JP2002510209A - Kringle domain 1-5 of plasminogen that can regulate angiogenesis in vivo - Google Patents

Kringle domain 1-5 of plasminogen that can regulate angiogenesis in vivo

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、内皮細胞増殖を制御することができるタンパク質、ならびにその使用に関する。本発明のタンパク質は、分子量が約５０〜６０kDa、好ましくは約５５kDaであり、プラスミノーゲン分子のＬｙｓ７８〜Ａｒｇ５３０からなるプラスミノーゲン断片の配列と実質的に同じであるアミノ酸配列を有する。 (57) Abstract The present invention relates to a protein capable of controlling endothelial cell proliferation, and use thereof. The protein of the present invention has a molecular weight of about 50-60 kDa, preferably about 55 kDa, and has an amino acid sequence that is substantially the same as the sequence of a plasminogen fragment consisting of Lys78-Arg530 of the plasminogen molecule.

Description

【発明の詳細な説明】 インビボで血管形成を調節することができるプラスミノーゲンのクリングルドメ イン１−５発明の分野 本発明は、新規の内皮細胞増殖インヒビターに関する。このインヒビターは、 血管形成関連疾患の阻害および血管形成プロ七スの調節において極めて強力であ る。さらに本発明は、本発明のインヒビターを血管形成性疾患を有するヒトまた は動物に投与することにより、これらを治療する方法に関する。背景 本明細書において用語「血管形成」は、組織または臓器への新しい血管の形成 を意味し、内皮細胞増殖が関与する。正常な生理学的条件下では、ヒトまたは動 物は非常に特異的な限定された状況でのみ血管形成をする。例えば血管形成は通 常、創傷治癒、胎児および胚成長、黄体、子宮内膜、および胎盤の形成で観察さ れる。用語「内皮細胞」は、漿液腔、リンパ管、および血管の内側をおおう平面 的な上皮細胞の薄い層を意味する。 制御された血管形成と制御されていない血管形成の両方も、同様の方法で進行 すると考えられている。基底膜に囲まれた内皮細胞と周皮細胞は、毛細血管を形 成する。血管形成は、内皮細胞および白血球から放出される酵素による基底膜の 侵食で始まる。血管の内腔をおおう内皮細胞は次に、基底膜から隆起する。血管 形成刺激物質は、侵食された基底膜中を移動するように内皮細胞を誘導する。移 動する細胞は、親血管から「芽」を出し、ここで内皮細胞は細胞分裂し増殖する 。内皮細胞芽は互いに融合して毛細血管係蹄を形成し、新しい血管を作り出す。 種々の病状、癌転移、および内皮細胞による異常増殖で、持続性の無秩序な血 管形成が起き、これらの症状でみられる病的傷害を維持する。無秩序な血管形成 が存在する多様な病状は、血管形成依存性または血管形成関連疾患として分類さ れている。 腫瘍の増殖が血管形成依存性であるという仮説は、１９７１年に初めて提唱さ れた（ジェイ・フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．），腫瘍血管形成：治療的 意味（Ｔｕｍｏｒ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍ ｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２８５：１１８２−１１ ８６、１９７１）。最も単純に以下のように記載されている：「いったん腫瘍の 「生着」が起きると、腫瘍細胞集団が増加するには、腫瘍の上に集合する新しい 毛細管が毎回増加しなければならない。」。腫瘍の「生着」は現在、腫瘍増殖の 血管前の段階であって、数立方ミリメートルの容量を占めるが数百万を超えない 腫瘍細胞の集団が、既存の宿主微小血管上で生存できる段階であると、理解され ている。この段階を超える腫瘍の容量の拡大には、新しい毛細血管の誘導が必要 である。例えばマウスの初期血管前段階の肺微小転移巣は、組織学的切片につい ての高分解能顕微鏡によってしか検出できないであろう。 この考え方を支持する間接的な証拠の例としては以下のものがある： （１）マウスの皮下透明室に移植された腫瘍の増殖速度は、血管新生前は遅く 直線的であり、血管新生後には速く指数的である（ジー・エィチ・アルギレ（Ａ ｌｇｉｒｅ ＧＨ）ら、インビボでの正常および悪性腫瘍の血管反応Ｉ．創傷な らびに正常および新生物移植に対するマウスの血管反応：Ｊ Ｎａｔｌ．Ｃａｎ ｃｅｒ Ｉｎｓｔ．６：７３−８５，１９４５）。 （２）血管が増殖せず単離され潅流された臓器中で増殖した腫瘍は１〜２mm3 に制限されるが、マウスに移植して血管新生がおきると急速に拡大し、この１０ ００倍以上になる（ジェイ・フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ）ら、単離され 潅流された臓器中での腫瘍の挙動：ウサギ甲状腺およびイヌ小腸切片での生検材 料のインビトロの増殖と転移。Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｒｙ １６４： ４９１−５０２，１９６６）。 （３）無血管角膜中の腫瘍の増殖は徐々にかつ直線的に進行するが、血管新生 後は指数的増殖に変化する（エム・エー・ギンブロン（Ｇｉｍｂｒｏｎｅ，Ｍ． Ａ．）ら、腫瘍増殖と血管新生：ウサギ角膜を用いる指数モデル。Ｊ．Ｎａｔｌ ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ５２：４１−４２７，１９７４）。 （４）ウサギの眼の前眼房の眼水中に懸濁された腫瘍は生存し、無血管であり 、１mm3未満のサイズに制限される。これらはいったん紅彩血管床に移植される と、 血管が新生し急速に増殖し、２週間以内に元の容量の１６，０００倍に達する（ エム・エー・ギンブロン（Ｇｉｍｂｒｏｎｅ，ＭＡ）ら、血管新生の妨害による インビボでの腫瘍の休眠、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３６：２６１−２７６）。 （５）腫瘍は、ヒヨコ胚の漿尿膜に移植されると７２時間未満の無血管段階中 は徐々に増殖するが、平均直径０．９３＋０．２９mmを超えない。血管新生の開 始２４時間後に急速な腫瘍拡大が起き、７日目までにこれらの血管形成腫瘍は平 均直径８．０＋２．５mmに達する（ディー・クナイトン（Ｋｎｉｇｈｔｏｎ Ｄ ）、ヒヨコ胚の無血管段階と血管段階、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３ ５：３４７−３５６，１９７７）。 （６）ウサギ肝臓の転移の血管の特徴は転移のサイズに不均一性を示すが、血 管新生が存在するサイズについては比較的均一なカットオフ点を示す。腫瘍は直 径０mmまでは一般的に無血管性であるが、この直径を超えると血管新生が起きる （ダブリュー・リエン（Ｌｉｅｎ Ｗ．）ら、実験的肝転移の血管供給．II．潅 流シリコーンゴムを用いる肝臓の正常なおよび腫瘍血管の微小循環試験、Ｓｕｒ ｇｅｒｙ ６８：３３４−３４０，１９７０）。 （７）膵島のベータ細胞で癌が発生するトランスジェニックマウスにおいて、 血管形成前過形成小島はサイズが１1mm3未満に制限される。６〜７週令で、小島 の４〜１０％は血管が新生し、これらの小島から血管新生前小島の容量より１０ ００倍以上大きな血管新生腫瘍が発生する（ジェイ・フォークマン（Ｆｏｌｋｍ ａｎ Ｊ．）ら、過形成から新生物への移行の間の血管形成の誘導、Ｎａｔｕｒ ｅ ３３９：５８−６１，１９８９）。 （８）ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）に対する特異抗体は微小血管密度を減少 させ、血管形成（ヌードマウスの）の唯一のメディエーターとしてＶＥＧＦに依 存する３っのヒト腫瘍の増殖を「有意にまたは劇的に」阻害する。この抗体は、 インビトロで腫瘍細胞の増殖を阻害しない（ケー・ジェイ・キム（Ｋｉｍ ＫＪ ）ら、血管内皮増殖因子誘導性の血管形成の阻害はインビボの腫瘍増殖を抑制す る、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：８４１−８４４，１９９３）。 （９）抗ｂＦＧＦモノクローナル抗体は、血管形成の唯一のメディエーターと してｂＦＧＦの分泌に依存するマウス腫瘍の増殖の７０％阻害を引き起こす。こ の抗体は、インビトロで腫瘍細胞の増殖を阻害しない（エー・ホリ（Ｈｏｒｉ Ａ）ら、ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子に対する免疫中和性モノクローナル抗体 による固形腫瘍増殖の抑制、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５１：６１８０ −６１８４，１９９１）。 （１０）ｂＦＧＦの腹腔内注入は、腫瘍中の毛細管内皮細胞の増殖を刺激する ことにより原発性腫瘍の増殖とその転移を増強する。腫瘍細胞自体はｂＦＧＦの 受容体が欠如し、ｂＦＧＦはインビトロで腫瘍細胞の分裂促進因子ではない（ジ ェイ・エル・グロス（Ｇｒｏｓｓ ＪＬ）ら、ｂＦＧＦＧによるインビボでの固 形腫瘍増殖の調節、Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．３１ ：７９，１９９０）。 （１１）特異的血管形成インヒビター（ＡＧＭ−１４７０）は、インビボで腫 瘍増殖と転移を阻害するが、インビトロでは腫瘍細胞増殖の阻害はあまり活発で はない。これは、腫瘍細胞増殖を阻害する濃度より４対数低い濃度で血管性内皮 細胞増殖を最大の半分阻害する（ディー・イングバー（Ｉｎｇｂｅｒ，Ｄ）ら、 アナイオインヒビン（Ａｎａｉｏｉｎｈｉｂｉｎｓ）：血管形成を阻害し腫瘍増 殖を抑制するフマギリン（ｆｕｍａｇｉｌｌｉｎ）の合成類似体、Ｎａｔｕｒｅ ４８：５５５−５５７，１９９０）。また、腫瘍増殖は血管形成依存性である という間接的な臨床的証拠がある。 （１２）硝子体に対して転移性であるヒトの網膜芽細胞腫は、生存活性があり3 Ｈ−チミジンを取り込むという事実にもかかわらず１mm3未満に制限される無血 管性スフェロイドになる（摘出された目から取り出しインビトロで分析した時） 。 （１３）卵巣癌は小さい無血管性白色の種子（１〜３mm3）として腹膜に転移 する。これらの移植物は、その１つまたはそれ以上が血管新生されるまでめった に増殖しない。 （１４）乳癌の血管新生の強度（エヌ・ウェイドナー（Ｗｅｉｄｎｅｒ Ｎ） ら、腫瘍血管形成は侵襲性乳癌の転移と相関する、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ． ３２４：１−８，１９９１、およびエヌ・ウェイドナー（Ｗｅｉｄｎｅｒ Ｎ） ら、腫瘍血管形成：初期乳癌における新しい有意なかつ独立の予知指標、Ｊ Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８４：１８７５−１８８７，１９９２）と 、前立腺癌（エヌ・ウェイドナー（Ｗｅｉｄｎｅｒ Ｎ）、ピー・アール・キャ ロル（Ｃａｒｒｏｌｌ ＰＲ）、ジェイ・フラックス（Ｆｌａｘ Ｊ）、ダブリ ュー・ブルメンフェルト（Ｂｌｕｍｅｎｆｅｌｄ Ｗ）、ジェイ・フォークマン （Ｆｏｌｋｍａｎ Ｊ．）、腫瘍血管形成は侵襲性前立腺癌の転移と相関する、 Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１４３（２） ：４０１−４０９，１９９３）は、将来の転移のハイリスクと高度に相関する。 （１０）ヒト皮膚黒色腫の転移は、血管新生前はまれである。血管新生の開始 により、病変の厚さが増し転移のリスクが上昇する（エー・スリヴァスタヴァ（ Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ Ａ）ら、中間の厚さ（０．７６〜４．０mmの厚さ）の皮 膚黒色腫の腫瘍血管の予知的意味、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３３：４１ ９−４２３，１９８８）。 （１６）膀胱癌では、血管形成ペプチド（ｂＦＧＦ）の尿レベルは、細胞学よ り高感度の疾患の状態と程度の指標である（エム・グエン（Ｎｇｕｙｅｎ Ｍ） ら、膀胱癌患者の尿中の血管形成ペプチドである塩基性繊維芽細胞増殖因子のレ ベルの上昇．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８５：２４１−２４２， １９９３）。 すなわち血管形成は、癌の転移において主要な役割を果たすことは明らかであ る。この血管形成活性が抑制もしくは排除されればまたは制御および調節されれ ば、腫瘍は存在しても増殖しないであろう。病気の時は血管形成を防止すること により、新しい微小血管系の侵襲により引き起こされる傷害を避けることができ るであろう。血管形成プロセスの制御を目的とする治療は、これらの疾患の排除 または緩和を引き起こすであろう。 従って本発明の分野において、内皮細胞増殖（例えば、特に腫瘍への血管の好 ましくない増殖）を阻害する組成物および方法に対する強いニーズがある。また そのような組成物を検出し、測定し、かつ局在化するための方法に対する強いニ ーズがある。そのような組成物は、転移前腫瘍における内因性増殖因子の活性を 克服し、腫瘍における毛細血管の形成を防止し、こうして腫瘍の増殖を阻害する ことができるであろう。さらにこの組成物、組成物の断片および組成物に対する 特異抗体は、他の血管形成プロセス（例えば、創傷治癒および生殖）における毛 細血管の形成を調節することができるであろう。当然ながら血管形成を阻害する ための組成物と方法は、好ましくは非毒性であり、ほとんど副作用を引き起こさ ない。また組成物の結合部位または組成物の生合成の部位を検出し、測定しかつ 局在化するための方法が必要とされる。この組成物および組成物の断片は、放射 性および非放射性標識のために、他の分子に結合することができる。先行技術 上記目的のための組成物としてプラスミノーゲン（アンギオスタチンとも呼ぶ ）の最初の４つのクリングル領域（ｎｏｓ．１−４）を使用することが示唆され ている。しかし内皮細胞増殖に対するアンギオスタチンの阻害作用は小さすぎて 満足できない。ヒト患者の薬剤として使用される時、アンギオスタチンが有効で あるためにはキログラム単位で投与しなければならず、これはもちろん実用的に は使用の大きな制限となる。もう１つの欠点は、その作用が小さいことによる製 造の必要量であり、これは製品を非常に高価なものにする。すなわちアンギオス タチンの発見にもかかわらず、上記目的を満足する組成物に対する大きなニーズ がある。発明の要約 本発明の目的は、上記ニーズを満足することである。これは本発明により達成 され、本発明は、インビトロで内皮細胞増殖をそしてインビボ測定法で血管形成 を調節または制御（例えば阻害）することができるタンパク質に関する。本発明 はまた、そのようなタンパク質をコードする任意の核酸に関する。本発明の種々 のさらなる面を、図面を参照してさらに詳細に説明する。図面の簡単な説明 図１は、模式的にかつゲルで精製したタンパク質分解性ヒトクリングル１−５ （Ｋ１−５）断片を示す。 図２Ａ−Ｂは、Ｋ１−５の抗内皮細胞増殖活性を示し、２Ｃ−Ｄは、毛細血管 内皮細胞増殖の阻害を示す。 図３は、Ｋ１−５処理した内皮細胞の形態を示す。 図４は、アンギオスタチンとＫ５による内皮細胞増殖の相乗的抑制を示す。 図５は、ヒヨコ胚の漿尿膜（ＣＡＭ）に及ぼす本発明のＫ１−５の抗血管形成 作用を示す。 図６は、本発明のＫ１−５による原発性腫瘍増殖の抑制を、Ｋ１−５で処理し たマウスを食塩水で処理したマウスと比較して示す。 図７は、抗ｖＷＦ抗体を用いる腫瘍組織切片の免疫組織学的染色による微小血 管転移の検出を示す。発明の詳細な説明 第１の面において本発明は、請求の範囲第１項で定義されるタンパク質に関す る。一般に本発明のタンパク質は、配列番号１に開示されるヒトクリングル１− ５と配列番号２に開示されるマウスクリングル１−５が共通に有するアミノ酸配 列の少なくとも約５０％からなる。より具体的な実施態様において本発明のタン パク質は、配列番号１と２が共通に有するアミノ酸配列の約６０〜７０％、およ びより具体的にはその配列の基本的にすべてを含んでなる。１つの具体的な実施 態様において本発明のタンパク質は、ヒトアミノ酸配列の必須部分からなり、別 の実施態様において本発明のタンパク質は、基本的にすべてのマウスアミノ酸配 列からなる。本発明のタンパク質のすべての実施態様において、類似体およびそ の機能的断片が包含されることを理解されたい。 １つの実施態様において本発明のタンパク質は、非還元ボリアクリルアミドゲ ル電気泳動で測定する時、約５０〜約６５キロダルトンの分子量を有する。分子 量は特に、分子がグリコシル化されているかどうかに依存し、グリコシル化はま たどのように産生されたかに依存する。本発明の分子は、プラスミノーゲン分子 のＬｙｓ７８〜Ａｒｇ５３０からなるプラスミノーゲン断片と実質的に同じアミ ノ酸配列を示す。文献では、プラスミノーゲンが開始し終了するアミノ酸の本体 について議論されている。しかし本発明において本発明の分子の最も重要な特徴 は、これが本明細書に記載の有利な血管形成性を有することである。すなわち本 発明の分子が似ている配列はＬｙｓ７７またはＬｙｓ７８で開始し、対応してＡ ｒｇ５２９またはＡｒｇ５３０で終わる。本発明の好適な実施態様は分子であり 、これはより具体的には、約５０〜約６０キロダルトン、好ましくは約５３〜約 ５ ７キロダルトン、および最も好ましくは約５５キロダルトンの分子量を有する。 上記の広い定義によるプラスミノーゲン断片（すなわちアミノ酸配列Ｌｙｓ７８ 〜Ａｒｇ５３０からなる）は、プラスミノーゲンの最初の５つのクリングルドメ インを含むため、Ｋ１−５とも呼ばれる。第５のドメインが存在することはすで に知られていたが、この分野の専門家の一般的な意見では、クリングルｎｏ．５ はアンギオスタチンの血管形成性に寄与または共有していないというものである 。すなわちプラスミノーゲンの領域１〜５のすべてからなる断片は、以前は内皮 細胞の増殖阻害に関して全体として試験されていない。本発明者は、そのような 新しい断片、またはそのような断片と実質的に同じ配列を示す分子についての非 常に有望な結果を開示することができ、これは従来のアンギオスタチン組成物と 比較すると、きわめて驚くべきことに本発明において非常に優れている。上記利 点に加えて、本発明の分子はまた先行技術の分子より大きいため、より好ましい 。その結果本発明の分子は、より安定であり、従って薬剤および薬剤組成物とし て使用するのにより好ましい。 本発明は、プラスミノーゲン断片は、ヒトプラスミノーゲン、マウスプラスミ ノーゲン、ウシプラスミノーゲン、アカゲサルプラスミノーゲンおよびブタプラ スミノーゲンよりなる群から選択される断片と類似である、上記で定義した分子 に関する。本発明の分子またはタンパク質は、インビトロ測定法で内皮細胞増殖 を阻害することができる。 本発明のタンパク質の好適な実施態様において、このタンパク質は、配列番号 １の基本的にすべての配列、またはその任意の機能性断片もしくは類似体を含む 。別の実施態様において本タンパク質は、配列番号２の基本的にすべての配列、 またはその任意の機能性断片もしくは類似体を含む。この機能は、本発明によっ てプラスミノーゲンのＫ１−５と関連するとされている、有利な内皮細胞増殖制 御性に関する。 本発明の別の目的は、Ｋ１−５のような本発明の分子の薬剤としての使用であ る。さらに本発明はまた、内皮細胞増殖を調節（例えば阻害）するために、例え ば血管形成関連症状または疾患、例えば腫瘍増殖（例えば癌）、糖尿病などの治 療用薬剤の製造のために上記分子を使用することに関する。 従って本発明はまた、本発明の分子ならびに１つまたはそれ以上の薬剤学的に 許容される担体および／または賦形剤を含む、薬剤組成物または獣医薬剤組成物 に関する。この組成物は、予防および／または治療のための投与方法（例えば、 非経口、局所的、経口または表面的投与）に応じて、種々の単位投与型で投与さ れる。例えば経口投与に適した単位投与型には、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤 およびトローチ剤がある。水性担体（例えば、緩衝化食塩水）のような多くの担 体が使用できる。これらの溶液は、好ましくない物質は混入していない。この組 成物はまた、生理学的条件に近づけるのに必要な薬剤学的に許容される補助物質 （例えば、ｐＨ調整剤および緩衝化剤、毒性調整剤など、例えば酢酸ナトリウム 、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなど）を含有してもよい。非 経口投与される組成物については、例えばレミントンの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇ ｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、第１５版、 マックパブリシングカンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａ ｎｙ）、イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、ペンシルバニア州（１９８０）を参照さ れたい。本発明の組成物または調製物は、はるかに低い用量で投与してもよく、 従ってその使用は既知のアンギオスタチン組成物より優れている。従ってアンギ オスタチンの使用と比較する時、Ｋ１−５を含む薬剤調製物の使用は、必要量が 少ないため投与が容易であり、この少用量のために薬剤が安価になる。本発明の ある実施態様において、組成物は、癌転移を阻害することができる分子またはタ ンパク質を含む。内皮細胞増殖の阻害のための本発明の分子の半最大濃度（ＥＣ ５０）は約５０pMであり、これと比較してアンギオスタチンのＥＣ５０は１３０ nMである。すなわち本発明の組成物の作用とアンギオスタチンの作用の間には５ ００〜１０００倍の差があり、これは顕著であり、かつ驚くべきことである。プ ラスミノーゲン、アンギオスタチンの最初の４つのクリングルドメインの阻害作 用を個別におよび組合せて評価すると、最も強力な内皮細胞増殖阻害は、クリン グル領域４をアンギオスタチンから除去した時に得られた（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎ ａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，ｖｏｌ２ ７１，Ｎｏ ４６：「ヒトアンギオスタチンのクリングルドメイン」、カオ（Ｃ ａｏ）らを参照されたい）。すなわち この分野の一般的意見では、このタンパク質からクリングルｎｏ４を除去すると 、より強力な断片が得られるであろうというものである。しかし驚くべきことに 本発明者らは、以前は不活性であると考えられていたプラスミノーゲンのクリン グル５が作用を示すのみでなく、新しい分子は他のアンギオスタチン断片の作用 を低下させることが知られているクリングル４を含有することを証明した。前述 のように本発明の分子は、おそらく存在するプロテアーゼや他の酵素に対するよ り強い耐性のために、先行技術の化合物よりヒトまたは動物の体内でより安定で ある。すなわちこれは半減期がより長く、これが投与頻度を低減させ投与用量を 低減することができるため有利である。すなわち本発明のＫ１−５調製物は、こ れで治療される患者にとってより便利であり、また先行技術のアンギオスタチン またはＫ５化合物より安価である。 本発明の別の目的は、本発明の分子をコードする核酸、例えばＤＮＡまたはＲ ＮＡである。そのような配列に相補的なｃＤＮＡ配列も包含される。すなわち本 発明のさらなる目的は、厳密性条件下で上記で定義した核酸の１つに特異的にハ イブリダイズする核酸である。本発明に関連して用語「特異的にハイブリダイズ する」とは、その配列がＤＮＡまたはＲＮＡの複合体中で存在する時、厳密性条 件下での特定のヌクレオチド配列のみへの分子の結合、２本鎖形成またはハイブ リダイゼーションを意味する。本発明に関連して用語「厳密性時条件」とは、プ ローブが標的配列にハイブリダイズするが他の配列にはハイブリダイズしない条 件を意味する。厳密性条件は配列依存性であり、異なる状況により異なるであろ う。当業者は、本発明に関連して適切な条件を容易に選択することができるであ ろう。一般的に厳密性条件は、規定のイオン強度とｐＨで、特定の配列について の熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。典型的には厳密性条件 は、ヌクレオチドの長さに依存して、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満 （例えば約０．０１〜１．０Ｍ）であり、ｐＨが約７．０〜８．３であり、温度 が約３０℃〜６０℃である条件である。厳密性条件はまた、不安定化物質（例え ば、ホルムアミド）を加えることにより達成される。本発明のそのようなヌクレ オチドは、上記定義に従い任意の長さである。 本発明の核酸は、インビトロ法（例えば、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣ Ｒ）、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）など）により クローン化または増幅することができる。広範なクローニングおよびインビトロ 増幅法が当業者に公知であり、例えばバーガーとキンメル（Ｂｅｒｇｅｒ ａｎ ｄ Ｋｉｍｍｅｒ）、分子クローニング法の指針（Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２ アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．）、サンジエゴ、カリホルニア州（バーガー（Ｂｅｒｇｅ ｒ）；サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）、モレキュラークロー ニング−実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第１〜３版、コールドスプリングハーバーラ ボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） 、コールドスプリングハーバープレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州；分子生物学の現代のプロトコール（Ｃｕｒｒ ｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、 エフ・エム・アウスベル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、現代のプロトコール（ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）；カシオン（Ｃａｓｈｉｏｎ）ら、米国 特許第５０１７４７８号；およびカー（Ｃａｒ）、ヨーロッパ特許第０２４６８ ６４号を参照されたい。 別の面において本発明は、本発明の核酸によりコードされるペプチド、ポリペ プチドまたはタンパク質に関する。そのような分子の一般的な調製法は、使用に 関する後記セクションでさらに開示される。 本発明の別の面は、本発明のタンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質に対 して作成した抗体である。ポリクローナル抗体の産生法は当業者に公知である。 簡単に説明すると、免疫原（抗原）好ましくは精製したポリペプチド、適当な担 体（例えば、ＧＳＴ、キーホールリンペットヘモシアニンなど）に結合したポリ ペプチド、または免疫化ベクター（例えば組換えワクシニアウイルス（米国特許 第４７２２８４８号を参照されたい））に取り込まれたポリペプチドを、アジュ バントと混合し、この混合物で動物を免疫する。免疫原調製物に対する動物の免 疫応答を、試験血液を採取し目的のポリペプチドに対する反応性の力価を測定す ることにより追跡する。免疫原に対する抗体の適当に高い力価が得られたら、動 物から血液を採取し血清を調製する。必要な場合は、ポリペプチドに対して反応 性の抗体をさらに濃縮するために抗血清のさらなる分画を行う（例えば、コリガ ン（Ｃｏｌｉｇａｎ）（１９９１）免疫学の現代のプロトコール（Ｃｕｒｒｒｅ ｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ワイリー／グリーン （Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ）、ニューヨーク州；およびハーローとレーン（Ｈ ａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ）（１９８９）抗体；実験室マニュアル（Ａｎｔ ｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプ リング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓ ｓ）、ニューヨーク州を参照されたい）。ある場合には、種々の哺乳動物宿主（ 例えば、マウス、齧歯類、霊長類、ヒトなど）からモノクローナル抗体を調製す ることが好ましい。そのようなモノクローナル抗体を調製するための方法の説明 は、例えばスタイテス（Ｓｔｉｔｅｓ）ら（編）基礎および臨床免疫学（Ｂａｓ ｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（第４版）、ランゲ メディカルパブリケーションズ（Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｌｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａ ｔｉｏｎｓ）、ロスアルトス（Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ）、カリホルニア州、および これらの中で引用されている文献を参照されたい；ハーローとレーン（Ｈａｒｌ ｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ）、前述；ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）（１９８６） 、モノクローナル抗体：原理と実際（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉ ｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（第２版）、アカデ ミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、ニューヨーク 州；およびコーラーとミルシュタイン（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉ ｎ）（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７を参照されたい。 さらなる目的は、遺伝子治療ならびにそのような遺伝子治療法における上記で 定義した分子の使用である。本発明の方法は、哺乳動物の細胞を本発明のポリペ プチドまたは抗体を発現するベクターでトランスフェクションすることが関与し てもよい。このトランスフェクションはインビボまたはエクスビボであってもよ い。エクスビボトランスフェクションは、細胞を生物に再注入することにより行 うことが適している。他の方法は、哺乳動物（例えばヒト）に、本発明のポリペ プチドと薬剤学的に許容される賦形剤および／または担体とを含む組成物の治療 上有効量を投与することを含む。 遺伝子治療法の総説については、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）、Ｓｃｉ ｅｎｃｅ（１９９２）２５６：８０８−８１３；ナーベルとフェルグナー（Ｎａ ｂｅｌ ａｎｄ Ｆｅｌｇｎｅｒ）（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１ −２１７；ミタニとカスキー（Ｍｉｔａｎｉ ａｎｄ Ｃａｓｋｅｙ）（１９９ ３）ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２−１６６；ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）（ １９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ９２６−９３２；ディロン（Ｄｉｌｌｏｎ）（１９ ９３）ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７−１７５；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）（１９ ９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５−４６０；バンブルント（Ｖａｎ Ｂｒｕ ｎｔ）（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）：１１４９−１１ ５４；ビグネ（Ｖｉｇｎｅ）（１９９５）Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏ ｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５−３６；クレマーとペ リコデット（Ｋｒｅｍｅｒ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ）（１９９５）Ｂ ｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）３１−４４；ハ ッダダ（Ｈａｄｄａｄａ）ら（１９９５）微生物学と免疫学の現代のトピック（ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉ ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、ドエーファーとベーム（Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂ ｏｅｈｍ）（編）スプリンガー−フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ ｇ）、ハイデルベルグ、ドイツ；およびユー（Ｙｕ）ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａ ｐｈｙ（１９９４）１：１３−２６を参照されたい。 本発明のさらなる目的は、内皮細胞増殖、特に血管形成により仲介される疾患 とプロセスの治療法を提供することである。治療されるそのような疾患の１つは 癌である。従い本発明は、血管形成性疾患を有するヒトまたは動物の治療法であ って、非還元性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定する時約５０〜６５ キロダルトンの分子量を有し、プラスミノーゲン分子のＬｙｓ７８〜Ａｒｇ５３ ０からなるプラスミノーゲン断片のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を 有する分子またはタンパク質を、該ヒトまたは動物に投与することを特徴とする 上記方法に関する。好適な実施態様において本タンパク質は、約５０〜６５キロ ダルトン、好ましくは約５３〜５７キロダルトン、最も好ましくは約５５キロダ ルトンの分子量を有する。 本発明の方法は、ヒトプラスミノーゲン、マウスプラスミノーゲン、ウシプラ スミノーゲン、アカゲサルプラスミノーゲンおよびブタプラスミノーゲンよりな る群から選択されるプラスミノーゲン断片と実質的に同じ分子を使用してもよい 。 すなわち本発明は、プラスミノーゲンのクリングル１−５のタンパク質分子類 似体ならびにその使用法を包含する。従って以前は既知のアンギオスタチン分子 に加えられた新しい部分は、プラスミノーゲンのクリングルｎｏ５であり、これ は別に後述する。従来の試験では、プラスミノーゲンのクリングルｎｏ５はある 阻害作用のみを有することを示した（本出願人により１９９６年１２月１２日に 出願された米国特許出願第０８／７６３５２８号を参照されたい。これは本特許 の出願時には秘密であり、従って本明細書に参照される）。しかしＫ５単独の作 用は、本発明の分子の作用より数百倍弱い。さらに本発明の分子の内皮細胞増殖 阻害作用は、Ｋ１−４とＫ−５の作用を単に加えたものよりはるかに優れている 。 本発明はまた、体液中の阻害性ペプチドの有無を検出するための、および内皮 細胞増殖を制御するためにそのような化合物の治療上有効量が必要な患者に、ペ プチドまたはそのペプチドに特異的に結合する抗体を投与するための、診断法お よび治療法を包含する。さらに阻害性ペプチドは、ペプチドの阻害作用を軽減す る化合物について試験するために、すなわち内皮細胞増殖の阻害を克服または反 転することができる増殖因子または他の化合物についてスクリーニングするため に、インビトロで増殖している内皮細胞培養物とともに使用してもよい。すなわ ち本発明の別の面は、本発明の核酸、タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド が使用されるスクリーニング測定法である。一般的な免疫測定法の総説は、例え ばＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３７巻；細胞生物学に おける抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、アサ イ（Ａｓａｉ）編、アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ）、ニューヨーク（１９９３）；基礎および臨床免疫学（Ｂａｓｉｃ ａ ｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（第７版）、スタイテスとタ ー（Ｓｔｉｔｅｓ ａｎｄ Ｔｅｒｒ）ら（編）（１９９１）を参照されたい。 免疫測定法は競合的または非競合的でもよい。すなわち本発明はまた、同じ機能 を示すが分子量が小さいためより好ましい、Ｋ１−５の代替物として有用な分子 の検出を目的としたスクリーニング測定法を包含する。すなわち本発明の方法は 、Ｋ１−５と同じ標的に結合し、従って同等の治療作用を示すペプチドまたはポ リペプチドまたはさらにはタンパク質の検出を目的とする。本発明の方法により 検出されるペプチドまたはポリペプチドまたはさらにはタンパク質もまた、本発 明の範囲内にあり、従って本発明のさらなる面は、本発明好ましくは配列番号１ と配列番号２により規定されるＫ１−５と同じ受容体に結合するペプチド、ポリ ペプチド、またはタンパク質である。 本発明のさらに別の目的は、生物学的液体試料（例えば体液または組織）中の インヒビターの存在および／または量を検出するための、診断法または予防法ま たは測定法、およびキットを提供することである。さらに本発明はまた、本明細 書で規定されるインヒビターの局在化のための組織学的キットに関する。 本発明の別の目的は、インヒビターの生合成と分解を追跡するための分子プロ ーブ、本発明のインヒビターに特異的な抗体、該インヒビターのウイルスに対す るペプチドアゴニストとアンタゴニストの開発、抗インヒビター受容体特異抗体 アゴニストとアンタゴニスト、およびインヒビターに結合した細胞障害性物質を 提供することである。 本発明のさらに別の目的は、特に限定されないが、血管腫、固形腫瘍、白血病 、転移、毛細血管拡張症、乾癬、強皮症、血管拡張性肉芽腫、心筋血管形成、プ ラーク血管新生、冠状側枝、脳側枝、動静脈形成異常、虚血性四肢血管形成、角 膜疾患、皮膚潮紅、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、後水晶体線維形成症、関 節炎、糖尿病血管新生、黄斑変性、創傷治癒、消化性潰瘍、ヘリコバクター（Ｈ ｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）関連疾患、骨折、ケロイド、脈管形成、造血、排卵、 月経、胎盤形成、および猫ひっかき熱を含む血管形成により仲介される疾患およ びプロセスを治療するための方法と組成物を提供することである。 本発明の別の目的は、癌の増殖を治療または抑制するための組成物を提供する ことである。 本発明の目的は、インビボまたはインビトロで本発明のインヒビターを産生す る酵素の産生または活性を調節または模倣する化合物を提供することである。 本発明のさらなる目的は、そのような治療を必要とするヒトまたは動物にイン ヒビターＤＮＡを直接注入することにより、インヒビターまたは抗インヒビター 抗体を提供することである。 本発明の目的は、体液中のインヒビターに特異抗体の存在を検出および定量す るための方法を提供することである。 本発明の別の目的は、癌の検出または予防のための方法を提供することである 。 