JP2002507430A - Biotransformation of raspberry ketone - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、フランビノンの製造法であって、β−グルコシダーゼ活性およびＤＨＳＡ（第二アルコールデヒドロゲナーゼ）活性を有する酵母菌株を用い，フランビノングルコシドを含む培地をフランビノンへの生物転換を行い、生物転換の後に培地からフランビノンを分離することを特徴とする、方法に関する。 (57) [Summary] The present invention relates to a method for producing flavinone, which comprises using a yeast strain having β-glucosidase activity and DHSA (secondary alcohol dehydrogenase) activity, and performing biotransformation of a medium containing flavinone glucoside to flavinone, thereby performing biotransformation. And separating flavinone from the culture medium after the method.
Description
【０００１】 本発明は、天然抽出物、特にカンバ樹皮の抽出物から出発する生物転換によっ
てフランビノンを得る方法に関する。The present invention relates to a process for obtaining flavinone by biotransformation starting from a natural extract, in particular an extract of birch bark.
【０００２】 フランビノンは、農産食物(agri-food)で強く求められている芳香性分子であ り、実際に、多数の他の分子から形成されているキイチゴ風味を特徴あるものと
しているのはこれである。しかしながら、農業食物の分野では、その使用はキイ
チゴ風味に限定されるものではなく、これは桃、パインアップル、イチゴ、キー
ウィフルーツ、およびサクランボの芳香性混合物に用いることができるからであ
る(Aretander, 1969; Clarke, 1992)。また、この分子は、芳香性混合物にフル ーティノートを提供する能力を有しており、香料、化粧品、および調剤に用いる
こともできる。[0002] Flambinone is an aromatic molecule that is highly sought after in agri-food, and in fact, it is characterized by a strawberry flavor formed from many other molecules. It is. However, in the field of agricultural foods, its use is not limited to the strawberry flavor, since it can be used for aromatic mixtures of peaches, pineapples, strawberries, kiwifruits and cherries (Aretander, 1969; Clarke, 1992). The molecule also has the ability to provide fruity notes to fragrance mixtures and can be used in perfumes, cosmetics, and preparations.
【０００３】 これまでは、キイチゴがこの分子の唯一の利用可能な供給源であるとされてき
たが、キイチゴで見出される濃度が極めて低く（キイチゴジュース１リットル当
たり０．１〜０．２mg）、この果実の価格がその工業的利用の大きな障害となっ
ている。実際に、キイチゴ５００kgを抽出しても、フランビノンは２５種類の他
成分と混合したものが１０mgしか得ることができないのである(Clarke, 1992)。Until now, strawberry has been considered to be the only available source of this molecule, but the concentrations found in strawberry are very low (0.1-0.2 mg per liter of strawberry juice), The price of this fruit is a major obstacle to its industrial use. In fact, extracting 500 kg of raspberry yields only 10 mg of flavinone mixed with 25 other components (Clarke, 1992).
【０００４】 この分子の製造業者が少なく、この化合物の需要が増してきており、芳香の印
象に関して本当にフランビノンに取って代わり得る代替分子がなく(Clarke, 199
2)、出発材料が変動するため、同一分子の化学合成の価格が高く、消費者が自然
食品に対する嗜好性を有するため、この化合物の他の製造法が注目されている。[0004] Due to the small number of manufacturers of this molecule and the increasing demand for this compound, there is no alternative molecule that can really replace flavinone in terms of aroma impression (Clarke, 199
2) Since the starting materials vary, the price of chemical synthesis of the same molecule is high, and consumers have a preference for natural foods. Therefore, other production methods of this compound are attracting attention.
【０００５】 先行技術では、幾つかの非合成的経路によるフランビノンの製造法が見出され
ている。例えば、Ayer and Singer, 1980は、糸状菌によりフランビノンを生合 成する方法を報告している。しかしながら、この自然法は、有益とは思われない
。もう一つの方法は、フランビノールからフランビノンの合成であり、実際にフ
ランビノール（パラ−ヒドロキシフェニルブタン−２−オール）は、天然の状態
では様々な植物に含まれている。これは、シャクナゲの葉で最初に確認されたも
のであり(Archangelsky, 1901)、二番目にカンバの内樹皮で確認された(Sosa, 1
935)。従って、この化合物は、通常はロードデンドロールおよびベチュリゲノー
ルと呼ばれている。カンバの樹皮では、これは本質的にグルコシド形態での結合
状態で見出されている（３−（パラ−ヒドロキシフェニル）−１ メチルプロピ
ル−β−Ｄ−グルコピラノシド）。他のグリコシドもアピオシル−β−Ｄ−グル
コシドおよびアラビノシル−β−Ｄ−グルコシドなどがシラカンバ(Betula)属で
確認されているが(Smite, Lundgren and Anderson, 1993)、グルコシドが主要で
あると思われる。[0005] In the prior art, methods for producing flavinone by several non-synthetic routes have been found. For example, Ayer and Singer, 1980, describe a method for synthesizing flavinone by filamentous fungi. However, this natural law does not seem beneficial. Another method is the synthesis of flavinone from flavinol, in fact flavinol (para-hydroxyphenylbutan-2-ol) is naturally found in various plants. It was first identified in rhododendron leaves (Archangelsky, 1901) and second in birch inner bark (Sosa, 1
935). Therefore, this compound is commonly called rhododendrol and beturigenol. In birch bark this is found essentially in a linked form in glucoside form (3- (para-hydroxyphenyl) -1 methylpropyl-β-D-glucopyranoside). Other glycosides such as apiosyl-β-D-glucoside and arabinosyl-β-D-glucoside have been identified in the genus Betula (Smite, Lundgren and Anderson, 1993), but glucosides appear to be the major .
【０００６】 フランビノールは、２種類の鏡像異性体形態、すなわちＲ型（（−）ロードデ
ンドロールまたは（−）ベチュリゲノール）と、他方のＳ型（（＋）ロードデン
ドロールまたはＤ−ベチュリゲノール）で存在する。しかしながら、これらの２
種類の鏡像異性体は、従来の化学合成の際には等しい比率（ラセミ混合物）で得
られるが、天然起源の生成物、特にカンバ樹皮の抽出物では、ＲおよびＳ異性体
は様々な比率で見出され、Ｒ異性体の方が見出されることが多い。[0006] Flambinol exists in two enantiomeric forms, the R form ((-) rhododendrol or (-) bethuligenol) and the other S form ((+) rhododendrol or D-betuligenol). I do. However, these two
The enantiomers are obtained in equal proportions (racemic mixture) during conventional chemical synthesis, but in products of natural origin, especially extracts of birch bark, the R and S isomers are present in varying ratios. The R isomer is often found.
【０００７】 欧州特許出願第０７０７０７２号明細書は、アルコールデヒドロゲナーゼ活性
を有する酵素の作用によってフランビノールから酵素的に出発するフランビノン
の製造法に関し、酵素系を用いるベチュロシドの加水分解によってフランビノー
ルを製造するには、これもまた条件が付けられている。この発明の好ましい態様
では、生物転換の前にフランビノールを抽出する。従って、記載されているこの
方法は極めて複雑であり、得られる収率は極めて低く、０．５ｇ／ｌ未満である
。EP-A-0 707 072 relates to a process for the preparation of flavinone, which enzymatically starts from flavinol by the action of an enzyme having alcohol dehydrogenase activity, for the production of flavinol by hydrolysis of betuloside using an enzyme system. , Which is also conditional. In a preferred embodiment of the invention, the flavinol is extracted before the bioconversion. The process described is therefore very complicated and the yields obtained are very low, less than 0.5 g / l.
【０００８】 フランス国特許２７２８８９７号明細書には、ＮＡＤ＋の存在下でＨＬＡＤＨ
による接触酸化を用いるフランビノールからフランビノンの製造法が記載されて
おり、ＨＬＡＤＨは無細胞製剤形態で用いられるウマ肝臓由来の酵素である。ま
た、フランビノールは、植物抽出物から調製することができるが、これは生物転
換の前に精製しなければならない。２段階でのこの方法は、以前に報告された方
法と同じ欠点を有している。[0008] French Patent 2,728,897 describes HLADH in the presence of NAD +.
A process for the production of flavinone from flavinol using catalytic oxidation by HLADH is described, wherein HLADH is an enzyme from horse liver used in a cell-free formulation. Also, furbinol can be prepared from plant extracts, which must be purified before biotransformation. This method in two steps has the same disadvantages as the method reported previously.
【０００９】 本発明は、ある種の微生物、具体的には酵母、特にPichia属の酵母は、 ・２種類の細胞外β−グルコシダーゼおよびＳＡＤＨ（第二アルコールデヒ
ドロゲナーゼ）活性を有し、 ・これら２種類の活性は同一培地で発現することができ、 ・この同時発現により、工程が簡略化されるだけでなく、フランビノンの収
率も非常に大きく増加する という事実の証明に基づいている。[0009] The present invention provides that certain microorganisms, specifically yeasts, especially yeasts of the genus Pichia , have two types of extracellular β-glucosidase and SADH (secondary alcohol dehydrogenase) activities; The different activities can be expressed in the same medium, and this is based on the proof that the co-expression not only simplifies the process but also greatly increases the yield of flavinone.
【００１０】 このため、本発明は、フランビノンの製造法であって、フランビノールグルコ
シドを含む培地のフランビノンへの生物転換を、 ・β−グルコシダーゼ活性、および ・ＳＡＤＨ（第二アルコールデヒドロゲナーゼ）活性 を有する酵母の菌株を用いて行い、 生物転換の後に、フランビノンを培地から分離する ことを特徴とする、方法に関する。[0010] Therefore, the present invention relates to a method for producing flavinone, which comprises converting a medium containing flavinol glucoside into flavinone by: β-glucosidase activity; and SADH (second alcohol dehydrogenase) activity. The present invention relates to a method for isolating flavinone from a culture medium after biotransformation using a yeast strain having the yeast strain.
