JP2002511757A - Cell activation process and reagents therefor - Google Patents

Cell activation process and reagents therefor

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JP2002511757A JP50537099A JP50537099A JP2002511757A JP 2002511757 A JP2002511757 A JP 2002511757A JP 50537099 A JP50537099 A JP 50537099A JP 50537099 A JP50537099 A JP 50537099A JP 2002511757 A JP2002511757 A JP 2002511757A
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Abstract

(57)【要約】 ２つ以上の異なる細胞質シグナル伝達成分を含むキメラ受容体をコードするDNAによってエフェクター細胞を形質転換する、細胞活性化プロセスを記述する。細胞質シグナル伝達成分の少なくとも１つは、テトラ・スパン膜通過蛋白質、CD43、CD6、マンノース、IL-7、IL-12もしくは補体受容体、インテグリン関連蛋白質、またはサイトカイン受容体に関連したγ鎖の全てもしくは一部に由来する。活性化された細胞は、医学において、例えば癌のような疾患の治療において有用である可能性がある。   (57) [Summary] Describes a cell activation process in which effector cells are transformed with DNA encoding a chimeric receptor containing two or more different cytoplasmic signaling components. At least one of the cytoplasmic signaling components comprises a tetra-span transmembrane protein, CD43, CD6, mannose, IL-7, IL-12 or a complement receptor, an integrin-related protein, or a gamma chain associated with a cytokine receptor. Derived from all or part. Activated cells may be useful in medicine, for example, in treating diseases such as cancer.

Description

【発明の詳細な説明】 細胞活性化プロセスおよびそのための試薬 本発明は、細胞を活性化するプロセス、細胞の活性化を得るためのDNA輸送シ ステムおよび活性化した細胞の医学での使用に関する。 天然のT細胞受容体は、抗原結合成分、膜通過成分および細胞質成分を含むポ リペプチド鎖の複雑な会合体である。抗原が受容体に正しく結合すると、T細胞 の活性化、および例えば抗原提示標的細胞の破壊に至る一連の細胞内イベントが 誘発される。抗原はMHC分子と会合して提示されて初めて、抗原認識が起こりう る。 天然のMHC提示抗原以外の結合リガンド上で活性となるようにT細胞を操作する ことによって、MHCが必要でなくなれば非常に望ましいであろう。これには、MHC 提示に関連した個体間の変動を防止する手段を提供し、より高度に発現された表 面抗原の標的化を可能にして、それによってリンパ球を媒介する治療、例えば腫 瘍治療の有効性が増加するであろう。 キメラ受容体は、その細胞表面に抗原を発現する細胞を標的としてT細胞を向 けるようにデザインされている。そのような組換え型キメラ受容体には、‘T体 ‘と呼ばれる、抗体からの結合ドメインおよびT細胞受容体の細胞内シグナル伝 達ドメインを含むキメラが含まれる[例えば、公開された国際特許明細書番号、 国際公関公報第92/10591号、国際公開公報第92/15322号、国際公開公報第93/191 63号および国際公開公報第95/02686号を参照のこと]。 当技術分野において記述される組換え型キメラ受容体は、リガンド結合成分、 膜通過成分および細胞質成分で構成される。しかし、T細胞にこれらの組換え型 キメラ受容体をトランスフェクトさせても、T細胞を例えば、高レベルのインタ ーロイキン2[IL-2]による処置によって同時に刺激しなければ、抗原が結合して もT細胞活性化の許容可能なレベルが得られない。共刺激が必要であるために、 この方法は主に患者のエクスビボ処置に適することとなる。これは冗長で複雑な 技法である。 国際特許番号、国際公開公報第97/23613号において、われわれは、IL-2のよ うな共刺激物質を加える必要性なく、エクスビボ活性化が改善された、現行のエ クスビボ・アプローチに対する代用法を提供する。その明細書に記述の方法は、 特に細胞外相互作用の一つのタイプに反応して、T細胞の成功したインビボ再指 向および活性化を都合よく提供する。 本質的に、国際特許明細書番号、国際公開公報第97/23613号に記述される本発 明は、キメラ受容体をコードするDNAで形質転換したエフェクター細胞を提供す る。キメラ受容体は、天然には結合しておらず、および細胞の活性化の改善を生 じるように協調作用するように都合よく選択される２つ以上の異なるシグナル伝 達細胞質成分を含む。そのような組換え型キメラ受容体をコードするDNAは、イ ンビボおよび／またはエクスビボでT細胞または他のエフェクター細胞に導入し てもよい。これらのキメラ受容体の１つ以上を発現するエフェクター細胞が後に 標的細胞に結合すると、キメラ受容体の集合および二量体形成を含むプロセスに おけるエフェクター細胞の活性化もしくはキメラ受容体のアロステリックな変化 を生じるシグナル伝達または受容体が誘因となるもう一つのメカニズムが誘発さ れる。 われわれは、国際特許明細書番号、国際公開公報第97/23613号において記述さ れる発明を創出し、エフェクター細胞の活性化または反応を正確に引き起こすた めに都合よく用いることができる一連のキメラ受容体を提供する。これは、特定 の共刺激シグナル伝達ドメインを有する受容体を利用することによって得ること ができる。 このように、本発明の一つの局面に従って、われわれは、細胞質成分が天然で は結合していない、および少なくとも１つは膜通過ポリペプチドに由来する、該 細胞質シグナル伝達成分の少なくとも１つが、テトラ・スパン膜通過蛋白質、CD 43、CD6、マンノース、IL-7、IL-12、もしくは補体受容体、インテグリン関連蛋 白質、またはサイトカイン受容体に関連したγ-鎖、の全てまたは一部に由来す る共刺激シグナル伝達ドメインであることを特徴とする、第一の細胞が、２つ以 上の異なる細胞質シグナル伝達成分を含む組換え型キメラ受容体の１つ以上をコ ードするDNAを含むDNA輸送システムによって提供される、第一の細胞と第二の標 的細胞に会合した分子とが１つのタイプの細胞外相互作用を行った 結果として、細胞を活性化する方法を提供する。 キメラ受容体をコードするDNAは、それが発現される場合に、および細胞と第 二の標的細胞が細胞外で相互作用を行う際に、細胞質シグナル伝達成分を通じて シグナルが異なる２つ以上の細胞内シグナル伝達メッセンジャーに変換されるよ うに配置される。この結果、細胞の活性化が起こり、標的細胞に対する生物反応 が誘発される。本明細書で用いられるように、細胞の活性化とは１つ以上のシグ ナル伝達経路の活性化を意味する。これは、細胞増殖の増加；例えば前または抗 炎症反応によるサイトカインの発現；サイトカイン活性の刺激、分化または他の エフェクター機能；抗体分泌；貧食；腫瘍の浸潤および／または接着の増加によ って示される可能性がある。 共刺激シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達成分は、好ましくはそ れらが協調して作用することができるように選択される。それらは「天然では結 合していない」、この用語は本明細書において単一のポリペプチド鎖上で本来互 いに結合していない細胞質シグナル伝達成分を指す。好ましくは細胞質シグナル 伝達成分は、それらが発現される細胞の細胞骨格成分１つ以上において結合する ことができる、および／または反応を生じることができる成分である。特に有用 なシグナル伝達成分には、本発明のその他の局面に関連して後述する成分が含ま れる。 細胞質シグナル伝達成分の他に、それぞれの組換え型キメラ受容体は、好まし くは標的細胞上の細胞表面分子を認識することができる結合成分、および膜通過 成分を含む。これらの成分をコードするDNAはさらに、一度発現されたキメラ受 容体が細胞表面膜を確実に指向するようにするためにシグナルペプチドをコード する。全ての成分は単一のDNAコード配列がコードしてもよい。 または、それぞれの細胞質シグナル伝達成分を２つ以上の異なるDNAコード配 列がコードしてもよい。この場合、それぞれのDNAコード配列もまた、シグナル ペプチド、膜通過成分および／または結合成分をコードしてもよい。結合成分は 異なっていてもよいが、例えば標的細胞に会合する同じ分子に結合することによ って、一般に全て同じタイプの細胞外イベントに関与することができる。一つの 好ましい態様において、結合成分は同じである。 以降に記述される出願のいくつかにおいて、例えば、結合成分が抗体または抗 体断片である場合、キメラ受容体をコードするDNAは、１つの配列が例えば、シ グナルペプチド、膜通過および細胞質シグナル伝達成分に結合する結合成分の一 部[抗体、例えばVH成分の場合]をコードし、および第二の配列が結合成分の残り をコードする[例えば、与えられた実施例におけるVL成分]、異なる２っのDNAコ ード配列を含んでもよい。 望ましい細胞を活性化するために、キメラ受容体をコードするDNAをまず、細 胞に輸送する必要がある。このように、本発明の第２の局面に従って、われわれ は、DNAが１つのタイプの細胞外相互作用を行うことができる組換え型キメラ受 容体をコードする、担体と会合したDNA、ならびに細胞質成分の少なくとも１つ が膜通過ポリペプチドに由来し、該細胞質シグナル伝達成分の少なくとも１つが テトラ・スパン膜通過蛋白質、CD9、CD43、CD6、マンノース、IL-7、IL-12、も しくは補体受容体、インテグリン関連蛋白質、またはサイトカイン受容体に会合 したγ鎖の全てもしくは一部に由来する共刺激シグナル伝達ドメインであるとい う特徴を有する、天然では結合していない２つ以上の異なる細胞外シグナル伝達 成分、を含むDNA輸送システムを提供する。 本発明のこの局面において、特に２つ以上の異なる細胞質シグナル伝達成分を コードするキメラ受容体を単一のDNAコード配列がコードしてもよい。このよう に、一つの好ましい態様において、本発明は、DNAが読みとり枠において、以下 の： i)シグナルペプチド成分； ii)標的細胞上で細胞表面分子を認識することができる結合成分； iii)膜通過成分； iv)細胞質成分の少なくとも１つが膜通過ポリペプチドに由来する、天然では結 合しない２つ以上の異なる細胞質シグナル伝達成分、および選択的に v)該細胞質シグナル伝達成分の少なくとも１つがテトラ・スパン膜通過蛋白質、 CD9、CD43、CD6、マンノース、IL-7、IL-12、もしくは補体受容体、インテグ リン関連蛋白質、またはサイトカイン受容体に会合したγ鎖の全てもしくは一 部に由来する共刺激シグナル伝達ドメインであるという特徴を有する、 該i)〜iv)成分のいずれか２つ以上を結合させる１つ以上のスペーサー領域を コードする、組換え型キメラ受容体をコードする、担体に会合したDNAを含むD NA輸送システムを提供する。 組換え型キメラ受容体の成分は、シグナル伝達細胞質成分がシグナルの伝達に おいて機能的であり、その結果結合成分によって標的細胞上で細胞表面分子が認 識された結果として１つ以上のメッセンジャーシステムの活性化が起こるように 機能的に結合する。 ２つ以上の成分を１つ以上のスペーサー領域によって結合してもよい。スペー サー領域は、成分が生物活性にとって正確なコンフォメーションをとることを促 進するように機能してもよい。膜通過成分iii)と結合成分ii)を結合させるため にスペーサー領域を用いることは特に都合がよい。 スペーサー領域は例えば、アミノ酸300個まで、好ましくはアミノ酸20〜100個 、および最も好ましくはアミノ酸25〜50個を含んでもよい。 スペーサーはCD8、CD4、またはCD28の細胞外領域の全てもしくは一部；または ヒンジ領域を含む抗体の定常領域の全てもしくは一部のような、天然に存在する 分子の全てもしくは一部に由来してもよい。細胞内シグナル伝達分子の機能的部 分間の天然のスペーサー成分の全てまたは一部、例えば、ITAMS（免疫受容体チ ロシンに基づく活性化モチーフ）間のスペーサーもまた用いてもよい。または、 スペーサーは天然に存在しない配列であってもよい。 結合成分ii)は、細胞表面分子と相互作用することができるいかなる分子であ ってもよく、および例えば、肺腫瘍細胞上に発現されるボンベシン受容体、癌胎 児抗原、多形性上皮ムチン、およびCD33炎症のような、ウイルスに感染した細胞 ；細菌に感染した細胞：癌細胞に関連した状態のような病的状態に関連して細胞 上に発現される表面マーカー；ペプチドホルモン、接着分子、自己免疫疾患にお いて存在する炎症分子、もしくはT細胞受容体、または自己免疫を生じる抗原を 認識するように選択してもよい。 本発明のキメラ受容体において用いられる適した結合成分は、細胞表面関連分 子との結合に関連する受容体；T細胞受容体；CD4；CD8；CD28；サイトカイン受 容体、例えばインターロイキン受容体、TNF受容体、またはインターフェ ロン受容体、例えばγ-IFNに対する受容体；コロニー刺激因子、例えばGMCSFに 対する受容体；例えばFab、Fab'、F(ab')2、一本鎖FV、FV、およびCHおよびCLド メインに関連して存在してもよいVHまたはVL成分抗体およびその抗原結合断片、 の全てまたは一部を含む。抗体または断片は、マウス、ヒト、キメラまたは遺伝 子操作したヒト抗体および断片であってもよい。本明細書で用いるように、遺伝 子操作したヒト抗体または断片とは、１つの抗体、例えばそうでなければヒト・ フレームワークの中に埋もれているマウス抗体、に由来する１つ以上のCDRおよ び１つ以上のフレームワーク残基を有する抗体または断片を意味すると解釈され る。そのような抗体は周知であり、例えば国際特許明細書、国際公関公報第91/0 9967号に記述のように、多くの方法によって調製してもよい。 特に有用な結合成分には、Fab'断片、または特に一本鎖FV断片が含まれる。 結合成分が、異なる結合鎖を含む一本鎖FV、VHまたはVL成分以外の抗体もしく は抗体断片である場合、第二の結合鎖をコードするために本発明の輸送システム において第二の異なるDNAコード配列を含む必要がある。この場合、細胞質シグ ナル伝達成分および抗体または断片の１つの鎖を含む第一のDNA配列は、抗体結 合成分の集合が起こり得るように、シグナル・ペプチドおよび抗体または断片の 第二の鎖をコードする第二のDNA配列と共に発現される。 膜通過成分iii)は、T細胞受容体のα、β、またはζ鎖、CD28、CD8、CD4、サ イトカイン受容体、例えばインターロイキン受容体、TNF受容体、もしくはイン ターフェロン受容体、またはコロニー刺激因子受容体、例えばGMCSFの全てまた は一部のような広範囲の起源に由来してもよい。望ましければ、膜通過成分は天 然において本明細書に記述するような共刺激シグナル伝達ドメインと会合する膜 通過ドメインであってもよく、およびテトラ・スパン膜通過ドメイン、CD43、CD 6、マンノース、IL-7、IL-12、もしくは補体受容体、インテグリン関連蛋白質、 またはサイトカイン受容体に会合したγ鎖に由来してもよい。 結合および膜通過成分は、直接または好ましくはスペーサー領域によって結合 してもよい。スペーサー領域は上記の領域１つ以上であってもよい。１つを超え る領域、例えば２つの領域が存在する場合、これらは好ましくは異なる領域、例 えばCD28の細胞外領域の全てまたは一部に結合する抗体ヒンジ領域である。 スペーサーおよび膜通過成分は、それら遊離のチオール基を有し、それによっ てキメラ受容体に多量体形成、特に二量体形成能力を与えるように選択すれば都 合がよい。このタイプの受容体、特に二量体は特に好ましく、この中にはCD28成 分を有する受容体、天然のT細胞受容体のζ鎖、および／または抗体ヒンジ配列 が含まれる。 膜通過成分は、それが直接またはスペーサーのいずれかによって結合する細胞 質成分に天然において結合してもよく、結合しなくてもよい。 細胞質シグナル伝達成分iv)は、例えばその結果１つ以上の細胞内メッセンジ ャーシステムの活性化が起こるシグナルを伝達することができる。細胞質成分の それぞれが異なるメッセンジャーシステムを活性化することが好ましい。直接ま たは間接的に活性化される細胞内メッセンジャーシステムは、例えば、NFATおよ びcAMP媒介経路を含む、チロシンキナーゼ、PKCもしくはMAPキナーゼを含む経路 ；G蛋白質もしくはホスホリパーゼ媒介経路；カルシウム媒介経路；およびイン ターロイキン、例えばIL-2のようなサイトカインの合成を含む経路のような１つ 以上のキナーゼ経路を含む。 少なくとも１つの細胞質シグナル伝達成分iv)は、特に上記の受容体の全てま たは一部に由来する共刺激シグナル伝達ドメインであろう。一般に、少なくとも シグナル伝達ドメイン、またはシグナル伝達および膜通過ドメインは、受容体を コードするDNAをまず構築する場合に都合のよい制限部位を利用するために、望 ましければ受容体の残りと共に用いてもよい。 このように、例えば、共刺激シグナル伝達ドメインは、例えばCD9のテトラ・ スパン膜通過蛋白質[ランザら（Lanza，F.）J．Biol．Chem．266，10638〜10645 （1991）]の全てまたは一部、特にアミノ酸約36位〜約227位；CD37[クラッソン ら(Classon，R.)、J．Exp．Med．172，1007（1990）]、特にアミノ酸約38位〜約 281位;CD53[アンゲリソバら(Angelisova P.)、Immunogenetics 32,281〜285(199 0)]、特にアミノ酸約37位〜219位;CD63[メッツェラーら(Metzelaar，M.)、J.Bio l.Chem.266,3239〜3245（1991）]、特にアミノ酸約35位〜約237位：およびCD82[ イマイら(Imai，T.)、J．Immunol．149，2879〜（1992）]、特にアミノ酸約35位 〜約267位；CD43[パラントら(Pallant,A.)、P.N.A.S.86, 1328〜1332（1989）]、特にアミノ酸約262位〜約385位または約240〜約385位；C D6[アルッフォら(Aruffo，A.)、J．Exp．Med．174，949〜952（1991）]、特にア ミノ酸約401〜約644位、または約374位〜約644位；マンノース受容体[エゼコビ ッッら(Ezekowitz)、J．Exp.Med.172，1785〜1794（1990）]、特にアミノ酸約13 94位〜1438位、または約1370〜約1438位；およびIL-7受容体α鎖（CD127）[グッ ドウィン(Goodwin,R.G.)、Cell 60,941〜951（1990）]、特にアミノ酸約245位〜 約439位、または約220位〜約439位；IL-12受容体β鎖[プレスキーら(Preskey,D. )、P.N.A.S.93，14002〜14007（1996）]、特にアミノ酸約647位〜約862位、また は約623位〜約862位；補体受容体、例えば、CR1（CD35）[ウォン(Wong，W.)、P. N.A.S．82，7711〜7715（1985）1、特にアミノ酸約1955〜約1998位、もしくは約 1931位〜約1998位、またはCR3およびCR3関連蛋白質[メシカら(Messlka，E.)、J ．Immunol．154，6663〜（1995）]；フォーム１およびフォーム２を含むCD47の ようなインテグリン関連蛋白質[リンドバーグら(Lindberg,F.)、J.Cell.Biol.12 3 ,485〜496(1993)];またはIL-2、IL-4、IL-7、IL-9、もしくはIL-15受容体のγ 鎖（CD132）[タケシタら(Takeshita,T.)、Science 257,379〜382（1992）]、特 にアミノ酸約262位〜約347位、または約233位〜約347位に由来してもよい。 上記引用のアミノ酸範囲は、それらがシグナル伝達機能を保持している限り、 望ましければ変更することができると認識される。このように、例えば、これら の範囲内の断片は、これが受容体をコードするDNAの構築において都合がよけれ ば(例えば、上記のような都合のよい制限部位を考慮に入れて)、および／または 例えば起こりうるグリコシル化部位を防止するために、これによって受容体の特 性の変化および／または改善が得られる場合には用いてもよい。このように、一 つの例において、アミノ酸残基52〜227位のCD9断片をコードするDNAを、アミノ 酸残基36〜227位の全長のCD9シグナル伝達ドメインをコードするDNAの代用とし て用いてもよい。その他のシグナル伝達ドメインの断片は、それぞれの断片の大 きさは親のドメインをコードするDNAの特性に応じて、および／またはドメイン のアミノ酸配列に応じて、特に何らかの制限部位および／またはグリコシル化部 位の位置に応じて、同じ原理に従って都合よく用いてもよい。その ような部位は肉眼で調べることによって、または他の従来の手段によって親配列 において容易に同定することができる。 一つの有用な共刺激シグナル伝達ドメインは、テトラ・スパン膜通過蛋白質の 全てまたは一部、特にCD9に由来するドメインである。 