本発明の別の目的は、インビボおよびインビトロでインヒビター結合部位を視 覚化または定量するための組成物を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、インヒビター生合成の検出と定量で使用するため の組成物を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、副作用の小さい癌の治療法、例えば上記で定義し た分子を利用する遺伝子治療法を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、本発明の内皮細胞増殖インヒビターまたは細胞障 害性物質に結合したインヒビターペプチド断片を含む組成物を提供することであ る。 本発明の別の目的は、インヒビター関連組成物の特定の位置への標的化供給法 を提供することである。 本発明のさらに別の目的は、内皮細胞増殖の調節、例えば血管形成プロセスの 遺伝子治療法に有用な組成物および方法を提供することである。 本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点は、開示された実施態様およ び添付の請求の範囲の以下の詳細な説明を検討すれば明らかになるであろう。図面の詳細な説明 図１ タンパク質分解性ヒトＫ１−５断片 （Ａ）Ｇｌｕ1プラスミノーゲンをウロキナーゼ活性化プラスミンで消化して 、ヒトプラスミノーゲンのＫ１−５断片を得た。プラスミンの切断部位は、Ｎ− 末 端の２つの陽性に荷電したＬｙｓ７６（７７）とＬｙｓ７７（７８）、およびＣ −末端のＡｒｇ５２９（５３０）とＬｙｓ５３０（５３１）である。Ｌｙｓ７７ 〜Ａｒｇ５２９の間の領域を含有するＫ１−５断片をリジン−セファロースクロ マトグラフィーにより精製し、次にセファデックスＧ−７５カラムにより精製し た。（Ｂ）精製したＫ１−５を１０〜１５％ＳＤＳ勾配ポリアクリルアミドゲル で分析した。分子量標準物質をキロダルトンで左に示す。 図２ 抗内皮細胞増殖活性と毛細血管内皮細胞増殖の阻害 ヒトプラスミノーゲンのプラスミン消化から精製したＫ１−５を、既に記載さ れている（カオ（Ｃａｏ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２９４６１− ２９４６７，１９９６；カオ（Ｃａｏ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、 印刷中、１９９７）ように、７２時間増殖測定法で１ng/mlのｂＦＧＦの存在下 でウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞について測定した。ＢＳＥ細胞に対するＫ１ −５の阻害活性を低濃度（０．２〜１０nM）および（Ｂ）高濃度（２０nM〜３２ ０nM）で試験した。（Ｃ）ＢＣＥ細胞に対するＫ１−５の半最大阻害は、約５０ pMで観察された。（Ｄ）阻害作用は可逆的である。調整培地からＫ１−５を除去 した後、内皮細胞は１ng/mlのｂＦＧＦを含有する新鮮なＤＭＥＭ培地中で増殖 することができる。 図３ Ｋ１−５処理した内皮細胞の形態 種々の濃度のＫ１−５の存在下で、対照細胞（Ａ）と比較してＢＣＥ細胞の増 殖を停止させた（Ｂ−Ｄ）。これらのデータは、高濃度のＫ１−５は内皮細胞に 対して毒性ではないことを示唆する。 図４ アンギオスタチンとＫ５による内皮細胞増殖の相乗的抑制 純粋なヒトアンギオスタチン（Ｋ１−４）とクリングル５(Ｋ５)をタンパク質 分解性断片として得た。これら２つの内皮細胞インヒビターを、１ng/mlの塩基 性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）で刺激したウシ毛細血管内皮（ＢＣＥ）細胞 に、別々にまたは一緒に加えた。１nMの濃度でアンギオスタチンは内皮細胞阻害 を示さなかった。クリングル５は内皮細胞増殖を約５０％阻害した。アンギオス タチンとＫ５を一緒にＢＣＥ細胞に加えると、細胞増殖の約９５％の抑制が検出 され、両方の断片が相乗的に内皮細胞増殖を阻害することを示していた。 図５ ヒヨコ胚の漿尿膜（ＣＡＭ）に及ぼすＫ１−５の血管形成作用 既に記載されている（カオ（Ｃａｏ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２，２０ ６９−２０７７，１９９５）ように、種々の用量のＫ１−５を含有するメチルセ ルロースディスクを６日令の胚のＣＡＭに移植した。ＣＡＭの総数に対する無血 管性ゾーンを有するＣＡＭの数を、パーセントとして示す。リン酸緩衝化生理食 塩水を陰性対照として使用した。 図６ Ｋ１−５による原発性腫瘍増殖の抑制 約１×１０6マウスＴ２４１線維肉腫細胞を、６週間令のＣ５７Ｂ１６／Ｊマ ウスのそれぞれの皮下に移植した。マウスを、１００μｌのＰＢＳまたは１００ μｌのＰＢＳ中の２．５mg/kg/日のＫ１−５で毎日一回全身的に処理した。 （Ａ）Ｋ１−５処理マウスと対照マウスを処理の２０日目に写真を撮った。 （Ｂ）腫瘍の容量をデジタルカリパーで測定し、幅×長さ×０．５２の一般的式 に従って計算した。データは平均値（±ＳＥＭ）を示す。 図７ 抗ｖＷＦ抗体を用いる腫瘍組織切片の免疫組織学的染色による微小血管 密度の検出 （Ａ）ＰＢＳで処理した対照腫瘍切片。（Ｂ）と（Ｃ）Ｋ１−５処理腫瘍切片 。（Ｄ）高視野での腫瘍組織切片の微小血管の定量。本発明の有利な使用 本発明において、内皮細胞増殖の阻害、血管形成の調節、および不要な血管形 成（特に腫瘍増殖に関連する血管形成）の阻害に有効な組成物と方法が提供され る。本発明は、クリングル１−５としてヒトプラスミノーゲンから得られる約４ ５２アミノ酸配列として性状解析されるタンパク質内皮細胞増殖インヒビターを 含む。インヒビターのアミノ酸配列は、種間で少し異なる。 活性インヒビター分子中のアミノ酸の数は変動し、内皮細胞阻害活性を有する すべての密接な相同的なアミノ酸配列は本発明に包含されると考えられることを 理解されたい。 本発明は、インビトロ測定法で内皮細胞増殖を阻害することができるヒトプラ スミノーゲンの約クリングル１−５を含む組成物を、好ましくない内皮細胞増殖 を有するヒトまたは動物に投与することにより、好ましくないかつ制御できない 内皮細胞増殖により仲介される疾患およびプロセス（例えば血管形成）を治療す るための方法と組成物を提供する。好ましくは単離されたタンパク質は少なくと も純度約８０％であり、さらに好ましくは少なくとも純度約９０％であり、さら に好ましくは少なくとも純度約９０％である。本発明は、腫瘍の治療またはその 増殖の抑制に特に有用である。血管新生前の転移腫瘍を有するヒトまたは動物へ のインヒビターの投与は、腫瘍の増殖または拡大を防止するのに有用である。 本発明はまた、内皮細胞増殖インヒビターをコードするＤＮＡ配列、内皮細胞 増殖インヒビターをコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクター、および該イ ンヒビターをコードするＤＮＡ配列を含有する１つまたはそれ以上の発現ベクタ ーを含有する細胞を包含する。 本発明はまた、内皮細胞増殖インヒビターをコードするＤＮＡ配列を患者に導 入してインビボのインヒビターレベルを修飾する、遺伝子治療法を包含する。 本発明はまた、生物学的流体および組織中の内皮細胞増殖インヒビターの検出 と測定のための、および組織と細胞中のインヒビターの局在化のための、診断法 とキットを包含する。この診断法とキットは、当業者に公知の任意の構成でよい 。本発明はまた、内皮細胞増殖インヒビターに特異的な抗体およびその部分、か つ内皮細胞増殖インヒビターに特異的な抗体の結合を阻害する抗体とを包含する 。これらの抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。内皮細 胞増殖インヒビターに特異的な抗体は、血管形成により仲介される癌または他の 疾患の発生または再発の診断または予知的である、インヒビターの存在と量を検 出するための診断キットで使用することができる。内皮細胞増殖インヒビターに 特異的な抗体はまたヒトまたは動物に投与して、インヒビターに対してヒトまた は動物を受動的に免疫し、こうして血管形成阻害を低減することができる。 本発明はまた、体液中の内皮細胞増殖インヒビターに結合する抗体の存在と量 を検出するための、診断法とキットを包含する。この診断法とキットは、当業者 に公知の任意の構成でよい。 本発明はまた、インヒビターの受容体に結合し、適切なシグナルを細胞に伝達 し、かつアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する、抗インヒビター受容 体特異抗体を包含する。 本発明はまた、特に限定されないが、陽電子放射断層撮影法、オートラジオグ ラフィー、フローサイトメトリー、放射受容体結合測定法、および免疫組織学を 含む方法を用いて、インヒビター結合部位の検出と視覚化で使用される他の分子 またはタンパク質でアイソトープで標識することができるインヒビターペプチド 断片および類似体を包含する。 これらのインヒビターペプチドおよび類似体はまた、インヒビター受容体でア ゴニストおよびアンタゴニストとして作用し、こうして内皮細胞増殖インヒビタ ーの生物活性を増強または阻止する。このようなペプチドは、インヒビターに特 異的に結合することができる受容体分子の単離で使用される。 本発明はまた、治療および研究応用のために細胞障害性物質に結合した、内皮 細胞増殖インヒビター、インヒビター断片、インヒビターに特異的な抗血清、お よびインヒビター受容体アゴニストおよび受容体アンタゴニストを包含する。 さらに、インヒビター、その断片、これに特異的な抗血清、インヒビター受容 体アゴニストおよびインヒビター受容体アンタゴニストは、薬剤学的に許容され る賦形剤と組合わされ、かつ除放性化合物または組成物（例えば生体分解性ポリ マーおよびマトリックス）と随時組合わされて、治療用組成物を形成する。 本発明は、内皮細胞増殖インヒビターの転写と翻訳に関与するリボ核酸および デオキシリボ核酸の分子プローブを包含する。これらの分子プローブは、組織お よび細胞中のインヒビター生合成を検出および測定するのに有用である。 インヒビターは、プラスミノーゲン（例えばヒトプラスミノーゲン）から単離 されるか、または化学的方法もしくは生物学的方法により合成される（例えば、 細胞培養、組換え遺伝子発現、ペプチド合成およびプラスミノーゲンまたはプラ スミンのインビトロ酵素的触媒により活性インヒビターを産生する）。組換え法 は、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）を使用するＤＮＡ供給源からの遺伝子 増幅、逆転写酵素／ＰＣＲを使用するＲＮＡ供給源からの遺伝子増幅を含む。 本発明はまた、内皮細胞増殖インヒビターをコードするＤＮＡ配列を含有する ベクターを含む組成物（ここでベクターは細胞中に存在する時インヒビターを発 現することができる）、ベクターを含有する細胞を含む組成物（ここでベクター は、インヒビター断片またはその類似体をコードするＤＮＡ配列を含有し、ベク ターは細胞中に存在する時インヒビターを発現することができる）、およびヒト またはヒトでない動物にベクターを含有する細胞を移植することを含む方法（こ こでベクターは、インヒビターをコードするＤＮＡ配列を含有し、ベクターは細 胞中に存在する時インヒビターを発現することができる）を包含する。 本明細書においてインヒビターアミノ酸および核酸配列について使用される時 、用語「実質的に類似」または「実質的に相同的」とは、内皮細胞増殖阻害活性 と約５５kDaの分子量とを有するアミノ酸配列を意味し、これはまた、本明細書 に開示の特異的なＮ−末端アミノ酸配列または分子量約５５kDaを有する内皮細 胞増殖インヒビターをコードする核酸配列を有するタンパク質と高度の配列相同 性を有し、本明細書に開示の特異的なＮ−末端アミノ酸配列を有するタンパク質 と高度の相同性を有する。 高度の相同性とは、少なくとも約８０％のアミノ酸の相同性、好ましくは少な くとも約９０％のアミノ酸の相同性、およびより好ましくは少なくとも約９５％ のアミノ酸の相同性を意味する。本明細書で使用される用語「内皮細胞阻害活性 」とは、一般的に血管形成を阻害する分子の能力を意味し、例えば繊維芽細胞増 殖因子の存在下で培養中のウシ毛細血管内皮細胞の増殖を阻害する能力を意味す る。 本発明はまた、癌のような疾患の診断または予防を目的とした体液および組織 中のインヒビターの検出を含む。本発明はまた、細胞および組織中のインヒビタ ー結合部位および受容体の検出を含む。本発明はまた、インヒビターの産生を刺 激し、および／または単離したインヒビターまたは好ましい精製インヒビター、 またはインヒビターアゴニストもしくはアンタゴニスト、および／またはインヒ ビター特異的抗血清もしくはインヒビター特異的抗血清に対する抗血清を、患者 に投与することにより、特に限定されないが関節炎および腫瘍を含む血管形成性 疾患およびプロセスを治療または防止する方法を含む。さらなる治療法は、細胞 障害性物質に結合した、インヒビター、その生物活性断片、インヒビター類似体 、インヒビター特異的抗血清、またはインヒビター受容体アゴニストおよびアン タゴニストの投与を含む。 従ってインヒビターに特異的に結合する抗体を使用する受動抗体療法を使用し て、血管形成依存性プロセス（例えば生殖、発生、および創傷治癒と組織修復） を調節することができる。さらにインヒビター特異抗体のＦab領域に対する抗血 清を投与して、内因性インヒビター特異的抗血清がインヒビターに結合する能力 を阻止することができる。 本発明はまた、インヒビターをコードする遺伝子が患者中で制御される遺伝子 治療を包含する。遺伝子産物タンパク質の発現のために細胞にＤＮＡを移動また は供給する種々の方法（遺伝子治療とも呼ばれる）は、インビボでの哺乳動物体 細胞への遺伝子輸送、エヌ・ヤング（Ｎ．Ｙａｎｇ）、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉ ｏｔｅｃｈｎ．１２（４）：３３５−３５６（１９９２）（これは参照すること により本明細書の一部とする）に開示されている。遺伝子治療法は、エクスビボ またはインビボ治療法で使用するための体細胞または生殖細胞へのＤＮＡ配列の 取り込みを包含する。遺伝子治療は、遺伝子を置換し、正常なまたは異常な遺伝 子機能を増強し、かつ感染症および他の病状と戦うのに機能する。 遺伝子治療を用いてこれらの医学的問題を治療する方策は、治療的方策（例え ば、欠陥遺伝子を同定し、次に機能性遺伝子を加えて欠陥遺伝子の機能を置換す るかまたはわずかに機能性の遺伝子を増強する）、または予防的方策（例えば、 遺伝子を産物タンパク質に加えて、これは症状を治療するかまたは組織または臓 器が治療法をより受け入れやすくする）を含む。予防的方策の例として、インヒ ビターをコードする核酸配列を患者に入れ、こうして血管形成の発生を防止する か；または、腫瘍細胞を放射性に対してより感受性にする遺伝子を挿入し、次に 腫瘍の放射線照射により、腫瘍細胞の死滅を増やす。 インヒビターＤＮＡまたはインヒビター制御配列の輸送のための多くのプロト コールが本発明で企図される。インヒビターに特異的に結合して通常見いだされ るもの以外のプロモーター配列、またはインヒビタータンパク質の産生を増加さ せる他の配列のトランスフェクションもまた、遺伝子治療法として企図される。 この技術の例はトランスカリオティック・セラピーズ・インク（Ｔｒａｎｓｋａ ｒｙｏｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ，Ｉｎｃ）（ケンブリッジ、マサチューセッ ツ州）中に見いだされ、相同的組換えを使用して、細胞中のエリスロポエチン遺 伝子のスイッチを入れる「遺伝子スイッチ」を挿入する。 Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ、１９９４年４月１５日を 参照されたい。そのような「遺伝子スイッチ」は、通常はインヒビター（または インヒビター受容体）を発現しない細胞中でインヒビター（またはインヒビター 受容体）を活性化するのに使用することができるであろう。 遺伝子治療のための遺伝子輸送法は３つの広い範疇に分類される−物理的（す なわち、電気穿孔法、直接遺伝子輸送法、および粒子衝撃法）、化学的（脂質ベ ースの担体、または他の非ウイルス性ベクター）、および生物学的（ウイルス由 来ベクター、および受容体取り込み）。例えばＤＮＡで被覆されたリポソームを 含む非ウイルスベクターが使用される。そのようなリポソーム／ＤＮＡ複合体は 、患者に直接静脈注射してもよい。リポソーム／ＤＮＡ複合体は肝臓中で濃縮さ れ、そこでマクロファージおよびクプファー細胞にＤＮＡを供給する。これらの 細胞は寿命が長く、従って供給されたＤＮＡの長期発現を提供する。さらにベク ターまたは遺伝子の「裸の」ＤＮＡを、治療用ＤＮＡの標的供給のために、所望 の臓器、組織または腫瘍に直接注入してもよい。 遺伝子治療法はまた、供給部位により説明することができる。遺伝子を供給す るための基礎的な方法には、エクスビボ遺伝子輸送法、インビボ遺伝子輸送法、 およびインビトロ遺伝子輸送法がある。エクスビボ遺伝子輸送法では、患者から 細胞を取り、細胞培養で増殖させる。ＤＮＡを細胞にトランスフェクションし、 トランスフェクションした細胞の数を拡張し、次に患者に再移植する。インビト ロ遺伝子輸送法では、形質転換した細胞は培養して増殖している細胞（例えば組 織培養細胞）であり、特定の患者からの特定の細胞ではない。これらの「実験室 」細胞をトランスフェクションし、トランスフェクションした細胞を選択し、患 者への移植のためにまたは他の用途のために拡張する。 インビボ遺伝子輸送法では、細胞が患者中にある時に患者の細胞にＤＮＡを導 入する。この方法では、非感染性ウイルスを使用して、患者の部位に患者の遺伝 子を供給するかまたは裸のＤＮＡを注入し、遺伝子産物タンパク質が発現される 細胞のパーセントによりＤＮＡを取り上げる。さらに本明細書に記載の他の方法 （例えば「遺伝子銃」の使用）が、内皮細胞増殖インヒビターＤＮＡまたはイン ヒビター制御配列のインビトロ挿入のために使用される。 遺伝子治療の化学的方法では、脂質ベースの化合物（必ずしもリポソームでは ない）を使用して、細胞膜を超えてＤＮＡを運ぶ。リポフェクチンまたはサイト フェクチン、陰性に荷電したＤＮＡに結合する脂質ベースの陽性イオンは、複合 体を形成し、これは細胞膜を横断し、細胞の内側にＤＮＡを提供する。別の化学 的方法では、受容体ベースのエンドサイトーシスを使用し、これは特異的リガン ドを細胞表面受容体に結合させ、これを成長させ、細胞膜を横断して運搬する。 リガンドはＤＮＡに結合し、全複合体は細胞内に運搬される。リガンド遺伝子複 合体は血流中に注入され、次に受容体を有する標的細胞はリガンドに特異的に結 合し、リガンド−ＤＮＡ複合体を細胞内に運搬する。 多くの遺伝子治療法が、ウイルスベクターを使用して遺伝子を細胞に挿入する 。例えばエクスビボ法では改変レトロウイルスベクターを使用して、遺伝子を末 梢血および腫瘍浸潤性リンパ球、肝細胞、上皮細胞、筋細胞、または他の体細胞 中に導入する。これらの改変細胞は次に患者に導入されて、挿入されたＤＮＡか ら遺伝子産物を提供する。インビボプロトコール使用して細胞内に遺伝子を挿入 するのに、ウイルスベクターがまた使用されている。組織特異的であることが公 知の、外来遺伝子、ｃｉｓ作用性制御要素またはプロモーターの直接の組織特異 的発現を使用することができる。あるいはこれは、インビボで特定の解剖的構造 部位へのＤＮＡまたはウイルスベクターのｉｎ ｓｉｔｕ送達を使用して行われ る。例えばインビボの血管への遺伝子輸送は、選択された部位または動脈壁にイ ンビトロで形質導入した内皮細胞を移植することにより行った。ウイルスは、遺 伝子産物を発現した周りの細胞も感染させた。ウイルスベクターは例えばカテー テルによりインビボ部位に直接送達することができ、従ってある領域のみがウイ ルスに感染されることを可能にし、長期の部位特異的遺伝子発現を提供する。レ トロウイルスベクターを使用するインビボの遺伝子輸送はまた、改変ウイルスを 臓器につながる血管へ注入することにより、哺乳動物組織および肝臓組織中で証 明されている。 遺伝子治療プロトコールで使用されているウイルスベクターは、特に限定され ないが、レトロウイルス、または他のＲＮＡウイルス（例えばポリオウイルスま たはシンドビスウイルス）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウ イルス、ＳＶ４０、ワクシニア、および他のＤＮＡウイルスを含む。複製欠陥マ ウスレトロウイルスベクターは、最も広く使用されている遺伝子輸送ベクターで ある。マウス白血病レトロウイルスは、核コアタンパク質およびポリメラーゼ（ ｐｏｌ）酵素と複合体を形成し、タンパク質コア（ｇａｇ）に入ったかつ宿主の 範囲を決定する糖タンパク質エンベロープ（ｅｎｖ）に囲まれた１本鎖ＲＮＡか らなる。レトロウイルスのゲノム構造は、５’および３’長い末端反復配列（Ｌ ＴＲ）により囲まれたｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含む。レトロウイル スベクター系は、５’と３’ＬＴＲとパッケージングシグナルを含有する最小ベ クターは、ベクターのパッケージング、感染および標的細胞への組み込みに充分 であり、ウイルス構造タンパク質はパッケージング細胞株中でｔｒａｎｓで供給 されるという事実を利用する。遺伝子輸送のためのレトロウイルスベクターの基 本的な利点は、ほとんどのタイプの細胞での効率的な感染と遺伝子発現であり、 標的細胞染色体ＤＮＡへの単一のコピーベクター、およびレトロウイルスゲノム の操作の容易さである。 アデノウイルスは、コアタンパク質と複合体を形成しキャプシドタンパク質に より囲まれた線状の２本鎖ＤＮＡからなる。分子ウイルス学の進歩により、標的 細胞にインビボで新規遺伝子配列を形質導入することができるベクターを作成す るためにこれらの生物の生物学を利用できるようになった。アデノウイルスベー スのベクターは、高レベルで遺伝子産物ペプチドを発現する。アデノウイルスベ クターは低力価のウイルスであっても高い感染効率を有する。さらにこのウイル スは無細胞ウイルス粒子として非常に感染性が高く、産生細胞株の注入は必要で はない。アデノウイルスベクターの他の可能性のある利点は、インビボで異種遺 伝子の長期発現ができることである。 ＤＮＡ供給の機械的方法には、フソゲニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）脂質液胞 （例えばリポソームまたは膜融合のための他の液胞）、リポフェクチンのような 陽イオン性脂質を取り込んでいるＤＮＡの脂質粒子、ＤＮＡのポリリジン介在移 動、ＤＮＡの直接注入（例えば、胚細胞または体細胞へのＤＮＡの微量注入法） 、空気で送達されるＤＮＡ被覆粒子（例えば、「遺伝子銃」で使用される金粒子 ）、および無機化学的アプローチ（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクシ ョ ン）を含む。他の方法、リガンド介在遺伝子治療は、ＤＮＡと特異的リガンドと 複合体形成させて、リガンド−ＤＮＡ結合体を形成させ、特定の細胞または組織 にＤＮＡを向かわせる。 筋肉細胞にプラスミドＤＮＡを注入することにより、トランスフェクションさ れ、マーカー遺伝子の持続性発現をする細胞が高率で得られることが見いだされ ている。プラスミドのＤＮＡは、細胞のゲノム中に組み込まれても組み込まれな くてもよい。トランスフェクションされたＤＮＡが組み込まれないことは、最終 分化した非増殖組織中で長期間、細胞またはミトコンドリアのゲノム中の突然変 異性挿入、欠失、または変化を引き起こす恐れがなく、遺伝子産物タンパク質の トランスフェクションと発現を可能にするであろう。特異的細胞への長期の（し かし必ずしも永久性ではない）治療遺伝子の輸送は、遺伝子疾患の治療または予 防的使用を提供するであろう。受容体細胞のゲノムで突然変異が起きることなく 、ＤＮＡは、遺伝子産物レベルを維持するために周期的に再注入される。外来性 のＤＮＡが組み込まれないことは、種々の遺伝子産物を発現する作製体のすべて とともに、１つの細胞内でいくつかの異なる外来性ＤＮＡ作製体の存在を可能に するかも知れない。 植物組織を形質転換するのに、粒子介在遺伝子輸送法が最初に使用された。粒 子衝撃装置または「遺伝子銃」を用いて機動力を発生させて、標的臓器、組織ま たは細胞の貫通を可能にする高速まで、ＤＮＡ被覆高密度粒子（例えば金または タングステン）を加速する。粒子衝撃法は、インビトロ系、またはエクスビボも しくはインビボ法で使用して、ＤＮＡを細胞、組織または臓器に導入することが できる。 遺伝子輸送のための電子穿孔法は、電流を使用して細胞または組織を電子穿孔 法介在遺伝子輸送に対して感受性にする。一定の電界強度を有する短い電気パル スを使用して、ＤＮＡ分子が細胞中に貫通できるように膜の透過性を上昇させる 。この方法はインビトロ系、またはエクスビボもしくはインビボ法で使用して細 胞、組織、または臓器中にＤＮＡを導入することができる。 担体介在遺伝子輸送をインビボで使用して、細胞に外来ＤＮＡをトランスフェ クションすることができる。担体−ＤＮＡ複合体は、体液または血流中に導入し て、次に部位特異的に体の標的臓器または組織に向かわせることが便利である。 リポソームとポリ陽イオン（例えば、ポリリジン、リポフェクチンまたはサイト フェクチン）の両方を使用することができる。細胞特異的または臓器特異的リポ ソームを開発することができ、こうしてリポソームが運搬する外来ＤＮＡが標的 細胞により摂取される。ある細胞上の特定の受容体を標的とする免疫リポソーム の注入は、受容体を有する細胞へのＤＮＡの挿入の便利な方法として使用するこ とができる。使用されている別の担体系は、インビボの遺伝子輸送のために肝細 胞にＤＮＡを運搬するアシアロ糖タンパク質／ポリリジン結合体系である。 トランスフェクションされるＤＮＡは、他の種類の担体と複合体を形成し、そ の結果ＤＮＡは受容体細胞に運搬され、次に細胞質または核質中にとどまる。特 異的に操作した液胞複合体中でＤＮＡを担体核タンパク質と結合させて、直接核 に運搬することができる。 本発明のインヒビターの遺伝子制御は、インヒビターの遺伝子、遺伝子に結合 した制御領域、またはその対応するＲＮＡ転写体に結合する化合物を投与して、 転写または翻訳の速度を修飾することにより行われる。さらにインヒビターをコ ードするＤＮＡ配列でトランスフェクションした細胞を患者に投与して、インヒ ビターのインビボ供給源を提供する。例えば細胞を、インヒビターをコードする 核酸配列を含有するベクターでトランスフェクションしてもよい。 本明細書において用語「ベクター」とは、特定の核酸配列を含有するかまたは これと結合する担体を意味し、これは特定の核酸配列を細胞に運搬するのに機能 する。ベクターの例には、プラスミドおよび感染性微生物（例えば、ウイルス） 、または非ウイルス性ベクター（例えば、リガンド−ＤＮＡ結合体、リポソーム 、脂質−ＤＮＡ複合体）がある。内皮細胞増殖インヒビターＤＮＡ配列を含む組 換えＤＮＡ分子は、発現列配列に機能的に結合して、インヒビターを発現するこ とができる発現ベクターを形成することが好ましい。トランスフェクションされ る細胞は、患者の正常な組織または患者の疾患組織由来でも、または患者以外の 細胞でもよい。 例えば患者から採取した腫瘍細胞を、本発明のインヒビタータンパク質を発現 することができるベクターでトランスフェクションし、患者に再導入することが できる。トランスフェクションした腫瘍細胞は患者中で、腫瘍の増殖を阻害する レベルのインヒビターを産生する。患者はヒトでもまたはヒトでない動物でもよ い。さらに担体の助けを借りることなく、インヒビターＤＮＡを患者直接注入し てもよい。特にインヒビターＤＮＡは、皮膚、筋肉または血液中に注入される。 インヒビター発現が長時間続くか、またはインヒビターＤＮＡを周期的に投与 して、細胞、組織もしくは臓器または生物学的流体中のインヒビタータンパク質 の所望のレベルを維持してもよい。 以下の仮説に拘束される意図はないが、腫瘍が血管形成性になるとき、１つま たはそれ以上の血管形成性ペプチド（例えば、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、 ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦなど）を放出し、これは局所的に作用し、細胞外の方向 から原発性腫瘍の近辺の内皮細胞を標的とし、循環しない（または短い半減期で 循環する）と考えられる。これらの血管形成性ペプチドは、原発性腫瘍がその集 団を拡張し続けるために、内皮細胞インヒビター（血管形成のインヒビター）の 作用を克服するのに充分な量で産生される必要がある。原発性腫瘍がいったん順 調に増殖すると、これは循環流中に内皮細胞インヒビターを放出し続ける。この 仮説に従うと、これらのインヒビターは原発性腫瘍からは遠いところで作用し、 血管内の方向から転移の毛細血管内皮細胞を標的とし、循環し続ける。すなわち ちょうど遠くの転移が血管形成を開始する時、近辺の毛細血管内皮細胞は入って くるインヒビターにより阻害される。 本発明の適切な内皮細胞増殖インヒビターの産生は、（１）本明細書に記載さ れ図で例示されるインヒビターを同定し精製する工程、（２）精製したインヒビ ターのＮ−末端アミノ酸配列を決定する工程、（３）インヒビター配列の５’お よび３’ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーを合成で作成する工程、（４）ポ リメラーゼを使用してインヒビター遺伝子配列を増幅する工程、（５）増幅した 配列を適当なベクター（例えば発現ベクター）中に挿入する工程、（６）インヒ ビター遺伝子を発現することができる微生物または他の発現系に、ベクターを含 有する遺伝子を挿入する工程、および（７）組換え法で産生したインヒビターを 単離する工程、を含む組換えＤＮＡ法を使用して行われる。適切なベクターには 、ウイルス、細菌および真核生物（例えば酵母）発現ベクターがある。上記方法 は、 「モレキュラークローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ ｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、サムブルー ク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、コールドスプリングハーバープレス（Ｃｏｌｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９（これは参照することによ り本明細書の一部とする）のような実験室マニュアルに記載されている。 インヒビターまたはその生物活性断片を産生するためのさらに別の方法は、ペ プチド合成である。インヒビターのアミノ酸配列は、例えば自動ペプチド配列決 定法により決定することができる。あるいは、例えば上記方法によりインヒビタ ーをコードする遺伝子またはＤＮＡ配列がいったん単離されると、当該分野で公 知の用手的または自動化配列法を使用してＤＮＡ配列を決定することができる。 次に核酸配列は、アミノ酸配列に関する情報を与える。 いったんペプチドのアミノ酸配列がわかると、「固相ペプチド合成：実用的ア プローチ（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、イー．アサートンとアール・シ ー・シェパード（Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｃ．Ｓｈｅｒｐｐａｒｄ ）、アイアールエルプレス（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、オックスフォード、イング ランド、に例示されるような当該分野で公知の方法により、ペプチド断片を合成 することができる。複数の断片を合成して、次にこれらを互いに結合させてより 大きい断片を形成することができる。これらの合成ペプチド断片はまた、インビ トロおよびインビボのアゴニストおよびアンタゴニスト活性について試験するた めに、特定の位置のアミノ酸置換を用いて作成することができる。組織に対して 高親和性結合をするペプチド断片を使用して、親和性カラム上のインヒビターに 結合する受容体を単離することができる。 本インヒビターは、内皮細胞増殖により仲介されるかまたはこれが関与する疾 患またはプロセス（例えば血管形成）の治療に有効である。本発明は、有効量の インヒビター、またはその生物活性のある断片、またはまとめて抗血管形成活性 を有するインヒビター断片もしくはインヒビターアゴニストおよびアンタゴニス トの組合せによる、血管形成介在疾患の治療法を含む。血管形成介在疾患は、特 に限定されないが、固形腫瘍；白血病のような血液由来腫瘍；腫瘍転移；良性腫 瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫； リウマチ様関節炎；乾癬；眼血管形成性疾患、例えば糖尿病網膜症、末熟児網膜 症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、後水晶体線維形成症、皮膚潮紅 ；オスラー-ウェーバー症候群；心筋血管形成；プラーク血管形成；毛細血管拡 張症；血友病性関節；血管線維腫；および創傷顆粒形成がある。 インヒビターは、内皮細胞の過剰または異常刺激の疾患の治療に有用である。 これらの疾患には、特に限定されないが、腸管癒着症、動脈硬化症、強皮症、お よび肥厚性瘢痕（すなわち、ケロイド）がある。インヒビターは、胚の着床に必 要な血管新生を防ぐことにより避妊薬として使用することができる。インヒビタ ーは、病的結果として血管形成を有する疾患、例えば、猫ひっかき病（ロシェレ マナリアクイントーサ（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｍｉｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ） ）および潰瘍（ヘリコバクター・ピローリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌ ｏｒｉ））の治療に有用である。 インヒビターの合成ペプチド断片は多くの用途がある。高特異性とアヴィディ ティでインヒビターに結合することができる受容体に結合するペプチドは放射能 標識し、オートラジオグラフィーと膜結合法を用いて結合部位の視覚化と定量に 利用される。 さらに短命アイソトープでインヒビターまたはそのペプチド断片を標識すると 、陽電子放射断層撮影法、またはインヒビター結合部位を用いて腫瘍を局在化す るための他の現代的放射線法を使用して、インビボで受容体結合部位の視覚化が 可能になる。 細胞障害物質（例えばリシン）はインヒビターおよびその高親和性ペプチド断 片に結合され、こうしてインヒビターに結合する細胞の破壊のための手段を提供 する。これらの細胞は多くの位置（特に限定されないが、微小転移巣および原発 性腫瘍）で見つかる。細胞障害物質に結合したペプチドは、所望の位置への送達 を最大にするように設計される。例えば標的部位に供給する血管中にカニューレ を介してまたは直接標的に供給してもよい。そのような物質はまた、注入カニュ ーレに結合した浸透圧ポンプにより制御された方法で供給される。インヒビター アンタゴニストの組合せを血管形成の刺激物質と同時に加えて、組織の血管形成 を上昇させてもよい。この治療法は、転移性癌を破壊するための有効な手段を提 供する。 インヒビターは、疾患の治療のために他の組成物および方法と組合せ使用され る。例えば腫瘍は、インヒビターと組合せて従来のように手術、放射線照射また は化学療法により治療し、次に患者にインヒビターを投与して微小転移巣の休止 状態を延長させ、残存する原発性腫瘍の増殖を阻害する。さらにインヒビター、 その断片、インヒビター特異的抗血清、インヒビター受容体アゴニストおよびア ンタゴニスト、またはこれらの組合せを、薬剤学的に許容される賦形剤とともに かつ随時除放性マトリックス（例えば、生体分解性ポリマー）と組合せて、治療 用組成物を形成させる。 本明細書において除放性マトリックスとは、酵素的または酸／塩基加水分解ま たは溶解により分解される物質（通常ポリマー）から作成されたマトリックスで ある。いったん体内に挿入されると、このマトリックスは酵素や体液の作用を受 ける。除放性マトリックスは好ましくは、リポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸 ）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチドｃｏ−グリコリ ド（乳酸とグリコール酸の共重合体）、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、 ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、 脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸（例えばフェニルアラ ニン、チロシン、イソロイシン）、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、 ポリビニルピロリドンおよびシリコーンのような生体適合性材料から選択される 。好適な生体分解性マトリックスは、ポリラクチド、ポリグリコリド、またはポ リラクチドｃｏ−グリコリド（乳酸とグリコール酸の共重合体）のいずれか１つ のマトリックスである。 本発明の血管形成調節性治療用組成物は、固体、液体、またはエアゾルでもよ く、任意の既知の投与経路により投与される。固体の治療用組成物の例には、丸 剤、クリーム剤、および移植可能な投与単位を含む。丸剤は、経口的に投与され 、治療用クリーム剤は局所的に投与される。移植可能な投与単位は局所的（例え ば、腫瘍部位）に投与されるか、または治療用血管形成調節組成物の全身性放出 のた めに、例えば皮下に移植される。液体組成物の例には、皮下、静脈内、動脈内注 入に適した製剤、および局所的および眼内投与用の製剤がある。エアゾル製剤の 例には、肺への投与のための吸入製剤がある。 本発明のインヒビタータンパク質はまた、インヒビターとその受容体に特異的 な抗体を作成するために使用することができる。この抗体はポリクローナル抗体 でもモノクローナル抗体でもよい。インヒビターまたはインヒビター受容体に特 異的に結合するこれらの抗体は、体液または組織中のインヒビターレベルまたは インヒビター受容体レベルを検出または定量することが当業者に公知の診断法お よびキットで使用することができる。これらの試験の結果を使用して、癌および 他の血管形成介在疾患の発症または再発を診断または予測することができる。 インヒビターはまた、インヒビターに結合することができる抗体を検出および 定量するための診断法およびキットの開発に使用することができる。これらのキ ットは、循環性のインヒビター特異抗体の検出を可能にする。そのような循環性 抗インヒビター抗体を有する患者は、複数の腫瘍および癌によりかかりやすく、 治療後または緩解期間後により癌が再発しやすい。これらの抗体のＦab断片を抗 原として使用して、抗インヒビター抗体を中和するために使用することができる 抗インヒビター特異的Ｆab断片抗血清を作成することができる。このような方法 は、抗インヒビター抗体により循環性インヒビターの除去を低減させ、こうして 循環性インヒビターレベルを有効に上昇させる。 本発明の別の面は、過剰の内因性インヒビターの作用を阻止する方法である。 これは、系の好ましくないインヒビターに特異的な抗体を用いて、ヒトまたは動 物を受動免疫することにより行われる。この治療は、異常排卵、月経および胎盤 形成、および脈管形成を治療するのに重要である。これは、転移プロセスに及ぼ すインヒビター除去の作用を調べるための有用な手段を提供する。インヒビター 特異抗体のＦab断片は、インヒビターの結合部位を含有する。この断片は、当業 者に公知の方法を使用してインヒビター特異抗体から単離される。インヒビター 特異的抗血清のＦab断片は、抗Ｆab断片血清を作成するための抗原として使用さ れる。インヒビターに特異的なＦab断片に対するこの抗血清の注入は、インヒビ ターがインヒビター抗体に結合するのを防止する。Fab断片または抗インヒビタ ーへのインヒビターの結合をブロックすることにより、内因性抗インヒビター抗 体が和され治療的利点が得られる。この治療の真の作用は、内因性循環インヒビ ターが標的細胞に到達する能力を促進し、こうして転移の拡散を低減させること である。 本発明は、内皮細胞増殖インヒビター活性を有するインヒビターの任意の誘導 体を含むことを企図することを理解されたい。本発明は、全インヒビタータンパ ク質、インヒビタータンパク質の誘導体、およびインヒビタータンパク質の生物 活性のある断片を含む。これらは、アミノ酸置換またはアミノ酸官能基に結合し た糖もしくは他の分子を有する、インヒビター活性を有するタンパク質を含む。 本発明はまた、インヒビターおよびインヒビター受容体をコードする遺伝子、な らびにこれらの遺伝子により発現されるタンパク質を含む。 上記のインヒビター活性を有するタンパク質およびタンパク質断片は、単離し たおよび実質的に精製したタンパク質およびタンパク質断片として、薬剤学的に 許容される製剤中で、当業者に公知の調製法を使用して提供される。これらの製 剤は標準的な経路により投与することができる。一般的に組合せ物は、局所的、 経皮的、腹腔内、頭蓋内、脳室内、脳内、膣内、子宮内、経口、直腸内、または 非経口（例えば、静脈内、脊髄内、皮下または筋肉内）経路により投与される。 さらにインヒビターは、化合物の持続性放出を可能にする生体分解性ポリマー中 に取り込まれ、ポリマーは薬剤送達が好ましい部位（例えば、腫瘍部位）の近傍 に移植されるか、またはインヒビターがゆっくり全身性に放出されるように移植 される。カニューレを介して目的の分子に高濃度のインヒビターを制御送達する ために（例えば、転移増殖巣中に直接、または腫瘍への血管供給中に）浸透圧ミ ニポンプを使用してもよい。