JP2002507394A

JP2002507394A - Ｉｈイオンチャンネルの配列およびその使用

Info

Publication number: JP2002507394A
Application number: JP2000532514A
Authority: JP
Inventors: アルンドバウマン; ヴォルフガングボニーク; レナータガウス; アレキサンダーショルテン; ラインハルトセイフェルト; ベンジャミンカウプ
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1998-02-17
Filing date: 1999-02-12
Publication date: 2002-03-12
Also published as: US7112667B1; EP1054963A1; DE59914479D1; DE19806581A1; EP1054963B1; US20060269959A1; US7547763B2; DK1054963T3; WO1999042574B1; EP1842917A1; WO1999042574A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ｉ_hイオンチャンネルの配列の少なくとも一部よりなる核酸、好ましくはＤＮＡに関する。前記配列は、例えば、ヒトＤＮＡ起源、ラットＤＮＡ起源、ウシＤＮＡ起源、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（キイロショウジョウバエ）ｍｅｋａｎｏｇａｓｔｅｒＤＮＡ起源またはウニＤＮＡ起源であってもよい。さらに、本発明は対応する配列を含むｍＲＮＡに関する。本発明はさらには、該核酸にエンコードされたポリペプチドまたはタンパク質に関する。さらに、本発明は、スクリーニング法および／または診断法への本発明の核酸およびタンパク質の使用、およびそれらのためのキットに関する。また、本発明は心臓血管障害および意識障害の治療および／または予防のための１以上の核酸およびタンパク質の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、Ｉ_hイオンチャンネルの配列の少なくとも一部よりなる核酸、好ま
しくはＤＮＡに関する。前記核酸は、例えば、ヒトＤＮＡ、ラットＤＮＡ、ウシ
ＤＮＡ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（キイロショウジョウバエ）ｍｅｌａｎｏｇａｓ
ｔｅｒＤＮＡまたはウニＤＮＡを起源であってもよい。さらに、本発明は、対応
する配列を含むｍＲＮＡに関する。本発明はさらに、アミノ酸配列起源の対応す
る配列を含むポリペプチドまたはプロテインに関する。

【０００２】さらに、本発明はスクリーニングおよび／または診断方法への１または２以上
の前記配列の使用、および前記方法に必要とされるキットに関する。

【０００３】さらには、本発明は、心臓血管障害および睡眠障害の治療および／または診断
への１または２以上の前記配列の使用方法に関する。

【０００４】神経系の多くの異なる機能は、ニューロンの固有特性とシナプス接続との間の
微妙に調節された相互作用によって実質的に決定される。ニューロンおよびシナ
プスの固有な電気生理学特性は、多数の伝達物質と細胞間伝達系により制御され
、ニューロンの形質膜を通過するイオン電流を調節する、電圧の局所化および密
度制御性イオンチャンネルおよび、リガンド制御性イオンチャンネルによって決
定される（ヒル、１９９２）。

【０００５】ニューロン要素に求められる比活性に関して、ニューロンが活動電位時に電圧
依存性ナトリウム（Ｎａ⁺）およびカリウム（Ｋ⁺）電流と（ホズキンおよびハ
ックスレイ、１９５２）と、数種の独特のイオン伝導性（リナス、１９８８）を
発生する古典的イオンチャンネルを含む幅広い種類のイオンチャンネルを有する
ことは驚くに値しない。

【０００６】イトウらが最初に、猫の動的ニューロンに見い出した独特な固有機構は（アラ
キら、１９６２；イトウおよびオオシマ、１９６５）、電流の過分極によって誘
起される電位変化のゆっくりとした緩和で、過分極方向での電流／電圧関係の非
オーム挙動に帰着することが明らかとなった。根底にある時間依存性の膜電流は
初め、桿体の光受容体でセシウム（Ｃｓ⁺）感受性の内部電流として特長づけら
れる。この内部電流は過分極により誘発され、膜で減極（脱分極）される。これ
は照射による初期の過渡的な過分極の典型的な手順へと導かれ、ゆっくりとした
減極へと続く（アットウェルおよびウィルソン、１９８０；ベイダーら、１９７
９、１９８２；ツェンら、１９７８）。

【０００７】光受容体の電流は、過分極によって誘発させるので、Ｉ_hと呼ばれる。類似し
たイオン電流が心臓、洞房結節のペースメーカー細胞および哺乳類の心臓のプル
キンエ繊維でほぼ同時期に発見され（ブラウンおよびディフランチェスコ、１９
８０；ブラウンら、１９７９；ディフランチェスコ、１９８１ａ、１９８１ｂ；
ヤナギハラおよびイリサワ、１９８０）、遅い内部電流がナトリウムおよびカリ
ウムに伴われていることが明らかとなった。この電流は独特の挙動、すなわち、
過分極によって誘発され、上記Ｋ⁺伝導性Ｉ_K2に類似しているという事実により
ファニー（ｆｕｎｎｙ）電流と呼ばれる。該電流が例えば、心臓の自発的活動の
発生および調節に関与していることから、該電流への関心は増加している。

【０００８】中央ニューロンでの対応する電流の存在を示すさらなる証拠が見つかり、ハリ
ウェルおよびアダムス（１９８２）によって初めて言及された。彼らは過分極後
の海馬の錐体細胞のクィアー（ｑｕｅｅｒ）電流と称される遅い内部電流を観察
し、その後、同様の特性をもつ電流がニューロン細胞および非ニューロン細胞で
多数発見され、該過分極誘発性電流は最終的に神経系の細胞での偏在現象として
認識された。Ｉ_hの名称が現在、該電流の呼び名として受け入れられている。

【０００９】当初、代表的なＩ_hチャンネルの活性化は調節不能であると考えられていたが
、Ｉ_hチャンネルは細胞電気活性の調節における重要な生理学的役割を強調し、
神経伝達系に関する重要なターゲットであることを示すデータが次々に登場して
いる。

【００１０】そうしているうちに、Ｉ_hは静止電位に実質的に寄与し、過剰な過電極を制限
し、活動パターン（発射パターン）の形状を決定し、膜電位の律動的な微細運動
を発生させることが知られるようになった。Ｉ_h電流は他の電圧制御のイオンチ
ャンネルから同種のものを識別する２、３種類の特性を有する。電圧制御性のＮ
ａ⁺、Ｃａ²⁺電流および固有のＫ⁺電流のように、Ｉ_h電流は急傾斜の電圧依存
カーブを有し、Ｓ字形の経時変化で誘発される。Ｉ_hは過分極により誘発される
が、Ｓ字運動により失活する。

【００１１】負電位の誘起とＣｓ⁺イオンによる遮断は、内部でのＫ⁺チャンネルの整流を
思い起こさせる。しかし、Ｉ_hの多くの特性はＫ⁺チャンネル系統群と明らかに
異なっている。すなわち、誘発の速度がより遅く、誘発の範囲がより正であり、
細胞外のＫ⁺の濃度に依存せず、導電性が細胞外のＢａ²⁺イオンにより実質的に
遮断される。また、Ｉ_hチャンネルはＫ⁺イオンのみならずＮａ⁺イオンにも透
過性である。リガンド制御性のカチオンチャンネルのような、他のカチオンチャ
ンネルとは対照的に、Ｉ_hチャンネルはＮａ⁺およびＫ⁺イオンに対し非常に感
受性が高く、するどい電圧依存性の制御を有する。

【００１２】現在の研究活動で重要視されているのは、心筋のペースメーカー機能における
Ｉ_hチャンネルの関与である。心臓におけるペースメーカー活動は心臓の特定の
領域（静脈洞）に位置し、心筋の残りの部分から分離したとしても自発的に拍動
することができる能力により特徴付けられる特別な筋細胞による。哺乳類の洞房
結節のペースメーカー細胞において、自発的な活動は、細胞の活動電位の基準的
な状態であるゆっくりとした心臓弛緩期の減極に続いて起こる。心臓の収縮サイ
クルの弛緩期に対応する前記状態時、膜は活動電位の消滅後、新たな活動電位の
発生が閾値に到達するまでの間、再びゆっくりと減極する。そのように、弛緩期
の減極は律動的な挙動の原因であり、洞房結節および他の自発的な活動する心臓
細胞の活動電位を特徴付ける。

