JP2002511851A - Use of recombinant oligonucleobases in vivo to correct hepatocyte genetic lesions in vivo - Google Patents

Use of recombinant oligonucleobases in vivo to correct hepatocyte genetic lesions in vivo

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JP2002511851A JP54742998A JP54742998A JP2002511851A JP 2002511851 A JP2002511851 A JP 2002511851A JP 54742998 A JP54742998 A JP 54742998A JP 54742998 A JP54742998 A JP 54742998A JP 2002511851 A JP2002511851 A JP 2002511851A
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スティア，クリフォード，ジェイ．
クレン，ベッツィー，ティー．
バンディオパディアイ，パラミタ，ティー．
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リージェンツ オブ ジ ユニバーシティー オブ ミネソタ
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Abstract

(57)【要約】 この発明は、動物の細胞の内因性遺伝子中の特異的な遺伝子変化の導入のための組成物と方法に関する。遺伝子変化は、一般的に長さが約100ヌクレオチド未満であるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド誘導体および類似体により行われる。この発明は、クラスリン被覆ピット受容体のリガンドを随時取り込んだ巨大分子担体を提供する。ある実施形態において、リガンドは乳糖またはガラクトースであり、遺伝子変化は肝細胞で行われる。この発明の方法により、標的遺伝子のコピーの最大40％がin vitroで変化する。クリグラー-ナジャー様表現型と血友病Ｂ表現型を有する突然変異遺伝子の修復が観察された。   (57) [Summary] The present invention relates to compositions and methods for introducing specific genetic alterations in endogenous genes of animal cells. Genetic alterations are generally made with oligonucleotides or oligonucleotide derivatives and analogs that are less than about 100 nucleotides in length. The present invention provides a macromolecular carrier that optionally incorporates a clathrin-coated pit receptor ligand. In certain embodiments, the ligand is lactose or galactose and the genetic change is made in hepatocytes. With the method of the invention, up to 40% of the copies of the target gene are changed in vitro. Repair of mutant genes with a Crigler-Naja-like phenotype and a hemophilia B phenotype was observed.

Description

【発明の詳細な説明】 肝細胞の遺伝的病変を修正するための リコンビナジェニックオリゴヌクレオ塩基のin vivoでの使用 本出願は、1997年４月30日に出願された米国特許出願第60/045,288号、1997年 ８月５日に出願された米国特許出願第60/054,837号、1997年11月10日に出願され た米国特許出願第60/064,996号（これらはそれぞれその全体を参照することによ り本明細書の一部とする）の優先権の利益を主張する。 １．発明の分野 本発明は、遺伝的欠陥を引き起こす疾患を修正するためのin vivoにおけるリ コンビナジェニックオリゴヌクレオ塩基(recombinagenic oligonucleobase)を使 用するための方法と組成物に関する。本発明は特に、被験体の肝細胞中の遺伝的 欠陥の修正により疾患が改善される種類の遺伝的欠陥の治療に適している。 ２．発明の背景 2.1 培養細胞の遺伝的変化を引き起こすキメラ突然変異ベクターの使用 この節に刊行物または特許出願を含めることは、その刊行物またはその出願の 発明（たとえあったとしても）が、本発明以前に存在したかまたは本発明者以外 の者の考えから得られたものであることを、決して容認するものではない。 リコンビナジェニックオリゴヌクレオ塩基の公表された実施例は、2-O-修飾リ ボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両者を含有するため、キメラ 突然変異ベクター（Chimeric Mutational Vectors）(CMV)またはキメラプラスト と呼ばれる。 相補的なデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを有し、バクテリ オファージMl3mp19の断片に相同な配列を含有するオリゴヌクレオチドは、Kmiec ，E．B.,ら、November 1994，Mol．and Cell．Biol．14，7163-7172に記載され ている。このオリゴヌクレオチドはリボヌクレオチドの単一の連続セグメントを 有 していた。Kmiecらによって、このオリゴヌクレオチドが、Ustilago maydisから のREC2相同的対合酵素の基質であることが判明した。 1995年６月15日に公開された特許公報WO95/15972およびその対応する米国特許 第5,565,350号（'350特許）には、真核生物細胞中に遺伝的変化を導入するため の２本鎖CMVが記載されている。Ustilago maydis遺伝子およびマウスras遺伝子 における例が報告されている。後者の例は、NIH 3T3細胞中のras遺伝子の突然変 異が成立すれば細胞コロニーの増殖が引き起こされる（「形質転換」）ように、 ras遺伝子中に形質転換性突然変異を導入するように設計された。'350特許には 、NIH 3T3の形質転換の最大速度は0.1％未満（すなわち、ras２本鎖CMVに暴露さ れた106細胞あたり約100形質転換体）であると報告されている。Ustilago maydi s系では、形質転換率は106あたり約600であった。ヒトbcl-2遺伝子に突然変異を 導入するように設計したキメラベクターは、Kmiec，E．B.，February 1996，Sem inars in Oncology 23，188中に記載されている。 K-rasのコドン12の突然変異を修復するように設計された２本鎖CMVは、Kmiec ，E．B.，December 1995，Advanced Drug Delivery Reviews 17，333-40に記載 されている。２本鎖CMVを、ヒト膵臓腺癌から誘導された細胞系であるCapan 2細 胞で試験し、LIPOFECTIN（登録商標）を使用して２本鎖CMVをCapan 2細胞へ導入 した。２本鎖CMV導入の24時間後、細胞を採取しゲノムDNAを抽出した；K-rasの コドン12を含有する断片をPCRにより増幅し、対立遺伝子特異的プローブとハイ ブリダイズさせて変換率を推定した。 肝臓／骨／腎臓型のアルカリ性ホスファターゼをコードする遺伝子中の突然変 異を修復するように設計した２本鎖CMVは、Yoon，K.ら、March 1996、Proc．Nat l．Acad．Sci．93，2071に報告されている。アルカリ性ホスファターゼ遺伝子は 、一時的にプラスミドによりCHO細胞中に導入した。６時間後２本鎖CMVを導入し た。２本鎖CMV導入の24時間後プラスミドを回収し、分析した。結果より、アル カリ性ホスファターゼ遺伝子の約30〜38％が２本鎖CMVにより修復されることが 示された。 E．B．Kmiec，A．Cole-StraussとK．YoonによるWO97/41411、および文献Cole- Strauss，A.ら、Sept 1996，Science 273，1386は、造血細胞の遺伝的疾 患（例えば、鎌状赤血球症、サラセミア、およびゴーシェ病）の治療に使用され る２本鎖CMVを開示している。E．B．KmiecのWO97/48714およびその対応する米国 特許第5,731,181号には、部位特異的突然変異誘発に使用される非天然のヌクレ オチドを有する２本鎖CMVが記載されている。Kmiecとその共同研究者のいくつか の出願と文献に記載されている２本鎖CMVは、DNA：DNAホモ２本鎖の中心セグメ ントおよびRNA：DNAヘテロ２本鎖または2'-OMe-RNA：DNAヘテロ２本鎖のフラン キングセグメントを含有する。Krenら、1997，Hepatology 25，1462-1468には、 非複製性初代肝細胞でのCMVの使用の成功が報告されている。Krenら、March 199 8，Nature Medicine 4，285には、ラットの血液凝固第IX因子をコードする遺伝 子中に遺伝的欠陥を導入するためのin vivoでのCMVの使用が報告されている。 Kmiecとその共同研究者の研究は、CMVに暴露された時に分裂活性な細胞（すな わち、増殖性細胞）に関する。Kmiecとその共同研究者は、あらかじめ形成して おいたリポソームまたは脂質小胞をCMVと混合したCMV／リポソーム巨大分子担体 複合体を使用した。このような複合体では、CMVはリポソームの表面に接着する と考えられる。 2.2 in vivoおよびin vitroトランスフェクションのためのポリエチレンイミン 巨大分子担体の使用 分岐鎖ポリエチレンイミンは、in vivoとin vitroの両方で真核生物細胞に核 酸を導入するための担体として使用されている。Boussif，O.ら、1995，Proc．N atl．Acad．Sci．92，7297;Abdallah，B.ら、1996，Human Gene Therapy 7，194 7，Boletta，A.ら、1997，8，1243-1251.培養したHepG2肝細胞癌細胞系にDNAを 導入するためのガラクトシル化ポリエチレンイミンのin vitroでの使用は、Zant aら、October 1，1997，Bioconjugate Chemistry 8，839-844により報告されて いる。タンパク質リガンドであるトランスフェリンのポリエチレンイミンへの結 合およびトランスフェリン受容体を使用して培養細胞に試験遺伝子を導入するた めのその使用は、Kircheis，R.ら、1997，Gene Therapy 4，409-4-18に記載され ている。分岐鎖ポリエチレンイミンは、広範囲のpKを有する第二級および 第三級アミノ基を含有し、従ってこれらのポリエチレンイミンは、ポリリシンが ほとんどまたは全く緩衝化能力を示さないｐＨ（すなわち、約８未満）で実質的 な緩衝化能力を有する。Tang，M．K.，& Szoka，F．C.，1997，Gene Therapy 4 ，823-832。 遺伝子をトランスフェクトするための直鎖ポリエチレンイミンのin vivoおよ びin vitroでの使用の成功は、Ferrari，S.ら、1997，Gene Therapy 4，1100-11 06に報告されている。 2.3 in vivoトランスフェクションのためのリポソーム担体の使用 外来タンパク質をコードするDNAを細胞に導入するためのリポソームまたは脂 質小胞の使用は記載されている。カプセル化DNA法は公知であるが、最も頻繁に 使用される方法では、DNAをカプセル化するのではなく、DNAを陽性に荷電したリ ポソームの表面に接着させる。米国特許第4,235,871号および4,394,448号が関係 する。この分野は、Smith，J．G.ら、1993，Biochim．Biophy．Acta 1154，327- 340およびStaubinger，R．M.ら、1987，Methods in Enzymology 185，512による 総説がある。in vivoで肝細胞をトランスフェクトするためのリポソーム中でのD OTAP（陽イオン性脂質）の使用が、Fabrega，A．J.ら、1996，Transplantation 62，1866-1871に記載されている。成体マウスの種々の細胞をトランスフェクト するための陽イオン性脂質含有リポソームの使用は、Zhu，N．ら、1993，Scienc e261，209に記載されている。トランスフェクション用のDNAをカプセル化するリ ポソームを形成するためのホスファチジルセリン含有脂質の使用は、Fraley，R. ら、1981，Biochemistry 20，6978-87に記載されている。 2.4 肝細胞特異的トランスフェクションのためのアシアロ糖タンパク質受容体 の使用 米国特許第5,166,320号と5,635,383号は、DNA、ポリ陽イオン性巨大分子担体 およびアシアロ糖タンパク質受容体用のリガンドからなる複合体を形成すること による、肝細胞のトランスフェクションを開示している。ある実施形態において 、巨大分子担体はポリリシンであった。in vivoで肝細胞をトランスフェクトす る ためのラクトシルセレブロシド含有リポソームの使用は、Nandi，P．K.ら、1986 ，J．Biol．Chem．261，16722-16722に記載されている。リポータープラスミド で肝細胞をトランスフェクトするためのアシアロフェチュイン標識リポソームの 使用は、Haraら、1995，Gene Therapy 2，764-788に記載されている。 ３．発明の要約 本発明は、リコンビナジェニックオリゴヌクレオ塩基を含む組成物と、被験個 体の細胞のDNA中に特定の遺伝的変化を導入する（「トランス突然変異(transmut ation)」と呼ばれるプロセス）ためのその使用方法に関する。リコンビナジェニ ックオリゴヌクレオ塩基は、トランス突然変異の標的である遺伝子の配列の60塩 基未満を含有するヌクレオ塩基ポリマーである。本発明は、公知のまたは開発す べき任意のリコンビナジェニックオリゴヌクレオ塩基とともに使用することがで きる。ある実施形態において、リコンビナジェニックヌクレオ塩基はキメラ突然 変異ベクター（CMV）であり、CMVを使用してトランス突然変異を行うプロセスは 「キメラプラスティ（Chimeraplasty）」と呼ばれる。そのような従来の組成物 および方法に対して、本発明の組成物と方法は、in vivoで遺伝的変化を起こさ せるために被験個体に投与することができる。本発明は、非増殖性（すなわち非 分裂性）細胞をトランス突然変異させるのにCMVが有効であるという予想外の発 見に一部基づく。本発明はさらに、クラスリン被覆ピット（clathrin-coated pi ts）を介してエンドソーム中に取り込まれる細胞表面受容体のリガンドに結合す る巨大分子担体と複合体を形成したCMVが、キメラプラスティに適している（「 クラスリン被覆ピット受容体」）という予想外の発見に依存する。 具体的な実施形態において本発明は、CMVと、CMVを含有する直径25nm〜400nm の水性コア脂質小胞；CMVの親油性塩を含有する脂質コアを含有する直径25nm〜4 00nmの脂質ナノスフィア；およびCMVのポリ陽イオン性塩よりなる群から選択さ れる巨大分子担体とを含む組成物を提供する。そのような塩のポリ陽イオンの例 には、ポリエチレンイミン、ポリリシンおよびヒストンＨ１がある。ある実施形 態においてポリ陽イオンは、500ダルトンより大きく1.3Md未満の質量平均分子量 を有する分岐鎖ポリエチレンイミン（PEI）塩である。 担体は、クラスリン被覆ピットを介してエンドソーム中に取り込まれる細胞受 容体のリガンドで任意に置換することができる。ある実施形態において、リガン ドはラクトシル部分であり、受容体は肝細胞のアシアロ糖タンパク質受容体であ る。他の受容体には、トランスフェリン、インスリン、グルカゴン、EGFおよび 低密度リポタンパク質（LDL）の受容体があり、リガンドは、受容体に結合する 天然のリガンドの断片でもよい。あるいはリガンドは（天然に存在するリガンド またはそうでないリガンドについても）、受容体に特異的に結合する任意の化合 物である。被験個体に投与する場合には、CMV／巨大分子担体／リガンドの組成 物は、緩衝化食塩水のような製薬上許容される水性担体をさらに含む。細胞培養 物に投与する場合には、該組成物は、細胞培養培地（これは血清を補足してもよ い）をさらに含む。 本発明のさらなる実施形態は、疾患を引き起こす遺伝的症状を有するヒト被験 者への上記複合体の投与を含む。複合体は非経口的に投与されるか、または好適 な実施形態では複合体は、疾患を引き起こす遺伝的症状に冒された臓器に直接投 与される。さらなる実施形態において本発明は、被験個体および細胞培養物中で のキメラプラスティのためのCMV／巨大分子担体／リガンド複合体の使用を含む 。 ４．定義 本発明は以下の定義に従って理解すべきである。 オリゴヌクレオ塩基はヌクレオ塩基のポリマーであり、このポリマーはワトソ ン-クリック塩基対合により、相補的配列を有するDNAにハイブリダイズすること ができる。 ヌクレオ塩基は塩基を含み、これは、プリン、ピリミジン、またはその誘導体 もしくは類似体である。ヌクレオ塩基はペプチドヌクレオ塩基、ペプチド核酸の サブユニット、およびモルホリンヌクレオ塩基ならびにヌクレオシドおよびヌク レオチドを含む。ヌクレオシドは、ペントースフラノシル部分を含有するヌクレ オ塩基であり、例えば任意に置換されたリボシドまたは2'-デオキシリボシドを 含む。ヌクレオシドは、いくつかの結合部分の１つにより結合することができ、 これはリンを含有してもしなくてもよい。非置換ホスホジエステル結合により結 合されるヌクレオシドは、ヌクレオチドと呼ぶ。オリゴヌクレオ塩基鎖は１つの5'末端と3'末端を有し、これらはポリマーの終 極ヌクレオ塩基である。特定のオリゴヌクレオ塩基鎖は、すべてのタイプのヌク レオ塩基を含有することができる。オリゴヌクレオ塩基化合物は、相補的であリ かつワトソン−クリック塩基対合によりハイブリダイズされる１つまたはそれ以 上のオリゴヌクレオ塩基鎖を含む化合物である。ヌクレオ塩基はデオキシリボ型 またはリボ型である。リボ型ヌクレオ塩基は、２’炭素がヒドロキシル、アルキ ルオキシまたはハロゲンにより置換されたメチレンであるヌクレオ塩基を含有す るペントースフラノシルである。デオキシリボ型のヌクレオ塩基は、リボ型ヌク レオ塩基以外のヌクレオ塩基であり、ペントースフラノシル部分を含有しないす べてのヌクレオ塩基を含む。 オリゴヌクレオ塩基ストランドは一般に、オリゴヌクレオ塩基鎖およびオリゴ ヌクレオ塩基鎖のセグメントまたは領域を含む。オリゴヌクレオ塩基ストランド は3'末端および5'末端を有する。オリゴヌクレオ塩基ストランドが鎖と同時伸長 性である時、ストランドの3'末端と5'末端はまた鎖の3'末端と5'末端である。 領域はオリゴヌクレオ塩基の一部であり、その配列はある特定の供給源（例え ば、ヒトβ−グロビン遺伝子の断片の配列を有する少なくとも15ヌクレオチドの 領域を有するCMV）から誘導される。セグメントは、ある特徴的な構造を有するC MVの部分である。所定のセグメントまたは所定の領域は、2'-デオキシヌクレオ チドとリボヌクレオチドの両方を含有することができる。しかしリボ型セグメン ト または2'- デオキシリボ型セグメントは、それぞれリボ型および2'-デオキシリ ボ型ヌクレオ塩基のみを含有する。 ５．発明の詳細な説明 以下の5.2節以降で、CMVに関する教示は、リコンビナジェニックオリゴヌクレ オ塩基にも適用できることを理解されたい。 5.1 キメラ突然変異ベクターの構造 キメラ突然変異ベクター（CMV）は、適当な配列を有するDNAとハイブリダイズ （すなわち、プリンおよびピリミジンのワトソン−クリック塩基対を形成）する プリンとピリミジンのポリマーからなる。各CMVは、互いに相補的であり共有結 合することができる（しかし必ずしも共有結合する必要はない）少なくとも15塩 基の第１のおよび第２のストランドに分割される。オリゴヌクレオ塩基ポリマー のサブユニットはヌクレオ塩基と呼ばれる。ヌクレオ塩基は、プリンもしくはピ リミジンまたはこれらの類似体もしくは誘導体である塩基を含有する。２つのタ イプのヌクレオ塩基がある。リボ型のヌクレオ塩基は、2'-ヒドロキシル、置換 ヒドロキシルまたは2'-ハロ−置換リボースを有するリボヌクレオシドである。 リボ型ヌクレオ塩基以外のすべてのヌクレオ塩基はデオキシリボ型ヌクレオ塩基 である。 第１および第２のストランドの配列は、標的遺伝子に相同的な少なくとも２つ の領域と、標的遺伝子とは異なり標的遺伝子に遺伝子変化を導入する１つまたは それ以上の領域（「突然変異誘発領域（mutator regions）」）とからなる。突 然変異誘発領域は、3'および5'方向の両方で相同的領域に直接隣接している。本 発明の好適な実施形態において、各突然変異誘発領域は、少なくとも３つの塩基 の相同的領域に3'および5'方向の両方で隣接している。本発明の好適な実施形態 において、各突然変異誘発領域は、少なくとも３つの塩基のリボ型のオリゴヌク レオ塩基セグメントにより3'と5'方向の両方でフランクされ、これらのセグメン トは必ずしも突然変異誘発領域に直接隣接する必要はない。フランクするリボ型 ヌクレオ塩基セグメントは突然変異誘発領域に直接隣接する必要はなく、すなわ ちデオキシリボ型ヌクレオ塩基を含む相同的領域の一部が介在してもよい。すべ ての相同的領域の全長は、好ましくは少なくとも16塩基であり、より好ましくは 約20ヌクレオチド〜約60ヌクレオチドの長さである。CMVが突然変異誘発領域に より分離された２つの相同的領域を含有するなら、相同的領域はより好ましくは 各々８〜１５塩基の長さであり、最も好ましくは10塩基の長さである。 第１のストランドの少なくとも２つの相同的領域は、第２のストランドのデオ キシリボ型ヌクレオ塩基にワトソン−クリック対合した少なくとも３つの連続リ ボ型ヌクレオ塩基からなる。好適な実施形態において、第１のストランドには９ 〜25リボ型ヌクレオ塩基およびより好ましくは20リボ型ヌクレオ塩基があり、こ れらは第２のストランドのデオキシリボ型ヌクレオ塩基にワトソン−クリック対 合している。１つの実施形態においては、第２のストランドにはリボ型ヌクレオ 塩基が無い。１つの実施形態においては、第１のストランドの突然変異誘発領域 はデオキシリボ型ヌクレオ塩基からなり、デオキシリボ型ヌクレオ塩基によりフ ランクされている。あるいは突然変異誘発領域は、第１のストランドのリボ型ヌ クレオ塩基と第２のストランドのデオキシリボ型ヌクレオ塩基から構成されても よい。 好ましくは突然変異誘発領域は20またはそれ以下の塩基、より好ましくは６ま たはそれ以下の塩基、そして最も好ましくは３またはそれ以下の塩基からなる。 標的遺伝子の挿入または欠失が得られるように、突然変異誘発領域は、CMVの相 同的領域との標的遺伝子相同性の領域を分離する配列の長さとは異なる長さでも よい。標的遺伝子中に欠失を導入するのにCMVが使用される時、突然変異誘発領 域内のように同定可能な塩基は無い。むしろ、標的遺伝子中で分離される２つの 相同的領域が並列することにより突然変異が起きる。本発明の目的において、標 的遺伝子中に欠失を導入するCMVの突然変異誘発領域の長さは、欠失の長さであ ると考えられる。１つの実施形態において突然変異誘発領域は、６〜１塩基の欠 失またはより好ましくは３〜１塩基の欠失である。複数の分離した突然変異が単 一のCMVにより導入され、この場合同じCMV内に複数の突然変異誘発領域がある。 あるいは、単一の遺伝子内に複数の遺伝子変化を導入するために、または同じ細 胞の複数の遺伝子内に遺伝子変化を導入するために、複数のCMVを同時に使用す ることができる。本明細書中、突然変異誘発領域は異種領域とも呼ばれる。 １つの実施形態においてCMVは、20〜200ヌクレオ塩基および好ましくは40〜10 0ヌクレオ塩基の単一のオリゴヌクレオ塩基鎖である。別の実施形態においてCMV は、それぞれ20〜100塩基の第１と第２のオリゴヌクレオ塩基鎖を含む（ここで 、第１の鎖は第１のストランドを含み、第２の鎖は第２のストランドを含む）。 第１と第２の鎖はヌクレオ塩基以外により共有結合されるか、またはワトソン− クリック塩基対合によってのみ結合することができる。第１のストランドと第２ のストランドの共有結合は、ポリエチレングリコール、ポリ−１，３−プロパン ジオールまたはポリ−１，４−ブタンジオールのようなオリゴアルカンジオール に より作成することができる。 別の実施形態において本発明は、デオキシヌクレオチドまたはデオキシヌクレ オシドおよび2'-Ｏ置換リボヌクレオチドもしくはリボヌクレオシドを含むCMVを 使用して行われる。適切な置換基は、Kmiec出願が教示する置換基Ｃ1-6アルカン を含む。別の置換基には、米国特許第5,334,711号（Sproat）が教示する置換基 、および特許公報EP629387およびEP679657（まとめて、Martin出願）が教示する 置換基（これらは、参照することにより本明細書の一部とする）がある。本明細 書においてリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの２’フルオロ、クロロも しくはブロモ誘導体、またはMartin出願またはSproatに記載の置換2'-Ｏを有す るリボヌクレオチドは、「2'-置換リボヌクレオチド」と呼ぶ。2'-置換リボヌク レオチドの具体的な好適な実施形態は、2'-フルオロ、2'-メトキシ、2'-プロピ ルオキシ、2'-アリルオキシ、2'-ヒドロキシルエチルオキシ、2'-メトキシエチ ルオキシ、2'-フルオロプロピルオキシおよび2'-トリフルオロプロピルオキシ置 換リボヌクレオチドである。より好適な実施形態において2'-置換リボヌクレオ チドは、2'-フルオロ、2'-メトキシ、2'-メトキシエチルオキシ、および2'-アリ ルオキシ置換ヌクレオチドである。 2'-置換リボヌクレオシドは同様に定義される。2'-置換リボヌクレオシドの具 体的な好適な実施形態は、2'-フルオロ、2'-メトキシ、2'-プロピルオキシ、2'- アリルオキシ、2'-ヒドロキシルエチルオキシ、2'-メトキシエチルオキシ、2'- フルオロプロピルオキシおよび2'-トリフルオロプロピルオキシ置換リボヌクレ オチドである。2'-置換リボヌクレオシドのより好適な実施形態は、2'-フルオロ 、2'-メトキシ、2'-メトキシエチルオキシ、および2'-アリルオキシ置換ヌクレ オチドである。 用語「ヌクレアーゼ耐性リボヌクレオシド」は、2'-置換リボヌクレオシドを 包含し、2'-置換リボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド以外のすべての2'-ヒ ドロキシルリボヌクレオシドを含む。好適な実施形態においてCMVは好ましくは 、少なくとも３つおよびより好ましくは６つのヌクレアーゼ耐性リボヌクレオシ ドを含む。１つの好適な実施形態においてCMVは、ヌクレアーゼ感受性リボヌク レオシドを含有しない。別の好適な実施形態において、すべての他のリボヌクレ オ シドはヌクレアーゼ耐性である。特定の2'-ブロッキング基は、プリンまたはピ リミジンについてより容易に合成することができる。CMVの１つの実施形態にお いて、リボヌクレオシドプリンのみまたはリボヌクレオシドピリミジンのみがヌ クレアーゼ耐性である。 CMVはさらに、少なくとも３つのヌクレアーゼ耐性リボ型ヌクレオ塩基を含有 することを特徴とする。好適な実施形態において、すべてのリボ型ヌクレオ塩基 はヌクレアーゼ耐性である。 5.2 in vivo使用に適した製剤 CMVと巨大分子担体の先行技術の製剤は、CMVについての能力が低くCMVは細胞 外酵素から防御されないため、in vivoでの有用性が限定される。本発明は、先 行技術のこれらの限界を克服する３つの別の巨大分子担体を提供する。これらの 担体は、ポリエチレンイミン（PEI）、水性コアの脂質小胞であり、これらは１ 層リポソームおよび脂質ナノスフィアとも呼ばれる。 各担体はさらに、標的細胞の細胞表面タンパク質に相補的なリガンドとともに 提供することができる。そのようなリガンドは、標的細胞へのCMVの取り込みの 量と特異性の両方を上昇させるのに有用である。本発明の１つの実施形態におい て標的細胞は肝細胞であり、リガンドはアシアロ糖タンパク質受容体に結合する ガラクトース型単糖または乳糖型二糖である。 5.2.1 ポリ陽イオン性担体 本発明は、in vitroで細胞にまたはin vivoで被験体に投与した時非毒性であ る任意のポリ陽イオンを使用して行うことができる。適当な例には、ポリリジン 、ポリアルギニンなどのポリ塩基アミノ酸、ヒストンH1などの塩基性タンパク質 、および分岐鎖ポリエチレンイミン：(-NHCH2CH2-)X[-N(CH2CH2NH2)CH2CH2-]Yな どの合成ポリマーがある。 本発明は、平均分子量が約500ダルトン以上、好ましくは約10Kd以上およびよ り好ましくは約25Kd以上（光散乱により測定される質量平均分子量）を有する任 意の分岐鎖ポリエチレンイミン（PEI）を用いて行うことができる。適切性の上 限は、PEIの毒性と溶解性により決定される。約1.3Md以上の分子量の毒性と不溶 解性は、PEI材料を不適切とする。細胞をDNAでトランスフェクトするための担体 としての高分子量PEIの使用は、Boussif，O.ら、1995，Proc．Natl．Acad．Sci ．92，7297（これは参照することにより本明細書の一部とする）に記載されてい る。PEI溶液は、Boussifらの方法により調製することができる。 CMV担体複合体は、CMVの水溶液とPEIの中性水溶液を、CMVリン酸塩当たり９〜 ４PEI窒素の比率で混合することにより作成される。好適な実施形態において、 この比は６である。例えば複合体は、0.15M NaCl中の10mMのPEI溶液（pH7.0）と CMVとを混合して100〜500nMの最終CMV濃度を作成することにより作成することが できる。 さらにクラスリン被覆ピット受容体のリガンドを、ポリ陽イオンまたはポリ陽 イオンの画分に結合させることができる。１つの実施形態においてリガンドは、 アシアロ糖タンパク質受容体に結合する単糖または二糖（例えば、乳糖、ガラク トース、またはN-アセチルガラクトサミン）である。リガンドを結合するのに任 意の方法を使用することができる。リガンド対ポリエチレンサブユニットの最適 比は、CMVを蛍光標識し、蛍光CMV／分子担体／リガンド複合体を目的の組織に直 接注入し、Krenら、1997，Hepatology 25，1462-1468の方法に従って蛍光取り込 みの程度を測定することにより定量することができる。 窒素当たり0.4〜0.8ラクトシル部分の比を有するラクトシル化PEIと非修飾PEI との１：１混合物を使用して、良好な結果を得ることができる。この混合物は、 CMVリン酸塩当たり４〜９PEI窒素の比で使用される。オリゴヌクレオホスフェー ト対窒素の好適な比は、１：６である。25Kdおよび800Kdの質量平均分子量を有 するPEI（それぞれ、Aldrich Chemical Co.からカタログ番号40,872-7と18,197- 8として販売されている）を使用して、良好な結果を得ることができる。 別の実施形態においてポリ陽イオン性担体は、ヒストンH1のような塩基性タン パク質でもよく、これはクラスリン被覆ピット受容体のリガンドで置換すること ができる。ヒストンとCMVの１：１（w/w）混合物を使用して本発明を実施するこ とができる。 5.2.2 担体に有用な脂質 本発明の脂質小胞へ取り込むための脂質と脂質ナノスフィア担体の選択は、決 定的に重要ではない。脂質ナノスフィアは、半精製脂質生物学的調製物、例えば 大豆油（Sigma Chem．Co.）、卵ホスファチジルコリン（EPC）（Avanti Polar L ipids）を使用して構築することができる。脂質ナノスフィアおよび／または脂 質小胞の調製に有用な他の脂質には、中性脂質、例えばジオレオイルホスファチ ジルコリン（DOPC）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE ）、陰イオン性脂質、例えばジオレオイルホスファチジルセリン（DOPS）、およ び陽イオン脂質、例えばジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（DOTAP ）、ジオクタデシルジアミドグリシルスペルミン（DOGS）、ジオレオイルトリメ チルアンモニウム（DOTMA）、およびDOSPER（1,3-ジ−オレオイルオキシ-2-(6- カルボキシ-スペルミル)-プロピル-アミド４酢酸、Boehringer-Mannheimから販 売されている）がある。本発明で使用できる脂質のさらなる例は、Gao，X.およ びHuany，L.，1995，Gene Therapy 2，710に見いだされる。糖リガンドは糖セレ ブロシドの形（例えば、ラクトシルセレブロシドまたはガラクトセレブロシド（ Avanti Polar Lipids））で加えることができる。 脂質の具体的な選択は決定的に重要ではない。水素化EPCまたはリソレシチン を、EPCの代わりに使用することができる。DPPC（ジパルミトイルホスファチジ ルコリン）を取り込んで、デシバリーシステムの有効性および／または安定性を 改良することができる。 5.2.3 脂質ナノスフィア担体の構築 脂質ナノスフィアは以下の方法により構築することができる。リン脂質のメタ ノールまたはクロロホルムメタノール溶液を小さい試験管に加え、窒素流により 溶媒を除去して脂質フィルムを残す。CMVの食塩水溶液を陽イオン性脂質のエタ ノール溶液と混合して、CMVの親油性塩を形成する。陽イオン性種がCMV陰イオン （リン酸塩）に対して約４倍モル過剰である時、良好な結果が得られる。親油性 CMV塩溶液を脂質フィルムに加え、静かにボルテックス混合し、次にリン脂質に 等しい重さの中性脂質を加える。CMVの濃度は、最高で脂質の総量の約３％(W/W) まであってもよい。 中性脂質の添加後、乳状の懸濁液が形成して明らかな分離が見られなくなるま でエマルジョンを４℃で１時間超音波処理する。最終直径が約50nmになるまで、 懸濁液をポリカーボネートフィルターを通して押し出す。標的細胞が網内系細胞 である時、脂質ナノスフィアの好適な直径は約100〜200nmである。次にCMV担持 脂質ナノスフィアを洗浄し、製薬上許容される担体または組織培養培地に入れる 。脂質ナノスフィアの能力は、ナノスフィア懸濁液500μl当たり約2.5mg CMVで ある。 5.2.4 脂質小胞の構築 脂質フィルムは、脂質のクロロホルムメタノール溶液を試験管に入れ、窒素流 により溶媒を除去することにより作成される。CMVの量が脂質の量の20％〜50％( w/w)になり、かつ水性溶媒の量が最終混合物中の脂質の量の約80％(w/w)になる ように、CMVの食塩水溶液を加える。静かにボルテックス混合後、最終直径が約5 0nmになるまでリポソーム含有液体を連続的により細かいポリカーボネートフィ ルター膜に通す。連続的により細かいポリカーボネートフィルター膜に通すと、 多層リポソームが１層リポソーム（すなわち、小胞）に変換される。標的細胞が 網内系細胞である場合、脂質ナノスフィアの好適な直径は約100〜200nmである。 次にCMV担持脂質ナノスフィアを洗浄し、製薬上許容される担体または組織培養 培地に入れることができる。 CMVを小胞の水性コアに捕捉する。添加したCMVの約50％が捕捉される。 基本的な方法の変法は、CMVリン酸塩当たり約４PEIイミンの比でPEI／CMV濃縮 物を含む水溶液の作成を含む。リポソームが陽性に荷電している時（すなわち、 脂質小胞がDOPSのような陰イオン性脂質の陰イオンの濃度より高い濃度のDOTAP 、DOTMAまたはDOSPERのような陽イオン性脂質の陽イオンの濃度を含有する時、 濃縮物は特に有用である。脂質小胞の能力は、脂質小胞懸濁液500μl当たり約15 0μgのCMVである。 好適な実施形態において脂質小胞は、陰イオン性リン脂質DOPSと中性脂質（例 えば、DOPEまたはDOPC）の混合物を含有する。脂質小胞を作成するために使用さ れる別の陰性に荷電したリン脂質は、ジオレオイルホスファチジン酸（DOPA）と ジオレオイルホスファチジルグリセロール（DOPG）を含む。より好適な実施形態 において中性脂質はDOPCであり、DOPS：DOPCの比は２：１〜１：２であり、好ま しくは約１：１である。10％未満の荷電脂質の存在は、小胞融合のために脂質小 胞を不安定にするため、陰性に荷電した脂質と中性脂質の比は１：９より大きく なければならない。 特定の脂質小胞形成は、トランスフェクトされた標的細胞中で容易に検出可能 な生成物を発現する約5.0kbの長さのプラスミドで標的細胞集団をトランスフェ クトするための製剤を使用して、試験することができる。プラスミドがイミン： リン酸塩比が９〜４：１のPEIで濃縮されるなら、プラスミドで細胞をトランス フェクトするために脂質小胞を使用することができる。プラスミドで細胞をトラ ンスフェクトする脂質小胞製剤の能力は、CMVを細胞に導入して核変換を起こさ せる製剤の能力を示す。 特定の脂質（特にポリ陽イオン性脂質）は、特定の細胞系および初代細胞培養 物に対して毒性であることがある。脂質小胞の生成は、そのような毒性脂質を避 けるように調整すべきである。 クラスリン被覆ピット受容体のリガンドは、種々の手段により脂質小胞中に導 入することができる。