JP2002512802A6 - Aromatic metabolism / Production of III substances by microorganisms - Google Patents
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Abstract
本発明は、芳香族代謝物質、特に芳香族アミノ酸を微生物学的に製造する方法に関する。加えて、本発明は、遺伝子構造及び形質転換された細胞に関する。本発明に従い、物質、特に芳香族アミノ酸の生産の増加がグルコースデヒドロゲナーゼの活性を導入し又は増加させることによって観察される。グルコース酸化酵素の活性の増加は、グルコース含有物質からのグルコノラクトン及びグルコン酸の細胞内形成を導くものである。好ましい態様においては、グルコースデヒドロゲナーゼはＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍから誘導される。本発明に従う方法は、より広範囲な種類の物質の提供に使用可能である。The present invention relates to a method for microbiologically producing aromatic metabolites, particularly aromatic amino acids. In addition, the present invention relates to gene structure and transformed cells. According to the present invention, an increase in the production of substances, in particular aromatic amino acids, is observed by introducing or increasing the activity of glucose dehydrogenase. Increased activity of glucose oxidase leads to intracellular formation of gluconolactone and gluconic acid from glucose-containing substances. In a preferred embodiment, the glucose dehydrogenase is derived from Bacillus megaterium. The method according to the invention can be used to provide a wider variety of substances.
Description
【０００１】
本発明は、請求項１乃至19項及び請求項２９記載の芳香族代謝物質の微生物学的製造方法、請求項２０乃至２２記載の遺伝子構造物、及び請求項23乃至２8記載の形質転換された細胞に関する。
【０００２】
微生物学的に製造された芳香族代謝物質、例えば、特に芳香族アミノ酸は、アミノ酸の需要が増大し続けていて多大な経済的関心の対象となっている。
【０００３】
すなわち、例えば、Ｌ−フェニルアラニンは、薬剤の製造に用いられ、又、特に、甘味剤アスパルテーム（α−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン メチル エステル）の製造に使用される。Ｌ−トリプトファンは、薬剤として、又、飼料添加剤として必要とされる；同様に、Ｌ−チロシンが薬剤として、又、薬品工業において原料として必要とされる。天然物からの分離の他に、バイオテクノロジーを使用した製造は、経済的に適性な条件下で、所望の光学活性型のアミノ酸を得るのに非常に重要な方法である。バイオテクノロジー的製造は、酵素的に又は微生物を使用してのいずれかで遂行される。
【０００４】
後者、すなわち微生物学的製造は、単純なそして廉価な原料を採用することができる利点を持つ。しかし、アミノ酸の生合成は非常に多種の様式により細胞中で制御されるので、生産性を増大させる多くの試みがなされている。例えば、アミノ酸同族体が生合成の制御をスイッチオフするのに使用される。例えば、フェニルアラニン同族体に対する抵抗を選択することにより、Ｌ−フェニルアラニンの生産を増加させるのを可能にするＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ の突然変異体を得ることができる（ＧＢ−２、０５３、９０６）。 また、同様のやり方でＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＪＰ−１９０３７/１９７６及びＪＰ−３９５１７/１９７８）及びＢａｃｉｌｌｕｓ（ＥＰ−０、１３８、５２６）の過剰生産菌株が得られた。
【０００５】
加えて、組換えＤＮＡ技術により構築された微生物が知られており、もはやフィードバック阻害されないキー酵素をコードする遺伝子のクローニング及び発現により生合成の制御が同様に消滅している。ひとつのモデルとして、ＥＰ−０、０７７、１９６は芳香族アミノ酸を産生する製法を開示し、そのなかで、もはやフィードバック阻害を起こさない３‐デオキシ‐Ｄ‐アラビノヘプツローソネート‐７‐フォスフェート シンターゼ（ＤＡＨＰ シンターゼ）がＥ．ｃｏｌｉ中で過剰発現されることを開示しいる. ＥＰ‐０、１４５、１５６は、Ｌ−フェニルアラニンを産生するためにコリスメートムターゼ/プリフェネート デヒドラターゼが追加的に過剰発現されるＥ．ｃｏｌｉ菌株を記載している。
【０００６】
ここで述べた戦略は、生産性を改善するための介入は芳香族アミノ酸に特異的な生合成経路に限定されるという共通の特徴を共有する。しかしながら、産生を更に増加させるためには、アミノ酸を産生するに必要な第一次代謝産物である、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）及びエリトロース‐４‐フォスフェイト（Ｅｒｙ４Ｐ）の供給を改善することに努力することが肝要である。
【０００７】
ＰＥＰは、解糖からの産物、ピルベート（ピルビン酸）の活性化前駆体である；Ｅｒｙ４Ｐは、ペントース フォスフェート経路の中間体である。
【０００８】
生産性を増加させるこれらの多くのさまざまな試みは、すべてアミノ酸の細胞質合成に対する制限を克服することに向けられている。 芳香族アミノ酸の製造において、第一次代謝産物、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）及びＥｒｙ４Ｐが３‐デオキシ‐Ｄ‐アラビノヘプツローソネート‐７-フォスフェイト（ＤＡＨＰ）を形成する縮合反応に必要とされる。
【０００９】
ある文献は、Ｅｒｙ４Ｐの入手性の増大させる幾つかの戦略、例えば、Ｅｒｙ４Ｐの供給を増加させること、そして結果として、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン又はＬ−フェニルアラニン産生物の形成が増大することがトランスケトラーゼの過剰発現によって可能になったと報じている（ＥＰ特許出願番号０、６００、４６３； Ｆｒｏｓｔ ＆ Ｄｒａｔｈｓ、Ａｎｎ、Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９（１９９５）５５７−５７９）。 最近、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ の ＰＴＳ−ネガティブ突然変異体の自発的グルコース‐ポジティブ復帰突然変異体は、ＧａｌＰシステムにより細胞中にグルコースを集中させ、グルコースでの成長が可能であったことが明らかにされた（Ｆｌｏｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４（１９９６）６２０−６２３）。 トランスケトラーゼ遺伝子ｔｋｔＡの追加的発現は、中間体ＤＡＨＰの形成の増大が観察されることを結果した。（Ｆｌｏｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４（１９９６）６２０−６２３）。
【００１０】
未公開である二つのドイツ特許出願、引用番号 ＤＥ １９６ ４４ ５６６．３ 及び ＤＥ１９６ ４４ ５６７．１において、出願人は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中のトランスアルドラーゼ又はトランスアルドラーゼ及びトランスケトラーゼの酵素活性を増加させることにより、又はＥｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ中のグルコキナーゼ又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中のグルコキナーゼ及び糖のためのＰＥＰ非依存性輸送システムの活性を増加させることにより又は上記酵素と輸送システムを組合せることにより、増大した量のフェニルアラニンを製造することが可能になったことを証明した。
【００１１】
本発明の目的は、芳香族代謝物質の改良された微生物学的合成が達成される方法を利用可能にすることである。
【００１２】
また、芳香族代謝物質の形成が増加された微生物が構築される。
【００１３】
驚くべきことに、グルコース酸化酵素活性を単純に増加させることにより、芳香族代謝物質を産生する微生物中で、グルコース又はグルコース含有基質が変化されることによりその目的が達成される。このようにして、既存のものに変わる代謝経路が提供される。この経路は、遊離のグルコースをグルコノラクトン/グルコネートへの酸化及び６−ホスホグルコネートを形成するグルコネートのホスホリル化を含む。
【００１４】
この結果は、単純にグルコース酸化酵素活性を増加させることが芳香族代謝物質を産生することにおいて重要な役割を演ずるということが決して自明でないから特に驚くべきことである。
【００１５】
本発明の意味において、芳香族代謝物質は、Ｅｒｙ４Ｐ、又はＥｒｙ４Ｐ及びＰＥＰの供給の増加が生化学的合成に有利である全ての化合物であると理解される。例えば、芳香族アミノ酸、インジゴ、インドール酢酸、アジピン酸、メラニン、シキミ酸、コリスミ酸、キノン、安息香酸そして又それらの潜在的誘導体及び第二次産物である。
【００１６】
これに関連して、本発明による介入に加えて、本物質を産生する微生物への更なる遺伝子的変更が、インジゴ、アジピン酸及び他の非自然的第二次産物の製造に必要とされることが注目される（Ｆｒｏｓｔ ＆ Ｄｒａｔｈｓ、Ａｎｎ、Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９（１９９５）５５７−５７９）。
【００１７】
微生物産生芳香族代謝物質は、グルコース又はグルコース含有基質、すなわち、グルコース含有二糖類又はオリゴ糖を種々の過程で代謝することができる：従って、グルコースは、ＡＴＰ依存性キナーゼ（ヘキソキナーゼ及びグルコキナーゼ）
によってホスホリル化され、それによって解糖系に集中されることが知られている。更に、多くの細菌は、グルコースを取込み、それをホスホリル化するためのＰＥＰ依存性システムを利用する。
【００１８】
グルコースは、種々の溶解性又は膜結合された酵素によっても酸化されうる（グルコノラクトンを経由してグルコン酸に変わる）。これらの酵素は、グルコースオキシダーゼ又はグルコースデヒドロゲナーゼを包含する。グルコースオキシダーゼは、分子状酸素の還元を伴い、グルコースを酸化してグルコノラクトンにする。グルコースデヒドロゲナーゼも、グルコースを酸化してグルコノラクトンにするが、ピローロキノリンキノン（ＰＱＱ）のような他の電子受容体又はニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）もしくはＮＡＤＰのような他の補助因子を使用する。 膜に結合したグルコースデヒドロゲナーゼは、膜の外側で起きる反応により補助因子ピローロキノリンキノン（ＰＱＱ）を使用してグルコースを酸化することが知られている。産生物（グルコノラクトン又はグルコン酸）をその細胞の中へ取り込むために、ｖａｎ Ｓｃｈｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６３ （１９８５）４９３−４９９；Ｉｓｔｕｒｉｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １３２ （１９８６）３２０９−３２１９； Ｉｚｕ ｅｔ ａｌ ．， Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２６７（１９９７）７７８−７９３ により記載されたように特殊の輸送システムを必要とするが、Ｉｚｕ等によってＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２６７（１９９７）７７８−７９３において及びＣｏｗａｙ．によりＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １０３ （１９９２）１−２７において記載されたように、その形質発現は、通常（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの中で）グルコースの存在により抑制される。
【００１９】
補助因子ＮＡＤ又はＮＡＤＰを使用するグルコースデヒドロゲナーゼは、細胞内に見出される可溶性酵素である。知られているプロデューサーは、バチルス菌株を包含し、その中の幾つかはグルコースデヒドロゲナーゼのイソ酵素を有する（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍの場合のグルコースデヒドロゲナーゼＩ‐ＩＶ； Ｍｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ ．，１９９０， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７０，３６３−３６９）。グルコースデヒドロゲナーゼの発現は、厳密に制御されており、例えば、バチルス種による内生胞子の形成過程の胞子前状態においてのみ生じることが知られている； グルコース上の成長に関連してグルコースデヒドロゲナーゼの生理学的役割は、Ｌａｍｐｅｌ等によりＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６６（１９８６）２３８−２４３，および最近では、Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ又はＦｏｒｔｎａｇｅｌ（“バチルス ズブチリス 及び他のグラム陽性細菌”（Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ、Ｈｏｃｈ ａｎｄ Ｌｏｓｉｃｋ，編）， Ｍ．Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ｐｐ．１５７−１７０及びＰ．Ｆｏｒｔｎａｇｅｌ ｐｐ．１７１−１８０； ＩＳＢＮ １−５５５８１−０５３−５； ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９３）で報告されたように、明らかでない。
【００２０】
これまで、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、又は特にＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａにおいてはＮＡＤ（Ｐ）依存性グルコースデヒドロゲナーゼは報告がなかった。バチルス菌株により誘導されたグルコースデヒドロゲナーゼのための遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中にクローン化されこの細菌中で発現された（Ｈｉｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １０７６（１９９１）２９８−３０４）。その目的は、特に、組換えグルコースデヒドロゲナーゼを得るためで、それはグルコース又は補助因子再生のための検出用システムとして採用されたものである（Ｈｉｌｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １０７６（１９９１）２９８−３０４；ドイツ国特許出願 ３ ７１１ ８８１）。対照的にこれらの遺伝子は、たとえば芳香族代謝物質を得るための基質として、グルコースを活用するためにはこれまで記載されていない。
【００２１】
本発明に従い、グルコースデヒドロゲナーゼを導入し、またはその活性を増加させることが驚くべきことに物質の形成へと導くということが見出された。グルコース酸化酵素の活性の増加が、グルコース含有基質からグルコノラクトン及びグルコン酸の細胞内形成へ導く。好ましい態様では、Ｍｉｔａｍｕｒａ等により、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７０ （１９９０）３６３−３６９において 及びＮａｇａｏ等により、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １５ （１９９２）５０１３−５０２０において述べられたようにグルコースデヒドロゲナーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，特にＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ グルコースデヒドロゲナーゼＩＶに由来する。
【００２２】