【００１１】 上記のように、本発明は、ある種の酵母、特にPichia属の酵母が頻繁に誘導可
能(Blondin et al., 1983)でありかつ細胞外の（培地またはペリプラズムに排泄
された）β−グルコシダーゼ活性を有し、グリコシル化テルペノイド芳香性物質
の放出法に既に報告されているように(Gunata et al., 1990)、細胞を基質と接 触させるだけで加水分解を行うことができることの証明に基づいている。本発明
による酵母はＳＡＤＨ活性も有し、好ましくはＰＡＤＨ活性を全くまたはほとん
ど持たない。酵母を含む多くの生物は、アルコール官能基Ｒ１−ＣＨＯＨ−Ｒ２
をケトンまたはアルデヒド官能基Ｒ１−ＣＯ−Ｒ２に酸化することができるアル
コールデヒドロゲナーゼＡＤＨ活性を有する。この活性に関与する酵素の特異性
は、本質的に基Ｒ１およびＲ２の性質によって変化する。ＡＤＨによって触媒さ
れた反応は、補助因子ＮＡＤまたはＮＡＰＤの酸化還元と対になっている。Sacc haromyces cerevisiae は、イソ酵素ＡＤＨ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３）で
あって、その活性が第一アルコール（Ｒ２＝Ｈ）に、更に具体的にはエタノール
（Ｒ１＝ＣＨ３）に特異的であるを有する。これらのＡＤＨは基質範囲が極めて
狭く、それらの活性は、鎖（Ｒ１）の長さが増加すると急激に低下し、またそれ
らはベンジルアルコールやシクロヘキサノールのような第二アルコールまたは環
状アルコールには作用しない(Ciriacy, 1997)。しかしながら、S. cerevisiaeは
フランビノンのような他の基質をフランビノール(Das et al., 1993)または長鎖
アルコール(Rochs and Azoulay, 1969)へ還元することができるが、その逆はこ れまでのところは知られておらず、上記の還元反応はイソ酵素ＡＤＨの活性と全
く関連性がない。逆に、主要な活性ＡＤＨとしては、他の酵素は、第二アルコー
ルに対して第二アルコールデヒドロゲナーゼＳＡＤＨ活性を有する（Ｒ１および
Ｒ２はＨではない）(Rehm and Reed, 1987)。この型の酵素は、精製したときに 、第二脂肪族（非芳香族）アルコールに対して強い親和性を有し、また相当する
第一アルコールに対しては無効である。これらは、典型的には第二アルコールの
官能基に対して特異的でありかつ第一アルコールには作用しないＳＡＤＨこうそ
であり、これがまさに本発明が求めている活性である。これらの酵素は、基質の
酸化と平行して還元される補助因子ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋の存在を必要とす
る。これらの酵素を反応装置で用いるときには、補助因子再生系を加えることが
必須である。文献に引用されている多くの例により、補助因子の利用可能性がこ
の型の酵素を必要とする生物転換反応の重要なようその一つであることを確かめ
ることができる。本発明で推奨されている完全な細胞を用いるときには、生物転
換の収率は、 内在性補助因子の還元がフランビノールのフランビノンへの酸化に最適とな
る、内在性補助因子の濃度、 細胞によって酸化可能な他のアルコールの存在（補助因子の望ましくない消
費） などの幾つかの条件によって変化する。As noted above, the present invention relates to the discovery that certain yeasts, particularly those of the genus Pichia , are frequently inducible (Blondin et al., 1983) and extracellular (excreted in the medium or periplasm). Hydrolysis can be performed simply by contacting the cells with the substrate, as previously reported in the release of glycosylated terpenoid aromatics with β-glucosidase activity (Gunata et al., 1990). Based on the proof of. Yeasts according to the invention also have SADH activity, preferably no or little PADH activity. Many organisms, including yeast, have the alcohol function R1-CHOH-R2
Has an alcohol dehydrogenase ADH activity capable of oxidizing to a ketone or aldehyde function R1-CO-R2. The specificity of the enzymes involved in this activity depends essentially on the nature of the groups R1 and R2. The reaction catalyzed by ADH is paired with the redox of the cofactor NAD or NAPD. Sacc haromyces cerevisiae is an isoenzyme ADH (ADH1, ADH2, ADH3) whose activity is specific for primary alcohols (R2 = H), and more specifically for ethanol (R1 = CH3) . These ADHs have a very narrow substrate range, their activity decreases sharply with increasing chain (R1) length, and they act on secondary or cyclic alcohols such as benzyl alcohol and cyclohexanol. No (Ciriacy, 1997). However, S. cerevisiae can reduce other substrates such as flavinone to frambinol (Das et al., 1993) or long-chain alcohols (Rochs and Azoulay, 1969), and vice versa. Is not known, and the above reduction reaction is completely unrelated to the activity of the isoenzyme ADH. Conversely, as the predominantly active ADH, other enzymes have secondary alcohol dehydrogenase SADH activity on secondary alcohols (R1 and R2 are not H) (Rehm and Reed, 1987). This type of enzyme, when purified, has a strong affinity for secondary aliphatic (non-aromatic) alcohols and is ineffective for the corresponding primary alcohols. These are SADH ligands which are typically specific for the functional group of the secondary alcohol and do not act on the primary alcohol, which is exactly the activity sought by the present invention. These enzymes require the presence of cofactors NAD + or NADP +, which are reduced in parallel with the oxidation of the substrate. When using these enzymes in a reactor, it is essential to add a cofactor regeneration system. The numerous examples cited in the literature make it possible to confirm that the availability of cofactors is an important one of the biotransformation reactions which require this type of enzyme. When using the intact cells recommended in the present invention, the biotransformation yield is such that the endogenous cofactor reduction is optimal for the oxidation of franvinol to franbinone, the concentration of endogenous cofactor, oxidizable by the cell. It depends on several conditions, such as the presence of other alcohols (undesired consumption of cofactors).
【００１２】 フランビノールグルコシドを含む培地の製造法も本発明による方法の重要な特
徴の一つを構成するのは、この理由である。[0012] It is for this reason that the process for the production of a medium containing flavinol glucoside also constitutes an important feature of the process according to the invention.
【００１３】 上記のように、本発明は、フランビノールグリコシド（フランビノンの前駆体
）、更に詳細にはフランビノールグルコシドのフランビノンへの単一工業的段階
で高収率での生物転換法であって、上記前駆体を少なくとも２種類のβ−グルコ
シダーゼと第二アルコールデヒドロゲナーゼＳＡＤＨ活性を同時に含む酵母と接
触させることを特徴とする方法に関する。β−グルコシダーゼ活性は、フランビ
ノールグルコシドをグルコースとフランビノールとに加水分解する。ＳＡＤＨ活
性は、フランビノールのアルコール官能基をケトン官能基に酸化して、フランビ
ノンを生成する。As mentioned above, the present invention is directed to a process for the biotransformation of flavinol glycosides (precursors of flavinone), more particularly frambinol glucosides, to flavinone in a single industrial step in high yield. And a method comprising contacting the precursor with a yeast simultaneously containing at least two kinds of β-glucosidase and a secondary alcohol dehydrogenase SADH activity. β-Glucosidase activity hydrolyzes flavinol glucoside to glucose and flavinol. SADH activity oxidizes the alcohol function of furbinol to a ketone function to produce furbinone.
【００１４】 本発明の生物転換法に用いる菌株は、好ましくはPichia属、特にPichia farin osa の菌株、好ましくはPichia farinosa PR-L201およびPR-L201-1である。[0014] Strains used for the biotransformation process of the present invention is preferably a Pichia genus, in particular strains of Pichia farin osa, preferably Pichia farinosa PR-L201 and PR-L201-1.
【００１５】 ２種類のβ−グルコシダーゼとアルコールデヒドロゲナーゼ活性を同時に有す
る菌株は、多数の国際コレクションおよび天然から単離された菌株の中から見出
された菌株から出発して選択することができる。本発明による菌株の選択法は、
例で説明する。[0015] Strains that simultaneously have two types of β-glucosidase and alcohol dehydrogenase activities can be selected starting from strains found in a number of international collections and strains isolated from nature. The method for selecting a strain according to the present invention comprises:
An example will be described.
【００１６】 出発菌株として、β−グルコシダーゼ活性を有する菌株を、必要ならば適当な
クロモゲン、例えばｐ−ニトロフェニルグルコシドを用いてこの活性を試験する
ことによって、用いる。次に、外因性β−グルコシダーゼ活性を有する菌株を、
ＳＡＤＨ活性について試験する。例えば、フランビノールを転換する能力を試験
し、フランビノンケトンの存在を試験することができるが、他の第二アルコール
性基質を用いることもできる。As starting strain, a strain having β-glucosidase activity is used, if necessary, by testing this activity with a suitable chromogen, for example p-nitrophenylglucoside. Next, a strain having exogenous β-glucosidase activity was
Test for SADH activity. For example, the ability to convert flavinol can be tested, and the presence of flavinone ketone can be tested, but other secondary alcoholic substrates can be used.
【００１７】 試験した菌株の中では、適当な薬剤によってまたは適当な菌株の選択の機会を
増加する目的で下記に記載する指定手法によって突然変異を行うことができる。Among the strains tested, the mutations can be made by means of suitable agents or by means of the designation techniques described below with the aim of increasing the opportunity for selection of suitable strains.
【００１８】 以下において用いられる菌株Pichia farinosaはPR-L201と呼ばれており、天然
から単離されたものである。しかしながら、この菌株は、ＳＡＤＨ活性の他に、
ＰＡＤＨ活性有しており、第一アルコールに対する活性もＮＡＤによって変化し
、補助因子を消費するので、問題となる。これが、ＰＡＤＨ活性をほとんどまた
は全く持たない菌株の使用が重要であることの理由である。The strain Pichia farinosa used below is called PR-L201 and has been isolated from nature. However, this strain, besides SADH activity,
It has PADH activity and its activity on primary alcohol is also changed by NAD and consumes cofactors, which is problematic. This is why the use of strains with little or no PADH activity is important.
【００１９】 このような菌株を得るため、グリセロールを含む培地でアリルアルコールに対
する耐性を用いる例１に記載の方法を用いることができる。To obtain such a strain, the method described in Example 1 using resistance to allyl alcohol in a medium containing glycerol can be used.