セレブロシド（例えば、ラクトセレブロシドまたはガラク トセレブロシド）は脂質混合物中に導入することができ、アシアロ糖タンパク質 受容体のリガンドを産生するために小胞中に取り込まれる。 別の実施形態において、脂質小胞はさらに、小胞の脂質二重層中に自身を挿入 する内部膜タンパク質を含む。具体的な実施形態において、タンパク質は、セン ダイウイルスまたは日本血球凝集性ウイルス（HVJ）のどちらかで呼ばれるウイ ルス由来のフシゲニック（fusigenic）（F-タンパク質）である。DNAを肝臓、心 筋および内皮細胞中に導入するために、脂質小胞を含有するF-タンパク質の調製 と使用が報告されている。例えば、米国特許第5,683,866号、国際出願PCT JP97/ 00612（WO97/31656として公表された）を参照されたい。また、Ramani，K.ら、1 996，FEBS Letters 404，164-168；Kaneda，Y.ら、1989，J．Biol．Chem．264， 121126-12129；Kenada，Y.ら、1989，Science 243，375；Dzau，V．J.ら、Proc ．Natl．Acad．Sci．93，11421-11425；Aoki，M.ら、1997，J．Mol．Cardiol．2 9，949-959も参照されたい。 5.3 疾患と疾患特異的CMV 本発明は、疾患を引き起こす突然変異（この突然変異により、１つまたはそれ 以上のヌクレオチドが変化するか、または１〜約30ヌクレオチドの挿入または欠 失を引き起こす）を修正するのに使用することができる。好適な実施形態におい て、この欠失または挿入は１〜約６ヌクレオチドである。この疾患を引き起こす 突然変異は、突然変異の遺伝子座に相同的な野生型遺伝子の配列を含有するCMV を投与することにより修正される。異種領域をフランクする突然変異DNA配列と 相同的な領域があるように、すなわち突然変異体から欠失している野生型配列の 部分を含有するCMVの領域があるように、CMVは構築される。突然変異が挿入から なる時、CMVの異種領域は、挿入部位に相同的な点であると見なされる。従ってC MVの異種領域の長さは、突然変異配列中の挿入の長さであると考えられる。しか し、CMVの配列は突然変異の位置により決定され、突然変異の配列は重要ではな いことに注意されたい。それよりCMVの配列は、いつも野生型遺伝子の配列また は所望の関連配列である。以下の配列のそれぞれにおいて、異種領域には下線を 施してある。 本発明の第１の実施形態は、フォンウィルブラント病を引き起こす突然変異を 修正するために使用することができるCMVである。この突然変異を修正するCMVは 、配列5'-CTC GGA GAG C CCC CTC GCA-3'（配列番号１）、同じ塩基配列を有す る混合リボ−デオキシリボオリゴヌクレオ塩基の配列、またはチミンがウラシル で置換されていることで異なる配列、またはその相補体の配列を含有する。フォ ンウィルブラント因子遺伝子が修正される必要がある組織は、血管内皮である。 本発明のさらなる実施形態は、血友病Ｂを引き起こす突然変異（これは、ヒト 凝固第IX因子遺伝子のnt1234のA→C置換である）を修正するのに使用することが できるCMVである。この突然変異を修正するCMVは、配列5'-CAA GGA GAT AGT GGG GGA C-3'（配列番号２）、同じ塩基配列を有する混合リボ−デオキシリボオリ ゴヌクレオ塩基の配列、またはチミンがウラシルで置換されていることで異なる 配列、またはその相補体の配列を含有する。本発明は、ヒト凝固第IX因子遺伝子 の他の突然変異を修正するのに使用することができ、その配列は、Kurachi，K． ら、1982，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79，6461-6464（これは参照することに より本明細書の一部とする）に記載されている。第IX因子遺伝子が修正される必 要がある組織は、肝細胞肝である。 本発明のさらなる実施形態は、α1-アンチトリプシン欠損を引き起こすＺ突然 変異を修正するのに使用することができるCMVである。Ｚ突然変異は、ヒトα1- アンチトリプシンのnt1145に位置するG→A置換である。この突然変異を修正する CMVは、5'-ACC ATC GAC GAG AAA GGG A-3'（配列番号３）、同じ塩基配列を有す る混合リボ−デオキシリボオリゴヌクレオ塩基の配列、またはチミンがウラシル で置換されていることで異なる配列、またはその相補体の配列を含有する。本発 明は、α1-アンチトリプシン遺伝子中の他の突然変異を修正するのに使用するこ とができ、その配列は、Long，G．L.ら、1984，Biochemistry 23，4828-4837に 記載されており、これは参照することにより本明細書の一部とする。α1-アンチ トリプシン遺伝子を修正する必要がある組織は肝細胞肝である。 本発明のさらなる実施形態は、家族性高コレステロール血症（FH）を引き起こ す低密度リポタンパク質受容体（LDLR）の突然変異を修正するのに使用すること ができるCMVである。FH症例の大部分を引き起こす単一の突然変異は存在しない 。105を超える点突然変異または25ntもしくはこれ以下の挿入もしくは欠失につ いての調査がHobbs，H．H.ら、1992，Hum．Mutat．1，445-466およびLeren，T． P．ら、Hum．Genet．95，671-676（これらはその全体を参照することにより本明 細書の一部とする）に見いだされる。ヒトLDLR cDNAの完全な配列は、Yamamoto ，T．ら、1984，CELL 39，27-38により公表されている。FHを改善するためにLDL Rを修正することができる組織は、肝細胞肝である。 本発明のさらなる実施形態は、ゴーシェ病を引き起こすグルコセレブロシダー ゼ遺伝子の突然変異を修正するのに使用することができるCMVである。ゴーシェ 病突然変異を修正するのに使用することができるCMVの構造は、本出願者の米国 特許出願第08/640,517号中に見いだされる。ゴーシェ病を改善するためにグルコ セレブロシダーゼ突然変異が修正され得る組織は、網内系（クプファー細胞）肝 である。 本発明のさらなる実施形態は、１型糖原病（GSD）を引き起こすグルコース− ６−ホスファターゼ（G-6-P）遺伝子の突然変異を修正するために使用すること ができるCMVである。ヒトG-6-Pの完全な配列は、Lei，K.-J.ら、Science 262，5 80（これは参照することにより本明細書の一部とする）中に記載されている。Le i，K.-J.ら、J．Clin．Investigation 95，234-240（これは参照することにより 本明細書の一部とする）に記載のように、１型GSDを引き起こす最も一般的な２ つの突然変異は、nt326のC→T、nt1118のC→T、およびnt459のTAの挿入である。 この最も一般的な２つの突然変異を修正するためのCMVは、5'-TTT GGA CAG CGT CCA TAC T-3'（配列番号４）または5'-TGC CTC GCC CAG GTC CTG G-3'(配列番号 ５)、同じ塩基配列を有する混合リボ−デオキシリボオリゴヌクレオ塩基の配列 、またはチミンがウラシルで置換されていることで異なる配列、またはその相補 体の配列を含有する。 本発明のさらなる実施形態は、オルニチンとカルバミルリン酸との縮合を触媒 してシトルリンとリン酸を生成するＸ結合遺伝子であるオルチニントランスカル バミラーゼ（OTC）遺伝子の突然変異を修正するのに使用することができるCMVで ある。ヒトOTC cDNAの完全な配列は、Horwich，A．L.ら、1984，Science 224，1 068（これは参照することにより本明細書の一部とする）中に記載されている。O TC遺伝子の構造および同定された突然変異体の構造は、Tuchman，M.，1992，Hum an Mutation 2,174に概説されている。 本発明のさらなる実施形態は、クリグラー-ナジャー症候群を引き起こすヒトU DP-グルクロノシルトランスフェラーゼ遺伝子の突然変異を修正するのに使用す ることができるCMVである。ヒトUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ遺伝子 の配列は、Bosma，P．J.ら、1992，Hepatology，15，941-7（これは参照するこ とにより本明細書の一部とする）中に記載されている。クリグラー-ナジャー症 候群を改善するためにUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼ遺伝子が修正され る組織は、肝細胞肝である。 本発明のさらなる実施形態は、ガラクトース血症を引き起こすガラクトース− １−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ遺伝子の突然変異を修正するために使用 することができるCMVである。ヒトガラクトース−１−リン酸ウリジルトランス フェラーゼ遺伝子の配列は、Flack，J．E.ら、1990 Mol．Biol．Med．7，365に 記載されており、ガラクトース血症の分子生物学と集団遺伝学は、Reichert，J ．K．V.ら、1991，Proc．Natl．Acad．Sci．88，2633-37およびReichert，J．K ．V.ら、1991，Am J．Hum．Gen．49，860（これらは参照することにより本明細 書 の一部とする）に記載されている。ガラクトース血症を引き起こす最も一般的な 突然変異は、アミノ酸188でのQ→Rである。この突然変異を修正するためのCMVは 、配列5'-CC CAC TGC CAG GTA TGG GC-3'（配列番号６）、同じ塩基配列を有す る混合リボ−デオキシリボオリゴヌクレオ塩基の配列、またはチミンがウラシル で置換されていることで異なる配列、またはその相補体の配列を含有する。 本発明のさらなる実施形態は、フェニルケトン尿症（PKU）または高フェニル アラニン血症を引き起こすフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（PAH、フェニル アラニン４−モノオキシゲナーゼ、EC1.14.16.1）の突然変異を修正するために 使用することができるCMVである。フェニルケトン尿症の分子遺伝学および集団 遺伝学は、Woo，SLC，1989，Biochemistry 28，1-7に記載されており、ヒトPAH の配列はKowk，S．C．M.ら、1985，Biochemistry 28，556-561（これは参照する ことにより本明細書の一部とする）に記載されている。PKUを引き起こす突然変 異のさらなる例は、Sworniczak，B.ら、1992，Hum．Mutat．1，138-146中に記載 されている。 本発明は「正常な」遺伝子の有益な変化（このような有益な変化の本体は同定 されている）を作成するのに使用することができることを、当業者は理解できる 。例えば3,000人のうち１人という多くが、末端切断型リポタンパク質アポＢ遺 伝子についてヘテロ接合性であるため、100mg/dlまたはこれ以下の血清コレステ ロールレベルを有する。Kane，J．P．とHavel，R．J.、The Metabolic Basisof Inherited Disease、第２巻中（1995，McGraw Hill，ニューヨーク州）p.1866。 本明細書において「疾患を引き起こす突然変異」とは、「正常な」遺伝子が疾患 （すなわち動脈硬化）に関係し、まれな対立遺伝子がヘテロ接合型でその疾患か ら防御的であるようなアポＢ遺伝子のような例を含む。従ってこれらの状況で、 統計的に最も高頻度の遺伝子は「疾患を引き起こす遺伝子」と見なされ、有益な 変化を有する遺伝子は、「野生型遺伝子」と見なされる。 5.4 in vivoでの製剤の使用 本発明のCMVは、非経口的に標的器官に50〜250μg/gmの投与量で直接投与する ことができる。標的器官が肝臓、筋肉または腎臓である時、CMV／巨大分子担体 複合体は直接器官中に注入することができる。標的器官が肝臓である時、一時的 に循環を遮断した肝臓の肝静脈または門脈中への静脈内注入を使用することがで きる。あるいはCMV／巨大分子複合体はさらに、肝臓を標的とするリガンド（例 えば、ラクトシルまたはガラクトシルサッカリド）を含み、全身循環中へのCMV ／巨大分子複合体の静脈内投与を可能にする。 標的器官が肺またはその組織である時、例えばエアゾールにより細気管支上皮 CMV／巨大分子複合体を投与することができる。リポソーム／DNA複合体の小粒子 エアゾール送達は、Schwarz L．A.ら、1996，Human Gene Therapy 7，731-741に 記載されている。 例えばフォンウィルブラント病のように標的器官が血管内皮である時、CMV／ 巨大分子複合体は直接全身循環中に送達することができる。他の器官は、リポソ ームが循環系の内皮細胞から遊出できるようにするリガンドを有するリポソーム を使用して標的とすることができる。 酵素欠陥については、患部組織の約１％の細胞の遺伝子を修正することにより 治療効果が得られる。実質細胞の寿命が延びた組織（例えば、肝臓）では、CMV による治療を繰り返し行って治療効果を上昇させることができる。 ６．実施例 6.1 CMV／巨大分子担体複合体 6.1.1 脂質ナノスフィア 材料 卵ホスファチジルコリン（EPC）、DOTAPおよびガラクトセレブロシド（Gc）（ Avanti Polar Lipids）；大豆油（Sigma Chemical Co.）；ジオクタデシルジア ミドグリシルスペルミン（DOGS（登録商標））（Promega）。 方法 EPC、DOTAPおよびGcは、あらかじめクロロホルムまたは無水メタノール中に規 定の濃度で溶解し、使用するまで-20℃で乾燥容器中で小さいガラスバイアル中 に保存した。EPC（40-45mg）、DOTAP（200μg）およびGc（43μg）溶液は、小さ い10×75mmホウ素ケイ酸試験管に一定量ずつ採取し、窒素流で溶媒を除去した。 CMVは0.15Ｍ NaClで希釈し（約80〜125μg／250〜300μl）；DOGS（エタノール 中の１０mg/ml溶液として）は添加したCMVの３〜５倍の重さで250〜300μl 0.15 Ｍ NaClに希釈した。２つの溶液を静かにボルテックス混合して内容物を混合し 、CMV溶液をDOGS溶液に静かに加えた。試験管を静かにたたき数回転倒させて、 内容物を混合させた。DOGS−複合体溶液を乾燥脂質に加え、次に大豆油（40〜45 mg）を加え、混合物を高速で数秒間ボルテックス混合し、浴をFS-15（Fisher Sc ientific）浴ソニケーター中で４℃に温度調節した部屋で約１時間超音波処理し た。時々浴から試験管を取り出してボルテックス混合した。均一に見えるミルク 様懸濁液（油滴の明らかな分離は見られない）が生成された時、孔径50nmになる まで一連のポリカーボネート膜中に通して押し出した。調製物を使用するまで４ ℃に保存し、使用前にボルテックス混合した。 6.1.2 陰性に荷電した標的化脂質小胞 材料 ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジオレオイルホスファチジルセ リン（DOPS）、ガラクトセレブロシド（Gc）またはラクトシルセレブロシド（Av anti Polar Lipids）。 方法 DOPS、DOPCおよびGcを１：１：0.16のモル比（総脂質500μg）でクロロホルム ：メタノール（１：１ v/v）に溶解し、次に窒素流下で乾燥して均一な脂質フィ ルムを得た。CMVを500μlの0.15Ｍ NaClで希釈した（約100〜250μg／500μl） 。室温で溶液を脂質フィルムに加えた。穏やかなボルテックス混合と加熱（37〜 42℃の水浴中）を交互に繰り返して脂質を完全に分散させた。均一なミルク様の 懸濁液が生成された後、Liposofast（登録商標）ミニ押出し機を使用して一連の ポリカーボネート膜（孔径0.8、0.4、0.2、0.1および0.05μm）中に通して押し 出した。押出しは各孔径で５〜７回行なった。調製後脂質小胞を、使用するまで ４℃で保存した。これらの条件下で脂質小胞は少なくとも１ヶ月安定であった。 最終生成物は凍結乾燥することができる。 6.1.3 中性標的脂質小胞 材料 ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジオレオイルホスファチジルエ タノールアミン（DOPE）、ガラクトセレブロシド（Gc）またはラクトシルセレブ ロシド、（Avanti Polar Lipids）。 方法 DOPS、DOPCおよびGc（１：１：0.16のモル比）またはDOPC：Gc（１：0.08）を クロロホルム：メタノール（１：１ v/v）に溶解し、次に窒素流下で乾燥して均 一な脂質フィルムを得た。オリゴヌクレオチド（またはキメラ分子）を500μlの 0.15M NaClで希釈した（約100〜250μg／500μl）。室温で溶液を脂質フィルム に加えた。穏やかなボルテックス混合と加熱（37〜42℃の水浴中）を交互に繰り 返して脂質を完全に分散させた。均一なミルク様の懸濁液が生成された後、Lipo sofast（登録商標）ミニ押出し機を使用して一連のポリカーボネート膜（孔径0. 8、0.4、0.2、0.1および0.05μm）中に通して押し出した。押出しは各孔径で５ 〜７回行なった。調製後脂質小胞を、使用するまで４℃で保存した。調製物の脂 質小胞のサイズは約５日間安定であった。 6.1.4 陽性に荷電した標的化脂質小胞 材料 ジオレオイルホスファチジルコリン（DOPC）、ジオレオイルトリメチルアンモ ニウムプロパン（DOTAP）、ガラクトースセレブロシド（Gc）またはラクトシル セレブロシド、（Avanti Polar Lipids）。ポリエチレンイミン（PEI）（分子量 800Kd）、Fluka Chemicals。 方法 DOPS、DOTAPおよびGc（６：１：0.56のモル比）（総脂質500μg）をクロロホ ルム：メタノール（１：１ v/v）に溶解し、次に窒素流下で乾燥して均一な脂質 フィルムを得た。水を使用してPEIを45mg／100mlの濃度に希釈した。溶液のpHを 、HClを使用して〜7.6に調整した。毎回PEIストック溶液を調製し、約50nmolア ミン／μlに等しかった。CMVを250μl中〜125μgの濃度で0.15Ｍ NaClに希釈し た。PEIを250μlの0.15Ｍ NaClにさらに希釈して、オリゴヌクレオチド／キメラ リン酸１モル当たり約４モルのPEIアミンが存在するようにした。PEI溶液をCMV 溶液（いずれも室温）に滴下して加え、５〜10分ボルテックス混合した。次にPE I−複合体溶液を脂質フィルムに加え、前述のように脂質を分散させた。均一な ミル ク様の懸濁液が生成した後、Liposofast（登録商標）ミニ押出し機を使用して一 連のポリカーボネート膜（孔径0.8、0.4、0.2、0.1および0.05μm)中に通して押 し出した。押出しは各孔径で５〜７回行なった。調製後脂質小胞を、使用するま で４℃で保存した。これらの条件下で脂質小胞は少なくとも１ヶ月安定であった 。より長期の完了した安定性のために、最終生成物は凍結することができる。 6.1.5 ラクトシル化PEI／PEI複合体 PEI（25kDa）は、Aldrich Chemical（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）か ら購入した。PEI（800kDa）はFluka Chemicals（Ronkonkoma、ニューヨーク州、 米国）から購入した。PEIのラクトシル化は、オリゴサッカライドをタンパク質 に結合するための既に記載されている方法の修飾法により行なった。簡単に説明 すると、酢酸アンモニウム（0.2Ｍ）またはトリス緩衝液（0.2Ｍ）（pH7.6）溶 液中３〜５mlのPEI（0.1〜1.2Ｍモノマー）を、７〜８mgのシアン水素化ホウ素ナト リウム（Sigma Chemical Co.、セントルイス、ミズーリ州）と約30mgの乳糖１水 和物（Sigma Chemical Co.、セントルイス、ミズーリ州）ともにインキュベート した。反応は、ポリプロピレン試験管中できつく栓をして37℃の振盪水浴中で行 なった。10日間後反応混合物を蒸留水（500ml）に対して48時間、水を１〜２回 交換して透析した。精製した複合体を0.2μmフィルターで無菌ろ過し、４℃に保 存した。PEIに結合した糖（ガラクトースとして）の量を、フェノール−スルホ ン酸法により測定した。 ラクトシル化PEI中の遊離アミン（１級＋２級）のモル数は以下のように測定 した：標準曲線はPEIの0.02Ｍストック溶液を使用して作成した；ストックのい くつかのアリコートを、脱イオン水を使用してガラス試験管中で１mlに希釈し、 次に各試験管に50μlのニンヒドリン試薬（Sigma Chemical Co.、セントルイス 、ミズーリ州）を加え、10秒間激しくボルテックス混合した。室温で10〜12分間 発色を進ませ、次にBeckman DU-64分光光度計を使用して485nmでO.D.を読んだ（ ４分以内）。20〜50μlのアリコートのL-PEIサンプルを上記のように処理し、遊 離アミンのモル数を標準曲線から求めた。ラクトシル化PEI（L-PEI）複合体は以 下のように調製した：RNA／DNAリン酸１mmol当たり、L-PEIとして３mmol当量の アミンとPEIとして３mmolのアミンを一緒に混合し、必要に応じて0.15Ｍ NaCl で希釈した；混合物をキメラらの溶液に滴下して加え、５分間ボルテックス混合 した。 キメラオリゴヌクレオチドとPEIまたはL-PEIとの完全な結合を証明するために 、複合体を形成していないキメラと複合体を形成したキメラのゲル分析（４％LM Pアガロース）を行なった。キメラの複合体化により提供されるヌクレアーゼ分 解に対する程度を定量するために、サンプルをRNAseとDNAseで処理した。クロロ ホルムフェノール抽出後、ヘパリン（50単位／μg核酸）を使用して複合体を分 解し、生成物を４％LMPアガロースゲルで分析した。 6.2 ラットおよびヒト第IX因子のPEI／CMV介在変化の証明 材料。胎児牛血清は、Atlanta Biologicals，Inc．（アトランタ、ジョージア ）から得た。ターミナルトランスフェラーゼ、フルオレセイン-12-dUTP、Expand （登録商標）高忠実度PCRシステム、dNTPおよび高純度PCR鋳型調製キットは、Bo ehringer Mannheim Corp．（インディアナポリス、インディアナ州）から得た。 Reflection（登録商標）NEF-496オートラジオグラフィーフィルムとReflection （登録商標）NEF-491強化スクリーンは、DuPont NEN（登録商標）Research Prod ucts（ボストン、マサチューセッツ州）から得た。ポリエチレンイミン（PEI）8 00kDaは、Fluka Chemical Corp．(Ronkonkoma，ニューヨーク州)から得た。［γ -32P］ATPは、ICN Biochemicals，Inc（Costa Mesa、カリホルニア州）から得た 。pCR（登録商標）2.1は、Invitrogen（サンジエゴ、カリホルニア州）から得た 。OTPTIMEM（登録商標）、ダルベッコー改変イーグル培地、ウィリアムＥ培地お よびオリゴヌクレオチド365-Aと365-Cは、Life Technologies，Inc．（Gaithers burg，メリーランド州）から得た。30,000分子量カットオフのスピンフィルター は、Millipore Corp．（ベッドフォード、マサチューセッツ州）から得た。Dila nd SlowFade（登録商標）アンティフェードマウンティングメディウムは、Molec ular Probes，Inc．（ユージーン、オレゴン州）から得た。T4ポリヌクレオチド キナーゼは、New England Biolabs，Inc．（ビバリー、マサチューセッツ州）か ら購入した。MSI MagnaGraph膜は、Micron Separations，Inc．（Westboro、マ サチューセッツ州）から購入した。PCR増幅に使用したプライマーは、Oligos Et c.，Inc．（Wilsonville、オレゴン州）から得た。テトラメチルアンモニウムク ロリドは、Sigma Chemical Company（セントルイス、ミズーリ州）から購入した 。他のすべての化学物質は、分子生物学または試薬等級であり、Aldrich Chemic al Company（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）、Curtin Matheson Scientif ic，Inc．（Eden Prairie、ミネソタ州）、およびFisher Scientific（Itasca、 イリノイ州）から購入した。 オリゴヌクレオチド合成。キメラRNA／DNAオリゴヌクレオチドHIXF、RIXFおよ びRIXRを合成した。CMVは、ABI394シンセサイザー上でDNAと2'-O-メチルRNAホス ホラミダイトヌクレオシドモノマーで調製した。DNAホスホラミダイト環外アミ ン基は、ベンゾイル（アデノシンとシチジン）およびイソブチリル（グアノシン ）で保護した。2'-O-メチルRNAホスホラミダイト上の保護基は、アデノシンにつ いてはフェノキシアセチル、シチジンについてはイソブチリル、およびグアノシ ンについてはジメチルホルムアミドであった。塩基保護基は合成後に、エタノー ル／濃水酸化アンモニウム中で55℃で20時間加熱して除去した。粗オリゴヌクレ オチドを、７Ｍ尿素を含有する15％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、DNA をUVシャドーイングにより視覚化した。キメラ分子をゲルスライスから溶出し、 沈殿して濃縮し、G-25スピンカラムを用いて脱塩した。95％を超える精製オリゴ ヌクレオチドは完全長であった。 野生型と「突然変異」ラット第IX因子の配列は、 RIXR、RIXFおよびHIXR CMVの構造は以下のとおりである： キメラオリゴヌクレオチド 大文字はデオキシリボヌクレオチドであり、小文字は2'-OMe-リボヌクレオチ ドである。非相同的領域のヌクレオチドには下線を引いてある。 細胞培養、トランスフェクションおよび肝細胞単離。HuH-7細胞を、10％(vol/ vol)熱不活性化胎児牛血清を含有するダルベッコー改変イーグル培地中で加湿CO2 雰囲気中で37℃で維持した。トランスフェクションの24時間前に、１×105細胞 を35mm培養皿に蒔いた。トランスフェクションの時に、細胞をOPTIMEM（登録商 標）培地で２回リンスし、同じ培地１mlでトランスフェクションを行なった。ト ランスフェクションの18時間後、20％(vol/vol)熱不活性化胎児牛血清を含有す るダルベッコー改変イーグル培地２mlを各35mm皿に加え、細胞をさらに30時間維 持してから、DNA単離のために採取した。PEI（800kDa）10mMストック溶液（ｐＨ 7.0）を調製した。簡単に説明するとキメラオリゴヌクレオチドを、10mM PEIで 、0.15M NaCl 100μl中でキメラリン酸当たり９当量のPEI窒素で、最終濃度150n M（４μg）、300nM（８μg）および450nM（12μg）でトランスフェクトした。18 時間後、さらに２mlの培地を加え、残りの30時間の培養の間、キメラ濃度をそれ ぞれ50nM、100nM、および150nMに低下させた。HuH-7ビヒクル対照トランスフェ クションは、HuIXFトランスフェクションで使用したものと同量のPEIを使用した が、オリゴヌクレオチドの代わりに等量の10mM トリス−塩酸（pH7.6）を使用 した。 初代ラット肝細胞を250ｇのオスのSprague-Dawleyラット（Harlan Sprague-Da wley，Inc.）から、既に記載されている（Fanら、Oncogne 23:1909-1919，1996 ）（これは参照することにより本明細書の一部とする）ように２工程コラゲナー ゼ潅流により単離し、Primaria（登録商標）プレートに４×105細胞／35mm皿で 蒔いた。培養物を、10％熱不活性化FBS、26mM重炭酸ナトリウム、23mMヘペス、0 .01U/mlインスリン、2mM L-グルタミン、10nMデキサメタゾン、5.5mMグルコース 、100U/mlペニシリンおよび100U/mlストレプトマイシンを補足したウィリアムＥ 培地中で維持した。プレートに蒔いた24時間後、肝細胞を同じ培地で２回洗浄し 、１mlの新鮮な培地を加え、細胞をPEI／キメラオリゴヌクレオチド複合体を使 用してHuH-7細胞の場合と同じ濃度でトランスフェクトした。18時間後、さらに 培地２mlを加え、細胞を６時間または30時間後に採取した。 キメラオリゴヌクレオチドの肝臓への直接注入。オスのSprague-Dawleyラット （〜175ｇ）を、標準的な12時間明暗サイクルで維持し、標準的な実験室の餌を 自由に与えた。ラットを麻酔し、中線切開により肝臓を露出させた。肝静脈と門 脈に尾状葉に入るところでクランプを取り付け、75μgの１：９キメラ／PEI複合 体を、最終容量250〜300μlで尾状葉に直接注入した。尾状葉は15分間結紮し、 次にクランプを除去して血流を再開した。切開部分を縫合した後、ラットを麻酔 から回復させ、食餌と水を自由に与えた。キメラオリゴヌクレオチドの代わりに 等量のトリス−塩酸（pH7.6）を使用してビヒクル対照を行なった。注入の24時 間と48時間後にラットを屠殺し、尾状葉を取り出し、注入部位の周りの組織をDN A単離のために解剖した。DNAを単離し、ラット第IX因子遺伝子の末端エキソンを PCRにより増幅した。 キメラ分子の核取り込み。キメラ２本鎖を、製造業者の薦めに従ってターミナ ルトランスフェラーゼとフルオレセイン-12-dUTPを使用して3'末端標識し、次に 非標識オリゴヌクレオチドと２：３の比で混合した。前述のようにトランスフェ クションを行い、24時間後細胞を、４％パラホルムアルデヒド（wt/vol）含有リ ン酸緩衝化生理食塩水（pH7.4）中で室温で10分間固定した。固定後、細胞を製 造業者の薦めに従って0.32Ｍショ糖中のDilの５μＭ溶液を使用して10分間逆染 色した。0.32Ｍショ糖と次にリン酸緩衝化生理食塩水（pH7.4）で洗浄後、リン 酸緩衝化生理食塩水中のSlowFade（登録商標）アンティフェードマウンティング メディウムを使用して細胞にカバースリップをかぶせ、MRC1000共焦点顕微鏡（B ioRad，Inc．Hercules，カリホルニア州）を使用して観察した。肝臓の尾状葉を 前述のようにフルオレセインで標識したキメラでin situで注入し、注入の24時 間後採取した。尾状葉を縦に２分割し、OCTを使用して包埋し、凍結した。凍結 切片を〜10μＭの厚さに切断し、４％パラホルムアルデヒド（wt/vol）含有リン 酸緩衝化生理食塩水（pH7.4）中で室温で10分間固定した。固定後、細胞を製造 業者の薦めに従って0.32Ｍショ糖中のDilの５μＭ溶液を使用して10分間逆染色 した。0.32Ｍショ糖と次にリン酸緩衝化生理食塩水（pH7.4）で洗浄後、リン酸 緩衝化生理食塩水中のSlowFade（登録商標）アンティフェードマウンティングメ ディウムを使用して切片にカバースリップをかぷせ、MRC1000共焦点顕微鏡（Bio Rad，Inc.）を使用して観察した。固定細胞と切片化組織の採取シリーズを１μ ｍ段階で作成して、核中のキメラの存在を確立した。 DNA単離とクローニング。トランスフェクションの24時間と48時間後、細胞をs crappingにより採取した。100〜150塩基対より大きいゲノムDNAを、製造業者の 薦めに従って高純度PCR鋳型調製キットを使用して単離した。ヒト肝臓IX遺伝子 中の８番目のエキソンの317nt断片のPCR増幅は、単離したDNA 500ngを用いて行 なった。使用したプライマーは、ヒト第IX因子cDNAのそれぞれヌクレオチド1008 -1032と1300-1324に対応する5'-CATTGCTGACAAGGAATACACGAAC-3'（配列番号14） と5'-ATTTGCCTTTCATTGCACACTCTTC-3'（配列番号15）である。プライマーを58℃ で20秒アニーリングし、72℃で45秒伸長し、変性は94℃で45秒間進行させた。サ ンプルは、Expand Hi-fidelity（登録商標）ポリメラーゼを使用して30サイクル 増幅した。ラット第IX因子遺伝子の374nt断片のPCR増幅は、初代肝細胞または肝 尾状葉から単離したDNA 500ngを用いて行なった。使用したプライマーは、ラッ ト第IX因子cDNAのそれぞれヌクレオチド433-457と782-806に対応する5'-ATTGCCT TGCTGGAACTGGATAAC-3'（配列番号16）と5'-TTGCCTTTCATTGCACATTCTTCAC-3'（配 列番号17）である。プライマーを59℃で20秒アニーリングし、72℃で45秒伸長し 、変性は94℃で45秒間進行させた。サンプルは、Expand Hi-fidelity（登録商標 ）ポリメラーゼを使用して30サイクル増幅した。ヒトとラットの第IX因子遺伝子 の両方からのPCR増幅産物を、製造業者の薦めに従ってTAクローニングベクターp CR（登録商標）2.1中にサブクローニングし、結合した物質を使用して、凍結し たコンピ-テントな大腸菌（Escherichia coli）を形質転換した。 コロニーハイブリダイゼーションと配列決定。プレートに蒔いた後18〜20時間 後、コロニーをMSI MagnaGraphナイロンフィルター上に取り上げ、複製し、製造 業者の薦めに従ってハイブリダイゼーションを進行させた。フィルターを17量体 オリゴヌクレオチドプローブ365-A（5'-AAGGAGATAGTGGGGGA-3'）（配列番号18） または365-C（5'-AAGGAGATCGTGGGGGA-3'）（配列番号19）（ここで、下線を引い たヌクレオチドは突然変異誘発の標的である）で24時間ハイブリダイズした。プ ローブを、製造業者の薦めに従って［γ-32］ATP（＞7,000Ci/mmol）とT4ポリヌ クレオチドキナーゼで32P-末端標識した。１％SDS、５×デンハルツおよび200μ g/mlの変性超音波処理サカナ精子DNAを含有する２×塩化ナトリウムクエン酸ナ トリウム中で37℃で行なった。ハイブリダイゼーション後、フィルターを１×塩 化ナトリウムEDTAリン酸、0.5％SDSでリンスし、次に３Ｍテトラメチルアンモニ ウムクロリド、２mM EDTA（pH8.0）、0.1％SDSを含有する50mMトリス−塩酸（ｐ Ｈ8.0）で54℃で１時間洗浄した。NEN（登録商標）Reflectionフィルムで強化ス クリーンを使用して-70℃でオートラジオグラフィーを行なった。Qiagen mi niprepキット（Chatsworth、カリホルニア州）を使用して365-Aまたは365-Cとハ イブリダイズするとして同定されるコロニーからプラスミドDNAを調製し、mp13 逆プライマーを使用してABI370Aシーケンサー（Perkin-Elmer，Corp.、フォスタ ーシティ、カリホルニア州）を使用して自動配列決定を行なった。 in vivoの結果 キメラオリゴヌクレオチドをフルオレセイン標識し、肝臓の尾状葉への直接注 入が可能かどうかを決定するために使用した。結果は、尾状葉内で注入部位に隣 接する肝細胞は、単離した初代肝細胞とHuH-7細胞中で観察されるものと類似の フルオレセイン標識キメラ分子の取り込みを証明することを示した。斑点状の物 質が細胞質中に少し存在したが、標識物質は主に核中で検出された。実際、注入 部位から最も遠い肝細胞中にのみヌクレオチド標識が観察された。非標識PEI／R IXFキメラ複合体およびビヒクル対照を、同じプロトコールを使用して尾状葉中 に直接注入し、注入の24時間と48時間後に動物を屠殺した。肝臓DNAを方法で記 載のように単離し、標的nt交換部位にわたる374nt配列のPCR増幅を行なった。大 腸菌（Escherichia coli）をPCR増幅材料でサブクローニングし形質転換した後 、形質転換したコロニーの二重測定フィルターリフトを行なった。フィルターを 、365-A（野生型）または365-C（第IX因子突然変異）に特異的な32-標識17量体 オリゴヌクレオチドでハイブリダイズし、方法に記載のようにハイブリダイゼー ション後に処理した。RIXFキメラ分子を直接肝臓に注入されたラットは、24時間 と48時間の両方でA→C変換頻度は〜１％であった。これに対してビヒクル対照は 、365-Cプローブとハイブリダイズしなかった。RIXFで処理した動物からの365-C プローブとハイブリダイズしたコロニーを培養し、プラスミドDNAを単離し配列 決定してA→C変換を確認した。増幅した374-nt断片の末端は、プライマーと正確 に対応し、観察された唯一のヌクレオチド変化は、標的交換部位でのA→Cであっ た。 ６．３ ラット第IX因子のラクトシル化PEI／CMV介在変化の証明 6.3.1 結果 ラクトシル化PEIとPEIとの混合物と複合体を形成したCMVを、上記第6.1.5節に 記載したRIXRオリゴヌクレオチドを使用して調製した。第IX因子の同じ領域の相 補鎖に対するCMVも構築した（RIXRC）。 キメラオリゴヌクレオチドによるSer365での標的ヌクレオチドの変換 蛍光標識キメラ分子の核局在化は、単離したラット肝細胞での効率的なトラン スフェクションを示した。次に培養した肝細胞を、800kDa PEIを担体として使用 して、匹敵する濃度の非標識キメラ分子因子RIXRCおよびRIXRでトランスフェク トした。さらに同時にビヒクル対照トランスフェクションを行なった。トランス フェクションの48時間後、細胞を採取し、DNAを単離し、第6.1.5節に記載のよう にハイブリダイゼーションのために処理した。Ser365でのA→C標的ヌクレオチド 変換を、第IX因子遺伝子のエキソン８のPCR増幅しクローン化した374-ntストレ ッチの二重測定コロニーリフトのハイブリダイゼーションにより測定した（Sark ar，B.，Koeberl，D．D．& Somer，S．S.