生体分解性ポリマーおよびその使用は、例えばブレ ム（Ｂｒｅｍ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７４：４４１−４４６（１９９１ ）（これはその全体を参照することにより本明細書の一部とする）中に詳述され ている。 本発明のインヒビターの投与量は、治療すべき症状または状態に依存し、ヒト または動物の体重や健康状態のような他の臨床的症状、および化合物の投与経路 に依存する。ヒトまたは動物を治療するためには、約５mg/kg/日を毎日一回投与 すると、腫瘍増殖が５０％以上抑制される。同じ投与量では、アンギオスタチン は何の作用もない。特定の動物またはヒトでのインヒビターの半減期に依存して 、インヒビターは１日に数回〜週に一回で投与することができる。本発明はヒト および獣医目的の使用も有することを理解されたい。本発明の方法は、同時にま たは長期間にわたって、単回ならびに複数回投与を企図する。 本インヒビター製剤は、経口、直腸、眼（硝子体内または眼房内を含む）、鼻 内、局所的（頬内および舌下を含む）、子宮内、膣内、または非経口（皮下、腹 腔内、筋肉内、静脈内、皮内、頭蓋内、気管内、および硬膜外）投与に適したも のを含む。インヒビター製剤は、単位投与型で提供することが便利であり、従来 の薬剤学的方法により調製される。そのような方法は、活性成分と薬剤担体また は賦形剤を一緒にする工程を含む。一般に製剤は、活性成分と液体担体または微 細固体担体またはその両方とを均一および密接に一緒にし、次に必要であれば、 生成物を成形して調製される。 非経口投与に適した製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤を含有してもよい水性 および非水性無菌注射溶液、および製剤を目的の受容体の血液と等張にする溶質 ；および懸濁剤や濃化剤を含有してもよい水性および非水性無菌懸濁剤がある。 製剤は単位投与容器または複数回投与容器（例えば、密封したアンプルおよびバ イアル）で提供してもよく、凍結乾燥状態で保存され、使用直前に無菌液体担体 （例えば注射水）を添加するのみでよい。即時注射溶液および懸濁液は、前記し た種類の無菌散剤、顆粒剤および錠剤から調製してもよい。好適な単位投与製剤 は、投与される成分の１日の用量または単位、１日の分割用量、またはその適当 な割合を含有するものである。上記した成分以外に本発明の製剤は、目的のタイ プの製剤に関して当該分野で常用される他の物質を含有してもよいことを理解さ れたい。場合により細胞障害物質を取り込むか、またはインヒビタータンパク質 またはその機能性ペプチド断片と組合せて、患者に２重治療法を提供してもよい 。 本発明の血管形成阻害性ペプチドは、標準的微小化学設備で合成することがで き、純度をＨＰＬＣと質量スペクトル法によりチェックすることができる。ペプ チド合成法、ＨＰＬＣ精製法および質量スペクトル法は、当業者に公知である。 インヒビターペプチドおよびインヒビター受容体ペプチドはまた、組換え大腸菌 （Ｅ．ｃｏｌｉ）または酵母発現系で産生され、カラムクロマトグラフィーで精 製される。 無傷のインヒビター分子の異なるペプチド断片は、特に限定されないが以下を 含むいくつかの応用で使用するために合成することができる：特異的抗血清の開 発のための抗原として、インヒビター結合部位で活性なアゴニストおよびアンタ ゴニストとして、インヒビターに結合する細胞の標的死滅のための細胞障害物質 に結合したかまたはこれと組合わされるペプチドとして。これらのペプチドを構 成するアミノ酸配列は、分子の外部領域上のその位置に基づき選択され、抗血清 への結合に利用できる。インヒビターのアミノ末端およびカルボキシ末端ならび に分子の中間領域は、合成される断片の間で別々に示される。 ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）、ブルークハーベンプロテイン（Ｂｒｏｏｋ ｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ）、スイス−プロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）、 およびピーアイアール（ＰＩＲ）のようなタンパク質配列データベースを使用し て、これらのペプチド配列を既知の配列と比較して、配列相同性の可能性を調べ る。この情報は、他の分子と高度の配列相同性を示す配列の排除を促進し、こう してインヒビターに対する抗血清、アゴニストおよびアンタゴニストの開発にお いて高い特異性に対する可能性を上昇させる。 インヒビターおよびインヒビター由来ペプチドは、標準的方法を使用して他の 分子に結合させることができる。インヒビターのアミノ末端とカルボキシ末端の 両方は、チロシンとリジン残基を含有し、多くの方法を用いてアイソトープでお よび非アイソトープで、例えば常法（チロシン残基−クロラミンＴ、ヨードゲン 、ラクトペルオキシダーゼ；リジン残基−ボルトンハンター試薬）を用いて標識 することができる。これらの結合法は当業者に公知である。あるいはチロシンま たはリジンを、これらの残基を持たない断片に加えて、ペプチド上の各アミノ基 およびヒドロキシル基の標識を促進する。結合法は、アミノ酸上の利用できる官 能基（特に限定されないが、アミノ、スルフヒドリル、カルボキシル、アミド、 フェノール、およびイミダゾール基を含む）に基づいて選択される。これらの結 合をさせるのに使用される種々の試薬には特に、グルタルアルデヒド、ジアゾ化 ベンジジン、カルボジイミド、およびｐ−ベンゾキノンがある。インヒビターペ プ チドは種々の応用のために、アイソトープ、酵素、担体タンパク質、細胞障害物 質、蛍光分子、発光性、生物発光性化合物、および他の化合物に化学的に結合さ れる。結合反応の効率は、特異的反応に適した異なる技術を使用して決定される 。例えば125Ｉを用いるインヒビターペプチドの放射能標識は、クロロミンＴと 高比活性のＮａ125Ｉを使用して行われる。反応はメタ重亜硫酸ナトリウムを用 いて停止させ、混合物をディスポのカラムで脱塩する。標識ペプチドをカラムか ら溶出し、画分を集める。各画分からアリコートを取り、ガンマカウンターで放 射能を測定する。こうして未反応のＮａ125Ｉが標識インヒビターペプチドから 分離される。最も高い比放射活性を有するペプチド断片を、以後の使用（例えば インヒビター抗血清に結合する能力の分析）のために保存する。 ペプチド結合の他の応用は、ポリクローナル抗血清の産生である。例えばリジ ン残基を含有するインヒビターペプチドは、グルタルアルデヒドを使用して、精 製したウシ血清アルブミンに結合される。反応の効率は、放射能標識ペプチドの 取り込みを測定することにより決定される。未反応グルタルアルデヒドとペプチ ドを透析により分離する。結合体を以後の使用のために保存する。 インヒビターに特異的な抗血清、インヒビター類似体、インヒビターのペプチ ド断片およびインヒビター受容体を作成することができる。ペプチド合成と精製 後、当業者に公知の確立された技術を使用してモノクローナルとポリクローナル 抗血清の両方を作成する。例えばポリクローナル抗血清は、ウサギ、ヒツジ、ヤ ギまたは他の動物で作成してもよい。担体分子（例えばウシ血清アルブミン）に 結合したインヒビターペプチドまたはインヒビター自体はアジュバント混合物と 組合せ、乳化させ、背中、首、横腹、および時に足蹠上の複数の部位の皮下に注 入する。追加注入を定期的な間隔で行う（例えば、２〜４週間毎）。注入の約７ 〜１０日後に例えば膨張後耳の端の静脈から静脈穿刺により血液試料を得る。血 液試料を４℃で一晩凝固させ、約２４００ｇで４℃で約３０分間遠心分離する。 血清を採取し、アリコートを取り、４℃で保存してすぐ使用するかまたは後の分 析に使用する。 ポリクローナル抗血清の作成からのすべての血清試料またはモノクローナル抗 血清の産生からの培地試料を、抗体力価について分析する。いくつかの手段（例 えば、ドットブロットおよび密度分析、およびプロテインＡ、第２抗血清、冷エ タノールまたは活性炭−デキストランを使用する放射能標識ペプチド−抗体複合 体の沈殿、次にガンマカウンターで活性の測定）により力価を確立する。最も高 力価の抗血清はまた、市販の親和性カラムで精製する。インヒビターペプチドを 親和性カラム中のゲルに結合させる。抗血清試料をカラムに通すと、抗インヒビ ター抗体はカラムに結合して残る。次にこれらの抗体を溶出し、集め、力価と特 異性について測定評価する。 最も高力価のインヒビター特異的抗血清を試験して以下を確立する：ａ）最も 高い抗原の特異的結合と最も低い非特異結合が得られるような最適の抗血清希釈 、ｂ）標準的排除曲線で上昇する量のインヒビターペプチドに結合する能力、ｃ ）関連種の関連ペプチドおよびタンパク質との交差反応性の可能性、ｄ）血漿、 尿、組織および細胞培養培地の抽出物中のインヒビターペプチドを検出する能力 。 インヒビターの測定のためのキットおよびインヒビター受容体もまた、本発明 の一部として企図される。最も高い力価と特異性を有し血漿、尿、組織および細 胞培養培地の抽出物中のインヒビターペプチドを検出することができる抗血清を さらに調べて、インヒビターの迅速で信頼性のある高感度かつ特異性の高い測定 と局在化のための使いやすいキットを確立する。これらの測定キットは、特に限 定されないが、以下の技術を含む：競合的および非競合的測定法、ラジオイムノ アッセイ、生物発光および化学発光測定法、蛍光測定法、サンドイッチ測定法、 免疫放射測定法、ドットブロット法、酵素結合測定法（ＥＬＩＳＡを含む）、マ イクロタイタープレート法、尿または血液の迅速モニタリングのための抗体被覆 ストリップ法またはディップスティック法、および免疫組織化学的方法。各キッ トについて測定法の範囲、感度、正確度、信頼性、特異性および再現性を確立す る。排除または活性の標準曲線上の２０％、５０％、および８０％の点の測定内 および測定間変動を確立する。 研究および診療所で一般的に使用される測定キットの１つの例は、ラジオイム ノアッセイ（ＲＩＡ）キットである。インヒビターＲＩＡを以下に例示する。放 射ヨード化がうまくいきインヒビターまたはインヒビターペプチドを精製した後 に、最も高い力価を有する抗血清をいくつかの希釈で、適当な緩衝系中で比較的 一定量の放射能（例えば１０，０００cpm）を有するチューブに加える。非特異 結合を定量するために、他のチューブは緩衝液または免疫前血清を含有する。４ ℃で２４時間インキュベーション後、プロテインＡを加え、チューブをボルテッ クス混合し、室温で９０分間インキュベートし、約２０００〜２５００ｇで４℃ で遠心分離して、標識抗原に結合した抗体の複合体を沈殿させる。吸引して上清 を除去し、ペレット中の放射能をガンマカウンターで計測する。非特異結合を引 いた後に標識ペプチドの約１０％〜４０％に結合する抗血清希釈をさらに解析す る。 次に、放射能標識ペプチドと抗血清を含有するチューブに、既知量のペプチド を加えて、抗血清の開発に使用したインヒビターペプチドの希釈範囲（約０．１ pg〜１０ng）を評価する。さらにインキュベーション（例えば２４〜４８時間） 後、プロテインＡを加え、チューブを遠心分離し、上清を除去し、ペレット中の 放射能を計測する。非標識インヒビターペプチド（標準物質）による放射能標識 インヒビターペプチドの排除が、標準曲線を与える。いくつかの濃度の他のイン ヒビターペプチド断片、異なる種からのインヒビター、および同族のペプチドを 測定チューブに加え、インヒビター抗血清の特異性を解析する。 種々の組織の抽出物（特に限定されないが、原発性および続発性腫瘍、ルイス 肺癌、インヒビター産生細胞の培養物、胎盤、子宮、および脳、肝増殖、および 小腸のような他の組織）を調製する。組織抽出物の凍結乾燥またはスピードバッ ク（Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ）後、測定緩衝液を加え、異なるアリコートをＲＩＡチ ューブに入れる。インヒビター産生細胞の抽出物は、標準曲線に平行の排除曲線 を与え、インヒビターを産生しない組織の抽出物はインヒビターから放射能標識 インヒビターを排除しない。さらに、ルイス肺癌を有する動物からの尿、血漿お よび髄液を、増加する量で測定チューブに加える。平行の排除曲線は、組織およ び体液中のインヒビターを測定するためのインヒビター測定法の有用性を示して いる。 インヒビターを含有する組織抽出物は、アリコートを逆相ＨＰＬＣに付すこと によりさらに特性を解析できる。溶出液画分を集め、スピードバック（Ｓｐｅｅ ｄ Ｖａｃ）で乾燥し、ＲＩＡ緩衝液で復元し、インヒビターＲＩＡ で分析する。インヒビター免疫反応性の最大量は、インヒビターの溶出位置に対 応する画分中に存在する。 測定キットは、説明書、抗血清、インヒビターまたはインヒビターペプチド、 およびおそらく放射能標識インヒビター、および／または結合したインヒビター −インヒビター抗体複合体の沈殿のための試薬を提供する。キットは腫瘍がある かまたは無い動物およびヒト生物学的流体および組織抽出物中のインヒビターの 測定に有用である。 組織および細胞中のインヒビターの局在化に、別のキットが使用される。この インヒビター免疫組織化学キットは、説明書、インヒビター抗血清、およびおそ らく阻止血清とフルオレセインイソチオシアネートのような蛍光分子または１次 抗血清を視覚化するのに使用される他の試薬に結合した２次抗血清を提供する。 免疫組織化学技術は、当業者に公知である。このインヒビター免疫組織化学キッ トは、光学顕微鏡および電子顕微鏡の両方を使用して組織切片および培養細胞中 のインヒビターの局在化を可能にする。これは研究および臨床目的に使用される 。例えば腫瘍を生検するかまたは集めて、組織切片をミクロトームで切断してイ ンヒビター産生部位を調べる。この情報は癌の検出と治療において診断およびお そらく治療目的に有用である。インヒビター生合成の部位を視覚化する別の方法 では、インヒビターメッセンジャーＲＮＡを探索するためのｉｎ ｓｉｔｕハイ ブリダイゼーションで使用される核酸を放射能標識する。同様にインヒビター受 容体は免疫組織化学法により局在化、視覚化、および定量される。 本発明をさらに以下の例により例示するが、これらは決して本発明の範囲を限 定するものと理解してはならない。それより本明細書の説明を読んだ後は、その 種々の他の実施態様、修飾および同等の例が当業者には明らかであると理解すべ きである。 例１ 方法 １．ヒトプラスミノーゲンからのクリングル１−５（Ｋ１−５）の調製 既に記載されている（カオ（Ｃａｏ）ら、１９９６、ＪＢＣ，２７１，２９４ ６１−２９４６７）ようにリジン−セファロースクロマトグラフィーにより、プ ールしたヒト血漿からヒトプラスミノーゲンを調製した。精製したヒトプラスミ ノーゲンをアルカリ性溶液中でインキュベートした。消化した混合物をリジン− セファロースカラムにのせ、Ｋ１−５を０．２５ε−アミノカプロン酸勾配によ り溶出した。Ｋ１−５画分をセファクリル−Ｓ２００カラム（２．５×７０）で さらに精製して微量のプラスミノーゲン混入を除去した。ＳＤＳゲル電気泳動に より分子量は５５，０００ダルトンであることを証明した。微量配列決定により 、Ｋ１−５はプラスミノーゲンＬｙｓ７７〜Ａｒｇ５２９に対応する断片からな ることが明らかになった。２．内皮細胞増殖測定法 ウシの毛細血管内皮細胞を、１０％熱不活性化ＢＣＳと３ng/ml組換えヒトｂ ＦＧＦを有するＤＭＥＭ中で維持した。細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンの０ ．０５％溶液中に分散した。ＤＭＥＭ、１０％ＢＣＳ、１％抗生物質で細胞懸濁 液を作成し、血球計算器で計測した後、濃度を２５，０００細胞／mlに調整した 。細胞を、ゼラチン化した２４ウェル培養プレート（０．５ml/ウェル）に蒔き 、１４時間インキュベートした（３７℃、１０％二酸化炭素中）。培地を０．２ ５mlのＤＭＥＭ、５％ＢＣＳで交換し、異なる濃度の試料を適用した。２０分間 のインキュベーション後、培地とｂＦＧＦを各ウェルに加えて、最終容量０．５ mlのＤＭＥＭ、５％ＢＣＳ、１％抗生物質および１ng/ml ｂＦＧＦを得た。７ ２時間インキュベーション後、細胞をトリプシンに分散し、ヘマタール（Ｈｅｍ ａｔａｌｌ）中に再懸濁し、コールターカウンターで計測した。例２ １．ヒトプラスミノーゲンからのＫ１−５の調製： 既に記載されている（カオ（Ｃａｏ）ら、１９９６、ＪＢＣ，２７１，２９４ ６１−２９４６７）ようにリジン−セファロースクロマトグラフィーにより、プ ールしたヒト血漿からヒトプラスミノーゲンを調製した。４mlのグリシン緩衝液 （ｐＨ１０．５）中の約４０mgのプラスミノーゲンを、固定化ウロキナーゼ活性 化プラスミン（１０モルのプラスミノーゲン／１モルのプラスミン）で２５℃で ２４時間インキュベートした。消化した混合物をリジン−セファロースカラム（ １．０×３０cm）にのせ、Ｋ１−５を０．２５Ｅ−アミノカプロン酸勾配によ り溶出した。Ｋ１−５画分をセファデックスＧ−７５カラム（２．５×９０）で さらに精製した。ＳＤＳゲル電気泳動により分子量は５５，０００ダルトンであ ることを証明した。微量配列決定により、Ｋ１−５はプラスミノーゲンＬｙｓ７ ７（７８）〜Ａｒｇ５２９（５３０）に対応する断片からなることが明らかにな った。２．内皮細胞増殖測定法： ウシの毛細血管内皮細胞を、１０％熱不活性化ＢＣＳ、抗生物質および３ng/m l組換えヒトｂＦＧＦを有するＤＭＥＭ中で維持した。細胞をＰＢＳで洗浄し、 トリプシンの０．０５％溶液中に分散した。ＤＭＥＭ、１０％ＢＣＳ、１％抗生 物質で細胞懸濁液を作成し、血球計算器で計測した後、濃度を２５，０００細胞 ／mlに調整した。細胞を、ゼラチン化した２４ウェル培養プレート（０．５ml／ ウェル）に蒔き、１４時間インキュベートした（３７℃、１０％二酸化炭素中） 。培地を０．２５mlのＤＭＥＭ、５％ＢＣＳで交換し、異なる濃度の試料を適用 した。２０分間のインキュベーション後、培地とｂＦＧＦを各ウェルに加えて、 最終容量０．５mlのＤＭＥＭ、５％ＢＣＳ、１％抗生物質および１ng/mlｂＦＧ Ｆを得た。７２時間インキュベーション後、細胞をトリプシンに分散し、ヘマタ ール（Ｈｅｍａｔａｌｌ）中に再懸濁し、コールターカウンターで計測した。３．ヒヨコ胚の漿尿膜測定法（ＣＡＭ）： ３日令の白色レッグホーンの受精卵を割り、無傷の黄味を有するヒヨコ胚を１ ００×２０mmプラスチックシャーレに広げた。３％二酸化炭素中で３７℃で３日 間インキュベーション後、１０μgのＫ１−５を含有するメチルセルロースのデ ィスクを、各胚のＣＡＭの上に置いた。４８時間インキュベーション後、胚とＣ ＡＭを実体鏡により無血管ゾーンの形成について分析した。４．マウスの腫瘍試験： 雄の６週令のＣ５７Ｂ１６／Ｊマウスを腫瘍試験に使用した。対数期で増殖し ているマウスＴ２４１線維肉腫細胞（１×１０6）を採取し、ＰＢＳ中に再懸濁 し、１００μｌの容量で各動物の背側正中線の皮下に移植した。各処理群と対照 群で３匹のマウスを使用した。１００μｌのＰＢＳまたは１００μｌのＫ１−５ の皮下注射を腫瘍細胞の注射の少し後に開始し、１日一回で合計２０日間続けた 。２４時間後腫瘍が見えて存在した。２４時間後原発性腫瘍が存在した。所定の 日に原発性腫瘍をデジタルカリパーでブラインドで測定した。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Plasminogen clingdomeme can regulate angiogenesis in vivo Inn 1-5Field of the invention   The present invention relates to novel endothelial cell proliferation inhibitors. This inhibitor is Extremely potent in inhibiting angiogenesis-related diseases and regulating angiogenesis You. Furthermore, the present invention relates to the use of the inhibitor of the present invention in humans having an angiogenic disease. Relates to methods of treating these by administering them to animals.background   As used herein, the term "angiogenesis" refers to the formation of new blood vessels in a tissue or organ. Means endothelial cell proliferation is involved. Under normal physiological conditions, humans or animals Objects form angiogenesis only in very specific and limited situations. For example, angiogenesis is Normal, observed in wound healing, fetal and embryonic development, corpus luteum, endometrium, and placenta formation It is. The term "endothelial cells" refers to the plane lining the serous cavities, lymph vessels, and blood vessels Means a thin layer of typical epithelial cells.   Both controlled and uncontrolled angiogenesis proceed in a similar manner It is believed that. Endothelial cells and pericytes surrounded by basement membrane form capillaries To achieve. Angiogenesis is caused by enzymes released from endothelial cells and leukocytes, Begin with erosion. Endothelial cells that line the lumen of the blood vessel then protrude from the basement membrane. Blood vessels Formation stimulants induce endothelial cells to migrate through the eroded basement membrane. Transfer Moving cells produce "buds" from the parent vessel, where endothelial cells divide and proliferate . Endothelial sprouts fuse with each other to form capillary loops, creating new blood vessels.   Persistent, disordered blood with various pathologies, cancer metastases, and abnormal proliferation by endothelial cells Tube formation occurs and maintains the pathological injuries seen in these conditions. Chaotic angiogenesis A variety of medical conditions in which a disease exists are classified as angiogenesis-dependent or angiogenesis-related Have been.   The hypothesis that tumor growth is dependent on angiogenesis was first proposed in 1971. (Folkman J.), Tumor Angiogenesis: Therapeutic Meaning (Tumor angiogenesis: Therapeutic im applications), N.M. Engl. J. Med. 285: 1182-11 86, 1971). The simplest description is: "Once the tumor When “engraftment” occurs, the tumor cell population needs to grow before new Capillaries must be increased each time. ". Tumor “engraftment” is currently Prevascular stage, occupying a volume of a few cubic millimeters but not exceeding millions It is understood that the population of tumor cells is at a stage where it can survive on existing host microvessels. ing. Expansion of tumor volume beyond this stage requires induction of new capillaries It is. For example, lung micrometastases in the early prevascular stage of mice can be found on histological sections. It will only be detectable by all high-resolution microscopes.   Examples of indirect evidence supporting this idea include:   (1) The growth rate of the tumor implanted in the subcutaneous clear room of the mouse is slow before neovascularization. It is linear and fast and exponential after angiogenesis (G.E. lgire GH) et al., Vascular response of normal and malignant tumors in vivo. Wounded Murine Vascular Response to Normal and Neoplastic Transplants: J Natl. Can cer Inst. 6: 73-85, 1945).   (2) Tumors that grew in isolated and perfused organs without growing blood vessels were 1-2 mmThree However, when blood vessels are transplanted into mice and angiogenesis occurs, they rapidly expand. (Folkman J, et al., Isolated Tumor behavior in perfused organs: biopsy specimens from rabbit thyroid and dog small intestine sections In vitro growth and transfer of material. Annals of Surgery 164: 491-502, 1966).   (3) The growth of the tumor in the avascular cornea progresses slowly and linearly, It then changes to exponential growth (Gimbrone, M .; A. ) Et al., Tumor growth and angiogenesis: Exponential model using rabbit cornea. J. Natl . Cancer Institute 52: 41-427, 1974).   (4) The tumor suspended in the aqueous humor of the anterior chamber of the rabbit eye is alive and avascular 1mmThreeLimited to a size less than. These are once implanted in the iris vascular bed When, The blood vessels grow and grow rapidly, reaching 16,000 times their original volume within two weeks ( Gimbrone, MA, et al., By blocking angiogenesis Tumor dormancy in vivo. Exp. Med. 136: 261-276).   (5) When the tumor is implanted in the chorioallantoic membrane of the chick embryo, Grows slowly but does not exceed an average diameter of 0.93 + 0.29 mm. Opening angiogenesis Rapid tumor expansion occurred 24 hours after the start, and by day 7 these angiogenic tumors had become flat. Reach an average diameter of 8.0 + 2.5 mm (Knighton D ), Avascular and Vascular Stages of Chick Embryos, British J. et al. Cancer, 3 5: 347-356, 1977).   (6) The characteristics of the blood vessels of the metastasis of the rabbit liver show heterogeneity in the size of the metastases, It shows a relatively uniform cut-off point for sizes where vascularization is present. Tumor is straight It is generally avascular up to 0 mm in diameter, but angiogenesis occurs above this diameter (Lien W., et al., Vascular Supply of Experimental Liver Metastases. II. Irrigation Liver Normal and Tumor Vascular Microcirculation Test Using Flow Silicone Rubber, Sur gery 68: 334-340, 1970).   (7) In a transgenic mouse in which cancer develops in beta cells of islets, Hyperplastic islets before blood vessel formation are 11mm in sizeThreeLimited to 6-7 weeks old, Kojima 4-10% of blood vessels are neovascularized, and from these islets 10% of the volume of pre-angiogenic islets An angiogenic tumor more than 00 times larger occurs (J. Folkman (Folkm) an J. ) Et al., Induction of angiogenesis during transition from hyperplasia to neoplasm, Natur e 339: 58-61, 1989).   (8) Specific antibody against VEGF (vascular endothelial growth factor) reduces microvessel density And rely on VEGF as the sole mediator of angiogenesis (in nude mice). "Significantly or dramatically" inhibit the growth of three existing human tumors. This antibody is Does not inhibit the growth of tumor cells in vitro (Kim KJ ) Et al., Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo Nature 362: 841-844, 1993).   (9) Anti-bFGF monoclonal antibody is the only mediator of angiogenesis Causes a 70% inhibition of the growth of mouse tumors, which is dependent on the secretion of bFGF. This Does not inhibit the growth of tumor cells in vitro (Hori A) et al., Immunoneutralizing monoclonal antibodies against human basic fibroblast growth factor Inhibition of solid tumor growth by Cancer Research, 51: 6180 -6184, 1991).   (10) Intraperitoneal injection of bFGF stimulates proliferation of capillary endothelial cells in tumor This enhances the growth of the primary tumor and its metastasis. The tumor cells themselves are bFGF Lacking the receptor, bFGF is not a mitogen for tumor cells in vitro (di Gross JL et al., In vivo fixation with bFGFG. Regulation of Tumor Growth, Proc. Amer. Assoc. Canc. Res. 31 : 79, 1990).   (11) Specific Angiogenesis Inhibitor (AGM-1470) Inhibits tumor growth and metastasis, but inhibits tumor cell growth very poorly in vitro There is no. This is because vascular endothelium is at a concentration 4 log lower than the concentration that inhibits tumor cell growth. Inhibits cell growth by half-maximum (Ingber, D) et al. Anaioinhibins: inhibits angiogenesis and increases tumor growth Nature, a synthetic analog of fumagillin that inhibits growth   48: 555-557, 1990). Tumor growth is also angiogenesis dependent There is indirect clinical evidence.   (12) Human retinoblastoma metastatic to the vitreous has viable activityThree 1mm despite the fact that it incorporates H-thymidineThreeBloodless restricted to less than Becomes tubular spheroids (when removed from enucleated eyes and analyzed in vitro) .   (13) Ovarian cancer is a small avascular white seed (1-3 mmThreeMetastasis to the peritoneum as) I do. These implants were rare until one or more of them were vascularized Does not proliferate.   (14) Intensity of angiogenesis in breast cancer (Weidner N) Et al., Tumor angiogenesis correlates with metastasis of invasive breast cancer. Engl. J. Med. 324: 1-8, 1991, and Weidner N Et al., Tumor angiogenesis: a new significant and independent predictive index in early breast cancer, J Natl. Cancer Inst. 84: 1875-1887, 1992) , Prostate cancer (Weidner N), P.R. Roll (Carroll PR), Jay Flux (Flux J), Dublin Blumenfeld W, Jay Folkman (Folkman J.), Tumor angiogenesis correlates with metastasis of invasive prostate cancer, American Journal of Pathology, 143 (2) : 401-409, 1993) are highly correlated with the high risk of future metastases.   (10) Metastasis of human cutaneous melanoma is rare before neovascularization. Initiation of angiogenesis Increases the thickness of the lesion and increases the risk of metastasis (A. Srivastava ( Srivastava A) et al., Intermediate thickness (0.76-4.0 mm thickness) skin Prognostic significance of tumor blood vessels in skin melanoma, Amer. J. Pathol. 133: 41 9-423, 1988).   (16) In bladder cancer, urinary levels of angiogenic peptide (bFGF) are Is a highly sensitive indicator of disease state and extent (Nguyen M) Et al. Reported that basic fibroblast growth factor, an angiogenic peptide in urine of bladder cancer patients. Bell rise. J. Natl. Cancer Inst. 85: 241-242, 1993).   Thus, it is clear that angiogenesis plays a major role in cancer metastasis. You. If this angiogenic activity is suppressed or eliminated or controlled and regulated If present, the tumor will not grow if present. Prevent angiogenesis when sick Avoids injuries caused by invasion of new microvasculature Will be. Treatment aimed at controlling the angiogenic process will eliminate these diseases Or will cause relaxation.   