グルコン酸は、その活性をグルコン酸ホスホリル化酵素に依存する。そのような酵素は、例えば、グルコン酸特異性を有するホスホエノールピルベート依存性酵素ＩＩでもよいし又はグルコン酸特異性を有するＡＴＰ依存性キナーゼでもよいことが知られている。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴＰ依存性グルコネートキナーゼ Ｇｎｔｋは、例えば、Ｉｚｕ等によって、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３９４ （１９９６）１４−１６において； Ｉｚｕ等によって、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２６７（１９９７）７７８−７９３及びＴｏｎｇ等によって、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８（１９９６）３２６０−３２６９において述べられているように、知られている。
【００２３】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおいて、産生物６−ホスホグルコネートは、ペントースフォスフェート経路及びエントナードウデロフ（Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｅｒｏｆｆ）経路双方の酸化枝分れの中間体であり、このことは、Ｆｒａｅｎｋｅｌｎにより、“Ｅｓｃｈｅｒｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ” 米国、ワシントン、ＡＳＭ出版、第二版（Ｎｅｉｄｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ）、ＩＳＢＮ−１−５５５８１−０８４−５、１９９６、１８９−１９８頁において述べらている。
【００２４】
物質の産生は、追加的にグルコン酸（グルコネート）−ホスホリル化酵素の活性を増加させることにより改良できる。グルコン酸ホスホリル化酵素が使用されるとき、例えば、多くの種類の微生物からのグルコン酸ホスホリル化酵素が好ましい、但し、それらが芳香族代謝物質を産生する微生物中で機能的に発現され得ることが条件となる。ＡＴＰ依存性グルコネートキナーゼ、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ グルコネートキナーゼ、特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ からのグルコネートキナーゼ（Ｇｎｔｋ）の使用が特に望ましい。グルコン酸ホスホリル化酵素用の他の遺伝子であっても、遺伝子産生物がグルコン酸をホスホリル化するものであれば、本発明に基づく製法に適しているといえる。他の腸内細菌、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，及びＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍからの遺伝子が例として挙げられる。
【００２５】
グルコキナーゼの効果は、グルコン酸／グルコネートの活性化に限定され、それはしかし例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ又は他の細菌によりグルコースの存在下で代謝されない。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中で生物がグルコン酸上で成長するときに、グルコネートキナーゼ Ｇｎｔｋが重要なだけで、グルコースの代謝には寄与しない。Ｉｚｕ等によって、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２６７（１９９７）７７８−７９３及びＴｏｎｇ等によって、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８（１９９６）３２６０−３２６９において述べられているように、
事実、その形成は、グルコースの存在下で実際に抑制され、グルコースの存在下では起きない。
【００２６】
それゆえ、この特定の態様においては、グルコン酸ホスホリル化酵素、特にグルコネートキナーゼ、なかんずくＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ グルコネートキナーゼ、そして特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ からのグルコネートキナーゼ Ｇｎｔｋ の追加の活性増加が、グルコン酸ホスホリル化酵素を細胞外グルコネートの不存在下又はグルコースの存在下で微生物中で利用できるようにする酵素を提供する。その利点は、本発明に基づく代謝経路による増加した物質の流れである。このことが、グルコン酸の６‐ホスホグルコネートへ変換の増加をグルコースの存在下であっても可能にするのである。これは、存在する６‐ホスホグルコネートの細胞内における比率を増加させ、それは既知の代謝順序により当該物質への転化されうる。
【００２７】
グルコノラクトンは、グルコース酸化酵素の反応生成物である。グルコノラクトンが、自動的にグルコン酸に転化可能であり、酵素がこの転化を触媒的に促進することが述べられている（例えば、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ グルコノラクトナーゼ、 Ｋａｎａｇａｓｕｎｄａｒａｍ ａｎｄ Ｓｃｏｐｅｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １１７１ （１９９２）１９８−２００）。それゆえ、別の態様において、グルコノラクトンからグルコン酸（又は各々６-Ｐ-グルコネート）への転化を促進するために、グルコース酸化酵素に加えて又はグルコース酸化酵素及びグルコン酸ホスホリル化酵素に加えてグルコノラクトナーゼ（例えば、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓからの）のための遺伝子が発現される。
【００２８】
グルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコネートキナーゼの遺伝子は、ある種のバチルス種においては、自然に生じうる；しかしながら、Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ又はＦｏｒｔｎａｇｅｌ（“バチルス ズブチリス 及び他のグラム陽性細菌”（Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ、Ｈｏｃｈ ａｎｄ Ｌｏｓｉｃｋ，ｅｄｓ），Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ｐｐ．１５７−１７０及びＰ．Ｆｏｒｔｎａｇｅｌ ｐｐ． １７１−１８０； ＩＳＢＮ １−５５５８１−０５３−５； ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９３）において述べられているように、その酵素のための遺伝子は異なったオペロン内に配列されそしてグルコースを代謝するためには一緒には明らかには用いられない。更に、胞子形成条件下でグルコースデヒドロゲナーゼの特異的誘導の故に、その二つの酵素が一緒になって物質の形成に寄与するとは期待できない。
【００２９】
従って、本発明の文脈内で記載されている、芳香族代謝物質の生成のための、グルコース又はグルコース含有基質上での成長と関連して、グルコース酸化酵素又はグルコース酸化酵素及びグルコン酸ホスホリル化酵素各々の酵素活性の増加の効果は、全く予測されないのである。
【００３０】
本発明の他の好ましい態様において、ＰＥＰ非依存性の糖摂取のための輸送タンパク質の活性は、グルコース酸化酵素又はグルコース酸化酵素及びグルコン酸ホスホリル化酵素の増加に加えて、増大する。
【００３１】
又、この態様は、ＰＥＰ依存性輸送システムにより糖を摂取することができる芳香族代謝物質を産生する微生物中でグルコース又はグルコース含有基質のＰＥＰ非依存性摂取のための輸送タンパク質の活性の増加を含む。追加のＰＥＰ非依存性輸送システムを組み入れることは、当該物質を産生する微生物中での糖の提供の増加を可能にする。本発明に従えば、この糖は、細胞内グルコース酸化酵素によりグルコノラクトンへ及び引き続きグルコン酸に転化されうる。次にグルコン酸は、グルコン酸ホスホリル化酵素の基質となる。一般的に、ＰＥＰは、これらの反応のエネルギードナーとして必要とされないので、解糖系及びペントースホスフェート経路における物質の一定の流れに基づいて、芳香族化合物のための共通の生合成経路の第一次代謝物、すなわち３-デオキシ‐Ｄ-アラビノ‐ヘプツローソネート‐７−フォスフェイト（ＤＡＨＰ）を形成するＥｒｙ４Ｐとの縮合反応のためおよびその後の芳香族代謝物質を生成するためにより多量に利用可能である。
【００３２】
輸送タンパク質の場合は、活性はタンパク質媒介摂取速度(protein-mediated uptake rate)として理解される。
【００３３】
グルコース又はグルコース含有基質のＰＥＰ非依存性摂取のための輸送たんぱく質に関して、特にタンパク質媒介の促進された拡散(facilitated diffusion) の原理に基づき行動する輸送たんぱく質、特に促進剤（facilitator）の使用が望まれる。Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ からのグルコース促進剤タンパク質（Ｇｌｆ）の使用が特に好ましい。後者が使用されるとき、そのタンパク質をコードする遺伝子、すなわち、ｇｌｆは、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ、特にＰａｒｋｅｒ等によって、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５（１９９５）７９５−８０２において又Ｗｅｉｓｓｅｒ等によって、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７７（１９９５）３３５１−３３５４において記載されたＺ．ｍｏｂｉｌｉｓ ＡＴＣＣ３１８２１ から分離された促進剤遺伝子に由来する。しかしながら、他の細菌由来の糖輸送遺伝子であって、その遺伝子産生物が糖を輸送し、その際いかなるＰＥＰも使用しない遺伝子、たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉａｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＧａｌＰ 系の遺伝子が本発明の製法にとくに適している。 更にＨＸＴ１〜ＨＸＴ７のような、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓ 又はＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓのような真核細胞微生物から由来する遺伝子又は極めて一般に他の微生物由来であって、微生物中で機能的に発現されかつ同時にその遺伝子産生物がＰＥＰなしでグルコースをホスホリル化し及び/又は輸送するために働きうる遺伝子を使用できる。糖輸送遺伝子は、アミノ酸プロデューサー中で発現され得ることが特に望ましい。
【００３４】
本発明の意味内において、活性を増加させる手段とは、グルコース酸化酵素の活性、又はグルコース酸化酵素の活性及び加えて、グルコン酸ホスホリル化酵素、グルコノラクトナーゼ及びＰＥＰ非依存性糖摂取のための輸送タンパク質の中の少なくとも一つの活性を増加するに適したあらゆる手段であると理解される。次のものは、この目的にとって特に好ましいものである。
‐例えば、ベクター又は鋳型ファージを使用する遺伝子の導入；
‐遺伝子コピー数の増大、例えば、本発明に従い遺伝子を増大したコピー数で、わずか（例えば、２〜５倍）から大きく増大したコピー数（例えば、１５〜50倍）までのコピー数で、生物に導入する目的でプラスミドを使用すること；
‐遺伝子発現の増大、例えば、転写速度を増大させること、たとえばＰｔａｃ、Ｐｔｅｔ又は他の調節ヌクレオチド配列のようなプロモーター因子を使用すること及び／又は翻訳速度を増大させること、例えば、コンセンサスリボソーム結合部位を使用することにより；
‐存在する酵素の内在活性を高めること、例えば、古典的な手法に従って間接的な方法で発生される突然変異により、例えば、UV照射又は変異原化合物により、あるいは除去、挿入、及び／又はヌクレオチド交換等の組替えDNA法により特異的に作られる突然変異によって；
‐酵素の構造を変えることにより酵素活性を増加させること、例えば、物理的、化学的、分子生物学的又は他の微生物学的方法を使用しての突然変異誘発による；
‐脱調節された酵素、例えば、もはやフィードバック阻害されていない酵素を使用すること；
‐脱調節された酵素をコードする相当する遺伝子を導入すること。
【００３５】
更に、記載した方法及び活性を増加させる他類似の方法の組み合わせも採用することが可能である。輸送タンパク質の場合には、内在的活性は増加されることができ、例えば、上記方法を使用して遺伝子をクローン化することにより、たとえば物質の輸送の増加を発揮する突然変異体を選択することにより行う。
【００３６】
好ましくは、一つの遺伝子構造あるいは幾つかの遺伝子構造物中に入れられた単一遺伝子又は複数の遺伝子によって、活性の増加が達成される。遺伝子は、一つのあるいは複数の遺伝子として、単一コピーとして又は増加したコピー数における遺伝子構造物中に導入される。
【００３７】
本発明の意味内で、遺伝子構造物は、遺伝子又は本発明に従った遺伝子を有する何らかのヌクレオチド配列と理解される。適当なヌクレオチド配列はたとえば、プラスミド、ベクター、染色体、ファージ又は環状に閉じていない他のヌクレオチド配列であり得る。
【００３８】
芳香族アミノ酸代謝の最初の中間体を産生するＰＥＰの利用可能性は、Ｅｒｙ４Ｐに向かう物質の流れが増大されている微生物に制限される。そのような場合には、代謝におけるＰＥＰ消費性反応を、もし存在すればであるが、減少させ又はスイッチオフ（switch off）するのが有益でありうる。その反応とは、ＰＥＰ反応：ＰＥＰ依存性糖摂取を触媒する糖ホスホトランスフェラーゼシステム（ＰＴＳ）である。
【００３９】
本発明によれば、ＰＴＳ活性の自然のレベルを示す有機体の使用がなされる；しかし、その方法をさらに改善する目的で、ＰＴＳ活性が減少されたところのＰＴＳ突然変異体の使用もまた可能である。この性質の減少は、酵素レベルにおいてまたは遺伝子的手法によるいずれかで達成され、後者は例えば、ｐｔｓ遺伝子を発現する代替の、強力な抑制可能なプロモーターの使用により、又は、ｇｌｆ遺伝子を染色体の中に、特にそのｐｔｓ遺伝子の遺伝子座の中に挿入することによりなされ、これは同時にその染色体中の組換えＤＮＡの安定化（分離安定性）及びその結果としてのベクターを使用して処理する能力に関係する。更に、調節可能なプロモターと一緒になってＰＴＳ活性は、培養期間中の関連するプロモーターの誘起物質又は阻害物質を加えることにより影響を受ける。
【００４０】
芳香族代謝物質を製造する本発明の方法において、微生物の中でこれらの物質の合成に追加的に関与する1以上の酵素が脱制御され及び/又はそれらの活性を増加させた微生物を採用することが好ましい。
【００４１】
これらの酵素は、特に、芳香族アミノ酸代謝の酵素、特にＤＡＨＰ シンターゼ、シキミ酸キナーゼ、コリスメートムターゼ/プリフェネートデヒドラターゼ及び芳香族代謝物質の合成に関与している他のすべての酵素、特にトランスアルドラーゼ、トランスケトラーゼ及びグルコキナーゼ等である。
【００４２】
本発明の酵素とは別に、アジピン酸、胆汁酸及びキノン化合物及びその誘導体等の物質の製造に重要なのは特にＤＡＨＰシンターゼの脱制御及び過剰発現である。加えて、シキメートキナーゼは、例えば、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、インディゴ、及びヒドロキシ‐及びアミノ安息香酸、及び、ナフト‐及びアントラキノン、及びそれらの第二次産生物の過剰合成を達成するために、脱制御されそしてその活性を増加されるべきである。脱制御され、過剰発現されたコリスメートムターゼ／プリフェネートデヒドラターゼは、フェニルアラニン及びフェニルピルビン酸及びそれらの誘導体の効率的製造に特に重要である。しかしながら、Ｅｒｙ４Ｐ又はＥｒｙ４Ｐ及びＰＥＰの供給によってその産生が促進される物質の生化学的合成にその活性が寄与するあらゆる他の酵素をも包含することも意図されている。
【００４３】
本発明に基づく介入とは別に、微生物に対する更なる遺伝子的変更が、インディゴ、アジピン酸及び他の非自然第二次産生物の製造には要求される。これらの手段は、当業者には知られている（Ｆｒｏｓｔ ＆ Ｄｒａｔｈｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．４９（１９９５）５５７−５７９）。
【００４４】
本発明に基づく方法は、芳香族アミノ酸、特にＬ−フェニルアラニンを製造するのに適している。Ｌ−フェニルアラニンの場合には、脱制御されたＤＡＨＰシンターゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ Ａｒｏｆ又はＡｒｏＨにおける）及び/又は同様に脱制御されたクリスメートムターゼ／プリフェネートデヒドラターゼ（ＰｈｅＡ）の遺伝子発現及び/又は酵素活性を同時に増加させることが好ましい。
【００４５】
好ましい産生有機体は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種であり又 Ｓｅｒｒａｔｉａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物又は古典的アミノ酸法によって知られているたの菌株である。Ｎｏｒｃａｒｄｉｃｅａｅ及びＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓファミリーの細菌も同様である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ が特に好ましい。
【００４６】
本発明は又、本方法を特別に成功裏に実施することを可能にする好ましい遺伝子及びこれらの遺伝子を運ぶ形質転換された細胞の提供に関する。
【００４７】