記述した共刺激シグナル伝達ドメインの他に、本発明の受容体において存在す る可能性がある他の適した細胞質成分iv)には、例えば、ζ、η、またはε鎖の 全てまたは一部のようなT細胞受容体に由来する成分;CD28;Fc受容体のγ鎖；ま たはサイトカイン受容体、例えばインターロイキン、TNFおよびインターフェロ ン受容体、コロニー刺激因子受容体、例えばGMCSF、チロシンキナーゼ、例えばZ AP-70、fyn、lyk、Itkおよびsykからのシグナル伝達成分；接着分子、例えばLFA -1およびLFA-2、B29、MB-1、CD3δ、CD3γ、CD5またはCD2が含まれる。シグナル 伝達細胞質成分は、好ましくはITAM含有細胞質成分である。 細胞質シグナル伝達成分は、好ましくはそれらが協調的に作用するように選択 される。それらは互いに対していかなる方向性であってもよい。特に有用な成分 には、上記の共刺激シグナル伝達ドメインの他に、CD28のシグナル伝達成分の全 てもしくは一部、T細胞受容体のζ鎖、またはFcεR1もしくはFcγR111のγ鎖が 含まれる。 シグナル伝達成分は結合成分に天然に会合するものであってもよく、他の起源 に由来するものであってもよい。 適したシグナルペプチド成分i)の例には、免疫グロブリンシグナル配列が含ま れる。 シグナル成分、結合成分、膜通過成分および細胞質成分は、好ましくはヒト配 列に由来する、またはヒト配列に基づく。 キメラ受容体の個々の成分の相同体を用いてもよく、本発明はそのような使用 にも拡大されると理解される。本明細書において、キメラ受容体の成分をコード する特定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に関して用いられる相同体という用 語は、相同体が常にキメラ受容体の特定の成分と実質的に同じ機能を有する限り 、その中でヌクレオチドまたはアミノ酸１個以上が付加、欠失、置換、またはそ う でなければ化学的に修飾されている対応する配列を表す。相同体は、標準的な分 子生物学および／または化学的技法、例えばcDNAまたは遺伝子クローニングによ って、またはオリゴヌクレオチド指向変異誘発、オリゴヌクレオチド指向合成技 法、もしくは酵素的開裂、またはギャップがあるオリゴヌクレオチドの酵素的埋 め合わせを使用することによって、得てもよい。 ヌクレオチド１個以上が欠失している個々の成分の断片は、その断片がキメラ 受容体の開始成分と同じ機能を実質的に保持している限り、これも用いてもよい 。 本発明のこのおよび他の局面において用いられるDNAは、標準的な分子生物学 および／または化学的技法を用いて、例えばオリゴヌクレオチド指向変異誘発も しくはオリゴヌクレオチド指向合成技法、酵素的開裂、またはギャップのあるオ リゴヌクレオチドにおける酵素的埋め合わせを利用することによって、容易に入 手可能なDNA起源から得てもよい。そのような技法は、マニアティスら（Maniati s）の「分子のクローニング(Molecular Cloning)」、コールド・スプリング・ハー バー研究所、ニューヨーク、1989および特に以降に述べる実施例に記述されてい る。 本発明のDNA輸送システムにおいて用いられる担体は、標的細胞および／また は標的宿主細胞にDNAをエクスビボ、またはインビボで導入するために適したベ クターまたは他の担体であってもよい。適したベクターの例にはレトロウイルス 、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、EBV、およびHSV、ならびにリポソーム ベクターおよびDNA凝縮剤に基づくベクターのような非ウイルスベクターが含ま れる。または、担体は抗体であってもよい。適当であれば、ベクターはさらに、 レトロウイルスLTRのようなウイルスからのプロモーター／調節配列および／ま たは複製機能、AAVリピート、SV40およびhCMVプロモーターおよび／エンハンサ ー、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル；EBVおよびBKウイルス複製 機能を含んでもよい。TCR-αプロモーター、E-セレクチンプロモーターおよびCD 2プロモーターならびに座制御領域のような組織特異的調節配列もまた、低酸素 症誘導プロモーターのような誘導型のプロモーターと同様に用いてもよい。 DNA輸送システムにおいてDNA２個以上を用いる場合には、それらは上記の ように同じまたは異なる担体に組み入れてもよい。 エクスビボで使用する場合、本発明のDNA輸送システムは当技術分野で周知の 方法、例えばトランスフェクション、形質導入、バイオリスティックス(biolist ics)、プロトプラスト融合、燐酸カルシウム沈殿DNA形質転換、電気穿孔、陽イ オンリポフェクション、または標的化リポソームを用いて、標的宿主から得られ るエフェクター細胞に導入してもよい。次に、エフェクター細胞を標準的な技法 を用いて宿主に再導入する。 本発明に従って、例えば、哺乳類、および特にヒトのような多様な標的宿主を 用いてもよい。 適したエフェクター細胞の例には、リンパ球、例えば細胞障害性T-リンパ球、 腫瘍浸潤性リンパ球、ナチュラルキラー細胞、好中球、抗塩基球、好酸球、肥満 細胞、またはT-ヘルパー細胞；樹状細胞、B細胞、造血幹細胞、マクロファージ または単球のような免疫系に関連する細胞が含まれる。細胞障害性Tリンパ球を 用いることが特に好ましい。マクロファージを用いる場合、共刺激シグナル伝達 ドメインは、好ましくはインテグリン関連蛋白質の全てまたは一部に由来する、 特にマンノース、補体受容体または関連蛋白質の全てまたは一部に由来する。こ の場合、Fc受容体のγ鎖をさらなる細胞質シグナル伝達成分として用いれば都合 がよい。 本発明のDNA輸送システムはインビボ投与に特に適している。一つの好ましい 実施例において本輸送システムは、担体が望ましいエフェクター細胞にDNAを指 向することができる標的化輸送システムの形となる。そのような標的化輸送シス テムの特定の例には、標的化裸核DNA、DNA標的化レトロウイルスシステムを封入 および／またはこれと複合体を形成する標的化リポソーム、ならびにプロタミン およびポリリジン凝縮DNAのような標的化凝縮DNAが含まれる。 標的化システムは当技術分野において周知であり、例えば、CD8；CD16；CD4； CD3；セレクチン、例えばE-セレクチン；CD5；CD7；CD34；活性化抗原、例えばC D69およびIL-2Rのようなインビボにおいて標的細胞上に発現される細胞表面抗原 に対する抗体またはその断片を用いることを含む。または、HIVgp160を発現する 標的細胞を標的として例えばCD4を向けるために他の受容体・リガ ンド相互作用を用いることができる。 一般に、抗体標的化DNA、特に抗体標的化裸核DNA、抗体標的化凝縮DNAおよび 特に抗体標的化リポソームを使用することが好ましい。用いてもよいリポソーム の特定のタイプには、例えば、低いpHで開裂するリンカーを用いて抗体をリポソ ームと結合させる場合にはpH感受性リポソームが含まれる。細胞膜と融合し、本 発明の組換え型キメラ受容体DNAを細胞質へ直接輸送する陽イオンリポソームも また用いてもよい。本発明において用いられるリポソームはまた、例えばポリエ チレングリコール・ポリマーのような循環中の半減期を増加させるためにそれら の表面に親水性基を結合させてもよい。リポソームまたは他の担体に結合させる ために適した置換基には当技術分野において多くの例がある；例えば、国際特許 明細書番号、国際公開公報第88/04924号、国際公開公報第90/09782号、国際公開 公報第91/05545号、国際公開公報第91/05546号、国際公開公報第93/19738号、国 際公開公報第94/20073号および国際公開公報第94/22429号を参照のこと。抗体ま たは他の標的化分子は、従来の容易に利用できる結合基および抗体における反応 性置換基、例えばチオール、またはアミン等およびDNAまたはDNA含有材料におけ る反応性置換基を用いて、DNA、凝縮DNAまたはリポソームに結合させてもよい。 非標的化輸送システムも同様に用いてもよく、これらの場合、DNAの標的化発 現が有利である。DNAの標的化発現は例えば、ζプロモーターおよびCD2プロモー ターおよび座制御領域、およびパーフォリンプロモーターのようなT-細胞特異的 プロモーターシステムを用いて行ってもよい。 上記の本発明の局面は、キメラ受容体をコードするために単一のDNA配列を利 用すると都合がよい。しかし、本発明はキメラ受容体が異なる２つ以上のDNAコ ード配列によってコードされるDNA輸送システムに拡大してもよいと理解される 。このように一つの例において、上記の同じ読みとり枠においてそれぞれが成分 i)〜iv)をコードし、選択的にv)をコードするが、細胞質シグナル伝達成分iv)が 同じでないという点において互いに異なるが、ただし少なくとも１つのシグナル 伝達成分が本明細書において記述のように共刺激シグナル伝達ドメインである、 第一および第二の異なるDNAコード配列が、輸送システムにおいて存在しても よい。２つのDNAコード配列は、第一のDNA上の少なくとも１つの成分が第二のDN A上の他のシグナル伝達成分とは異なっている限り、１つ以上のシグナル伝達成 分をコードしてもよい。上記のように、シグナル伝達成分は協調的に作用するよ うに選択すると都合よく、残りの成分はDNAが１つである場合の態様に関して先 に記述した成分のいずれかであってもよい。第一のDNAによってコードされる結 合成分iv）は、好ましくは第二のDNAによってコードされる結合成分と同じであ る。第一のDNAによってコードされる結合成分は、第二のDNAによってコードされ る結合成分とは異なるスペーサー領域によって膜通過成分とは離れていることが 都合がよい。 輸送システムはエクスビボにおいて用いてもよく、さらなる局面において、本 発明は本発明のDNA輸送システムによってトランスフェクトしたェフェクター細 胞を提供する。エフェクター細胞は、エクスビボでの使用に適した既に記述した 細胞のいずれかであってもよく、好ましくはT細胞であり、最も好ましくは細胞 障害性T細胞である。 DNA輸送システムは薬学的組成物の形であってもよい。これは治療的または診 断的組成物であってもよく、投与に適したいかなる適した剤形であってもよい。 好ましくはこれは非経口投与、例えば注射もしくは注入、例えば１回注射、また は持続的注入に適した剤形であってもよい。組成物が注射もしくは注入用である 場合、これは油性または水性溶媒中での懸濁液、溶液、または乳液の剤形であっ てもよく、および懸濁化剤、保存剤、安定化剤、および／または分散剤のような 製剤化物質を含んでもよい。または、組成物は使用する前に適当な滅菌液体によ って溶解する乾燥剤形であってもよい。 組成物が経口投与に適している場合、組成物は活性成分の他に、デンプン、例 えばジャガイモ、トウモロコシ、もしくはコムギデンプン、またはセルロース、 または微結晶セルロースのようなデンプン誘導体、シリカ、乳糖のような様々な 糖、カルボン酸マグネシウムおよび／またはリン酸カルシウムのような添加剤を 含んでもよい。製剤が経口投与用である場合、それは患者の消化管に十分耐容さ れるものであることが望ましい。このため、製剤に粘液形成剤および樹脂を含む ことが望ましいかも知れない。同様に、胃液において不溶性である組成物をカプ セルに封入することによって耐容性を改善することも望ましいかも知れない。ま た組成物を徐放製剤に含めることも好ましいかも知れない。 本発明のDNA輸送システムは医学において有用で、本発明は、その方法が上記 のDNA輸送システムの有効量を被験者に投与することを含む、ヒトまたは動物被 験体の治療法に拡大される。用いる正確な量は、患者の年齢および状態、疾患ま たは障害の特性、ならびに投与経路に依存するが、従来の手段、例えば、動物実 験に由来するデータを外挿することによって、決定してもよい。特に、エクスビ ボで使用する場合、トランスフェクトしたエフェクター細胞の数は、動物モデル への広範囲のエフェクター細胞数のエクスビボトランスフェクションおよび再導 入によって確立してもよい。同様に、インビボで使用するために必要なDNAの量 は動物において広範囲のDNA濃度を用いて確立してもよい。 本発明のDNA輸送システムは、多くの疾患または障害の治療において有用であ るかも知れない。そのような疾患または障害は感染疾患、例えばHIV感染症；炎 症疾患／自己免疫疾患、例えば、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、炎症性腸疾 患：癌；アレルギー／アトピー疾患、例えば、喘息、湿疹：先天性疾患、例えば 嚢胞性繊維症、鎌状赤血球貧血；皮膚疾患、例えば、乾癬；神経疾患、例えば多 発性硬化症；移植、例えば臓器移植拒絶、移植片宿主拒絶反応；代謝／特発性疾 患、例えば糖尿病という一般項目の下に記述される疾患を含んでもよい。 本明細書に記述のキメラ受容体をコードするDNAはまた、特に本明細書に記述 の輸送システムにおいて用いられる本発明の特徴である。 本発明のキメラ受容体をコードするDNAは既知のDNA配列から組み立ててもよく 、本明細書およびわれわれの国際特許明細書、国際公開公報第97/23613号および より詳しくは本明細書および国際公開公報第97/23613号における実施例および図 に一般的に記述される方法およびアプローチを用いてエフェクター細胞に発現し てもよい。 以下の実施例は本発明を説明する。1) キメラ受容体遺伝子の構築（図１〜21） 図１〜21は、本発明のキメラ受容体構築物を示す[各図のa〜f]。 これらのキメラ受容体構築物のそれぞれの成分はPCRによってクローニングし た、または標準的な技法によって組み立てられる(PCRプロトコール、イニスら(I nnis)、1990、Academic Press Inc)。それぞれの成分は、われわれの国際特許明 細書番号、国際公開公報第97/23613号の実施例１に記述のものと類似のカセット 型においてpBIuescript SK+（ストラタジーン社）にインフレームでサブクロー ニングされるように、制限部位を形成するアミノ酸結合２〜４個によって隣接さ れる。 このように、例えば図1aにおいて、p67 scFv/h.CD28/CD9-FcRγキメラ受容体 は、ヒトIgG1ヒンジを含む細胞外スペーサーと結合したヒトCD33に対して特異的 な操作したヒト抗体P67.6の一本鎖Fv、およびヒトCD9の一部を通じてヒトFcεR1 のγ鎖の細胞内ドメインに結合したヒトCD28の細胞外領域の一部を含む。 一本鎖Fvは、（Gly4 Ser）５リンカーによって、操作したヒト抗体の重鎖の可 変成分に結合した操作したヒト抗体の軽鎖のリーダー配列および可変成分を含む 。細胞外スペーサー成分は、ヒトIgG1ヒンジの残基234〜243位およびヒトCD28の 残基118〜134位を含む。これはヒトCD9の残基52〜227位（ブーシェクスら(Bouch eix)、1991、J．Biol．Chem．266 117〜122）を通じてヒトFcεR1のγ鎖の残基2 7〜68位（カスターら(Kuster)、1989、J.Biol.Chem.255，6448〜6452）に結合さ れる。 図１（b〜f）の残りおよび図２〜21に示すように、本発明の他の受容体は、示 された成分を用いて同様に構築してもよい。 このように、まさに記述したP67scFvのような一本鎖Fv、または国際公開公報 第97/23613号の実施例１に記述したようなhCTMO1scFvは、例えばヒトIgG1ヒンジ およびまさに記述したヒトCD28の細胞外領域の一部を含む細胞外スペーサーに結 合し、その後表示の様々な膜通過および細胞内成分に結合してもよい。それぞれ の図において、各共刺激ドメインの大きさをCD9の36〜227、CD37の38〜281等と して示す。これらの図において、用いられる特定のCD28、ζおよびFcRγ成分を 示していない場合、FcRγの場合には上記のように、またはCD28およびζの場合 には国際公開公報第97/23613号の実施例１に記述のよう に、同じまたは類似の大きさの成分を用いてもよい。これらの最後の成分のそれ ぞれは、該実施例に記述の受容体に関する記述と同様に、本発明に従って構築し 、受容体に組み入れてもよい。2) Jurkat細胞に発現されたキメラ受容体構築物の分析 特に図1aにおける構築物に関して記述される以下の方法を用いて、トランスフ ェクトした細胞における本発明の受容体の発現および作用を示してもよい。P67scFv/h.CD28/CD9-FcR 全長のキメラ受容体構築物を、Hind IIIからEcoRI制限断片上の発現ベクターp EE6hCMV/ne[ベッビントン(Bebbington、1991)、Methods 2 136〜145]にpBluescr iptからサブクローニングした。 プラスミドを直鎖状にして、1000Vおよび３μFの１秒パルス２回を用いたバイ オラド遺伝子パルサーを用いた電気穿孔によって、Jurkat E6.1細胞（ECACC）に トランスフェクトした。キメラ受容体を発現する細胞株を薬剤G418(２mg/ml)を 含む培地において選別した。約４週間後、細胞が表面にscFvを発現するか否かお よびIL-2を産生するか否かを分析した。scFv の表面発現の分析 細胞約５×105個を飽和濃度のフルオレセイン結合抗原（２μg/ml）で染色し た。蛍光はFACScanサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン社）によって分 析した。抗原発現細胞の刺激 Jurkatトランスフェクタント１×105個を、96ウェルプレート（ファルコン社 ）において抗原を発現する、または抗原を発現しない対照の標的細胞１×105個 と共に37℃／５％CO2で一晩インキュベートした。18〜20時間後、細胞を遠心し て、上清をヒトIL-2に対してアッセイした(クアンティカイン・キット、R&Dシス テムズ)。固相抗原刺激 Jurkatトランスフェクタント１×105個を、抗原の飽和濃度を予めコーティン グした96ウェルプレート（ヌンク社）において、非選択培地中で37℃／５％CO2 でインキュベートした。18〜20時間後、細胞を遠心して上清をヒトIL-2に対し てアッセイした(クアンティカイン・キット、R&Dシステムズ)。3) 結果 図22は、フルオレセイン結合ヒトCD33を用いて測定した、トランスフェクトし たJurkat細胞上でのP67scFv/h.CD28/CD9-FcRγキメラ受容体の明確な表面発現を 示す。 図23は、標的細胞がない場合または抗原陰性細胞［N.EE6（対照プラスミドを 発現するマウス骨髄腫NSO）］と比較して抗原陽性標的細胞[HL60およびN.CD33( ヒトCD33を発現するマウス骨髄腫NSO)]によって刺激した場合の、P67scFv/h.CD2 8/CD29-FcRγキメラ受容体でトランスフェクトしたJurkat細胞による抗原特異的 IL-2産生を、トランスフェクトしていないJurkat細胞と比較して示す。図は、抗 原（CD33）陽性細胞の存在下では、キメラ受容体を発現するトランスフェクトし たJurkat細胞は刺激されてIL-2を産生したことを示している。同じ細胞は抗原を 提示していない細胞の存在下ではIL-2を産生しなかった。それぞれの場合につい て、トランスフェクトしていないJurkat対照細胞も同様に反応せず、IL-2の測定 可能な量を生じなかった。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                  Cell activation process and reagents therefor   The present invention relates to a process for activating cells, a DNA transport system for obtaining cell activation. It relates to the use of stems and activated cells in medicine.   Natural T-cell receptors are antigen-binding, transmembrane, and cytoplasmic components. It is a complex association of the polypeptide chains. When the antigen binds correctly to the receptor, T cells Activation and a series of intracellular events leading to, for example, destruction of antigen-presenting target cells Triggered. Antigen recognition can occur only when the antigen is presented in association with the MHC molecule You.   Manipulate T cells to be active on binding ligands other than the native MHC-presented antigen It would be highly desirable if MHC were no longer needed. This includes MHC Provide a means to prevent inter-individual variability related to presentation, and Therapies that allow targeting of surface antigens and thereby mediated lymphocytes, such as tumors The effectiveness of tumor treatment will be increased.   