JP2002508951A

JP2002508951A - 脂肪酸シンターゼｍＲＮＡ結合タンパク質

Info

Publication number: JP2002508951A
Application number: JP2000540151A
Authority: JP
Inventors: セメンコヴィッチ，クレイ
Original assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 1998-01-13
Filing date: 1998-12-21
Publication date: 2002-03-26
Also published as: US6528637B1; CA2315299A1; US20030176388A1; WO1999036436A1; AU1907399A; EP1047712A1; US6403318B1

Abstract

(57)【要約】均質になるよう精製され、そしてその結合要素が性質決定されている、１７８ｋＤａグルコース誘導性ヒト脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）ｍＲＮＡ結合タンパク質が開示される。この大きなリンタンパク質は、ＦＡＳｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の新規反復要素に結合する。特に、該結合は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの最初の６５塩基内の３７ヌクレオチド区間にマッピングされている。該結合タンパク質はＦＡＳ発現を仲介するのに、リポタンパク質分泌および細胞増殖を制御するのに、そしてＦＡＳ阻害剤としての活性に関し試験化合物をスクリーニングするのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、脂肪酸シンターゼのグルコース制御、およびより詳細には、グルコ
ース誘導性ヒト脂肪酸シンターゼｍＲＮＡ結合タンパク質に関する。

【０００２】長鎖脂肪酸は、正常細胞構造および機能に必要である。新規（ｄｅｎｏｖｏ
）合成は、これらの脂肪酸の重要な供給源を代表する。本過程に必須なのは、ア
セチル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡ、およびＮＡＤＰＨから飽和脂肪酸（大部分
パルミチン酸エステル）を合成する多機能タンパク質である酵素、脂肪酸シンタ
ーゼ（ＦＡＳ）である。ＦＡＳは、アテローム性動脈硬化症および悪性腫瘍など
の多用な疾患の病因に関与すると考えられる。ＦＡＳ過剰発現は、アテローム性
動脈硬化症に罹りやすくする一般的な障害である、高トリグリセリド血症に関連
付けられている。ＦＡＳが高レベルであると、ヒトにおいて、乳癌の予後が劣る
ことが予測される。（注：以下の背景情報、ならびに当業者に周知の慣用的な試験法および実験法、
ならびに本明細書に用いられるような他の最新技術に関する参考文献は、括弧内
の文献番号により示され、そして本明細書の最後に添付される）。

【０００３】発明の背景真性糖尿病のヒトに見られるような、慢性的に上昇した濃度のグルコースは、
おそらく有毒である。インスリンは、特定の組織におけるグルコース輸送に重要
であるが、グルコース取り込みの大部分はインスリン独立性であり、そして循環
しているグルコース濃度に比例する（６）。ＩＩ型糖尿病などのインスリン耐性
状態では、肝臓などの特定の組織を横断するグルコース総流量は、実質的に増加
する。グルコース単独で、ホルモンによる撹乱とは独立し、高脂血症などの糖尿
病の合併症に寄与する可能性がある（３３）。

【０００４】グルコースがどのように高脂血症を促進するかは正確には知られていない。肝
臓は本過程の中心であり、そして炭水化物は、脂肪酸シンターゼ、Ｌ−型ピルビ
ン酸キナーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ＡＴＰ−クエン酸リアーゼ
、およびリンゴ酸酵素を含む、中間代謝および脂質合成に関与するいくつかの肝
遺伝子の発現を増加させる（１０）。この効果は主に転写性であるが、グルコー
スはまた、多くの摂食（ｆｅｅｄｉｎｇ）反応性肝遺伝子のｍＲＮＡも安定化す
る（３２）。グルコースは、食物流動および脂質代謝に中心的な別のタンパク質
である、インスリン受容体のメッセージの安定を促進する（１２）。

【０００５】ｍＲＮＡ安定性制御は、哺乳動物遺伝子発現を改変する重要な機構である。メ
ッセンジャーＲＮＡ半減期は、少なくとも３つの構成要素：１）ｍＲＮＡを分解する酵素；２）ｍＲＮＡのどこに位置してもよいが、通常該メッセージの３’末端に位置す
るシス決定因子；および３）該メッセージと相互作用し、減衰を促進するまたは妨げるトランス作用因子
に依存する。

【０００６】おそらく、少数の真核リボヌクレアーゼが存在する（２０）。制御されるメッ
セージ安定性は、リボヌクレアーゼへの接近を促進するまたは妨げる、結合タン
パク質と特定のＲＮＡ配列との相互作用に依存する可能性がある。

【０００７】脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）は、アセチル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡ、およ
びＮＡＤＰＨからパルミチン酸エステルを合成する、細胞質ゾル酵素である（３
６）。脂肪酸シンターゼは、脂肪酸合成の長期調節において速度を限定し（３５
）、そしていくつかの異なる種類の栄養物により制御される（８）。ＦＡＳ過剰
発現は、肥満症の動物モデルで起こる（１６）。炭水化物はＦＡＳ発現を刺激し
、そして動物およびヒトにおいて高トリグリセミド血症を生じる（３５、１５）
。

【０００８】ＦＡＳはまた悪性腫瘍とも関係する。培養癌腫細胞は、高濃度の外因性脂肪酸
が存在しても、高レベルの内因性脂肪酸合成を維持する（２４）。乳癌および前
立腺癌におけるＦＡＳ過剰発現は、臨床的結果が劣ることを強く予測する（１、
９）。該酵素は、結腸直腸腫瘍で過剰発現されている（２７）。癌細胞において
グルコース輸送および異化作用が亢進しており（２８）、これによりグルコース
および脂質代謝の協調性の制御が悪性状態を特徴付けることが示唆される。

【０００９】グルコースは単独で、ホルモンとは独立し、ＨｅｐＧ２細胞におけるＦＡＳメ
ッセージを安定化する（３２）。本モデル系において、グルコースは、数時間、
メッセージレベルを維持する一方、グルコース枯渇後の減衰は迅速である（３１
）。

【００１０】発明の概要本発明において、グルコースが、新規１７８ｋＤａタンパク質の脂肪酸シン
ターゼ（ＦＡＳ）メッセージに対する結合を誘導することが見出されてきた。こ
のグルコース誘導性ヒトＦＡＳｍＲＮＡ結合タンパク質は、均質になるよう精
製され、そしてその結合要素が定義されてきた。この大きなリンタンパク質は、
ＦＡＳｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の新規反復要素に結合する。特に
、該結合は、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの最初の６５塩基内の３７ヌクレオチド区間
にマッピングされている。

【００１１】本発明の新規１７８ｋＤａタンパク質の精製および性質決定を行うと共に、
グルコースがＦＡＳのｍＲＮＡを安定化する根底にある機構、および高脂血症、
肥満症および悪性腫瘍を含む、多様なヒト障害に対するその関係の決定を行った
。

【００１２】より詳細には、以下により詳細に記載されるように行った：ＲＮＡゲル移動度シフトアッセイを用い、ヒトＨｅｐＧ２細胞およびウシ肝臓
が、ヒトＦＡＳｍＲＮＡの３’末端に特異的に結合する細胞質因子を含むこと
を立証した。

【００１３】Ｄ−グルコースは、グルコース供給（ｆｅｅｄｉｎｇ）の３時間後、活性ピー
クが２．０２倍（ｐ＝０．００３３）になるよう、ＲＮＡ結合活性を増加させた
。

【００１４】煮沸またはプロテイナーゼＫでの抽出物の処理により、結合が消失した。ＦＡＳｍＲＮＡ結合因子のＵＶ架橋の後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、見かけ
の分子量が１７８±７ｋＤのプロテイナーゼＫ感受性バンドを分離した。

【００１５】非変性ポリアクリルアミドゲルをアフィニティーマトリックスとして使用し、
該タンパク質を均質になるよう精製した。

【００１６】該タンパク質を酸性ホスファターゼで処理すると、ＦＡＳｍＲＮＡへの結合
が妨げられたが、結合活性はスルフヒドリル基修飾により影響されず、そしてＭ
ｇ⁺⁺またはＣａ⁺⁺依存性ではなかった。

【００１７】欠失およびＲＮａｓｅＴ１マッピングにより、該タンパク質の結合部位は、
反復モチーフＡＣＣＣＣにより特徴付けられ、そして３’ＵＴＲの最初の６５塩
基内に見られる３７ヌクレオチドに位置決定された。