本発明の趣旨の範囲内で、新たな遺伝子構造物が利用可能となり、それらの遺伝子構造物は組み換え体の形で、ａ）グルコン酸ホスホリル化酵素をコードする遺伝子と共に又はｂ）ＰＥＰ非依存性糖摂取のための輸送タンパク質をコードする遺伝子と共に又はｃ）グルコン酸ホスホリル化酵素、グルコノラクトナーゼ、糖のＰＥＰ非依存性摂取のための輸送タンパク質をコードする３つの遺伝子の内のすくなくとも２つと共に、グルコース酸化酵素をコードする遺伝子を含む。
【００４８】
特に、グルコース酸化酵素のための遺伝子はグルコースデヒドロゲナーゼをコードし、グルコン酸ホスホリル化酵素用の遺伝子は、グルコネートキナーゼをコードする。
【００４９】
グルコースデヒドロゲナーゼのための遺伝子は、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ
ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍから誘導され、グルコネートキナーゼのための遺伝子は、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉから誘導され、グルコノラクトナーゼ及び輸送タンパク質のための遺伝子は、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓから誘導される。グルコースデヒドロゲナーゼのための遺伝子がＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍからのグルコースデヒドロゲナーゼＩＶ（ｇｄｈIV）であり、グルコネートキナーゼのための遺伝子ｇｎｔｋが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからのＧｎｔｋであり、輸送タンパク質及びグルコノラクトナーゼのための遺伝子が、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓからのｇｌｆ及びｇｎｌ遺伝子であるところの遺伝子構造物がとくに有利である。関連する遺伝子の分離及び細胞の形質転換は、従来の方法で遂行される：Ｅ．ｃｏｌｉグルコネートキナーゼ遺伝子ｇｎｔＫ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍグルコースデヒドロゲナーゼ ＩＶ （ｇｄｈＩＶ）遺伝子又はＺｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓグルコノラクトナーゼ（ｇｎｌ）遺伝子又は輸送遺伝子ｇｌｆをクローン化する場合には、遺伝子の特異的に増殖するポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）法が好ましく、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２（ｇｎｔＫ），Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ （ｇｄｈＩＶ）、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ 菌株ＡＴＣＣ ２９１９１又は ＡＴＣＣ ３１８２１（ｇｎｌ，ｇｌｆ）を各々使用する。
【００５０】
公知のベクター（ｐＧＥＭ７、ｐＵＣＢＭ２０、ｐＵＣ１９又はその他）でDNAを増幅し、試験管内でそれを組換えた後で、宿主細胞は化学的方法、エレクトロポレーション、形質導入又は接合の手段により形質転換される。
【００５１】
３つのドナー有機体からのｇｎｔＫ，ｇｄｈＩＶ，ｇｎｌ及びｇｌｆ遺伝子の完全ヌクレオチド配列は、知られており、一般的にアクセス可能な入手先より入手可能であり、例えば、ハイデルバーグにあるＥＭＢＬ／ＨＵＳＡＲのようなデタベースにおいてからアクセス番号、Ｄ ８４３６２（ｇｎｔＫ），Ｄ １０６２６（ｇｄｈＩＶ），X ６７１８９（ｇｎｌ）及び Ｍ ６０６１５（ｇｌｆ）で寄託されている。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２菌株からの染色体ＤＮＡを用いた遺伝子及びＩｚｕ等によって、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２６７（１９９７）７７８−７９３及びＴｏｎｇ等によって、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８（１９９６）３２６０−３２６９において述べられている遺伝子配列を用いた遺伝子を特異的に増幅させるＰＣＲは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｇｎｔＫ遺伝子をクロ−ン化するのに好ましい。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍからの染色体ＤＮＡはたとえば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ｇｄｈＩＶ遺伝子（Ｎａｇａｏ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７４（１９９２）５０１３−５０２０）をクローン化するのに好ましい。
【００５２】
分離されたグルコースデヒドロゲナーゼＩＶ遺伝子は、本発明の趣旨の範囲内で述べられた１以上の遺伝子と共に、いかなる組み合わせでも組み込まれて、単一の遺伝子構造物あるいは幾つかの遺伝子構造物とされることができる。これは、遺伝子構造への正確な配置を考慮することなく、ｇｄｈＩＶ＋ｇｎｔＫ，ｇｄｈＩＶ＋ｇｌｆ，ｇｄｈＩＶ＋ｇｎｔＫ＋ｇｌｆ；ｇｄｈＩＶ＋ｇｎｔＫ＋ｇｎｌ；ｇｄｈＩＶ＋ｇｎｌ＋ｇｌｆ；ｇｄｈＩＶ＋ｇｎｔＫ＋ｇｎｌ＋ｇｌｆのような組み合わせに導く。上記遺伝子構造物に加えて、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、グルコキナーゼ、ＤＡＨＰシンターゼ、コリスメートムターゼ/プリフェネートデヒドラターゼ、コリスメートムターゼ/プリフェネートデヒドラゲナーゼ又は芳香族代謝物質の合成にポジティブに影響をあたえる他の酵素をコードする1以上の遺伝子を追加的に含むいかなる遺伝子構造物をも意味する。
【００５３】
遺伝子を配置するとき、ｇｌｆは、一つの遺伝子構造又は複数の遺伝子構造中に、膜タンパク質の過剰発現から生じる在りうる負の結果を避けるために、好ましくは低いコピー数ｘ（ｘ＝１-１０）で導入される。
【００５４】
遺伝子の一つに与えられた少なくとも一つの調節遺伝子配列を含む遺伝子構造が、有利である。
【００５５】
従って、調節要素は、特に転写シグナルを強化することにより転写レベルにおいて好ましく強化されうる。これはたとえば、構造遺伝子の上流に位置するプロモーター配列を変化させことにより又はより活性なプロモーターで完全にそのプロモーターを置き換えることにより、プロモーターの活性を増加して達成される。転写は、又、遺伝子に割り振られた調節遺伝子に適切に影響を及ぼすことにより強化されうる；しかし加えて、たとえばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の安定性を改善することにより翻訳を強化することもできる。
【００５６】
更に、本発明の趣旨の範囲内で、複製可能な形で本発明の遺伝子構造物を宿す形質転換された細胞もまた利用可能である。本発明の目的の範囲内で、形質転換された細胞とは、芳香族代謝物質の細胞中で形成の増加をもたらす本発明の遺伝子構造物を運ぶ任意の微生物を意味するものと理解される。宿主細胞は、化学的方法で（Ｈａｎａｈａｎ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６（１９８３）５５７−５８０）またエレクトロポレイション、接合又は形質導入によっても形質転換される。
【００５７】
形質転換のために、物質の合成に追加的に関与する1以上の酵素が、脱制御され及び/又はその活性を増加されている宿主細胞を採用することが有利となる。微生物菌株、特に本発明に基づき芳香族アミノ酸または他の芳香族代謝物質を産生するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、関連する遺伝子を含む遺伝子構造物により形質転換される。
【００５８】
遺伝子構造物による形質転換のために、更に、ＰＥＰ依存性糖摂取系が存在すれば、その活性が減少又はスイッチオフされている宿主細胞を採用することが好都合である。
【００５９】
特に、形質転換された細胞は、芳香族アミノ酸好ましくはＬ−フェニルアラニンを産生できる形質転換細胞が利用可能にされる。
【００６０】
芳香族代謝物質を微生物学的に製造する方法であって、上記したように、遺伝子構造物を宿す形質転換された細胞を使用する方法が従って利用できるようになる。
【００６１】
本発明に基づく方法の特に好ましい態様においては、Ｅｒｙ４Ｐとは別に、中枢代謝の他の代謝物をも含む形質転換細胞が、より利用可能性が増した状態で使用される。これらの代謝物の例は、細胞内合成過程から生じるα‐オキソグルタレート又はオキサロアセテート、又は、対応する化合物中で供給することによって成長する細胞が利用できるその他のもの、又は、クエン酸回路の代謝物としてのフマール酸又はマレイン酸エステルのようなそれらの前駆体である。
【００６２】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ菌株
ＡＴ２４７１／ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶは、ＤＳＭＺ（Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に1998年4月15日にブタペスト条約の条件下で寄託番号 ＤＳＭ 12118の下に寄託された。
【００６３】
採用された有機体、即ちＡＴ２４７１は、ＴａｙｌｏｒとＴｒｏｔｔｅｒ（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．１３（１９６７）３３２−５３）によって 番号 ４５１０でＣＧＳＣに寄託され、無償で入手できる。
【００６４】
採用された物質及び方法が下記に示されそして本発明が実験による実施例及び比較例により支持される。
【００６５】
一般的方法
遺伝子研究の目的の範囲内で、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株は、特に断りの無い限り、ディフコ バクトトリプトン（１０ｇ／ｌ），ディフコ 酵母エキス（５ｇ／ｌ）及び食塩（１０ｇ／ｌ）からなるＬＢ培地で培養した。採用された菌株の耐性により、アンピシリン（１００ｍｇ／ｌ）及びクロラムフェニコール（１７−３４ｍｇ／ｌ）が、必要に応じ培地に加えられた。これに関連して、アンピシリンは、あらかじめ水に溶解させ、クロラムフェニコールはあらかじめエタノールに溶解させ、そして濾過により滅菌した後に既にオートクレーブにかけた培地に加えられた。ディフコ バクトアガー（１．５％）が、寒天プレートを作成するためＬＢ培地に加えられた。
【００６６】
Ｅ．ｃｏｌｉからのプラスミドＤＮＡは、商業的に入手可能なシステム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）を用いてアルカリ溶解法により分離された。染色体ＤＮＡは、チェン（Ｃｈｅｎ）及びクオ（Ｋｕｏ）法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２１（１９９３）２２６０）を使用してＥ．ｃｏｌｉ及び Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＤＳＭ ３１９から分離された。制限酵素である、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、アルカリ性フォスファターゼ、ＲＮａｓｅ及びＴ４ ＤＮＡリガーゼが製造者指示（ベーリンガー、マンハイム、ドイツ又はプロメガ社、ドイツ、ハイデルバーグ）に基づいて用いられた。制限分析については、ＤＮＡ断片が、アガロースゲル（０．８％）中で分画され、そして商業的に入手可能なシステム（ＱｕｉａＥｘＩＩ，ドイツ、ヒルデン）を使用して抽出によりアガロースから分離された。
【００６７】
形質転換前に、細胞は、３７℃で２．５−３時間、２００ｒｐｍの回転でＬＢ培地中（５ｍｌ管）でインキュベートした。約０．４の吸光度（６２０ｎｍ）において、細胞を遠心分離で落とし、ＴＳＳ（１０％(w/v)ＰＥＧ ８０００，５％（v/v）ＤＭＳＯ及び５０ｍＭ ＭｇＣｌ2を含むＬＢ培地）の１０分の１体積の量で採取した。４℃で３０分間０．１〜１００ｎｇのＤＮＡと共にインキュベートし、引き続き、３７℃で１時間インキュベートした後で、細胞は、適当な抗生物質を含むＬＢ培地上にプレートされた。
【００６８】
【実施例１】
本発明に基づくプラスミドをベースとした遺伝子構造のモデルとしてのｐＧＥＭ
７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶの調製
グルコースデヒドロゲナーゼＩＶをコードするＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＤＳＭ ３１９ ｇｄｈＩＶ 遺伝子が、Ｎａｇａｏ等著、Ｊｏｕｒｎａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１５巻（１９９２）、第５０１３〜５０２０頁に記載された既知の遺伝子のＤＮＡ配列に基づいて、ポリメラーゼチェーン反応法（ＰＣＲ）によってＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＤＳＭ ３１９の染色体ＤＮＡの特異的増幅に従いクローン化された。ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、制限酵素ＢａｍＨＩ（５´末端）及びＳａｃＩ（３´末端）についての開裂部位が備えられた。プライマー１（ＢａｍＨＩ）は、５´ＡＴＧ ＧＡＴ ＣＣＡ ＴＧＡ ＡＡＡ ＣＡＣ ＴＡＧ ＧＡＧ ＧＡＴ ＴＴＴ 3´からなる。プライマー２（ＳａｃＩ）は、５´ ＧＣＣ ＡＧＡ ＧＣＴ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＣＣ ＡＣＡ ＴＣＧ ＡＴＴ ＡＡＡ ＡＡＣ ＴＡＴ ３´からなり，ｇｄｈＩＶ 遺伝子の３´末端に対し相補的であった。結果として生じるＤＮＡ増幅産生物は、約８００の塩基対を持ちＢａｍＨＩ及びＳａｃＩによって制限され、次いで同じように処理された（表１参照）ベクターｐＧＥＭ７内に連結された。形質転換は、菌株ＪＭ１０９ＤＥ３の中でＸ−ＧａＬ及びアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で選別して達成された。成功裡のクローン化が、クローン化されたｇｄｈＩＶ遺伝子のＤＮＡ配列を決定することにより検出された。このベクター（ｐＧＥＭ７ｇｄｈＩＶ）は、Ｔ７ポリメラーゼ系（菌株ＪＭ１０９ＤＥ３）の存在なしでもグルコースデヒドロゲナーゼＩＶ活性の発現を可能にした（表２参照）。染色体テンプレートとしてのＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ Ｗ３１１０菌株を使用して，特異性ＤＮＡ増幅法によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２ グルコネートキナーゼのｇｎｔＫ遺伝子がクローン化された。ｇｎｔＫ遺伝子の配列は、Ｔｏｎｇ等によって、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第１７８巻（１９６６）、第３２６０〜３２６９頁において記載されている。ＰＣＲによる増幅法については、ＥｃｏＲＩ（５´）及びＢａｍＨＩ（３´）に関する制限開裂部位を追加的に備えたオリゴヌクレオチドプライマーが選択された。プライマー１は、５´ ＣＣＧ ＡＡＴ ＴＣＴ ＴＧＴ ＡＴＴ ＧＴＧ ＧＧＧ ＧＣＡ Ｃ ３´からなり及びｇｎｔＫ遺伝子の５´上流に結合する；プライマー２は、５´ ＣＣＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＴＡ ＡＴＧ ＴＡＧ ＴＣＡ ＣＴＡ ＣＴＴ Ａ ３´からなり、ｇｎｔＫ遺伝子の３´末端に対し相補性である。約６００の塩基対を持つ増幅産生物は精製され、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩによって制限され、開環されているベクターｐＧＥＭ７に連結された。形質転換は、菌株ＪＭ１０９ＤＥ３の中でＸ−ＧａＬ及びアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上を選択して達成された。成功裡のクローン化が、クローン化されたｇｎｔｋ遺伝子のＤＮＡ配列を決定することにより検出された。このベクター（ｐＧＥＭ７ｇｎｔｋ）は、Ｔ７ポリメラーゼ系（菌株ＪＭ１０９ＤＥ３）の存在なしでもグルコネートキナーゼ活性の発現を可能にした（表２参照）。
ｇｎｔＫ及びｇｄｈＩＶ遺伝子は、ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩによる二重制限に付してベクターｐＧＥＭ７ｇｄｈＩＶを開くことにより結合される。８００の塩基対断片は、ベクターｐＧＥＭ７ｇｄｈＩＶを制限した後に得られ、ｇｄｈＩＶ遺伝子を含んでいるが、このようにして開かれたこのベクター内に連結される。再び、形質転換がアンピシリンについて選別して遂行される。新しい遺伝子構造ｐＧＥＭ７ｇｎｔｋｇｄｈＩＶが、本発明に従い、グルコースデヒドロゲナーゼＩＶに関して又グルコネートキナーゼＧｎｔＫに関して酵素活性のＴ７ポリメラーゼ非依存性発現を媒介する（表２参照）。
得られた形質転換細胞は、−８０℃においてグリセリン培養物の形でＬＢ培地上で保管される。必要なときに、グリセリン培養物は使用直前に解凍される。
【００６９】
【実施例２】
グルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコースキナーゼの酵素活性の測定
バクテリア粗抽出物における酵素活性を測定するために、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞及びプラスミド寄生突然変異体の細胞が、鉱物性培地で培養された。この培地は、クエン酸・３Ｈ2Ｏ（１．０ｇ／ｌ）、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．３ｇ／ｌ）、ＫＨ2ＰＯ4（３．０ｇ／ｌ），ＫＨ2ＰＯ4（１２．０ｇ／ｌ），ＮａＣｌ（０．１ｇ／ｌ），（ＮＨ4）2ＳＯ4（５．０ｇ／ｌ），ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（１５．０ｍｇ／ｌ），ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．０７５ｇ／ｌ）及びＬ−チロシン（０．０４ｇ／ｌ）からなる。更に、鉱物が痕跡量の元素溶液（１ｍｌ／ｌ）の形で加えられた。その溶液は、Ａｌ2（ＳＯ4）3・１８Ｈ2Ｏ（２．０ｇ／ｌ）、ＣｏＳＯ4・６Ｈ2Ｏ（０．７ｇ／ｌ）、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（２．５ｇ／ｌ）、Ｈ3ＢＯ3（０．５ｍｇ／ｌ）、 ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ（２０．０ｇ／ｌ）、Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ（３．０ｇ／ｌ）、ＮｉＳＯ4・３Ｈ2Ｏ（２．０ｇ／ｌ）及びＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（１５．０ｇ／ｌ）からなった。ビタミンＢ１（５．０ｍｇ／ｌ）が、水に溶解され、ろ過により滅菌された後、オートクレーブで処理された培地に加えられた。必要に応じアンピシリン、及び／又はアンピシリンとクロランフエニコールが同様に加えられた。グルコース（３０ｇ／ｌ）は、別途同じようにオートクレーブで処理され、あらかじめオートクレーブで処理された培地に加えられた。
採取された細胞は、１００ｍｌのトリス/ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した。沈殿物の細胞は、超音波（マイクロチップ装着ブランソン ソニフィアー２５０）で、２５％の超音波処理サイクルで、４０ワットの強さで、細胞縣濁液１ｍｌにつき４分の時間で破壊した。１８、０００ｇ、及び４℃で３０分間遠心分離の後、上澄み（粗抽出液）が、グルコースデヒドロゲナーゼ及び／又はグルコネートキナーゼの活性の測定のために使用された。
グルコースデヒドロキナーゼの活性は、Ｈａｒｗｏｏｄ＆Ｃｕｔｔｉｎｇ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ ｓｏｎｓに記載の方法で測定された。グルコースデヒドロゲナーゼは、グルコースからグルコノラクトンへの酸化を触媒する。酵素の活性は光度計により、還元された補助因子ＮＡＤＨ＋Ｈ+ の濃度の増加を３４０ｎｍの波長で測定することにより決定された。１ｍｌの全容量を有する石英キュヴェット中で測定した。反応混合液は、トリスＨＣｌ（最終濃度 ２５０ｍＭ、ｐＨ８．０）、２．５ｍＭ ＥＤＴＡナトリウム、１００ｍＭ ＫＣｌ及び２ｍＭ ＮＡＤからなった。粗抽出液は、２５℃で５分間緩衝液中で予めインキュベイトした。グルコース（最終濃度、１００ｍＭ）が検出反応を開始するために加えられた。吸光度の増加は、３４０ｎｍでモニターした。各場合においてグルコースなしの混合液を対照として供した。特異的グルコースデヒドロゲナーゼ活性は、１分当たり及びタンパク質１ｍｇ当たり１μモルのグルコースヘの変換と同等であるよう設定された、１分当たり及びタンパク質ｍｇ当たり１μモルのＮＡＤＨ形成として定義されるＵ／ｍｇ単位で与えられる。
グルコネートキナーゼは、Ｉｚｕ等によって，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第３９４巻（１９９６）第１４〜１６頁に記載されたようにして粗抽出液中で測定された。
グルコネートキナーゼは、グルコネートから６−ホスホグルコネートへのＡＴＰ依存性ホスホリル化反応を触媒する。酵素試験においては、形成される６−ホスホグルコネートが、ＮＡＤＰ依存性補助酵素６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ（ベーリンガーマンハイム、Ｎｏ．１０８４０５）を使用したときのＮＡＤＰＨ濃度の増加により３４０ｎｍの波長で光度計で測定される。これに関連して、１μモルのＮＡＤＰＨの形成は、１μモルのグルコネートのホスホリル化に相当する。酵素的検出は、１ｍｌの全容量を有する石英キュヴェット中で２５℃において遂行された。反応混合液は、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＡＴＰ、０．２５ｍＭ ＮＡＤＰ、１．２単位の補助酵素６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ及び変動量の粗抽出液を含んだ。混合液は、２５℃で５分間、予めインキュベイトされ、次いで反応はグルコン酸（ｐＨ６．８；混合液での最終濃度、１０ｍＭ）を加えて開始された。グルコン酸を加えない混合液は、対照として利用に供された。
粗抽出液中のタンパク質濃度は、商業的に入手可能な色素試薬を使用してＢｒａｄｆｏｒｄ Ｍ．Ｍ．（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第７２巻（１９７６）第２４８〜２５４頁）に従って測定された。仔牛血清アルブミンがスタンダードとして用いられた。
表２は、宿主菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０及びプラスミドｐＧＥＭ７ｇｄｈＩＶ、ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫ又はｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶを寄生させる突然変異体を使用したときの酵素測定結果を表す。既に述べられ、及び本発明に従う遺伝子構造が用いられた場合には、本発明に従い、細胞中で機能的な方法で酵素を発現させることが可能であることが判明した。
【００７０】
【実施例３】
増加されたグルコースデヒドロゲナーゼ活性を示す菌株を使用した、物質の産生
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１／ｐＧＥＭ７ＫｇｈｄＩＶの合成効率が、実施例２で述べた鉱物性培地中で測定された。このために、振とうフラスコ（１００ｍｌの培地を含む１０００ｍｌ容器）に２ｍｌのグリセリン培養物を接種し、旋回振とう器で３７℃、１５０ｒｐｍで７２時間インキュベイトした。培養物のｐＨを約１２時間間隔で測定し、必要に応じてＫＯＨ（４５％）を加えて開始値７．２に回復させた。更に、試料（２ｍｌ）が、吸光度及びグルコースとＬ−フェニルアラニンの濃度を測定するために、２４時間及び４８時間後に採取された。
フェニルアラニンの濃度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ヒューレットパッカード社、ドイツ、ミュンヘン市）により蛍光法検出（３３５ｎｍでの励起、５７０ｎｍでの発光）と組み合わせて確認され、ヌクレオシル‐１２０−８Ｃ１８カラム（２５０・４．６ｍｍ）が固相として使用された；溶出はグラディエントを用いて行われた（溶出剤Ａ：９０％ ５０ｍＭ リン酸、１０％メタノール、ｐＨ２．５；溶出剤Ｂ：２０％ ５０ｍＭ リン酸、８０％ メタノール、ｐＨ２．５；グラディエント；０−８分、１００％ Ａ、８−１３分、０％ Ａ、１３−１９分、１００％ Ａ）。溶出速度は、１．０ｍｌ／ｍｉｎ及びカラム温度は４０℃に設定した。ポストカラム誘導体化は、ｏ−フタルジアルデヒドを使用して反応キャピラリー（１４ｍ・０．３５ｍｍ）内で室温にて行われた。
既述した条件のもとで、Ｌ−フェニルアラニンは６．７分の保持時間を有することがわかった。
酵素試験紙（ディアバー、ドイツ、ベーリンガーマンハイム社）を使用して、グルコース濃度を測定し、その結果とは独立に、引き続き２ｍｌの濃縮されたグルコース溶液（５００ｇ／ｌ）を計量しながら入れることにより，実験混合溶液中でグルコースが制限的にならないよう注意を払った。
単にプラスミドｐＧＥＭ７ｇｄｈＩＶを導入すことにより、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１宿主菌株の指標値（フェニルアラニン）の１００と比較して、４８時間のインキュベーション時間の後で、フェニルアラニン濃度を記載する指標値として１４５が結果的に達成された。この結果は、本発明に従い物質産生性の微生物中でのグルコースデヒドラゲナーゼの酵素活性の増加の芳香族化合物の合成増加効果を証明している。
【００７１】
【実施例４】
グルコースデヒドラゲナーゼの酵素活性の増加に加えてＰＥＰ非依存性糖摂取系
が発現される菌株を使用しての物質の製造
Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ ｇｌｆ遺伝子は、プラスミドｐＺＹ６００（Ｗｅｉｓｓｅｒ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７７ （１９９５） ３３５１−３３４５）を使用してテンプレートとして増幅された。同時に、プライマーの選択は、ＢａｍＨＩ開裂部位及びＫｐｎＩ開裂部位の導入が結果としてもたらされた。これらの特有の開裂部位を用いてベクターｐＵＣＢＭ２０（ベーリンガーマンハイム）に遺伝子が挿入され、これらは同様にＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩにより開かれた。大きさが１．５ｋｂのＤＮＡ断片は、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで制限することによりこのベクター（ｐＢＭ２０ｇｌｆ）より分離され、ベクタープラスミドｐＺＹ５０７（Ｗｅｉｓｓｅｒ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７７ （１９９５） ３３５１−３３４５）に連結され、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで同様に開かれた。組換えプラスミドｐＺＹ５０７ｇｌｆは、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換し形質転換細胞をクローン化した後に得られた。このベクターはクロランフェニコール耐性を与え、ｌａｃＩq −ｔａｃ プロモーターシステムを含み、低いコピー数を有している。
ベクターｐＺＹ５０７ｇｌｆは、実施例１の記載に従って得られた本発明の遺伝子構造と共に宿主菌株ＡＴ２４７１に形質転換された。
実施例３で述べられた実験条件に従って、突然変異体 Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１ｇｌｆ、 Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１ｇｌｆ／ｐＧＥＭ７、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１ｇｌｆ／ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫ及びＥ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１ｇｌｆ／ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶはそれぞれ２つの並列する混合液で培養された。４８時間後、培地中のＬ−フェニルアラニン濃度が測定された。
指標値１００に相当するＬ−フェニルアラニン濃度を達成する開始菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１ｇｌｆとの比較において、ベクターｐＧＥＭ７の存在は
指標値９６をもたらし、結果的に、実質的には同一の濃度が達成される。対照的に、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７ｇｌｆ／ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫの使用は、既述した菌株と比較すれば指標値１７９に相当するＬ−フェニルアラニン濃度を結果としてもたらす。Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１ｇｌｆ／ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶ中の代替の代謝遺伝子、即ちグルコースデヒドロゲナーゼ及びグルコネートキナーゼ双方の発現は、指標値１９５を表すフェニルアラニン濃度のさらなる増加を達成した。
この結果は、グルコースデヒドロゲナーゼの酵素活性を導入し、グルコネートキナーゼの酵素活性を増大させることによる代替の代謝経路の発現が、同時にＰＥＰ非依存性糖摂取システムが形質転換されそして発現されたこれらの微生物中で特異的にＬ−フェニルアラニン合成に対するポジティブな影響力を有していることを証明している。
【００７２】
【実施例５】
その内部でグルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性が増加されることに加えてＰＥ
Ｐ−非依存性糖摂取システムが発現されるＰＴＳ−突然変異を使用した物質の製
造
Ｅ．ｃｏｌｉ ＰＴＳ系の成分をコードする遺伝子中にｇｌｆ遺伝子を取込むために、プラスミドｐＰＴＳ１は、ＢｇｌＩＩで消化され、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片で処理される。その独特の開裂部位はｐｔｓＩ遺伝子に存在する。そのｇｌｆ遺伝子は、ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ断片としてプラスミドｐＢＭ２０ｇｌｆｇｌｋから分離され、クレノウ断片で同じように処理される。ｐｔｓＨＩとしての同じ配位におけるｇｌｆ遺伝子を運搬するクローンは、平滑末端によって得られた。ｐｔｓＨ遺伝子及び取込まれたｇｌｆおよびｃｒｒを有するｐｔｓＩの３´領域を運ぶ４．６ｋｂのＰｓｔＩ断片は、結果として生ずるプラスミドｐＰＴＳｇｌｆから得られた。この断片は、ベクターｐＧＰ７０４のＥｃｏＲＶ開裂部位に連結された。このベクターは、λｐｉｒ菌株においてのみ複製されることができるので、このファージを宿さない形質転換細胞は、もしそれらがカルベニシリン上で成長可能であるならば、染色体の中にそのベクターを取込むことができる。取込みは、サザン分析法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｍｉｌｌｅｒ Ｖ．Ｌ．等，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０（１９８８）２５７５−８３）によってチェックされた。ｇｌｆ遺伝子に加えて、得られた形質転換細胞は、完全なＰＴＳ遺伝子も含んでいた。
ベクターの部分はカルベニシリン耐性の欠損へと導く第２の相同的交差の状態に組替えが行われ得る。この場合ｐｔｓ遺伝子の挿入は、ｇｌｆ遺伝子によって妨げられるので、ＰＴＳはこれらの突然変異体中で機能的に発現されない。
望ましいＰＴＳ-突然変異体は、次ぎのように選別される：静止したＰＴＳ+形質転換細胞を抗生物質なしでＬＢ培地上で繰り返しサブイノキュレート（サブ接種）した後、細胞縣濁液の一部は１００μｇ／ｌのホスホマイシンを含むＬＢプレート上に置き培養された。ＰＴＳ-突然変異体は、これらのプレート上で成長可能である。成長するクローンは、ホスホマイシン又は２０μｇ／ｌのカルベニシリンのいずれかを含むＬＢプレート上で画線培養された。染色体ＤＮＡは、ホスホマイシンプレート上で新たな成長を示すがカルベニシリンプレート上では成長はしないクローンから分離された。ｇｌｆ遺伝子のＰＴＳ系をコードする遺伝子への組み込みは、サザン分析により確認された。相当する突然変異体は、表現型上ＰＴＳ欠損として同定された。
一つのクローンは、宿主有機体がＥ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１ｇｌｆｉｎｔＰＴＳ-として選別され、プラスミドｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶで形質転換のため使用された（上記参照）。
実施例３及び４で記載された実験的条件に従い、ＰＴＳ陰性突然変異体 Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１ｇｌｆｉｎｔＰＴＳ- ／ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶ及び相当する宿主菌株 ＡＴ２４７１ｇｌｆｉｎｔＰＴＳ- は、それぞれの場合、２つの並列の混合液で培養された。４８時間培養後全体のバイオマス特異的生産性が、その結果より計算された。
宿主菌株 Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＴ２４７１ｇｌｆｉｎｔＰＴＳ-と比較されるように、その全体バイオマス特異的生産性は指標値１００として表されるが、突然 変異体 ＡＴ２４７１ｇｌｆｉｎｔＰＴＳ- ／ｐＧＥＭ７ｇｎｔＫｇｄｈＩＶは、指標値１３３を有する全体バイオマス特異的生産性を達成した。
この結果は、グルコースデヒドロゲナーゼの酵素活性を導入し、グルコネートキナーゼの酵素活性を増大させることが、同時にＰＥＰ非依存性糖摂取システムが取込まれそしてその酵素活性が減少されるか完全にスイッチオフされたＰＴＳ系によって特徴づけられるこれらの微生物中で特異的にフェニルアラニン合成のｙ生産性に対しポジティブな影響力を有していることを証明している。