Thus, in the field of the present invention, endothelial cell proliferation (eg, the enhancement of blood vessels, particularly to tumors). There is a strong need for compositions and methods that inhibit unwanted growth). Also Strong need for methods to detect, measure, and localize such compositions There is a Such compositions may be used to increase the activity of endogenous growth factors in pre-metastatic tumors. Overcome and prevent capillary formation in tumors, thus inhibiting tumor growth Will be able to. Further to the composition, composition fragments and compositions Specific antibodies are useful for hair growth in other angiogenic processes such as wound healing and reproduction. The formation of small blood vessels could be regulated. Naturally inhibits angiogenesis The compositions and methods for are preferably non-toxic and cause few side effects Absent. Detecting and measuring the binding site of the composition or the site of biosynthesis of the composition; A method for localization is needed. The composition and fragments of the composition are radiated It can bind to other molecules for both sexual and non-radioactive labels.Prior art   Plasminogen (also called angiostatin) as a composition for the above purpose ) Are suggested to use the first four kringle regions (nos. 1-4). ing. However, the inhibitory effect of angiostatin on endothelial cell proliferation is too small I'm not satisfied. Angiostatin is effective when used as a drug in human patients In order to be able to do so, they have to be given in kilograms, which is of course practical Is a major limitation on use. Another disadvantage is that the effect is small. Manufacturing cost, which makes the product very expensive. Ie Angios Despite the discovery of Tatin, a great need for a composition that meets the above objectives There is.Summary of the Invention   An object of the present invention is to satisfy the above needs. This is achieved by the present invention The present invention is directed to endothelial cell proliferation in vitro and angiogenesis in in vivo assays. Related to proteins that can regulate or regulate (eg, inhibit). The present invention Also relates to any nucleic acid encoding such a protein. Various aspects of the present invention Further aspects of are described in more detail with reference to the drawings.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES   FIG. 1 shows schematically and gel purified proteolytic human kringle 1-5. (K1-5) shows a fragment.   2A-B show the anti-endothelial cell proliferation activity of K1-5, 2C-D show capillary 4 shows inhibition of endothelial cell proliferation.   FIG. 3 shows the morphology of endothelial cells treated with K1-5.   FIG. 4 shows the synergistic inhibition of endothelial cell proliferation by angiostatin and K5.   FIG. 5 shows anti-angiogenic effect of K1-5 of the present invention on chorioallantoic membrane (CAM) of chick embryo. Show action.   FIG. 6 shows that the suppression of primary tumor growth by K1-5 of the present invention was treated with K1-5. Mice compared to mice treated with saline.   FIG. 7 shows microblood obtained by immunohistological staining of a tumor tissue section using an anti-vWF antibody. 4 shows detection of duct metastasis.Detailed description of the invention   In a first aspect, the invention relates to a protein as defined in claim 1. You. Generally, the protein of the present invention comprises the human kringle 1- 5 and the amino acid sequence shared by mouse kringle 1-5 disclosed in SEQ ID NO: 2 Consist of at least about 50% of the rows. In a more specific embodiment, the tan The protein is about 60-70% of the amino acid sequence shared by SEQ ID NOS: 1 and 2, and And more specifically, essentially all of the sequence. One specific implementation In one embodiment, the protein of the invention consists of an essential part of the human amino acid sequence, In one embodiment, the protein of the invention comprises essentially all mouse amino acid sequences. Consists of columns. In all embodiments of the protein of the present invention, the analog and its It is to be understood that functional fragments of   In one embodiment, the protein of the invention is a non-reduced polyacrylamide gel. Has a molecular weight of about 50 to about 65 kilodaltons as measured by electrophoresis. molecule The amount depends in particular on whether or not the molecule is glycosylated, Depends on how it was produced. The molecule of the present invention is a plasminogen molecule Substantially the same as the plasminogen fragment consisting of Lys78 to Arg530 3 shows the acid sequence. In the literature, the body of amino acids where plasminogen starts and ends Has been discussed. However, in the present invention, the most important feature of the molecule of the present invention Is that it has the advantageous angiogenic properties described herein. Ie book Sequences to which the molecules of the invention resemble begin with Lys77 or Lys78 and correspond to A Ends with rg529 or Arg530. A preferred embodiment of the present invention is a molecule. More specifically, from about 50 to about 60 kilodaltons, preferably from about 53 to about 5 It has a molecular weight of 7 kilodaltons, and most preferably about 55 kilodaltons. Plasminogen fragments according to the broad definition above (ie the amino acid sequence Lys78) ~ Arg530) are the first five clinging dome of plasminogen. It is also called K1-5 because it contains in. The fifth domain already exists But in the general opinion of experts in this field, Kringle no. 5 Does not contribute or share angiostatin angiogenesis . That is, a fragment consisting of all of regions 1 to 5 of plasminogen was Not entirely tested for cell growth inhibition. The inventor believes that such New fragments or molecules that exhibit substantially the same sequence as such fragments We can always disclose promising results, which are comparable to traditional angiostatin compositions By comparison, it is very surprising that the present invention is very excellent. Above In addition to the points, the molecules of the present invention are also preferred because they are larger than the prior art molecules. . As a result, the molecules of the present invention are more stable and thus can be used as drugs and drug compositions. It is more preferable to use.   According to the present invention, the plasminogen fragment comprises human plasminogen and mouse plasminogen. Nogen, bovine plasminogen, rhesus monkey plasminogen and porcine plastic A molecule as defined above, which is similar to a fragment selected from the group consisting of suminogen About. The molecule or protein of the present invention may be used for endothelial cell proliferation in an in vitro assay. Can be inhibited.   In a preferred embodiment of the protein of the present invention, the protein comprises SEQ ID NO: Including one essentially all sequences, or any functional fragment or analog thereof . In another embodiment, the protein comprises essentially all of the sequence of SEQ ID NO: 2, Or any functional fragment or analog thereof. This feature is provided by the present invention. Beneficial endothelial cell proliferation, which has been linked to K1-5 of plasminogen About the nobility.   Another object of the invention is the use of a molecule of the invention, such as K1-5, as a medicament. You. In addition, the present invention also provides a method for modulating (eg, inhibiting) endothelial cell proliferation, eg, Treatment of angiogenesis-related symptoms or diseases such as tumor growth (eg, cancer), diabetes, etc. It relates to the use of said molecules for the manufacture of a medicament.   Accordingly, the present invention also relates to molecules of the present invention as well as one or more pharmaceutically Pharmaceutical or veterinary composition comprising an acceptable carrier and / or excipient About. The composition may be administered in a prophylactic and / or therapeutic manner (eg, Parenteral, topical, oral or topical administration). It is. For example, unit dosage forms suitable for oral administration include powders, tablets, pills, and capsules. And lozenges. Many carriers such as aqueous carriers (eg, buffered saline) The body can be used. These solutions are free of undesirable substances. This group The product is also a pharmaceutically acceptable auxiliary substance required to approximate physiological conditions (Eg, pH and buffering agents, toxicity modifiers, such as sodium acetate , Sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, etc.). Non For orally administered compositions, see, eg, Remington's Pharmaceutical Sciences (Reming ton's Pharmaceutical Sciences), 15th edition, Mac Publishing Company ny), Easton, PA (1980). I want to be. The composition or preparation of the present invention may be administered at much lower doses, Thus, its use is superior to known angiostatin compositions. Therefore Angi When compared to the use of ostatin, the use of drug preparations containing K1-5 requires less The low dose makes administration easy, and the low dose makes the drug less expensive. Of the present invention In some embodiments, the composition comprises a molecule or tag capable of inhibiting cancer metastasis. Contains protein. Half-maximal concentration of the molecule of the invention for inhibition of endothelial cell proliferation (EC 50) is about 50 pM, compared to an angiostatin with an EC50 of 130 nM. That is, 5 times between the action of the composition of the present invention and the action of angiostatin. There is a 1000-1000 fold difference, which is significant and surprising. Step Inhibition of the first four kringle domains of rasminogen and angiostatin When evaluated individually and in combination, the most potent endothelial cell growth Glu region 4 from angiostatinRemoval(The Journal al of Biological Chemistry, 1996, vol2 71, No. 46: "Kringle domain of human angiostatin", Khao (C ao) et al.). Ie The general opinion in this field is that removing kringle no4 from this protein , A stronger fragment would be obtained. But surprisingly We believe that the plasminogen clin, previously thought to be inactive, Not only does Glu5 show an effect, but the new molecule also acts as an angiostatin fragment. Containing kringle 4, which is known to reduce the Above The molecules of the present invention, like More stable in the human or animal body than prior art compounds due to their greater resistance is there. That is, it has a longer half-life, which reduces the frequency of administration and This is advantageous because it can be reduced. That is, the K1-5 preparation of the present invention Angiostatin is more convenient for patients treated with Or it is cheaper than the K5 compound.   Another object of the present invention is to provide a nucleic acid encoding a molecule of the invention, such as DNA or R NA. CDNA sequences complementary to such sequences are also included. Ie book It is a further object of the invention to specifically treat one of the above defined nucleic acids under stringent conditions. It is a nucleic acid that hybridizes. The term “specifically hybridizes” in the context of the present invention "Does" means that the sequence is present in a complex of DNA or RNA, Of a molecule to a specific nucleotide sequence only under the condition, duplex formation or hive Means redidation. In the context of the present invention, the term "stringent time conditions" A condition in which the lobes hybridize to the target sequence but not to other sequences Means. Stringency conditions are sequence-dependent and may be different in different circumstances. U. Those skilled in the art can easily select appropriate conditions in connection with the present invention. Would. In general, stringency conditions are defined for a particular sequence at a defined ionic strength and pH. Is selected to be about 5 ° C. lower than the thermal melting point (Tm) of Typically stringent conditions Is less than about 1.0 M sodium ion, depending on the length of the nucleotide (For example, about 0.01 to 1.0 M), the pH is about 7.0 to 8.3, and the temperature is Is about 30 ° C. to 60 ° C. Stringency conditions may also affect destabilizing substances (eg, For example, formamide). Such a nucleus of the present invention Otides are of any length as defined above.   The nucleic acid of the present invention can be prepared by an in vitro method (for example, polymerase chain reaction (PC R), ligase chain reaction (LCR), transcription-based amplification system (TAS), etc.) Can be cloned or amplified. Extensive cloning and in vitro Amplification methods are known to those skilled in the art, for example, Berger and Kimmel (Berger and d Kimmer), Guide to Molecular Cloning (Guide to Mole) color Cloning Technologies), Methods in   Enzymology 152 Academic Press (Academic) Press Inc. ), San Diego, California (Berger r); Sambrook et al. (1989), molecular claw. -Labing Manual (Molecular Cloning-A Lab) operative manual), 1st to 3rd edition, Cold Spring Harvara Volatile (Cold Spring Harbor Laboratory) , Cold Spring Harbor Press   Press), New York; modern protocols for molecular biology (Curr) ent Protocols in Molecular Biology), FM Ausubel et al., A modern protocol ( Current Protocols; Cashion et al., USA No. 5,017,478; and Car, EP 02468. See No. 64.   In another aspect, the invention relates to peptides, polypeptides, and polypeptides encoded by the nucleic acids of the invention. Related to peptides or proteins. The general preparation of such molecules is This is further disclosed in the following section.   Another aspect of the invention relates to a protein, polypeptide or protein of the invention. This is an antibody created by: Methods for producing polyclonal antibodies are known to those skilled in the art. Briefly, an immunogen (antigen), preferably a purified polypeptide, Poly (eg, GST, keyhole limpet hemocyanin) Peptides, or immunization vectors (eg, recombinant vaccinia virus (US Pat. No. 4,722,848)). Mix with bunt and immunize animals with this mixture. Animal immunity to immunogen preparations The epidemic response is determined by collecting test blood and titrating the reactivity to the polypeptide of interest. Track by doing. Once a suitably high titer of antibody to the immunogen is obtained, Blood is collected from the product and serum is prepared. If necessary, react with the polypeptide Further fractionation of the antiserum is performed to further enrich for neutralizing antibodies (eg, Coliga (Coligan) (1991) A modern protocol for immunology (Currre). ntProtocols in Immunology, Wiley / Green (Wiley / Greene), New York; and Harlow and Lane (H arrow and Lane) (1989) Antibody; Laboratory Manual (Ant) ibodies: A Laboratory manual), Cold Sp Cold Spring Harbor Pres s), New York). In some cases, various mammalian hosts ( For example, prepare monoclonal antibodies from mice, rodents, primates, humans, etc. Preferably. Description of methods for preparing such monoclonal antibodies Are described in, for example, Stites et al. (Eds.) Basic and Clinical Immunology (Bas). ic and Clinical Immunology (4th edition), Lange Medical Publications (Lange Medical Publica) tions), Los Altos, California, and See the references cited in these; Harlow and Lane. ow and Lane), supra; Goding (1986). , Monoclonal antibody: principle and practice (Monoclonal Antibodi) es: Principles and Practice) (2nd edition), Academy Academic Press, New York, New York State; and Kohler and Milstein n) (1975) Nature 256: 495-497.   A further object is the above in gene therapy as well as in such methods of gene therapy. The use of defined molecules. The method of the present invention comprises the steps of: Involves transfection with a vector that expresses the peptide or antibody. You may. This transfection can be in vivo or ex vivo No. Ex vivo transfection is performed by reinjecting cells into the organism. Is suitable. Other methods include providing a mammal (eg, a human) with a polypeptide of the invention. Treatment of a composition comprising a peptide and a pharmaceutically acceptable excipient and / or carrier Administering an effective amount.   For a review of gene therapy, see Anderson, Sci. ence (1992) 256: 808-813; Nabel and Fergner (Na Bel and Felgner) (1993) TIBTECH 11: 211. -217; Mitani and Caskey (199) 3) TIBTECH 11: 162-166; Muligan ( 1993) Science 926-932; Dillon (19) 93) TIBTECH 11: 167-175; Miller (19) 92) Nature 357: 455-460; Bambrudt (Van Bru nt) (1988) Biotechnology 6 (10): 1149-11. 54; Vigne (1995) Restorative Neuro logic and Neuroscience 8: 35-36; Lycodet (Kremer and Perricaudet) (1995) B ritish Medical Bulletin 51 (1) 31-44; Haddada et al. (1995) Modern topics in microbiology and immunology ( Current Topics in Microbiology and I Munology, Döfer and Böhm (Doerfler and B) oehm) (ed.) Springer-Verla g), Heidelberg, Germany; and Yu et al., Gene Thera phy (1994) 1: 13-26.   A further object of the present invention is to provide a disease mediated by endothelial cell proliferation, especially angiogenesis. And to provide a cure for the process. One such disease to be treated is It is cancer. Accordingly, the present invention is a method of treating a human or animal having an angiogenic disease. About 50-65 when measured by non-reducing polyacrylamide gel electrophoresis. Lys78-Arg53 of the plasminogen molecule having a molecular weight of kilodaltons An amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence of the plasminogen fragment consisting of Administering a molecule or protein having the compound to the human or animal. It relates to the above method. In a preferred embodiment, the protein is about 50-65 kilograms. Daltons, preferably about 53-57 kilodaltons, most preferably about 55 kilodaltons It has a molecular weight of Luton.   The method of the present invention comprises the steps of using human plasminogen, mouse plasminogen, bovine More than sminogen, rhesus monkey plasminogen and porcine plasminogen Substantially the same molecule as the plasminogen fragment selected from the group .   That is, the present invention relates to protein molecules of kringle 1-5 of plasminogen. Includes analogs as well as their uses. Thus the previously known angiostatin molecule The new part added to is the plasminogen kringle no5, Will be described separately below. In a conventional test, there is kringle no5 of plasminogen Having only an inhibitory effect (by the applicant on December 12, 1996). See U.S. patent application Ser. No. 08 / 765,528. This is the patent At the time of the filing of this application, and is therefore referred to herein). But K5 alone The use is several hundred times weaker than the action of the molecules of the invention. Further, endothelial cell proliferation of the molecules of the invention The inhibitory effect is much better than simply adding the effects of K1-4 and K-5 .   