JP2002514389A - Screening method for substances that act as activators or inhibitors of protein kinase B - Google Patents
Screening method for substances that act as activators or inhibitors of protein kinase BInfo
- Publication number
- JP2002514389A JP2002514389A JP2000547256A JP2000547256A JP2002514389A JP 2002514389 A JP2002514389 A JP 2002514389A JP 2000547256 A JP2000547256 A JP 2000547256A JP 2000547256 A JP2000547256 A JP 2000547256A JP 2002514389 A JP2002514389 A JP 2002514389A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- xaa
- sequence
- amino acid
- pkb
- peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/91—Transferases (2.)
- G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
- G01N2333/9121—Phosphotransferases in general with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. general tyrosine, serine or threonine kinases
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】 本発明は、Ｃ末端に大きい疎水性残基を含まない配列を含むペプチドの使用によって、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）の賦活物質または阻害物質となりＰＫＢのキナーゼ基質として使用できる物質をスクリーニングする方法に関する。これらのペプチドは、ＰＫＢの活性を測定するアッセイに使用でき、ＰＫＢの触媒活性が関与するフォークヘッドタンパク質の遺伝子転写調節の賦活物質または阻害物質となる物質をスクリーニングするために使用でき、また、転写によるインスリン作用を媒介する化合物の効果と代謝に関与する酵素の活性をリン酸化によって変調する化合物の効果とを識別するために使用できる。基質ペプチド配列は、配列１：ＡｒｇＸａａＡｒｇＸａａＸａａＳｅｒＸａａまたは配列２を含み、配列中の２位のＸａａはアミノ酸、好ましくはＰｒｏ及びＧｌｙから選択され、４位及び５位のＸａａは任意のアミノ酸、好ましくはＴｈｒ及びＳｅｒから選択され、７位のＸａａは任意のアミノ酸、好ましくはＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒから選択され、但し、配列はリン酸化部位に直結したＣ末端に大きい疎水性残基を含まない。 (57) [Summary] The present invention relates to a method of screening for a substance that becomes an activator or an inhibitor of protein kinase B (PKB) and can be used as a kinase substrate of PKB by using a peptide containing a sequence that does not contain a large hydrophobic residue at the C-terminus. These peptides can be used in assays for measuring the activity of PKB, and can be used to screen for substances that act as activators or inhibitors of the gene transcription regulation of forkhead proteins involved in the catalytic activity of PKB. Can be used to discriminate between the effects of compounds that mediate insulin action by and the effects of compounds that modulate the activity of enzymes involved in metabolism by phosphorylation. The substrate peptide sequence comprises SEQ ID NO: 1: ArgXaaArgXaaXaaSerXaa or sequence 2, wherein Xaa at position 2 is selected from amino acids, preferably Pro and Gly, and Xaa at positions 4 and 5 are any amino acids, preferably Thr and Xaa at position 7, selected from Ser, is selected from any amino acid, preferably Asn, Gln, Thr, Ser, provided that the sequence does not include a large hydrophobic residue at the C-terminus directly connected to the phosphorylation site.
Description
【０００１】 （概要） 本発明は、Ｃ末端に大きい疎水性残基を含まない特定の配列から成るペプチド
の使用によって、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）の賦活物質または阻害物質と
なりＰＫＢのキナーゼ基質として使用できる物質をスクリーニングする方法に関
する。本発明のペプチドは、ＰＫＢの活性を測定するアッセイに使用でき、ＰＫ
Ｂの触媒活性が関与するフォークヘッドタンパク質による遺伝子転写調節の賦活
物質または阻害物質となる物質をスクリーニングするために使用でき、また、転
写によるインスリン作用を媒介する化合物の効果と代謝に関与する酵素の活性を
リン酸化によって変調する化合物の効果とを識別するために使用できる。基質ペ
プチド配列は、配列１：ＡｒｇＸａａＡｒｇＸａａＸａａＳｅｒＸａａ、または
、配列２：ＡｒｇＸａａＡｒｇＸａａＸａａＴｈｒＸａａを含み、配列中の２位
のＸａａは任意のアミノ酸、好ましくはＰｒｏ及びＧｌｙから選択され、４位及
び５位のＸａａは任意のアミノ酸、好ましくはＴｈｒ及びＳｅｒから選択され、
７位のＸａａは任意のアミノ酸、好ましくはＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒか
ら選択され、但し、配列はリン酸化部位に直結したＣ末端に大きい疎水性残基を
含まない。(Summary) The present invention provides an activator or inhibitor of protein kinase B (PKB) by using a peptide having a specific sequence that does not contain a large hydrophobic residue at the C-terminus, and is used as a kinase substrate of PKB. To a method for screening for possible substances. The peptide of the present invention can be used in an assay for measuring the activity of PKB.
B can be used to screen for substances that act as activators or inhibitors of gene transcription regulation by forkhead proteins involved in the catalytic activity of B. It can be used to distinguish effects of compounds that modulate activity by phosphorylation. The substrate peptide sequence comprises: Sequence 1: ArgXaaArgXaaXaaSerXaa or Sequence 2: ArgXaaArgXaaXaaThrXaa, wherein Xaa at position 2 in the sequence is selected from any amino acid, preferably from Pro and Gly, and Xaa at positions 4 and 5 are any Amino acids, preferably selected from Thr and Ser,
Xaa at position 7 is selected from any amino acid, preferably Asn, Gln, Thr, Ser, provided that the sequence does not include a large hydrophobic residue at the C-terminus directly connected to the phosphorylation site.
