that ABC1 is required for swallowing cells undergoing apoptosis, but AB The molecular mechanism underlying C1 function is unknown (Luciani et al., Supra, 1996). hAB When C3 functions in a manner similar to ABC1, pulmonary macrophages involved in host defense The Can be expressed by ABC transporters cover substrates ranging from small ions to large polysaccharides and proteins. It was described. Based on high levels of expression in the lung, substrates for hABC3 Function (including ion or polysaccharide transport). Further Some clues can be provided by more precise testing of hABC3 expression in the lung. These studies identify the lung cells responsible for hABC3 expression and identify the subcellular localization of hABC3. Including decisions. The identification and cloning of hABC3 cDNA is based on the potential R domain Cystic fibrosis because it contains cancer and is expressed at the highest level in the lungs. May be involved. hABC3 plays an essential role in lung function Modulation or alteration of hABC3 substrate specificity has significant therapeutic implications for CF I can do it. Some cDNAs are homologous to the GeneTrapper direct selection system and ABC1 The most 5 'trapped exon coding sequence (with trapped exo L48747). The most 5 'side Normal human lung using custom oligonucleotides designed from Sontrap The longest clone isolated from the cDNA library with the GeneTrapper system is The length was 5719 bp (ABCgt. 1). Additional cDNA clones (ABC. 5) The pro Radioactively labeled as It was isolated using a 1 kb RT-PCR product (ABC3-12). (Figure 15). The 5 'end of the ABC3 cDNA was further characterized using 5' RACE and several R The ACE product contained multiple in-frame stop codons upstream of the initiation methionine. Therefore, the present invention provides a novel homology to mouse ABC1 and ABC2 genes. Human ABC gene, as well as C. Cosmid C48B4 derived from elegans. 4 (Wilson et al., Provided are sequences predicted to be encoded by supra). 6. 4 kb cDNA is hABC3 Assembled for transport. The assembled cDNA encodes 1705 amino acids Contains the 5116 nucleotide long open reading frame The protein had a molecular weight of 191 kDa. The proposed starting methionine was cloned ABCg t. It is 50 bp upstream of the 5 'end of 1. P1 clone 109. 8C and 47. The five trapped exons from 2H are Shown to contain sequences with homology to human ribosomal protein L3 cDNA Hybridization studies point to L3-like genes from centromeres to telomeres (Transcript L in FIG. 1). The ribosomal L3 gene product is Five essential proteins for peptidyltransferase activity in the One of the proteins (Schulze and Nierhaus, EMBO J. 1: 609-613,198 2). Not surprisingly, the L3 amino acid sequence is highly conserved among species. You. The mammalian L3 gene showing about 98% protein sequence identity is human (Genbank) Accession number X73460), mouse (Peckham et al., Genes Dev. 3: 2062-2071, 1989) (Kuwano and Wool, Biochim. Biophys. Res. Comm. 187: 58-64, 1992), and Cattle (Simonic et al., Biochem. Biophys. Acta 1219: 706-710, 1994) Was. Human ribosomal protein L3 cDNA reported as trapped exons Is 74% (537/724) at the nucleotide level. Was. Full-length cDNA encoding a novel ribosomal L3 protein subtype, SEM L3 It was isolated and sequenced (FIG. 11). This gene is now called RPL3L, and G Designated as enbank accession number U65581. Putative protein sequence is 407 amino acids long And are themselves highly conserved, other known mammalian L3 proteins. Shows 77% identity to protein. Hybridization of human genomic DNA Analysis showed that this new gene was a single copy, and that tissue-specific expression patterns Is suggested. The expression patterns of the previously identified human L3 gene and the novel human RPL3L Numbers of tissue were determined using Northern blots. The human L3 gene is found in the pancreas A ubiquitous expression pattern was shown in all tissues with the highest expression. Contrast In addition, the novel genes described herein are associated with lower expression levels in the pancreas. In addition, it is strongly expressed in skeletal muscle and heart tissue. This new gene RPL3L (Like ribosomal protein L3), chromosome 16p13. Near PKD1 and TSC2 genes on 3 Are located in regions rich in many genes. The RPL3L protein is different from the previously described nuclear-encoded mitochondrial protein. Closely related to the aforementioned cytosolic ribosomal proteins (Graack et al., Eur. J. Bio chem. 206: 373-380, 1992). The existence of highly conserved nuclear localization sequences in RPL3L , This represents a novel cytoplasmic L3 ribosomal protein subtype, and We further support the hypothesis that we do not show domitochondrial proteins. Furthermore, an exon trap derived from a gene located on the telomere side of the L3-like gene ( Genbank accession number L48792) was obtained (transcript M in FIG. 1). Copy by transcript M The sequence to be read is pilB from Neisseria gonorrhoeae (Taha et al., EMBO J. 7:43 67-4378, 1988), as well as C.I. from elegans Cosmid F44E2. 17.Coded by 6. 2kDa protein (Wilson et al., Supra) Has been shown to be homologous to Using the sequence from exon trap L48792, a 600 bp partial cDNA was isolated. And it was determined that the corresponding gene was directed from the centromere to the telomere. 1. 3k The message in b was detected by this cDNA in a Northern blot. part Assuming a target cDNA 17. The sequence conserved between the 2 kDa protein and the Neisseria gon pilB protein from orrhoeae (Taha et al., supra), hypothetical from yeast 19. 3 kDa protein (Genbank accession number P25566), and pili from Haemophilus In the transcriptional regulatory repressor (Fleischmann et al., Science 269: 496-512 1995) Saved (Figure 2). The pilB protein binds to the histidine kinase sensor Has homology and is responsible for inhibiting pilin production in Neisseria gonorrhoeae (Taha et al., Supra, 1988; Taha et al., Mol. Microbiol. 5: 137-148, 1991). However, pilB, transcript M, and C. elangans, yeast, and And the conserved residues between the Haemophilus sequences are conserved histidines from pilB It does not contain a kinase domain (Taha et al., Supra, 1991). These findings are The conserved region in M is independent of pilB's proposed histidine kinase sensor activity It suggests that it has the function. 109. 8C clone and 47. Additional exhaustion from the overlapping region with the 2H P1 clone Sontrap traps the human LLRep3 sequence (Slynn et al., Nuc. Acids Res. 18: 681, 1990) It was shown to include. Hybridization studies were performed using the LLRep3 sequence (transcription of Figure 1). Object K) was located between sazD and the L3-like gene. Highest gene density The region of the telomere end of this cloned interval, in particular, TSC2 and D16S84 And at least five genes (transcription units K, L, and M, sazD and hERV1) map to this area. Rat enhancers of liver regeneration previously described (Hagiya et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , USA 91: 8142-8146, 1994) and is 86% identical at the nucleotide level (17 0/197) Exon traps have also been mapped to this area. ALR is a damaged liver A growth factor that increases the growth of visceral tissue but has no effect on resting liver is there. Studies have demonstrated that rat ALR can increase hepatocyte regeneration after hepatectomy Was. This ALR-like exon trap also supports the recently described hERV1 gene (which Sequence from the mother ERV1 (encoding a functional homologue to Lisowsky et al., Supra) It was shown to contain. HALR, a 468 bp cDNA, is obtained from the human ALR gene (FIG. 13). ALR distribution Column is 84. for rat ALR protein. 8% identical, and 94. 1% similar Encodes a protein of 119 amino acids (FIG. 14). The cloning of human ALR is significantly involved in the treatment of degenerative liver disease. For example Biologically active rat ALR is produced from COS-7 cells expressing rat ALR cDNA (Hagiya et al., Supra). Therefore, recombinant hALR is useful for treating damaged liver. Could be used. Furthermore, constructs expressing hALR may be used to treat chronic liver disease. Used in gene therapy. 43 trapped exons are found in protein or DNA databases It has no significant homology to the sequence and the exon traps observed in dbEST It was also not an EST (expressed sequence tag) containing a sequence derived from the template. These new d The absence of an EST containing sequences from the xon trap is a further analysis. One of the criteria for selecting exon traps for Not surprising, as was the presence of the EST in. These traps Exons appear to represent a true product. Because often they Multiple times from different P1 clones and in combination with adjacent exons Because it was wrapped. The present invention relates to an isolated nucleic acid comprising a unique exon sequence derived from chromosome 16. Includes a novel human gene. The sequences described herein may be used for transcription mapping. Providing valuable resources for and at least two causes of genetic disorders Create a set of sequence preparation templates for a gene-rich interval. Accordingly, the present invention provides human netrin (hNET), human ATP binding cassette transporter (hABC3) , Human ribosome L3 (RPL3L), and human enhancer of liver regeneration (hALR) polypeptide Provided is an isolated nucleic acid that encodes a nucleic acid. The present invention is derived from chromosome 16 Further provided is an isolated nucleic acid comprising a unique exon sequence. The term "nucleic acid" (Po RNA) and single- and double-stranded DNA, cDNA, etc. Also includes oligonucleotides. As used herein, the phrase "isolated" , A non-naturally occurring form of a polynucleotide. One method for isolating a polynucleotide encoding a polypeptide of the present invention is described below. This means that human tissue-specific libraries can be natively or naturally-occurring using methods well known in the art. Is to probe with an artificially designed DNA probe. Human Netrin Gene (hNET), human ABC transporter gene (hABC3), human ribosomal protein L3 Gene derived from the gene (RPL3L) or the human enhancer gene for liver regeneration (hALR) Probes are particularly useful for this purpose. DNA encoding the polypeptide of the present invention and And cDNA molecules using the methods described in more detail below, Obtain complementary genomic DNA, cDNA, or RNA from animals or other animal sources Or more relevant by screening cDNA or genomic libraries cDNA or genomic clones can be isolated. The present invention relates to isolated nuclei derived from the sequences shown in FIGS. 3, 4, 8, 11 and 15. Acid sequences (including sense and antisense oligonucleotide sequences). hN Sequences from ET, hABC3, PRL3L (SEM L3), and hALR also contain heterologous sequences (pro Motor, enhancer, response element, signal sequence, polyadenylation sequence Etc.). Further, nucleic acids are stable, soluble, binding affinity, And can be modified to alter specificity. For example, a sequence derived from the present invention is: Nuclease resistant phosphorothioates, phosphoramidates and methylphospho Nate derivatives, and as described in Nielsen et al., Science, 254: 1497, 1991. The protein nucleic acid (PNA) is formed by coupling a base to the amino acid backbone. ) ". Nucleic acids may be derived from ligation of α-anomeric nucleotides or Or methyl phosphotriester or ethyl phosphotriester or It can be derivatized by formation of a kilphosphordate linkage. Further, the core of the present invention The acid sequence