【００７３】
【表１】
【表２】
The present invention provides a method for microbiological production of an aromatic metabolite according to claims 1 to 19 and claim 29, a genetic structure according to claims 20 to 22, and a transformed structure according to claims 23 to 28. Regarding cells.
[0002]
Microbiologically produced aromatic metabolites, such as aromatic amino acids in particular, are of great economic interest as the demand for amino acids continues to increase.
[0003]
That is, for example, L-phenylalanine is used in the manufacture of drugs, and in particular, in the manufacture of sweetener aspartame (α-L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester). L-tryptophan is required as a drug and as a feed additive; similarly, L-tyrosine is required as a drug and as a raw material in the pharmaceutical industry. In addition to separation from natural products, production using biotechnology is a very important way to obtain the desired optically active amino acid under economically suitable conditions. Biotechnological production is accomplished either enzymatically or using microorganisms.
[0004]
The latter, or microbiological production, has the advantage that simple and inexpensive raw materials can be employed. However, since amino acid biosynthesis is regulated in cells in a very diverse manner, many attempts have been made to increase productivity. For example, amino acid analogs are used to switch off biosynthetic control. For example, by selecting resistance to phenylalanine analogs, mutants of Escherichia coli that allow for increased production of L-phenylalanine can be obtained (GB-2, 053, 906). In addition, overproducing strains of Corynebacterium (JP-19037 / 1976 and JP-39517 / 1978) and Bacillus (EP-0, 138, 526) were obtained in the same manner.
[0005]
In addition, microorganisms constructed by recombinant DNA technology are known, and biosynthetic control is similarly abolished by cloning and expression of genes encoding key enzymes that are no longer feedback-inhibited. As one model, EP-0, 077, 196 discloses a process for producing aromatic amino acids, in which 3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate no longer causes feedback inhibition Synthase (DAHP synthase) EP-0, 145, 156 discloses E. coli in which chorismate mutase / prephenate dehydratase is additionally overexpressed to produce L-phenylalanine. E. coli strains are described.
[0006]
The strategies described here share the common feature that interventions to improve productivity are limited to biosynthetic pathways specific for aromatic amino acids. However, to further increase production, the supply of phosphoenolpyruvate (PEP) and erythrose-4-phosphate (Ery4P), the primary metabolites necessary to produce amino acids, was improved. It is important to make an effort.
[0007]
PEP is an activated precursor of the product from glycolysis, pyruvate (pyruvate); Ery4P is an intermediate in the pentose phosphate pathway.
[0008]
These many different attempts to increase productivity are all aimed at overcoming the limitations on amino acid cytoplasmic synthesis. In the production of aromatic amino acids, the primary metabolites, phosphoenolpyruvate (PEP) and Ery4P are required for the condensation reaction to form 3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-phosphate (DAHP). Is done.
[0009]
One document states that several strategies to increase the availability of Ery4P, such as increasing the supply of Ery4P and, as a result, increasing the formation of L-tryptophan, L-tyrosine or L-phenylalanine products. It has been reported that it was made possible by overexpression of transketolase (EP Patent Application Nos. 0, 600, 463; Frost & Draths, Ann, Rev. Microbiol. 49 (1995) 557-579). Recently, a spontaneous glucose-positive revertant of the Escherichia coli PTS-negative mutant was shown to be able to concentrate glucose in cells and grow on glucose by the GalP system ( Flores et al., Nature Biotechnology 14 (1996) 620-623). Additional expression of the transketolase gene tktA resulted in an observed increase in the formation of the intermediate DAHP. (Flores et al., Nature Biotechnology 14 (1996) 620-623).
[0010]
In two unpublished German patent applications, reference numbers DE 196 44 566.3 and DE 196 44 567.1, the applicant increases the enzymatic activity of transaldolase or transaldolase and transketolase in Escherichia coli Or by increasing the activity of a PEP-independent transport system for glucokinase in Escherichia coli or glucokinase and sugars in Escherichia coli, or by combining the enzyme with a transport system. It proved that it became possible to produce phenylalanine.
[0011]
The object of the present invention is to make available a process whereby an improved microbiological synthesis of aromatic metabolites is achieved.
[0012]
In addition, microorganisms with increased formation of aromatic metabolites are constructed.
[0013]
Surprisingly, by simply increasing glucose oxidase activity, the objective is achieved by changing glucose or glucose-containing substrates in microorganisms that produce aromatic metabolites. In this way, a metabolic pathway that replaces the existing one is provided. This pathway involves the oxidation of free glucose to gluconolactone / gluconate and phosphorylation of gluconate to form 6-phosphogluconate.
[0014]
This result is particularly surprising since it is by no means obvious that simply increasing glucose oxidase activity plays an important role in producing aromatic metabolites.
[0015]
In the sense of the present invention, aromatic metabolites are understood to be all compounds in which an increase in the supply of Ery4P or Ery4P and PEP is advantageous for biochemical synthesis. For example, aromatic amino acids, indigo, indoleacetic acid, adipic acid, melanin, shikimic acid, chorismic acid, quinone, benzoic acid and their potential derivatives and secondary products.
[0016]
In this context, in addition to the intervention according to the invention, further genetic changes to the microorganisms producing this substance are required for the production of indigo, adipic acid and other non-natural secondary products. It is noted (Frost & Draths, Ann, Rev. Microbiol. 49 (1995) 557-579).
[0017]
Microbial-produced aromatic metabolites can metabolize glucose or glucose-containing substrates, ie glucose-containing disaccharides or oligosaccharides, in a variety of processes: glucose is therefore an ATP-dependent kinase (hexokinase and glucokinase)
It is known to be phosphorylated by and thereby concentrated in the glycolytic system. In addition, many bacteria utilize PEP-dependent systems to take up glucose and phosphorylate it.
[0018]
Glucose can also be oxidized by various soluble or membrane bound enzymes (converted to gluconic acid via gluconolactone). These enzymes include glucose oxidase or glucose dehydrogenase. Glucose oxidase involves reduction of molecular oxygen and oxidizes glucose to gluconolactone. Glucose dehydrogenase also oxidizes glucose to gluconolactone, but uses other electron acceptors such as pyrroloquinoline quinone (PQQ) or other cofactors such as nicotine adenine dinucleotide (NAD) or NADP To do. Glucose dehydrogenase bound to the membrane is known to oxidize glucose using the cofactor pyrroloquinoline quinone (PQQ) by a reaction that takes place outside the membrane. To incorporate the product (gluconolactone or gluconic acid) into the cell, van Schie et al. , Journal of Bacteriology 163 (1985) 493-499; Isuriz et al. , Journal of General Microbiology 132 (1986) 3209-3219; Izu et al. , Journal of Molecular Biology 267 (1997) 778-793, but requires a special transport system, but by Izu et al. In Journal of Molecular Biology 267 (1997) 778-793 and in Coway. As described in FEMS Microbiology Reviews 103 (1992) 1-27, its expression is normally suppressed by the presence of glucose (eg, in Escherichia coli).