【０００２】 （背景） 動物体内のグルコース処理を調節するインスリンの基本的なメカニズムは近年
になって極めて詳細に解明された。正常機能状態のとき、インスリンから発生さ
れた信号がタンパク質の相互作用カスケードによって変換され、これに基づいて
種々の起原の細胞が血流からグルコースを吸収し蓄積することは文献に記載され
ている（Ｗｈｉｔｅ，１９９７）。現在の解釈では、インスリンによってインス
リン受容体が活性化され、次いでインスリン受容体基質（ＩＲＳ）タンパク質が
リン酸化及び活性化される。これらは種々の下流タンパク質のドッキングタンパ
ク質として作用し、下流タンパク質を活性化に導く機能を有している。インスリ
ン信号に対して最も重要な下流タンパク質はホスホイノシチド３−キナーゼ（Ｐ
Ｉ３Ｋ）であり、第二のメッセンジャーであるホスファチジルイノシトール３，
４，５−三リン酸の産生を触媒する。ホスファチジルイノシトール３，４，５−
三リン酸は脂質であり、ＰＫＢの活性化に最も重要である（（Ｆｒａｎｋｅら，
１９９５）；（Ｊａｍｅｓら，１９９６）；（Ｆｒａｎｋｅら，１９９７）；（
Ｋｌｉｐｐｅｌら，１９９７）；（Ａｌｅｓｓｉら，１９９７）；（Ｓｔｏｋｏ
ｅら，１９９７））。これは、ＰＫＢ及びＰＫＢの活性化に関与する３−ホスホ
イノシチド依存性キナーゼ１（ＰＤＫ１）と呼ばれる上流キナーゼのｐｌｅｃｋ
ｓｔｒｉｎホモロジー（ＰＨ）ドメインに接している。BACKGROUND The basic mechanism of insulin that regulates glucose processing in animals has recently been elucidated in great detail. It has been described in the literature that during normal functioning, signals generated from insulin are converted by an interaction cascade of proteins, based on which cells of various origins absorb and accumulate glucose from the bloodstream. (White, 1997). In the current interpretation, insulin activates the insulin receptor, which then phosphorylates and activates the insulin receptor substrate (IRS) protein. These act as docking proteins for various downstream proteins and have the function of leading the downstream proteins to activation. The most important downstream protein for the insulin signal is phosphoinositide 3-kinase (P
I3K) and the second messenger, phosphatidylinositol 3,
Catalyzes the production of 4,5-triphosphate. Phosphatidylinositol 3,4,5-
Triphosphate is a lipid and is most important for the activation of PKB ((Franke et al.,
(1995); (James et al., 1996); (Franke et al., 1997);
(Klippel et al., 1997); (Alessi et al., 1997); (Stoko)
e et al., 1997)). This is the pluck of PKB and the upstream kinase called 3-phosphoinositide-dependent kinase 1 (PDK1), which is involved in PKB activation.
It contacts the string homology (PH) domain.
【０００３】 ＰＫＢは、グルコース利用の調節及びインスリンによるタンパク質合成調節の
鍵となる介在体であると考えられている（Ｃｒｏｓｓら，１９９５）；（Ｃｏｈ
ｅｎら，１９９７）；（Ｐｅａｋら，１９９８）；（Ｇｉｎｇｒａｓら，１９９
８））。例えば、ＰＫＢがグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３；（Ｃ
ｒｏｓｓら，１９９５））をリン酸化し不活性化してグルコースからグリコーゲ
ンを合成させることが証明された。また心筋細胞中では、ＰＫＢがホスホフルク
トキナーゼ−２（Ｄｅｐｒｅｚｅｔら，１９９７）をリン酸化し活性化して、解
糖のアロステリック活性化剤として作用するフルクトース２，６−ビスリン酸を
産生させることが判明した。第三のＰＫＢ基質はタイプ３ＢのサイクリックＡＭ
Ｐホスホジエステラーゼである可能性が大きい（Ｗｉｊｋａｎｄｅｒら，１９９
８）。この酵素はインスリン応答性組織中でリン酸化によって活性化され、アド
レナリン作動性賦活プロセスを不活性化に導く。[0003] PKB is thought to be a key mediator in regulating glucose utilization and in regulating protein synthesis by insulin (Cross et al., 1995);
(Peak et al., 1998); (Gingras et al., 199).
8)). For example, if PKB is glycogen synthase kinase 3 (GSK3; (C
ross et al., 1995)), has been demonstrated to phosphorylate and inactivate glycogen from glucose. In cardiomyocytes, PKB can phosphorylate and activate phosphofructokinase-2 (Deprezet et al., 1997) to produce fructose 2,6-bisphosphate, which acts as an allosteric activator of glycolysis. found. The third PKB substrate is a type 3B cyclic AM
P phosphodiesterase is likely (Wijkander et al., 199).
8). This enzyme is activated by phosphorylation in insulin-responsive tissues, leading to an inactive adrenergic activation process.
【０００４】 ＰＫＢによってリン酸化される基質の範囲は多様であるが、記載されたすべて
の基質が、ＰＫＢの標的領域の機能を果たす共通の短い一次配列を有している。
アミノ酸のコンセンサス配列はＧＳＫ−３中で最初に同定され、ＧｌｙＡｒｇＰ
ｒｏＡｒｇＴｈｒＳｅｒＳｅｒＰｈｅＡｌａＧｌｕＧｌｙ（ＧＲＰＲＴＳＳＦＡ
ＥＧ）として示されている（Ｃｒｏｓｓら，１９９５）。国際特許ＷＯ９７／２
２３６０も参照。[0004] Although the range of substrates phosphorylated by PKB is diverse, all of the substrates described have a common short primary sequence that serves the function of the target region of PKB.
The consensus sequence of amino acids was first identified in GSK-3, and GlyArgP
roArgThrSerSerPheAlaGluGly (GRPRTSSSFA
EG) (Cross et al., 1995). International Patent WO97 / 2
See also 2360.