【００１３】律動的な活動の発生とは別に、自律神経伝達物質による心拍周期の制御下、弛
緩期（またはペースメーカー）減極が起こる。交感神経系および副交感神経系の
刺激により、心拍の増加および減少が引き起こされることが知られている。

【００１４】そうしているうちに、Ｉ_hチャンネルがこのペースメーカー機能によって引き
起こされることが知られるようになった。洞房結節のＩ_h電流は非特異的なカチ
オン電流であり、通常Ｎａ⁺およびＫ⁺に伴われ、弛緩期減極の電圧領域を取り
込んだ電圧領域中でゆっくりと誘発される。Ｉ_hの特徴は、Ｉ_hチャンネルが活
性化された電圧領域での過分極に対する反作用として発生する減極プロセスによ
く一致している。

【００１５】しかし、今までのところ、Ｉ_hチャンネルをコードする遺伝子の配列は確認さ
れていない。さらに、同様の生化学特性を特定するのに、十分な量のチャンネル
タンパク質を利用できない。また、Ｉ_h電流は全ての細胞で確認され、さらに、
Ｋ⁺およびＮａ⁺選択的導電性であり、経験的に他の電流から孤立しているため
、Ｉ_hチャンネルの薬理学的特性評価は非常に困難である。

【００１６】そのため、本発明の目的はＩ_hイオンチャンネルをコードする核酸を示すこと
、該核酸の可能な応用を示すこと、および実用的な状態で、かつ生化学分析およ
び薬理学的利用に十分な量のタンパク質を提供することである。

【００１７】前記目的は、独立請求項の主題により達成される。有利な展開は、付随請求項
で示されている。

【００１８】本明細書中で使用している用語の意味を以下に示す。

【００１９】Ｉ_hイオンチャンネルとは、（１）過分極により開放し、より正の電圧値（Ｖ _m ≧−１０ｍＶ）により閉止し、（２）完全な活性化と不活性化とが比較的ゆっ
くりとしたＳ字形の経時変化で起こり、（３）Ｋ⁺イオンのみならずＮａ⁺イオ
ンにも伝導性を示し、（４）０．１〜３ｍＭの細胞外Ｃｓ⁺により遮断され、（
５）環状ヌクレオチド、特に環状ＡＭＰおよび環状ＧＭＰにより直接調節される
イオンチャンネルを表す。

【００２０】ストリンジェント状態とは、０．１〜５×ＳＳＣで、好ましくは１〜２×ＳＳ
Ｃで、かつ６０〜７０℃の温度で、好ましくは６５℃でハイブリダイゼーション
することを意味する。

【００２１】低ストリンジェント状態とは、０．１〜５×ＳＳＣで、好ましくは１〜２×Ｓ
ＳＣで、かつ５０〜６０℃の温度で、好ましくは５５℃でハイブリダイゼーショ
ンすることを意味する。

【００２２】Ｉ_hイオンチャンネルの部とは抗原決定基に適したプロテイン配列のセクショ
ンを意味し、例えば、最低６アミノ酸のセクション等である。図１Ａに示すＳ１
、Ｓ２等のセクションのような領域の形態で発生するセクションもまた、部とみ
なされる。この部は、ＩＵＰＡＣコードの配列番号１〜１５で示されるＤＮＡ配
列から導かれる、さらに細かくいうと、生物学的機能を維持した状態での、前記
ＤＮＡ配列からのアミノ酸交換、欠失および付加によって導かれるイオンチャン
ネルのセクションを含む。

【００２３】核酸と関連する部分での部とは、少なくとも６ヌクレオチド、好ましくは１２
ヌクレオチド、より好ましくは１８ヌクレオチドの長さを有するフラグメントを
意味する。該部は対応する全配列と特異的な（選択的な）オリゴヌクレオチドハ
イブリゼーションを介したハイブリダイズを行うのに適する。そのことから、核
酸の部は、前記配列の１つと選択的なハイブリダイズを行うのに適した配列番号
１〜１５の配列からのセクションである。

【００２４】選択的（特異的）とは、ある核酸が、適切なハイブリダイズ条件において、配
列番号１〜１５の配列のいずれか１の配列で示されるような、１つの核酸とのみ
ハイブリダイズを行い、各宿主生物の通常関連する他の核酸とはハイブリダイズ
は起こらない状況を意味する。

【００２５】本明細書において、相同性は以下の手順で計算される。比較される配列または
配列のセクションで個々の部位が同一であるか、または類似しているアミノ酸の
部位を合計する。得られた数値をアミノ酸残基の総数で割り、１００を乗ずる。
これにより、配列の類似性または相同性の百分率が得られる。以下に計算例を示
す。ＴＷＡＬＦＫＡＬＳＨＭＬＣＩＧＹＧＫＦＰＰＱＳＰＤＡＦＷＷＡＶＶＴＭＴＴＶＧＹＧＤＭＴＰＶＧ上記サンプル配列において、互いに比較される部位の総数は２３残基であり、占有する部位が同一であるアミノ酸が７あり、類似するアミノ酸が６ある。こ
こから相同性は下記のように計算される。［（７＋６）／２３］×１００＝５６．５％類似するアミノ酸の交換は、保存的交換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｅｘｃ
ｈａｎｇｅ）と呼ばれる（参考：デイホフら、１９７８）。

【００２６】請求項１によれば、Ｉ_hイオンチャンネルの配列の少なくとも１部よりなる核
酸が提供される。該核酸と相補関係にある核酸もまた、本発明の実施態様とみな
される。前記核酸は好ましくは、ヒトＤＮＡ起源であってもよく、その場合は特
に配列番号１、１０，１１および１５の配列により特徴付けられる。

【００２７】また、該配列はラットＤＮＡ起源であってもよく、その場合は特に配列番号２
、８、９、１３および１４により特徴付けられる。

【００２８】本発明の好ましい態様において、該配列はウシＤＮＡ起源であってもよく、こ
の場合は特に配列番号３、６、７および１２により特徴付けられる。

【００２９】さらに、該配列はウニＤＮＡ起源であってもよく、この場合は特に配列番号４
の配列により特徴付けられる。

【００３０】さらに、該ＤＮＡは好ましくは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（キイロショウジョウ
バエ）ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ起源であってもよい。この場合、完全配列は配
列番号５に従う。

【００３１】特に好ましい態様では、配列番号１〜１５のいずれか１の配列との相同性が少
なくとも８０％である。さらに好ましい態様では、配列番号１〜１５のいずれか
１で示される配列との相同性が少なくとも９０％である。

【００３２】特に好ましい方法では、低ストリンジェント条件で配列番号１〜１５のいずれ
か１の配列とハイブリダイズを行い、さらに好ましい方法では、高ストリンジェ
ント条件でハイブリダイズを行う。

【００３３】本発明は、配列番号１〜１５の配列の修飾体、例えば、遺伝子コードの退行変
性、欠失、挿入、転換およびさらなる突然変異により得られるものも対象とし、
エンコードされるチャンネルタンパク質またはその一部の生物学的特性は維持さ
れていることが好ましい。

【００３４】さらに、本発明は上記配列のいずれか１に相同する配列よりなるｍＲＮＡに関
する。従って、本発明は上記核酸によりエンコードされるポリペプチドも対象と
する。

【００３５】上記配列はスクリーニング法に利用でき、また、診断法に利用可能である。ス
クリーニング法では、Ｉ_hイオンチャンネルの配列を識別できることから、前記
配列を用いて、イオンチャンネル上の物質の影響を試験することができる。

【００３６】そのようなスクリーニング法は、例えば、以下の手順よりなってもよい。・例えば、卵母細胞、哺乳類細胞のような好適な宿主に上記核酸を発現させる
ことにより、相同性を有するチャンネル調整物を作製する段階。・前記チャンネル調整物で物質をテストする段階。物質のテストは、チャンネルに影響を及ぼす試験物質の存在下、または該物質
の不在下においてチャンネル活性を測定することにより決定できる。