【００２０】 本発明による好ましい菌株は、Pichia farinosaはPR-L201およびPR-L201-1の 菌株であって、非常に興味深いことには同時にβ−グルコシダーゼおよびアルコ
ールデヒドロゲナーゼＡＤＨ活性のレベルを示し、かつPR-L201-1については、 ＳＡＤＨ活性とごく僅かなＰＡＤＨ活性を有する。本発明による方法では、用い
られる菌株は、非発酵性炭素源、特にグリセロール、エタノール、メタノールま
たはイソプロパノール、またはそれらの混合物を用いることによってβ−グルコ
シダーゼ活性を誘導した培地由来のものであり、この培地はグルコースを含まな
い。[0020] A preferred strain according to the invention is that Pichia farinosa is a strain of PR-L201 and PR-L201-1, and very interestingly simultaneously exhibits the level of β-glucosidase and alcohol dehydrogenase ADH activity, and -L201-1 has SADH activity and very little PADH activity. In the method according to the invention, the strain used is derived from a medium in which β-glucosidase activity has been induced by using a non-fermentable carbon source, in particular glycerol, ethanol, methanol or isopropanol, or a mixture thereof. Does not contain glucose.
【００２１】 好ましくは、用いられる菌株は、指数増殖期の終わりまたは静止期の始めに選
択される。生物転換は、細胞密度が１０７個／mlを上回り、好ましくは１０８個
／mlの程度で行う。[0021] Preferably, the strain used is selected at the end of the exponential growth phase or at the beginning of the stationary phase. Bioconversion the cell density exceeds 10 7 / ml, preferably at the degree of 10 8 / ml.
【００２２】 本発明による方法のもう一つの重要な特徴は、フランビノール前駆体の起源で
ある。Another important feature of the process according to the invention is the origin of the franbinol precursor.
【００２３】 上記のように、フランビノール前駆体を含む幾つかの植物、特にシャクナゲお
よびカンバがある。本発明によれば、カンバ樹皮の抽出物、特に８０℃未満、好
ましくは６０℃未満、一般的には少なくとも４０℃の温度で得られる水性抽出物
を用いるのが好ましい。低温で得られるこの型の水性抽出物では、抽出生成物が
分解されずまた内在性のβ−グルコシダーゼ活性を保持することができる。As mentioned above, there are several plants, including rhododendron and birch, that contain the franbinol precursor. According to the invention, preference is given to using extracts of birch bark, in particular aqueous extracts obtained at a temperature below 80 ° C., preferably below 60 ° C., generally at least 40 ° C. In this type of aqueous extract obtained at low temperatures, the extract product is not degraded and can retain endogenous β-glucosidase activity.
【００２４】 前駆体をある種の供給源に限定しようとするものではないが、特にＲ異性体の
濃度が高い種、すなわちBetula alba、Betula chichibuensis、Betula nana、お
よびBetula populifoliaを挙げることができる。While not intending to limit the precursors to any particular source, it is particularly contemplated that species having a high concentration of the R isomer, such as Betula alba , Betula chichibuensis , Betula nana , and Betula populifolia Can be mentioned.
【００２５】 本発明のもう一つの有利な態様によれば、フランビノンの前駆体であるカンバ
の樹皮の抽出物は精製される。これにより、特に抽出物中のβ−グルコシダーゼ
およびＡＤＨ酵素の阻害剤を除去し、生物転換を最適にすることができる。精製
は、好ましくは樹脂、例えばグリコシドを固定する樹脂、例えば疎水性のアニオ
ン交換樹脂のカラム上でのクロマトグラフィーによって行う。溶出は、水に１０
〜２０％のアルコールを含むアルコール性溶液に続いて生物転換の前に可能な濃
度の溶離液で行うことができる。According to another advantageous embodiment of the invention, the extract of birch bark, which is a precursor of flavinone, is purified. This makes it possible, in particular, to remove the inhibitors of β-glucosidase and ADH enzymes in the extract and to optimize the biotransformation. The purification is preferably carried out by chromatography on a column of a resin, for example a resin that fixes the glycosides, for example a hydrophobic anion exchange resin. Elution is 10 to water
This can be done with an alcoholic solution containing ２０20% alcohol, followed by a possible concentration of eluent before bioconversion.
【００２６】 生物転換培地に含まれるフランビノンは、任意の適当な手続きによって、特に
適当な有機溶媒による抽出によって抽出することができる。このような抽出／精
製の収率は５０〜１００％であり、更に詳細には純粋なもので９０％程度であり
、これは先行技術に記載されている手法と比較して明らかに有利である（欧州特
許第０７０７０７２号明細書の例５を参照されたい。この例でのベチュロシドの
抽出収率は約７７％に過ぎない）。フランビノールグルコシドの濃度増加の水準
は約１０倍であり、これにより既知の手法より少ないバイオマスの量を用いるこ
とができる（欧州特許第０７０７０７２号明細書の例９を参照されたい。濃度増
加＝２倍）。同様に、本発明の生物転換の比率は１００％であり、フランス国特
許第９４１５８４８号明細書についてのそれは８０％に過ぎない。[0026] Flambinone contained in the biotransformation medium can be extracted by any suitable procedure, especially by extraction with a suitable organic solvent. The yield of such extraction / purification is 50-100%, more particularly of the order of 90% pure, which is clearly an advantage compared to the procedures described in the prior art. (See Example 5 of EP 0707 072, in which the extraction yield of betuloside is only about 77%). The level of increase in the concentration of flavinol glucoside is about 10-fold, so that a smaller amount of biomass can be used than in known procedures (see Example 9 of EP 0707 072; concentration increase = 2 times). Similarly, the bioconversion rate of the present invention is 100%, which is only 80% for French Patent No. 9415848.
【００２７】 従って、菌株Pichia farinosa PR-L201、その突然変異体、特にPR-L201-1、お
よびその抽出／精製法により、高生物転換率および単一の工業的段階での経済的
方法が得られる。これらの菌株の使用はフランビノンの製造法に限定されず、実
際にPR-L201およびPR-L201-1はグリコシド誘導体の加水分解および第一およびと
りわけ第二アルコールの官能基の酸化からなるあらゆる化合物の変換法に用いる
ことができる。[0027] Thus, the strain Pichia farinosa PR-L201, its mutants, especially PR-L201-1, and its extraction / purification method provide a high bioconversion rate and an economical method in a single industrial step. Can be The use of these strains is not limited to the production of flavinone; in fact, PR-L201 and PR-L201-1 can be used to synthesize any compound consisting of the hydrolysis of glycoside derivatives and the oxidation of functional groups of primary and especially secondary alcohols. It can be used for conversion methods.
【００２８】 図を参照して、以下の説明および例について説明する。The following description and examples will be described with reference to the drawings.
【００２９】 菌株PR-L201の同定 菌株PR-L201は、同時に酵母の分類学で従来から用いられている試験により(Ba
rnett et al., 1990)、およびS. cerevisiaeの染色体の研究で用いられかつこの
菌株に適用された方法(Kaiser et al., 1994)による電気泳動的核型(electropho
retic karyotype)の確立によって同定した。同定試験および核型の結果をＣＢＳ
(Centraal Bureau voor Schimmelcultures Cultures，デルフト，オランダ国） から得た２種類の菌株から得られるものを比較したところ、PR-L201はPichia fa rinosa 種に属する菌株であることを示唆している（下記の表１および図１参照）
。Identification of Strain PR-L201 Strain PR-L201 was simultaneously determined by tests conventionally used in yeast taxonomy (Ba
rnett et al., 1990), and an electrophoretic karyotype (electrophophore) by the method used in chromosome studies of S. cerevisiae and applied to this strain (Kaiser et al., 1994).
retic karyotype). Identification tests and karyotyping results for CBS
Comparison of the two strains obtained from (Centraal Bureau voor Schimmelcultures Cultures, Delft, The Netherlands) suggests that PR-L201 is a strain belonging to the species Pichia fa rinosa (see below). (See Table 1 and Fig. 1)
.
【００３０】[0030]
【表１】 [Table 1]
【００３１】 表１：Barnett et al., 1990によるPichia farinosa種の同定。菌株CBS185、CBS
5013およびPR-L201を用いて得た結果の比較。Table 1: Identification of Pichia farinosa species by Barnett et al., 1990. Strain CBS185, CBS
Comparison of results obtained with 5013 and PR-L201.
【００３２】 PR-L201およびPR-L201-1の酵素活性および基質特異性 PR-L201では、培地がグリセロール、エタノール、メタノール、イソプロパノ ール、またはこれらの分子の混合物などの炭素源を含むときには、β−グルコシ
ダーゼ活性が誘導される。グルコースが単独でまたは上記炭素源の存在下で用い
られるときには、β−グルコシダーゼ活性は誘導されない（下記の表２参照）。Enzyme activity and substrate specificity of PR-L201 and PR-L201-1 For PR-L201, when the medium contains a carbon source such as glycerol, ethanol, methanol, isopropanol, or a mixture of these molecules, β-glucosidase activity is induced. When glucose is used alone or in the presence of the carbon source, no β-glucosidase activity is induced (see Table 2 below).
【００３３】[0033]
【表２】 [Table 2]
【００３４】表２ ：ｐＮＰＧを基質として用いて得た特異的β−グルコシダーゼ活性。値は、
μＭ／ｍｎ／ｍｇで表したもの。３０時間培養物。ＹＰ＝１％酵母エキス，１％
ペプトン。 Table 2 : Specific β-glucosidase activity obtained using pNPG as substrate. value is,
Expressed in μM / mn / mg. 30 hour culture. YP = 1% yeast extract, 1%
peptone.
【００３５】 図２ａおよび２ｂは、成長過程におけるβ−グリコシダーゼ活性の発生を示す
。菌株PR-L201の生物転換能力は、培養物の成長相並びに使用炭素源によって変 化するＡＤＨ活性レベル（フランビノールの酸化）によって変化する（下記の図
２ｃおよび２ｄ参照）。FIGS. 2 a and 2 b show the development of β-glycosidase activity during the growth process. The biotransformation capacity of the strain PR-L201 varies depending on the growth phase of the culture as well as the level of ADH activity (oxidation of franbinol) which varies with the carbon source used (see Figures 2c and 2d below).
