JP2002511933A

JP2002511933A - Protein elongation factor 2 as a target for antifungal and antiparasitic drugs

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Publication number: JP2002511933A
Application number: JP50307999A
Authority: JP
Inventors: ニールセン−カーン，ジエニフアー; ジヤステイス，マイクル・シー; シユマツツ，デニス・エム; シユウ，ミン−ジヨ; クー，テリーザ・ダブリユ
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1997-06-10
Filing date: 1998-06-09
Publication date: 2002-04-16
Also published as: AU8062798A; WO1998057176A1; AU741017B2; EP0995120A1; CA2291653A1

Abstract

(57)【要約】蛋白延長因子（２）の阻害は、抗真菌および抗寄生虫化合物の可能性があるものを同定するための標的を提供する。ＥＦ２阻害物質は真菌および寄生虫感染症に対する治療薬として有用である。 (57) [Summary] Inhibition of protein elongation factor (2) provides a target for identifying potential antifungal and antiparasitic compounds. EF2 inhibitors are useful as therapeutics against fungal and parasitic infections.

Description

【発明の詳細な説明】抗真菌薬および抗寄生虫薬の標的としての蛋白延長因子２発明の背景延長因子２（ＥＦ２）は真核細胞における蛋白合成中のリボソーム転座を触媒する必須蛋白である。この因子はすべての真核生物で高度に保存され、ヒト、コムギ麦芽、および真菌などの互いに異なる生物から再構成されたインビトロ蛋白合成系において広く互換性があることが明らかにされている。ＥＦ２は真核細胞系において広汎に認められ、様々な真核細胞系由来のＥＦ２間でアミノ酸配列が高度の相同性を示すにも拘わらず、ある化合物群すなわちソルダリン（ｓｏｒｄａｒｉｎ）類が、真菌ＥＦ２との選択的相互作用を介して真菌蛋白合成を選択的に阻害することが認められた。この知見により、侵襲性生物を殺すことができる一方でホストにはいかなる有害な影響も与えない、病原体選択的ＥＦ２阻害物質開発の可能性が示される。本発明以前には、ＥＦ２は抗真菌薬または抗寄生虫薬の分別標的とは考えられていなかった。発明の概要本発明は抗真菌薬または抗寄生虫薬に対する標的としての延長因子２（以下「ＥＦ２」と呼ぶ）に関する。特に本発明は、試験化合物が病原体ＥＦ２との選択的相互作用を介して病原体蛋白合成を特異的に阻害することができるかどうかを評価することによる、抗真菌薬および抗寄生虫薬の可能性がある物質を同定する方法に関する。本発明は、薬物発見を促進するための、異種ＥＦ２による形質転換真核微生物を用いる、または用いない、メカニズムに基づくアッセイの利用について述べる。さらに、本発明は、真菌または寄生虫感染症を患うホストに、ＥＦ２を介して病原体の蛋白合成を特異的に阻害する化合物の治療上有効な量を投与することにより、真菌感染症を治療する方法に関する。発明の詳細な説明本発明は、酵母の、遺伝子操作されたソルダリン感受性株（ｓＳ１）およびソルダリン耐性株（ｓＲ１）株または天然において選択されたソルダリン耐性株を含む分別２プレートアッセイを含む、抗真菌および抗寄生虫活性を有する化合物の同定および評価法を提供する。アッセイの読み出しは、ソルダリン耐性株に比べてソルダリン感受性株でより明らかな阻止域により示される抗菌活性である。サッカロミセス−セレビジエにはＥＦＴ１およびＥＦＴ２の２つのＥＦ２遺伝子があり、生存にはこれらの遺伝子の少なくとも１つが必要である。類似遺伝子型株であるｓＳ１およびｓＲ１を、ＥＦＴ１およびＥＲＧ６遺伝子の両方が破壊される一連の遺伝子交叉により構築した。得られた株はｅｒｇ６の破壊（エルゴステロール欠損）が原因でより透過性が高くなっており、ＥＦＴ２の野生型コピーまたは耐性コピーのいずれかをＥＦ２の唯一の遺伝子として有している。既知数のこれらの酵母細胞を固形培地に接種するか、または液体培地に懸濁し、これらの酵母の増殖を阻害するサンプルを同定するために試験化合物または発酵抽出物を加える。培養物を特定の温度で一定の期間インキユベートして試験生物を増殖させる（すなわち、３０℃で１６〜２４時間）。目的の試験サンプルは、ソルダリン耐性株に比較して感受性株に対し分別作用を示すものである。本来、野生型に対してより強力なサンプルはＥＦ２標的を介して増殖を妨げていなければならない。他の態様において、本発明は（ａ）真菌および寄生虫病原体からのまたはホスト種からの異種ＥＦ２に依存する真菌または原虫細胞を構築すること、（ｂ）前記細胞を試験化合物または天然産物抽出物の既知の希釈液に接触させること、および（ｃ）試験化合物が液体中の増殖を完全に阻害する最小阻害濃度（ＭＩＣ）または固形基質状の阻止域の測定値を求めることを含む、病原体ＥＦ２機能を特異的に阻害する化合物の同定法を提供する。対象となる試験化合物または発酵抽出物は、分別できる程度の阻害（すなわち、試験生物の耐性株に比べて野性株に対するより強い阻害活性）を示すものである。例えば、ヒトＥＦ２依存性生物に比べて酵母ＥＦ２依存性生物の増殖阻害においてより効果的なサンプルである。本発明の方法は、抗真菌薬および抗寄生虫薬の可能性がある化合物をスクリーニングするための簡便で特異的なアッセイを提供する。本発明の方法はまた、実験室で培養できない寄生病原体のＥＦ２標的に対する試験化合物の評価も可能にする。本発明において、ＥＦ２は、増殖阻害アッセイに用いるために病原生物からクローニングすることができ、またはインビトロ結合アッセイもしくは翻訳阻害アッセイに用いるためにこれらの病原体から精製することができる。ＥＦ２は、カンジダ、アスペルギルス、クリプトコックス、ＥｒｙｓｉｐｈｅおよびＰｕｃｃｉｎｉａなどの、ヒト、動物または植物の病原性真菌から得ることができる。また、プラスモディウム、アイメリア、クリプトスポリジウムおよびトキソプラズマなどの寄生原生動物ならびにヒトおよび他の望まれるホスト真核細胞からも得ることができる。ＥＦ２を阻害する化合物は、標的生物においてｍＲＮＡの翻訳を妨害するものであろう。ＥＦ２を阻害する化合物の例にはジフテリア毒素およびフシジン酸が含まれるが、これらはいずれもホストよりも病原体への特異性を示すことはない。フシジン酸は、多くの生物において、正常なリボソーム−ＥＦ２相互作用を破壊することにより翻訳を阻害する。ＥＦ２を阻害する化合物は、化合物と酵素との間の相互作用の程度を容易に定量できるように標識されていることが好ましい。好ましい放射性同位体標識はトリチウムである。試験化合物は単一の合成化合物、複数の合成化合物の混合物、粗製品、精製製品または植物、微生物もしくは動物から得られた天然産物の最初の抽出物でもよい。抗真菌薬ソルダリンおよびその類縁体が特定の病原真菌において真菌ＥＦ２機能を阻害することにより蛋白合成を阻害することが明らかにされている。ソルダリンは糸状菌ソルダリア−アラネオーサ（Ｓｏｒｄａｒｉａａｒａｎｅｏｓａ）から単離された抗真菌抗生物質である（英国特許第１１６２０２７号およびＨｅｌｖｅｔｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ，１９７１，５１：１１９ −２０参照）。ソルダリン骨格を有する他の化合物も抗真菌薬として報告されている。特開昭６２−０４０２９２はＺｏｆｉｅｌａｍａｒｉｎａ種から単離された化合物ゾフィマリンを開示し、特開平６−１５７５８２はペニシリウム属から単離された化合物ＢＥ−３１４０５を開示し、またＳＣＨ５７４０４がＪ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，１９９５，４８：１１７１−１１７２に報告されている。ソルダリンの半合成誘導体がＰＣＴ国際出願第ＷＯ９６／１４３２６号および第ＷＯ９６／１４３２７号に報告されている。アグリコンであるソルダリシンが、ソルダリンから酸加水分解によって得られる（ＨａｕｓｅｒａｎｄＳｉｇｇ，ＨｅｌｖｅｔｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ，１９７１，５１：１１９−２０）。同様に、ソルダリシンメチルエステルがソルダリンメチルエステルから得られる。ソルダリシンメチルエステルの全合成がＫａｔｏ他，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９３，１００２−１００４に報告されており、この文献ではＯ− メトキシメチルソルダリシンメチルエステルも開示されている。４−デスホルミル−４−ヒドロキシメチルソルダリシンの２酢酸塩がＭａｎｄｅｒａｎｄＲｏｂｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，５６（１１）：３３９５ −３６０１に開示されている。ソルダリシンおよび報告されているその誘導体のいずれも、生物活性を有すると判明したものはない。式Ｉのソルダリン類縁体［式中Ｒは（ａ）Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ¹、（ｂ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ²Ｒ³、（ｃ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒ⁴、（ｄ）ＣＨ（Ｒ²）ＯＲ⁵、（ｅ）Ｃ（Ｒ⁶）（Ｒ⁷）（Ｒ⁸）、もしくはであり；ただしＲ¹²がＣＨＯの場合、Ｒは（ｇ）ではなく；Ｒ¹は（ａ）Ｃ₁〜Ｃ₁₄アルキル、（ｂ）Ｃ₂〜Ｃ₁₄アルケニル、（ｃ）Ｃ₂〜Ｃ₁₄アルキニル、（ｄ）Ｃ₃〜Ｃ₂₀シクロアルキル、（ｅ）アリールもしくは（ｆ）アリールＣ₁〜Ｃ₆アルキルであり；Ｒ²とＲ³は別々に（ａ）Ｈもしくは（ｂ）Ｒ¹であり；Ｒ⁴は（ａ）Ｈ、（ｂ）Ｒ¹もしくは（ｃ）−（ＣＨ₂）_mＮＲ²Ｒ³であり；Ｒ⁵は（ａ）Ｒ¹もしくは（ｂ）−（ＣＨ₂）_xＯ（ＣＨ₂）_yＨであり；Ｒ⁶は（ａ）Ｈ、（ｂ）Ｃ₁〜Ｃ₁₄アルキル、（ｃ）アリール、（ｄ）アリールＣ₁〜Ｃ₆アルキル、（ｅ）−（ＣＨ₂）_yＣＨＲ₁₁（ＣＨ₂）_zＨ、（ｆ）−（ＣＨ₂）_yＣ≡Ｃ（ＣＨ₂）_zＨ、（ｇ）−（ＣＨ₂）_yＣ（Ｒ⁷）＝ＣＨ（ＣＨ₂）_zＨ、（ｈ）−（ＣＨ₂）_yＣ≡Ｃ（ＣＨ₂）_mＲ¹¹、（ｉ）−（ＣＨ₂）_yＣ（Ｒ⁷）＝ＣＨ（ＣＨ₂）_mＲ¹¹であり、Ｒ⁷とＲ⁸は別々に（ａ）Ｈ、もしくは（ｂ）Ｃ₁〜Ｃ₁₄アルキルであり；Ｒ⁹とＲ¹⁰は別々に（ａ）Ｈ、（ａ）Ｃ₁〜Ｃ₁₄アルキル、（ａ）Ｃ₂〜Ｃ₁₄アルケニル（ａ）アリールＣ₁〜Ｃ₆アルキルであり；Ｒ¹¹は（ａ）ＯＨもしくは（ｂ）ＮＲ²Ｒ³であり；Ｒ¹²は（ａ）−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ¹⁴、（ｂ）−ＣＨ＝ＮＯＨ、もしくは（ｃ）−ＣＨ₂ＯＣＨ₃であり；Ｒ¹³は（ａ）Ｈ、（ｂ）−ＣＨ₂Ｃ₆Ｈ₅、（ｃ）−ＣＨ₂ＣＨ＝ＣＨ₂、もしくはであり；Ｒ¹⁴は（ａ）Ｈ、（ｂ）Ｃ₁〜Ｃ₁₄アルキル、（ｃ）−ＣＣｌ₃、（ｄ）−ＣＢｒ₃、（ｅ）−ＣＨ₃、もしくは（ｆ）ＯＨであり；ｎは０もしくは１であり；ｍは１〜６であり；ｘは２〜６であり；ｙは０〜６であり；ｚは０〜６である。］またはその医薬品としてもしくは農業上許容できる塩が、１９９６年１０月７日に出願された係属中の米国特許出願第６０／０２６９９３号に開示されている。他のソルダリン類縁体が１９９６年９月１８日に出願された米国特許出願第６０／０２６５８０号に開示されている。ＥＦ２阻害物質は抗真菌薬および抗寄生虫薬として有用である。それ自体で、ヒト、動物および植物の真菌症および寄生虫症の治療および予防に用いることができる。ＥＦ２阻害物質を用いることのできる真菌症とそれぞれの起因病原体の例には次のものが含まれる：１）植物および作物で感染症を引き起こすＥｒｙｓｉｐｈｅ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ、ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｐｌａｓｍｏｐｏｒａおよびその他の真菌、２）ヒトおよび動物で真菌感染症を引き起こすカンジダ、アスペルギルス、クリプトコックス、フザリウム、ペニシリウムおよび他の真菌、３）ヒトおよび動物に感染するプラスモディウム、アイメリア、トキソプラズマ、ネオスポラ、クリプトスポリジウムおよび他の原虫。