JP2002511263A - 脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ−２タンパク質 - Google Patents

脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ−２タンパク質

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、発現された配列タグ（ＥＳＴｓ）を含む核酸配列、オリゴヌクレオチドプローブ、ポリペプチド、抗体、ベクター及びヒト及びｐａｔｃｈｅｄ-２に対するイムノアドヘシン、アゴニスト及びアンタゴニストを発現する宿主細胞に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、一般的にシグナル伝達分子、特に、細胞増殖及び分化に含まれるヘ
ッジホッグ（ｈｈ）カスケードにおけるシグナル伝達及びメディエータ分子に関
する。
【０００２】 （発明の背景） 多細胞生物の発育は少なくとも部分的に、細胞、組織、又は器官のパターンの
位置的情報を特定、指揮又は維持するメカニズムに依存している。種々の分泌さ
れたシグナル伝達分子、例えばトランスフォーミング成長因子-ベータ（ＴＧＦ-
β）、Ｗｎｔ、繊維芽成長因子及びヘッジホッグファミリー等は、ショウジョウ
バエ及び脊椎動物における様々な細胞及び構造のパターン形成に関連している。
Perrimon, Cell: 80: 517-520 (1995)。 セグメントポラリティ遺伝子はショウジョウバエにおいて最初に発見され、そ
れが突然変異した場合に体節構造のパターンに変化を起こした。これらの変化は
頭から尾に沿ったパターンに影響を与えた。ヘッジホッグ（Ｈｈ）は、キイロシ
ョウジョウバエにおける遺伝子スクリーニングによりセグメントポラリティ遺伝
子として最初に同定され、Nusslein-Volhard等, Roux. Arch. Dev. Biol. 193:
267-282 (1984)、それは広範な発達機能を果たす。Perrimon, 上掲。１つのショ
ウジョウバエＨｈ遺伝子しか同定されていないが、３つのヒトＨｈ相同体：ソニ
ックＨｈ（Ｓｈｈ）、デザートＨｈ（Ｄｈｈ）及びインディアンＨｈ（Ｉｈｈ）
が単離されている、Echelard等, Cell 75, 1417-30 (1993)；Riddle等, Cell 75
: 1401-16 (1993)。Ｓｈｈは発育中の脊椎動物胚の脊索及び底板で高レベルで発
現され、発育中の肢、体節及び神経管における細胞運命を確立するために作用す
る。インビトロ外植片アッセイ並びにトランスジェニック動物におけるＳｈｈの
異所性発現は、ＳＨｈが神経管パターン形成において鍵となる役割を果たすこと
を示している、Echelard等, 上掲, Ericson等, Cell 81: 747-56 (1995); Marti
等, Nature 375: 322-5 (1995); Roelink等 (1995), 上掲; Hynes等, Neuron 19
: 15-26 (1997)。また、Ｈｈは、肢（Krauss等, Cel 75: 1431-44 (1993）; Lau
fer等, Cell 79, 993-1003 (1994)）、体節（Fan 及びTessier-Lavigne, Cell 7
9, 1175-86 (1994); Johnson等, Cell 79: 1165-73 (1994)）、肺（Bellusci等,
Develop. 124: 53-63 (1997)）及び皮膚（Oro等, Science 276: 817-21 (1997)
）の発達においても役割を果たす。同様に、Ｉｈｈ及びＤｈｈは骨、腸及び胚細
胞発育に関連する、Apeqvist等, Curr. Biol. 7: 801-4 (1997); Bellusci等, D
evelopment 124: 55-63 (1997); Bitgood等, Curr. Biol. 6: 298-304 (1996);
Roberts等, Development 121: 3163-74 (1995)。特に、Ｉｈｈは軟骨細胞発達に
含まれていたが［Vorlamp, A.等, Science 273: 613-22 (1996)］、Ｄｈｈは精
巣発達において役割を果たす。Bitgood等, 上掲。Ｉｈｈ及びＳｈｈが発現され
る腸を除いて、ヘッジホッグファミリーメンバーの発現パターンは重複しない。
Bitgood等, 上掲。
【０００３】 細胞表面において、Ｈｈ機能は、ショウジョウバエにおいてセグメントポラリ
ティ遺伝子として最初に同定され、後に脊椎動物で特徴付けされた２つの多重膜
貫通タンパク質であるｐａｔｃｈｅｄ（ｐｔｃｈ）及びＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（
Ｓｍｏ）を含む多成分レセプター複合体によって媒介されていることがわかった
。Nakano等, Nature 341: 508-13 (1989); Goodrich等, Genes Dev. 10: 301-31
2 (1996); Marigo等, Develop. 122: 1225-1233 (1996); van den Heuval, M.及
びIngham, P.W., Nature 382: 547-551 (1996); Alcedo等, Cell 86: 221-232 (
1996); Stone, D.M.等, Nature 384: 129-34 (1996)。ＨｈのＰｔｃｈへの結合
に際し、ＰｔｃｈのＳｍｏに対する正常な阻害効果が解除され、Ｓｍｏが細胞質
膜を通したＨｈシグナルを伝達するのを可能にする。Ｐｔｃｈ／Ｓｍｏレセプタ
ー複合体が哺乳動物の３つ全てのヘッジホッグを媒介する場合、又は特定の成分
が存在する場合、それは確立されたままである。興味深いことに、第２のマウス
Ｐｔｃｈ遺伝子、Ｐｔｃｈ-２が最近単離されたが［Motoyama, J.等, Nature Ge
netics 18: 104-106 (1998)］、そのＨｈレセプターとしての機能は確立されて
いない。Ｐｔｃｈ-２を特徴付けし、それを種々のＨｈファミリーメンバーの生
物学的機能についてＰｔｃｈと比較するために、本出願人は、ヒトＰｔｃｈ-２
遺伝子を単離した。Ｐｔｃｈ及びＰｔｃｈ-２の生物学的分析は、両方共がＨｈ
ファミリーの全てのメンバーに類似の親和性で結合し、両方の分子がＳｍｏと複
合体を形成できることを示した。しかしながら、Ｐｔｃｈ-２及びＰｔｃｈの発
現パターンは重複していない。Ｐｔｃｈはマウス胚を通して発現されるが、Ｐｔ
ｃｈ-２は、正常な発達のためにデザートヘッジホッグ（Ｄｈｈ）を必要とする
精母細胞に主に見られ、Ｐｔｃｈ-２が精巣におけるＤｈｈ活性を媒介すること
を示唆している。Ｐｔｃｈ-２の染色体局在化は、それを幾つかの生殖細胞にお
いて欠失される領域である染色体１ｐ３３-３４に配置させ、Ｐｔｃｈ-２がＤｈ
ｈ標的細胞における腫瘍サプレッサーとなる可能性を向上させる。
【０００４】 （発明の概要） 一実施態様では、本発明は、（ａ）Ｆｉｇ１のアミノ酸１〜１２０３の配列を
含むｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ
）のＤＮＡ分子の補体に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有し；ｐａｔ
ｃｈｅｄ-２の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸
分子を提供する。配列同一性は、好ましくは＞９１％、より好ましくは約９２％
、最も好ましくは約９５％である。一態様において、単離された核酸は、Ｆｉｇ
１のアミノ酸残基１〜約１２０３の配列を有するポリペプチドに対して少なくと
も＞９１％、より好ましくは少なくとも約９２％、さらに好ましくは少なくとも
約９５％の配列同一性を有する。さらなる態様において、単離された核酸分子は
、Ｆｉｇ１のアミノ酸残基１〜約１２０３を有するヒトｐａｔｃｈｅｄ-２ポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる。さらに他の態様では、本発明は、（
ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０９７７８のｃＤＮＡ（記号：ｐＲＫ７.ｈｐｔｃ２.Ｆ
ｌａｇ-１４０５）にコードされるのと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ分子、あるいは、ＡＴＣＣ２０９７７８の登録番号で寄託されたクローンｐＲ
Ｋ７.ｈｐｔｃ２.Ｆｌａｇ-１４０５のコード化配列に対して少なくとも９５％
の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸を提供する。またさら
なる態様では、本発明はＡＴＣＣ寄託番号２０９７７８のｃＤＮＡ（記号：ｐＲ
Ｋ７.ｈｐｔｃ２.Ｆｌａｇ-１４０５）のｃＤＮＡの配列、又はそれに緊縮条件
下でハイブリッド形成する配列をコードするヒトｐａｔｃｈｅｄ-２を含んでな
る核酸を提供する。
【０００５】 他の実施態様では、本発明は、ヒトｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチドをコード
するＤＮＡを含むベクターを提供する。また、そのようなベクターを含む宿主細
胞も提供される。例えば、宿主細胞は哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）、原核
生物細胞（例えば大腸菌）又は酵母細胞（例えばサッカロミセスセレヴィシアエ
(Saccaromyces cerevisiae)）でよい。さらに、宿主細胞を、ｐａｔｃｈｅｄ-２
の発現に適した条件下で培養し、細胞培地からそれを回収することを含んでなる
ｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチドの製造方法も提供される。 さらに他の実施態様では、本発明は単離されたｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチ
ドを提供する。特に、本発明は単離された天然配列ｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプ
チドを提供し、それは一実施態様においてＦｉｇ１の残基１〜約１２０３を含む
アミノ酸配列を含んでなるヒトｐａｔｃｈｅｄ-２である。メチオニンから開始
されてもされなくてもよいヒトｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチドが特に含まれる
。また、本発明は登録番号ＡＴＣＣ２０９７７８の下で寄託された核酸にコード
されるヒトｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチドを提供する。 さらに他の実施態様では、本発明は、異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融
合したｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチドｐａｔｃｈｅｄ-２を含んでなるキメラ分
子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は免疫グロ
ブリンの定常領域の融合したｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチドｐａｔｃｈｅｄ-２
を含むキメラ分子である。 さらに他の実施態様では、本発明は、Ｆｉｇ２Ａ（９０５５３１）（配列番号
：３）及びＦｉｇ２Ｂ（１３２６２５８）（配列番号：５）で同定される核酸配
列を含む発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。 さらに多の実施態様では、本発明は、ｐａｔｃｈｅｄ-２の生物学的活性を持
つ選択的にスプライシングされたヒトｐａｔｃｈｅｄ-２の変異体を提供する。 さらに他の実施態様では、本発明は、ヘッジホッグ（Ｈｈ）、特にデザートヘ
ッジホッグ（Ｄｈｈ）によって少なくとも部分的に媒介される疾患の治療のため
のｐａｔｃｈｅｄ-２の使用方法を提供する。特に精巣癌である。さらに他の実
施態様では、本発明は、Ｈｈシグナル伝達、特にＤｈｈシグナル伝達を阻止する
ことにより効果をあげる疾患の治療又は生理学的状態の生成のためのｐａｔｃｈ
ｅｄ-２アンタゴニスト又はアゴニストの使用方法を提供する。（例えば、避妊
）。
【０００６】 （好適な実施態様の詳細な説明） Ｉ．定義 ここで使用される際の「ｐａｔｃｈｅｄ-２」及び「ｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペ
プチド」という用語は、天然配列ｐａｔｃｈｅｄ-２及びｐａｔｃｈｅｄ-２の生
物学的活性を有するｐａｔｃｈｅｄ-２変異体（ここで更に詳細に定義する）を
含む。ｐａｔｃｈｅｄ-２は、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源
から単離してもよく、あるいは組換え又は合成方法によって調製してもよい。 「天然配列ｐａｔｃｈｅｄ-２」は、天然由来のヒトｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペ
プチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天
然配列ｐａｔｃｈｅｄ-２は、自然から単離することもできるし、組換え及び／
又は合成手段により生産することもできる。「天然配列脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ
-２」という用語には、特に、ヒトｐａｔｃｈｅｄ-２の自然に生じる切断形態、
自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びヒトｐ
ａｔｃｈｅｄ-２の自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。よって、本発明
の一実施態様において、天然配列ｐａｔｃｈｅｄ-２は、Ｆｉｇ１（配列番号：
２）のアミノ酸１〜１２０３を含む成熟又は全長天然ヒトＰｔｃｈ-２であり、
位置１に開始メチオニンを有しても有さなくてもよい。 「ｐａｔｃｈｅｄ-２変異体」とは、以下に定義されるように、（ａ）ｐａｔ
ｃｈｅｄ-２ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ
分子の補体と少なくとも約＞９１％のアミノ酸配列同一性を有する活性なヒトｐ
ａｔｃｈｅｄ-２を意味する。特別な実施態様において、ｐａｔｃｈｅｄ-２変異
体は、全長天然配列ヒトｐａｔｃｈｅｄ-２についてＦｉｇ１に示した推定アミ
ノ酸配列を有するヒトＰｔｃｈ-２（配列番号：２）と少なくとも＞９１％のア
ミノ酸配列相同性を有する。このようなｐａｔｃｈｅｄ-２変異体は、これらに
限られないが、Ｆｉｇ１(配列番号：２)の配列のＮ-又はＣ-末端において一又は
複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチ
ドを含む。好ましくは、核酸又はアミノ酸配列同一性は、少なくとも約９２％、
より好ましくは少なくとも約９３％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％
である。
【０００７】 ｐａｔｃｈｅｄ-２配列に対してここで同定されている「パーセント(％)アミ
ノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るため
に必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えない
とした、ｐａｔｃｈｅｄ-２配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミ
ノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定
する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例
えば、初期設定パラメータに設定されたBLAST-2ソフトウエアのような公に入手
可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者
であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するため
に必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパ
ラメータを決定することができる。 ここで同定されるｐａｔｃｈｅｄ-２配列に対する「パーセント(％)核酸配列
同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要な
らば間隙を導入し、ｐａｔｃｈｅｄ-２配列のヌクレオチドと同一である候補配
列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性
を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方
法、例えば、初期設定パラメータに設定したBLAST-2ソフトウエアのような公に
入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当
業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成する
ために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切
なパラメータを決定することができる。
【０００８】 「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチ
ド」に融合したｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチド、又はその一部、ｐａｔｃｈｅ
ｄ-２を含んでなるキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その
抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な残基を有しているが、ｐａｔ
ｃｈｅｄ-２ポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリ
ペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないよ
うにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは一般に、少なくとも６のアミ
ノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残
基)を有する。 ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アド
ヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを
組み合わせた抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合
特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミ
ノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘ
シン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの
結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定
常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ
、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの
任意の免疫グロブリンから得ることができる。文献に報告されたイムノアドヘシ
ンは、Ｔ細胞レセプター＊［Gascoigne等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 29
36-2940 (1987)］；ＣＤ４＊［Capron等, Nature 337: 525-531 (1989); Traune
cker等, Nature 339: 68-70 (1989); Zettmeissl等, DNA Cell Biol. USA 9: 34
7-353 (1990); Byrn等, Nature 344, 667-670 (1990)］；Ｌ-セレクチン（ホー
ミングレセプター）［Watson等, J. Cell. Biol. 110, 2221-2229 (1990); Wats
on等, Nature 349, 164-167 (1991)］；ＣＤ４４＊［Aruffo等, Cell 61, 1303-
1313 (1990)］；ＣＤ２８＊及びＢ７＊［Linsley等, J. Exp. Med. 173, 721-73
0 (1991)］；ＣＴＬＡ-４＊［Lisley等, J. Exp. Med. 174, 561-569 (1991)］
；ＣＤ２２＊［Stamenkovic等, Cell 66. 1133-1144 (1991)］；ＴＮＦレセプタ
ー［Ashkenazi等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535-10539 (1991); Less
lauer等, Eur. J. Immunol. 27, 2883-2886 (1991); peppel等, J. Exp. Med. 1
74, 1483-1489 (1991)］；ＮＰレセプター［Bennett等, J. Biol. Chem. 266, 2
3060-23067 (1991)］；ＩｇＥレセプターα鎖＊［Ridgway及びGorman, J. Ce;;.