【００３６】 酵母によるフランビノールグルコシドのフランビノンへの二段階変換を、生物
転換培地の直接ＨＰＬＣ分析によって行った（下記の図３ｄ参照）。生物転換に
必要な細胞を用いるのは、２種類の活性が最大になる瞬間である。Blondin et a
l., 1983により完全な細胞で測定したβ−グルコシダーゼ活性は、培養物が指数
増殖期の終了時に最大値になる。同様に、Bergmeyer, 1970によって無細胞抽出 物で測定開始したフランビノールでのＡＤＨ活性は、この同じ成長期に最大値に
達する。異なる年齢の細胞を用いて行った身精製カンバ抽出物の生物転換によっ
て、イン・ビトロで得た観察が確かめられる（下記の図４参照）。更に正確には
、PR-L201のβ−グルコシダーゼ活性によって遊離したフランビノールの生物転 換は、ＮＡＤ＋に依存するＳＡＤＨ活性の存在によって行われる。同時に、これ
も同様にＮＡＤ＋依存性であるＰＡＤＨ活性の存在が、観察される。このことは
、「漏出」突然変異体である菌株PR-L201-1であって、第一アルコールについて はＰＡＤＨ活性が極端に減少し、またそれにも拘わらず第二アルコールについて
は正常なＳＡＤＨ活性およびフランビノールをフランビノンへ転換する能力が保
存されるものの取得によって示すことができた（下記の５図参照）。第二アルコ
ールおよびフランビノールには不活性であるが、菌株PR-L201のＰＡＤＨ活性は 不利なものと考えることができ、木材抽出物に含まれる第一アルコールの酸化に
よって内在性ＮＡＤ＋の消費を不必要に増加するからである。PR-L201-1を使用 することにより、精製または未精製カンバ抽出物でのフランビノールの酸化収率
を向上させることができる。更に、所定条件下でのPR-L201-1突然変異体のβ− グルコシダーゼ活性の水準も増加する（上記の表２参照）。The two-step conversion of flavinol glucoside to flavinone by yeast was performed by direct HPLC analysis of the biotransformation medium (see FIG. 3d below). The cells required for bioconversion are used at the moment when the two activities are maximized. Blondin et a
The β-glucosidase activity measured in intact cells according to l., 1983, is at a maximum at the end of the exponential phase of the culture. Similarly, the activity of ADH on franbinol, measured by Bergmeyer, 1970 on cell-free extracts, reaches a maximum during this same growth phase. Biotransformation of the purified birch extract with cells of different ages confirms the observations obtained in vitro (see FIG. 4 below). More precisely, the bioconversion of flavinol released by the β-glucosidase activity of PR-L201 is effected by the presence of NAD + -dependent SADH activity. At the same time, the presence of PADH activity, which is also NAD + dependent, is observed. This indicates that the "leakage" mutant, strain PR-L201-1, has an extremely reduced PADH activity for primary alcohols and nevertheless normal SADH activity and secondary alcohols. The ability to convert franbinol to flavinone could be demonstrated by the acquisition of a conserved one (see Figure 5 below). Although it is inactive against secondary alcohols and furbinols, the PADH activity of strain PR-L201 can be considered disadvantageous, and the consumption of endogenous NAD + is not required by oxidation of primary alcohols contained in wood extracts. It is because it increases. By using PR-L201-1, the oxidation yield of flavinol in purified or unpurified birch extract can be improved. In addition, the level of β-glucosidase activity of the PR-L201-1 mutant under certain conditions also increases (see Table 2 above).
【００３７】 PR-L201はフランビノール、更に正確にはフランビノールのＲ異性体に対して ＡＤＨ活性を有する。このことを、 ・生物転換培地に含まれる合成フランビノール（ラセミ混合物）の約５０％の系
統的酸化（初期濃度０．０５ｇ／ｌ〜４ｇ／ｌ）、 ・キラルカラムを用いる気相クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるフランビノー
ルの２種類の鏡像異性体の分離、 ・菌株PR-L201によって転換した鏡像異性体の性質のＮＭＲによる同定 によって明らかにすることができた（下記の表３参照）。PR-L201 has ADH activity on flavinol, more precisely the R isomer of flavinol. This means that:-Systematic oxidation of about 50% of the synthetic flavinol (racemic mixture) contained in the biotransformation medium (initial concentration 0.05 g / l to 4 g / l)-Gas phase chromatography (GPC) using a chiral column Separation of the two enantiomers of franbinol by HPLC.-The identity of the enantiomers converted by the strain PR-L201 could be revealed by NMR identification (see Table 3 below).
【００３８】 これらの結果により、Ｒ異性体の濃度が高いフランビノールグルコシドの供給
源の使用を選択することが正しいものと判断された。木材抽出物に含まれるある
種の未同定化合物は、細胞が成長する培地に応じてフランビノールに対するPR-L
201のイン・ビトロでのＳＡＤＨ活性を強力に阻害する（下記の図９参照）。同 様に、イン・ビボでは、PR-L201-1によるフランビノールのフランビノンへの生 物転換は、木材抽出物の化合物によって阻害される。これは、様々な抽出物の生
物転換の後に得られた酸化収率を比較することによって明らかにされる（下記の
表３参照）。From these results, it was concluded that choosing to use a source of furbinol glucoside with a high concentration of the R isomer was correct. Certain unidentified compounds in wood extracts contain PR-L for flavinol, depending on the medium in which the cells are grown.
Strongly inhibits SADH activity in vitro at 201 (see Figure 9 below). Similarly, in vivo, the conversion of franbinol to flavinone by PR-L201-1 is inhibited by compounds in wood extracts. This is demonstrated by comparing the oxidation yields obtained after biotransformation of the various extracts (see Table 3 below).
【００３９】[0039]
【表３】 [Table 3]
【００４０】表３ ：様々な条件下でのフランビノンのモル酸化収率および生産。菌株PR-L201 およびPR-L201-1（Ｙｐｉｐ培地での３０時間の前培養：１％酵母エキス、１％ ペプトン、炭素源としての１％イソプロパノール。カンバ抽出物は、下記の方法
で得た：Ａ 樹皮２０ｇを水１００ml中で４０℃にて１時間浸出による；Ｂ 樹
皮６００ｇを３リットル中で浸出した後、ＩＲＡ ９３ＳＰ樹脂０．５リットル
上で、精製当たり輸液１リットルの流速での３回の連続クロマトグラフィー段階
での濾液の精製；Ｃ 浸出した樹皮２００ｇを１リットル中で浸出した後、ＩＲ
Ａ９３ＳＰ樹脂０．５リットル上で精製）。 Table 3 : Molar oxidation yield and production of flavinone under various conditions. Strains PR-L201 and PR-L201-1 (30 h preculture in Ypip medium: 1% yeast extract, 1% peptone, 1% isopropanol as carbon source. Birch extract was obtained by the following method: A by leaching 20 g of bark in 100 ml of water at 40 ° C. for 1 hour; B. After leaching 600 g of bark in 3 liters, three times on 0.5 liter of IRA 93SP resin at a flow rate of 1 liter of infusion per purification. Purification of the filtrate in a continuous chromatography step: C. After leaching 200 g of leached bark in 1 liter, the IR
Purified on 0.5 liter of A93SP resin).
【００４１】 イン・ビトロでは、この阻害は、突然変異体PR-L201-1では、遙かに顕著でな くなる。部分精製したカンバ抽出物での生物転換性能により、これらの観察が確
認される（下記の図３ｃ参照）。B. alba樹皮のグリコシド抽出物の調製は、下 記の方法で行った：樹皮片０．２kgを水１リットル中で４０℃で１時間浸軟した
。不溶性残渣を濾過によって除去した後、抽出物を予め水およびエタノールで洗
浄したＩＲＡ９３ＳＰ樹脂０．５リットルのカラムに載荷する。次に、カラムを
洗浄水１．５リットルで溶出した後、１５％アルコール／水２リットルで溶出す
る。この最後の溶出物がグリコシド抽出物を構成する。これを、次に部分真空下
にて４０℃の濃縮装置で１０倍に濃縮し、生物転換に直接使用する。樹脂は、純
エタノールおよび水で連続洗浄して再コンディショニングした後、上記と同じ手
続きに従って更に２回再使用する。このようにして、B. alba樹皮０．６kgから 出発して、０．６リットルでグリコシド２．５ｇが得られる。抽出温度が低い点
に留意することが重要であり、これにより、転換される抽出物が精製されていな
い場合には、植物の内在性β−グルコシダーゼ活性が保存される。樹脂カラム上
でのクロマトグラフィーによって精製したカンバ抽出物を使用することにより、
先行技術の方法に関してかなり改良が見られる。実際に、精製段階は、In vitro, this inhibition is much less pronounced in mutant PR-L201-1. Biotransformation performance with the partially purified birch extract confirms these observations (see Figure 3c below). The preparation of the glycoside extract of B. alba bark was carried out as follows: 0.2 kg of bark pieces were macerated in 1 liter of water at 40 ° C. for 1 hour. After removing the insoluble residue by filtration, the extract is loaded onto a 0.5 liter column of IRA93SP resin, which has been previously washed with water and ethanol. Next, the column is eluted with 1.5 liter of washing water and then with 2 liter of 15% alcohol / water. This last eluate constitutes the glycoside extract. This is then concentrated 10-fold in a 40 ° C. concentrator under partial vacuum and used directly for bioconversion. The resin is continuously washed with pure ethanol and water, reconditioned, and then reused two more times according to the same procedure described above. In this way, starting from 0.6 kg of B. alba bark, 2.5 g of glycoside are obtained in 0.6 liter. It is important to note that the extraction temperature is low, which preserves the plant's endogenous β-glucosidase activity if the extract to be converted is not purified. By using birch extract purified by chromatography on a resin column,
Significant improvements are seen over prior art methods. In fact, the purification step
【００４２】 ・用いられる植物材料の濃度がどのようなものでも、生物転換培地の前駆体の濃
度を所定の値に調整することができ、従ってWhatever the concentration of plant material used, the concentration of the precursor of the bioconversion medium can be adjusted to a predetermined value,
【００４３】 ・生物転換を高前駆体濃度で行い、バイオマスおよび培地の容積の操作を少なく
することができ、Biotransformation can be performed at high precursor concentrations, reducing manipulation of biomass and medium volumes;
【００４４】 ・菌株PR-L201によるフランビノンの形成収率を向上させることができ（上記の 表３および下記の図３ａ参照）、生物転換の後のキラル分析でも、Ｒ異性体の酸
化がこれらの条件下で９５〜９９％に達することを示しており、The yield of flavinone formation by the strain PR-L201 can be improved (see Table 3 above and FIG. 3a below), and even in chiral analysis after bioconversion, oxidation of the R isomers Under conditions, to reach 95-99%,
【００４５】 ・フランビノールの生物転換の後に得られるフランビノンの精製および簡略化抽
出を行うことができ、The purification and simplified extraction of flavinone obtained after biotransformation of flavinol,
【００４６】 ・特に酵素β−グルコシダーゼおよびＡＤＨに作用する各種の阻害剤を除去する
ことができ（下記の図３ｂおよび３ｃ参照）It is possible in particular to remove various inhibitors acting on the enzymes β-glucosidase and ADH (see FIGS. 3b and 3c below)
【００４７】 ・木材抽出物に含まれる非常に多くの化合物、特にβ−グルコシダーゼおよびＡ
ＤＨ酵素の様々な阻害剤が予め除去されるため、生成したフランビノンの抽出お
よび精製が容易になる（下記の図３ｂおよび３ｃ参照）。β−グルコシダーゼお
よびＡＤＨ活性の重要性は、グリコシド抽出物で示される（下記の図７ｂ参照）
。実際に、グルコシドの前加水分解を外来性のβ−グルコシダーゼ（市販製剤）
によって行うと、収率は上がらず（８０％＝１．６ｇ／ｌ産生ケトン）、工程は
長くなりかつ費用がかかることになると思われる。生物転換が終了したならば、
バイオマスを任意の適当な化学的、物理的または物理化学的方法によって除去し
た後、このようにして生成した芳香性分子を回収する。これは、例えば水と不混
和性の極性溶媒による抽出、膜分離、蒸発、または更に精溜からなることもでき
る。A very large number of compounds contained in wood extracts, in particular β-glucosidase and A
The removal of various inhibitors of the DH enzyme in advance facilitates the extraction and purification of the generated flavinone (see FIGS. 3b and 3c below). The importance of β-glucosidase and ADH activity is shown in the glycoside extract (see FIG. 7b below).