【００３７】本発明はまた、スクリーニング法等の実施に用いる上記核酸またはポリペプチ
ドの少なくとも１つよりなるキットに関する。

【００３８】該配列はまた、診断法、特に心臓血管障害を識別するための診断法にも利用可
能である。

【００３９】前記診断法において、患者の核酸を好ましくは、上記ＤＮＡまたはＲＮＡと接
触させ、それによりイオンチャンネル核酸配列の存在および／または不在を示す
信号を得る。患者のイオンチャンネルにおける突然変異もまた、例えば、鑑別診
断に有用な短いオリゴヌクレオチドのような適当なサンプルを選択することによ
り検出可能である。

【００４０】さらに、本発明は、診断法に使用する上記配列のいずれか１よりなるキットに
関する。

【００４１】さらに、上記配列は心臓血管障害、意識障害および苦痛状態の治療および／ま
たは予防に利用可能である。好ましい態様において、洞房結節の調節異常による
心臓血管障害を早期に治療または識別することが可能である。さらに、皮質視床
ニューロンの機能障害による意識障害が好ましく識別される。例えば、遺伝子治
療の領域において、機能しなくなったイオンチャンネルと交換するため、本明細
書中に記載する核酸でエンコードされた完全に機能するイオンチャンネルを患者
に挿入する。

【００４２】さらに、本発明は、上記核酸のいずれか１、または２以上、若しくは上記ポリ
ペプチドよりなる薬剤組成物に関する。そのような薬剤組成物は心臓血管障害、
特に洞房結節の調節異常による心臓血管障害、意識障害、特に皮質視床の機能障
害によって引き起こされる意識障害の治療に利用可能である。

【００４３】以下、実施例および添付した図面を参考に本発明を示す。

【００４４】本発明によるイオンチャンネルタンパク質の典型的な代表例は、ウニ起源のチ
ャンネル（ＳＰＩＨ）である。ｐｃＳＰＨＩ構成体（図６）でトランスフェクト
されたＨＥＫ２９３セルのチャンネル活性を全細胞配置中でのパッチクランプ法
により調べた。過分極電圧段階では、複雑な波形を有する内部電流を示した（図
２Ａ参照）。時間分解性ではない速い電流成分に、遅れを伴って発生した時間依
存性の電流が続き、最大値に到達した後、試験電圧Ｖ_mが−３０ｍＶ以下になっ
た時に振幅の幅が減少した（図２Ａ）。Ｖ_mが＋１０ｍＶまで戻った後、複雑な
経時変化を示す尾電流が発生した。過分極電圧パルスの末端（図２Ａ中の矢印）
での電流／電圧（Ｉ／Ｖ）間の定常状態の相関は、強い内部修正を示した（図２
Ｂ）。瞬間Ｉ／Ｖ相関は、電圧段階に関する異なるプロトコル（図２Ｃ）を用い
て決定した。瞬間Ｉ／Ｖ相関は−３０ｍＶの逆電圧Ｖ_revによりわずかに外側に
修正された（図２Ｄ）。内部ナトリウム電流は［Ｋ⁺］_oによって大きく増幅さ
れるため、Ｉ／Ｖ相関はより高い［Ｋ⁺］_oでほぼ線形となった（図４Ｈ参照）
。ＳＰＩＨチャンネルは正電圧状態で閉止、または不活性化されるため、電流は
強く内部修正されるという結論に導かれる。開放確率Ｐ_oの電圧依存性（図２Ｆ
）は、＋１０ｍＶでの尾電流の振幅から決定される（図２Ａ）。観察された最大
電流の半分の電流値での電圧Ｖ_1/2は−２６．１ｍＶ（施行数７）であった。そ
のようにして、ＳＰＩＨチャンネルは＋１０ｍＶ以上の電圧で不活性化され、過
分極により開放される。この電圧依存性は異なる細胞中で起こる過分極誘発性の
電流（Ｉ_h）を思わせる（ディフランチェスコ、１９９０、１９９３；ペープ、
１９９６）。その特異的な特性のため、Ｉ_hはクィアー（ｑｕｅｅｒ）電流（Ｉ _q ）またはファニー（ｆｕｎｎｙ）電流（Ｉ_F）と称される。本発明によるチャ
ンネルは、（１）過分極電圧により活性化され、（２）環状ヌクレオチドにより
直接調節され、（３）ミリモル濃度の細胞外Ｃｓ⁺により阻害され、（４）Ｐ_Na ／Ｐ_Kが０．２〜０．４の範囲でカチオン感受性であり、（５）内部ナトリウム
電流は［Ｋ⁺］_o感受性である。以下の実施例で、前記特徴が非相同発現のＳＰ
ＩＨチャンネルで確認されたことが示されている。

【００４５】１ｍＭのｃＡＭＰのピペット溶液で過分極を起こし、遅れを伴って発生し、ゆ
っくりと定常状態に達する大電流を発生させた。電流のＳ字形の経時変化（図３
Ａの枠内参照）は脊椎動物のＩ_h電流の特徴である。１ｍＭのｃＧＭＰのピペッ
ト溶液を用いた場合でもＳＰＩＨで誘発された電流は変化する。Ｐ_oの電圧依存
性はホールセル尾電流により決定される（図３Ｂ）。ボルツマン式からＶ_1/2＝
−５０．８ｍＶとなる。ピペット溶液中の細胞の透析には数分を要した。このこ
とからｃＡＭＰの過渡的な影響が試験を悪化させた可能性がある。そのため、手
法はかご状誘導体からのｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの急速光終結を用いて実施した
（アダムスおよびツェン、１９９３；ヘーゲンら、１９９６参照）。細胞は１０
０μｍのかご状ｃＡＭＰで透析し、ＳＰＩＨチャンネルはＶ_mを＋１０ｍＶから
−７０ｍＶまで変化させることにより活性化させた。その際ＵＶ光線の短時間の
フラッシュがＳＰＩＨに誘起される内部電流の振幅の急激な増加に影響を与えた
（図３Ｃ）。フラッシュを行う前、過分極に励起された電流は基準電流に類似し
ている（図３Ｃトレース１）。一方、ＵＶフラッシュを行った後の電流の振幅お
よび経時変化（図３Ｃトレース２）は、ｃＡＭＰの存在下で記録されたもの（図
３Ｅ）と類似している。１００μＭのかご状ｃＧＭＰのピペット溶液に対し、同
様の時間、同様の強度のＵＶフラッシュを行ったところ、ＳＰＩＨに誘起される
電流に変化は生じなかった。環状ヌクレオチドに対する結合モチーフはｃＡＭＰ
がリン酸化反応の関与なしで直接チャンネル活性を拡大していることを示唆して
いる。この仮定を確認するため、ＳＰＩＨチャンネル電流をｃＡＭＰが存在しな
い状態（図３Ｄ）および存在する状態（図３Ｅ）について、切り離された膜クラ
ンプ上で測定した。ｃＡＭＰ（１ｍＭ）は電圧誘起の電流の振幅を２０倍まで拡
大させた。ｃＡＭＰによる電流の増加は可逆的であり、Ｍｇ²⁺／ＡＴＰを必要と
しない。異なるｃＡＭＰ濃度を含む溶液に入った活性化された膜パッチの上澄み
は、用量依存の形でＳＰＩＨ電流を拡大させた。ｃＡＭＰ濃度への電流の依存性
は０．７４μＭのＫ_1/2の単純な結合等温線と１からそれほど離れていないヒル
係数で示すことができる（図３Ｆ）。分離された膜パッチにおいて、ｃＡＭＰの
存在下でのＶ_1/2は約３５ｍＶで、ホールセル配置で測定したＶ_1/2よりも負で
あった（図３Ｂ）。この知見はＨＥＫ２９３セルにより与えられる内因性ファク
ターもまた、Ｖ_1/2により決定されることを示唆している。１ｍＭまでのｃＧＭ
Ｐ濃度では、ＳＰＩＨチャンネルの振幅は変化しなかった。本実施例から、ｃＧ
ＭＰではなくｃＡＭＰがＳＰＩＨチャンネル活性を調節することができるという
結論を導くことができる。そのようにして、ＣＮＧチャンネルとは対照的に（フ
ィンら、１９９６）、ＳＰＩＨは電圧とｃＡＭＰの二重の管理下にある。細胞外
Ｃｓ⁺によるＳＰＩＨチャンネルの遮断を、図２Ｃの電圧プロトコルでのｏｕｔ
ｓｉｄｅ−ｏｕｔ膜で調べた。ＳＰＩＨチャンネルは濃度および電圧に依存する
形でＳＰＩＨチャンネルを遮断する。１０ｍＭのＣｓ⁺の存在下、外部尾電流は
存在したままであるにもかかわらず、内部電流は完全に消滅した（図４Ａおよび
４Ｂ参照）。０〜１０ｍＭのＣｓ⁺存在下でのＩ／Ｖ相関を図４Ｃに示した。標
準化電流Ｉ／Ｉ_max（−７０ｍＶ）を［Ｃｓ⁺］に対してプロットした（図４Ｄ
）。プロットしたデータは２４５μＭの抑制定数Ｋ_iおよびｎ＝１．２のヒル係
数と適合した。ＳＰＩＨチャンネルのイオン選択性をｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ膜で
決定した。電流の振幅を増加させるため、バス溶液は常に０．１ｍＭのｃＡＭＰ
を含む。バス中の１００ｍＭのＫ⁺をＲｂ⁺、Ｎａ⁺、Ｌｉ⁺またはＣｓ⁺で置
換した（図４Ｅ）。浸透率はＰ_K：Ｐ_Rb：Ｐ_Na：Ｐ_Li：Ｐ_Csを１：０．７：０．
２６：０．１５：０．０６として計算した。ＳＰＩＨのイオン選択性は様々な脊
椎動物のＩ_hチャンネルのイオン選択性とよく一致する（ペイプ、１９９６；ウ
ルマスおよびヒル、１９９２）。細胞外膜がＮａ⁺のみ含む時、外部電流の振幅
が有意に変化しないにもかかわらず、内部電流がほほ完全に消滅した（図４Ｇ）
。［Ｋ⁺］_oの５ｍＭから２０ｍＭへの増加は内部電流を劇的に増加させた。こ
れらの結果はナトリウムがいかなる量存在していてもカリウムイオンが存在しな
い場合、ＳＰＩＨチャンネルはほとんど導電性を持たないことを示している。