，「６つの種の第IX因子遺伝子の活性 化ペプチドと触媒ドメインの直接配列決定」、Genomics，6，133-143，1990）。 野生型365-A（5'-AAGGAGATAGTGGGGGA-3'）（配列番号20）または変換された365- C（5'-AAGGAGATCGTGGGGGA-3'）の間を区別するために使用した17量体オリゴヌク レオチドプローブは、cDNA配列のヌクレオチド710〜726に対応していた。 標的ヌクレオチドの変換の全体的頻度は、365-Cオリゴヌクレオチドとハイブ リダイズするクローンの数を両方のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイ ズするクローンの総数で割って算出した。RIXRCについて結果を表１に示す。Ser365 でのA→C変換は、RIXRまたはRIXRCでトランスフェクトした初代肝細胞でのみ 観察された。RIXRまたはRIXRCでトランスフェクトした肝細胞中で同様の変換頻 度が観察された。ビヒクルでトランスフェクトした細胞も他のキメラオリゴヌク レオチドでトランスフェクトした細胞のいずれも、365-Cオリゴヌクレオチドプ ローブとハイブリダイズするクローンを形成しなかった（公表されていない観察 ）。さらに未処理の肝細胞から単離し、0.5〜1.5μgのオリゴヌクレオチドの存 在下でPCR増幅したDNAから得たクローンへの、365-Cオリゴヌクレオチドプロー ブのハイブリダイゼーションは観察されなかった。単離した肝細胞中のA→C変換 率は、第6.1.5節で記載したようにラクトシル化PEI誘導体を使用すると用量依存 性であり、19％と高かった。ラクトシル化PEIと平行してトランスフェクト した培養細胞から単離したRNAのRT-PCRとハイブリダイゼーション分析は、11.9 〜22.3％の範囲のA→C変換頻度を示した。 無傷の肝臓中でのキメラオリゴヌクレオチドによる部位特異的ヌクレオチド交換 肝臓の尾状葉への直接注入後のキメラ分子の細胞取り込みを測定するためにも 、蛍光標識オリゴヌクレオチドを使用した。結果は、尾状葉中の注入部位に隣接 する肝細胞は、単離したラット肝細胞中で観察されるものと同様の蛍光標識キメ ラの取り込みを示すことを示した。点状の物質が肝細胞の細胞質中に少し存在し たが、標識物質は主に核中に存在していた。実際、注入部位から最も遠い領域中 では核標識のみが観察された。非標識RIXRキメラオリゴヌクレオチドおよびビヒ クル対照を、25kDa PEIの尾静脈注入によりin vivoで投与し、注入５日後に肝組 織を採取した。肝臓DNAを単離し、初代肝細胞で使用したものと同じプライマー を使用して、標的ヌクレオチド交換部位にわたる374nt配列のPCR増幅を行なった 。大腸菌（E．coli）をPCR増幅材料でサブクローニングし形質転換した後、形質 転換したコロニーの二重測定(duplicate)フィルターリフトを行なった。フィル ターを、365-A（野生型）または365-C（突然変異体）に特異的な32Ｐ-標識17量 体オリゴヌクレオチドでハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション後に処理し た。100μgのRIXRキメラオリゴヌクレオチドで処理したラットは、13.9〜18.9％ の範囲のA→C変換頻度を示し、２回の注入で総量で350μgを投与されたラットは 40％の変換を示した。これに対してビヒクル対照は、365-Cプローブとハイブリ ダイズしなかった。単離したRNAのRT-PCRハイブリダイゼーションは、高用量肝 臓で26.4％〜28.4％のA→C変換頻度を示した。ビヒクル処理したラットのAPTTは 、対照値（131.84％±32.89％）の89.7％〜181.9％であり、オリゴヌクレオチド 処理した動物のAPTTは、48.9％〜61.7％（53.8％±4.8％）の範囲であった。 ヘペス緩衝液（50mMヘペス／100mM NaCl／0.02％ NaN3、pH7.4）中のラット試 験血漿の1/10希釈のAPTT時間を、正常（ｎ＝９）ラットと２回注入ラット（ｎ＝ ３）の両方について測定した。二重測定サンプルの第IX因子活性は、12匹の正常 なオスラット（６〜８週令）からのプール血漿の希釈（1:10〜1:80）についての APTT結果から作成したlog-log標準曲線から決定した。正常ラットのAPTT結果は 、 対照値（平均＝131.84％±32.89％）の89.7％〜181.9％であり、２回注入ラット のAPTTは、49.0％〜61.7％（平均＝53.8％±5.8％）の範囲であった。正常ラッ トのAPTT凝固時間（秒）は60.9秒〜81.6秒（平均＝71.3±7.3秒）であり、２回 感染ラットのAPTT時間は92.3秒〜98.6秒（平均＝96.3±2.9秒）であった。 単離した肝細胞と無傷の肝臓中の突然変異した第IX因子遺伝子の配列解析 in vitroとin vivo試験の両方のフィルターハイブリダイゼーションからの結 果を確認するために、野生型遺伝子と突然変異遺伝子の直接配列決定を行なった 。無傷の肝臓または単離した肝細胞からの365-Aまたは365-Cにハイブリダイズす る少なくとも10個の独立のコロニーを解析した。配列決定の結果は、365-Aにハ イブリダイズするコロニー（図６、上のパネル）は野生型IX配列（すなわち、報 告されたcDNA配列のSer365でのＡ）を示すことを示した。これに対して365-Cオ リゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする、因子RIXRCトランスフェクト した初代肝細胞から得られたコロニーはSer365でＣに変換した。同様のSer365で のA→C変換は、17量体の365-Cオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズす るトランスフェクトしたラット肝臓から得られたコロニーで観察された。第IX因 子遺伝子の全374-nt PCR増幅した領域をすべてのクローンについて配列決定し、 Ser365での記載した変化以外の変化は検出されなかった。最後に初代肝細胞と無 傷の肝臓の両方から得られた374-ntのPCR増幅したゲノムDNAの開始点および停止 点は、増幅プロセスで使用したプライマーのものと正確に対応し、クローン化お よび配列決定したDNAは、非分解キメラオリゴヌクレオチドではなくゲノムDNAか ら得られたことを示している。 表１ コロニーリフトハイブリダイゼーションによるラット第IX因子ゲノムDNA のSer365でのA→C変換パーセント１ 初代肝細胞トランスフェクションについて示したデータは、２回の実験の平 均値である。 ２ in vivoキメラ／PEI複合体は、５％デキストロースを３００μlの容量で尾 静脈注入で投与した。各用量での３匹の動物の結果を個々に示す。 6.3.2 材料と方法 キメラオリゴヌクレオチドのin vivo送達。オスのSprague-Dawleyラット（Har lan Sprague-Dawley，Inc.）（〜50ｇ）を、標準的な12時間明暗サイクルで維持 し、標準的な実験室の餌を自由に与えた。300μlの５％デキストロース中のキメ ラホスフェート当たり６当量のPEI窒素の比のビヒクル対照とラクトシル化25kDa PEI（Abdallah，B.ら、「成体哺乳動物の脳へのin vivo遺伝子導入のための強 力な非ウイルスベクター：ポリエチレンイミン；、Human Gene Therapy，7，194 7-1954，1996）。アリコートを100μgの単回用量または150μgと200μgに分割し た用量で連続した日に尾静脈注入により投与した。注入の５日後、DNAとRNA単離 のために肝臓組織を取った。ラット第IX因子遺伝子のエキソン８のPCR増幅のた めに、DNAを既に記載されている（Kren，B．T.，Trembley，J．H．& Steer，C． J.、「ラット肝再生中のmRNA安定性の変化」、Am J．Physiol.，270，G763-G777 ，1996）ように単離した。製造業者のプロトコールに従ってRNAexolとRNAmate（ Intermountian Scientific Corp.，Kaysville，UT）を使用してゲノムDNAと同じ 領域のRT-PCR増幅のためにRNAを単離した。 第IX因子活性アッセイ。２回目の尾静脈注入の20日後に、ビヒクル（ｎ＝９）お よびオリゴヌクレオチド処理（ｎ＝３）ラットから血液サンプルを、0.1容量の0 .105Ｍクエン酸ナトリウム／クエン酸中に採取した。得られた血漿を2,500×ｇ そして次に15,000×ｇで遠心分離後、-70℃に保存した。第IX因子活性は活性化 部分トロンボプラスチン時間（APTT）アッセイにより測定した。簡単に説明する と、50μlのAPTT試薬（DADE、マイアミ、フロリダ州）、50μlのヒト第IX因子欠 乏血漿（George King Biomedical，Overland，KS）、およびヘペス緩衝液（50mM ヘペス／100mM NaCl／0.02％ NaN3、pH7.4）中50μlの1/10希釈ラット試験血漿 を、ST4コアグロメーター（American Bioproducts，Parsippany，NJ）中で37℃ で３分インキュベートした。ヘペス緩衝液中33mMのＣａＣｌ2 50μlを添加して 凝固を開始させた。二重測定サンプルの第IX因子活性は、正常なオスラット（ｎ ＝12）からのプール血漿の希釈（1:10〜1:80）についてのAPTT結果から作成した log-log標準曲線から測定した。 DNA／RNA単離とクローニング。トランスフェクションの48時間後、細胞をscrapp ingにより採取した。100〜150塩基対より大きいゲノムDNAを、製造業者のプロト コールに従って高純度PCR鋳型調製キット（Boehringer-Mannheim，Corp.，イン ディアナポリス、インディアナ州）を使用して単離した。RNAは、製造業者のプ ロトコールに従ってRNAzol（登録商標）B（Tel-Test，Inc.，Friendswood，TX） を使用して単離した。初代肝細胞または肝臓組織から単離した300ngのDNAで、ラ ット第IX因子遺伝子の374-nt断片のPCR増幅を行なった。プライマーは、ラット 第IX因子cDNAのそれぞれヌクレオチド433-457および782-806に対応する5'-ATTGC CTTGCTGGAACTGGATAAAC-3'（配列番号22）と5'-TTGCCTTTCATTGCACATTCTTCAC-3'（ 配列番号23）（Oligos Etc.，Wilsonville，OR）として設計した。プライマーを 59℃で20秒アニーリングし、72℃で45秒伸長し、変性は94℃で45秒進行させた。 サンプルは、Expand Hi-fidelity（登録商標）ポリメラーゼ（Boehringer Mannh eim，Corp.）を使用して30サイクル増幅した。肝細胞および無傷の肝臓第IX因子 遺伝子からのPCR増幅産物を、TAクローニングベクターpCR（登録商標）2.1（Inv itrogen、サンジエゴ、カリホルニア州）中にサブクローニングし、結合した物 質を使用して、凍結したコンピテントな大腸菌（E．coli）を形質転換した。PCR アーティファクトを排除するために、300ngの対照DNAを0.5、1.0および1.5μgの オリゴヌクレオチドとインキュベートしてから、PCR増幅反応を行なった。さら に1.0μgのキメラのみを、PCR増幅の「鋳型」として使用した。 RT-PCR増幅は、製造業者のプロトコールに従ってDNA PCR増幅について使用し たものと同じプライマーを使用して、Titian（登録商標）ワンチューブRT-PCRシ ステム（Boehringer Mannheim，Corp.）を使用して行なった。DNA汚染を回避す るために、RNAサンプルをRQI DNase遊離RNase（Promega Corp.、マジソン、ウィ スコンシン州）で処理し、RNase処理したRNAサンプルのRT-PCR陰性対照をRT-PCR 反応と平行して行なった。各PCR反応物を同じTAクローニングベクター中に連結 し、凍結したコンピテントな大腸菌（E．coli）中に形質転換した。 コロニーハイブリダイゼーションと配列決定。プレートに蒔いた後18〜20時間後 、コロニーをMSI MagnaGraphナイロンフィルター上に取り上げ、複製し、製造業 者の薦めに従ってハイブリダイゼーションさせた。フィルターを17量体オリゴヌ クレオチドプローブ365-A（5'-AAGGAGATAGTGGGGGA-3'）（配列番号24）または36 5-C（5'-AAGGAGATCGTGGGGGA-3'）（配列番号25）（Life technologies，Inc.，G aithersburg，MD）（ここで、下線を引いたヌクレオチドは突然変異誘発の標的 である）を用いて24時間ハイブリダイズにかけた。プローブを、（γ-32P）ATP （＞7,000Ci/mmol）とT4ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs，Inc .、ビバリー、マサチューセッツ州）で32P-末端標識した。１％SDS、５×デンハ ルツおよび200μg/mlの変性超音波処理サカナ精子DNAを含有する２×塩化ナトリ ウムクエン酸ナトリウム中で37℃でハイブリダイゼーションを行なった。ハイブ リダイゼーション後、フィルターを１×塩化ナトリウムリン酸ナトリウムEDTA、 0.5％SDSでリンスし、次に３Ｍテトラメチルアンモニウムクロリド、2mM EDTA（ pH8.0）、0.1％SDSを含有する50mMトリス−塩酸（ｐＨ8.0）で54℃で１時間洗浄 した（Melchior，W．B．& Von Hippel，P．H．「DNA中のdA.dTとdG.dC塩基対の 相対的安定性の変化」、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，70，298-302，1973）。N EN（登録商標）Reflectionフィルムで増感板を使用して-70℃でオートラジオグ ラフィーを行なった。Qiagen miniprepキット（Chatsworth、カリホルニア州） を使用して365-Aまたは365-Cとハイブリダイズするとして同定されたコロニーか らプラスミドDNAを調製し、mp13前進プライマーおよび逆プライマー、ならびに ラット第IX因子cDNAのヌクレオチド616〜638に対応する遺伝子特異的プライマー 5'-GTTGACCGAGCCACATGCCTTAG-3'（配列番号26）を使用してABI 370Aシーケンサ ー（Perkin-Elmer，Corp.、フォスターシティ、カリホルニア州）を使用して、 自動配列決定を行なった。 6.4 Chapel Hillイヌの血友病Ｂ突然変異の修正 動物で血友病を起こす（G→A）1477突然変異を有するChapel Hill株のイヌを 使用して、初代培養肝細胞を得た。突然変異を修正するために設計したCMVを以 下に示す。 肝細胞を、25kDa Lac-PEIまたはガラクトセレブロシド含有水性コアの陰性に 荷電した脂質小胞（Gc-NLV）中で複合体を形成した360nM DIXIで処理した。結果 を以下の表２に示す。 第IX因子遺伝子のヌクレオチド1477のＡからＧへの変換の頻度 （血友病ＢイヌのChapel Hill株からの初代肝細胞） *平行したトランスフェクション培養物のRT-PCRは、ＡからＧへの変換頻度11.1 ％を与えた。 6.5 GUNNラットのクリグラー-ナジャー様突然変異の修正 高ビリルビン血症を有する突然変異ラット（Gunnラットと呼ぶ）は、ビリルビ ン−ウリジンジホスホグルクロネートグルクロノシルトランスフェラーゼ（UGT1 A1）をコードする遺伝子中に単一のヌクレオチド欠失を有する。Roy Chowdhury ，J.ら、1991，J．Biol．Chem．266，18294。クリグラー-ナジャー症候群１型を 有するヒト患者はまた、UGT1A1遺伝子の突然変異を有し、一生続く高ビリルビン 血症を起こし、その結果脳の障害を引き起こす。Bosma，P．J.ら、1992，FASEB J.，6，2859；Jansen，P．L．M.ら、Progress in Liver Diseases，XIII，Boyer ，J．L.，& Ockner，R．K.、編者（W．B．Saunders，Phil．1995）、pp 125-150 。Gunnラット突然変異を修正するために設計したCMVであるCN3の構造を以下に示 す。 Gunnラット初代培養肝細胞を、上記プロトコールに従って150nM CN3で処理し たが、担体は、オリゴヌクレオチドホスフェート対イミンの比が１：４の第6.2. 2節の陰性に荷電したグリコシル化脂質小胞またはラクトシル化PEI担体である。 結果は、陰性に荷電したリポソームでは8.5％変換であり、ラクトシル化PEI担体 では3.6％変換であった。 前述のようにGunnラットに、25kDa Lac-PEIと複合体を形成したかまたは陰性 荷電したGc脂質小胞と複合体を形成したCN3 １mg/kgを注入した。遺伝子変換率 は、第IX因子について記載した方法に従ってクローニングとハイブリダイゼーシ ョンをすることにより測定した。以下の結果は、UGT1A1遺伝子のコピーの約15％ 〜25％が変換されたことを示す。 UGT-1遺伝子のヌクレオチド1239のＧの挿入頻度（Gunnラット） １ 初期変換頻度を測定した。 ２ 70％の部分肝切除の７日後の変換頻度を測定した。 Gunnラットに、前述のように25kDa Lac-PEIと複合体を形成したCN3 １mg/kgを 、５日間連続で注入した。最後の注入の25日後、血清ビリルビンは6.2mg/dlから 3.5mg/dlに低下し、さらに25日間このレベルに維持された。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                    For correcting genetic lesions in hepatocytes         In vivo use of recombinant oligonucleobases.   This application is related to U.S. Patent Application No. 60 / 045,288, filed April 30, 1997, US Patent Application No. 60 / 054,837 filed on August 5, filed on November 10, 1997 U.S. Patent Application No. 60 / 064,996, each of which is incorporated by reference in its entirety. (Herein incorporated by reference). 1. Field of the invention   The present invention provides an in vivo remedy for correcting a disease causing a genetic defect. Uses combinagenic oligonucleobases Methods and compositions for use. The present invention is particularly directed to the genetic modification of hepatocytes in a subject. Suitable for the treatment of a type of genetic defect in which the correction of the defect ameliorates the disease. 2. Background of the Invention 2.1 Use of chimeric mutant vectors that cause genetic changes in cultured cells   The inclusion of a publication or patent application in this section implies that the publication or its application The invention, if any, existed before the present invention or was not the inventor I do not tolerate anything that came from the thoughts of the old.   Published examples of recombinagenic oligonucleobases include 2-O-modified Contains both bonucleotides and deoxyribonucleotides, making it chimeric Chimeric Mutational Vectors (CMV) or chimeric plasts Called.   Has complementary deoxyribonucleotides and ribonucleotides, Oligonucleotides containing sequences homologous to a fragment of the phage Ml3mp19 were purchased from Kmiec , E .; B., et al., November 1994, Mol. and Cell. Biol. 14,7163-7172 ing. This oligonucleotide contains a single contiguous segment of ribonucleotides. Yes Was. By Kmiec et al., This oligonucleotide was obtained from Ustilago maydis. Was found to be a substrate for the REC2 homologous pairing enzyme.   Patent publication WO 95/15972 and its corresponding U.S. patent published June 15, 1995 No. 5,565,350 (the '350 patent) describes the introduction of genetic changes into eukaryotic cells. Has been described. Ustilago maydis gene and mouse ras gene Examples have been reported. The latter example is a sudden change in the ras gene in NIH 3T3 cells. Just as a difference results in the growth of cell colonies ("transformation"), It was designed to introduce a transforming mutation into the ras gene. The '350 patent The maximum rate of transformation of NIH 3T3 was less than 0.1% (ie, exposure to ras double-stranded CMV). 106About 100 transformants per cell). Ustilago maydi In the s strain, the transformation rate is 106It was about 600 per. Mutation in human bcl-2 gene Chimeric vectors designed to be introduced are described in Kmiec, E .; B., February 1996, Sem inars in Oncology 23, 188.   A double-stranded CMV designed to repair the codon 12 mutation in K-ras , E .; B., described in December 1995, Advanced Drug Delivery Reviews 17, 333-40 Have been. Double-stranded CMV was transformed into Capan 2 cell line, a cell line derived from human pancreatic adenocarcinoma. Tested on cells and transfected double-stranded CMV into Capan 2 cells using LIPOFECTIN® did. Twenty-four hours after introduction of double-stranded CMV, cells were harvested and genomic DNA was extracted; The fragment containing codon 12 was amplified by PCR and allele-specific Conversion was estimated by hybridization.   Mutations in the gene encoding liver / bone / kidney type alkaline phosphatase Double-stranded CMVs designed to repair differences are described in Yoon, K. et al., March 1996, Proc. Nat l. Acad. Sci. 93, 2071. The alkaline phosphatase gene , Transiently introduced into CHO cells by plasmid. After 6 hours, double-stranded CMV was introduced Was. Twenty-four hours after introduction of the double-stranded CMV, the plasmid was recovered and analyzed. From the results, About 30-38% of the potassium phosphatase gene is repaired by double-stranded CMV Indicated.   E. B. Kmiec, A .; Cole-Strauss and K. WO97 / 41411 by Yoon, and Cole- Strauss, A. et al., Sept 1996, Science 273, 1386, describe the genetic disease of hematopoietic cells. Used to treat patients (eg, sickle cell disease, thalassemia, and Gaucher disease) Discloses a double-stranded CMV. E. B. Kmiec WO97 / 48714 and its corresponding United States No. 5,731,181 discloses non-naturally occurring nucleic acids used for site-directed mutagenesis. Double-stranded CMVs with otide have been described. Kmiec and some of his collaborators The double-stranded CMV described in the application and literature is a DNA-DNA homoduplex central segment. And RNA: DNA heteroduplex or 2'-OMe-RNA: DNA heteroduplex furan Contains King segment. Kren et al., 1997, Hepatology 25, 1462-1468, Successful use of CMV in non-replicating primary hepatocytes has been reported. Kren et al., March 199. 8, Nature Medicine 4,285 contains the genetic code for blood coagulation factor IX in rats. The use of CMV in vivo to introduce genetic defects in offspring has been reported.   Kmiec and co-workers have shown that mitotically active cells (such as Ie, proliferating cells). Kmiec and his collaborators have CMV / liposome macromolecule carrier containing mixed liposomes or lipid vesicles with CMV The conjugate was used. In such a complex, CMV adheres to the surface of the liposome it is conceivable that. 2.2 Polyethylenimine for in vivo and in vitro transfection Use of macromolecular carriers   Branched-chain polyethyleneimine nucleates eukaryotic cells both in vivo and in vitro. It has been used as a carrier for introducing acids. Boussif, O. et al., 1995, Proc. N atl. Acad. Sci. 92, 7297; Abdallah, B. et al., 1996, Human Gene Therapy 7, 194. 7, Boletta, A. et al., 1997, 8, 1243-1251. DNA was added to cultured HepG2 The use of galactosylated polyethyleneimine in vitro to introduce a et al., October 1, 1997, reported by Bioconjugate Chemistry 8, 839-844. I have. Binding of transferrin, a protein ligand, to polyethyleneimine Transfer of test genes into cultured cells using synthetic and transferrin receptors. Its use has been described in Kircheis, R. et al., 1997, Gene Therapy 4, 409-4-18. ing. Branched polyethylene imines are secondary and broad-chain pKs. Containing tertiary amino groups, these polyethylenimines therefore have polylysine Substantially at a pH that exhibits little or no buffering capacity (ie, less than about 8) It has a good buffering capacity. Tang, M .; K., & Szoka, F.S. C., 1997, Gene Therapy 4 , 823-832.   In vivo and linear polyethylenimine for gene transfection. And in vitro use have been described by Ferrari, S. et al., 1997, Gene Therapy 4, 1100-11. Reported on 06. 2.3 Use of liposome carriers for in vivo transfection   Liposomes or lipids for introducing DNA encoding a foreign protein into cells The use of quality vesicles has been described. Encapsulated DNA methods are known, but most often The method used does not encapsulate the DNA, but rather positively charges the DNA. Attach to the surface of the posome. U.S. Pat.Nos. 4,235,871 and 4,394,448 involved I do. This area is described in Smith, J. et al. G. et al., 1993, Biochim. Biophy. Acta 1154, 327- 340 and Staubinger, R.A. M. et al., 1987, Methods in Enzymology 185, 512. There is a review. D in liposomes for transfecting hepatocytes in vivo The use of OTAP (cationic lipids) is described in Fabrega, A .; J. et al., 1996, Transplantation. 62, 1866-1871. Transfect various cells of adult mouse The use of cationic lipid-containing liposomes to perform Et al., 1993, Scienc e261, 209. Re-encapsulation of DNA for transfection The use of phosphatidylserine-containing lipids to form posomes is described in Fraley, R .; Et al., 1981, Biochemistry 20, 6978-87. 2.4 Asialoglycoprotein receptor for hepatocyte-specific transfection Use of   U.S. Patent Nos. 5,166,320 and 5,635,383 describe DNA, polycationic macromolecular carriers. And a complex comprising a ligand for the asialoglycoprotein receptor Discloses hepatocyte transfection. In some embodiments The macromolecular carrier was polylysine. Transfect hepatocytes in vivo To The use of liposomes containing lactosyl cerebroside for liposomes is described in Nandi, P .; K. et al., 1986 , J. et al. Biol. Chem. 261, 16722-16722. Reporter plasmid Of asialofetuin-labeled liposomes for transfecting hepatocytes with The use is described in Hara et al., 1995, Gene Therapy 2, 764-788. 