. In fact, the pre-hydrolysis of glucoside is exogenous β-glucosidase (commercial formulation)
Do not increase the yield (80% = 1.6 g / l ketone produced) and would make the process longer and more costly. Once the biotransformation is complete,
After removing the biomass by any suitable chemical, physical or physicochemical method, the aromatic molecules thus formed are recovered. This can consist, for example, of extraction with a polar solvent immiscible with water, membrane separation, evaporation, or even rectification.
【００４８】 本発明は、β−グルコシダーゼおよびＳＡＤＨ活性を有し、特にＰＡＤＨ、好
ましくはＰＡＤＨ０活性をほとんどまたは全く持たないPichia farinosaの菌株 、具体的には菌株Pichia farinosa PR-L201およびPR-L201-1、並びに上記活性を
保持しているそれらの突然変異体にも関する。[0048] The present invention, beta-has a glucosidase and SADH activity, particularly pADH, preferably a strain of Pichia farinosa that little or have any pADH 0 activity, strains specifically Pichia farinosa PR-L201 and PR-L201 -1 as well as those mutants that retain the above activity.
【００４９】 最後に、本発明は、本発明による精製法を用いることによって得られるフラン
ビノールおよびフランビノールグルコシドの精製抽出物、並びに本発明の方法に
よって得られるフランビノンに関する。Finally, the present invention relates to purified flavinol and flambinol glucoside extract obtained by using the purification method according to the present invention, and to flavinone obtained by the method of the present invention.
【００５０】 本発明を行う優先的方法を、以下の例で説明するが、後者は純粋に例示のため
のものであり、制限のためのものではない。The preferred method of practicing the present invention is described in the following examples, the latter being purely illustrative and not limiting.
【００５１】 例１：菌株PR-L201の突然変異体の取得 ＰＡＤＨ活性が改質された突然変異体の単離のプロトコールは、Wills and Ph
elps, 1975によって用いられたものによって奨励されている。このプロトコール
によれば、ＡＤＨＩ、ＡＤＨIIおよびＡＤＨIIIイソ酵素活性を完全に欠いてい るSaccharomyces cerevisiaeのＡＤＨ０（ゼロ）突然変異体を単離することがで
きる（S. cerevisiaeは、これまでに知られているＳＡＤＨ活性を全く持たない ）。Example 1 Obtaining Mutants of Strain PR-L201 The protocol for the isolation of mutants with altered PADH activity is described in Wills and Ph.
encouraged by those used by elps, 1975. According to this protocol, an ADH 0 (zero) mutant of Saccharomyces cerevisiae completely devoid of ADHI, ADHII and ADHIII isoenzyme activities can be isolated (S. cerevisiae has been previously known). No SADH activity).
【００５２】 この原理は、最初はS. cerevisiaeで行ったが、下記のプロトコールに記載さ れているような炭素源としてグリセロールを含む培地でアリルアルコール５０ｍ
Ｍに耐性を示すコロニーの単離によって、Pichia farinosaのＰＡＤＨ突然変異 体を得ることができた。This principle was initially performed in S. cerevisiae, but in a medium containing glycerol as a carbon source as described in the protocol below, 50 ml of allyl alcohol was used.
Isolation of colonies that were resistant to M made it possible to obtain a PADH mutant of Pichia farinosa .
【００５３】 ＹＰＧ培地（１％酵母エキス、１％ペプトン、および２％グルコース）中で１
５０ｒｐｍで攪拌しながら３０℃で１６時間インキュベーションした液体培養物
の２・１０８個の細胞を採取した。遠心分離によって回収した細胞を蒸留水で２
回洗浄し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液，ｐＨ７の１mlに再懸濁した。次に、
細胞懸濁液を順次希釈して、アリルアルコール５０ｍＭを加えたＹＰｇｌｙ固体
培地（１％酵母エキス、１％ペプトン、３％グリセロール、および２％寒天）の
プレート当たり１０５個の細胞を筋状塗布した。次に、塗布した細胞を、殺菌剤
チューブから４０cmの位置でＵＶに暴露することによって２０秒間処理した（Ｕ
Ｖ−Ｃ２５４nm，３０Ｗ，エネルギー：２ｍの距離で６０μＷ・ｃｍ−２）。次
に、プレートを３０℃で３日間インキュベーションし、出現するコロニーを採取
して、試験した。５０ｍＭありるアルコールに安定な耐性を有するものの中では
、菌株PR-L201-1が、野生型菌株PR-L201との比較研究の主題であった（上記の表
２および下記の図５および６参照）。In YPG medium (1% yeast extract, 1% peptone, and 2% glucose)
2 · 108 cells in liquid culture for 16 h at 30 ° C. with stirring at 50rpm was collected. The cells collected by centrifugation are distilled 2 times with distilled water.
Washed twice and resuspended in 1 ml of 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7. next,
The cell suspension was serially diluted and 10 5 cells were streaked per plate of YPgly solid medium (1% yeast extract, 1% peptone, 3% glycerol, and 2% agar) supplemented with 50 mM allyl alcohol. did. The coated cells were then treated for 20 seconds by exposing to UV at 40 cm from the fungicide tube (U
V-C 254 nm, 30 W, energy: 60 μW · cm −2 at a distance of 2 m. The plates were then incubated at 30 ° C. for 3 days and emerging colonies were picked and tested. Among those having a stable resistance to 50 mM alcohol, strain PR-L201-1 was the subject of comparative studies with wild-type strain PR-L201 (see Table 2 above and FIGS. 5 and 6 below). ).
【００５４】 例２：出発材料の特性決定 植物出発材料の前駆体のポテンシャルを、 − 高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって測定したフランビノー
ルグルコシドの含量（→「グルコシド」ポテンシャル）、 − ＨＰＬＣによって測定した酸加水分解によって遊離したフランビノールの
含量（グリコシドの徹底的加水分解→「グリコシド」ポテンシャル）、および − 最後に、酸加水分解によって遊離したフランビノールの異性体組成（→Ｒ
異性体のポテンシャル） によって測定する。Example 2: Characterization of the starting material The potential of the precursors of the plant starting material is determined by:-The content of frambinol glucoside measured by high pressure liquid chromatography (HPLC) (→ "glucoside"potential);-Measured by HPLC Content of flavinol released by acid hydrolysis (exhaustive hydrolysis of glycosides → “glycoside” potential), and finally, the isomer composition of flavinol released by acid hydrolysis (→ R
(Isomer potential).
【００５５】 この分析は、シラカンバ(Betula)の種または考察を行った木材のバッチによっ
て、Ｒ異性体の組成はかなり変動する可能性があることを示しており（例えば、
７〜９９％）、これは、グルコシドの含量について同じである（０〜２３ｇ／kg
付近）（下記の表４参照）。また、ある種のカンバでは、無視し得ないほどのフ
ランビノールグリコシド（グルコシドを除く）の含量を有する（下記の図３ｂを
参照）。遊離状態でのフランビノールの存在が可能であることと同時に、この特
徴によって、加水分解後のグルコシドのモル濃度とフランビノールのモル濃度と
の間の系統的不適正(systematic nonadequation)が説明される。本明細書記載の
方法では、生物転換の後の培地のキラル分析は、考察を行った菌株はカンバ由来
のＲ異性体の総て（９９〜１００％）を変換したことを示している。従って、フ
ランビノンの生成収率は、Ｒ異性体の含量と直接相関した（下記の図８および表
４参照）。This analysis shows that the composition of the R isomer can vary considerably depending on the species of birch ( Betula ) or the batch of wood studied (eg,
7-99%), which is the same for glucoside content (0-23 g / kg).
Around) (see Table 4 below). Also, certain birches have a non-negligible content of furbinol glycosides (excluding glucosides) (see Figure 3b below). At the same time that the presence of flavinol in the free state is possible, this feature explains the systematic nonadequation between the molarity of the glucoside after hydrolysis and the molarity of the flavinol. In the method described herein, chiral analysis of the culture medium after biotransformation indicates that the strain under consideration converted all (99-100%) of the R isomer from birch. Therefore, the production yield of flavinone was directly correlated with the content of the R isomer (see FIG. 8 and Table 4 below).