【００１８】本配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドとのＦＡＳ転写物のハイブリ
ダイゼーションにより、結合が消失した。

【００１９】これらの知見は、１７８ｋＤのグルコース誘導性リンタンパク質が、グルコ
ースがＦＡＳメッセージを安定化するのと同じ時間枠で、ＦＡＳｍＲＮＡの３
’ＵＴＲ内の（ＡＣＣＣＣ）_n含有配列に結合することを示す。本タンパク質はしたがって、ＦＡＳ遺伝子発現の転写後調節に関与すると考えられる。

【００２０】発明の詳細な説明本明細書は、本発明を構成すると見なされる内容を詳細に指摘し、そして明瞭
に請求する請求項で結論付けられるが、本発明は、付随する図面と共に、以下の
本発明の好ましい態様から、よりよく理解されるであろうと考えられる。

【００２１】本発明をさらに詳細に例示するため、以下の特定の実験例を行った。このよう
に特定の実施例が本明細書に例示されるが、本発明はこれらの特定の例示的な実
施例またはその中の細部に限定されないことが理解されるであろう。

【００２２】

【実施例】

方法組織培養試薬および培養条件グルコース不含／炭酸水素塩不含ＲＰＭＩ−１
６４０、炭酸水素塩、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、およびウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ、画分Ｖ）はＳｉｇｍａより購入した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）は
Ｉｎｔｅｒｇｅｎより購入した。ＭＥＭはワシントン大学組織培養支援センター
（ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒ
ｅＳｕｐｐｏｒｔＣｅｎｔｅｒ）より提供された。

【００２３】大規模細胞抽出物調製およびタンパク質精製のため、ＨｅｐＧ２細胞をＭＥＭ
＋１０％ＦＢＳ中で増殖させた。グルコース制御を伴う実験には、細胞を記載
されるように処理した（３１、３２）。ＨｅｐＧ２細胞は、世界中に広く分配さ
れているヒト肝癌細胞であり、そして長年に渡り、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ）寄託施設、メリーランド州ロックビルから、制限なしに公共に容
易に入手可能となっている。

【００２４】継代後３または４日目に、細胞にＭＥＭ＋１０％ＦＢＳを供給した。５また
は６日目に、培地をＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＢＳ＋４５００ｍｇ／ｌＤ−グルコースで置換した。２４時間後、培地を除去し、そしてプレートを３
７℃でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。その後、細胞にＲＰＭ
Ｉ−１６４０＋３％ＢＳＡ＋４５００ｍｇ／ｍｌＤ−グルコースを供給し
た。

【００２５】６時間後、培地を除去し、そしてプレートを３７℃でＰＢＳで２回洗浄した。
その後細胞に、４５００ｍｇ／ｌＤ−グルコースまたは４５００ｍｇ／ｌＬ−グルコースを含むＲＰＭＩ−１６４０＋３％ＢＳＡを供給した。

【００２６】Ｓ１００細胞質ゾル抽出物の調製ＨｅｐＧ２細胞に関しては、培地を除去し
、そしてプレートを４℃でＰＢＳで２回洗浄した。１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、４０ｍＭＫＣｌ、０．１５ｍＭスペルミン、２ｍＭＥ
ＤＴＡ、５ｍＭジチオスレイトール、および１００ μｇ／ｍｌフェニル
メチルスルホニルフロリドからなる溶解緩衝液（２５０ μｌ／１００ｍｍプ
レート）に、細胞を掻き取った。ダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーを用
い、緊密にはめ込まれた内筒（ｐｅｓｔｌｅ）を２０回往復させることにより、
細胞をホモジナイズした。１３，０００ｇで１０分間遠心分離することにより
、核を除去した。この上清をＢｅｃｋｍａｎＴＬ−１００超遠心分離機で、１
００，０００ｇで１時間遠心分離し、ポリソーム不含抽出物（Ｓ１００）を得
た。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用い、タンパク質濃度を測定
した。

【００２７】ウシ肝臓は、地元の食肉処理場（ＳｃｈｎｅｉｄｅｒＰａｃｋｉｎｇＣｏ
．、セントルイス）から得た。屠殺後直ちに肝臓をプラスチック袋に入れ、そし
て氷中に詰めた。実験室で、肝臓を生理食塩水で灌流し、血液を除去した後、Ｗ
ａｒｉｎｇ混合器を用い、溶解緩衝液中でホモジナイズした。核を沈澱させ、そ
してその後、上清を１００，０００ｇで遠心し、ポリソーム不含抽出物を得た
。

【００２８】ｉｎｖｉｔｒｏ転写によるＲＮＡの調製ＦＡＳ全長３’非翻訳領域（ＵＴ
Ｒ）の転写のテンプレートとして用いる親プラスミドは、ヒトＦＡＳｃＤＮＡ
のＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ制限断片（参考文献３１に番号付けられる、ヌクレオ
チド１１９０ないし２２３７）を、ｐＧＥＭ−５Ｚにサブクローニングすること
により、構築した。本断片（図６、転写物１）は、ＦＡＳタンパク質の７２カル
ボキシル末端アミノ酸に対するコード領域および３’ＵＴＲの全８０６塩基を含
んだ。いくつかのさらなるＦＡＳプラスミド（図６を参照されたい）が、標準的
クローニング技術により本構築物から得られた。鋳型をｉｎｖｉｔｒｏ転写の
前に直線化し、そしてゲル精製した。

【００２９】放射標識ＦＡＳＲＮＡプローブを、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（センス）ま
たはＳＰ６（アンチセンス）および³²Ｐ−ＣＴＰを用いて調製し、そしてゲル移
動度シフトアッセイに用いる前にＮｕｃＴｒａｐカラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
）を用い精製した。競合研究に用いる非放射能転写物は、転写反応に非標識ＣＴ
Ｐを用いる以外は同じ方法で調製した。リポタンパク質リパーゼメッセージのコ
ード領域の一部の転写のテンプレートとして用いるプラスミドは、以前Ｓｅｉｐ
ら（３０）に記載されている。

【００３０】ｉｎｖｉｔｒｏ転写により生成されるＲＮＡはすべて、同一に処理した。プ
ローブは、調製後直ちに−７０℃で凍結した。ゲル移動度シフトアッセイに使用
する前に、転写物を室温でゆるやかに融解した。

【００３１】ゲル移動度シフトアッセイＳ１００細胞質ゾル抽出物および０．５−１．０ｘ１０⁵ ｃｐｍの³²Ｐ標識ＲＮＡを用い、結合緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ[ｐＨ７．４]、２ｍＭＥＤＴＡ、４０ｍＭＫＣｌ、および５ｍ
Ｍジチオスレイトール）中で、結合反応を行った。競合実験には、標識ＲＮＡ
添加前に、競合剤転写物、ポリリボヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドを
添加した。

【００３２】結合反応を４℃で１０分間インキュベーションした。その後、タンパク質に結
合していない一本鎖ＲＮＡを分解するＲＮａｓｅＴ１の５単位を添加し、そし
て室温で１０分間インキュベーションを続けた。その後、結合反応物を、６％非
変性ポリアクリルアミドゲルを通じ、電気泳動に供した。ゲルを−７０℃で４−
２４時間オートラジオグラフした。

【００３３】ＲＮＡ−タンパク質複合体の紫外線架橋６％非変性ゲルの多数のレーンに結
合反応産物を装填した。このうちいくつかは放射標識ＲＮＡのみを含んだ。電気
泳動後、ゲルに２７０，０００ μＪ／ｃｍ²でＵＶ照射した。

【００３４】ゲルをオートラジオグラフし、その後、抽出物を装填したレーンから放射標識
バンドを切り出し；ＲＮＡのみで行ったレーンからも対応するゲル領域を切り出
した。試料をプールし、そして等量のＬａｅｍｍｌｉ電気泳動緩衝液中で、５０
℃で３０分間、その後１００℃で１時間インキュベーションした。抽出物を含む
レーンからの溶出物を２つのアリコットに分け、１つはプロテイナーゼＫで処理
し、そしてもう１つは処理しなかった。試料を６％ゲル中でＳＤＳ−ＰＡＧＥに
供し、その後、−７０℃でオートラジオグラフした。