Chimeric receptors target T cells by targeting cells that express the antigen on their cell surface. It is designed to work. Such recombinant chimeric receptors include ‘T 結合, a binding domain from antibodies and intracellular signaling of T cell receptors Chimeras that include a chimeric domain [e.g., published international patent specification numbers, International Patent Publication No. 92/10591, International Publication No. 92/15322, International Publication No. 93/191 63 and WO 95/02686].   Recombinant chimeric receptors described in the art comprise a ligand binding component, It is composed of a transmembrane component and a cytoplasmic component. However, these recombinant forms When transfected with the chimeric receptor, T cells, for example, -Unless stimulated simultaneously by treatment with leukin 2 [IL-2], antigen will bind Nor does it provide acceptable levels of T cell activation. Because co-stimulation is needed, This method will be primarily suitable for ex vivo treatment of patients. This is redundant and complex Technique.   In International Patent Number, WO 97/23613, we have identified IL-2 as Current ex vivo activation was improved without the need for additional costimulators Provides an alternative to the ex vivo approach. The method described in that specification is: Successful in vivo repointing of T cells, especially in response to one type of extracellular interaction Advantageously provide orientation and activation.   In essence, the invention described in International Patent Specification No. 97/23613 Ming provides effector cells transformed with DNA encoding the chimeric receptor You. Chimeric receptors are not naturally associated and result in improved cell activation. Two or more different signals that are conveniently selected to cooperate Contains cytoplasmic components. DNA encoding such a recombinant chimeric receptor may be Transfect T cells or other effector cells ex vivo and / or ex vivo You may. Effector cells expressing one or more of these chimeric receptors will later Binding to target cells leads to processes involving chimeric receptor assembly and dimer formation Of effector cells or allosteric changes in chimeric receptors in Trigger another signaling- or receptor-triggered mechanism It is.   We have described in International Patent Specification Number WO 97/23613. To precisely trigger activation or reaction of effector cells There is provided a series of chimeric receptors that can be used to advantage. This is specific By utilizing a receptor having a co-stimulatory signaling domain Can be.   Thus, according to one aspect of the present invention, we consider that cytoplasmic components Is unbound, and at least one is derived from a transmembrane polypeptide. At least one of the cytoplasmic signaling components is a tetra-span transmembrane protein, CD 43, CD6, mannose, IL-7, IL-12, or complement receptor, integrin-related protein From all or part of white matter, or the gamma-chain associated with cytokine receptors A first cell characterized by a costimulatory signaling domain Coating one or more of the above recombinant chimeric receptors containing different cytoplasmic signaling components The first cell and the second marker provided by the DNA transport system containing the DNA to be loaded Cells associated with a specific cell made one type of extracellular interaction As a result, a method for activating a cell is provided.   The DNA encoding the chimeric receptor, when expressed, and with cells When two target cells interact extracellularly, through cytoplasmic signaling components Signals are converted to two or more different intracellular signaling messengers Are arranged as follows. As a result, the cells are activated and the biological response to the target cells Is triggered. As used herein, activation of a cell refers to one or more sigs. Activation of the null transmission pathway. This may be an increase in cell proliferation; Expression of cytokines by inflammatory response; stimulation of cytokine activity, differentiation or other Effector function; antibody secretion; poor diet; increased tumor invasion and / or adhesion May be indicated.   The cytoplasmic signaling component containing the costimulatory signaling domain is preferably They are chosen so that they can work in concert. They say "naturally `` Is not compatible '', as the term is used herein in its own right on a single polypeptide chain. Refers to the cytoplasmic signaling component that is not bound to any of the components. Preferably cytoplasmic signal Transmission components bind at one or more cytoskeletal components of the cells in which they are expressed And / or a component capable of causing a reaction. Especially useful Signaling components include those described below in connection with other aspects of the invention. It is.   In addition to the cytoplasmic signaling component, each recombinant chimeric receptor is preferably Or a binding component capable of recognizing cell surface molecules on target cells, and transmembrane Contains ingredients. The DNAs encoding these components can further comprise a once expressed chimeric receptor. Encodes a signal peptide to ensure that the receptor points to the cell surface membrane I do. All components may be encoded by a single DNA coding sequence.   Alternatively, each cytoplasmic signaling component is composed of two or more different DNA coding sequences. The columns may be coded. In this case, the respective DNA coding sequence is also a signal It may encode a peptide, a transmembrane component and / or a binding component. The binding component is Can be different, for example, by binding to the same molecule associated with the target cell. Thus, they can generally participate in the same type of extracellular event. One In a preferred embodiment, the binding components are the same.   In some of the applications described hereinafter, for example, if the binding component is an antibody or an anti- When the fragment is a body fragment, the DNA encoding the chimeric receptor has one sequence, for example, One of the binding components that binds to the signal peptide, transmembrane and cytoplasmic signaling components Part [Antibody, for example VHComponent case], and the second sequence is the remainder of the binding component [Eg, V in a given embodimentLIngredients], two different DNA It may include a code array.   To activate the desired cells, the DNA encoding the chimeric receptor is first Need to be transported to the cell. Thus, in accordance with the second aspect of the present invention, we Is a recombinant chimeric receptor in which DNA can perform one type of extracellular interaction. At least one of a carrier-associated DNA encoding a receptor, and a cytoplasmic component Is derived from a transmembrane polypeptide, wherein at least one of said cytoplasmic signaling components is Tetra-span transmembrane protein, CD9, CD43, CD6, mannose, IL-7, IL-12, also Or associated with complement receptors, integrin-related proteins, or cytokine receptors Is a costimulatory signaling domain derived from all or part of the γ chain Two or more different non-naturally associated extracellular signaling A DNA transport system comprising:   In this aspect of the invention, in particular, two or more different cytoplasmic signaling components The encoding chimeric receptor may be encoded by a single DNA coding sequence. like this In one preferred embodiment, the present invention relates to the following: of: i) a signal peptide component; ii) a binding component capable of recognizing a cell surface molecule on a target cell; iii) transmembrane components; iv) at least one of the cytoplasmic components is derived from a transmembrane polypeptide;   Two or more different cytoplasmic signaling components that do not match, and optionally v) at least one of said cytoplasmic signaling components is a tetra-span transmembrane protein;   CD9, CD43, CD6, mannose, IL-7, IL-12, or complement receptor, int   All or one of the gamma chains associated with phosphorus-related proteins or cytokine receptors   Having the feature of being a costimulatory signaling domain derived from the   One or more spacer regions for binding any two or more of the components i) to iv)   Encoding, encoding recombinant chimeric receptor, comprising carrier-associated DNA   Provide NA transport system.   The components of the recombinant chimeric receptor are signal transduction cytoplasmic components And thus the binding component recognizes cell surface molecules on the target cell. Activate one or more messenger systems as a result of knowledge Functionally combine.   Two or more components may be linked by one or more spacer regions. Space The protein region promotes the correct conformation of the component for biological activity. It may function to proceed. To combine the transmembrane component iii) with the binding component ii) It is particularly convenient to use a spacer region for   The spacer region is, for example, up to 300 amino acids, preferably 20 to 100 amino acids , And most preferably 25 to 50 amino acids.   The spacer may be all or part of the extracellular region of CD8, CD4, or CD28; or Naturally occurring, such as all or part of the constant region of an antibody including the hinge region It may be derived from all or part of the molecule. Functional part of intracellular signaling molecule All or part of the natural spacer component, such as ITAMS (immunoreceptor Spacers between rosin-based activation motifs) may also be used. Or The spacer may be a non-naturally occurring sequence.   