【０００５】 別の基質と比較することによって上記の配列から、ＰＫＢによってリン酸化さ
れるために必須の構造を含むと見込まれる１つのコンセンサス配列を誘導できる
。このコンセンサス配列はＲＸＲＸＸＡ／ＴＦ（Ａｌｅｓｓｉら，１９９６）で
あり、配列中のＦはフェニルアラニンであるが、別の嵩高い疎水性残基によって
置換されていてもよい。文献中のデータ（Ａｌｅｓｓｉら，１９９６及びＷａｌ
ｋｅｒら，１９９８）は、ＰＫＢによってリン酸化されるためにはアミノ酸配列
がリン酸化部位に直結したＣ末端に大きい疎水性残基を含まなければならないこ
とを強力に示唆している。By comparing with another substrate, one can derive from the above sequence a consensus sequence that is expected to contain the essential structure for being phosphorylated by PKB. The consensus sequence is RXRXXA / TF (Alessi et al., 1996), where F is phenylalanine, but may be replaced by another bulky hydrophobic residue. Data in the literature (Alessi et al., 1996 and Wal
ker et al., 1998) strongly suggest that in order to be phosphorylated by PKB, the amino acid sequence must include a large hydrophobic residue at the C-terminus directly connected to the phosphorylation site.
【０００６】 このような残基はＰＫＢによってリン酸化されるために極めて重要であると記
載されている。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに関する最近の研究は、転写因子ファミリー
の転写活性を抑制することがインスリンの重要な作用であることを示唆した（Ｏ
ｇｇら，１９９７）。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ中の特定の転写因子を不活性化するこ
とによってＣ．ｅｌｅｇａｎｓがインスリン受容体の非存在下で代謝を回復でき
ることが示された。[0006] Such residues are described as being extremely important for being phosphorylated by PKB. C. recent studies on elegans suggested that inhibiting the transcriptional activity of the transcription factor family is an important effect of insulin (O
gg et al., 1997). C. elegans by inactivating certain transcription factors. elegans has been shown to be able to restore metabolism in the absence of the insulin receptor.
【０００７】 （図面） 図１ａは、ＨＡ−ＰＫＢによってトランスフェクトされたＣｏｓ−７。Ｃｒｏ
ｓｓｔｉｄｅのリン酸化（黒棒グラフ）を本発明のペプチド（灰色棒グラフ）に
比較した。(Drawing) FIG. 1 a shows Cos-7 transfected with HA-PKB. Cro
Phosphorylation of sside (black bar graph) was compared to peptides of the invention (grey bar graph).
【０００８】 図１ｂは、ＩＧＦ−１刺激した筋肉細胞溶解液とのインキュベーションによっ
て活性化した不活性ｒＰＫＢα。Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅのリン酸化（黒棒グラフ）
を本発明のペプチド（灰色棒グラフ）に比較した。FIG. 1 b shows inactive rPKBα activated by incubation with IGF-1 stimulated muscle cell lysate. Phosphorylation of Crossside (black bar graph)
Was compared to the peptides of the invention (grey bar graph).
【０００９】 図２ａは、ペプチドのリン酸化をペプチド配列ＲＰＲＴＳＳＦのリン酸化に比
較した。FIG. 2 a compares the phosphorylation of the peptide to the phosphorylation of the peptide sequence RPRTSSF.
【００１０】 図２ｂは、種々に修飾されたペプチドのリン酸化をペプチド配列ＧＲＰＲＴＳ
ＳＦのリン酸化に比較した。FIG. 2b shows the phosphorylation of variously modified peptides on the peptide sequence GRPRTS.
Compared to phosphorylation of SF.
【００１１】 （発明） 我々はここに、リン酸化部位に直結したＣ末端に大きい疎水性残基を含まない
ペプチドを知見した。これらのペプチドは意外にも、リン酸化部位に直結したＣ
末端に大きい疎水性残基を含む従来公知のペプチドと同様の優れたＰＫＢ基質で
あることが判明した。これらの新規なペプチドは、プロテインキナーゼＢ（ＰＫ
Ｂ）の賦活物質、阻害物質または結合物質となる物質をスクリーニングするため
に使用できる。本発明は特許請求の範囲に定義されている。(Invention) Here, we have found a peptide that does not contain a large hydrophobic residue at the C-terminal directly connected to the phosphorylation site. Surprisingly, these peptides have a C
It was found to be an excellent PKB substrate similar to a conventionally known peptide containing a large hydrophobic residue at the end. These novel peptides include protein kinase B (PK
It can be used to screen for substances that act as activators, inhibitors or binders of B). The invention is defined in the claims.
【００１２】 ペプチドは、転写の調節によるインスリン作用を媒介する化合物の効果と代謝
に関与する酵素の活性をリン酸化によって変調する化合物の効果とを識別するた
めに使用され得る。このような識別はこれまでは可能でなかった。Peptides can be used to discriminate between the effects of compounds that mediate insulin action by regulating transcription and those that modulate by phosphorylation the activity of enzymes involved in metabolism. Such identification was not previously possible.
【００１３】 本発明は、配列１：ＡｒｇＸａａＡｒｇＸａａＸａａＳｅｒＸａａ、または、
配列２：ＡｒｇｘａａＡｒｇＸａａＸａａＴｈｒＸａａを含むペプチド配列の使
用に関する。本発明の配列は、配列が標的酵素ＰＫＢに接近可能であるという条
件付で任意のペプチドまたはタンパク質にその一部分として含まれていてもよい
。[0013] The present invention provides a method for treating the sequence 1: ArgXaaArgXaaXaaSerXaa, or
Sequence 2: for the use of a peptide sequence comprising ArgxaaArgXaaXaaThrXaa. The sequences of the present invention may be included as part of any peptide or protein, provided that the sequence is accessible to the target enzyme PKB.