【００３５】サイズ排除クロマトグラフィーＨｅｐＧ２細胞またはウシ肝臓どちらか由来
のＳ１００細胞質ゾル抽出物を、２５−４５％硫酸アンモニウムで沈澱させた
。溶解緩衝液に対する透析の後、０．９ＭＮａＣｌ＋０．２ｍＭＥＤＴ
Ａ＋０．２ｇ／ｌＮａＮ₃で平衡化されているＳｕｐｅｒｏｓｅ６カラムに試料を装填した。流速０．４ｍｌ／分で０．５ｍｌの分画を集め、そして
ゲル移動度シフトアッセイによりＲＮＡ結合活性に関しアッセイした。

【００３６】イオン交換クロマトグラフィー硫酸アンモニウム分画化の後、Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａＦＰＬＣを用い、あらかじめ充填された陰イオン（ＭｏｎｏＱ）また
は陽イオン交換カラム（ＭｏｎｏＳ）に試料を適用した。

【００３７】ＭｏｎｏＳカラムに関しては、別個の実験において、カラム平衡化のため、
５０ｍＭマロン酸（ｐＨ５．０）および５０ｍＭＭＥＳ（ｐＨ６．
０）両方を用いた。ＭｏｎｏＱカラムに関しては、２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐ
Ｈ７．５）を用い平衡化を行った；溶出緩衝液は２０ｍＭＴｒｉｓ；（ｐ
Ｈ７．５）＋０−１．０ＭＫＣｌであった。

【００３８】両イオン交換カラムに関し、流速は０．５ｍｌ／分であり、そして集めた分
画をＲＮＡ結合活性に関しアッセイした。結合タンパク質は、多様な条件下で、
ＭｏｎｏＳカラムには結合しなかった。該タンパク質はＭｏｎｏＱカラムに
は結合し、そしてｐＨ７．５で０．３ＭＫＣｌで溶出された。

【００３９】ＲＮＡ結合タンパク質精製典型的な精製において、Ｓ１００細胞質ゾル抽出
物は、およそ１０⁹のＨｅｐＧ２細胞から調製した。上述のように、２５−４５％の硫酸アンモニウムで分画化しそして透析した後、試料を陰イオン交換クロマ
トグラフィーに供した。

【００４０】ＲＮＡ結合タンパク質を含む分画をプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０繊維
で５０００ｇで濃縮し、その後４０−４５の非変性ポリアクリルアミドゲルを
用い、大規模ゲルシフト法に供した。

【００４１】バンドを切り出し、そして電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）装置（
ＢｉｏＲａｄモデル４２２）に入れた。溶出は、１ＸＴＢＥ中で、１０ｍＡ
／ガラス試験管で５時間行った。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎフィルターを用いて、試料
を脱塩し、その後２−１５％勾配ゲルを用いＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルを
アミドブラックＢで染色した後、−７０℃でオートラジオグラフした。

【００４２】ＲＮＡ結合タンパク質の脱リン酸化Ｓ１００抽出物を硫酸アンモニウム分画
化および陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。部分的に精製したタンパク
質を、ＫｗｏｎおよびＨｅｃｈｔに記載されるように（１７）、ＭＯＰＳ（ｐＨ６．５）、１ｍＭＭｇＣｌ₂、１００ｍＭＫＣｌ、０．２ｍＭロイペプチン中でジャガイモ（ｐｏｔａｔｏ）酸性ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）と共に、３０℃で３０分間インキュベーションし
た。いくつかの試料には、インキュベーション前に、ホスファターゼ阻害剤オカ
ダ酸（１０μＭ）を添加した。

【００４３】ＲＮａｓｅＴ１マッピングＨｅｐＧ２細胞由来の２５−４５％硫酸アン
モニウム分画を用い、ゲル移動度シフトアッセイを行った。上述のように、バン
ドをゲルから切り出し、そして電気溶出した。

【００４４】試料をフェノール／クロロホルムで抽出し、その後エタノール沈澱した。放射
能ＲＮＡ（〜１０，０００ｃｐｍ）を２つのアリコットに分け、１つは２０単
位のＲＮａｓｅＴ１で、室温で３０分間消化した。第二のアリコットは、模擬
（ｓｈａｍ）消化した。その後、試料を、末端標識サイズマーカーと共に１５％
変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、そしてオートラジオグラフした。

【００４５】オリゴヌクレオチド競合放射標識ＲＮＡを７５℃で１０分間加熱し、多様な
濃度の競合剤オリゴヌクレオチド（オリゴ＃１、＃２または＃３）を添加し、そ
して混合物を、３０−６０分間に渡り、ゆるやかに室温まで冷却し、ＲＮＡ転写
物とオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にした。

【００４６】その後、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドをＨｅｐＧ２抽出物とインキュベーショ
ンし、そしてゲルシフト活性に関しアッセイした。競合剤オリゴの配列は：オリゴ＃１− ＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＡＴ
ＧＧＴＧＧＡＧＴＧＡ [配列番号１] オリゴ＃２− ＧＡＴＣＴＡＧＣＴＴＣＣＣＧＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴ
ＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＴＧＣＣＧＧＣＡ [配列番号２] オリゴ＃３− ＧＡＴＣＴＧＣＣＧＧＣＡＴＧＴＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣＧ
ＧＡＣＴＣＡＴＣＡＧＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡ [配列番号３] であった。結果ＨｅｐＧ２抽出物をＦＡＳ３’末端に対応する転写物とインキュベーション
した際、ＲＮＡゲルシフトアッセイではっきりしたバンドが見られた（図１、レ
ーン２）が、ＲＮＡのみ（レーン１）では現れなかった。

【００４７】１０倍モル過剰の非放射能ＦＡＳセンス転写物を添加すると、本質的にゲルシ
フトシグナルが除かれた（レーン５）が、非放射能ＦＡＳアンチセンス（レーン
１０）およびＬＰＬセンス（レーン１２）転写物では、いかなる効果もなかった
。５つの別個の実験で同一の結果が見られた。

【００４８】他の実験において、１００倍モル過剰までのＦＡＳアンチセンスおよびＬＰＬ
センス転写物を添加しても、結合に対し何の効果もなかった。ＨｅｐＧ２抽出物
を放射標識リポタンパク質リパーゼＲＮＡとインキュベーションした際、複合体
は見られなかった。

【００４９】ポリリボヌクレオチドは、結合に関し、³²Ｐ標識ＦＡＳＲＮＡと競合しなか
った。２つの別個の実験において、１００倍モル過剰のＦＡＳセンス転写物は、
結合を除いたが、同モル過剰のポリアデニル酸、ポリウリジル酸、ポリグアニル
酸およびポリシチジル酸は何の効果も持たなかった。

【００５０】結合活性はまた、ウシ肝臓由来の細胞質抽出物にも存在した。容易に入手可能
であるため、始めは、ウシ肝臓から該タンパク質を精製しそして性質決定しよう
としたが、ウシ肝臓ではＨｅｐＧ２細胞より発現レベルが低く、そして後者の方
が、操作がより簡単だった。

【００５１】ゲルシフトしたバンドの強度は、アッセイに投入したタンパク質に依存した。
５つの別個の実験で、バンド強度は、５ないし２０μｇのタンパク質濃度で、直
線的に増加した。

【００５２】グルコースはＦＡＳｍＲＮＡ結合因子の発現を制御する（図２）。細胞を血
清不含培地で培養すると、Ｄ−グルコース（図２Ａ、レーン３）はゲルシフトア
ッセイにおいて結合活性を増加させたが、Ｌ−グルコース（図２Ａ、レーン４）
は増加させなかった。アッセイの直線反応範囲内のタンパク質濃度を用いた３つ
の別個の実験において、３時間の時点で、図２Ｂに示されるような結合強度（任
意の単位、平均±ＳＥＭ）は、Ｄ−グルコースで１４．９５±１．２０、そして
Ｌ−グルコースで７．４０±０．１８だった（ｐ＝０．００３、不対ツーテール
ｔ検定による）。

【００５３】結合におけるグルコース誘導増加に関する時間経過を、図２Ｃに典型的な実験
で示す。４５００ｍｇ／ｌのＤ−グルコースを供給した後、結合強度は、１時
間までに増加し、そして３時間でピークになった。ベースラインに戻る時間は多
様で、供給６時間後および１１時間後の間に戻った。Ｌ−グルコースには何の効
果もなかった。結果は３つの別個の実験で確認した。