Biol. 115, 要約, 1448 (1991)］；ＨＧＦレセプター［Mark, M.R.等, J. Biol
. Chem., 267(36): 26166-26171 (1992)］の融合物を含み、ここで星印（*）は
、レセプターが免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであることを示す
。
【０００９】 ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般
的に プローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プ
ローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短
くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がそれらの
Ｔｍ（融点）に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再
アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の
所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、
より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下
させる。さらに、緊縮性は塩濃度にも逆比例する。ハイブリッド形成反応の緊縮
性の更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biol
ogy (1995)を参照のこと。 ここで定義される「緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高
温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍ
のクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２
）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０
％（vol/vol）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコー
ル／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウ
ムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム
を用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７
５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナト
リウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、
超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％の
デキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン
酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃でのホルムアミド、次いで５５℃におけるＥ
ＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定さ
れる。
【００１０】 「単離された」とは、ここで開示される種々のポリペプチドを記述するために
使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収され
たポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの
診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び
他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様におい
て、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することに
より、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分な
まで、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還
元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離
されたポリペプチドには、ｐａｔｃｈｅｄ-２の自然環境の少なくとも１つの成
分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しか
しながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により
調製される。 「単離された」ｐａｔｃｈｅｄ-２核酸分子は、同定され、ｐａｔｃｈｅｄ-２
核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された
核酸分子である。単離されたｐａｔｃｈｅｄ-２核酸分子は、天然に見出される
形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたｐａｔｃｈｅｄ-２核
酸分子は、天然の細胞中に存在するようなｐａｔｃｈｅｄ-２核酸分子から区別
される。
【００１１】 「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合
したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好
適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及び
リボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化
シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。 核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」てい
る。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に
参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡ
に作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影
響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合
部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用
可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤ
ＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズに
あることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない
。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位
が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター
あるいはリンカーが使用される。
【００１２】 「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に単一のモノクロー
ナル抗体(アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む)、及び多エピトープ特異性
を持つ抗体組成物、並びに、これらが所望の生物学的活性を示す限りにおいて抗
体断片（例えばＦａｂ、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ）を包含している。 ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体
の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性
のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を指す。モノクローナ
ル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対応する。さらに、異なる決定
基(エピトープ)に対応する異なる抗体を典型的に含む従来の(ポリクローナル)抗
体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対応する。
それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の免疫グロブリン
で汚染されていないハイブリドーマ培地で合成されるという点で有利である。「
モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られるとい
う抗体の特徴を示すものであり、或る特定の方法による抗体生産を必要とすると
解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は
、最初にKohler及びMilsteinによって、Nature, 256:495 (1975)に記載されたハ
イブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作る
ことができる［例えば米国特許第4,816,567号（Cabilly等）参照］。 ここで、モノクローナル抗体は特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種
から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配
列と同一又は相同であるが、鎖の残りの部分は他の種から誘導された又は他の抗
体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である「キ
メラ」抗体（免疫グロブリン）、並びに、それらが所望の生物学的活性を示す限
りそれらの抗体の断片を含む［米国特許第4,816,567号、Cabilly等；Morrison
等, Proc. Natl. acad. Sci. U.S.A. 81: 6851-6855 (1984）］。
【００１３】 非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘
導された最小配列を含有する特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又
はそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の
他の抗原結合性配列）である。大部分において、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリ
ン（レシピエント抗体）であって、そのレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ
）が、マウス、ラット、ヤギなどのヒト以外の種のＣＤＲ（ドナー抗体）に由来
する所望の特異性、親和性及び容量を持つ残基で置換されている。ある場合は、
ヒト免疫グロブリンのＦｖ枠残基が対応する非ヒト残基で置換される。さらに、
ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、輸入されるＣＤＲ又は枠配列にも見られ
ない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに精密かつ最適化
するために施される。一般にヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質上全てが
非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質上全てがヒト免
疫グロブリン共通配列のものである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメ
インの実質的に全部を含有するであろう。また、最適なヒト化抗体は、免疫グロ
ブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一
部も含有するであろう。さらなる詳細については、Jones等, Nature 321: 522 -
525 (1986)；Reichmann等, Nature 332: 323-329 (1988)；Presta, Curr. Op. s
truct. Biol. 2: 593 -596 (1992)及び1993年7月6日発行の米国特許第5,225,539
号（Winter）を参照のこと。
【００１４】 ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ｐａｔｃ
ｈｅｄ-２の生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するｐａｔｃｈｅｄ-２の形
態を意味する。好ましい活性は、ヘッジホッグ（Ｈｈ）、特にデザートヘッジホ
ッグ（Ｄｈｈ）シグナル伝達に結合及び影響、例えば阻止又はその他の変調をさ
せる能力である。例えば、精巣眼、雄精母細胞形成及び基底細胞癌の病原を調節
である。 ここで用いられる「アンタゴニスト」なる用語は、最も広い意味において、Ｈ
ｈシグナル伝達におけるｐａｔｃｈｅｄ-２の正常な機能を阻止、防止、阻害、
中和する任意の分子を含む。アンタゴニストの１つの特別な形態は、Ｄｈｈとｐ
ａｔｃｈｅｄ-２との相互作用を阻害する分子を含む。あるいは、アンタゴニス
トはｐａｔｃｈｅｄ-２のレベルを増大させる分子でもあり得る。同様に、ここ
で用いられる「アゴニスト」なる用語は、Ｈｈシグナル伝達経路におけるＨｈの
ｐａｔｃｈｅｄ-２への結合を促進、向上又は刺激する、あるいはそれをアップ
レギュレートする（例えば、ｐｔｃｈ-２（配列番号：２）のＳｍｏ（配列番号
：１７）への結合を阻止する）任意の分子を含む。Ｈｈ及びｐａｔｃｈｅｄ-２
及びその結合タンパク質のタンパク質−タンパク質相互作用に影響する好ましい
分子は、後者の断片又は小さな生物有機分子、例えばペプチド類似物を含み、そ
れらは場合によってＨｈのｐａｔｃｈｅｄ-２への結合を防止又は促進するであ
ろう。非限定的な例は、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、グリコペプチド
、糖脂質、多糖類、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチド類似物、製薬剤又
はそれらの代謝物、転写及び翻訳制御配列などを含む。アンタゴニストの他の好
ましい形態は、野生型ｐａｔｃｈｅｄ-２の正しい転写を阻害するアンチセンス
ヌクレオチドを含む。
【００１５】 「変調」又は「変調する」という語句は、シグナル伝達経路のアップレギュレ
ーション又はダウンレギュレーションを意味する。シグナル伝達の制御下での細
胞プロセスは、これらに限られないが、特定遺伝子の転写；代謝、増殖、分化、
接着、アポトーシス及び生存などの正常な細胞機能、並びに、形質転換、分化及
び転移の阻止といった異常なプロセスを含みうる。 「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」の技術は、ここで用いられる場合、
一般に核酸、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの特定の切片の少量が1987年7月28日発行
の米国特許第4,683,195号に記載されたように増幅される方法を意味する。一般
的に、対象とする領域の末端から又は利用可能の必要性を越える配列情報は、オ
リゴヌクレオチドプライマーの設計を可能にし；これらのプライマーは増幅され
るテンプレートの反対鎖の配列と同一又は類似している。２つのプライマーの５
’末端ヌクレオチドは増幅された物質の末端と一致する。ＰＣＲ配列は、全ゲノ
ムＤＮＡ、及び全細胞性ＲＮＡ、バクテリオファージ、又はプラスミド配列等か
ら転写されたｃＤＮＡを形成する。一般的に、Mullis等, Cold Spring Harbor S
ymp. Quant Biol. 51: 263 (1987); Erlich, Ed., PCR Technology, (Stockton
Press, NY, 1989)を参照のこと。ここで用いられるように、ＰＣＲは、プライマ
ーとして公知の核酸を、そして核酸の特定の切片を増幅又は生成するために核酸
ポリメラーゼを使用することを含む核酸試験試料の唯一ではない一例であると考
えられる。
【００１６】 ＩＩ. 本発明の組成物と方法 Ａ．全長ｐａｔｃｈｅｄ-２ 本発明は、本出願においてｐａｔｃｈｅｄ-２と称されるポリペプチドをコー
ドする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下
の実施例で更に詳細に開示するような、ヒトｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチドを
コードするｃＤＮＡを同定し単離した。（初期パラメータに設定された）ＢＬＡ
ＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラ
ムを用いて、本出願人は、ヒトｐａｔｃｈｅｄ-２の全長天然配列（即ち、Ｆｉ
ｇ３のＰｔｃｈ-２、配列番号：２）がヒトｐａｔｃｈｅｄ（即ちＰｔｃｈ、配
列番号：４）と５３％のアミノ酸配列同一性を有することを見出した。さらに、
ヒト全長配列ｐａｔｃｈｅｄ-２（即ち、Ｐｔｃｈ-２、配列番号：２）は、マウ
スＰｔｃｈ-２（配列番号：７）（Ｆｉｇ８）と約９１％の配列同一性を有して
いた。従って、現在では、本出願で開示されるヒトｐａｔｃｈｅｄ-２（即ち、
Ｐｔｃｈ-２、配列番号：２）ががヘッジホッグシグナル伝達カスケード、特に
デザートヘッジホッグの新たに同定されたメンバーであると考えられている。 ヒトｐａｔｃｈｅｄ-２遺伝子の全長天然配列、又はその一部は、全長遺伝子
を単離するための、又はＦｉｇ１（配列番号：２）に開示したヒトｐａｔｃｈｅ
ｄ-２配列と所定の配列同一性を有する更に他の脊椎動物相同遺伝子（例えば、
ｐａｔｃｈｅｄ-２の天然発生変異体又は他の種からのｐａｔｃｈｅｄ-２をコー
ドするもの）を単離するためのｃＤＮＡライブラリ用のハイブリッド形成プロー
ブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０から約５０塩基
であろう。ハイブリッド形成プローブは、Ｆｉｇ１（配列番号：１）の核酸配列
から、又は天然配列脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２のプロモーター、エンハンサー
エレメント、及びイントロンを含むゲノム配列から誘導されうる。例えば、スク
リーニング方法は、脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２遺伝子のコード化領域を周知の
ＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを
含む。ハイブリッド形成プローブは、３２Ｐ又は３５Ｓなどの放射性ヌクレオチ
ド、アビジン／ビオチン結合系を解してプローブに結合したアルカリホスファタ
ーゼ等の酵素標識を含む種々の標識によって標識してよい。本発明の脊椎動物ｐ
ａｔｃｈｅｄ-２遺伝子に相補的な配列を有する標識したプローブは、ヒトｃＤ
ＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリのスクリーニングに使用でき、そ
れらのライブラリの何れのメンバーにプローブがハイブリッド形成するかを決定
できる。
【００１７】 Ｂ．ｐａｔｃｈｅｄ-２変異体 ここに記載した全長天然配列ｐａｔｃｈｅｄ-２に加えて、ｐａｔｃｈｅｄ-２
変異体も調製できると考えられる。ｐａｔｃｈｅｄ-２変異体は、公知のｐａｔ
ｃｈｅｄ-２ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは
所望のｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチドを合成することにより調製できる。当業
者は、アミノ酸変化がｐａｔｃｈｅｄ-２の翻訳後プロセスを変えうることを理
解するであろう。 天然全長配列ｐａｔｃｈｅｄ-２又はここに記載したｐａｔｃｈｅｄ-２の種々
のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている
保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができ
る。変異は、結果として天然配列ｐａｔｃｈｅｄ-２と比較してｐａｔｃｈｅｄ-
２のアミノ酸配列が変化するｐａｔｃｈｅｄ-２をコードする一又は複数のコド
ンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つ
のアミノ酸の、ｐａｔｃｈｅｄ-２の一又は複数のドメインの任意の他のアミノ
酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えること
なく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ｐａｔｃｈｅｄ-２の配列を相同性
の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミ
ノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミ
ノ酸を類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸で置換した結果、例
えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換とすることができる。
挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができ
る。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に
作成し、得られた変異体を下記の実施例に記載するインビトロアッセイの任意の
もので活性について試験することにより決定される。
【００１８】 変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキ
ャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で周知の技術を用いてなすこ
とができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331
(1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異
誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等,
Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他のこの分野で
知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して、脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-
２変異体ＤＮＡを作成することもできる。 また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニング
アミノ酸分析を用いることができる。中でも好ましいスキャンニングアミノ酸は
、比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グ
リシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖
を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好まし
いスキャンニングアミノ酸である。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸で
あるため典型的には好ましい。さらに、それは埋没した及び露出した位置の両方
に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.
); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異
体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる
。 Ｆｉｇ３に示したヒトｐａｔｃｈｅｄ及びｐａｔｃｈｅｄ-２（例えば、Ｐｔ
ｃｈ、配列番号：４及びＰｔｃｈ-２、配列番号：２）の間の比較では、１２の
膜貫通ドメインを灰色で同定し、同一残基をボックスで囲んだ。ギャップはダッ
シュ（−）で示し、２つの配列間の全同一スコアを最大にするように挿入した。
【００１９】 Ｃ．ｐａｔｃｈｅｄ-２の修飾 ｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれ
る。共有結合的修飾の一型は、ｐａｔｃｈｅｄ-２の標的とするアミノ酸残基を
、ｐａｔｃｈｅｄ-２の選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機
誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばｐ
ａｔｃｈｅｄ-２を水不溶性支持体マトリクスあるいは抗-ｐａｔｃｈｅｄ-２抗
体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常
用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエ
タン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-
アジドサリチル酸、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）
等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-
マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-ア
ジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。 他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル
及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、
セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、
及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Stru
cture and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79
-86 (1983)]、Ｎ-末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ-末端カルボキシル基
のアミド化を含む。 ｐａｔｃｈｅｄ-２の共有結合的修飾の他の型は、ｐａｔｃｈｅｄ-２ポリぺプ
チドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリ
プロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,64
0,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は
第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。このような修飾は、哺乳動物
系での循環における分子の半減期の増大が予想され；ｐａｔｃｈｅｄ-２分子の
半減期の延長は、ｐａｔｃｈｅｄ-２変異体が治療薬として投与される場合など
の或る種の状況下で有用であり得る。
【００２０】 また、本発明のｐａｔｃｈｅｄ-２は、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配
列に融合したｐａｔｃｈｅｄ-２を含むキメラ分子を形成する方法で修飾しても
よい。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合で
きるエピトープを提供するタグポリペプチドとｐａｔｃｈｅｄ-２との融合を含
む。エピトープタグは、一般的にはｐａｔｃｈｅｄ-２のアミノ-又はカルボキシ
ル-末端に位置する。このようなｐａｔｃｈｅｄ-２のエピトープタグ形態の存在
は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピ
トープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性
マトリクスを用いたアフィニティ精製によってｐａｔｃｈｅｄ-２を容易に精製
できるようにする。もう一つの実施態様において、キメラ分子はｐａｔｃｈｅｄ
-２の免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含む。キメラ
分子の二価形態では、このような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。 通常は、ｐａｔｃｈｅｄ-２レセプターの隣接アミノ酸配列のＣ-末端が、免疫
グロブリン定常領域の隣接アミノ酸配列のＮ-末端に、可変領域に換えて融合す
るが、Ｎ-末端融合も可能である。 典型的には、このような融合物は、少なくとも免疫グロブリン重鎖の定常領域
の機能的活性ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持する。また融合は、定常
ドメインのＦｃ部分のＣ-末端、又は重鎖のＣＨ１の直近Ｎ-末端又は軽鎖の対応
する領域にもなされる。これは、通常は、適当なＤＮＡ配列を作成し、それを組
換え細胞培地で発現させることにより達成される。あるいは、イムノアドヘシン
は周知を方法に従って合成してもよい。 融合がなされる正確な位置は重要ではなく；特定の位置は良く知られており、
免疫グロブリンの生物学的活性、分泌又は結合特性を最適化するために選択され
うる。
【００２１】 好ましい実施態様では、ｐａｔｃｈｅｄ-２の結合部位を含む隣接アミノ酸配
列のＣ-末端が、Ｎ-末端において、抗体のＣ-末端部分（特にＦｃドメイン）に
融合し、免疫グロブリン、例えば免疫グロブリンＧｌ（ＩｇＧ-ｌ）のエフェク
ター機能を含有する。ここで上述したように、全重鎖定常領域を結合部位を含む
配列に融合させることができる。しかしながら、より好ましくは、パパイン切断
部位（ＩｇＧＦｃを化学的に定義する；残基２１６、重鎖定常領域の第１残基を
１１４とする［Kobet等, 上掲］、又は他の免疫グロブリンの類似部位）の直上
流のヒンジ領域で開始する配列が融合に用いられる。イムノアドヘシンにおいて
異種タンパク質重鎖融合タンパク質が効率的に分泌されるには免疫グロブリン軽
鎖が必要であるというのが以前の考えであったが、全ＩｇＧｌ重鎖を含むイムノ
アドヘシンでさえも軽鎖無しで効率的に分泌されることが見出された。軽鎖が不
要であるので、本発明のイムノアドヘシンの作成に用いられる免疫グロブリン重
鎖定常ドメインは、軽鎖結合部位を持たなくてもよい。これは、通常は軽鎖が結
合する免疫グロブリンの重鎖配列成分を除去又は十分に変化させ、そのような結
合がもはや不可能とすることにより達成される。よって、ｐａｔｃｈｅｄ-２／
免疫グロブリンキメラの或る実施態様では、ＣＨ１ドメインが完全に除去され得
る。 特に好ましい実施態様では、ｐａｔｃｈｅｄ-２の細胞外ドメインを含むアミ
ノ酸配列がヒンジ領域及びＣＨ２、ＣＨ３；又はＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ
-３、又はＩｇＧ-４の重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合
する。 幾つかの実施態様において、ｐａｔｃｈｅｄ-２／免疫グロブリン分子（イム
ノアドヘシン）は、単量体、二量体、又は多量体、特に二量体又は三量体として
組み立てられる。一般的に、これらの組み立てられたイムノアドヘシンは、対応
する免疫グロブリンのものに似た周知の単位構造を有する。基本的な４つの鎖構
造単位（２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の二量体）は、ＩｇＧ、ＩｇＡ及び
ＩｇＥが存在する形態である。４つの鎖単位は高分子量免疫グロブリンで繰り返
され；ＩｇＭは一般にジスルフィド結合で保持された基本的な４つの鎖単位の五
量体として存在する。ＩｇＡグロブリン、場合によってはＩｇＧグロブリンも、
血清中で多量体形態でも存在する。多量体の場合、４つの各鎖単位は同じでも異
なっていてもよい。
【００２２】 ｐａｔｃｈｅｄ-２／免疫グロブリンキメラの全免疫グロブリン部分が同じ免
疫グロブリンからである必要はない。イムノアドヘシンの特性を最適化するため
に、異なる免疫グロブリンの種々の部分が結合され、天然免疫グロブリンの変異
体及び誘導体がｐａｔｃｈｅｄ-２について上述したように作成されうる。例え
ば、ＩｇＧ-１のヒンジがＩｇＧ-３のものに置換されたイムノアドヘシン作成物
が、機能的であり全ＩｇＧ-１重鎖を含むイムノアドヘシンに薬力学的に匹敵す
ることがわかった。 種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている
。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン
（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Fiel
d等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８
Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular an
d Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タン
パク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):54
7-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等,
BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等,
Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinn
er等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパ
ク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393
-6397 (1990)］を含む。好ましいタグはインフルエンザＨＡタグである。
【００２３】 Ｄ．ｐａｔｃｈｅｄ-２の調製 以下の説明は、主として、ｐａｔｃｈｅｄ-２核酸を含むベクターで形質転換
又は形質移入された細胞を培養することにより特定のｐａｔｃｈｅｄ-２を生産
する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用
いてｐａｔｃｈｅｄ-２を調製することはできると考えられる。例えば、ｐａｔ
ｃｈｅｄ-２配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によっ
て生産してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H.
Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 8
5:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成
を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチ
ド合成機(Applied Biosystems peptide Synthesizer)（Foster City, CA）を用
いて、製造者の指示により実施してもよい。脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２の種々
の部分を、別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全
長ｐａｔｃｈｅｄ-２を生産してもよい。
【００２４】 １．脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２をコードするＤＮＡの単離 ｐａｔｃｈｅｄ-２をコードするＤＮＡは、ｐａｔｃｈｅｄ-２ｍＲＮＡを保有
していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃ
ＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトｐａｔｃｈｅｄ-２ＤＮ
Ａは、実施例に記載されるような、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラ
リから簡便に得ることができる。また脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２コード化遺伝
子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもでき
る。 ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはそれによりコードされるタンパク質
を同定するために設計された(ｐａｔｃｈｅｄ-２に対する抗体又は少なくとも約
２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の)プローブによってスクリーニングで
きる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニン
グは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York:
Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順
を使用して実施することができる。脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２をコードする遺
伝子を単離する代替的手段はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等, 上掲
；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Labo
ratory Press, 1995)］。 下記の実施例は、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。
プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が
最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スク
リーニングされるライブラリ内のＤＮＡへのハイブリッド形成時に検出可能であ
るように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く
知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるい
は酵素標識の使用が含まれる。中程度の緊縮性及び高度の緊縮性を含むハイブリ
ッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。 このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genban
k等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能
とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の一
定の領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列
同一性は、相同性測定のための種々のアルゴリズムを用いるＢＬＡＳＴ、ＢＬＡ
ＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、ＤＮＡｓｔａｒ、及びＩＮＨＥＲＩＴ等のコンピュータ
ソフトウェアプログラムを用いた配列アラインメントを通して決定することがで
きる。 タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ
酸配列を使用して、選択したｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングす
ることにより、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成
中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来の
プライマー伸展法を使用することにより得られる。
【００２５】 ２．宿主細胞の選択及び形質転換 宿主細胞を、ここに記載したｐａｔｃｈｅｄ-２生産のための発現又はクロー
ニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体
を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性され
た常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度
の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を
最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biote
chnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook
等, 上掲に見出すことができる。 形質移入の方法、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションは当業者に
知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な
方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウ
ムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的
な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメ
ファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公
開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用い
られる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan de
r Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。
哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載
されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact.
