JP2002511239A - スクリーニングのための調節された標的発現 - Google Patents

スクリーニングのための調節された標的発現

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JP2002511239A
JP2002511239A JP2000543482A JP2000543482A JP2002511239A JP 2002511239 A JP2002511239 A JP 2002511239A JP 2000543482 A JP2000543482 A JP 2000543482A JP 2000543482 A JP2000543482 A JP 2000543482A JP 2002511239 A JP2002511239 A JP 2002511239A
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デニス ヤング，
カーステン ローズナウ，
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Abstract

(57)【要約】 潜在的治療活性について化合物をスクリーニングするため、および薬物標的を同定するための方法および化合物が提供される。この方法は、必須の細胞遺伝子の制御された発現（過小発現または過剰発現のいずれか）に依存し、そして、この発現は、１つの実施態様においては、遺伝子への異種調節エレメントの融合によって達成され得る。この方法は、標的機能について何ら知識がない場合でも、薬物標的を同定し得る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願の相互参照） 本出願は、以下の米国仮特許出願：１９９８年４月１４日に出願された米国仮
特許出願６０／０９８，５６３号；１９９８年４月２４日に出願された同第６０
／０８２，９５２号；１９９８年７月１０日に出願された同第６０／１００，４
３０号；１９９８年１０月２３日に出願された同第６０／１０５，４４１号；１
９９８年１０月２３日に出願された同第６０／１０５，４４７号；１９９９年１
月２９日に出願された同第６０／１１７，７５８号；および１９９９年１月２９
日に出願された同第６０／１１７，９５５号に対して、米国特許法第１１９条（
ｅ）項に基づいて、優先権を主張する。これらの出願の全ての開示は、その全体
が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】 （技術分野） 本発明は、薬物スクリーニングおよび薬物発見の分野にある。より詳細には、
微生物遺伝学の技術を利用して、標的を同定し、そして候補治療剤をスクリーニ
ングするための方法および組成物を提供する。
【０００３】 （背景） 新規な治療剤（例えば、抗生物質）の発見のための多くの方法が存在する。無
細胞の、標的ベースのアッセイは、しばしば、潜在的な標的インヒビターを同定
するが、この様式で同定されたインヒビターは、しばしば、完全な細胞に対して
全く活性を示さないか、またはごくわずかしか活性を示さない。例えば、Ｉｓａ
ａｃｓｏｎ（１９９４）Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ ３
：８３−９１；Ｊ．ＳｕｔｃｌｉｆｆｅおよびＮ．Ｇｅｏｒｇｏｐａｐａｄａｋ
ｏｕ（編）Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉ
ａｌ ａｎｄ Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｐｍａｎお
よびＨａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９９２を参照のこと。完全細胞法（ｗｈｏｌｅ
−ｃｅｌｌ ｍｅｔｈｏｄ）は、伝統的には、野生型株の病原体に対する化合物
をスクリーニングする工程および病原体の生存性に対してネガティブな効果を有
する化合物を候補として選択する工程を包含した。これらの条件下では、候補物
として選択された化合物は、野生型レベルで発現される標的と一般に相互作用す
る。この型のアッセイの能力は、作用機構に対する情報が提供されないために制
限されている。この情報は、候補物の選択のためには重要である。薬物標的の同
定および標的機能の決定は、コストが高く、かつ時間のかかるプロセスである。
これらの問題のいくつかを克服するための１つのアプローチは、特定の薬剤に感
受性過剰である変異体を単離すること、およびこれを使用して類似の特性および
／または作用機構を有する新たな薬剤をスクリーニングすることである。さらに
、感受性過剰株に対して活性を有する化合物は、しばしば、最小限の改変を伴っ
て、野生型株に対して強い活性を有する薬剤に変換され得る。このような感受性
過剰変異体は、一般に、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジンのような薬剤での標準的な化学的変異誘発後に得られる。例えば、Ｋｉｔ
ａｎｏら（１９７７）Ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎ
ｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，第ＸＸＸ巻、増補、第Ｓ２３９−Ｓ２４５頁；Ｎｕｍａｔ
ａら（１９８６）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、第
ＸＸＸＩＸ巻、第９９４−１０００頁；およびＫａｍｏｇａｓｈｉｒａら（１９
８８）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、第ＸＩＩ巻、
第８０３−８０６頁を参照のこと。
【０００４】 クローニングされた遺伝子の調節された発現のための系が記載された。これら
としては、以下のプロモーターが挙げられる：ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｔａｃ
、ｔｒｃ、λＰL、λＰR、ｔｅｔＡ、ｒｅｃＡ、ｐｈｏＡ、ｍａｌＸ、ｍａｌＭ
（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ｘｙｌ（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）およびＴ７。
例えば、以下を参照のこと：
【０００５】
【表１３】
【０００６】 一般的総説については、以下を参照のこと：
【０００７】
【表１４】
【０００８】 上記の系の大部分は、１つ以上のクローニングされた遺伝子を過剰発現し得る。
これらの系は、しばしば、中程度から高程度の基底発現レベルを示す。これを超
える過剰発現は、環境条件の操作および／または誘導分子の供給によって誘導さ
れ得る。アラビノースオペロンのＰBADプロモーターと異種遺伝子との間の融合
は、異種遺伝子の過剰発現のために使用された。米国特許第５，０２８，５３０
号を参照のこと。しかし、他の系とは対照的に、ＰBADプロモーターは、非常に
低い基底レベルの発現を提供するように、非常に強固に調節され得る。例えば、
Ｇｕｚｍａｎら（１９９５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７７：４１２１
−４１３０を参照のこと。ａｒａ調節エレメントの制御下に必須遺伝子を配置す
ることによって生成されたアラビノース依存性株の構築が記載される。例えば、
Ｂｒｏｗｎら（１９９５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：４１９４−４１９
７；Ｄａｌｂｅｙら（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１５９２５
−１５９３１；およびＧｕｚｍａｎら、前出を参照のこと。
【０００９】 標的遺伝子産物の過剰発現によってインヒビターに対する耐性の獲得が生じる
薬物スクリーニングのための系が記載され、このことによって、インヒビターの
潜在的標的として遺伝子産物が同定される。例えば、ｄｅｌ Ｃａｓｔｉｌｌｏ
ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８８６
０−８８６４を参照のこと。特定の酵素のインヒビターについてのスクリーニン
グは、酵素を欠損する株に対する試験化合物の効果を、異なる変異を有する株に
対する試験化合物の効果と比較することによって達成された。例えば、ＥＰ６４
４２６８を参照のこと。他のスクリーニング系が開発され、この系は、変異タン
パク質（例えば、温度感受性タンパク質）を発現する株を生成することおよび試
験化合物に対してそれらの感受性を評価することに依存する。例えば、ＰＣＴ公
開ＷＯ９６／２３０７５を参照のこと。
【００１０】 従って、低い基底発現レベルを有する高度に誘導性の調節系は、必須遺伝子お
よび微生物における必須遺伝子のインヒビターの同定のために非常に有用である
。
【００１１】 （発明の開示） 本発明の１つの目的は、インヒビターの作用機構および／またはインヒビター
の標的機能が既知であるか否かにかかわらず、生物の増殖または生存可能性を阻
害する化合物を同定するための方法および組成物を提供することである。本発明
の別の目的は、インヒビターに対して感受性過度である細胞を用いる、化合物を
スクリーニングするための組成物および方法を提供することである。本発明のさ
らなる目的は、分子遺伝学および組換えＤＮＡの技術、特に標的遺伝子の調節さ
れた発現（過小発現、正常なレベルでの発現、および過剰発現を含む）を可能に
する技術を利用する、既知のインヒビターに対して感受性過度である細胞を生成
するための方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、微生物の必須
遺伝子および遺伝子産物、ならびにビルレンスおよび薬物耐性に関与する遺伝子
および遺伝子産物を同定するための組成物および方法を提供することである。本
発明のなお別の目的は、インヒビターの作用機構を決定するための方法および組
成物を提供することである。本発明のさらなる目的は、制御された遺伝子発現の
ための方法および組成物を提供することである。さらなる目的は、特定の標的遺
伝子の発現が、細胞において正常に存在するレベルより低いレベルおよびより高
いレベルの両方に調節されるのを可能にする方法および組成物を提供することで
ある。
【００１２】 従って、本発明の１つの局面は、必須の機能に関与する遺伝子産物の発現が調
節され得る細胞を提供する。詳細には、本発明は、野生型レベル未満で遺伝子産
物を発現するように遺伝子の発現がダウンレギュレートされ得る細胞、ならびに
遺伝子発現が、野生型より高いレベルにアップレギュレートされ得る細胞を提供
する。いくつかの場合において、正常より低いレベルでの遺伝子産物の発現は、
実際にそれ自体で、その遺伝子産物を必須であると規定する増殖の欠陥または非
存在を生じる。他の場合において、所定の遺伝子産物の特定のレベルの発現が必
須である環境条件（例えば、温度、ｐＨ、栄養供給源、イオン強度、他の生物の
存在、感染、および／または化合物の存在）が決定され得る。
【００１３】 １つの局面において、本発明の方法および組成物は、細胞中の任意の遺伝子の
発現が、外部刺激（例えば、栄養濃度）によって独立して調節されるのを可能に
する。次いで、特定の遺伝子産物のレベルが増殖または他の重要な細胞機能（例
えば、病因または抗生物質に対する耐性）についての制限になる点にまで、その
発現がダウンレギュレートされ得る遺伝子が同定され得る。一旦そのような遺伝
子が同定されると、制限的であるレベルと任意のより高い発現レベルとの間の任
意のレベルでその遺伝子を発現する細胞は、試験化合物でチャレンジされ得る。
より低いレベルの遺伝子産物を発現する細胞に対してより高い効力（ｐｏｔｅｎ
ｃｙ）を示す化合物は、候補インヒビターである。この方法は、単に特定の遺伝
子産物のレベルを調節することに依存するので、調節されている遺伝子産物の機
能を予め知ることは必要とされず、また、インヒビターの作用機構を知ることも
必要ないことが理解され得る。従って、標的機能の知識は、本発明の実施におけ
るインヒビターの同定に必要ではない。
【００１４】 別の局面において、本発明は、必須の細胞プロセスに関与する遺伝子産物の発
現が、正常よりも低いレベルに調節される細胞を試験化合物に曝露することによ
る、必須の細胞プロセスに影響を及ぼす化合物の同定のための方法および組成物
を提供する。
【００１５】 なお別の局面において、本発明は、必須の細胞プロセスに関与する遺伝子産物
の発現が、正常より低いレベルに調節される細胞を試験化合物に曝露することに
よる、インヒビターの標的および作用機構を決定するための方法および組成物を
提供する。
【００１６】 なお別の局面において、本発明は、必須の細胞プロセスに関与する種々の遺伝
子産物の発現が、正常より低いレベルに調節される細胞のライブラリーを試験化
合物に曝露することによる、インヒビターの標的および作用機構を決定するため
の方法および組成物を提供する。
【００１７】 さらなる局面において、本発明の実施は、以下の同定を可能にする：薬物標的
をコードする遺伝子、必須の細胞機能をコードする遺伝子、ビルレンス因子をコ
ードする遺伝子、抗生物質耐性因子をコードする遺伝子、薬物標的またはビルレ
ンス因子として作用するポリペプチドまたはそのフラグメント；必須の細胞機能
または抗生物質耐性に関与するポリペプチドまたはそのフラグメント；薬物標的
またはビルレンス因子として作用するＲＮＡ、および必須の細胞機能または抗生
物質耐性に関与するＲＮＡ。
【００１８】 必須の細胞プロセスに関与する遺伝子産物の発現が正常より低いレベルに調節
される細胞は、微生物遺伝学および分子生物学の技術を通じて入手され得る。例
えば、必須遺伝子への異種調節エレメントの融合は、その遺伝子を、その異種調
節エレメントの制御下に置く。この異種調節エレメントは、必須遺伝子の正常な
調節系より低い発現レベルを本質的に提供し得るか、またはこの異種調節エレメ
ントは、ダウンレギュレートされ得る。いずれかの場合において、正常より低い
レベルでのこの必須遺伝子の発現が可能である。
【００１９】 本発明はまた、調節された遺伝子発現のための方法および組成物を提供し、こ
れによって発現は、過小発現〜正常な発現レベル〜過剰発現の範囲に及ぶ範囲の
レベルにわたって制御される。例示的な組成物は、調節可能プロモーター、エン
ハンサー、オペレーター、ならびに他の転写制御エレメントおよび／または翻訳
制御エレメントを含む。例示的な方法は、調節可能プロモーター、エンハンサー
、オペレーター、ならびに他の転写制御エレメントおよび／または翻訳制御エレ
メントを、遺伝子またはコード配列と作動可能な連結に配置すること、ならびに
そのような構築物の細胞における発現のための方法を含み、ここで発現は、イン
デューサーおよび／またはリプレッサーによって調節される。
【００２０】 微生物における遺伝子の調節された発現のための方法および組成物もまた提供
される：ここで、この方法は、調節エレメント（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＰBAD
プロモーターまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＰAGAプロモーター）と作動可
能に連結された遺伝子またはそのフラグメントを含む構築物を利用する。この方
法は、宿主細胞にこの構築物を導入すること、この宿主細胞を増殖培地で培養す
ること、ならびにこの増殖培地において１つ以上のモジュレーター物質の濃度を
調整することを含む。モジュレーター物質は、この構築物中に存在するｒａｆ調
節エレメントのインデューサーおよび／またはネガティブモジュレーター（すな
わち、リプレッサー）であり得る。
【００２１】 別の実施態様において、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｒａｆ調節領域の成分と
作動可能に連結された構築物（遺伝子またはそのフラグメントを含む）を作製す
るための組成物および方法が提供される。そのような構築物は、染色体または染
色体外であり得る。
【００２２】 従って、本発明は、薬物スクリーニング、標的同定、抗生物質の作用機構の決
定、ビルレンスおよび抗生物質耐性の機構の決定のため、ならびに当業者に明ら
かであるような他の目的のために有用である。
【００２３】 （発明を実施するための態様） 本発明の実施には、他に示されなければ、有機化学、生化学、分子生物学、微
生物学、遺伝学、組換えＤＮＡ、および関連分野における、当業者の範囲内であ
るような従来技術が用いられる。これらの技術は、文献に十分に説明されている
。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、ＭＯＬ
ＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、
（１９８２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍ
ＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡ
Ｌ、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯ
ＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ（１９８７、１９８８、１９８９、１９９０、１９９１、１９９２、
１９９３、１９９４、１９９５、１９９６）；Ｓｉｌｈａｖｙら、ＥＸＰＥＲＩ
ＭＥＮＴＳ ＷＩＴＨ ＧＥＮＥ ＦＵＳＩＯＮＳ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８４）；Ｇｅｒｈａｒ
ｄｔら、ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＧＥＮＥＲＡＬ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡ
Ｒ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、１９９４；Ｌｏ
ｒｉａｎ、ＡＮＴＩＢＩＯＴＩＣＳ ＩＮ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＥＤＩＣ
ＩＮＥ、第４版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ
、１９９６；およびＭｕｒｒａｙら、ＭＡＮＵＡＬ ＯＦ ＣＬＩＮＩＣＡＬ
ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、第６版、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏ
ｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、１９９５を
参照のこと。
【００２４】 本明細書中で引用されている全ての特許、特許出願、および刊行物は、その全
体が参考として援用される。
【００２５】 本発明は、必須の細胞プロセスに影響する化合物、耐性機構に干渉する化合物
、およびビルレンス因子に干渉する化合物の同定；必須の細胞プロセス、耐性機
構、またはビルレンス因子に影響する化合物の標的の同定；必須の細胞プロセス
、耐性機構、またはビルレンス因子に影響する化合物の標的をコードする遺伝子
の同定；必須の細胞プロセス、耐性機構、またはビルレンスに関与する遺伝子、
ＲＮＡ、およびポリペプチドの同定のために有用な方法および組成物を提供する
。同定は、必須の細胞プロセスに関与する遺伝子の制御された発現によって容易
にされる。遺伝子またはその産物の機能の知識は、それが必須の細胞プロセスに
関与するものとして同定するため、または遺伝子産物に影響する化合物を同定す
るためのいずれかのために、必要とされない。
【００２６】 （細胞型） １つの実施態様では、本発明は、微生物に対する活性を有する化合物の同定に
用いられる。従って、本発明により具体化される組成物は、微生物の必須遺伝子
の発現が、異種調節エレメントへの融合によって調節される微生物を含む。同様
に、その発現が異種調節エレメントによって調節される標的遺伝子およびポリペ
プチドは、しばしば、微生物の生存に必須であるか、またはそのビルレンスもし
くは薬物耐性を担うものであり得る。
【００２７】 微生物は、原核生物または真核生物のいずれかであり得る；そして原核生物は
、グラム陽性またはグラム陰性のいずれかであり得る。例示の原核生物は、以下
を包含するが、これらに限定されない：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（例えば
、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ（例えば、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａ
ｌａｃｔｉａｅ）、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆ
ａｅｃｉｕｍ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ、Ｌｉｓｔｅｒ
ｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｃｏｒｙｎｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ、Ｎｏ
ｃａｒｄｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、腸内細菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｙｅ
ｒｓｉｎｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ（例えば、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ）、Ｋ
ｌｅｂｓｉｅｌｌａ（例えば、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋ．ｏｘｙｌｏｃａ
）、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ、Ｐ
ｒｏｔｅｕｓ（例えば、Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）、Ｍ
ｏｒｇａｎｅｌｌａ（例えば、Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌ
ｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｖｉｂｒｉｏ、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａ
ｃｔｅｒ（例えば、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｌｋ
ｅｎｅｌｌａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ
．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈ
ｏｍｏｎａｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ａｌｃａｌ
ｉｇｅｎｅｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅ
ｌｌａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（例えば、Ｈ．ｉｎｆｌｕ
ｅｎｚａｅ）、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｂａｃｔｅｒ
ｏｉｄｅｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｆｕｓｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｒｉｃｋｅｔｓｉ
ａ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ、およびＢａｒｔｏｎｅｌｌａ。
【００２８】 例示の真核微生物は、酵母および真菌、例えば、Ｃａｎｄｉｄａ（例えば、Ｃ
．ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ
、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅ
ｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓを包含するが、それらに限定
されない。
【００２９】 本発明の実施はまた、真核生物細胞（例えば、植物細胞、哺乳動物細胞、およ
びヒト細胞）にも適用され得る。１つの実施態様では、治療に耐性である悪性細
胞が、耐性の遺伝子座を決定するため、および耐性を担う細胞成分と相互作用す
ることにより耐性を逆転する化合物を同定するために分析され得る。この文脈で
は、治療は、化合物（例えば、薬物）、複数の化合物を含む組成物、または物理
的処置（例えば、照射）を包含し得る。
【００３０】 （必須細胞機能） １つの実施態様では、本発明は、必須細胞機能に関与する遺伝子および／また
は遺伝子産物を同定するための方法および組成物を提供する。特定の細胞のため
の必須機能は、細胞の遺伝子型および細胞の環境に依存する。例示のために、必
須細胞機能は、遺伝物質の複製、修復、組換えおよび転写；タンパク質合成（翻
訳）、プロセシング、および輸送；タンパク質輸出；細胞分子のタンパク質同化
合成；細胞栄養素の異化；細胞膜および細胞壁の合成；脂質代謝；タンパク質代
謝；エネルギー代謝；細胞分裂；細胞形状；線維形成（ｆｉｌａｍｅｎｔａｔｉ
ｏｎ）；調節；ＤＮＡ結合；ＲＮＡ結合；流出（ｅｆｆｌｕｘ）系；輸送系；ビ
ルレンスまたは病因性；および薬物耐性に関与する機能である。タンパク質代謝
は、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、およびユビキチン化（ほんの数例を
挙げる）のようなタンパク質修飾を包含し得る。必須細胞機能に関与し得る遺伝
子産物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：トポイソメラー
ゼ、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、プリマーゼ、ヘリカーゼ、ＤＮＡポリメラ
ーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ヒストン修飾酵素、キナーゼ、ホスファターゼ、ア
セチラーゼ、デアセチラーゼ、ホルミラーゼ、デホルミラーゼ、シャペロニン、
イオン輸送因子、細胞骨格エレメント、コリシン、シトクローム、リボソームタ
ンパク質、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ヒドロラーゼ、プロテアーゼ、エピ
メラーゼ、ロタマーゼ、シンターゼ、ラセマーゼ、デヒドロゲナーゼ、トランス
フェラーゼ、リガーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、トランスグリコシラーゼ
、トランスペプチダーゼ、ペプチダーゼ、ＧＴＰアーゼ、ＡＴＰアーゼ、トラン
スロカーゼ、リボヌクレアーゼ、転写因子、シグマ因子、リボソーム放出因子、
構造ＲＮＡおよび構造タンパク質。
【００３１】 より一般的には、必須の細胞性プロセスは、通常より低い速度で、またはより
少ない程度で生じる場合、細胞の生存能力にネガティブに影響する、任意のプロ
セスである。細胞の生存能力の決定のための方法は、当業者に周知であり、そし
て以下を含むがそれらに限定されない：生体染色、階段希釈および細胞培養物の
プレート化後の顕微鏡的またはコロニー計数的にのいずれかによる細胞計数、細
胞培養物による光散乱の測定、蛍光活性化細胞ソーティング、ポリヌクレオチド
前駆体および／またはポリペプチド前駆体の取り込み、レポーター遺伝子の発現
ならびに細胞重量および／または容積の測定。
【００３２】 必須の細胞プロセスに関与し得る分子の型としては、核酸、ポリペプチドおよ
び他の細胞の高分子が挙げられ得る。核酸としては、例えば、ＤＮＡ；調節ＲＮ
Ａ分子（例えば、リボザイムＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ）；トランスファ
ーＲＮＡおよびリボソームＲＮＡが挙げられる。ポリペプチドとしては、例えば
、構造タンパク質、酵素レセプター、細胞内シグナル伝達分子、および細胞接着
分子が挙げられ得る。
【００３３】 （調節エレメント） 本発明の１つの局面において、必須の細胞機能に関与する遺伝子の発現は、異
種の調節エレメントへの、遺伝子またはそのフラグメントの融合により調節され
る。異種の調節エレメントは、本発明の実施においてそのエレメントが調節する
遺伝子と、通常は関連せず、そして通常はその遺伝子を調節しないエレメントで
ある。調節エレメントは、転写エレメント、転写後エレメント、翻訳エレメント
、および翻訳後エレメント、ならびに複製に関与する調節エレメントを含み得る
。例示の目的で、転写調節エレメントは、転写開始、伸長および／または終止の
速度を調節する、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびエレメント
を含み得る；転写後調節エレメントは、メッセンジャーの安定性、プロセシング
および輸送に影響するエレメントを含み得る；転写調節エレメントは、翻訳開始
の頻度および翻訳伸長の速度を調節するエレメントを含み得る；翻訳後調節エレ
メントは、タンパク質のプロセシング、安定性および輸送に影響するエレメント
を含み得る；そして複製関連調節エレメントは、遺伝子用量に関係するエレメン
トを含み得る。
【００３４】 好ましい実施態様において、異種調節エレメントは、調節性プロモーターを含
む。特に好ましい実施態様において、調節性プロモーターは、ＰBADとしても知
られる、ａｒａＢＡＤプロモーターである。ＰBADによる調節は、大規模研究の
目的であった。そしてその調節性の特性は十分理解される。例えば、Ｓｃｈｌｅ
ｉｆ（１９９２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：１９９〜２２３；Ｇ
ｕｚｍａｎら（１９９５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７７：４１２１〜
４１３０；およびＧａｌｌｅｇｏｓら（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６１：３９３
〜４１０を参照のこと。
【００３５】 ＰBADプロモーターは、ポジティブな調節活性およびネガティブな調節活性の
両方を有する、ＡｒａＣタンパク質によって調節される。Ｌ−アラビノースまた
は他のインデューサー（例えば、Ｌ−リボースのような）の非存在下で、Ａｒａ
Ｃは、ＰBADの転写開始部位の上流部位に結合することによりＰBADからの転写を
抑制する。Ｌ−アラビノースのようなインデューサーは、ＡｒａＣタンパク質と
相互作用し、ＰBAD転写のアクチベーターを形成する。これは異なる上流部位に
結合して転写を刺激する。本発明に関して、ＡｒａＣ／ＰBAD調節系の望ましい
特徴は、アラビノースの非存在下で得られる転写の非常に低い基底レベル、およ
び培地中のＰBADからの転写とアラビノースの濃度の間の直接の関係である。例
えば、Ｇｕｚｍａｎら（前出）を参照のこと。
【００３６】 ＰBADの活性は、環境中のアラビノースの濃度に直接比例し、そして重要なこ
とには、低いアラビノース濃度では非常に低い基底レベルの発現が得られる。Ｐ BAD プロモーターはまた、サイクリックＡＭＰおよびサイクリックＡＭＰレセプ
タータンパク質（異化抑制タンパク質（ＣＲＰ）としても知られる）により媒介
される、異化抑制による調節に供される。従って、ＰBAD発現のさらなる調節は
、細胞中でＣＲＰ活性を調節する、環境中のグルコース（または、例えば、グル
コース−６−ホスフェートのような他の炭素源）の濃度を調節することにより得
られ得る。特に、ＰBADの最小発現（最大抑制）は、グルコースの存在、かつア
ラビノースの非存在下で得られる。培地からのグルコースの除去およびアラビノ
ース（または別のインデューサー）の添加は、ＰBADからの転写の迅速な誘導を
生じる。ここで発現レベルはアラビノース濃度と比例する。インデューサーの濃
度に依存して、１，０００倍の範囲を超えて変化する発現レベルが、観察され得
る。例えば、Ｇｕｚｍａｎら（前出）を参照のこと。
【００３７】 任意の原核生物または真核生物由来の、ＰBADプロモーターまたはＡｒａＣ／
ＸｙｌＳファミリーの任意の他のプロモーターは、本発明の実施に用いられ得る
。例えば、Ｇａｌｌｅｇｏｓら（前出）；ｄｅ Ｖｏｓら（１９９７）Ｃｕｒｒ
．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５４７〜５５３；およびＫｌｅｅｒｅ
ｂｅｚｅｍら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２４：８９５〜９０４
を参照のこと。特に好ましいのは、Ｅ．ｃｏｌｉ．およびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒ
ｉｕｍのＰBADプロモーターである。
【００３８】 本発明の実施において有用な別の調節系は、ＭａｌＲにより調節される、Ｓ．
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｍａｌＭ／ｍａｌＸ系である。ＭａｌＲは、Ｓ．ｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅにおけるマルトサッカライドレギュロンの発現を制御するリプレ
ッサーであり、そしてＬａｃＩ−ＧａｌＲファミリーのリプレッサーに属する。
２つのオペロンが逆方向に調節される（ｍａｌＸＣＤ（Ｐｘプロモーター）およ
び★ｍｕＨＭＰ（Ｐｍプロモーター））。図１（配列番号１）、Ｓｔａｓｓｉら
（１９８２）Ｇｅｎｅ ２０：３５９〜３６６；およびＮｉｅｔｏら（１９９７
）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３０８６０〜３０８６５を参照のこと。Ｐ
ｍに対するＭａｌＲの親和性は、Ｐｘに対してよりも高く、そして両方の場合、
発現の高い基底レベルが報告されている。Ｎｉｅｔｏら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３０８６０〜３０８６５。実施例６（後出）は、最小培
地中でマルトースにより緻密な調節を得るための、カタラーゼ遺伝子へのｍａｌ
Ｐｘの融合、およびｍａｌ Ｐｘプロモーターの改変を記載する。
【００３９】 本発明の実施において有用な調節系のさらなる別の例は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｒａｆ調節系である。実施例１４は、ｒａｆ
Ｒ遺伝子産物がＰAGA（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのα−ガラクトシダーゼ遺伝
子についてのプロモーター）のようなプロモーターのポジティブなレギュレータ
ーとして作用することを示す。従って、ｒａｆＲ機能を発現する細胞における、
ＰAGAへの標的遺伝子の融合は、標的遺伝子のラフィノース調節性発現を可能に
する。実施例７を参照のこと。ｒａｆ調節系におけるさらなる調節エレメントと
しては、ｒａｆＲ遺伝子のプロモーター（ＰrafR）、およびｒａｆＥ遺伝子のプ
ロモーター（ＰrafE）が挙げられる。
【００４０】 ＰAGAプロモーターは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇに開示され
るＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅゲノム配列の検索を通じて発見された。この配列は
、ＡｒａＣ／ＸｙｌＳファミリーの翻訳アクチベーターに対する相同体をコード
し得る配列について検索された。Ｇａｌｌｅｇｏｓら（１９９７）Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ ６１：３９３〜４１０。Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ｍｓｍＲ遺伝子に対するタンパク質相
同体をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が同定され、そして
ｒａｆＲと名付けられた。ｒａｆＲの近傍のさらなるＯＲＦの体系化もまた研究
された。これらの研究の結果として、１つの遺伝子クラスターが同定された。こ
れは調節性タンパク質（ｒａｆＲおよびｒａｆＳ）をコードする２つのＯＲＦ、
遺伝子間領域、および構造タンパク質をコードする６つのＯＲＦを含んだ。図２
を参照のこと。この遺伝子クラスターは、多岐的に転写される２つのオペロン：
ｒａｆＲおよびｒａｆＳをコードする調節オペロン、ならびにａｇａ、ｒａｆＥ
、ｒａｆＦ、ｒａｆＧ、★ｇｔｆＡおよび可能性としてはｒａｆＨ、をコードす
る代謝オペロンを含む。
【００４１】 Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの株ＶＳＰＮ３０２６においてｒａｆＳ、ｒａｆＲ
およびａｇａを含むｒａｆ遺伝子クラスターの領域のヌクレオチド配列が、決定
された。図３（配列番号２）を参照のこと。ｒａｆＳ遺伝子は、この配列のヌク
レオチド座標１００１〜２９１の相補体の間に存在することが検出された。ここ
にはヌクレオチド９３８〜２９４の相補体の間に存在するＲａｆＳタンパク質を
コードする領域を有する。ｒａｆＲ遺伝子は、ヌクレオチド１７９８〜９３５の
相補体の間に存在することが検出された。ここにはヌクレオチド１７９５〜９３
８に相補的なＲａｆＲコード領域を有する。ａｇａ遺伝子は、ヌクレオチド１９
０３〜４０６５にわたっていた。ここには１９０３〜４０６２の間に存在するコ
ード領域を有する。ＶＳＰＮ３０２６のｒａｆ配列（図３）とｈｔｔｐ：／／ｗ
ｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇのデータベースにおいて開示された配列との間にいくつ
かの差異が検出された。表１に提示するこれらの差異は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅの異なる株間の多型性を示すようである。 表１：Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＶＳＰＮ３０２６のｒａｆ領域における特有
の配列
【００４２】
【表１】
【００４３】 Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｒａｆ遺伝子クラスターは２つのドメインに体系
化される。１方のドメインは、２つの調節ＯＲＦであるｒａｆＲおよびｒａｆＳ
を含む。そして他方はＳ．ｍｕｔａｎｓ遺伝子に対するその相同性に基づき、お
そらく取り込みおよび異化に関与する遺伝子を含む。図２を参照のこと。用語「
ｒａｆ遺伝子クラスター」は、ｒａｆ転写単位およびその関連する調節遺伝子、
特にｒａｆＲ、ｒａｆＳ、ａｇａ、ｒａｆＥ，ｒａｆＦ、ｒａｆＧ、ｇｔｆＡお
よびｒａｆＨ遺伝子、ならびにこれらの遺伝子に関連する遺伝子間領域を含むＳ
．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムの領域をいう。遺伝子間領域は、タンパク質を
コードしないが、ＤＮＡ配列のタンパク質コード領域に隣接して存在するＤＮＡ
配列をいう。遺伝子間領域は、しばしば、プロモーターおよびオペレーターのよ
うな調節配列を含むが、調節配列はまた、コード領域に配置され得る。
【００４４】 ｒａｆＲのすぐ上流は、多岐的に転写される遺伝子、ａｇａであり、Ｓ．ｍｕ
ｔａｎｓのα−ガラクトシダーゼに対する配列相同性を有する。ａｇａ領域に変
異を有する株の構築、続いて、変異株のα−ガラクトシダーゼアッセイは、Ｓ．
ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのａｇａ遺伝子が、実際、α−ガラクトシダーゼ活性を有
するポリペプチドをコードすることを示す。実施例１４を参照のこと。ａｇａの
下流は、ｍｓｍ輸送系に対するタンパク質相同体をコードするさらなる遺伝子で
あり、そしてｇｔｆＡと呼ばれる遺伝子である、これはＳ．ｍｕｔａｎｓのスク
ロースホスホリラーゼの相同体である。それは、いくつかの相同なＯＲＦを含む
が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｒａｆ遺伝子クラスターが２つの調節遺伝子を
含むという事実は、その調節がＳ．ｍｕｔａｎｓにおけるｍｓｍ遺伝子クラスタ
ーの調節よりも、より複雑であり得ることを示唆する。
【００４５】 Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｒａｆ遺伝子クラスターは、少なくとも２つの調
節遺伝子（ｒａｆＲおよびｒａｆＳ）、遺伝子間領域、および少なくとも５つの
構造遺伝子（ａｇａ、ｒａｆＥ、ｒａｆＦ、ｒａｆＧおよびｇｔｆＡ）を含む。
図２を参照のこと。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｒａｆ遺伝子クラスターの調節
および構造遺伝子の発現を調節する配列は、遺伝子間領域および遺伝子間領域に
隣接する遺伝子内に見出されるようである。このような配列は、ｒａｆ調節配列
を意味し、そして例えば、プロモーター配列およびオペレーター配列（例えば、
ｒａｆＲプロモーター（ＰrafR）、α−ガラクトシダーゼプロモーター（ＰAGA
）およびｒａｆＥプロモーター（ＰrafE）を含む。プロモーター配列は、ＲＮＡ
ポリメラーゼが転写を開始するために結合する配列である。オペレーター配列は
、調節タンパク質（例えば、アクチベーターおよびリプレッサーのような）が結
合し、これによりプロモーターに結合するＲＮＡポリメラーゼの能力に影響する
配列である。一般に、リプレッサーは、ＲＮＡポリメラーゼの結合を阻害し、そ
してアクチベーターは結合を容易にする（またはリプレッサー媒介性の阻害を軽
減する）。ＲＴ−ＰＣＲによる転写物分析は、図２に示されるように存在するＰ AGA プロモーター、ＰrafEプロモーターおよびＰrafRプロモーターの位置と一致
する結果を提供した。周知の原核生物転写調節配列に対する配列エレメント相同
体の存在に基づき、ＰAGAの位置は、図３に提示される配列のヌクレオチド１７
９６〜１９０２の間に存在することが検出された。ＰrafRプロモーターはまた、
この領域内に存在すると考えられる。
【００４６】 １つの実施態様において、本発明は、コード配列の調節された発現のためのｒ
ａｆ調節領域由来の配列（例えば、ｒａｆプロモーター配列およびオペレーター
配列）を提供する。この配列には、例えば、相同遺伝子および異種遺伝子または
遺伝子フラグメントが含まれ得る。本明細書において開示されたＳ．ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅの調節配列に関して、相同遺伝子は、天然の調節配列と関連して通常
見出される遺伝子である。対照的に、異種配列は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅま
たは他の任意の生物体由来の配列であり、天然には、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
のｒａｆ調節配列と関連しては通常、見出されない。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
の調節配列の例としては、ｒａｆＲプロモーター（ＰrafR）、α−ガラクトシダ
ーゼプロモーター（ＰAGA）、およびｒａｆＥ遺伝子のプロモーター（ＰrafE）
が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４７】 配列相同性に関して上で考察したように、そして後出の実施例１４で例示的に
実証したように、ｒａｆＲ遺伝子産物はポジティブなレギュレーターとして作用
し、そしてｒａｆＳ遺伝子産物は、ｒａｆオペロンのネガティブなレギュレータ
ーとして作用する。ラフィノースの存在下での細胞の増殖は、ｒａｆ調節配列の
制御下での遺伝子の発現を誘導するが、ラフィノース以外の糖での細胞増殖は、
ｒａｆ調節配列の制御下での遺伝子の発現を阻害する。従って、本発明により提
供される方法および組成物は、ｒａｆ調節配列により媒介される、遺伝子の過剰
発現および過少発現の両方を可能にする。発現の基底レベルは、低く、そして抑
制条件（例えば、マルトースでの細胞増殖）および誘導条件（ラフィノースでの
細胞増殖）の間の発現レベルの範囲は、約１０００倍である。実施例１４（後出
）を参照のこと。
【００４８】 １つの実施態様では、本発明は、目的の遺伝子の発現の調節のための組換え構
築物を提供する。この組換え構築物は、分子生物学および生物工学の標準的な方
法を用いて、ｒａｆ調節配列の近傍へのコード配列の挿入によるか、またはコー
ド配列の近傍へのｒａｆ調節配列の挿入のいずれかにより、ｒａｆ調節領域配列
に作動可能な結合でコード配列を配置して作製される。好ましい実施態様では、
このｒａｆ調節配列は、それが作動可能な結合に設置される場合、コード配列の
上流である。挿入部位としての使用のため、ｒａｆ遺伝子クラスター内の制限酵
素認識配列の位置は、ｒａｆ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列から当業者に
より容易に決定され得る。あるいは、種々のインビトロ技術が、特定の部位での
制限酵素認識配列の挿入のために、または制限酵素認識配列を含まない部位での
異種配列の挿入のために用いられ得る。このような方法としては、以下が挙げら
れるがこれらに限定されない：１つ以上の制限酵素認識配列の挿入のためのオリ
ゴヌクレオチド媒介性異種二重鎖形成（例えば、Ｚｏｌｌｅｒら（１９８２）Ｎ
ｕｃｌｅｃｉ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７〜６５００；Ｂｒｅｎｎａ
ｎら（１９９０）Ｒｏｕｘ’ｓ Ａｒｃｈ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９：８９〜
９６；およびＫｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １
５４：３６７〜３８２を参照のこと）、およびより長い配列の挿入のためのＰＣ
Ｒ−媒介方法（例えば、Ｚｈｅｎｇら（１９９４）Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ ３１：１６３〜１８６を参照のこと）。
【００４９】 作動可能な結合とは、調節配列がコード配列に対してその調節効果を発揮し得
るような、１つ以上のコード配列を有する１つ以上の調節配列の整列をいう。例