may also provide a detectable signal, either directly or indirectly. Label. Exemplary labels include radioisotopes, fluorescent molecules, biotin Including In general, nucleic acid manipulation according to the present invention is described, for example, in Sambrook et al., Molecular Clonin. g, A Laboratory Manual 2nd edition (Cold Spring Harbor, NY, 1989) or Ausubel Et al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene Assoc. , Wiley Interscie nce, NY, NY, 1992) using methods well known in the art. Examples of nucleic acids include human netrin, human ABC transporter, human ribosomal L3 subtype, Or RNA, cDNA, or genomic encoding a human enhancer polypeptide for liver regeneration. Is DNA. Such nucleic acids are shown in FIGS. 3, 4, 8, 11 and 15, respectively. May have substantially the same coding sequence as the coding sequence. The present invention relates to hNET, hABC3, PRL3L (formerly SEM L3), hALR gene or Further providing an isolated oligonucleotide corresponding to the sequence in each cDNA, These, alone or together, combine a genuine expressed gene with a homolog or other repetitive sequence. Can be used to distinguish. These oligonucleotides can be from about 12 to about It can be 60 nucleotides, preferably about 18 nucleotides, single or double stranded Yes, and can be labeled or modified as described below. The present invention also differs from the nucleic acids shown in FIGS. 3, 4, 8, 11 and 15 but in the same table. Have the same type (ie, the same as shown in FIGS. 3, 4, 8, 11 and 15 respectively) Nucleic acids that substantially encode the amino acid sequence). Phenotypically similar nucleic acids also , "Functionally equivalent nucleic acids". As used herein, the phrase "functionally equivalent "Unique nucleic acid" refers to the same protein product (one or more) as the nucleic acid disclosed herein. ) That function in substantially the same manner to produce And nucleic acids characterized by: In particular, functionally equivalent nucleic acids are referred to herein. The same protein as that disclosed or having conservative amino acid mutations. Code. For example, a conservative mutation may involve the replacement of a non-polar residue with another non-polar residue, or Or the replacement of a charged residue with a similarly charged residue. These mutations are And mutations recognized by those skilled in the art as mutations that do not substantially alter the tertiary structure of The nucleic acids of the invention under specific hybridization conditions due to the degeneracy of the genetic code Not necessarily hybridize to human netrin, human ABC3 transporter, human ribosomal Encoding L3 subtype and human enhancer polypeptide for liver regeneration Are further provided. A preferred nucleic acid encoding a polypeptide of the invention is shown in FIG. Encoding substantially the same amino acid sequence shown in 8, 11, and 15 Consisting of Alternatively, encodes the polypeptide (s) of the invention Preferred nucleic acids are shown in FIGS. 3, 4, 8, 11 and 15 under high stringency conditions. The substantially complete sequence or a substantial portion of the nucleic acid sequence shown in That is, typically, at least 12 to 60 nucleotides). As used herein, the stringency of hybridization is poly This refers to conditions under which the nucleotide hybrid is stable. As known to those skilled in the art, Brid stability is a function of sodium ion concentration and temperature (eg, See Sambrook et al., Supra). The present invention provides for operably linked promoters for RNA transcription as well as other regulatory sequences. Provided isolated polynucleotides. As used herein, the phrase “operable "Functionally linked" refers to the regulation and effector of polynucleotides and nucleotides -Sequences (eg, promoters, enhancers, transcription and translation termination sites, And other signal sequences). For example, polynucleotide An operable linkage to the promoter is such that DNA transcription specifically recognizes and binds to the promoter. Is initiated from the promoter by a matching RNA polymerase, and Polynucleotide that directs transcription of RNA from the polynucleotide. Refers to the physical and functional relationship between the promoter and the promoter. The promoter region is sufficient for RNA polymerase recognition, binding, and transcription initiation. Contains a specific sequence. In addition, the promoter region recognizes and binds RNA polymerase. And sequences that regulate transcription initiation activity. Such an arrangement may act cis Or be responsive to trans-acting factors. Depends on the nature of the regulation Thus, a promoter can be constitutive or regulated. promoter Examples include SP6, T4, T7, SV40 early promoter, cytomegalovirus (CMV) Motor, mouse mammary tumor virus (MMTV) steroid-inducible promoter, Ronnie mouse leukemia virus (MMLV) promoter and the like. A promoter and clonin to which a polynucleotide can be operably linked Vectors that contain both coding sites are well known in the art. Such a vector Can transcribe RNA in vitro, in vivo and in vivo, and ) And Promega Biotech (Madison, WI). Departure Extra, potential, and unsuitable for optimizing current and / or in vitro transcription Expression, either at the critical or alternative translation initiation codon or at the transcription or translation level. 5 ′ of the clone and / or to eliminate other sequences that may be harmed or reduced It may be necessary to remove, add or change the 3 'untranslated portion. Alternatively, the consensus ribosome binding site is used to enhance the expression Can be inserted just 5 'to the Similarly, alternative codons encoding the same amino acid are To enhance transcription, human netrin, human ABC3 transporter, human ribosomal L3 Genotype, or in place of the coding sequence of a human enhancer polypeptide for liver regeneration. (Eg, the host cell's codon preference can be adopted, and the G-C rich domain And the like can be reduced). Examples of vectors are described for expression in various eukaryotic and prokaryotic hosts. And can be used for gene therapy as well as simple protein expression Viruses typically used in the art (eg, baculovirus and Retrovirus), bacteriophage, cosmid, plasmid, fungal vector , And other recombinant vehicles. The polynucleotide is inserted into the vector genome using methods well known in the art. It is. For example, the insert and the vector DNA pair with each other and ligase Appropriate conditions to create complementary ends on each molecule that can be joined together using Under certain conditions. Alternatively, the synthetic nucleic acid linker is treated with a restriction enzyme. Can be ligated to the terminated polynucleotide. These synthetic linkers are -Contains the nucleic acid sequence corresponding to a particular restriction site in DNA. In addition, stop codons and Oligonucleotides containing appropriate restriction sites are provided for insertion, for example, It can be linked to a vector containing some or all: a selectable marker gene (eg, , Neural networks for the selection of stable or transient transfectants in mammalian cells Omycin gene); derived from the immediate early gene of human CMV for high-level transcription Enhancer / promoter sequence; SV40-derived promoter for mRNA stability Transcription termination and RNA processing signals; SV40 plasmid for proper episomal replication Rioma origin of replication and ColE1; diversified multicloning sites; and T7 and SP6 RNA promoters for in vitro transcription of sense and antisense RNA Data. Other means are well known and available in the art. Bacterial cells, yeast cells, amphibian cells, insect cells, mammalian cells, and other animals Human netrin, human ABC3 transporter, human ribosomal, adapted for expression in cells L3 subtype and a polynucleic acid encoding a human enhancer polypeptide for liver regeneration Also provided are vectors containing the nucleotides. Vectors enable their expression As such, human netrin, human ABC3 transporter, human ribosomal L3 subtype, Is position relative to a polynucleotide encoding a human enhancer polypeptide for liver regeneration Polynucleotides in bacteria, yeast, amphibians, mammals, or animal cells It further contains regulatory elements required for expression of the tide. As used herein, `` expression '' Means that the polynucleotide is transcribed into mRNA and that the peptide, polypeptide, or Or the process of being translated into protein. Polynucleotides become genomic DNA If derived, expression is controlled by mRNA mRNA if an appropriate eukaryotic host is selected. May include pricing. The regulatory elements required for expression are RNA polymerase A promoter sequence that binds to the enzyme and a transcription initiation sequence for ribosome binding. Including. For example, bacterial expression vectors contain a promoter such as the lac promoter. And a Shine-Dalgarno sequence for transcription initiation and the start codon AUG (Sa mbrook et al., supra). Similarly, eukaryotic expression vectors contain variants for RNA polymerase II. Species or homologous promoter, downstream polyadenylation signal, start codon AUG, And a stop codon for ribosome isolation. Such vectors are commercially available Obtained by the method or a method well known in the art (for example, constructing a general vector). (Methods for building above). Departure Current vectors are useful for generating cells that express the receptor of the present invention. The present invention relates to human netrin, human ABC3 transporter, human ribosomal L3 subtype, or Or a transformed host cell that recombinantly expresses a human enhancer polypeptide for liver regeneration. Provide vesicles. The host cell of the present invention comprises human netrin, human ABC3 transporter, human ribosome. A polypeptide encoding a somatic L3 subtype or a human enhancer polypeptide for liver regeneration It has been transformed with a nucleotide. Examples are suitable for expression in mammalian cells. A mammalian cell containing the combined plasmid. Plasmids are human netrin, human ABC3 transporter, human ribosomal L3 subtype or human enhancer poly for liver regeneration Necessary for the expression of the polynucleotide encoding the peptide and the protein of the present invention. Includes essential regulatory elements. Suitable host cells are bacteria, archaebacteria, fungi, especially yeast, plant cells, insect cells, and others. And animal cells, especially mammalian cells. E. coli, B. Subtilis, Saccharomyces cerevisiae, SF9 cells, C129 cells, 293 cells, Neurospora, and CHO cells, COS cells Vesicles, HeLa cells, and immortalized mammalian myeloid and lymphoid cell lines are of particular interest deep. Preferred replication systems include M13, ColE1, SV40, baculovirus, λ, adenovirus Includes ills, artificial chromosomes, etc. Numerous transcription initiation and termination regulatory regions have been isolated And is effective at transcribing and translating heterologous proteins in various hosts. Are shown. Examples of these regions, isolation methods, modes of operation, etc. are publicly available in the art. Is knowledge. Under appropriate expression conditions, the host cell may contain the recombinantly produced hNET, hABC3, R PL 3L (formerly SEM L3), and / or can be used as a source of hALR. Nucleic acids (polynucleotides) encoding the polypeptides of the invention may also be recombinant. Events can be incorporated into the genome of the recipient cell. For example, such a