他の態様において、本発明は真菌または寄生虫感染症をわずらうホストにＥＦ２機能を阻害する化合物の治療上有効な量を投与することを含む、真菌または寄生虫感染症を治療する方法を提供する。治療上有効な量とは、原因となる真菌または寄生虫の蛋白合成を阻害するのに十分な量でありうる。ＥＦ２阻害物質は、他の抗真菌薬および抗寄生虫薬に用いられるのと同様の方法で、治療が必要なホストに投与することができる。例えば、非経口、経口、局所、または直腸投与することができる。投与する用量は、用いる化合物の種類、感染生物、特定のホスト、疾患の重症度、ホストの身体状態、および選択した投与経路によって異なる。適切な用量は当分野の技術者により容易に決めることができる。ヒトおよび動物の真菌症および寄生虫症の治療において、用量は０．０１ｍｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇまで上下することがある。ヒトおよび動物における予防的使用では、用量は０．０１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲である。本発明の組成物はＥＦ２阻害物質と不活性担体とを含む。この組成物は、ヒトおよび獣医学的使用のための医薬品組成物の形態でもよく、または飼料組成物の形態でもよい。「組成物」という用語は、１つまたは複数の活性成分と、担体となる１つまたは複数の不活性成分とを含む製品、ならびに２つ以上の成分の組合せ、複合体形成もしくは凝集から、または１つ以上の成分の解離から、または１つ以上の成分の他の型の反応から、直接もしくは間接的に生じるいかなる製品も包含すると解釈される。本発明の組成物は、このように、ＥＦ２阻害物質と不活性担体を混合して生成した場合の組成物を含む。本発明の医薬品組成物は、活性成分としてのＥＦ２阻害物質を含み、同時に医薬品として許容できる担体および任意に他の治療的成分を含有してもよい。組成物は、経口、直腸、局所、および非経口（皮下、筋肉内、および静脈内を含む）投与に適した組成物を含むが、いかなる所与の症例においても最適な経路はホストと、活性成分の投与対象となる状態の性質および重症度によって異なることになる。医薬品組成物は単位用量の形態で都合よく提供することができ、薬学分野でよく知られているいかなる方法によっても調製することができる。実際の使用において、ＥＦ２阻害物質は、通常の医薬品調剤法に従う、医薬品担体との密接混合における活性成分として組み合わせることができる。担体は投与、例えば経口または非経口(静脈内を含む)投与のために望まれる製剤形態に応じて様々な形態をとりうる。経口投与形態のための組成物調製において、いかなる通常の医薬品媒質を用いてもよい。例えば、懸濁剤、エリキシル剤および溶液などの経口液体製剤の場合、水、グリコール、オイル、アルコール、着香剤、保存剤、着色剤などを用いることができる。または粉末剤、カプセル剤および錠剤などの経口固形製剤の場合、デンプン、糖類、微結晶性セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などの担体が含まれてもよい。投与の容易さにより、この場合、錠剤およびカプセル剤が最も有益な経口投与単位の形態で、固形医薬品担体が明らかに採用される。望まれる場合には、錠剤を標準の水性または非水性法により被覆してもよい。前述の一般的投与形態に加えて、ＥＦ２阻害物質は制御放出手段および／または送達装置により投与することもできる。経口投与に適した本発明の医薬品組成物は、それぞれがあらかじめ決められた量の活性成分を粉末もしくは顆粒、または水性、非水性溶液もしくは懸濁液、水中油型乳液もしくは油中水型乳液として含有する、カプセル剤、カシェ剤または錠剤などの個別単位で提供することができる。このような組成物はいかなる製薬方法によっても調製することができるが、すべての方法は活性成分を１つまたは複数の必須成分を構成する担体と一緒にする段階を含む。一般に、組成物は活性成分を液体担体もしくは細かく分離した固形担体またはその両方と均一かつ密接に混合し、次いで必要があれば製品を所望の体裁に成型することにより調製する。例えば、錠剤は１つまたは複数の補助成分を任意に加えて圧縮または成形により調製することができる。圧縮錠剤は、適当な機械中、粉末または顆粒などの自由に流動できる形態の活性成分を、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、界面活性剤または分散剤と任意に混合して圧縮することにより調製できる。成型錠剤は、適当な機械中、不活性希釈液で湿潤させた粉末化合物の混合物を成型することによって作ることができる。望ましくは、各錠剤は約１ｍｇから約５００ｍｇの活性成分を含み、各カシェ剤またはカプセル剤は約１から約５００ｍｇの活性成分を含む。非経口投与に適した本発明の医薬品組成物は、これらの活性成分をヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適当に混合した水溶液または水性懸濁液として調製することができる。分散剤もグリセロール、液状ポリエチレングリコール、およびそれらの油中混合物中で調製することができる。通常の貯蔵および使用条件下では、これらの製剤は微生物の増殖を防ぐために保存剤を含む。注射用に適した医薬品形態には無菌水溶液または分散剤および注射用無菌水溶液または分散剤の即時調剤用無菌粉末が含まれる。すべての場合に、この医薬品形態は無菌でなければならず、また容易に注射可能な程度に流動性がなければならない。製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されていなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコール）、それらの適当な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適当な局所用製剤には、経皮装置、エアロゾル、クリーム、軟膏、ローション、散布剤などが含まれる。これらの製剤は活性成分を含む通常の方法によって調製することができる。例を示すと、クリームまたは軟膏は、十分な量の親水性物質と、約５〜１０重量％の化合物を含む、望まれる軟度のクリームまたは軟膏を作るために十分な量の水とを混合することにより調製される。担体が固体である直腸内投与に適した医薬品組成物は、単位用量坐剤として提供されることが最も好ましい。適当な担体にはカカオ脂および当技術分野で一般的に用いられる他の物質が含まれ、坐剤は軟化または溶融した担体と組み合わせて混合した後、冷硬し、成型することにより都合よく作ることができる。前述の担体成分に加えて、前述の医薬品組成物は希釈剤、緩衝剤、着香剤、結合剤、界面活性剤、増粘剤、滑沢剤、保存剤（抗酸化剤を含む）などを適宜含むことがあり、且つ製剤を対象となるレシピエントの血液と等張にするための物質を含むことがあることを理解されたい。式Ｉの化合物を含む組成物は、粉末または濃縮液の形態でも調製することができる。標準的な獣医用製剤慣行にしたがい、粉末の物理的性質を改善するために乳糖またはショ糖などの通常の水溶性添加物を混合することもできる。したがって、本発明の特に適当な粉末は５０から１００重量％、好ましくは６０から８０重量％の組合せと、０から５０重量％、好ましくは２０から４０重量％の通常の獣医用添加物とを含む。これらの粉末は動物飼料に、例えば中間であらかじめ混合することにより加えるか、または動物の飲料水中に希釈してもよい。本発明の濃縮液は水溶性化合物の組合せを適宜含み、且つ獣医用に許容できる水混和性溶媒、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、グリセロールホルマール、またはこのような溶媒と３０体積％までのエタノールとの混合液を任意に含んでもよい。この濃縮液は動物、特に家禽の飲料水に投与することができる。実施例本発明の例示のために下記の実施例を示すが、これらに制限されることはない。アッセイは９６穴もしくは他の適当なサイズのプレート中、または適当な液体培地中で実施することができる。実施例で用いる物質の調製次式の化合物Ｉはソルダリン類縁体である。化合物Ｉの調製は１９９６年１０月７日に出願された米国特許出願第６０／０２６９９３号に記載されている。酵母菌株の構築ＥＦ２をコードする遺伝子の両染色体コピーが欠失している酵母菌株ＹＥＦＤ１２ｈ／ｐＵＲＡ３−ＥＦＴ１をＪａｍｅｓＢｏｄｌｅｙの研究室から入手した（Ｐｈａｎ他，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９３），２６８：８６６５−８６６８）。この菌株はＥＦ２をコードする遺伝子のエピソームコピーも含んでおり、細胞の生存に必須である。対象となる病原体由来のＥＦ２遺伝子を発現する酵母菌株は、（１）異種ＥＦ２コード化遺伝子を含む酵母発現プラスミドによるＹＥＦＤ１２ｈ／ｐＵＲＡ３−ＥＦＴ１の形質転換と、（２）細胞由来の天然ＥＦ２遺伝子を含むプラスミドの除去により構築することができる。これを下記の増殖阻害アッセイに用いることができる。実施例１競合結合アッセイ競合アッセイを、Ｓ３０粗抽出物中でサッカロミセス−セレビジエＥＦ２に結合する³Ｈ−化合物Ｉなどの病原体ＥＦ２への特異性を有する放射性同位体標識した化合物の置換により実施することができる。Ｓ３０結合アッセイで認められた阻害物質の特異性を立証するために、洗浄リボソーム存在下、精製ＥＦ２を用いて結合競合も実施することができる。 ³Ｈ−化合物Ｉの特異的結合がサッカロミセスＳ３０抽出物で認められ、リボソームならびにＥＦ２の存在が必要とされる。結合は無標識Ｌ−７９３，４２２、ソルダリンおよび類縁体により置換可能である。哺乳動物細胞またはコムギ麦芽Ｓ３０抽出物では結合は認められない。酵母リボソームをラットまたはコムギ麦芽に置き換えても結合に影響がないのに対し、酵母ＥＦ２をラットまたはコムギ麦芽ＥＦ２に置き換えると結合しないことから、³Ｈ−Ｌ７９３，４２２の酵母に対する特異性はＥＦ２分子によるものである。材料：セファデックスＧ−７５（Ｇ−７５−１２０）ミニカラム：ＧＳ−ＱＳクイックセップ（ｑｕｉｃｋ−ｓｅｐ）マイクロカラム（Ｉｓｏｌａｂ）ミニバイアル（４ｍｌ）Ｓｃｉｎｔｉｖｅｒｓｅ緩衝液Ａ：５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌＰＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭＥＤＴＡ緩衝液Ｂ：５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌＰＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ２、１ｍＭＥＤＴＡＧＴＰ−γ−ｓ（Ｓｉｇｍａ）酵母Ｓ−３０、調製は下記の通り。３Ｈ−化合物Ｉ（２０ｍＣｉ／ｍｇ）８０００ｍＣｉ／ｍｍｏｌ；０．００４ｍｇ／ｍｌ）微量遠心チューブ中、１００μｌのアッセイ混合液には以下の物質が含まれる：酵母Ｓ−３０１０μｇ、２５μＭＧＴＰ−γ−ｓ（５ｍＭ原液０．５μｌ）、結合に対する競合能を試験する物質の希釈液と、緩衝液Ｂで全量を９８μｌとする。ボルテックスミキサーにかけ、室温で５分間インキュベートする。２μｌの³Ｈ−化合物Ｉ（水で１：２０に希釈）を加える。ボルテックスミキサーにかけ、２０〜３０分間インキュベートする。セファデックスＧ−７５カラムをあらかじめ緩衝液Ａ（２０ｇ／４００ｍｌ）に数時間浸漬した。ミニカラムをＧ−７５で印線（約１．６ｍｌ）まで正確に充填し、２ｍｌの緩衝液Ａで洗浄して沈下させた。培養混合液１００μｌをＧ−７５カラムにのせる（分取しない）。サンプルがゲル床に入ったら（約２０秒）直ちに０．７ｍｌの緩衝液Ａを加え、溶出液をミニバイアルに取り、３ｍｌのＳｃｉｎｔｉｖｅｒｓｅを加えてバイアルをカウントする。サッカロミセスＳ３０抽出物：野生型ＥＦ２を含むサッカロミセス−セレビジエ株を、１ｇ／ｌ中にＢａｃｔｏＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃｔ１０ｇ、ＢａｃｔｏＰｅｐｔｏｎｅ２０ｇ、デキストロース２０ｇおよびアデニン６０ｍｇを含む培地に接種し、３０℃で対数増殖期中期から後期まで振盪しながらインキュベートする（Ａ６００〜２）。細胞を集め、水で２回洗浄する。ペレットは破壊まで無期限に−７０℃で貯蔵することができる。破壊時には、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＣｌｐＨ７．