【００５４】ＨｅｐＧ２抽出物をプロテイナーゼＫまたは煮沸により処理すると、結合活性
が消失した（図３Ａ）。３つの別個の実験で、同じ結果が見られた。

【００５５】図３Ａのレーン２は、優勢な上部のバンド（矢じりで示される）と共により速
い移動度の下部のバンドを示す。この下部のバンドはおそらく分解産物を表す。
該バンドは新鮮な抽出物ではかすかで、そして時間が経つと強度が増した。

【００５６】図３Ａの矢じりのバンドを、先の方法に記載されるように、ＵＶ架橋した後、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。バンドを多数のレーンから切り出し、溶出し、プ
ールし、そしてＳＤＳゲル中で電気泳動した（図３Ｂ）。ＦＡＳｍＲＮＡ結合
タンパク質（矢じり、図３Ｂ、レーン１）をこれらの条件下で解析すると、見か
け上１７８±７ｋＤの分子量を有した（４つの別個の実験の平均±ＳＥＭ）。

【００５７】４つの実験のうち２つでは、未変性ゲルから上部の優勢なバンドのみを切り出
したにも関わらず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは１７８ｋＤバンドのすぐ下により低
い分子量のタンパク質が示され、ゲルシフトアッセイで時々見られるパターンは
タンパク質分解のためであるという仮説と一致した。溶出したバンドをＳＤＳ−
ＰＡＧＥの前にプロテイナーゼＫで処理すると、１７８ｋＤシグナルは現れず
（図３Ｂ、レーン２）、そして抽出物を含まないレーンには存在しなかった（レ
ーン３）。

【００５８】ＳＤＳ−ＰＡＧＥで決定される見かけの大きさは、架橋リボヌクレオチドを含
むため、ＦＡＳＲＮＡ結合タンパク質の分子量を、先の方法に記載されるよう
にゲル濾過クロマトグラフィーでも測定した。ＨｅｐＧ２またはウシ肝臓抽出物
のどちらかを用いると、ＲＮＡ結合活性を持つ分画は、１６０−１７０ｋＤの
見かけの分子量で溶出された。

【００５９】先の方法に記載されるように、ＨｅｐＧ２Ｓ１００抽出物から、硫酸アンモ
ニウム沈澱、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティー段階の組み
合わせにより、タンパク質を精製した。ＲＮＡアフィニティーカラムを作成する
代わりに、非変性ポリアクリルアミドゲルを、クロマトグラフィーマトリックス
として用いた。

【００６０】調製規模のゲルをＵＶ架橋し、そしてオートラジオグラフし、その後ＲＮＡ結
合タンパク質に相当するバンドを切り出し、そして電気溶出した。典型的な精製
の結果を図４に示す。精製の各段階でのタンパク質収量を表１に示す。図４にお
いて、レーン６はレーン５の精製タンパク質のオートラジオグラフである。精製
中、放射標識ＦＡＳＲＮＡがタンパク質に架橋されているため、オートラジオ
グラフィー後、タンパク質は可視となる。４つの別個の精製で同一の結果が見ら
れた。

【００６１】１７８ｋＤタンパク質の精製により、その特性を定義することが可能になっ
た。いくつかのＲＮＡ結合タンパク質の活性には、リン酸化が必要である（１７
、１９）。酸性ホスファターゼは、用量依存方式で、ＭｏｎｏＱ精製タンパク
質の結合活性を減少させ、この効果はホスファターゼ阻害剤であるオカダ酸で逆
転した（図５）。図５の結果は、３つの別個の実験の平均±ＳＥＭを表す。

【００６２】鉄反応性タンパク質（１４）、ＡＵ結合因子（１９）およびｃ−ｍｙｃメッセ
ージに結合するタンパク質（２６）は、結合活性に、損なわれていない（ｉｎｔ
ａｃｔ）スルフヒドリル基を必要とするＲＮＡ結合タンパク質の代表的な例であ
る。

【００６３】ヒトＦＡＳｍＲＮＡ結合タンパク質の活性におけるスルフヒドリル基の役割
を試験するため、ＭｏｎｏＱ精製タンパク質を、ＤＴＴの存在下または非存在
下で、ＳＨ−酸化剤ジアミド（０−１０ｍＭ）またはＳＨ−アルキル化剤ＮＥ
Ｍ（Ｎ−エチルマレイミド、０−２ｍＭ）で処理した。３つの別個の実験にお
いて、スルフヒドリル基の修飾は、ＲＮＡ結合活性に実質的に何の効果も持たな
かった。

【００６４】いくつかのＲＮＡ結合タンパク質は二価陽イオンを必要とする（１９）。Ｍｏ
ｎｏＱ精製タンパク質を用いた４つの別個の実験において、０および４ｍＭ
の間のマグネシウム濃度ならびに０および２ｍＭの間のカルシウム濃度は、ゲ
ルシフト活性に何の効果も持たなかった。

【００６５】１７８ｋＤタンパク質の別の重要な特性は、その結合要素である。一連の欠
失プラスミドを構築し、そしてゲルシフトアッセイのための転写物を生成するの
に用いた（図６）。結合活性は図６の転写物３に対するシグナルに対し規準化し
た。メッセージの全３’末端に相当する転写物（転写物１）は、転写物３に比べ
ると、より低い結合活性を有する傾向があった（８８±１３対１００±２、ｐ＝
０．２９７６）。

【００６６】遠位（ｄｉｓｔａｌ）３’ＵＴＲに相当する転写物２は、いかなる結合活性も
持たなかった。転写物１、３、４、および５に対するアンチセンス転写物もまた
、いかなる結合活性も持たなかった。転写物７の活性は転写物３の活性の６％だ
った（６±１対１００±２、ｐ＜０．０００１）。完全な結合活性は、近位３’
ＵＴＲを含む１２６ヌクレオチド転写物である、転写物８により保持された。

【００６７】高レベル結合活性を仲介する特定の配列は、ＦＡＳ３’ＵＴＲの最初の６５
塩基内に同定された。図６の転写物４および５を用いたＲＮａｓｅＴ１マッピ
ングにより、３７ヌクレオチド断片を同定した（図７）。結合しているタンパク
質から単離されたＲＮＡのＲＮａｓｅＴ１消化は、単離ＲＮＡの泳動にいかな
る効果も持たなかった（図７Ａ、レーン２および４）ため、該断片は、内部Ｇを
含まなかった。ＦＡＳ３’ＵＴＲ内に、正確に３７ヌクレオチドのＧ不含領域
が１つある。本配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（図７Ｂ、オリゴ
＃１）をＦＡＳ転写物にハイブリダイズさせると、ＲＮＡ結合活性は消失した。
２つの異なるコントロールオリゴヌクレオチドにはいかなる効果もなかった。

【００６８】図６の転写物８の最も可能性が高い二次構造を図８に示す。Ｇ不含結合要素は
、矢印で示す。本要素の配列は：ＵＣ−ＡＣＵＣＣ−ＡＣＣ−ＡＵＣＣＣＣ−ＡＣＣＣＣ−ＡＣＣＣＣ−ＡＣＣＣ
Ｃ−ＡＣＣＣＣＣ [配列番号４] である。

【００６９】上述のように、ヒトＦＡＳｍＲＮＡの近位３’ＵＴＲ内の反復ＡＣＣＣＣモ
チーフに特異的に結合する大きな細胞質ゾルタンパク質を、均質になるよう精製
した。結合はグルコースで誘導され、そしてリン酸化を必要とする。グルコース
枯渇により、ＦＡＳｍＲＮＡは迅速に減衰するが、これはＤ−グルコース供給
により妨げられる（３１）。グルコース枯渇がＦＡＳｍＲＮＡ減衰を促進する
因子に関連しているか、またはグルコース供給がメッセージを減衰から保護する
因子に関連しているか、どちらかである。

【００７０】上記の例では、Ｄ−グルコースがＦＡＳｍＲＮＡを減衰から保護するのと、
正確に同じ時間枠で、Ｄ−グルコースは１７８ｋＤ結合活性を増加させ、これ
により本タンパク質が保護能力を持つトランス作用ｍＲＮＡ結合タンパク質であ
ることが示唆される。

【００７１】いくつかのおそらく保護能力を持つｍＲＮＡ結合タンパク質が、栄養または環
境的シグナルに反応し誘導される。鉄枯渇により、トランスフェリン受容体３’
ＵＴＲに対する鉄反応性タンパク質の結合が誘導され、そして該メッセージをヌ
クレオチド鎖切断（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）攻撃から保護する（１４
）。