【００４６】チャンネルタンパク質におけるメッセンジャーＲＮＡの発現をノーザンブロッ
トにより分析した。オスの性腺のポリ（Ａ）⁺ＲＮＡでは約３．３ｋｂの主転写
産物と２．９ｋｂの副転写産物を検出したが、メスではこれらは検出されなかっ
た。転写産物の大きさはクローンされたｃＤＮＡの大きさ（３ｋｂ）とよく一致
している。ＳＰＩＨ特異性プローブはウニの消化管から分離したポリ（Ａ）⁺Ｒ
ＮＡとハイブリダイズしなかった（図５Ａ）。オスの性腺でのＳＰＩＨｍＲＮ
Ａの排他的発現はチャンネルが精液中で発現することを示唆している。この仮定
をチャンネルポリペプチド（残基６６２〜７６７）のＣ末端領域の融合タンパク
質に配向する精製した抗体ＦＰｃ４４ＫおよびＦＰｃ４５Ｋで試験した。これら
の抗体はウエスタンブロット分析（図５Ｃ）および免疫細胞化学（図５Ｂ）で使
用された抗体である。これらの抗体はいずれもウニ精液から精製した鞭毛膜のウ
エスタンブロットのＭ_rが９２Ｋまでの主バンドを認識した（図５Ｃ列３）。精
子の頭部から精製した膜は抗体を認識しなかった（図５Ｃ列５）。この結果は個
々の精液の免疫細胞化学により確認した。抗体ＦＰｃ４５Ｋはほぼ排他的に精子
鞭毛膜を染色する（図５Ｂ）。いくつかの頭部構成体の弱い染色はおそらく抗体
の非特異的な交差反応性を示している。Ｍ_rが８８Ｋまでのバンドがトランスフ
ェクトされたＨＥＫ２９３セルウエスタンブロットで観察された（図５Ｃ列２）
。ＨＥＫ２９３セル中に発現したチャンネルポリペプチドのＭ_rは誘導アミノ酸
配列（８７．９Ｋ）のものであると予想されるＭ_rの値とほぼ同一である。トラ
ンスフェクトされていないＨＥＫ２９３細胞において、抗体による８８Ｋポリペ
プチドが検出されなかった（図５Ｃ列１）。鞭毛膜のアルカリホスホファターゼ
での処理により、天然ポリペプチドのＭ_rは９２Ｋまでから、８８Ｋまでへと低
下した。天然および非相同発現のポリペプチドは類似の大きさであるので、クロ
ーンされたｃＤＮＡはＳＰＩＨの完全なコード配列を運搬する。脱リン酸条件下
でのＭ_rのわずかな減少は、脱リン酸された形態の天然ポリペプチドが電気泳動
移動度がわずかに減少した状態で存在していることを示している。大部分の脱リ
ン酸実験では、９２Ｋから８８Ｋへのシフトは完全ではなく、最低２つの中間バ
ンドが観察された。この結果はチャンネルポリペプチドが数回脱リン酸されてい
ることを示唆している。ＳＰＩＨチャンネルはＰＫＡ、ＰＫＧ、ＰＫＣおよびチ
ロシンキナーゼによる脱リン酸に関する配列モチーフを保有する（図１Ａ参照）
。