The binding component ii) is any molecule capable of interacting with a cell surface molecule. And bombesin receptors expressed on lung tumor cells, Cells infected with the virus, such as baby antigens, polymorphic epithelial mucin, and CD33 inflammation Cells infected with bacteria: cells associated with a pathological condition, such as those associated with cancer cells Surface markers expressed on peptide hormones, adhesion molecules, and autoimmune diseases Inflammatory molecules, or T cell receptors, or antigens that cause autoimmunity You may choose to recognize.   Suitable binding components for use in the chimeric receptor of the present invention include cell surface related components. T cell receptor; CD4; CD8; CD28; cytokine receptor Condition, such as interleukin receptor, TNF receptor, or Ron receptor, eg, receptor for γ-IFN; colony stimulating factor, eg, GMCSF Receptor; eg, Fab, Fab ', F (ab') 2, single-chain FV, FV, And CHAnd CLDo V that may exist in relation to the mainHOr VLComponent antibodies and antigen-binding fragments thereof, All or a part of The antibody or fragment can be mouse, human, chimeric or genetic. It may be a human antibody and a fragment that has been subjected to child manipulation. As used herein, genetic An engineered human antibody or fragment is a single antibody, for example, an otherwise human antibody. One or more CDRs from a mouse antibody buried within the framework and And antibodies or fragments having one or more framework residues. You. Such antibodies are well known, for example, International Patent Specification, International Publication No. 91/0. It may be prepared by a number of methods, as described in 9967.   Particularly useful binding moieties include Fab 'fragments, or especially single-chain FVFragments are included.   Single-stranded F wherein the binding component comprises different binding chainsV, VHOr VLAntibodies other than components Is a transport system of the invention for encoding a second binding chain when is an antibody fragment Need to include a second different DNA coding sequence. In this case, the cytoplasmic sig The first DNA sequence, including the null transfer component and one strand of the antibody or fragment, contains the antibody binding The signal peptide and the antibody or fragment must be It is expressed together with a second DNA sequence encoding a second strand.   The transmembrane component iii) is the α, β, or ζ chain of the T cell receptor, CD28, CD8, CD4, Itokine receptor, e.g., interleukin receptor, TNF receptor, or Terferon receptor, or a colony stimulating factor receptor, e.g., all or May be from a wide range of sources, such as some. If desired, the transmembrane component Naturally a membrane associated with a costimulatory signaling domain as described herein Transmembrane domain and tetra-span transmembrane domain, CD43, CD 6, mannose, IL-7, IL-12 or complement receptor, integrin-related protein, Alternatively, it may be derived from a gamma chain associated with a cytokine receptor.   Binding and transmembrane components are bound directly or, preferably, by a spacer region May be. The spacer region may be one or more of the above regions. More than one If there are two regions, e.g. two regions, these are preferably different regions, e.g. For example, an antibody hinge region that binds to all or a part of the extracellular region of CD28.   Spacers and transmembrane components have their free thiol groups, thereby To provide the chimeric receptor with the ability to form multimers, especially dimers. Good. Receptors of this type, especially dimers, are particularly preferred, among which are CD28 components. , A ζ chain of a natural T cell receptor, and / or an antibody hinge sequence Is included.   The transmembrane component is the cell to which it binds, either directly or by a spacer It may or may not naturally bind to the quality component.   The cytoplasmic signaling component iv) may for example comprise one or more intracellular messages. Signal that results in activation of the marker system. Of cytoplasmic components Preferably, each activates a different messenger system. Directly Intracellular messenger systems that are activated, or indirectly, include, for example, NFAT and Pathways involving tyrosine kinase, PKC or MAP kinase, including cAMP-mediated pathway A G-protein or phospholipase-mediated pathway; a calcium-mediated pathway; One such as a pathway involving the synthesis of cytokines such as terleukins, eg IL-2 Including the above kinase pathway.   The at least one cytoplasmic signaling component iv) is, in particular, all of the above-mentioned receptors. Alternatively, it may be a costimulatory signaling domain from part. Generally, at least The signaling domain, or the signaling and transmembrane domains, To take advantage of convenient restriction sites when constructing the encoding DNA first, It may be used with the rest of the receptor, if desired.   Thus, for example, the costimulatory signaling domain may be, for example, the tetra- Span transmembrane protein [Lanza et al. Biol. Chem.266, 10638-10645 (1991)], particularly about amino acid positions 36 to 227; CD37 [Krasson (Classon, R.), J. et al. Exp. Med.172, 1007 (1990)], especially about amino acids 38- 281th place; CD53 [Angelisova P., Immunogenetics32, 281-285 (199 0)], especially about amino acids 37-219; CD63 [Metzelaar, M., J. Bio l.Chem.266, 3239-3245 (1991)], especially amino acids from about position 35 to about position 237: and CD82 [ Imai, T., J. et al. Immunol.149, 2879- (1992)], especially about amino acid position 35 CD43 [Pallant, A., P.N.A.S.86, 1328-1332 (1989)], especially amino acids about 262 to about 385 or about 240 to about 385; C D6 [Aluffo, A .; Exp. Med.174949-952 (1991)]. Amino acid about 401 to about 644, or about 374 to about 644; a mannose receptor [Ezecovi Ellekowitz, J. et al. Exp.Med.172, 1785-1794 (1990)], especially about 13 amino acids. Positions 94 to 1438, or about 1370 to about 1438; and the IL-7 receptor α-chain (CD127) [good Dewin (Goodwin, R.G.), Cell60, 941-951 (1990)], especially about amino acid position 245 About position 439, or about 220 to about 439; IL-12 receptor β chain [Preskey, D .; ), P.N.A.S.93, 14002-14007 (1996)], especially about amino acids 647-862, Is at about position 623 to about 862; a complement receptor such as CR1 (CD35) [Wong, W., P .; N.A.S.82, 7711-7715 (1985) 1, especially amino acids about 1955 to about 1998, or about Positions 1931 to about 1998, or CR3 and CR3-related proteins [Messlka, E., J. . Immunol.154, 6663- (1995)]; of CD47 including Form 1 and Form 2 Such integrin-related proteins [Lindberg et al. (Lindberg, F.), J. Cell. Biol.12 Three 485-496 (1993)]; or the gamma of the IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, or IL-15 receptor Chain (CD132) [Takeshita, T., Science257, 379-382 (1992)] From about amino acids 262 to about 347, or from about 233 to about 347.   The amino acid ranges quoted above, as long as they retain the signaling function It is recognized that changes can be made if desired. Thus, for example, these Fragments within this range are convenient for constructing the DNA encoding the receptor. (E.g., taking into account convenient restriction sites as described above), and / or This prevents receptor features, for example to prevent possible glycosylation sites. It may be used when a change in sex and / or improvement is obtained. In this way, one In one example, the DNA encoding the CD9 fragment at amino acid residues 52 to 227 is replaced with an amino acid As a substitute for the DNA encoding the full length CD9 signaling domain at acid residues 36-227. May be used. Other signaling domain fragments are large The size depends on the properties of the DNA encoding the parent domain and / or the domain Depending on the amino acid sequence, especially any restriction sites and / or glycosylation sites Depending on the position of the position, it may be conveniently used according to the same principle. That Such sites can be visually inspected or by other conventional means. Can be easily identified.   One useful costimulatory signaling domain is the tetra-span transmembrane protein All or part, especially the domain from CD9.   In addition to the costimulatory signaling domains described, Other suitable cytoplasmic components iv) that may be present include, for example, ζ, η, or ε chains. Components derived from T cell receptors such as all or some; CD28; γ chain of Fc receptor; Or cytokine receptors such as interleukin, TNF and interfero Receptors, colony stimulating factor receptors such as GMCSF, tyrosine kinases such as Z Signal transduction components from AP-70, fyn, lyk, Itk and syk; adhesion molecules such as LFA -1 and LFA-2, B29, MB-1, CD3δ, CD3γ, CD5 or CD2. signal The transmitting cytoplasmic component is preferably an ITAM-containing cytoplasmic component.   Cytoplasmic signaling components are preferably selected such that they act in concert Is done. They may be in any direction relative to each other. Particularly useful ingredients In addition to the above costimulatory signaling domains, all of the signaling components of CD28 Or part of the T cell receptor ζ chain, or the γ chain of FcεR1 or FcγR111 included.   The signaling component may be naturally associated with the binding component and may be of other origin. May be derived from   Examples of suitable signal peptide components i) include immunoglobulin signal sequences It is.   The signal, binding, transmembrane and cytoplasmic components are preferably human From a column or based on a human sequence.   