, 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)
の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法
、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞
、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロト
プラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種
々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及
び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００２６】 ここに記載のベクターにおいてＤＮＡをクローン化あるいは発現するために適
切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核
生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性
生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用
可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７
７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC
53,635）である。 原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、脊椎動物ｐａｔ
ｃｈｅｄ-２コード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である
。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物で
ある。 脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２の発現に適切な宿主細胞は多細胞生物から誘導さ
れる。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳ
ｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は
、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例
は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651
);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細
胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細
胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216
(1980))；マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (
1980)）；ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75)；ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065)；
及びマウス乳房腫瘍 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択
は、この分野の技量の範囲内にある。
【００２７】 ３．複製可能なベクターの選択及び使用 ｐａｔｃｈｅｄ-２をコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は
、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入さ
れる。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミ
ド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な
核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの
分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベ
クター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数
のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレ
メント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を
含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術
を用いる。 発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞におい
てベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は種々の細菌、
酵母菌及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来
する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点
は酵母菌に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノ
ウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに
有用である。好ましい複製可能なベクターは、プラスミドｐＲＫ５である。Holm
es等, Science, 253: 1278-1280 (1991)。 発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される
選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)抗生物質あるいは他の毒素、例
えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリン
に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)複合培地から得られない重要
な栄養素、例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼを供給す
るタンパク質をコードする。
【００２８】 哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの他の例は、ＤＨＦＲあるいはチミジン
キナーゼのように、ｐａｔｃｈｅｄ-２核酸を取り込むことのできる細胞成分の
同定が可能なものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Ur
laub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されてい
るようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ細胞系である
。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母菌プラスミドＹＲｐ７に存在する
ｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingman等, Ge
ne, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、
例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン
内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［
Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。 発現及びクローニングベクターは、通常、ｐａｔｃｈｅｄ-２核酸配列に作用
可能に結合してｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主
細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使
用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Cah
ng等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アル
カリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic
Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例
えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25
(1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたｐａｔｃｈｅｄ-２をコー
ドするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。 酵母菌宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグ
リセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他
の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Bioch
emistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン
酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ
フルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレー
トムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコ
ースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【００２９】 他の酵母菌プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的
効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソ
チトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオ
ネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及び
ガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現
に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。 哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのｐａｔｃｈｅｄ-２転写は、例え
ば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,
504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉
腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサ
ルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異
種哺乳動物から得られるプロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グ
ロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによ
って、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。 より高等の真核生物による脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２をコードしているＤＮ
Ａの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得
る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用し
てその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多く
のエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン
、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞
ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後
期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初
期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及び
アデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ｐａｔｃｈｅｄ-２
コード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ま
しくはプロモーターから５’位に位置している。 また真核生物宿主細胞(酵母菌、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多
細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮ
Ａの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤ
ＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これ
らの領域は、ｐａｔｃｈｅｄ-２をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデ
ニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。 組換え脊椎動物細胞培養でのｐａｔｃｈｅｄ-２の合成に適応化するのに適切
なさらに他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625
(1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058
に記載されている。
【００３０】 ４．遺伝子増幅／発現の検出 遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識
されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写
を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:52
01-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッ
ド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ
二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タン
パク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもで
きる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は
表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合
した抗体の存在を検出することができる。 あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な
方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のア
ッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又
はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意
の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ｐａｔｃｈｅ
ｄ-２ポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした
合成ペプチドに対して、又はｐａｔｃｈｅｄ-２ＤＮＡに融合し特異的抗体エピ
トープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００３１】 ５．ポリペプチドの精製 ｐａｔｃｈｅｄ-２の形態は、宿主細胞の溶解液から回収することができる。
ｐａｔｃｈｅｄ-２は膜結合性であるので、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)
又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ｐａｔｃｈｅｄ-２の発
現に用いられる細胞は、凍結解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞
溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。 ｐａｔｃｈｅｄ-２を、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製するこ
とが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち
、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチ
オン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシ
ング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５
を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラ
ム；及びｐａｔｃｈｅｄ-２のエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化
カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology
, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Spr
inger-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用い
ることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生
産される特定のｐａｔｃｈｅｄ-２の性質に依存する。
【００３２】 Ｅ．ｐａｔｃｈｅｄ-２の用途 （１）ｐａｔｃｈｅｄ-２はデザートヘッジホッグ（Ｄｈｈ）に対する特異的
レセプターである。 ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達経路は、哺乳動物及び無脊椎動物の胚構造
の形成に含まれている。多重経路膜貫通レセプターｐａｔｃｈｅｄは、Ｈｈ経路
のネガティブレギュレータであり、セルペンチン(serpentine)シグナル伝達分子
ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）を抑制する。データは、ｐａｔｃｈｅｄの喪失
がＨｈ経路の調節解除を導き、胚における異常構造及び成人における癌の形成を
もたらすことを示した。 ｐａｔｃｈｅｄ-２（例えば、Ｐｔｃｈ-２、配列番号：２）と命名される出願
人が新たに同定した第２のヒトｐａｔｃｈｅｄ遺伝子は、ｐａｔｃｈｅｄと類似
の１２膜貫通ドメインのトポロジーを有し、Ｈｈファミリーの全てのメンバーと
結合でき、Ｓｍｏ（例えば、配列番号：１７）と複合体を形成できる。しかしな
がら、ｐａｔｃｈｅｄ-２とｐａｔｃｈｅｄの発現パターンは重複しない。ｐａ
ｔｃｈｅｄ-２は主に発育中の精母細胞で発現され、それはデザートヘッジホッ
グ産生セルトリ細胞によって直接支持され、ｐａｔｃｈｅｄ-２がデザートヘッ
ジホッグのレセプターであることを示唆している。 成人細管において、通常は大きな分泌細胞であるセルトリ細胞は、精細管を基
底層から管腔側へ行き来し、胚細胞を飲み込む細胞質隆起を送り出している。こ
れらの接触は、単相ラウンドの精子細胞が分化して高度に特化した運動性精子が
生成される精子完成の間に特に密接である。隣接するセルトリ細胞間の密接な結
合は、細管を有糸分裂精原細胞及び初期精母細胞を含む基底領域、及びに減数分
裂精母細胞及び成熟精子細胞を含むアドルミナル(adluminal)区画とに区分する
。実際に、セルトリ誘導細胞系は培地の胚細胞の減数分裂的進行を支持し、セル
トリ細胞から誘導された因子が胚細胞成熟に寄与するという見方に一致する、Ra
ssoulzadegan, M.等, Cell 1993, 75: 997-1006。Ｄｈｈ活性の喪失は、劣性の
性特異的フェノタイプをもたらす。雌マウス同型接合の変異は十分に生存可能で
繁殖可能であったが、雄マウスでは生存可能だが繁殖不可能であった。試験全体
により、18.5dpc程度の初期では、変異した雄の精子は同型接合同腹仔のものよ
り検出できる程度に小さいことが示された。Bitgood等, Curr. Biol., 1996, 6(
3): 298-304。即ち、セルトリ細胞は、出生後発育の間の胚細胞発達の有糸分裂
及び減数分裂段階を独立に調節するようである。従って、ｐａｔｃｈｅｄ-２は
Ｄｈｈ（配列番号：１３）のレセプターであることが明らかとなったので、Ｄｈ
ｈ（配列番号：１３）のｐａｔｃｈｅｄ-２への結合を変調させる分子はＤｈｈ
（配列番号：１３）シグナル伝達の活性化に影響を与え、よってＤｈｈ（配列番
号：１３）に媒介される状態の治療に有用性を持つ。（例えば、精巣癌である）
。あるいは、ｐａｔｃｈｅｄ-２のアンタゴニスト又はアゴニストがＤｈｈシグ
ナル伝達の阻止によって影響される疾患の治療又は望ましい生理学的状態の生成
に使用できることも提案される。（例えば、避妊、不妊治療である）。
【００３３】 （２）ｐａｔｃｈｅｄ-２の一般的用途 ｐａｔｃｈｅｄ-２をコードする核酸配列（又はそれらの補体）は、ハイブリ
ッド形成プローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺
伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種
々の用途を有している。また、ｐａｔｃｈｅｄ-２核酸は、ここに記載される組
み換え技術によるｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチドの調製にも有用であろう。 全長天然配列ｐａｔｃｈｅｄ-２遺伝子、又はその一部は、全長遺伝子の単離
又はＦｉｇ１（配列番号：１）に開示されたｐａｔｃｈｅｄ-２配列に対して所
望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子（例えば、ｐａｔｃｈｅｄ-２の天然発生
変異体をコードするもの）の単離のためのｃＤＮＡライブラリ用のハイブリッド
形成プローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約
５０塩基である。ハイブリッド形成プローブは、Ｆｉｇ１（配列番号：１）の核
酸配列から、又は天然配列ｐａｔｃｈｅｄ-２のプロモーター、エンハンサー成
分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング
法は、ｐａｔｃｈｅｄ-２遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単
離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリッド形
成プローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビジン／ビオ
チン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を
含む種々の標識で標識されうる。本発明のｐａｔｃｈｅｄ-２遺伝子に相補的な
配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ
のライブラリーをスクリーニングし、それらのライブラリーの何れのメンバーが
プローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリッド形成
技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。 また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したｐａｔｃｈｅｄ-２
配列の同定のための配列のプールを作成するのに用いることができる。
【００３４】 また、ｐａｔｃｈｅｄ-２をコードする核酸配列は、そのｐａｔｃｈｅｄ-２を
コードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析
のためのハイブリッド形成プローブの作成にも用いることができる。ここに提供
される核酸配列は、インサイツハイブリッド形成、既知の染色体マーカーに対す
る結合分析、及びライブラリーでのハイブリッド形成スクリーニング等の周知の
技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。 ｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチドは、究極的にヘッジホッグシグナル伝達の変
調をもたらすｐａｔｃｈｅｄ-２との複合体形成に含まれる他のタンパク質又は
分子を同定するアッセイに用いることができる。あるいは、これらの分子は、ｐ
ａｔｃｈｅｄ-２のＤｈｈ（配列番号：１３）への結合を変調させることもでき
る。このような方法によって、結合性相互作用の阻害剤を同定することができる
。また、このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分
子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができ
る。また、ｐａｔｃｈｅｄ-２の基質は、関連する複合体形成タンパク質の単離
に使用することもできる。スクリーニングアッセイは、天然ｐａｔｃｈｅｄ-２
の生物学的活性に似たリード化合物の発見のために、又はｐａｔｃｈｅｄ-２に
対して基質として作用するものの発見のために設計され得る。このようなスクリ
ーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも
用いられ、それらを小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。そのような
小分子阻害剤は、ｐａｔｃｈｅｄ-２の酵素活性を阻止し、それによりヘッジホ
ッグシグナル伝達を阻害できる。考慮される小分子阻害剤は、合成有機又は無機
化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク
質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び
細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【００３５】 ｐａｔｃｈｅｄ-２又はその修飾形態をコードする核酸は、トランスジェニッ
ク動物又は「ノックアウト」動物を作成するのに用いることもでき、言い換える
と、治療的に有用な薬剤の開発及びスクリーニングに有用である。トランスジェ
ニック動物（マウス又はラット等）は、出生前、例えば胚段階で、その動物又は
その動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺
伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれるＤＮ
Ａである。一実施形態では、ｐａｔｃｈｅｄ-２をコードするｃＤＮＡを、確立
された技術によりｐａｔｃｈｅｄ-２をコードするゲノムＤＮＡをクローニング
するために使用することができ、ゲノム配列を、ｐａｔｃｈｅｄ-２をコードす
るＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用
することができる。特にマウス又はラット等のトランスジェニック動物を産生す
る方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第4,736,866号
や第4,870,009号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エン
ハンサーでのｐａｔｃｈｅｄ-２導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物
の生殖系列に導入されたｐａｔｃｈｅｄ-２をコードする導入遺伝子のコピーを
含むトランスジェニック動物は、ｐａｔｃｈｅｄ-２をコードするＤＮＡの増大
した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰
発現を伴う病理的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物と
して使用できる。 脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２の非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入された
ｐａｔｃｈｅｄ-２をコードする変更ゲノムＤＮＡと、ｐａｔｃｈｅｄ-２をコー
ドする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ｐａｔｃｈｅｄ-２をコー
ドする欠陥又は変更遺伝子を有するｐａｔｃｈｅｄ-２「ノックアウト」動物を
作成するために使用できる。例えば、ｐａｔｃｈｅｄ-２をコードするＤＮＡは
、確立された技術に従い、ｐａｔｃｈｅｄ-２をコードするゲノムＤＮＡのクロ
ーニングに使用できる。ｐａｔｃｈｅｄ-２をコードするゲノムＤＮＡの一部を
欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードす
る遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変
化のフランキングＤＮＡ(５'と３'末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相
同的組換えベクターについてはThomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)を参
照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーション等によっ
て)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選
択する［例えば、Li等, Cell, 69:915 (1992)参照］。選択された細胞は次に動
物(例えば、マウス又はラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する［
例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical
Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。
その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、「ノックアウト」動物
を作ると言われる。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的
な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられた
ＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ｐａｔｃｈ
ｅｄ-２ポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及び病理的状
態の進行に対して防御する能力によって特徴付けられる。
【００３６】 また、Ｄｈｈシグナル伝達の抑制又は阻害（拮抗作用）も治療方法の対象であ
る。ｐａｔｃｈｅｄ-２がヘッジホッグファミリーの全てのメンバー（即ち。Ｓ
ｈｈ、Ｄｈｈ、Ｉｈｈ）に結合できるので、ヘッジホッグ分子のＰｔｃｈ-２（
配列番号：２）への結合を防止するアンタゴニスト分子は治療的有用性を持つ。
例えば、Ｓｈｈシグナル伝達は基底細胞癌において活性化されることが知られ；
Ｄｈｈ（配列番号：１３）は精母細胞の調節に含まれることが知られている。Ｈ
ｈシグナル伝達の阻害剤又はアンタゴニストは、各々基底細胞の治療又は雄の避
妊において有効な治療薬である。 Ｄｈｈシグナル伝達の刺激（作動作用）も治療方法の対象である。Ｐｔｃｈ-
２（配列番号：２）はＨｈファミリーの他のメンバー、Ｉｈｈ及びＳｈｈにも結
合するので、Ｄｈｈシグナル伝達の活性化は、不活性又は不十分なＨｈシグナル
伝達に特徴付けられる疾患状態又は疾病において有用である。例えば、神経系の
変性疾患、例えば、パーキンソン病、記憶障害、アルツハイマー病、ルー・ゲー
リグ病、ハンティングトン病、精神分裂病、発作及び薬物嗜癖である。さらに、
ｐａｔｃｈｅｄ-２アゴニストは、腸疾患、骨疾患、皮膚疾患、精巣の疾患（不
妊症を含む）、潰瘍、肺疾患、膵臓の疾患、糖尿病、骨粗鬆症の治療に使用でき
る。
【００３７】 Ｆ．抗-ｐａｔｃｈｅｄ-２抗体 本発明は、さらに抗-脊髄動物ｐａｔｃｈｅｄ-２抗体を提供するものである。
抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及び
ヘテロ抱合体抗体が含まれる。 １．ポリクローナル抗体 抗-ｐａｔｃｈｅｄ-２抗体はポリクローナル抗体を含んでよい。ポリクローナ
ル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗
体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回
注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジ
ュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は
、ｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化
剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合さ
せるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られない
が、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリ
ン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例
には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホ
リル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロト
コールは、過度の実験することなく当業者により選択されるであろう。
【００３８】 ２．モノクローナル抗体 あるいは、抗-ｐａｔｃｈｅｄ-２抗体はモノクローナル抗体であってもよい。
モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載さ
れているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイ
ブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免
疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するか
あるいは生成可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免
疫化することもできる。 免疫化剤は、典型的にはｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチド又はその融合タンパ
ク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢ
Ｌ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞
又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融
合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成
する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic P
ress, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動
物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット
又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは
、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適
切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホス
ホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドー
マの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(
「ＨＡＴ培地」)、このれら物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。 好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による
安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性
のものである。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例
えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Cente
rやメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及
びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 13
3:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and
Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
【００３９】 次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ｐａｔｃｈｅｄ-２に対
するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ
細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオ
イムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合
検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公
知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Ana
l. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定する
ことができる。 所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサ
ブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。
この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及び
ＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物
においてインビボで腹水として成長させることもできる。 サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ
−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、
透析又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法
によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【００４０】 また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567
号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体
をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び
軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使
用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細
胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡ
は発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞
、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク
質を生成などしない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でのモノク
ローナル抗体の合成を得ることができる。また、ＤＮＡは、例えばヒト重鎖及び
軽鎖定常ドメインのコード化配列を相同マウス配列に換えて置換することにより
［US. Patent No.4,816,567；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード
配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の一部又は全部を共有結合
することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチ
ドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つ
の抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生する
ことができる。 抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく
知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現
を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切
断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか
欠失させて架橋を防止する。 一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その
断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使
用して達成できる。
【００４１】 ３．ヒト化抗体 本発明の抗-ｐａｔｃｈｅｄ-２抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む
。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロ
ブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるい
は抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最
小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)
からの残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能
力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲからの残基によって置換されたヒト免
疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリン
のＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。ま
た、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレーム
ワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、
全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し
、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列
のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全て
を含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒ
トの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Natur
e, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPres
ta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【００４２】 非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト
化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒト
アミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移
入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト
抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者［
Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1
988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って実施され
る。従って、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的
に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4
,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及
び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によ
って置換されたヒト抗体である。 また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol
. Biol., 227:381 (1992)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含む
この分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及
びBoerner等の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる
［Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1
985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。
【００４３】 ４．二重特異性抗体 二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する
モノクローナル、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合にお
いて、結合特異性の一方は脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２に対してであり、他方は
任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプター
サブユニットに対してである。 二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的に
は、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免
疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature,
305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため
、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合
物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精
製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の
手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-
3656 (1991)に開示されている。 所望の結合特異性(抗体−抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロ
ブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部
、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのもの
である。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常
領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードする
ＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入
し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更な
る詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を
参照されたい。
【００４４】 ５．ヘテロ抱合体抗体 ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結
合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対
してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治
療のために［WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089］提案されている。この抗
体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用
して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド
交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を
作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレー
ト及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,6767,980
号に開示されているものが含まれる。
【００４５】 Ｇ．抗-ｐａｔｃｈｅｄ-２抗体の用途 本発明の抗-ｐａｔｃｈｅｄ-２抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗
-ｐａｔｃｈｅｄ-２抗体は、ｐａｔｃｈｅｄ-２の診断アッセイ、例えばその特
定細胞、組織、又は血清での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直
接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降ア
ッセイ［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press,
Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が
使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。
検出可能な部位は、直接又は間接に検出可能なシグナルを発生しなければならな
い。例えば、検出可能な部位は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等
の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェ
リン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-
ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。
Hunter等 Nature, 144:945 (1962)；David等, Biochemistry, 13: 1014 (1974)
；Pain等, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Histochem. an
d Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法を含む、抗体を検出可能な部位に
抱合するためにこの分野で知られた任意の方法が用いられる。 また、抗-ｐａｔｃｈｅｄ-２抗体は、組換え細胞培養又は天然供給源からのｐ
ａｔｃｈｅｄ-２のアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、
ｐａｔｃｈｅｄ-２に対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用し
て、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定化する。次に、固定
化された抗体を、精製するｐａｔｃｈｅｄ-２を含む試料と接触させた後、固定
された抗体に結合したｐａｔｃｈｅｄ-２以外の試料中の物質を実質的に全て除
去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ｐａｔｃｈｅｄ-２を抗体から
離脱させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
【００４６】 基底細胞癌（ＢＣＣ）は最もありふれたヒトの癌である。Ｈｈシグナル伝達経
路は、全てのＢＣＣで活性化されることが見出された。ｐａｔｃｈｅｄ機能の喪
失は、調節されないＳｍｏ活性を導き、全てのＢＣＣの約半分の原因となると考
えられている。ｐａｔｃｈｅｄはＨｈ経路自体の標的であり、ｐａｔｃｈｅｄｍ
ＲＮＡレベルの増加が、ＢＣＣ［Gailani等, Nature Genet. 14: 78-81 (1996)
］並びにＢＣＣの動物モデルにおいて検出されている。Oro等, Science 276: 81
7-821 (1997); Xie等, Nature 391: 90-92 (1998)。ＢＣＣで生じるようなＳｈ
シグナル伝達の異常な活性化を試験してｐａｔｃｈｅｄ-２発現が増加したか否
かを確認した。Ｆｉｇ９に示すように、Ｓｍｏ-Ｍ２（配列番号：１６）トラン
スジェニックマウスにおけるＰｔｃｈ（配列番号：４）及びＰｔｃｈ-２（配列
番号：２）についてのインサイツハイブリッド形成（Xie等, 上掲）は、Ｐｔｃ
ｈより低いものの、腫瘍細胞においても高かった。このことは、Ｐｔｃｈ-２（
配列番号：２）に対する治療的抗体がＢＣＣの治療に有用であることを示してい
る。 抗-ｐａｔｃｈｅｄ-２抗体は、前のセクション「Ｅ．ｐａｔｃｈｅｄ-２の用
途」で明示したものと同様の有用性を有する。抗-ｐａｔｃｈｅｄ-２抗体がｐａ
ｔｃｈｅｄ-２レセプターに結合し、Ｈｈシグナル伝達を阻害するか（アンタゴ
ニスト）、ｐａｔｃｈｅｄ-２のＳｍｏ（配列番号：１７）との複合体形成を阻
害して、それによりＳｍｏ（配列番号：１７）のＨｈシグナル伝達に対する正常
な蘇我以降かを阻害するか（アゴニスト）に応じて、抗体はｐａｔｃｈｅｄ-２
について既に明示したものに対応する有用性を具備する。
【００４７】 Ｈ．ｐａｔｃｈｅｄ-２アンタゴニスト 本発明の融合アンタゴニスト及びアゴニスト化合物を生成させるのに幾つかの
方法を好適に用いることができる。アンタゴニスト分子を細胞内部に標的化でき
、それが野生型ｐａｔｃｈｅｄ-２を正常な作用から阻害又は防止する任意の方
法が好ましい。例えば、変異体ｐａｔｃｈｅｄ-２レセプターを含む競合的阻害
剤は、野生型ｐａｔｃｈｅｄ-２がＤｈｈ及びＨｈシグナル伝達に必要な他のタ
ンパク質と正しく結合することを防止する。膜貫通輸送に適した電荷、サイズ及
び疎水性等の、そのようなアンタゴニスト又はアゴニスト分子のさらなる特性は
、当業者によって容易に決定可能である。 ｐａｔｃｈｅｄ-２の模倣物又は他の哺乳動物相同体が同定され評価される場
合、細胞を試験化合物に暴露し、ヒトｐａｔｃｈｅｄ-２のみに暴露したポジテ
ィブ対照、化合物にも天然リガンドにも暴露していないネガティブ対照と比較す
る。ｐａｔｃｈｅｄ-２シグナル変調のアンタゴニスト又はアゴニストを同定し
評価する場合は、細胞を天然リガンドの存在下で本発明の化合物に暴露し、試験
化合物に暴露していない対照と比較する。 本発明のアンタゴニスト／アゴニスト化合物のＨｈシグナル伝達の阻害／促進
活性を評価する一次スクリーニングとして検出アッセイが用いられる。このアッ
セイは、濃度範囲、例えば１００ｍＭから１ｐＭの範囲で試験し、リン酸化又は
シグナル伝達が対照に比較して５０％減少又は増加する量の濃度（ＩＣ５０）を
計算することにより、化合物の相対的能力を評価するのに使用してもよい。 アッセイは、ｐａｔｃｈｅｄ-２基質のＨｈシグナル伝達に影響する化合物の
同定のために実施してもよい。特に、アッセイはｐａｔｃｈｅｄ-２のリン酸化
活性を増大させる化合物の同定のために実施でき、あるいはアッセイはｐａｔｃ
ｈｅｄ-２基質のＨｈシグナル伝達を低下させる化合物を同定するために実施で
きる。これらのアッセイは、全細胞自体又は細胞抽出物のいずれにも実施するこ
とができる。アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スク
リーニングアッセイ、免疫アッセイ、細胞ベースのアッセイ等を含む種々の様式
で実施できる。このようなアッセイ様式は、この分野で公知である。 本発明のスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリの高スループットスク
リーニングに適用でき、特に小分子薬剤候補の同定に適している。
【００４８】 （１）アンタゴニスト及びアゴニスト分子 ｐａｔｃｈｅｄ-２シグナル伝達のアンタゴニスト及び／又はアゴニストをス
クリーニングするために、アッセイ混合物を、候補となる製薬剤の存在を別にす
れば、ｐａｔｃｈｅｄ-２が基準活性でヘッジホッグシグナル伝達を誘発する条
件下でインキュベートした。混合物の成分は、必要なヘッジホッグ活性を与える
任意の順序で添加できる。インキュベーションは、最適な結合を促進する任意の
温度、典型的には約４℃から４０℃、より通常には約１５℃から４０℃で実施す
る。インキュベーション時間も同様に最適結合のために選択されるが、迅速で高
スループットのスクリーニングを促進するために最小化され、典型的には約０．
１から１０時間、好ましくは５時間未満、より好ましくは２時間未満である。イ
ンキュベーションの後、候補製薬剤のｐａｔｃｈｅｄ-２シグナル伝達に対する
効果を任意の都合の良い方法で決定する。細胞無しの結合型アッセイでは、結合
及び非結合成分を分離するための分離工程がしばしば用いられる。分離は、例え
ば、沈殿（例えばＴＣＡ沈殿、免疫沈降など）、固定化（例えば、固体基体上）
、それに続く洗浄によってなされる。結合したタンパク質は、それに結合した検
出可能な標識により、例えば放射活性放出、光学又は電子密度を測定することに
より、あるいは、例えば抗体抱合を用いた間接的な検出により都合良く検出され
る。 例えば、適切なｐａｔｃｈｅｄ-２アンタゴニスト及び／又はアゴニストのス
クリーニング方法は、Ｄｈｈ及び他のヘッジホッグリガンドの適用を含みうる。
このようなスクリーニングアッセイは、ｐａｔｃｈｅｄ-２発現組織における候
補アンタゴニスト及び／又はアゴニストの存在下又は不存在下でのインサイツハ
イブリッド形成、並びにｐａｔｃｈｅｄ-２変調細胞成長の確認又は不存在を比
較することができる。典型的には、これらの方法は、固定化ｐａｔｃｈｅｄ-２
をそれに結合すると予測される分子に暴露すること、レポーター作成物のリガン
ド結合下流の活性化レベルを決定すること、及び／又は分子がｐａｔｃｈｅｄ-
２を活性化（又は活性化の阻止）をするか否かを評価することを含む。このよう
なｐａｔｃｈｅｄ-２結合リガンドを同定するために、ｐａｔｃｈｅｄ-２を細胞
表面で発現させ、合成候補化合物又は（例えば、血清又は細胞などの内因性供給
源からの）天然発生化合物ライブラリのスクリーニングに用いることができる。
【００４９】 ｐａｔｃｈｅｄ-２及びその結合タンパク質のタンパク質−タンパク質相互作
用に影響する好適な分子は、後者の断片又は小分子、例えばリガンド−レセプタ
ー相互作用を阻害するペプチド模倣物を含む。そのような小分子は、通常１０Ｋ
分子量未満であり、細胞に透過しやすいので治療薬として好適であり、種々の細
胞機構による分解を受けにくく、タンパク質のように免疫反応を誘発しやすくな
い。小分子は、これらに限られないが、合成有機又は無機化合物を含む。多くの
製薬会社が、そのような分子の広範なライブラリを有しており、それは本発明の
アッセイを用いて都合良くスクリーニングできる。非限定的な例は、タンパク質
、ペプチド、糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖、核酸
、生物有機分子、ペプチド模倣物、薬理学的試薬及びそれらの代謝物、転写及び
翻訳制御配列等を含む。 ｐａｔｃｈｅｄ-２に結合する分子の同定に好ましい技術は、アッセイ用プレ
ートのウェルなどの固相に結合したキメラ基質（例えば、エピトープタグｐａｔ
ｃｈｅｄ-２又はｐａｔｃｈｅｄ-２イムノアドヘシン）を利用する。場合によっ
ては標識された（例えば放射性標識された）候補分子の固定化レセプターへの結
合が測定できる。あるいは、種々のＨｈ経路、特にＤｈｈ（配列番号：１３）に
対する競合が測定できる。アンタゴニスト及び／又はアゴニストのスクリーニン
グにおいて、ｐａｔｃｈｅｄ-２はｐａｔｃｈｅｄ-２基質、次いで推定アンタゴ
ニスト及び／又はアゴニストに暴露され、あるいはｐａｔｃｈｅｄ-２結合タン
パク質及びアンタゴニスト及び／又はアゴニストが同時に添加され、アンタゴニ
スト及び／又はアゴニストのｐａｔｃｈｅｄ-２活性化を阻止する能力が評価さ
れる。
【００５０】 （２）検出アッセイ ｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチドは、ｐａｔｃｈｅｄ-２レセプター／リガンド
ヘッジホッグシグナル伝達を変調させる治療的活性薬のためのリード化合物を同
定するアッセイにおいて有用である。特に、リード化合物は、ｐａｔｃｈｅｄ-
２シグナル伝達複合体の形成を防止する、あるいはｐａｔｃｈｅｄ-２変調ヘッ
ジホッグシグナル伝達を防止又は減弱する（例えば、ｐａｔｃｈｅｄ-２に結合
する）。 この分野で知られた種々の方法が、本発明のｐａｔｃｈｅｄ-２タンパク質の
活性阻害の同定、評価又は検定に使用できる。ｐａｔｃｈｅｄ-２はＤｈｈ（配
列番号：１３）のレセプターであるが、Ｓｈｈ（配列番号：１４）及びＩｈｈ（
配列番号：２９）にも結合すると考えられるので、リガンド／レセプターモジュ
レータの同定で用いる公知の技術を本発明に用いてもよい。一般的に、そのよう
なアッセイは、培地中の標的細胞を化合物に暴露し、（ａ）細胞溶解物を生化学
的に分析して結合のレベル及び／又は同一性を評価する；又は（ｂ）試験基質に
暴露していない対照細胞に比較した処理細胞におけるフェノタイプ又は機能変化
を評点化することを含む。このようなスクリーニングアッセイは、米国特許第5,
602,171号、米国特許第5,710,173号、WO 96/35124及びWO 96/40276に記載されて
いる。
【００５１】 （ａ）生化学的検出技術 生化学的分析は種々の技術によって評価できる。本発明で使用できる１つの典
型的なアッセイ混合物は、ｐａｔｃｈｅｄ-２及び通常はｐａｔｃｈｅｄ-２に付
随するタンパク質（例えば、Ｄｈｈ（配列番号：１３））を、通常は単離された
、部分的に純粋又は純粋な形態で含有する。これらの成分の一方又は両方は、例
えばアッセイ条件下等でタンパク質−タンパク質結合を提供又は促進する他のペ
プチド又はポリペプチドに融合してよい。さらに、成分の一方は、通常検出可能
な標識を含むかそれに結合している。標識は、放射活性、蛍光、光学又は電子密
度等の測定による直接検出、あるいはエピトープタグ、酵素等の間接的検出を提
供する。アッセイ混合物は候補製薬剤をさらに含み、場合によっては、結合を促
進し、安定性を向上させ、非特異的又はバックグラウンドの相互作用を減少させ
、又は他にアッセイの効率又は感度を向上させる種々の他の成分、例えば塩、バ
ッファー、担体タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤、プロテアーゼ阻害剤、
ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤等を含む。 以下の検出方法は、シグナル伝達基質分子及びｐａｔｃｈｅｄ-２を含む細胞
溶解物が本発明の化合物と混合される細胞無しの系で使用できる。化合物の活性
を評価するために、反応混合物をＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析してもよく、あ
るいは、それを固体支持体に結合した基質特異的固着抗体に添加し、分離又は捕
捉した基質に上記の検出方法を実施してｐａｔｃｈｅｄ-２結合リガンドの存在
又は不存在を評価してもよい。結果は、化合物を添加しない反応混合物で得られ
た結果と比較する。細胞無しの系は、天然リガンド又はその同定の知識を必要と
しない。例えば、Posner等（米国特許第5,155,031号）は、パーバナデート（per
vanadate）のＰＴＰ活性を阻害する能力を示すのに、基質としてのインシュリン
レセプター及び標的細胞としてのラット脂肪細胞の使用を記載している。他の例
Burke等, Biochem. Biophys. Res. Comm. 204: 129-134 (1994)は、ホスホチロ
シル模倣物の阻害活性の評価における自己リン酸化インシュリンレセプター及び
組換えＰＴＰ１Ｂの使用を記載している。
【００５２】 （ｉ）全細胞検出 共通の技術は、細胞をｐａｔｃｈｅｄ-２及び放射性標識リガンドとともにイ
ンキュベートし、細胞を溶解し、溶解物からＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル（
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）技術を用いて、一又は二次元のいすれかで細胞性タンパク質
成分を分離し、Ｘ-線フィルムに暴露して標識タンパク質の存在を検出すること
を含む。検出は、放射性標識を用いることなくなすこともできる。そのような技
術において、タンパク質成分（例えば、分離されたＳＤＳ-ＰＡＧＥ）はニトロ
セルロース膜に移され、そこでｐａｔｃｈｅｄ-２−リガンド複合体の存在が抗-
リガンド抗体を用いて検出される。 あるいは、抗-ｐａｔｃｈｅｄ-２リガンド抗体は、セイヨウワサビペルオキシ
ダーゼ等の酵素に抱合させ、次いで酵素用の比色基質を添加することにより検出
することもできる。さらなる代替法は、抗-ｐａｔｃｈｅｄ-２リガンドを認識す
る二次抗体と反応させることによる抗-ｐａｔｃｈｅｄ-２リガンドの検出を含み
、この二次抗体は、既に述べたような放射活性部分又は酵素で標識されている。
これらの例及び類似の技術は、Hansen等, Electrophoresis 14: 112-126 (1993)
; Campbell等, J. Biol. Chem. 268: 7427-7434 (1993); Donato等, Cell Growt
h Diff. 3: 258-268 (1992); Katagiri等, J. Immunol. 150: 585-593 (1993)に
記載されている。さらに、抗-ｐａｔｃｈｅｄ-２リガンドは、それを放射活性基
質で標識し、次いで標識ニトロセルロースをスキャンニングして放射活性又は検
出するか、Ｘ-線フィルムに暴露することにより検出できる。 上記のものに好適なさらなる検出技術を開発してもよい。特に高スループット
スクリーニングに関連する使用のために、それらの方法は、良好な感度及び特異
性、拡張された線形範囲、低いバックグラウンドシグナル、最小のゆらぎ、他の
試薬との相容性、及び自動化取り扱い系との適合性が予測される。 本発明の処理のインビボ有効性は、齧歯類モデルにおいて化学的に誘発した腫
瘍に対して実験することができる。インビトロ細胞培地で成長させた腫瘍細胞系
を実験用齧歯類、例えばマウスに、例えば皮下経路による注射によって導入され
る。実験動物における腫瘍の化学的誘発の技術は当該分野で良く知られている。
【００５３】 （ｉｉ）キナーゼアッセイ ｐａｔｃｈｅｄ-２はＨｈシグナル伝達のネガティブレギュレータであるから
、Ｈｈによって活性化されたときにＳｍｏに対する正常な阻害効果を放棄し、ｐ
ａｔｃｈｅｄ-２のＳｍｏへの結合の阻害は、Ｈｈシグナル伝達に伴う種々のキ
ナーゼ基質の活性化によって測定できる。ｐａｔｃｈｅｄ-２アンタゴニスト／
アゴニストについての本発明のスクリーニング方法がエキソビボアッセイとして
行われる場合、標的キナーゼ（例えばｆｕｓｅｄ）は実質的に精製されたポリペ
プチドでありうる。キナーゼ基質（例えば、ＭＢＰ、Ｇｌｉ）は実質的に精製さ
れた基質であり、アッセイにおいて、キナーゼに触媒される実質的に精製された
リン酸塩供給源との反応でリン酸化される。リン酸化の程度は、反応でリン酸化
された基質の量を測定することにより決定される。種々の可能な基質を使用して
よく、キナーゼ自身も含まれるが、その場合はアッセイで測定されるリン酸化反
応は自己リン酸化である。外因性基質を用いることもでき、ミエリン塩基性タン
パク質（ＭＢＰ）等の標準的なタンパク質基質；酵母菌タンパク質基質；合成タ
ンパク質基質、及びポリマー基質が含まれる。これらの中で、ＭＢＰ及び他の標
準的タンパク質基質が好ましいとされる。しかしながら他の基質も同定され、そ
れらは、キナーゼに対する親和性、反応速度の最小摂動、単一又は相同反応部位
の保持、取扱及び反応後回収の容易さ、強いシグナル生成能力、及び試験化合物
に対する耐性及び不活性によって優れている。
【００５４】 本発明のエキソビボアッセイでリン酸化された基質量の測定は、イムノアッセ
イ、ラジオアッセイ又は他の周知の方法で行うことができる。イムノアッセイ測
定において、反応中に形成されるリン酸化部位に特異的な抗体（ヤギ又はマウス
抗-ホスホセリン／スレオニン抗体）を使用してよい。周知のＥＬＩＳＡ技術を
用いて、ホスホセリン／スレオニン抗体複合体は、測定可能なシグナルを発生す
ることのできる標識（例えば、蛍光又は放射活性標識）に結合した更なる抗体に
より、それ自身検出される。さらに、ミクロタイタープレートにおけるＥＬＩＳ
Ａ型アッセイを精製された基質の試験に用いてもよい。Peraldi等, J. Biochem.