えば、転写調節配列またはプロモーターは、これがコード配列の転写を促進する
場合、コード配列に作動可能に連結している。同様に、オペレーターへのリプレ
ッサーの結合が、コード配列の発現を妨害するかまたは減弱するようにプロモー
ターでの開始を阻害する場合、オペレーターは、プロモーター、またはコード配
列に作動可能に連結していると考えられる。作動可能に連結された転写調節配列
は、一般的に、コード配列と共にｃｉｓに連結されるが、それに対して直接隣接
する必要はない。
【００５０】 １つ以上のｒａｆ調節領域配列と作動可能な連結でコード配列を含む組換え構
築物はまた、他の型の配列を含み得る。この配列には以下が挙げられるがこれら
に限定されない：複製開始点、選択マーカー（抗生物質耐性をコードする配列を
含むがそれに限定されない）、転写終結部位、翻訳開始および終止を指示する配
列、ｍＲＮＡプロセシングおよび／または安定性を媒介する配列、ならびに複数
クローニング部位。好ましい実施態様では、これらのさらなる配列は、グラム陽
性の微生物（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ
、ＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉおよびＬａｃｔｏｃｏｃｃｉのような）で機能的であ
る。好ましい種としては以下が挙げられる：例えば、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、ランスフィールドＡ群連
鎖球菌、ランスフィールドＢ群連鎖球菌、ランスフィールドＣ群連鎖球菌、ラン
スフィールドＦ群連鎖球菌、ランスフィールドＧ群連鎖球菌、およびビリダンス
連鎖球菌。これらのさらなる配列が機能的である好ましい連鎖球菌以外の種とし
ては、例えば、腸球菌（例えばＥ．ｆａｅｃａｌｉｓおよびＥ．ｆａｅｃｉｕｍ
）、およびラクトコッカス（ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉ）（例えば、Ｌ．ｌａｃｔｉ
ｓ）が挙げられる。このような組換え構築物の構築方法は、当業者に周知である
。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと。構築物を含む細胞の単離
および同定を補助するために、組換え構築物に選択マーカーを含むことはまた、
しばしば有用である。選択マーカーとしては、ポジティブ選択を容易にするもの
（例えば、抗生物質耐性をコードする配列）、およびネガティブ選択を容易にす
るものが挙げられる。Ｂｏｃｈｎｅｒら（１９８０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．
１４３：９２６〜９３３；およびＧａｙら（１９８５）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
．１６４：９１８〜９２１。組換え構築物は、自由に複製する染色体外エレメン
ト（例えば、プラスミドもしくはエピソーム）として存在し得るか、または染色
体組換え体（例えば、目的の遺伝子に隣接する微生物の染色体へのｒａｆ調節カ
セットの組み込みによるか、もしくは、例えばｒａｆ調節配列に隣接する染色体
への目的の遺伝子の挿入によるかのいずれかで獲得される）として存在し得る。
組換え構築物の染色体への組み込みを達成するための方法は、例えば、以下によ
って記載されている：Ｇｅｒｈａｒｄｔら、ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＧＥＮＥ
ＲＡＬ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇ
ｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９４；Ｌｉｎｋら（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
．１７９：６２２８〜６２３７；およびＭｅｔｃａｌｆら（１９９６）Ｐｌａｓ
ｍｉｄ ３５：１〜１３。
【００５１】 組換え構築物に存在する場合、コード配列は、完全長の遺伝子産物（すなわち
、野生型細胞に通常見出される長さ）または遺伝子産物の任意のフラグメントを
コードし得る。遺伝子産物は、ＲＮＡまたはポリペプチドであり得る；非翻訳Ｒ
ＮＡ遺伝子産物は、構造ＲＮＡ分子、触媒性ＲＮＡ分子および調節性ＲＮＡ分子
を含み得る。非翻訳ＲＮＡ遺伝子産物の例としては、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アン
チセンスＲＮＡおよびリボザイムが挙げられるがこれらに限定されない。１つの
実施態様では、コード配列は、病原性因子、耐性因子、または遺伝子産物（その
機能が、特定の環境条件のセットのもとで細胞に必須である）をコードし得る遺
伝子を含む。目的の任意の遺伝子は、その発現がｒａｆ調節領域配列により調節
されるように、ｒａｆ調節領域配列と作動可能な結合で配置され得る。
【００５２】 １つの実施態様では、本発明は、宿主細胞におけるコード配列の発現を調節し
得る組換え構築物を提供する。これらの構築物は、コード配列と作動可能な連結
で１つ以上のｒａｆ調節配列を含む。この構築物は、ｒａｆオペロン調節配列が
機能的である任意の細胞における使用に適切である。ｒａｆ調節タンパク質Ｒａ
ｆＲおよびＲａｆＳは、上記の組換え構築物とともに、またはその一部として細
胞に導入され得るので、ｒａｆ調節配列によるコード配列の調節は、グラム陽性
およびグラム陰性の微生物の両方を含み得る多くの細胞で達成され得る。好まし
い実施態様において、宿主細胞は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ、およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｉ
のようなグラム陽性の微生物である。好ましい種としては、例えば、Ｓ．ｐｎｅ
ｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、ランスフ
ィールドＡ群連鎖球菌、ランスフィールドＢ群連鎖球菌、ランスフィールドＣ群
連鎖球菌、ランスフィールドＦ群連鎖球菌、ランスフィールドＧ群連鎖球菌、お
よびビリダンス連鎖球菌が挙げられる。ｒａｆ調節系がコード配列の調節発現に
利用され得る、好ましい連鎖球菌以外の種としては、例えば、腸球菌（例えばＥ
．ｆａｅｃａｌｉｓおよびＥ．ｆａｅｃｉｕｍ）、およびラクトコッカス（ｌａ
ｃｔｏｃｏｃｃｉ）（例えば、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）が挙げられる。
【００５３】 本発明の一つの局面の実施において、組換え構築物を、宿主細胞に導入して、
コード配列の調節された発現を提供する。この構築物の宿主細胞への導入は、当
業者に周知の方法（例えば、天然の形質転換または人工の形質転換、形質導入、
接合、微量注入、トランスフェクション、エレクトロポレーション、ＣａＰＯ4
共沈、ＤＥＡＥデキストラン、脂質媒介性移入、粒子ボンバードメントなどを含
む）によって行われる。
【００５４】 宿主細胞を、任意の適切な増殖培地（液体培地または固体培地を含む）におい
て培養する。種々の型の微生物について適切な増殖培地は、当業者に周知である
。例えば、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、第２巻、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂ
ａｌｔｉｍｏｒｅ、１９８０；Ｇｅｒｈａｒｄｔら「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ
Ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」Ａ
ｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓ
ｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、１９９４；およびＭｕｒｒａｙら、前出を参照のこ
と。
【００５５】 モジュレーター物質は、増殖培地に添加されて、ｒａｆ調節配列の転写活性に
影響を与え得る。このような効果は、ｒａｆ調節配列が作動可能に連結されるコ
ード配列の発現レベルにおける変化として示される。モジュレーター物質は、一
般に、インデューサー（転写活性を増加させる）またはネガティブモジュレータ
ー（転写を減少させる）として特徴付けられ得る。本発明の１つの実施態様にお
いて、モジュレーター物質は、代謝物である。好ましい実施態様において、それ
は炭素源である。より好ましい実施態様において、それは糖であり、そして特に
好ましい実施態様において、インデューサーとしてラフィノースおよびネガティ
ブモジュレーターとしてマルトースが使用される。
【００５６】 本発明は、低い基底発現レベルおよび高い程度の誘導を提供する系を利用する
。そのような方法および組成物は、例えば、微生物の増殖を阻害する化合物を同
定するために、および薬物標的（ビルレンス耐性および薬物耐性に関与する遺伝
子を含む）の発見のために使用され得る。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｒａｆ調
節系が、低い基底発現レベルに対して少なくとも１０００倍の誘導レベルによっ
て特徴付けられることから（実施例１４を参照のこと）、この系は本発明の実施
における使用に充分に適合している。
【００５７】 従って、本明細書において開示されるように、ｒａｆ調節配列を使用して、微
生物の必須遺伝子を同定し得、必須遺伝子の発現のレベルを調節し得、そして必
須遺伝子および遺伝子産物のインヒビターを同定し得る。これらの特徴は、Ｐra fR 、ＰrafE、ＰAGAなどのようなｒａｆ調節配列を、必須遺伝子をコードする、
相同なコード配列または異種コード配列へと、そのコード配列がｒａｆ調節配列
の転写制御下にあるように融合することによって達成される。必須遺伝子は、Ｓ
．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの増殖に必須であるもの、または他の任意の微生物の増
殖に必須であるものを含み得る。ある遺伝子の必須性は、その遺伝子が発現され
る細胞のインビボまたはインビトロの環境に依存し得る。例えば、有効濃度の抗
生物質の存在下で、その抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子は、必須遺伝
子である。実施例７は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉｅαガラクトシダーゼプロモータ
ー（ＰAGA）とＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅリーダーペプチダーゼ（ｓｐｉ）遺伝
子との間の融合物の構築および特性を示す。この融合物は、ｓｐｉ遺伝子を、ラ
フィノース制御下に置き、低ラフィノース濃度で細胞増殖を制限する。
【００５８】 さらなるポジティブ調節されるプロモーター／アクチベーター系もまた、本発
明の実施においての使用を見出す。これらとしては、ラムノース利用（ｒｈａＳ
遺伝子産物またはｒｈａＲ遺伝子産物によって調節される）についての系、メリ
ビオース利用（ｍｅｌＲ遺伝子産物によって調節される）についての系、キシロ
ース利用（ｘｙｌＲ遺伝子産物によって調節される）についての系、ｐ−ヒドロ
キシフェニル酢酸利用（ｈｐａＡ遺伝子産物によって調節される）についての系
、およびウレアーゼ産生（ｕｒｅＲ遺伝子産物によって調節される）についての
系が挙げられるがそれらに限定されない。ポジティブ調節される系のさらなる例
については、Ｇａｌｌｅｇｏｓら、前出を参照のこと。本発明において使用され
るさらなる調節可能なプロモーターは、当業者に周知である。それらとしては、
ｌａｃ（これは、ラクトースおよびグルコースによって調節される）；ｔｒｐ（
これは、トリプトファンによって調節される）、ｔａｃ（これは、ラクトースに
よって調節される）、ｔｅｔ（これは、テトラサイクリンおよびテトラサイクリ
ンアナログによって調節される）、ｇａｌ（これは、ガラクトースによって調節
される）、Ｔ７（これは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの提供によって調節される
）、Ｔ３（これは、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼの提供によって調節される）、Ｓ
Ｐ６（これは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの提供によって調節される）、λｐ R （これは、λリプレッサー（ｃＩ遺伝子産物）によって調節される）、および
λｐL（これは、λリプレッサー（ｃＩ遺伝子産物）によって調節される）が挙
げられるがそれらに限定されない。その調節可能性の程度について試験され得、
そして本発明の実施において有用であり得るグラム陰性生物由来のさらなるプロ
モーターとしては、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｐｒｏＵ、ｃｓｔ−ｌ、ｔｅ
ｔＡ、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｌｐｐ−ｌａｃ、ｃｓｐＡ、Ｔ７−ｌａｃ、ｐＬ−Ｔ
７、Ｔ３−ｌａｃ、Ｔ５−ｌａｃ、ｎｐｒＭ−ｌａｃ、ＶＨｂ、二成分調節系に
よって調節されるプロモーター、およびａｒａＣ／ＸｙｌＳファミリーのレギュ
レーターによって調節されるプロモーターが挙げられるが、それらに限定されな
い。二成分系としては、シグナル伝達の機構としてタンパク質リン酸化を利用す
るものが挙げられる。１つの実施態様において、センサタンパク質は、環境刺激
の受容の際に細胞によってリン酸化される。次いで、ホスフェート基がレギュレ
ータータンパク質へと転移され、このタンパク質がリン酸化で誘導されるコンホ
メーション変化を受ける。この変化が、例えば、遺伝子転写のような応答を惹起
する。例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ、前出；Ｊ．Ａ．ＨｏｃｈおよびＴ．Ｊ．Ｓｉ
ｌｈａｖｙ、ｅｄｓ．（１９９５）「Ｔｗｏ−Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｓｉｇｎａ
ｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．；ならびにＧａ
ｌｌｅｇｏｓら、前出を参照のこと。その調節可能性の程度について試験され得
、そして本発明の実施において有用であり得る、グラム陽性生物からのさらなる
プロモーターとしては、ｓｐａｃ−１、ｘｙｌＡ、ｌａｃＡ、ｌａｃＲ、Ｐ１５
、ｄｎａＪ、ｓｏｄＡ、ｐｒｔＰ、ｐｒｔＭ、ＰＡ１７０、ｔｒｐＥ、ｎｉｓＡ
、ｎｉｓＦ、ｍａｌＸ、ｍａｌＭ、ｘｙｌ、およびφｒ１ｔおよびφ３１由来の
バクテリオファージプロモーターが挙げられるがそれらに限定されない。例えば
、ｄｅ Ｖｏｓら、前出を参照のこと。これらのプロモーターのいくつかは、現
在の技術を用いては、ＰBADを用いて得られ得るレベルほどに低い基底レベルを
発現し得ないが、本発明のそれほど好ましくない実施態様において使用を見出す
。 （遺伝子融合物の構築） 本発明の好ましい実施態様において、異種調節エレメントを必須の細胞機能を
コードする遺伝子へと融合することは、ａｒａ調節カセットを、研究している生
物の染色体へと挿入することまたはａｒａ調節カセットを、研究している生物に
内在するプラスミドへと挿入することによって達成される。ａｒａ調節カセット
は、以下の順でａｒａＣ遺伝子、ＰC（ａｒａＣプロモーター）およびＰBAD（ａ
ｒａＢ遺伝子、ａｒａＡ遺伝子、およびａｒａＤ遺伝子の発現を調節するプロモ
ーター）を含むＤＮＡ分子を含み得る。これは、これらのエレメントがＥ．ｃｏ
ｌｉおよびＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの染色体において配置される順序である
。ここで、ＰCプロモーターおよびＰBADプロモーターは、隣接され、そして多様
に配向される。このカセットの挿入は、細胞にＡｒａＣの機能を提供し、そして
、下流のコード配列を、ＰBADの制御下に置く。ＰBADは、ＡｒａＣによって調節
される。あるいは、ＡｒａＣ機能がすでにその細胞によって提供されている場合
はＰBADのみを含むカセットが挿入され得る。
【００５９】 別の実施態様において、目的の遺伝子またはヌクレオチド配列を含むカセット
が、その遺伝子または配列がＰBADの転写調節下にくるようにＰBADに隣接する染
色体へと挿入され得る。実施例１３を参照のこと。さらに、当業者には、ＰBAD
（または任意の他の調節エレメント）と、目的の遺伝子またはヌクレオチド配列
との間の融合物自体が、当該分野で周知の技術を用いて多数の異なる染色体位置
のいずれか一つまたは染色体外位置へと移動され得ることは明らかである。
【００６０】 例示のために、融合物は、ａｒａ調節カセットを微生物の染色体またはプラス
ミドへランダム挿入すること、続いて増殖についてアラビノース依存性である株
についてスクリーニングすることによって得られ得る。アラビノース依存性の株
は、必須の細胞機能をコードする配列が、そのコード配列がＰBAD制御下にくる
ような方法でａｒａ調節カセットへと融合された株である。コード配列は、全長
遺伝子産物（すなわち、野生型細胞において通常見出される長さ）または必須の
細胞機能をコードし得る遺伝子産物の任意のフラグメントをコードし得る。遺伝
子産物は、ＲＮＡまたはポリペプチドであり得る。非翻訳ＲＮＡ遺伝子産物は、
構造ＲＮＡ分子、触媒ＲＮＡ分子および調節ＲＮＡ分子を含み得る。
【００６１】 ランダム染色体組込みは、代表的に、トランスポゾンを用いて達成される。ト
ランスポゾンは、宿主生物の染色体またはプラスミド内にランダムに挿入する能
力を有するＤＮＡセグメントである。非常にわずかな相同性が、トランスポゾン
の末端とその組込み部位との間に必要とされる。そして、そのプロセスは、宿主
の相同組換え系とは独立している。トランスポゾン挿入物は、代表的には、その
トランスポゾンにおいて保有される抗生物質耐性マーカーについて選択すること
によってモニターされる。トランスポゾンが低い部位特異性を有し得ることから
、そのトランスポゾンは、遺伝子破壊によってランダムに不活化するために広汎
に使用される。
【００６２】 外因性配列の効率よい標的化染色体組込み（部位特異的組換えを含む）は、代
表的に、２００塩基対以上の相同性のストレッチを要求する。この組込みは、宿
主の相同組換え系を利用して組込みを達成する。標的化した組込みは、代表的に
、染色体と、染色体配列および抗生物質耐性マーカーを含む条件的複製欠損プラ
スミドとの間の組換え事象を含む。プラスミド複製を許容しない条件下で、かつ
、選択因子の存在下で、生存する細胞の殆どは、標的化された組換えが、そのプ
ラスミドの相同配列と、その染色体ＤＮＡとの間で生じた細胞である。Ｇｅｒｈ
ａｒｄｔら、前出；Ｌｉｎｋら（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：
６２２８−６２３７；およびＭｅｔｃａｌｆら（１９９６）Ｐｌａｓｍｉｄ ３
５：１−１３。同じ考慮事項は、プラスミド内の標的化された挿入にも適用され
る。
【００６３】 例示の目的で、細胞性のコード配列へのａｒａ調節カセットの融合物を生成す
るための一つの方法は、実施例１、下記において記載するように、標的化された
コード配列に対して相同な配列を有する調節カセットを隣接させることによる。
しかし、遺伝子融合物を生成するための他の方法は、当業者に公知である。例え
ば、Ｃａｓａｄａｂａｎら Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１００巻（編
Ｒ．Ｗｕ、Ｌ．Ｇｒｏｓｓｍａｎ、Ｋ．Ｍｏｌｄａｖｅ）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８３）２９３−３０８頁；Ｓｉｌｈａｖｙら
、前出；およびＧｅｒｈａｒｄｔら、前出を参照のこと。本発明のさらなる実施
態様は、例えば、プラスミドに存在する染色体外遺伝子融合物を含む。そのよう
なプラスミド融合物は、当業者に周知の遺伝学および組換えＤＮＡの技術を用い
てインビボまたはインビトロで構築され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前
出；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出；Ｓｉｌｈａｖｙら、前出；およびＧｅｒｈａｒｄ
ｔら、前出を参照のこと。本発明の目的のために、インビトロで構築された核酸
は、当該分野で周知の方法（裸のＤＮＡを用いる形質転換、エレクトロポレーシ
ョン、微量注入、リン酸カルシウム媒介移入、ＤＥＡＥデキストラン媒介移入、
遺伝子銃などを含む）によって細胞へと導入されて形質転換細胞が生成され得る
。
【００６４】 ａｒａ調節カセットについての上記の方法に類似する方法もまた、ｍａｌ、ｒ
ａｆまたは他の調節エレメント（これらは、調節エレメントが作動可能に連結さ
れる遺伝子の制御された発現を可能にする）を含む調節カセットの構築および組
込みに適用され得ることは明らかである。
【００６５】 （制御された低レベル発現のための方法） 本発明の好ましい実施態様において、必須遺伝子の発現は、低い基底レベルに
まで制御される。低い基底レベルは、野生型の５０％未満であり、好ましくは、
３０％未満、より好ましくは２０％未満、そして最も好ましくは１０％未満であ
る。いくつかの場合、低い基底レベルでの必須遺伝子の発現は、細胞を非生存性
にする。他の場合において、この発現は、細胞を生物学的に活性な因子に対して
過敏にする。ａｒａ ＰBADによる低い基底レベルの調節の例は、Ｇｕｚｍａｎ
ら、前出により提供される。ＰBAD−ｍｕｒＡ融合物を含む株におけるアラビノ
ースによる細胞増殖の調節は、以下の実施例２において実証される。
【００６６】 調節は、標的遺伝子の異種調節エレメント（この発現は、例えば、化学物質、
栄養、温度、ｐＨ、浸透圧などのような環境条件によって外因的に制御され得る
）への融合によって達成される。好ましい実施態様において、調節は、標的遺伝
子産物のレベルが調節のために用いられる環境因子の濃度またはレベルに比例す
るように存在する。なおさらに好ましい本発明の実施態様において、標的遺伝子
は、ＰBADに融合され、そして調節は、増殖培地中のＬ−アラビノースの濃度を
調整することによって達成される。低レベルの発現は、その培地中のアラビノー
スの低濃度および／またはグルコースの存在と相関する。
【００６７】 さらなる実施態様において、調節は、アラビノース以外のインデューサーの濃
度を変動させることによって達成される。例えば、マルトースによる調節は、Ｍ
ａｌＲ機能を発現する細胞において、標的遺伝子がｍａｌ Ｐｍまたはｍａｌ
Ｐｘに融合される場合に、達成される。さらに別の例を提供するために、標的遺
伝子のｒａｆ調節エレメントＰAGAへの融合物は、ＲａｆＲ機能を発現する細胞
においてラフィノースによる調節を可能にする。ｒａｆ調節系におけるさらなる
制御エレメントとしては、ｒａｆＲ遺伝子のプロモーターであるＰrafRおよびｒ
ａｆＥ遺伝子のプロモーターであるＰrafEが挙げられる。これらの例に基づいて
、任意の調節可能なプロモーター（ポジティブに調節されていようとネガティブ
に調節されていようと）を使用して、その特定のプロモーターを調節する物質ま
たは環境条件に応答して標的遺伝子の発現を制御し得ることは当業者には明らか
である。