【００４７】明瞭な電気物理学特性は、ＳＰＩＨをＩ_hチャンネル系統族の一員として確認
する。しかし、ＳＰＩＨと脊椎動物のＩ_hチャンネルの間での特性の相違点につ
いても言及しておく。第一に、ｃＡＭＰが存在しない場合、ＳＰＩＨ電流は過渡
的であるが、ｃＡＭＰの存在下での経時変化は脊椎動物のものと類似している。
第二に、ｃＡＭＰによるＳＰＩＨチャンネル電流の大幅な増加は主に最大電流の
増加によって起こるが、Ｖ_1/2が最大振幅に影響することなくより正にシフトす
るよう（ディフランチェスコ、１９９３）、心臓のＩ_hチャンネルを調節する（
イングラムおよびウイリアムズ、１９９６；アッチーリら、１９９７）。最後に
、心臓Ｉ_hはミクロモル濃度のｃＧＭＰによっても調節されるが（ディフランチ
ェスコおよびトルトラ、１９９１）、ＳＰＩＨは前記効果を呈さない。ＳＰＩＨ
チャンネルは電圧制御のＫ⁺チャンネルとＣＮＧカチオンチャンネルのいずれも
に非常に類似している。Ｉ_hチャンネルが電圧制御のチャンネル系統族の範疇に
含まれているということである。ＳＰＩＨは減極により開放するＫ⁺、Ｎａ⁺お
よびＣａ²⁺のような電圧センサー（Ｓ４）の特性モチーフを有する。しかし、過
分極により活性化されるチャンネルにおいて電圧センサーとしてＳ４モチーフを
除外する重要な理由はなく、ＨＥＲＧ−Ｋ⁺チャンネルの活性機構のようなもの
も考えられる（トルドゥら、１９９５；スミスら、１９９６）。ＨＥＲＧの強い
内部修正に関して、それは正電圧時にチャンネルが閉止する不活性化の結果であ
るが、チャンネルは負電圧時、不活性化から急速に回復することが実証されてい
る。ＨＥＲＧチャンネルにおいて、不活性化は活性化よりもはるかに速く、その
ため反応速度論的には認識できない（スミスら、１９９６）。ＣＮＧチャンネル
と共に、ＳＰＩＨは環状ヌクレオチドの結合領域を有し、その特性はｃＡＭＰに
より調節される。ｃＡＭＰはおそらく高度に保護された環状ヌクレオチド結合領
域と結合することにより、ＳＰＩＨの活性を増強させる。ＣＮＧチャンネルにお
いて、ｃＧＭＰに対する高選択性に関し、該選択性がＴｈｒ残基（桿体視細胞の
αサブユニットにおけるＴ３６３、アルテンフフェンら、１９９１）およびＡｓ
ｐ残基（γＣＮＧαにおけるＤ６０４、バーナムら、１９９５）を伴うことが実
証されている。ＳＰＩＨは対応する部位にＶａｌおよびＩｌｅ残基を有し、これ
らの部位はＳＰＩＨのリガンド選択性を制御していると考えられている。精子の
鞭毛膜におけるＩ_hチャンネルの物理学的重要性は以下のように説明できる。走
化性ペプチドｓｐｅｒａｃｔを有するＳ．ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓｓｐｅｒｍの
刺激作用は過分極を引き起こし（リーおよびガーバーズ、１９８６；ガーバーズ
、１９８９）、それはＫ⁺チャンネルの開放によるものと考えられている（バブ
コックら、１９９２）。より高いペプチド濃度では、過分極に続いて減極が起こ
る。異なる選択性および薬理学特性を有する２つ（または２以上）のイオンチャ
ンネルタイプがｓｐｅｒａｃｔに誘発される減極に寄与し得る（ダースゾンら、
１９９６参照）。前記チャンネルの１つは、弱Ｋ⁺選択性（Ｐ_{Na/ Pk}＝０．２）
と、ｃＧＭＰではなく、ｃＡＭＰによりかなり増強される非常に低いＰ_o（Ｖ_m ＝０ｍＶ）を有する（ラバルカら、１９９６）。これらの観察は前記チャンネル
が実際ＳＰＩＨであることを示唆している。ｓｐｅｒａｃｔ誘発性の過分極はＳ
ＰＩＨチャンネル活性を誘起することができ、該活性は電圧依存性のアデニル酸
シクラーゼによって（ベルトランら、１９８０）、同時に起こるｃＡＭＰレベル
の増加によって拡大されうる（ハンブロースら、１９８０）。与えられた海水の
イオン組成および０．２〜０．４のＰ_Na／Ｐ_KでＳＰＩＨチャンネルの開放およ
びその後のＮａ⁺の流入はｓｐｅｒａｃｔ誘発性の減極に影響し得る。Ｉ_hチャ
ンネル、例えば心臓細胞または視床ニューロンのもの、が膜電圧の振動に関与し
、それにより鞭毛中のＣａ²⁺の振動を引き起こすことも合理的に考え得る（スア
レスら、１９９３）。［Ｃａ²⁺］_iの変化は鞭毛の振動を変化させ、それにより
走化性反応に寄与しうる。

【００４８】（実施例）手法ｃＤＮＡクローンの分離２つの退化プライマー（Ｎｏ．１７６４、Ｎｏ．１７７２）を用いて、一本鎖
ｃＤＮＡ（ウニ性腺、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（キイロショウジョウバエ）ｍａｌ
ａｎｏｇａｓｔｅｒ、ウシ網膜、ラットの臭覚組織から）またはｃＤＮＡライブ
ラリー（ヒト視床または心臓から）上でＰＣＲを実施した。１００μｌＰＣＲバ
ッチの組成は以下の通り。一本鎖ｃＤＮＡ３〜１０ｎｇ、ｃＤＮＡライブラリー
約１０⁵ｐｆｕ、退化プライマー１．６μｇ、ＰＣＲバッファ１倍、ｄＮＴＰ２
ｍＭ、ＰｒｉｍｅＺｙｍｅ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ）１Ｕ。ＰＣＲバッチは最初９４
℃で２分間変性させ、その後下記の手順で４５サイクル培養した。変性９４℃、４５秒ハイブリダイズ４８℃、４５秒重合７２℃、４０秒退化されたプライマーの配列（５’→３’）は以下の通りである。Ｎｏ．１７６４：CTGACTGCAGARGTNTTYCARCCNGGNGA （配列番号１６）Ｎｏ．１７７２：ATCGGAATTCNCCRAARTANGANCCRTC （配列番号１７）プライマーＮｏ．１７６４およびＮｏ．１７７２で増殖されたＰＣＲフラグメ
ントは放射能標識され、高ストリンジェント条件での完全ｃＤＮＡに対するｃＤ
ＮＡライブラリーをスクリーニングするプローブとして使用される。部分クロー
ンＨＨＩＨ（配列番号１１）は低ストリンジェントハイブリダイゼーションによ
り分離された。ハイブリダイゼーション条件は以下の通りである。

【表１】（１）１×ＳＳＣ：ＮａＣｌ１５０ｍＭ、クエン酸ナトリウム１５ｍＭ、ｐＨ
７．０（２）１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ：フィコール、ポリビニルピロリジン、ウシ血
清アルブミン（各０．２ｇ／ｌ）陽性ファージを分離し、ｃＤＮＡを生体内切除（λＺＡＰＩＩファージの場合
）により、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ誘導体に転換した。ｃＤＮＡはＥｃｏＲ
Ｉによりλｇｔ１１ファージから切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫプラスミ
ドＤＮＡにサブクローンした。ＤＮＡはジデオキシ媒介チェーンターミネーショ
ン法で配列を決定した（サンガーら、１９９７）。

【００４９】ノーザンブロット、ウエスタンブロット異なるウニ組織から分離したポリ（Ａ）⁺ＲＮＡをノーザンブロットにより分
析した。各列は約１０μｇのポリ（Ａ）⁺ＲＮＡを含む。ブロットは³²Ｐ標識１
０７４ｂｐｃＤＮＡフラグメント（ヌクレオチドポジション）で４２℃、５×
ＳＳＣ、５０％ホルムアミドでハイブリダイゼーションを行った。ＳＰＩＨポリ
ペプチドのＣ末端領域がマルトーゼ結合タンパク質との融合構成体として発現し
た。精製した融合タンパク質は、ポリクローナル抗体ＦＰｃ４４ＫおよびＦＰｃ
４５Ｋを作製するために使用された。該抗体はウサギ血清から、融合タンパク質
を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。精子鞭毛はダース
ゾンら（１９９４）により分離した。精製した鞭毛および頭部膜はＮａｃｌ１５
０ｍＭ、ＭｇＣｌ₂１ｍＭ、ＨＥＰＥＳ２０ｍＭ（ｐＨ７．５）、ＥＧＴＡ０．
１ｍＭおよび０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む溶液バッファ中で均質化
し、４０，０００ｒｐｍで６０分間遠心分離した。このプロセスを２回繰り返し
た。トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞は溶解バッファ（ＨＥＰＥＳ１０
ｍＭ、ＤＴＴ１ｍＭおよびＥＤＴＡ１ｍＭ（ｐＨ７．４））で均質化し、凍結乾
燥を５回行い（液体窒素中）、最後に５５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し
た。膜ペレットは溶液バッファに溶解させた。鞭毛膜タンパク質は３０℃の溶液
バッファ中で３０〜６０分間、１ユニットのアルカリホスファターゼを用いて脱
リン酸した。膜タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、イモビロン膜に変
性し、ポリクローナル抗体で標識した。免疫反応性はＥＣＬ検出キット（アマー
シャム社製）で確認できるようにした。個々の精子の免疫細胞化学分析は上記手
順で実施した（ワイナー、１９９７）。