285: 71-78 (1992); Schaag等, Anal. Biochem. 211: 233-239 (1993); Cleavl
and, Anal. Biochem. 190: 259-253 (1990); Farley, Anal. Biochem. 203: 151
-157 (1992)及びLozaro, Anal. Biochem. 192: 257-261 (1991)。 例えば、検出計画では、キナーゼ反応中の基質消費を測定することができる。
最初に、リン酸塩供給源を３２Ｐ又は３３Ｐ等の同位体で放射性標識し、反応中
に基質に取り込まれた放射性標識の量を決定することによりリン酸化された基質
の量を測定してもよい。検出は、（ａ）フィルター又はミクロタイターウェル表
面に吸着させた後、ベータカウンターを用いる市販の閃光体含有プレート及びビ
ーズ、又は（ｂ）シンチレーション近接アッセイビーズ又は閃光体プレートに結
合させた後の光度測定手段により達成される。Weernink及びKijken, J. Biochem
. Biophs. Methods 31: 49, 1996; Brauwalder等, Anal. Biochem. 234: 23 (19
96); Kentrup等, J. Biol. Chem. 271: 3488 (1996)及びRusken等, Meth. Enzym
ol. 200: 98 (1991)。
【００５５】 好ましくは、基質を固体支持体表面に非特異的又は好ましくは特異的に結合さ
せる。このような結合は、シグナル検出に先立ってリン酸化基質を非リン酸化標
識リン酸塩供給源（アデノシン三リン酸など）から分離するのを可能にする。一
実施態様では、基質は反応の前に、Nunc(商品名)高タンパク質結合プレート（Ha
nke等, J. Biol. Chem. 271: 695 (1996)）又はWalac ScintiStrip(商品名)プレ
ート（Brauwalder等, Anal. Biochem. 234: 23 (1996)）の使用を介して物理的
に固定化される。また、基質は、例えばＰ８１ホスホセルロース（塩基性ペプチ
ド用）、ＰＥＩ／酸性モリブデン塩樹脂又はＤＥＡＥ上への捕捉、又はWhatman(
商品名)３ＭＭペーパーへのＴＣＡ析出により反応後に固定化してもよい、Tigan
is等, Arch. Biochem. biophys. 325: 289 (1996); Morawetz等, Mol. Gen. Gen
et. 250: 17 (1996); Budde等, Int. J. Pharmacognosy 33: 27 (1995)及びCasn
ellie, meth. Enz. 200: 115 (1991)。さらに他の可能性は、予め支持体に結合
させたグルタチオン及びストレプトアビジン（各々ＧＳＴ及びビオチンの場合）
等の結合パートナーで抱合することにより、あるいは同様に支持体に結合させた
タグに特異的な抗体を介して支持体表面に基質を結合させる事である。 上記のものに適したさらなる検出方法を開発してもよい。特に、高スループッ
トスクリーニングに関連した用途では、そのような方法は、良好な選択性及び特
異性、延長された直線範囲、低いバックグラウンドシグナル、最小の摂動、他の
試薬との相容性、及び自動取扱システムとの相容性を示すことが予測される。 本発明の治療のインビボ有効性は、種々の齧歯類モデルにおいて化学的に誘発
された腫瘍に対して実験できる。腫瘍細胞系はインビトロ細胞培地で成長させ、
実験用齧歯類、例えばマウスに、例えば皮下経路での注射によって導入される。
実験動物における腫瘍の化学的誘発はの技術は、この分野で良く知られている。
【００５６】 （ｂ）生物学的検出技術 本発明のアンタゴニスト／アゴニスト化合物の、それ自身がヘッジホッグシグ
ナル伝達を変調するｐａｔｃｈｅｄ-２の活性を変調させる能力は、リガンド結
合に伴う形態又は機能変化についての評点化によって測定される。この分野で知
られている任意の定性的及び定量的技術は、ｐａｔｃｈｅｄ-２の制御下で起こ
る細胞プロセスの観察及び測定のために適用できる。また、本発明の化合物の活
性は、ヘッジホッグシグナル伝達の機能不全によって生ずる又はそれに関連する
疾患の実験的モデルを用いて動物で評価することもできる。例えば、マウスにお
ける無効なＤｈｈヘッジホッグシグナル伝達は、生存できるが繁殖できないマウ
スを導く。さらに、正しいＳｈｈシグナル伝達は、脊索及び底板、神経管、末端
肢構造、脊柱及び肋骨におけるマウス胚成長に重要である。また、不正なＳｈｈ
シグナル伝達は単眼症に関連している。これらのフェノタイプ特性は、ｐａｔｃ
ｈｅｄ-２アンタゴニスト及び／又はアゴニストについてのスクリーニングアッ
セイにおいて評価され定量化される。ヘッジホッグの過剰発現に伴う疾患状態は
、基底細胞癌に関連するが、不活性なＳｈｈシグナル伝達は異常な神経発達を導
く。 これらの細胞培養アッセイ及び動物実験で得られたデータは、ヒトで使用する
ための用量範囲の処方に用いられる。本発明の化合物の用量は、毒性を殆ど又は
全く持たない循環濃度の範囲内にある。用量は、採用する投与形態及び投与経路
に応じてこの範囲内で変化する。
【００５７】 （２）アンチセンスオリゴヌクレオチド アンタゴニストの他の好ましいクラスは遺伝子治療技術の使用を含み、アンチ
センスオリゴヌクレオチドの投与を含む。適用可能な遺伝子治療技術は、治療的
に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの一回又は複数回投与を含む。アンチセンスＲＮＡ
及びＤＮＡは、インビボでの或る種の遺伝子の発現を阻止するための治療薬とし
て使用できる。参照用の短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に移入でき
、それらは細胞膜による制限された取り込みによって生ずる低い細胞内濃度にも
関わらず阻害剤として作用する、Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:
4143-4146 (1986)。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば負に荷電した
ホスホジエステル基を不荷電基で置換することにより、それらの取り込みを促進
させるように修飾することができる。 生存細胞に核酸を導入するために知られた種々の技術がある。これらの技術は
、対象とする宿主の細胞において、インビトロ、エキソビボ、又はインビボで培
養された細胞に移行されるかによって変化する。インビトロで哺乳動物細胞に核
酸を移行するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイク
ロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＤ-デキストラン、リン酸カルシウム沈
殿法などの使用を含む。現在好ましいインビボ遺伝子移行技術は、ウイルス（典
型的にはレトロウイルス）ベクターでの形質移入及びウイルスコートタンパク質
−リポソーム媒介形質移入を含む、Dzau等, Trends Biotech. 11: 205-210 (199
3)。幾つかの状況では、核酸供給源を標的細胞をターゲティングする試薬と共に
提供するのが好ましく、例えば、エンドサイトーシスを伴う細胞表面膜タンパク
質に特異的な抗体をターゲティング及び／又は取り込みの促進のために用いても
よく、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクリ
ングで内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティング
し細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介エンドサイトー
シスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262: 4429-2232 (1987); Wagner
等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。周
知の遺伝子作成及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Sc
ience 256: 808-813 (1992)を参照のこと。 一実施態様では、ｐａｔｃｈｅｄ-２発現は、ｐａｔｃｈｅｄ-２タンパク質の
発現を低下させるのに有効な量のｐａｔｃｈｅｄ-２アンチセンスＲＮＡ又はＤ
ＮＡとともにｐａｔｃｈｅｄ-２発現細胞を提供することにより低下させうる。
【００５８】 Ｉ．診断的用途 ここに記載した本発明の化合物（例えば、ｐａｔｃｈｅｄ-２、ｐａｔｃｈｅ
ｄ-２及び抗-ｐａｔｃｈｅｄ-２抗体）の他の用途は、ｐａｔｃｈｅｄ-２又はヘ
ッジホッグシグナル伝達により疾患が幾分進行したか否かの診断を助けることで
ある。例えば、基底細胞癌細胞は活性なヘッジホッグシグナル伝達に関連し、精
母細胞形成はＤｈｈシグナル伝達に関連し、ｐａｔｃｈｅｄ及びｐａｔｃｈｅｄ
-２抑制の欠損は精巣癌に関連する。 ｐａｔｃｈｅｄ-２変調ヘッジホッグシグナル伝達によって特定の疾患が導か
れるか否かを決定する診断アッセイは以下の工程を用いて実施される：（１）試
験細胞又は組織を培養する；（２）ｐａｔｃｈｅｄ-２とＳｍｏ（配列番号：１
７）の結合を防止する化合物を投与し、それによりＨｈシグナル伝達経路を活性
化する；及び（３）ヘッジホッグシグナル伝達を測定する。工程は、この開示に
照らして標準的な技術を用いて実施できる。例えば、細胞又は組織の単離及び培
養又はインビボに標準的な技術を使用できる。 選択性の程度が変化した化合物類は、ｐａｔｃｈｅｄ-２の役割を診断するの
に有用である。例えば、他の形態のキナーゼに加えてｐａｔｃｈｅｄ-２を阻害
する化合物は、幾つかのシグナル伝達リガンドが疾患を導くか否かを決定する最
初の試験化合物として使用できる。選択的化合物は、次いで、疾患の誘導におけ
る他のリガンドの可能な役割をさらに排除するのに使用できる。試験化合物は、
細胞毒性効果の発揮よりも、リガンド−ｐａｔｃｈｅｄ-２結合活性の阻害にお
いて有力であるべきである（例えば、ＩＣ５０／ＬＤ５０が１より大きい）。Ｉ
Ｃ５０及びＬＤ５０は、ＭＴＴアッセイ等の標準的技術、又はＬＤＨ放出量の測
定により測定できる。化合物のＩＣ５０／ＬＤ５０の度合いは、診断アッセイの
評価を考慮すべきである。一般的に、ＩＣ５０／ＬＤ５０の比率が大きくなると
情報がより相対的になる。適切な対照は、化合物の起こりうる毒性効果を考慮し
、例えば、増殖疾患を伴わない細胞（例えば対照細胞）の試験化合物での処理は
、診断アッセイの一部として用いることができる。本発明の診断方法は、ｐａｔ
ｃｈｅｄ-２のヘッジホッグシグナル伝達に対する効果を変調させる試薬につい
てのスクリーニングを含む。例示的な検出技術は、放射性標識及び免疫沈降を含
む（米国特許第5,385,915号）。
【００５９】 Ｊ．製薬組成物及び用量 本発明の組成物の治療用製剤は、所定の純度を持つｐａｔｃｈｅｄ-２分子、
アゴニスト及び／又はアンタゴニストを、この分野で典型的に用いられる任意の
「製薬的に許容される」又は「生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤
（以下、全てを「賦形剤」と称する）と混合することにより凍結乾燥製剤又は水
溶液として調製され保存される。例えば、緩衝剤、安定化剤、防腐剤、等張化剤
、非イオン性洗浄剤、酸化防止剤及び他の添加剤である（Remington's Pharmace
utical Sciences, 16th ed., Osol, A.編, (1980)参照）。このような添加剤は
、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性でなければならない。 緩衝剤は、ｐＨを生理学的条件近傍に維持するのを助ける。それらは、約２ｍ
Ｍから約５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本発明での使用に適した緩衝剤は、
有機及び無機酸の両方及びその塩、例えば、クエン酸バッファー（例えば、クエ
ン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリ
ウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸バッファ
ー（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリ
ウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸バッファー
（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、
酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸バッファー（例えば、フマル
酸−フマル酸一ナトリウムなど）、フマル酸バッファー（例えば、フマル酸−フ
マル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸
一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸バッファー（例
えば、グルコン酸−グルコン酸一ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリ
ウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸バッファ
ー（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウ
ム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸バッファー（例えば
、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カ
リウム混合物など）及び酢酸バッファー（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物
、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）を含む。さらに、リン酸バッファー、ヒ
スチジンバッファー、及びトリス等のトリメチルアミン塩を挙げることができる
。
【００６０】 防腐剤は、微生物成長を抑制するために添加され、０．２％−１％(w/v)の範
囲の量で添加される。本発明での使用に適した防腐剤は、フェノール、ベンジル
アルコール、メタ-クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデ
シルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ハロゲン化ベンザルコニウム(ben
zalconium)（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、ヘキサメトニウム、メチル
又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シ
クロヘキサノール、及び３-ペンタノールを含む。 等張化剤は「安定化剤」としても知られ、本発明の液体組成物の等張性を確保
するために存在し、多価糖アルコール、好ましくは三価又はそれ以上の糖アルコ
ール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソル
ビトール及びマンニトールを含む。多価アルコールは、他の成分との相対量を考
慮して、０．１％から２５重量％、好ましくは１％から５％の間の量で存在する
。 安定化剤は賦形剤の広い範疇を意味し、充填剤から、治療薬を可溶化する、又
は変性及び容器壁面への付着の防止を助ける添加剤までの範囲とすることができ
る。典型的な安定化剤は、多価糖アルコール（上で列挙した）；アミノ酸、例え
ばアルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、ア
ラニン、オルニチン、Ｌ-ロイシン、２-フェニルアラニン、グルタミン酸、スレ
オニン等、有機糖又は糖アルコール、例えばラクトース、トレハロース、スタキ
オース(stachyose)、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リボチトー
ル、ミオイノシトール、ガラクチトール、グリセロール等、イノシトール等のシ
クリトールを含む；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；イオウ含有還
元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオシト(thiocutic)酸、チオグリコール酸
、チオグリセロール、α-モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム；低分
子量ポリペプチド（＜約１０残基）；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン
、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親
水性ポリマー；キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース等の単糖類
；ラクトース、マルトース、スクロース等の二糖類及びラフィノース等の三糖類
；デキストラン等の多糖類とすることができる。安定化剤は、活性タンパク質重
量部当たり０．１から１０，０００重量の範囲で存在することができる。
【００６１】 非イオン性界面活性剤又は洗浄剤（「湿潤剤」としても知られる）は、治療薬
の可溶化を助けるため、並びに撹拌い誘発される凝集に抗して治療用タンパク質
を保護するために存在し、製剤をタンパク質変性することなく応力のかかった剪
断表面に暴露するのを可能にする。好ましい非イオン性界面活性剤は、ポリソル
ベート（２０、８０等）、ポリオキサマー（１８４、１８８等）、Pluronic(登
録商標)ポリペプチドオール、ポリペプチドオキシエチレンソルビタンモノエー
テル（Tween(登録商標)-20、Tween(登録商標)-80等）を含む。非イオン性界面活
性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌから約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０７
ｍｇ／ｍｌから約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在する。 さらなる種々の賦形剤は、充填剤（例えばデンプン）、キレート化剤（例えば
ＥＤＴＡ）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、眼チオノン、ビタミンＥ）及
び共溶媒を含む。 ここで製剤は、治療すべき特定の症状の必要に応じて一以上の化合物を含有し
てもよく、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものである。
例えば、免疫抑制剤をさらに提供するのが望ましい場合もある。このような分子
は、意図する目的に有効な量で組み合わせて好適に存在させる。 また活性成分は、コロイド状ドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソー
ム、アルブミン微小球、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル）
又はマイクロエマルションにおいて、マイクロカプセルに包括させてもよく、例
えば、コアセルベーション技術により又は界面重合により調製された、例えば、
各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリペプチ
ド-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルである。これらの技術はRemington
's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Csal, 編 (1980)に記載されて
いる。
【００６２】 インビボ投与に用いられる製剤は無菌でなければならない。これは、例えば滅
菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。 持続放出製剤を調製することもできる。持続放出製剤の好適な例は、本発明の
化合物を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、当該マトリク
スは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マト
リクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル
-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)、ポリアクチド（米国特許第3,
773,919号））、Ｌ-グルタミン酸及びエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非
分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばLu
pron Depot(商品名)（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから
なる注射可能な微小球）、及びポリ-Ｄ-(−)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エ
チレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸等のポリマーは分子を１００日に渡
って放出することを可能にするが、或る種のヒドロゲルはより短時間しかタンパ
ク質を放出しない。本発明のカプセル化化合物が体内に長時間滞在すると、それ
らは３７℃の水分に暴露される結果変性又は凝集して生物学的活性の喪失及び免
疫原性の変化を起こすこともある。含まれるメカニズムによって安定化を工夫し
て合理的な方法とすることができる。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフ
ィド交換を通した細胞間Ｓ-Ｓ結合形成であることが見出された場合、スルフヒ
ドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、適当な添加剤を用いた水分の制御
、及び特定のポリマーマトリクス組成の開発によって安定化が達成される。 特定の疾患又は状態の治療において有効な治療用ポリペプチド、抗体又はその
断片の量は疾患又は状態の性質に依存し、標準的な臨床技術により決定できる。
可能ならば、最初にインビトロで、次いでヒトにおける試験の前に有用な動物モ
デル系で本発明の製薬組成物についての用量−応答曲線を決定する。しかしなが
ら、この分野の常識に基づいて、Ｄｈｈ及びＨｈシグナル伝達の変調に有効な製
薬組成物は、約１０から１０００ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは１００から８００
ｎｇ／ｍｌの間、最も好ましくは２００ｎｇ／ｍｌから６００ｎｇ／ｍｌのＰｔ
ｃｈ-２（配列番号：２）という局所的ｐａｔｃｈｅｄ-２タンパク質濃度を与え
てもよい。
【００６３】 好ましい実施態様では、治療用ポリペプチド、抗体又はその断片の水溶液が皮
下注射によって投与される。各用量は体重１ｋｇ当たりに約０．５μｇから約５
０μｇ、より好ましくは体重１ｋｇ当たりに約３μｇから約３０μｇの範囲であ
る。 皮下投与の投与スケジュールは、疾患の型、疾患の重篤さ、及び治療薬に対す
る患者の感受性に応じて、週に１回から毎日変えられる。 ｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチドは、Ｆｉｇ１に示したようなアミノ酸配列又
はそのサブ配列、それから誘導される活性アミノ酸配列、又は機能的等価な配列
を含んでよく、このサブ配列はｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチドの機能的部分を
含むと考える。 患者が、発熱、風邪又は流感様症状、疲労などといった望ましくない副作用を
現した場合、より低用量でより頻繁な間隔で投与するのが望ましいであろう。こ
のような副作用を緩和するために、一又は複数の付加的薬剤、例えば解熱剤、抗
炎症剤又は鎮痛剤をｐａｔｃｈｅｄ-２と組み合わせて投与してもよい。
【００６４】 以下の実施例は例示する目的にのみ提供されるものであって、本発明の範囲を
決して限定することを意図するものではない。 本明細書で引用した全ての特許及び文献の全体を、出典明示によりここに取り
込む。 （実施例） 実施例で言及されている全ての他の市販試薬は、特に示さない限りは製造者の
使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体
を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション、ロックビル、メリーランドである。
【００６５】 実施例１ 序文 細胞表面において、Ｈｈ機能はＰｔｃｈ及びＳｍｏ（配列番号：１７）を含む
多成分レセプター複合体によって媒介されることがわかり、２つの多重膜貫通タ
ンパク質がショウジョウバエにおいてセグメントポラリティ遺伝子として同定さ
れ、後に脊椎動物において特徴付けされた。Nakano等, Nature 341: 508-13 (19
89); Goodrich等, Genes Dev. 10: 301-312 (1996); Marigo等, Develop. 122:
1225-1233 (1996); van den Heuval等, Nature 382: 547-551 (1996); Alcedo等
, Cell 86: 221-232 (1996); Stone, D.M.等, Nature 384: 129-34 (1996)。遺
伝学的及び生化学的証拠がともに、Ｐｔｃｈ（配列番号：４）がリガンド結合性
サブユニットであり、Ｇタンパク質結合レセプター様分子であるＳｍｏ（配列番
号：１７）がシグナル伝達成分であることを支持している。Stone, D.M.等, Nat
ure 384: 129-34 (1996); Marigo等, Nature 384: 176-79 (1996), Chen等, Cel
l 87: 553-63 (1996)。ＨｈのＰｔｃｈ（配列番号：４）への結合の際に、Ｐｔ
ｃｈ（配列番号：４）のＳｍｏ（配列番号：１７）に対する正常な阻害効果が開
放され、Ｓｍｏ（配列番号：１７）が原形質膜を通してＨｈシグナルを伝達する
ことを可能にする。
【００６６】 結果 ＰＴＣＨ／ＳＭＯ複合体が３つの哺乳類Ｈｈ全てを媒介するか否か、又は特定
の成分が存在するか否かは、未だ確立されずにいる。近年、第２のマウスｐａｔ
ｃｈｅｄ遺伝子ｍＰａｔｃｈｅｄ-２（配列番号：７）が最近単離されたが［Mot
oyama等, Nature Genet. 18: 104-106 (1998)］、そのＨｈレセプターとしての
機能は確立されていない。ｐａｔｃｈｅｄ-２（配列番号：２）を特徴付け、そ
れをＰａｔｃｈｅｄ（配列番号：４）と種々のＨｈファミリーメンバーの生物学
的機能について比較するため、我々はＰａｔｃｈｅｄ（配列番号：４）タンパク
質でＥＳＴデータベースをスクリーニングして新規なヒトｐａｔｃｈｅｄ遺伝子
についての２ＥＳＴ候補を同定した。ヒトＰｔｃｈ-２（配列番号：２）をコー
ドする全長ｃＤＮＡは精巣ライブラリからクローニングした。開始ＡＴＧは、約
131kDaの推定分子量を持つ1204アミノ酸長タンパク質をコードする3612ヌクレオ
チドのオープンリーディングフレームを決定する。ヒトＰｔｃｈ（配列番号：４
）とＰｔｃｈ-２（配列番号：２）との全体の同一性は54%であり（Ｆｉｇ１）、
ヒトＰＴＣＨ-２と最近記載されたマウスＰｔｃｈ-２（配列番号：７）当量の同
一性は90%である（Ｆｉｇ８）。２つのヒトＰａｔｃｈｅｄタンパク質の間の最
も明白な構造的な相違は、Ｐｔｃｈ-２（配列番号：２）の切断されたＣ-末端細
胞質ドメインである。さらに、Ｐｔｃｈ（配列番号：４）に存在する２つのグリ
コシル化部位の一方のみがＰｔｃｈ-２（配列番号：２）に保存されている。 Ｐａｔｃｈｅｄ-２がＨｈレセプターであるか否か、２つのＰａｔｃｈｅｄ分
子が種々のＨｈリガンド間を特異的な結合を介して識別できるか否かを決定する
ために、本出願人は、ヒト２９３胚腎臓細胞をＰｔｃｈ（配列番号：４）又はＰ
ｔｃｈ-２（配列番号：２）発現作成物で形質移入し、その細胞のＳｈｈ、Ｄｈ
ｈ及びＩｈｈ結合について分析した。Ｆｉｇ７Ａに示すとおり、１２５Ｉ-Ｓｈ
ｈの結合性が過剰のＳｈｈ、Ｄｈｈ又はＩｈｈ（配列番号：１４、１３及び２９
）各々と比較できる。置換曲線のスキャッチャード分析は、Ｐｔｃｈ（配列番号
：４）（Ｓｈｈ、1.0nM）（配列番号：１４）；Ｄｈｈ、2.6nM（配列番号：１３
）；Ｉｈｈ、1.0nM（配列番号：２９）及びＰｔｃｈ-２（配列番号：２）（Ｓｈ
ｈ、1.8nM（配列番号：１４）；Ｄｈｈ、0.6nM（配列番号：１３）；Ｉｈｈ、0.