【００１４】 好ましいペプチドは配列１４：ＳｅｒＴｈｒＰｈｅＡｒｇＰｒｏＡｒｇＴｈｒ
ＳｅｒＳｅｒＡｓｎＡｌａ（ＳＴＦＲＰＲＴＳＳＮＡ）である。スクリーニング
方法に使用される配列は特許請求の範囲に定義されている。アミノ酸Ａｓｐ、Ｇ
ｌｕ、Ｌｙｓ及びＡｒｇは電荷を有しており、恐らくはこれがリン酸化に影響を
及ぼすものであろう。大きいまたは強力な疎水性残基という表現は、例えばＰｈ
ｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ及びＣｙｓを意味する。ＰＫＢという用語はその任
意のアイソフォームを包含する。定義された配列の使用は特許請求の範囲に記載
されている。A preferred peptide is SEQ ID NO: 14: SerThrPheArgProArgThr
SerSerAsnAla (STFRPRTSSNA). The sequences used in the screening method are defined in the claims. Amino acids Asp, G
Lu, Lys and Arg carry a charge, which probably affects phosphorylation. The expression large or strong hydrophobic residues is, for example, Ph
e, Leu, Ile, Trp and Cys. The term PKB includes any of its isoforms. The use of the defined sequence is claimed.
【００１５】 遺伝子転写の調節という表現は、酵素及び代謝に関与する別の成分の活性化ま
たは抑制、例えば肝臓のＰＥＰＣＫ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナ
ーゼ）の抑制を意味する。The expression regulation of gene transcription means the activation or suppression of enzymes and other components involved in metabolism, for example the suppression of hepatic PEPCK (phosphoenolpyruvate carboxykinase).
【００１６】 フォークヘッド転写因子ファミリーの構成員としては例えばＦＫＨＲ、ＦＫＨ
ＲＬ１、ＡＦＸ及びＡＦ６ｑ２１（それぞれ登録番号ＡＦ０３２８８５、ＡＦ０
３２８８６、Ｘ９３９９９６及びＡＪ００１５８９）がある。[0016] Members of the forkhead transcription factor family include, for example, FKHR, FKH
RL1, AFX and AF6q21 (registration numbers AF032885, AF0
32886, X939996 and AJ001589).
【００１７】 更に、特許請求の範囲に記載のペプチドは、ＰＫＢの新しい基質を探索するた
めに配列探索の鋳型として使用することもでき、及び／または、ＰＣＲのような
分子生物学の技術でプライマーとして使用することもできる。Furthermore, the claimed peptides can also be used as template for sequence search to search for new substrates of PKB and / or primers in molecular biology techniques such as PCR. It can also be used as
【００１８】 実施例１ Ｎ末端ヘマグルチニン（ＨＡ）タグを含むウシＰＫＢαをトランスフェクトし
たＣｏｓ−７細胞の溶解液（約１ｍｇのタンパク質）からＰＫＢのαアイソフォ
ームを免疫沈降させた。洗浄後、ＰＫＢによるペプチドＲＰＲＴＳＳＦ（図１ａ
の黒棒グラフ）及びＳＴＦＲＰＲＴＳＳＮＡ（図１ａの灰色棒グラフ）のリン酸
化を３３Ｐ標識ＡＴＰの存在下にインキュベーションする平行アッセイで測定し
た。２つのペプチドで得られた結果を比較すると、３０分以内のアッセイでは、
使用アッセイ条件下で等量のペプチドが０．５ピコモル／分の速度でリン酸化形
態に変換されたことが示される。Example 1 An α isoform of PKB was immunoprecipitated from a lysate of Cos-7 cells transfected with bovine PKBα containing an N-terminal hemagglutinin (HA) tag (about 1 mg of protein). After washing, the peptide RPRTSSF with PKB (FIG. 1a)
Black bars) and STFRPRTSSNA (measured in parallel assay incubation in the presence of a phosphorylated 33 P-labeled ATP gray bars) in Fig. 1a. Comparing the results obtained with the two peptides, the assay within 30 minutes shows that
It shows that an equivalent amount of peptide was converted to the phosphorylated form at a rate of 0.5 pmol / min under the assay conditions used.
【００１９】 ＰＫＢの免疫沈降は別の形態の酵素を免疫沈降させ、また、ＣＯＳ７細胞は野
生型ＰＫＢを含有するので、現行のアッセイはＰＫＢα以外のアイソフォームを
含むであろう。[0019] Immunoprecipitation of PKB immunoprecipitates another form of the enzyme, and since COS7 cells contain wild-type PKB, current assays will include isoforms other than PKBα.
【００２０】 従って、この実施例は、本発明のペプチドがα−フォーム以外のアイソフォー
ムのＰＫＢ活性を測定するために有用であることを示唆する。Thus, this example suggests that the peptides of the present invention are useful for measuring PKB activity of isoforms other than the α-form.
【００２１】 実施例２ グルタチオンビーズに予め結合させた実質的に不活性の組換えＧＳＴ−ＰＫＢ
αをＩＧＦ−１刺激したＨ９Ｃ２心筋細胞の漸増濃度の溶解液（約０、２０、１
００及び２００μｇ／ｍｌ）と共に非標識ＡＴＰの存在下でインキュベートして
活性化した。次いでビーズを完全に洗浄し、３３Ｐ−標識ＡＴＰの存在下でペプ
チドＲＰＲＴＳＳＦ（図１ｂの黒棒グラフ）及びペプチドＳＴＦＲＰＲＴＳＳＮ
Ａ（図１ｂの灰色棒グラフ）の各々をリン酸化するために使用した。データは、
各ペプチドがＰＫＢによって同等にリン酸化されること、及び、各ペプチドが酵
素の活性化度の増加と同じ程度までリン酸化されることを示した。Example 2 Substantially inactive recombinant GST-PKB pre-bound to glutathione beads
A lysate of increasing concentrations of H9C2 cardiomyocytes stimulated with α by IGF-1 (approximately 0, 20, 1
(00 and 200 μg / ml) and activated in the presence of unlabeled ATP. The beads were then washed thoroughly and the peptides RPRTSSF (black bar graph in FIG. 1b) and peptide STFRPRTSSN in the presence of 33 P-labeled ATP.