[0019]
Glucose dehydrogenase using cofactor NAD or NADP is a soluble enzyme found in cells. Known producers include Bacillus strains, some of which have glucose dehydrogenase isoenzymes (eg, glucose dehydrogenase I-IV in the case of Bacillus megaterium; Mitamura et al., 1990, Journal of Fermentation. and Bioengineering 70, 363-369). The expression of glucose dehydrogenase is tightly controlled and is known, for example, to occur only in the pre-spore state of the process of endospore formation by Bacillus species; the physiology of glucose dehydrogenase in relation to growth on glucose The role played by Lampel et al., Journal of Bacteriology 166 (1986) 238-243, and recently Steinmetz or Fortnagel ("Bacillus subtilis and other Gram-positive bacteria" (Sonsenshein, Hoch and Lostickp, ed.). 157-170 and P. Fortagel pp. 171-180; ISBN 1-55581-053-5; ASM Press, Washington, D. C., as reported in 1993), it is not clear.
[0020]
So far, no NAD (P) -dependent glucose dehydrogenase has been reported in Escherichia coli, Corynebacterium, or in particular Brevibacterium. The gene for glucose dehydrogenase induced by Bacillus strains was cloned into Escherichia coli and expressed in this bacterium (Hilt et al., Biochimica et Biophysica Acta 1076 (1991) 298-304). The purpose is in particular to obtain recombinant glucose dehydrogenase, which has been adopted as a detection system for glucose or cofactor regeneration (Hilt et al., Biochimica et Biophysica Acta 1076 (1991) 298- 304; German patent application 3 711 881). In contrast, these genes have not been described so far to utilize glucose, for example as a substrate for obtaining aromatic metabolites.
[0021]
In accordance with the present invention, it has been found that introducing glucose dehydrogenase or increasing its activity surprisingly leads to the formation of substances. Increased activity of glucose oxidase leads to intracellular formation of gluconolactone and gluconic acid from glucose-containing substrates. In a preferred embodiment, glucose dehydrogenase, particularly as described in Journal of Fermentation and Bioengineering 70 (1990) 363-369 and by Nagao et al. In Journal of Bacteriology 15 (1992) 5013-5020, Derived from Bacillus megaterium glucose dehydrogenase IV.
[0022]
Gluconic acid depends on gluconate phosphorylase for its activity. It is known that such an enzyme may be, for example, a phosphoenolpyruvate-dependent enzyme II having gluconic acid specificity or an ATP-dependent kinase having gluconic acid specificity. Escherichia coli ATP-dependent gluconate kinase Gntk is described, for example, by Izu et al. In FEBS Letters 394 (1996) 14-16; by Izu et al. By Journal of Molecular Biology 267 (1997) 778-793 and Ton et al. Known as described in Bacteriology 178 (1996) 3260-3269.
[0023]
In Escherichia coli, the product 6-phosphogluconate is an intermediate of the oxidative branching of both the pentose phosphate pathway and the Entner-Doudeloff pathway, which is described by Fraenkeln in “Escheria coli”. and Salmonella ", USA, Washington, ASM Publishing, Second Edition (Neidhart et al., Eds), ISBN-1-55581-084-5, 1996, 189-198.
[0024]
The production of the substance can additionally be improved by increasing the activity of the gluconate (phosphonate) -phosphorylating enzyme. When gluconate phosphorylase is used, for example, gluconate phosphorylase from many types of microorganisms is preferred, provided that they can be functionally expressed in microorganisms that produce aromatic metabolites. It becomes a condition. The use of an ATP-dependent gluconate kinase, preferably Escherichia coli gluconate kinase, in particular gluconate kinase (Gntk) from Escherichia coli K-12, is particularly desirable. Other genes for gluconate phosphorylase can be said to be suitable for the production method according to the present invention as long as the gene product phosphorylates gluconate. Examples include genes from other intestinal bacteria, Zymomonas mobilis, Bacillus subtilis, and Corynebacterium glutamicum.
[0025]
The effect of glucokinase is limited to the activation of gluconic acid / gluconate, but it is not metabolized in the presence of glucose, for example by Escherichia coli or other bacteria. For example, when an organism grows on gluconic acid in Escherichia coli, the gluconate kinase Gntk is only important and does not contribute to glucose metabolism. As described by Izu et al. In Journal of Molecular Biology 267 (1997) 778-793 and Tong et al. In Journal of Bacteriology 178 (1996) 3260-3269,
In fact, its formation is actually suppressed in the presence of glucose and does not occur in the presence of glucose.
[0026]
Therefore, in this particular embodiment, an additional increase in the activity of gluconate phosphorylase, especially gluconate kinase, especially Escherichia coli gluconate kinase, and especially gluconate kinase Gntk from Escherichia coli K-12, Provided are enzymes that make phosphorylating enzymes available in microorganisms in the absence of extracellular gluconate or in the presence of glucose. Its advantage is increased substance flow through the metabolic pathway according to the present invention. This allows an increased conversion of gluconic acid to 6-phosphogluconate even in the presence of glucose. This increases the intracellular ratio of 6-phosphogluconate present, which can be converted to the substance by a known metabolic sequence.
[0027]
Gluconolactone is a reaction product of glucose oxidase. It is stated that gluconolactone can be automatically converted to gluconic acid and that the enzyme catalytically promotes this conversion (eg, Zymomonas mobilis gluconolactonase, Kanagasundaram and Scopes, Biochimica et Biophysica Acta). 1171 (1992) 198-200). Therefore, in another embodiment, in addition to glucose oxidase or in addition to glucose oxidase and gluconate phosphorylase to facilitate the conversion of gluconolactone to gluconic acid (or 6-P-gluconate each) A gene for gluconolactonase (eg from Zymomonas mobilis) is expressed.
[0028]
Glucose dehydrogenase and gluconate kinase genes can occur naturally in certain Bacillus species; however, Steinmetz or Fortnagel (“Bacillus subtilis and other Gram-positive bacteria” (Sonenshein, Hoch and Losick, eds), Steinmetz pp. 157-170 and P. Fortnagel pp. 171-180; ISBN 1-55581-053-5; ASM Press, Washington, D.C., 1993). Are arranged in different operons and are not obviously used together to metabolize glucose. Furthermore, because of the specific induction of glucose dehydrogenase under sporulation conditions, the two enzymes cannot be expected to contribute together to form a substance.
[0029]
Thus, glucose oxidase or glucose oxidase and gluconate phosphorylase in connection with growth on glucose or glucose-containing substrates for the production of aromatic metabolites as described in the context of the present invention The effect of increasing each enzyme activity is totally unpredictable.
[0030]
In another preferred embodiment of the invention, the activity of transport proteins for PEP-independent sugar intake is increased in addition to the increase in glucose oxidase or glucose oxidase and gluconate phosphorylase.
[0031]
This embodiment also increases the activity of transport proteins for PEP-independent uptake of glucose or glucose-containing substrates in microorganisms that produce aromatic metabolites that can be ingested by a PEP-dependent transport system. Including. Incorporation of an additional PEP-independent transport system allows for increased sugar provision in the microorganism producing the substance. According to the present invention, this sugar can be converted to gluconolactone and subsequently to gluconic acid by intracellular glucose oxidase. Gluconic acid then becomes a substrate for the gluconate phosphorylating enzyme. In general, since PEP is not required as an energy donor for these reactions, the first of a common biosynthetic pathway for aromatic compounds is based on a constant flow of substances in the glycolytic and pentose phosphate pathways. Utilized in larger quantities for condensation reactions with the secondary metabolite, Ery4P, forming 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate-7-phosphate (DAHP) and subsequent generation of aromatic metabolites Is possible.
[0032]
In the case of transport proteins, activity is understood as protein-mediated uptake rate.
[0033]
With regard to transport proteins for PEP-independent intake of glucose or glucose-containing substrates, it is desirable to use transport proteins that act on the principle of protein-mediated facilitated diffusion, particularly facilitators . Particularly preferred is the use of a glucose promoter protein (Glf) from Zymomonas mobilis. When the latter is used, the gene encoding the protein, ie glf, is Z. mobilis, in particular Parker et al., in Molecular Microbiology 15 (1995) 795-802, and by Weisser et al., in Journal of Bacteriology 177 (1995) 3351-3354. It is derived from the promoter gene isolated from mobilis ATCC31821. However, sugar transport genes derived from other bacteria, in which the gene product transports sugar and does not use any PEP, such as the Escherichia coli GalP gene, are particularly suitable for the production method of the present invention. Yes. Furthermore, genes derived from eukaryotic microorganisms such as Saccharomyces cerevisiae, Pichia stititis or Kluyveromyces lactis, such as HXT1 to HXT7, or very generally derived from other microorganisms, which are functionally expressed in the microorganism and simultaneously Any gene that the product can serve to phosphorylate and / or transport glucose without PEP can be used. It is particularly desirable that the sugar transport gene can be expressed in an amino acid producer.
[0034]
Within the meaning of the present invention, means for increasing the activity are glucose oxidase activity or glucose oxidase activity and in addition to gluconate phosphorylase, gluconolactonase and PEP-independent sugar intake. It is understood that any means suitable for increasing the activity of at least one of the transport proteins. The following are particularly preferred for this purpose.
-Introduction of genes using eg vector or template phage;
An increase in gene copy number, for example, an increased copy number of a gene according to the present invention, with a copy number from slightly (eg 2-5 times) to a greatly increased copy number (eg 15-50 times) Use of plasmids for the purpose of introduction into
-Increasing gene expression, e.g. increasing the rate of transcription, e.g. using promoter elements such as Ptac, Ptet or other regulatory nucleotide sequences and / or increasing the rate of translation, e.g. consensus ribosome binding site By using
-Increasing the intrinsic activity of the enzyme present, e.g. by mutations generated in an indirect manner according to classical techniques, e.g. by UV irradiation or mutagenic compounds, or by removal, insertion and / or nucleotide exchange By mutations made specifically by recombinant DNA methods such as;
-Increasing enzyme activity by changing the structure of the enzyme, eg by mutagenesis using physical, chemical, molecular biology or other microbiological methods;
-Using deregulated enzymes, eg enzymes that are no longer feedback-inhibited;
-Introducing the corresponding gene encoding the deregulated enzyme.
[0035]
In addition, combinations of the described methods and other similar methods that increase activity may be employed. In the case of transport proteins, the intrinsic activity can be increased, for example by selecting a mutant that exerts an increase in the transport of a substance, for example by cloning a gene using the method described above. To do.
[0036]
Preferably, increased activity is achieved by a single gene or multiple genes placed in one gene structure or several gene structures. Genes are introduced into gene constructs as single or multiple genes, as single copies or in increased copy numbers.
[0037]
Within the meaning of the invention, a genetic construct is understood as a gene or any nucleotide sequence having a gene according to the invention. A suitable nucleotide sequence can be, for example, a plasmid, vector, chromosome, phage, or other nucleotide sequence that is not circularly closed.
[0038]
The availability of PEP to produce the first intermediate of aromatic amino acid metabolism is limited to microorganisms that have increased material flow towards Ery4P. In such cases, it may be beneficial to reduce or switch off the PEP-consuming response in metabolism, if present, if present. The reaction is a PEP reaction: a sugar phosphotransferase system (PTS) that catalyzes PEP-dependent sugar intake.
[0039]
According to the present invention, the use of organisms exhibiting natural levels of PTS activity is made; however, it is also possible to use PTS mutants with reduced PTS activity for the purpose of further improving the method It is. This reduction in properties is achieved either at the enzyme level or by genetic means, the latter being used, for example, by the use of an alternative, strong repressible promoter that expresses the pts gene, or the glf gene in the chromosome. In particular by inserting into the locus of the pts gene, which at the same time stabilizes the recombinant DNA in the chromosome (separation stability) and the resulting ability to process using the vector. Involved. In addition, PTS activity along with regulatable promoters is affected by adding inducers or inhibitors of the relevant promoter during the culture period.
[0040]
The method of the present invention for producing aromatic metabolites employs microorganisms in which one or more enzymes additionally involved in the synthesis of these substances in the microorganism are deregulated and / or have increased their activity It is preferable.
[0041]
These enzymes include in particular aromatic amino acid metabolism enzymes, in particular DAHP synthase, shikimate kinase, chorismate mutase / prephenate dehydratase and all other enzymes involved in the synthesis of aromatic metabolites, in particular transaldolases. , Transketolase and glucokinase.
[0042]
Apart from the enzymes according to the invention, it is especially the deregulation and overexpression of DAHP synthase that is important for the production of substances such as adipic acid, bile acids and quinone compounds and their derivatives. In addition, shikimate kinase is used to achieve oversynthesis of, for example, L-tryptophan, L-tyrosine, indigo, and hydroxy- and aminobenzoic acid, and naphtho- and anthraquinone, and their secondary products. Should be deregulated and increase its activity. Deregulated and overexpressed chorismate mutase / prephenate dehydratase is particularly important for the efficient production of phenylalanine and phenylpyruvic acid and their derivatives. However, it is also intended to encompass any other enzyme whose activity contributes to the biochemical synthesis of substances whose production is promoted by the supply of Ery4P or Ery4P and PEP.
[0043]
Apart from the intervention according to the invention, further genetic changes to the microorganism are required for the production of indigo, adipic acid and other non-natural secondary products. These means are known to those skilled in the art (Frost & Draths, Ann. Rev. Microbial. 49 (1995) 557-579).
[0044]
The process according to the invention is suitable for producing aromatic amino acids, in particular L-phenylalanine. In the case of L-phenylalanine, deregulated DAHP synthase (eg in E. coli Arof or AroH) and / or similarly deregulated crismate mutase / prephenate dehydratase (PheA) gene expression and / or It is preferred to increase the enzyme activity simultaneously.