4nM（配列番号：２９）について全てのＨｈが類似の親和性を有することを示し
、ＰＴＣＨ（配列番号：４）及びＰＴＣＨ-２（配列番号：２）の両方が３つの
哺乳動物Ｈｈタンパク質に対する生理学的レセプターを提供しうることを示して
いる。
【００６７】 次に本出願人は、Ｐａｔｃｈｅｄ-２が、Ｐａｔｃｈｅｄと同様に、Ｓｍｏ（
配列番号：１７）と物理的複合体を形成するか否かを決定した。Ｆｌａｇタグの
Ｐｔｃｈ（配列番号：４）又はＰｔｃｈ-２（配列番号：２）を、Ｍｙｃタグの
Ｓｍｏ（配列番号：１７）とともに２９３細胞で同時形質移入した。既に述べら
れているように［Stone, D.M.等, Nature 384: 129-34 (1996)］、Ｐｔｃｈ（配
列番号：４）及びＳｍｏ（配列番号：１５）を発現する細胞において、Ｐｔｃｈ
（配列番号：４）はエピトープタグＳｍｏ（配列番号：１５）に対する抗体で免
疫沈降できる（Ｆｉｇ７Ｂ）。同様に、Ｐａｔｃｈｅｄ-２は、２つのタンパク
質が２９３細胞で同時発現される場合はエピトープタグＳｍｏ（配列番号：１５
）に対する抗体で免疫沈降できる。それとともに、これらの結果は、ＰＴＣＨに
ついて記載されたもの（Stone等, 上掲）と同様に、Ｐａｔｃｈｅｄ-２がＳｍｏ
（配列番号：１７）とともに多成分Ｈｈレセプター複合体を形成するモデルを示
唆している。興味深いことに、切断Ｐａｔｃｈｅｄの分析によって既に示唆され
ているように（Stone等, 上掲）、これらの結果はＰａｔｃｈｅｄ-２には無い長
いＣー末端尾部がＳｍｏ（配列番号：１７）との相互作用には不要であることも
示している。しかしながら、Ｃ-末端の不存在がＰａｔｃｈｅｄ-２のＳｍｏ（配
列番号：１７）によるシグナル伝達を阻止する能力に影響を与え、Ｐａｔｃｈｅ
ｄ-２に比較してＰａｔｃｈｅｄによるシグナル伝達の相違を導くことは可能で
ある。 Ｐａｔｃｈｅｄ-２が、その発現プロフィールに基づいて特定のＨｈ分子の作
用を変調できるか否かをさらに実験するために、本出願人は、Ｐｔｃｈ（配列番
号：４）及びＰｔｃｈ-２（配列番号：２）の発現を比較した。第１にＰｔｃｈ-
２（配列番号：１）に特異的なプローブを用いたノーザンブロット分析は、精巣
における高レベルのＰＴＣＨ２ｍＲＮＡを明らかにした（Ｆｉｇ４）。この方法
により、胚組織を含む分析した他の全ての組織においてＰｔｃｈ-２（配列番号
：１）発現は検出されなかった（データは示さず）。このプロフィールは、ノー
ザンブロットで精巣には見られないが多数の成人及び胚組織で見られるＰｔｃｈ
（配列番号：１８）で観察されるものとは非常に異なる［Goodrich等, Genes De
v. 10: 301-312 (1996)］。Ｐｔｃｈ（配列番号：１８）及びＰｔｃｈ-２（配列
番号：１）の発現パターンの更に詳細な分析は、精巣に特に注意したインサイツ
ハイブリッド形成によって実施した。既に記載されているように（Motoyama等,
上掲）、低レベルのＰｔｃｈ-２（配列番号：１）の発現が発達中の歯及び皮膚
の上皮細胞で検出された（データは示さず）。高レベルのＰｔｃｈ-２（配列番
号：２）コード化ｍＲＮＡが精細管内部で、一次及び二次精母細胞上に発現され
たが（Ｆｉｇ６（ｂ）、６（ｅ））、精細管の間質に局在化したライディヒ細胞
で低レベルのＰｔｃｈ（配列番号：４）コード化ｍＲＮＡが検出できるのみであ
る（Ｆｉｇ６（ａ））。一次及び二次精母細胞は、精巣におけるＤｈｈ（配列番
号：１３）の供給源である支持セルトリ細胞と密に接触する［Bitgood等, Curr.
Biol. 6: 298-304 (1996)］。２つのレセプターの何れが精巣でのＤｈｈ（配列
番号：１３）活性の最も関連するメディエータであるかを決定するために、我々
はＦｕＲＫ（配列番号：１０）、Ｈｈシグナル伝達経路の成分と考えられている
Ｆｕｓｅｄ関連キナーゼの発現プロフィールを分析した。Ｐａｔｃｈｅｄ-２が
精巣におけるＤｈｈの標的であるという考えに一致して、我々は、ＦｕＲＫ（配
列番号：１０）、それとＰｔｃｈ-２（配列番号：２）とが共に局在化した胚細
胞のみで発現されることを見出した（Ｆｉｇ４（ｃ）、（ｆ））。雄Ｄｈｈ-欠
損マウスが成熟精子を欠くため繁殖不能であるので、Ｄｈｈ（配列番号：１３）
は胚細胞の正しい分化に必要である（Bitgood等, 上掲）。我々のデータは、Ｄ
ｈｈ（配列番号：１３）がＰｔｃｈ-２（配列番号：２）を通して胚細胞に直接
作用するが、テストステロン産生ライディヒ細胞上で低レベルで発現されたＰｔ
ｃｈ（配列番号：４）の機能は不明であることを示唆している。
【００６８】 議論 Ｐａｔｃｈｅｄの異型接合性の喪失（ＬＯＨ）が家系性並びに散発性基底細胞
癌において高頻度で生ずることが報告され［Johnson等, Science 272: 1688-71
(1996); Hahn等, Cell 85: 841-51 (1996); Gailani等, Nature Genetics 14: 7
8-81; Xie等, Cancer Res. 57: 2369-72 (1997)］、それが腫瘍サプレッサとし
て機能することを示唆している。上記のレセプターモデルに従うと、Ｐａｔｃｈ
ｅｄ機能の喪失がＳｍｏ（配列番号：１７）による異常なシグナル伝達をもたら
し、皮膚基底細胞層の過剰増殖を導きうる。上記で示唆されたように、Ｐａｔｃ
ｈｅｄ-２がＤｈｈの機能を媒介するならば、Ｐａｔｃｈｅｄ-２の喪失は、Ｓｍ
ｏ（配列番号：１７）活性がＰａｔｃｈｅｄ-２に制御されている組織における
腫瘍形成を導きうる。Ｐｔｃｈ-２（配列番号：２）をコードする遺伝子は、蛍
光インサイツハイブリッド形成及びヒト染色体１ｐ３３−３４に対する放射性ハ
イブリッドパネルを用いたＰＣＲによってマッピングされた（データは示さず）
。興味深いことに、精上皮腫を含む精巣腫瘍における再発性の染色体異常の最近
の分析は、領域１ｐ３２−３６の欠失を明らかにした［Summersgill等, B. J. C
ancer 77: 305-3313 (1998)］。Ｐａｔｃｈｅｄ-２座位を含むこの領域の喪失は
、胚細胞腫瘍の場合の36%と一致した。これらのデータから、基底細胞癌及び髄
芽細胞腫におけるＰａｔｃｈｅｄと同様に、Ｐａｔｃｈｅｄ-２が、精母細胞な
どのＤｈｈ（配列番号：１３）標的細胞における腫瘍サプレッサであり、さらに
癌におけるＨｈシグナル伝達に関係している可能性が生じる。 要するに、我々のデータは、Ｐａｔｃｈｅｄ及びＰａｔｃｈｅｄ-２の両方が
純粋なＨｈレセプターであり、それらがともにＳｍｏ（配列番号：１７）と複合
体を形成できることを示している。結合データは、Ｐａｔｃｈｅｄ及びＰａｔｃ
ｈｅｄ-２が親和性の相違を介して種々のＨｈリガンド間を識別しないことを示
しているが、これら２つのレセプターの明確な組織分布は、インビボにおいてＰ
ａｔｃｈｅｄはＳｈｈの主要なレセプターであり、Ｐａｔｃｈｅｄ-２は主にＤ
ｈｈシグナル伝達を媒介することを示唆している。Ｈｈシグナル伝達成分の幾つ
かが存在しないときのライディヒ細胞におけるＰａｔｃｈｅｄ発現の機能は、未
だ説明されていない。同様に、Ｐａｔｃｈｅｄ-２が発達中の歯及び皮膚に存在
するＳｈｈ発現細胞において発現されたときに役割を果たすか否かを決定するの
は興味深い、Motoyama等, Nature Genet. 18: 104-106 (1998)。最後に、Ｐａｔ
ｃｈｅｄ-２の存在は、さらなるＰａｔｃｈｅｄレセプター、特にＩｈｈ（配列
番号：２９）の機能を媒介するものが存在するか否かという疑問を生じさせる。
【００６９】 材料と方法 １． ヒトｐａｔｃｈｅｄ-２ｃＤＮＡクローンの単離 発現された配列タグ（ＥＳＴ）データベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Phar
maceuticals、Palo Alto, CA）を、ショウジョウバエのセグメントポラリティ遺
伝子ｐａｔｃｈｅｄ-２のヒト相同体について検索した。２つのＥＳＴ（Incyte
#905531及び1326258）（Ｆｉｇ２）を潜在的な候補として同定した。ヒトｐａｔ
ｃｈｅｄ-２クローンを含むヒトｃＤＮＡライブラリを同定するために、ｐＲＫ
５におけるヒトｃＤＮＡライブラリを以下のプライマーを用いたＰＣＲによって
最初にスクリーニングした： 5'-905531(A): 5'-AGGCGGGGGATCACAGCA-3' （配列番号：１９） 3'-905531(A): 5'-ATACCAAAGAGTTCCACT-3' （配列番号：２０） 胎児肺ライブラリを選択し、加熱開始した後に添加した10μlの10xＰＣＲバッ
ファ（Klentaq(登録商標)）、1μlのｄＮＴＰ（200μM）、1μlのライブラリＤ
ＮＡ（200ng）、0.5μlのプライマー、86.5μlのＨ２Ｏ及び1μlのKlentaq(登録
商標)(Clontech)を含む反応において3'-905531(A)プライマーを用いてｄｕｔ−
／ｕｎｇ−宿主で成長させたプラスミドライブラリから一本鎖ＤＮＡを発現させ
ることによりｐａｔｃｈｅｄ-２ｃＤＮＡクローンを富化した。反応は95℃で1分
間変性させ、60℃で1分間アニールし、次いで72℃で20分間伸展させた。ＤＮＡ
をフェノール／ＣＨＣｌ３で抽出し、エタノール沈殿させ、次いでエレクトロポ
レーションによりＤＨ１０Ｂ(Gibco/BRLi)宿主細菌に移行させた。各形質転換体
からのクローンをナイロン膜上にレプリカプレートし、以下の配列のＥＳＴ配列
（#905531）から誘導された重複オリゴプローブでスクリーニングした： 5'-ptch2プローブ: 5'-CTGCGGCGCTGCTTCCTGCTGGCCGTCTGCATCCTGCTGGTGTGC-3' （配列番号：２１） 3'-ptch2プロー: 5'-AGAGCACAGACGAGGAAAGTGCACACCAGCAGGATGCAGACGGCC-3' （配列番号：２２）
【００７０】 オリゴプローブを、［γ-３２Ｐ］-ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ
で標識した。フィルターは、42℃において、50%のホルミアミド、5XＳＳＣ、10X
デンハード、0.05mのリン酸ナトリウム（pH6.5）、0.1%のピロリン酸ナトリウム
、50μg/mlの超音波処理サケ精子ＤＮＡ中でハイブリッド形成した。次いでフィ
ルターを2xＳＳＣでリンスし、0.1xＳＳＣ、0.1%ＳＤＳで洗浄し、次にKodak(登
録商標)Ｘ線フィルムに暴露した。この方法を用いて、胎児脳ライブラリから部
分クローンを単離した（クローン３Ａ−Ｆｉｇ１０）（配列番号：８）。失った
5'-配列を単離するために、精巣ライブラリ（下記のノーザンブロット参照）を
スクリーニングした。精巣ライブラリをプローブするためのクローン３Ａからの
204bpプローブを増幅するのに使用したプライマーは： RACE 5: 5'-ACTCCTGACTTGTAGCAGATT-3' （配列番号：２３）及び RACE 6: 5'-AGGCTGCATACACCTCTCAGA-3' （配列番号：２４）であった。 増幅したプローブをアガロースゲルから切除することにより精製し、ランダムプ
ライマー標識化キット（Boehringer Mannheim）で標識した。潜在的開始メチオ
ニンを含むもの（クローン１６．１−Ｆｉｇ１１）（配列番号：９）を含む幾つ
かのクローンを単離した。これらのクローンの幾つかを組み立てることによりＰ
ａｔｃｈｅｄ-２をコードする全長ｃＤＮＡを再構築した。ヒトＰｔｃｈ-２（Ｆ
ｉｇ１（配列番号：１））をコードする全長ｃＤＮＡは、144kDaの推定分子量を
持つ1204アミノ酸タンパク質をコードする3612ヌクレオチド長のオープンリーデ
ィングフレームリーディングフレームを有する。ヒトＰｔｃｈ（配列番号：４）
とのアラインメントは、２つの分子間でのアミノ酸レベルで53%の同一性を明ら
かにした（Ｆｉｇ３）。１２の膜貫通ドメイン全てが保存された。最も有意な相
違は、Ｐｔｃｈ（配列番号：４）に比較して短いＰｔｃｈ-２（配列番号：２）
のＣ-末端細胞内ドメインである。
【００７１】 ２． ノーザンブロット 完全な全長ｐａｔｃｈｅｄ-２ｃＤＮＡを単離スルのに最良の組織供給源を決
定し、その発現プロフィールを決定するために、我々は以下のプライマー： TM2: 5'-GCTTAGGCCCGAGGAGAT-3' （配列番号：２５） URT2: 5'-AACTCACAACTTTCTCTCCA-3' （配列番号：２６） を用いてＰａｔｃｈｅｄ-２の3'非切断領域から増幅した752bpの断片でヒト多重
組織ノーザンブロット（Clontech）をプローブした。得られた断片をゲル精製し
てランダムプライミングにより標識した。ブロットをExpressHyb(登録商標)ハイ
ブリッド形成溶液（Clontech）中、1x10６cpm/mlの３２Ｐ-標識プローブ存在下
、42℃で終夜ハイブリッド形成した。ブロットを2xＳＳＣで室温において１０分
間洗浄し、0.1xＳＳＣ／0.1%ＳＤＳ中、42℃で30分間洗浄し、次いでＸ-線フィ
ルムに終夜暴露した。Ｆｉｇ４は、Ｐｔｃｈ-２メッセージが精巣のみで高レベ
ルで発現されたことを示している。
【００７２】 ３． 染色体局在化 上記のプライマーＴＭ２（配列番号：２５）及びＵＴＲ２（配列番号：２６）
をGenome System (St. Louis, MO) BACライブラリのスクリーニングに使用した
。このライブラリから２つの個々のＢＡＣクローンを得て、これらのクローン両
方のＦＩＳＨ法による染色体局在化は、Ｐｔｃｈ-２（配列番号：２）がヒト染
色体１ｐ３３−３４にマッピングされることを示した（Ｆｉｇ５）。Ｐａｔｃｈ
ｅｄについての異型接合性の喪失（ＬＯＨ）が基底細胞癌で高頻度に起こること
が報告された。Ｐａｔｃｈｅｄ機能の喪失はＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）（
配列番号：１７）による恒常的シグナル伝達を導き、真皮の基底層の過剰増殖を
もたらす。類似のメカニズムが胚細胞腫瘍の形成を導きうる。このモデルは胚細
胞腫瘍の進行の第１段階が胚細胞前駆体によるＤＮＡの初期喪失であり、次いで
精上皮腫を形成する腫瘍性胚細胞を導くことを提案している［De Jong等, Cance
r Genet. Cytogenet. 48: 143-167 (1990)］。侵襲性精上皮腫から、全ての他の
形態の胚細胞型が発生する。全ての胚細胞腫瘍の約80%は同腕染色体１２ｐ（ｉ
１２ｐ）に関連し、精上皮腫より非精上皮腫でより高頻度で見られる［Rodrigue
z等, Cancer Res. 52: 2285-2291 (1992)］。しかしながら、精上皮腫を含む精
巣腫瘍における再発性の染色体異常の分析は、領域１ｐ３２−３６の欠失を明ら
かにした。この領域の喪失は、最近の研究における胚細胞腫瘍の36%と一致した
［Summersgill等, B. J. Cancer 57: 305-313 (1998)］。染色体１ｐ３２−３６
の類似の欠失は、乏突起細胞腫において28%の頻度で報告されている；Bello等,
Int. J. Cancer 57: 172-175 (1994)。Ｐｔｃｈ-２（配列番号：２）の脳におけ
る発現はここで詳細に試験されていないが、Ｐｔｃｈ-２（配列番号：２）はＤ
ｈｈレセプターと考えられ（下記参照）、マウスシュワン細胞によるＤｈｈの発
現が以前に報告されている［Bitgood等, Develop. Biol. 172: 126-138 (1995)
］。Ｐｔｃｈ-２（配列番号：２）は染色体１ｐ３３−３４に局在しているので
、Ｐａｔｃｈｅｄ-２はＤｈｈ標的細胞においてＳｍｏ（配列番号：１７）シグ
ナル伝達を調節し、Ｐａｔｃｈｅｄ-２機能の喪失がこれらの細胞における異常
なＳｍｏ（配列番号：１７）シグナル伝達、続いて腫瘍形成を導きうる。
【００７３】 ４． インサイツハイブリッド形成 マウス精巣断片を16μmで切り出し、 Phillips等, Science 250: 290-294 (1
990)に記載された方法によりインサイツハイブリッド形成用に加工した。３３Ｐ
-ＵＴＰ標識ＲＮＡプローブをMelton等, Nucleic Acids Res. 12: 7035-7052 (1
984)に記載されているように生成させた。センス及びアンチセンスプローブをマ
ウスＰａｔｃｈｅｄの3'非コード化領域から、又はヒト配列のアミノ酸３１７−
４８６コード化領域に相当するマウスＦｕＲＫｃＤＮ断片から各々Ｔ３及びＴ７
を用いて合成した。 PTCH: 503(アンチセンス) 5'GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCAATGGCCTAAACCGACTGC3'（配列番号：２７） 503(センス) 5'CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGACCCACGGCCTCTCCTCACA3'（配列番号：２８） PTCH2: 504(アンチセンス) 5'GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGCCCCTAAACTCCGCTGCTCCAC3'（配列番号：１２） 504(センス) 5'CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGAGCTCCCGTGAGTCCCTATGTG3'（配列番号：１１） ＦｕＲＫセンス及びアンチセンスは、ヒトのアミノ酸残基３１７−４８６コード
化領域に相当するマウスｆｕｓｅｄＤＮＡ断片から各々Ｔ３及びＴ７を用いて合
成した。
【００７４】 Ｆｉｇ６は、Ｐｔｃｈ（配列番号：４）及びＰｔｃｈ-２（配列番号：２）の
両方が精巣で発現されるが、それらの発現パターンは重複しないことを示してい
る。Ｐｔｃｈ（配列番号：４）は間質のライディヒ細胞で発現されるのに対し、
Ｐｔｃｈ-２（配列番号：２）は一次及び二次精母細胞で発現される。 発達中の精母細胞に特異的なＰａｔｃｈｅｄ-２の発現は、Ｐａｔｃｈｅｄ-２
がＤｈｈ（配列番号：１３）の直接の標的であることを示唆している。Ｄｈｈ（
配列番号：１３）はセルトリ細胞で発現され、Ｄｈｈ（配列番号：１３）を欠く
マウスは精子生産の欠損により繁殖不能である［Bitgood等, Curr. Biol. 6: 29
8-304 (1996)］。この胚細胞への効果は間接的であり、ライディヒ細胞上に存在
するＰａｔｃｈｅｄによって媒介されると考えられていたが、我々のデータは、
ＤｈｈがＰａｔｃｈｅｄ-２を介して胚細胞に直接作用することを示唆している
。このことは、ＦｕＲＫ（配列番号：１０）の局在化、ショウジョウバエＦｕｓ
ｅｄに相同な細胞内キナーゼによって更に示され、ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナ
ルの伝達に含まれている。Ｆｉｇ６に示すように、ＦｕＲＫ（配列番号：１０）
は、Ｐｔｃｈ（配列番号：４）とともにライディヒ細胞ではなく、Ｐｔｃｈ-２
（配列番号：２）とともに胚細胞に局在し、ＰａｔｃｈｅｄではなくＰａｔｃｈ
ｅｄ-２がＤｈｈシグナルを伝達できることを示唆している。これらの結果はＰ
ａｔｃｈｅｄ-２がＤｈｈレセプターであることを示唆する。 Ｓｍｏ-Ｍ２（配列番号：１６）トランスジェニックマウス［ＢＣＣに類似す
る自律的フェノタイプをもたらすＳｍｏ変異、Xie等, Nature 391: 90-92 (1998
)］におけるＰｔｃｈ-２ｍＲＮＡレベルは、Ｈｈシグナル伝達経路の異常な活性
化の際に増加しうる。Ｆｉｇ９に示すように、Ｐｔｃｈ-２（配列番号：２）レ
ベルは腫瘍細胞で高い（Ｐｔｃｈ（配列番号：４）レベルよりは低い）。このこ
とは、Ｐｔｃｈ-２（配列番号：２）に対する抗体がＢＣＣの治療に有用である
ことを示唆している。
【００７５】 ５． Ｓｍｏでの免疫沈降： ｍｙｃ-エピトープタグＳｍｏ（配列番号：１５）及びＦＬＡＧ-エピトープタ
グＰａｔｃｈｅｄ又はＰａｔｃｈｅｄ-２発現作成物の一過性形質移入系を用い
て、標準的技術を用いた２９３細胞における同時形質移入により、Ｐａｔｃｈｅ
ｄ-２のＳｍｏ（配列番号：１７）への結合を評価した（Gorman, C., DNA Cloni
ng: A Practical Approach, Clover, DM編, Vol. 11, pp. 143-190, IRL Press,
Washington, D.C.）。形質移入の36時間後、細胞を1%のＮＰ-４０中に溶解し、
９Ｅ１０抗-ｍｙｃ抗体又はＭ２抗-ＦＬＡＧ抗体（IBI-Kodak）、続いてプロテ
インＡセファロースで免疫沈降させ、次に変性6%ポリアクリルアミドゲル上で分
離した。タンパク質を、ニトロセルロースに移してＥＣＬ検出系（Amersham）を
用いてＦｌａｇ又はＭｙｃエピトープに対する抗体でプローブすることにより検
出した。Ｆｉｇ７Ｂは、Ｐｔｃｈ（配列番号：４）又はＰｔｃｈ-２（配列番号
：２）の両方が同レベルで発現され（ＩＰ Ｆｌａｇ、Ｂｌｏｔ Ｆｌａｇ）、Ｐ
ｔｃｈ（配列番号：４）のようにＰｔｃｈ-２（配列番号：２）がＳｍｏ（配列
番号：１７）と物理的複合体を形成することを示している。これらの結果は、Ｐ
ａｔｃｈｅｄと同様に、Ｐａｔｃｈｅｄ-２がそのＳｍｏ（配列番号：１７）と
の相互作用を介してＨｈシグナル伝達を制御することを示唆している。
【００７６】 ６． Ｈｈ結合： Ｐａｔｃｈｅｄ-２が種々のヘッジホッグリガンドに結合するか否かを決定す
るために、２９３細胞を標準的手法を用いてＰｔｃｈ（配列番号：４）又はＰｔ
ｃｈ-２（配列番号：２）で形質移入した。細胞を100pMの１２５Ｉ-Ｓｈｈ（マ
ウスＳｈｈ（配列番号：１４）の19kDアミノ末端断片）とともに、過剰の非標識
のＳｈｈ（配列番号：１４）又はＤｈｈ（配列番号：１３）の存在下又は非存在
下で室温において2時間インキュベートした。平衡に達した後、リガンド結合細
胞を連続スクロース勾配を通して遠心して未取り込み物を分離し、シンチレーシ
ョンカウンターでカウントした。Ｆｉｇ７Ａは、Ｄｈｈ（配列番号：１３）及び
Ｓｈｈ（配列番号：１４）の両方がＰｔｃｈ（配列番号：４）及びＰｔｃｈ-２
（配列番号：２）に結合することを示す。種々の濃度の非放射性競合物は、２つ
のリガンドがＰｔｃｈ（配列番号：４）及びＰｔｃｈ-２（配列番号：２）に対
して類似の親和性を有することを示している。
【００７７】 実施例２：大腸菌におけるｐａｔｃｈｅｄ-２の発現 ヒトｐａｔｃｈｅｄ-２をコードするＤＮＡ配列を、選択したＰＣＲプライマ
ーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素
部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用
いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌から誘導されたもの；
Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)参照）であり、アンピシリン及びテトラサイクリ
ン耐性の遺伝子を含む。ベクターは制限酵素で消化され脱リン酸される。ＰＣＲ
増幅した配列は、次いでベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物
質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ｐｏｌｙｈｉｓリーダー（最初の６つのＳ