４、１０％（重量／体積）グリセロール、２ｍＭＭｇＣｌ₂、２ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルを含む緩衝液２ｖｏｌに細胞を再度懸濁し、酸洗浄した０．５ｍｍのガラス玉と長時間撹拌することにより破壊する。上清を３０ｇで１５分間遠心分離し、細胞の破片を沈降させる。結果：野生型サッカロミセスからのＳ３０抽出物１０μｇは、約０．５ｐｍｏｌの標識ソルダリン類縁体³Ｈ−化合物Ｉを結合する。これはソルダリンまたはそのより活性な類縁体により３ｎｇ／ｍｌのＩＣ５０で置き換えられる。精製成分による結合アッセイ：このアッセイは、前述のアッセイにおける１０μｇのＳ３０を０．４Ａ２６０ユニットの塩洗浄したＳ．セレビジエリボソームおよび１ｐｍｏｌの精製ＥＦ２に置き換えた、前述と同じ手順を含む。リボソームおよびＥＦ２はいずれも既報の方法により調製する（Ｌ．Ｓｋｏｇｅｒｓｏｎ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ＶｏｌＬＸ，ｐ６７６−６８５）。Ｓ３０結合アッセイと同じく、このアッセイは成分結合薬剤を同定するため、または不明の物質による競合を調べるためのいずれかに用いることができる。結果０．６５ｐｍｏｌの精製したサッカロミセスＥＦ２および４ｐｍｏｌの精製したサッカロミセスリボソームは約０．６ｐｍｏｌの標識化合物を結合し、活性類縁体による置き換えは同程度である（ＩＣ５０３ｎｇ／ｍｌ）。サッカロミセスリボソームをラット肝またはコムギ麦芽のいずれかのリボソームで置き換えても結合は低下しない。しかし、サッカロミセスＥＦ２をこれらのいずれか由来のＥＦ２に置き換えると、結合はバックグラウンドのレベルに抑えられる。実施例３病原体／ホストにおける蛋白合成の測定病原体蛋白合成の特異的阻害物質を同定する別法は、病原体およびホストにおけるＴＣＡで沈殿可能な蛋白への放射性同位元素で標識したアミノ酸の取り込みを測定する方法である。次いで病原体選択性を示す活性の試験サンプルをより特異的なＥＦ２アッセイでさらにスクリーニングする。再構成蛋白合成このアッセイは、再構成されたインビトロ翻訳系におけるポリフェニルアラニン合成阻害に関する。リボソーム、ＥＦ１、ＥＦ２およびＥＦ３をサッカロミセス−セレビジエから精製し、（Ｌ．Ｓｋｏｇｅｒｓｏｎ,ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ＶｏｌＬＸ，ｐ６７６−６８５）に記載のとおりにアッセイを実施する。ソルダリン、その類縁体およびいかなる不明物質もこのアッセイで力価を測定し、阻害に対するＩＣ₅₀値を求める。他の真核細胞系由来のリボソームおよびＥＦ２を、文献に記載のとおりに精製してもよい。ラット肝由来ＥＦ２（Ｊ．Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｆ．ＲａｅｂｕｒｎａｎｄＥ．Ｓ．Ｍａｘｗｅｌｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ：２４６ｐｐ１０４９−１０６４［１９７１］記載のとおりに調製）またはコムギ麦芽由来ＥＦ２（Ｓ．Ｊ．Ｌａｕｅｒ，Ｅ．Ｂｕｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ＩｒｖｉｎａｎｄＪ．Ｍ．Ｒａｖｅｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：ｐｐ１６４４−１６４８［１９８４］記載のとおりに調製）をＳ．セレビジエ系の酵母ＥＦ２の代わりに用いた場合、ソルダリン類の化合物ではその薬物溶解性の限界濃度まで阻害作用は認められなかった。一方、酵母リボソームの代わりにラット肝またはコムギ麦芽リボソームを用いても、ソルダリン類の再構成翻訳系阻害能に影響はない。結果阻害に対するＩＣ₅₀ 実施例４増殖阻害アッセイＩＳ．セレビジエを代用生物として用いて、ソルダリン様活性を有する抗真菌化合物を同定するためのアッセイが開発された。このアッセイは、膜透過性を増大させ、様々な物質の取り込みを容易にする、ｅｒｇ６欠失を含むソルダリン感受性株（ｓＳ１）および耐性株（ｓＲ１）を用いた、分別２プレート阻止域アッセイからなる。このスクリーニングでは、活性化合物は感受性株のプレートで明白な阻止域を示し、耐性株のプレートでは阻止域は現れない。方法１ｍｌあたり約１ｘ１０⁶の細胞を２％寒天を含む増殖培地に加える。培地および細胞を混合し、プレートに流し込み、固化させる。これらの酵母の増殖を阻害するサンプルを同定するために、試験化合物または発酵抽出物をのせる。培養液を３０℃で１６〜２４時間インキュベートする。同様のアッセイを、高処理能力マイクロタイター方式で試験化合物または発酵抽出物を含む液体増殖培地に細胞を接種することにより実施することもできる。個々の培養液の光学密度を測定して求めることができる増殖阻害をアッセイすることにより、活性化合物を同定することができる。結果０．５μｇのソルダリンは感受性株では２０ｍｍの明白な阻止域を示し、耐性株では阻止域は認められない。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Protein elongation factor 2 as a target for antifungal and antiparasitic agents Background of the Invention Elongation factor 2 (EF2) catalyzes ribosome translocation during protein synthesis in eukaryotic cells Is an essential protein. This factor is highly conserved in all eukaryotes and is In vitro proteins reconstituted from different organisms such as wheat malt and fungi It has been shown to be widely compatible in synthetic systems. EF2 is a eukaryotic cell Amino acid sequence is widely found in EF2 from various eukaryotic cell lines. Despite exhibiting a high degree of homology, a class of compounds, namely solderin (sordin) arin) selectively select fungal protein synthesis via selective interaction with fungal EF2 Was observed. This finding can kill invasive organisms On the other hand, pathogen-selective EF2 inhibitors that do not have any detrimental effects on the host The development potential is shown. Prior to the present invention, EF2 was an antifungal or antiparasitic agent. Was not considered a sorting target. Summary of the Invention The present invention relates to elongation factor 2 (hereinafter referred to as "target" for antifungal or antiparasitic drugs). EF2 ”). In particular, the present invention relates to the selection of test compounds against the pathogen EF2. The ability to specifically inhibit pathogen protein synthesis through kinetic interactions? Identify potential antifungal and antiparasitic agents by assessment About the method. The present invention relates to transformation with heterologous EF2 to facilitate drug discovery. For the use of mechanism-based assays with or without recombinant eukaryotic microorganisms I will talk about it. Further, the present invention provides a host having a fungal or parasitic infection with an E. A therapeutically effective amount of a compound that specifically inhibits pathogen protein synthesis via F2. The method of treating a fungal infection. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a genetically engineered sordarin-sensitive strain of yeast (sS1) Rudarin resistant strain (sR1) strain or naturally selected Sordarin resistant strain With antifungal and antiparasitic activity, including fractionated two-plate assays Methods for identification and evaluation of Assay readouts are lower than those of Be And antibacterial activity exhibited by a more pronounced inhibition zone in Sordarin-sensitive strains. Saccharomyces cerevisiae has two EF2 genes, EFT1 and EFT2. There are offspring and survival requires at least one of these genes. Similar genes Both EFT1 and ERG6 genes disrupt the type strains sS1 and sR1 Was constructed by a series of gene crossovers. The resulting strain was erg6 disrupted (Ergo Sterol deficiency), resulting in a higher permeability and a wild-type copy of EFT2. Or EF2 as the only gene for EF2. Known A number of these yeast cells are inoculated on a solid medium or suspended in a liquid medium. Test compounds or fermentation extraction to identify samples that inhibit the growth of these yeasts Add things. Incubate the culture at a specific temperature for a period of time to increase the test organism (I.e., 16-24 hours at 30 ° C). The desired test sample is It shows a differentiating effect on susceptible strains compared to darin-resistant strains. Originally wild Samples that are more potent against the mold must have prevented