【００７２】エストロゲンは、メッセージ安定化と関連し、ビテロゲニン３’ＵＴＲに対す
るタンパク質結合を誘導する（７）。低酸素症は、チロシン水酸化酵素ｍＲＮＡ
を安定化させ、そしてその３’ＵＴＲに対するタンパク質結合を増加させる（５
）。

【００７３】ＡＵＲＥ（配列ＡＵＵＵＡの反復コピー）は不安定性要素である；いくつかの
タンパク質が、メッセージ安定化と関連し、ＡＵＲＥと結合する（３、３７）。
腫瘍壊死因子αはグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ１）ｍＲＮＡを安定化させ、そ
してＧＬＵＴ１３’ＵＴＲのＧＣ−リッチ領域に対するタンパク質結合を誘導
する（２０）。

【００７４】保護能力を持つＲＮＡ結合タンパク質がどのように作用するのか、正確には知
られていない。結合が、メッセージの重要な部位で恒常的エンドヌクレアーゼの
作用を遮断する可能性がある。細胞質メッセージがどのように区画化される（ｃ
ｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚｅｄ）のかは、あまり理解されていないが、本明
細書に記載される新規グルコース誘導性タンパク質がＦＡＳｍＲＮＡ輸送を改
変し、細胞質減衰複合体への接近を妨げる可能性がある。

【００７５】記載された系において、グルコース枯渇後、ポリリボソームがＦＡＳｍＲＮ
Ａを減衰から保護する（３１）ことにより、１７８ｋＤタンパク質がＦＡＳメ
ッセージの翻訳装置との結合を促進する可能性が生じる。

【００７６】本明細書に記載される結合活性は、以前報告された同様の大きさのｍＲＮＡ結
合タンパク質のいずれでもないようであるため、新規であると考えられる。１７
８ｋＤ結合要素（ＡＣＣＣＣ）_nは、特有であるようである。該結合要素は、シチジンがウリジンに対し置換されたＡＵＲＥ様である。最近のデータにより、
ＵＵＡＵＵＵＡＵＵ[配列番号５]がＡＵＲＥが与える不安定性の最小配列である
可能性が示唆される（３８）。

【００７７】本要素が他のものに類似しているとすれば、機能モチーフはＣＣＡＣＣＣＣＡ
ＣＣ[配列番号６]である可能性がある；１７８ｋＤ結合要素には本配列のオー
バーラップするコピーが３つある。多くのＲＮＡ結合タンパク質はポリピリミジ
ンを認識するが、シチジンではなくウリジンが一般的に好ましい（２２）。

【００７８】 β₂アドレナリン受容体ｍＲＮＡに結合する３５ｋＤ細胞質タンパク質（２５）、およびａｐｏＢｍＲＮＡに結合しそして該ｍＲＮＡを編集するシチジン
脱アミノ酵素、ａｐｏｂｅｃ−１（２）は、ポリ（Ｕ）で終わるＲＮＡ結合タン
パク質の例である。ポリリボヌクレオチドは、１７８ｋＤタンパク質のＦＡＳｍＲＮＡとの相互作用にいかなる効果も持たなかった（上記、結果を参照され
たい）。（ＡＣＣＣＣ）_nモチーフの突然変異誘発、および本配列が、グルコースが誘導する安定性を関連のないメッセージに与えることが可能であるか決定す
ることは、その機能をさらに性質決定するため不可欠であろう。

【００７９】１ダース以上の古典的な代謝酵素が核酸に結合することが示されてきており、
そしてこれらの酵素に一般的なジヌクレオチド結合ドメインが関与している可能
性がある（１３）。鉄反応性タンパク質はまた、アコニターゼであり、クエン酸
からイソクエン酸への変換を触媒する（１１）。グリセルアルデヒド−３−リン
酸デヒドロゲナーゼはｔＲＮＡ（３４）およびＡＵＲＥ（２３）に結合する。カ
タラーゼはそれ自体のｍＲＮＡに結合しそして該ｍＲＮＡを安定化する（４）。

【００８０】上記より、１７８ｋＤ因子のＦＡＳｍＲＮＡに対する結合を、グルコース
がどのように増加させるかが理解される。最適結合にはリン酸化が必要とされる
（図５）。グルコース代謝が１７８ｋＤタンパク質のリン酸化を誘導し、ＦＡ
ＳｍＲＮＡに対する結合を促進すると考えられる。リン酸化を通じたグルコー
スの遺伝子発現制御は酵母で起こることが知られており、これによりグルコース
は複雑なリン酸化カスケードを開始する。リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（２１）お
よび転写活性化因子ＳＩＰ４（１８）はグルコース利用可能性に反応し、異なっ
てリン酸化される酵母タンパク質の例である。

【００８１】グルコースがＦＡＳｍＲＮＡ減衰を妨げるのと同じ時間枠で、グルコースは
一過的に大きなリンタンパク質の、ヒトＦＡＳｍＲＮＡの３’ＵＴＲ中のＡＣ
ＣＣＣ反復要素に対する結合を増加させる。

【００８２】異常なグルコースおよび脂質代謝は一般的に関連しているため、本タンパク質
のさらなる性質決定は、糖尿病性異脂肪血症（ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ）およ
び悪性腫瘍などの多様な障害の根底にある機構がよりよく理解されるように、解
糖および脂質生成をさらに関連付ける可能性がある。

【００８３】

【表１】

【００８４】本発明の精神および範囲から逸脱することのない多様な他の例は、本開示を読
んだ後、当業者に明らかになるであろう。こうした他の例すべてが、付随する請
求の範囲に含まれることが意図される。