【００６８】 二倍体生物において、遺伝子発現の制御された調節は、単一の染色体挿入を用
いて達成することは、原核生物においての場合のようには容易でないかもしれな
い。しかし、特定の状況において、標的遺伝子の２コピーのうち１つの変異また
は「ノックアウト」は、入手されるべき薬物感受性の新たに獲得された程度に対
して充分な程にその標的の発現を低下させ得る。あるいは、標的遺伝子の１コピ
ーの変異または「ノックアウト」は、残りの野生型コピーの制御発現と組み合せ
て使用して、二倍体内において高められた薬物感受性を達成し得る。同様に、原
核生物および真核生物の両方において、複数コピーの遺伝子（例えば、Ｅ．ｃｏ
ｌｉにおけるリボソーム遺伝子）が存在する状況に遭遇し得る。これらの状況に
おいて、ノックアウトおよび／またはその遺伝子の１コピー以外のノックアウト
は、本発明の方法に従って、残りの機能的コピーの調節を可能にする。
【００６９】 （例示的適用） 本発明の方法および組成物によって、細胞において発現される遺伝子産物（標
的）の量を制御することによって試験化合物に対する細胞の感受性を制御するこ
とが可能になった。これは、インデューサーの濃度を調整することによって達成
される。次いで、このインデューサーは、異種制御エレメントに融合されている
コード配列の発現を調節する。次いで、試験化合物に対する感受性を、コード配
列の種々のレベルの発現にて、および異なる濃度の試験化合物にて決定する。正
常レベル未満の標的の発現は、細胞をその特定の標的と相互作用する化合物に対
して過敏とさせる。あるいは、正常未満のレベルの特定の遺伝子産物を発現する
細胞は、通常は感受性ではない化合物に対して感受性になり得る（すなわち、そ
の細胞は、正常レベルのその標的を発現する場合に感受性ではない）。このよう
な化合物は、化学改変の後に、正常レベルのその標的を発現する細胞の生存を阻
害し得るようになり得る候補治療剤である。潜在的な治療剤化合物の化学改変の
ための技術は、当業者に周知である。例えば、Ｍｏｒｉｎら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｂｅｔａ−Ｌａｃｔａｍ Ａｎｔｉｂｉｏ
ｔｉｃｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８２を参照
のこと。
【００７０】 標的と相互作用する多くの化合物は、野生型細胞に対しては活性ではない。な
ぜなら、その細胞において標的の濃度を考慮すると、その化合物の細胞内濃度が
阻害に充分である濃度に達し得ないからである。多くの因子は、この型の天然の
耐性を担う。例えば、化合物が加水分解され得、流出され得、適切な輸送を欠く
ために非存在であり得るなど。例えば、Ｄａｖｉｅｓ（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２６４：３７５−３８２；およびＮｉｋａｉｄｏ（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２６４：３８２−３８８を参照のこと。しかし、天然の耐性に関与する遺伝
子の不活化（例えば、流出ポンプ）は、野生型細胞が耐性である化合物に対して
感受性である変異体の構築を可能にする。そのような変異体は、多くの無関連化
合物に対して過敏になり得、そして新規の抗菌剤を特徴付けるために使用されて
きた。本発明の方法および組成物は、代謝、輸送、流出などに関与する遺伝子に
おける変異のために化合物に対する感受性の増加を示す変異体とともに使用され
て、そうでなければ検出可能ではないインヒビターを同定し得る。実施例１１を
参照のこと。
【００７１】 図４は、単一のモノマー性標的と相互作用することによって化合物が細胞の生
存を阻害し、そして標的の発現レベルが調節される状況について理想的な結果を
示す。この図は、インデューサーの濃度と試験化合物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）
との間の関係を示す。ＭＩＣは、インデューサーの特定の濃度の存在下で（適用
可能な場合）（代表的には、連続二倍希釈の試験化合物を用いて）増殖を阻害す
る試験化合物の最小濃度を評価することによって決定される。増殖は、例えば、
培養物の分光光学的または肉眼での検査によって記録され得る。増殖を完全に阻
害するか、またはコントロール培養物に比較して１０％未満の増殖を支持する試
験化合物の最小量がＭＩＣと定義される。野生型細胞について、ＭＩＣは、誘導
因子の全ての濃度において一定である。なぜなら、標的の発現レベルは、インデ
ューサーの濃度では変動しないと予測されるからである。標的発現がインデュー
サー濃度によって調節される細胞について、ＭＩＣがインデューサー濃度に正比
例するインデューサー濃度の範囲が存在する。従って、野生型よりも低いレベル
で標的の発現をもたらすより低いインデューサー濃度は、野生型細胞を用いて観
察されるものよりも低いＭＩＣと相関する。このアッセイは、標的レベルの制御
にのみ依存することから、このアッセイは、その標的の機能が公知であるか否か
に拘らず、候補治療剤についてのスクリーニングを提供する。下記の実施例３は
、ＭｕｒＡ発現がアラビノースによって調節されている細胞について、細胞がＭ
ｒｒＡインヒビターであるホスホマイシンで攻撃される場合に、野生型細胞につ
いてのＭＩＣよりも低いＭＩＣ値および高いＭＩＣ値の両方が得られ得ることを
示す。
【００７２】 特定の状況において、標的は、異なるサブユニット（例えば、ヘテロ多量体）
から構成される多量体構造の部分であり得る。そして、試験化合物は、１つを超
えるサブユニットが寄与する多量体のサブ領域と相互作用し得、これらのサブユ
ニットのうちの一つは、その標的である。標的レベルが調節される場合、前述の
パラグラフにおいて記載される状況におけるように、ＭＩＣがインデューサーの
濃度に比例する特定の範囲のインデューサー濃度が存在する。この範囲のインデ
ューサー濃度によって特定される標的レベルにおいて、その標的は、多量体構造
の制限成分である。しかし、漸増量のインデューサー濃度および同時により高い
標的レベルを用いると、その標的が、もはやその多量体の律速化合物ではない点
に到達する。この点において、ＭＩＣとインデューサー濃度との関係は、プラト
ー値に達する。このプラトー値は、野生型株のＭＩＣとは独立している。この状
況は、図５において模式的に示される。
【００７３】 先行技術のスクリーニング方法は、細胞内に特定の化合物が複数の標的を有す
る状況には適用不可能である。ここで、各標的は、その化合物に対して異なる程
度の感受性を有する。これらの場合において、先行技術の方法は、そのアッセイ
条件下で最も簡単に阻害される標的に対する効果のみを検出する。本発明の方法
は、インヒビターの標的の発現を制御するために使用され得る。その標的がその
インヒビターによって標的化される唯一の細胞遺伝子産物である場合、漸増レベ
ルのその標的の発現は、そのインヒビターについてより高いＭＩＣをもたらす（
図４を参照のこと）。そのインヒビターがさらなる標的を有する場合、インデュ
ーサー濃度（すなわち、標的レベル）の関数としてのＭＩＣの増加は、プラトー
値に達する。このことは、そのインヒビターによる二次標的の阻害を示唆する。
図５は、そのような状況において得られるデータの理想的な図を示す。第一（最
も感受性のある）遺伝子産物の発現を固定し、他方で、他の遺伝子産物の発現を
変動させると、さらなる標的の検出が可能になる。
【００７４】 従って、試験化合物が単一の標的と相互作用する場合、ＭＩＣとインデューサ
ー濃度との間の関係は、細胞増殖と一致して、ともかくインデューサー濃度に比
例する。以下の実施例３、４、および８〜１３を参照のこと。対照的に、試験化
合物が複数の標的と相互作用する場合、または試験化合物が、複数の分子（その
うちの１つが標的である）によって形成される構造と相互作用する場合、ＭＩＣ
とインデューサー濃度との間の関係は、その標的がもはや制限成分でないインデ
ューサー濃度以上の濃度でプラトーな値に達する。標的は、ポリペプチドおよび
／または核酸であり得る。例えば、リボソームは、両方の型の標的を含む。
【００７５】 細胞は、当該分野で公知であるかまたは合成される任意の化合物に曝露され得
、そして曝露の経路は、例えば、液体細胞培養培地中にその化合物を含めること
、固体培養培地中にその化合物を取り込むこと、またはその化合物を固体培養培
地に適用塗布すること（例えば、化合物で飽和した多孔質ディスクの媒体への適
用もしくは単純にその化合物の小滴を固体培地上にピペッティングすること）に
よって行なわれ得る。
【００７６】 本発明の使用は、可能性のある新規な治療（例えば、抗菌剤）の迅速な同定を
可能にする。以下の実施例５を参照のこと。この方法によって同定された候補は
、当該分野で公知のように化学修飾に供され得（例えば、Ｂｒｉｓｔｏｌ，Ｊ．
Ａ．（編）Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏを参照のこ
と）、そして正常なレベルの標的を発現する細胞に対して試験され得る。正常な
レベルの標的を発現する細胞に対する活性を示す修飾された化合物は、候補治療
剤である。
【００７７】 （実施例） 以下の実施例は、本発明を例示することが意図され、本発明を限定することは
意図されない。
【００７８】 （実施例１：ｍｕｒＡへのＰBADの融合物を含む株の構築） ｍｕｒＡ遺伝子を、試験のために選択した。なぜなら、ｍｕｒＡ遺伝子は、薬
物ホスホマイシン（ｆｏｓｆｏｍｙｃｉｎ）の標的である細胞質タンパク質をコ
ードするからである。染色体中にアラビノースの制御下のｍｕｒＡ遺伝子の単一
の機能性コピーを保有するＥ．ｃｏｌｉ株を構築した。この株では、ｍｕｒＡの
発現レベルは、培地中に存在するアラビノースの量によって制御される。さらに
、この株は、アラビノースに依存する。なぜなら、この糖は、必須遺伝子ｍｕｒ
Ａの発現を誘導するために必要とされるからである。そして、この株は、アラビ
ノースを代謝できない。なぜなら、代謝遺伝子が欠失されているからである（Δ
（ａｒａＣＢＡ）ａｒａＤ）。ホスホマイシン（ウリジンジホスホ−Ｎ−アセチ
ル−Ｄグルコサミンエノールピルビルトランスフェラーゼ（ＭｕｒＡ）のインヒ
ビター）に対するこの株の感受性を、種々の濃度のアラビノースを用いて試験し
た。他の標的（すなわち、テトラサイクリン（タンパク質合成インヒビター）お
よびシプロフロキサシン（ＤＮＡジャイレースインヒビター））を阻害する、関
連のない抗生物質に対する感受性もまた試験した。ＭｕｒＡの新規なインヒビタ
ーを、本発明の実施によって同定した。実施例５を参照のこと。
【００７９】 本実施例のために用いたＥ．ｃｏｌｉ株は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＶＥＣＯ２０４２
（ｐｉｒ+、ｒｅｃＡ）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＶＥＣＯ２０５４（Δ（ａｒａＣＢＡ
）ａｒａＤ）、およびＥ．ｃｏｌｉ ＶＥＣＯ２０５５（（Δ（ａｒａＣＢＡ）
ａｒａＤ）ＰｍｕｒＡ：：Ｋｍ−ａｒａＣ−ＰBAD）である。
【００８０】 ＶＥＣＯ２０５５を以下の通りに構築した。
【００８１】 対立遺伝子置換は、二重組換え事象が生じることを必要とする。組換えのため
に用いた２つの相同性領域は、ｍｕｒＡコード領域およびｍｕｒＡのすぐ上流の
４００塩基対のＤＮＡであった。野生型ｍｕｒＡをＰBAD- ｍｕｒＡで置換する
ために用いた染色体置換カセットおよびストラテジーを、図６に図示する。
【００８２】 ｍｕｒＡを含むＤＮＡ配列を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９の染色体ＤＮＡから
、オリゴヌクレオチドＤＹＶ−０５５（配列番号３、表２）およびＤＹＶ−０５
６（配列番号４、表２）を用いてＰＣＲ増幅し、そしてＮｃｏｌ／ＸｂａＩフラ
グメントとして発現ベクターｐＢＡＤ−ＭｙｃＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローニングした。
【００８３】 ４００塩基対の上流ｍｕｒＡ配列を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９の染色体ＤＮ
Ａから、オリゴヌクレオチドＤＹＶ−０５７（配列番号５、表２）およびＤＹＶ
−０５８（配列番号６、表２）を用いてＰＣＲ増幅し、そしてｐＣＲ２．１（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に直
接クローニングした。
【００８４】 自殺ベクターｐＷＭ９５（Ｍｅｔｃａｌｆら（１９９６）Ｐｌａｓｍｉｄ ３
５：１−１３）を選択して、対立遺伝子置換手順を行った。ｐＷＭ９５は、プラ
スミドの複製が起きるためにはｐｉｒ遺伝子をトランスで必要とする、条件的に
複製可能なアンピシリン耐性プラスミドである。ｐＷＭ９５はまた、スクロース
の存在下で増殖させた形質転換株にスクロース感受性を付与するｓａｃＢ遺伝子
を保有する。このプラスミドを、Ｐｉｒタンパク質を供給しない宿主に導入する
場合、染色体構成要素（ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）を保有する株を選択し得る。次い
で、ｓａｃＢ遺伝子は、プラスミドを含まない分離物を、スクロース耐性クロー
ンとして選択することを可能にする。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＶＥＣＯ２０４２（ｐｉｒ + 、ｒｅｃＡ）を、条件的複製性のｐＷＭ９５およびその誘導体を用いる全ての
クローニング工程に用いた。
【００８５】 ａｒａＣ−ＰBAD−ｍｕｒＡおよび上流のｍｕｒ配列を、３方向連結（ｔｈｒ
ｅｅ−ｗａｙ ｌｉｇａｔｉｏｎ）によって自殺ベクターｐＷＭ９５中にクロー
ニングして、ｐＤＹ−１０を作製した。プラスミドｐＢＳＬ９９（ＡＴＣＣ ８
７１４１）由来のカナマイシン耐性遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとし
てｐＤＹ１０中にクローニングして、ｐＤＹ１１を作製した。
【００８６】 ｐＤＹ１１を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＶＥＣＯ２０５４中に導入した。形質転換体を
、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を
補充したＬＢプレートにプレーティングし、そして３７℃にて一晩インキュベー
トした。多数の形質転換体を、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）およびアラビノ
ース（０．２％）を補充したＬＢプレートにストリークし、そして３７℃にて一
晩インキュベートした。次いで、単離されたコロニーを、カナマイシン（２５μ
ｇ／ｍｌ）、スクロース（６％）、およびアラビノース（０．２％）を補充した
ＬＢプレートにストリークし、スクロース耐性組換え体を選択した。ＮａＣｌを
、スクロース耐性選択の間にＬＢプレートから削除した。スクロース耐性組換え
体を、アンピシリン感受性およびアラビノース増殖依存性についてスクリーニン
グした。候補クローンにおける染色体置換を、ＰＣＲプライマー対ＤＹＶ−０７
０／ＤＹＶ−０７３（配列番号７／配列番号９）およびＤＹＶ−０８２／ＤＹＶ
−０７１（配列番号１０／配列番号８）を用いて染色体連結をチェックすること
により確認した。
【００８７】
【表２】
【００８８】 （実施例２：アラビノースによるＶＥＣＯ２０５５の増殖調節） ＰBAD−ｍｕｒＡ融合株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＶＥＣＯ２０５５）の増殖を、アラ
ビノース濃度の関数として試験した。図７は、この融合株の増殖が、アラビノー
ス濃度に依存することを示し、このことは、異種調節エレメントによるｍｕｒＡ
の調節を実証し、そして低いアラビノース濃度では、ｍｕｒＡの関数が細胞増殖
についての制限であることを示す。
【００８９】 （実施例３：ホスホマイシンに対するＶＥＣＯ２０５５の感受性） ＰBAD−ｍｕｒＡ融合株（ＶＥＣＯ２０５５）およびその親株（ＶＥＣＯ２０
５４）を用いて実験を行い、異なるアラビノース濃度でのホスホマイシンに対す
るそれらの感受性を比較した。ホスホマイシンは、ｍｕｒＡ遺伝子産物を標的と
する抗生物質である。Ｋａｈａｎら（１９７４）Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．２３５：３６４−３８６。
【００９０】 （接種物の調製） 細胞を、０．１％アラビノースを補充した５ｍｌのＬＢ中で、３５℃および２
００ｒｐｍでロータリーシェーカーにおいて一晩増殖させた。１００μｌの一晩
培養物を、収集し、室温にて１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして細
胞ペレットを、アラビノースを添加していない１ｍｌのＬＢ中に懸濁した。細胞
懸濁物を、ＬＢ中に１：１０００で希釈し、そして接種物として用いた。
【００９１】 （チェッカーボードアッセイのための９６ウェルプレートの調製） チェッカーボードアッセイを、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて
行った。ここで、アラビノース濃度を１次元目で変化させ、そしてホスホマイシ
ン濃度を２次元目で変化させた。ホスホマイシン濃度は、行の間で２倍変化した
；希釈を、種々の濃度のアラビノースを補充したＬＢ、またはアラビノースを欠
くＬＢにおいて行った。ホスホマイシンを欠くコントロールの行、およびアラビ
ノースを欠くコントロールの列もまた含めた。各ウェルにおける総容量は、５０
μｌであった。
【００９２】 （プレートの接種およびインキュベーション） ５０μｌの接種物（すなわち、希釈した細胞懸濁物）を、各ウェルに添加した
。３５℃での２０時間のインキュベーション後、細胞増殖を、各ウェルにおいて
測定し、そして接種物を有さないウェルと比較した。
【００９３】 図８に示す結果は、野生型と比較したホスホマイシンの最少阻止濃度（ＭＩＣ
）を、アラビノース濃度の関数としてＰBAD−ｍｕｒＡ融合株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｖ
ＥＣＯ２０５５について示す。この結果は、野生型細胞についてのＭＩＣよりも
高いＭＩＣ値および低いＭＩＣ値が、アラビノースレベルの調節によって融合株
において達成され得ることを実証する。
【００９４】 （実施例４：ホスホマイシンに対するＶＥＣＯ２０５５の感受性の、ｍｕｒＡ
遺伝子産物を標的としない抗生物質に対する感受性との比較） ＰBAD−ＭｕｒＡ融合株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＶＥＣＯ２０５５）について実験を
行って、ホスホマイシンに対するその感受性を、ｍｕｒＡ遺伝子産物を標的とし
ないいくつかの他の抗生物質（テトラサイクリンおよびシプロフロキサシン）に
対するその感受性と比較した。
【００９５】 （接種物の調製） 細胞培養および接種物の調製を、上記の実施例３に記載されるように行った。
【００９６】 （チェッカーボードアッセイのための９６ウェルプレートの調製） チェッカーボードアッセイを、９６ウェルマイクロタイターにおいて行った。
ここで、アラビノース濃度を１次元目で変化させ、そして抗生物質濃度を２次元
目で変化させた。抗生物質濃度は、行の間で２倍変化した；希釈を、種々の濃度
のアラビノースを補充したＬＢ、またはアラビノースを欠くＬＢにおいて行った
。抗生物質を欠くコントロールの行、およびアラビノースを欠くコントロールの
列もまた含めた。各ウェルにおける総容量は、５０μｌであった。ホスホマイシ
ン、テトラサイクリン、またはシプロフロキサシンを用いて類似のアッセイを行
ない、これらの抗生物質への感受性に対するアラビノースの影響を試験した。
【００９７】 （プレートの接種およびインキュベーション） ５０μｌの接種物（すなわち、希釈した細胞懸濁物）を、各ウェルに添加した
。３５℃での２０時間のインキュベーション後、細胞増殖を、各ウェルにおいて
測定し、そして接種物を有さないウェルと比較した。図９は、テトラサイクリン
およびシプロフロキサシンに対する株ＶＥＣＯ２０５５の感受性が、培地中のア
ラビノースの存在とは独立していたことを示す。シプロフロキサシンおよびテト
ラサイクリンに対する感受性で観察された変動は、ＭＩＣ決定においてえられる
変動を代表する。ホスホマイシンに対する感受性は、アラビノース濃度に依存し
ていた。このことは、図８に示された結果を確認する。増殖を支持するために必
要とされる最少濃度のアラビノースは、５×１０-5％であった。
【００９８】 ホスホマイシンに対する株ＶＥＣＯ２０５５の感受性は、培地中に存在するア
ラビノースの量と強く関連していた。野生型に適合性のＭＩＣは、十分なアラビ
ノースを培地に添加した場合に達成可能であった。細胞は、濃度依存性様式で、
より低い濃度のホスホマイシンに対してより感受性になった。最低のＭＩＣと最
高のＭＩＣとの間の感受性の相違は、約１００倍であった。テトラサイクリンお
よびシプロフロキサシンに対する感受性は、一定のままであり、そしてアラビノ
ース濃度とは独立していた。
【００９９】 （実施例５：ＭｕｒＡの新規なインヒビターの同定および確認） （接種物の調製） 細胞培養および接種物の調製を、上記の実施例３に記載されるように行った。
Ｅ．ｃｏｌｉ ＶＥＣＯ２０５５を全ての実験において用いた。
【０１００】 （スクリーニング） マイクロタイタープレートを、スクリーニングのために用いた。ウェルは、０
、０．０００４、または０．００２％のアラビノースを有するＬＢを含んでいた
。８０個の関連のない化合物を試験した；試験化合物を、２、４、および８μｇ
／ｍｌの最終濃度でウェルに添加した。５０μｌの接種物を各ウェルに添加し、
そしてこのプレートを、３５℃にてインキュベートした。増殖を、２４時間後お
よび４０時間後に測定した。より高いアラビノース濃度（０．００２％）でイン
キュベートした細胞の増殖は、いずれの試験化合物によっても阻害されなかった
。細胞をより低いアラビノース濃度（０．０００４％）でインキュベートした場
合、化合物４７−７−７０は、試験した３つの濃度全てで増殖を阻害した唯一の
試験化合物であった。コントロールとして、ホスホマイシンについてのＭＩＣを
、各アラビノース濃度で決定した。
【０１０１】 （ＭｕｒＡ活性の阻害） 精製したＭｕｒＡの酵素活性を、上記のスクリーニングで用いた同じ試験化合
物の存在下でアッセイした。種々の濃度の試験化合物を、７μｇ／ｍｌ Ｍｕｒ
Ａを含む緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８；０．２ｍＭ ＵＤＰ−
Ｎ−アセチルグルコサミン）に添加した。反応は、０．１ｍＭでのホスホエノー
ルピルベートの添加により始まり、そしてこの反応混合物を２５℃にて３０分間
インキュベートした。放出されたリン酸を、マラカイトグリーン試薬を用いて測
定し、そして分光測光法によって定量した。化合物４７−７−７０のみが、８μ
ｇ／ｍｌのＩＣ50である阻害活性を示した。
【０１０２】 （アラビノース濃度の関数としての化合物４７−７−７０に対するＶＥＣＯ２
０５５の感受性） 上記の実施例３において記載されるのと同様に、チェッカーボードアッセイを
、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて行った。化合物４７−７−７０
の濃度を１次元目において変化させ、そしてアラビノース濃度を他の次元におい
て変化させた。化合物４７−７−７０を欠くコントロールの行、およびアラビノ
ースを欠くコントロールの列はまた、プレートに含まれていた。さらに、化合物