growth through the EF2 target. No. In another aspect, the invention relates to (a) fungal and parasite pathogens A fungal or protozoan cell that depends on a heterologous EF2 from a host or from a host species (B) exposing the cells to a known dilution of a test compound or natural product extract. Touching, and (c) the minimum inhibition at which the test compound completely inhibits growth in the liquid. Pathogens, including determining the harmful concentration (MIC) or inhibition zone of the solid substrate Methods for identifying compounds that specifically inhibit somatic EF2 function are provided. Targeted testing The compound or fermented extract has a fractional inhibition (ie, a resistant strain of the test organism). (A stronger inhibitory activity against a wild-type strain as compared with). For example, human E More effective in inhibiting the growth of yeast EF2-dependent organisms than F2-dependent organisms Here is a sample. The method of the present invention screens potential antifungal and antiparasitic compounds. Provides a convenient and specific assay for training. The method of the present invention also Test compounds can be evaluated against EF2 targets of parasitic pathogens that cannot be cultured in the laboratory I do. In the present invention, EF2 is purified from pathogenic organisms for use in growth inhibition assays. Can be roaned or used in in vitro binding assays or translation inhibition It can be purified from these pathogens for use in assays. EF2 is Ngida, Aspergillus, Cryptocox, Erysiphe and Puccinia Such as pathogenic fungi of humans, animals or plants. In addition, Such as Smodium, Eimeria, Cryptosporidium and Toxoplasma Obtainable from protozoan parasites as well as humans and other desired host eukaryotic cells it can. Compounds that inhibit EF2 interfere with mRNA translation in the target organism Will. Examples of compounds that inhibit EF2 include diphtheria toxin and fusidic acid Included, but none of them are more specific for the pathogen than the host . Fusidic acid breaks down the normal ribosome-EF2 interaction in many organisms. Breaking will hinder translation. Compounds that inhibit EF2 include compounds and enzymes Is preferably labeled so that the degree of interaction between . A preferred radioisotope label is tritium. The test compound can be a single synthetic compound, a mixture of multiple synthetic compounds, a crude product, Product or the first extract of natural products obtained from plants, microorganisms or animals. No. The antifungal drug sordarin and its analogs are Have been shown to inhibit protein synthesis by inhibiting fungal EF2 function. Have been. Sordarin is a filamentous fungus, Sordaria-araneosa. eosa) is an antifungal antibiotic isolated from British Patent No. 1162027. And Helvetica Chimica Acta, 1971, 51: 119. -20). Other compounds with a sordarin skeleton have also been reported as antifungals I have. Japanese Patent Application Laid-Open No. 62-040292 was isolated from the species Zofiela marina. The disclosed compound zofimarin is disclosed in Discloses a compound BE-31405 isolated from J. Am. A ntibiotics, 1995, 48: 1171-1172. . Semi-synthetic derivatives of sordarin are described in PCT International Application No. WO 96/14326 and No. WO 96/14327. The aglycone, sodalysine, is obtained from sodaline by acid hydrolysis. (Hauser and Sigg, Helvetica Chimica Acta, 1971, 51: 119-20). Similarly, solderaricin methyles Ter is obtained from Sordarin methyl ester. Soldarisin Mechi The total synthesis of the ester is described by Kato et al. Chem. Soc. Chem. Com mun. , 1993, 1002-1004. Methoxymethyl sodarricin methyl ester is also disclosed. 4-Desholmi The diacetate of ru-4-hydroxymethylsodaricin is found in Mander and R obinson, J .; Org. Chem. , 1991, 56 (11): 3395. -3601. Of sodarricin and its reported derivatives None of them have been found to have biological activity. Sordarin analogs of formula I [In the formula R is (a) C (= O) OR¹, (B) C (= O) NR^TwoR^Three, (C) C (= O) R^Four, (D) CH (R^Two) OR^Five, (E) C (R⁶) (R⁷) (R⁸), Or Is; Where R¹²R is not (g) when is CHO; R¹Is (a) C₁~ C₁₄Alkyl, (B) C_Two~ C₁₄Alkenyl, (C) C_Two~ C₁₄Alkynyl, (D) C_Three~ C₂₀Cycloalkyl, (E) aryl or (F) aryl C₁~ C₆Alkyl; R^TwoAnd R^ThreeSeparately (A) H or (B) R¹Is; R^FourIs (a) H, (B) R¹Or (C)-(CH_Two)_mNR^TwoR^ThreeIs; R^FiveIs (a) R¹Or (B)-(CH_Two)_xO (CH_Two)_yH; R⁶Is (a) H, (B) C₁~ C₁₄Alkyl, (C) aryl, (D) aryl C₁~ C₆Alkyl, (E)-(CH_Two)_yCHR₁₁(CH_Two)_zH, (F)-(CH_Two)_yC≡C (CH_Two)_zH, (G)-(CH_Two)_yC (R⁷) = CH (CH_Two)_zH, (H)-(CH_Two)_yC≡C (CH_Two)_mR¹¹, (I)-(CH_Two)_yC (R⁷) = CH (CH_Two)_mR¹¹And R⁷And R⁸Separately (A) H, or (B) C₁~ C₁₄Alkyl; R⁹And R^TenSeparately (A) H, (A) C₁~ C₁₄Alkyl, (A) C_Two~ C₁₄Alkenyl (A) aryl C₁~ C₆Alkyl; R¹¹Is (a) OH or (B) NR^TwoR^ThreeIs; R¹²Is (a) -C (= O) R¹⁴, (B) -CH = NOH, or (C) -CH_TwoOCH_ThreeIs; R¹³Is (a) H, (B) -CH_TwoC₆H_Five, (C) -CH_TwoCH = CH_Two,Or Is; R¹⁴Is (a) H, (B) C₁~ C₁₄Alkyl, (C) -CCl_Three, (D) -CBr_Three, (E) -CH_ThreeOr (F) OH; n is 0 or 1; m is 1-6; x is 2-6; y is 0-6; z is 0-6. ] Or a pharmaceutical or agriculturally acceptable salt thereof, dated October 7, 1996 No. 60/026993, filed in US Patent Application Ser. Other solderin analogs No. 60/026580 filed Sep. 18, 1996. It has been disclosed. EF2 inhibitors are useful as antifungal and antiparasitic agents. By itself, It can be used for the treatment and prevention of mycosis and parasitosis in humans, animals and plants it can. Mycosis that can use EF2 inhibitors and their causative pathogens Examples include: 1) Erys causing infections in plants and