A (grey bar graph in FIG. 1b) was used to phosphorylate each. Data is,
It was shown that each peptide was equally phosphorylated by PKB, and that each peptide was phosphorylated to the same extent as the increase in enzyme activation.
【００２２】 この実験は、本発明のペプチドがＰＫＢαアイソフォームの活性を検定するア
ッセイに有用であることを証明する。This experiment demonstrates that the peptides of the invention are useful in assays that assay the activity of PKBα isoforms.
【００２３】 実施例３ 活性化された組換えＰＫＢが異なる種々のペプチドをリン酸化させる能力を研
究することによって、ＰＫＢリン酸化アッセイに使用するペプチド基質の全体的
特徴をより詳細に検討した（図２ａ及びｂ）。即ち、活性化された０．２μｇの
組換えＰＫＢ（ＵＢＩから購入）と共にペプチド（１００μＭ）を１０μＭの３ ３ Ｐ−ＡＴＰの存在下でインキュベートし、ペプチドのリン酸化の程度を、ＰＫ
Ｂ基質として従来使用されていたペプチド配列ＲＰＲＴＳＳＦ（Ａｌｅｓｓｉら
，１９９６）のリン酸化の程度に比較した。図２ａは、リン酸化を触媒すると考
えられるＰＫＢ配列のいずれかの末端に３つ以下の中性または小さい疎水性アミ
ノ酸を添加しても各ペプチドのそれぞれのリン酸化の程度に顕著な効果が全くな
かったことを示す。これらのデータは更に、Ｃ末端のリン酸化残基に嵩高い疎水
性アミノ酸を有していないタンパク質のフォークヘッド転写因子ファミリーに由
来のペプチドが優れたＰＫＢ基質であるという我々の主張を支える。Example 3 The overall characteristics of the peptide substrates used in the PKB phosphorylation assay were examined in more detail by studying the ability of activated recombinant PKB to phosphorylate different peptides (FIG. 2a and b). That, along with activated 0.2μg recombinant PKB (purchased from UBI) peptide (100 [mu] M) were incubated in the presence of 3 3 P-ATP in 10 [mu] M, the degree of phosphorylation of the peptide, PK
The degree of phosphorylation of the peptide sequence RPRTSSF (Alessi et al., 1996) conventionally used as a B substrate was compared. FIG. 2a shows that adding no more than three neutral or small hydrophobic amino acids to either end of the PKB sequence that is thought to catalyze phosphorylation has no significant effect on the degree of phosphorylation of each peptide. Indicates that there was no. These data further support our claim that peptides from the forkhead transcription factor family of proteins that do not have bulky hydrophobic amino acids at the C-terminal phosphorylated residue are excellent PKB substrates.
【００２４】 図２ｂは、種々に修飾されたペプチドをリン酸化するＰＫＢの能力を示す。ペ
プチドＧＲＰＲＴＳＳＦのＮ末端にビオチン部分のような嵩高いユニットが添加
されると、ＰＫＢによるリン酸化は７５％減少した。ＰＫＢはまた、ペプチドＫ
ＫＲＮＲＴＬＴＫ（ＰＫＢに近縁のキナーゼであるｐ７０Ｓ６キナーゼの活性を
測定するためにしばしば使用されるペプチド）及びペプチドＡＰＲＰＲＶＥＴＳ
Ｑ（ピルピン酸デヒドロゲナーゼキナーゼ１に由来）をＧＲＰＲＴＳＳＦの１／
４未満の程度までしかリン酸化しなかった。これらのデータは、ＰＫＢによって
リン酸化されるコンセンサスペプチド配列のいずれかの末端に荷電アミノ酸を添
加すると、これらの配列をリン酸化するＰＫＢの能力が顕著に低下することを示
す。特に、各ペプチドはリン酸化されるアミノ酸に隣接した荷電残基を含んでお
り、これは、標的残基に直結したＮ−及びＣ−末端のこれらの位置の無電荷がＰ
ＫＢに有利であることを示している。FIG. 2 b shows the ability of PKB to phosphorylate variously modified peptides. Addition of a bulky unit such as a biotin moiety to the N-terminus of the peptide GRPRTSSF reduced the phosphorylation by PKB by 75%. PKB also contains peptide K
KRNRTLK (a peptide often used to measure the activity of p70S6 kinase, a kinase related to PKB) and peptide APRPRVETS
Q (derived from pyruvate dehydrogenase kinase 1)
It was phosphorylated only to a degree of less than 4. These data indicate that the addition of charged amino acids to either end of the consensus peptide sequences phosphorylated by PKB significantly reduces the ability of PKB to phosphorylate these sequences. In particular, each peptide contains charged residues adjacent to the amino acid to be phosphorylated, indicating that the uncharged N- and C-termini at these positions directly linked to the target residue are P
It shows that it is advantageous for KB.
【００２５】 考察 我々のデータは、ＰＫＢに媒介されるリン酸化のためには標的残基に直結した
Ｃ末端に大きい疎水性アミノ酸残基が必要であるというこれまでに報告されてい
た要件が効率的なリン酸化には必要でないこと、及び、（ＦＫＨＲ及びその他の
転写因子ファミリーの構成員に見られるような）この位置のアミノ酸はその殆ど
が好適でありＰＫＢのリン酸化能力を低下させないことを示した。データはまた
、我々が特許請求の範囲に記載した新規なペプチドがＰＫＢモジュレーターをス
クリーニングするために有用な成分として使用できることを示す。DISCUSSION Our data suggest that the previously reported requirement that PKB-mediated phosphorylation requires a large hydrophobic amino acid residue at the C-terminus that is directly linked to the target residue is an efficient And that the amino acids at this position (as found in FKHR and other members of the transcription factor family) are most preferred and do not reduce the phosphorylation capacity of PKB. Indicated. The data also show that the novel peptides we claim can be used as useful components to screen for PKB modulators.