distribution Rows are microinjected into cells, which results in hNET, hABC3, RPL3L (hereinafter Previously SEM L3), and / or the endogenous gene encoding hALR, Or pseudogene, or hNET, hABC3, RPL3L (SEM L3), or hALR-encoded genes It may result in homologous recombination at the site of the sequence having substantial identity to the offspring. Other recombination-based methods (eg, heterologous recombination) or, in particular, Endogenous gene deletion by homologous recombination in can also be used. The present invention relates to isolated peptides, polypeptides encoded by the nucleic acids of the invention. Provide the drug (s) and / or protein (s) You. The invention also relates to the hNET, hABC3, RPL3L (SEM L3) and hALR genes. Polypeptide having the sequence to be encoded, and 6 polypeptides derived therefrom. Includes peptides of the above amino acids. The polypeptide (s) will be Or can be isolated from human tissue obtained by autopsy or described herein. Can be produced in heterologous cells by the following recombinant DNA method. As used herein, the term "isolated" refers to cellular components and / or natural A protein molecule that is free of contaminants normally associated with in vivo smells. Departure The clear polypeptide and / or protein may be any naturally occurring allele. Includes variants as well as recombinant forms thereof. Polypeptides of the invention are well known to those of skill in the art. Can be isolated using various methods. Methods available for isolating and purifying the proteins of the invention include precipitation, gel filtration, And chromatographic methods (molecular sieving, ion exchange, and, for example, hNET , HABC3, RPL3L (SEM L3), and / or hALR-specific antibodies or ligands (Including the affinity chromatography used). Another well-known method is De utscher et al., Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology Volume 182 (A cademic Press, 1990). Recombinant polypeptide of the invention to be purified When produced in a recombinant system, the recombinant expression vector may have an additional amino terminus or These sequences may include additional sequences that encode the carboxy terminal amino acids; Noic acid can be purified by immunoaffinity purification using immobilized antibodies or immobilized ligands. Serves as a "tag" for the affinity purification used. Peptides containing hNET, hABC3, RPL3L (SEM L3), or hALR specific sequences are Proteolytic cleavage was used (e.g., using a proteic such as trypsin well known in the art). Isolated by the chemical treatments such as the thease and cyanogen bromide). HNET, hABC3, RPL3L (SEM L3), or hALR polypeptide. is there Alternatively, peptides up to 60 residues in length can be milled using a commercially available peptide synthesizer. It can be synthesized on a daily basis in the desired amount. Examples of means for preparing the polypeptide (s) of the invention include Suitable host cells (eg, bacterial cells, yeast cells, amphibians) can be prepared using methods well known in the art. Cells (ie, oocytes), insect cells (ie, Drosophila), or In mammalian cells), hNET, hABC3, RPL3L (SEM L3), and / or hALR Express the encoding polynucleotide and express it again using well-known methods. To recover the recovered polypeptide. The polypeptide of the present invention is described in detail below. It can be isolated directly from cells transformed with the described expression vectors. Of the present invention Polypeptides, biologically active fragments, and functional equivalents thereof also , Can be produced by chemical synthesis. As used herein, the term "biologically active In FIGS. 4, 8, 11, and 15 that can be assembled into active proteins. Any part of the polypeptide represented by the amino acid sequence. Synthetic polypep Pide was purchased from Applied Biosystems, Inc. using chemistry provided by the manufacturer. Model 430A or 431A automated peptide synthesizer (Foster City, CA) You. The following phrases: "recombinantly expressed / produced", "isolated", or Nucleic acids, polynucleotides, polypeptides of the invention having "substantially pure" , Peptides, or protein modifications can be produced by humans in such forms. Nucleic acids, polynucleotides that have been isolated from their natural in vivo cellular environment. Includes nucleotides, polypeptides, peptides, or proteins. This person's intervention As a result of the recombinant nucleic acids, polynucleotides, polypeptides, peptides And proteins, where the corresponding naturally occurring molecule is a selective drug or compound. It is useful in that it is not as useful as the identification of Sequences having "substantial sequence homology" have at least about 90% of the nucleic acids of the invention. A nucleotide sequence that shares identity; and at least with a polypeptide of the present invention. Intended to refer to an amino acid sequence that typically shares about 95% amino acid identity. It is. However, it contains less than the above level of homology that occurs as a splice variant Or modified by conservative amino acid substitutions or by substitution of degenerate codons It is recognized that polypeptides or nucleic acids that are also included within the scope of the present invention. You. The present invention relates to human netrin, human ABC3 transporter, human ribosomal L3 subtype, or Or nucleic acid sequence encoding a human enhancer polypeptide for liver regeneration (Eg, within the nucleotide sequences shown in FIGS. 3, 4, 8, 11, and 15, respectively) And a polynucleotide that can specifically hybridize with the A nucleic acid probe. As used herein, a "nucleic acid probe" is shown in FIGS. 3, 4, 8, 11, and 15. About 12 to about 60 contiguous bases, preferably about 18 nucleotides, comprising a single strand or Can be double-stranded and can be labeled or modified as described herein. Nucleotide sequence. The preferred region from which the construction probe is derived is 5 'or And / or 3 'coding sequences, sequences predicted to encode transmembrane domains, Sequences predicted to encode the cytoplasmic loop, signal sequence, ligand binding site Including The full length or fragment of the cDNA clone can also be used to detect and Can be used as a probe for release. Fragments used as probes If preferred, the cDNA sequence is derived from the carboxy-terminal coding portion of the cDNA, Most preferably it comprises the predicted transmembrane domain coding portion of the cDNA sequence. Transmembrane Domain regions are described, for example, in Kyte and Doolittle (J. Mol. Biol. 157: 105, 1982) Can be predicted based on the hydropathic index analysis of the deduced amino acid sequence using the method . As used herein, the phrase “specifically hybridizes” refers to a polynucleotide. Recognizes the nucleic acid sequence complementary to it and via hydrogen bonding between complementary base pairs. And the ability to form double helix segments. Nucleic acid probe technology is And those skilled in the art will recognize that such probes can vary greatly in length. And a detectable agent (eg, radioactive (A sex isotope, a fluorescent dye, etc.). Professional of the present invention Can be a human netrin, a human ABC3 transporter, a human ribosomal L3 subtype, or Useful for detecting the presence of nucleic acids encoding human enhancer polypeptides for liver regeneration It is. For example, a probe may locate a biological tissue in which a gene of the invention is expressed. It can be used for in situ hybridization to attach. Further Human netrin, human ABC3 transporter, human ribosomal L3 subtype, or liver Complementary to the nucleic acid of a polynucleotide encoding a human enhancer of regeneration polypeptide The synthesized oligonucleotides were tested for the genes of the invention and their associated mRNAs. Homology screening for genomic or cDNA libraries For isolation of related genes using PCR or using amplification techniques well known to those skilled in the art. And is useful as a probe. Human netrin, human ABC3 transporter, human ribosomal L3 subtype, or liver Specific binding to any part of the mRNA encoding the raw human enhancer polypeptide Antisense oligonucleotides with sequences that can interfere with the translation of mRNA are also provided. Provided. Antisense oligonucleotides include human netrin, human ABC3 transporter , Human ribosome L3 subtype, or human enhancer polypeptide for liver regeneration May have a sequence that can specifically bind to any part of the cDNA sequence to be loaded. This specification As used in the phrase "specifically binds," the nucleic acid sequence recognizes a complementary nucleic acid sequence, And form double helical segments with complementary base pairs via hydrogen bonding between them Including the ability to Examples of antisense oligonucleotides are the chemical Anti-sense oligonucleotides containing analogs (ie, synthetic antisense Oligonucleotide, SAO). Passes through the cell membrane and human netrin, human ABC3 transporter, human ribosomal L3 Specific for mRNA encoding subtype or human enhancer polypeptide for liver regeneration Acceptable hydrophobic carrier capable of binding to its translation and crossing cell membranes Prevent human netrin, human ABC3 transporter, human ribosomal L3 subtype Or antisense agents effective to reduce expression of the human enhancer polypeptide. A composition comprising an amount of a sense oligonucleotide (SAOC) is also provided herein. It is. Acceptable hydrophobic carriers that can cross cell membranes can also be selected cell types. That bind to specific receptors for May include structures that are absorbed. This structure binds to cell type specific receptors May be part of a known protein. The present invention provides synthetic antigens that inhibit the translation of mRNAs encoding these polypeptides. Of the present invention by using antisense oligonucleotide composition (SAOC) To provide a means of regulating the expression level of the peptide. Recognizes and specifically binds mRNA Synthetic oligonucleotides or other antisense chemical structures designed to The construction of DNA, RNA, or chemically modified artificial nucleic acids is shown in Figures 3, 4, 8, 11, and And are constructed to be complementary to portions of the nucleotide sequence shown in FIGS. SA OC can be used in the bloodstream for administration to a subject by injection, or in the laboratory. Designed to be stable under culture conditions. SAOC can cross cell membranes Depending on the physical and chemical properties of the SAOC (for example, creating a small hydrophobic SAOC chemical structure) Specific transport of cells that recognizes SAOC and transports it to cells) The delivery system is designed to be able to cross the cell membrane and enter the cytoplasm of the cell. In addition, SAOCs are specific for binding and absorbing SAOCs only within selected cell populations. By targeting SAOCs as recognized by a specific cell uptake mechanism Can be designed for administration to only a selected population of cells. For example, SAOC Binds to receptors found only on certain cell types as discussed in Can be designed. SAOC also recognizes and selectively binds target mRNA sequences Which are included in the sequences shown in FIGS. 3, 4, 8, 11 and 15. Can correspond to an array. SAOC binds to target mRNA and degrades mRNA (eg, RNase I ) Or prevent the binding of translational regulators or ribosomes. Harm, or other chemical structure that either degrades or chemically modifies the target