ＴＩＩコドン、ｐｏｌｙｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、
脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２コード化領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺
伝子をコードする配列を含む。 ライゲーション混合物は、次いで、Sambrook等, 上掲に記載された方法を用い
る選択した大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレー
トで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。
プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列決定で確認される。 選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培養培地で
終夜成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地への播種に用いら
れる。次に細胞を所望の光学密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作
動する。 数時間以上の細胞培養の後、細胞を採集して遠心分離できる。遠心分離で得ら
れた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化し、次いで
可溶化脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２タンパク質を金属キレート化カラムを用いて
タンパク質を緊密に結合させる条件下で精製した。
【００７８】 実施例３：哺乳動物細胞におけるｐａｔｃｈｅｄ-２の発現 発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（1989年3月15日発行のEP 307,247参照
）を用いた。場合によっては、脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２ＤＮＡを選択した制
限酵素でｐＲＫ５に結合させ、Sambrook等,上掲に記載されたようなライゲーシ
ョン方法を用いて脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２ＤＮＡを挿入させる。得られたベ
クターは、ｐＲＫ５-ｐａｔｃｈｅｄ-２と呼ばれる。 一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト
２９３細胞（ATCC CCL 1573）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及
び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの媒質中で組織培養プレートにおいて
成長させて集密化した。約10μgのｐＲＫ５-ｐａｔｃｈｅｄ-２ＤＮＡを約1μg
のＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Thimmappaya等, Cell, 31:543 (198
2))］と混合し、500μlの1mMトリス-ＨＣｌ、0.1mMのＥＤＴＡ、0.227MのＣａＣ
ｌ２に溶解させた。この混合物に、滴状の、500 μlの50mMのＨＥＰＥＳ（pH7.35）、280mMのＮａＣｌ、1.5mMのＮａＰＯ４を添
加し、25℃で10分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて
37℃で約4時間定着させた。培養培地を吸引し、2mlのＰＢＳ中20%グリセロール
を30分間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添
加し、細胞を約5日間インキュベートした。 形質移入の約24時間後、培養培地を除去し、培養培地（のみ）又は200μCi/ml
の３５Ｓ-システイン及び200μCi/mlの３５Ｓ-メチオニンを含む培養培地で置換
した。12時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルター
で濃縮し、15%ＳＤＳゲル上に負荷した。処理したゲルを乾燥させ、脊椎動物ｐ
ａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルム
に暴露した。形質転換した細胞を含む培地は、さらなるインキュベーションを施
し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
【００７９】 これに換わる技術において、脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２は、Somparyac等, Pr
oc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用い
て２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大
密度まで成長させ、700μgのｐＲＫ５-ｐａｔｃｈｅｄ-２ＤＮＡを添加する。細
胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。
ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で4時間インキュベートした。細
胞を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、5
μg/mlウシインシュリン及び0.1μgmlウシトランスフェリンを含むスピナーフラ
スコに再度導入した。約4日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細
胞片を除去した。次いで発現された脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２を含む試料を濃
縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製
した。 他の実施態様では、脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２をＣＨＯ細胞で発現させるこ
とができる。ｐＳＶｉ-ｐａｔｃｈｅｄ-２は、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ-デキス
トランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記
したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）又は３５Ｓ
-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。脊椎動物ｐａ
ｔｃｈｅｄ-２ポリペプチドの存在を同定した後、培養培地を無血清培地に置換
してもよい。好ましくは、培地を約6日間インキュベートし、次いで条件培地を
収集する。次いで、発現された脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２を含む培地を濃縮し
て、選択した任意の方法によって精製することができる。 また、エピトープタグ脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２を宿主ＣＨＯ細胞において
発現させてもよい。脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２はｐＲＫ５ベクターからサブク
ローニングした。サブクローン挿入物は、次いで、ＰＣＲを施してバキュロウイ
ルス発現ベクター中のｐｏｌｙ-ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持
つ枠に融合できる。ｐｏｌｙ-ｈｉｓタグ脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２挿入物は、
次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４
０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導
ベクターで（上記のように）形質移入した。発現を確認するために、上記のよう
に標識化を行ってもよい。発現されたｐｏｌｙ-ｈｉｓタグ脊椎動物ｐａｔｃｈ
ｅｄ-２を含む培養培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ２＋-キレートアフィニティクロ
マトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
【００８０】 実施例４：酵母菌での脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２の発現 以下の方法は、酵母菌中での脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２の組換え発現を記載
する。 第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからの脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-
２の細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。脊椎動物ｐａ
ｔｃｈｅｄ-２をコードするＤＮＡ、選択されたシグナルペプチド及びプロモー
ターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入して脊椎動物ｐａｔｃｈ
ｅｄ-２の細胞内発現を指示する。分泌のために、脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２を
コードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター
をコードするＤＮＡ、酵母菌アルファ因子分泌シグナル／リーダー配列、及び（
必要ならば）脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２の発現のためのリンカー配列とともに
クローニングすることができる。 酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し
、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、10%トリク
ロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブ
ルー染色でゲルの染色をすることができる。 続いて組換え脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２は、発酵培地から遠心分離により酵
母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃
縮することによって単離及び精製できる。脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２を含む濃
縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよ
い。
【００８１】 実施例５：バキュロウイルス感染昆虫細胞での脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２の発
現 以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中における脊椎動物ｐａｔｃｈ
ｅｄ-２の組換え発現を記載する。 脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２は、バキュロウイルス発現ベクター内に含まれる
エピトープタグの上流ｐａｔｃｈｅｄ-２である。このようなエピトープタグは
、ｐｏｌｙ-ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含
む。ｐＶＬ１３９３（Navogen）などの市販されているプラスミドから誘導され
るプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、脊椎動
物ｐａｔｃｈｅｄ-２又は脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２の所定部分（膜貫通タンパ
ク質の細胞外ドメインをコードする配列など）が、５’及び３’領域に相補的な
プライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、隣接する（選択さ
れた）制限酵素部位を包含していてもよい。生成物は、次いで、選択された制限
酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。 組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGoldＴＭウイルスＤ
ＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL
1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入するこ
とにより作成される。28℃で4-5日インキュベートした後、放出されたウイルス
を回収し、さらなる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reil
ley等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxfo
rd University Press (1994)に記載されているように実施した。
【００８２】 次いで、発現されたｐｏｌｙ-ｈｉｓタグ脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２は、例え
ば、Ｎｉ２＋-キレートアフィニティクロマトグラフィーにより以下のように精
製される。抽出物は、Rupert等, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されている
ように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９
細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（25mLのＨｅｐｅｓ、pH7.9；12.5mMの
ＭｇＣｌ２；0.1mMのＥＤＴＡ；10%のグリセロール；0.1%のＮＰ-４０；0.4Mの
ＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で2回20秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心
分離で透明化し、上清を負荷バッファー（50mMのリン酸塩、300mMのＮａＣｌ、1
0%のグリセロール、pH7.8）で50倍希釈し、0.45μmフィルターで濾過した。Ｎｉ ２＋ -ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を5mlの総容積で調製し、25mL
の水で洗浄し、25mLの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎
分0.5mLでカラムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０の
ベースラインまで負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質
を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（50mMのリン酸塩；300mmのＮａＣｌ
、10%のグリセロール、pH6.0）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達
した後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mmのイミダゾール勾配で展開
した。1mLの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファ
ターゼ（Qiagen）に複合したＮｉ２＋-ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析し
た。溶離したＨｉｓ１０−タグ脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２を含む分画をプール
し、負荷バッファーで透析した。 あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２の精製は
、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知
のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【００８３】 実施例６：脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２に結合する抗体の調製 この実施例は、脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２に特異的に結合できるモノクロー
ナル抗体の調製を例示する。 モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば
、Goding,上掲に記載されている。用いられ得る免疫原は、精製脊椎動物ｐａｔ
ｃｈｅｄ-２、脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２を含む融合タンパク質、細胞表面に組
換え脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２を発現する細胞を含む。免疫原の選択は当業者
が過度の実験をすることなくなすことができる。 Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は
腹腔内に1-100マイクログラムで動物注入する脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２免疫原
（例えば、細胞外部分又はｐｔｃｈ-２を発現した細胞）で免疫化する。あるい
は、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, Ham
ilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、
次いで10から12日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加
免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。脊椎
動物ｐａｔｃｈｅｄ-２抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するため
に、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい
。
【００８４】 適当な抗体力価が検出された後、抗体に「陽性」な動物に、脊椎動物ｐａｔｃ
ｈｅｄ-２静脈内注射の最後の注入をすることができる。3から4日後、マウスを
屠殺して脾臓を取り出した。次いで脾臓細胞を（35%ポリエチレングリコールを
用いて）、ＡＣＴＴから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１
等の選択されたマウス骨髄細胞系に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞
が生成され、次いで、それをＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチ
ミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非ｐａｔｃｈｅｄ-２
細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。 ハイブリドーマ細胞は、脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２に対する反応性について
ＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。所望の脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２に対す
るモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常
識の範囲内である。 陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗-脊
椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２モノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるい
は、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させる
こともできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニ
ウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。
あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニテ
ィクロマトグラフィーを用いることもできる。
【００８５】 実施例７ Ｇｌｉルシフェラーゼアッセイ 以下のアッセイは、ショウジョウバエキュービタツインターラプタス(Drospph
ia cubitus interruptus（Ｃｉ）の哺乳類相同体である転写因子ＧＬＩの活性化
を測定するために使用してよい。ＧＬＩが細胞のＳｈｈ刺激に際して活性化され
た転写因子であることが示された。 ＮＨＦ３βエンハンサーに存在するＧＬＩ結合部位の９つのコピー（Sasaki等
, Development 124: 1313-1322 (1997））を、ｐＧＬ３プラスミド（Promega）
のルシフェラーゼリポーター遺伝子を制御するチミジンキナーゼ最小プロモータ
ーの前に導入した。ＧＬＩ結合配列は：TCGACAAGCAGGGAACACCCAAGTAGAAGCTC（ｐ
９ＸＧｌｉＬｕｃ）（配列番号：３１）であり、ネガティブ対照配列は：TCGACA