【００２６】 特許請求の範囲に記載のペプチドは、インスリン信号発生経路の変換器、代謝
に関与する酵素、などのような代謝必須成分の量が不足している患者の治療に有
用な成分を見出すために使用できる。特許請求の範囲に記載のスクリーニングに
よって見出された成分はまた、血管機能不全、ニューロン細胞の欠失、膵臓のβ
細胞の欠失、などのようなインスリンレジスタンスを原因とする長期合併症に使
用できると期待される。国際特許ＷＯ９７／２２３６０に記載のようなモジュレ
ーターを使用することによってこれらの化合物を見出すことはできない。The claimed peptides find components useful in the treatment of patients with a deficient amount of essential metabolic components, such as insulin signaling pathway transducers, enzymes involved in metabolism, and the like. Can be used for Components found by the claimed screens also include vascular dysfunction, loss of neuronal cells, pancreatic β
It is expected that it can be used for long-term complications caused by insulin resistance, such as cell loss. These compounds cannot be found by using modulators as described in International Patent WO 97/22360.
【００２７】[0027]
【表１】 [Table 1]
【配列表】 [Sequence list]
【図１ａ】 ＨＡ−ＰＫＢによってトランスフェクトされたＣｏｓ−７。Ｃ
ｒｏｓｓｔｉｄｅのリン酸化（黒棒グラフ）を本発明のペプチド（灰色棒グラフ
）に比較したグラフを表す。FIG. 1a. Cos-7 transfected by HA-PKB. C
3 shows a graph comparing the phosphorylation of rosside (black bar graph) with the peptide of the present invention (grey bar graph).
【図１ｂ】 ＩＧＦ−１刺激した筋肉細胞溶解液とのインキュベーションに
よって活性化した不活性ｒＰＫＢα。Ｃｒｏｓｓｔｉｄｅのリン酸化（黒棒グラ
フ）を本発明のペプチド（灰色棒グラフ）に比較したグラフを表す。FIG. 1b. Inactive rPKBα activated by incubation with IGF-1 stimulated muscle cell lysate. 2 shows a graph comparing the phosphorylation of Crossside (black bar graph) to the peptide of the present invention (grey bar graph).
【図２ａ】 ペプチドのリン酸化をペプチド配列ＲＰＲＴＳＳＦのリン酸化
に比較したグラフを表す。FIG. 2a shows a graph comparing the phosphorylation of the peptide to the phosphorylation of the peptide sequence RPRTSSF.
【図２ｂ】 種々に修飾されたペプチドのリン酸化をペプチド配列ＧＲＰＲ
ＴＳＳＦのリン酸化に比較したグラフを表す。FIG. 2b shows the phosphorylation of variously modified peptides by the peptide sequence GRPR
Figure 2 shows a graph comparing to phosphorylation of TSSF.
Claims (17)
から選択され、４位及び５位のＸａａは任意のアミノ酸、好ましくはＴｈｒ及び
Ｓｅｒから選択され、７位のＸａａは任意のアミノ酸、好ましくはＡｓｎ、Ｇｌ
ｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒから選択され、但し、配列がリン酸化部位に直結したＣ末端
に大きい疎水性残基を含まない基質ペプチドを使用することを特徴とするプロテ
インキナーゼＢ（ＰＫＢ）の賦活物質または阻害物質となる物質のスクリーニン
グ方法。1. Sequence 1 or Sequence 2: ArgXaaArgXaaXaaSerXaa (1); or ArgXaaArgXaaXaaThrXaa (2): wherein Xaa at position 2 in the sequence is any amino acid, preferably Pro and Gly.
Xaa at positions 4 and 5 is selected from any amino acid, preferably Thr and Ser, and Xaa at position 7 is any amino acid, preferably Asn, GI
an activator of protein kinase B (PKB), wherein the activator is selected from n, Thr, and Ser, provided that a substrate peptide containing no large hydrophobic residue at the C-terminus directly connected to a phosphorylation site is used. A method for screening a substance that serves as an inhibitor.
ｇからは選択されないことを特徴とする請求項１に記載のスクリーニング方法。2. Xaa at the 4- and 5-positions is Asp, Glu, Lys or Ar.
The screening method according to claim 1, wherein the method is not selected from g.
り、３位のＸａａは任意のアミノ酸、好ましくはＰｒｏ及びＧｌｙから選択され
、５位及び６位のＸａａは任意のアミノ酸、好ましくはＴｈｒ及びＳｅｒから選
択され、８位のＸａａは任意のアミノ酸、好ましくはＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、
Ｓｅｒから選択され、但し、配列がリン酸化部位に直結したＣ末端に大きい疎水
性残基を含まないことを特徴とする請求項１に記載のスクリーニング方法。4. The peptide comprises the sequence 4 or 5: XaaArgXaaArgXaaXaaSerXaa (4); XaaArgXaaArgXaaXaaThrXaa (5): Xaa at position 1 in the sequence is a large hydrophobic amino acid, preferably Phe, and Xa at position 3 is optional. Are preferably selected from Pro and Gly, Xaa at positions 5 and 6 are selected from any amino acid, preferably Thr and Ser, and Xaa at position 8 is any amino acid, preferably Asn, Gln, Thr,
The screening method according to claim 1, wherein the screening method is selected from Ser, except that the sequence does not contain a large hydrophobic residue at the C-terminal directly connected to the phosphorylation site.