【００５６】[0056]
【表４】 [Table 4]
【００５７】表４ ：シラカンバ(Betula)属の様々な種由来フランビノールのグルコシドの含量
および異性体組成 １−木材抽出物の直接ＨＰＬＣ分析によって測定したグルコシド、 ２−木材抽出物の酸加水分解後のＨＰＬＣ分析によって測定した総フランビノー
ル、 ３−酸加水分解後のキラルＧＰＣ分析によって測定したＲ異性体の優位性、 ４−測定値２および３によって測定した転換可能なフランビノンのポテンシャル
。 Table 4 : Glucoside content and isomer composition of flavinol from various species of the genus Betula 1-Glucoside determined by direct HPLC analysis of wood extract, 2-Glucoside after acid hydrolysis of wood extract Total flavinol as determined by HPLC analysis, 3-dominance of the R isomer as determined by chiral GPC analysis after acid hydrolysis, 4-potential of convertible flavinone as determined by measurements 2 and 3.
【００５８】 酸化段階とは対照的に、フランビノンのグルコシドの酵母による加水分解は、
ラセミ混合物での比率で２種類の異性体グルコシドを含むカンバの抽出物では(B . fructicosa )、加水分解の９０％が２４時間で観察されるので、選択的ではな い（下記の図９参照）。In contrast to the oxidation step, the hydrolysis of the glucoside of flavinone by yeast is
Birch extract containing two isomeric glucosides in a racemic mixture ( B. fructicosa ) is not selective because 90% of the hydrolysis is observed in 24 hours (see FIG. 9 below). ).
【００５９】 例３：β−グルコシダーゼ活性のイン・ビトロ測定 静止期の開始時の培養物からの細胞を遠心分離し、蒸留水で２回洗浄した後、
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液，ｐＨ７が１ml入っている２ml微量遠沈管に移し
た。Blondin et al., (1983)によるβ−グルコシダーゼ活性の測定は、下記のよ
うに改質した。細胞懸濁液１００μlおよび２．５ｍＭのｐＮＰＧ（パラ−ニト ロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド）１００μlを、２０ｍＭクエン酸−リ ン酸緩衝液，ｐＨ６ ５００μlに加えた。全体を３０℃で１５分間インキュベ ーションした後、１Ｍ炭酸ナトリウム５００μlを加えて反応を停止した。遠沈 管を１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清の吸光度を、ｐＮＰ（パラ−
ニトロフェノール）の吸光度が最大になる波長の４０５nmで記録した。ｐＮＰは
、ｐＮＰＧに対するβ−グルコシダーゼの作用によって生成する。特異的活性を
、ｐＮＰのモル消光係数１７，８９０Ｍ−１・ｃｍ−１を用いて計算した。タン
パク質の濃度を、２Ｎ ＮａＯＨの存在下にて９５℃で抽出した後、ビューレッ
ト法によって測定した。Example 3 In Vitro Measurement of β-Glucosidase Activity Cells from the culture at the beginning of the stationary phase were centrifuged and washed twice with distilled water.
It was transferred to a 2 ml microcentrifuge tube containing 1 ml of 50 mM potassium phosphate buffer, pH7. Measurement of β-glucosidase activity by Blondin et al., (1983) was modified as follows. 100 μl of cell suspension and 100 μl of 2.5 mM pNPG (para-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside) were added to 500 μl of 20 mM citrate-phosphate buffer, pH6. After the whole was incubated at 30 ° C. for 15 minutes, the reaction was stopped by adding 500 μl of 1M sodium carbonate. The centrifuge tube was centrifuged at 14,000 rpm for 1 minute, and the absorbance of the supernatant was measured using pNP (para-
(Nitrophenol) was recorded at 405 nm, the wavelength at which the absorbance was maximized. pNP is produced by the action of β-glucosidase on pNPG. Specific activity was calculated using the molar extinction coefficient of pNP of 17,890 M-1 cm-1. The protein concentration was determined by the burette method after extraction at 95 ° C. in the presence of 2N NaOH.
【００６０】 例４：ＡＤＨ活性のイン・ビトロ測定 静止期の開始時の培養物５０mlを遠心分離し、細胞を蒸留水で２回洗浄した後
、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液，ｐＨ７が１ml入っている２ml微量遠沈管に移
した。一定容積のガラス球を懸濁液に加え、予め氷上で１０分間冷却した全体を
、細胞磨砕装置を用いて１分間激しく攪拌した。液相を回収して１４，０００ｒ
ｐｍで４℃にて１５分間遠心分離した。新しい試験管に移した上清を活性測定の
ための粗製無細胞抽出物として用いた。合成フランビノールを包含する様々な基
質を用いた（下記の図５および６参照）。用いたＡＤＨ活性の測定法は、基質と
してエタノールおよび補助因子としてＮＡＤ＋を用いるS. cerevisiaeの無細胞 抽出物のＡＤＨ活性の研究についてBergmeyer (1970)によって記載された方法で
ある。測定原理は、基質の酸化と平行する経時的なＮＡＤＨの形成を記録するこ
とにある（３３４nmでの吸光度）。検討を行った各基質は、飽和濃度（Ｖｍａｘ
）であり、比活性を計算した。タンパク質の濃度は、Lowry et al. (1951)の方 法によって測定した。Example 4 In Vitro Measurement of ADH Activity At the beginning of the stationary phase, 50 ml of the culture were centrifuged and the cells were washed twice with distilled water, followed by 1 ml of 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7, To a 2 ml microcentrifuge tube. A fixed volume of glass spheres was added to the suspension and the whole previously cooled on ice for 10 minutes was vigorously stirred for 1 minute using a cell triturator. Collect the liquid phase to 14,000r
Centrifuged at 4 ° C. for 15 minutes at pm. The supernatant transferred to a new tube was used as a crude cell-free extract for activity measurement. Various substrates were used, including synthetic franbinol (see FIGS. 5 and 6 below). The method of measuring ADH activity used is that described by Bergmeyer (1970) for the study of ADH activity of cell-free extracts of S. cerevisiae using ethanol as substrate and NAD + as cofactor. The measurement principle consists in recording the formation of NADH over time parallel to the oxidation of the substrate (absorbance at 334 nm). Each substrate examined was at a saturation concentration (Vmax
) And the specific activity was calculated. Protein concentration was determined by the method of Lowry et al. (1951).
【００６１】 例５：フランビノール、フランビノンおよびフランビノールグルコシドの定量 直接注入により、最小時間で、３化合物の同時定量を行う目的で、高圧液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法を開発した。分析は、ＲＰ１８カラム（Hibar ：５μｍ；２５０×４mm）上で、２５％メタノール／０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
＝４．６６）からなる溶出溶媒を用いて行う。検出は、２８０nmでＵＶで行う。
定量は、３種類の純粋な化合物を用いて外部標準によって行う（下記の図３ａ参
照）。精製したまたは不純な木材抽出物と生物転換培地を注入して、直接分析し
た（７０μl）。この方法の終了時に得られるフランビノンを、ＨＰＬＣ溶媒に おける既知濃度の試料の生成によって分析する。Example 5: Quantification of Flavinol, Flavininone and Flavinol Glucoside A high pressure liquid chromatography (HPLC) method was developed for the simultaneous quantification of three compounds in a minimum time by direct injection. The analysis was carried out on a RP18 column (Hibar: 5 μm; 250 × 4 mm) using 25% methanol / 0.1 M acetate buffer (pH
= 4.66). Detection is performed at 280 nm with UV.
Quantification is performed by external standards using three pure compounds (see Figure 3a below). Purified or impure wood extract and biotransformation medium were injected and analyzed directly (70 μl). The furanbinone obtained at the end of the method is analyzed by producing a sample of known concentration in the HPLC solvent.
【００６２】 例６：カンバのフランビノールグリコシドの酸加水分解 カンバの総フランビノールのポテンシャルを、木材に含まれるグリコシドを徹
底的に加水分解した後、ＨＰＬＣ分析によって測定する。植物体０．６２５ｇを
、２Ｎ ＨＣｌ２５ml中で１００℃で１時間還流加熱する。炭酸ナトリウムを用
いてｐＨ＝７で中和した後、試料を直接注入し、フランビノールの遊離を測定す
る（上記の表４参照）。Example 6 Acid Hydrolysis of Birch Flavinol Glycoside The potential of birch total flavinol is determined by HPLC analysis after extensive hydrolysis of the glycosides contained in wood. 0.625 g of the plant is heated at 100 ° C. under reflux in 25 ml of 2N HCl for 1 hour. After neutralization at pH = 7 with sodium carbonate, the sample is injected directly and the release of franbinol is measured (see Table 4 above).
【００６３】 例７：キラル分析 様々な出発材料の異性体組成並びに酵母の作用特異性を、気相でのキラルカラ
ム上でのフランビノールのＲおよびＳ異性体の分割によって決定する（下記の図
１０および１１ｃ参照）。Example 7: Chiral Analysis The isomer composition of the various starting materials and the working specificity of the yeast are determined by resolution of the R and S isomers of franbinol on a chiral column in the gas phase (see FIG. 10 and below). 11c).
【００６４】 分析を行う水相をエーテルで抽出して濃縮した後、下記の条件下で気相クロマ
トグラフィー装置に注入する。 キャピラリーカラム；２，３−ジアセチル＝６−第三ブチルジメチルシリル−β
−シクロデキストリン／ＰＳ−０８６；長さ：２５ｍ；内径：０．２５mm；温度
プログラミング：５０℃で３分，２℃／分の速度で１９０℃まで増加，１９０℃
で６０分；水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ），２５０℃。After the aqueous phase to be analyzed is extracted with ether and concentrated, it is injected into a gas phase chromatography apparatus under the following conditions. Capillary column; 2,3-diacetyl = 6-tert-butyldimethylsilyl-β
-Cyclodextrin / PS-086; length: 25m; inner diameter: 0.25mm; temperature programming: 3 minutes at 50 ° C, increasing to 190 ° C at a rate of 2 ° C / min, 190 ° C
At 60 minutes; Flame ionization detector (FID), 250 ° C.
【００６５】 異性体を、B. albaの幾つかの試料に含まれる試料のみのキラル分析およびＮ ＭＲによるクロマトグラフィープロフィールに配置した（クロマトグラフィーに
よる精製の後、ＮＭＲ分析）。The isomers were arranged in a chiral analysis of only the samples contained in some samples of B. alba and in a chromatographic profile by NMR (purification by chromatography followed by NMR analysis).