４７−７−７０の代わりにホスホマイシンの希釈物を含むコントロールのプレー
トもまた試験した。
【０１０３】 上記の実施例３に記載されるように調製した５０μ１のＶＥＣＯ２０５５接種
物を、各ウェルに添加した。このプレートを、３５℃にて２０時間インキュベー
トした。この時点で、細胞増殖を測定し、そして接種物を受けなかったウェルに
おける細胞増殖と比較した。結果を、表３に示す。理解され得るように、化合物
４７−７−７０に対するＶＥＣＯ２０５５の感受性の増加は、ＭｕｒＡ酵素の阻
害によって細胞増殖をブロックする化合物について予想されるように、培地中で
のより低い濃度のアラビノースと相関していた。
【０１０４】
【表３】
【０１０５】 （実施例６：強固に調節されたマルトース調節系の構築および特性） ＭａｌＲは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおいてマルトサッカリドレギュロン
の発現を制御するリプレッサーであり、そしてＬａｃＩ−ＧａＩＲファミリーの
リプレッサーに属する。２つのオペロンは、対向する方向で（ｍａｌＸＣＤ （
Ｐｘプロモーター）およびｍａｌＭＰ（Ｐｍプロモーター））調節される。図１
（配列番号１）を参照のこと。Ｐｍに対するＭａｌＲの親和性は、Ｐｘに対して
の親和性よりも高く、両方の場合において、高い基底レベルの発現が報告されて
いる。Ｎｉｅｔｏら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３０８６０
〜３０８６５。本実施例は、Ｐｘプロモーターのより強固な調節が、リプレッサ
ー部位を改変し、そして最少培地中で細胞を増殖させることにより、得られ得る
ことを示す。
【０１０６】 本実施例に用いたＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
ＶＳＰＮ３０２６、Ｐｘ制御下でｋａｔＡを有するＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
ＶＳＰＮ３０２１、改変されたＰｘ制御下でｋａｔＡを有するＳ．ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉｅ ＶＳＰＮ３０２５、および上流でＰｍを有するＰｘ制御下でｋａｔＡ
を有するＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉｅ ＶＳＰＮ３０２２である。
【０１０７】 （ＶＳＰＮ３０２１の構築） Ｐｘを、ＶＳＰＮ３０２６から、オリゴヌクレオチドＭＡＬ１およびＭＡＬ２
を用いてＰＣＲ増幅し（表４）、そしてＴテールＰｉｎＰｏｉｎｔ Ｘａ−１
Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ
）中にクローニングした。この構築物を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し
、そして３８７ｂｐのＰｘ含有フラグメントをｐＲ３２６ベクター中にクローニ
ングして、ｐＲ３２６ＭＸを作製した。発現を測定するために用いられるレポー
ター遺伝子は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ ６６３３由来のカタラーゼに
ついての遺伝子ｋａｔＡであった。ｋａｔＡをコードする遺伝子を、オリゴヌク
レオチドＫＡＴ１およびＫＡＴ２を用いてＰＣＲ増幅し（表４）、そしてｐＲ３
２６ＭＸのＮｄｅＩ部位にクローニングして、ｐＲ３２６ＭＸＫを作製した。
【０１０８】 さらなるＤＮＡ配列をこの構築物に添加して、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉｅ染色体
の非必須ＤＮＡ配列への挿入を標的化した。この目的のために、ｃｐｂＡ遺伝子
の３００ｂｐのフラグメントを、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ＶＳＰＮ３０２６の
ＤＮＡから、オリゴヌクレオチドＣＰＢ１およびＣＰＢ２を用いてＰＣＲ増幅し
（表４）、そして増幅産物を、ｐＲ３２６ＭＸＫのＣｌａｌ部位に挿入してｐＲ
３２６ＭＸＫＣを作製した。このプラスミドを用いて、ＶＳＰＮ３０２６を形質
転換し、そしてＣｌａｖｅｒｙｓら（１９９５）Ｇｅｎｅ １６４：１２３−１
２８の挿入重複変異誘発法に従って、染色体中に挿入を保有するＳ．ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ株ＶＳＰＮ３０２１を構築した。
【０１０９】 （ＶＳＰＮ３０２５の構築） Ｐｘのリプレッサー結合部位を含むＤＮＡ配列を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部
位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を
用いることにより変異誘発させて、ＧＧＡをＧＣＧへと変換した（図１を参照の
こと）。オリゴヌクレオチドＭＡＬ６およびＭＡＬ６Ｃ（表４）をプライマーと
して用い、そしてｐＲ３２６ＭＸＫＣをテンプレートとして用いた。ＭＡＬ６Ｃ
が変異配列を含むことに留意されたい。Ｐｘにおける変異を有する、得られるプ
ラスミドを、ｐＲ３２６ＭＭＸＫＣと名づけた。このプラスミドを用いてＶＳＰ
Ｎ３０２６を形質転換し、そして染色体中に挿入を保有するＳ．ｐｎｅｕｍｏｎ
ｉｅ株ＶＳＰＮ３０２５を構築した。
【０１１０】 （ＶＳＰＮ３０２２の構築） ＰｘおよびＰｍ調節領域を、オリゴヌクレオチドＭＡＬ３およびＭＡＬ２（表
４）を使用して、ＶＳＰＮ３０２６からＰＣＲ増幅し、そしてＴテール（ｔａｉ
ｌｅｄ）ＰｉｎＰｏｉｎｔ Ｘａ−１ Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中にクローニングした。この構築物を
ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そしてＰｘおよびＰｍ含有フラグメント
をｐＲ３２６ベクター中にクローニングして、ｐＲ３２６ＭＸＭを作製した。カ
タラーゼ遺伝子を、この調節領域の制御下で、上記のように挿入し、ｐＲ３２６
ＭＸＭＫＣを作製した。このプラスミドを使用して、ＶＳＰＮ３０２６を形質転
換し、そして染色体中に挿入物を保有するＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株、ＶＳＰ
Ｎ３０２２を構築した。
【０１１１】
【表４】
【０１１２】 （カタラーゼアッセイ） カタラーゼ活性を、グルコースを除いた培地Ｃ＋Ｙ（Ｔｏｍａｓｚ（１９７０
）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１０１：８６０〜８７１）およびグルコースを除い
た最少培地ＣＤＥＮ中で増殖された細胞培養物において測定した。Ｒａｎｅら（
１９４０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４０：６９５〜７０４。細胞を、中期対数
増殖期で収集し、遠心分離し、そして０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含
有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８中に再懸濁した。細胞の自己
溶解（ａｕｔｏｌｙｓｉｓ）の後、１０μｌの抽出物を、１ｍｌの１．５ｍＭ
Ｈ2Ｏ2に添加し、そしてこの反応を、スコポレチン（ｓｃｏｐｏｌｅｔｉｎ）で
蛍光比色法で測定した。１単位のカタラーゼ活性は、２２℃で１分間当たり１μ
ｍｏｌ Ｈ2Ｏ2の加水分解である（表５を参照のこと）。
【０１１３】
【表５】
【０１１４】 このデータ（カタラーゼ活性の単位として表される）は、マルトース調節系の
よりしっかりした調節が、最少培地（ＣＤＥＮ）を使用する場合に得られ得るこ
と、そして最もしっかりした調節が、改変されたＰｘプロモーター（ＶＳＰＮ３
０２５）を使用する場合に得られることを示す。
【０１１５】 （実施例７：Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ａｇａプロモーターによるＳ．ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｐｉ遺伝子のラフィノース調節性発現） （Ａ．転写融合物の構築） Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｒａｆＲおよびＰAGA（ａｇａプロモーター）を
含むＤＮＡ配列を、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＶＳＰＮ３０２６染色体ＤＮＡ
から、オリゴヌクレオチドＲＥＧＡＧＡＥＩ５’（配列番号２０、表６）および
ＲＥＧＡＧＡＮＢ３’（配列番号２１、表６）を使用して、ＰＣＲ増幅し、そし
て組み込み型ベクターｐＲ３２６（Ｃｌａｖｅｒｙｓら、前出）中に、ＥｃｏＲ
Ｉ／ＮｄｅＩフラグメントとしてクローニングして、プラスミドｐＲ３２６Ｒａ
ｆＲＰａｇａを作製した。Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ Ｒ６染色体ＤＮＡ由来の
リーダーペプチダーゼ遺伝子（ｓｐｉ）の初めの２７０ｂｐを含むＤＮＡフラグ
メントを、オリゴヌクレオチドＭＡＬＳＰＩ５’（配列番号２２、表６）および
ＭＡＬＳＰＩ３’（配列番号２３、表６）を使用して、ＰＣＲ増幅し、そしてＮ
ｄｅＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとして、プラスミドｐＲ３２６ＲａｆＲＰａｇ
ａ中にクローニングし、プラスミドｐＲ３２６ＲＰＡＳＰＩを得た。
【０１１６】 このプラスミドをテンプレートとして使用して、ＰAGA配列およびｓｐｉ配列
のみを含むＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドＰａｇａ５’ＥＩ（配列
番号２４、表６）およびＭＡＬＳＰＩ３’（配列番号２３、表６）を使用して、
増幅し、そしてＴテール化ｐＧＥＭ−Ｔ ＥＡＳＹベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中にクローニングした。この
構築物を、ＥｃｏＲＩで消化し、そしてＰAGA−ｓｐｉ含有フラグメントを、組
み込み型ベクターｐＲ３２６中にクローニングして、ＰＲ３２６ＰａｇａＳｐｉ
を作製した。このプラスミドを使用して、スクロースを除いてかつ０．２％ラフ
ィノースで補充されたＣ＋Ｙ（Ｃ＋Ｙ＋Ｒａｆ）中で増殖されたＶＳＰＮ３０２
６を形質転換した。形質転換体を、クロラムフェニコール（２．５μｇ／ｍｌ）
およびラフィノース（０．２％）で補充したＴＳＡヒツジ血液プレート上にプレ
ートし、そして３７℃／５％ＣＯ2で一晩インキュベートした。クロラムフェニ
コール耐性株を、Ｃ＋Ｙ＋Ｒａｆ培地中で培養した。
【０１１７】 挿入の部位を、単離物のうちの１つ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＶＳＰＮ３
０４１において検証した。ｓｐｉ遺伝子中の標的部位における挿入を、プライマ
ーＰａｇａ１００（配列番号２５、表６）およびＳｐｉ３’ＳＰｎ（配列番号２
６、表６）を使用して、ＰＣＲにより検証した。この分析は、ＶＳＰＮ３０４１
が、天然のプロモーター制御下の短縮型２７０ｂｐのｓｐｉ遺伝子、およびＰAG A 制御下の完全なｓｐｉ遺伝子を保有したことを示した。
【０１１８】
【表６】
【０１１９】 （Ｂ．ラフィノースによるＶＳＰＮ３０４１の増殖の調節） ＶＳＰＮ３０４１は、ＰAGAの制御下で必須遺伝子（ｓｐｉ）を保有するので
、この株は、増殖についてはラフィノースに依存するはずである。従って、ＶＳ
ＰＮ３０４１および親の同系株ＶＳＰＮ３０２６の増殖に対するラフィノースの
効果を比較した。
【０１２０】 ９６ウェルプレートの調製：９６ウェルマイクロタイタープレートを実験に使
用した。ラフィノース（Ｃ＋Ｙ培地中）の２倍希釈系列を、複数のカラム（ラフ
ィノースを添加しなかった１つのカラムを含む）にわたって実行した。各ウェル
の全容量は、５０μｌであった。
【０１２１】 接種物の調製：ＶＳＰＮ３０４１およびＶＳＰＮ３０２６を、５ｍｌのＣ＋Ｙ
＋ｒａｆ中３７℃で４時間増殖した。１０μｌの培養物を、１％スクロースを含
む１０ｍｌのＣ＋Ｙに添加し、３７℃で６時間インキュベートし、次いで１５％
グリセロール溶液として凍結した。２×１０6のコロニー形成単位／ｍｌを含む
、スクロースを除いているＣ＋Ｙにおける凍結ストックの１：１０希釈物を、接
種物として使用した。
【０１２２】 ９６ウェルプレートにおける細菌の増殖：５０μｌの接種物を各ウェルに添加
し、１００μｌの最終容量を得た。プレートを、３５℃でインキュベートし、そ
して増殖を、１０時間後まで１時間毎にモニターした。
【０１２３】 結果：図１０は、光学密度により測定された、異なるラフィノース濃度でのＶ
ＳＰＮ３０４１の増殖を示す。融合株の増殖は、ラフィノース濃度に依存するこ
とが明確であり、このことは必須遺伝子が、ＶＳＰＮ３０４１においてラフィノ
ースにより調節されることを実証する。図１１に示される実験において、ラフィ
ノース上でのＶＳＰＮ３０４１の増殖は、スクロース上での増殖と比較される（
それぞれの糖は、培地中に０．２％Ｗ／Ｖで存在する）。この実験の結果は、Ｖ
ＳＰＮ３０４１がラフィノースの非存在下で増殖しないことを示し、このことは
、必須遺伝子が、この株において、ラフィノースにより正に調節されることを再
度実証する。図１２は、異なるラフィノース濃度での、ＶＳＰＮ３０４１および
この親の同系株ＶＳＰＮ３０２６の増殖を比較する。この結果は、ＶＳＰＮ３０
４１がラフィノースに依存し、一方、親株の増殖がラフィノースに依存しないこ
とを示す。
【０１２４】 その親株と比較したＶＳＰＮ３０４１のラフィノース依存性表現型は、ＰAGA
が、ＶＳＰＮ３０４１における必須遺伝子の発現を制御することを示す。ＶＳＰ
Ｎ３０４１とその親との間の差異がＰAGA制御下にｓｐｉ遺伝子を置く挿入であ
る場合、ＶＳＰＮ３０４１において必須なラフィノース調節性遺伝子は、ｓｐｉ
遺伝子（またはｓｐｉの下流の遺伝子）である。従って、ラフィノースに応答し
てＰAGAプロモーターにより調節される、ＶＳＰＮ３０４１中のｓｐｉ遺伝子（
またはその下流の遺伝子）は、低濃度のラフィノースでの細胞増殖に対する律速
である。増殖は、この必須遺伝子の発現に依存し、かつ誘導のレベルは、制御さ
れ得るので、ＶＳＰＮ３０４１の増殖は、ＰAGAプロモーターの誘導または抑制
により制御され得る。
【０１２５】 （実施例８：ＰBAD−ｄｅｆ転写融合物を含む株の構築および特性） （Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰBAD−ｄｅｆ転写融合物の構築） ｄｅｆ遺伝子の産物である酵素ペプチジルデホルミラーゼは、細菌におけるタ
ンパク質合成に主要な役割を果たす。全長ｄｅｆ遺伝子を含むＤＮＡ配列を、オ
リゴヌクレオチドＤＹＶ−１５７（配列番号２７）およびＤＹＶ−１５８（配列
番号２８）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９の染色体ＤＮＡからＰＣＲ増
幅し、そしてＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントとして、発現ベクターｐＢＡＤ
−ＭｙｃＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｉｔｏｎ、Ｃａｒｌ
ｓｂａｄ、ＣＡ）中にクローニングし、ｐＤＹ８を作製した。オリゴヌクレオチ
ド配列を表７に示す。
【０１２６】 ｐＤＹ２０を、プライマーＤＹＶ−０８７（配列番号３５）およびＤＹＶ−０
８８（配列番号３６）を用いて、プラスミドｐＢＳＬ９９由来のカナマイシン耐
性カセットのＰＣＲ増幅により作製し、そしてＸｂａ／ＳａｃＩフラグメントと
してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏ
ｌｌａ、ＣＡ）中にクローニングした。ｄｅｆ配列の上流６００塩基対を、オリ
ゴヌクレオチドＤＹＶ−１５５（配列番号２９）およびＤＹＶ−１５６（配列番
号３０）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅し
、そしてＳａｃＩ／ＡｓｃＩフラグメントとしてベクターｐＤＹ２０中にクロー
ニングしてｐＤＹ９を作製した。オリゴヌクレオチド配列を表７に示す。
【０１２７】 自殺ベクターｐＫＯ３（Ｌｉｎｋら、前出）を選択して、ｄｅｆ遺伝子との対
立遺伝子置換の手順を実行した。ｐＫＯ３は、温度感受性ｐＳＣ１０１複製起点
および逆選択のためのｓａｃＢ遺伝子を含む、クロラムフェニコール耐性ベクタ
ーである。ｐＫＯ３誘導体化プラスミドは、４３℃で自律複製し得る。ｐＫＯ３
構築物を保有する宿主株を、クロラムフェニコールを含む培地上に４３℃でプレ
ートした場合、染色体組み込み体を選択し得る。上昇した温度での宿主染色体中
へのｐＫＯ３構築物の組み込みは、ｐＫＯ３中にクローニングされたＥ．ｃｏｌ
ｉ ＤＮＡとＥ．ｃｏｌｉ染色体との間の相同組換えを介して生じる。
【０１２８】 ａｒａＣ−ＰBAD−ｄｅｆカセットを、ｐＤＹ８からＮｄｅＩ／ＢｅｇｌＩＩ
フラグメントとして切り出し、上流のｄｅｆ−カナマイシンカセットを、ｐＤＹ
９からＥｃｌ１３６ＩＩ／ＮｄｅＩフラグメントとして切り出した。精製したフ
ラグメントを、Ｓｍａ１／ＢａｍＨＩ消化したｐＫＯ３と３点（ｔｈｒｅｅ−ｗ
ａｙ）で連結してクローニングし、ｐＤＹ１５を作製した。
【０１２９】 ｐＤＹ１５を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＶＥＣＯ２０５４内に導入した。形質転換体を
、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（２５μｇ／ｍ
ｌ）を補充したＬＢプレート上で、３０℃で一晩インキュベートして選択した。
多くの形質転換体を、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）、カナマイシン
（２５μｇ／ｍｌ）およびアラビノース（０．２％）を補充したＬＢプレート上
に画線して、そして４３℃で一晩インキュベートした。次いで、単離したコロニ
ーを、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）およびアラビノース（０．２％）を補充
したＬＢプレート上に画線して、そして３７℃で一晩インキュベートした。次い
で、単離したコロニーを、６％スクロースを補充した同じ培地（ＬＢ＋ｋａｎ＋
ａｒａ）上に画線し、そして３７℃で一晩インキュベートして、スクロース耐性
組換え体について選択した。このスクロース耐性選択工程の間、ＮａＣｌをＬＢ
プレートから除去した。スクロース耐性組換え体を、クロラムフェニコール感受
性かつアラビノース依存性増殖についてスクリーニングした。クローンＶＥＣＯ
２０６５（ａｒａＣ−ＰBAD−ｄｅｆ）におけるｄｅｆ遺伝子の染色体置換を、
ＰＣＲプライマー対ＤＹＶ−０６９（配列番号３７）／ＤＹＶ−０８２（配列番
号１０）およびＤＹＶ−０７３（配列番号９）／ＤＹＶ−１５５（配列番号２９
）を用いて、染色体の結合部から誘導される特異的なＰＣＲ産物についてアッセ
イすることにより確認した。プライマー配列については、表２および表７を参照
のこと。
【０１３０】 （Ｂ．ＶＲＣ４８３および他の抗菌剤に対するＶＥＣＯ２０６５（ＰBAD−ｄ
ｅｆ）株の感受性） アラビノース濃度のある範囲にわたる、ＶＥＣＯ２０６５株およびその親株（
ＶＥＣＯ２０５４）のＶＲＣ４８３に対する感受性を比較するために、それらの
株を使用して実験を行った。ＶＲＣ４８３は、ｄｅｆ遺伝子産物を標的とする抗
菌活性を有する化合物である。この化合物を、デホルミラーゼスクリーニングに
おいて変色（Ｖｅｒｓｉｃｏｒ）で同定し、そしてＩＣ50は、Ｅ．ｃｏｌｉデホ
ルミラーゼについて１１ｎＭである。デホルミラーゼ活性は、Ｒａｊａｇｏｐａ
ｌａｎら（１９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：１３９１０−１３９１８
に記載のように測定した。無関係の抗生物質ホスホマイシンおよびシプロフロキ
サシンに対するＶＥＣＯ２０６５の感受性もまた試験した。
【０１３１】 （１．接種物の調製） 細胞を、３５℃で２００ｒｐｍのロータリーシェーカ
ー上の、０．１％アラビノースを補充した５ｍｌのＬＢ中で一晩増殖させた。１
００μｌの一晩培養物を収集し、１４，０００ｒｐｍで５分間、室温で遠心分離
し、その細胞ペレットを、アラビノース非添加の１ｍｌの培地中に再懸濁した。
細胞懸濁物を、培地中に１：１０００で希釈して、そして接種物として使用した
。
【０１３２】 （２．９６ウェルプレートの調製） チェッカーボードアッセイを、９６ウェ
ルのマイクロタイタープレート中で行った。ここでは、アラビノース濃度を、第
１次元において変化させ、そして抗菌性化合物の濃度を、第２次元において変化
させた。抗菌剤の濃度は、行間で２倍に変化した。異なる濃度のアラビノースを
補充した培地中またはアラビノースを欠く培地中で、希釈を行った。抗菌剤を欠
くコントロール行およびアラビノースを欠くコントロール列もまた含んだ。各ウ
ェル中の総容量は５０μｌであった。
【０１３３】 （３．プレートの接種およびインキュベーション） ５０μｌの接種物（すな
わち、希釈した細胞懸濁物）を、各ウェルに添加した。３５℃で２０時間のイン
キュベーション後、細胞増殖を各ウェルにおいて測定し、非接種のウェルに対し
て比較した。
【０１３４】 （４．結果） 図１３は、ＰBAD−ｄｅｆ株ＶＥＣＯ２０６５についてのＶＲ
Ｃ４８３の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を、アラビノースの濃度の関数として示す。
親野生型株（ＶＥＣＯ２０５４）は、試験した範囲においてＶＲＣ４８３に感受
性でなかった。ＶＥＣＯ２０６５は、低アラビノース濃度でＶＲＣ４８３に感受
性であり、そしてその感受性は、誘導物質の濃度に反比例的に関連した。ｄｅｆ
遺伝子の産物を標的化しない化合物（例えば、ホスホマイシンおよびシプロフロ
キサシン）に対するＶＥＣＯ２０６５の感受性は、アラビノース濃度に伴い変化
しなかった。
【０１３５】 （実施例９：ＰBAD−ｆｏｌＡ転写融合体を含む株の構築および特性） （Ａ．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰBAD−ｆｏｌＡ転写融合体の構築） ｆｏｌＡ遺伝子の産物は、ジヒドロ葉酸レダクターゼである。この酵素は、細
菌中の葉酸合成に関与している。全長ｆｏｌＡ遺伝子を含むＤＮＡ配列を、Ｅ．
ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９の染色体ＤＮＡから、オリゴヌクレオチドＤＹＶ−０９５
（配列番号３１）およびＤＹＶ−０９６（配列番号３２）を使用してＰＣＲ増幅
し、そしてＮｃｏ１／ＢｅｇｌＩＩフラグメントを、発現ベクターｐＢＡＤ−Ｍ
ｙｃＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂ
ａｄ，ＣＡ）内へクローニングして、ｐＤＹ５を作製した。オリゴヌクレオチド
配列を、表７に与える。
【０１３６】 上流ｆｏｌＡ配列の６００塩基対を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０９の染色体ＤＮ
Ａから、オリゴヌクレオチドＤＹＶ−０９３（配列番号３３）およびＤＹＶ−０
９４（配列番号３４）を使用してＰＣＲ増幅し、そしてＳａｃＩ／ＡｓｃＩフラ