Homologs of individual components of the chimeric receptor may be used, and the present invention It is understood that it is expanded to. As used herein, the components of the chimeric receptor are encoded Homolog used for a particular nucleotide or amino acid sequence The term is used as long as the homologue always has substantially the same function as a particular component of the chimeric receptor. In which one or more nucleotides or amino acids are added, deleted, substituted, or U Otherwise, it represents the corresponding sequence that is chemically modified. Homologues are standard By biological and / or chemical techniques such as cDNA or gene cloning Or oligonucleotide-directed mutagenesis, oligonucleotide-directed synthetic techniques Method or enzymatic cleavage or enzymatic filling of gapped oligonucleotides It may be obtained by using mating.   Fragments of individual components in which one or more nucleotides have been deleted are chimeric This may also be used as long as it substantially retains the same function as the starting component of the receptor .   The DNA used in this and other aspects of the invention may be a standard molecular biology And / or using chemical techniques, eg, oligonucleotide-directed mutagenesis Oligonucleotide-directed synthesis techniques, enzymatic cleavage, or Easy entry by utilizing enzymatic compensation in the oligonucleotides It may be obtained from accessible DNA sources. Such techniques are described in Maniati et al. s) “Molecular Cloning”, Cold Spring Heart Bar Laboratories, New York, 1989 and in particular described in the Examples set forth below. You.   The carrier used in the DNA transport system of the present invention may be a target cell and / or a carrier. Are suitable for introducing DNA into target host cells ex vivo or in vivo. Or another carrier. An example of a suitable vector is a retrovirus , Adenovirus, adeno-associated virus, EBV, and HSV, and liposomes Includes non-viral vectors such as vectors and vectors based on DNA condensing agents It is. Alternatively, the carrier may be an antibody. Where appropriate, the vector may further comprise: Promoter / regulatory sequences and / or promoters from viruses such as the retrovirus LTR Or replication function, AAV repeat, SV40 and hCMV promoters and / or enhancers Splicing and polyadenylation signals; EBV and BK virus replication Functions may be included. TCR-α promoter, E-selectin promoter and CD Tissue-specific regulatory sequences such as the two promoters and locus control regions also It may be used in the same manner as inducible promoters such as disease induction promoters.   If two or more DNAs are used in the DNA transport system, As described above may be incorporated into the same or different carriers.   When used ex vivo, the DNA transport system of the present invention is well known in the art. Methods such as transfection, transduction, biolistics ics), protoplast fusion, calcium phosphate precipitated DNA transformation, electroporation, positive Obtained from the target host using onlipofection or targeted liposomes Effector cells. Next, the effector cells are transformed using standard techniques. And reintroduce it into the host.   In accordance with the present invention, a variety of target hosts, such as, for example, mammals, and especially humans, May be used.   Examples of suitable effector cells include lymphocytes, such as cytotoxic T-lymphocytes, Tumor infiltrating lymphocytes, natural killer cells, neutrophils, antibasophils, eosinophils, obesity Cells or T-helper cells; dendritic cells, B cells, hematopoietic stem cells, macrophages Or cells associated with the immune system, such as monocytes. Cytotoxic T lymphocytes It is particularly preferred to use. When using macrophages, costimulatory signaling The domain is preferably derived from all or part of an integrin-related protein, In particular, it is derived from all or part of mannose, complement receptor or related proteins. This In this case, it is convenient to use the γ chain of the Fc receptor as an additional cytoplasmic signaling component. Is good.   The DNA transport system of the present invention is particularly suitable for in vivo administration. One preferred In one embodiment, the delivery system directs DNA to effector cells for which a carrier is desired. In the form of targeted transport systems. Such targeted transport systems Specific examples of systems include targeted naked nuclear DNA, DNA-targeted retroviral systems And / or targeted liposomes complexed therewith, and protamine And targeted condensed DNA such as polylysine condensed DNA.   Targeting systems are well known in the art, for example, CD8; CD16; CD4; CD3; selectin, eg, E-selectin; CD5; CD7; CD34; activating antigen, eg, C Cell surface antigens expressed on target cells in vivo such as D69 and IL-2R And the use of antibodies or fragments thereof. Alternatively, express HIV gp160 Targeting target cells, e.g. CD4 Can be used.   Generally, antibody-targeted DNA, particularly antibody-targeted naked nuclear DNA, antibody-targeted condensed DNA and Particularly, it is preferable to use an antibody-targeted liposome. Liposomes that may be used Certain types of liposomes include, for example, liposomes using linkers that cleave at low pH. When combined with a chromosome, pH-sensitive liposomes are included. Fused with cell membrane Cationic liposomes that directly transport the recombinant chimeric receptor DNA of the invention to the cytoplasm Also, it may be used. The liposomes used in the present invention may also be, for example, polyether To increase circulating half-life such as Tylene glycol polymers May be bonded to a hydrophilic group. Attached to liposomes or other carriers Substituents suitable for are many examples in the art; see, for example, international patents. Specification number, International Publication No.88 / 04924, International Publication No. 90/09782, International Publication Publication No. 91/05545, International Publication No. 91/05546, International Publication No. 93/19738, National See International Publication No. 94/20073 and International Publication No. 94/22429. Antibody Or other targeting molecules can react with conventional readily available linking groups and antibodies. Sex substituents such as thiols or amines and DNA or DNA-containing materials The DNA, condensed DNA or liposomes may be attached using a reactive substituent.   Non-targeted transport systems may be used as well, in which case the targeted development of DNA The present is advantageous. Targeted expression of DNA can be performed, for example, by using the ζ promoter and the CD2 promoter. T-cell specific, such as promoter and locus control regions, and perforin promoter This may be performed using a promoter system.   The aspects of the invention described above utilize a single DNA sequence to encode a chimeric receptor. It is convenient to use. However, the present invention relates to two or more DNA Is understood to extend to the DNA transport system encoded by the sequence . Thus, in one example, in the same reading frame above, each component i) to iv) and optionally v), but the cytoplasmic signaling component iv) Differ from each other in that they are not the same, but with at least one signal The transduction component is a costimulatory signaling domain as described herein; The first and second different DNA coding sequences may be present in a transport system. Good. The two DNA coding sequences are such that at least one component on the first DNA is a second DN One or more signaling components, as long as they are different from the other signaling components on A Minutes may be coded. As mentioned above, the signaling components act in concert. Conveniently, the remaining components are the same as in the single DNA embodiment. May be any of the components described above. The result encoded by the first DNA The binding component iv) is preferably the same as the binding component encoded by the second DNA. You. The binding component encoded by the first DNA is encoded by the second DNA Be separated from the transmembrane component by a spacer region different from the binding component convenient.   The transport system may be used ex vivo, and in a further aspect, the book The invention relates to effector cells transfected by the DNA transport system of the invention. Provide vesicles. Effector cells previously described suitable for use ex vivo It may be any of the cells, preferably a T cell, and most preferably a cell It is a cytotoxic T cell.   The DNA transport system may be in the form of a pharmaceutical composition. This is therapeutic or diagnostic The composition may be in the form of a disintegrating composition or in any suitable dosage form suitable for administration. Preferably this is parenteral administration, such as injection or infusion, such as a single injection, or May be in a form suitable for continuous infusion. The composition is for injection or infusion In cases where this is the form of a suspension, solution or emulsion in an oily or aqueous medium, And such as suspending, preserving, stabilizing, and / or dispersing agents. Formulation substances may be included. Alternatively, the composition may be formulated with a suitable sterile liquid before use. In a dry dosage form.   If the composition is suitable for oral administration, the composition may contain, in addition to the active ingredient, a starch, e.g. For example, potato, corn, or wheat starch, or cellulose, Or a variety of starch derivatives such as microcrystalline cellulose, silica, lactose Additives such as sugar, magnesium carboxylate and / or calcium phosphate May be included. If the formulation is for oral administration, it is well tolerated by the patient's gastrointestinal tract. It is desirable that they be For this reason, the formulation contains a mucus-forming agent and a resin It may be desirable. Similarly, capsulate compositions that are insoluble in gastric juices. It may also be desirable to improve tolerance by encapsulating in the cell. Ma It may also be preferable to include the composition in a sustained release formulation.   