ｇからは選択されないことを特徴とする請求項４に記載のスクリーニング方法。5. Xaa at the 5- and 6-positions is Asp, Glu, Lys or Ar.
5. The screening method according to claim 4, wherein the method is not selected from g.
Ｇｌｙから選択されることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の
スクリーニング方法。6. The peptide comprises the sequence 6 or 7: ArgXaaArgXaaXaaSerXaaXaa (6); or ArgXaaArgXaaXaaThrXaaXaa (7): wherein Xaa at position 8 in the sequence is selected from small hydrophobic amino acids, preferably Ala and Gly. The screening method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that:
Ｇｌｙから選択されることを特徴とする請求項４から６のいずれか一項に記載の
スクリーニング方法。7. The peptide comprises the sequence 8 or 9: XaaArgXaaArgXaaXaaSerXaaXaa (8); or XaaArgXaaArgXaaXaaThrXaaXaa (9): wherein Xaa at position 9 in the sequence is a hydrophobic amino acid, preferably from Ala to Gla, preferably from Ala to Gla. The screening method according to any one of claims 4 to 6, characterized in that:
）： を含み、配列中の５位のＸａａは任意のアミノ酸、好ましくはＰｒｏ及びＧｌｙ
から選択され、７位及び８位のＸａａは任意のアミノ酸、好ましくはＴｈｒ及び
Ｓｅｒから選択され、１０位のＸａａは任意のアミノ酸、好ましくはＡｓｎ、Ｇ
ｌｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒから選択され、１１位のＸａａは小さい疎水性アミノ酸、
好ましくはＡｌａ及びＧｌｙから選択されることを特徴とする請求項７に記載の
スクリーニング方法。9. The peptide of SEQ ID NO: 12: SerThrPheArgXaaArgXaaXaaSerXaaXaa (12
Wherein Xaa at position 5 in the sequence is any amino acid, preferably Pro and Gly
Xaa at position 7 and 8 are selected from any amino acid, preferably Thr and Ser, and Xaa at position 10 is selected from any amino acid, preferably Asn, G
Xaa at position 11 is a small hydrophobic amino acid selected from ln, Thr, Ser
The screening method according to claim 7, wherein the method is preferably selected from Ala and Gly.
）： を含み、配列中の５位のＸａａは任意のアミノ酸、好ましくはＰｒｏ及びＧｌｙ
から選択され、７位及び８位のＸａａは任意のアミノ酸、好ましくはＴｈｒ及び
Ｓｅｒから選択され、１０位のＸａａは任意のアミノ酸、好ましくはＡｓｎ、Ｇ
ｌｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒから選択され、１１位のＸａａは小さい疎水性アミノ酸、
好ましくはＡｌａ及びＧｌｙから選択されることを特徴とする請求項８に記載の
スクリーニング方法。10. The peptide has the primary sequence 13: SerThrPheArgXaaArgXaaXaaThrXaaXaa (13
Wherein Xaa at position 5 in the sequence is any amino acid, preferably Pro and Gly
Xaa at position 7 and 8 are selected from any amino acid, preferably Thr and Ser, and Xaa at position 10 is selected from any amino acid, preferably Asn, G
Xaa at position 11 is a small hydrophobic amino acid selected from ln, Thr, Ser
9. The screening method according to claim 8, wherein the method is preferably selected from Ala and Gly.
）： から成ることを特徴とする請求項９に記載のスクリーニング方法。11. The peptide has the primary sequence 14: SerThrPheArgProArgThrSerSerAsnAla (14
): The screening method according to claim 9, comprising:
れかを使用することを特徴とする、ＰＫＢの触媒活性が関与するフォークヘッド
タンパク質による遺伝子転写調節の賦活物質、阻害物質及び結合物質となる物質
のスクリーニング方法。12. An activator or inhibitor of the regulation of gene transcription by a forkhead protein involved in the catalytic activity of PKB, comprising using any one of the peptides according to any one of claims 1 to 11. A screening method for a substance and a substance to be a binding substance.
れかを使用することを特徴とする、ＰＫＢの活性を変調する能力を有する物質の
スクリーニング方法。13. A method for screening a substance having the ability to modulate the activity of PKB, comprising using any one of the peptides according to any one of claims 1 to 11.
１のいずれか一項に記載のペプチドの使用。14. The method according to claim 1, wherein the activity of PKB is measured.
Use of a peptide according to any one of the preceding claims.
よる遺伝子転写調節の賦活物質または阻害物質となる物質をスクリーニングする
ための請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチドの使用。15. The use of the peptide according to any one of claims 1 to 11, for screening a substance that becomes an activator or an inhibitor of gene transcription regulation by a forkhead protein involved in PKB catalytic activity.
謝に関与する酵素の活性をリン酸化によって変調する化合物の効果とを識別する
ための請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチドの使用。16. The method according to any one of claims 1 to 11, for distinguishing between the effect of a compound that mediates insulin action by transcription and the effect of a compound that modulates the activity of an enzyme involved in metabolism by phosphorylation. Use of the described peptide.