crops. ife, Puccinia, Septoria, Botrytis, phyt opthora, Plasmopora and other fungi, 2) human and Candida, Aspergillus, Cryptocox, which cause fungal infections in animals Fusarium, penicillium and other fungi, 3) plastics that infect humans and animals Smodium, Eimeria, Toxoplasma, Neospora, Cryptosporidium And other protozoa. In other embodiments, the present invention provides EF to a host suffering from a fungal or parasitic infection. (B) administering a therapeutically effective amount of a compound that inhibits function; Methods for treating live insect infections are provided. A therapeutically effective amount is defined as the number of Or parasitic The amount may be sufficient to inhibit insect protein synthesis. EF2 inhibitors are similar to those used for other antifungal and antiparasitic agents. In a manner, it can be administered to a host in need of treatment. For example, parenteral, oral, local Can be administered locally or rectally. The dose to be administered depends on the type of compound used, Infected organism, specific host, disease severity, host physical condition, and selected Depends on the route. Appropriate dosages can be readily determined by one skilled in the art. it can. In the treatment of mycoses and parasites in humans and animals, the dose is 0.0 May fluctuate from 1 mg / kg to 500 mg / kg. For humans and animals For prophylactic use in dosages from 0.01 mg / kg to 100 mg / kg Range. The composition of the present invention comprises an EF2 inhibitor and an inert carrier. This composition is human And in the form of a pharmaceutical composition for veterinary use, or of a feed composition. It may be in a form. The term "composition" refers to one or more active ingredients, and a carrier. A product comprising one or more inert ingredients, and a combination of two or more ingredients From complex formation or aggregation, or from dissociation of one or more components, or From other types of reactions of one or more components, It is to be construed to include any product that occurs directly or indirectly. Set of the present invention The resulting product is a set obtained by mixing an EF2 inhibitor and an inert carrier. Including adult products. The pharmaceutical composition of the present invention contains an EF2 inhibitor as an active ingredient, It may contain a pharmaceutically acceptable carrier and optionally other therapeutic ingredients. composition Objects are oral, rectal, topical, and parenteral (including subcutaneous, intramuscular, and intravenous) While containing compositions suitable for administration, the optimal route in any given case will be And the nature and severity of the condition to which the active ingredient is administered Become. Pharmaceutical compositions may be conveniently presented in unit dosage form, Can be prepared by any of the well-known methods. In actual use, the EF2 inhibitor may be used in a pharmaceutical It can be combined as the active ingredient in intimate mixing with a carrier. Carrier For example, for oral or parenteral (including intravenous) administration. It can take various forms. In preparing the compositions for oral dosage form, any conventional pharmaceutical media will be employed. You may. For example, suspensions, elixirs and Water, glycols, oils, alcohols, Perfumes, preservatives, coloring agents and the like can be used. Or powder, capsule And oral solid preparations such as tablets, starches, sugars, microcrystalline cellulose, Carriers such as excipients, granulating agents, lubricants, binders, and disintegrants may be included. Volume of administration Due to its ease, tablets and capsules are in this case the most beneficial oral dosage unit form Thus, solid pharmaceutical carriers are obviously employed. If desired, pill tablets into standard water It may be coated by an aqueous or non-aqueous method. In addition to the common dosage forms described above, EF 2 Inhibitors can also be administered by controlled release means and / or delivery devices . Pharmaceutical compositions of the invention suitable for oral administration are each predetermined Amount of active ingredient in powder or granule, or aqueous, non-aqueous solution or suspension, water Capsules, cachets or as a medium-oil or water-in-oil emulsion It can be provided in individual units such as tablets. Such a composition may be any pharmaceutical It can also be prepared by methods, but all methods involve the addition of one or more active ingredients. Including the step of bringing into association with a carrier constituting a plurality of essential components. Generally, the composition is active Components as liquid carrier Or intimately and intimately with the finely divided solid carrier or both, and then If necessary, it is prepared by molding the product to the desired appearance. For example, tablets May be prepared by compression or molding, optionally with one or more accessory ingredients. it can. Compressed tablets are free-flowing forms, such as powders or granules, in a suitable machine. Active ingredients in the form of binders, lubricants, inert diluents, surfactants or dispersants. It can be prepared by gently mixing and compressing. Molded tablets are inert in a suitable machine Can be made by molding a mixture of powdered compounds moistened with a neutral diluent. Wear. Desirably, each tablet contains from about 1 mg to about 500 mg of the active ingredient. Chews or capsules contain from about 1 to about 500 mg of the active ingredient. Pharmaceutical compositions of the present invention suitable for parenteral administration