The present invention also relates to detecting the presence or absence of inhibitory peptides in body fluids, and to endothelium. Patients who require a therapeutically effective amount of such compounds to control cell proliferation, Diagnostic methods for administering antibodies that specifically bind the peptide or its peptide. And treatments. In addition, inhibitory peptides reduce the inhibitory effect of the peptide To test for compounds that do not overcome or inhibit inhibition of endothelial cell proliferation. To screen for growth factors or other compounds that can be inverted Alternatively, it may be used with an endothelial cell culture growing in vitro. Sand Another aspect of the present invention relates to the nucleic acid, protein, peptide or polypeptide of the present invention. Is the screening assay used. For a review of common immunoassays, see If Methods in Cell Biology, Vol. 37; For Cell Biology In Antibody in Cell Biology, Asa Asai, edited by Academic Press Inc), New York (1993); Basic and Clinical Immunology (Basic a). nd Clinical Immunology (7th edition), Stytes and Ta -(States and Terr) et al. (Eds.) (1991). Immunoassays can be competitive or non-competitive. That is, the present invention also has the same function Which is more preferable because of its low molecular weight, and is useful as a substitute for K1-5 And a screening assay for the purpose of detection of That is, the method of the present invention , K1-5, bind to the same target and therefore exhibit an equivalent therapeutic effect. For the detection of a peptide or even a protein. By the method of the present invention The peptide or polypeptide or even protein to be detected is also Thus, a further aspect of the present invention relates to the present invention And a peptide that binds to the same receptor as K1-5 as defined by SEQ ID NO: 2, poly Peptide or protein.   Still another object of the present invention is to provide a method for analyzing biological fluid samples (eg, body fluids or tissues). Diagnostic or prophylactic methods to detect the presence and / or amount of the inhibitor Or a method of assay and providing a kit. Furthermore, the present invention also relates to the present specification Histological kits for the localization of inhibitors as defined in this document.   Another object of the present invention is to provide a molecular process for tracking inhibitor biosynthesis and degradation. An antibody specific for the inhibitor of the present invention, and an antibody against the virus of the inhibitor. Of peptide agonists and antagonists, anti-inhibitor receptor specific antibodies Agonists and antagonists, and cytotoxic substances bound to inhibitors To provide.   Yet another object of the present invention is, but not limited to, hemangiomas, solid tumors, leukemias. Metastasis, telangiectasia, psoriasis, scleroderma, vasodilator granulomas, myocardial angiogenesis, Lark angiogenesis, coronary collaterals, cerebral collaterals, arteriovenous dysplasia, ischemic limb angiogenesis, horns Membrane disease, skin flush, neovascular glaucoma, diabetic retinopathy, posterior lens fibrosis, Arthritis, diabetic angiogenesis, macular degeneration, wound healing, peptic ulcer, Helicobacter (H elicobacter) related diseases, fractures, keloids, angiogenesis, hematopoiesis, ovulation, Diseases mediated by angiogenesis, including menstruation, placenta formation, and feline scratching fever To provide methods and compositions for treating the disease and processes.   Another object of the present invention provides a composition for treating or inhibiting cancer growth. That is.   It is an object of the present invention to produce the inhibitors of the present invention in vivo or in vitro. To modulate or mimic the production or activity of an enzyme.   A further object of the present invention is to inject humans or animals in need of such treatment. By direct injection of inhibitor DNA, inhibitors or anti-inhibitors Is to provide antibodies.   An object of the present invention is to detect and quantify the presence of a specific antibody for an inhibitor in a body fluid. Is to provide a way to:   Another object of the present invention is to provide a method for detecting or preventing cancer. .   It is another object of the present invention to view inhibitor binding sites in vivo and in vitro. It is to provide a composition for stimulating or quantifying.   Yet another object of the present invention is to use in the detection and quantification of inhibitor biosynthesis. Is to provide a composition of   Yet another object of the invention is a method of treating cancer with low side effects, such as defined above. To provide a gene therapy method utilizing the molecule.   Yet another object of the present invention is to provide an endothelial cell proliferation inhibitor or cytotoxic cell of the present invention. To provide a composition comprising an inhibitor peptide fragment bound to a harmful substance. You.   Another object of the present invention is a method of targeted delivery of an inhibitor-related composition to a specific location. It is to provide.   Yet another object of the invention is to regulate endothelial cell proliferation, such as in the angiogenic process. It is to provide compositions and methods useful for gene therapy.   These and other objects, features, and advantages of the present invention are disclosed in the disclosed embodiments and The following detailed description of the appended claims and the following claims will become apparent.Detailed description of the drawings   Figure 1 Proteolytic human K1-5 fragment   (A) Glu1Digest plasminogen with urokinase-activated plasmin Thus, a K1-5 fragment of human plasminogen was obtained. The cleavage site of plasmin is N- End Two positively charged Lys76 (77) and Lys77 (78) at the end and C -Terminal Arg529 (530) and Lys530 (531). Lys77 -Arg529 fragment containing the K1-5 fragment was purified by lysine-sepharose chromatography. Purified by chromatography, then by Sephadex G-75 column Was. (B) Purified K1-5 is subjected to 10-15% SDS gradient polyacrylamide gel Was analyzed. Molecular weight standards in kilodaltons are shown on the left.   Figure 2 Anti-endothelial cell proliferation activity and inhibition of capillary endothelial cell proliferation   K1-5 purified from plasmin digestion of human plasminogen was previously described. (Cao et al., J. Biol. Chem. 271: 29461). 29467, 1996; Cao et al. Biol. Chem. 272, During printing, in the presence of 1 ng / ml bFGF in a 72 hour proliferation assay as in 1997). For bovine capillary endothelial (BCE) cells. K1 for BSE cells -5 inhibitory activity at low concentrations (0.2-10 nM) and (B) high concentrations (20 nM-32 0 nM). (C) Half-maximal inhibition of K1-5 on BCE cells is about 50 Observed at pM. (D) The inhibitory effect is reversible. Remove K1-5 from conditioned medium After growth, the endothelial cells were grown in fresh DMEM medium containing 1 ng / ml bFGF. can do.   Fig. 3 Morphology of endothelial cells treated with K1-5   In the presence of various concentrations of K1-5, the expansion of BCE cells compared to control cells (A) The breeding was stopped (BD). These data indicate that high concentrations of K1-5 are associated with endothelial cells. Suggests that it is not toxic.   Figure 4 Synergistic inhibition of endothelial cell proliferation by angiostatin and K5   Pure human angiostatin (K1-4) and kringle 5 (K5) Obtained as degradable fragments. These two endothelial cell inhibitors were combined with 1 ng / ml base. Bovine capillary endothelial (BCE) cells stimulated with inflammatory fibroblast growth factor (bFGF) Were added separately or together. Angiostatin inhibits endothelial cells at 1 nM concentration Did not show. Kringle 5 inhibited endothelial cell proliferation by about 50%. Angios Statins and K5 added to BCE cells together detect about 95% inhibition of cell proliferation And showed that both fragments synergistically inhibited endothelial cell proliferation.   Fig. 5 Angiogenic effect of K1-5 on chorioallantoic membrane (CAM) of chick embryo   (Cao et al., J. Exp. Med. 182, 20). 69-2077, 1995). Lulose discs were implanted into 6 day old embryo CAMs. Bloodless for the total number of CAMs The number of CAMs with a tubular zone is shown as a percentage. Phosphate buffered physiological diet Brine was used as a negative control.   Figure 6 Inhibition of primary tumor growth by K1-5   About 1 × 106Mouse T241 fibrosarcoma cells were transferred to 6 week old C57B16 / J mice. Each mouse was implanted subcutaneously. Mice were treated with 100 μl of PBS or 100 Treated systemically once daily with 2.5 mg / kg / day of K1-5 in μl PBS. (A) K1-5 treated and control mice were photographed on day 20 of treatment. (B) The volume of the tumor was measured with a digital caliper, and a general formula of width × length × 0.52 was obtained. Was calculated according to Data represent mean values (± SEM).   Figure 7 Microvessels by immunohistological staining of tumor tissue sections using anti-vWF antibody Density detection   (A) Control tumor sections treated with PBS. (B) and (C) K1-5 treated tumor sections . (D) Quantification of microvessels in tumor tissue sections in high field.Advantageous use of the invention   In the present invention, inhibition of endothelial cell proliferation, regulation of angiogenesis, and Compositions and methods are provided that are effective in inhibiting growth, particularly angiogenesis associated with tumor growth You. The present invention relates to about 4% of kringle 1-5 obtained from human plasminogen. A protein endothelial cell proliferation inhibitor characterized as a 52 amino acid sequence Including. The amino acid sequence of the inhibitors varies slightly between species.   The number of amino acids in the activity inhibitor molecule varies and has endothelial cell inhibitory activity It is to be understood that all closely homologous amino acid sequences are considered to be encompassed by the present invention. I want to be understood.   The present invention relates to a human plasmid capable of inhibiting endothelial cell proliferation in an in vitro assay. A composition comprising about kringle 1-5 of suminogen may be used to inhibit unwanted endothelial cell proliferation. And uncontrollable by administration to humans or animals with Treat diseases and processes (eg, angiogenesis) mediated by endothelial cell proliferation Methods and compositions are provided. Preferably, the isolated protein is at least Is about 80% pure, more preferably at least about 90% pure, Preferably at least about 90% pure. The present invention relates to the treatment of tumors or It is particularly useful for inhibiting growth. To humans or animals with metastatic tumors before angiogenesis Administration of an inhibitor of is useful to prevent tumor growth or spread.   The present invention also relates to a DNA sequence encoding an endothelial cell proliferation inhibitor, An expression vector containing a DNA sequence encoding a growth inhibitor; One or more expression vectors containing a DNA sequence encoding an inhibitor -Containing cells.   The present invention also provides for the introduction of a DNA sequence encoding an endothelial cell proliferation inhibitor into a patient. And modifies inhibitor levels in vivo.   The present invention also provides for the detection of endothelial cell proliferation inhibitors in biological fluids and tissues. For diagnostics and measurement and for localization of inhibitors in tissues and cells And a kit. The diagnostic method and kit may be of any configuration known to those of skill in the art. . The present invention also provides antibodies and portions thereof that are specific for endothelial cell proliferation inhibitors. Antibodies that inhibit the binding of antibodies specific to endothelial cell proliferation inhibitors . These antibodies may be polyclonal or monoclonal. Endothelium Antibodies specific for vesicle growth inhibitors can be used for cancer or other angiogenesis-mediated To detect the presence and amount of an inhibitor that is diagnostic or predictive of disease onset or recurrence Can be used in a diagnostic kit to issue. As an endothelial cell proliferation inhibitor Specific antibodies can also be administered to humans or animals to provide human or animal Can passively immunize animals and thus reduce angiogenesis inhibition.   The invention also relates to the presence and amount of antibodies that bind to endothelial cell proliferation inhibitors in body fluids. Diagnostics and kits for detecting This diagnostic method and kit are Any known configuration may be used.   The present invention also binds to the receptor of the inhibitor and transmits the appropriate signal to the cell Anti-inhibitor receptor that acts as an agonist or antagonist Body-specific antibodies.   The invention also includes, but is not limited to, positron emission tomography, autoradiography, Luffy, flow cytometry, radioreceptor binding assays, and immunohistology Other molecules used in the detection and visualization of inhibitor binding sites using methods that include Or an inhibitor peptide that can be labeled with a protein isotope Includes fragments and analogs.   These inhibitor peptides and analogs may also be active at inhibitor receptors. Acts as a gonist and antagonist, and thus acts as an endothelial cell proliferation inhibitor Enhances or inhibits the biological activity of Such peptides are particularly useful for inhibitors. Used in the isolation of receptor molecules that can bind differentially.   The present invention also relates to endothelial conjugates to cytotoxic substances for therapeutic and research applications. Cell proliferation inhibitors, inhibitor fragments, inhibitor-specific antisera, And inhibitor receptor agonists and receptor antagonists.   In addition, inhibitors, their fragments, their specific antisera, inhibitor acceptance Body agonists and inhibitor receptor antagonists are pharmaceutically acceptable And a sustained release compound or composition (eg, a biodegradable polymer). In combination with a polymer and a matrix) to form a therapeutic composition.   The present invention relates to ribonucleic acids involved in the transcription and translation of endothelial cell proliferation inhibitors and Includes molecular probes of deoxyribonucleic acid. These molecular probes are used in tissues and And is useful for detecting and measuring inhibitor biosynthesis in cells.   Inhibitors are isolated from plasminogen (eg, human plasminogen) Or synthesized by chemical or biological methods (eg, Cell culture, recombinant gene expression, peptide synthesis and plasminogen or plasmid An active inhibitor is produced by the in vitro enzymatic catalysis of sumin). Recombinant method Is a gene from a DNA source using the polymerase chain reaction (PCR) Amplification, including gene amplification from an RNA source using reverse transcriptase / PCR.   The present invention also contains a DNA sequence encoding an endothelial cell proliferation inhibitor. A composition comprising a vector (where the vector will release an inhibitor when present in the cell) A composition comprising a vector-containing cell (where the vector is Contains a DNA sequence encoding an inhibitor fragment or an analog thereof, Are capable of expressing an inhibitor when present in a cell), and human Or a method comprising transplanting cells containing the vector into a non-human animal (this method). Here, the vector contains a DNA sequence encoding the inhibitor, and the vector Which can express the inhibitor when present in the vesicle).   As used herein for inhibitor amino acid and nucleic acid sequences The term “substantially similar” or “substantially homologous” refers to endothelial cell growth inhibitory activity. And an amino acid sequence having a molecular weight of about 55 kDa, which is also described herein. Endothelial cells having a specific N-terminal amino acid sequence or a molecular weight of about 55 kDa High sequence homology to proteins with nucleic acid sequences encoding vesicle growth inhibitors Protein having specificity and having a specific N-terminal amino acid sequence disclosed herein With a high degree of homology.   A high degree of homology is at least about 80% amino acid homology, preferably less. At least about 90% amino acid homology, and more preferably at least about 95% Amino acid homology. As used herein, the term `` endothelial cell inhibitory activity By "means generally the ability of the molecule to inhibit angiogenesis, e.g. Implies the ability to inhibit the growth of bovine capillary endothelial cells in culture in the presence of growth factors You.   The invention also relates to body fluids and tissues for the diagnosis or prevention of diseases such as cancer. Includes the detection of inhibitors in The invention also relates to inhibitors in cells and tissues. -Including detection of binding sites and receptors. The present invention also stimulates inhibitor production. Vigorous and / or isolated inhibitors or preferred purified inhibitors, Or an inhibitor agonist or antagonist, and / or an inhibitor Antisera to the bitter-specific or inhibitor-specific antisera Angiogenic, including, but not limited to, arthritis and tumors Includes methods of treating or preventing diseases and processes. A further treatment is cells Inhibitors, biologically active fragments thereof, and inhibitor analogs bound to an obstacle substance , Inhibitor-specific antisera, or inhibitor receptor agonists and Including administration of agonists.   Therefore, the use of passive antibody therapy, which uses antibodies that specifically bind to the inhibitor, And angiogenesis-dependent processes (eg, reproduction, development, and wound healing and tissue repair) Can be adjusted. Further, anti-blood against the Fab region of the inhibitor-specific antibody The ability of endogenous inhibitor-specific antisera to bind inhibitors by administering Qing Can be prevented.   