グメントを、ベクターｐＤＹ２０（実施例８を参照のこと）内にクローニングし
て、ｐＤＹ６を作製した。オリゴヌクレオチド配列を、表７に与える。
【０１３７】 ａｒａＣ−ＰBAD−ｆｏｌＡカセットを、ｐＤＹ５からＮｄｅＩ／ＢｅｇｌＩ
Ｉフラグメントとして切り出し、上流のｆｏｌＡ−カナマイシンカセットを、ｐ
ＤＹ６からＥｃｌ１３６ＩＩ／ＮｄｅＩフラグメントとして切り出した。精製し
たフラグメントを、Ｓｍａ１／ＢａｍＨＩ消化したｐＷＭ９５と３点で連結して
クローニングし、ｐＤＹ４２を作製した。
【０１３８】 ｐＤＹ４２を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＶＥＣＯ２０５４内に導入した。形質転換体を
、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を
補充したＬＢプレート上で、３７℃で一晩インキュベートして選択した。多くの
形質転換体を、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）およびアラビノース（０．２％
）を補充したＬＢプレート上に画線して、そして３７℃で一晩インキュベートし
た。単離したコロニーを選び取り、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）およびアラ
ビノース（０．２％）を補充したＬＢプレート上に再画線して、そして３７℃で
一晩インキュベートした。次いで、単離したコロニーを、６％スクロースを補充
した同じ培地（ＬＢ＋ｋａｎ＋ａｒａ）上に画線し、そして３７℃で２４時間イ
ンキュベートした。次いで、プレートを室温でさらに２４時間インキュベートし
て、スクロース耐性組換え体について選択した。このスクロース耐性選択程の間
、ＮａＣｌをＬＢプレートから除去した。スクロース耐性組換え体を、アンピシ
リン感受性かつアラビノース依存性増殖についてスクリーニングした。クローン
ＶＥＣＯ２０７９（ａｒａＣ−ＰBAD−ｆｏｌＡ）におけるｆｏｌＡ遺伝子の染
色体置換を、ＰＣＲプライマー対ＤＹＶ−０９３（配列番号３３）／ＤＹＶ−１
６３（配列番号３８）およびＤＹＶ−１０７（配列番号３９）／ＤＹＶ−２１８
（配列番号４０）を用いて、染色体の結合部から誘導される特異的なＰＣＲ産物
についてアッセイすることにより確認した。プライマー配列については、表７を
参照のこと。
【０１３９】 （Ｂ．トリメトプリムおよび他の抗菌剤に対するＶＥＣＯ２０７９（ＰBAD−
ｆｏｌＡ）株の感受性） アラビノース濃度のある範囲にわたる、ＶＥＣＯ２０７９株およびその親株（
ＶＥＣＯ２０５４）のトリメトプリムに対する感受性を比較するために、それら
の株を使用して実験を行った。トリメトプリムは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（
ｆｏｌＡ遺伝子の産物）を標的化する抗菌活性を有する化合物である。Ｈｕｏｖ
ｉｎｅｎら（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈ
ｅｒ．３９（２）：２７９−２８９。無関係の抗生物質ホスホマイシンおよびシ
プロフロキサシンに対するＶＥＣＯ２０７９の感受性もまた試験した。
【０１４０】 （１．接種物の調製） 細胞を、３５℃で２００ｒｐｍのロータリーシェーカ
ー上の、０．１％アラビノースを補充した５ｍｌのＬＢ中で一晩増殖させた。１
００μｌの一晩培養物を収集し、１４，０００ｒｐｍで５分間、室温で遠心分離
し、その細胞ペレットを、アラビノース非添加の１ｍｌの培地中に懸濁した。細
胞懸濁物を、培地中に１：１０００で希釈して、そして接種物として使用した。
【０１４１】 （２．９６ウェルプレートの調製） チェッカーボードアッセイを、９６ウェ
ルのマイクロタイタープレート中で行った。ここでは、アラビノース濃度を、第
１次元において変化させ、そして抗菌性化合物の濃度を、第２次元において変化
させた。抗菌剤の濃度は、行間で２倍に変化した。異なる濃度のアラビノースを
補充した培地中またはアラビノースを欠く培地中で、希釈を行った。抗菌剤を欠
くコントロール行およびアラビノースを欠くコントロール列もまた含んだ。各ウ
ェル中の総容量は５０μｌであった。
【０１４２】 （３．プレートの接種およびインキュベーション） ５０μｌの接種物（すな
わち、希釈した細胞懸濁物）を、各ウェルに添加した。３５℃で２０時間のイン
キュベーション後、細胞増殖を各ウェルにおいて測定し、非接種のウェルに対し
て比較した。
【０１４３】 （４．結果） 図１４は、親野生株であるＶＥＣＯ２０５４と比較したＰBAD
−ｆｏｌＡ株（ＶＥＣＯ２０７９）についてのアラビノース濃度の関数とした、
トリメトプリムの最小阻害濃度（ＭＩＣ）を示す。この結果は、ｆｏｌＡインヒ
ビターであるトリメトプリムのＭＩＣが、ＰBAD−ｆｏｌＡ株（ＶＥＣＯ２０７
９）においてアラビノース濃度に依存したことを示す；一方、野生型株について
のトリメトプリムのＭＩＣ値は、アラビノース濃度に依存しなかったことを示す
。図１４はまた、ｆｏｌＡ遺伝子産物（例えば、ホスホマイシンおよびシプロフ
ロキサシン）を標的としない化合物に対するＶＥＣＯ２０７９の感受性が、アラ
ビノース濃度に伴って変化しなかったことを示す。
【０１４４】 （実施例１０：ＰBAD−ｇｙｒＢ転写融合物を含む株の構築およびその特性） （Ａ．Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰBAD−ｇｙｒＢ転写融合物の構築） ｇｙｒＢ遺伝子産物は、細菌性ＤＮＡトポイソメラーゼであるジャイレースの
βサブユニットである。全長のｇｙｒＢ遺伝子を含むＤＮＡ配列を、オリゴヌク
レオチドＤＹＶ−０９９（配列番号４１）およびＤＹＶ−２０４（配列番号４２
）を用いてＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅し、そし
てＮｃｏＩ／ＰｓｔＩフラグメントとして発現ベクターｐＢＡＤ−ＭｙｃＨｉｓ
Ｂ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ
）にクローニングしてｐＤＹ３４を作製した。オリゴヌクレオチド配列を表７に
示す。
【０１４５】 ｇｙｒＢ配列の上流６００塩基対を、オリゴヌクレオチドＤＹＶ−０９７（配
列番号４３）およびＤＹＶ−０９８（配列番号４４）を用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｊ
Ｍ１０９株の染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅し、そしてＳａｃＩ／ＡｓｃＩフラグ
メントとしてベクターｐＤＹ２０（実施例８を参照のこと）にクローニングし、
ｐＤＹ３８を作製した。オリゴヌクレオチド配列を表７に示す。
【０１４６】 ＮｄｅＩ／Ｘｂａフラグメントとして、ｐＤＹ３４からａｒａＣ−ＰBAD−ｇ
ｙｒＢカセットを切り出し、そしてＥｃｌ１３６ＩＩ／ＮｄｅＩフラグメントと
してｐＤＹ３８から上流ｇｙｒＢ−カナマイシンカセットを切り出した。これら
の精製フラグメントをＳｍａｌ／ＸｂａＩで消化させたｐＷＭ９５を用いて３つ
の連結方法でクローニングし、ｐＤＹ４０を作製した。
【０１４７】 ｐＤＹ４０をＥ．ｃｏｌｉ ＶＥＣＯ２０５４株に導入した。形質転換体を、
アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を補
充したＬＢプレート上で選択し、３７℃で一晩インキュベートした。多くの形質
転換体を、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）およびアラビノース（０．２％）を
補充したＬＢプレート上に画線した。単離したコロニーを拾い、そして同じ培地
（ＬＢ＋ｋａｎ＋ａｒａ）上に再画線し、そして３７℃で一晩インキュベートし
た。次いで単離したコロニーを、６％スクロースを補充した同じ培地（ＬＢ＋ｋ
ａｎ＋ａｒａ）上に画線し、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、こ
のプレートを室温でさらに２４時間インキュベートし、スクロース耐性組換え体
を選択した。スクロース耐性を選択する間、ＬＢプレートからはＮａＣｌを省い
た。スクロース耐性組換え体をアンピシリン感受性およびアラビノース依存性増
殖についてスクリーニングした。クローンＶＥＣＯ２０８３（ａｒａＣ−ＰBAD
−ｇｙｒＢ）におけるｇｙｒＢ遺伝子の染色体置換を、ＰＣＲプライマー対、Ｄ
ＹＶ−２１１（配列番号４５）／ＤＹＶ−１６３（配列番号３８）およびＤＹＶ
１０７（配列番号３９）／ＤＹＶ−２１４（配列番号４６）との染色体結合部か
ら誘導される特定のＰＣＲ産物についてアッセイすることによって検証した。プ
ライマー配列については表７を参照のこと。
【０１４８】 （Ｂ．ＶＥＣＯ２０８３（ＰBAD−ｇｙｒＢ）株のノボビオシンおよび他の抗
菌剤に対する感受性） ＶＥＣＯ２０８３株のノボビオシン、ならびに無関係の抗生物質ホスホマイシ
ンおよびシプロフロキサシンに対する感受性を試験した。ノボビオシンは、ｇｙ
ｒＢ遺伝子産物に結合することによりジャイラーゼを阻害するクマリン群の抗生
物質である。Ｍａｘｗｅｌｌ（１９９３）Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９（４
）：６８１〜６８６。
【０１４９】 （１．接種物の調製） ０．１％アラビノースを補充した５ｍｌのＬＢ中で、
ロータリーシェイカー上で３５℃、２００ｒｐｍで細胞を一晩増殖させた。一晩
たった培養物１００μｌを採取し、１４，０００ｒｐｍで５分間、室温で遠心分
離し、そして細胞ペレットをアラビノース無添加の培地１ｍｌ中に懸濁した。こ
の細胞懸濁液を培地中で１：１０００に希釈し、そして接種物として使用した。
【０１５０】 （２．９６ウェルプレートの調製） チェッカーボードアッセイを９６ウェル
マイクロタイタープレート中で実施した。ここでは、一次元においてアラビノー
ス濃度を変化させ、そして二次元において抗菌性化合物の濃度を変化させた。抗
菌性化合物の濃度は、行（ｒｏｗ）間の２倍で変化させた。希釈を、異なる濃度
のアラビノースを補充した培地、またはアラビノースを欠く培地で実施した。抗
菌性化合物を欠くコントロールの行、およびアラビノースを欠くコントロールの
列（ｃｏｌｕｍｎ）もまた含んだ。各ウェルの全用量は、５０μｌであった。
【０１５１】 （３．プレートの接種およびインキュベーション） ５０μｌの接種物（すな
わち希釈した細胞懸濁液）を各ウェルに添加した。３５℃での接種２０時間後、
各ウェルにおける細胞増殖を測定し、そして接種物なしのウェルと比較した。
【０１５２】 （４．結果） 図１５は、ＰBAD−ｇｙｒＢ株、ＶＥＣＯ２０８３についての
アラビノース濃度の関数とした、ノボビオシンの最小阻害濃度（ＭＩＣ）を示す
。この結果は、ジャイラーゼサブユニットＢのインヒビターであるノボビオシン
のＭＩＣがアラビノース依存性であることを示す。図１５はまた、ｇｙｒＢ遺伝
子産物（例えば、ホスホマイシンおよびシプロフロキサシン）を標的としない化
合物に対するＶＥＣＯ２０８３の感受性が、アラビノース濃度に伴って変化しな
かったことを示す。
【０１５３】
【表７】
【０１５４】 （実施例１１：感受性過度なＥ．ｃｏｌｉ株の構築およびその特性） この実施例は、ＰBAD制御下で必須遺伝子であるｄｅｆを有し、かつｔｏｌＣ
遺伝子中に欠失を有するＥ．ｃｏｌｉ株、ＶＥＣＯ０２０６８の構築を記載する
。必須のｄｅｆ遺伝子は、ＰBAD制御下にあるので、ｄｅｆ遺伝子産物のインヒ
ビターに対するＶＥＣＯ２０６８の感受性は、増殖培地中のアラビノース濃度に
依存する。ｔｏｌＣにおける変異体は、多くの化合物に対して感受性過度である
。なぜならば、ｔｏｌＣは、流出ポンプの構成要素として働き得る外膜タンパク
質をコードするからである。従って、ｄｅｆ遺伝子産物と相互作用する化合物に
対する感受性の閾値は、野生型と比較して、ｔｏｌＣ変異体においては低い。そ
の高められた感受性のために、ｔｏｌＣ／ＰBAD−ｄｅｆ株を、ｔｏｌＣに対し
て野生型である株のインヒビターとして同定されていない別の化合物を検出する
ために使用し得る。
【０１５５】 （Ａ．ＰBAD−ｄｅｆ転写融合物を含むＥ．ｃｏｌｉ株におけるｔｏｌＣ欠失
の構築） ｔｏｌＣ遺伝子を、プライマーＶＣＪ００５（配列番号４７、表７）およびＶ
ＣＪ００７（配列番号４８、表７）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＶＥＣＯ１００４
株からＰＣＲ増幅した。２．７ｋｂのＰＣＲ産物を、平滑末端化し、ｐＵＣ１８
にクローニングしてｐＣＨ１２を作製した。ｔｏｌＣの７００ｂｐの内部欠失を
、ｐＣＨ１２を適合する酵素ＰｓｔＩおよびＮｓｉＩで消化することによって作
成し、ｐＣＨ１３を作製した。２．０ｋｂΔｔｏｌＣフラグメントを、ｐＣＨ１
３からＳｍａＩ／ＥｈｅＩ消化により切り出し、そしてＳｍａＩで消化させたｐ
ＫＯ３にクローニングしてｐＤＹ９２を作製した。
【０１５６】 ｐＤＹ９２プラスミドを使用して、他の自殺ベクター構築物について先に記載
された選択／対向選択手順を通じて、ｔｏｌＣ欠失変異（ΔｔｏｌＣ）をＶＥＣ
Ｏ２０６５（染色体ＰBAD−ｄｅｆ融合物を含むＥ．ｃｏｌｉ株）の染色体に導
入した。実施例８〜１０を参照のこと。形質転換した細胞を、ＬＢ＋０．２％ア
ラビノース上にプレーティングすることにより、ΔｔｏｌＣ変異の首尾良い組込
みについてスクリーニングし、そしてＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天（これは、Δｔｏ
ｌＣ変異体の増殖を支持しない）上に複製プレーティングした。ＭａｃＣｏｎｋ
ｅｙ感受性クローンのΔｔｏｌＣ組込みの確認を、オリゴヌクレオチドＶＣＪ０
０５（配列番号４７、表７）およびＶＣＪ００７（配列番号４８、表７）を用い
たＰＣＲによって行った。ＰBAD−ｄｅｆ融合物を含むΔｔｏｌＣ株である、Ｖ
ＥＣＯ２０６８を、感受性試験のために選択した。
【０１５７】 （Ｂ．ＶＲＣ４８３および他の抗菌剤に対するＶＥＣ２０６８の感受性） ＶＥＣＯ２０６８（ΔｔｏｌＣ、ＰBAD−ｄｅｆ）および欠失したｔｏｌＣ遺
伝子を含み、かつＰBAD−ｄｅｆ融合物を欠く親株（ＶＲＣＯ２０６６）を用い
て、実験を行い、アラビノース濃度のある範囲にわたるＶＲＣ４８３に対するそ
れらの感受性を比較した。ＶＲＣ４８３は、ｄｅｆ遺伝子産物を標的とする抗菌
活性を有する化合物である。この化合物を、Ｖｅｒｓｉｃｏｒでデホルミラーゼ
（ｄｅｆｏｒｍｙｌａｓｅ）スクリーニングにおいて同定し、そしてこのＩＣ50 は、Ｅ．ｃｏｌｉデホルミラーゼに対して１１ｎＭである。デホルミラーゼ活性
を、実施例８に記載されるように測定した（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎら、前出）
。
【０１５８】 （１．接種物の調製） ０．１％アラビノースを補充した５ｍｌのＬＢ中で、
ロータリーシェイカー上で３５℃、２００ｒｐｍで細胞を一晩増殖させた。一晩
たった培養物１００μｌを採取し、１４，０００ｒｐｍで５分間、室温で遠心分
離し、そして細胞ペレットをアラビノース無添加の培地１ｍｌ中に懸濁した。こ
の細胞懸濁液を培地中で１：１０００に希釈し、そして接種物として使用した。
【０１５９】 （２．９６ウェルプレートの調製） チェッカーボードアッセイを９６ウェル
マイクロタイタープレート中で実施した。ここでは、一次元においてアラビノー
ス濃度を変化させ、そして二次元において抗菌性化合物の濃度を変化させた。抗
菌性化合物の濃度は、行間の２倍で変化させた。希釈を、異なる濃度のアラビノ
ースで補充した培地、またはアラビノースを欠く培地で実施した。抗菌性化合物
を欠くコントロールの行、およびアラビノースを欠くコントロールの列もまた含
んだ。各ウェルの全用量は、５０μｌであった。
【０１６０】 （３．プレートの接種およびインキュベーション） ５０μｌの接種物（すな
わち希釈した細胞懸濁液）を各ウェルに添加した。３５℃での接種２０時間後、
各ウェルにおける細胞増殖を測定し、そして接種物なしのウェルと比較した。
【０１６１】 （４．結果） 図１６は、ｔｏｌＣ／ＰBAD−ｄｅｆ株ＶＥＣＯ２０６８につ
いてのアラビノース濃度の関数とした、ＶＲＣ４８３の最小阻害濃度（ＭＩＣ）
を示す。この結果は、デホルミラーゼインヒビターであるＶＲＣ４８３のＶＥＣ
Ｏ２０６８についてのＭＩＣが、増殖培地においてアラビノース濃度依存性であ
ることを示す。親野生型株は、試験した範囲での抗生物質に対して感受性ではな
かった。図１３（実施例８）との比較は、ＶＲＣ４８２に対する感受性は、予期
されたようにより低いアラビノース濃度で生じることを示す。図１６はまた、ｄ
ｅｆ遺伝子を標的としない化合物（例えば、ホスホマイシンおよびシプロフロキ
サシン）に対するＶＥＣＯ２０８３の感受性が、アラビノース濃度に伴って変化
しなかったことを示す。
【０１６２】 （実施例１２：ＰAGA−ｄｅｆ転写融合物を含むＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株
の構築およびその特性） （Ａ．Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおけるＰAGA−ｄｅｆ転写融合物の構築） ｒａｆＲおよびＰAGA（ａｇａプロモーター）を含むＤＮＡ配列を、オリゴヌ
クレオチドＲＥＧＡＧＡＥＩ５’（配列番号２０、表６）およびＲＥＧＡＧＡＮ
Ｂ３’（配列番号２１、表６）を用いて、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＶＳＰＮ
３０２６染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅し、そしてＥｃｏＲＩ／ＮｄｅＩフラグメ
ントとして組込みベクターｐＲ３２６（Ｃｌａｖｅｒｙｓら、前出）にクローニ
ングし、プラスミドｐＲ３２６ＲａｆＲＰａｇａを得た。
【０１６３】 Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＶＳＰＮ３０２６染色体ＤＮＡ由来のデホルミラ
ーゼ遺伝子（ｄｅｆ）の最初の３１７ｂｐを、オリゴヌクレオチドＭＡＬＤＥＦ
５’（配列番号４９、表８）およびＭＡＬＤＥＦ３’（配列番号５０、表８）を
用いてＰＣＲ増幅し、そしてＮｅｄＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとしてプラスミ
ドｐＲ３２６ＲａｆＲＰａｇａにクローニングし、プラスミドｐＲ３２６ＲＰＡ
ＤＥＦを得た。
【０１６４】 ｐＲ３２６ＲＰＡＤＥＦをテンプレートとして用いて、ＰAGAおよびｄｅｆフ
ラグメントのみを含むＤＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドＰａｇａ５’ＥＩ（配
列番号２４、表６）およびＭＡＬＤＥＦ３’（配列番号５０、表８）を用いて増
幅し、そしてＴテール化ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にクローニングした。こ
の構築物をＥｃｏＲＩで消化し、そしてＰAGA−ｄｅｆを含むフラグメントを組
込みベクターｐＲ３２６にクローニングし、ｐＲ３２６Ｐａｇａｄｅｆを作製し
た。このプラスミドを用いて、ＶＳＰＮ３０２６を形質転換し、スクロースなし
のＣ＋Ｙで増殖させ、異なるラフィノース濃度（２％〜０．００８％の２倍希釈
）を補充した。形質転換体を用いて、クロラムフェニコール（２．５μｇ／ｍｌ
）および異なる濃度のラフィノース（１％〜０．０４１％）を補充した２ｍｌの
Ｃ＋Ｙ培地を含むチューブに接種し、そして３７℃で一晩インキュベートした。
一晩たった培養物を、異なる濃度のラフィノース（１％〜０．０４１％の範囲）
を有する２００μｌのＣ＋Ｙを含む９６ウェルマイクロタイタープレートに接種
し（１ウェルあたり１０μｌ）（上記を参照のこと）、５％ＣＯ2でＣＯ2インキ
ュベーター中で、３７℃にてインキュベートした。培養物を、クロラムフェニコ
ール（２．５μｇ／ｍｌ）および０．２％ラフィノースを含むＴＳＡヒツジ血液
寒天プレート上でプレーティングした。このプレートを、３５℃で一晩培養し、
そして単一コロニーを拾い、そしてクロラムフェニコール（２．５μｇ／ｍｌ）
およびラフィノース（０．０３％）を補充したＣ＋Ｙ培地に移した。得られたＳ
．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株、ＶＳＰＮ３０４４は、染色体中のｄｅｆ遺伝子座で
挿入があり、このことは、プライマーＰａｇａ１００（配列番号２５、表６）お
よびＤＥＦ３’Ｂａｍ（配列番号５１、表８）を用いてＰＣＲにより確認した。
この株は、天然プロモーターの制御下で短縮型３１６ｂｐのｄｅｆ遺伝子を保有
し、ＰAGA制御下では全長ｄｅｆ遺伝子を保有する。
【０１６５】
【表８】
【０１６６】 （Ｂ．ＶＲＣ４８３、バンコマイシン、およびエリスロマイシンに対するＶＳＰ
Ｎ３０４４の感受性） ＰAGA−ｄｅｆ株ＶＳＰＮ３０４４およびその親株（ＶＳＰＮ３０２６）を用
いて実験を行い、ラフィノース濃度の関数としてＶＲＣ４８３に対するそれらの
感受性を比較した。異なるラフィノース濃度でのバンコマイシンおよびエリスロ
マイシンに対するＶＳＰＮ３０４４の感受性もまた試験した。ＶＲＣ４８３は、
ｄｅｆ遺伝子産物を標的とする抗菌活性を有する化合物である。この化合物を、
Ｖｅｒｓｉｃｏｒでのデホルミラーゼスクリーニングにおいて同定し、そしてそ
のＩＣ50は、Ｅ．ｃｏｌｉデホルミラーゼについて１１ｎＭである。デホルミラ
ーゼ活性を、実施例８（Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎら、前出）に記載のように測定
した。
【０１６７】 （１．接種物の調製） ＶＳＰＮ３０４４およびＶＳＰＮ３０２６を、０．０
３％のラフィノースを補充したスクロースを欠く５ｍｌのＣ＋Ｙ中で、３７℃で
４時間増殖させた。細胞を６００ｎｍで０．２のＯＤになるまで増殖させた。２
００μｌのアリコートを１５％グリセロール溶液として−７０℃で凍結させた。
接種のために必要となった場合、凍結したストックを融解し、遠心分離し、そし
て上清を除去した。この細胞ペレットを、グルコースを含む１ｍｌのＣ＋Ｙ中に
再懸濁させ、同じ培地（クロラムフェニコールをＶＳＰＮ３０４４培地に添加し
た）に１：１０００で希釈し、そして接種物として使用した。
【０１６８】 （２．９６ウェルプレートの調製） チェッカーボードアッセイを９６ウェル
マイクロタイタープレート中で実施した。ここでは、一次元においてラフィノー
ス濃度を変化させ、そして二次元において抗菌性化合物（ＶＲＣ４８３、バンコ
マイシンまたはエリスロマイシン）の濃度を変化させた。抗菌性化合物の濃度は
、行間の２倍で変化させた。希釈を、異なる濃度のラフィノースを補充したＣ＋
Ｙ中、またはラフィノースを欠くＣ＋Ｙ中で実施した。抗菌性化合物を欠くコン
トロールの行、およびラフィノースを欠くコントロールの列もまた含んだ。各ウ
ェルの全用量は、５０μｌであった。
【０１６９】 （３．プレートの接種およびインキュベーション） ５０μｌの接種物（すな
わち希釈した細胞懸濁液）を各ウェルに添加した。３５℃での接種２０時間後、
各ウェルにおける細胞増殖を測定し、そして接種物なしのウェルと比較した。
【０１７０】 （４．結果） 図１７は、ラフィノース濃度の関数とした、ＰAGA−ｄｅｆ株
ＶＳＰＮ３０４４について、親野生型株ＶＳＰＮ３０２６と比較した、ＶＲＣ４
８３の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を示す。この結果は、ＶＳＰＮ３０４４について
、デホルミラーゼインヒビターであるＶＲＣ４８３のＭＩＣが増殖培地中のラフ