The DNA transport system of the present invention is useful in medicine, and the present invention Administering to a subject an effective amount of a DNA transport system of the present invention. Expanded to the treatment of the subject. The exact amount to be used depends on the age and condition of the patient, Or the nature of the disorder, as well as conventional means, such as animal It may be determined by extrapolating data from experiments. In particular, Exbi When used in an animal model, the number of transfected effector cells Vivo transfection and re-directing of a wide range of effector cell numbers to cells May be established by input. Similarly, the amount of DNA required for use in vivo May be established using a wide range of DNA concentrations in animals.   The DNA transport system of the present invention is useful in treating many diseases or disorders. May be. Such diseases or disorders are infectious diseases, such as HIV infection; Diseases / autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, osteoarthritis, inflammatory bowel disease Disease: cancer; allergy / atopic disease, eg, asthma, eczema: congenital disease, eg, Cystic fibrosis, sickle cell anemia; skin disorders, such as psoriasis; neurological disorders, such as polyps Multiple sclerosis; transplantation, eg, organ transplant rejection, graft host rejection; metabolic / idiopathic disease It may include a disease, such as those described under the general heading Diabetes.   The DNA encoding the chimeric receptor described herein may also be specifically described herein. Is a feature of the present invention used in the transportation system of the present invention.   The DNA encoding the chimeric receptor of the present invention may be assembled from a known DNA sequence. , This specification and our international patent specification, WO 97/23613 and More specifically, the examples and figures in this specification and WO 97/23613 Expressed in effector cells using the methods and approaches generally described in You may.   The following examples illustrate the invention.1) Construction of chimera receptor gene   1 to 21 show the chimeric receptor constructs of the present invention [a to f in each figure].   The components of each of these chimeric receptor constructs were cloned by PCR. Or assembled by standard techniques (PCR protocol, Innis et al. (I. nnis), 1990, Academic Press Inc). Each component is described in our International Patent Statement Book number, cassette similar to that described in Example 1 of WO 97/23613 In-frame subcloning with pBIuescript SK + (Stratagene) Flanked by two to four amino acid bonds forming a restriction site It is.   Thus, for example, in FIG. 1a, the p67 scFv / h.CD28 / CD9-FcRγ chimeric receptor Is specific for human CD33 bound to an extracellular spacer containing the human IgG1 hinge Single engineered human antibody P67.6 single chain Fv, and human FcεR1 through part of human CD9 And a portion of the extracellular region of human CD28 bound to the intracellular domain of the gamma chain of   The single chain Fv is linked to the heavy chain of the engineered human antibody by a (Gly4 Ser) 5 linker. Contains the leader sequence and the variable component of the engineered human antibody light chain attached to the variable component . The extracellular spacer component comprises residues 234 to 243 of the human IgG1 hinge and human CD28. Includes residues 118-134. This corresponds to residues 52-227 of human CD9 (Boucheks et al. eix), 1991, J.M. Biol. Chem.266 117-122) through residue 2 of the gamma chain of human FcεR1 7-68 (Kuster et al., 1989, J. Biol. Chem.255, 6448-6452) It is.   As shown in the rest of FIG. 1 (b-f) and in FIGS. A similar construction may be made using the obtained components.   Thus, a single-chain Fv, such as the P67scFv just described, or HCTMO1scFv as described in Example 1 of 97/23613 is for example a human IgG1 hinge And an extracellular spacer containing part of the extracellular region of human CD28 just described. And may then bind to the various transmembrane and intracellular components indicated. Respectively In the figure, the size of each costimulatory domain is 36 to 227 for CD9 and 38 to 281 for CD37. Shown. In these figures, the specific CD28, ζ and FcRγ components used are If not shown, as above for FcRγ or for CD28 and ζ As described in Example 1 of WO 97/23613 Alternatively, components of the same or similar size may be used. That of these last ingredients Each was constructed in accordance with the invention in the same manner as described for the receptor described in the Examples. , May be incorporated into the receptor.2) Analysis of chimeric receptor constructs expressed in Jurkat cells   Transfection was performed using the following method, described in particular for the construct in FIG. And the expression and action of the receptor of the present invention in the affected cells.P67scFv / h.CD28 / CD9-FcR   The full length chimeric receptor construct was transferred from Hind III to the expression vector p on the EcoRI restriction fragment. EE6hCMV / ne (Bebbington, 1991), MethodsTwo 136-145] to pBluescr Subcloned from ipt.   The plasmid was linearized and biaded using two 1 second pulses at 1000 V and 3 μF. Jurkat E6.1 cells (ECACC) by electroporation using Orad gene pulsar Transfected. The cell line expressing the chimeric receptor was transformed with the drug G418 (2 mg / ml). Selection was performed in the containing medium. After about 4 weeks, determine whether the cells express scFv on their surface. And whether to produce IL-2.scFv Analysis of surface expression   About 5 × 10 cellsFiveStained with a saturating concentration of fluorescein-conjugated antigen (2 μg / ml) Was. Fluorescence was measured with a FACScan cytometer (Becton Dickinson). Was analyzed.Stimulation of antigen-expressing cells   Jurkat Transfectant 1 × 10FivePieces into a 96-well plate (Falcon 1) control target cells that express or do not express antigen inFivePieces With 37 ℃ / 5% COTwoFor overnight. After 18-20 hours, centrifuge the cells The supernatant was assayed for human IL-2 (Quanticaine kit, R & D system). Thames).Solid phase antigen stimulation   Jurkat Transfectant 1 × 10FiveOf the cells, and In a 96-well plate (Nunc) at 37 ° C./5% COTwo And incubated. After 18-20 hours, the cells are centrifuged and the supernatant is directed against human IL-2. Assay (Quanticaine kit, R & D Systems).3) result   FIG. 22 shows transfected cells measured using fluorescein-conjugated human CD33. Surface expression of P67scFv / h.CD28 / CD9-FcRγ chimeric receptor on Jurkat cells Show.   FIG. 23 shows that no target cells or antigen-negative cells [N.EE6 (control plasmid Expressing mouse myeloma NSO)] and antigen-positive target cells [HL60 and N.CD33 ( P67scFv / h.CD2 when stimulated by mouse myeloma NSO expressing human CD33) Antigen specificity by Jurkat cells transfected with 8 / CD29-FcRγ chimeric receptor IL-2 production is shown relative to untransfected Jurkat cells. The figure shows the anti In the presence of primordial (CD33) positive cells, transfected cells expressing the chimeric receptor Jurkat cells were stimulated to produce IL-2. The same cells take the antigen It did not produce IL-2 in the presence of unpresented cells. About each case As a result, untransfected Jurkat control cells did not respond, Did not produce a possible amount.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/715 14/715 14/735 14/735 16/28 16/28 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ウェアー、アンドリュー、ネイル、チャー ルズ イギリス国 バークシャー、トウイフォー ド、ウイロウ ドライブ ７──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI theme coat ゛ (Reference) C07K 14/705 C07K 14/715 14/715 14/735 14/735 16/28 16/28 19/00 19 / 00 C12N 15/00 A C12N 5/10 5/00 B (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU , MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, L) S, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH , CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ , TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW (72) Inventor Ware, Andrew, Nail, Charles Berkshire, England, Twiford, Willow Drive 7

Claims (1)