The invention also relates to a gene wherein the gene encoding the inhibitor is regulated in the patient. Including treatment. Transfer DNA to cells for expression of gene product proteins or The various methods of delivery (also called gene therapy) can be performed in vivo by the mammalian body. Gene transfer to cells, N. Young (N. Yang), Crit. Rev .. Bi otechn. 12 (4): 335-356 (1992) (see for reference) , Incorporated herein by reference). Gene therapy is ex vivo Or the transfer of DNA sequences to somatic or germ cells for use in in vivo therapy Includes uptake. Gene therapy replaces genes and replaces them with normal or abnormal It functions to enhance child function and combat infectious diseases and other medical conditions.   Strategies for treating these medical problems using gene therapy are curative (eg, Identify the defective gene and then add a functional gene to replace the function of the defective gene Or slightly enhance functional genes), or preventative measures (eg, In addition to the gene to the product protein, this will either treat the condition or Makes the vessel more amenable to treatment). As an example of a preventive measure, Putting a bitter-encoding nucleic acid sequence into a patient, thus preventing the occurrence of angiogenesis Or inserting a gene that makes the tumor cells more sensitive to radioactivity, Irradiating tumors increases the killing of tumor cells.   Many protocols for the transport of inhibitor DNA or inhibitor control sequences Calls are contemplated by the present invention. Normally found by binding specifically to the inhibitor Promoter sequences other than those described above, or increase the production of inhibitor proteins Transfection of other sequences to be effected is also contemplated as gene therapy. An example of this technology is Transcariatic Therapies, Inc. ryotic Therapies, Inc. (Cambridge, Mass.) And the use of homologous recombination to eliminate erythropoietin residues in cells. Insert a "gene switch" to switch on the gene. Genetic Engineering News, April 15, 1994 Please refer to. Such a “gene switch” is usually an inhibitor (or Inhibitors (or inhibitors) in cells that do not express the inhibitor receptor Receptor) could be used.   Gene delivery methods for gene therapy fall into three broad categories-physical ( That is, electroporation, direct gene transfer, and particle bombardment), chemical (lipid-based Source, or other non-viral vectors) and biological (viral Vector, and receptor uptake). For example, liposomes coated with DNA Non-viral vectors are used. Such a liposome / DNA complex Alternatively, the patient may be directly injected intravenously. The liposome / DNA complex is concentrated in the liver Where it supplies DNA to macrophages and Kupffer cells. these The cells have a long life span and thus provide long-term expression of the supplied DNA. More The “naked” DNA of the gene or gene is desired for targeted delivery of therapeutic DNA. May be injected directly into an organ, tissue or tumor.   Gene therapy can also be described by the delivery site. Supply genes Basic methods for ex vivo gene transfer, in vivo gene transfer, And in vitro gene transfer methods. With ex vivo gene transfer, patients Cells are harvested and grown in cell culture. Transfecting the cells with DNA, The number of transfected cells is expanded and then reimplanted into the patient. Inbit In gene transfer, transformed cells are grown in culture (eg, Tissue cells) and not specific cells from a specific patient. These "labs Transfect cells, select transfected cells, Expansion for human transplantation or other uses.   In vivo gene transfer involves transferring DNA to a patient's cells when the cells are in the patient. Enter. This method uses a non-infectious virus to transfer the patient's genetic information to the patient's site. Feeding offspring or injecting naked DNA, gene product protein is expressed DNA is picked up by percent of cells. Still other methods described herein (Eg, the use of a “gene gun”) is the endothelial cell proliferation inhibitor DNA or Used for in vitro insertion of inhibitor control sequences.   In chemical methods of gene therapy, lipid-based compounds (not necessarily liposomes) To carry DNA across cell membranes. Lipofectin or site Fectin, a lipid-based positive ion that binds to negatively charged DNA Form the body, which crosses the cell membrane and provides DNA inside the cell. Another chemistry The method uses receptor-based endocytosis, which is specific Binds to the cell surface receptor, grows it and transports it across the cell membrane. The ligand binds to the DNA and the entire complex is transported into the cell. Ligand gene duplication The coalescence is injected into the bloodstream, and then the target cells bearing the receptor bind specifically to the ligand. And transport the ligand-DNA complex into the cell.   Many gene therapy methods use viral vectors to insert genes into cells . For example, ex vivo methods use modified retroviral vectors to terminate genes. Peripheral blood and tumor-infiltrating lymphocytes, hepatocytes, epithelial cells, muscle cells, or other somatic cells Introduce inside. These modified cells are then introduced into the patient and the inserted DNA Provide gene products. Insert genes into cells using in vivo protocols To do so, viral vectors have also been used. Tissue specific Direct tissue specificity of a known foreign gene, cis-acting regulatory element or promoter Expression can be used. Alternatively, this may be a specific anatomical structure in vivo. Performed using in situ delivery of a DNA or viral vector to the site. You. For example, gene delivery to blood vessels in vivo can be performed at selected sites or arterial walls. It was performed by transplanting endothelial cells transduced in vitro. The virus remains Surrounding cells that expressed the gene product were also infected. Viral vectors are, for example, Can be delivered directly to an in vivo site, so that only certain areas It allows for infection with Russ and provides long-term site-specific gene expression. Les In vivo gene transfer using torovirus vectors can also By injecting into blood vessels leading to organs, it can be tested in mammalian and liver tissues. Has been stated.   The viral vectors used in gene therapy protocols are particularly limited. But not retroviruses or other RNA viruses (such as poliovirus Or Sindbis virus), adenovirus, adeno-associated virus, herpes sp. Includes irs, SV40, vaccinia, and other DNA viruses. Duplication defect The mouse retrovirus vector is the most widely used gene transfer vector. is there. Murine leukemia retrovirus contains nuclear core proteins and polymerase ( pol) forms a complex with the enzyme, enters the protein core (gag) and Is single-stranded RNA surrounded by a glycoprotein envelope (env) that determines the range? Become. The retroviral genomic structure is characterized by 5 'and 3' long terminal repeats (L TR) containing the gag, pol and env genes. Retro virus The vector system is a minimal vector containing 5 'and 3' LTRs and a packaging signal. Vector is sufficient for vector packaging, infection and integration into target cells. And the viral structural proteins are supplied trans in the packaging cell line Take advantage of the fact that Retroviral vector vectors for gene transfer The main advantage is efficient infection and gene expression in most cell types, Single copy vector into target cell chromosomal DNA, and retroviral genome Ease of operation.   Adenovirus forms a complex with the core protein to form the capsid protein It consists of a linear double-stranded DNA surrounded by more. Targeted by advances in molecular virology Create vectors that can transduce cells with novel gene sequences in vivo To this end, the biology of these organisms has become available. Adenovirus-based Vectors express gene product peptides at high levels. Adenovirus Have a high infection efficiency even with low titers of virus. More this will Are highly infectious as cell-free virus particles and do not require injection of producer cell lines. There is no. Another potential advantage of adenovirus vectors is that they are heterologous in vivo. That is, long-term expression of the gene can be achieved.   Mechanical methods of DNA supply include fusogenic lipid vacuoles (Eg liposomes or other vacuoles for membrane fusion), such as lipofectin Lipid particles of DNA incorporating cationic lipids, polylysine-mediated transfer of DNA Direct injection of DNA (eg, microinjection of DNA into embryonic or somatic cells) , DNA-coated particles delivered by air (eg, gold particles used in "gene guns") ), And inorganic chemical approaches (eg, calcium phosphate transfection Yo Including). Another method, ligand-mediated gene therapy, involves combining DNA with specific ligands. Complex to form a ligand-DNA conjugate and bind to a particular cell or tissue To the DNA.   Transfection is achieved by injecting plasmid DNA into muscle cells. It was found that cells with sustained expression of marker genes were obtained at a high rate. ing. Plasmid DNA may or may not be integrated into the cell genome. You may not. Failure to incorporate the transfected DNA will Mutations in the genome of cells or mitochondria for prolonged periods in differentiated non-proliferating tissues Gene product proteins without the risk of causing heterologous insertions, deletions, or alterations Will allow transfection and expression. Long-term access to specific cells However, it is not always permanent) Delivery of therapeutic genes is Will provide protective use. No mutations in the recipient cell genome The DNA is periodically re-injected to maintain gene product levels. Extrinsic Is not integrated, which means that all constructs that express various gene products Also allows for the presence of several different foreign DNA constructs in a single cell Maybe.   Particle-mediated gene transfer was first used to transform plant tissue. grain Use a child impactor or a “gene gun” to generate mobility to target organs, tissues, Or DNA-coated high density particles (eg, gold or Accelerate tungsten). Particle bombardment can be performed in vitro or ex vivo. Or in vivo methods to introduce DNA into cells, tissues or organs. it can.   Electroporation for gene transfer uses current to electroporate cells or tissues Sensitivity to method-mediated gene transfer. Short electric pal with constant electric field strength To increase the permeability of the membrane so that DNA molecules can penetrate cells . This method can be used in vitro systems, or in ex vivo or in vivo methods. DNA can be introduced into cells, tissues, or organs.   Transferring foreign DNA to cells using carrier-mediated gene transfer in vivo Action. The carrier-DNA complex is introduced into a body fluid or blood stream. It is then convenient to target the target organ or tissue of the body in a site-specific manner. Liposomes and polycations (eg, polylysine, lipofectin or Fectin) can be used. Cell-specific or organ-specific lipo Chromosomes can be developed, thus targeting foreign DNA carried by liposomes Ingested by cells. Immunoliposomes targeting specific receptors on certain cells Injection can be used as a convenient method of inserting DNA into cells with receptors. Can be. Another carrier system used is the liver for gene delivery in vivo. An asialoglycoprotein / polylysine binding system that carries DNA to the vesicles.   The transfected DNA forms a complex with another type of carrier, As a result, the DNA is transported to the recipient cell and then remains in the cytoplasm or nucleoplasm. Special DNA is bound to the carrier nucleoprotein in an engineered vacuole complex and directly nucleated. Can be transported.   The gene regulation of the inhibitor of the present invention is performed by binding the inhibitor gene to the gene. Administering a compound that binds to the regulatory region, or its corresponding RNA transcript, It does so by modifying the rate of transcription or translation. In addition inhibitor Cells transfected with the DNA sequence to be administered are administered to the patient and Provides an in vivo source of bitter. For example, encode cells, inhibitors It may be transfected with a vector containing the nucleic acid sequence.   As used herein, the term "vector" contains a specific nucleic acid sequence or A carrier that binds to it, which functions to deliver a specific nucleic acid sequence to cells. I do. Examples of vectors include plasmids and infectious microorganisms (eg, viruses) Or non-viral vectors (eg, ligand-DNA conjugates, liposomes) , Lipid-DNA complex). Set comprising endothelial cell proliferation inhibitor DNA sequence The recombinant DNA molecule is operably linked to the expression sequence to express the inhibitor. It is preferred to form an expression vector that can be Transfected Cells may be derived from the patient's normal tissue, the patient's diseased tissue, or It may be a cell.   For example, a tumor cell collected from a patient expresses the inhibitor protein of the present invention. Transfected with a vector that can be it can. Transfected tumor cells inhibit tumor growth in patients Produce levels of inhibitors. Patients can be human or non-human animals No. In addition, the inhibitor DNA can be injected directly into the patient without the help of a carrier. You may. In particular, the inhibitor DNA is injected into the skin, muscle or blood.   Inhibitor expression lasts for a long time or inhibitor DNA is administered periodically Inhibitor protein in a cell, tissue or organ or biological fluid May be maintained at a desired level.   While not intending to be bound by the following hypothesis, when a tumor becomes angiogenic, Or more angiogenic peptides (eg, aFGF, bFGF, VEGF, IL-8, GM-CSF, etc.) which act locally and direct extracellularly Target endothelial cells near the primary tumor and do not circulate (or have a short half-life) Circulation). These angiogenic peptides are In order to continue to expand the group, endothelial cell inhibitors (inhibitors of angiogenesis) It must be produced in sufficient quantities to overcome the effect. Once the primary tumor is in order When grown properly, it continues to release endothelial cell inhibitors into the circulation. this According to the hypothesis, these inhibitors act far from the primary tumor, Target metastatic capillary endothelial cells from within the vessel and continue to circulate. Ie When a distant metastasis begins angiogenesis, nearby capillary endothelial cells enter Inhibited by coming inhibitors.   The production of a suitable endothelial cell proliferation inhibitor of the present invention is described in (1) The step of identifying and purifying the inhibitors exemplified in the figures, (2) the purified inhibitors Determining the N-terminal amino acid sequence of the inhibitor, (3) 5 'and 5' of the inhibitor sequence. And 3 ′ DNA oligonucleotide primer synthetically, (4) Amplifying the inhibitor gene sequence using limase, (5) amplified Inserting the sequence into a suitable vector (eg, an expression vector); Microorganisms or other expression systems capable of expressing the bitter gene include the vector. (7) inserting the gene produced by the recombinant method; Isolation using a recombinant DNA method. Suitable vectors include , Viral, bacterial and eukaryotic (eg, yeast) expression vectors. The above method Is "Molecular Cloning: Laboratory Manual (Molecular Clo ning: A Laboratory Manual), 2nd edition, Samblue Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press (Cold S). Spring Harbor Press), 1989, which is hereby incorporated by reference. Laboratory manual).   Yet another method for producing inhibitors or biologically active fragments thereof is Peptide synthesis. The inhibitor amino acid sequence can be determined, for example, by automated peptide sequencing. It can be determined by a standard method. Alternatively, for example, the inhibitor Once the gene or DNA sequence encoding a gene has been isolated, it is publicly known in the art. DNA sequences can be determined using known manual or automated sequencing methods. The nucleic acid sequence then gives information about the amino acid sequence.   Once the amino acid sequence of the peptide is known, "solid phase peptide synthesis: a practical approach" Approach (Solid Phase Peptide Synthesis: A   Practical Approach) ", e. Atherton and Earl Si ー Shepherd (E. Atherton and R.S. C. Sharppard ), IRL Press, Oxford, Ing The peptide fragment is synthesized by a method known in the art as exemplified in Rand. can do. Synthesize multiple fragments and then ligate them together Large fragments can be formed. These synthetic peptide fragments are also To test for agonist and antagonist activity in toro and in vivo For example, they can be created using amino acid substitutions at specific positions. Against the organization Inhibitors on affinity columns using peptide fragments with high affinity binding The receptor that binds can be isolated.   The inhibitors are those that are mediated by or involve endothelial cell proliferation. It is effective in treating a disease or process (eg, angiogenesis). The present invention provides an effective amount of Inhibitor, or biologically active fragment thereof, or collectively anti-angiogenic activity Fragment or Inhibitor Agonist Having Antibodies and Antagonis And combinations thereof for the treatment of angiogenesis-mediated diseases. Angiogenesis-mediated diseases are But not limited to solid tumors; blood-derived tumors such as leukemia; tumor metastases; benign tumors Tumors, such as hemangiomas, acoustic neuromas, neurofibromas, trachoma, and purulent granulomas; Rheumatoid arthritis; psoriasis; ocular angiogenic diseases, such as diabetic retinopathy, retina in premature Disease, macular degeneration, corneal transplant rejection, neovascular glaucoma, posterior lens fibrosis, flushing skin Osler-Weber syndrome; myocardial angiogenesis; plaque angiogenesis; There is tonicity; hemophilic joints; hemangiofibromas; and wound granulation.   Inhibitors are useful for treating diseases of excessive or abnormal stimulation of endothelial cells. These disorders include, but are not limited to, intestinal adhesions, arteriosclerosis, scleroderma, And hypertrophic scars (ie keloids). Inhibitors are essential for embryo implantation It can be used as a contraceptive by preventing necessary angiogenesis. Inhibita Are diseases that have angiogenesis as a pathological consequence, such as cat scratch disease (Rocheret) Manaria Quintosa (Rochel minalia quintosa) ) And ulcers (Helicobacter pylori) ori)).   