【００８５】参考文献１．Ａｌｏ，Ｐ．Ｌ．，Ｐ．Ｖｉｓｃａ，Ａ．Ｍａｒｃｉ，Ａ
．Ｍａｎｇｏｎｉ，Ｃ．Ｂｏｔｔｉ，およびＵ．ＤｉＴｏｎｄｏ．
「第１期乳癌患者における再発の予測因子としての脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）
の発現」Ｃａｎｃｅｒ７７：４７８−４８２，１９９６．２．Ａｎａｎｔ，Ｓ．，Ａ．Ｊ．ＭａｃＧｉｎｎｉｔｉｅ，およびＮ
．Ｏ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ．「哺乳動物アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集酵
素の触媒サブユニット、ａｐｏｂｅｃ−１は、新規ＲＮＡ結合タンパク質である
」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１４７６２−１４７６７，１９
９５．３．Ｃｈｅｎ，Ｃ．−Ｙ．，Ｙ．Ｙｏｕ，およびＡ．−Ｂ．Ｓｈｙ
ｕ．「２つの細胞タンパク質は、ｍＲＮＡ不安定性のｃ−ｆｏｓタンパク質コ
ード領域決定因子の脱安定化機能に必要なプリン−リッチ配列に特異的に結合す
る」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：５７４８−５７５７，１９
９２．４．Ｃｌｅｒｃｈ，Ｌ．Ｂ．，Ｊ．Ｉｑｂａｌ，およびＤ．Ｍａｓ
ｓａｒｏ．「出生前ラット肺カタラーゼ遺伝子発現：コルチコステロイドおよ
び高酸素症の影響」Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６０：Ｌ４２８−Ｌ
４３３，１９９１．５．Ｃｚｙｚｙｋ−Ｋｒｚｅｓｋａ，Ｍ．Ｆ．，Ｚ．Ｄｏｍｉｎｓｋ
ｉ，Ｒ．Ｋｏｌｅ，およびＤ．Ｅ．Ｍｉｌｌｈｏｒｎ．「低酸素症は、
ラットチロシン水酸化酵素ｍＲＮＡの３’非翻訳領域におけるピリミジン−リッ
チ配列に対する細胞質タンパク質の結合を刺激する」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．２６９：９９４０−９９４５，１９９４．６．Ｄｉｎｎｅｅｎ，Ｓ．，Ｊ．Ｇｅｒｉｃｈ，およびＲ．Ｒｉｚ
ｚａ．「非インスリン依存真性糖尿病における炭水化物代謝」Ｎ．Ｅｎｇ
ｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：７０７−７１３，１９９２．７．Ｄｏｄｓｏｎ，Ｒ．Ｅ．，およびＤ．Ｊ．Ｓｈａｐｉｒｏ．「エ
ストロゲン誘導性タンパク質は、エストロゲンに安定化されるビテロゲニンｍＲ
ＮＡの３’非翻訳領域中の配列に特異的に結合する」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．１４：３１３０−３１３８，１９９４．８．ＤｕｄｅｋＳ．Ｍ．，およびＣ．Ｆ．Ｓｅｍｅｎｋｏｖｉｃｈ．
「必須アミノ酸は、荷電されていないトランスファーＲＮＡ依存機構を通じ、脂
肪酸シンターゼ発現を制御する」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２
９３２３−２９３２９，１９９５．９．Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｉ．，Ｍ．Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，および
Ａ．Ｗ．Ｐａｒｔｉｎ．「前立腺の腺癌の病理学的状態の独立した予測因子
としてのＯＡ−５１９（脂肪酸シンターゼ）」Ｕｒｏｌｏｇｙ４５：８１−
８６，１９９５．１０．Ｇｏｏｄｒｉｄｇｅ，Ａ．Ｇ．「遺伝子発現の食餌制御：炭水化
物および脂質代謝に関与する酵素」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．７：
１５７−１８５，１９８７．１１．Ｇｒａｙ，Ｎ．Ｋ．，Ｓ．Ｑｕｉｃｋ，Ｂ．Ｇｏｏｓｅｎ
，Ａ．Ｃｏｎｓｔａｂｌｅ，Ｈ．Ｈｉｒｌｉｎｇ，Ｌ．Ｋｕｈｎ，
およびＭ．Ｈｅｎｔｚｅ．「組換え鉄制御因子は、鉄反応性要素結合タンパ
ク質、翻訳リプレッサーおよびアコニターゼとして作用する」Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８：６５７−６６７，１９９３．１２．Ｈａｕｇｕｅｌ−ｄｅ−Ｍｏｕｚｏｎ，Ｓ．，Ｃ．Ｍｒｅｊｅ
ｎ，Ｆ．Ａｌｅｎｇｒｉｎ，Ｆ．，およびＥ．ＶａｎＯｂｂｅｒｇ
ｈｅｎ．「培養細胞における、ヒトインスリン受容体ｍＲＮＡおよびチロシン
キナーゼ活性のグルコース誘導刺激」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０５：１１
９−１２４，１９９５．１３．Ｈｅｎｔｚｅ，Ｍ．Ｗ．「ＲＮＡ結合タンパク質としての酵素：
（ジ）ヌクレオチド結合ドメインの役割？」ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：１０１−１０３，１９９４．１４．Ｈｅｎｔｚｅ，Ｍ．Ｗ．，Ｔ．Ｒｏｕａｕｌｔ，Ｊ．Ｂ．
Ｈａｒｆｏｒｄ，およびＲ．Ｄ．Ｋｌａｕｓｎｅｒ．「酸化還元および制御
性ＲＮＡ−タンパク質相互作用の分子機構」Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：３５７
−３５９，１９８９．１５．ＨｕｄｇｉｎｓＬ．Ｃ．，Ｍ．Ｈｅｌｌｅｒｓｔｅｉｎ，Ｃ
．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｒ．Ｎｅｅｓｅ，Ｊ．Ｄｉａｋｕｎ，およびＪ．Ｈｉｒｓｃｈ．「ヒト脂肪酸合成は、適正カロリー（ｅｕｃａｌｏｒｉｃ）
低脂肪高炭水化物食餌により刺激される」Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：２０８１−２０９１，１９９６．１６．Ｊｏｎｅｓ，Ｂ．Ｈ．，Ｊ．Ｈ．Ｋｉｍ，Ｍ．Ｂ．Ｚｅｍ
ｅｌ，Ｒ．Ｐ．Ｗｏｙｃｈｉｋ，Ｅ．Ｊ．Ｍｉｃｈａｕｄ，Ｗ．Ｏ．Ｗｉｌｋｉｓｏｎ，およびＮ．Ｍｏｕｓｔａｉｄ．「アグチ（ａｇｏｕｔ
ｉ）タンパク質による脂肪細胞上方制御：黄色マウス（ｙｅｌｌｏｗｍｏｕｓ
ｅ）肥満症にありうるパラクリン作用」Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２
７０：Ｅ１９２−Ｅ１９６，１９９６．１７．Ｋｗｏｎ，Ｙ．Ｋ．，およびＮ．Ｂ．Ｈｅｃｈｔ．「マウスプ
ロタミン２ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に対するリンタンパク質の結合は、その
翻訳を一時的に抑制する」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：６５４
７−６５５７，１９９３．１８．Ｌｅｓａｇｅ，Ｐ．，Ｘ．Ｙａｎｇ，およびＭ．Ｃａｒｌｓ
ｏｎ．「酵母ＳＮＦ１プロテインキナーゼは、Ｃ₆亜鉛クラスター転写活性化因子、ＳＩＰ４と相互作用する；グルコース反応におけるＳＮＦ１の新たな役割
」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：１９２１−１９２８，１９９
６．１９．Ｍａｌｔｅｒ，Ｊ．Ｓ．，およびＹ．Ｈｏｎｇ．「酸化還元ス
イッチおよびリン酸化は、ホルボールエステルおよびイオノホアによる、アデノ
シン−ウリジン結合因子の翻訳後上方制御に関与する」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２６６：３１６７−３１７１，１９９１．２０．ＭｃＧｏｗａｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｓ．Ｐｏｌｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．
Ｗｉｎｓｌｏｗ，およびＰ．Ｈ．Ｐｅｋａｌａ．「グルコース輸送体（ＧＬ
ＵＴ１）ｍＲＮＡ代謝回転（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）の腫瘍壊死因子−α制御」Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１３３１−１３３７，１９９７．２１．Ｍｉｎａｒｄ，Ｋ．Ｉ．，およびＬ．ＭｃＡｌｉｓｔｅｒ−Ｈｅ
ｎｎ．「サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）におけるリンゴ酸デヒドロゲナーゼＭＤＨ２アイソザイムのグ
ルコース誘導リン酸化」Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
３１５：３０２−３０９，１９９４．２２．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｄ．Ｒ．，Ｔ．Ｋａｋｅｇａｗａ，Ｒ．Ｌ．Ｋａｓｐａｒ，およびＭ．Ｗ．Ｗｈｉｔｅ．「ポリピリミジン領域および
その結合タンパク質：遺伝子発現の転写後調節のための制御部位」Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ３２：２９３１−２９３７，１９９３．２３．Ｎａｇｙ，Ｅ．，およびＷ．Ｆ．Ｒｉｇｂｙ．「グリセルアル
デヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ（＋）結合領域（ロスマンフォ
ールド）中のＡＵ−リッチＲＮＡに選択的に結合する」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７０：２７５５−２７６３，１９９５．２４．Ｐｉｚｅｒ，Ｅ．Ｓ．，Ｆ．Ｄ．Ｗｏｏｄ，Ｇ．Ｒ．Ｐａ
ｓｔｅｒａｃｋ，およびＦ．Ｐ．Ｋｕｈａｊｄａ．「脂肪酸シンターゼ（Ｆ
ＡＳ）：ＨＬ６０前骨髄球性白血病細胞における細胞毒性代謝拮抗物質の標的」ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５６：７４５−７５１，１９９６．２５．Ｐｏｒｔ，Ｊ．Ｄ．，Ｌ．−Ｙ．Ｈｕａｎｇ，およびＣ．Ｃ．Ｍａｌｂｏｎ．「受容体ｍＲＮＡを下方制御するβ−アドレナリンアゴニス
トは、β−アドレナリン受容体ｍＲＮＡに選択的に結合する、Ｍ_r３５，０００の単数または複数のタンパク質を上方制御する」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６７：２４１０３−２４１０８，１９９２．２６．Ｐｒｏｋｉｐｃａｋ，Ｒ．Ｄ．，Ｄ．Ｊ．Ｈｅｒｒｉｃｋ，お
よびＪ．Ｒｏｓｓ．「ヒトｃ−ｍｙｃｍＲＮＡのＣ末端コード領域に結合
するタンパク質の精製および特性」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：
９２６１−９２６９，１９９４．２７．Ｒａｓｈｉｄ，Ａ．，Ｅ．Ｓ．Ｐｉｚｅｒ，Ｍ．Ｍｏｇａ
，Ｌ．Ｚ．Ｍｉｌｇｒａｕｍ，Ｍ．Ｚａｈｕｒａｋ，Ｇ．Ｒ．Ｐａ
ｓｔｅｒｎａｋ，Ｆ．Ｐ．Ｋｕｈａｊｄａ，およびＳ．Ｒ．Ｈａｍｉｌｔ
ｏｎ．「結腸直腸新生物における脂肪酸シンターゼの上昇発現および脂肪酸合
成活性」Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．１５０：２０１−２０８，１９９７．２８．Ｒｅｍｐｅｌ，Ａ．，Ｓ．Ｐ．Ｍｅｔｈｕｐａｌａ，およびＰ
．Ｌ．Ｐｅｄｅｒｓｏｎ．「癌細胞におけるグルコース異化作用：ＩＩ型ヘ
キソキナーゼプロモーターのグルコースおよびサイクリックＡＭＰによる制御」ＦＥＢＳＬｅｔｔ．３８５：２３３−２３７，１９９６．２９．Ｒｏｓｓ，Ｊ．「より高次の真核生物におけるメッセンジャーＲ
ＮＡ安定性の調節」ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔｉｃｓ１２：１７１−１７５
，１９９６．３０．ＳｅｉｐＲ．Ｌ．，Ｔ．Ｊ．Ａｎｇｅｌｏｐｏｕｌｏｓ，およ
びＣ．Ｆ．Ｓｅｍｅｎｋｏｖｉｃｈ．「運動は骨格筋でヒトリポタンパク質
リパーゼ遺伝子発現を誘導するが、脂肪組織では誘導しない」Ａｍ．Ｊ．
Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６８：Ｅ２２９−Ｅ２３６，１９９５．３１．ＳｅｍｅｎｋｏｖｉｃｈＣ．Ｆ．，Ｔ．Ｃｏｌｅｍａｎ，およ
びＦ．Ｔ．ＦｉｅｄｏｒｅｋＪｒ．「ヒト脂肪酸シンターゼｍＲＮＡ：組
織分布、遺伝子マッピング、およびグルコース枯渇後の減衰の動力学」Ｊ．
ＬｉｐｉｄＲｅｓ．３６：１５０７−１５２１，１９９５．３２．ＳｅｍｅｎｋｏｖｉｃｈＣ．Ｆ．，Ｔ．Ｃｏｌｅｍａｎ，およ
びＲ．Ｇｏｆｏｒｔｈ．「グルコースの生理学的濃度は、脂肪酸シンターゼ
ｍＲＮＡ安定性を仲介することにより、ＨｅｐＧ２細胞における脂肪酸シンター
ゼ活性を制御する」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：６９６１−６９
７０，１９９３．３３．ＳｅｍｅｎｋｏｖｉｃｈＣ．Ｆ．，およびＪ．Ｗ．Ｈｅｉｎｅｃ
ｋｅ．「糖尿病およびアテローム性動脈硬化症の謎：新たな構想の時」Ｄｉ
ａｂｅｔｅｓ４６：３２７−３３４，１９９７．３４．Ｓｉｎｇｈ，Ｒ．，およびＭ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ．「グリセルア
ルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼによるトランスファーＲＮＡの配列特異
的結合」Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：３６５−３６８，１９９３．３５．Ｖｏｌｐｅ，Ｊ．Ｊ．，およびＰ．Ｒ．Ｖａｇｅｌｏｓ．「飽
和脂肪酸の生合成の機構および制御」Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．５６：３
３９−４１７，１９７６．３６．Ｗａｋｉｌ，Ｓ．Ｊ．，Ｊ．Ｋ．Ｓｔｏｏｐｓ，およびＶ．Ｃ
．Ｊｏｓｈｉ．「脂肪酸合成およびその制御」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．５２：５３７−５７９，１９８３．３７．Ｚｈａｎｇ，Ｗ．，Ｂ．Ｊ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｋ．Ｅｈｒｅ
ｎｍａｎ，Ａ．Ｗ．Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｃ．Ｔ．ＤｅＭａｒｉａ，Ｄ
．Ｃｒａｔｅｒ，Ｋ．ＤｅＨａｖｅｎ，Ｌ．Ｌｏｎｇ，およびＧ．
Ｂｒｅｗｅｒ．「ＡＵ−リッチ要素ＲＮＡ結合タンパク質、ＡＵＦ１の精製、
性質決定、およびｃＤＮＡクローニング」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：７６５２−７６６５，１９９３．３８．Ｚｕｂｉａｇａ，Ａ．Ｍ．，Ｊ．Ｇ．Ｂｅｌａｓｃｏ，および
Ｍ．Ｅ．Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ．「９量体、ＵＵＡＵＵＵＡＵＵは、ｍＲＮＡ
分解を仲介する重要なＡＵ−リッチ配列モチーフである」Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
．Ｂｉｏｌ．１５：２２１９−２２３０，１９９５．