mRNA. (Eg, ribozyme sequences or reactive chemical groups) to convert mRNA targets. It is designed to inactivate the target mRNA sequence either by inhibiting translation. SAOC may be capable of such properties when directed against mRNA targets. (Cohen et al., TIPS, 10: 435, 1989 and Weintraub, Sci. American, January 40, 1990). The present invention relates to an acceptable carrier as well as isolated purified human netrin, human AB C3 transporter, human ribosomal L3 subtype, or polypep, a human enhancer of liver regeneration Pide, its active fragment, or purified mature protein and its activity Further provided are compositions comprising fragments, alone or in combination with each other. This These polypeptides or proteins can be obtained recombinantly or chemically synthesized Or purified from natural sources. As used herein, the term An "acceptable carrier" is a standard pharmaceutical carrier (eg, a phosphate buffered saline diet). Aqueous salt solutions, water, and emulsions (eg, oil / water or water / oil emulsions) ), And any of various types of wetting agents). The human netrin, human ABC3 transporter, human ribosomal L3 subtype of the present invention, or Also provides antibodies that have specific reactivity with human enhancer polypeptides for liver regeneration It is. Active fragments of an antibody are included within the definition of “antibody”. Antibodies of the invention Are those known in the art using the protein of the present invention or a portion thereof as an antigen. Method. For example, polyclonal and monoclonal antibodies For example, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Har bor Laboratory 1988), by methods well known in the art. Can be The polypeptides of the present invention are used as immunogens in the production of such antibodies. Can be Alternatively, the synthetic peptide is prepared (using a commercially available synthesizer) and It can be used as an immunogen. Natural or synthetic hNET, hABC3, RPL3L (SEM L3), And / or using peptides derived from hALR, hNET, hABC3, RPL3L (SEM L3) And / or induces a hALR-specific immune response, this peptide is a suitable key Carrier (eg, KLH) and a suitable adjuvant (eg, , Freund's adjuvant). Preferably selected The peptide was obtained from Tam, Proc. Natl. Acad. Sci, USA. 85: 5409-5413, 1988 It is bound to the lysine core carrier according to the target. The resulting antibody is in a monovalent form (eg, For example, Fab, Fab_Two, FAB ', FV). Anti-idiotype antibodies are also public It can be prepared using known methods. In one embodiment, normal or mutant hNET, hABC3, RPL3L (SEM L3), and HALR polypeptide immunizes mice, after which their spleens are removed and Using splenocytes and cells with myeloma cells according to standard techniques in the art Used to form hybrids and obtain clones of antibody-secreting cells . The resulting monoclonal antibodies include hNET, hABC3, RPL3L (SEM L3), and / or Is the hALR protein or hNET, hABC3, RPL3L (SEM L3), and / or Screened for specific binding to the ream peptide. In another embodiment, the antibody is normal or mutant hNET, hABC3, RPL3L (SEM L3) , Or for selective binding to the hALR sequence. hNET, hABC 3, antibodies that distinguish between normal and mutant forms of RPL3L (SEM L3) or hALR are ELIS In diagnostic tests (see below) using A, EMIT, CEDIA, SLIFA, etc. Can be used. Anti-hNET, hABC3, RPL3L (SEM L3), or hALR antibodies also And can be used to perform histochemical localization studies. Finally, antibodies are normal Or HNET, hABC3, RPL3L (SEM L3), and / or hALR polypep Blocking the function of the tide or conducting rational drug design studies (eg, Identify and test inhibitor function (using an anti-idiotypic antibody approach) Can be used to test. The amino acid sequence is the hydrophobic or hydrophilic domain of the polypeptide to which they correspond. Can be analyzed by methods well known in the art to determine whether to code You. Altered antibodies (eg, chimeric, humanized, CDR-conjugated, or bifunctional antibodies) ) Can also be produced by methods well known in the art. Such antibodies also See, for example, the hive described in Sambrook et al., Supra and Harlow and Lane, supra. It can be produced by lidoma, chemical synthesis, or recombinant methods. Anti-peptide and anti- Both fusion protein antibodies can be used (eg, Bahouth et al., Trends Pharma). col. Sci. 12: 338, 1991; see Ausubel et al., supra). The antibodies of the invention can be used to isolate a polypeptide of the invention. Follow Antibodies may be used to detect the presence of a polypeptide of the invention, as well as localize the polypeptide. , Composition, and structure of functional domains. Human netrin, human AB C3 transporter, human ribosomal L3 subtype, or polypep, a human enhancer of liver regeneration Methods for detecting the presence of a tide allow binding of an antibody to a polypeptide Contacting the cell with an antibody that specifically binds to the polypeptide under conditions, Detecting the presence of the antibody bound to the Detecting the presence of the polypeptide. Detection of such polypeptides For, the antibodies can be used in in vitro diagnostic or in vivo imaging methods. Target human netrin, human ABC3 transporter, human ribosomal L3 subtype in sample Or immunology useful for in vitro detection of human enhancer polypeptides for liver regeneration Typical procedures include immunoassays using detectable antibodies. Such an immuno Assays are well known in the art, for example, ELISAs, Pandex microfluorometric assays , Agglutination assays, flow cytometry, serodiagnostic assays, and immunoorganization Biological staining procedure. Antibodies can be made detectable by various means well known in the art. Can be For example, a detectable marker can be directly or indirectly linked to the antibody. obtain. Useful markers include, for example, radionuclides, enzymes, fluorogens, colors Elementary And chemiluminescent labels. For in vivo imaging methods, a detectable antibody can be administered to a subject, and Binding of the antibody to the polypeptide of the invention is detected by imaging techniques well known in the art. Can be issued. Suitable imaging agents are known and are described, for example, in U.S. Pat. No. 7, γ-ray radionuclide (for example,¹¹¹In,^99mTc,⁵¹Cr etc.) In addition to paramagnetic metal ions. Radionuclide, gamma-ray scintillation photometry Positron emission tomography, single photon emission computed tomography, and gamma X-ray camera enables tissue imaging with whole-body imaging, while paramagnetic metal ions Enables visualization by magnetic resonance imaging. The present invention relates to human netrin, human ABC3 transporter, human ribosomal L3 subtype, or Or a transgene capable of expressing a nucleic acid encoding a human enhancer polypeptide for liver regeneration A genic non-human mammal is provided. Normal activity is not possible (ie, Human netrin, human ABC3 transporter mutated to , Human ribosome L3 subtype, or human enhancer polypeptide for liver regeneration A transgenic non-human mammal capable of expressing the nucleic acid to be loaded is also provided. . The present invention also relates to human netrin, human ABC3 transporter, human ribosomal L3 subtype Or an antibody complementary to mRNA encoding a human enhancer polypeptide for liver regeneration Sense mRNA (which hybridizes to the mRNA and thereby reduces its translation ), Human netrin, human ABC3 transporter, human ribosomal Nucleic acid encoding a human L3 subtype, or a human enhancer polypeptide for liver regeneration Transgenic non-human female having a genome containing an antisense nucleic acid complementary to Provide dairy animals. The polynucleotide may be one whose expression is induced or Inducible promoter and / or tissue specific regulation so that it can be restricted to the vesicle type Elements may further be included. Examples of polynucleotides are shown in FIGS. Or cDNA having a coding sequence substantially the same as the coding sequence shown in SEQ ID NOs: 15 and 15 It is. Examples of non-human transgenic mammals include transgenic bovine, Sheep, goats, pigs, rabbits, rats, and mice. Tissue specificity determination Examples of elements are the metallothionein promoter and the T7 promoter. Animal model systems to elucidate the physiological and behavioral roles of the polypeptides of the invention , Production of transgenic animals in which polypeptide expression is altered using various techniques It is produced by forming. An example of such a technique is to produce transgenic animals. Microinjection, retroviral infection, or Human netrin, human ABC3 transporter, human Encodes a ribosome L3 subtype or a human enhancer polypeptide for liver regeneration Includes the insertion of a normal or mutated version of the nucleic acid. For example, Carver et al., Bio / Techno logy 11: 1263-1270, 1993; Carvcr et al., Cytotechnology 9: 77-84, 1992; Clark et al. Bio / Technology 7: 487-492, 1989; Simons et al., Bio / Technology 6: 179-183,19. 88; Swanson, Bio / Technology 10: 557-559, 1992; Velander et al., Proc. Natl. Acad. .Sci., USA 89: 12003-12007, 1992; Hammer et al., Nature 315: 680-683, 1985; Krim. penfort et al., Bio / Technology 9: 844-847, 1991; Ebert et al., Bio / Technology 9: 835. -838, 1991; Simons et al., Nature 328: 530-532, 1987; Pittius et al., Proc. Natl. Aca d.Sci., USA 85: 5874-5878, 1988; Greenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 8. 327-8331, 1991; Whitelaw et al., Transg. Res. 1: 3-13, 1991; Gordon et al., Bio / Techn. ology 5: 1183-1187, 1987; Grosveld et al., Cell 51: 975-985, 1987; Brinster et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 478-482.1991; Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. ., USA 85: 836-840, 1988; Brinstcr et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82: 4438-4442. A1-Shawi et al., Mol. Cell. Biol. 10 (3): 1192-1198, 1990; Van Der Putten. Acad. Sci., USA 82: 6148-6152, 1985; Thompson et al., Cell 56: 313-. 