[0045]
Preferred production organisms are Escherichia species and are strains of Serratia, Bacillus, Corynebacterium, or Brevibacterium, known by classical amino acid methods. The same is true for the bacteria of the Norcardiceae and Actinomycetals families. Escherichia coli is particularly preferred.
[0046]
The present invention also relates to the provision of preferred genes and transformed cells carrying these genes that make it possible to carry out the method particularly successfully.
[0047]
Within the scope of the present invention, new gene constructs are available which are in recombinant form, either a) with a gene encoding gluconate phosphorylase or b) PEP independent. Together with genes encoding transport proteins for sugar intake or c) at least two of the three genes encoding transport proteins for PEP-independent intake of gluconate phosphorylase, gluconolactonase and sugar And a gene encoding glucose oxidase.
[0048]
In particular, the gene for glucose oxidase encodes glucose dehydrogenase and the gene for gluconate phosphorylase encodes gluconate kinase.
[0049]
The gene for glucose dehydrogenase is preferably Bacillus
A gene derived from megaterium, the gene for gluconate kinase is preferably derived from Escherichia coli, and the genes for gluconolactonase and transport proteins are derived from Zymomonas mobilis. The gene for glucose dehydrogenase is glucose dehydrogenase IV (gdhIV) from Bacillus megaterium, the gene gntk for gluconate kinase is Gntk from Escherichia coli, and the genes for transport protein and gluconolactonase are Particularly advantageous are gene constructs that are the glf and gnl genes from Zymomonas mobilis. Isolation of related genes and cell transformation is accomplished in a conventional manner: When cloning the E. coli gluconate kinase gene gntK, Bacillus megaterium glucose dehydrogenase IV (gdhIV) gene or Zymomonas mobilis gluconolactonase (gnl) gene or transport gene glf, PCR) method is preferred, using Escherichia coli K-12 (gntK), Bacillus megaterium (gdhIV), Zymomonas mobilis strain ATCC 29191 or ATCC 31821 (gnl, glf), respectively.
[0050]
After amplifying the DNA with a known vector (pGEM7, pUCBM20, pUC19 or others) and recombining it in vitro, the host cell is transformed by means of chemical methods, electroporation, transduction or conjugation. The
[0051]
The complete nucleotide sequences of the gntK, gdhIV, gnl, and glf genes from the three donor organisms are known and are available from publicly available sources, such as the EMBL / HUSAR in Heidelberg Such databases are deposited with access numbers D 84362 (gntK), D 10626 (gdhIV), X 67189 (gnl) and M60615 (glf). The gene using the chromosomal DNA from Escherichia coli K-12 strain and Izu et al., Journal of Molecular Biology 267 (1997) 778-793 and Tong et al., Journal of Bacteriology 178 (1996) 3260-3969. PCR that specifically amplifies the gene using the gene sequence is preferable for cloning the Escherichia coli gntK gene. Chromosomal DNA from Bacillus megaterium is preferred, for example, for cloning the Bacillus megaterium gdhIV gene (Nagao et al. Journal of Bacteriology 174 (1992) 5013-5020).
[0052]
The isolated glucose dehydrogenase IV gene may be incorporated in any combination with one or more genes described within the spirit of the present invention to form a single gene structure or several gene structures. Can do. This leads to combinations such as gdhIV + gntK, gdhIV + glf, gdhIV + gntK + glf; gdhIV + gntK + gnl; gdhIV + gnl + glf; gdhIV + gntK + gnl + glf without considering the exact placement in the gene structure. Positively affects the synthesis of transketolase, transaldolase, glucokinase, DAHP synthase, chorismate mutase / prephenate dehydratase, chorismate mutase / prephenate dehydrogenase or aromatic metabolites in addition to the above gene structure Any gene construct that additionally contains one or more genes encoding other enzymes to be given.
[0053]
When placing genes, glf preferably has a low copy number x (x = 1-10) to avoid possible negative consequences resulting from overexpression of membrane proteins in a gene structure or multiple gene structures. ).
[0054]
A genetic structure comprising at least one regulatory gene sequence given to one of the genes is advantageous.
[0055]
Thus, regulatory elements can be preferably enhanced at the transcription level, particularly by enhancing transcription signals. This can be achieved, for example, by increasing the activity of the promoter by changing the promoter sequence located upstream of the structural gene or by completely replacing the promoter with a more active promoter. Transcription can also be enhanced by appropriately affecting the regulatory genes assigned to the gene; but in addition, translation can be enhanced, for example, by improving the stability of messenger RNA (mRNA).
[0056]
Furthermore, within the spirit of the invention, transformed cells harboring the gene structure of the invention in a replicable form can also be used. Within the scope of the present invention, transformed cells are understood to mean any microorganism carrying the gene construct of the present invention that results in increased formation of aromatic metabolite cells. Host cells are transformed by chemical methods (Hanahan J. Mol. Biol. 166 (1983) 557-580) and also by electroporation, conjugation or transduction.
[0057]
For transformation, it is advantageous to employ a host cell in which one or more enzymes additionally involved in the synthesis of the substance are deregulated and / or increased in its activity. Microbial strains, particularly Escherichia coli that produces aromatic amino acids or other aromatic metabolites according to the present invention, are transformed with a genetic construct containing the relevant gene.
[0058]
For transformation with genetic constructs, it is also advantageous to employ host cells whose activity is reduced or switched off if a PEP-dependent sugar uptake system exists.
[0059]
In particular, transformed cells are made available for transformed cells capable of producing aromatic amino acids, preferably L-phenylalanine.
[0060]
A method of microbiologically producing an aromatic metabolite, as described above, using a transformed cell harboring a genetic structure will thus be available.
[0061]
In a particularly preferred embodiment of the method according to the invention, transformed cells that contain other metabolites of central metabolism apart from Ery4P are used with increased availability. Examples of these metabolites are α-oxoglutarate or oxaloacetate resulting from intracellular synthesis processes, or others available to cells growing by feeding in the corresponding compound, or of the citrate cycle Their precursors such as fumaric acid or maleate as metabolites.
[0062]
Escherichia coli strain
AT2471 / pGEM7gntKgdhIV was deposited with DSMZ (German Collection of Microorganism and Cell Cultures) on April 15, 1998 under the deposit treaty DSM 12118 under the conditions of the Budapest Treaty.
[0063]
The adopted organism, AT2471, is deposited with the CGSC at 4510 by Taylor and Trotter (Bacteriol. Rev. 13 (1967) 332-53) and is available free of charge.
[0064]
The materials and methods employed are shown below and the present invention is supported by experimental examples and comparative examples.
[0065]
General method
Within the scope of genetic research, Unless otherwise specified, E. coli strains were cultured in an LB medium consisting of Difco bacto tryptone (10 g / l), Difco yeast extract (5 g / l) and sodium chloride (10 g / l). Depending on the resistance of the employed strain, ampicillin (100 mg / l) and chloramphenicol (17-34 mg / l) were added to the medium as needed. In this context, ampicillin was pre-dissolved in water, chloramphenicol was pre-dissolved in ethanol and added to the medium that had been autoclaved after sterilization by filtration. Diffcobactergar (1.5%) was added to LB medium to make agar plates.
[0066]
E. Plasmid DNA from E. coli was isolated by the alkaline lysis method using a commercially available system (Qiagen, Hilden). Chromosomal DNA is obtained from E. coli using the Chen and Kuo methods (Nucl. Acid Res. 21 (1993) 2260). E. coli and Bacillus megaterium DSM 319. The restriction enzymes Taq DNA polymerase, DNA polymerase I, alkaline phosphatase, RNase and T4 DNA ligase were used according to the manufacturer's instructions (Boehringer, Mannheim, Germany or Promega, Heidelberg, Germany). For restriction analysis, DNA fragments were fractionated in an agarose gel (0.8%) and separated from agarose by extraction using a commercially available system (QuiaEx II, Hilden, Germany).
[0067]
Prior to transformation, cells were incubated in LB medium (5 ml tube) at 37 ° C. for 2.5-3 hours at 200 rpm rotation. At an absorbance of about 0.4 (620 nm), the cells are centrifuged down and TSS (10% (w / v) PEG 8000, 5% (v / v) DMSO and 50 mM MgCl2LB medium) was collected in an amount of 1/10 volume. After incubating with 0.1-100 ng DNA for 30 minutes at 4 ° C., followed by 1 hour incubation at 37 ° C., the cells were plated on LB medium containing the appropriate antibiotics.
[0068]
[Example 1]
PGEM as a model of gene structure based on plasmids according to the present invention
Preparation of 7gntKgdhIV
The Bacillus megaterium DSM 319 gdhIV gene encoding glucose dehydrogenase IV is based on the DNA chain of a known gene described in Nagao et al., Journal Bacteriology, Volume 15 (1992), pages 5013-5020. It was cloned by specific amplification of chromosomal DNA of Bacillus megaterium DSM 319 by the method (PCR). The PCR oligonucleotide primers were provided with cleavage sites for the restriction enzymes BamHI (5 ′ end) and SacI (3 ′ end). Primer 1 (BamHI) consists of 5 'ATG GAT CCA TGA AAA CAC TAG GAG GAT TTT 3'. Primer 2 (SacI) consisted of 5 'GCC AGA GCT CTT TTT TCC ACA TCG ATT AAA AAC TAT 3' and was complementary to the 3 'end of the gdhIV gene. The resulting DNA amplification product was ligated into the vector pGEM7 which had approximately 800 base pairs, was restricted by BamHI and SacI, and then processed in the same way (see Table 1). Transformation was achieved by selection on LB agar plates containing X-GaL and ampicillin in strain JM109DE3. Successful cloning was detected by determining the DNA sequence of the cloned gdhIV gene. This vector (pGEM7gdhIV) allowed the expression of glucose dehydrogenase IV activity in the absence of the T7 polymerase system (strain JM109DE3) (see Table 2). E. as a chromosome template. The Escherichia coli K-12 gluconate kinase gntK gene was cloned by a specific DNA amplification method using E. coli K-12 W3110 strain. The sequence of the gntK gene is described by Tong et al. in Journal of Bacteriology, Volume 178 (1966), pages 3260-3269. For PCR amplification, oligonucleotide primers with additional restriction cleavage sites for EcoRI (5 ′) and BamHI (3 ′) were selected. Primer 1 consists of 5 'CCG AAT TCT TGT ATT GTG GGG GCA C 3' and binds 5 'upstream of the gntK gene; Primer 2 consists of 5' CCG GAT CCG TTA ATG TAG TCA CTA CTT A 3 ' , Complementary to the 3 ′ end of the gntK gene. The amplified product with about 600 base pairs was purified and ligated into the vector pGEM7 restricted by EcoRI and BamHI and opened. Transformation was achieved by selecting on LB agar plates containing X-GaL and ampicillin in strain JM109DE3. Successful cloning was detected by determining the DNA sequence of the cloned gntk gene. This vector (pGEM7gntk) allowed expression of gluconate kinase activity even in the absence of the T7 polymerase system (strain JM109DE3) (see Table 2).
The gntK and gdhIV genes are joined by opening the vector pGEM7gdhIV with double restriction by BamHI and SacI. An 800 base pair fragment is obtained after restriction of the vector pGEM7gdhIV, which contains the gdhIV gene, but is ligated into the vector thus opened. Again, transformation is performed by selecting for ampicillin. The new gene structure pGEM7gntkgdhIV mediates T7 polymerase-independent expression of enzyme activity according to the present invention with respect to glucose dehydrogenase IV and with respect to gluconate kinase GntK (see Table 2).
The resulting transformed cells are stored on LB medium in the form of glycerol cultures at -80 ° C. When necessary, glycerin cultures are thawed immediately prior to use.
[0069]
[Example 2]
Measurement of enzyme activity of glucose dehydrogenase and glucose kinase
In order to measure enzyme activity in bacterial crude extracts, E. coli cells and plasmid parasitic mutant cells were cultured in mineral media. This medium is citric acid 3H2O (1.0 g / l), MgSOFour・ 7H2O (0.3 g / l), KH2POFour(3.0 g / l), KH2POFour(12.0 g / l), NaCl (0.1 g / l), (NHFour)2SOFour(5.0 g / l), CaCl2・ 2H2O (15.0 mg / l), FeSOFour・ 7H2It consists of O (0.075 g / l) and L-tyrosine (0.04 g / l). In addition, minerals were added in the form of trace elemental solutions (1 ml / l). The solution is Al2(SOFour)Three・ 18H2O (2.0 g / l), CoSOFour・ 6H2O (0.7 g / l), CuSOFour・ 5H2O (2.5 g / l), HThreeBOThree(0.5 mg / l), MnCl2・ 4H2O (20.0 g / l), Na2MoOFour・ 2H2O (3.0 g / l), NiSOFour・ 3H2O (2.0 g / l) and ZnSOFour・ 7H2O (15.0 g / l). Vitamin B1 (5.0 mg / l) was dissolved in water, sterilized by filtration and then added to the autoclaved medium. Ampicillin and / or ampicillin and chloramphenicol were added as needed. Glucose (30 g / l) was separately treated in an autoclave in the same manner and added to a medium that had been treated in advance in an autoclave.
The collected cells were washed with 100 ml of Tris / HCL buffer (pH 8.0). The cells in the precipitate were disrupted by sonication (Branson Sonifier 250 with microchip) in a 25% sonication cycle at a strength of 40 watts for 4 minutes per ml of cell suspension. After centrifugation at 18,000 g and 4 ° C. for 30 minutes, the supernatant (crude extract) was used for the measurement of glucose dehydrogenase and / or gluconate kinase activity.