AGCAGGGAAGTGGGAAGTAGAAGCTC（ｐ９ＸｍＧｌｉＬｕｃ）（配列番号：３２）であ
った。これらの作成物を、Ｆ１２、ＤＭＥＭ（50:50）、10%の熱不活性化ＦＣＳ
中で成長させたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞中で全長Ｐｔｃｈ-２及びＳｍｏととも
に同時形質移入した。形質移入の前日に、ウェル当たり1x10５細胞を6ウェルプ
レートに2ml培地中で播種した。次の日に、1μgの各作成物を、0.025mgのｐｔｋ
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼプラスミドで、100μlのＯｐｔｉＭｅｍ（GlutaM
axを含む）中のリポフェクタミン（Gibco-BRL）を用い、製造者の指示に従って3
7℃で3時間再度同時形質移入した。次いで血清（20%、1ml）を各ウェルに添加し
、細胞を37℃でさらに3時間インキュベートした。次いで細胞をＰＢＳで2回洗浄
し、次に37℃で48時間2mlの培地中でインキュベートした。次いで各ウェルをＰ
ＢＳで洗浄し、細胞を0.5mlの受動的溶解バッファー（Promega）で15分間室温で
振盪装置上で溶解させた。溶解物を氷上のエッペンドルフ管に移し、冷却遠心機
で30秒間スピンし、上清を氷上で保存した。各測定について、20μlの細胞溶解
物をポリプロピレン管内の100μlのＬＡＲＩＩ（ルシフェラーゼアッセイ試薬、
Promega）に添加し、ルシフェラーゼ光活性を測定した。停止及びグローバッフ
ァー（Promega）の添加により反応を停止し、3から5回ピペット上下することに
より混合し、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ光活性を照度計で測定した。
【００８６】 材料の寄託 次の細胞系をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, １２３０１
パークローンドライブ、ロックビル、メリーランド、米国(12301 Parklawn Driv
e, Rockville, MD, USA)(ＡＴＣＣ)に寄託した： 材料 ATCC寄託番号 寄託日 pRK7.hptc2.Flag-1405 209778 1998年4月14日 この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条
約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付
から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。
寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の
合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうと
も、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄
託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法
第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３
７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定し
た者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
【００８７】 本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に
死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座
に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる
政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスである
とみなされるものではない。 上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十
分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として
意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため
、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの
物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本
発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものでは
ないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈される
ものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変す
ることは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の
範囲内に入るものである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【Ｆｉｇ１】 ヒトｐｔｃｈ-２の天然配列の核酸配列（配列番号：１）及
び誘導アミノ酸配列（配列番号：２）を示す図である。
【Ｆｉｇ２】 ヒトＰｔｃｈ（配列番号：１８）とのアラインメントにおけ
いて２ＡはＥＳＴ９０５５３１（配列番号：３）を示し、２ＢはＥＳＴ１３２６
２５８（配列番号：５）を示す。これらのＥＳＴは、ヒト全長Ｐｔｃｈ-２（配
列番号：１）のクローン化に用いられた。
【Ｆｉｇ３】 ヒトＰｔｃｈ（配列番号：４）とｐｔｃｈ-２（配列番号：
２）の間の比較を示す図である。最適なアラインメントのために導入されたギャ
ップはダッシュで示した。同一のアミノ酸はボックスで囲んだ。１２の膜貫通ド
メインを灰色のボックスで示し、それら全ては２つの配列間で保持されている。
２つの配列間のアラインメントの結果は５３％の同一性を示している。最も有意
な相違は、ヒトＰｔｃｈ（配列番号：４）と比較してより短いヒトｐｔｃｈ-２
（配列番号：２）のＣ-末端細胞内ドメインである。
【Ｆｉｇ４】 ｐａｔｃｈｅｄ-２（配列番号：２）のノーザンブロット分
析を示す図であり、発現が精巣に限定されていることを示している。複数のヒト
胎児及び成人組織ノーザンブロットは、マウスＰｔｃｈ-２の３’-非翻訳領域に
対応する断片でプローブされた。
【Ｆｉｇ５】 ヒトｐａｔｃｈｅｄ-２誘導プローブでのＰＣＲスクリーニ
ングによって単離した２つのＢＡＣクローンの染色体局在化を示す図である。両
方のプローブは、ＦＩＳＨによりヒト染色体１ｐ３３−３４にマッピングされた
。
【Ｆｉｇ６】 Ｐｔｃｈ（配列番号：４）、ｐｔｃｈ-２（配列番号：２）
及びＦｕｓｅｄ（ＦｕＲＫ）（配列番号：１０）発現を比較するインサイツハイ
ブリッド形成を示す。（ａ）Ｐｔｃｈ、Ｐｔｃｈ-２（配列番号：２）（ｂ）、
及びＦｕＲＫ（配列番号：１０）（ｃ）の発現を示す高倍率のマウス精巣。各々
、Ｐｔｃｈ-２センス（配列番号：１１）（ｄ）及びアンチセンスプローブ（配
列番号：１２）（ｅ）でハイブリッド形成した低倍率の精巣断面。 Ｆｉｇ６（ｆ）は、ＦｕＲＫ（配列番号：１０コード化核酸）でハイブリッド形
成した低倍率の精巣断面を示す。スケール・バー：ａ，ｂ，ｃ：０．０５ｍｍ；
ｄ，ｅ，ｆ：０．３３ｍｍ。
【Ｆｉｇ７Ａ】 Ｐｔｃｈ-２（配列番号：２）のＤｈｈ（配列番号：１３
）及びＳｈｈ（配列番号：１４）への結合を比較する対数プロットである。組換
えマウス１２５Ｉ-Ｓｈｈの、Ｐｔｃｈ（配列番号：４）又はＰｔｃｈ-２（配列
番号：２）を過剰発現する２９３細胞への競合的結合。ｍｏｃｋ形質移入細胞へ
の検出可能な結合は無かった（データは示さず）。
【Ｆｉｇ７Ｂ】 エピトープタグＰｔｃｈ（配列番号：４）又はＰｔｃｈ-
２（配列番号：２）とエピトープタグＳｍｏ（配列番号：１５）との同時免疫沈
降を示すウェスタンブロットである。免疫沈降はＦｌａｇタグＰｔｃｈ（配列番
号：４）に対する抗体で実施し、ＭｙｃタグＳｍｏ（配列番号：１５）に対する
抗体を含む６％アクリルアミドゲル上で分析した。タンパク質複合体はＰｔｃｈ
（配列番号：４）及びＰｔｃｈ-２（配列番号：２）の両方で検出され、Ｓｍｏ
（配列番号：１５）Ｐｔｃｈ（配列番号：４）及びＰｔｃｈ-２（配列番号：２
）は、Ｆｌａｇタグに対する抗体を用いた免疫沈降及び同じ抗-Ｆｌａｇ抗体を
用いたウェスタンブロットによって示されたように類似のレベルで発現する。
【Ｆｉｇ８】 ヒトＰｔｃｈ-２（配列番号：２）及びマウスＰｔｃｈ-２（
配列番号：７）の間の配列比較を示す図であり、２つの配列の間に約９１％の同
一性があることを示している。
【Ｆｉｇ９】 ＳＭＯ-Ｍ２（配列番号：１６）を過剰発現するＥ１８トラ
ンスジェニックマウスの基底細胞におけるインサイツハイブリッド形成で検出さ
れたＰｔｃｈ（配列番号：４）及びＰｔｃｈ-２（配列番号：２）ｍＲＮＡの蓄
積を示すインサイツハイブリッド形成を示す（Xie等, Nature 391: 90-92 (1998
)）。
【Ｆｉｇ１０】 胎児脳ライブラリから最初に単離された部分的ｐａｔｃｈ
ｅｄ-２断片であるクローン３（配列番号：８）を示す部分配列である。
【Ｆｉｇ１１】 精巣ライブラリから単離された部分的ｐａｔｃｈｅｄ-２
断片であるクローン１６．１（配列番号：９）を示す部分配列である。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年４月７日（２０００．４．７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ ４Ｈ０４５ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/68 33/50 (Ｃ１２Ｐ 21/02 33/68 Ｃ１２Ｒ 1:645） //(Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (71)出願人 460 Ｐｏｉｎｔ Ｓａｎ Ｂｒｕｎｏ Ｂｌｖｄ．，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａ ｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ 94080 ＵＳＡ (72)発明者 カーペンター， デービッド エー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94122， サン フランシスコ， トゥウェンティ ーセカンド アベニュー 1582 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA34 AA35 AA40 BB20 CB01 CB21 DA36 FB02 4B024 AA01 AA11 BA63 BA80 CA04 CA07 CA09 CA20 DA03 DA06 DA12 EA02 EA04 FA02 FA18 GA11 GA19 GA27 HA03 HA13 HA14 4B063 QA05 QA19 QA20 QQ02 QQ08 QQ21 QQ41 QQ61 QR48 QR77 QR80 QX10 4B064 AG20 CA02 CA06 CA10 CA19 CC01 CC24 CE02 CE03 CE06 CE12 DA01 DA13 4B065 AA26X AA80X AA90X AA93X AA93Y AB01 AC14 AC15 AC16 BA02 BA25 BC01 BD01 BD14 BD15 BD17 BD50 CA24 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA50 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74 GA01 GA05 GA10 GA15 GA26

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）Ｆｉｇ１（配列番号：２）のアミノ酸１〜約１２０３
    の配列を含む脊髄動物ｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子
    、又は（ｂ）（ａ）の補体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、ｐａ
    ｔｃｈｅｄ-２の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含ん
    でなる単離された核酸。
  2. 【請求項２】 （ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０９７７８（記号：ｐＲＫ７.ｈ
    ｐｔｃ２.Ｆｌａｇ-１４０５）のｃＤＮＡによってコードされるのと同じ成熟ポ
    リペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対
    して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸
    。
  3. 【請求項３】 ＡＴＣＣ寄託番号２０９７７８（記号：ｐＲＫ７.ｈｐｔｃ
    ２.Ｆｌａｇ-１４０５）のｃＤＮＡの配列をコードするヒトｐａｔｃｈｅｄ-２
    、又はそれに緊縮条件下でハイブリダイズする配列を含んでなる請求項２に記載
    の単離された核酸。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載の核酸を含むベクター。
  5. 【請求項５】 当該ベクターで形質転換された宿主細胞に認識されるコント
    ロール配列に作用可能に結合した請求項４に記載のベクター。
  6. 【請求項６】 請求項４に記載のベクターで形質変換された宿主細胞。
  7. 【請求項７】 哺乳動物である請求項６に記載の宿主細胞。
  8. 【請求項８】 前記細胞がＣＨＯ細胞である請求項７に記載の宿主細胞。
  9. 【請求項９】 原核生物である請求項６に記載の宿主細胞。
  10. 【請求項１０】 前記細胞が大腸菌細胞である請求項９に記載の宿主細胞。
  11. 【請求項１１】 前記細胞が酵母菌細胞である請求項７に記載の宿主細胞。
  12. 【請求項１２】 サッカロミセスセレヴィシアエである請求項１１に記載の
    宿主細胞。
  13. 【請求項１３】 請求項９に記載の宿主細胞を、脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-
    ２の発現に適した条件下で培養し、細胞培地からｐａｔｃｈｅｄ-２を回収する
    ことを含んでなるｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチドの製造方法。
  14. 【請求項１４】 Ｆｉｇ１（配列番号：２）のアミノ酸残基１〜１２０３を
    含んでなる単離された天然配列ヒトｐａｔｃｈｅｄ-２ポリペプチド。
  15. 【請求項１５】 ＡＴＣＣ登録番号２０９７７８（記号：ｐＲＫ７.ｈｐｔ
    ｃ２.Ｆｌａｇ-１４０５）の下で寄託されたｐａｔｃｈｅｄ-２生物学的活性を
    有するヌクレオチドにコードされる単離された天然配列ヒトｐａｔｃｈｅｄ-２
    ポリペプチド。
  16. 【請求項１６】 異種アミノ酸配列に融合した脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２
    ポリペプチドＰａｔｃｈｅｄ-２を含んでなるキメラ分子。
  17. 【請求項１７】 前記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項
    １６に記載のキメラ分子。
  18. 【請求項１８】 前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンの定常領域である
    請求項１７に記載のキメラ分子。
  19. 【請求項１９】 Ｄｈｈシグナル伝達経路におけるＤｈｈの機能を阻止、防
    止、阻害及び／又は中和する脊椎動物ｐａｔｃｈｅｄ-２のアンタゴニスト。
  20. 【請求項２０】 生物有機化学的小分子である請求項１９に記載のアンタゴ
    ニスト。
  21. 【請求項２１】 アンチセンスヌクレオチドである請求項１９に記載のアン
    タゴニスト。
  22. 【請求項２２】 Ｄｈｈシグナル伝達経路においてｐａｔｃｈｅｄ-２の正
    常な機能発現を刺激又は促進するｐａｔｃｈｅｄ-２のアゴニスト。
  23. 【請求項２３】 ｐｔｃｈ-２（配列番号：２）のＳｍｏ（配列番号：１７
    ）活性化を防止する請求項２２に記載のアゴニスト。
  24. 【請求項２４】 生物有機化学的小分子である請求項２２に記載のアゴニス
    ト。
  25. 【請求項２５】 生物有機化学的小分子である請求項２４に記載のアゴニス
    ト。
  26. 【請求項２６】 ｐａｔｃｈｅｄ-２生物学的活性のアンタゴニスト又はア
    ゴニストのためのスクリーニング方法において、 （ａ）培地中でｐａｔｃｈｅｄ-２発現標的細胞を候補化合物及びＤｈｈに暴
    露し、そして （ｂ）細胞をＤｈｈのｐａｔｃｈｅｄ-２への結合について分析するか、又は （ｃ）処理した細胞のフェノタイプ又は機能変化を評点化し、 そして、当該結果を候補化合物に暴露していない対照細胞と比較することを含ん
    でなる方法。
  27. 【請求項２７】 ｐａｔｃｈｅｄ-２生物学的活性のアンタゴニスト又はア
    ゴニスト分子のためのスクリーニング方法において、 （ａ）ｐａｔｃｈｅｄ-２リガンド及びｐａｔｃｈｅｄ-２生物学的活性を有す
    る化合物を候補アンタゴニスト又はアゴニストに暴露し、そして （ｂ）基質をリガンドの化合物への結合について分析し、そして、 当該結果を候補分子に暴露していない対照反応と比較することを含んでなる方法
    。
  28. 【請求項２８】 特定の疾患がＤｈｈシグナル伝達によって変調されるか否
    かを決定する診断方法において、 （ａ）試験細胞又は組織を培養し、 （ｂ）ｐａｔｃｈｅｄ-２変調Ｄｈｈシグナル伝達を阻害できる化合物を投与
    し、そして、 （ｃ）試験細胞におけるｐａｔｃｈｅｄ-２へのＤｈｈ結合又はＤｈｈ変調フ
    ェノタイプ効果を分析することを含んでなる方法。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE9803393D0 (sv) * 1998-10-06 1998-10-06 Karolinska Innovations Ab A novel component in the hedgehog signalling pathway
GB9908798D0 (en) * 1999-04-16 1999-06-09 Pharmacia & Upjohn Spa Human homologues of fused gene
US6903073B2 (en) * 1999-12-10 2005-06-07 The General Hospital Corporation Methods to stimulate insulin production by pancreatic beta-cells
SE0000345D0 (sv) * 2000-02-03 2000-02-03 Karolinska Innovations Ab New matter
EP1229046A3 (en) * 2001-01-30 2004-02-25 Aeomica, Inc. Human testis expressed patched like protein

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002526050A (ja) * 1998-10-06 2002-08-20 カロリンスカ イノヴェーション アーベー ヘッジホッグ送信パスウェイにおける新規な構成要素

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
WO1995018856A1 (en) 1993-12-30 1995-07-13 President And Fellows Of Harvard College Vertebrate embryonic pattern-inducing hedgehog-like proteins
US6027882A (en) 1994-10-07 2000-02-22 The Regents Of The University Of California Patched genes and their use for diagnostics
ES2245454T3 (es) 1994-10-07 2006-01-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Genes patched y su utilizacion.
EP0879888A3 (en) 1997-05-23 1999-07-14 Smithkline Beecham Plc Patched-2 polypeptides and polynucleotides and methods for their production
US6309879B1 (en) 1997-12-08 2001-10-30 Curis, Inc. Human patched genes and proteins, and uses related thereto
US6022708A (en) 1998-02-26 2000-02-08 Genentech, Inc. Fused

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002526050A (ja) * 1998-10-06 2002-08-20 カロリンスカ イノヴェーション アーベー ヘッジホッグ送信パスウェイにおける新規な構成要素

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6009017142, Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ, 199802, Ｖｏｌ．１８, ｐ．１０４−１０６ *
JPN6009017143, ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．, 1997, Ｖｏｌ．４１０, ｐ．４８５−４８９ *
JPN6009017145, Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ, 1996, Ｖｏｌ．１２２, ｐ．２８３５−２８４６ *

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