include those active ingredients which are An aqueous solution or suspension suitably mixed with a surfactant such as propylcellulose Can be prepared as Dispersant is glycerol, liquid polyethylene glyco And mixtures thereof in oils. Normal storage and Under the conditions of use, these preparations contain a preservative to prevent the growth of microorganisms. Pharmaceutical forms suitable for injection include sterile aqueous solutions or dispersions and sterile aqueous solutions for injection. It includes sterile powders for the extemporaneous preparation of solutions or dispersants. In all cases, this medicine The form must be sterile and must be fluid to the extent that easy syringability exists. No. It must be stable under the conditions of manufacture and storage and must not be restricted to bacteria and fungi. Must be protected against the contaminating action of microorganisms. The carrier is, for example, water, Ethanol, polyol (eg glycerol, propylene glycol and liquid Polyethylene glycol), suitable mixtures thereof, and solvents containing vegetable oils Or it may be a dispersion medium. Suitable topical preparations include transdermal devices, aerosols, creams, ointments, lotions , Spraying agents and the like. These preparations are prepared by the usual methods containing the active ingredient. Can be manufactured. As an example, a cream or ointment should have a sufficient amount of hydrophilic A cream or ointment of desired softness, containing about 5 to 10% by weight of the compound. It is prepared by mixing a sufficient amount of water to make. Pharmaceutical compositions suitable for rectal administration wherein the carrier is a solid are provided as unit dose suppositories. Most preferably, it is provided. On a suitable carrier Contains cocoa butter and other substances commonly used in the art; After mixing and mixing with the liquefied or molten carrier, It can be conveniently made. In addition to the aforementioned carrier components, the aforementioned pharmaceutical compositions may also contain diluents, buffers, flavoring agents, Includes mixture, surfactant, thickener, lubricant, preservative (including antioxidant) as appropriate Substances that may make the product isotonic with the blood of the intended recipient It is to be understood that may be included. Compositions comprising a compound of Formula I may also be prepared in powder or concentrate form. Wear. Follow standard veterinary formulation practices to improve the physical properties of the powder Conventional water-soluble additives such as lactose or sucrose can also be mixed. Accordingly Thus, a particularly suitable powder of the invention is 50 to 100% by weight, preferably 60 to 80%. % Of the combination with 0 to 50%, preferably 20 to 40% by weight of the usual Veterinary additives. These powders are premixed in animal feed, for example in the middle. It may be added by combining or diluted in animal drinking water. The concentrate of the present invention optionally contains a combination of water-soluble compounds and is veterinarily acceptable. Water miscible solvents such as polyethylene glycol Propylene glycol, glycerol, glycerol formal, or And optionally up to 30% by volume of a mixture of solvents such as This concentrate can be administered to drinking water of animals, especially poultry. Example The following examples are provided to illustrate, but not limit, the present invention. . Assays may be performed in 96-well or other appropriately sized plates, or in an appropriate liquid It can be performed in a medium. Preparation of substances used in the examples Compound I of the following formula is a sordarin analog. The preparation of Compound I is described in US patent application Ser. No. 60/02, filed Oct. 7, 1996. No. 6993. Construction of yeast strains Yeast strain YEFD lacking both chromosomal copies of the gene encoding EF2 12h / pURA3-EFT1 was obtained from the James Bodley laboratory (Phan et al., Journal of Biological Chemis try (1993), 268: 8665-8668). This strain encodes EF2 It also contains an episomal copy of the gene to be mutated and is essential for cell survival. Target The yeast strain expressing the EF2 gene derived from the pathogen to be used is (1) a heterologous EF2 gene. YEFD12h / pURA3-EF with yeast expression plasmid containing doping gene Transformation of T1 and (2) removal of plasmid containing cell-derived native EF2 gene Can be constructed by This can be used in the growth inhibition assays described below. Wear. Example 1 Competitive binding assays Competition assays were performed on Saccharomyces cerevisiae EF2 in S30 crude extract. Join^ThreeH-Radioisotope labeling with specificity for pathogen EF2 such as compound I Can be carried out by substituting the compound described above. Detected in the S30 binding assay Purification in the presence of washed ribosomes to demonstrate the specificity of the inhibitor Binding competition can also be performed using EF2. ^ThreeSpecific binding of H-Compound I was observed in Saccharomyces S30 extract, The presence of somes as well as EF2 is required. Binding is unlabeled L-793,422 , Solderin and analogs. Mammalian cells or wheat No binding is observed in the bud S30 extract. Yeast ribosome for rat or wheat Replacement with malt has no effect on binding, whereas yeast EF2 is Since it does not bind when replaced with malt EF2,^ThreeH-L793,422 Yeast The specificity for the mother is due to the EF2 molecule. material: Sephadex G-75 (G-75-120) Mini column: GS-QS quick-sep Micro column (Isolab) Mini vial (4ml) Scintiverse Buffer A: 50 mM Tris-HCl PH7.5, 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA Buffer B: 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA GTP-γ-s (Sigma) Yeast S-30, preparation is as follows. 