【特許請求の範囲】 1. 細胞質成分が天然では結合せず、および少なくとも１つが膜通過ポリペプチ ドに由来し、該細胞質シグナル伝達成分の少なくとも１つが、テトラ・スパ ン膜通過蛋白質、CD43、CD6、マンノース、IL-7、IL-12もしくは補体受容体 、インテグリン関連蛋白質、またはサイトカイン受容体に関連するγ鎖の全 てもしくは一部に由来する共刺激シグナル伝達ドメインであることを特徴と する、第一の細胞が、異なる細胞質シグナル伝達成分を２つ以上含む１つ以 上の組換え型キメラ受容体をコードするDNAを含むDNA輸送システムによって 提供されることを特徴とする、第一の細胞と、第二の標的細胞に会合する分 子との１つのタイプの細胞外相互作用が起こった結果として、細胞を活性化 する方法。 2. 細胞質シグナル伝達成分が協調的に作用することができる、請求項１に記載 の方法。 3. 結合成分が標的細胞上の細胞表面分子を認識することができる、DNAがさら にシグナルペプチド、１つ以上のキメラ受容体の結合成分および／または膜 通過成分をコードする、請求項１または２に記載の方法。 4. シグナルペプチド、膜通過および細胞質シグナル伝達成分ならびに結合成分 の全てまたは一部が単一のDNAコード配列によってコードされる、請求項３ に記載の方法。 5. それぞれのDNA配列がさらにシグナルペプチド、膜通過成分、および結合成 分の全てまたは一部をコードする、それぞれの細胞質シグナル伝達成分が異 なるDNAコード配列によってコードされる、請求項３に記載の方法。 6. DNAが結合成分の一部をコードし、およびさらなる異なるDNAコード配列が結 合成分の残りをコードする、請求項４または５に記載の方法。 7. １つのDNA配列によってコードされる結合成分が、他のいかなるDNA配列によ ってコードされる結合成分とも同じタイプの細胞外結合イベントに関与する ことができる、請求項５または６に記載の方法。 8. それぞれの結合成分が標的細胞に関連した同じ分子に結合する、請求項７に 記載の方法。 9. それぞれの結合成分が同じである、請求項８に記載の方法。 10．１つ以上の組換え型キメラ受容体が標的細胞上のウイルスまたは細胞表面分 子を認識することができる、請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。 11．DNAが１つのタイプの細胞外相互作用を行うことができる組換え型キメラ受 容体をコードする、担体と会合したDNA、ならびに該細胞質成分の少なくと も１つが膜通過ポリペプチドに由来し、細胞質シグナル伝達成分の少なくと も１つが、テトラ・スパン膜通過蛋白質、CD43、CD6、マンノース、IL-7、I L-12もしくは補体受容体、インテグリン関連蛋白質、またはサイトカイン受 容体に関連するγ鎖の全てもしくは一部に由来する共刺激シグナル伝達ドメ インであることを特徴とする、天然では結合しない２つ以上の異なる細胞質 シグナル伝達成分、を含むDNA輸送システム。 12．受容体のそれぞれが、天然では結合しない１つ以上の異なる細胞質シグナル 伝達成分を含み、および細胞質成分の少なくとも１つが膜通過ポリペプチド に由来する、該細胞質シグナル伝達成分の少なくとも１つが、テトラ・スパ ン膜通過蛋白質、CD43、CD6、マンノース、IL-7、IL-12または補体受容体、 インテグリン関連蛋白質、またはサイトカイン受容体に関連するγ鎖の全て または一部に由来する共刺激シグナル伝達ドメインであることを特徴とする 、それぞれが同じ一つのタイプの細胞外相互作用を行うことができる２つ以 上の組換え型キメラ受容体をDNAがコードする、担体と会合したDNAを含むDN A輸送システム。 13．DNAが読みとり枠において以下の： i)シグナルペプチド成分； ii)標的細胞上の細胞表面分子を認識することができる結合成分； iii)膜通過成分； iv)細胞質成分の少なくとも１つが膜通過ポリペプチドに由来する、天然では 結合していない異なる２つ以上の細胞質シグナル伝達成分、および任意に； v)細胞質シグナル伝達成分の少なくとも１つが、テトラ・スパン膜通過蛋白質 、CD43、CD6、マンノース、IL-7、IL-12もしくは補体受容体、インテ グリン関連蛋白質、またはサイトカイン受容体に関連するγ鎖の全てもしく は一部に由来する共刺激シグナル伝達ドメインであることを特徴とする、該 i)〜iv)の成分のいずれか２つ以上を結合する１つ以上のスペーサー領域 をコードする、請求項11に記載のDNA輸送システム。 14．DNAが、1）読みとり枠において以下の： i)シグナルペプチド成分； ii)結合成分の一つもしくは一部； iii)膜通過成分； iv)細胞質成分の少なくとも１つが膜通過ポリペプチドに由来する、天然では 結合していない２つ以上の細胞質シグナル伝達成分、および任意に； v)細胞質シグナル伝達成分の少なくとも１つが、テトラ・スパン膜通過蛋白質 、CD43、CD6、マンノース、IL-7、IL-12もしくは補体受容体、インテグリン 関連蛋白質、またはサイトカイン受容体に関連するγ鎖の全てもしくは一部 に由来する共刺激シグナル伝達ドメインであることを特徴とする、該i)〜iv )の成分のいずれか２つ以上を結合する１つ以上のスペーサー領域をコード する第一のDNA、ならびに2)結合成分の部分が共に標的細胞上で細胞表面分 子を認識することができるように、読みとり枠においてシグナルペプチド成 分および該第一のDNAによってコードされる結合成分ii)のさらなる成分をコ ードする第二の異なるDNAを含む、請求項11に記載のDNA輸送システム。 15．DNAが、そのそれぞれが読みとり枠において以下の： i)シグナルペプチド成分； ii)標的細胞上の細胞表面分子を認識することができる結合成分； iii)膜通過成分； iv)細胞質成分の少なくとも１つが膜通過ポリペプチドに由来する、天然では 結合していない異なる１つ以上の細胞質シグナル伝達成分、および任意に； v)第一のDNAが、第二のDNAによってコードされない少なくとも１つの シグナル伝達成分iv)をコードする場合であれば、細胞質シグナル伝達成分 の少なくとも１つが、テトラ・スパン膜通過蛋白質、CD43、CD6、マンノー ス、IL-7、IL-12もしくは補体受容体、インテグリン関連蛋白質、またはサ イトカイン受容体に関連するγ鎖の全てもしくは一部に由来する共刺激シグ ナル伝達ドメインであることを特徴とする、該i)〜iv)の成分のいずれか２ つ以上を結合する１つ以上のスペーサー領域をコードする、第一のDNAおよ び第二の異なるDNAを含む、請求項12に記載のDNA輸送システム。 16．DNAが、1)そのそれぞれが読みとり枠において以下の： i)シグナルペプチド成分； ii)結合成分の一部； iii)膜通過成分； iv)細胞質成分の少なくとも１つが膜通過ポリペプチドに由来する、天然では 結合していない異なる１つ以上の細胞質シグナル伝達成分、および任意に； v)第一のDNAが、第二のDNAによってコードされない少なくとも１つのシグナル 伝達成分iv)をコードする場合であれば、細胞質シグナル伝達成分の少なく とも１つが、テトラ・スパン膜通過蛋白質、CD43、CD6、マンノース、IL-7 、IL-12もしくは補体受容体、インテグリン関連蛋白質、またはサイトカイ ン受容体に関連するγ鎖の全てもしくは一部に由来する共刺激シグナル伝達 ドメインであることを特徴とする、該i)〜iv)の成分のいずれか２つ以上を 結合する１つ以上のスペーサー領域をコードする第一のおよび第二の異なる DNA、ならびに2）第一および第三のDNAによって提供される結合成分部分な らびに第二および第四のDNAによって提供される結合成分部分が共に、それ ぞれ標的細胞上で細胞表面分子を認識することができるように、そのそれぞ れが読みとり枠においてシグナルペプチド成分ならびに該第一および第二の DNAによってそれぞれコードされる結合成分ii)のさらなる部分をコードする 、異なる第三および第四のDNAを含む、請求項12に記載のDNA輸送システム。 17．それぞれのシグナルペプチド成分が免疫グロブリンシグナル配列である、 請求項13〜16に記載のDNA輸送システム。 18．第一のDNAによってコードされる結合成分が第二のDNAによってコードされる 結合成分と同じである、請求項15〜17に記載のDNA輸送システム。 19.結合成分が抗体またはその抗原結合断片である、請求項13〜18に記載のDNA輸 送システム。 20．抗体またはその断片が操作されたヒト抗体またはその抗原結合断片である、 請求項19に記載のDNA輸送システム。 21．結合成分が一本鎖Fv断片である、請求項18〜20に記載のDNA輸送システム。 22．結合成分がFab'断片である、請求項18〜20に記載のDNA輸送システム。 23．膜通過成分がT細胞受容体のα、β、もしくはζ鎖、CD28、CD8、CD4、サイ トカイン受容体、コロニー刺激因子受容体、テトラ・スパン膜通過蛋白質、 CD43、CD6、マンノース、IL-7、IL-12もしくは補体受容体、インテグリン関 連蛋白質、またはサイトカイン受容体に関連したγ鎖の全てもしくは一部に 由来する、請求項13〜22のいずれか１つに記載のDNA輸送システム。 24．膜通過成分がCD28の全てまたは一部に由来する、請求項23に記載のDNA輸送 システム。 25．共刺激シグナル伝達ドメインがCD9、CD37、CD53、CD82、CD43、CD6、CD127 、IL-12受容体β鎖、CD35、CD3、およびCR3関連蛋白質、CD47、またはIL-2 、IL-4、IL-7、IL-9もしくはIL-15受容体のγ鎖の全てもしくは一部に由来 する、請求項11〜24のいずれか１つに記載のDNA輸送システム。 26．共刺激ドメインがCD9の全てまたは一部に由来する、請求項25に記載のDNA輸 送システム。 27．細胞質シグナル伝達成分の少なくとももう一つがT細胞受容体のζ、η、も しくはε鎖、CD28、Fc受容体のγ鎖、サイトカイン受容体、コロニー刺激因 子受容体、チロシンキナーゼ、または接着分子B29、MB-1、CD3δ、CD3γ、C D5、もしくはCD2の細胞質ドメインの全てもしくは一部に由来 する、請求項13〜26のいずれかに記載のDNA輸送システム。 28．細胞質シグナル伝達成分がCD28、T細胞受容体のζ鎖および／またはFcεR1 またはFcγR111の全てもしくは一部に由来する、請求項27に記載のDNA輸送 システム。 29．細胞質シグナル伝達成分が互いに対していかなる方向でもある、請求項11〜 28のいずれかに記載のDNA輸送システム。 30．成分i)〜iv)をコードするDNAがさらに、結合成分ii)および膜通過成分iii) を結合する一つ以上のスペーサー領域をさらにコードする、請求項13〜29の いずれか１つに記載のDNA輸送シスーム。 31．２つ以上の異なるスペーサー領域が結合成分ii)および膜通過成分iii)を結 合する、請求項30に記載のDNA輸送システム。 32．スペーサー領域が遊離のチオール基１つ以上を提供するように選択される、 請求項30または請求項31に記載のDNA輸送システム。 33．スペーサー領域がCD8、CD4、またはCD28の細胞外領域の全てまたは一部に由 来する、請求項30〜32に記載のDNA輸送システム。 34．スペーサー領域が抗体の定常領域の全てまたは一部である、請求項30または 32に記載のDNA輸送システム。 35．スペーサー領域がCD28の細胞外領域の全てまたは一部に結合した抗体ヒンジ 領域の全てまたは一部に由来する、請求項30〜32に記載のDNA輸送システム 。 36．担体がウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請求項11〜35の いずれかに記載のDNA輸送システム。 37．非ウイルスベクターがリポソームベクターである、請求項36に記載のDNA輸 送システム。 38．担体が標的化した非ウイルスベクターである、請求項37に記載のDNA輸送シ ステム。 39．標的化したベクターが抗体標的化リポソームである、請求項38に記載のDNA 輸送システム。 40．標的化したベクターが抗体標的化凝縮DNAである、請求項38に記載のDNA 輸送システム。 41．標的化したベクターが抗体標的化プロタミンまたはポリリジン凝縮DNAであ る、請求項40に記載のDNA輸送システム。 42．標的化したベクターが抗体標的化裸核DNAである、請求項38に記載のDNA輸送 システム。 43．抗体が抗体全体またはその抗原結合断片である、請求項39〜42に記載のDNA 輸送システム。 44．抗体が操作されたヒト抗体またはその抗原結合断片である、請求項43に記載 のDNA輸送システム。 45．請求項１〜444のいずれか１つに記載のDNA輸送システムでトランスフェクト したエフェクター細胞。 46．リンパ球、樹状細胞、B細胞、造血幹細胞、マクロファージ、単球、または NK細胞である、請求項45に記載のエフェクター細胞。 47．細胞障害性Tリンパ球である、請求項46に記載のエフェクター細胞。 48．感染疾患、炎症疾患、癌、アレルギー／アトピー疾患、先天性疾患、皮膚疾 患、神経疾患、移植および代謝／特発性疾患の治療において用いられる、請 求項11〜47のいずれか１つに記載のDNA輸送システム。 49．リウマチ性関節炎、変形性関節炎、炎症性腸疾患、喘息、湿疹、嚢胞性繊維 症、鎌状赤血球貧血、乾癬、多発性硬化症、臓器もしくは組織移植拒絶、移 植片対宿主拒絶反応、または糖尿病の治療において用いられる請求項48記載 のDNA輸送システム。 50．１つ以上の製剤化物質と共に、請求項11〜44のいずれか１つに記載されるDN A輸送システムを含む薬学的組成物。 51．製剤化物質が懸濁剤、保存剤、安定化剤、および／または分散剤である、請 求項50に記載の薬学的組成物。 52．請求項11〜44のいずれか１つに記載の輸送システムにおいて用いられる組換 え型キメラ受容体をコードするDNA。[Claims] 1. a cytoplasmic component not naturally bound and at least one transmembrane polypeptide     And at least one of the cytoplasmic signaling components is derived from Tetra Spa     Transmembrane protein, CD43, CD6, mannose, IL-7, IL-12 or complement receptor     Gamma chain associated with, integrin-related protein, or cytokine receptor     Characterized in that it is a costimulatory signaling domain derived from     One or more cells comprising two or more different cytoplasmic signaling components.     By a DNA transport system containing DNA encoding the above recombinant chimeric receptor     A fraction associated with a first cell and a second target cell, characterized by being provided.     Activate cells as a result of one type of extracellular interaction with the offspring     how to. 2. The method of claim 1, wherein the cytoplasmic signaling component is capable of acting cooperatively.     the method of. 3. The binding component can recognize cell surface molecules on the target cell,     Signal peptide, binding component and / or membrane of one or more chimeric receptors     3. The method according to claim 1 or 2, wherein the passage component is coded. 4. Signal peptide, transmembrane and cytoplasmic signaling components and binding components     4. All or part of is encoded by a single DNA coding sequence.     The method described in. 5. Each DNA sequence contains additional signal peptide, transmembrane components, and binding components.     The cytoplasmic signaling components that encode all or part of the     4. The method of claim 3, wherein the method is encoded by a DNA coding sequence. 6. DNA encodes a portion of the binding component, and additional different DNA coding sequences     A method according to claim 4 or 5, wherein the remainder of the composition is encoded. 7. The binding component encoded by one DNA sequence is     Are also involved in the same type of extracellular binding event     7. A method according to claim 5 or claim 6, wherein 8. The method of claim 7, wherein each binding component binds to the same molecule associated with the target cell.     The described method. 9. The method of claim 8, wherein each binding component is the same. 10. One or more of the recombinant chimeric receptors is a virus or cell surface component on a target cell.     10. The method according to any one of the preceding claims, wherein the child can be recognized. 11． Recombinant chimeric recipients in which DNA can perform one type of extracellular interaction     The carrier-associated DNA encoding the receptor, and at least the cytoplasmic component     One is derived from a transmembrane polypeptide and has at least a cytoplasmic signaling component.     One of them is a tetra-span transmembrane protein, CD43, CD6, mannose, IL-7, I     L-12 or complement receptor, integrin-related protein, or cytokine receptor     Costimulatory signaling domain from all or part of the gamma chain associated with the body     Two or more different cytoplasms that are not naturally associated     A DNA transport system comprising a signaling component. 12． Each of the receptors has one or more different cytoplasmic signals that do not naturally bind     A transmembrane polypeptide comprising a transduction component and at least one of the cytoplasmic components     Wherein at least one of the cytoplasmic signaling components is derived from Tetra Spa     Transmembrane protein, CD43, CD6, mannose, IL-7, IL-12 or complement receptor,     All gamma chains associated with integrin-related proteins or cytokine receptors     Or a co-stimulatory signaling domain derived from a part thereof     Two or more, each of which can perform the same type of extracellular interaction     The above-described recombinant chimeric receptor is encoded by a DNA, and the DN comprises a carrier-associated DNA.     A transport system. 13. DNA reads in the reading frame:   i) a signal peptide component;   ii) a binding component capable of recognizing a cell surface molecule on a target cell;   iii) transmembrane components;   iv) naturally at least one of the cytoplasmic components is derived from a transmembrane polypeptide;     Two or more different uncoupled cytoplasmic signaling components, and optionally;   v) at least one of the cytoplasmic signaling components is a tetra-span transmembrane protein;     , CD43, CD6, mannose, IL-7, IL-12 or complement receptor,     All or all of the gamma chains associated with gulin-related proteins or cytokine receptors     Is a costimulatory signaling domain derived from a part thereof,     One or more spacer regions that bind any two or more of the components of i) to iv)     The DNA transport system according to claim 11, which encodes: 14. DNA, 1) in reading frame:   i) a signal peptide component;   ii) one or a portion of the binding components;   iii) transmembrane components;   iv) naturally at least one of the cytoplasmic components is derived from a transmembrane polypeptide;     Two or more cytoplasmic signaling components that are not bound, and optionally;   v) at least one of the cytoplasmic signaling components is a tetra-span transmembrane protein;     , CD43, CD6, mannose, IL-7, IL-12 or complement receptor, integrin     All or part of the related protein or gamma chain related to cytokine receptor     Wherein i) to iv are co-stimulatory signaling domains derived from     ) Encodes one or more spacer regions that bind any two or more of the components     The first DNA that binds, and 2) the portion of the binding component     Signal peptide synthesis in the reading frame so that the offspring can be recognized.     