Synthetic peptide fragments of inhibitors have many uses. High specificity and Avidi Peptides that bind to receptors that can bind inhibitors with radioactivity Label and visualize and quantify binding sites using autoradiography and membrane binding Used.   Further labeling inhibitors or peptide fragments with short-lived isotopes Localize tumors using positron emission tomography, or inhibitor binding sites Using other modern radiation methods to visualize receptor binding sites in vivo Will be possible.   Cytotoxic substances (eg lysine) are inhibitors and their high affinity peptide cleavage Provides a means for destruction of cells that are bound to the strip and thus bind to the inhibitor I do. These cells can be located in many locations, including but not limited to micrometastases and primary Tumor). Delivery of peptide bound to cytotoxic substance to desired location Designed to maximize For example, a cannula in the blood vessel that supplies the target site Or directly to the target. Such substances are also It is supplied in a controlled manner by an osmotic pump coupled to the pump. Inhibitor A combination of antagonists is added at the same time as a stimulator of angiogenesis to achieve tissue angiogenesis May be raised. This treatment provides an effective means to destroy metastatic cancer. Offer.   Inhibitors are used in combination with other compositions and methods for the treatment of disease You. For example, tumors can be treated in a conventional manner with surgery, radiation or Is treated with chemotherapy and then given an inhibitor to the patient to stop the micrometastases Prolong the condition and inhibit the growth of remaining primary tumors. In addition, inhibitors, Fragments, inhibitor-specific antisera, inhibitor receptor agonists and Antagonist, or a combination of these, together with a pharmaceutically acceptable excipient. And optionally in combination with a sustained release matrix (eg, a biodegradable polymer) To form a composition for use.   As used herein, sustained release matrix refers to enzymatic or acid / base hydrolysis. Or a matrix made from a substance (usually a polymer) that is decomposed by dissolution is there. Once inserted into the body, this matrix is subject to the action of enzymes and bodily fluids. I can. The sustained-release matrix is preferably a liposome, polylactide (polylactic acid). ), Polyglycolide (a polymer of glycolic acid), polylactide co-glycolide (Copolymer of lactic acid and glycolic acid), polyanhydride, poly (ortho) ester, Polypeptide, hyaluronic acid, collagen, chondroitin sulfate, carboxylic acid, Fatty acids, phospholipids, polysaccharides, nucleic acids, polyamino acids, amino acids (eg, phenyl ara Nin, tyrosine, isoleucine), polynucleotide, polyvinyl propylene, Selected from biocompatible materials such as polyvinylpyrrolidone and silicone . Suitable biodegradable matrices include polylactide, polyglycolide, or polylactide. Any one of relactide co-glycolide (copolymer of lactic acid and glycolic acid) Is a matrix.   The angiogenic modulating therapeutic composition of the present invention may be a solid, liquid, or aerosol. And is administered by any known route of administration. Examples of solid therapeutic compositions include circles Preparations, creams, and implantable dosage units. Pills are administered orally The therapeutic cream is administered topically. Implantable dosage units are topical (eg, Systemic release of a therapeutic angiogenesis modulating composition administered to a tumor site) Nota For example, it is implanted subcutaneously. Examples of liquid compositions include subcutaneous, intravenous, and intraarterial There are formulations suitable for entry, and formulations for topical and ocular administration. Aerosol formulation An example is an inhalation formulation for administration to the lung.   The inhibitor proteins of the present invention may also be specific for inhibitors and their receptors. Antibodies can be used to generate unique antibodies. This antibody is a polyclonal antibody Alternatively, a monoclonal antibody may be used. Specific for inhibitors or inhibitor receptors These antibodies, which bind differentially, may have inhibitor levels in body fluids or tissues or It is well known to those skilled in the art to detect or quantify inhibitor receptor levels. And can be used in kits. Using the results of these tests, cancer and The onset or recurrence of other angiogenesis-mediated diseases can be diagnosed or predicted.   The inhibitor also detects and can detect antibodies that can bind to the inhibitor. It can be used to develop diagnostic methods and kits for quantification. These keys The kit allows for the detection of circulating inhibitor-specific antibodies. Such cyclicality Patients with anti-inhibitor antibodies are more susceptible to multiple tumors and cancers, Cancer is more likely to recur after treatment or after a period of remission. The Fab fragments of these antibodies were Can be used as a source to neutralize anti-inhibitor antibodies Anti-inhibitor specific Fab fragment antisera can be generated. This way Reduces the removal of circulating inhibitors with anti-inhibitor antibodies, thus Effectively raises circulating inhibitor levels.   Another aspect of the invention is a method of blocking the action of excess endogenous inhibitor. This can be achieved by using antibodies specific for unwanted inhibitors of the system, This is done by passive immunization of an object. This treatment includes abnormal ovulation, menstruation and placenta It is important in treating formation and angiogenesis. This affects the transfer process To provide a useful tool to study the effects of inhibitor removal. Inhibitor The Fab fragment of the specific antibody contains a binding site for the inhibitor. This fragment is From the inhibitor-specific antibody using methods known to those skilled in the art. Inhibitor The Fab fragment of the specific antiserum is used as an antigen to generate anti-Fab fragment serum. It is. Injection of this antiserum against the inhibitor specific Fab fragment To prevent binding of the inhibitor to the inhibitor antibody. Fab fragment or anti-inhibitor Blocking the binding of the inhibitor to the endogenous anti-inhibitor The body is softened and therapeutic benefits are obtained. The real effect of this treatment is that endogenous circulating inhibitors Enhance the ability of the metastasis to reach target cells, thus reducing the spread of metastases It is.   The present invention provides for the optional induction of inhibitors having endothelial cell proliferation inhibitor activity. It should be understood that it is intended to include the body. The present invention relates to all inhibitor proteins. Protein, derivative of inhibitor protein, and organism of inhibitor protein Contains active fragments. These bind to amino acid substitutions or amino acid functional groups. And proteins having inhibitory activity, having a sugar or other molecule. The invention also provides genes encoding inhibitors and inhibitor receptors, such as It also includes proteins expressed by these genes.   Proteins and protein fragments having the above inhibitory activity are isolated and Pharmacologically as purified and substantially purified proteins and protein fragments It is provided in an acceptable formulation using preparation methods known to those skilled in the art. Made of these Agents can be administered by standard routes. Generally, the combination is topical, Transdermal, intraperitoneal, intracranial, intraventricular, intracerebral, vaginal, intrauterine, oral, rectal, or It is administered by the parenteral (eg, intravenous, intraspinal, subcutaneous or intramuscular) route. In addition, inhibitors may be found in biodegradable polymers that allow for sustained release of the compound. And the polymer is located near a site where drug delivery is preferred (eg, a tumor site) Implanted or implanted so that the inhibitor is slowly released systemically Is done. Controlled delivery of high concentrations of inhibitors to molecules of interest via cannula Osmotic pressure (eg, directly during metastatic focus or during vascular supply to the tumor) Two pumps may be used. Biodegradable polymers and their use are e.g. Brem et al. Neurosurg. 74: 441-446 (1991) ), Which is hereby incorporated by reference in its entirety. ing.   The dosage of the inhibitors of the present invention will depend on the condition or condition to be treated and Or other clinical symptoms, such as the weight and health of the animal, and the route of administration of the compound. Depends on. Approximately 5 mg / kg / day, once daily, to treat humans or animals Then, tumor growth is suppressed by 50% or more. At the same dose, angiostatin Has no effect. Depending on the half-life of the inhibitor in a particular animal or human The inhibitor can be administered several times a day to once a week. The invention is human It should be understood that they also have use for veterinary purposes. The method of the present invention Single or multiple administrations over an extended period of time are contemplated.   This inhibitor formulation can be used for oral, rectal, ocular (including intravitreal or intraocular), nasal Intra-, topical (including buccal and sublingual), intra-uterine, intra-vaginal, or parenteral (subcutaneous, Suitable for intracavity, intramuscular, intravenous, intradermal, intracranial, intratracheal, and epidural) administration Including It is convenient to provide inhibitor preparations in unit dosage form. Prepared by the pharmacological method of Such methods involve combining the active ingredient with a drug carrier or Comprises combining excipients. In general, the formulations consist of the active ingredient in a liquid carrier or finely divided form. Combine the fine solid carrier or both uniformly and closely together, and then, if necessary, It is prepared by molding the product.   Formulations suitable for parenteral administration are aqueous solutions which may contain antioxidants, buffers, bacteriostats And non-aqueous sterile injectable solutions and solutes that render the formulation isotonic with the blood of the intended recipient And aqueous and non-aqueous sterile suspensions which may contain suspending agents and thickening agents. The formulations may be presented in unit-dose or multi-dose containers (for example, Iar), stored in lyophilized form, and sterile liquid carrier immediately before use. (For example, water for injection) only needs to be added. Immediate injection solutions and suspensions are described above. It may be prepared from various types of sterile powders, granules and tablets. Suitable unit dosage form Is a daily dose or unit of the component to be administered, a daily divided dose, or an appropriate fraction thereof. Containing a large proportion. In addition to the above components, the formulation of the present invention It should be understood that other materials commonly used in the art for the preparation of I want to be. Optionally take up cytotoxic substances or inhibit protein Or in combination with a functional peptide fragment thereof, to provide a dual therapy to the patient. .   The angiogenesis inhibitory peptide of the present invention can be synthesized using standard microchemical equipment. The purity can be checked by HPLC and mass spectrometry. Pep Tide synthesis, HPLC purification and mass spectrometry are known to those skilled in the art. Inhibitor peptides and inhibitor receptor peptides are also available from recombinant E. coli. (E. coli or yeast expression systems and purified by column chromatography. Made.   Different peptide fragments of the intact inhibitor molecule are not particularly limited, but include: Can be synthesized for use in several applications, including: opening specific antisera Agonists and antagonists active at inhibitor binding sites as antigens for development As a gonist, a cytotoxic substance for targeted killing of cells that bind to inhibitors As a peptide bound to or associated with Structure these peptides The resulting amino acid sequence is selected based on its position on the outer region of the molecule, Available for binding to Amino and carboxy termini of inhibitors The intermediate region of the molecule is shown separately between the fragments to be synthesized.   GenBank, Brookhaven Protein (Brook) haven Protein), Swiss-Plot (SWISS-PROT), And using protein sequence databases such as PIR And compare these peptide sequences to known sequences to determine possible sequence homology. You. This information facilitates the elimination of sequences with a high degree of sequence homology to other molecules, To develop antisera, agonists and antagonists against inhibitors And increase the potential for high specificity.   Inhibitors and inhibitor-derived peptides can be isolated from other inhibitors using standard methods. Can be attached to a molecule. Amino- and carboxy-terminal of the inhibitor Both contain tyrosine and lysine residues and are isotopically prepared using a number of methods. And non-isotopes, for example, by the usual method (tyrosine residue-chloramine T, iodogen , Lactoperoxidase; lysine residue-Bolton-Hunter reagent) can do. These conjugation methods are known to those skilled in the art. Or tyrosine Or lysine, in addition to fragments without these residues, And labeling of hydroxyl groups. Conjugation methods are available on amino acids Functional groups (including, but not limited to, amino, sulfhydryl, carboxyl, amide, Phenol, and imidazole groups). These conclusions Glutaraldehyde, diazotization, among others, are various reagents used to There are benzidine, carbodiimide, and p-benzoquinone. Inhibitor tape Step Pide is used for various applications such as isotopes, enzymes, carrier proteins, Chemically bound to proteins, fluorescent molecules, luminescent, bioluminescent compounds, and other compounds. It is. The efficiency of the binding reaction is determined using different techniques suitable for the specific reaction . For example125The radioactive labeling of the inhibitor peptide using I is chloromin T and High specific activity Na125This is done using I. The reaction uses sodium metabisulfite And the mixture is desalted on a column of the disposable. Is the labeled peptide a column? And elute and collect fractions. Take an aliquot from each fraction and release on a gamma counter Measure the shooting power. Thus, unreacted Na125I is from the labeled inhibitor peptide Separated. The peptide fragment having the highest specific radioactivity was used for subsequent use (eg, (Analysis of the ability to bind to inhibitor antisera).   Another application of peptide conjugation is in the production of polyclonal antisera. For example, Rigi Inhibitor peptides containing amino acid residues are purified using glutaraldehyde. It is bound to bovine serum albumin produced. The efficiency of the reaction depends on the radiolabeled peptide. Determined by measuring uptake. Unreacted glutaraldehyde and pepti The solution is separated by dialysis. The conjugate is saved for future use.   Inhibitor-specific antisera, inhibitor analogs, inhibitor pepti Fragments and inhibitor receptors can be generated. Peptide synthesis and purification Later, using established techniques known to those skilled in the art, monoclonal and polyclonal Make both antisera. For example, polyclonal antisera can be used for rabbits, sheep, It may be made of giant or other animals. For carrier molecules (eg bovine serum albumin) The bound inhibitor peptide or inhibitor itself is combined with the adjuvant mixture. Combine, emulsify and inject subcutaneously at multiple sites on the back, neck, flank, and sometimes on the footpad Enter. Booster injections are performed at regular intervals (eg, every 2-4 weeks). About 7 of injection Blood samples are obtained after 10 days, for example, by venipuncture from the vein at the end of the ear after inflation. blood The liquid sample is allowed to solidify at 4 ° C. overnight and centrifuged at about 2400 g at 4 ° C. for about 30 minutes. Serum is collected and aliquoted and stored at 4 ° C for immediate use or later Used for analysis.   All serum samples or monoclonal antibodies from the production of polyclonal antisera Media samples from the production of serum are analyzed for antibody titers. Some means (example For example, dot blot and density analysis, and protein A, second antiserum, cold Radiolabeled peptide-antibody conjugates using tanol or activated carbon-dextran The titer is established by sedimentation of the body followed by measurement of the activity with a gamma counter). Highest The titer of antiserum is also purified on a commercial affinity column. Inhibitor peptide Bind to gel in affinity column. When an antiserum sample is passed through the column, The tar antibody remains bound to the column. These antibodies are then eluted, collected, and titered and characterized. Measure and evaluate for isomerism.   Test the highest titer inhibitor-specific antisera to establish: a) most Optimal antiserum dilution for high specific antigen binding and lowest non-specific binding B) the ability to bind increasing amounts of inhibitor peptide in a standard exclusion curve, c ) Possible cross-reactivity with related peptides and proteins of related species, d) plasma, Ability to detect inhibitor peptides in extracts of urine, tissue and cell culture media .   Kits for the measurement of inhibitors and inhibitor receptors are also provided by the present invention. Is contemplated as part of Highest titer and specificity in plasma, urine, tissue and cells Antiserum that can detect inhibitor peptides in extracts of cell culture media Further investigations provide fast, reliable, sensitive and specific measurement of inhibitors And establish an easy-to-use kit for localization. These measurement kits are particularly limited Not specified, but includes the following techniques: competitive and non-competitive assays, radioimmuno Assays, bioluminescence and chemiluminescence assays, fluorescence assays, sandwich assays, Immunoradiometric assay, dot blot assay, enzyme-linked assay (including ELISA), Cyclotiter plate method, antibody coating for rapid urine or blood monitoring Strip or dipstick methods, and immunohistochemical methods. Each kit Establish the range, sensitivity, accuracy, reliability, specificity and reproducibility of the assay You. Within the measurement of the 20%, 50% and 80% points on the standard curve of exclusion or activity And establish inter-measurement variability.   