3H-Compound I (20 mCi / mg) 8000 mCi / mmol; 0.004 m g / ml) In a microcentrifuge tube, 100 μl of the assay mixture contains: : 10 μg of yeast S-30, 25 μM GTP-γ-s (0.5 μl of 5 mM stock solution) A total of 98 μl of the diluted solution of the substance to be tested for the ability to compete for binding and the buffer B was used. I do. Vortex mixer and incubate for 5 minutes at room temperature. 2 μl of^ThreeH-Compound I (diluted 1:20 with water) is added. Vortex mixer And incubate for 20-30 minutes. Sepadex G-75 column was previously buffered A (20 g / 400 ml) For several hours. Fill the mini column with G-75 exactly to the marked line (approximately 1.6 ml). And washed with 2 ml of Buffer A to settle. Load 100 μl of the culture mixture onto a G-75 column (do not fractionate). Sample is Immediately after entering the gel bed (about 20 seconds) ml of Buffer A, add the eluate to a mini vial, and add 3 ml of Scintiv Add erse and count vials. Saccharomyces S30 extract: Saccharomyces cerevisiae containing wild-type EF2 D. Bacto Yeast Extract 10 g / Ba in 1 g / l cto Peptone 20g, dextrose 20g and adenine 60m g of medium and incubate at 30 ° C with shaking from mid- to late-log phase. Cuvate (A600-2). The cells are collected and washed twice with water. Pellets It can be stored at -70 ° C indefinitely until destruction. At the time of destruction, 50 mM T ris-Cl pH 7.4, 10% (weight / volume) glycerol, 2 mM Mg Cl_Two2 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride The cells were resuspended in 2 vol of a buffer solution containing Break down by stirring for hours. The supernatant was centrifuged at 30 g for 15 minutes, Settle the debris. result: 10 μg of S30 extract from wild-type Saccharomyces has approximately 0.5 pmol of label Sordarin analog^ThreeH-binds compound I. This is solderin or more 3 ng / ml depending on the active analog IC50. Binding assay with purified components: This assay replaces 10 μg of S30 in the aforementioned assay with 0.4 A26. 0 units of salt washed S. Cerevisiae ribosome and 1 pmol of purified EF 2 including the same procedure as described above. Both ribosome and EF2 are already (L. Skogerson, Methods in E) nzymology, Vol LX, p676-685). Like the S30 binding assay, this assay identifies component binding agents, Alternatively, it can be used to check for competition by unknown substances. result 0.65 pmol of purified Saccharomyces EF2 and 4 pmol of purified Saccharomyces ribosome binds about 0.6 pmol of labeled compound and Displacement by the analog is comparable (IC50 3 ng / ml). Saccharomyce Replace sribosomes with ribosomes from either rat liver or wheat malt Nor does the binding decrease. However, Saccharomyces EF2 was derived from any of these If you replace it with EF2, It is suppressed to the level of the round. Example 3 Measurement of protein synthesis in pathogen / host Another way to identify specific inhibitors of pathogen protein synthesis is to treat pathogens and hosts. Of radioisotope-labeled amino acids into proteins that can be precipitated with TCA in aqueous solution Is a method of measuring Next, test samples with activity showing pathogen selectivity are Screen further with a different EF2 assay. Reconstituted protein synthesis This assay is based on polyphenylalanine in a reconstituted in vitro translation system. On synthesis inhibition. Ribosomes, EF1, EF2 and EF3 Purified from S. cerevisiae and purified from (L. Skogerson, Methods in Enzymology, Vol LX, p676-685). Perform the assay. Sordarin, its analogs and any unknowns are The titer is determined by assay and the IC for inhibition₅₀Find the value. From other eukaryotic cell lines Ribosomes and EF2 may be purified as described in the literature. Rat liver EF2 (JF Collins, F. Raeburn and ES. Maxwell. J. Biol. Chem: 246 pp 1049-1064 [ 1971] or wheat malt-derived EF2 (SJ Lau). er, E .; Burks, J .; D. Irvin and J.M. M. Ravel. J . Biol. Chem. 259: pp1644-1648 [1984] Prepared in the cage). When used in place of S. cerevisiae yeast EF2, No inhibitory action was observed for the compounds of the quinone class up to the limit concentration of drug solubility. On the other hand, using rat liver or wheat malt ribosome instead of yeast ribosome Also does not affect the ability of the soldarins to inhibit the reconstituted translation system. result IC for inhibition₅₀ Example 4 Growth inhibition assay I S. Using S. cerevisiae as a surrogate organism, sordarin-like activity Assays have been developed to identify antifungal compounds having This assay Includes erg6 deletion, which increases membrane permeability and facilitates uptake of various substances Separation using a suldarin-sensitive strain (sS1) and a resistant strain (sR1) Consists of a plate inhibition zone assay. In this screen, the active compound is a sensitive strain Plate shows a clear zone of inhibition, whereas the plate of the resistant strain does not. Method About 1x10 per ml⁶Of cells to growth medium containing 2% agar. Medium And cells are mixed, poured into plates and allowed to solidify. Inhibit the growth of these yeasts The test compound or fermented extract is loaded to identify the offending sample. culture The solution is incubated at 30 ° C. for 16-24 hours. Similar assays with high throughput In a liquid microtiter system, the test compound or fermentation extract can be applied to liquid growth media. It can also be carried out by inoculating vesicles. Measure optical density of individual cultures Active compounds identified by assaying growth inhibition can do. result 0.5 μg of sordarin shows a clear inhibition zone of 20 mm in sensitive strains, No stop zone is observed in the strain.