【００５０】電気物理学ＳＰＩＨポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、先に示したようにＨＥＫ２９
３細胞中に過渡的に発現させた（ボーマンら、１９９４）。ＳＰＩＨの制御され
た電流をホールセル配列および無細胞膜パッチでのパッチクランプ法で記録した
。様々なバスおよびピペット溶液の組成を図中の記号で示す（下記参照）。チャ
ンネルは膜電圧を＋１０ｍＶから様々な負電圧値にステップさせることにより活
性化させた。チャンネルの開放確率の電圧依存性を＋１０ｍＶの尾電流から決定
した。ＳＰＩＨチャンネルのＣｓ⁺による遮断を１ｍＭｃＡＰＭを含むピペッ
ト溶液の存在下、ｏｕｔｓｉｄｅ−ｏｕｔ膜パッチを用いて分析した。バス中の
溶液は０．０３〜１０ｍＭのＣｓＣｌを含む。相対的なイオン透過性は、バスの
１００ｍＭのＫ⁺をＮａ⁺、Ｌｉ⁺、Ｒｂ⁺またはＣｓ⁺と置換した際、無細胞
ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ膜パッチで測定したＶ_revの個々のシフトから計算した。
かご状ｃＡＭＰまたはかご状ｃＧＭＰを用いた実験は先に示したようにして実施
した（ヘーゼンら、１９９６）。

【００５１】前記実験の結果を以下、より詳細に説明する。

【００５２】図１Ａは、ウニＩ_hチャンネル（ＳＰＩＨ）の核酸配列および派生アミノ酸配
列を示す。ヌクレオチドは、オープンリーディングフレームスタートコドンの最
初のヌクレオチド（ＡＴＧ）が＋１に対応するよう、５’→３’の方向で番号付
けした。ヌクレオチド＋１から５’の位置のヌクレオチドを負の数字で示した。
派生アミノ酸配列（１文字のコード）を核酸配列の下に示し、番号付けした。ス
タートコドン（ＡＴＧ）、対応するメチオニンおよびストップコドン（ＴＧＡ；
位置２３０２〜２３０４）はボールド体で記載した。スタートコドンより前にあ
る同一のリーディングフレーム中のストップコドンに下線を付した。位置２５０
１〜２５０７でのポリアデニル化信号に囲いを付した。ポア形成領域および環状
ヌクレオチドに対する結合部位の膜貫通セグメントＳ１〜Ｓ６の位置を核酸配列
の上方に線を付すことにより、印付けした。前記領域の制限は他の電圧依存性Ｋ ⁺ チャンネル、ＥＡＧ−Ｋ⁺チャンネルおよびＣＮＧチャンネルとの配列比較に
より定義した。ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ依存性キナーゼによるリン酸化に対するコン
センサス配列を三角（△）により印付けした。プロテインキナーゼによるリン酸
化に対するコンセンサス配列を丸（●）により印付けし、チオリンキナーゼによ
るリン酸化に対するコンセンサス配列を星印（＊）により印付けした。ＳＰＩＨ
配列（配列番号４）を計算分子量８７，９３７Ｄａの７６７アミノ酸のタンパク
質でコードした。

【００５３】図１ＢはウニのＩ_hチャンネルと他のチャンネルの電圧センサー（Ｓ４）モチ
ーフの比較を示す。一定の間隔で存在するＡｒｇまたはＬｙｓを枠で囲い、他の
正荷電の残基をボールド体で記載した。Ｓｈａｌｅｒ（ポングスら、１９８８）：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（キイロショウ
ジョウバエ）Ｓｈａｋｅｒ遺伝子によりエンコードされたＫ⁺チャンネルＤｍＥＡＧ（ワーンケら、１９９７）：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（キイロショウジ
ョウバエ）ＥＡＧチャンネルＫＡＴ１（アンダーソンら、１９９２）：Ａｒａｂｏｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉ
ａｎａのＫ⁺チャンネルｂｒＣＮＧＣα（カウップら、１９８９）：ウシ桿体視細胞からの環状ヌクレオ
チド制御性チャンネルのαサブユニット

【００５４】図１Ｃは、ＳＰＩＨのポアモチーフを電圧制御性および環状ヌクレオチド制御
性のイオンチャンネルの系統族の他の構成物のポアモチーフと共に示す。

【００５５】ＳＰＩＨの対応するアミノ酸と同一または類似の残基に黒または灰色の背景を
付して強調した。

【００５６】図１Ｄは、ｃＮＭＰ結合領域の配列比較を示す。ｂｏＣＮＧＣα：ウシ臭覚ニューロンのＣＮＧチャンネルのαサブユニット（ル
ジックら、１９９０）ＰＫＡ１：プロテインキナーゼＡのｃＡＭＰ結合部位１（チタニら、１９８４）
ＰＫＧ１：プロテインキナーゼＧのｃＧＭＰ結合部位１（タキオら、１９８４）
ＣＡＰ：カタボライト活性化タンパク質（アイバら、１９８２）環状ヌクレオチド結合モチーフの高保存性の残基を矢印で示し、ｂｒＣＮＧＣ
αのリガンド選択性を決定する残基を星印で示した．ＣＡＰのｃＡＭＰ結合領域
から導かれる二次構造の予測を配列に下線を付して示した。

【００５７】図２はＳＰＩＨチャンネルの電気物理学的特性を示す。

【００５８】図２Ａは、ホールセル配置のトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞で観察
された電流を示す。該電流は＋１０ｍＶの保持値から−１００ｍＶ〜＋１０ｍＶ
の様々な試験値まで１０ｍＶの増分でステップさせた。尾電流は試験値の電圧か
ら＋１０ｍＶまでステップし戻した際に記録された。ＨＥＫ２３９細胞は以下の
成分を含むバス溶液で洗浄された。バス溶液の組成（ｍＭ）：ＮａＣｌ１３５
、ＣａＣｌ₂ １．８、ＭｇＣｌ₂ ２．８、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ５（ｐＨ
７．４）；ピペット溶液の組成（ｍＭ）：ＫＣｌ１２６、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ
１０、ＥＧＴＡ１０（ｐＨ７．４）。

【００５９】図２Ｂは、図２Ａにおいて矢印で示した時間において、平衡条件下で測定した
電圧と電流の相関（Ｉ／Ｖ）をプロットしたものである。

【００６０】図２Ｃは、瞬間Ｉ／Ｖ相関を決定する際に使用した測定プロトコルを示したも
のであり、電圧は最初、０ｍＶの保持値から−７０ｍＶまでステップされ、次に
＋５０ｍＶ〜−７０ｍＶの範囲の試験値まで１０ｍＶの増分でステップさせた。

【００６１】図２Ｄは、図２Ｃの差し込み図で矢印で示した時間に測定した瞬間Ｉ／Ｖ相関
のプロットを示す。

【００６２】図２Ｅは、電圧を＋３０ｍＶまでリセットした際の尾電流の経時変化を示す。

【００６３】図２Ｆは、チャンネルの相対的な開放確率Ｐ_oの電圧依存性を示す。

【００６４】図３は、環状ヌクレオチドによるＳＰＩＨチャンネルの調節を示す。

【００６５】図３Ａは、１ｍＭのｃＡＭＰの存在下でのホールセルＳＰＩＨチャンネルの調
節を示す。電圧のステッププロトコルは図２Ａのものと同じである。バスの組成
（ｍＭ）は、ＮａＣｌ１３５、ＫＣｌ５、ＣａＣｌ₂ １．８、ＭｇＣｌ₂ ２．８、ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ５（ｐＨ７．４）で、ピペット溶液の組成（
ｍＭ）は、ＫＣｌ１２６、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ１０、ＥＧＴＡ１０（ｐＨ
７．４）、ｃＡＭＰ１ｍＭである。差し込み図は、Ｓ字形の経時変化をよりよ
く示すための拡大図である。

【００６６】図３Ｂは、＋１０ｍＶにおける標準化したホールセル尾電流から導きだした相
対的なＰ_o（●）と、ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔパッチにより記録された尾電流（△
）の電圧依存性を示す。実線はデータのボルツマン式への適合度を示す。図３Ａ
のホールセル電流に対するＶ_1/2は−５０．８ｍＶであり、図３Ｅのｉｎｓｉｄ
ｅ−ｏｕｔパッチ電流に対するＶ_1/2は−８４．５ｍＶであり、Ｑ値は各々３．
８、２．７であった。