3. Summary of the Invention   The present invention relates to a composition comprising a recombinant oligonucleobase, and a test subject. Introduce certain genetic changes into the DNA of the body's cells ("transmutation" ation) ”). Recombinajeni Nucleonucleobases are 60 salts of the sequence of the gene that is the target of trans mutation. Is a nucleobase polymer containing less than one group. The present invention is known or developed. Can be used with any recombinant oligonucleobase Wear. In certain embodiments, the recombinant nucleobase is a chimeric suddenly. Mutation vector (CMV), and the process of transmuting using CMV It is called "chimeraplasty". Such a conventional composition In contrast to the methods and methods, the compositions and methods of the present invention result in genetic alterations in vivo. Can be administered to test subjects. The present invention provides non-proliferative (ie, non-proliferative) Unexpected source that CMV is effective in transmuting cells Based in part on look. The present invention further provides a clathrin-coated pi ts) binds to cell surface receptor ligands that are incorporated into endosomes CMV that forms a complex with a macromolecular carrier that is suitable for chimeric plasticity (" Clathrin-coated pit receptor ").   In a specific embodiment, the present invention relates to a CMV, a diameter of 25 nm to 400 nm containing CMV. Aqueous core lipid vesicles; 25 nm to 4 in diameter containing lipid core containing lipophilic salt of CMV Selected from the group consisting of 00 nm lipid nanospheres; and polycationic salts of CMV. And a macromolecular carrier. Examples of polycations of such salts Include polyethyleneimine, polylysine and histone H1. An implementation Polycations have a weight average molecular weight greater than 500 Daltons and less than 1.3 Md A branched polyethyleneimine (PEI) salt having the formula:   The carrier is a cell receptor that is taken up into endosomes via clathrin-coated pits. It can be optionally substituted with a ligand of the receptor. In some embodiments, the ligand Is the lactosyl moiety and the receptor is the hepatocyte asialoglycoprotein receptor. You. Other receptors include transferrin, insulin, glucagon, EGF and There is a receptor for low density lipoprotein (LDL) and ligand binds to the receptor It may be a fragment of a natural ligand. Alternatively, the ligand may be a (naturally occurring ligand Or other ligands), any compound that specifically binds to the receptor Things. When administered to test individuals, the composition of CMV / macromolecular carrier / ligand The article further comprises a pharmaceutically acceptable aqueous carrier, such as a buffered saline solution. Cell culture When administered to a product, the composition may comprise a cell culture medium, which may be supplemented with serum. I).   A further embodiment of the present invention relates to a human subject having a genetic condition that causes a disease. Administration of the conjugate to an individual. The conjugate is administered parenterally or is suitable In certain embodiments, the complex is directly administered to an organ affected by the genetic condition that causes the disease. Given. In a further embodiment, the present invention is directed to test individuals and cell cultures. Including the use of CMV / macromolecular carrier / ligand complexes for chimeric plasticity of . 4. Definition   The present invention should be understood according to the following definitions.   OligonucleobaseIs a polymer of a nucleobase, which is Hybridize to DNA with complementary sequence by non-click base pairing Can be.   NucleobaseContains a base, which may be a purine, a pyrimidine, or a derivative thereof. Or an analog. The nucleobase isPeptide nucleobaseOf peptide nucleic acids Subunits and morpholine nucleobases and nucleosides and nucleos Contains leotide.NucleosideIs a nucleic acid containing a pentosefuranosyl moiety Base, for example, optionally substituted riboside or 2′-deoxyriboside Including. The nucleoside can be linked by one of several linking moieties, It may or may not contain phosphorus. Linked by an unsubstituted phosphodiester bond The combined nucleosides arenucleotideCall.Oligonucleobase chainHas one 5 'end and 3' end, which are the ends of the polymer. It is a polar nucleobase. Certain oligonucleobase chains are compatible with all types of nucleobases. A leo base can be included.Oligonucleobase compoundsAre complementary And one or more hybridized by Watson-Crick base pairing The compound containing the above oligonucleobase chain. Nucleobase is deoxyribo type Or it is a ribo type.RibonucleobaseMeans that the 2 'carbon is hydroxyl, alk Containing a nucleobase that is methylene substituted by ruoxy or halogen Pentose furanosyl.Deoxyribo-type nucleobasesIs a ribonucleic acid It is a nucleobase other than a leo base and does not contain a pentosefuranosyl moiety. Includes all nucleobases.   Oligonucleobase strandGenerally represent oligonucleobase chains and oligo Includes segments or regions of the nucleobase chain. Oligonucleobase strand Has a 3 'end and a 5' end. Oligonucleobase strands extend simultaneously with the strand When sex, the 3 'and 5' ends of the strand are also the 3 'and 5' ends of the strand.   regionIs a part of an oligonucleobase, the sequence of which is determined by a particular source (eg, For example, at least 15 nucleotides having the sequence of a fragment of the human β-globin gene Derived from a CMV with a region.segmentIs a C having a characteristic structure This is the MV part. A given segment or a given region is a 2'-deoxynucleotide. It can contain both tides and ribonucleotides. HoweverRibo-segment G Or2'- Deoxyribo-type segmentAre ribo-type and 2'-deoxyl, respectively. Contains only bovine nucleobases. 5. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION   From Section 5.2 below, the teachings on CMV will be It should be understood that it is applicable to o-bases. 5.1 Structure of chimeric mutation vector   The chimeric mutation vector (CMV) hybridizes with DNA having an appropriate sequence. (Ie, form Watson-Crick base pairs of purines and pyrimidines) Consists of a purine and pyrimidine polymer. Each CMV is complementary and shared At least 15 salts that can be combined (but not necessarily covalently linked) The first and second strands are divided. Oligonucleobase polymer Subunits are called nucleobases. Nucleobases can be purines or It contains a base which is limidine or an analogue or derivative thereof. Two tabs There is a nucleobase of ip. Ribo-type nucleobases are 2'-hydroxyl, substituted Ribonucleosides having a hydroxyl or 2'-halo-substituted ribose. All nucleobases other than ribonucleobases are deoxyribonucleobases It is.   The sequences of the first and second strands are at least two homologous to the target gene. And one that introduces a genetic change into the target gene, unlike the target gene, And more regions ("mutator regions"). Sudden The mutagenic region is immediately adjacent to the homologous region in both the 3 'and 5' directions. Book In a preferred embodiment of the invention, each mutagenic region has at least three bases. Flanking in both 3 'and 5' directions. Preferred embodiments of the present invention Wherein each mutagenic region is a ribo-type oligonucleotide of at least 3 bases. Leo base segments flank both the 3 'and 5' Does not necessarily have to be immediately adjacent to the mutagenic region. Flank ribotype The nucleobase segment need not be immediately adjacent to the mutagenic region, i.e. A part of a homologous region containing a deoxyribo-type nucleobase may be interposed. Everything The total length of all homologous regions is preferably at least 16 bases, more preferably About 20 nucleotides to about 60 nucleotides in length. CMV becomes mutagen If it contains two more separated homologous regions, the homologous region is more preferably Each is 8-15 bases long, most preferably 10 bases long.   At least two homologous regions of the first strand are located on the second strand. At least three consecutive Watson-Crick pairs of xyribonucleotide bases Consists of a bovine nucleobase. In a preferred embodiment, the first strand has 9 ~ 25 ribonucleobases and more preferably 20 ribonucleobases, These are the Watson-Crick pair on the deoxyribonucleotide base of the second strand. I agree. In one embodiment, the second strand has a ribonucleotide No base. In one embodiment, the mutagenic region of the first strand Consists of deoxyribo-type nucleobases, and Ranked. Alternatively, the mutagenic region is a ribonucleic acid of the first strand. A nucleobase and a second strand deoxyribo-type nucleobase. Good.   Preferably the mutagenic region is 20 or fewer bases, more preferably 6 or less. Or less bases, and most preferably 3 or less bases. The mutagenic region should be a phase of CMV so that insertion or deletion of the target gene is obtained. A length that differs from the length of the sequence that separates the region of target gene homology with the homologous region Good. When CMV is used to introduce a deletion into the target gene, There are no identifiable bases as in the region. Rather, the two separated in the target gene Mutations occur due to juxtaposition of homologous regions. For the purposes of the present invention, The length of the mutagenic region in CMV that introduces a deletion into the target gene is the length of the deletion. It is thought that. In one embodiment, the mutagenic region has a deletion of 6-1 bases. Or more preferably a deletion of 3 to 1 bases. Multiple isolated mutations Introduced by one CMV, where there are multiple mutagenic regions within the same CMV. Alternatively, to introduce multiple genetic changes within a single gene, or to use the same Use multiple CMVs simultaneously to introduce genetic alterations within multiple genes of a cell Can be In the present specification, the mutagenic region is also called a heterologous region.   In one embodiment, the CMV comprises 20-200 nucleobases and preferably 40-100 A single oligonucleobase chain of 0 nucleobases. In another embodiment, the CMV Contains first and second oligonucleobase chains of 20-100 bases each (where , The first strand comprises a first strand and the second strand comprises a second strand). The first and second strands are covalently linked by other than a nucleobase or It can only bind by click base pairing. The first strand and the second The covalent bonds of the strands are polyethylene glycol, poly-1,3-propane Oligoalkanediols such as diols or poly-1,4-butanediol To More can be created.   In another embodiment, the present invention provides a method for treating deoxynucleotides or deoxynucleotides. CMV containing oside and 2'-O substituted ribonucleotides or ribonucleosides Done using. Suitable substituents are the substituents C taught by the Kmiec application.1-6Alkanes including. Other substituents include those taught by US Patent No. 5,334,711 (Sproat). And patent publications EP629387 and EP679657 (collectively, Martin applications) teach There are substituents, which are incorporated herein by reference. This specification Ribonucleotides or 2'fluoro, chloro nucleotides of ribonucleotides Or a bromo derivative, or a substituted 2'-O as described in the Martin application or Sproat Ribonucleotides are referred to as "2'-substituted ribonucleotides." 2'-substituted ribonucleic acid Specific preferred embodiments of leotide are 2'-fluoro, 2'-methoxy, 2'-propyl Ruoxy, 2'-allyloxy, 2'-hydroxylethyloxy, 2'-methoxyethyl Loxy, 2'-fluoropropyloxy and 2'-trifluoropropyloxy A replacement ribonucleotide. In a more preferred embodiment, the 2'-substituted ribonucleotides Tide is 2'-fluoro, 2'-methoxy, 2'-methoxyethyloxy, and 2'-allyl. Is a luoxy-substituted nucleotide.   2'-substituted ribonucleosides are similarly defined. Ingredients for 2'-substituted ribonucleosides Preferred physical embodiments are 2'-fluoro, 2'-methoxy, 2'-propyloxy, 2'- Allyloxy, 2'-hydroxylethyloxy, 2'-methoxyethyloxy, 2'- Fluoropropyloxy and 2'-trifluoropropyloxy substituted ribonucleic acid It is Ochido. A more preferred embodiment of the 2'-substituted ribonucleoside is 2'-fluoro , 2'-methoxy, 2'-methoxyethyloxy, and 2'-allyloxy substituted nucleotides It is Ochido.   The term "nuclease resistant ribonucleoside" refers to a 2'-substituted ribonucleoside. Encompasses all 2'-substituted ribonucleotides and non-ribonucleotides Including droxyl ribonucleoside. In a preferred embodiment, the CMV is preferably , At least three and more preferably six nuclease-resistant ribonucleotides Including In one preferred embodiment, CMV is a nuclease-sensitive ribonucleic acid. Contains no reoside. In another preferred embodiment, all other ribonucleic acids Oh Sid is nuclease resistant. Certain 2'-blocking groups are purines or Limidine can be synthesized more easily. One embodiment of CMV Only ribonucleoside purines or ribonucleoside pyrimidines It is creatase resistant.   CMV also contains at least three nuclease-resistant ribonucleobases It is characterized by doing. In a preferred embodiment, all ribonucleobases Is nuclease resistant. 5.2 Formulations suitable for in vivo use   Prior art formulations of CMV and macromolecular carriers have lower capacity for CMV and Lack of protection from exoenzymes limits their usefulness in vivo. The present invention Three alternative macromolecular carriers are provided that overcome these limitations of line technology. these The carrier is polyethyleneimine (PEI), an aqueous core lipid vesicle, Also called lamellar liposomes and lipid nanospheres.   Each carrier is further provided with a ligand complementary to the cell surface protein of the target cell. Can be provided. Such ligands are responsible for the uptake of CMV into target cells. Useful for increasing both quantity and specificity. In one embodiment of the present invention Target cell is a hepatocyte and ligand binds to asialoglycoprotein receptor It is a galactose-type monosaccharide or a lactose-type disaccharide. 5.2.1Polycationic carrier   The invention is non-toxic when administered to cells in vitro or to a subject in vivo. This can be done using any polycation. A suitable example is polylysine , Polybasic amino acids such as polyarginine, basic proteins such as histone H1 , And branched-chain polyethyleneimine: (-NHCHTwoCHTwo-)X[-N (CHTwoCHTwoNHTwo) CHTwoCHTwo-]YWhat There are any synthetic polymers.   The present invention provides that the average molecular weight is about 500 Daltons or more, preferably about 10 Kd or more, and More preferably has a molecular weight of about 25 Kd or more (mass average molecular weight measured by light scattering). It can be performed using any desired branched polyethyleneimine (PEI). On appropriateness Limits are determined by the toxicity and solubility of PEI. Toxicity and insoluble with a molecular weight of about 1.3Md or more Resolvability makes PEI materials inappropriate. Carrier for transfecting cells with DNA The use of high molecular weight PEI as is described in Boussif, O. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci . 92, 7297, which is incorporated herein by reference. You. The PEI solution can be prepared by the method of Boussif et al.   The CMV carrier complex is prepared by mixing an aqueous solution of CMV and a neutral aqueous solution of PEI with 9 to It is made by mixing at a ratio of 4 PEI nitrogen. In a preferred embodiment, This ratio is 6. For example, the complex can be combined with a 10 mM PEI solution (pH 7.0) in 0.15 M NaCl. Can be created by mixing with CMV to create a final CMV concentration of 100-500 nM. it can.   In addition, the ligand of the clathrin-coated pit receptor can be polycation or polycation. It can be bound to a fraction of ions. In one embodiment, the ligand is Mono- or disaccharides that bind to asialoglycoprotein receptors (eg, lactose, galactose) Toose, or N-acetylgalactosamine). Responsible for binding ligand Any method can be used. Optimal ligand vs. polyethylene subunit The ratio is determined by fluorescently labeling CMV and directing the fluorescent CMV / molecular carrier / ligand complex to the target tissue. Indirect injection and fluorescent uptake according to the method of Kren et al., 1997, Hepatology 25, 1462-1468. It can be quantified by measuring the degree of blemishes.   Lactosylated and unmodified PEI with a ratio of 0.4-0.8 lactosyl moieties per nitrogen Good results can be obtained using a 1: 1 mixture with This mixture Used at a ratio of 4-9 PEI nitrogen per CMV phosphate. Oligonucleophosphate A suitable ratio of g to nitrogen is 1: 6. Has a weight average molecular weight of 25Kd and 800Kd PEI (Aldrich Chemical Co., catalog nos. 40,872-7 and 18,197- 8) and good results can be obtained.   