321, 1989; Gordon et al., Science 214: 1244-1246, 1981; and Hogan et al., Manipul. ating the Mouce Embryo: A Laboratry Manual (Cold Spring Harbor Laboratory , 1986). Another technique, mutation or normality of these genes in transgenic animals Homologous recombination between the version and the native locus will result in expression regulation of the polypeptide of the invention. Can be used to alter a node or structure (Capecchi et al., Science 244: 1288, 198) 9; see Zimmer et al., Nature 338: 150, 1989). Homologous recombination technology Well known in the art. Homologous recombination replaces a natural (endogenous) gene with a recombinant gene or It cannot replace the mutated gene to express the native (endogenous) protein. Human netrin, human ABC3 transporter, human ribosomal L3 subtype, or liver regeneration Can express mutant proteins that result in altered expression of human enhancer polypeptides Make animals. In contrast to homologous recombination, microinjection eliminates host genes. Add genes to the host genome without the need. Microinjection is intrinsic Both exogenous and exogenous human netrin, human ABC3 transporter, human ribosomal L3 subtype Or a transgene capable of expressing a human enhancer polypeptide for liver regeneration. Animal. Inducible promoter regulates transgene expression To the coding region of the nucleic acid to provide a means for Tissue-specific regulation Elements are coding regions to allow tissue-specific expression of the transgene Can be connected. Transgenic animal model system activates polypeptide response Ligands (ie, agonists and antagonists) It is useful for in vivo screening of compounds for determination. Nucleic acids, oligonucleotides (including antisense) of the present invention, and vectors containing the same , Transformed host cells, polypeptides, and antibodies To determine if the compound is a potential agonist for the protein of the invention. Can be used to determine whether it functions as a host or antagonist. These in vitro screening assays are based on the function and function of the proteins of the invention. Information on the specific interaction with the protein of the invention. Can lead to the identification and design of possible compounds. According to yet another embodiment of the present invention, human netrin, human ABC3 transporter, human Binds ribosomal L3 subtype or human enhancer polypeptide for liver regeneration Methods are provided for identifying compounds. The protein of the present invention has competitive binding Can be used in assays. Such an assay provides a rapid method for large numbers of compounds. Compatible with screening to determine which compounds can bind to a polypeptide of the invention. , If any, can be decided. Then, a more detailed assay, such as Is a modulator, agonist, or antagonist of a polypeptide of the invention. Found to bind to further determine whether it acts as a gonist Can be performed with those compounds used. According to another embodiment of the present invention, the polypeptide of the present invention is expressed recombinantly. The transformed host cell can be contacted with a test compound, and then its modulating effect is tested. Human netrin, human ABC3 transporter, human ribosomes in the presence and absence of the compound To compare human L3 subtypes or human enhancer polypeptide-mediated responses of liver regeneration Or test cells or control cells (ie, By comparing the response to the presence of the compound Can be evaluated. As used herein, compounds that “modulate activity” of a polypeptide of the invention Or the activity of the polypeptide of the invention is determined by the absence of the compound or signal. Differently in the presence of compound or signal from below, human netrin, human ABC3 Transporter, human ribosomal L3 subtype, or human enhancer polypeptide, liver regeneration A compound or signal that alters the activity of the compound. In particular, such compounds or Signals include agonists and antagonists. Agonists are polypep Includes compounds or signals that activate tid function. Alternatively, an antagonist Include compounds or signals that interfere with polypeptide function. Typically, Ann The effects of the agonists are viewed as blocking agonist-induced protein activation. Be guessed. Antagonists include competitive and non-competitive antagonists. Competition Synergistic antagonists (or competitive blockers) are specific for agonist binding Interact at or near the site. Non-competitive antagonist or blocker Interact with a site other than the agonist interaction site, Inactivates the function of the tide. The following examples are intended to illustrate the invention without limiting the scope of the invention. Illustrated. Example I: Contig assembly A. Cosmid Multiple cosmids to initiate walking in YAC and P1 libraries Used as reagent. Clone 16-166N (D16S277), 16-191N (D16S279), 16-198 N (D16S280), and 16-140N (D16S276) were previously isolated from a cosmid library (Lerner et al., Mamm. Genome 3: 92-100, 1992). Cosmid cCMM65 (D16S84), c2 Cloning insert 91 (D16S291), cAJ42 (ATP6C), and cKG8 as probes Products (CMM65) or sequence-specific oligonucleotides Cosmid library (built in house or by Stratagene, La Jolla, CA) ). c326 cosmid contig and clone 413C12 Generated from a flow-sorted chromosome 16 library (Stallings et al., Genomics) 13 (4): 1031-1039, 1992). c326 contig was clone 2H2, 77E8, 325A11, And 325B10. B. YAC Gridded interspersed repeats with cosmid-specific IRS probes (Mark IRS, Mark II, and IRS pools from the Mega-YAC library) As described previously (Liu et al., Genomics 26: 178-191, 1995). IR S probe was used for cosmids 16-166N, 16-191N, cAJ42, 16-198N, 325A11, cCMM65, And made from 16-140N. The biotinylated YAC probe was used to identify the IRS products from each YAC. A nick-translating complex mixture was made. Blend of sufficient complexity The mixture was subjected to independent DNA amplification of whole yeast DNA using various Alu primers (Lic Hter et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 87: 6634-6638, 1990), followed by the most diverse This was achieved by combining the appropriate reactants, including C. P1 Chromosome walking experiments were performed using a single set of members containing a gridded P1 library pool. This was performed using brene (Shepherd et al., Supra, 1994). The grid filter is Dr. Mark Leppert and the Utah Center for Human Genome Research Kindly provided by the Technology Access Section. P1 gridded membrane Ren is treated with a set of chromosome 16 cosmids (see above) and Screened using a terminal probe from the P1 clone as defined . Both RNA transcripts and bubble-PCR products were utilized as end probes. D. probe Radiolabeled transcripts were tested against phage RNA polymerases T3, T7, and SP6. Restriction enzyme digested cosmid or P1 (AluI, HaeIII, RsaI, TaqI) It was produced using. T3 and T7 promoter elements are cosmid-derived T7 and SP6 promoter sequences, while the P1-based template Included in the rate. The transcription reaction is [αP³²] -ATP (Amersham, Arlington Heights, I L) as recommended by the manufacturer (Stratagene, La Jolla, CA) in the presence of Was. Bubble-PCR products were synthesized from restriction digested P1 (AluI, HaeIII, RsaI, TaqI) . A bubble adapter with appropriate overhangs and phosphorylated 5 'ends (Riley et al., Nuc. Acids Res. 18: 2887-2890, 1990). Ligated to digested P1 DNA. Universal vector derived from bubble adapter sequence The sequence of the vectorette primer is 5'-GTTCGTACGAGAATCGCT-3 '(SEQ ID NO: 67). ) And of Riley and his collaborators with 12 fewer 5 'nucleotides Different from the ones. Tm of shortened vectorette primer is derived from vector Of a paired amplimer derived from the promoter sequence (SP6, T7) It matched it more closely. The desired bubble-PCR product is gel purified before radiolabeling. (Feinberg et al., Anal. Biochem. 132: 6-13, 1983; Feinberg and Vogelstei). n, Anal. Biochem. 137: 266-267, 1984). Specificity of all end probes on a single set of gridded P1 filter arrays Determined before their use in. Radiolabeled probe as recommended (Li fe Tcchnologies Inc., Gaithersburg, MD) previously annealed to Cot1 DNA, then 0-20 ng of each of the following DNA: Cloned used to create the probe One or more unrelated cloned genomic DNAs; A cloned vector (without insert); and human genomic DNA ligated, Hybridized to small pieces of nylon membrane. Hybridization was performed with CAK solution (5x SSPE, 1% SDS, 5x Denhardt's Solution, 100 mg / mL Torula RNA) at 65 ° C. overnight. Each end probe has 5 × 10^FivePresent at a concentration of cpm / mL. The hybridized membrane is added to 0.1 × SSC / Washed at 65 ° C. to a final stringency of 0.1% SDS. Hybridization The results were visualized by autoradiography. Each of them Strongly hybridized to the roned template, while unrelated Do not hybridize to cloned, vector, or genomic DNA New probe and use it to screen the gridded P1 filter. I did it. Hybridization to the sequenced P1 pool Except for occasional use, describe nylon membrane pieces (above). I went as if. Positive clones were identified and 100 mm plates (LB + 25 mg / mL Plate at a density of 200-500 cfu per isin) and use an 82 mm HATF membrane (Millipo re, Bedford, MA) and processed for hybridization (Sambro ok et al., supra) and then rescreened with the complex probe mixture. Select a single positive clone from each pool and re-add to the master plate Plated. Colony-purified genomic P1 clone and its corresponding probe Multiple P1 DNA dot blots were prepared to identify Each was hybridized to a sex-labeled probe. All hybridizations Chromosome 16p13.3 reference probe (eg, cAJ42) as well as a uniquely labeled Included P1 DNA probe. Example II: Exon Trapping Genomic P1 clones are digested with PstI, double digested with BamHI / BglII, or restricted Prepared for exon trapping experiments by partial digestion with an amount of Sau3AI. BamHI digested digested P1 DNA and ligated to pSPL3B, a dephosphorylated vector On the other hand, PstI digested P1 DNA Cloned. The ligation was performed with 1, 3, or 6 mass equivalents of 50 ng of vector DNA and digested P1 DNA. Was performed in triplicate. Transformations are performed after overnight incubation at 16 ° C. 1/10 and 1/2 of the transformants were plated on LB (ampicillin) plates . After overnight growth at 37 ° C, colonies were selected for the highest transformation efficiency ("no insert" series). Scrape the plate with (based on comparison with the knot control) Miniprep was performed using the re-dissolution method. To determine the ratio of pSPL3B containing insert , A small portion of the miniprep was replaced with HindIII (this is the p SpL3B). Example III: RNA preparation Approximately 10 μg of residual miniprep DNA is ethanol precipitated and resuspended in 100 μl of sterile PBS. Turbid and 約 2 × 10 5 using BioRad GenePulser electroporator⁶Pieces of CO S-7 cells (in 0.7 ml ice-cold PBS) were electroporated (1.2 kV, 25 μF And 200Ω). Incubate the electroporated cells on ice for 10 minutes. After plating, transfer to a 100 mm tissue culture dish containing 10 ml of pre-warmed complete DMEM. Were added. Cytoplasmic RNA was isolated 48 hours after transfection. Transfect The isolated COS-7 cells were purified with 0.25% trypsin / 1 mM EDTA (Life Technologies Inc., G. aithersburg, MD). Trypsin treatment Wash cells with DMEM / 10% FCS and add 1 μl RNAsin (Promega, Madison, WI) 400 μl of replenished ice-cold TKM (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM KCl, 1 mM MgCl_Two) Resuspended. After adding 20 μl of 10% Triton X-100, the cells were incubated on ice for 5 minutes. Cubbed. Nuclei were removed by centrifugation at 1200 rpm for 5 minutes at 4 ° C. 30 Add microliters of 5% SDS to the supernatant and remove cytoplasmic RNA from phenol / chlorophore. Further purification by three extractions with lume / isoamyl alcohol (24: 24: 1) Was. The cytoplasmic RNA is ethanol precipitated and 50 μl of H_TwoResuspended in O. Reverse transcription and PCR were performed using commercially available exon-trapping oligonucleotides (LifeT echnologies Inc., Gaithersburg, MD) (Church et al. Supra, 1994), with the cytoplasmic RNA prepared above. The resulting CUA tailed The product is added to pAMP10 as recommended by the manufacturer (Life Technologies Inc.,) Shotgun subcloning. Random clones derived from each ligation Analyzed by colony PCR using R primer (Life Technologies Inc.) . Miniprep DNA containing pAMP10 / exon trap was prepared according to the manufacturer's instructions. EasyPrep assembly or QIAwell8 system (Pharmacia, Pistcataway, respectively) , NJ and Qiagen Inc., Chatsworth, CA) by alkaline lysis overnight Prepared from The DNA product containing the trapped exon was converted to a 177 bp Selected for sequencing based on comparison with "only" DNA product. Example IV: Sequencing DNA sequencing was performed using Pharmacia ALF and Applied Biosystems 377PRISM automated DNA This was performed using a sequencer (Piscataway, NJ and Foster City, CA). DNA distribution The columns were aligned using Sequencher DNA analysis software (Genecodes, Ann Arbor, MI). Lined up. DNA and protein database searches were performed using BLASTN (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990) and BLASTX (Altschul et al., Supra, 1990; Gish et al., Nat. Genet. 