【００６７】図３Ｃは、かご状ｃＡＭＰの光分解によるホールセルＳＰＩＨ電流の調節を示
す。ピペット溶液は１００μＭのかご状ｃＡＭＰを含む。ＳＰＩＨ電流はＵＶフ
ラッシュを行う前の＋１０ｍＶから−７０ｍＶまでの電圧ジャンプにより誘発さ
れ（線１）、３回連続のＵＶフラッシュによっても誘発された（線２）。−７０
ｍＶでフラッシュにより誘発された電流の経時変化を下図に示す。

【００６８】図３ＤおよびＥは、バス中にｃＡＭＰが存在しない状態（Ｄ）および１ｍＭの
ｃＡＭＰ存在下（Ｅ）での電圧誘発性のＳＰＩＨ電流を示す。電圧のステッププ
ロトコルは図２Ａと同じである。ピペット溶液およびバス溶液の組成（ｍＭ）は
ＫＣｌ１２６、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ１０、ＥＧＴＡ１０（ｐＨ７．４）お
よびｃＡＭＰ１ｍＭ（バス溶液のみ）である。

【００６９】図３Ｆは、ＳＰＩＨ電流の振幅のｃＡＭＰ濃度依存性を示す。ｃＡＭＰの濃度
（μＭ）は、０．１、０．３、１、３、１０および１０００である。実線はデー
タのヒル係数への適合度を示すものであり、Ｋ_1/2＝０．７４μＭ、ｎ＝１．０
５での１０回の施行の平均である。

【００７０】図４は、ＳＰＩＨチャンネルの薬理学的特性を示す。

【００７１】図４ＡおよびＢは、バス溶液中にＣｓ⁺が存在しない状態（Ａ）および１０ｍ
ＭのＣｓ⁺の存在下（Ｂ）でのｏｕｔｓｉｄｅ−ｏｕｔパッチで記録された電圧
誘発性のＳＰＩＨ電流を示すものであり、ピペット溶液の組成（ｍＭ）は、ＫＣ
ｌ１２４、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ１０、ＥＧＴＡ１０（ｐＨ７．４）および
ｃＡＭＰ１ｍＭであり、バス溶液の組成はＫＣｌ１２６、ＨＥＰＥＳ−ＫＯ
Ｈ１０、ＥＧＴＡ１０（ｐＨ７．４）であり、ＣｓＣｌの濃度は図示した通
りである。

【００７２】図４Ｃは、バス中に０〜１０ｍＭのＣｓ⁺が存在する場合のＩ／Ｖ相関を示す
。

【００７３】図４Ｄは、−７０ｍＶでの標準化電流の［Ｃｓ⁺］依存性を示す。実線は前記
データのヒル係数への適合度であり、Ｋ_i＝２４５μ_Mであり、ヒル係数は１．
２（１〜６回の施行の平均）である。

【００７４】図４Ｅは、ＳＰＩＨチャンネルのイオン選択性を示す。Ｖ_revはｉｎｓｉｄｅ
−ｏｕｔパッチで保持電圧（−７０ｍＶ）から−３０ｍＶ〜＋３０ｍＶの範囲内
の試験値まで５ｍＶの増分でステップすることで決定した。ピペット溶液の組成
（ｍＭ）はＫＣｌ１５０、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ１０、ＥＧＴＡ１０（ｐＨ
７，４）であり、バス溶液の組成（ｍＭ）は、ＫＣｌ５０、ＸＣｌ１００、
ＨＥＰＥＳ−ＮＭＤＧ１０、ＥＧＴＡ１０（ｐＨ７．４）およびｃＡＭＰ
０，１である。

【００７５】図４Ｆは、図４Ｅに示した電流でのＩ／Ｖ相関を示す。Ｖ_revは１６．９ｍＶ
Ｎａ⁺）、２０．６ｍＶ（Ｌｉ⁺）、５．６ｍＶ（Ｒｂ⁺）、２４．６ｍＶ（Ｃ
ｓ⁺）である（３〜１０回の施行の平均）。相対的なイオン透過性Ｐ_X／Ｐ_Kは
下記の式を用いて計算した。Ｐ_X／Ｐ_K＝｛［Ｋ⁺］_o−［Ｋ⁺］_jｅｘｐ（ｚＦＶ_rev／ＲＴ）｝／［Ｘ ⁺ ］_jｅｘｐ（ｚＦＶ_rev／ＲＴ）

【００７６】図４Ｇは、細胞外媒体中に０．５ｍＭおよび２０ｍＭのＫ⁺が存在する状態で
のホールセル内部Ｎａ⁺電流のＫ⁺依存性を示す。

【００７７】図４Ｈは、バスにＫ⁺が０、１、３、５、１０および２０ｍＭが存在する場合
の瞬間Ｉ／Ｖ相関を示す。

【００７８】ピペット溶液の組成は図４Ｂと同様であり、バス溶液の組成は指定したＫ⁺濃
度における図４Ａと同様である。イオン強度は各ＮＭＤＧ濃度と同じ値に調整し
た。

【００７９】図５は、ＳＰＩＨの発現パターンを示す。

【００８０】図５Ａは、ＳＰＩＨ転写産物の組織分布のノーザンブロット分析であり、列１
はオス性腺のｍＲＮＡに関し、列２はメス性腺のｍＲＮＡに関し、列３は腸細胞
のｍＲＮＡに関し、各々ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡは１０μｌである。

【００８１】図５Ｂはウェスタンブロット分析を示すものであり、列１は擬似トランスフェ
クト（ｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）されたＨＥＫ２９３細胞に関し（タンパ
ク質２．５μｇ）、列２はＳＰＩＨｃＤＮＡでトランスフェクトされたＨＥＡ
２９３細胞に関し（タンパク質２．５μｇ）、列３はＳ．ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ
の精子からの精製した鞭毛に関し（タンパク質６μｇ）、列４は脱リン酸された
鞭毛膜に関し（タンパク質６μｇ）、列５は精子の頭部に関する（タンパク質１
５μｇ）。

【００８２】

【表２】

【００８３】文献 Accili,E.A.,Redaelli, G. and DiFrancesco, D.：ウサギ洞房結節筋細胞でのｃ
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【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】ウニＳｔｒｏｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓｐｕｒｐｕｒａｔｕ
ｓからのチャンネル（ＳＰＨＩチャンネル）起源の核酸およびチャンネルタンパ
ク質である。

【図１Ｂ】他の既知のチャンネル配列との比較として、前記チャンネルタン
パク質のＳ４モチーフを示す。

【図１Ｃ】他のチャンネルの他の配列との比較として、前記配列のポアモチ
ーフを示す。

【図１Ｄ】イオンチャンネルの他の配列との比較として、Ｉ_hイオンチャン
ネルのｃＤＮＡのｃＮＭＰ結合領域を示す。

【図２Ａ】＋１０ｍＶの保持電圧から、より負の試験値までの過分極電圧ス
テップにより誘発される複雑な波形を有する内部電流を示す。

【図２Ｂ】過分極電圧パルスの末端で決定される平衡電流／電圧（Ｉ／Ｖ）
の相関を示す。

【図２Ｃ】尾電流の振幅から、瞬間電流／電圧（Ｉ／Ｖ）の相関を決定する
ための測定プロトコルを示す。

【図２Ｄ】 −３０ｍＶの逆転電圧での、わずかに外側に修正された瞬間Ｉ／
Ｖの相関を示す。

【図２Ｅ】電圧の時間による変化に依存する尾電流の経時変化を示す。

【図２Ｆ】図２Ａに示したものと類似の＋１０ｍＶでの尾電流の振幅から決
定されるチャンネルが開放している相対確率Ｐ_oの電圧依存性を示す。

【図３Ａ】１ｍＭのｃＡＭＰの存在下での過分極による大きなホールセル電
流の誘発を示し、該電流は遅れて発生し、ゆっくりと平衡に達する。

【図３Ｂ】標準化されたホールセル尾電流およびｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔパッ
チの電流から決定されるＰ_oの電圧依存性を示す。