In another embodiment, the polycationic carrier is a basic tannin such as histone H1. Protein, which can be replaced by a ligand for clathrin-coated pit receptor Can be. The present invention can be practiced using a 1: 1 (w / w) mixture of histone and CMV. Can be. 5.2.2Useful lipids for carriers   The choice of lipid and lipid nanosphere carrier for incorporation into the lipid vesicles of the present invention is critical. Not crucially important. Lipid nanospheres are semi-purified lipid biological preparations, such as Soybean oil (Sigma Chem. Co.), egg phosphatidylcholine (EPC) (Avanti Polar L) ipids). Lipid nanospheres and / or fats Other lipids useful for preparing vesicles include neutral lipids such as dioleoyl phosphatid. Zircholine (DOPC) and dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) ), Anionic lipids such as dioleoylphosphatidylserine (DOPS), and And cationic lipids such as dioleoyltrimethylammonium propane (DOTAP ), Dioctadecyldiamidylglycylspermine (DOGS), dioleoyltrime Tylammonium (DOTMA) and DOSPER (1,3-di-oleoyloxy-2- (6- (Carboxy-spermyl) -propyl-amide tetraacetic acid, available from Boehringer-Mannheim Sold). Further examples of lipids that can be used in the present invention are Gao, X. and And Huany, L., 1995, Gene Therapy 2, 710. Sugar ligand is sugar sel The form of the broside (eg, lactosyl cerebroside or galactocerebroside ( Avanti Polar Lipids)).   The specific choice of lipid is not critical. Hydrogenated EPC or lysolecithin Can be used instead of EPC. DPPC (Dipalmitoyl phosphatidyl (Lucolin) to increase the effectiveness and / or stability of the Can be improved. 5.2.3Construction of lipid nanosphere carrier   The lipid nanosphere can be constructed by the following method. Phospholipid meta Add a solution of methanol or chloroform to a small tube and add a stream of nitrogen. The solvent is removed leaving a lipid film. Add CMV saline solution to cationic lipid Mix with the phenolic solution to form the lipophilic salt of CMV. The cationic species is CMV anion Good results are obtained with about a 4-fold molar excess over (phosphate). Lipophilic Add the CMV salt solution to the lipid film, vortex gently, and then add Add an equal weight of neutral lipid. CMV concentration up to about 3% of total lipid (W / W) It may be.   After the addition of neutral lipids, a milky suspension forms until no clear separation can be seen. Sonicate the emulsion at 4 ° C. for 1 hour. Until the final diameter is about 50nm Extrude the suspension through a polycarbonate filter. Target cells are reticulum cells The preferred diameter of the lipid nanosphere is about 100-200 nm. Next, carry CMV Wash lipid nanospheres and place in pharmaceutically acceptable carrier or tissue culture medium . The capacity of lipid nanospheres is about 2.5 mg CMV per 500 μl of nanosphere suspension. is there. 5.2.4Construction of lipid vesicles   Lipid film is prepared by placing a solution of lipid in methanol To remove the solvent. The amount of CMV is 20% to 50% of the amount of lipid ( w / w) and the amount of aqueous solvent is about 80% (w / w) of the amount of lipids in the final mixture Add CMV saline solution as above. After gentle vortex mixing, the final diameter is about 5 Continuously finer the liposome-containing liquid to a finer polycarbonate Pass through Luther membrane. Continuously passing through a finer polycarbonate filter membrane, Multilamellar liposomes are converted to unilamellar liposomes (ie, vesicles). Target cells In the case of reticuloendothelial cells, the preferred diameter of the lipid nanosphere is about 100-200 nm. Next, the CMV-supported lipid nanospheres are washed, and a pharmaceutically acceptable carrier or tissue culture is performed. It can be placed in the medium.   CMV is captured in the aqueous core of the vesicle. About 50% of the added CMV is captured.   A variation on the basic method is PEI / CMV enrichment at a ratio of about 4 PEI imines per CMV phosphate Including the preparation of aqueous solutions containing substances. When the liposome is positively charged (ie, DOTAP with a higher concentration of lipid vesicles than the concentration of anions in anionic lipids such as DOPS Containing the concentration of the cation of a cationic lipid, such as DOTMA or DOSPER, Concentrates are particularly useful. The capacity of lipid vesicles is about 15 per 500 μl of lipid vesicle suspension. 0 μg of CMV.   In a preferred embodiment, the lipid vesicle comprises an anionic phospholipid DOPS and a neutral lipid (eg, For example, DOPE or DOPC). Used to create lipid vesicles Another negatively charged phospholipid is dioleoylphosphatidic acid (DOPA). Contains dioleoyl phosphatidyl glycerol (DOPG). More preferred embodiment In this case, the neutral lipid is DOPC, and the ratio of DOPS: DOPC is 2: 1 to 1: 2. Or about 1: 1. The presence of less than 10% of charged lipids is The ratio of negatively charged lipid to neutral lipid is greater than 1: 9 to destabilize the vesicles There must be.   Specific lipid vesicle formation is easily detectable in transfected target cells Transfer the target cell population with an approximately 5.0 kb long plasmid expressing the desired product Can be tested using the formulation to be tested. Plasmid is imine: If the phosphate ratio is enriched in PEI at 9-4: 1, transfect cells with plasmid. Lipid vesicles can be used to effect the infection. Transform cells with plasmid The ability of transfected lipid vesicles to transfect cells by introducing CMV into cells Indicate the ability of the formulation to be applied.   Certain lipids (especially polycationic lipids) are specific cell lines and primary cell cultures. May be toxic to substances. Lipid vesicle formation avoids such toxic lipids. Should be adjusted so that   The ligand for the clathrin-coated pit receptor can be introduced into lipid vesicles by various means. You can enter. Cerebroside (eg, lactocerebroside or galacto) Tocerebroside) can be introduced into the lipid mixture, asialoglycoprotein It is incorporated into vesicles to produce the ligand for the receptor.   In another embodiment, the lipid vesicles further insert themselves into the lipid bilayer of the vesicle. Internal membrane proteins. In a specific embodiment, the protein is A virus called either the die virus or the Japanese hemagglutinating virus (HVJ) It is a fusigenic (F-protein) derived from Ruth. DNA to liver, heart Preparation of F-proteins containing lipid vesicles for introduction into muscle and endothelial cells And use has been reported. For example, U.S. Patent No. 5,683,866, International Application PCT JP97 / 00612 (published as WO 97/31656). Also, Ramani, K. et al., 1 996, FEBS Letters 404, 164-168; Kaneda, Y. et al., 1989, J. Am. Biol. Chem. 264, 121126-12129; Kenada, Y. et al., 1989, Science 243, 375; J. et al., Proc . Natl. Acad. Sci. 93, 11421-11425; Aoki, M. et al., 1997, J. Am. Mol. Cardiol. Two See also 9, 949-959. 5.3Diseases and disease-specific CMV   The present invention relates to a disease-causing mutation, wherein the mutation causes one or more mutations. More than one nucleotide changes, or insertion or deletion of 1 to about 30 nucleotides To cause loss). In the preferred embodiment Thus, the deletion or insertion is from 1 to about 6 nucleotides. Cause this disease The mutation is a CMV containing the sequence of the wild-type gene homologous to the mutation locus. Is corrected by administering A mutated DNA sequence flanking a heterologous region There is a region of homology, i.e. of the wild-type sequence deleted from the mutant The CMV is constructed such that there is a region of the CMV containing the part. Mutation from insertion In some cases, the heterologous region of CMV is considered to be a point homologous to the insertion site. Therefore C The length of the heterologous region of the MV is considered to be the length of the insertion in the mutant sequence. Only However, the sequence of the CMV is determined by the location of the mutation, and the sequence of the mutation is not important. Please note that Instead, the sequence of CMV is always the sequence of the wild-type gene or Is the desired related sequence. In each of the following sequences, the heterologous region is underlined. It has been given.   A first embodiment of the present invention provides a mutation that causes von Willebrand disease. A CMV that can be used to modify. CMV that corrects this mutation , Sequence 5'-CTC GGA GAGCCCC CTC GCA-3 '(SEQ ID NO: 1), having the same nucleotide sequence Sequence of mixed ribo-deoxyribooligonucleobases, or thymine is uracil Contains a sequence that differs by being substituted with, or its complement. Pho The tissue in which the Nwillbrand factor gene needs to be modified is the vascular endothelium.   A further embodiment of the present invention relates to a mutation causing hemophilia B, which is a human (A → C substitution of nt1234 in the coagulation factor IX gene) It is a CMV that can be done. The CMV that corrects this mutation has the sequence 5'-CAA GGA GATAGT GGG  GGA C-3 '(SEQ ID NO: 2), mixed ribo-deoxyribooligo having the same base sequence Depends on the sequence of the nucleonucleobase, or thymine is replaced with uracil It contains the sequence, or its complement. The present invention provides a human coagulation factor IX gene. Can be used to correct other mutations, the sequence of which can be found in Kurachi, K .; Et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6461-6464 (this is for reference only) (Herein incorporated by reference). Factor IX gene must be corrected The tissue in need is hepatocellular liver.   A further embodiment of the present invention is directed to a Z-mutant causing α1-antitrypsin deficiency. CMV that can be used to correct mutations. The Z mutation is human α1- G → A substitution located at nt1145 of antitrypsin. Fix this mutation CMV is 5'-ACC ATCGAC GAG AAA GGG A-3 '(SEQ ID NO: 3), having the same nucleotide sequence Sequence of mixed ribo-deoxyribooligonucleobases, or thymine is uracil Contains a sequence that differs by being substituted with, or its complement. Departure Ming is used to correct other mutations in the α1-antitrypsin gene. And the array is Long, G. L. et al., 1984, Biochemistry 23, 4828-4837. Have been described and are hereby incorporated by reference. α1-anti The tissue in which the trypsin gene needs to be modified is hepatocyte liver.   Further embodiments of the invention cause familial hypercholesterolemia (FH) Used to correct mutations in the low density lipoprotein receptor (LDLR) It is a CMV that can be done. No single mutation causes most of FH cases . More than 105 point mutations or insertions or deletions of 25 nt or less Hobbs, H .; H. et al., 1992, Hum. Mutat. 1, 445-466 and Leren, T .; P. Hum. Genet. 95, 671-676 (these are incorporated by reference in their entirety. To be part of a small book). The complete sequence of the human LDLR cDNA is available from Yamamoto , T .; Et al., 1984, CELL 39, 27-38. LDL to improve FH The tissue that can modify R is hepatocyte liver.   A further embodiment of the present invention relates to glucocerebrosidase causing Gaucher disease CMV that can be used to correct mutations in the ze gene. Gaucher The structure of CMV that can be used to correct disease mutations is It is found in patent application Ser. No. 08 / 640,517. Glucose to improve Gaucher disease The tissue in which the cerebrosidase mutation can be corrected is the retinal system (Kupfer cells) liver It is.   A further embodiment of the present invention provides glucose-induced glucose-1 disease (GSD). Use for correcting mutations in the 6-phosphatase (G-6-P) gene It is a CMV that can be done. The complete sequence of human G-6-P is described in Lei, K.-J., et al., Science 262,5. 80, which is incorporated herein by reference. Le i, K.-J. et al. Clin. Investigation 95, 234-240 (this is by reference The most common two that cause type 1 GSD, as described in One mutation is a C → T of nt326, a C → T of nt1118, and a TA insertion of nt459. The CMV for correcting the two most common mutations is 5'-TTT GGA CAGCGT CCA TAC T-3 '(SEQ ID NO: 4) or 5'-TGC CTC GCCCAG GTC CTG G-3 '(SEQ ID NO: 5), sequence of mixed ribo-deoxyribooligonucleobase having the same base sequence , Or a sequence that differs by the substitution of thymine with uracil, or its complement Contains body sequences.   A further embodiment of the invention catalyzes the condensation of ornithine with carbamyl phosphate Orcinin transcal, an X-binding gene that produces citrulline and phosphate In CMV that can be used to correct mutations in the Bamylase (OTC) gene is there. The complete sequence of the human OTC cDNA can be found in Horwich, A .; L. et al., 1984, Science 224, 1 068, which is incorporated herein by reference. O The structure of the TC gene and the structure of the identified mutant are described in Tuchman, M., 1992, Hum. outlined in An Mutation 2,174.   A further embodiment of the present invention relates to a human U Used to correct mutations in the DP-glucuronosyltransferase gene. CMV that can be used. Human UDP-glucuronosyltransferase gene The sequence of Bosma, P .; J. et al., 1992, Hepatology, 15, 941-7 (see And incorporated herein by reference). Crigler-Nadja disease UDP-glucuronosyltransferase gene modified to improve climate group Is a hepatocyte liver.   A further embodiment of the invention is a galactose-causing galactosemia. Used to correct mutations in the 1-phosphate uridyltransferase gene Is a CMV that can Human galactose-1-uridyl transphosphate The sequence of the ferase gene is described in Flack, J .; E. et al., 1990 Mol. Biol. Med. 7,365 Molecular biology and population genetics of galactosemia have been described by Reichert, J. . K. V. et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 2633-37 and Reichert, J.M. K . V. et al., 1991, Am J. Hum. Gen. 49,860 (these are hereby incorporated by reference. book To be part of). The most common causing galactosemia The mutation is a Q → R at amino acid 188. CMV to fix this mutation , Sequence 5'-CC CAC TGC CAG GTA TGG GC-3 '(SEQ ID NO: 6), having the same nucleotide sequence Sequence of mixed ribo-deoxyribooligonucleobases, or thymine is uracil Contains a sequence that differs by being substituted with, or its complement.   A further embodiment of the present invention relates to phenylketonuria (PKU) or high phenyl Phenylalanine hydroxylase (PAH, phenyl Alanine 4-monooxygenase, EC1.14.16.1) to correct mutations CMV that can be used. Molecular genetics and population of phenylketonuria Genetics are described in Woo, SLC, 1989, Biochemistry 28, 1-7, and human PAH The sequence of Kowk, S. C. M. et al., 1985, Biochemistry 28, 556-561 (see As part of this specification). Sudden change causing PKU Further examples of differences are described in Sworniczak, B. et al., 1992, Hum. Mutat. 1, described in 138-146 Have been.   The present invention relates to beneficial changes in the "normal" gene (the identity of such beneficial changes is identified Those skilled in the art can understand that . For example, as many as one out of 3,000 people have truncated lipoprotein Apo B Serum cholesterol of 100 mg / dl or less due to heterozygosity for the gene Has a role level. Kane, J .; P. And Havel, R .; J., The Metabolic Basisof Inherited Disease, Volume 2 (1995, McGraw Hill, NY) p.1866. As used herein, “disease-causing mutation” means that a “normal” gene is If the rare allele associated with (ie, atherosclerosis) is heterozygous and the disease Includes examples such as the apoB gene that are protective. So in these situations, The statistically most frequent genes are considered "genes that cause disease" Genes with alterations are considered "wild-type genes." 5.4 Use of the formulation in vivo   The CMV of the present invention is administered parenterally directly to the target organ at a dose of 50 to 250 μg / gm. be able to. CMV / macromolecular carrier when target organ is liver, muscle or kidney The complex can be injected directly into the organ. Transient when the target organ is the liver Intravenous infusion into the hepatic vein or portal vein of the liver, whose circulation has been blocked Wear. Alternatively, the CMV / macromolecule complex can also be a ligand targeting the liver (eg, For example, lactosyl or galactosyl saccharide) and CMV into the systemic circulation / Allow intravenous administration of macromolecular conjugates.   When the target organ is the lung or its tissue, for example, bronchiolar epithelium by aerosol CMV / macromolecular complexes can be administered. Small particles of liposome / DNA complex Aerosol delivery is described in Schwarz L. et al. A. et al., 1996, Human Gene Therapy 7, 731-741. Has been described.   When the target organ is the vascular endothelium, for example in von Willebrand disease, CMV / Macromolecular complexes can be delivered directly into the systemic circulation. Other organs are liposomes Liposomes containing ligands that allow the cell to transmigrate from endothelial cells in the circulatory system Can be used to target.   For enzyme deficiency, by modifying the genes of about 1% of the cells in the affected tissue A therapeutic effect is obtained. In tissues where parenchymal cells have an extended lifespan (eg, liver), CMV The treatment effect can be repeated to increase the therapeutic effect. 