【００６６】 例８：フランビノールの合成 フランビノールは、フランビノンをテトラヒドロフラン中水素化アルミニウム
リチウムによって還元することによって生成される。次に、アルコールが、「エ
ーテル／ペンタン」媒体中シリカカラム上でのクロマトグラフィーによって１０
０％付近の純度で得られる。合成した化合物の構造は、質量分光分析法を組み合
わせた気相クロマトグラフィー分析によって確かめた。Example 8 Synthesis of Franbinol Franbinol is produced by reducing franbinone with lithium aluminum hydride in tetrahydrofuran. The alcohol is then purified by chromatography on a silica column in "ether / pentane" medium.
Obtained with a purity of around 0%. The structure of the synthesized compound was confirmed by gas phase chromatography analysis combined with mass spectrometry.
【００６７】 例９：カンバ樹皮からのフランビノールグリコシドの抽出 カンバ樹皮に含まれるグリコシドを、樹皮片を４０℃の水中で浸軟して、すり
潰すことによって抽出する。この穏やかな抽出法により、含まれている可能性が
ある植物の内在性β−グルコシダーゼ活性を保存することができる。懸濁液を、
濾過または遠心分離によって固形粒子から分離し、前駆体の濃度をＨＰＬＣによ
って測定する（下記の図３ｂ参照）。これらの条件下でのグリコシドの抽出率は
、木材および用いる木材の濃度による出発材料に含まれているポテンシャルの９
０〜９９％程度である。２００ｇ木材／浸出液１リットルの濃度が、実際的寒天
から最大と思われる。このようにして得た着色浸出液を直接生物転換に用い、ま
たは生物転換用のグリコシドの更に純粋かつ更に濃縮した抽出物を得る目的で樹
脂上でのクロマトグラフィーによって精製する（上記の表３参照）。Example 9: Extraction of Flavinol Glycoside from Birch Bark Glycosides contained in birch bark are extracted by maceration of bark pieces in water at 40 ° C and grinding. This gentle extraction method allows for the preservation of endogenous β-glucosidase activity in plants that may be present. The suspension,
Separate from the solid particles by filtration or centrifugation and measure the concentration of the precursor by HPLC (see FIG. 3b below). Under these conditions, the glycoside extraction rate is 9% of the potential contained in the starting material depending on the wood and the concentration of wood used.
It is about 0 to 99%. A concentration of 200 g wood / liter of leachate appears to be the maximum from practical agar. The colored leachate thus obtained is used directly for bioconversion or purified by chromatography on a resin in order to obtain a more pure and more concentrated extract of the glycoside for bioconversion (see Table 3 above). .
【００６８】 例１０：フランビノールグリコシドのカラム精製 植物出発材料から抽出したグリコシドを含む水性抽出物（４０℃での浸出液）
を、ROHM & HAAS製の「ＩＲＡ９３ＳＰ」型のカラムで溶出することによって精 製する。この樹脂は、窒素性基（アニオン交換体）をグラフトさせたスチレン−
ジビニルベンゼン（疎水性）からなっている。カラムに吸着したグリコシドは、
抽出物を充填した樹脂を水で洗浄した後、１５％エタノール性水混合物によって
溶出される。この１５％画分を真空濃縮し、微生物転換の目的で所望なグリコシ
ド含量としかつアルコールを除去する。ＨＰＬＣ分析により、この方法の収率を
測定し、抽出物の含量および純度を得ることができる（下記の図３ｃ参照）。こ
の方法により、９０％程度の回収率が得られ、また樹脂を再使用することができ
る。Example 10: Column Purification of Flavinol Glycoside Aqueous Extract Containing Glycoside Extracted from Plant Starting Materials (Leachate at 40 ° C)
Is purified by elution with a column of the type “IRA93SP” manufactured by ROHM & HAAS. This resin is a styrene-grafted nitrogenous group (anion exchanger).
It is made of divinylbenzene (hydrophobic). The glycoside adsorbed on the column is
After washing the resin loaded with the extract with water, it is eluted with a 15% ethanolic water mixture. The 15% fraction is concentrated in vacuo to the desired glycoside content and the alcohol removed for microbial conversion purposes. HPLC analysis can determine the yield of this method and obtain the content and purity of the extract (see FIG. 3c below). By this method, a recovery rate of about 90% can be obtained, and the resin can be reused.
【００６９】 例１１：フランビノールグルコシドまたは合成フランビノールのフランビノンへ
の転換 グリセロール、エタノール、メタノール、イソプロパノールまたはこれらの炭
素源の組合せを含む固定相の開始時における培養物由来の菌株PR-L201または突 然変異体PR-L201-1の細胞を用いて、カンバ樹皮抽出物、または上記の方法で精 製した抽出物、または合成フランビノールの溶液１ml当たり１０８個の密度で接
種した。全量を、３５℃で１７０ｒｐｍで攪拌しながら、２４時間インキュベー
ションした。２種類の微生物変換反応をＨＰＬＣ分析によって同時に追跡した（
下記の図３ｄ参照）。Example 11 Conversion of Flavinol Glucoside or Synthetic Flavinol to Flavinone Strains PR-L201 or Prop from Culture at the Start of a Stationary Phase Containing Glycerol, Ethanol, Methanol, Isopropanol or a Combination of These Carbon Sources Naturally, the cells of the mutant PR-L201-1 were used to inoculate at a density of 10 8 per ml of a solution of birch bark extract, an extract purified by the above method, or synthetic flavinol. The whole volume was incubated for 24 hours at 35 ° C. with stirring at 170 rpm. The two microbial conversion reactions were tracked simultaneously by HPLC analysis (
See Figure 3d below).
【００７０】 例１２：フランビノンの抽出および取得 遠心分離または濾過によって細胞から分離した生物転換培地を、酢酸エチル、
エーテルなどの適当な極性の溶媒を用いて容積対容積で抽出する。フランビノン
を含む有機層を、次に留去する。このようにして得たフランビノンの純度は、Ｈ
ＰＬＣによってチェックする（下記の図１１参照）。図１１に、培地０．３リッ
トルの生物転換（フランビノン１．２ｇ／ｌ）、酢酸エチルによる抽出（０．３
リットルで２回）、および部分真空下での蒸発乾固によって得たフランビノン０
．５８ｇの純度を示す。これらの条件下でのフランビノンの抽出率は９５％であ
り、このようにして得た芳香性抽出物のフランビノンの質量含量は５９％（＋２
７％残留フランビノン）である。ＨＰＬＣ−ＵＶおよびＧＰＣ−ＦＩＤ分析によ
って測定した純度は、それぞれ６１％（＋２８％残留フランビノン）および６７
％（＋３０％残留フランビノン）である。Example 12: Extraction and Acquisition of Flambinone Biotransformation medium separated from cells by centrifugation or filtration was purified by adding ethyl acetate,
Extract volume-to-volume with a suitable polar solvent such as ether. The organic layer containing flavinone is then distilled off. The purity of the thus obtained flavinone is H
Check by PLC (see Figure 11 below). FIG. 11 shows biotransformation of 0.3 liter of medium (1.2 g / l of flavinone) and extraction with ethyl acetate (0.3 liter).
Flavinone 0 obtained by evaporation to dryness under partial vacuum)
. Shows a purity of 58 g. Under these conditions, the extraction rate of flavinone is 95%, and the mass content of flavinone of the aromatic extract thus obtained is 59% (+2
7% residual flavinone). Purities as determined by HPLC-UV and GPC-FID analysis were 61% (+ 28% residual flavinone) and 67%, respectively.
% (+ 30% residual flavinone).
【００７１】 キラル分析は、B. albaの樹皮から出発したこの収率での残留フランビノンの ９２％は転換不可能なＳ異性体に相当することを示している。Chiral analysis shows that 92% of the residual flavinone in this yield starting from the bark of B. alba corresponds to the non-convertible S-isomer.
【００７２】[0072]
【表５】 [Table 5]
【００７３】[0073]
【表６】 [Table 6]
【図１】 菌株の電気泳動的核型：１，S. cerevisiae YNN-295；２，P. farinosa CBS18
5；３，P. farinosa CBS5013；４，Pr-L201；５，PR-L201-1；６，Hansenula wi ngei YB-4662-VIA。染色体ＤＮＡを含むブロックをKaiser et al., (1994)の方 法によって調製し、染色体を、ＣＨＥＦ ＤＲＩＩＩシステム(Bio-Rad)を用い 、下記の移動条件を適用することによって、０．９％アガロースゲル(Bio-Rad) 上で０．５×ＴＢＥ緩衝液中で分離した。４Ｖ／ｃｍ，角度１２０°；２１時間
パルス時間１２０秒、次いで２１時間パルス時間２００秒、および３１時間パル
ス時間４５０秒。FIG. 1 Electrophoretic karyotype of strain: 1, S. cerevisiae YNN-295; 2, P. farinosa CBS18
5; 3, P. farinosa CBS5013; 4, Pr-L201; 5, PR-L201-1; 6, Hansenula wingei YB-4662-VIA. Blocks containing chromosomal DNA were prepared by the method of Kaiser et al., (1994), and chromosomes were prepared using the CHEF DRIII system (Bio-Rad) by applying the following transfer conditions to 0.9% agarose. Separated in 0.5 × TBE buffer on gel (Bio-Rad). 4V / cm, angle 120 °; 21 hour pulse time 120 seconds, then 21 hour pulse time 200 seconds, and 31 hour pulse time 450 seconds.
【図２】 酵素活性の展開：ａ，ＹＰＧ２０培地での成長および特異的β−グルコシダー
ゼ活性；ｂ，Ｙｐｇｌｙ培地での成長および特異的β−グルコシダーゼ活性；ｃ
，ＹＰＧ培地での成長および基質としてのフランビノールに対する特異的ＡＤＨ
活性；ｄ，Ｙｐｇｌｙ培地での成長および基質としてのフランビノールに対する
特異的ＡＤＨ活性。FIG. 2: Development of enzyme activities: a, growth in YPG20 medium and specific β-glucosidase activity; b, growth in Ypgly medium and specific β-glucosidase activity; c
, A specific ADH for franbinol as substrate and growth in YPG medium
Activity; d, Specific ADH activity for growth in Ypgly medium and for flavinol as substrate.