3266-272, 1993). Replace the SASE sequence with BLAST (Alts ch ul et al., supra, 1990; Gish et al., supra, 1993) and FASTA (Lipman et al., Science 227: 1). 435-1441, 1985) Analyzed by processing the search. Protein sequence, MacVe ctor (Oxford Molecular Group, Cambell, CA), BCM Launcher (Smith et al., Genome Research 6: 454-462, 1996), ClustalW (Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22: 467). 3-4680, 1994), and PSORT (Nakni et al., Genomics 14: 897-911, 1992). Was analyzed. Example V: RT-PCR, RACE, SASE, and cDNA isolation Two oligonucleotide primers based on the determined sequence (above) (Table II) using Oligo 4.0 (National Bioscienccs Inc., Plymouth, MN). Designed for Kixon trap. Which tissue-specific libraries should be screened for transcripts or cDNA The RT-PCR reaction and / or PCR reaction should be performed on each exon trap to determine Using oligonucleotide primers designed for Using tissue-derived RNA and / or cDNA libraries as templates I went there. The exon-designed oligonucleotides (Table II) are then used for one or more of the following: Use the corresponding tissue-specific cDNA library to use in the positive selection format below. Lee was screened. For RT-PCR experiments, the first oligonucleotide was used as the sense primer. And using the second oligonucleotide as an antisense primer Was. RT-PCR for poly A from adult brain and placenta⁺As described using RNA (K awasaki, In PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al. Academic Press, San Diego, CA, pp. 21-27, 1990). All PCR products Using the pGEM-T vector as described by the manufacturer (Promega, Madison, WI) Cloned. To clone the sequence 3 'of the selected exon trap, End rapid amplification (RACE) was performed as described (Frohman, PCR Met. Appl. 4: S40- S58, 1994). In the 3′RACE experiment, the first oligonucleotide was Used as a primer and a second oligonucleotide with an internal primer Used. A first oligonucleotide primer for the Genetrapper cDNA positive selection system The immer is biotinylated and used for direct selection while the second oligonucleotide Was used for restoration. In addition to exon trapping, cloning contigs also Genomic P1 clone (Dackowski et al., Genome Res. 6: 515-524, 1996) And essentially as described (Parimoo et al., Anal. Biochem. 228: 1-17 1995) c Screened using DNA selection. Other coding sequences, SAmple SEquen Obtained by cing (SASE). SASE was performed as a functional genomic method for gene identification. Easy going, individual DNA from P1 was partially digested with Sau3A and the 3 kb fragment was digested with pBluesc riptKS⁺It was subcloned into a plasmid (Stratagene, La Jolla, CA). Sa The clones were sequenced from both ends, and a half-random sequence from the P1 clone Was prepared. Example VI: Nucleotide sequence analysis hNET: Random shotgun library essentially as described (Ande rsson et al., (1994) Anal. Biochem. 218: 300-308). Subcloning into P10 vector (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) As a result, a 53.8B P1 clone (FIG. 18) was prepared. P1 DNA is sprayed (Hudson RCI, Temecula, CA). 6 libraries kb XhoI fragment (which may contain a netrin-encoded exon trap) (Figure 18)). After that, distribute the library Flanking 3.5 kb XhoI fragment to obtain additional clones for row determination Was screened. Positive clones were isolated as previously described (The Americ an PKD1 Consortium (1995) Hum. Mol. Genet. 4: 575-582), forward and reverse vector vectors. It was sequenced using a primer. The genome sequence is edited using Sequencher (GeneCodes, Ann Arbor, MI) and Assembled. Copy the coding region to the genomic sequence (in all reading frames GRAIL2 program (Uberbach) comparing chicken netrin with er and Mural (1991) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 88: 11261-11265; Xu et al., (1994 ) Genet.Eng.N.Y.16: 241-253) World Wide Web version and MacVec tor (Oxford Molecular Group, Cambell, CA) Pustell DNA / protein matrix Predicted using analysis. Database searches were performed using BLASTN (Altschul et al. (1990) J. Mol. iol. 215: 403-410) and BLASTX (Altschul et al., 1990, supra; Gish and States (19 93) Nat. Genet. 3: 266-272). RT-PCR: Adults (brain, heart, kidney, leukocyte, liver, lung, lymphoblastoma cell line, embryo CDNA libraries for both disc, spleen, and testis) and fetal (kidney and brain) Was purified by PCR as described (Van Raay et al., 1996, supra). Prescreened for presence. Using nested RT-PCR, The transcribed sequence derived from the gene was cloned. Briefly, spinal poly A⁺RNA (C lontech, Palo Alto, CA) as described (Kawasaki, 1990 "PCR Protoc ols: A Guide to Methods and Appllcations '' (M.A.Innis, D.H.Gelfand, J.J.Sn insky and T.J.White, Ed.), pp. 21-27, Academic Press, Inc., San Diego) Run Reverse transcription was performed using dumb primers. Primers for PCR (Table IV) were replaced with exons predicted from genomic sequence analysis. And was used to amplify spinal cord RNA. Because the spinal cord Because it has previously been shown to express low levels of chicken netrin ( Serafini et al., Supra). Nested PCR detects RT-PCR products from human spinal cord RNA It was needed to be. Reverse transcription of spinal cord RNA using random primers And the primary PCR was performed using primers designed from the genetic model (Table IV). Performed in the presence of M betaine (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Then 1 The secondary PCR reaction was diluted 1:20 and the secondary PCR was performed again in the presence of betaine Using primers (also designed from the gene model), 1 μL The reaction was performed with the primary reaction. The inclusion of betaine at a final concentration of 2.5 M in the PCR reaction was Dramatically increased the purity and yield of human netrin RT-PCR products (eg, Open WO 96/12041; Reeves et al., (1994) Am. J. Hum. Genet. 55.A238; Baskaran et al., (1 996) Genome Rcsearch 6: 633-638). RT-PCR products were analyzed using pGEM-T (Promega, Madison, WI) as recommended by the manufacturer. Was used for subcloning. The obtained RT-PCR clone is Data Chemistry (Perkin Elmer, Foster City, CA) and ABI 377 automated sequencer -(Perkin Elmer, Foster City, CA) The sequence was determined using the primers. Multiple sequence alignments can be performed using ClustalW (Tho mpson et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680). Sequence analysis of the RT-PCR product shows that hNET contains at least 6 exons Was. RT-PCR data show that the fourth predicted exon is in the human netrin gene. Actually being split by introns and existing as two exons Show. Three of the RT-PCR exons must be identical to the first exon trap It has been shown. With the exception of extra exons, this genetic model is almost identical to the RT-PCR product. Are identical. The cDNA coding sequence, putative protein product, and full-length sequence 4A to 4C, respectively. Northern blot analysis: Radiolabel the genome and RT-PCR probe (Feinbe rg and Vogelstein, Anal. Biochem. 132: 6-13, 1983) and use this RNA from various adult tissues, including a panel of RNAs from different neural tissues, including the spinal cord Northern blots (Clontech, Palo Alto, CA) were probed. further , A human RNA Master Blot containing RNA from 50 different adult and fetal tissues (Cl ontech, Palo Alto, CA) were screened as recommended by the manufacturer. Was. hABC3: A human lung cDNA library (LTI, Gaithersburg, MD) was added to mouse ABC1. The most 5 'trapped exon with homology Capture and repair oligonucleotides designed from exon L48757 (each, 5'-CATTGCCCGTGCTGTCGTG-3 '(SEQ ID NO: 52) and 5'-CATCGCCGCCTCCTTCATG-3' ( Column No. 53)) and use GeneTrapper system (LTI, Gaithersburg, MD) I was leaning. Direct cDNA library screening has also been used as a probe. Using a RT-PCR clone. 5'RACE (Frohman, M.A. in Methods Enzymol . (Edited by J.N. Abelson and M.I.Simon) pp. 340-356, Academic Press, San Diego, CA 1993) was used to isolate additional 5 'sequences from ABC3 transcripts. Northern blot analysis: 679 bp fragment derived from the 3 'untranslated region (UTR) of ABC3 cDNA Fragmentation is radioactive by random priming (Feinberg et al., Supra, 1983). Label and use it to label multiple tissue nodes under conditions recommended by the manufacturer. Xan blots (Clontech, Palo Alto, CA) were probed. Identification of coding sequences for novel ABC transporters: A new ATP binding cassette called ABC3 (ABC) transporter gene was mapped to the PKDI locus on chromosome 16 (Bur n et al., Genome Res. 6: 525-537, 1996). 8 exons derived from hABC3 gene From 30.1F, 64.12C, and 96.4B P1 clones using exon trapping Obtained. This is shown in FIG. The upper part shows the genome spacing around the hABC3 gene , NotI sites, DNA markers, and distances in kilobases (kb) are also shown. hABC3 remains Genomic P1 clones derived from intervals containing gene-derived sequences are listed below the genome map. Show. The relative position of the hABC3 cDNA is provided below the P1 clone and the selected cDNA, Shown are the exons, RT-PCR clones, and cDNAs that were skipped. Additional hABC3 sequence Trapped exons and RT-PCR clones used for isolation were labeled. K The discontinuity in the row of loan ABCgt.1 is due to the exon being spliced separately. Indicates absence. Seven of these trapped exons were analyzed by BLASTX analysis (Altschul et al., Supra). Homology to mouse ABC1 and ABC2 based on Gish et al., Supra, 1993). Exons L48758, L48759, and L4, which encode sequences with The sequence from 8760 had the highest homology. Exon L48760 Trapped The sequence encoded by Caenorhabditis ele gans ABC transporter (Wilson et al., supra). cDNA selection involves a single 261 bp cDNA clone mapped near the 5 'end of the ABC3 gene. Occurred. As with L48760, this clone is directed against the hypothetical C. elegans ABC transporter. And encoded sequences with homology. First of SASE results from 30.1F P1 clone The analysis showed that four of the 164 reactions showed sequences with homology to ABC1 and ABC2. Code to show. Subsequent comparisons between the SASE data and the final hABC3 cDNA Shows that the seven sequencing reactions contained a coding sequence derived from the ABC3 gene. Was. A total of 1.6 kb of the ABC3 coding sequence was aligned with the SASE data. 5 'end of hABC3 gene This is because the 3.5 kb-only coding sequence from the end maps to the 30.1 F P1 clone. Shows the 45% coverage level of the ASE analysis. Assembly and analysis of a novel ABC transporter cDNA: Using two complementary approaches Was used to assemble full-length hABC3 cDNA. First, trap using RT-PCR Exons, selected cDNA, and SASE data were ligated. Second, cDNA Library screening, direct selection and radiolabeled probes It was performed using. Designed from trapped exons L48757, L48758, L48760, and L75924 3 RT-PCR products containing the 3.3 kb coding sequence were cloned using the primers (Table I and FIG. 16). Add additional RT-PCR primers with the selected cDNA It was designed from the area of identity with the SASE data (Table I). 