6. Example 6.1 CMV / macromolecular carrier complex 6.1.1Lipid nanosphere material   Egg phosphatidylcholine (EPC), DOTAP and galactocerebroside (Gc) ( Avanti Polar Lipids); soybean oil (Sigma Chemical Co.); dioctadecyldia Midoglysyl spermine (DOGS®) (Promega). Method   EPC, DOTAP and Gc are pre-defined in chloroform or anhydrous methanol. Dissolve at constant concentration and in small glass vials in a drying vessel at -20 ° C until use Saved. EPC (40-45 mg), DOTAP (200 μg) and Gc (43 μg) An aliquot was taken in a 10 × 75 mm boron silicic acid test tube, and the solvent was removed with a stream of nitrogen. CMV is diluted with 0.15 M NaCl (about 80-125 μg / 250-300 μl); DOGS (ethanol As a 10 mg / ml solution in 250-300 μl 0.15 with 3-5 times the weight of added CMV Diluted in M NaCl. Gently vortex the two solutions to mix the contents The CMV solution was gently added to the DOGS solution. Beat the test tube gently and invert several times. The contents were mixed. The DOGS-complex solution is added to the dried lipid and then the soybean oil (40-45 mg) was added, the mixture was vortexed at high speed for several seconds, and the bath was cooled to FS-15 (Fisher Sc ientific) In a bath sonicator, sonicate for about 1 hour in a room temperature controlled at 4 ° C. Was. From time to time the tubes were removed from the bath and vortex mixed. Milk that looks uniform Pore size of 50 nm when a turbid suspension (no apparent separation of oil droplets) is formed And extruded through a series of polycarbonate membranes. 4 to use the preparation C. and vortex mixed before use. 6.1.2Negatively charged targeted lipid vesicles material   Dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), dioleoylphosphatidylse Phosphorus (DOPS), galactocerebroside (Gc) or lactosylcerebroside (Av anti Polar Lipids). Method   DOPS, DOPC and Gc in a molar ratio of 1: 1: 0.16 (total lipid 500 μg) in chloroform : Dissolve in methanol (1: 1 v / v), then dry under a stream of nitrogen to obtain a uniform lipid Got Lum. CMV was diluted with 500 μl of 0.15 M NaCl (about 100-250 μg / 500 μl) . The solution was added to the lipid film at room temperature. Gentle vortex mixing and heating (37- (In a 42 ° C. water bath) was alternately repeated to completely disperse the lipid. Even milky After the suspension has been produced, a series of liposofast® mini-extruders are used. Push through polycarbonate membrane (pore size 0.8, 0.4, 0.2, 0.1 and 0.05μm) Issued. Extrusion was performed 5 to 7 times for each hole diameter. After preparation, use lipid vesicles until use Stored at 4 ° C. Under these conditions, the lipid vesicles were stable for at least one month. The final product can be lyophilized. 6.1.3Neutral target lipid vesicles material   Dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), dioleoylphosphatidylcholine Tanolamine (DOPE), galactocerebroside (Gc) or lactosylceleb Rosiside, (Avanti Polar Lipids). Method   DOPS, DOPC and Gc (1: 1: 0.16 molar ratio) or DOPC: Gc (1: 0.08) Dissolve in chloroform: methanol (1: 1 v / v), then dry under a stream of nitrogen and average. One lipid film was obtained. 500 μl of oligonucleotide (or chimeric molecule) Diluted with 0.15 M NaCl (about 100-250 μg / 500 μl). Lipid film with solution at room temperature Added. Gentle vortex mixing and heating (in a 37-42 ° C water bath) alternately Turn back to completely disperse the lipids. After a uniform milky suspension is formed, Lipo Using a sofast® mini extruder, a series of polycarbonate membranes (pore size 0. 8, 0.4, 0.2, 0.1 and 0.05 μm). Extrusion is 5 holes for each hole diameter. Performed ~ 7 times. After preparation, the lipid vesicles were stored at 4 ° C. until use. Prepared fat The size of the vesicles was stable for about 5 days. 6.1.4Positively charged targeted lipid vesicles material   Dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), dioleoyltrimethylammonium Nium propane (DOTAP), galactose cerebroside (Gc) or lactosyl Cerebroside, (Avanti Polar Lipids). Polyethyleneimine (PEI) (molecular weight 800Kd), Fluka Chemicals. Method   DOPS, DOTAP and Gc (6: 1: 0.56 molar ratio) (500 μg total lipids) Lum: Dissolve in methanol (1: 1 v / v), then dry under a stream of nitrogen to obtain a uniform lipid A film was obtained. PEI was diluted to a concentration of 45 mg / 100 ml using water. The pH of the solution Adjusted to 〜7.6 using HCl. Prepare a PEI stock solution each time and add approximately 50 nmol It was equal to min / μl. CMV was diluted in 0.15 M NaCl at a concentration of ~ 125 μg in 250 μl Was. PEI was further diluted in 250 μl of 0.15 M NaCl to obtain oligonucleotide / chimera There was about 4 moles of PEI amine per mole of phosphoric acid. CMV PEI solution The solution (all at room temperature) was added dropwise and vortex mixed for 5 to 10 minutes. Then PE The I-complex solution was added to the lipid film to disperse the lipid as described above. uniform mill After a suspension similar to that of a liquid has been formed, it can be removed using a Liposofast® mini-extruder. Through a continuous polycarbonate membrane (pore size 0.8, 0.4, 0.2, 0.1 and 0.05 μm) I started. Extrusion was performed 5 to 7 times for each hole diameter. After preparation, the lipid vesicles are At 4 ° C. Under these conditions, lipid vesicles were stable for at least one month . For longer-term, completed stability, the final product can be frozen. 6.1.5Lactosylated PEI / PEI complex   PEI (25 kDa) from Aldrich Chemical (Milwaukee, Wis.) Purchased. PEI (800 kDa) is available from Fluka Chemicals (Ronkonkoma, NY, United States). PEI lactosylation converts oligosaccharides to protein This was accomplished by a modification of the previously described method for conjugation. Brief description Then, ammonium acetate (0.2 M) or Tris buffer (0.2 M) (pH 7.6) was dissolved. 3-5 ml of PEI (0.1-1.2M in the liquid)monomer) With 7-8 mg of sodium cyanoborohydride Lium (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) and about 30 mg lactose in water Incubate with Japanese soybean (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) did. The reaction was performed in a 37 ° C shaking water bath with the stopper tightly closed in a polypropylene test tube. became. After 10 days, the reaction mixture is added to distilled water (500 ml) for 48 hours, and water is applied once or twice. Replaced and dialyzed. The purified complex is aseptically filtered through a 0.2 μm filter and kept at 4 ° C. Existed. The amount of sugar (as galactose) bound to PEI is It was measured by the acid method.   The number of moles of free amine (primary + secondary) in lactosylated PEI is measured as follows The standard curve was generated using a 0.02 M stock solution of PEI; Dilute several aliquots to 1 ml in glass tubes using deionized water, Next, 50 μl of ninhydrin reagent (Sigma Chemical Co., St. Louis) was added to each tube. , Missouri) and vortexed vigorously for 10 seconds. 10-12 minutes at room temperature The color was allowed to proceed, then the O.D. was read at 485 nm using a Beckman DU-64 spectrophotometer ( Within 4 minutes). A 20-50 μl aliquot of the L-PEI sample was processed as above and The number of moles of released amine was determined from a standard curve. The lactosylated PEI (L-PEI) complex is Prepared as follows: 3 mmol equivalents of L-PEI per mmol of RNA / DNA phosphate The amine and 3 mmol of amine as PEI are mixed together and optionally 0.15 M NaCl The mixture was added dropwise to the solution of the chimeras and vortex mixed for 5 minutes did.   To demonstrate complete binding of chimeric oligonucleotides to PEI or L-PEI And gel analysis (4% LM) of uncomplexed and complexed chimeras. P agarose). Nuclease content provided by chimera complexation Samples were treated with RNAse and DNAse to quantify the extent to the solution. Chloro After extraction with formphenol, the complex was separated using heparin (50 units / μg nucleic acid). Upon disassembly, the product was analyzed on a 4% LMP agarose gel. 6.2 Demonstration of PEI / CMV-mediated changes in rat and human factor IX   material. Fetal bovine serum was obtained from Atlanta Biologicals, Inc. (Atlanta, Georgia ). Terminal transferase, fluorescein-12-dUTP, Expand ® High Fidelity PCR System, dNTPs and High Purity PCR Template Preparation Kit ehringer Mannheim Corp. (Indianapolis, Indiana). Reflection® NEF-496 autoradiography film and Reflection (Registered trademark) NEF-491 intensifying screen is a DuPont NEN (registered trademark) Research Prod Obtained from ucts (Boston, Mass.). Polyethylene imine (PEI) 8 00kDa is available from Fluka Chemical Corp. (Ronkonkoma, NY). [Γ -32[P] ATP was obtained from ICN Biochemicals, Inc (Costa Mesa, CA) . pCR® 2.1 was obtained from Invitrogen (San Diego, Calif.) . OTPTIMEM®, Dulbecco's Modified Eagle Medium, William E Medium And oligonucleotides 365-A and 365-C are available from Life Technologies, Inc. (Gaithers burg, Maryland). 30,000 molecular weight cut-off spin filter Is Millipore Corp. (Bedford, Mass.). Dila nd SlowFade® Antifade Mounting Medium is available from Molec ular Probes, Inc. (Eugene, Oregon). T4 polynucleotide Kinases are available from New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.) Purchased. MSI MagnaGraph membranes are available from Micron Separations, Inc. (Westboro, Ma Purchased from S.A. Primers used for PCR amplification were Oligos Et c., Inc. (Wilsonville, Oregon). Tetramethyl ammonium chloride Loride was purchased from Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) . All other chemicals are molecular biology or reagent grade, and Aldrich Chemic al Company, Milwaukee, Wisconsin, Curtin Matheson Scientif ic, Inc. (Eden Prairie, Minnesota), and Fisher Scientific (Itasca, (Illinois).   Oligonucleotide synthesis. Chimeric RNA / DNA oligonucleotides HIXF, RIXF and And RIXR were synthesized. CMV is used for DNA and 2'-O-methyl RNA phospho on the ABI394 synthesizer. Prepared with holamidite nucleoside monomer. DNA phosphoramidite exocyclic amino acid Benzoyl (adenosine and cytidine) and isobutyryl (guanosine) ) Protected. The protecting group on the 2'-O-methyl RNA phosphoramidite is For phenoxyacetyl, for cytidine isobutyryl, and guanosine. Dimethylformamide was used. After synthesis, the base protecting group is And heated at 55 ° C. for 20 hours in concentrated ammonium hydroxide. Crude oligonucleotide Otide was electrophoresed on a 15% polyacrylamide gel containing 7M urea and DNA Was visualized by UV shadowing. Elute the chimeric molecule from the gel slice, The precipitate was concentrated, and desalted using a G-25 spin column. > 95% purified oligo The nucleotides were full length.   The sequences of wild-type and "mutant" rat factor IX are:   The structure of RIXR, RIXF and HIXR CMV is as follows: Chimeric oligonucleotides  Uppercase letters are deoxyribonucleotides, lowercase letters are 2'-OMe-ribonucleotides. Is. The nucleotides in the heterologous region are underlined.   Cell culture, transfection and hepatocyte isolation. HuH-7 cells were transformed to 10% (vol / vol) Humidified CO in Dulbecco's modified Eagle's medium containing heat-inactivated fetal bovine serum.Two Maintained at 37 ° C. in the atmosphere. 24 hours before transfection, 1 × 10Fivecell Was plated on a 35 mm culture dish. At the time of transfection, cells are transferred to OPTIMEM (registered trademark). (Marker) The cells were rinsed twice with the medium and transfected with 1 ml of the same medium. G Eighteen hours after transfection, contains 20% (vol / vol) heat-inactivated fetal calf serum Add 2 ml of Dulbecco's Modified Eagle's Medium to each 35 mm dish and keep the cells for an additional 30 hours. And then harvested for DNA isolation. PEI (800kDa) 10mM stock solution (pH 7.0) was prepared. Briefly, a chimeric oligonucleotide is prepared at 10 mM PEI. With 9 equivalents of PEI nitrogen per chimeric phosphate in 100 μl of 0.15 M NaCl, 150 nM final concentration Transfected with M (4 μg), 300 nM (8 μg) and 450 nM (12 μg). 18 After hours, an additional 2 ml of medium was added and the chimera concentration was reduced for the remaining 30 hours of culture. It was reduced to 50 nM, 100 nM and 150 nM, respectively. HuH-7 vehicle control transfer The same amount of PEI was used as for HuIXF transfection. Uses an equal volume of 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) instead of oligonucleotide did.   Primary rat hepatocytes were weighed with a 250 g male Sprague-Dawley rat (Harlan Sprague-Da wley, Inc.) (Fan et al., Oncogne 23: 1909-1919, 1996). ) (This is incorporated herein by reference). Isolate by perfusion and 4x10 on Primaria® platesFiveCells / 35mm dish Sowed. Cultures were incubated with 10% heat inactivated FBS, 26 mM sodium bicarbonate, 23 mM Hepes, 0 mM .01 U / ml insulin, 2 mM L-glutamine, 10 nM dexamethasone, 5.5 mM glucose E, supplemented with 100 U / ml penicillin and 100 U / ml streptomycin Maintained in the medium. Twenty-four hours after plating, hepatocytes are washed twice with the same medium. Add 1 ml of fresh medium and cultivate cells using PEI / chimeric oligonucleotide complex. And transfected at the same concentration as for HuH-7 cells. 18 hours later, more 2 ml of medium was added and cells were harvested after 6 or 30 hours.   Direct injection of chimeric oligonucleotides into the liver. Male Sprague-Dawley rat (〜175 g) on a standard 12 hour light / dark cycle and use standard laboratory chow Gave it freely. Rats were anesthetized and the liver was exposed by midline incision. Hepatic vein and portal Attach the clamp where the vein enters the caudate lobe, 75 μg of the 1: 9 chimera / PEI complex The body was injected directly into the caudate lobe in a final volume of 250-300 μl. The caudate lobe is ligated for 15 minutes, The clamp was then removed and blood flow resumed. After suturing the incision, the rat is anesthetized And had free access to food and water. Instead of chimeric oligonucleotides Vehicle controls were performed using an equal volume of Tris-HCl (pH 7.6). 24 hours of injection Between and 48 hours later, the rats are sacrificed, the caudate lobe is removed, and the tissue surrounding the injection site is DN A Dissected for isolation. DNA is isolated and the terminal exon of the rat factor IX gene is Amplified by PCR.   Nuclear uptake of chimeric molecules. The chimeric duplex is terminated according to the manufacturer's recommendations 3 ′ end labeling using luciferase and fluorescein-12-dUTP, then It was mixed with the unlabeled oligonucleotide at a ratio of 2: 3. Transfer as described above After 24 hours, the cells were washed with a solution containing 4% paraformaldehyde (wt / vol). The cells were fixed in a phosphate buffered saline (pH 7.4) at room temperature for 10 minutes. After fixation, prepare cells Reverse stain for 10 minutes using a 5 μM solution of Dil in 0.32 M sucrose according to the manufacturer's recommendations Colored. After washing with 0.32M sucrose and then with phosphate buffered saline (pH 7.4), SlowFade® antifade mounting in acid buffered saline Cover the cells with a medium and cover the cells with an MRC1000 confocal microscope (B ioRad, Inc. Hercules, California). The caudate lobe of the liver Inject in situ with chimeras labeled with fluorescein as described above, and Soon after, it was collected. Caudate lobes were bisected vertically, embedded using OCT and frozen. Frozen Sections were cut to a thickness of 1010 μM, and phosphorylated with 4% paraformaldehyde (wt / vol). The cells were fixed in an acid-buffered saline (pH 7.4) at room temperature for 10 minutes. After fixation, produce cells Reverse-stain for 10 minutes using a 5 μM solution of Dil in 0.32 M sucrose according to the manufacturer's recommendations did. After washing with 0.32M sucrose and then with phosphate buffered saline (pH 7.4), SlowFade® antifade mounting in buffered saline Cover sections with coverslips using a dium and use MRC1000 confocal microscope (Bio Rad, Inc.). 1μ collection series of fixed cells and sectioned tissue Created at m stages to establish the presence of the chimera in the nucleus.   DNA isolation and cloning. 