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ヒトＦＡＳｍＲＮＡの３’末端に特異的に結合する細
胞質ゾルＨｅｐＧ２因子を同定するゲル移動度シフトアッセイを示す。ＦＡＳｍＲＮＡの遠位コード領域および３’ＵＴＲの最初の４００塩基を含
む放射標識転写物（図６の転写物３）を、ｉｎｖｉｔｒｏ転写により生成した
。各レーンにつき、ＨｅｐＧ２Ｓ１００細胞質ゾル抽出物１０μｇを、放射標
識センスＦＡＳＲＮＡとインキュベーションした後、ＲＮａｓｅＴ１で処理
し、そして非変性ゲルで電気泳動した。インキュベーションは、非放射能競合剤ＲＮＡの存在下（レーン３−５および
７−１２）および非存在下（レーン１、２、６）で行った。ゲルシフトしたバンドの位置は、矢じりで示される。遊離のＲＮａｓｅＴ１
消化プローブの位置は、ゲルの底部に示される。レーン１は抽出物を含まず、プローブのみ（Ｐ）を含んだ。レーン３−５は、１−１０倍モル過剰の非放射能ＦＡＳセンスＲＮＡの存在下
で行ったインキュベーションを表す。レーン７−９は、１−１０倍モル過剰の非放射能ＦＡＳアンチセンスＲＮＡの
存在下で行ったインキュベーションを表す。レーン１０−１２は、１−１０倍モル過剰のリポタンパク質リパーゼセンスＲ
ＮＡの存在下で行ったインキュベーションを表す。

【図２】図２の３つの部分、Ａ、Ｂ、およびＣは、ＦＡＳｍＲＮＡ結合
因子の結合がＤ−グルコースにより誘導されることを示す。図２Ａは、時間ゼロ（レーン２）、および４５００ｍｇ／ｌのＤ−グルコー
ス供給の３時間後（レーン３）または同濃度のＬ−グルコース供給の３時間後（
レーン４）の、等量のＨｅｐＧ２細胞質ゾル抽出物（アッセイの直線反応範囲内
）のＲＮＡ結合活性を比較する、典型的なゲル移動度シフトアッセイの結果を示
す。図２Ｂは、濃度測定（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）により定量化された、図２
Ａと同一の３つの別個の実験の結果を示す。ゲルシフトしたバンドの結合活性（
任意の単位、平均±ＳＥＭ）は、Ｄ−グルコースでは１４．９５±１．２０、そ
してＬ−グルコースでは７．４０±０．１８だった（ｐ＝０．００３３）。図２Ｃは、典型的な時間経過実験の結果を示す。４５００ｍｇ／ｍｌのＤ−
またはＬ−グルコースの処理後、抽出物を多様な時点で調製し、ゲルシフトアッ
セイに供し、そして結果を濃度測定により、定量化した。

【図３】図３の２つの部分、ＡおよびＢは、ＦＡＳｍＲＮＡ結合因子が
タンパク質であることを示す。図３Ａでは、レーンは、２０μｇのＨｅｐＧ２細胞質ゾルタンパク質の非存在
下（レーン１）または存在下（レーン２−４）で、放射標識ＦＡＳＲＮＡを含
んだ。ＨｅｐＧ２抽出物を、ＦＡＳＲＮＡ添加前に、処理せず（レーン２）、５０
０ μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫと共に３７℃で１時間のインキュベーション
に供し（レーン３）、または１００℃で５分間の加熱に供した（レーン４）。より速い移動度の別のバンドが、レーン２の矢じりにより示される有力なバン
ドのすぐ下に見られる。この下部のバンドは、本文に記載されるように、上部の
バンドのタンパク質分解断片を表す可能性がある。遊離のＲＮａｓｅＴ１消化プローブは各レーンにおいて、ゲルの底部に沿っ
て現れる。図３Ｂでは、未変性ゲルの多数のレーンを用い、ゲル移動度シフトアッセイを
行った。ゲルはＵＶ架橋し、その後、図３Ａの矢じりで示されるバンドを切り出
し、そして６％ゲル中で直接ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供するか（レーン１）、または
電気泳動前に５００ μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫで３７℃で１時間処理した
（レーン２）。ＨｅｐＧ２抽出物の代わりに溶解緩衝液を装填した未変性ゲルの
適切な領域もまた切り出し、そして電気泳動した（レーン３）。矢じりは、１７
８ｋＤ位を示す。