One example of a measurement kit commonly used in research and clinics is the radioimmune No assay (RIA) kit. The inhibitor RIA is exemplified below. Release After successful iodination and purification of the inhibitor or inhibitor peptide Alternatively, the antisera with the highest titer may be used at several dilutions in a suitable buffer Add to a tube with a certain amount of radioactivity (eg, 10,000 cpm). Non-specific Other tubes contain buffer or pre-immune serum to quantify binding. 4 After incubation at 24 ° C for 24 hours, add Protein A and vortex the tube. Mix, incubate at room temperature for 90 minutes, and To precipitate the antibody complex bound to the labeled antigen. Aspirate and supernatant Is removed, and the radioactivity in the pellet is measured with a gamma counter. Subtract non-specific binding The antiserum dilution that binds to about 10% to 40% of the labeled peptide after You.   Next, a known amount of peptide was placed in a tube containing the radiolabeled peptide and antiserum. And the dilution range of the inhibitor peptide used in the development of the antiserum (approximately 0.1 pg to 10 ng). Further incubation (eg 24-48 hours) Thereafter, protein A was added, the tube was centrifuged, the supernatant was removed, and the Measure the radioactivity. Radioactive labeling with unlabeled inhibitor peptide (standard substance) Exclusion of the inhibitor peptide gives a standard curve. Some concentration of other in Inhibitor peptide fragments, inhibitors from different species, and cognate peptides. Analyze the specificity of the inhibitor antiserum in addition to the assay tube.   Extracts of various tissues, including but not limited to primary and secondary tumors, Lewis Lung cancer, inhibitor-producing cell cultures, placenta, uterus, and brain, liver proliferation, and Other tissue, such as the small intestine). Lyophilize or speedbatch the tissue extract After the speed vac, the measurement buffer is added and different aliquots are taken in RIA tubes. Into a tube. Inhibitor-producing cell extracts are exclusion curves parallel to the standard curve And extracts of tissues that do not produce the inhibitor are radiolabeled from the inhibitor. Do not rule out inhibitors. In addition, urine, plasma and urine from animals with Lewis lung cancer And cerebrospinal fluid are added to the measuring tube in increasing amounts. The parallel exclusion curves show the tissue and Of an inhibitor assay for the measurement of inhibitors in human and body fluids I have.   For tissue extracts containing inhibitors, aliquots should be subjected to reverse phase HPLC. Can further analyze the characteristics. The eluate fractions were collected and speed-vacuated (Speed d Vac), reconstituted with RIA buffer, and treated with inhibitor RIA. Analyze with. The maximum amount of inhibitor immunoreactivity depends on the elution position of the inhibitor. Present in the corresponding fraction.   The assay kit includes instructions, antisera, inhibitor or inhibitor peptide, And possibly radiolabeled and / or bound inhibitors -To provide reagents for precipitation of the inhibitor antibody complex. Kit has tumor Of inhibitors in animal and human biological fluids and tissue extracts, with or without Useful for measurement.   Separate kits are used for the localization of inhibitors in tissues and cells. this Inhibitor immunohistochemistry kits contain instructions, inhibitor antisera, and Fluorescent molecules or primary, such as easy blocking serum and fluorescein isothiocyanate Provide a secondary antiserum conjugated to other reagents used to visualize the antiserum. Immunohistochemical techniques are known to those skilled in the art. This inhibitor immunohistochemistry kit Can be performed on tissue sections and cultured cells using both light and electron microscopy. Enables the localization of inhibitors. It is used for research and clinical purposes . For example, a tumor may be biopsied or collected and a tissue section cut with a microtome to Investigate the inhibitor production site. This information can be used to diagnose and treat cancer detection and treatment. Probably useful for therapeutic purposes. Alternative ways to visualize sites of inhibitor biosynthesis Now, in situ high-level search for inhibitor messenger RNA The nucleic acids used in the hybridization are radioactively labeled. Similarly, the inhibitor The condition is localized, visualized and quantified by immunohistochemistry.   The invention is further illustrated by the following examples, which in no way limit the scope of the invention. Should not be understood. After reading the description in this specification, It should be understood that various other embodiments, modifications and equivalents will be apparent to those skilled in the art. It is.                                   Example 1 Method 1. Preparation of Kringle 1-5 (K1-5) from human plasminogen   (Cao et al., 1996, JBC, 271, 294). 61-29467) by lysine-Sepharose chromatography. Plasminogen was prepared from cooled human plasma. Purified human plasmid Nogen was incubated in alkaline solution. The digested mixture is lysine- Load K1-5 on a Sepharose column using a 0.25ε-aminocaproic acid gradient. Eluted. The K1-5 fraction was separated on a Sephacryl-S200 column (2.5 × 70). Further purification was performed to remove trace amounts of plasminogen contamination. For SDS gel electrophoresis The molecular weight proved to be 55,000 daltons. By microsequencing , K1-5 consist of a fragment corresponding to plasminogen Lys77 to Arg529. It became clear that.2. Endothelial cell proliferation assay   Bovine capillary endothelial cells were treated with 10% heat-inactivated BCS and 3 ng / ml recombinant human b. Maintained in DMEM with FGF. The cells are washed with PBS and trypsinized . Dispersed in 05% solution. Cell suspension with DMEM, 10% BCS, 1% antibiotic After preparing a liquid and counting with a hemocytometer, the concentration was adjusted to 25,000 cells / ml. . Cells are plated in gelatinized 24-well culture plates (0.5 ml / well) For 14 hours (37 ° C., 10% carbon dioxide). 0.2 medium Replaced with 5 ml DMEM, 5% BCS and applied different concentrations of sample. 20 minutes After incubation, medium and bFGF were added to each well to a final volume of 0.5 ml of DMEM, 5% BCS, 1% antibiotic and 1 ng / ml bFGF were obtained. 7 After a 2 hour incubation, the cells were dispersed in trypsin and hematal (Hemtal) re-suspended in a coulter counter.Example 2 1. Preparation of K1-5 from human plasminogen:   (Cao et al., 1996, JBC, 271, 294). 61-29467) by lysine-Sepharose chromatography. Plasminogen was prepared from cooled human plasma. 4 ml of glycine buffer About 40 mg of plasminogen in (pH 10.5) was converted to immobilized urokinase activity. Plasmin (10 mol plasminogen / 1 mol plasmin) at 25 ° C Incubated for 24 hours. The digested mixture is applied to a lysine-Sepharose column ( 1.0 × 30 cm), and K1-5 was subjected to a 0.25 E-aminocaproic acid gradient. Eluted. The K1-5 fraction was separated on a Sephadex G-75 column (2.5 × 90). Further purification. The molecular weight was 55,000 daltons by SDS gel electrophoresis. Prove that. By microsequencing, K1-5 was found to be plasminogen Lys7 7 (78) to Arg529 (530). Was.2. Endothelial cell proliferation assay:   Bovine capillary endothelial cells were treated with 10% heat-inactivated BCS, antibiotics and 3 ng / m2. l Maintained in DMEM with recombinant human bFGF. Wash cells with PBS, Dispersed in a 0.05% solution of trypsin. DMEM, 10% BCS, 1% antibiotic Make a cell suspension with the substance, measure it with a hemocytometer, and adjust the concentration to 25,000 cells. / Ml. Cells were plated in gelatinized 24-well culture plates (0.5 ml / Well) and incubated for 14 hours (37 ° C., 10% carbon dioxide) . Replace the medium with 0.25 ml DMEM, 5% BCS and apply different concentrations of sample did. After a 20 minute incubation, media and bFGF were added to each well, 0.5 ml final volume of DMEM, 5% BCS, 1% antibiotic and 1 ng / ml bFG F was obtained. After 72 hours of incubation, the cells were dispersed in trypsin and Resuspended in Hematall and counted on a Coulter counter.3. Chorionic Allantoic Membrane Assay (CAM):   Crack the fertilized egg of a 3-day-old white leg horn and remove one intact yellowish chick embryo. It was spread on a 00 × 20 mm plastic petri dish. 3 days at 37 ° C in 3% carbon dioxide After incubation, the methylcellulose containing 10 μg K1-5 Disks were placed on the CAM of each embryo. After 48 hours incubation, embryos and C AM was analyzed by stereoscopy for the formation of an avascular zone.4. Mouse tumor test:   Male 6 week old C57B16 / J mice were used for tumor testing. Proliferate in log phase Mouse T241 fibrosarcoma cells (1 × 106) And resuspend in PBS Each animal was implanted subcutaneously at the dorsal midline in a volume of 100 μl. Each treatment group and control Three mice were used in the group. 100 μl PBS or 100 μl K1-5 Injection started shortly after tumor cell injection and continued once a day for a total of 20 days . Twenty-four hours later the tumor was visible and present. After 24 hours, there was a primary tumor. Predetermined On day, primary tumors were measured blindly with a digital caliper.

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年９月１７日（１９９９．９．１７） 【補正内容】 請求の範囲 １． インビトロで内皮細胞増殖を調節しインビボで血管形成を調節すること ができ、プラスミノーゲン分子のＬｙｓ７８〜Ａｒｇ５３０の配列の少なくとも 約４１０、好ましくは少なくとも約４３５、および最も好ましくは４５３の連続 的アミノ酸を含有し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定する時、分子量が 約５０〜約６０、好ましくは約５３〜５７、および最も好ましくは約５５キロダ ルトンである、単離されたタンパク質、またはその類似体。 ２． 血管形成を阻害することができる、請求の範囲第１項記載のタンパク質 。 ３． 配列番号１に開示されたアミノ酸配列の基本的にすべてを含み、かつヒ ト由来である、請求の範囲第１項または第２項に記載のタンパク質。 ４． 配列番号２に開示されたアミノ酸配列の基本的にすべてを含み、かつマ ウス由来である、請求の範囲第１項または第２項に記載のタンパク質。 ５． 請求の範囲第１〜４項までのいずれか１項に記載のタンパク質またはそ の機能性断片もしくは類似体の、薬剤としての使用。 ６． 血管形成関連疾患または障害（例えば、癌または糖尿病）の治療用薬剤 の製造のための、請求の範囲第１〜４項までのいずれか１項に記載のタンパク質 またはその機能性断片もしくは類似体の使用。 ７． 請求の範囲第１〜４項までのいずれか１項に記載のタンパク質またはそ の機能性断片もしくは類似体と、１つまたはそれ以上の薬剤学的に許容される担 体および／または賦形剤とを含んでなる薬剤組成物または獣医薬剤組成物。 ８． 請求の範囲第１〜４項までのいずれか１項に記載のタンパク質またはそ の機能性断片もしくは類似体をコードする核酸、またはその任意の変種。 ９． 厳密性条件下で請求の範囲第８項記載の核酸に特異的にハイブリダイズ する核酸。 １０． 請求の範囲第１〜４項までのいずれか１項に記載のペプチド、ポリペ プチドもしくはタンパク質に対して作成された抗体。 １１． 請求の範囲第８項または９項に記載の核酸、請求の範囲第１〜４項ま でのいずれか１項に記載のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または 請求の範囲第１０項記載の抗体が使用される、スクリーニング測定法。 １２． 請求の範囲第８項または９項に記載の核酸、請求の範囲第１〜４項ま でのいずれか１項に記載のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または 請求の範囲第10項記載の抗体が使用される、診断および予知方法。 １３． 請求の範囲第１２項記載の方法を実施するためのキット。[Procedure of Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Submission date] September 17, 1999 (September 17, 1999) [Correction contents]                                The scope of the claims   1. Regulating endothelial cell proliferation in vitro and regulating angiogenesis in vivo At least the sequence of Lys78 to Arg530 of the plasminogen molecule. About 410, preferably at least about 435, and most preferably 453 contiguous Contains amino acids and the molecular weight is lower when measured by polyacrylamide gel electrophoresis. About 50 to about 60, preferably about 53 to 57, and most preferably about 55 kilodaltons An isolated protein, or an analog thereof, that is a ruton.   2. 2. The protein according to claim 1, which is capable of inhibiting angiogenesis. .   3. It contains essentially all of the amino acid sequence disclosed in SEQ ID NO: 1; 3. The protein according to claim 1, which is derived from a protein.   4. It contains essentially all of the amino acid sequence disclosed in SEQ ID NO: 2, and The protein according to claim 1 or 2, which is derived from a mouse.   5. The protein or its protein according to any one of claims 1 to 4, Use of a functional fragment or analog of as a drug.   6. Agent for treating an angiogenesis-related disease or disorder (eg, cancer or diabetes) A protein according to any one of claims 1 to 4 for the production of Or use of a functional fragment or analog thereof.   7. The protein or its protein according to any one of claims 1 to 4, Functional fragments or analogs of one or more pharmaceutically acceptable carriers A pharmaceutical or veterinary composition comprising a body and / or an excipient.   8. The protein or its protein according to any one of claims 1 to 4, A nucleic acid encoding a functional fragment or analog of, or any variant thereof.   9. 9. Hybridizing specifically to the nucleic acid according to claim 8 under stringent conditions Nucleic acids   10. The peptide or polypeptide according to any one of claims 1 to 4. Antibodies generated against peptides or proteins.   11. The nucleic acid according to claim 8 or 9, and the nucleic acid according to claims 1 to 4. The peptide, polypeptide or protein according to any one of the above, or A screening assay, wherein the antibody according to claim 10 is used.   12. The nucleic acid according to claim 8 or 9, and the nucleic acid according to claims 1 to 4. The peptide, polypeptide or protein according to any one of the above, or A diagnostic and predictive method, wherein the antibody according to claim 10 is used.   13. A kit for performing the method of claim 12.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 49/00 Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 9/00 9/00 17/00 17/00 27/00 27/00 29/00 29/00 35/00 35/00 43/00 １０１ 43/00 １０１ １７１ １７１ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/47 (31)優先権主張番号 ９７０３０５７−１ (32)優先日 平成９年８月25日(1997．8．25) (33)優先権主張国 スウェーデン（ＳＥ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 49/00 A61P 3/10 A61P 3/10 9/00 9/00 17/00 17/00 27/00 27/00 29/00 29/00 35/00 35/00 43/00 101 43/00 101 171 171 C07K 16/40 C07K 16/40 C12Q 1/37 C12N 15/09 G01N 33/53 D C12Q 1/37 C12N 15/00 A G01N 33/53 A61K 37/47 (31) Priority claim number 973057-1 (32) Priority date August 25, 1997 (August 25, 1997) (33) Priority claim country Sweden (81) Designated Countries EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA ( BF, BJ, CF, CG, CI, M, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG) , KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES , FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ , VN, YU, ZW

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １． インビトロで内皮細胞増殖を調節しインビボで血管形成を調節すること ができ、配列番号１または配列番号２に開示された配列の少なくとも約５０％を 含んでなるアミノ酸を有する、単離されたタンパク質、またはその類似体。 ２． プラスミノーゲン分子のＬｙｓ７８〜Ａｒｇ５３０の配列を含んでなる 、請求の範囲第１項記載のタンパク質、またはその機能性断片もしくは類似体。 ３． ポリアクリルアミドゲル電気泳動で測定する時、分子量が約５０〜約６ ０キロダルトン、好ましくは約５３〜５７キロダルトン、および最も好ましくは 約５５キロダルトンである、請求の範囲第１項または第２項に記載のタンパク質 、またはその機能性断片もしくは類似体。 ４． 血管形成を阻害することができる、請求の範囲第１〜３項までのいずれ か１項に記載のタンパク質、またはその機能性断片もしくは類似体。 ５． 配列番号１に開示されたアミノ酸配列の基本的にすべてを含み、かつヒ ト由来である、請求の範囲第１〜４項までのいずれか１項に記載のタンパク質、 またはその機能性断片もしくは類似体。 ６． 配列番号２に開示されたアミノ酸配列の基本的にすべてを含み、かつマ ウス由来である、請求の範囲第１〜４項までのいずれか１項に記載のタンパク質 、またはその機能性断片もしくは類似体。 ７． 請求の範囲第１〜６項までのいずれか１項に記載のタンパク質またはそ の機能性断片もしくは類似体の、薬剤としての使用。 ８． 血管形成関連疾患または障害（例えば、癌または糖尿病）の治療用薬剤 の製造のための、請求の範囲第１〜６項までのいずれか１項に記載のタンパク質 またはその機能性断片もしくは類似体の使用。 ９． 請求の範囲第１〜６項までのいずれか１項に記載のタンパク質またはそ の機能性断片もしくは類似体と、１つまたはそれ以上の薬剤学的に許容される担 体および／または賦形剤とを含んでなる薬剤組成物または獣医薬剤組成物。 １０． 請求の範囲第１〜６項までのいずれか１項に記載のタンパク質または その機能性断片もしくは類似体をコードする核酸、またはその任意の変種。 １１． 厳密性条件下で請求の範囲第１０項記載の核酸に特異的にハイブリダ イズする核酸。 １２． 請求の範囲第１１項記載の核酸によりコードされるペプチド、ポリペ プチドもしくはタンパク質、またはその機能性断片もしくは類似体。 １３． 請求の範囲第１２項記載のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質 に対して作成された抗体。 １４． 請求の範囲第１１項または１１項に記載の核酸、請求の範囲第１２項 記載のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または請求の範囲第１３項 記載の抗体が使用される、スクリーニング測定法。 １５． 請求の範囲第１１項または１１項に記載の核酸、請求の範囲第１２項 記載のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または請求の範囲第１３項 記載の抗体が使用される、診断および／または予知方法。 １６． 請求の範囲第１５項記載の方法を実施するためのキット。[Claims]   1. Regulating endothelial cell proliferation in vitro and regulating angiogenesis in vivo And at least about 50% of the sequence disclosed in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 An isolated protein having an amino acid comprising, or an analog thereof.   2. Comprising the sequence of Lys78 to Arg530 of the plasminogen molecule A protein according to claim 1, or a functional fragment or analog thereof.   3. When measured by polyacrylamide gel electrophoresis, the molecular weight is about 50 to about 6 0 kilodaltons, preferably about 53-57 kilodaltons, and most preferably 3. A protein according to claim 1 or claim 2 which is about 55 kilodaltons. Or a functional fragment or analog thereof.   4. Any of claims 1 to 3, which can inhibit angiogenesis Or the functional fragment or analog thereof.   5. It contains essentially all of the amino acid sequence disclosed in SEQ ID NO: 1; The protein according to any one of claims 1 to 4, which is derived from Or a functional fragment or analog thereof.   6. It contains essentially all of the amino acid sequence disclosed in SEQ ID NO: 2, and The protein according to any one of claims 1 to 4, which is derived from a mouse. Or a functional fragment or analog thereof.   7. The protein or its protein according to any one of claims 1 to 6, Use of a functional fragment or analog of as a drug.   8. Agent for treating an angiogenesis-related disease or disorder (eg, cancer or diabetes) The protein according to any one of claims 1 to 6, for the production of Or use of a functional fragment or analog thereof.   9. The protein or its protein according to any one of claims 1 to 6, Functional fragments or analogs of one or more pharmaceutically acceptable carriers A pharmaceutical or veterinary composition comprising a body and / or an excipient.   10. The protein according to any one of claims 1 to 6, or A nucleic acid encoding a functional fragment or analog thereof, or any variant thereof.   11. A hybridizer specific for the nucleic acid of claim 10 under stringent conditions Nucleic acid to be released.   12. A peptide or polypeptide encoded by the nucleic acid according to claim 11. A peptide or protein, or a functional fragment or analog thereof.   13. A peptide, polypeptide or protein according to claim 12 Antibodies created against   14． A nucleic acid according to claim 11 or claim 11, wherein the nucleic acid according to claim 12 14. The peptide, polypeptide or protein of claim 13, or claim 13. A screening assay, wherein the described antibody is used.   15. A nucleic acid according to claim 11 or claim 11, wherein the nucleic acid according to claim 12 14. The peptide, polypeptide or protein of claim 13, or claim 13. A diagnostic and / or prognostic method, wherein the described antibody is used.   16. A kit for performing the method of claim 15.
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