24 and 48 hours after transfection, remove cells Collected by crapping. Genomic DNA larger than 100-150 base pairs is Isolated using a high purity PCR template preparation kit as recommended. Human liver IX gene PCR amplification of the 317 nt fragment of exon 8 was performed using 500 ng of isolated DNA. became. The primers used were nucleotides 1008 each of human Factor IX cDNA. 5'-CATTGCTGACAAGGAATACACGAAC-3 'corresponding to -1032 and 1300-1324 (SEQ ID NO: 14) And 5'-ATTTGCCTTTCATTGCACACTCTTC-3 '(SEQ ID NO: 15). Primer at 58 ° C For 20 seconds and extended at 72 ° C. for 45 seconds, denaturation proceeded at 94 ° C. for 45 seconds. Sa The sample was subjected to 30 cycles using Expand Hi-fidelity® polymerase. Amplified. PCR amplification of the 374 nt fragment of the rat factor IX gene was performed using primary hepatocytes or liver. This was performed using 500 ng of DNA isolated from the cotyledon. The primers used are 5'-ATTGCCT corresponding to nucleotides 433-457 and 782-806 of factor IX cDNA TGCTGGAACTGGATAAC-3 '(SEQ ID NO: 16) and 5'-TTGCCTTTCATTGCACATTCTTCAC-3' ( Column number 17). Primers were annealed at 59 ° C for 20 seconds and extended at 72 ° C for 45 seconds. Denaturation proceeded at 94 ° C for 45 seconds. The sample is Expand Hi-fidelity (registered trademark) ) Amplified for 30 cycles using polymerase. Human and rat factor IX genes The PCR amplification products from both were cloned into the TA cloning vector p according to the manufacturer's recommendations. Subcloned into CR® 2.1 and frozen using the conjugated material. The competent Escherichia coli was transformed.   Colony hybridization and sequencing. 18-20 hours after sowing on plate Later, the colonies are picked on MSI MagnaGraph nylon filters, replicated and manufactured Hybridization proceeded according to the manufacturer's recommendations. 17-mer filter Oligonucleotide probe 365-A (5'-AAGGAGATAGTGGGGGA-3 ') (SEQ ID NO: 18) Or 365-C (5'-AAGGAGATCGTGGGGGA-3 ') (SEQ ID NO: 19) (where underlined Nucleotide is the target of mutagenesis) for 24 hours. Step Lobes were prepared according to the manufacturer's recommendations [γ-32ATP (> 7,000 Ci / mmol) and T4 polynu With nucleotide kinase32P-end labeled. 1% SDS, 5x Denhaltz and 200μ 2x sodium chloride citrate containing g / ml denatured sonicated fish sperm DNA Performed at 37 ° C. in thorium. After hybridization, remove the filter Rinse with sodium EDTA phosphoric acid, 0.5% SDS, then 3M tetramethylammonium Um chloride, 2 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM Tris-HCl containing 0.1% SDS (p H8.0) at 54 ° C. for 1 hour. Stiffened with NEN® Reflection film Autoradiography was performed at -70 ° C using a clean. Qiagen mi Using the niprep kit (Chatsworth, CA) with 365-A or 365-C Plasmid DNA was prepared from colonies identified as hybridizing and mp13 ABI370A sequencer (Perkin-Elmer, Corp., Foster Automated sequencing was performed using the following method. In vivo results   Label the chimeric oligonucleotide with fluorescein and inject directly into the caudate lobe of the liver Used to determine if entry is possible. Results are in the caudate lobe next to the injection site Hepatocytes in contact are similar to those observed in isolated primary hepatocytes and HuH-7 cells Has been shown to demonstrate incorporation of fluorescein-labeled chimeric molecules. Spots The label was mainly detected in the nucleus, although some was present in the cytoplasm. In fact, injection Nucleotide labeling was observed only in hepatocytes furthest from the site. Unlabeled PEI / R IXF chimera conjugate and vehicle control in caudate using the same protocol And animals were sacrificed 24 and 48 hours after injection. Liver DNA Isolated as above and PCR amplified for a 374 nt sequence spanning the target nt exchange site. Big After subcloning and transforming Escherichia coli with PCR amplified material A double measurement filter lift of the transformed colonies was performed. Filter Specific for 365-A (wild-type) or 365-C (factor IX mutation)32-Label 17mer Hybridize with oligonucleotide and hybridize as described in Methods After processing. Rats injected with the RIXF chimeric molecule directly into the liver The A → C conversion frequency was １1% for both and 48 hours. In contrast, the vehicle control , Did not hybridize with the 365-C probe. 365-C from animals treated with RIXF Culture colonies hybridized with the probe, isolate plasmid DNA and sequence The decision was made to confirm the A → C conversion. The ends of the amplified 374-nt fragment should be The only nucleotide change observed was A → C at the target exchange site. Was. 6.3 Evidence for lactosylated PEI / CMV-mediated changes in rat factor IX 6.3.1result   CMV complexed with a mixture of lactosylated PEI and PEI is described in Section 6.1.5 above. Prepared using the described RIXR oligonucleotides. Phase IX in the same region of factor IX A CMV for the complement was also constructed (RIXRC). Ser with chimeric oligonucleotides365Conversion of target nucleotides   Nuclear localization of fluorescently labeled chimeric molecules is an efficient translocation in isolated rat hepatocytes. Sfection was indicated. Next, use the cultured hepatocytes with 800kDa PEI as a carrier. And comparable concentrations of unlabeled chimeric molecular factor RIXRCAnd transfection with RIXR I did it. A vehicle control transfection was also performed at the same time. Trance Forty-eight hours post-fection, cells are harvested, DNA is isolated, and as described in Section 6.1.5. Was processed for hybridization. Ser365A → C target nucleotide at Conversion was performed by PCR-amplified and cloned exon 8 of the factor IX gene into a 374-nt strain. (Sark) ar, B., Koeberl, D .; D. & Somer, S.M. S., "Activities of Factor IX Genes in Six Species Sequencing of Activated Peptides and Catalytic Domains ", Genomics, 6, 133-143, 1990). Wild-type 365-A (5'-AAGGAGATAGTGGGGGA-3 ') (SEQ ID NO: 20) or converted 365-A 17-mer oligonucleotide used to distinguish between C (5'-AAGGAGATCGTGGGGGA-3 ') The reotide probe corresponded to nucleotides 710-726 of the cDNA sequence.   The overall frequency of conversion of the target nucleotide is determined by the The number of clones to be hybridized was hybridized with both oligonucleotide probes. Calculated by dividing by the total number of clones used. RIXRCTable 1 shows the results. Ser365 A → C conversion is RIXR or RIXRCOnly in primary hepatocytes transfected with Was observed. RIXR or RIXRCConversion frequency in hepatocytes transfected with Degree was observed. Vehicle-transfected cells can be used with other chimeric oligonucleotides. All of the cells transfected with leotide were treated with 365-C oligonucleotide Did not form clones that hybridized with lobes (unpublished observations ). Furthermore, 0.5 to 1.5 μg of oligonucleotide isolated from untreated hepatocytes A 365-C oligonucleotide probe into clones derived from PCR-amplified DNA No hybridization was observed. A → C conversion in isolated hepatocytes The rates are dose dependent using lactosylated PEI derivatives as described in Section 6.1.5. Sex, which was as high as 19%. Transfected in parallel with lactosylated PEI RT-PCR and hybridization analysis of RNA isolated from cultured cells The A → C conversion frequency in the range of 222.3% was shown. Site-specific nucleotide exchange by chimeric oligonucleotides in intact liver   Also to measure cellular uptake of chimeric molecules after direct injection into the caudate lobe of the liver Fluorescently labeled oligonucleotides were used. Results adjacent to injection site in caudate lobe Hepatocytes that are fluorescently labeled are similar to those observed in isolated rat hepatocytes. LA incorporation. A small amount of punctate substance is present in the cytoplasm of hepatocytes. However, the labeling substance was mainly present in the nucleus. In fact, in the area farthest from the injection site Only nuclear labeling was observed. Unlabeled RIXR chimeric oligonucleotides and Control was administered in vivo by tail vein injection of 25 kDa PEI, and 5 days after injection, The weave was collected. Isolate liver DNA and use the same primers used in primary hepatocytes Was used to perform PCR amplification of the 374 nt sequence across the target nucleotide exchange site. . After subcloning and transforming E. coli with PCR amplified material, Duplicate filter lifts of the transformed colonies were performed. fill Specific for 365-A (wild type) or 365-C (mutant)3217 P-labels Hybridized with the oligonucleotide, and treated after hybridization. Was. Rats treated with 100 μg of RIXR chimeric oligonucleotide had 13.9-18.9% Shows the frequency of A → C conversion in the range of ラ ッ ト, rats given a total of 350 μg in two injections A conversion of 40% was shown. In contrast, the vehicle control hybridized with the 365-C probe. Did not soy. RT-PCR hybridization of isolated RNA is performed in high-dose liver The A → C conversion frequency was 26.4% to 28.4% in the gut. APTT of vehicle-treated rats 89.7% to 181.9% of the control value (131.84% ± 32.89%), The APTT of the treated animals ranged from 48.9% to 61.7% (53.8% ± 4.8%).   Hepes buffer (50 mM Hepes / 100 mM NaCl / 0.02% NaNThreeRat test in pH 7.4) The APTT time at 1/10 dilution of the test plasma was compared between the normal (n = 9) rat and the twice-injected rat (n = It measured about both 3). Factor IX activity of duplicate samples was 12 normal Dilution of pooled plasma (1: 10-1: 80) from healthy male rats (6-8 weeks old) It was determined from the log-log standard curve created from the APTT results. APTT results for normal rats , 89.7% to 181.9% of the control value (mean = 131.84% ± 32.89%) APTT ranged from 49.0% to 61.7% (mean = 53.8% ± 5.8%). Normal APTT clotting time (seconds) is 60.9 seconds to 81.6 seconds (average = 71.3 ± 7.3 seconds), twice The APTT time of infected rats ranged from 92.3 to 98.6 seconds (mean = 96.3 ± 2.9 seconds). Sequence analysis of mutated factor IX gene in isolated hepatocytes and intact liver.   The results from both in vitro and in vivo filter hybridizations Direct sequencing of wild-type and mutant genes to confirm results . Hybridize to 365-A or 365-C from intact liver or isolated hepatocytes At least 10 independent colonies were analyzed. Sequencing results are available in 365-A The hybridizing colonies (FIG. 6, upper panel) show the wild-type IX sequence (ie, Ser of the reported cDNA sequence365A). On the other hand, 365-C Factor RIXR that hybridizes with a ligand probeCTransfect Colonies obtained from primary hepatocytes365Was converted to C. Similar Ser365so A → C conversion of the DNA hybridizes with the 17-mer 365-C oligonucleotide probe. Were observed in colonies obtained from transfected rat liver. Factor IX All 374-nt PCR amplified regions of the offspring gene were sequenced for all clones, Ser365No change other than the change described in was detected. Finally, primary hepatocytes and nothing Start and stop of 374-nt PCR-amplified genomic DNA from both wounded livers The points correspond exactly to those of the primers used in the amplification process, Is the sequenced DNA a genomic DNA rather than a non-degradable chimeric oligonucleotide? It shows that it was obtained. Table 1 Genomic DNA of rat factor IX by colony lift hybridization Ser365A to C conversion percentage in1 Data shown for primary hepatocyte transfection are based on two experiments. It is an average value. 2 The in vivo chimeric / PEI complex was tailed with 5% dextrose in a volume of 300 μl. It was administered by intravenous infusion. The results for three animals at each dose are shown individually. 6.3.2Materials and methods   In vivo delivery of chimeric oligonucleotides. Male Sprague-Dawley rat (Har lan Sprague-Dawley, Inc.) (~ 50 g) maintained on a standard 12 hour light-dark cycle And had free access to standard laboratory chow. Texture in 300 μl of 5% dextrose Vehicle control and lactosylated 25 kDa at a ratio of 6 equivalents of PEI nitrogen per laphosphate  PEI (Abdallah, B. et al., “Strengths for in vivo gene transfer into the brain of adult mammals. Powerful non-viral vectors: polyethyleneimine; Human Gene Therapy, 7, 194 7-1954, 1996). Aliquots are divided into single doses of 100 μg or 150 μg and 200 μg Doses were administered by tail vein injection on consecutive days. 5 days after injection, DNA and RNA isolation Taken liver tissue for. PCR amplification of exon 8 of the rat factor IX gene DNA has already been described (Kren, BT, Trembley, JH & Steer, C .; J., "Changes in mRNA stability during rat liver regeneration", Am J. et al. Physiol., 270, G763-G777 , 1996). RNAexol and RNAmate (according to the manufacturer's protocol) Same as genomic DNA using Intermountian Scientific Corp., Kaysville, UT) RNA was isolated for RT-PCR amplification of the region. Factor IX activity assay. Twenty days after the second tail vein injection, vehicle (n = 9) and And oligonucleotide-treated (n = 3) blood samples from 0.1 volume of 0 Collected in .105M sodium citrate / citric acid. 2,500 xg of the obtained plasma Then, after centrifugation at 15,000 × g, it was stored at −70 ° C. Factor IX activity is activated It was measured by a partial thromboplastin time (APTT) assay. Briefly explain And 50 μl APTT reagent (DADE, Miami, FL), 50 μl human factor IX deficient Plasma poor (George King Biomedical, Overland, KS) and Hepes buffer (50 mM Hepes / 100 mM NaCl / 0.02% NaNThree50 μl of 1/10 diluted rat test plasma in pH 7.4) At 37 ° C. in an ST4 core gulometer (American Bioproducts, Parsippany, NJ). For 3 minutes. 33 mM CaCl in Hepes bufferTwo Add 50 μl Coagulation was started. Factor IX activity in duplicate samples was determined in normal male rats (n = 12) generated from APTT results for dilutions of pooled plasma (1: 10-1: 80) It was determined from a log-log standard curve. DNA / RNA isolation and cloning. 48 hours after transfection, scrapp cells Collected by ing. Genomic DNA larger than 100-150 base pairs is High-purity PCR template preparation kit (Boehringer-Mannheim, Corp., Dianapolis, Indiana). RNA is RNAzol® B (Tel-Test, Inc., Friendswood, TX) according to protocol Was isolated using. 300 ng of DNA isolated from primary hepatocytes or liver tissue PCR amplification of the 374-nt fragment of the human factor IX gene was performed. Primer is rat 5'-ATTGC corresponding to nucleotides 433-457 and 782-806 of Factor IX cDNA, respectively CTTGCTGGAACTGGATAAAC-3 '(SEQ ID NO: 22) and 5'-TTGCCTTTCATTGCACATTCTTCAC-3' ( SEQ ID NO: 23) (Oligos Etc., Wilsonville, OR). Primer Annealed at 59 ° C for 20 seconds, extended at 72 ° C for 45 seconds, and denaturation proceeded at 94 ° C for 45 seconds. The sample was Expand Hi-fidelity® polymerase (Boehringer Mannh eim, Corp.) for 30 cycles. Hepatocytes and intact liver factor IX The PCR amplification product from the gene was transferred to the TA cloning vector pCR® 2.1 (Inv itrogen, San Diego, Calif.) The quality was used to transform frozen competent E. coli. PCR To eliminate artifacts, add 300 ng of control DNA to 0.5, 1.0 and 1.5 μg After incubation with the oligonucleotide, a PCR amplification reaction was performed. Further Only 1.0 μg of the chimera was used as the “template” for PCR amplification.   RT-PCR amplification is used for DNA PCR amplification according to the manufacturer's protocol. Using the same primers, use the Titian® one-tube RT-PCR system. This was performed using a stem (Boehringer Mannheim, Corp.). Avoid DNA contamination To obtain RNA samples, use RQI DNase-free RNase (Promega Corp., Madison, Wis.). RT-PCR-treated RNase-treated RNA samples Performed in parallel with the reaction. Ligate each PCR reaction into the same TA cloning vector And transformed into frozen competent E. coli. Colony hybridization and sequencing. 18-20 hours after sowing on the plate Pick colonies on MSI MagnaGraph nylon filters, replicate, The hybridization was performed according to the recommendations of the manufacturer. Filter the 17-mer oligonucleotide Nucleotide probe 365-A (5'-AAGGAGATAGTGGGGGA-3 ') (SEQ ID NO: 24) or 36 5-C (5'-AAGGAGATCGTGGGGGA-3 ') (SEQ ID NO: 25) (Life technologies, Inc., G aithersburg, MD) (where the underlined nucleotides are targets for mutagenesis) ) For 24 hours. The probe was replaced with (γ-32P) ATP (> 7,000 Ci / mmol) and T4 polynucleotide kinase (New England Biolabs, Inc.) ., Beverly, Mass.)32P-end labeled. 1% SDS, 5x Denha 2 × NaCl containing ruth and 200 μg / ml denatured sonicated fish sperm DNA Hybridization was performed at 37 ° C. in sodium um citrate. Hive After redidation, filter 1 × sodium chloride sodium phosphate EDTA, Rinse with 0.5% SDS, then 3M tetramethylammonium chloride, 2mM EDTA ( pH 8.0), 50% Tris-HCl (pH 8.0) containing 0.1% SDS for 1 hour at 54 ° C (Melchior, WB & Von Hippel, PH, "dA.dT and dG.dC base pairs in DNA Changes in relative stability ", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 298-302, 1973). N Autoradiography at -70 ° C using an intensifier with EN® Reflection film Ruffy was done. Qiagen miniprep kit (Chatsworth, CA) Colonies identified as hybridizing to 365-A or 365-C using Prepare plasmid DNA from the mp13 forward and reverse primers, and Gene-specific primers corresponding to nucleotides 616-638 of rat factor IX cDNA ABI 370A sequencer using 5'-GTTGACCGAGCCACATGCCTTAG-3 '(SEQ ID NO: 26) -(Perkin-Elmer, Corp., Foster City, CA) Automatic sequencing was performed. 