【図３Ｃ】短時間のＵＶ照射後の内部電流の振幅の急激な上昇を示す。

【図３Ｄ】ｃＡＭＰなしでの無細胞膜片のＳＨＩＨ電流を示す。

【図３Ｆ】０．７４μＭのＫ_1/2との単純な結合等温線と、１から明白には
離れていないヒル係数とによって示されるｃＡＭＰ濃度の電流依存性を示す。

【図４Ａおよび４Ｂ】Ｃｓ⁺によるＳＰＩＨチャンネルの遮断を示す（図４
Ａ：標準、図４Ｂ：＋１０ｍＭＣｓ⁺）。

【図４Ｃ】０〜１０ｍＭのＣｓ⁺存在下でのＩ／Ｖ相関を示す。

【図４Ｄ】Ｃｓ⁺と標準化された電流Ｉ／Ｉ_max（−７０ｍＶ）のプロット
を示す。

【図４Ｅ】バス中の１００ｍＭのＫ⁺を対応する濃度のＲｂ⁺、Ｎａ⁺、Ｌ
ｉ⁺またはＣｓ⁺で置き換えた場合のｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔパッチにおけるＳＰ
ＩＨチャンネルのイオン選択性を示す。

【図４Ｆ】図４Ｅで示した様々なイオン条件下でのＩ／Ｖ相関を示す。

【図４Ｇ】細胞外媒体にＮａ⁺を含む場合に、外部電流の振幅が変化しない
にもかかわらず内部電流がほぼ完全に遮断されることを示す。

【図４Ｈ】図４Ｇに示した異なるＫ⁺濃度の電流によるＩ／Ｖ相関を示す。

【図５Ａ】約３．３ｋｂの主転写産物と、約２．９ｋｂの副転写産物とを有
するチャンネルメッセンジャーＲＮＡのノーザンブロットを示す。

【図５Ｂ】Ｓ．ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓからの精子の光学顕微鏡写真（右図）
と、ＳＰＩＨチャンネルを特異的に識別する抗体を用いた対応する免疫組織化学
染色（左図）である。

【図５Ｃ】対応するウェスタンブロット分析を示す。

【図６】ＨＥＫ２３３セル中でのＳＰＩＨの非相同発現に使用されるｐｃＳ
ＰＩＨ構成体を示す概念図である。ｃＤＮＡ領域はをハッチバーで示し、プラス
ミドベクター（ｐｃＤＮＡＩ）の近接領域をボールド線で示した。プラスミド
ベクターにおけるｃＤＮＡの配向はＴ７ポリメラーゼに関するプロモーターと多
重クローン領域中の制限部位から推定される。挿入されたコザック配列をＫで示
す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１１年９月２５日（１９９９．９．２５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 25/00 Ａ６１Ｐ 25/20 ４Ｃ０８４ 25/04 Ｃ０７Ｋ 14/705 ４Ｃ０８６ 25/20 16/28 ４Ｈ０４５Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/28 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 5/10 33/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/68 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者ガウスレナータドイツ国ユーリッヒＤ−52428 アルトドルファーシュトラーセ 34 (72)発明者ショルテンアレキサンダードイツ国ドルマゲンＤ−41541 スチュールゼルベルガーシュトラーセ 18 (72)発明者セイフェルトラインハルトドイツ国アーヘンＤ−52062 ガスボルン 21 (72)発明者カウプベンジャミンドイツ国アーヘンＤ−52062 ザールシュトラーセ 86 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 AA40 DA12 DA13 DA14 DA77 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 HA14 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ02 QQ42 QQ53 QR08 QR55 QR62 QS25 QS34 4B064 AG01 CA19 CC24 DA03 DA13 4B065 AA01X AA57X AA87X AA90Y AA91Y AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 AA13 CA47 CA49 NA14 ZA052 ZA212 ZA402 ZC412 4C086 AA01 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA21 ZA40 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】Ｉ_hイオンチャンネルまたはその一部をコードする核酸、好ま
しくはＤＮＡ、若しくはそれらに相補的な核酸。
【請求項２】ヒト起源であることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項３】配列番号１の配列またはその一部よりなることを特徴とする請
求項２に記載の核酸。
【請求項４】ラット起源であることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項５】配列番号２の配列またはその一部よりなることを特徴とする請
求項４に記載の核酸。
【請求項６】ウシ起源であることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項７】配列番号３または配列番号１２の配列、若しくはそれらの一部
よりなることを特徴とする請求項６に記載の核酸。
【請求項８】ウニ起源であることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項９】配列番号４の配列またはその一部よりなることを特徴とする請
求項８に記載の核酸。
【請求項１０】Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（キイロショウジョウバエ）起源であ
ることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項１１】配列番号５の配列またはその一部よりなることを特徴とする
請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】配列が請求項１ないし１１のいずれか１の核酸と少なくとも
８０％の相同性を示すことを特徴とする核酸、好ましくはＤＮＡ。
【請求項１３】前記相同性が少なくとも９０％であることを特徴とする請求
項１２に記載の核酸。
【請求項１４】低ストリンジェント条件で配列番号１、２、３、４、５およ
び／または１２の配列とハイブリダイズすることを特徴とする核酸、好ましくは
ＤＮＡ。
【請求項１５】ストリンジェント条件で配列番号１、２、３、４、５および
／または１２の配列とハイブリダイズすることを特徴とする請求項１４に記載の
核酸。
【請求項１６】ＲＮＡであることを特徴とする請求項１ないし１５のいずれ
か１に記載の核酸。
【請求項１７】請求項１ないし１６のいずれか１の核酸によりエンコードさ
れるポリペプチド。
【請求項１８】イオンチャンネルの活性に影響を及ぼす物質を識別する上で
の請求項１ないし１６のいずれか１に記載の核酸および／または請求項１７に記
載のポリペプチドの使用方法。
【請求項１９】イオンチャンネルに関連する疾病の治療および／または診断
における請求項１ないし１６のいずれか１に記載の核酸および／または請求項１
７に記載のポリペプチドの使用方法。
【請求項２０】イオンチャンネルに影響を及ぼす物質の識別方法であって、
請求項１ないし１６のいずれか１の核酸および／または請求項１７に記載のポリ
ペプチドを試験対象の物質に接触させる段階よりなる識別方法。
【請求項２１】請求項１ないし１６のいずれか１の核酸および／または請求
項１７に記載のポリペプチドを用いて均質のチャンネル試料を作成する段階と、
前記チャンネル試料で物質を試験する段階よりなる請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】請求項１ないし１６のいずれか１または数項に記載の少なく
とも１の核酸および／または請求項１７に記載のポリペプチドよりなる、請求項
２０および／または２１に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項２３】心臓血管障害を検出する方法であって、請求項１ないし１６
のいずれか１に記載の核酸および／または請求項１７に記載するポリペプチドを
患者から採取した試料に接触させることを特徴とする方法。
【請求項２４】請求項１ないし１６のいずれか１に記載の核酸を患者から採
取した核酸と接触させ、それによりイオンチャンネル配列の存在および／または
欠如の指標である信号を得る段階よりなる請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】心臓血管障害、意識障害および／または痛みの治療および／
または予防目的での請求項１ないし１６のいずれか１に記載の核酸および／また
は請求項１７に記載のポリペプチドの使用方法。
【請求項２６】心臓血管障害が洞房結節の制御異常によることを特徴とする
請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】意識障害が視床神経の機能障害によることを特徴とする請求
項２５に記載の方法。
【請求項２８】１または２以上の請求項１ないし１６に記載の核酸、および
／または請求項１７に記載のポリペプチドよりなる薬剤組成物。
【請求項２９】請求項１ないし１６のいずれか１に記載の核酸を含む構成体
。
【請求項３０】請求項２９に記載の構成体を含む宿主細胞。
【請求項３１】請求項１７に記載のポリペプチドと反応する抗体。
【請求項３２】配列番号１、２、３、４、５および／または１２の核酸に特
異的な核酸サンプル。