900bp RT-PCR clone Using the latter primer together with a primer derived from the trapped exon I got it. In total, a 4.2 kb coding sequence was obtained using RT-PCR. Some cDNAs are homologous to the GeneTrapper direct selection system and ABC1 The 5'-most trapped exon encoding a sequence with It was cloned using an oligo designed from exon L48747). GeneTrappe The longest clone isolated in the r system was 5719 bp in length (ABCgt.1) ( (FIG. 8). This cDNA was cut 20 bp upstream of the consensus sporiadenylation-polyA tail. Includes a 792 bp 3 'untranslated region with a cleavage site. Additional cDNA clones (ABC.5) Isolated using a radiolabeled 1.1kb RT-PCR product (ABC3-12) as a probe (Fig. 16). The 5 'end of ABC3 cDNA was further characterized using 5' RACE and several Some RACE products contain multiple in-frame stop codons upstream of the initiation methionine. It is. Sequence analysis showed that clone ABCgt.1 was cloned into RT-PCR clone and cDNA clone ABC.5. Lacking the 147 bp sequence found. The additional 147 bp segment In that this does not interrupt the open reading frame, another splicing It looks like the result. The presence of both transcript populations is another spliced exo Was confirmed by PCR using primers adjacent to the primers. A 6.4 kb cDNA was assembled for the hABC3 transporter. The assembled cDNA is , A 5116 nucleotide long open reading frame encoding 1705 amino acids The predicted protein has a molecular weight of 191 kDa. Suggested start Thionine is 50 bp upstream of the 5 'end of clone ABCgt.1. Around the starting methionine Sequence matches the Kozak sequence at only 6 of the 10 positions (Kozak, J. Cell Bi ol. 115: 887-903, 1991), two positions that have been shown to be important for function (-3 A and +4 G) are conserved in hABC3. hABC3 cDNA is a consensus Includes a 792 bp 3 'UTR with a cleavage site 20 bp upstream of the sporadenylated / poly A region . A 6.8 kb transcript was detected on a Northern blot with a 3'UTR cDNA probe. , The highest levels of expression are in the lungs and the lower levels are in the brain, Detected. Significantly lower levels of expression were observed in placenta and Observed in skeletal muscle. ABC3 transcript was not detected in liver or kidney . RPL3L (SEM L3): The longest cDNA is 1548 nucleotides in length (Figure 11). 3 All cDNAs have the longest cDNA containing a 48 nucleotide 5 'untranslated region. It has a 24 nucleotide open reading frame (ORF). 7th Inn After the frame stop codon, the Kozak start sequence CCACCATGT (SEQ ID NO: 68) (Kozak, Out) continues. Each 3'UTR of the three cDNAs differs in length, and Lacks the Nylation cleavage site. The longest cDNA was compared to the human, bovine, and mouse ribosomal L3 genes. At the nucleotide level, RPL3L (SEM L3) cDNA and these other ribosomal L3 cDNA There is only 74% identity with the upcoming consensus. This includes humans, cows, and In sharp contrast to the 98% identity shared between mouse L3 nucleotide sequences is there. There is no similarity between the 3'UTR of the cDNA isolated here and other L3 genes. hALR: A sequence is prepared using primers designed from exon traps (eg, external 5'-T GGCCCAGTTCATACATTTA-3 '(SEQ ID NO: 69) and internal 5'-TTACCCCTGTGAGGAGTGTG-3' (SEQ ID NO: 70)) and cloned from the human ALR gene by 3'RACE . A total of 468 bp were obtained from the human ALR gene (FIG. 13). Example VII: Amino acid sequence analysis hNET: hNET cDNA is at least 210 bp of 5 'untranslated sequence, 5' initiation methionine codon Has a 3 'stop codon (TGA) and is predicted to be 580 amino acids in length (FIG. 4), the conserved common domain structure of the netrin family (FIG. 20A). all Physically, human netrin is more effective against chicken netrin-2 than netrin-1 It was found to have high homology (ie, 56.3% vs. 53.9%). Netrin As in other members of the family, the largest conserved region is the three EGF repeats , While the C-terminal domain is not very well conserved (FIG. 20A). EGF repeats , Between human netrin and chicken netrin-1 and netrin-2, 78 .7% and 82.2% identical and 66.3% identical when compared to UNC-6. The C-terminal domains of human netrin and chicken netrin-1 and -2 are respectively Are 41.9% and 42.5% identical, and the same domain of UNC-6 is similar to human netrin. Only 29.4% were identical. Overall, human netrin is NETB VI and NETA spreads in C domain when additional sequence is included in V-1 domain (Harris et al., 1996, supra; Mitchell et al., 1996, supra); More closely resembles chicken netrin and UNC-6 than ETA and NETB.The structure of the netrin gene is conserved between Drosophila and humans The position of the intron in the human gene is determined by the entire netrin / UNC-6 family. Compare to encoded protein to determine if gene structure is preserved (Fig. 20B). This analysis shows that the Drosophila netrin gene and the human netrin gene Revealed a striking similarity between In human genes, exon 1 Contains the Gnal peptide, domain VI, and the first EGF domain (domain V-1) While exons 2 and 3 contain EGF repeats, domains V-2 and V-3, respectively. Include each. Exons 4, 5, and 6 contain a C domain portion. C Domain This motif / exon arrangement, except for additional introns in the Conserved in the hila netrin gene. Two Drosophila netrin genes Are shown to be highly conserved, each of which occurs at a homologous site. Split by two introns (Harris et al., 1996, supra). Six Drosophila Five of the intron positions were found to be conserved in the human gene (FIG. 20B). The UNC-6 gene contains 12 introns in the coding region (Ishii Et al., 1992, supra), these five positions are the positions of the introns in the human gene. Correlates with Interestingly, the sixth Drosophila intron is located in the human gene Has no counterpart in Drosophila and is not conserved in the UNC-6 gene The only intron coming. hABC3: Database search for homology between ABC3 and mouse ABC1 and ABC2 (Luciani et al., Supra, 1994). Mouse ABC1 and ABC2 proteins In addition, the ABC3 protein is also predicted to be encoded by the cosmid sequence of C48B4.4. Shows homology to constant C. elegans protein (Wilson et al., Supra). Overall And the genes encoded by ABC3, ABC1, ABC2, and C. elegans cosmid C48B4.4. Rows have the highest homology in the region around the ATP binding cassette (FIG. 17). However, the first ATP bond, called the linker domain (Luciani et al., Supra, 1994), When comparing sequences between the fusion cassette and the second transmembrane domain, ABC3 Shares very low homology to these same three proteins listed in (Amino acids 765-1044 in ABC3 in FIG. 17). ABC3 linker domain is ABC 1 and about 200 residues shorter than the linker domain present in ABC2. as a result, Optimal protein alignment is conserved HH1 hydrophobic, located at positions 917-959 of ABC3 Gap in the ABC3 sequence immediately C-terminal to the sex domain (Luciani et al., Supra, 1994) Place it (Fig. 17). For further comparison, the ABC3 linker domain was About the size of the linker domain encoded by C48B4.4 Indicates that it is one. As in ABC1 and ABC2, the linker domain of ABC3 is Contains numerous polar residues and several potential phosphorylation sites. Further analysis of the putative ABC3 protein sequence is directed at the ABC1 / ABC2 subfamily. Revealed further similarities. Based on PSORT analysis (Nakai et al., Supra), AB The C3 protein does not appear to contain an N-terminal signal sequence and Protein (Singer, Annu. Rev. Cell Biol. 6: 247-296 1990). The N-terminus of the transmembrane domain sequence is located in the cytoplasm (FIG. 17). A similar form is ABC1 (Luciani et al., Supra, 1994) and all other ABCs transported (Higgins, supra, 1992). As described above, mice ABC1 and A BC2 is shown to contain a novel hydrophobic region, HH1, within the conserved linker domain Was. The HH1 domain is less conserved at the amino acid level in ABC3, The domain appears to be in the linker region based on hydrophilicity analysis. As well The HH1 domain of the C. elegans derived cosmid C48B4.4 Found in the column. In all these cases, the HH1 domain Predicted to have a conformation. RPL3L (SEM L3): The RPL3L (SEM L3) cDNA open reading frame is 46.3 kDa Is predicted (FIG. 11). RPL3L (SEM L3) cDNA in vivo Transcription-translation has an apparent molecular weight of 46 kD, which closely matches the predicted amount of 46.3 kD. Resulting in a protein product. Two nuclear targeting sequences, which are 100% conserved between human, mouse and bovine ) Diverged slightly in the RPL3L (SEM L3) amino acid sequence. First target The cleavage site is a 21 amino acid N-terminal oligopeptide. Human, cow, and mouse Serine and arginine at positions 13 and 19 of L3, respectively, are RPL3L (SEM L3 ) Is replaced by histidine (FIG. 12). The second potential nuclear targeting site is divided into two parts It is a motif. Here, human, bovine, and mouse proteins are 341-3 KKR- (aa) at position 58₁₂-KRR, while the SEM L3 gene is KKR- (aa) at positions 341-358_Ten -Has HHSRQ. The second half of this two-part motif remains basic Did not match those found in other nuclear targeting motifs (Simonic et al.) Supra, 1994). Overall, RPL3L (SEM L3) and other mammalian L3 ribosomes 77.2% amino acid identity with consensus derived from the gene; RPL3L (SEM L3) 56% of the nucleotide differences between and L3 are silent. hALR: hALR cDNA sequence is 84.8% identical and 94.1% to rat ALR protein Encodes a similar 119 amino acid sequence protein (see FIGS. 13 and 14) thing). Although the invention has been described by reference to the disclosed embodiments, various modifications may be made. It should be understood that this can be done without departing from the spirit of the invention. Obedience Accordingly, the invention is limited only by the claims that follow the sequence listing.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/53 5/00 Ａ (31)優先権主張番号０８／７６２，５００ (32)優先日平成８年12月９日(1996．12．9) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者コナーズ，ティモシーディー. アメリカ合衆国マサチューセッツ 01748，ホプキントン，ヘイデンロウストリート 304 (72)発明者ダクコウスキー，ウィリアムアール. アメリカ合衆国マサチューセッツ 01748，ホプキントン，バレンタインロード４ (72)発明者バンライ，テレンスジェイ. アメリカ合衆国マサチューセッツ 01749，ハドソン，ウォーセスターアベニュー 43 (72)発明者キリンジャー，キャサリンダブリュー. アメリカ合衆国マサチューセッツ 01776，サドブリー，ボウディッチロード 54──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) C12N 1/21 C12P 21/02 C 5/10 G01N 33/53 D C12P 21/02 C12N 15/00 ZNAA G01N 33/53 5/00 A (31) Priority claim number 08 / 762,500 (32) Priority date December 9, 1996 (12.9 1996) (33) Priority claiming country United States (US) ( 81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), AU, CA, JP (72) Inventors Connors, Timothy Dee. 304 United States Massachusetts 01748, Hopkinton, Hayden Row Street 304 (72) Inventors Duckowski, William R. A. United States of America, Massachusetts 01748, Hopkinton, Valentine Road 4 (72) Inventor Ban Rai, Terrence Jay. United States of America Massachusetts 01749, Hudson, Worcester Avenue 43 (72) Inventor Kiringer, Catherine Double. Massachusetts, USA 01776, Sudbury, Bowditch Load 54

Claims