【図３】 高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析：ａ．標準；ｂ．木材浸
出液：このB. albaにおける１４．３分のグリコシドは、フランビノールのポテ ンシャルの約２０％を表す；ｃ．樹脂上で精製したカンバ樹皮のグリコシドの抽
出物；ｄ．生物転換培地。FIG. 3. Analysis by high pressure liquid chromatography (HPLC): a. Standard; b. Wood leachate: This 14.3 minute glycoside in B. alba represents about 20% of the potential of frambinol; c. Birch bark glycoside extract purified on resin; d. Biotransformation medium.
【図４】 カンバ抽出物の生物転換の動態： ａ，１６時間エージングした細胞による；ｂ，３０時間エージングした細胞によ
る。Ｇ−Ｆｏｌ，フランビノールグルコシド；Ｆ−ｏｌ，フランビノール，Ｆ−
ｏｎｅ，フランビノン； 酸化率（％）＝フランビノン（mg/l）／［（フランビノール（mg/l）＋フランビ
ノン（mg/l）］。 生物転換容積１０ml。FIG. 4: Kinetics of biotransformation of birch extract: a, by cells aged 16 h; b, by cells aged 30 h. G-Fol, franbinol glucoside; F-ol, franbinol, F-
Oxidation rate (%) = Franbinone (mg / l) / [(Flambinol (mg / L) + Franbinone (mg / L)] Biotransformation volume 10 ml.
【図５】 菌株PR-L201およびPR-L201-1の無細胞抽出物の第一アルコール、第二アルコー
ルおよびフランビノールに対する特異的ＡＤＨ活性：ＥｔＯＨ，エタノール；Ｐ
ｒｏｐ−１，プロパン−１−オール；Ｂｕｔ−１，ブタン−１−オール；Ｐｅｎ
ｔ−１，ペンタン−１−オール；ｃｉｎｎａｍｙｌ，シンナミルアルコール；Ｆ
ｒ−ｏｌ，フランビノール；Ｐｒｏｐ−２，プロパン−２−オール；Ｂｕｔ−２
，ブタン−２−オール；Ｐｅｎｔ−２，ペンタン−２−オール。３０時間培養物
。FIG. 5: Specific ADH activity of cell-free extracts of strains PR-L201 and PR-L201-1 against primary alcohol, secondary alcohol and frambinol: EtOH, ethanol; P
rop-1, propan-1-ol; But-1, butan-1-ol; Pen
t-1, pentan-1-ol; cinnamyl, cinnamyl alcohol; F
r-ol, franbinol; Prop-2, propan-2-ol; But-2
, Butan-2-ol; Pent-2, pentan-2-ol. 30 hour culture.
【図６】 フランビノール、および８．３３％カンバ抽出物を加えたフランビノールに対
する特異的ＡＤＨ活性：菌株PR-L201およびPR-L201-1。Ｆｒ−ｏｌ，フランビノ
ール；Ｆｒ−ｏｌ＋木材，フランビノール＋カンバ抽出物。３０時間培養物。FIG. 6: Specific ADH activity on franbinol and franbinol with 8.33% birch extract: strains PR-L201 and PR-L201-1. Fr-ol, franbinol; Fr-ol + wood, franbinol + birch extract. 30 hour culture.
【図７】 ３．９５ｇ／ｌのフランビノールグルコシドの濃度に相当する精製したカンバ
抽出物の菌株PR-L201による生物転換の動態：ａ，未処理抽出物；ｂ，グリコシ ダーゼ(Rapidase 9108 Gist-Brocades)を含むペクチナーゼ３ml/lで予め処理し た抽出物、４０℃で１１時間インキュベーション。 生物転換容積１０ml。Ｇ−Ｆｏｌ，フランビノールグルコシド；Ｆ−ｏｌ，フラ
ンビノール；Ｆ−ｏｎｅ，フランビノン；酸化率（％）＝フランビノン（mg/l）
／［（フランビノール（mg/l）＋フランビノン（mg/l）］。FIG. 7: Kinetics of biotransformation of the purified birch extract by strain PR-L201 corresponding to a concentration of 3.95 g / l of flavinol glucoside: a, untreated extract; b, glycosidase (Rapidase 9108 Gist). -Brocades) containing 3 ml / l of pectinase-extracted extract, incubation at 40 ° C for 11 hours. Bioconversion volume 10 ml. G-Fol, franbinol glucoside; F-ol, franbinol; F-one, franbinone; oxidation rate (%) = franbinone (mg / l)
/ [(Franbinol (mg / l) + Franbinone (mg / l)].
【図８】 予めβ−グルコシダーゼで処理した様々な種のカンバ抽出物の生物転換の動態
。生物転換率は、生物転換前の抽出物におけるフランビノールのＲ異性体の初期
含量に相当する：B. fructicosa，４３％；B. humilis，６３％；B. alba，１０
０％；Ｆ−ｏｌ，フランビノール；Ｆ−ｏｎｅ，フランビノン。FIG. 8. Kinetics of biotransformation of birch extracts of various species previously treated with β-glucosidase. The bioconversion rate corresponds to the initial content of the R isomer of flavinol in the extract before biotransformation : B. fructicosa , 43%; B. humilis , 63%; B. alba , 10
0%; F-ol, frambinol; F-one, frambinone.
【図９】 PR-L201によるB. fructicosaカンバ抽出物の生物転換の動態：浸出は、水１０
０ml中０．８ｇ樹皮から出発し、４０℃で１時間攪拌した後、ガーゼで濾過して
行った。生物転換容積１０ml。グルコシドの加水分解の９０％は、初期含量に関
して２４時間で観察された。FIG. 9: Kinetics of biotransformation of B. fructicosa birch extract by PR-L201: leaching was 10
Starting from 0.8 g bark in 0 ml, stirring at 40 ° C. for 1 hour was performed by filtration through gauze. Bioconversion volume 10 ml. 90% of the glucoside hydrolysis was observed at 24 hours for the initial content.
【図１０】 合成フランビノールのキラル気相クロマトグラフィー（ＧＰＣ）による分析：
ａ，生物転換前；ｂ，生物転換後。ピークは、１，フランビノールのＲ異性体；
２，フランビノールのＳ異性体；３，フランビノン。FIG. 10: Analysis of synthetic flavinol by chiral gas phase chromatography (GPC):
a, before bioconversion; b, after bioconversion. Peak is the R isomer of 1, furbinol;
2, S isomer of franbinol; 3, flavinone.
【図１１】 溶媒抽出および濃縮の後のフランビノンの製造の分析結果：ａ，ＨＰＬＣ−Ｕ
Ｖによる分析；ｂ，ＧＰＣ−ＦＩＤ（水素炎イオン化検出器）による分析；ｃ，
キラルＧＰＣ−ＦＩＤによる分析（Ｆ−ｏｌ：フランビノール；Ｆ−ｏｎｅ：フ
ランビノン）。FIG. 11. Analytical results of the production of flavinone after solvent extraction and concentration: a, HPLC-U
Analysis by V; b, analysis by GPC-FID (flame flame ionization detector); c,
Analysis by Chiral GPC-FID (F-ol: Franbinol; F-one: Franbinone).
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書[Procedural Amendment] Submission of translation of Article 34 Amendment of the Patent Cooperation Treaty
【提出日】平成１２年３月２７日（２０００．３．２７）[Submission date] March 27, 2000 (2000.3.27)
【手続補正１】[Procedure amendment 1]
【補正対象書類名】明細書[Document name to be amended] Statement
【補正対象項目名】特許請求の範囲[Correction target item name] Claims
【補正方法】変更[Correction method] Change
【補正内容】[Correction contents]
【特許請求の範囲】[Claims]
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 パトリック、ジラール フランス国レ、ジュリ、ル，ボワ、デュ、 ロワ、29 Ｆターム(参考） 4B064 AC31 CA06 CB07 CB13 CC03 CD09 DA10 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of front page (81) Designated country EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE ), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SL, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AE, AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR , BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GD, GE, GH, GM, HR, HU, ID, IL, IN, IS , JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZA, ZW (72) Inventor Patrick, Girard France, Juli, Le, Bois, Du, Rois, 29F term (reference) 4B064 AC31 CA06 CB07 CB13 CC03 CD09 DA10
Claims (17)
ンビノンへの生物転換を、 β−グルコシダーゼ活性、および ＳＡＤＨ（第二アルコールデヒドロゲナーゼ）活性 を同時に有する酵母の菌株を用いて行い、 フランビノンを生物転換の後に培地から分離することを特徴とする、方法。1. A process for producing flavinone, wherein a biotransformation of a medium containing flavinol glucoside to flavinone is performed using a yeast strain having both β-glucosidase activity and SADH (secondary alcohol dehydrogenase) activity. Separating flambinone from the culture medium after biotransformation.
求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。4. The method according to claim 1, wherein the strain is used in the form of a culture at the end of the exponential growth phase or at the beginning of the stationary phase.
る、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。5. The method according to claim 1, wherein one or more non-fermentable carbons are used to induce the activity of an enzyme involved in biotransformation.
たはこれらのアルコールの混合物を含む、請求項５に記載の方法。6. The method according to claim 5, wherein the culture comprises glycerol, ethanol, methanol or isopropanol, or a mixture of these alcohols.
１項に記載の方法。7. The method according to claim 1, wherein the strain is used at a density higher than 10 7 cells / ml.
部分の分離によって得る、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。8. The method according to claim 1, wherein the medium containing flavinol glucoside is obtained by aqueous extraction of birch bark and separation of insoluble parts.
選択される、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。11. The method according to claim 8 , wherein the birch is selected from species rich in the R isomer of flavinol glucoside, in particular from the species Betu la alba , Betula chichibuensis , Betula nana and Betula populifolia. The method described in the section.
行い、場合によっては溶出物を濃縮することによって精製した後、生物転換を行
う、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。12. The biotransformation according to claim 8, wherein the aqueous extract of birch bark is purified by chromatography on a hydrophobic anion exchange resin, optionally concentrating the eluate, followed by bioconversion. Or the method of claim 1.
２のいずれか１項に記載の方法。13. The method of claim 1, wherein the flambinone is extracted with a suitable organic solvent after the biotransformation.
3. The method according to any one of 2.
ランビノン。17. Flavinone obtained by using the method according to any one of claims 1 to 13.
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