The activity of glucose dehydrokinase was measured by the method described in Harwood & Cutting, Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley & sons. Glucose dehydrogenase catalyzes the oxidation of glucose to gluconolactone. The activity of the enzyme was measured by a photometer using the reduced cofactor NADH + H+Was determined by measuring the increase in concentration at a wavelength of 340 nm. Measurements were made in a quartz cuvette with a total volume of 1 ml. The reaction mixture consisted of Tris HCl (final concentration 250 mM, pH 8.0), 2.5 mM EDTA sodium, 100 mM KCl and 2 mM NAD. The crude extract was preincubated in buffer for 5 minutes at 25 ° C. Glucose (final concentration, 100 mM) was added to initiate the detection reaction. The increase in absorbance was monitored at 340 nm. In each case, a mixture without glucose served as a control. Specific glucose dehydrogenase activity is defined as U / mg units defined as 1 μmol NADH formation per minute and mg protein, set to be equivalent to conversion to 1 μmol glucose per minute and 1 mg protein Given in.
Gluconate kinase was measured in the crude extract as described by Izu et al. In FEBS Letters, 394 (1996) pages 14-16.
Gluconate kinase catalyzes the ATP-dependent phosphorylation reaction from gluconate to 6-phosphogluconate. In the enzyme test, the 6-phosphogluconate formed is photometric at a wavelength of 340 nm due to an increase in NADPH concentration when using NADP-dependent auxiliary enzyme 6-phosphogluconate dehydrogenase (Boehringer Mannheim, No. 108405). Measured in In this connection, the formation of 1 μmol NADPH corresponds to the phosphorylation of 1 μmol gluconate. Enzymatic detection was performed at 25 ° C. in a quartz cuvette with a total volume of 1 ml. The reaction mixture contained 50 mM Tris HCl, pH 8.0, 100 mM ATP, 0.25 mM NADP, 1.2 units of auxiliary enzyme 6-phosphogluconate dehydrogenase and varying amounts of crude extract. The mixture was preincubated for 5 minutes at 25 ° C., then the reaction was started by adding gluconic acid (pH 6.8; final concentration in the mixture, 10 mM). A mixture without gluconic acid was used as a control.
Protein concentration in the crude extract was determined using Bradford M. using commercially available dye reagents. M.M. (Anal. Biochem., Vol. 72 (1976) pp. 248-254). Calf serum albumin was used as a standard.
Table 2 shows the host strain E. coli. The enzyme measurement result when using the mutant which parasitizes E. coli W3110 and plasmid pGEM7gdhIV, pGEM7gntK or pGEM7gntKgdhIV is represented. It has been found that if a gene structure according to the present invention has been used, as described above, the enzyme can be expressed in cells in a functional manner according to the present invention.
[0070]
[Example 3]
Production of substances using strains exhibiting increased glucose dehydrogenase activity
The synthesis efficiency of Escherichia coli AT2471 and Escherichia coli AT2471 / pGEM7KghdIV was measured in the mineral medium described in Example 2. To this end, shake flasks (1000 ml containers containing 100 ml of medium) were inoculated with 2 ml of glycerin culture and incubated for 72 hours at 37 ° C. and 150 rpm with a swirl shaker. The pH of the culture was measured at about 12 hour intervals and KOH (45%) was added as needed to restore the starting value to 7.2. In addition, samples (2 ml) were taken after 24 and 48 hours to measure absorbance and glucose and L-phenylalanine concentrations.
The concentration of phenylalanine was confirmed by high performance liquid chromatography (HPLC, Hewlett-Packard Company, Munich, Germany) in combination with fluorescence detection (excitation at 335 nm, emission at 570 nm) and a nucleosyl-120-8C18 column (250 4.6 mm) was used as the solid phase; elution was performed using a gradient (eluent A: 90% 50 mM phosphoric acid, 10% methanol, pH 2.5; eluent B: 20% 50 mM phosphoric acid) 80% methanol, pH 2.5; gradient; 0-8 minutes, 100% A, 8-13 minutes, 0% A, 13-19 minutes, 100% A). The elution rate was set to 1.0 ml / min and the column temperature was set to 40 ° C. Post-column derivatization was performed at room temperature in a reaction capillary (14 m · 0.35 mm) using o-phthaldialdehyde.
Under the conditions described above, L-phenylalanine was found to have a retention time of 6.7 minutes.
Using an enzyme test strip (Dieber, Boehringer Mannheim, Germany), the glucose concentration is measured and, independently of the result, subsequently 2 ml of a concentrated glucose solution (500 g / l) is metered in. Care was taken to ensure that glucose was not limiting in the experimental mixture.
Simply introduce the plasmid pGEM7gdhIV to As a result, 145 was achieved as an index value describing the phenylalanine concentration after an incubation time of 48 hours compared to an index value of 100 for the E. coli AT2471 host strain (phenylalanine). This result demonstrates the effect of increasing the synthesis of aromatic compounds by increasing the enzyme activity of glucose dehydrogenase in substance-producing microorganisms according to the present invention.
[0071]
[Example 4]
PEP-independent sugar uptake system in addition to increased enzyme activity of glucose dehydrase
Of substances using strains in which
The Zymomonas mobilis glf gene was amplified as a template using plasmid pZY600 (Weisser et al., J. Bacteriol 177 (1995) 3351-3345). At the same time, the selection of primers resulted in the introduction of a BamHI cleavage site and a KpnI cleavage site. These unique cleavage sites were used to insert genes into the vector pUCBM20 (Boehringer Mannheim), which were similarly opened by BamHI and KpnI. A 1.5 kb DNA fragment was isolated from this vector (pBM20glf) by restriction with BamHI and HindIII and ligated to the vector plasmid pZY507 (Weisser et al., J. Bacteriol 177 (1995) 3351-3345), It was similarly opened with the restriction enzymes BamHI and HindIII. The recombinant plasmid pZY507glf is It was obtained after transforming E. coli and cloning transformed cells. This vector confers chloramphenicol resistance and lacIq-Contains the tac promoter system and has a low copy number.
Vector pZY507glf was transformed into host strain AT2471 along with the gene structure of the present invention obtained as described in Example 1.
According to the experimental conditions described in Example 3, the mutant E. E. coli AT2471glf, E. coli. E. coli AT2471glf / pGEM7, E. coli. E. coli AT2471glf / pGEM7gntK and E. coli E. coli AT2471glf / pGEM7gntKgdhIV was each cultured in two parallel mixtures. After 48 hours, the L-phenylalanine concentration in the medium was measured.
Starting strain E. coli that achieves an L-phenylalanine concentration corresponding to an index value of 100. In comparison to E. coli AT2471glf, the presence of the vector pGEM7 is
This results in an index value of 96, so that substantially the same concentration is achieved. In contrast, E.I. The use of E. coli AT247glf / pGEM7gntK results in an L-phenylalanine concentration corresponding to an index value of 179 when compared to the previously described strains. E. Expression of both alternative metabolic genes in E. coli AT2471glf / pGEM7gntKgdhIV, namely glucose dehydrogenase and gluconate kinase, achieved a further increase in phenylalanine concentration representing an index value of 195.
This result shows that expression of alternative metabolic pathways by introducing the enzymatic activity of glucose dehydrogenase and increasing the enzymatic activity of gluconate kinase, while those transformed and expressed at the same time that the PEP-independent sugar uptake system was transformed It proves to have a positive influence on L-phenylalanine synthesis specifically in microorganisms.
[0072]
[Example 5]
In addition to its increased glucose dehydrogenase enzyme activity, PE
Production of substances using PTS-mutations in which a P-independent sugar intake system is expressed
Construction
E. In order to incorporate the glf gene into the gene encoding the components of the E. coli PTS system, the plasmid pPTS1 is digested with BglII and treated with the Klenow fragment. Its unique cleavage site is in the ptsI gene. The glf gene is isolated from plasmid pBM20glfglk as a BamHI / KpnI fragment and treated in the same way with the Klenow fragment. A clone carrying the glf gene in the same coordination as ptsHI was obtained with blunt ends. The 4.6 kb PstI fragment carrying the ptsH gene and the 3 ′ region of ptsI with the incorporated glf and crr was obtained from the resulting plasmid pPTSglf. This fragment was ligated to the EcoRV cleavage site of vector pGP704. Since this vector can only be replicated in lambda pi strains, transformed cells that do not harbor this phage will incorporate the vector into the chromosome if they can grow on carbenicillin. Can do. Uptake was checked by Southern analysis (Miller VL et al., J. Bacteriol. 170 (1988) 2575-83). In addition to the glf gene, the resulting transformed cells also contained the complete PTS gene.
The portion of the vector can be recombined into a second homologous crossover state leading to a lack of carbenicillin resistance. In this case, insertion of the pts gene is prevented by the glf gene, so PTS is not functionally expressed in these mutants.
Desirable PTS-Mutants are selected as follows: stationary PTS+After the transformed cells were repeatedly subinoculated (sub-inoculated) on LB medium without antibiotics, a portion of the cell suspension was placed on LB plates containing 100 μg / l fosfomycin and cultured. PTS-Mutants can grow on these plates. Growing clones were streaked on LB plates containing either fosfomycin or 20 μg / l carbenicillin. Chromosomal DNA was isolated from clones that showed new growth on fosfomycin plates but not on carbenicillin plates. Integration of the glf gene into the gene encoding the PTS system was confirmed by Southern analysis. The corresponding mutant was phenotypically identified as PTS deficient.
One clone has the host organism E. coli. E. coli AT2471glintPTS-And used for transformation with plasmid pGEM7gntKgdhIV (see above).
According to the experimental conditions described in Examples 3 and 4, PTS negative mutants E. coli AT2471glintPTS-/ PGEM7gntKgdhIV and corresponding host strain AT2471glintPTS-Were cultured in each case in two parallel mixtures. The overall biomass specific productivity after 48 hours of cultivation was calculated from the results.
Host strain E. E. coli AT2471glintPTS-As compared to the total biomass-specific productivity, it is expressed as an index value of 100, but suddenly the mutant AT2471glintPTS-/ PGEM7gntKgdhIV achieved overall biomass specific productivity with an index value of 133.
This result shows that introducing the enzyme activity of glucose dehydrogenase and increasing the enzyme activity of gluconate kinase simultaneously incorporates a PEP-independent sugar uptake system and reduces or completely switches off that enzyme activity. It proves to have a positive influence on the y productivity of phenylalanine synthesis specifically in these microorganisms characterized by the developed PTS system.
[0073]
[Table 1]
[Table 2]
Claims (29)
b ）及び / 又は遺伝子コピー数を増加させることにより、
c ）及び / 又は遺伝子発現を増加させることにより、
d ）及び / 又は該酵素の内在的活性を増加させることにより、
e ）及び / 又は酵素の構造を変更することにより、
f ）及び / 又は脱制御された酵素を使用することにより、
g ）及び / 又は脱制御された酵素をコードする遺伝子を導入
することにより、
グルコース酸化酵素活性又はグルコース酸化酵素活性とさらにグルコン酸ホスホリル化酵素、グルコノラクトナーゼ及びPEP非依存性糖摂取用輸送タンパク質の内の少なくとも１つの活性を増加させることを特徴とする請求項２乃至１１の１つに記載の方法。a) By introducing a gene,
b) and / or by increasing the number of gene copies,
c) and / or by increasing gene expression
d) and / or by increasing the intrinsic activity of the enzyme,
e) and / or by changing the structure of the enzyme,
f) and / or by using a deregulated enzyme,
g) and / or by introducing a gene encoding a deregulated enzyme,
Glucose oxidase activity or glucose oxidase activity and further at least one activity of gluconate phosphorylase, gluconolactonase and transport protein for PEP-independent sugar intake are increased. The method according to one of 11.
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| RU2004105179A (en) * | 2004-02-25 | 2005-08-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) | 6-PHOSPHOGLUCONOLACTONASE FROM ESCHERICHIA COLI, DNA FRAGMENT, BACTERIA BELONGING TO THE GENUS ESCHERICHIA, PRODUCER OF L-AMINO ACID, AND METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACID |
| EP1718731B2 (en) * | 2004-02-25 | 2016-10-19 | Ajinomoto Co., Inc. | Microorganism expressing 6-phosphogluconolactonase and its use in the production of L-amino acids. |
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| US8076108B2 (en) | 2005-04-26 | 2011-12-13 | Cargill, Incorporated | Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors |
| US7582455B2 (en) | 2005-04-26 | 2009-09-01 | Cargill, Incorporated | Polypeptides and biosynthetic pathways for the production of stereoisomers of monatin and their precursors |
| US9150868B2 (en) | 2008-11-05 | 2015-10-06 | Mitsui Chemicals, Inc. | Bacterium producing 2-deoxy-scyllo-inosose (DOI) and method of producing 2-deoxy-scyllo-inosose (DOI) by using same |
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Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPH0286779A (en) * | 1988-09-22 | 1990-03-27 | Amano Pharmaceut Co Ltd | Improved type recombinant dna, transformant containing the same and production of heat-resistant glucose dehydrogenase therewith |
| US5437083A (en) | 1993-05-24 | 1995-08-01 | Advanced Cardiovascular Systems, Inc. | Stent-loading mechanism |
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