【図４】図４は、１７８ｋＤのＦＡＳｍＲＮＡ結合タンパク質の精製
を示す。ＨｅｐＧ２抽出物を先の方法に記載されるように処理した。精製の各段階でのタンパク質収量は、先の表１に示される。レーン２−４には、レーン当たり２０μｇのタンパク質を装填した。レーン５は、標準との比較により決定されるように１０μｇの精製タンパク質
に相当する。レーン１−５は、２−１５％勾配ゲルのアミドブラックＢ染色を表す。レーン６は、レーン５に示されるのと同一のゲルのオートラジオグラフである
。１７８ｋＤ位は、矢じりで示される。

【図５】図５は、ＦＡＳｍＲＮＡ結合タンパク質がリンタンパク質であ
ることを示す。部分的に精製されたタンパク質を、増加する濃度のジャガイモ酸性ホスファタ
ーゼの非存在下（ホスファターゼなし）または存在下でインキュベーションした
後、ゲルシフトアッセイおよび濃度測定による定量化を行った。実験は、１０μＭオカダ酸の存在下で、最高濃度のジャガイモ酸性ホスファ
ターゼ（０．３６単位）を含む試験管を含んだ。アスタリスクは、ホスファターゼ０．２４単位（ｐ＜０．０１）および０．３
６単位（ｐ＜０．００１）の存在下での結合活性がどちらも、ホスファターゼの
非存在下での活性とは有意に異なっていたことを示す。結果は３つの別個の実験の平均±ＳＥＭを表す。挿入図は、典型的な実験の結果を示す：レーン１＝ホスファターゼなしレーン２＝０．０９単位レーン３＝０．２４単位レーン４＝０．３６単位レーン５＝０．３６単位＋オカダ酸

【図６】図６は、１７８ｋＤタンパク質に対する結合要素を位置決定す
るのに用いた転写物を示す。１７８ｋＤタンパク質に関するゲルシフトアッセイの結果は、右に示されて
いる（ＲＮＡ結合活性を％で示す）。結合活性は濃度測定により定量化し、そして転写物３に対するシグナルに対し
規準化した。各転写物は、少なくとも３回アッセイした。転写物１および３により生成されたシグナルは、有意には異ならなかった（ｐ
＝０．２９７６、ｎ＝４）。転写物３および７の間の相違は有意であった（ｐ＜０．０００１、ｎ＝３）。終止コドン（ＵＡＧ）およびポリアデニル化シグナル（ＡＵＵＡＡＡ）の位置
を示す。転写物２はＲＮＡ結合活性を持たなかった。転写物１、３、４、および５に対
するアンチセンス転写物と共にリポタンパク質リパーゼのセンス転写物もまた、
ＲＮＡ結合活性を持たなかった。

【図７】図７の２つの部分、ＡおよびＢは、ＲＮａｓｅＴ１マッピング
およびオリゴヌクレオチド競合による、１７８ｋＤタンパク質に対する結合要
素の同定を示す。図７Ａでは、図６の転写物４および５を用い、ゲルシフトアッセイを行った。
ＲＮＡタンパク質複合体を切り出し、溶出し、フェノール／クロロホルムで抽出
し、そして沈澱させた。ＲＮＡをＲＮａｓｅＴ１の存在下（レーン２および４）または非存在下（レ
ーン１および３）でインキュベーションした後、１５％変性ポリアクリルアミド
ゲル上で分離し、そしてオートラジオグラフした。レーン１−２は、図６の転写物４を用いた結果を示し、そしてレーン３−４は
転写物５を用いた結果を示す。図６の転写物３を用いた場合もまた、同一の結果が得られた。ヌクレオチドサイズマーカーは、図７Ａパネルの左に示され、そして３７ヌク
レオチドの保護断片の位置は矢じりで示される。図７Ｂでは、先の方法に記載されるように、競合剤オリゴヌクレオチドの存在
下で、ＨｅｐＧ２抽出物および図６の転写物４を用い、ゲルシフトアッセイを行
った。オリゴ＃１は、図７Ａに同定される３７ヌクレオチドに対するアンチセンスで
あった。オリゴ＃２および＃３は、関連のない調節配列であった。レーン１−６は、増加する量のオリゴヌクレオチドの存在下でのゲルシフトア
ッセイの結果を示す。オリゴは、以下の量で添加された。レーン１＝０ｎｇレーン２＝４．５ｎｇレーン３＝９ｎｇレーン４＝１８ｎｇレーン５＝１８０ｎｇレーン６＝９００ｎｇ

【図８】図８は、１７８ｋＤ結合要素の予測される構造を示す。図６の転写物８は１２６ヌクレオチドを含み、該転写物を、ｗｗｗ．ｉｂｃ．
ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／〜ｚｕｋｅｒ／ｒｎａ／ｆｏｒｍ１．ｃｇｉ．のＭｉｃｈ
ａｅｌＺｕｋｅｒ、ワシントン大学医学部のＲＮＡ二次構造プログラムを用い
、フォールディングした。本構造の予測される自由エネルギーは、−４３．２ｋｃａｌ／ｍｏｌである
。本プログラムは、もう１つの潜在的な構造を予測するが、該構造はＲＮａｓｅＴ１マッピングデータと一致しない。結合要素は、矢印により示される。ＲＮＡハイブリダイゼーションの点は、黒丸で示される。終止コドン（ＵＡＧ）および３’ＵＴＲの最初の塩基の位置もまた、示される
。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年３月７日（２００１．３．７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 3/06 Ａ６１Ｐ 3/10 ４Ｈ０４５ 3/10 35/00 35/00 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｑ 1/48 ＺＣ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA10 BA43 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 HA14 4B063 QQ26 QQ42 QR32 QR62 QS34 4B065 AA90X AA93X AA99Y AB01 BA02 CA24 CA29 CA44 CA46 4C084 AA13 AA17 DC32 NA14 ZB262 ZC202 ZC332 ZC352 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB26 ZC33 ZC35 4H045 AA11 BA10 BA41 CA40 DA01 DA86 EA27 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】１７８＋７ｋＤａの分子量を有し、そしてヒト脂肪酸シ
ンターゼｍＲＮＡの３’非翻訳領域に結合する、グルコース誘導性のリン酸化さ
れているｍＲＮＡ結合タンパク質。
【請求項２】ヒト脂肪酸シンターゼｍＲＮＡの３’非翻訳領域の最初の
６５塩基内の反復ＡＣＣＣＣ配列を含む３７ヌクレオチド区間（ｓｔｒｅｔｃｈ
）に結合する、請求項１の結合タンパク質。
【請求項３】ヒト肝癌細胞から均質になるよう精製されている、請求項
１の結合タンパク質。
【請求項４】配列番号４の３７ヌクレオチド配列を含む、請求項１のタ
ンパク質結合要素。
【請求項５】請求項４の結合要素を含み、そして図８（配列番号７）の
ヌクレオチド配列を有する、ヒト脂肪酸シンターゼｍＲＮＡの近位（ｐｒｏｘｉ
ｍａｌ）３’非翻訳領域を含む、１２６ヌクレオチド転写物。
【請求項６】ヒト脂肪酸シンターゼ遺伝子発現を仲介する方法であって
、ヒト細胞におけるまたは温血動物の代謝経路における、請求項１の結合タンパ
ク質の結合活性を阻害するまたは亢進することを含む、前記方法。
【請求項７】リポタンパク質分泌および細胞増殖を制御する方法であっ
て、ヒト細胞における、請求項１の結合タンパク質を不活性化させるまたは過剰
発現させることを含む、前記方法。
【請求項８】ヒト脂肪酸シンターゼ阻害剤としての活性に関し試験化合
物をスクリーニングする方法であって、請求項１の結合タンパク質の結合活性に
対する試験化合物の効果を測定することを含む、前記方法。