ィノース濃度に依存することを示す。野生型株についてのＭＩＣ値はラフィノー
ス濃度に依存しない。図１７はまた、エリスロマイシンおよびバンコマイシン（
これはｄｅｆ遺伝子を標的としない）に対するＶＳＰＮ３０４４の感受性が、ラ
フィノース濃度に伴って変化しなかったことを示す。
【０１７１】 （実施例１３：ＰBAD−ｌｐｘＣ転写融合物およびｔｏｌＣ欠失を含む株の構
築およびその特性） この実施例は、目的の遺伝子をＰBADの正常な染色体位置でＰBADプロモーター
の下流に挿入した融合物の構築およびその特性を実証する。このようにして、目
的の遺伝子から下流の遺伝子に対する潜在的な極性効果を避ける。
【０１７２】 （Ａ．ＰBAD−ｌｐｘＣ転写融合物を有するＥ．ｃｏｌｉΔｔｏｌＣ株の構築
） ｌｐｘＣ遺伝子産物は、酵素ＵＤＰ−３−Ｏ−（Ｒ−３−ヒドロキシミリスト
イル）−Ｎ−アセチルグルコサミンデアセチラーゼであり、これは、グラム陰性
細菌におけるリポポリサッカライド合成において主な役割を果たす。全長ｌｐｘ
Ｃ遺伝子を含むＤＮＡ配列を、オリゴヌクレオチドＤＹＶ−２４０（配列番号５
６）およびＤＹＶ−２４１（配列番号５７、表９）を用いてＥ．ｃｏｌｉ株ＭＧ
１６５５染色体ＤＮＡから、ＰＣＲ増幅し、そしてＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩフラグ
メントとしてｐＮＲ４１にクローニングしてｐＮＲ４３を作製した。ｐＮＲ４１
は、染色体上のａｒａＢＡＤ遺伝子座と相同な２つの領域を含む。１つの領域は
、最適化ＰBADプロモーターおよびａｒａＣ遺伝子に対応するＤＮＡの約５００
ｂｐ上流を含み、第２の領域は、６００ｂｐのａｒａＤ遺伝子の内部フラグメン
トを含む。ａｒａＣ−ＰBAD−ｌｐｘＣ−ａｒａＤカセットを、ＸｍａＩ／Ｓａ
ｌＩフラグメントとしてｐＮＲ４３から切り出し、そしてＸｍａＩ／ＳａｌＩで
消化したｐＫＯ３にクローニングし、このようにｐＮＲを作製した。
【０１７３】 ｐＮＲ４８を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５株に形質転換した。形質転換体を
、３０℃で、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢプレート
上で選択した。多くの形質転換体を、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）
を補充したＬＢプレート上に画線塗布し、そして４３℃で一晩インキュベートし
た。次いで、単離したコロニーを、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を
補充したＬＢプレート上で、４３℃で再び画線培養した。次に、単離したコロニ
ーを、ＬＢプレート上に画線塗布し、そして３７℃で一晩インキュベートした。
次いで、単離したコロニーを、スクロース（６％）を補充したＬＢプレート上に
画線塗布し、そして３７℃で一晩インキュベートしてスクロース耐性組換え体に
ついて選択した。ＮａＣｌを、スクロース耐性選択の間、ＬＢプレートから除い
た。スクロース耐性組換え体を、アラビノースが０．４％アラビノースを補充し
たＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天プレート上で発酵できないことについてスクリーニン
グし、そしてクロラムフェニコール感受性についてスコア付けした。アラビノー
スの利用を欠損するクロラムフェニコール感受性クローンは、ａｒａＢＡＤオペ
ロンへのｌｐｘＣ遺伝子の首尾よい組込みについて候補物であった。１つのクロ
ーンであるＶＥＣＯ２５２０（ａｒａＣ−ＰBAD−ｌｐｘＣ）を、ＰＣＲプライ
マー対であるＤＹＶ−２４６／ＤＹＶ−２４９（配列番号５８および５９、表９
）を用いてクロラムフェニコール接合部をチェックすることによって確認した。
【０１７４】 アラビノース制御下においてａｒａＢＡＤ遺伝子座にｌｐｘＣ遺伝子が配置さ
れたので、次の工程は、その正常な染色体状況から内因性ｌｐｘＣ遺伝子を欠失
することであった。ｌｐｘＣのインフレーム欠失（これは、必須遺伝子ｓｅｃＡ
を有するジシストロンの（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）オペロンに存在する）は、
交差ＰＣＲを使用して作製された。Ｌｉｎｋら（１９９７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．１７９：６２２８〜６２３７。交差ＰＣＲ反応によって、欠失について標
的化される配列の左および右に、６００ｂｐのＤＮＡフラグメントからなる１．
２ｋｂの産物を得た。交差ＰＣＲ増幅に使用した４つのプライマーは、ＤＹＶ−
２２４（配列番号５２）、ＤＹＶ−２２５（配列番号５３）、ＤＹＶ−２２６（
配列番号５４）およびＤＹＶ−２２７（配列番号５５、表９）であった。得られ
たＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩで消化し、そしてＢａｍＨＩで消化したｐＫＯ３中
にクローニングして、ｐＮＲ３６を作製した。
【０１７５】 プラスミドｐＮＲ３６を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＶＥＣＯ２５２０株に形質転換した
。形質転換体を、３０℃で、０．２％アラビノースおよびクロラムフェニコール
（２５μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢプレート上で選択した。多くの形質転換体を
、０．２％アラビノースおよびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を補充
したＬＢプレート上に画線塗布し、そして４３℃で一晩インキュベートした。次
いで、単離したコロニーを、０．２％アラビノースおよびクロラムフェニコール
（２５μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢプレート上で、４３℃で再び画線培養した。
次に、単離したコロニーを、０．２％アラビノースを補充したＬＢプレート上に
画線塗布し、そして３７℃で一晩インキュベートした。次いで、単離したコロニ
ーを、０．２％アラビノースおよびスクロース（６％）を補充したＬＢプレート
上に画線塗布し、そして３７℃で一晩インキュベートしてスクロース耐性組換え
体について選択した。ＮａＣｌを、スクロース耐性選択の間、ＬＢプレートから
除いた。スクロース耐性組換え体を、アラビノース依存性増殖についてスクリー
ニングし、そしてクロラムフェニコール感受性についてスコア付けした。増殖の
ためにアラビノースを必要としたクロラムフェニコール感受性クローンは、その
正常な染色体状況からのｌｐｘＣ遺伝子の首尾よい欠失についての候補物であっ
た。１つのクローンであるＶＥＣＯ２５２２（ａｒａＣ−ＰBAD−ｌｐｘＣ、Δ
ｌｐｘＣ）を、ＰＣＲプライマー対であるＤＹＶ−２２４／ＤＹＶ−２２７（配
列番号５２および５５、表９）を用いてクロラムフェニコール接合部をチェック
することによって確認した。
【０１７６】 ｔｏｌＣ遺伝子を、プライマーＶＣＪ００５（配列番号４７、表７）およびプ
ライマーＶＣＪ００７（配列番号４８、表７）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＶＥ
ＣＯ１００４株からＰＣＲ増幅した。２．７ｋｂのＰＣＲ産物を、ｐＵＣ１８中
に平滑末端クローニングして、ｐＣＨ１２を作製した。ｔｏｌＣの７００ｂｐの
内部欠失を、適合性酵素であるＰｓｔＩおよびＮｓｉＩを用いるｐＣＨ１２の消
化によって作製して、ｐＣＨ１３を作製した。２．０ｋｂのΔｔｏｌＣフラグメ
ントを、ＳｍａＩ−ＥｈｅＩを用いてｐＣＨ１３から切り出し、そしてＳｍａＩ
で消化したｐＫＯ３中にクローニングしてｐＤＹ９２を作製した。
【０１７７】 ΔｔｏｌＣ変異を、他の自殺ベクター構築物について以前に記載された選択／
対抗選択手順によって、ｐＤＹ９２を用いてＶＥＣＯ２５２２およびＥ．ｃｏｌ
ｉ ＭＪｌ６５５上へ導入した。ΔｔｏｌＣ変異の首尾よい組込みを、Δｔｏｌ
Ｃ変異体の増殖を支持しないＭａｃＣｏｎｋｅｙ寒天上でスクリーニングした。
ＭａｃＣｏｎｋｅｙ感受性クローンにおけるΔｔｏｌＣ組み込みの確認を、オリ
ゴヌクレオチドＶＣＪ００５（配列番号４７、表７）およびＶＣＪ００７（配列
番号４８、表７）を用いてＰＣＲにより確認した。ＶＥＣＯ２５２４は、ａｒａ
Ｃ−ＰBAD−ｌｐｘＣ，ΔｌｐｘＣ，ΔｔｏｌＣ変異株であり、そしてＶＥＣＯ
２５２６は、ΔｔｏｌＣ変異株である。これらの株を、さらなる実験のために使
用した。
【０１７８】 （Ｂ．Ｌ１５９６９２および他の抗菌剤に対するＶＥＣＯ２５２４（ＰBAD−
ｌｐｘＣ）の感受性） ＶＥＣＯ２５２４株およびｔｏｌＣ同質遺伝子型株（ＶＥＣＯ２５２６）を使
用して実験を行い、ある範囲内のアラビノース濃度でＬ１５９６９２に対するこ
れらの感受性を比較した。Ｌ１５９６９２は、ｌｐｘＣ遺伝子産物を標的化する
抗細菌性化合物である。Ｏｎｉｓｈｉら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：
９８０〜９８２。他の非関連性の抗生物質（リネゾリド（ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ）
およびエリスロマイシン）に対するＶＥＣＯ２５２６の感受性もまた、試験した
。
【０１７９】 （１．接種物の調製） 細胞を、０．１％アラビノースを補充した５ｍｌのＬ
Ｂ中で、３５℃および２００ｒｐｍで回転振盪機上で一晩増殖させた。１００μ
ｌの一晩培養物を採集し、５分間、室温にて１４，０００ｒｐｍで遠心分離し、
そして細胞ペレットを、アラビノースを添加していない１ｍｌの培地中に懸濁し
た。この細胞懸濁液を、培地中で１：１０００に希釈し、そして接種物として使
用した。
【０１８０】 （２．９６ウェルプレートの調製） チェッカーボードアッセイを、９６ウェ
ルマイクロタイタープレートにおいて実行した。このプレートにおいて、アラビ
ノース濃度を一次元用において変化させ、そして抗菌性化合物を二次元用におい
て変化させた。抗菌性の濃度は、行の間で２倍ずつ変化させた。希釈を、異なる
濃度のアラビノースを補充した培地、またはアラビノースを含まない培地におい
て実行した。抗菌性を含まないコントロールの行、およびアラビノースを含まな
いコントロールの列もまた、含ませた。各ウェルの総容量は、５０μｌであった
。
【０１８１】 （３．プレートの接種物およびインキュベーション） ５０μｌの接種物（す
なわち、希釈した細胞懸濁液）を、各ウェルに添加した。３５℃において接種の
２０時間後、細胞増殖を各ウェルにおいて測定し、そして接種物のないウェルに
対して比較した。
【０１８２】 （４．結果） 図１８は、ＰBAD−ｌｐｘＣ株について、アラビノース濃度の
関数としての、Ｌ１５９６９２、リネゾリド、およびエリスロマイシンの最小阻
止濃度（ＭＩＣ）を示す。同質遺伝子型ｔｏｌＣ株（ＶＥＣＯ２５２６）の、任
意の試験される化合物に対する感受性は、培地中のインデューサーの量に影響を
受けなかった。
【０１８３】
【表９】
【０１８４】 （実施例１４：Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｒａｆ遺伝子クラスターの調節特
性） 種々の糖（ラフィノースを含む）によるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｒａｆオ
ペロンの調節を、レポーターとしてα−ガラクトシダーゼ活性を使用して示した
。ａｇａ遺伝子は、他の原核生物α−ガラクトシダーゼに対して配列相同性を示
し、そしてこの実施例は、α−ガラクトシダーゼ活性がＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ中のａｇａによってコードされることを示す。従って、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅ ａｇａ遺伝子のプロモーター（ＰAGA）によって調節されるＳ．ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ ａｇａ遺伝子は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｒａｆ遺伝子クラ
スターの誘導および調節の研究における使用のための、天然に存在するレポータ
ー遺伝子として作用し、そしてＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよび他の微生物にお
ける他の潜在的な調節配列の分析のためのレポーター遺伝子として使用され得る
。
【０１８５】 （細胞および細胞増殖） Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＶＳＰＮ３０２６株を、本明細書中に記載される
実施例について、野生型として使用した。細胞を、０．２％（ｗ／ｖ）スクロー
スおよび０．２％（ｗ／ｖ）グルコースを含むＣ＋Ｙ培地（Ｔｏｍａｓｚ（１９
７０）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１０１：８６０〜８７１）中で増殖させ、そし
て対数期の細胞を、接種のために使用されるように、２０％（ｖ／ｖ）グリセロ
ール中で凍結させた。ガラクトシダーゼ活性の誘導因子を同定するための実験に
おいて、種々の糖を含むＣ＋Ｙ培地を使用した。全ての糖を、０．２％（ｗ／ｖ
）の濃度で使用した。８ｍｌの培地を、２００μｌの凍結保存溶液を用いて接種
させ、そしてその培養物を、３７℃で増殖させた。この培養物の増殖を、可視分
光光度計を用いて６００ｎｍの吸光度によって測定した。Ａ600が０．４に達し
た時点で、細胞を実験に使用した、 （α−ガラクトシダーゼ活性の測定） 酵素活性の測定のための細胞溶解物を調製するために、細胞培養物の１．５ｍ
ｌサンプルを採集し、そして直ちに５分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離して
細胞をペレット化した。この上清を捨て、そしてこのペレットを、０．２５％Ｔ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５
）の０．１ｍｌ中に再懸濁した。この混合物を、３７℃で１０分間インキュベー
トして、細胞を溶解させた。
【０１８６】 α−ガラクトシダーゼ活性を、最終濃度０．９ｍｇ／ｍｌでｐ−ニトロフェニ
ル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏ
ｕｉｓ，ＭＯ）を含む、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＭｇＣｌ2、４
５ｍＭ β−メルカプトエタノールを含む緩衝液（ｐＨ７．５）中で測定した。
この反応を、９０μｌの反応緩衝液に１０μｌの細胞溶解物を添加することによ
って開始させ、そしてこの反応混合物を２５℃でインキュベートした。酵素活性
を、４０５ｎｍの吸光度を測定することによってモニターした。Ａ405の測定は
、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ２５０マイクロタイタープレートリーダー（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、３０分間
、３０秒毎に行った。比活性を、ｐ−ニトロフェノール標準を使用して算出した
。
【０１８７】 結果を、表１０に示す。見られ得るように、低い基底レベルのα−ガラクトシ
ダーゼ活性を、唯一の炭素源としてラフィノース以外の糖を用いる細胞増殖から
の溶解物において観察した。しかし、α−ガラクトシダーゼ活性の２００〜１，
０００倍の誘導を、ラフィノースにおける細胞増殖において観察した。ラフィノ
ースおよび第２の糖の組合わせにより、第２の糖のみを用いて得られる酵素レベ
ルよりも１６〜５００倍高い酵素レベルが得られた。従って、培地において糖の
濃度および／または糖の組合せを調整することによって、ｒａｆ調節配列によっ
て調節されるコード配列の発現は、約１，０００倍の範囲を超えて調整され得る
。
【０１８８】
【表１０】
【０１８９】 （ａｇａ遺伝子、ｒａｆＲ遺伝子およびｒａｆＳ遺伝子における変異体の構築
） ｒａｆ調節系を特徴付けるために、ａｇａ遺伝子、ｒａｆＲ遺伝子およびｒａ
ｆＳ遺伝子における遺伝子ノックアウトを、以下のように、Ｃｌａｖｅｒｙｓら
（１９９５）Ｇｅｎｅ １６４：１２３〜１２８の方法によって構築した。
【０１９０】 ａｇａ遺伝子の領域を含むＤＮＡフラグメントを、プライマーとしてオリゴヌ
クレオチドａｇａ１およびオリゴヌクレオチドａｇａ２を使用するポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。オリゴヌクレオチドの配列については、
表１１を参照のこと。これは、３２０ｂｐの増幅産物を生成した。この増幅した
配列を、ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ．ＷＩ）へ
連結した。得られた構築物を、ＥｃｏＲＩで消化して、ａｇａ配列を含む約３３
９ｂｐのフラグメントを放出させた。このフラグメントを、ｐＲ３２６（Ｃｌａ
ｖｅｒｙｓら、前出）のＥｃｏＲＩ部位へ挿入して、ｐＲ３２６ＡＧＡＫＯを作
製した。このプラスミドを使用してＶＳＰＮ３０２６を形質転換し、染色体ａｇ
ａ遺伝子においてｐＲ３２６配列の挿入物を有し、それによって、ａｇａ遺伝子
が不活化されるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＶＳＰＮ３０３７株を構築した。
【０１９１】 ｒａｆＲ遺伝子の内部部分を含むＤＮＡフラグメントを、プライマーとしてオ
リゴヌクレオチドｒａｆＲ１およびオリゴヌクレオチドｒａｆＲ２を使用してＰ
ＣＲ増幅した。配列については、表１１を参照のこと。これは、４４９ｂｐの増
幅産物を生成した。この増幅した配列を、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，
Ｃａｌｓｂａｄ，ＣＡ）へ連結した。得られた構築物をＥｃｏＲＩで消化し、そ
してｒａｆＲを含む約４４０ｂｐのフラグメントを、ｐＲ３２６のＥｃｏＲＩ部
位へ挿入して、ｐＲ３２６ＲＡＦＲＫＯを作製した。このプラスミドを使用して
ＶＳＰＮ３０２６を形質転換し、染色体ｒａｆＲ遺伝子においてｐＲ３２６配列
の挿入物を有し、それによって、ｒａｆＲ遺伝子が不活化されるＳ．ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ ＶＳＰＮ３０３８株を構築した。
【０１９２】 ｒａｆＳ遺伝子の内部部分を含むＤＮＡフラグメントを、プライマーとしてオ
リゴヌクレオチドｒａｆＳ１およびオリゴヌクレオチドｒａｆＳ２を使用してＰ
ＣＲ増幅した。配列については、表１１を参照のこと。これは、４５４ｂｐの増
幅産物を生成した。この産物を、ｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｓ
ｂａｄ，ＣＡ）へ連結した。得られた構築物をＥｃｏＲＩで消化し、そしてｒａ
ｆＳを含む約４４５ｂｐのフラグメントを得た。このフラグメントを、ｐＲ３２
６のＥｃｏＲＩ部位へ挿入して、ｐＲ３２６ＲＡＦＳＫＯを作製した。このプラ
スミドを使用してＶＳＰＮ３０２６を形質転換し、染色体ｒａｆＳ遺伝子におい
てｐＲ３２６配列の挿入物を有し、それによって、ｒａｆＳ遺伝子が不活化され
るＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＶＳＰＮ３０３９株を構築した。
【０１９３】
【表１１】
【０１９４】 （変異株の特徴） 炭素源として、ラフィノース、スクロースまたはラフィノースおよびスクロー
スの混合物を用いて提供される場合、ａｇａ変異株、ｒａｆＲ変異株およびｒａ
ｆＳ変異株を、増殖およびα−ガラクトシダーゼ活性について試験した。変異株
を、異なる炭素源（表１２に示されるような）を含むＣ＋Ｙ培地中で増殖させ、
そして増殖を、分光光度計によって測定される、６００ｎｍにおける培養物の吸
光度によってモニターした。培養物が０．４のＡ600に達した時点で、細胞を採
集し、そして上述のようなα−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。ア
ッセイの結果を、表１２に示す。
【０１９５】 ａｇａにおいて変異を有する株は、ラフィノース上で増殖し得なかった。ａｇ
ａ変異株がラフィノース上で増殖し得ないことは、変異がラフィノース代謝のた
めに必要な遺伝子を生じなかったことを確証し、そしてラフィノースがα−ガラ
クトシダーゼであるので、α−ガラクトシダーゼの不活化と一致する。
【０１９６】 スクロースまたはスクロース＋ラフィノースのいずれかを炭素源として提供し
た場合、ａｇａ変異株は増殖したが、これらの両方の条件下において、測定不能
なレベルのα−ガラクトシダーゼ活性を示した。表１２を参照のこと。これらの
結果は、ラフィノース上で増殖する野生型細胞において観察されるα−ガラクト
シダーゼ活性が、ａｇａ遺伝子の産物によって提供されることを示す。まとめる
と、これらの結果は、ａｇａ遺伝子の発現がラフィノースによって活性化される
こと、すなわち、ラフィノースがａｇａのインデューサーであることを示す。
【０１９７】 ｒａｆＲ遺伝子における変異株を含む株は、ラフィノースを増殖し得るが、こ
の株においてα−ガラクトシダーゼの誘導化レベルは、野生型細胞におけるレベ
ルよりも７倍低い。表１２を参照のこと。従って、ｒａｆＲの機能は、ａｇａ活
性の最大誘導を必要とする。これらの結果は、ｒａｆＲ遺伝子産物がａｇａ遺伝
子のアクチベーターとして作用する場合に予測される結果であり、そしてｒａｆ
Ｒ遺伝子産物のアミノ酸配列において、ＡｒａＣファミリーシグネチャ（ｓｉｇ
ｎａｔｕｒｅ）配列の存在に一致する。これらはまた、ＲａｆＲアミノ酸配列と
他の転写アクチベータータンパク質との間の高度な相同性と一致する。
【０１９８】 ラフィノースが唯一の炭素源として提供される場合、ＲａｆＲがｒａｆ代謝オ
ペロンの誘導因子である場合に予測されるように、ｒａｆＲ変異を有する株は、
ゆっくりと増殖する。しかし、ラフィノース以外の糖が炭素源として提供される
場合、ｒａｆＲ変異株はまた、野生型よりもよりゆっくり増殖する。このことは
、ＲａｆＲがｒａｆ代謝オペロンの外側にさらなる調節標的を有すること、およ
びＲａｆＲタンパク質がラフィノース代謝に関連する機能を超えて、さらなる調
節機能を有し得ることを示唆する。ＲａｆＲによって調節される非ｒａｆ遺伝子
の産物は、薬物探索のための潜在的な標的として作用し得る。
【０１９９】 ラフィノースの存在下（すなわち、ラフィノース単独またはラフィノース＋ス
クロースのいずれか）において増殖する、ｒａｆＳにおいて変異を有する株は、
野生型細胞よりもより高いレベルのα−ガラクトシダーゼ活性を表す。これらの
結果は、ａｇａ発現のネガティブレギュレーターであるｒａｆＳ遺伝子産物と一
致する。
【０２００】 これらの結果の代替的な解釈は、例えば、ｒａｆＲの不活化がｒａｆＳに対し
て極性効果を有し、その結果、ｒａｆＲ変異株において検出される活性が、Ｒａ
ｆＲ機能およびＲａｆＳ機能の両方の非存在を反映する場合に可能である。この
場合、ｒａｆＲ遺伝子産物は、アクチベーターであり得、またはｒａｆＲ遺伝子
産物およびｒａｆＳ遺伝子産物を合わせた活性は、アクチベーター機能を提供し
得る。
【０２０１】
【表１２】
【０２０２】 前述の発明は、理解を明瞭にする目的のために、例示および実施例によって幾
分詳細に記載されているが、種々の変化および改変が本発明の精神から逸脱する
ことなく実施され得ることが、当業者に明らかである。従って、前述の詳細な説