インスリン作用を媒介する化合物の効果と、代謝に関与する酵素の活性をリン酸
化によって変調する化合物の効果とを識別するための請求項１４に記載の使用。17. A method for distinguishing between the effect of a compound that mediates insulin action by transcription involving the forkhead transcription factor family and the effect of a compound that modulates the activity of an enzyme involved in metabolism by phosphorylation. Use as described in.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9801530-8 | 1998-04-30 | ||
| SE9801530A SE9801530D0 (en) | 1998-04-30 | 1998-04-30 | Method of screening |
| PCT/SE1999/000609 WO1999057305A1 (en) | 1998-04-30 | 1999-04-16 | Method for screening for substances which are activators or inhibitors of protein kinase b |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002514389A true JP2002514389A (en) | 2002-05-21 |
Family
ID=20411158
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000547256A Withdrawn JP2002514389A (en) | 1998-04-30 | 1999-04-16 | Screening method for substances that act as activators or inhibitors of protein kinase B |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1090140A1 (en) |
| JP (1) | JP2002514389A (en) |
| AU (1) | AU754508B2 (en) |
| CA (1) | CA2327540A1 (en) |
| SE (1) | SE9801530D0 (en) |
| WO (1) | WO1999057305A1 (en) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7622446B2 (en) | 2001-04-18 | 2009-11-24 | The Open University | Polypeptides, derivatives and uses thereof |
| US7491702B2 (en) | 2001-04-18 | 2009-02-17 | The Open University | Polypeptides related to amyloid precursor protein, pharmaceutical compositions thereof, and methods of treatment using the same |
| WO2006023879A1 (en) * | 2004-08-20 | 2006-03-02 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Screening of agents for activity against ischemic myocardial insults |
| WO2006108270A1 (en) | 2005-04-11 | 2006-10-19 | Pharmagap Inc. | Inhibitors of protein kinases and uses thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5532167A (en) * | 1994-01-07 | 1996-07-02 | Beth Israel Hospital | Substrate specificity of protein kinases |
| ATE274053T1 (en) * | 1995-11-16 | 2004-09-15 | Novartis Pharma Gmbh | METHOD FOR IDENTIFYING COMPOUNDS THAT INTERACT WITH RAC PROTEINE KINASE |
| AU1200497A (en) * | 1995-12-20 | 1997-07-14 | Medical Research Council | Control of protein synthesis, and screening method for agents |
-
1998
- 1998-04-30 SE SE9801530A patent/SE9801530D0/en unknown
-
1999
- 1999-04-16 EP EP99948555A patent/EP1090140A1/en not_active Withdrawn
- 1999-04-16 WO PCT/SE1999/000609 patent/WO1999057305A1/en not_active Application Discontinuation
- 1999-04-16 JP JP2000547256A patent/JP2002514389A/en not_active Withdrawn
- 1999-04-16 AU AU42982/99A patent/AU754508B2/en not_active Ceased
- 1999-04-16 CA CA002327540A patent/CA2327540A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU754508B2 (en) | 2002-11-21 |
| WO1999057305A1 (en) | 1999-11-11 |
| CA2327540A1 (en) | 1999-11-11 |
| SE9801530D0 (en) | 1998-04-30 |
| EP1090140A1 (en) | 2001-04-11 |
| AU4298299A (en) | 1999-11-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bianchi et al. | Regulation of FAK Ser-722 phosphorylation and kinase activity by GSK3 and PP1 during cell spreading and migration | |
| Kim et al. | Signalling through IGF-I and insulin receptors: where is the specificity? | |
| Bandyopadhyay et al. | Effects of transiently expressed atypical (ζ, λ), conventional (α, β) and novel (δ, ɛ) protein kinase C isoforms on insulin-stimulated translocation of epitope-tagged GLUT4 glucose transporters in rat adipocytes: specific interchangeable effects of protein kinases C-ζ and C-λ | |
| Osherov et al. | Epidermal‐growth‐factor‐dependent activation of the src‐family kinases | |
| Zhang et al. | The insulin receptor-related receptor. Tissue expression, ligand binding specificity, and signaling capabilities. | |
| Ikeda et al. | Studies on the generation of Ca2+/calmodulin-independent activity of calmodulin-dependent protein kinase II by autophosphorylation. Autothiophosphorylation of the enzyme | |
| Welsh et al. | Peptide substrates suitable for assaying glycogen synthase kinase-3 in crude cell extracts | |
| Ando et al. | Enhanced insulin-induced mitogenesis and mitogen-activated protein kinase activities in mutant insulin receptors with substitution of two COOH-terminal tyrosine autophosphorylation sites by phenylalanine. | |
| Murray et al. | Identification of filamin C as a new physiological substrate of PKBα using KESTREL | |
| Glass | Substrate specificity of the cyclic GMP-dependent protein kinase | |
| CA2848433C (en) | Screening methods | |
| JP2003516760A (en) | Protein kinase regulation | |
| US6207393B1 (en) | Inhibition of intracellular signal transduction by 14-3-3-binding peptides | |
| JP2002514389A (en) | Screening method for substances that act as activators or inhibitors of protein kinase B | |
| Lipinski et al. | Critical role of the FERM domain in Pyk2 stimulated glioma cell migration | |
| EP1699460B1 (en) | Use of enzymatic inhibitors of h-prune for the prevention and treatment of the metastases of tumours overexpressing h-prune | |
| Nacusi et al. | Akt1 sequentially phosphorylates p27 kip1 within a conserved but non-canonical region | |
| Woischwill et al. | Regulation of the human atrial myosin light chain 1 promoter by Ca2+‐calmodulin‐dependent signaling pathways | |
| WO2003059943A2 (en) | Conformation-specific, protein kinase binding peptides and related methods and products | |
| US6753413B1 (en) | P35NCK5A binding proteins | |
| WO1999047557A2 (en) | Identification of factors which mediate the interaction of heterotrimeric g proteins and monomeric g proteins | |
| Cengel et al. | Phosphatidylinositol 3′-kinase associates with an insulin receptor substrate-1 serine kinase distinct from its intrinsic serine kinase | |
| Miquet et al. | Increased SH2-Bβ content and membrane association in transgenic mice overexpressing GH | |
| EP1551443A2 (en) | Proteins involved in the regulation of energy homeostasis | |
| KR20090037498A (en) | Method of regulating mammalian target-of-rapamycin activity by interaction between phospholipase d and raptor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20060704 |