6.4 Correction of Hemophilia B Mutation in Chapel Hill Dog   Cause hemophilia in animals (G → A)1477Mutating Chapel Hill strain dogs Used to obtain primary cultured hepatocytes. The CMV designed to correct the mutation Shown below.   Hepatocytes are negative for 25 kDa Lac-PEI or galactocerebroside-containing aqueous core Treated with 360 nM DIXI complexed in charged lipid vesicles (Gc-NLV). result Are shown in Table 2 below. Frequency of conversion of nucleotide 1477 from A to G of factor IX gene (Primary hepatocytes from the Chapel Hill strain of a hemophilia B dog) * RT-PCR of parallel transfection cultures shows A to G conversion frequency of 11.1 % Given. 6.5 Correction of Crigler-Naja-Like Mutations in GUNN Rats   Mutant rats with hyperbilirubinemia (referred to as Gunn rats) are N-uridine diphosphoglucuronate glucuronosyltransferase (UGT1 Has a single nucleotide deletion in the gene encoding A1). Roy Chowdhury J. et al., 1991, J. Am. Biol. Chem. 266, 18294. Crigler-Naja Syndrome Type 1 Human patients who also have a mutation in the UGT1A1 gene and have high bilirubin It causes blood disorders, which in turn causes brain damage. Bosma, P .; J. et al., 1992, FASEB J., 6, 2859; Jansen, P .; L. M. et al., Progress in Liver Diseases, XIII, Boyer , J. et al. L., & Ockner, R.A. K., editor (WB Saunders, Phil. 1995), pp 125-150 . The structure of CN3, a CMV designed to correct the Gunn rat mutation, is shown below. You.   Primary cultures of Gunn rat hepatocytes were treated with 150 nM CN3 according to the protocol described above. However, the carrier was prepared as described in Section 6.2., Where the ratio of oligonucleotide phosphate to imine was 1: 4. Section 2 negatively charged glycosylated lipid vesicles or lactosylated PEI carriers. The result is 8.5% conversion for the negatively charged liposomes, indicating that the lactosylated PEI carrier The conversion was 3.6%.   Gunn rats complexed or negative with 25kDa Lac-PEI as described above 1 mg / kg CN3 complexed with charged Gc lipid vesicles was injected. Gene conversion rate Was cloned and hybridized according to the method described for factor IX. It was measured by performing the following steps. The following results indicate that about 15% of the UGT1A1 gene copy Indicates that ~ 25% was converted. Frequency of G insertion at nucleotide 1239 of UGT-1 gene (Gunn rats) 1 Initial conversion frequency was measured. Conversion frequency was measured 7 days after partial hepatectomy of 270%.   Gunn rats were given 1 mg / kg of CN3 complexed with 25 kDa Lac-PEI as described above. Injections for 5 consecutive days. 25 days after the last infusion, serum bilirubin from 6.2 mg / dl It dropped to 3.5 mg / dl and remained at this level for a further 25 days.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/04 Ａ６１Ｐ 7/04 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ６０／０６４，９９６ (32)優先日 平成９年11月10日(1997．11．10) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ (72)発明者 クレン，ベッツィー，ティー. アメリカ合衆国 55454 ミネソタ州，ミ ネアポリス，29番 アベニュー エス． 810 (72)発明者 バンディオパディアイ，パラミタ，ティ ー. アメリカ合衆国 55414 ミネソタ州，ミ ネアポリス，27番 アベニュー エス．イ ー．1062ビー──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 7/04 A61P 7/04 C12N 15/09 ZNA C12N 15/00 ZNAA (31) Priority claim number 60 / 064,996 (32) Priority Date November 10, 1997 (November 10, 1997) (33) Priority Country United States (US) (81) Designated State EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, T M), AL, AM, AU, BA, BB, BG, BR, CA, CN, CU, CZ, EE, GE, HU, IL, IS, JP, KP, KR, LC, LK, LR, LT, LV, MG, MK, MN, MX, NO, NZ, PL, RO, SG, SI, SK, SL, TR, TT, UA, US, UZ, VN, YU (72) Inventor Clen, Betsy, Tee United States 55454 Minneapolis, Minnesota, 29th Avenue S. 810 (72) Inventor Bandio Padiai, Paramita, T. United States 55414 Minneapolis, Minnesota, 27th Avenue S.S. A. 1062 Bee

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．a) リコンビナジェニックオリゴヌクレオ塩基； b) 水性担体；および c) (i) 水性コアがオリゴヌクレオ塩基を含有する水性コア脂質小胞、 (ii) オリゴヌクレオ塩基の親油性塩を含む脂質ナノスフィア、および (iii) 500ダルトン〜1.3Mdの平均分子量を有し、オリゴヌクレオ塩基と塩を形 成するポリ陽イオン体、よりなる群から選択される巨大分子担体 を含んでなる組成物。 ２．受容体は巨大分子担体に結合した、クラスリン被覆ピット受容体のリガンド をさらに含む、請求項１記載の組成物。 ３．巨大分子担体は陰性に荷電した水性コア脂質小胞である、請求項２記載の組 成物。 ４．水性コア脂質小胞はジオレオイルホスファチジルコリンおよびジオレオイル ホスファチジルセリンを含む、請求項３記載の組成物。 ５．水性コア脂質小胞はセレブロシドをさらに含む、請求項４記載の組成物。 ６．巨大分子担体は分岐鎖ポリエチレンイミンである、請求項２記載の組成物。 ７．巨大分子担体は、フシゲニックＦ−タンパク質を含む水性コア脂質小胞であ る、請求項２記載の組成物。 ８．オリゴヌクレオ塩基は、 (i) 一緒になると長さは少なくとも16ヌクレオ塩基でありかつ60ヌクレオチド 塩基以下であり、哺乳動物の標的遺伝子と相同的である第１と第２の相同的領 域；および (ii) 第１の相同的領域と第２の相同的領域の間に置かれ、長さは少なくとも１ ヌクレオ塩基でかつ20ヌクレオ塩基以下であり、標的遺伝子と異種であり、変 化を含有する、異種領域 を含む請求項２記載の組成物。 ９．リコンビナジェニックオリゴヌクレオ塩基は、2'-置換リボヌクレオチドと ワトソン−クリック塩基対合する少なくとも15デオキシヌクレオチドを含む、 請求項８記載の組成物。 10．2'-置換リボヌクレオチドは、2'-メトキシ-リボヌクレオチド、2'-アリルオ キシ-リボヌクレオチド、2'-メトキシエトキシ-リボヌクレオチドおよび2'-フ ルオロ-リボヌクレオチドよりなる群から独立に選択される、請求項９記載の 組成物。 11．リガンドは、トランスフェリン、ニコチン酸、カルニチン、インスリン、お よびインスリン様増殖因子−１よりなる群から選択される、請求項８記載の組 成物。 12．クラスリン被覆ピット受容体はアシアロ糖タンパク質受容体である、請求項 ８記載の組成物。 13．リガンドは、乳糖、ガラクトース、およびN-アセチルガラクトサミンよりな る群から選択される部分を含み、オリゴヌクレオ塩基の配列は、α１−アンチ トリプシン、凝固第IX因子、ウリジンジホスホグルクロン酸グルクロノシルト ランスフェラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルコース−６−ホスファター ゼ、低密度リポタンパク質受容体、オルニチントランスカルバミラーゼ、およ びフェニルアラニンヒドロキシラーゼよりなる群から選択される物質をコード するヒト遺伝子、またはこれらの相補体、の連続する16ヌクレオチド断片の配 列を含む、請求項12記載の組成物。 14．水性の製薬上許容される担体およびリコンビナジェニックオリゴヌクレオ塩 基を含む方法を、被験体哺乳動物に投与することを含んでなる、被験体哺乳動 物の組織中の標的遺伝子を変化させる方法であって、該オリゴヌクレオ塩基は ： a) リコンビナジェニックオリゴヌクレオ塩基； b) 水性担体；および c) (i) 水性コアがオリゴヌクレオ塩基を含有する水性コア脂質小胞、 (ii) オリゴヌクレオ塩基の親油性塩を含む脂質ナノスフィア、および (iii) 500ダルトン〜1.3Mdの平均分子量を有し、オリゴヌクレオ塩基と塩を形 成するポリ陽イオン体、よりなる群から選択される巨大分子担体、 を含んでなり、クラスリン被覆ピット受容体のリガンドが巨大分子担体に共有結 合している、上記方法。 15．組織は肝臓である、請求項14記載の方法。 16．巨大分子担体は陰性に荷電した水性コア脂質小胞である、請求項14記載の方 法。 17．水性コア脂質小胞は、ジオレオイルホスファチジルコリンおよびジオレオイ ルホスファチジルセリンを含む、請求項16記載の方法。 18．水性コア脂質小胞はセレブロシドをさらに含む、請求項17記載の方法。 19．巨大分子担体は分岐鎖ポリエチレンイミンである、請求項14記載の方法。 20．巨大分子担体は直鎖ポリエチレンイミンまたは直鎖ポリ陽イオン性ポリペプ チドである、請求項14記載の方法。 21．オリゴヌクレオ塩基は： a) 一緒になると長さは少なくとも16ヌクレオ塩基でありかつ60ヌクレオチド 塩基以下であり、哺乳動物の標的遺伝子と相同的である第１と第２の相同的領 域；および b) 第１の相同的領域と第２の相同的領域の間に置かれ、長さは少なくとも１ ヌクレオ塩基でかつ20ヌクレオ塩基以下であり、標的遺伝子と異種であり、前 記変化を含有する、異種領域 を含む、請求項14記載の方法。 22．リコンビナジェニックオリゴヌクレオ塩基は、2'-置換リボヌクレオチドと ワトソン−クリック塩基対合する少なくとも15デオキシヌクレオチドを含む、 請求項21記載の方法。 23．2'-置換リボヌクレオチドは、2'-メトキシ-リボヌクレオチド、2'-アリルオ キシ-リボヌクレオチド、2'-メトキシエトキシ-リボヌクレオチドおよび2'-フ ルオロ-リボヌクレオチドよりなる群から独立に選択される、請求項22記載の 方法。 24．クラスリン被覆ピット受容体はアシアロ糖タンパク質受容体であり、巨大分 子担体はポリエチレンイミンまたは陰性に荷電した水性コア脂質小胞である、 請求項22記載の方法。 25．水性の製薬上許容される担体、およびリボ型とデオキシリボ型ヌクレオ塩基 を有するオリゴヌクレオ塩基を含むある量の組成物を、ヒト被験体に投与する ことを含んでなる、ヒト被験体の細胞中の標的遺伝子の疾患を引き起こす配列 に有益な変化を導入する方法であって、該オリゴヌクレオ塩基は： a) リコンビナジェニックオリゴヌクレオ塩基； b) 水性担体；および c) (i) 水性コアがオリゴヌクレオ塩基を含有する水性コア脂質小胞、 (ii) オリゴヌクレオ塩基の親油性塩を含む脂質ナノスフィア、および (iii) 500ダルトン〜1.3Mdの平均分子量を有し、オリゴヌクレオ塩基と塩を形 成するポリ陽イオン体、よりなる群から選択される巨大分子担体 を含んでなり、クラスリン被覆ピット受容体のリガンドが巨大分子担体に共有結 合しており、量は、配列が引き起こす疾患を改善するのに有効である、上記方 法。 26．細胞は肝細胞である、請求項25記載の方法。 27．巨大分子担体は陰性に荷電した水性コア脂質小胞である、請求項25記載の方 法。 28．水性コア脂質小胞は、ジオレオイルホスファチジルコリンおよびジオレオイ ルホスファチジルセリンを含む、請求項27記載の方法。 29．水性コア脂質小胞はセレブロシドをさらに含む、請求項28記載の方法。 30．巨大分子担体は分岐鎖ポリエチレンイミンである、請求項25記載の方法。 31．巨大分子担体は直鎖ポリエチレンイミンまたは直鎖ポリ陽イオンポリペプチ ドである、請求項25記載の方法。 32．オリゴヌクレオ塩基は、 a) 一緒になると長さは少なくとも16ヌクレオ塩基でありかつ60ヌクレオチド 塩基以下であり、哺乳動物の標的遺伝子と相同的である第１と第２の相同的領 域；および b) 第１の相同的領域と第２の相同的領域の間に置かれ、長さは少なくとも１ ヌクレオ塩基でかつ20ヌクレオ塩基以下であり、標的遺伝子と異種であり、前 記変化を含有する、異種領域 を含む請求項25記載の組成物。 33．リコンビナジェニックオリゴヌクレオ塩基は、2'-置換リボヌクレオチドと ワトソン−クリック塩基対合する少なくとも15デオキシヌクレオチドを含む、 請求項32記載の組成物。 34．2'-置換リボヌクレオチドは、2'-メトキシ-リボヌクレオチド、2'-アリルオ キシ-リボヌクレオチド、2'-メトキシエトキシ-リボヌクレオチドおよび2'-フ ルオロ-リボヌクレオチドよりなる群から独立に選択される、請求項33記載の 方法。 35．クラスリン被覆ピット受容体はアシアロ糖タンパク質受容体であり、巨大分 子担体はポリエチレンイミンまたは陰性に荷電した水性コア脂質小胞である、 請求項33記載の方法。 36．リガンドは、乳糖、ガラクトース、およびN-アセチルガラクトサミンよりな る群から選択される部分を含み、オリゴヌクレオ塩基の配列は、α１−アンチ トリプシン、凝固第IX因子、ウリジンジホスホグルクロン酸グルクロノシルト ランスフェラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルコース−６−ホスファター ゼ、低密度リポタンパク質受容体、オルニチントランスカルバミラーゼ、およ びフェニルアラニンヒドロキシラーゼよりなる群から選択される物質をコード するヒト遺伝子、またはこれらの相補体、の連続する16ヌクレオチド断片の配 列を含む、請求項35記載の方法。[Claims] 1. a) recombinagenic oligonucleobases; b) an aqueous carrier; and c) (i) an aqueous core lipid vesicle wherein the aqueous core contains an oligonucleobase, (ii) a lipid nanosphere comprising a lipophilic salt of an oligonucleobase, and (iii) having an average molecular weight of 500 Daltons to 1.3 Md and forming a salt with an oligonucleobase.   Macrocationic carrier selected from the group consisting of polycationic substances formed A composition comprising: 2. Receptor is a ligand for clathrin-coated pit receptor bound to a macromolecular carrier   The composition of claim 1, further comprising: 3. 3. The set of claim 2, wherein the macromolecular carrier is a negatively charged aqueous core lipid vesicle.   Adult. 4. The aqueous core lipid vesicles are dioleoyl phosphatidylcholine and dioleoyl   4. The composition of claim 3, comprising phosphatidylserine. 5. 5. The composition of claim 4, wherein the aqueous core lipid vesicle further comprises cerebroside. 6. 3. The composition of claim 2, wherein the macromolecular carrier is a branched polyethylene imine. 7. Macromolecular carriers are aqueous core lipid vesicles containing fusogenic F-proteins.   The composition of claim 2, wherein 8. Oligonucleobases are (i) together at least 16 nucleobases in length and 60 nucleotides in length   First and second homologous regions that are less than or equal to bases and that are homologous to the mammalian target gene   Area; and (ii) located between the first homologous region and the second homologous region and having a length of at least 1   It is a nucleobase and no more than 20 nucleobases, is heterologous to the target gene,   Heterogeneous area containing The composition according to claim 2, comprising: 9. Recombinagenic oligonucleobases are combined with 2'-substituted ribonucleotides.   Comprising at least 15 deoxynucleotides that Watson-Crick base pair,   A composition according to claim 8. 10. 2'-substituted ribonucleotides are 2'-methoxy-ribonucleotides, 2'-allyl   Xy-ribonucleotides, 2'-methoxyethoxy-ribonucleotides and 2'-phenyl   10. The method according to claim 9, wherein the member is independently selected from the group consisting of fluoro-ribonucleotides.   Composition. 11． Ligands include transferrin, nicotinic acid, carnitine, insulin,   9. The set of claim 8, wherein the set is selected from the group consisting of and insulin-like growth factor-1.   Adult. 12． The clathrin-coated pit receptor is an asialoglycoprotein receptor   9. The composition according to 8. 13. Ligands consist of lactose, galactose, and N-acetylgalactosamine.   And a sequence selected from the group consisting of:   Trypsin, coagulation factor IX, glucuronosyl uridine diphosphoglucuronic acid   Transferase, glucocerebrosidase, glucose-6-phosphatase   , Low-density lipoprotein receptor, ornithine transcarbamylase, and   Encodes a substance selected from the group consisting of phenylalanine hydroxylase   Of a contiguous 16 nucleotide fragment of the human gene or its complement   13. The composition according to claim 12, comprising rows. 14. Aqueous pharmaceutically acceptable carriers and recombinant oligonucleosalts   Administering a method comprising the group to a subject mammal.   A method for altering a target gene in a tissue of a product, wherein the oligonucleobase is   : a) recombinagenic oligonucleobases; b) an aqueous carrier; and c) (i) an aqueous core lipid vesicle wherein the aqueous core contains an oligonucleobase, (ii) a lipid nanosphere comprising a lipophilic salt of an oligonucleobase, and (iii) having an average molecular weight of 500 Daltons to 1.3 Md and forming a salt with an oligonucleobase.   A polycationic substance, a macromolecular carrier selected from the group consisting of And the ligand of the clathrin-coated pit receptor is covalently linked to the macromolecular carrier.   The above-mentioned method conforms. 15． 15. The method of claim 14, wherein the tissue is a liver. 16． The method of claim 14, wherein the macromolecular carrier is a negatively charged aqueous core lipid vesicle.   Law. 17． Aqueous core lipid vesicles contain dioleoylphosphatidylcholine and dioleoyl.   17. The method according to claim 16, comprising luphosphatidylserine. 18． 18. The method of claim 17, wherein the aqueous core lipid vesicle further comprises cerebroside. 19. 15. The method of claim 14, wherein the macromolecular carrier is a branched polyethylene imine. 20. The macromolecular carrier is linear polyethyleneimine or linear polycationic polypep   15. The method according to claim 14, which is a tide. twenty one. Oligonucleobases are:   a) together at least 16 nucleobases in length and 60 nucleotides in length   First and second homologous regions that are less than or equal to bases and that are homologous to the mammalian target gene   Area; and   b) located between the first and second homologous regions and having a length of at least 1   A nucleobase and no more than 20 nucleobases, heterologous to the target gene,   Heterogeneous areas containing the above changes 15. The method of claim 14, comprising: twenty two. Recombinagenic oligonucleobases are combined with 2'-substituted ribonucleotides.   Comprising at least 15 deoxynucleotides that Watson-Crick base pair,   22. The method according to claim 21. 23. 2'-substituted ribonucleotides are 2'-methoxy-ribonucleotides, 2'-allyl   Xy-ribonucleotides, 2'-methoxyethoxy-ribonucleotides and 2'-phenyl   23.The chloro-ribonucleotide is independently selected from the group consisting of:   Method. twenty four. Clathrin-coated pit receptors are asialoglycoprotein receptors,   The daughter carrier is polyethyleneimine or a negatively charged aqueous core lipid vesicle,   23. The method according to claim 22. twenty five. Aqueous pharmaceutically acceptable carriers, and ribo- and deoxyribo-type nucleobases   An amount of a composition comprising an oligonucleobase having the formula:   A disease-causing sequence of a target gene in cells of a human subject, comprising:   Wherein the oligonucleobase is: a) recombinagenic oligonucleobases; b) an aqueous carrier; and c) (i) an aqueous core lipid vesicle wherein the aqueous core contains an oligonucleobase, (ii) a lipid nanosphere comprising a lipophilic salt of an oligonucleobase, and (iii) having an average molecular weight of 500 Daltons to 1.3 Md and forming a salt with an oligonucleobase.   Macrocationic carrier selected from the group consisting of polycationic substances formed And the ligand of the clathrin-coated pit receptor is covalently linked to the macromolecular carrier.   And the amount is effective to ameliorate the disease caused by the sequence.   Law. 26. 26. The method of claim 25, wherein the cells are hepatocytes. 27. The method of claim 25, wherein the macromolecular carrier is a negatively charged aqueous core lipid vesicle.   Law. 28. Aqueous core lipid vesicles contain dioleoylphosphatidylcholine and dioleoyl.   28. The method of claim 27, comprising luphosphatidylserine. 29. 29. The method of claim 28, wherein the aqueous core lipid vesicle further comprises cerebroside. 30. 26. The method of claim 25, wherein the macromolecular carrier is a branched polyethylene imine. 31. The macromolecular carrier is linear polyethyleneimine or linear polycationic polypeptide.   26. The method of claim 25, wherein the method is 32. Oligonucleobases are   a) together at least 16 nucleobases in length and 60 nucleotides in length   First and second homologous regions that are less than or equal to bases and that are homologous to the mammalian target gene   Area; and   b) located between the first and second homologous regions and having a length of at least 1   A nucleobase and no more than 20 nucleobases, heterologous to the target gene,   Heterogeneous areas containing the above changes 26. The composition of claim 25, comprising: 33. Recombinagenic oligonucleobases are combined with 2'-substituted ribonucleotides.   Comprising at least 15 deoxynucleotides that Watson-Crick base pair,   33. The composition of claim 32. 34. 2'-substituted ribonucleotides are 2'-methoxy-ribonucleotides, 2'-allyl   Xy-ribonucleotides, 2'-methoxyethoxy-ribonucleotides and 2'-phenyl   The method of claim 33, which is independently selected from the group consisting of fluoro-ribonucleotides.   Method. 35. Clathrin-coated pit receptors are asialoglycoprotein receptors,   The daughter carrier is polyethyleneimine or a negatively charged aqueous core lipid vesicle,   34. The method of claim 33. 36. Ligands consist of lactose, galactose, and N-acetylgalactosamine.   And a sequence selected from the group consisting of:   Trypsin, coagulation factor IX, glucuronosyl uridine diphosphoglucuronic acid   Transferase, glucocerebrosidase, glucose-6-phosphatase   , Low-density lipoprotein receptor, ornithine transcarbamylase, and   Encodes a substance selected from the group consisting of phenylalanine hydroxylase   Of a contiguous 16 nucleotide fragment of the human gene or its complement   36. The method of claim 35, comprising a column.
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