[Claims] 1. An isolated nucleic acid encoding human netrin (hNET) or its complement. 2. 2. The isolated nucleic acid according to claim 1, wherein said nucleic acid is mRNA. 3. The method according to claim 1, wherein the nucleic acid is a DNA containing the sequence shown in SEQ ID NO: 19. An isolated nucleic acid. 4. The method according to claim 1, wherein the nucleic acid is a DNA containing the sequence shown in SEQ ID NO: 20. An isolated nucleic acid. 5. The method according to claim 1, wherein the nucleic acid is a DNA containing the sequence shown in SEQ ID NO: 78. An isolated nucleic acid. 6. A simple hybridizer that hybridizes to the nucleic acid of claim 1 under stringent conditions. Isolated nucleic acids. 7. 7. The method of claim 6, comprising the sequence 5'-GCCTGTCATCGCTCTAG-3 '(SEQ ID NO: 59). Isolated nucleic acids. 8. 7. The method according to claim 6, comprising the sequence 5'-CAGTCGCAGGCCCTGCA-3 '(SEQ ID NO: 60). Isolated nucleic acids. 9. 7. The method according to claim 6, comprising the sequence 5′-GAGGACGCGCCAACATC-3 ′ (SEQ ID NO: 61). Isolated nucleic acids. 10. 7. The method of claim 6, comprising the sequence 5'-CGGCAGTAGTGGCAGTG-3 '(SEQ ID NO: 62). An isolated nucleic acid. 11. 7. The method according to claim 6, comprising the sequence 5'-CCTGCCTCGCTTGCTCCTGC-3 '(SEQ ID NO: 63). An isolated nucleic acid. 12. 7. The method according to claim 6, comprising the sequence 5'-CGGGCAGCCGCAGGCCGCAT-3 '(SEQ ID NO: 64). An isolated nucleic acid. 13. 7. The method of claim 6, comprising the sequence 5'-CCTGCAACGGCCATGCCCGC-3 '(SEQ ID NO: 65). An isolated nucleic acid. 14． 7. The method of claim 6, comprising the sequence 5'-GCATCCCCGGCGGGCACCCA-3 '(SEQ ID NO: 66). An isolated nucleic acid. 15. 7. The method of claim 6, comprising the sequence 5'-CTTGCAGGGCCTGCGAC-3 '(SEQ ID NO: 80). An isolated nucleic acid. 16. 7. The method of claim 6, comprising the sequence 5'-GAAGGCACAGGGTGAAC-3 '(SEQ ID NO: 81). An isolated nucleic acid. 17． 7. The method of claim 6, comprising the sequence 5'-CTGCAACCAGACCACAG-3 '(SEQ ID NO: 82). An isolated nucleic acid. 18. 7. The method according to claim 6, comprising the sequence 5'-TAGATGTGGGAGCAGCG-3 '(SEQ ID NO: 83). An isolated nucleic acid. 19. Specifically binds to the mRNA of claim 2 and regulates translation of said mRNA. , Antisense oligonucleotides. 20. Isolated human netrin (hNET) and its biologically active fragment G. 21. 21. The isolated according to claim 20, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21. HNET. 22. A vector comprising the isolated nucleic acid of claim 1. 23. A host cell comprising the vector of claim 22. 24. A method for producing a human netrin protein, the method comprising: Process: (A) using the host cell of claim 23 in a medium and for expression of the protein; Culturing under appropriate conditions, and (B) isolating the expressed protein; A method comprising: 25. An antibody that specifically binds to human netrin (hNET). 26. Passes through the cell membrane and specifically binds to the mRNA encoding hNET in the cell Claims of an amount effective to regulate hNET expression by preventing or inhibiting its translation An oligonucleotide according to claim 19, and an acceptable hydrophobicity capable of crossing a cell membrane A composition comprising a carrier. 27. Block binding of naturally occurring ligands to hNETs and acceptable carriers A composition comprising an effective amount of the antibody of claim 25. 28. Transgenic non-expressing DNA encoding human netrin (hNET) Human mammal. 29. A method for identifying a compound that binds to human netrin (hNET), comprising: Wherein the cell of claim 23 is exposed to a plurality of compounds and binds to said cell. A competitive binding assay to identify a compound that has been identified. 30. An isolated nucleic acid encoding a human ATP binding cassette transporter (hABC3) or Its complement. 31. 31. The isolated nucleic acid of claim 30, wherein said nucleic acid is an mRNA. 32. The nucleic acid according to claim 30, wherein the nucleic acid is a DNA comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 24. An isolated nucleic acid as described. 33. The method according to claim 30, wherein the nucleic acid is a DNA comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 74. The isolated nucleic acid. 34. Hybridizing to the nucleic acid of claim 30 under stringent conditions. Isolated nucleic acid. 35. 35. The method of claim 34, comprising the sequence 5'-GACGCTGGTGAAGGAGC-3 '(SEQ ID NO: 42). An isolated nucleic acid. 36. 35. The method of claim 34, comprising the sequence 5'-TCGCTGACCGCCAGGAT-3 '(SEQ ID NO: 43). An isolated nucleic acid. 37. 35. The method of claim 34, comprising the sequence 5'-CATTGCCCGTGCTGTCGTG-3 '(SEQ ID NO: 52). The isolated nucleic acid. 38. 35. The method of claim 34, comprising the sequence 5'-CATCGCCGCCTCCTTCATG-3 '(SEQ ID NO: 53). The isolated nucleic acid. 39. 35. The method of claim 34, comprising the sequence 5'-GCGGAGCCACCTTCATCA-3 '(SEQ ID NO: 54). An isolated nucleic acid. 40. 35. The method of claim 34, comprising the sequence 5'-GACGCTGGTGAAGGAGC-3 '(SEQ ID NO: 55). An isolated nucleic acid. 41. 35. The method of claim 34, comprising the sequence 5'-ATCCTGGCGGTCAGCGA-3 '(SEQ ID NO: 56). An isolated nucleic acid. 42. 35. The method of claim 34, comprising the sequence 5'-AGGGATTCGACATTGCC-3 '(SEQ ID NO: 57). An isolated nucleic acid. 43. 35. The method of claim 34, comprising the sequence 5'-CTTCAGAGACTCAGGGGCAT-3 '(SEQ ID NO: 58). The isolated nucleic acid. 44. 35. The method of claim 34, comprising the sequence 5'-AGCTGGCGCTCCTCCTCT-3 '(SEQ ID NO: 76). An isolated nucleic acid. 45. 32. Specifically binds to the mRNA of claim 31 and regulates translation of said mRNA. Antisense oligonucleotides. 46. Isolated human ATP-binding cassette transporter (hABC3) and its biological activity Fragments. 47. The isolated amino acid sequence of claim 46, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25. HABC3. 48. The isolated amino acid sequence of claim 46, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 75. HABC3. 49. A vector comprising the isolated nucleic acid of claim 30. 50. A host cell comprising the vector of claim 49. 51. A method for producing a human ATP binding cassette transporter (hABC3), comprising: The method involves the following steps: (A) using the host cell of claim 50 in a medium and for expression of the protein; Culturing under appropriate conditions, and (B) isolating the expressed protein; A method comprising: 52. An antibody that specifically binds to the human ATP binding cassette transporter (hABC3). 53. Crosses the cell membrane and specifically binds to hABC3-encoding mRNA in cells Claiming an amount effective to regulate hABC3 expression by preventing its translation Item 46. The oligonucleotide according to item 45, and an acceptable hydrophobic which can pass through a cell membrane. A composition comprising a sexual carrier. 54. An effective amount of a binding agent to block binding of a naturally occurring ligand to hABC3. 53. A composition comprising the antibody of claim 52 and an acceptable carrier. 55. Transformer expressing DNA encoding human ATP binding cassette transporter (hABC3) A transgenic non-human mammal. 56. A method for identifying compounds that bind to the human ATP binding cassette transporter (hABC3) A method, wherein the cell of claim 50 is exposed to a plurality of compounds. A competitive binding assay to identify compounds that bind to said cells. 57. An isolated nucleic acid encoding human ribosomal L3 (RPL3L) or its complement . 58. 58. The isolated nucleic acid of claim 57, wherein said nucleic acid is an mRNA. 59. The method according to claim 57, wherein the nucleic acid is a DNA comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 28. The isolated nucleic acid. 60. Hybridizing to the nucleic acid of claim 57 under stringent conditions. Isolated nucleic acid. 61. 61. The method of claim 60, comprising the sequence 5'-ACGGACACCTGGGCTTC-3 '(SEQ ID NO: 48). An isolated nucleic acid. 62. 61. The method of claim 60, comprising the sequence 5'-AAACGGGAGGAGGTGGA-3 '(SEQ ID NO: 49). An isolated nucleic acid. 63. 62. The method of claim 60, comprising the sequence 5'-AGACAGCCCAAGAGAAGAGG-3 '(SEQ ID NO: 73). The isolated nucleic acid. 64. 59. It specifically binds to the mRNA of claim 58 and regulates translation of said mRNA. Antisense oligonucleotides. 65. Isolated human ribosomal L3 (RPL3L) and its biologically active flag Ment. 66. 66. The isolated sequence of claim 65 comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 29. RPL3L. 67. A vector comprising the isolated nucleic acid of claim 57. 68. A host cell comprising the vector of claim 67. 69. A method for producing human ribosome L3 (RPL3L), the method comprising: Process of: (A) using the host cell of claim 68 in a medium and for expression of the protein; Culturing under appropriate conditions, and (B) isolating the expressed protein; A method comprising: 70. An antibody that specifically binds to human ribosome L3 (RPL3L). 71. Specific binding to mRNA encoding RPL3L across cell membranes In an amount effective to modulate RPL3L expression by inhibiting its translation Item 64. The oligonucleotide according to Item 64, and an acceptable hydrophobic which can pass through a cell membrane. A composition comprising a sexual carrier. 72. An effective amount of a blocking agent to block binding of a naturally occurring ligand to RPL3L. A composition comprising the antibody of claim 70, and an acceptable carrier. 73. Transgenic expressing DNA encoding human ribosomal L3 (RPL3L) Non-human mammal. 74. A method for identifying compounds that bind to human ribosome L3 (RPL3L). The method may further comprise exposing the cell of claim 68 to a plurality of compounds; A method comprising a competitive binding assay to identify compounds that have bound to cells. 75. An isolated nucleic acid encoding a human enhancer of liver regeneration (hALR) or a phase thereof Complement. 76. 76. The isolated nucleic acid of claim 75, wherein said nucleic acid is an mRNA. 77. The method according to claim 75, wherein the nucleic acid is a DNA comprising the sequence shown in SEQ ID NO: 33. The isolated nucleic acid. 78. Hybridizing to the nucleic acid of claim 75 under stringent conditions. Isolated nucleic acid. 79. 78. The method of claim 78, comprising the sequence 5'-TGGCCCAGTTCATACATTTA-3 '(SEQ ID NO: 69). The isolated nucleic acid. 80. 78. The method of claim 78, comprising the sequence 5'-TTACCCCTGTGAGGAGTGTG-3 '(SEQ ID NO: 70). The isolated nucleic acid. 81. Specifically binds to the mRNA of claim 76 and regulates translation of said mRNA. Antisense oligonucleotides. 82. An isolated human enhancer of liver regeneration (hALR) and its biologically active Lugment. 83. 83. The isolated according to claim 82, comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 34. hALR. 84. A vector comprising the isolated nucleic acid of claim 75. 85. A host cell comprising the vector of claim 84. 86. A method for producing a human enhancer of liver regeneration (hALR), comprising: The following steps: (A) using the host cell of claim 85 in a medium and for expression of the protein; Culturing under appropriate conditions, and (B) isolating the expressed protein; A method comprising: 87. An antibody that specifically binds to a human enhancer of liver regeneration (hALR). 88. Passes through the cell membrane and specifically binds to the mRNA encoding hALR in the cell Claim 8 in an amount effective to regulate hALR expression by preventing its translation. An oligonucleotide according to claim 1, and an acceptable hydrophobic key capable of passing through a cell membrane. A composition comprising a carrier. 89. Claiming an amount effective to block binding of the naturally occurring ligand to hALR Item 91. A composition comprising the antibody of Item 87 and an acceptable carrier. 90. Transgene expressing DNA encoding human enhancer of liver regeneration (hALR) Nick non-human mammal. 91. A method to identify compounds that bind to the human enhancer of liver regeneration (hALR) Wherein the method comprises exposing the cell of claim 85 to a plurality of compounds; and A method comprising a competitive binding assay identifying compounds that bound to said cells.