明および実施例は、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＰｘおよびＰｍ領域のヌクレオチド配列
（配列番号１）を示す。ＧＧＡ配列をＧＣＧに変換するＰｘプロモーターのリプ
レッサー結合部位における変異（実施例６に記載される変異構築物）を、図の下
線上に示す。
【図２】 図２は、２つのｒａｆオペロンを含むＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｒａｆ遺伝
子クラスターの模式図である。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を矢印
で示す。プロモーターの位置もまた示す。Ｓ．ｍｕｔａｎｓのｍｓｍ領域におけ
るＯＲＦの模式図を比較のために示す。
【図３】 図３は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ株ＶＳＰＮ３０２６のｒａｆ領域のヌクレ
オチド配列（配列番号２）を示す。ＰAGAプロモーターの一般的な位置を下線に
よって示す。
【図４】 図４は、標的発現レベルがインデューサー濃度によって調節され、そして標的
が化合物によって阻害される単一の成分である細胞における、化合物の最小阻害
濃度をインデューサー濃度の関数として決定する実験の理想化された結果を示す
。
【図５】 図５は、１）標的が複数の成分を含み、そして化合物が２つ以上の成分によっ
て規定される部位と相互作用するか、または２）化合物が複数の標的と相互作用
し、そして成分（または、標的）のうちの１つのレベルがインデューサー濃度に
よって調節されるかのいずれかの細胞における、化合物の最小阻害濃度をインデ
ューサー濃度の関数として決定する実験の理想化された結果を示す。
【図６】 図６は、野生型ｍｕｒＡ調節エレメントのａｒａ調節カセットでの置換のため
のスキームを示す。
【図７】 図７は、ＰBAD−ｍｕｒＡ融合株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＶＥＣＯ２０５５）の増殖
をアラビノース濃度の関数として示す。
【図８】 図８は、野生型と比較した、ＰBAD−ｍｕｒＡ融合株Ｅ．ｃｏｌｉ ＶＥＣＯ
２０５５についてのホスホマイシンの最小阻害濃度を、アラビノース濃度の関数
として示す。
【図９】 図９は、アラビノース濃度の関数として表される、Ｅ．ｃｏｌｉ ＰBAD−ｍ
ｕｒＡ融合株ＶＥＣＯ２０５５についてのホスホマイシン、シプロフロキサシン
、およびテトラサイクリンの最小阻害濃度を示す。
【図１０】 図１０は、異なるラフィノース濃度で増殖されたＶＳＰＮ３０４１の培養物の
接種後の種々の時間での光学密度測定を示す。
【図１１】 図１１は、スクロースまたはラフィノースのいずれかでのＶＳＰＮ３０４１の
増殖の光学密度測定を示す。
【図１２】 図１２は、異なるラフィノース濃度での、ＶＳＰＮ３０４１および親同系遺伝
子型株（ｐａｒｅｎｔ ｉｓｏｇｅｎｉｃ ｓｔｒａｉｎ）ＶＳＰＮ３０２６の
増殖を示す。増殖を、培養の１０時間後に光学密度によって測定した。
【図１３】 図１３は、ＶＥＣＯ２０６５（染色体ＰBAD−ｄｅｆ融合物を有するＥ．ｃｏ
ｌｉ株）の、ＶＲＣ４８３（ｄｅｆ遺伝子産物のインヒビター）に対する感受性
を示す。感受性は、ＶＲＣ４８３の最小阻害濃度（ＭＩＣ）（μｇ／ｍｌ）とし
て、インデューサー（アラビノース）濃度の関数として示される。ＶＥＣＯ２０
６５の、ホスホマイシンおよびシプロフロキサシンに対する感受性もまた示す。
【図１４】 図１４は、ＶＥＣＯ２０７９（染色体ＰBAD−ｆｏｌＡ融合物を有するＥ．ｃ
ｏｌｉ株）の、トリメトプリム（ｆｏｌＡ遺伝子産物のインヒビター）に対する
感受性を示す。感受性は、トリメトプリムの最小阻害濃度（ＭＩＣ）（μｇ／ｍ
ｌ）として、インデューサー（アラビノース）濃度の関数として示される。ＶＥ
ＣＯ２０７９の、ホスホマイシンおよびシプロフロキサシンに対する感受性、な
らびに親株ＶＥＣＯ２０５４（ｗｔで示す）のトリメトプリムに対する感受性も
また示す。
【図１５】 図１５は、ＶＥＣＯ２０８３（染色体ＰBAD−ｇｙｒＢ融合物を有するＥ．ｃ
ｏｌｉ株）の、ノボビオシン（ｇｙｒＢ遺伝子産物のインヒビター）に対する感
受性を示す。感受性は、ノボビオシンの最小阻害濃度（ＭＩＣ）（μｇ／ｍｌ）
として、インデューサー（アラビノース）濃度の関数として示される。ＶＥＣＯ
２０８３の、ホスホマイシンおよびシプロフロキサシンに対する感受性もまた示
す。
【図１６】 図１６は、ＶＥＣＯ２０６８（染色体ＰBAD−ｄｅｆ融合物およびｔｏｌＣ欠
失を有するＥ．ｃｏｌｉ株）の、ＶＲＣ４８３（ｄｅｆ遺伝子産物のインヒビタ
ー）に対する感受性を示す（ＶＲＣ４８３と標識された曲線によって示す）。感
受性は、ＶＲＣ４８３の最小阻害濃度（ＭＩＣ）（μｇ／ｍｌ）として、インデ
ューサー（アラビノース）濃度の関数として示される。ＶＥＣＯ２０６８の、ホ
スホマイシンおよびシプロフロキサシンに対する感受性、ならびに親株ＶＥＣＯ
２０６６のＶＲＣ４８３に対する感受性（ＶＲＣ４８３，ｔｏｌＣと標識された
曲線によって示す）もまた示す。
【図１７】 図１７は、ＶＳＰＮ３０４４の、ＶＲＣ４８３（ｄｅｆ遺伝子産物のインヒビ
ター）に対する感受性を示す。ＶＳＰＮ３０４４は、ＰAGA−ｄｅｆ転写融合物
を含み、その結果、ｄｅｆ遺伝子産物の発現がラフィノースによって調節される
。感受性は、ＶＲＣ４８３の最小阻害濃度（ＭＩＣ）（μｇ／ｍｌ）として、イ
ンデューサー（ラフィノース）濃度の関数として示される。ＶＳＰＮＡ３０４４
の、エリスロマイシンおよびバンコマイシンに対する感受性、ならびに親株ＶＳ
ＰＮ３０２６のＶＲＣ４８３に対する感受性（ＶＲＣ４８３ｗｔによって示す）
もまた示す。
【図１８】 図１８は、ＶＥＣＯ２５２４（ＰBAD−ｌｐｘＣ、ΔｔｏｌＣ）の、Ｌ１５９
６９２（ｌｐｘＣ遺伝子産物を標的とする抗菌性化合物）に対する感受性を示す
。最小阻害濃度を、アラビノース濃度の関数として示す。リンゾリド（ｌｉｎｅ
ｚｏｌｉｄ）およびエリスロマイシンの最小阻害濃度もまた、アラビノース濃度
の関数として示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/04 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/04 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ 33/50 Ｂ Ｃ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号 ６０／１００，４３０ (32)優先日 平成10年７月10日(1998．7．10) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１０５，４４１ (32)優先日 平成10年10月23日(1998．10．23) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１０５，４４７ (32)優先日 平成10年10月23日(1998．10．23) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１１７，７５８ (32)優先日 平成11年１月29日(1999．1．29) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／１１７，９５５ (32)優先日 平成11年１月29日(1999．1．29) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，Ｚ Ｗ (72)発明者 ローズナウ， カーステン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94065， レッドウッド シティ， リボーノ ウ ェイ 105

Claims (77)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 必須の細胞プロセスに関与する遺伝子を発現する細胞であっ
    て、該遺伝子の発現が一定範囲のレベルにわたって調節され得、そしてさらに該
    範囲が低い基底発現レベルを含む、細胞。
  2. 【請求項２】 前記基底発現レベルが、野生型の約５０％未満である、請求
    項１に記載の細胞。
  3. 【請求項３】 前記基底発現レベルが、細胞増殖を支持するに不十分である
    、請求項１に記載の細胞。
  4. 【請求項４】 前記遺伝子がポリペプチドをコードする、請求項１に記載の
    細胞。
  5. 【請求項５】 前記遺伝子が非翻訳ＲＮＡ分子をコードする、請求項１に記
    載の細胞。
  6. 【請求項６】 前記ポリペプチドが構造タンパク質、酵素、レセプター、細
    胞内シグナル伝達分子および細胞接着分子からなる群より選択される、請求項４
    に記載の細胞。
  7. 【請求項７】 前記細胞プロセスが複製、組換え、ＤＮＡ修復、転写、翻訳
    、タンパク質プロセシング、タンパク質搬出、細胞壁生合成、細胞膜合成、脂質
    代謝、タンパク質代謝、エネルギー代謝、細胞分裂、薬物耐性およびビルレンス
    からなる群より選択される、請求項１に記載の細胞。
  8. 【請求項８】 前記遺伝子の発現が、該遺伝子の異種調節エレメントへの融
    合によって調節される、請求項１に記載の細胞。
  9. 【請求項９】 前記ポリペプチドの発現が、該ポリペプチドまたはそのフラ
    グメントをコードする配列に融合した異種調節エレメントによって調節される、
    請求項４に記載の細胞。
  10. 【請求項１０】 前記調節エレメントがＰBADプロモーターである、請求項
    ９に記載の細胞。
  11. 【請求項１１】 発現が細胞増殖培地中のＬ−アラビノースまたはＬ−リボ
    ースの濃度を調整することにより調節される、請求項１０に記載の細胞。
  12. 【請求項１２】 さらなる調節が前記細胞増殖培地中のグルコースまたは他
    の炭素源を調整することにより達成される、請求項１１に記載の細胞。
  13. 【請求項１３】 前記調節エレメントがｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモ
    ーター、ｔａｃプロモーター、ｇａｌプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐｈ
    ｏＡプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター
    、λｐRプロモーター、λｐLプロモーター、およびｔｅｔプロモーターからなる
    群より選択される、請求項９に記載の細胞。
  14. 【請求項１４】 前記異種調節エレメントがＡｒａＣ／ＸｙｌＳファミリー
    のメンバーによって調節される、請求項９に記載の細胞。
  15. 【請求項１５】 前記異種調節エレメントが２成分調節系によって調節され
    る、請求項９に記載の細胞。
  16. 【請求項１６】 前記細胞が微生物である、請求項１に記載の細胞。
  17. 【請求項１７】 前記細胞が原核生物細胞である、請求項１６に記載の細胞
    。
  18. 【請求項１８】 前記細胞がグラム陽性である、請求項１７に記載の細胞。
  19. 【請求項１９】 前記細胞がグラム陰性である、請求項１７に記載の細胞。
  20. 【請求項２０】 前記細胞が真核生物細胞である、請求項１に記載の細胞。
  21. 【請求項２１】 前記細胞が酵母細胞である、請求項２０に記載の細胞。
  22. 【請求項２２】 前記細胞が真菌細胞である、請求項２０に記載の細胞。
  23. 【請求項２３】 前記細胞が植物細胞である、請求項２０に記載の細胞。
  24. 【請求項２４】 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２０に記載の細胞
    。
  25. 【請求項２５】 前記細胞がヒト細胞である、請求項２４に記載の細胞。
  26. 【請求項２６】 前記細胞が悪性である、請求項２５に記載の細胞。
  27. 【請求項２７】 前記細胞が治療に対して耐性である、請求項２６に記載の
    細胞。
  28. 【請求項２８】 前記細胞が治療に対して耐性である、請求項１７に記載の
    細胞。
  29. 【請求項２９】 前記細胞が治療に対して耐性である、請求項２０に記載の
    細胞。
  30. 【請求項３０】 必須の細胞プロセスに影響を及ぼす化合物を同定する方法
    であって、該方法は、以下の工程： （ａ）請求項１に記載の細胞を提供する工程、 （ｂ）該細胞を該化合物に曝す工程、および （ｃ）細胞生存性をアッセイする工程、 を包含する、方法。
  31. 【請求項３１】 前記細胞が液体培地で培養され、そして該細胞が該培養培
    地に前記化合物を添加することによって該化合物に曝されている、請求項３０に
    記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記細胞が固体培地で培養され、そして該細胞が該固体培
    地に前記化合物の適用によって該化合物に曝されている、請求項３０に記載の方
    法。
  33. 【請求項３３】 細胞生存性が、細胞増殖を測定することによってアッセイ
    される、請求項３０に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 細胞増殖が、生体染色、細胞計数、光散乱、高分子前駆体
    の取り込み、蛍光活性化細胞ソーティングおよびレセプター遺伝子発現からなる
    群により選択される測定によって決定される、請求項３３に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 化合物の標的を決定する方法であって、該方法は、以下の
    工程： （ａ）請求項１に記載の細胞のライブラリーを提供する工程であって、ここで
    、該ライブラリーの各メンバーにおいて異なる遺伝子産物の発現が調節され、そ
    して該ライブラリーを含む細胞において種々の異なる遺伝子産物が調節される、
    工程； （ｂ）該ラブラリーを該化合物に曝す工程；および （ｃ）細胞増殖をアッセイする工程； を包含し、 ここで、該ライブラリーのメンバーの増殖が、ネガティブに影響を及ぼされる
    場合、そのメンバーにおいて調節された該遺伝子産物が、該標的である、方法。
  36. 【請求項３６】 必須の細胞プロセスに関与する遺伝子を同定する方法であ
    って、該方法は、以下の工程： （ａ）異種調節エレメントとコード配列との間の融合物を構築する工程であっ
    て、ここで該異種調節エレメントが一定範囲のレベルにわたって該コード配列の
    発現を可能にし、そしてさらに該範囲が低い基底発現レベルを含む、工程、 （ｂ）融合物を含む細胞をある濃度の試験化合物に曝す工程、および （ｃ）該試験化合物の存在下で細胞生存性をアッセイする工程、 を包含する、方法。
  37. 【請求項３７】 前記融合物がインビトロで構築され、そして細胞に導入さ
    れる、請求項３６に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記融合物が前記細胞内でインビボで構築される、請求項
    ３６に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 細胞生存性が細胞増殖を測定することによってアッセイさ
    れる、請求項３６に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 生存性が前記コード配列の発現の１つより多いレベルでア
    ッセイされる、請求項３６に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記コード配列が非翻訳ＲＮＡ分子をコードする、請求項
    ３６に記載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記コード配列がポリペプチドまたはそのフラグメントを
    コードする、請求項３６に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 生存性が前記試験化合物の１つより多い濃度でアッセイさ
    れる、請求項３６に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 生存性が前記試験化合物の１つより多い濃度でアッセイさ
    れる、請求項４０に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記調節エレメントがＰBADプロモーターである、請求項
    ３５に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 発現が細胞増殖培地中のＬ−アラビノースまたはＬ−リボ
    ースの濃度を調整することにより調節される、請求項４５に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 さらなる調節が前記細胞増殖培地中のグルコースまたは他
    の炭素源の濃度を調整することにより達成される、請求項４６に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記調節エレメントがｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモ
    ーター、ｇａｌプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プ
    ロモーター、λｐRプロモーター、λｐLプロモーター、およびｔｅｔプロモータ
    ーからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記異種調節エレメントがＡｒａＣ／ＸｙｌＳファミリー
    のメンバーによって調節される、請求項３６に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 前記異種調節エレメントが２成分調節系によって調節され
    る、請求項３６に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 前記基底発現レベルが、野生型の約５０％未満である、請
    求項３６に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 前記コード配列が、構造タンパク質、酵素、レセプター、
    細胞内シグナル伝達分子および細胞接着分子からなる群より選択されるポリペプ
    チドをコードする、請求項４２に記載の方法。
  53. 【請求項５３】 前記細胞プロセスが、複製、組換え、ＤＮＡ修復、転写、
    翻訳、タンパク質プロセシング、タンパク質搬出、細胞壁生合成、細胞膜合成、
    脂質代謝、タンパク質代謝、エネルギー代謝、細胞分裂、薬物耐性およびビルレ
    ンスからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記細胞が液体培地で培養され、そして該細胞が該培養培
    地に前記化合物を添加することによって該化合物に曝されている、請求項３６に
    記載の方法。
  55. 【請求項５５】 前記細胞が固体培地で培養され、そして該細胞が該固体培
    地に前記化合物を適用することによって該化合物に曝されている、請求項３６に
    記載の方法。
  56. 【請求項５６】 細胞増殖が、生体染色、細胞計数、光散乱、高分子前駆体
    の取り込み、蛍光活性化細胞ソーティングおよびレセプター遺伝子発現からなる
    群により選択される測定によって決定される、請求項３６に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 試験化合物に対する感受性の付与を担う遺伝子を同定する
    方法であって、請求項３６に記載の方法に従って遺伝子を同定する工程を包含す
    る、方法。
  58. 【請求項５８】 抗生物質に対する耐性の付与を担う遺伝子を同定する方法
    であって、該方法が、請求項３６に記載の遺伝子を同定する工程を包含し、ここ
    で、該試験化合物が抗生物質であり、そして必須の細胞機能が抗生物質耐性であ
    る、方法。
  59. 【請求項５９】 請求項１に記載の細胞を使用して、ビルレンスを担う遺伝
    子を同定する方法であって、前記必須の細胞プロセスがビルレンスに関与する、
    方法。
  60. 【請求項６０】 必須の細胞プロセスに関与するポリペプチドを同定する方
    法であって、該方法が、請求項３６に記載の遺伝子を同定する工程および該遺伝
    子の配列から該ポリペプチドを決定する工程を包含する、方法。
  61. 【請求項６１】 必須の細胞プロセスに関与するＲＮＡを同定する方法であ
    って、該方法が、請求項３６に記載の遺伝子を同定する工程および該遺伝子の配
    列からＲＮＡの同一性を決定する工程を包含する、方法。
  62. 【請求項６２】 前記異種調節エレメントがｍａｌ Ｐｘプロモーターおよ
    びｍａｌ Ｐｍプロモーターからなる群より選択される、請求項９に記載の細胞
    。
  63. 【請求項６３】 発現が増殖培地中のマルトースの濃度を調整することによ
    って調節される、請求項６２に記載の細胞。
  64. 【請求項６４】 前記細胞が最少培地で増殖する、請求項６３に記載の細胞
    。
  65. 【請求項６５】 前記異種調節エレメントがｍａｌ Ｐｘプロモーターおよ
    びｍａｌ Ｐｍプロモーターからなる群より選択される、請求項３６に記載の方
    法。
  66. 【請求項６６】 発現が増殖培地中のマルトースの濃度を調整することによ
    って調節される、請求項６５に記載の方法。
  67. 【請求項６７】 前記細胞が最少培地で増殖する、請求項６６に記載の方法
    。
  68. 【請求項６８】 前記およそ−８０で配列ＧＧＡがＧＣＧに変換される、図
    １に記載の改変されたｍａｌ Ｐｘプロモーター。
  69. 【請求項６９】 前記異種調節エレメントがｒａｆ ＰAGA、ｒａｆ ＰRお
    よびｒａｆ ＰEからなる群より選択される、請求項９に記載の細胞。
  70. 【請求項７０】 発現が増殖培地中のラフィノースの濃度を調整することに
    よって調節される、請求項６９に記載の細胞。
  71. 【請求項７１】 発現が増殖培地中のスクロースの濃度を調整することによ
    って調節される、請求項６９に記載の細胞。
  72. 【請求項７２】 前記異種調節エレメントがｒａｆ ＰAGA、ｒａｆ ＰRお
    よびｒａｆ ＰEからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
  73. 【請求項７３】 前記異種調節エレメントが増殖培地中のラフィノースの濃
    度を調整することによって調節される、請求項７２に記載の方法。
  74. 【請求項７４】 前記異種調節エレメントが増殖培地中のスクロースの濃度
    を調整することによって調節される、請求項７２に記載の方法。
  75. 【請求項７５】 前記細胞が前記化合物に対して感受性過剰である、請求項
    ３０に記載の方法。
  76. 【請求項７６】 感受性過剰が細胞遺伝子の変異に起因する、請求項７５に
    記載の方法。
  77. 【請求項７７】 前記細胞遺伝子が流出ポンプの成分をコードする、請求項
    ７６に記載の方法。
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