And the further components of the binding component ii) encoded by the first DNA     12. The DNA transport system according to claim 11, comprising a second different DNA to be loaded. 15． DNA has the following in each reading frame:   i) a signal peptide component;   ii) a binding component capable of recognizing a cell surface molecule on a target cell;   iii) transmembrane components;   iv) naturally at least one of the cytoplasmic components is derived from a transmembrane polypeptide;     One or more different uncoupled cytoplasmic signaling components, and optionally;   v) at least one of the first DNAs is not encoded by the second DNA;     If coding for the signaling component iv), the cytoplasmic signaling component     At least one of the proteins is a tetra-span transmembrane protein, CD43, CD6, mannose     Protein, IL-7, IL-12 or complement receptor, integrin-related protein, or     Co-stimulatory sig derived from all or part of the gamma chain associated with the Itokine receptor     Any one of the above components i) to iv), which is a null transduction domain     A first DNA and one or more spacer regions encoding one or more     13. The DNA transport system according to claim 12, comprising a second and a different DNA. 16． DNA, 1) each of which in the reading frame:   i) a signal peptide component;   ii) part of the binding component;   iii) transmembrane components;   iv) naturally at least one of the cytoplasmic components is derived from a transmembrane polypeptide;     One or more different uncoupled cytoplasmic signaling components, and optionally;   v) at least one signal wherein the first DNA is not encoded by the second DNA     If coding for the transmission component iv), the cytoplasmic signaling component     One of them is tetra-span transmembrane protein, CD43, CD6, mannose, IL-7     , IL-12 or complement receptor, integrin-related protein, or cytochrome     Signaling from all or part of the gamma chain associated with the receptor     Characterized in that it is a domain, any two or more of the components i) to iv)     First and second different encoding one or more spacer regions to bind     DNA, and 2) the binding component portion provided by the first and third DNAs.     In addition, the binding component portions provided by the second and fourth DNA     In order to be able to recognize cell surface molecules on the target cells,     In the reading frame, the signal peptide component and the first and second     Encodes a further part of the binding component ii) each encoded by DNA     13. The DNA transport system according to claim 12, comprising different third and fourth DNAs. 17． Each signal peptide component is an immunoglobulin signal sequence,     17. The DNA transport system according to claim 13. 18． The binding component encoded by the first DNA is encoded by the second DNA     18. The DNA transport system according to claims 15 to 17, which is the same as the binding component. 19. The DNA transfer device according to claim 13, wherein the binding component is an antibody or an antigen-binding fragment thereof.     Feeding system. 20. The antibody or a fragment thereof is an engineered human antibody or an antigen-binding fragment thereof,     20. The DNA transport system according to claim 19. twenty one. 21. The DNA transport system according to claims 18 to 20, wherein the binding component is a single-chain Fv fragment. twenty two. 21. The DNA transport system according to claims 18 to 20, wherein the binding component is a Fab 'fragment. twenty three. Transmembrane components are T-cell receptor α, β, or ζ chains, CD28, CD8, CD4,     Tokain receptor, colony stimulating factor receptor, tetra-span transmembrane protein,     CD43, CD6, mannose, IL-7, IL-12 or complement receptor, integrin     All or part of the gamma chain associated with the     The DNA transport system according to any one of claims 13 to 22, which is derived from the DNA transport system. twenty four. 24.The DNA transport of claim 23, wherein the transmembrane component is derived from all or a portion of CD28.     system. twenty five. Co-stimulatory signaling domain is CD9, CD37, CD53, CD82, CD43, CD6, CD127     IL-12 receptor β-chain, CD35, CD3, and CR3-related proteins, CD47, or IL-2     From all or part of the gamma chain of the IL-4, IL-7, IL-9 or IL-15 receptor     The DNA transport system according to any one of claims 11 to 24, wherein: 26. The DNA transfer of claim 25, wherein the costimulatory domain is derived from all or a portion of CD9.     Feeding system. 27. At least one of the cytoplasmic signaling components is also a T cell receptor T, η,     Chain, CD28, γ chain of Fc receptor, cytokine receptor, colony stimulating factor     Child receptor, tyrosine kinase, or adhesion molecule B29, MB-1, CD3δ, CD3γ, C     From all or part of the cytoplasmic domain of D5 or CD2     The DNA transport system according to any one of claims 13 to 26. 28. The cytoplasmic signaling component is CD28, the T cell receptor ζ chain and / or FcεR1     Or the DNA transport according to claim 27, which is derived from all or a part of FcγR111.     system. 29. The cytoplasmic signaling components are in any direction relative to each other.     29. The DNA transport system according to any of 28. 30. DNA encoding components i) to iv) further comprises a binding component ii) and a transmembrane component iii).     The method of claim 13, further encoding one or more spacer regions that bind     The DNA transport system according to any one of the above. 31. Two or more different spacer regions link the binding component ii) and the transmembrane component iii).     31. The DNA transport system of claim 30, which is compatible. 32. The spacer region is selected to provide one or more free thiol groups;     32. The DNA transport system according to claim 30 or claim 31. 33. The spacer region is due to all or part of the extracellular region of CD8, CD4, or CD28.     33. The DNA transport system of claims 30-32. 34. The spacer region is all or part of the constant region of the antibody, or     32. The DNA transport system according to 32. 35. Antibody hinge with spacer region attached to all or part of the extracellular region of CD28     The DNA transport system according to claims 30 to 32, which is derived from all or a part of the region.     . 36. The carrier of claim 11 to 35, wherein the carrier is a viral vector or a non-viral vector.     The DNA transport system according to any one of the above. 37. The DNA transfer according to claim 36, wherein the non-viral vector is a liposome vector.     Feeding system. 38. 38. The DNA transport system according to claim 37, wherein the carrier is a targeted non-viral vector.     Stem. 39. The DNA of claim 38, wherein the targeted vector is an antibody-targeted liposome.     Transport system. 40. The DNA of claim 38, wherein the targeted vector is an antibody-targeted condensed DNA.     Transport system. 41. If the targeted vector is antibody-targeted protamine or polylysine condensed DNA     41. The DNA transport system according to claim 40, wherein 42. The DNA transport of claim 38, wherein the targeted vector is an antibody-targeted naked nuclear DNA.     system. 43. The DNA of claim 39, wherein the antibody is a whole antibody or an antigen-binding fragment thereof.     Transport system. 44. The antibody of claim 43, wherein the antibody is an engineered human antibody or an antigen-binding fragment thereof.     DNA transport system. 45. Transfected with the DNA transport system according to any one of claims 1 to 444     Effector cells. 46. Lymphocytes, dendritic cells, B cells, hematopoietic stem cells, macrophages, monocytes, or     46. The effector cell according to claim 45, which is an NK cell. 47. 47. The effector cell according to claim 46, which is a cytotoxic T lymphocyte. 48. Infectious disease, inflammatory disease, cancer, allergy / atopic disease, congenital disease, skin disease     Disease, neurological disease, transplantation and metabolic / idiopathic disease     48. The DNA transport system according to any one of claims 11 to 47. 49. Rheumatoid arthritis, osteoarthritis, inflammatory bowel disease, asthma, eczema, cystic fiber     Disease, sickle cell anemia, psoriasis, multiple sclerosis, organ or tissue transplant rejection, transfer     49. The method of claim 48 for use in treating plant versus host rejection, or diabetes.     DNA transport system. 50. The DN according to any one of claims 11 to 44, together with one or more formulated substances.     A pharmaceutical composition comprising an A delivery system. 51. An agent wherein the formulation material is a suspending, preserving, stabilizing and / or dispersing agent.     A pharmaceutical composition according to claim 50. 52. Recombination for use in a transportation system according to any one of claims 11 to 44.     DNA encoding the chimeric chimeric receptor.
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