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/395 Ｃ０７Ｋ 14/395 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 15/09 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/569 Ａ 33/569 (Ｃ１２Ｎ 1/19 //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865）Ｃ１２Ｒ 1:865）Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ジヤステイス，マイクル・シーアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者シユマツツ，デニス・エムアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者シユウ，ミン−ジヨアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者クー，テリーザ・ダブリユアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI Theme coat ゛ (Reference) C07K 14/395 C07K 14/395 C12N 1/19 C12N 1/19 15/09 G01N 33/15 Z G01N 33 / 15 33/569 A 33/569 (C12N 1/19 // (C12N 1/19 C12R 1: 865) C12R 1: 865) C12N 15/00 A (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ) , T M), AL, AM, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CN, CU, CZ, EE, GE, GW, HU, ID, IL, IS, JP, KG, KR, KZ, LC, LK, LR, LT, LV, MD, MG, MK, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, RU, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA U.S.A., US, UZ, VN, YU (72) Inventor Justice, Mikle Sea United States, New Jersey 07065, Lowway, East Lincoln Avenue 126 (72) Inventor Shumatsu, Dennis M. United States, New United States Jersey 07065, Lowway, East Lincoln Avenue 126 (72) Inventor Shiyu, Min-Jiyo United States, New Jersey 07065, Lowway, East Lincoln Avenue 126 (72) Inventor Ku, Teresa Daville, New Jersey 07065, United States, Lowway, East Lincoln Avenue 126

Claims

[Claims] 1. Impairing fungal or parasite elongation factor 2 (EF2) function Alternatively, a method of identifying a compound that selectively inhibits parasite protein synthesis. 2. EF2 as a specific target for antifungal and antiparasitic agents. 3. (A) Genes capable of detecting pathogen-selective effects on EF2 function Adding a compound to the child-operated eukaryote; (B) whether the compound inhibits protein synthesis by assaying for growth inhibition; Determining a compound that inhibits EF2. 4. (A) Fungal cells expressing heterologous EF2 from fungal and parasite pathogens Or constructing a protozoan cell; (B) Inoculating cells into a liquid or solid growth medium containing test compound or fermentation extract To do (C) the minimum inhibitory concentration (MIC) at which the test compound completely inhibits growth in liquid or Determining the stopband measurement on the solid substrate; A method for identifying a compound that selectively inhibits EF2, comprising: 5. Cells are inoculated into solid growth medium and the MIC of the test compound is determined by the inhibition zone on the solid substrate 5. The method of claim 4, wherein the method is a measured value. 6. Cells are inoculated into liquid growth medium and the MIC of the test compound is completely inhibited from growing in the liquid. 5. The method of claim 4, which is a harm measurement. 7. (A) culturing a known dilution of the cells on a suitable medium; (B) contacting the cells with a known dilution of a test compound or natural product extract Stages and (C) incubating the cells at about 30 ° C. for about 16 to 24 hours; (D) Growth specific to loss of EF2 function by test compound or natural product extract Quantifying the percent inhibition. 8. Saccharomyces wherein the eukaryote is deleted or mutated for EF2 4. The method according to claim 3, which is cerevisiae. 9. A modified Saccharomyces cerevisiae cell in which cells express heterologous EF2 Vesicles. 10. (A) Labeling of EF2 or an extract containing EF2 that interacts with EF2 Contacting with a known amount of the compound; (B) converting the EF2 or the extract to a known test compound or natural product extract Contacting with a diluent; (C) quantifying the percent interaction inhibition of the labeled compound from the test compound Identifying a compound having antifungal activity. 11. Inhibition of interaction of the labeled compound derived from the test compound with host EF2 11. The method of claim 10, further comprising quantifying the percentage. 12. Therapeutically or prophylactically effective compounds that inhibit fungal EF2 function in the host A method of treating or preventing mycosis, comprising administering an appropriate amount. 13. Therapeutic or prophylactic of compounds that inhibit EF2 function of parasites in the host A method for treating or preventing parasitosis, comprising administering an effective amount. 14． The mycosis is Candida, Aspergillus, Cryptococcus Claims, caused by ox, fusarium, penicillium or dermatophytes Item 13. The method according to Item 12. 15. The parasitic disease is Plasmodium, Eimeria, Isospora, Neospora LA, Toxoplasma, Cryptosporidium, Trypanosoma, Leishmania 14. The method according to claim 13, wherein the disease is caused by Tyrelia. 16. Said compound impairs fungal EF2 function significantly more than host EF2 function, The method according to claim 12. 17． The compound impairs parasite EF2 function significantly more than host EF2 function 14. The method according to claim 13. 18. Presence of an inert carrier and a compound that selectively impairs fungal or parasite EF2 function An effective amount of a composition useful for the prevention or treatment of mycosis. 19. Said compound that selectively impairs fungal or parasite EF2 function is soldalin 19. The composition according to claim 18, which is: