JP2002506425A

JP2002506425A - Improved liquid chromatography media for polynucleotide separation

Info

Publication number: JP2002506425A
Application number: JP54717998A
Authority: JP
Inventors: グジエルド，ダグラス・テイ; テイラー，ポール・デイ
Original assignee: トランスジエノミツク・インコーポレーテツド
Priority date: 1997-04-25
Filing date: 1998-04-24
Publication date: 2002-02-26
Also published as: AU725928B2; CA2285307A1; EP1027121A1; EP1027121A4; AU7157798A; WO1998048914A1

Abstract

(57)【要約】約0.5〜100ミクロンの平均直径を有する非多孔質ビーズは、当該ビーズが、ポリマーで被覆されるまたは本質的に全部の表面基質基を非極性炭化水素もしくは置換された炭化水素基でエンドキャッピングされている非多孔質粒子を含んで成る場合に、ポリヌクレオチドの混合物のクロマトグラフィー分離に適する。当該ビーズはマッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーを使用するポリヌクレオチドの効率的な分離を提供する。 (57) [Summary] Non-porous beads having an average diameter of about 0.5-100 microns can be obtained by coating the beads with a polymer or end capping essentially all surface substrate groups with non-polar or substituted hydrocarbon groups. Suitable for chromatographic separation of a mixture of polynucleotides, if the mixture comprises non-porous particles. The beads provide for efficient separation of polynucleotides using matched ion polynucleotide chromatography.

Description

【発明の詳細な説明】ポリヌクレオチド分離のための改良された液体クロマトグラフィー媒体発明の分野本発明は非多孔質ビーズを使用するポリヌクレオチドの分離に向けられる。より具体的には、本発明は、非多孔質ビーズを含有するクロマトグラフィーカラムを使用するクロマトグラフィーによる一本鎖および二本鎖双方のポリヌクレオチドのクロマトグラフィー分離に向けられ、ここで、ビーズは、ポリマーもしくは非極性の置換ポリマーで被覆され、そして／または本質的に全部の表面基質基(s urface substrate group)が非極性炭化水素もしくは非イオン性の置換炭化水素で置換されている有機もしくは無機いずれかの粒子を含んで成る。発明の背景ＤＮＡのようなポリヌクレオチドの分離は、伝統的にスラブゲル電気泳動もしくはキャピラリー電気泳動を使用して実施されている。しかしながら、ポリヌクレオチドの液体クロマトグラフィー分離は、分析を自動化しそしてそれらが分離された後に画分を収集する能力のためより重要になっている。従って、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）によるポリヌクレオチド分離のためのカラムがより重要になっている。シリカを基材としたカラムははるかに最も普遍的なＬＣカラムである。これらのうち、逆相のシリカを基材としたカラムが好ましい。なぜならそれらは高分離効率を有し、機械的に安定であり、そして多様な官能基が多様なカラム選択性のために容易に結合され得るからである。シリカを基材とした逆相カラム材料は一本鎖ＤＮＡを分離するために十分に作動しているとは言え、これらの材料は二本鎖ＤＮＡを分離するために十分に作動していない。シリカを基材とした材料を使用する二本鎖ＤＮＡ分離からのピークはよくない形状を有するかもしくは幅広く、または二本鎖ＤＮＡは溶出することさえできない。分離は数時間までかかり得るか、もしくは分離度、ピーク対称性および分離の感度が不十分である。ＤＮＡ分離のための高品質材料は、米国特許第５，５８５，２３６号に開示されるようなポリマー性担体を基礎としている。二本鎖ＤＮＡの分離に適するシリカを基材としたカラム充填材料(packing material)および他の材料に対する要求が存在する。発明の要約従って、本発明の一目的は、改良された分離および効率でポリヌクレオチドを分離するためのクロマトグラフィーの方法を提供することである。この目的、および以下の詳細を読むことから明らかになるであろう本発明の他の目的は、本発明の方法により達成されており、ここで、ポリヌクレオチドは非多孔質ビーズを含有するカラムを使用してクロマトグラフィーで分離され、ここでビーズは、ポリマーもしくは非極性の置換ポリマーで被覆され、そして／または本質的に全部の表面基質基を非極性炭化水素もしくは非イオン性の置換炭化水素で置換されている有機もしくは無機いずれかの粒子を含んで成る。ポリヌクレオチドの混合物の分離方法が本明細書で開示される。当該方法は、 1500までの塩基対を有するポリヌクレオチドの混合物を0.5ないし100ミクロンの平均直径を有するビーズを含有する分離カラムを通して流すこと、そしてポリヌクレオチドの混合物を分離することを含んで成る。当該ビーズは、炭化水素もしくは非極性の置換ポリマーで被覆されたか、または本質的に全部の表面基質基を非極性炭化水素もしくは置換された炭化水素基と反応されている非多孔質粒子を含んで成る。予防措置が、それらが多価陽イオン汚染物質を本質的に含まずかつビーズがいかなる残余の表面の金属汚染物質も除去するように例えば酸洗浄処理により処理されるように、ビーズの製造の間にとられる。一態様において、ビーズは最低0.05の（下で定義されるような）ＤＮＡ分離係数を有することを特徴とする。好ましい一態様においては、ビーズは最低0.5のＤＮＡ分離係数を有することを特徴とする。分離は、好ましくは、下に定義されるようなマッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー(Matched Ion Polynucleotide Chromatography)（ＭＩＰＣ）による。ビーズは、好ましくは、約１〜５ミクロンの平均直径を有する。非多孔質粒子は、好ましくは、シリカ、シリカカーバイド、亜硝酸シリカ、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ジルコニウム、炭素、セルロースのような不溶性多糖、およびケイソウ土、もしくは非多孔質であるよう修飾されているこれらの材料のいずれかから選択される。非多孔質粒子は最も好ましくはシリカであり、これは、好ましくは未反応シラノール基を本質的に含まない。粒子は、非共有結合コーティング、共有結合コーティング、もしくは炭化水素基とのシラノール基の反応により製造され得る。非多孔質粒子はポリマーで被覆され得る。当該ポリマーは、好ましくは、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリアミド、セルロース、ポリジメチルシロキサンおよびポリジアルキルシロキサンから選択される。当該ポリマーは、場合によっては、置換されないかまたは炭化水素基もしくは非イオン性置換基を有する他の基で置換される。ポリマーは、場合によっては、１から1,000,000個までの炭素を有する炭化水素基で置換され得、この炭化水素基は、場合によっては、１から100個までの炭素、そして好ましくは１から24個までの炭素をもつアルキル基である。24から1,000,000までの炭化水素基は本明細書で炭化水素ポリマーとして記述され、そして本明細書で定義されるような炭化水素基の構成(constit uency)を有する。有機シラノール（例えばＨＯ−Ｓｉ−Ｒ₃）もしくはアルコキシ（例えばＲＯ −Ｓｉ−Ｒ₃）シランのシリカ支持体(supports)との重合を伴わない反応もまた良好な充填物を生じ得る。当該方法は、アルキルもしくはアルキル置換の官能基、エステル、シアノ、および他の非イオン性基の密度の大きい単層を生じさせる。単官能基のジメチルシラン（Ｘ−Ｓｉ（ＣＨ₃）₂−Ｒ）の使用は、最小限の残余のＳｉ−ＯＨ基をもつ均質な有機コーティングを提供する。モノクロロシラン試薬が、必要とされる有機官能性が準備され得る場合は好ましい。これらの反応は再現可能でありかつ高品質の充填物材料を提供する。未反応の接近可能なシラノールが最初の反応後に残され得る。当該非多孔質粒子は、好ましくは、トリ（低級アルキル）クロロシラン（好ましくはトリメチルクトトシラン）でエンドキャッピングされて(endcapped)被覆もしくは炭化水素置換の後の残余の反応性シラノール部位を封鎖する。あるいは、シラノール部位の全部が、全部の反応性シラノール基を失わせるように過剰のエンドキャッピング試薬と反応され得る。非多孔質粒子のエンドキャッピングは、トリアルキルクロロシラン（例えばトリメチルクロロシラン）のような対応する炭化水素置換されたシランとの非多孔質粒子の反応、もしくはジクロロテトラアルキルジシラザン（例えばジクロロテトラメチルジシラザン）のような対応する炭化水素置換されたジシラザンとの反応により遂げられ得る。本発明の方法は、約1500ないし2000までの塩基対を有する二本鎖ポリヌクレオチドを分離するのに使用され得る。多くの場合、当該方法は、600までの塩基もしくは塩基対を有する、または５ないし80までの塩基もしくは塩基対を有するポリヌクレオチドを分離するのに使用される。当該方法は、10,000psiより大きくない背圧を生じるように20℃ないし90℃の範囲内の温度で実施される。当該方法はまた、好ましくは、水溶性である有機溶媒も使用する。この溶媒は、好ましくは、アルコール、ニトリル、ジメチルホルムアミド、エステルおよびエーテルから成る群から選択される。当該方法はまた、好ましくは、酢酸トリアルキルアミン、炭酸トリアルキルアミンおよびリン酸トリアルキルアミンから選択される対イオン剤も使用する。最も好ましい対イオン剤は酢酸トリエチルアンモニウムもしくはトリエチルアンモニウムヘキサフルオロイソプロピルアルコールである。当該方法はまた、好ましくは、分離カラムに進入する溶液に、それの中に保持されるもしくはそれを通って流れるプロセス溶液(process solution)を接触するプロセス溶液接触表面を有する成分を供給し(supplying)そして送る(feeding)ことを含んで成る。プロセス溶液接触表面は、それの中に保持されるもしくはそれを通って流れる水性溶液中に多価陽イオンを放出しない材料であり、その結果カラムおよびその内容物が多価陽イオンの汚染から保護される。プロセス溶液接触表面は、好ましくは、チタン、被覆ステンレス鋼、不動態化ステンレス鋼および有機ポリマーから成る群から選択される材料である。カラムに進入する溶離液溶液およびサンプル溶液中の多価陽イオンはまた、好ましくは、樹脂床を多価陽イオンの汚染から保護するように溶液がカラムに進入する前に溶液を多価陽イオン捕捉樹脂と接触させることによっても除去される。多価捕捉樹脂は陽イオン交換樹脂およびキレート樹脂から選択される。カラム、およびその中に保持されるもしくはそれを通って流れるプロセス溶液は、好ましくは多価陽イオン汚染物質を本質的に含まない。ポリヌクレオチドはマッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーにより分離される。 1500までの塩基対を有するポリヌクレオチドの混合物を0.5ないし100ミクロンの平均直径を有するビーズを含有する分離カラムを通して流すこと、そしてポリヌクレオチドの混合物をマッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーにより分離することを含んで成る、ポリヌクレオチドの混合物の分離方法もまた本明細書で開示される。当該ビーズは、ポリマーで被覆された、または本質的に全部の表面基質基を非極性炭化水素もしくは置換された炭化水素基と反応および／もしくはそれでエンドキャッピングされている非多孔質粒子を含んで成る。当該ビーズは最低0.05のＤＮＡ分離係数を有することを特徴とする。カラム、およびその中に保持されるもしくはそれを通って流れるプロセス溶液は、多価陽イオン汚染物質を本質的に含まない。当該方法は、10,000psiより大きくない背圧を生じるように20℃ないし90℃の範囲内の温度で実施される。水溶性である有機溶媒が当該方法の実施において使用される。ポリマーで被覆された非多孔質粒子を含んで成るビーズもまた本明細書で開示される。当該ビーズは0.5ないし100ミクロンの平均直径を有し、また、最低0.05のＤＮＡ分離係数を有することを特徴とする。好ましい一態様において、当該ビーズは最低0.5のＤＮＡ分離係数を有することを特徴とする。当該ビーズは、好ましくは約１〜５ミクロンの直径を有する。非多孔質粒子は、好ましくは、シリカ、シリカカーバイド、亜硝酸シリカ、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ジルコニウム、炭素、セルロースのような不溶性多糖、およびケイソウ土、もしくは非多孔質であるよう修飾されているこれらの材料のいずれかから選択される。非多孔質粒子は、最も好ましくはシリカであり、これは好ましくは最小限のシラノール基を有する。当該ポリマーは、好ましくは、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリアミド、セルロース、ポリジメチルシロキサンおよびポリジアルキルシロキサンから選択され、そして、好ましくは置換されないか、アルキル化されるか、またはアルキルもしくはアリール置換されるか、あるいはメチル置換もしくはエチル置換された置換アルキル基でアルキル化される。当該ポリマーは、１〜22個の炭素原子、好ましくは８〜18個の炭素原子を有するアルキル基でアルキル化され得る。本質的に全部の表面基質基を、炭化水素基と反応されそしてその後非極性炭化水素もしくは置換された炭化水素基、好ましくはトリ（低級アルキル）クロロシランもしくはテトラ（低級アルキル）ジクロロジシラザンでエンドキャッピングされている非多孔質粒子を含んで成るビーズもまた本明細書に開示される。当該ビーズは0.5ないし100ミクロンの平均直径を有し、そして最低0.05のＤＮＡ分離係数を有することを特徴とする。当該ビーズは、好ましくは約１〜５ミクロンの直径を有する。当該非多孔質粒子は、好ましくは、シリカ、シリカカーバイド、亜硝酸シリカ、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ジルコニウム、炭素、セルロースのような不溶性多糖、およびケイソウ土、もしくは非多孔質であるよう修飾されているこれらの材料のいずれかから選択される。非多孔質粒子は最も好ましくはシリカであり、これは好ましくは最小限のシラノール基を有する。非多孔質粒子のエンドキャッピングは、トリメチルクロロシランもしくはジクロロテトライソプロピルジシラザンとの非多孔質粒子の反応により遂げられ得る。図面の簡単な説明図１は、ＤＮＡ分離係数が分離にどのように適用されるかの略図的表示である。図２は、シリカコア(silica core)およびエンドキャッピングシールド(endcap ping shielding)をもつ逆相ビーズの代表物の断面の略図である。図３は、シリカコアおよびポリマーシールドをもつ逆相ビーズの代表物の断面の略図である。図４は、アルキル化されたポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズを含有するカラムでのｐＵＣ１８ＤＮＡ−ＨａｅIII消化断片のＭＩＰＣ分離である。ピークは、溶離された断片の塩基対の数で印をつけられる(labeled)。図５は、誘導体化されないポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）の非多孔質の2. 1ミクロンのビーズを含有するカラムでのｐＵＣ１８ＤＮＡ−ＨａｅIII消化断片のＭＩＰＣ分離である。図６は、溶媒としてアセトニトリルを使用して正のエンタルピーを示すアルキル化されたポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズでの保持係数１／Ｔ［°Ｋ^-1］のファントホッフプロットである。図７は、溶媒としてアセトニトリルを使用して正のエンタルピーを示す誘導体化されないポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズでの保持係数１／Ｔ［° Ｋ^-1］のファントホッフプロットである。図８は、溶媒としてメタノールを使用して負のエンタルピーを示すアルキル化されたポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズでの保持係数１／Ｔ［°Ｋ^-1 ］のファントホッフプロットである。図９はアルキル化されたビーズおよび溶媒としてアセトニトリルを使用する分離である。図１０はアルキル化されたビーズおよび溶媒として50.0％メタノールを使用する分離である。図１１はアルキル化されたビーズおよび溶媒として25.0％エタノールを使用する分離である。図１２はアルキル化されたビーズおよび溶媒として25.0％ウオツカ（ストリクナヤ(Stolichnaya)、100プルーフ）を使用する分離である。図１３はアルキル化されたビーズおよび溶媒として25.0％１−プロパノールを使用する分離である。図１４はアルキル化されたビーズおよび溶媒として25.0％１−プロパノールを使用する分離である。図１５はアルキル化されたビーズおよび溶媒として10.0％２−プロパノールを使用する分離である。図１６はアルキル化されたビーズおよび溶媒として10.0％２−プロパノールを使用する分離である。図１７はアルキル化されたビーズおよび溶媒として25.0％ＴＨＦを使用する分離である。図１８はアルキル化されないポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズでのアイソクラチック／勾配分離である。発明の詳細な記述その最も一般的な形態において、本発明の主題は、約0.5〜100ミクロン；好ましくは１〜10ミクロン；より好ましくは１〜５ミクロンの平均直径を有する非多孔質ビーズで充填されたカラムを利用するマッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーによるポリヌクレオチドの分離である。1.0〜3.0ミクロンの平均直径を有するビーズが最も好ましい。米国特許第５，５８５，２３６号において、ボン(Bonn)らは、このポリヌクレオチド分離方法を逆相イオン対形成(ion pairing)クロマトグラフィー（ＲＰＩＰＣ）として特徴づけた。しかしながら、ＲＰＩＰＣは本発明に記述されるある不可欠の特徴を組み込まないため、別の用語、マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー（ＭＩＰＣ）が選択された。本明細書で使用されるところのＭＩＰＣは、非極性ビーズを使用して一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドを分離する方法と定義され、ここで当該方法は対イオン剤、およびビーズからポリヌクレオチドを脱着するための有機溶媒を使用し、また、ここで、ビーズは最低0. 05のＤＮＡ分離係数を有すると特徴づけられる。好ましい一態様においては、ビーズは最低0.5のＤＮＡ分離係数を有すると特徴づけられる。本発明のビーズの性能は、二本鎖および一本鎖ＤＮＡのＭＩＰＣによる高効率分離により立証される。われわれは、ビーズの性能を測定するための最良の基準がＤＮＡ分離係数であることを見出した。これは、ｐＵＣ１８ＤＮＡ−Ｈａｅ III制限消化物の257および267塩基対の二本鎖ＤＮＡ断片の分離度として測定され、ここで、ピークの間の谷からピークの一方の頂上までの距離は基線(baseline)から谷までの距離を越える。図１の図解表示を参照すれば、ＤＮＡ分離係数は、基線からピーク「ｂ」と「ｃ」との間の谷「ｅ」までの距離「ａ」、および谷「ｅ」からピーク「ｂ」もしくは「ｃ」の一方の頂上までの距離「ｄ」を測定することにより決定される。ピーク高が同等でない場合、最高のピークが「ｄ」を得るのに使用される。ＤＮＡ分離係数はｄ／（ａ＋ｄ）の比である。この図解表示中の257および267塩基対のピークは高さが類似である。本発明の操作上の(operational)ビーズは最低0.05のＤＮＡ分離係数を有する。好ましいビーズは最低0.5のＤＮＡ分離係数を有する。至適の一態様においては、ビーズは最低0.95のＤＮＡ分離係数を有する。理論により束縛されることを願わず、われわれは、本明細書で明記されるようなＤＮＡ分離係数に従うビーズは、分離されているポリヌクレオチドをビーズに進入することから本質的に排除する孔径を有すると考える。本明細書で使用されるところの「非多孔質」という用語は、その中で使用される溶媒媒体中での分離での最小のＤＮＡ断片の大きさおよび形状より小さい直径を有する表面孔を有するビーズを示すことを定義される。それらの本来の状態でこれらの明記された最大の大きさの制限を有する、もしくは必要とされる最大有効孔径を合致させるためにそれらの孔径を減少させるよう処理されたビーズが、本定義に包含される。好ましくは、最低0.05のＤＮＡ分離係数を提供する全部のビーズは、「非多孔質」ビーズの定義内に包含されることを意図される。本発明の非多孔質ビーズの表面の配座は、分離過程を妨害しないくぼみ(depre ssions)および浅いたて穴(pit)様構造を包含し得る。それを非多孔質にするための多孔質ビーズの前処理は、ビーズ構造中の孔を満たすことができかつＭＩＰＣ過程を有意に妨害しないいずれかの材料で遂げられ得る。孔は、それを通って溶離液および他の物質がビーズ構造に進入し得る開放構造である。孔は、しばしば、１個の孔に進入する液体が別の孔から出ることができるように相互に連結される。われわれは、相互に連結される孔構造およびビーズ中へのポリヌクレオチドの動きを可能にする寸法を有する孔は、分離の分離度を損なうか、もしくは非常に長い保持時間を有する分離を生じると考える。しかしながら、ＭＩＰＣでは、ビーズは「非多孔質」であり、そしてポリヌクレオチドはビーズ構造に進入しない。ポリヌクレオチドという用語は、１個のリボース（もしくはデオキシリボース）から別のものまでリン酸残基を介して結合される不確定数のヌクレオチドを含有する直鎖状ポリマーと定義される。本発明は、ＲＮＡまたは二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡの分離で使用され得る。本発明の記述を単純にする目的上、そして制限としてでなく、二本鎖ＤＮＡの分離が本明細書の実施例で記述されることができ、全部のポリヌクレオチドが本発明の範囲内に包含されることが意図されることが理解される。カラムビーズのクロマトグラフィー効率は、主として、表面および近表面領域の特性により影響される。この理由から、以下の記述はとりわけポリマービーズの表面に近い領域(close-to-the-surface region)に関する。こうしたビーズの本体および／もしくは中央は、本発明のポリマービーズの表面でもしくはその近くで観察されるものと全く異なる化学および物理特性の組を表わし得る。本発明のビーズは、非極性分子またはその表面に付着されたもしくはその上に被覆された非極性ポリマーを有する非多孔質粒子を含んで成る。一般に、当該ビーズは、ポリマーで被覆されているか、または本質的に全部の表面基質基を非極性炭化水素もしくは置換された炭化水素基と反応されておりそしていかなる残存する表面基質基も上述されたようなトリ（低級アルキル）クロロシランもしくはテトラ（低級アルキル）ジクロロジシラザンでエンドキャッピングされている非多孔質粒子を含んで成る。当該非多孔質粒子は好ましくは無機粒子であるが、しかし非多孔質有機粒子であり得る。非多孔質粒子は、例えば、シリカ、シリカカーバイド、亜硝酸シリカ、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ジルコニウム、炭素、セルロースのような不溶性多糖、もしくはケイソウ土、または非多孔質であるよう修飾されているこれらの材料のいずれかであり得る。炭素粒子の例はいかなる妨害する汚染物質も除去するよう処理されているダイアモンドおよびグラファイトを包含する。好ましい粒子は本質的に非変形性であり、かつ、高圧に逆らい得る。非多孔質粒子は既知の処置により製造される。好ましい粒子径は約0.5〜100ミクロン：好ましくは１〜10ミクロン；より好ましくは１〜５ミクロンである。1.0〜3.0ミクロンの平均直径を有するビーズが最も好ましい。慣習的なシリカを基材とした逆相ＨＰＬＣ材料を製造する化学は公知であるため、本明細書の本発明のビーズの記述の大部分はシリカに関して提示される。しかしながら、上に列挙されたもののような他の非多孔質粒子が同一の様式で修飾され得そして本発明の方法でシリカの代わりに用いられ得ることが理解されるはずである。シリカの一般的な化学の記述については、プール(Poole，Colin F.)とプール(Salwa K．Poole)、Chromat ography Today、エルゼビア(Elsevier)：ニューヨーク(1991)、pp.313-342、およびシュナイダー(Snyder，R.L.)とカークランド(J.J．Kirkland)、Introductio n to Modern Liquid Chromatography、第２版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ・インク(John Wiley & Sons，Inc.)：ニューヨーク(1979)、pp.272-278を参照、それらの開示はこれによりそっくりそのまま引用により本明細書に組み込まれる。本発明の非多孔質ビーズは、コーティングもしくはアルキル化試薬との反応後に最小限の露出シラノール基を有することを特徴とする。最小限のシラノール基は、担体とのＤＮＡの相互作用を抑制するため、ならびにまた高ｐＨおよび水性環境での材料の安定性を向上させるために必要とされる。シラノール基は、それらがＤＮＡ分子の負の電荷を反発し得、カラムの固定相とのＤＮＡの相互作用を予防もしくは制限するため、有害であり得る。相互作用の別の可能な機構は、シラノールがイオン交換部位として作用し得、鉄（III）もしくはクロム（III）のような金属を集めることである。鉄（III）もしくはカラムに捕捉される他の金属は、ＤＮＡのピークをゆがめ得るか、もしくはＤＮＡがカラムから溶出されることを予防さえし得る。シラノール基は水を基材とした溶離液により加水分解され得る。加水分解は、より多くのシラノール部位を露出させること、もしくはシリカコア中に存在し得る金属を露出させることにより固定相の極性および反応性を増大させることができる。加水分解は増大されたシラノール基とともにより優勢であることができる。ＤＮＡ分離に対するシラノール基の影響は妨害のどの機構が最も優勢であるかに依存する。例えば、鉄（I II）は、鉄（III）が溶離液中に存在するか、器具に存在するかもしくはサンプルに存在するかに依存して、露出シラノール部位に付加されたようになり得る。金属の影響は、金属が系もしくは試薬内にすでに存在する場合にのみ発生し得る。系もしくは試薬内に存在する金属はシリカ上のイオン交換部位により捕捉され得る。しかしながら、金属が系もしくは試薬内に存在しない場合には、シラノール基それら自身がＤＮＡ分離の妨害を引き起こし得る。水性環境による露出シラノール部位の加水分解は、シリカコア中に存在しうる金属を露出し得る。完全に加水分解されたシリカは表面１平方メートルあたり８μモルのシラノール基の濃度を含有する。せいぜい、立体の理由(consideration)のため、最大で１平方メートルあたり約4.5μモルのシラノール基が反応され得、シラノールの残余は反応された基により立体的に遮蔽される。最小限のシラノール基は、シラノール基が分離を妨害することを予防するのに十分な遮蔽の理論上の限界に達するもしくはこれを有することと定義される。多数の方法が非多孔質のシリカコア粒子を形成するために存在する。例えば、メタノール中に注がれたケイ酸ナトリウム溶液はケイ酸ナトリウムの微細に分割された球状粒子の懸濁液を生じることができる。これらの粒子は酸との反応により中和される。こうして、約１〜２ミクロンの直径を有するシリカゲルの球形粒子が得られる。シリカは有機液体もしくは蒸気から沈殿され得る。高温（約2000 ℃）でシリカは気化され、そして蒸気が温度の低下もしくは酸化するガスを使用することのいずれかにより凝縮されて微細に分割されたシリカを形成し得る。シリカの合成および特性は、The Chemistry of Silica，Solubility，Po1ymerization，Col loid and Surface Properties，and Biochemistry、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ(John Wiley & Sons)：ニューヨーク(1979)にイラー(R.K．Iler)により記述される。シュテーバー(W．Stober)らは、J．Colloid and Interface Sci.、26:62-69(1 968)に、ミクロンの大きさの範囲の単分散シリカ球体の制御された成長を記述した。シュテーバー(Stober)らは、ケイ酸アルキルの加水分解およびその後のアルコール溶液中でのケイ酸の凝縮によって均一な大きさの球状シリカ粒子の制御された成長を可能にする化学反応系を記述する。アンモニアが形態触媒(morpholog ical catalyst)として使用される。懸濁液中で得られる粒子径は直径0.05μm未満から２μmまでの範囲にわたる。非多孔質シリカコアビーズは、ミクラサイエンティフィック(Micra Scienti fic)（イリノイ州ノースブルック）およびヒェミーウエティコン(Chemie Ueti kkon)（スイス、ローザンヌ）から得られることができる。本発明の非多孔質ビーズを製造するためには、非多孔質粒子がポリマーで被覆されるか、または、非多孔質粒子の本質的に全部の表面基質基が非極性炭化水素もしくは置換された炭化水素基で封鎖されるように反応されかつエンドキャッピングされる。これはいくつかの方法により成し遂げられ得る。有機結合相(bonded phase)のシロキサンコーティングは、単分子層もしくは重合された多層コーティングとして作成され得る。いわゆる単分子有機相をもつ充填物は、通常、ケイ酸を基材とした(siliceous-base) 粒子の表面シラノール基を単、二もしくは三官能基のクロロ、ジメチル、アミノ、シロキシもしくはアルコキシシランと反応させることにより製造される。これらの反応で使用される典型的な単官能基反応体はＸ−Ｓｉ−Ｒを包含し、ここでＸ＝Ｃｌ、ＯＨ、ＯＣＨ₃もしくはＯＣ₂Ｈ₅、そしてＲは有機基である。図２は、シリカコア２２および単分子有機相を有するビーズ２０の略図表示である。（この図は本発明のビーズの形態もしくは孔構造を必ずしも示さず、かつ、具体的な説明の目的のみに予定される。）表面修飾にＲ₂ＳｉＸ₂およびＲＳｉＸ₃のような二および三官能基反応体を使用すると、結合された官能基あたり２個までのＳｉ−Ｘ基が反応されないままである。水での処理後に、これらの未反応基の加水分解が起こり、そして、付加的なシラノール基が、充填物中に存在する結合された有機官能基とほぼ同一濃度で（ときにポリマーマトリックス中で）形成される。これらの酸性の有機シラノール基は、溶質の保持挙動に有意に影響を及ぼし得、また、ｐＨ＞７の水性溶液中での充填物の安定性に有害に影響し得る。かように、シラン試薬での表面の不完全な反応、または二もしくは三官能基修飾剤(modifier)を使用することからの新たなＳｉ−ＯＨ基の形成は、移動相もしくはサンプルの分子に容易に接近可能である残余の酸性Ｓｉ−ＯＨ基の集団をもたらし得る。従って、最近の趨勢は、（ａ）部分的被覆(coverage)の代わりに官能基の密度の大きな単層、および（ｂ）残余のＳｉ−ＯＨ基の最小限の可能性をもつ均質な有機コーティングを提供するための単官能基ジメチルシラン［Ｘ−Ｓｉ（ＣＨ₃）₂−Ｒ］の使用に向かう。モノクロロシラン試薬が、必要とされる有機官能性が準備され得る場合は好ましい。単官能基修飾剤のＲ基の２個がメチルである場合は、表面被覆は（炭素分析を基礎として）１平方メートルの有機(organic)あたり約４μモル程度であり得る。後者の場合、シリカ表面上の残余のＳｉ−ＯＨ基は立体遮蔽のため大部分の溶質とのクロマトグラフィー性相互作用に利用できない。有機シラノール（例えばＨＯ−Ｓｉ−Ｒ₃）もしくは有機アルコキシ（例えばＲＯ−Ｓｉ−Ｒ₃）シランのシリカ支持材との重合を伴わない反応もまた良好な充填物を生じ得る。これらの反応は比較的再現可能であるが、ただし僅少の水もしくは他の反応性の種が非存在である。反応されない接近可能なシラノールが最初の反応後に残され得るが、しかしこれらはクロロトリメチルシランでの充填物のキャッピングにより除去され得る（ただしＲ基は後者のシランと反応しない）。一方法に従えば、非多孔質粒子はポリマーコーティングで被覆される。当該粒子の被覆での使用に適するポリマーは、連鎖反応ポリマーおよび段階反応ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリアミド、セルロースのような不溶性多糖、ポリジメチルシロキサン、ポリジアルキルシロキサンおよび関連材料を包含する。ポリマーコーティングは、表面の完全な遮蔽が達成されるように多被覆工程によって非多孔質粒子に付着され得る。最近数年で、ポリマー被覆もしくはポリマー封入充填物として知られる新たな結合相充填物が、開放管状カラムガスクロマトグラフィーのための固定された固定相を製造するのに使用される技術を基礎として導入された。この場合には、当該相は、裸のシリカもしくは前シラン化された(presilanized)シリカ微粒子のいずれかをポリ（シロキサン）もしくはポリ（ブタジエン）プレポリマーで機械的に被覆することにより製造され、これがその後過酸化物、アゾ−ｔｅｒｔ−ブタンもしくはガンマ線照射で誘発される化学的架橋反応により固定される。図３はシリカコア３２およびポリマーコーティング３４を有する被覆ビーズ３０の図解の具体的説明である。（この図は本発明のビーズの形態もしくは孔構造を必ずしも示さず、かつ、具体的な説明の目的のみに予定される。）代替の一方法は、ビニル含有シラン分子と共有結合すること、およびその後粒子の表面上でコーティングを重合することの組み合わせを含んで成る。第二のコーティングが、残余のシラノール基もしくは金属基が存在する場合に適用され得る。本方法の一変形物では、シリカ表面が最初にビニルトリクロロシランとの反応、次いで誘導体化されたシリカ表面に対しかつその上にアクリル酸誘導体を重合することにより修飾される。多数の有用なモノマーおよびプレポリマーの利用可能性が、広範な逆相の極性かつイオン交換充填物が同一の一般的反応を使用して製造されることを可能にした。また、この一般的アプローチは根底にある担体の化学に依存しないため、シリカ以外の材料、例えばアルミナおよびジルコニアが、シリカが例えばｐＨ範囲２〜7.5の外側の移動相と不適である条件下で修飾かつ使用され得る。シリカに戻れば、前シラン化(presilanization)は活性シラノール基の数を減少させ、それはその後表面上につなぎとめられるポリマー薄膜によりさらに遮蔽される。逆相液体クロマトグラフィーにおいては、これらの充填物は、塩基性溶質の分離に関して、モノマー性の化学的に結合された相に比較して改良されたクロマトグラフィー特性を示した。ポリマー封入充填物は約１nmの薄膜厚さを有して妥当な物質移動の特徴を維持する。この処置の記述はエンゲルハルト(H．Enge1hart)らにより刊行されている（ Chromatographia、27:535(1989)）。上の方法のいずれかに従って製造されるポリマー被覆ビーズは、それらの未修飾状態で使用され得るか、もしくは炭化水素基での置換により修飾され得る。いずれの炭化水素基も適する。本明細書で使用されるところの「炭化水素」という用語は、１から1,000,000個までの炭素を有するアルキルおよびアルキル置換アリール基を包含することを定義され、アルキル基は、アルデヒド、ケトン、エステル、エーテル、アルキル基などを包含する多様な型の直鎖状、分枝鎖状、環状、飽和、不飽和の非イオン性官能基を包含し、また、アリール基は、フェニル、ナフチルなどを包含する単環、二環および三環性の芳香族炭化水素基のようなものを包含する。炭化水素置換の方法は当該技術分野で慣習的かつ公知であり、そして本発明の一局面でない。炭化水素は、非極性の逆相官能基であるとみなされるヒドロキシ、シアノ、ニトロ基などもまた含有し得る。好ましい炭化水素基はアルキル基であり、また、下の適する置換方法の記述は単純化の目的上かつ制限としてでなくアルキル化として提示され、慣習的処置によるアリール置換もまた本発明の範囲内に包含されることが意図されることが理解される。ポリマー被覆ビーズはヨウ化アルキルのような対応するアルキルハロゲン化物との反応によりアルキル化され得る。アルキル化は、ポリマーブレンドの表面の芳香環で求電子芳香族置換を遂げるためのフリーデルクラフツ触媒の存在下にポリマー被覆ビーズをアルキルハロゲン化物と混合することにより達成される。適するフリーデルクラフツ触媒は当該技術分野で公知であり、そして、塩化アルミニウム、三フッ化ホウ素、四塩化スズなどのようなルイス酸を包含する。１から1,000,000個まで、そして好ましくは１から22個までの炭素を有する炭化水素基での置換がこれらの方法により遂げられ得る。23から1,000,000個までの炭素を有する炭化水素基は本明細書で炭化水素ポリマーとして称される。アルキル化は多数の既知の合成手順により成し遂げられ得る。これらはアルキルハロゲン化物でのフリーデルクラフツアルキル化、エーテルを形成するようなクロロメチル化ビーズへのアルキルアルコールの付加などを包含する。本発明のポリマー被覆ビーズをアルキル化するための好ましい方法は、ポリマーコーティングが非多孔質粒子上で形成された後のアルキル化であるとは言え、アルキル化の代替の一方法はアルキル化されたモノマーを重合して非多孔質粒子上にアルキル化されたポリマーのコーティングを形成することである。この態様においては、モノマーはいずれかの数の炭素原子、例えば分離の変数の要件に依存して、例えば１から100まで、１ないし50もしくは１ないし24個を有するアルキル基で置換されることができる。ポリマーコーティングに対する一代替として、非多孔質粒子が、アルキル基、もしくはシアノ、エステルおよび他の非イオン性基を包含する他の非極性官能基で機能化され得、次いで完全なエンドキャッピング工程がシラノールおよび金属の相互作用を抑制する。非多孔質粒子のエンドキャッピングは、当該粒子を例えばトリメチルクロロシランもしくはジクロロテトライソプロピルジシラザンのようなトリアルキルクロロシランもしくはテトラアルキルジクロロジシラザンと反応させることにより達成され得る。多数の因子が、結合反応の成功および最終的な結合相製品の品質に影響する。結合反応の速度および程度は、シランの反応性、溶媒および触媒の選択、時間、温度、ならびに担体に対する試薬の比に依存する。脱離基としてのＣｌ、ＯＨ、ＯＲ、Ｎ（ＣＨ₃）₂、ＯＣＯＣＦ₃およびエノラートを含む反応性の有機シランが幅広く使用されている。ジメチルアミン、トリフルオロアセテートおよびペンタン−２，４−ジオンのエノールエーテルが最も反応性の脱離基であるが、とは言え、安価、入手可能性および普及性が、とりわけ商業的製造者の間で最も幅広く使用されているクロロシランおよびアルコキシシランによりもたらされる。最初は、反応はほとんど化学量論的であり得るが、しかし、表面被覆が最大値に近づくにつれて反応は非常にゆっくりになる。この理由から、反応時間が長く（12 〜72時間）、反応温度が適度に高い（大部分の場合で約100℃）傾向があり、また、クロロシランの場合には酸受容体触媒（例えばピリジン）が使用される。アルキルシリルエノラートおよびアルキルシリルジメチルアミンのようないくつかの試薬は、反応を実施するのに追加の触媒もしくは溶媒さえ必要としない。使用される最も普遍的な溶媒はトルエンおよびキシレンであるとは言え、四塩化炭素、トリクロロエタンおよびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）のような他の溶媒が優れているとして推奨されている。結合反応は不活性雰囲気中で還流することにより実施されるため、溶媒は、しばしば、有機シランの良好な溶媒である、および還流で所望の反応温度を達成するそれらの能力を基礎として選択される。３− シアノプロピルシロキサン結合相を除いては、ある極性官能基（例えばＯＨなど）に対するクロロシランの高反応性が、極性の逆相の結合相の製造のためのこれらの基の使用を除外する。酸性もしくは塩基性の官能基を含有するアルコキシシランは自己触媒性であり、そして結合相は、通常、シランを不活性溶媒中、表面シラノール基との縮合反応により形成されるアルコールを蒸留して除くのに十分高い温度で還流することにより製造される。中性の極性リガンドの結合は、一般に、シリカの単層被覆を生じさせるのに十分な水の存在下にトルエン−４−スルホン酸もしくはトリエチルアミンのような触媒の添加を必要とする。水の存在は吸着された有機シランのアルコキシ基の加水分解を加速し、これは溶液中で重合するよりはむしろ表面シラノール基と反応する傾向がある。表面シラノール基が物理的に吸着された有機シランにより封鎖されて作業後に理論的に予測される最大より小さい結合相密度を生じさせることが、極性の結合相の製造において一般的問題となるようである。結合相密度が２回目に反応を反復することにより増大され得るか、もしくは露出シラノール基がエンドキャッピングにより最小限にされ得る。大部分の結合相はケイ素に結合された単一の官能基化されたリガンドを含有する有機シランから製造され、残存する基は脱離基および／もしくはメチル基であるとは言え、より高度に置換された有機シランもまた使用され得る。１，３−ジクロロテトライソプロピルジシラザンのような二官能基有機シランは、鎖の双方の端で表面シラノール基と反応することが可能であり、慣習的有機シランから形成される結合相より加水分解的に安定である結合相を形成する。二座(bidentate )有機シランは、シリカ表面上のシラノール基の間隔により緊密に合致する反応性部位を有し、そして同一のケイ素原子に結合された双方の脱離基をもつジクロロシランで達成されるより大きな結合相被覆を提供する。アルキルジメチルシランに関しては、アルキル基の長さを増大させることは、トリメチルシリル結合されたリガンドのものに関して結合相の加水分解安定性を増大させる。メチル基の鎖長を増大させることは結合相の加水分解安定性を増大させるが、しかし、立体効果により相被覆を減少させる。シランのケイ素原子上に１もしくは２個の嵩高い基、例えばイソプロピルもしくはｔ−ブチルを含有する単官能基有機シランの使用は、低いｐＨでの使用のための結合相の製造でより重要となり得る。嵩高いアルキル基は、メチル基がするよりも、充填物表面の加水分解的に感受性のシロキサン基に対するより良好な立体保護を提供する。シリカ担体の被覆およびエンドキャッピングの一般的方法は公知の技術である。しかしながら、これらの材料を使用したことのある者の一般的理解は、それらは高性能の二本鎖ＤＮＡ分離に適しないことである。しかしながら、本発明のビーズは、シリカコアの完璧な遮蔽を遂げるためのコーティングおよびエンドキャッピング処置のより慎重な適用により形成され、生じるビーズは、例えば米国特許第５，５８５，２３６号に開示されるアルキル化された非多孔質ポリマービーズを使用して達成されるものに同等もしくはより良好である一本鎖および二本鎖双方のＤＮＡの迅速な分離を実施する能力を有する。本発明のビーズは、ＤＮＡを結合し得る、少量の金属汚染物質もしくは他の汚染物質を有することもまた特徴とする。本発明の好ましいビーズは、いかなる多価陽イオン汚染物質（例えばＦｅ（III）、Ｃｒ（III）もしくはコロイド状金属汚染物質）も本質的に排除するよう設計される酸洗浄処理のような汚染除去処理を包含する製造の間の予防措置にかけられていることを特徴とする。非常に純粋の非金属含有材料のみが、生じるビーズが最小限の金属含有量を有することができるためにビーズの製造で使用されるべきである。ビーズの表面が最小限のシラノールもしくは金属酸化物の露出を有すること、および表面が非多孔質のままであることを確実にするために、ビーズの製造の間に注意が払われなくてはならない。ポリヌクレオチドの高分離度のクロマトグラフィー分離を達成するためには、クロマトグラフィーカラムを固相の非多孔質ビーズできつく充填することが一般に必要である。カラム充填物材料でカラムを充填するいずれかの既知の方法が、十分な高分離度の分離を得るために本発明で使用され得る。典型的には、ビーズのスラリーがビーズの密度と同等のもしくはより小さい密度を有する溶媒を使用して調製される。カラムがその後ビーズスラリーで満たされ、そして振動もしくは攪拌されてカラム中のビーズの充填密度を向上させる。機械的振動もしくは超音波処理が充填密度を向上させるのに典型的に使用される。例えば、50×4.6mm直径のカラムを充填するには、2.0グラムのビーズが超音波処理の助けを借りて10mLのメタノール中に懸濁され得る。この懸濁液がその後、 8,000psiの圧で50mLのメタノールを使用してカラム中に充填される。これは充填床の密度を向上させる。本発明の分離方法は、一般に、ＤＮＡおよびＲＮＡの一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドのクロマトグラフィー分離に応用可能である。ポリヌクレオチドの混合物を含有するサンプルは、ポリヌクレオチドの全合成、制限エンドヌクレアーゼもしくは他の酵素または化学物質でのＤＮＡもしくはＲＮＡの切断、ならびにポリメラーゼ連鎖反応技術を使用して増殖および増幅されたポリヌクレオチドサンプルから生じ得る。本発明の方法は約1500ないし2000までの塩基対を有する二本鎖ポリヌクレオチドを分離するのに使用され得る。多くの場合には、当該方法は、600までの塩基もしくは塩基対を有する、または５ないし80までの塩基もしくは塩基対を有するポリヌクレオチドを分離するのに使用される。好ましい一態様においては、分離はＭＩＰＣによる。本発明の非多孔質ビーズは、ＤＮＡ分離を生じさせるための対イオン剤および溶媒勾配とともに機能することができる逆相材料として使用される。ＭＩＰＣでは、ＤＮＡ断片が対イオン剤と対にされ(matched)、そしてその後本発明の非多孔質ビーズを使用する逆相クロマトグラフィーにかけられる。酢酸トリアルキルアミン、炭酸トリアルキルアミン、リン酸トリアルキルアミンなどのような揮発性である対イオン剤が本発明の方法での使用に好ましく、酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）およびトリエチルアンモニウムヘキサフルオロイソプロピルアルコールが最も好ましい。本発明のビーズを使用するＭＩＰＣによるＤＮＡの分離の間の至適なピーク分離度を達成するために、当該方法は、10,000psiより大きくない背圧を生じるよう20℃ないし90℃の範囲内の温度で実施される。一般に、一本鎖断片の分離はより高温で実施されるべきである。われわれは、分離が実施される温度が分離で使用される溶媒の選択に影響を及ぼすことを見出した。分離が上の範囲内の温度で実施される場合、水溶性である有機溶媒、例えば、アルコール、ニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エステルおよびエーテルが好ましく使用される。水溶性の溶媒は、本発明の操作の全条件下で水系と単一相として存在するものと定義される。本発明の方法での使用にとりわけ好ましい溶媒は、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびアセトニトリルを包含し、アセトニトリルが最も好ましい。２種の化合物（この場合は異なる大きさのＤＮＡ断片）は、それらが異なる分配係数（Ｋ）を有する場合にのみ分離され得る。ネルンストの分配係数は、移動相中のその濃度により割られる固定相中の被検体の濃度（Ａ）と定義される。すなわち分配係数（Ｋ）および保持係数（ｋ）は、以下の等式すなわちにより関連づけられ、商Ｖ_m／Ｖ_sはまた相体積比（Φ）とも呼ばれる。従って：ｋ＝ＫΦ 収着エンタルピーを算出するためには、以下の基礎的な熱力学の等式が必要である。すなわち最後の２式を変換することにより、われわれはファントホッフの等式：を得る。プロット1nｋ対１／Ｔから、収着エンタルピーΔＨ_sorpがグラフの傾きから得られることができる（直線が得られる場合）。Δ_sorpは相体積比（Φ）が既知である場合に算出され得る。ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）で被覆されたシリカビーズでの実験もまた、1nｋ対１／Ｔのプロットについて負の傾きを与えるが、とは言えこのプロットはわずかに湾曲する。アセトニトリルがメタノールで置き換えられる場合、保持係数ｋは増大する温度とともに減少し、保持の機構が発熱過程（ΔＨ_sorp＜０）であることを示す。（下の実施例で示されるような）熱力学的データは、本発明のビーズおよび溶出溶媒に対するＤＮＡ−対イオン剤複合体の相対的親和性を示す。吸熱反応プロットはビーズに対するＤＮＡ複合体の好みを示す。発熱反応プロットは、溶媒に対するビーズを上回るＤＮＡ複合体の好みを示す。本明細書に示されるプロットは実施例に記述されるようなアルキル化されたおよびアルキル化されない表面についてである。大部分の液体クロマトグラフィー分離は発熱反応プロットを示す。本質的に金属を含まないビーズそれら自身に加えて、われわれは、ＲＰＩＰＣの間の至適のピーク分離を達成するためには、分離カラム、およびカラム内に保持されるもしくはカラムを通って流れる全プロセス溶液が、多価陽イオン汚染物質（例えばＦｅ（III）、Ｃｒ（III）およびコロイド状金属汚染物質）を本質的に含まないべきであることもまた見出した。共通に所有される同時係属中の米国出願番号０８／７４８，３７６（1996年11月13日に申請された）に記述されるとおり、これは、カラムを多価陽イオンの汚染から保護するために、カラム内に保持されるもしくはこれを通って流れるプロセス溶液中に多価陽イオンを放出しない材料で作成されたプロセス溶液接触表面を有する成分を分離カラムに進入する溶液に供給し(supply)そして送る(feed)ことにより達成され得る。この系成分のプロセス溶液接触表面は、好ましくは、チタン、被覆ステンレス鋼、不動態化ステンレス鋼および有機ポリマーから成る群から選択される材料である。例えば、ステンレス鋼中に見出される金属は、それらが酸化されたもしくはコロイド状の部分的に酸化された状態にない限りは分離を傷つけない。例えば、３１６ステンレス鋼フリットはカラムの機材(hardware)で許容できるが、しかし、表面酸化されたステンレス鋼フリットはＤＮＡ分離を傷つける。付加的保護のため、カラムに進入する溶離液溶液およびサンプル溶液中の多価陽イオンは、樹脂床を多価陽イオンの汚染から保護するためにこれらの溶液がカラムに進入する前にこれらの溶液を多価陽イオン捕捉樹脂と接触させることにより除去され得る。多価捕捉樹脂は、好ましくは陽イオン交換樹脂および／もしくはキレート樹脂である。本発明の他の特徴は例示的態様の以下の記述の間に明らかになることができ、これらは本発明の具体的説明のために与えられかつその制限的であることを意図されない。本明細書に引用される全参考文献はこれによりそっくりそのまま引用により組み込まれる。下の実施例で過去時制で記述される処置は実験室で実施された。現在時制で記述される処置は実験室で実施されておらず、そして本出願の申請で実施するよう構成上縮小される。実施例１Ｃ−１８結合相の標準相 1000mL丸底フラスコに、200gの非多孔質の２μmシリカおよび１個の小さな攪拌卵(stirring egg)を添加する。シリカを含むフラスコをオーヴンに移し、そして125℃で一夜（すなわち最低８時間）加熱する。加熱マントルおよび冷却器を据え付けておく。Ｃ−１８結合試薬ｎ−オクタデシルジメチルシランは室温で蝋質の白色の固体ないし半固体である。移すために、フード中で瓶を開け、そしてヒートガンで穏やかに加温する（注意：圧が、貯蔵されたクロロシランの瓶中で高まり得、また、それらはそれらが塩酸であるかのように取り扱われるべきである。なぜなら、湿気との接触に際して塩酸は副生成物であるからである）。第二のフラスコに、125gのｎ−オクタデシルメチルクロロシラン試薬、10mLのクロロホルム、400mLのトルエンおよび65mLのピリジンを移す。液体試薬をぐるぐるかき混ぜること(swirling)により混合し、そしてその後、乾燥されたシリカに添加し、そしてシリカの全部が懸濁されるまでぐるぐるかき混ぜる。還流冷却器を取付け、そして混合物を還流に15時間もたらす。混合物を還流が停止するように冷まさせる。20mLのトリメチルクロロシラン、20mLのトルエン中の６mLのヘキサメチルシランのキャッピング試薬包装(package)を添加する。混合物を再懸濁し、そして系を還流に６時間戻す。混合物を室温に冷まさせる。ブフナー漏斗に移し、そしてメタノールの３個の200mLアリコート、次いでアセトンの３個の200mLアリコートで洗浄する。最低0.5時間風乾し、そしてその後オーブン中100℃で一夜乾燥する。サンプルを元素分析および炭素パーセントに提出する。乾燥された結合相は今やカラム充填の準備ができている。実施例２ＣＮ結合相、シアノ相 1000mLの丸底フラスコに、200gの非多孔質の２μmシリカ、１個の攪拌卵を添加し、そして125℃のオーヴン中に一夜（すなわち最低８時間）置いて乾燥する。乾燥されたシリカに、100mLの３−シアノプロピルメチルジクロロシラン、10m Lのクロロホルム、450mLのトルエンおよび50mLのピリジンを添加する。混合物を懸濁しそして15時間還流にもたらす。冷濾過し(cool filter)、そして、ブフナー漏斗中で、トルエンの１個の200mLアリコート、次いでメタノールの２個の200 mLアリコートで洗浄する。ビーカーに移し、そして塩酸を含む300mLの50：50メタノール：水、ｐＨ5.5を添加する。懸濁し、そして室温で１時間そのままにさせる。ブフナー漏斗上に濾過し、そして相をメタノールおよびアセトンで洗浄する。1000mL丸底フラスコに移し、そしてオーヴン中で一夜乾燥する。次に、20mLのトリメチルクロロシラン、６mLのヘキサメチルジシラザン、350m Lのトルエン、10mLのクロロホルムおよび25mLのピリジンを乾燥された結合相に添加することによりエンドキャッピングし、そして６時間還流にもたらす。生じる混合物を冷却し、ブフナー漏斗に移し、そしてメタノールの３個の200mLアリコート、次いでアセトンの３個の200mLアリコートで洗浄する。最低0.5時間風乾し、そしてその後オーヴン中100℃で一夜乾燥する。サンプルを元素分析に提出する。結合相は今やカラム充填の準備ができている。実施例３ジオクチルシリル相−Ｃ−８×２ＣＮ結合相についての段階の全部を反復するが、しかし３−シアノプロピルメチルジクロロシランを100mLのジオクチルジクロロシランで置き換える。実施例４酸洗浄処理実施例１の処置を反復するが、しかし、シリカを、乾燥するのに先立ち500mL の100mM塩酸およびその後水で洗浄する。生成物を、冷却した後かつメタノール洗浄に先立ち500mLの100mM塩酸で洗浄する。実施例５実施例１の生成物を、１グラムのジビニルベンゼンおよび10mgの過酸化ベンゾイルを含有する100mLのジクロロメタンで被覆する。ジクロロメタンを、モノマーがビーズ上に被覆されるまで回転蒸発(rotary evaporation)により除去する。非常にゆっくり回転しつつ、温度を70℃に８時間上昇させる。生成物をメタノールで洗浄する。この処置を実施例４の生成物で反復する。実施例６実施例５の処置を、ジビニルベンゼンの代わりにステアリルジビニルベンゼンで反復する。この処置を実施例４の生成物で反復する。実施例７ 15グラムの非多孔質シリカ粒子、50mLの２，２，４−トリメチルペンタンおよび25mLのビニルトリクロロシランを２時間還流する。修飾されたシリカをその後、２，２，４−トリメチルペンタンおよびアセトン双方で数回洗浄し、そして80 ℃で乾燥する。上述されたとおり製造された５グラムのビニル被覆シリカ粒子を丸底フラスコに入れる。２gのビニルモノマー（ジビニルベンゼン、スチレン、アクリロニトリル、アクリル酸、ブチルメタクリレートもしくは２−ヒドロキシメタクリレート）を含有する25mLのアセトニトリルを添加し、そして混合物を十分に分散させる。0.2gの過酸化ジベンゾイルを含有する25mLのアセトニトリルを添加し、そして混合物を２時間還流する。生成物を、アセトニトリル、そしてその後アセトンで抽出して未反応のモノマーおよびオリゴマーを粒子から除去する。アクリル酸で修飾されたシリカの場合は水での抽出もまた実施する。充填物材料を充填に先立ち80℃で乾燥する。実施例８分離媒体の性能を試験するための標準的手順分離粒子をＨＰＬＣカラムに充填し、そして標準ＤＮＡ混合物を分離するそれらの能力について試験する。標準混合物は、それぞれ11、18、80、102、174、25 7、267、298、434、458および587塩基対を有する11個の断片を含有するｐＵＣ１８ＤＮＡ−ＨａｅIII消化物（シグマ−アルドリッチ(Sigma-Aldrich)、Ｄ６２９３）である。標準品を水で希釈し、そして、0.25μgのＤＮＡの総量を含有する５μLを注入する。充填体積および充填極性に依存して、当該手順は、駆動溶媒(driving solvent )濃度、ｐＨおよび温度の選択を必要とする。分離条件を、257、267のピークの保持時間が約６ないし10分であるように調節する。以下の溶媒、すなわちメタノール、エタノール、２−プロパノール、１−プロパノール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）もしくはアセトニトリルのいずれか１種を使用し得る。対イオン剤を、酢酸トリアルキルアミン、炭酸トリアルキルアミン、リン酸トリアルキルアミンもしくはポリヌクレオチド陰イオンと対にされたイオン(matched ion)を形成し得るいずれかの他の型の陽イオンから選択する。この手順の一例として、図４は、オクタデシルで修飾された非多孔質のポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）ビーズを使用する標準ＤＮＡ混合物の高分離度を示す。この分離は以下の条件下で実施した。すなわち溶離液Ａ：0. 1MＴＥＡＡ、ｐＨ7.0；溶離液Ｂ：0.1MＴＥＡＡ、25％アセトニトリル；勾配：流速は0.75mL/分であり、260nmでの検出ＵＶ、カラム温度50℃。ｐＨは7.0であった。図４でと同一の分離条件を使用するこの手順の別の例として、図５は、誘導体化されないポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）の非多孔質の2.1ミクロンのビーズを含有するカラムでの標準ＤＮＡ混合物の高分離度の分離である。実施例９本実施例は、実施例１に記述されたようなオクタデシルで修飾された非多孔質シリカ逆相材料を使用するＤＮＡ制限断片の高分離度の分離を立証する。この実験は以下の条件下で実施する。すなわち、カラム：50×4.6mm 直径。移動相：0.1MＴＥＡＡ、ｐＨ7.0。勾配：２分で8.75−11.25％アセトニトリル、次いで10分で11.25−14.25％アセトニトリル、４分で14.5−15.25％アセトニトリル、そして４分で15.25−16.25％アセトニトリル。流速１mL／分。カラム温度：50℃。検出：254nmのＵＶ。サンプル：0.75μgのｐＢＲ３２２ＤＮＡ −ＨａｅIII制限消化物および0.65μgのΦ×１７４ＤＮＡ−ＨｉｎｃII制限消化物の混合物。高分離度の分離が、酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）の濃度、勾配曲線の形状、カラム温度および流速を至適化することにより得られる。ピークの分離度は、25mMから最低125mMＴＥＡＡまで変化することにおいて連続的に高められる。勾配は、ＤＮＡ分子の断片長さを増大させるとともに勾配曲線の急勾配を減少させることにより至適化される。二本鎖ＤＮＡ分子の最良の分離は約30℃ないし50℃で成し遂げられる。約50℃より高くでのＤＮＡの変性は二本鎖ＤＮＡ断片のためのより高いカラム温度の利用を予防するが、とは言え一本鎖ＤＮＡの分離は80℃までおよびより高い温度で実施され得る。実施例１０勾配遅延容積(gradient delay volume)が最小限にされる場合は、生存および死亡生物体（動物および植物）ならびにこうした生物体の部分（例えば血液細胞、生検、精子など）を包含するＤＮＡの多様な供給源由来のＰＣＲ産物およびハイブリッドＤＮＡの、オクタデシルで修飾された非多孔質のポリ−（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）被覆ビーズでの分離が、２分より下の運転時間 (run time)で達成され得る。ＰＣＲ産物およびハイブリッドＤＮＡの分析は、通常、既知の長さの１もしくは２種の分離および検出のみを必要とする。このため、分離度の要件はＤＮＡの制限断片の分離についてよりかなりより少なく厳しい。こうしたより少なく厳しい分離度の要件は、急勾配の勾配の利用を可能にし、そして結果としてなおより短い運転時間につながる。404塩基対を含有するＤＮＡ断片の回収率は約97.5％である。キャピラリー電気泳動（ＣＥ）と異なり、ＰＣＲサンプルはＭＩＰＣによる分析に先立ち脱塩される必要はない。これはＣＥを上回るＭＩＰＣの決定的な一利点を表わす。ＭＩＰＣでは、従って、自動オートサンプラーが利用される場合にＰＣＲサンプルの完全に自動化された分析を達成することが可能である。さらに、サンプル注入の体積が既知であるため、ＣＥと対照的に、数桁にわたる定量が内部標準に対する要求なしに達成され得、これゆえに遺伝子発現の定量、ならびに組織および体液中のウイルス力価の決定を可能にする。本発明の方法の完全に自動化された作り替え物(version)は、正常を突然変異された遺伝子から識別（区別）する、ならびに、診断の目的上、癌遺伝子、細菌およびウイルスのゲノムのポリヌクレオチド（Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ、結核）を検出するのに使用され得る。さらに、カラム温度の調節は、ハイブリダイゼーション反応の厳しさを和らげること、もしくはホモ二重鎖のＤＮＡ種からヘテロ二重鎖を分離することを可能にする。臨床使用のための本発明のポリマー被覆ビーズの適合は、以下の条件下で記述される。すなわち、カラム：50×4.6mm直径。移動相：0.1MＴＥＡＡ、ｐＨ7.0。勾配：１分で11.25−13.75％アセトニトリル、次いで６秒間22.5％アセトニトリル、そして54秒間11.25％アセトニトリル。流速：３mL／分。カラム温度：50℃ 。検出：256nmのＵＶ。サンプル：2 0μlのＰＣＲサンプル。分離では以下の溶出順序が得られる。すなわち、１＝非特異的ＰＣＲ産物、２＝120塩基対を有するＰＣＲ産物、３＝132塩基対を有するＰＣＲ産物、そして４＝167塩基対を有するＰＣＲ産物。ＰＣＲの方法および工程は、Science、23):1350-1354(1985)にサイキ(R.K．Sa iki)ら、および米国特許第４，８６３，２０２号にマリス(K.B．Mullis)により記述される。これらの参考文献は、本発明の方法を使用して分離され得るＰＣＲサンプルを得るための方法および工程のより完全な記述のため引用により本明細書に組み込まれる。本発明の方法を使用するＰＣＲ産物の反復分析は記述された分析条件下で高度に再現可能である。結果は先行する注入によりいかなる方法でも影響されない。本方法は臨床検査の現実の状況下での慣例の使用に高度に適する。実施例１１以下は一本鎖ＤＮＡの分離を記述する。実施例１に記述されたような1.５ミクロン、30×4.6mm直径のシリカ−Ｃ１８カラムを、１mL／分および40℃で、40分で0.1M酢酸トリエチルアンモニウム中2.5−12.5％アセトニトリルの直線勾配で使用する。ｐ（ｄＣ）１２−１８およびｐ（ｄＴ）１２−１８のオリゴヌクレオチドの混合物が分離され、第一の混合物は５と15分との間に溶出し、また、第二の混合物は15と30分との間に溶出する。実施例１２収着エンタルピー測定ＤＮＡ消化物の４種の断片（５μlのｐＵＣ１８ＤＮＡ−ＨａｅIII消化物中に見出される174塩基対、257塩基対、267塩基対および298塩基対、0.04μgＤＮＡ／μl）を、Ｃ−１８アルキル化されたポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ポリマービーズを使用して異なる温度のアイソクラチック条件下で分離する。この分離に使用される条件は：溶離液：0.75mL／分の0.1M酢酸トリエチルアンモニウム、14.25％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、250nmのＵＶでの検出、それぞれ35、40、45、50、55および60℃の温度、である。1nｋ対１／Ｔのプロット（図６）は、保持係数ｋが温度を増大させることに伴い増大していることを示す。これは、保持の機構が吸熱反応過程（ΔＨ_sorp＞０）を基礎とすることを示す。アルキル化されないポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズでの同一の実験（図７）は、1nｋ対１／Ｔのプロットについて負の傾きを与えるが、とは言えこのプロットはわずかに湾曲する。アルキル化されたポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズでの、しかしアセトニトリル溶媒をメタノールで置き換える同一の実験（図８）は、保持係数ｋが温度を増大させることに伴い減少していることを示すプロット1nｋ対１／Ｔを与える。これは、保持の機構が発熱反応過程（ΔＨ_sorp＜０）を基礎とすることを示す。アルキル化されたおよびアルキル化されないポリマービーズをアルキル化されたポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）およびアルキル化されないアルキル化されたポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）のコーティングを有するシリカビーズで置き換えることは、同一の結果を与えることができる。実施例１３アルキル化されたポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズでの分離溶離液を、溶出溶媒の脱着能力をＤＮＡ−対イオン複合体に対するビーズの誘引特性に合致させるように選択する。ビーズの極性が減少するにつれて、より強い（より有機性の）もしくはより高濃度の溶媒が必要とされることができる。メタノールのようなより弱い有機溶媒は、一般に、アセトニトリルのようなより強い有機溶媒より高濃度で必要とされる。図９は、オクタデシルで修飾された非多孔質のポリ（エチルビニルベンゼン− ジビニルベンゼン）ビーズを使用するＤＮＡ制限断片の高分離度の分離を示す。この実験は以下の条件下で実施した。カラム：50×4.6mm直径；移動相0.1Mテトラエチル酢酸（ＴＥＡＡ）、ｐＨ7.2；勾配：３分で33−55％アセトニトリル、７分で55−66％アセトニトリル、2.5分間65％アセトニトリル；１分で65−100％アセトニトリル；そして1.5分で100−35％アセトニトリル。流速は0.75mL／分であり、260nmの検出ＵＶ、カラム温度51℃。サンプルは５μl（＝0.2μgのｐＵＣ１８ＨａｅIII消化物）であった。 0.1MＴＥＡＡ中のアセトニトリルを50.0％メタノールで置き換えて上の手順を反復することは図１０に示される分離を与える。 0.1MＴＥＡＡ中のアセトニトリルを25.0％エタノールで置き換えて上の手順を反復することは図１１に示される分離を与える。 0.1MＴＥＡＡ中のアセトニトリルを25％ウオツカ（ストリクナヤ(Stlichnaya) 、100プルーフ）で置き換えて上の手順を反復することは図１２に示される分離を与える。図１３に示される分離は、以下のようにオクタデシルで修飾された非多孔質のポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）ビーズを使用して得た。すなわち、カラム：50×4.6mm直径；移動相0.1MＴＥＡＡ、ｐＨ7.3；勾配：３分で12 −18％0.1MＴＥＡＡおよび25.0％１−プロパノール（溶離液Ｂ）、７分で18-22％Ｂ、2.5分間22％Ｂ；１分で22-100％Ｂ；そして1.5分で100−12％Ｂ。流速は0.75mL／分であり、260nmの検出ＵＶ、およびカラム温度51℃。サンプルは５μl（＝0.2μgのｐＵＣ１８ＤＮＡ−ＨａｅIII 消化物）であった。図１４に示される分離は、以下のようにオクタデシルで修飾された非多孔質のポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）ビーズを使用して得た。すなわち、カラム：50×4.6mm直径；移動相0.1MＴＥＡＡ、ｐＨ7.3；勾配：２分で15 −18％0.1MＴＥＡＡおよび25.0％１−プロパノール（溶離液Ｂ）、８分で18-21 ％Ｂ、2.5分間21％Ｂ；１分で21-100％Ｂ：そして1.5分で100−15％Ｂ。流速は0 .75mL／分であり、260nmの検出ＵＶ、およびカラム温度51℃。サンプルは５μ1 （＝0.2μgのｐＵＣ１８ＤＮＡ−ＨａｅIII消化物）であった。図１５に示される分離は、以下のようにオクタデシルで修飾された非多孔質のポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）ビーズを使用して得た。すなわち、カラム：50×4.6mm直径；移動相0.1MＴＥＡＡ、ｐＨ7.3；勾配：３分で35 −55％0.1MＴＥＡＡおよび10.0％２−プロパノール（溶離液Ｂ）、10分で55-65 ％Ｂ、2.5分間65％Ｂ；１分で65-100％Ｂ；そして1.5分で100−35％Ｂ。流速は0 .75mL／分であり、260nmの検出ＵＶ、およびカラム温度51℃。サンプルは５μl （＝0.２μgのpＵＣ１８ＤＮＡ−ＨａｅIII消化物）であった。図１６に示される分離は、以下のようにオクタデシルで修飾された非多孔質のポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）ビーズを使用して得た。すなわち、カラム：50×4.6mm直径：移動相0.05MＴＥＡ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ7.3；勾配：３分で35-55％0.05MTＥＡ₂ＨＰＯ₄および1 0.0％２−プロパノール（溶離液Ｂ）、７分で55−65％Ｂ、2.5分間65％Ｂ；１分で65−100％Ｂ；そして1.5分で100−65％Ｂ。流速は0.75mL／分であり、260nmの検出ＵＶ、およびカラム温度51℃。サンプルは５μl（＝0.2μgのｐＵＣ１８ＤＮＡ−ＨａｅIII消化物）であった。図１７に示される分離は、以下のようにオクタデシルで修飾された非多孔質のポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）ビーズを使用して得た。すなわち、カラム：50×4.6mm直径；移動相0.1MＴＥＡＡ、ｐＨ7.3；勾配：３分で６ −９％0.1MＴＥＡＡおよび25.0％ＴＨＦ（溶離液Ｂ）、７分で９−11％Ｂ）2.5 分間11％Ｂ；１分で11−100％Ｂ；そして1.5分で100−６％Ｂ。流速は0.75mL／分であり、260nmの検出ＵＶ、およびカラム温度51℃。サンプルは５μl（＝0.2 μgのｐＵＣ１８ＤＮＡ−ＨａｅIII消化物）であった。実施例１４ｄｓＤＮＡのアイソクラチック／勾配分離以下は、ポリスチレン被覆されたシリカ基材(base)の材料でのｄｓＤＮＡのアイソクラチック／勾配分離である。アイソクラチック分離は、ビーズに対するＤＮＡ／アルキルアンモニウムイオン対の選択性の大きな差異のため、ＤＮＡ分離で実施されていない。しかしながら、勾配およびアイソクラチック溶出条件の組み合わせを使用することにより、系の分離力が特定の大きさ範囲のＤＮＡについて高められ得る。例えば、250〜300塩基対の範囲が、50×4.6mmの架橋ポリスチレン被覆されたシリカの逆相カラム、2.0ミクロンで、40℃で0.75mL／分で0.1M ＴＥＡＡおよび14.25％アセトニトリルの溶離液を使用することにより標的にされ得る。ｐＵＣ１８ＤＮＡ−ＨａｅIII消化物をアイソクラチック条件下で注入し、そして257、267および298塩基対のＤＮＡが完全に分離されて溶出した。その後、カラムを、９分で0.1MＴＥＡＡ／25％アセトニトリルでより大きな断片を一掃した。図１８は同一の溶出条件を使用するがしかしポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ポリマーを基材としたカラムで実施された分離を示す。他の例では、初期のアイソクラチック段階（カラムの調子を整える(condition) ため）、その後勾配段階（特定の大きさの第一群のＤＮＡを除去するもしくは標的にするため）、その後アイソクラチック段階（異なる大きさ範囲の標的物質を分離するため）、そして最後にカラムを浄化するための勾配段階が存在しうる。前述は本発明の特定の態様を提示した一方、これらの態様は例のみとして提示されたことが理解されるべきである。他者が、前述と異なるとは言え本明細書に記述されかつ特許請求されるような本発明の技術思想および範囲から離れない変形物を認めかつ実施することができることが期待される。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Improved liquid chromatography media for polynucleotide separation Field of the invention The present invention is directed to the separation of polynucleotides using non-porous beads. Yo More specifically, the present invention relates to a chromatography column containing non-porous beads. Single- and Double-Stranded Polynucleotides by Chromatography Using HPLC For the chromatographic separation of beads, where the beads are polymer or Coated with a non-polar substituted polymer and / or essentially all surface substrate groups (s urface substrate group) is a non-polar hydrocarbon or non-ionic substituted hydrocarbon Comprising either organic or inorganic particles substituted with Background of the Invention Separation of polynucleotides such as DNA has traditionally been achieved by slab gel electrophoresis. Or capillary electrophoresis. However, Polynuk Liquid chromatographic separation of leotide automates the analysis and allows them to be separated Has become more important due to the ability to collect fractions after they have been. Therefore, liquid chromatography Columns are more important for separation of polynucleotides by chromatography (LC) It has become. Silica-based columns are by far the most common LC columns. these Among them, a column using silica having a reversed phase as a base material is preferable. Because they are highly separated Efficient, mechanically stable, and various functional groups have various column selectivities Because they can be easily combined. Silica-based reversed-phase column materials are well-prepared to separate single-stranded DNA. Although moving, these materials separate double-stranded DNA Not working well enough. Double-stranded DNA using silica-based material Peaks from the separation have poor or wide shape or double stranded DN A cannot even be eluted. Separation can take up to several hours or separation Poor degree, peak symmetry and sensitivity of separation. High quality materials for DNA isolation are disclosed in US Pat. No. 5,585,236. Based on a polymeric carrier such as Suitable for separation of double-stranded DNA Requirements for mosquito-based column packing materials and other materials Exists. Summary of the Invention Accordingly, one object of the present invention is to separate polynucleotides with improved separation and efficiency. It is to provide a chromatographic method for separation. Other objects of the present invention, as will be apparent from reading this and the following details. Has been achieved by the method of the present invention, wherein the polynucleotide is non- Chromatographically separated using a column containing porous beads. The beads are coated with a polymer or a non-polar substituted polymer, and / or Are essentially all non-polar hydrocarbons or non-ionic substituted hydrocarbons Comprising either organic or inorganic particles that have been substituted with silicon. Disclosed herein is a method for separating a mixture of polynucleotides. The method is Mixtures of polynucleotides with up to 1500 base pairs from 0.5 to 100 microns Flowing through a separation column containing beads having an average diameter; and Including separating the mixture of nucleotides Consists of Are the beads coated with a hydrocarbon or non-polar substituted polymer? Or a non-polar hydrocarbon or substituted hydrocarbon having essentially all surface substrate groups Comprising non-porous particles that have been reacted with elemental groups. Precautions but they are polyvalent The beads are essentially free of ionic contaminants and the beads have any residual metallic contaminants The production of the beads so that they are also removed, for example by an acid wash treatment. Intervened. In one embodiment, the beads have a minimum of 0.05 (as defined below) It has a DNA separation coefficient. In one preferred embodiment, the beads Have a DNA separation factor of at least 0.5. The separation is preferably a matched ion polynucleotide as defined below. Chromatography (Matched Ion Polynucleotide Chromatography) (MIPC )by. The beads preferably have an average diameter of about 1-5 microns. Non-many The porous particles are preferably silica, silica carbide, silica nitrite, titanium oxide. Water, insoluble metals such as aluminum oxide, zirconium oxide, carbon, and cellulose. Sugar and diatomaceous earth or those materials that have been modified to be non-porous Selected from any of the fees. The non-porous particles are most preferably silica, It is preferably essentially free of unreacted silanol groups. Particles are non-covalent Coating, covalent coating, or silanol group with hydrocarbon group It can be produced by a reaction. Non-porous particles can be coated with a polymer. The polymer is preferably a poly Styrene, polymethacrylate, polyethylene, polyurethane, polypropylene , Polyamide, cellulose, polydimethylsiloxane and polydialkylsilo Selected from xanes. The polymer may be Some are unsubstituted or have hydrocarbon or nonionic substituents Substituted with another group. Polymer may be from 1 to 1,000,000 May be substituted with a hydrocarbon group having the carbon atoms of Alkyl with 1 to 100 carbons, and preferably 1 to 24 carbons Group. From 24 to 1,000,000 hydrocarbon groups are referred to herein as hydrocarbon polymers And the composition of the hydrocarbon group as defined herein (constit uency). Organic silanols (eg, HO-Si-R_Three) Or alkoxy (eg, RO -Si-R_Three) Reactions without the polymerization of silanes with silica supports are also Good packing can result. The method involves the use of alkyl or alkyl-substituted functional groups. Produces a dense monolayer of, esters, cyano, and other non-ionic groups . Monofunctional dimethylsilane (X-Si (CH_Three)_Two-R) with minimal residual Provide a homogeneous organic coating with excess Si-OH groups. Monochlorosilane It is preferred if the reagent can be provided with the required organic functionality. These reactions Provides reproducible and high quality filler materials. Unreacted accessible sila Knol may be left after the first reaction. The non-porous particles are preferably a bird ( Lower alkyl) chlorosilane (preferably trimethyloctosilane) The residual reactivity after coating or hydrocarbon displacement is capped. Block the lanol moiety. Alternatively, all of the silanol sites are all reactive It can be reacted with an excess of endcapping reagent to lose lanol groups. Non End capping of the porous particles can be accomplished by trialkylchlorosilane (eg, Non-porous particles with the corresponding hydrocarbon-substituted silanes such as Child's reaction, Alternatively, dichlorotetraalkyldisilazane (for example, dichlorotetramethyldisilazane) Reaction with the corresponding hydrocarbon-substituted disilazane such as Can be The method of the present invention relates to a double-stranded polynucleotide having from about 1500 to 2000 base pairs. Can be used to separate tides. In many cases, the method involves up to 600 bases. Or a base having 5 to 80 bases or base pairs. Used to separate oligonucleotides. The method is performed at a temperature between 20 ° C. and 90 ° C. to produce a back pressure no greater than 10,000 psi. It is performed at a temperature within the range. The method also preferably comprises an organic solvent that is water-soluble. A medium is also used. The solvent is preferably alcohol, nitrile, dimethylform. Selected from the group consisting of muamides, esters and ethers. The method also , Preferably trialkylamine acetate, trialkylamine carbonate and phosphoric acid A counter-ionic agent selected from trialkylamines is also used. Most preferred counter ion Agent is triethylammonium acetate or triethylammonium hexaflur Oroisopropyl alcohol. The method also preferably holds the solution entering the separation column therein. Contact a process solution that is run or flows through it Supplying and feeding components having process solution contact surfaces And The process solution contact surface is retained within or Is a material that does not release polyvalent cations into aqueous solutions flowing through it, The rum and its contents are protected from polyvalent cation contamination. Process solution contact The surface is preferably titanium, coated stainless steel, passivated stainless steel and Organic poly A material selected from the group consisting of Eluent solution entering the column and The polyvalent cations in the sample solution also preferably cause the resin bed to become contaminated with polyvalent cations. Multiply the cation-trapping resin before the solution enters the column to protect it from staining. Also removed by contact with Polyvalent capture resins are cation exchange resins and And chelating resins. The column and the The process solution flowing therethrough is preferably essentially free of polycationic contaminants. Not included. The polynucleotide is a matched ion polynucleotide chromatograph Separated by 0.5 to 100 microns for a mixture of polynucleotides with up to 1500 base pairs Flowing through a separation column containing beads having an average diameter of Mixtures of nucleotides for matched ion polynucleotide chromatography A method for separating a mixture of polynucleotides, comprising further separating Disclosed in the specification. The beads may be polymer coated or essentially all Reacting some of the surface substrate groups with non-polar hydrocarbons or substituted hydrocarbon groups and / or Or comprising non-porous particles endcapped therewith. The The beads are characterized by having a DNA separation factor of at least 0.05. Columns, and The process solution retained therein or flowing therethrough is a polyvalent cation Essentially free of contaminants. The method produces a back pressure no greater than 10,000 psi. It is carried out at a temperature in the range of 20 ° C. to 90 ° C. Water-soluble organic solvents Are used in the practice of the method. Beads comprising non-porous particles coated with a polymer are also disclosed herein Is done. The beads have an average diameter of 0.5 to 100 microns, Further, it has a DNA separation coefficient of at least 0.05. In a preferred embodiment Wherein the beads have a DNA separation factor of at least 0.5. This The beads preferably have a diameter of about 1-5 microns. Non-porous particles are preferred Preferably, silica, silica carbide, silica nitrite, titanium oxide, aluminum oxide , Zirconium oxide, carbon, insoluble polysaccharides such as cellulose, and silica. Soil or any of these materials that have been modified to be non-porous Selected from The non-porous particles are most preferably silica, which is preferably Has minimal silanol groups. The polymer is preferably polystyrene , Polymethacrylate, polyethylene, polyurethane, polypropylene, polya Mid, cellulose, polydimethylsiloxane and polydialkylsiloxane And is preferably unsubstituted, alkylated, or Alkyl or aryl substituted, or methyl substituted or ethyl substituted Alkylated with the substituted substituted alkyl group. The polymer has 1 to 22 carbons Can be alkylated with an atom, preferably an alkyl group having 8 to 18 carbon atoms . Essentially all surface substrate groups are reacted with hydrocarbon groups and then Hydrogen or substituted hydrocarbon groups, preferably tri (lower alkyl) chloro Endcapping with orchid or tetra (lower alkyl) dichlorodisilazane Beads comprising the described non-porous particles are also disclosed herein. The The beads have an average diameter of 0.5 to 100 microns and a minimum DNA separation of 0.05 It is characterized by having a coefficient. The beads are preferably about 1-5 microns. Has a diameter. The non-porous particles are preferably silica, silica carbide, nitrous acid Silica, titanium oxide, aluminum oxide, zirconium oxide, carbon, cellulose Insoluble polysaccharides such as diatomaceous earth, and diatomaceous earth, or modified to be non-porous Selected from any of these materials. Non-porous particles are most preferred Is silica, which preferably has minimal silanol groups. Non-porous grains Endcapping of the child is trimethylchlorosilane or dichlorotetriate. It can be achieved by reaction of non-porous particles with isopropyl disilazane. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 is a schematic representation of how DNA separation factors are applied to separations. . FIG. 2 shows a silica core and an endcapping shield (endcap). 1 is a schematic diagram of a cross section of a representative of reversed phase beads with ping shielding. Figure 3 shows a cross section of a representative reversed phase bead with a silica core and a polymer shield. FIG. FIG. 4 contains alkylated poly (styrene-divinylbenzene) beads MIPC separation of pUC18 DNA-HaeIII digested fragment on a column that performs . The peaks are labeled with the number of base pairs of the eluted fragment. FIG. 5 shows the non-porous 2. (non-porous) poly (styrene-divinylbenzene) underivatized. PUC18 DNA-HaeIII digestion digestion on a column containing 1 micron beads MIPC separation of one piece. FIG. 6 shows an architecture showing positive enthalpy using acetonitrile as solvent. With modified poly (styrene-divinylbenzene) beads Retention coefficient 1 / T [° K^-1] Is a Fant-Hoff plot. FIG. 7 shows a derivative showing positive enthalpy using acetonitrile as a solvent. Retention coefficient of poly (styrene-divinylbenzene) beads not converted to 1 / T [° K^-1] Is a Fant-Hoff plot. FIG. 8 shows alkylation showing negative enthalpy using methanol as solvent Coefficient of 1 / T [° K^-1 ] Is a Fant-Hoff plot. FIG. 9 shows the use of acetonitrile as the alkylated beads and solvent. It is separation. FIG. 10 shows the use of alkylated beads and 50.0% methanol as solvent. Separation. FIG. 11 shows the use of alkylated beads and 25.0% ethanol as solvent. Separation. FIG. 12 shows alkylated beads and 25.0% vodka (strike) as solvent. Separation using Naya (Stolichnaya, 100 proof). FIG. 13 shows alkylated beads and 25.0% 1-propanol as solvent. The separation to use. FIG. 14 shows alkylated beads and 25.0% 1-propanol as solvent. The separation to use. FIG. 15 shows alkylated beads and 10.0% 2-propanol as solvent. The separation to use. FIG. 16 shows alkylated beads and 10.0% 2-propanol as solvent. The separation to use. FIG. 17 shows alkylated beads and 25.0% THF as solvent. Is the separation to use. FIG. 18 shows the results for unalkylated poly (styrene-divinylbenzene) beads. Isocratic / gradient separation. Detailed description of the invention In its most general form, the subject of the present invention is from about 0.5 to 100 microns; Non-porous having an average diameter of 1 to 10 microns; more preferably 1 to 5 microns -Ion polynucleotide chromatography using columns packed with porous beads Separation of polynucleotides by chromatography. Average diameter of 1.0-3.0 microns Beads having a diameter are most preferred. In U.S. Patent No. 5,585,236, Bonn et al. The method for separating oxides is called reverse phase ion pairing chromatography (RPI). PC). However, RPIPC is described in the present invention Another term, matched-ion polynucleotide, because it does not incorporate essential features Chromatography (MIPC) was selected. As used herein MIPC separates single- and double-stranded polynucleotides using non-polar beads. Release method, wherein the method comprises removing the counterion agent and the polynucleotide from the beads. Use an organic solvent to desorb the nucleotides, where the beads are at least 0. It is characterized as having a DNA separation factor of 05. In one preferred embodiment, Doses are characterized as having a DNA separation factor of at least 0.5. The performance of the beads of the present invention is high efficiency of MIPC of double-stranded and single-stranded DNA by MIPC. Proven by separation. We are the best standard for measuring bead performance Is a DNA separation coefficient. This is because pUC18 DNA-Hae Two 257 and 267 base pairs of III restriction digest It is measured as the separation of strand DNA fragments, where the valley between the peaks and the peak The distance to the summit exceeds the distance from the baseline to the valley. Diagram of Figure 1 Referring to the figure, the DNA separation factor is the valley between peaks “b” and “c” from the baseline. Distance "a" to "e" and one of peaks "b" or "c" from valley "e" It is determined by measuring the distance "d" to the top. Peak heights are equal If not, the highest peak is used to get "d". The DNA separation factor is d / (A + d). The peaks at 257 and 267 base pairs in this diagram are It is similar. The operational beads of the present invention have a minimum DNA separation agent of 0.05. Have a number. Preferred beads have a minimum DNA separation factor of 0.5. Optimum form In some embodiments, the beads have a DNA separation factor of at least 0.95. Without wishing to be bound by theory, we will note that as specified herein Beads that comply with various DNA separation factors convert separated polynucleotides into beads. It is considered to have a pore size that essentially eliminates it from entering. As used herein The term "non-porous" refers to the separation in the solvent medium Has surface pores with diameters smaller than the smallest DNA fragment size and shape at Is defined as indicating a bead. These specified conditions in their original state With a large size limit or to meet the required maximum effective pore size Beads that have been treated to reduce their pore size are included in this definition. Preferably, all beads providing a minimum DNA separation factor of 0.05 are "non-porous" "Is intended to be included within the definition of a bead. The conformation of the surface of the non-porous beads of the present invention is a depression that does not interfere with the separation process. ssions) and shallow pit-like structures. Non it Pretreatment of the porous beads to make them porous will fill the pores in the bead structure It can be accomplished with any material that can and does not significantly interfere with the MIPC process. The pore is an open structure through which eluents and other substances can enter the bead structure It is. Holes often allow liquid entering one hole to exit another. Interconnected so that We have interconnected pore structures and beads Pores with dimensions that allow movement of the polynucleotide into it increase the resolution of the separation. It is thought to be detrimental or result in a separation with a very long retention time. However However, in MIPC, beads are "non-porous" and polynucleotide Does not enter the bead structure. The term polynucleotide refers to one ribose (or deoxyribose). ) Contains an undefined number of nucleotides linked via phosphate residues from one to another Is defined as having a linear polymer. The invention relates to RNA or double-stranded or single-stranded It can be used in the separation of single-stranded DNA. For the purpose of simplifying the description of the present invention, and Without limitation, the separation of double-stranded DNA can be described in the Examples herein. All polynucleotides are intended to be included within the scope of the present invention. Is understood. Chromatographic efficiency of column beads is mainly due to surface and near surface area. Affected by characteristics. For this reason, the following description is especially for polymer beads. Regarding the close-to-the-surface region. Book of these beads The body and / or center is at or near the surface of the polymer beads of the invention. May represent a completely different set of chemical and physical properties than those observed in. The beads of the invention may be non-polar molecules or attached to or on a surface thereof. Comprising non-porous particles having a coated non-polar polymer. Generally, Can be either coated with a polymer or essentially free of all surface substrate groups. Has been reacted with water-soluble or substituted hydrocarbon groups and any residual The surface substrate group to be formed may also be tri (lower alkyl) chlorosilane as described above or Non-endcapped with tetra (lower alkyl) dichlorodisilazane Comprising porous particles. The non-porous particles are preferably inorganic particles, but are non-porous organic particles. possible. Non-porous particles, for example, silica, silica carbide, silica nitrite Like titanium oxide, aluminum oxide, zirconium oxide, carbon, cellulose Insoluble polysaccharide or diatomaceous earth or modified to be non-porous It can be any of these materials. Examples of carbon particles are any interfering pollutants As well as diamond and graphite that have been treated to remove. Good Good particles are essentially non-deformable and can withstand high pressures. Non-porous particles Is manufactured by known procedures. Preferred particle size is about 0.5-100 microns: preferred 1 to 10 microns; more preferably 1 to 5 microns. 1.0-3.0 microns Most preferred are beads having an average diameter of The chemistry for producing conventional silica-based reverse phase HPLC materials is known. For that reason, most of the description of the inventive beads herein is presented in terms of silica. I However, other non-porous particles, such as those listed above, are modified in the same manner It is understood that silica can be substituted for silica in the method of the present invention. It is. Silica general chemistry For descriptions, see Pool (Poole, Colin F.), Pool (Salwa K. Poole), Chromat ography Today, Elsevier: New York (1991), pp.313-342 And Schneider (R.L.) and Kirkland (J.J.), Introductio n to Modern Liquid Chromatography, 2nd Edition, John Wiley & Sa Inc. (John Wiley & Sons, Inc.): New York (1979), pp.272-278. References, the disclosures of which are hereby incorporated by reference in their entirety. I will. The non-porous beads of the invention can be used after coating or reaction with an alkylating reagent. Having a minimum of exposed silanol groups. Minimal silanol groups Is used to inhibit DNA interaction with the carrier, and also at high pH and aqueous Needed to improve the stability of the material in the environment. The silanol group Can repel the negative charge of the DNA molecule and disrupt the interaction of the DNA with the stationary phase of the column. Can be harmful to prevent or limit. Another possible mechanism of interaction is Lanol can act as an ion exchange site, with iron (III) or chromium (III) Is to collect such metals. Iron (III) or other gold trapped on the column The genus can distort the DNA peak or the DNA is eluted from the column Can even prevent it. Silanol groups can be hydrolyzed by a water-based eluent. The hydrolysis is Exposing more silanol sites or present in the silica core Exposure of the metal can increase the polarity and reactivity of the stationary phase. Wear. Hydrolysis can be more prevalent with increased silanol groups . Which mechanism of interference is most prevalent in the effects of silanol groups on DNA separation Depends on. For example, iron (I II) indicates whether iron (III) is present in the eluent, in the instrument, or in the sample. Depending on whether it is present in the exposed silanol sites. Metal effects can only occur if the metal is already present in the system or reagent. You. Metals present in the system or reagents are trapped by ion exchange sites on the silica. Can be However, if the metal is not present in the system or reagent, The radicals themselves can cause interference with DNA separation. Exposure due to aqueous environment Hydrolysis of the lanol moiety may expose metals that may be present in the silica core. Fully hydrolyzed silica has 8 μmol of silanol per square meter of surface. It contains the concentration of the hydroxyl group. At most, for reasons of three-dimensional (consideration), at most About 4.5 μmol of silanol groups per square meter can be reacted, The remainder is sterically shielded by the reacted groups. The minimum silanol group is Reaching the theoretical limit of shielding sufficient to prevent the hydroxyl group from interfering with separation Or having this. Numerous methods exist for forming non-porous silica core particles. For example, Sodium silicate solution poured into methanol is finely divided into sodium silicate A suspension of the treated spherical particles can be produced. These particles react with the acid. Is neutralized. Thus, spherical particles of silica gel having a diameter of about 1-2 microns The child is obtained. Silica can be precipitated from organic liquids or vapors. High temperature (about 2000 ° C) silica is vaporized and the vapors use a gas that reduces or oxidizes the temperature Any of the above can be condensed to form finely divided silica. Shi Rika's Go The composition and properties are described in The Chemistry of Silica, Solubility, Po1ymerization, Col. loid and Surface Properties, and Biochemistry, John Wiley and ・ John Wiley & Sons: New York (1979) by R.K.Iler Is described. W. Stober et al. Colloid and Interface Sci., 26: 62-69 (1 968) describe the controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range. Was. Stober et al. Reported the hydrolysis of alkyl silicates and subsequent Control of uniformly sized spherical silica particles by condensation of silicic acid in coal solution Describes a chemical reaction system that enables advanced growth. Ammonia is a morpholog ical catalyst). The particle size obtained in suspension is less than 0.05 μm in diameter. It ranges from full to 2 μm. Non-porous silica core beads are available from Micra Scientific. fic) (Northbrook, Illinois) and Chemie Ueti kkon) (Lausanne, Switzerland). To produce the non-porous beads of the present invention, the non-porous particles are coated with a polymer. Or essentially all of the surface substrate groups of the non-porous particles are non-polar hydrocarbons. Or end capping by reacting to be blocked by a substituted hydrocarbon group. Is performed. This can be achieved in several ways. The siloxane coating in the organic bonded phase can be a monolayer or It can be made as a combined multilayer coating. Charge with so-called monomolecular organic phase Filling is usually based on silicic acid (siliceous-base) The surface silanol groups of the particles are mono-, di- or trifunctional chloro, dimethyl, amino , Siloxy or alkoxysilane. this Typical monofunctional reactants used in these reactions include X-Si-R, where X = Cl, OH, OCH_ThreeOr OC_TwoH_FiveAnd R is an organic group. Figure 2 , A schematic representation of a bead 20 having a silica core 22 and a monomolecular organic phase. ( This figure does not necessarily show the morphology or pore structure of the beads of the present invention, and Scheduled for illustrative purposes only. ) R for surface modification_TwoSix_TwoAnd RSix_ThreeUse bi- and tri-functional reactants such as When used, up to two Si-X groups per bound functional group remain unreacted is there. After treatment with water, hydrolysis of these unreacted groups occurs, and additional Of silanol groups at almost the same concentration as the bound organic functional groups present in the packing (Sometimes in a polymer matrix). These acidic organic silanols Groups can significantly affect the retention behavior of solutes and in aqueous solutions with pH> 7 Can have a detrimental effect on the stability of the packing at the same time. Thus, incomplete reaction of the surface with the silane reagent, or di- or tri-functional modification The formation of new Si-OH groups from the use of a modifier is Or a population of residual acidic Si-OH groups that are easily accessible to sample molecules. Can work. Therefore, the recent trend is that (a) instead of partial coverage, government A single layer with a high density of active groups, and (b) the minimal possibility of residual Si-OH groups. Monofunctional dimethylsilane [X-S] to provide a homogeneous organic coating with i (CH_Three)_Two-R]. Monochlorosilane reagents are required Machine sensuality It is preferable if it can be prepared. When two of the R groups of the monofunctional group modifier are methyl Has a surface coating (based on carbon analysis) of one square meter of organic About 4 μmol. In the latter case, the residual Si-OH groups on the silica surface Cannot be used for chromatographic interactions with most solutes due to steric shielding No. Organic silanols (eg, HO-Si-R_Three) Or organic alkoxy (eg, RO-Si-R_Three) The reaction without polymerization of silane with silica support is also good Filling can occur. These reactions are relatively reproducible, but with little water Or other reactive species are absent. Accessible silanols that are not reacted It can be left after the first reaction, but these are filled with chlorotrimethylsilane. (But the R group does not react with the latter silane) . According to one method, the non-porous particles are coated with a polymer coating. The grain Polymers suitable for use in coating the strands include chain reaction polymers and step reaction polymers. -For example, polystyrene, polymethacrylate, polyethylene, polyurethane Insoluble polysaccharides such as polypropylene, polyamide, cellulose, polydimethyl Includes siloxanes, polydialkylsiloxanes and related materials. Polymer Co The coating is non-porous by a multi-coating process so that complete shielding of the surface is achieved. Can be attached to the porous particles. In recent years, a new, known as polymer-coated or polymer-encapsulated filling The bonded phase packing is immobilized on a stationary solid for open tubular column gas chromatography. It was introduced on the basis of the technology used to produce stationary phases. In this case, The phase may be bare silica or pre-silanized (Presilanized) silica particles are converted to poly (siloxane) or poly (siloxane). Butadiene) produced by mechanical coating with a prepolymer, which Chemicals induced by post-peroxide, azo-tert-butane or gamma irradiation It is fixed by a crosslinking reaction. FIG. 3 shows a silica core 32 and a polymer coating. 4 is a specific illustrative illustration of a coated bead 30 having 34. (This figure shows the view of the present invention. Does not necessarily indicate the shape or hole structure of the To be scheduled. ) One alternative is to covalently bond with the vinyl-containing silane molecule and then granulate. Comprising a combination of polymerizing the coating on the surface of the child. Second child Can be applied when residual silanol or metal groups are present You. In one variant of the method, the silica surface first reacts with vinyltrichlorosilane. Then polymerizes the acrylic acid derivative onto and on the derivatized silica surface To be modified. Many useful monomers and prepolymers available Performance using a wide range of reversed phase polar and ion exchange packings using the same general reaction Allowed to be manufactured. This general approach also applies to the underlying carrier. Independent of chemistry, materials other than silica, such as alumina and zirconia, Are modified under conditions where the silica is unsuitable for example with a mobile phase outside the pH range 2 to 7.5. One can be used. Returning to silica, presilanization can be activated silanol The number of polymer groups, which in turn results in a thin polymer film that is tethered on the surface. Even more shielded. In reversed-phase liquid chromatography, these packings The material is compared with the monomeric chemically bound phase with respect to the separation of basic solutes. Showed improved chromatographic properties. Polymer-filled packing has a film thickness of about 1 nm and maintains reasonable mass transfer characteristics You. A description of this procedure has been published by H. Enge1hart et al. ( Chromatographia, 27: 535 (1989)). Polymer-coated beads made according to any of the above methods are subject to their unmodified It can be used in a decorated state or modified by substitution with a hydrocarbon group. I Stable hydrocarbon groups are also suitable. As used herein, "hydrocarbon" The term refers to alkyl and alkyl-substituted alkyls having from 1 to 1,000,000 carbons. An alkyl group is defined to include a reel group; Diverse types of linear, branched, and cyclic, including ter, ether, alkyl groups, etc. , Saturated and unsaturated nonionic functional groups, and the aryl group is phenyl, Monocyclic, bicyclic and tricyclic aromatic hydrocarbon groups including naphthyl and the like Including. Methods for hydrocarbon substitution are conventional and known in the art, and Thus, this is not an aspect of the present invention. Hydrocarbons are considered to be non-polar, reverse-phase functional groups. Hydroxy, cyano, nitro groups and the like. Preferred hydrocarbon groups are An alkyl group, and the description of suitable substitution methods below is for simplicity and limitation Aryl substitution by conventional procedures is also presented as alkylation and not as It is understood that it is intended to be included within the scope of the present invention. Polymer-coated beads are the corresponding alkyl halides, such as alkyl iodides And can be alkylated. Alkylation is a function of the surface of the polymer blend. Possibility in the presence of a Friedel-Crafts catalyst to effect electrophilic aromatic substitution at the aromatic ring This is achieved by mixing the rimer-coated beads with the alkyl halide. Suitable Friedel-Crafts catalyst Known in the art and include aluminum chloride, boron trifluoride, And Lewis acids such as 1 to 1,000,000 and preferably Is substituted by a hydrocarbon group having from 1 to 22 carbons by these methods. Can be Hydrocarbon groups having from 23 to 1,000,000 carbons are referred to herein as carbohydrates. Also referred to as hydrogen polymer. Alkylation can be accomplished by a number of known synthetic procedures. These are archi Friedel-Crafts alkylation with halides, forming ethers And addition of alkyl alcohol to chloromethylated beads. Of the present invention A preferred method for alkylating polymer-coated beads is a polymer coating. Alkylation after formation on non-porous particles One alternative is to polymerize the alkylated monomer to form an alkyl on the non-porous particles. Forming a coating of the polymerized polymer. In this embodiment Depending on the requirements of any number of carbon atoms, e.g. the variables of separation, For example, from 1 to 100 are substituted with an alkyl group having 1 to 50 or 1 to 24. Can be replaced. As an alternative to polymer coatings, the non-porous particles may have alkyl groups, Or other non-polar functional groups, including cyano, esters and other non-ionic groups And then a complete endcapping step is performed with silanol and metal Suppress the interaction of End-capping of non-porous particles, for example, For example, trimethylchlorosilane or dichlorotetraisopropyldisilazane. With trialkylchlorosilane or tetraalkyldichlorodisilazane Can be achieved. Numerous factors affect the success of the coupling reaction and the quality of the final bonded phase product. The rate and extent of the coupling reaction depends on the reactivity of the silane, the choice of solvent and catalyst, the time, It depends on the temperature, as well as the ratio of reagent to carrier. Cl, OH as a leaving group, OR, N (CH_Three)_Two, OCOCF_ThreeOrganosilanes containing phenols and enolates Is widely used. Dimethylamine, trifluoroacetate and pen The enol ether of tan-2,4-dione is the most reactive leaving group, but Nevertheless, inexpensiveness, availability and widespread availability are among the broadest, especially among commercial manufacturers. Provided by the commonly used chlorosilanes and alkoxysilanes. Most Initially, the reaction can be almost stoichiometric, but the surface coverage is near maximum. The reaction becomes very slow. For this reason, the reaction time is long (12 ~ 72 hours), the reaction temperature tends to be moderately high (about 100 ° C in most cases), In the case of chlorosilane, an acid acceptor catalyst (for example, pyridine) is used. A Some like rusilsilyl enolate and alkylsilyl dimethylamine Does not require additional catalyst or solvent to perform the reaction. use Although the most common solvents used are toluene and xylene, carbon tetrachloride , Trichloroethane and other solvents such as dimethylformamide (DMF) Recommended for being excellent. The binding reaction should be refluxed in an inert atmosphere As is more practiced, the solvent is often a good solvent for the organosilane, and Selection is based on their ability to achieve the desired reaction temperature at reflux and reflux. 3- Except for the cyanopropylsiloxane bonded phase, certain polar functional groups (such as OH The high reactivity of chlorosilanes for the production of polar reversed-phase bonded phases Exclude the use of these groups. Acidic Alternatively, alkoxysilanes containing basic functional groups are autocatalytic and The binder phase is usually formed by the condensation reaction of silane with surface silanol groups in an inert solvent. By refluxing at a temperature high enough to distill off the alcohol formed Manufactured. Binding of neutral polar ligands generally results in a monolayer coating of silica. Toluene-4-sulfonic acid or triethylamide in the presence of sufficient water to Requires the addition of a catalyst such as The presence of water depends on the adsorbed organosilane alcohol Accelerates the hydrolysis of xy groups, which results in surface silanols rather than polymerizing in solution. Tends to react with the thiol group. Organosilane with surface silanol groups physically adsorbed Results in a binder phase density smaller than the theoretically expected maximum after work Seems to be a general problem in the production of polar binder phases. Join The phase density can be increased by repeating the reaction a second time, or Nol groups can be minimized by endcapping. Most bonded phases contain a single functionalized ligand bonded to silicon And the remaining groups are leaving groups and / or methyl groups. However, more highly substituted organosilanes can also be used. 1,3-di Bifunctional organosilanes, such as chlorotetraisopropyldisilazane, Can react with surface silanol groups at the ends of the It forms a bonded phase that is more hydrolytically stable than the formed bonded phase. Bidentate ) Organosilane is a reaction that more closely matches the spacing of silanol groups on the silica surface With both leaving groups attached to the same silicon atom Provides greater binder phase coverage achieved with rosilane. Alkyl dime For tyl silane, increasing the length of the alkyl group is Increases the hydrolytic stability of the bonded phase with respect to that of the conjugated ligand. Me Increasing the chain length of the chill group increases the hydrolytic stability of the bonded phase, but only And reduce phase coverage by steric effects. 1 or 2 on silicon atom of silane Monofunctional organic containing one bulky group such as isopropyl or t-butyl The use of silanes can be more important in the manufacture of bonded phases for use at low pH . Bulk alkyl groups are more hydrolytically sensitive to the packing surface than methyl groups do. To provide better steric protection against siloxane groups. General methods for coating and endcapping silica supports are known techniques. . However, the general understanding of those who have used these materials is that Is not suitable for high-performance double-stranded DNA separation. However, the present invention The coatings and end caps provide perfect shielding of the silica core. The beads formed and resulting from the more careful application of the tapping procedure are, for example, U.S. Pat. Alkylated non-porous polymer beads disclosed in U.S. Patent No. 5,585,236 Single and double stranded that are comparable or better than those achieved using It has the ability to perform a rapid separation of both DNAs. The beads of the present invention are capable of binding small amounts of metal contaminants or other contaminants that can bind DNA. It is also characterized by having a dye substance. Preferred beads of the present invention can be any number of beads. Valent cation contaminants (eg Fe (III), Cr (III) or colloidal metals Decontamination treatments, such as acid cleaning treatments, designed to essentially eliminate contaminants Characterized by being subjected to precautionary measures during the manufacture, including: Very pure Only non-metal-containing materials Used in the manufacture of beads because the bead can have a minimal metal content. Should be used. That the surface of the beads has minimal exposure of silanols or metal oxides; And during manufacture of the beads to ensure that the surface remains non-porous Attention must be paid to To achieve high resolution chromatographic separation of polynucleotides, It is common to pack chromatography columns tightly with solid, non-porous beads Is necessary for Any known method of packing a column with column packing material comprises: It can be used in the present invention to obtain a sufficiently high resolution separation. Typically, beads Use a solvent whose slurry has a density equal to or less than the density of the beads It is prepared by The column is then filled with the bead slurry and shaken or Is agitated to increase the packing density of the beads in the column. Mechanical vibration or super Sonication is typically used to increase packing density. For example, to pack a 50 x 4.6 mm diameter column, 2.0 grams of beads are It can be suspended in 10 mL of methanol with the help of processing. This suspension is then The column is packed using 50 mL of methanol at a pressure of 8,000 psi. This is filling Improve floor density. The separation method of the present invention generally comprises single- and double-stranded DNA and RNA. It is applicable to chromatographic separation of nucleotides. Polynucleotide The sample containing the mixture contains total polynucleotide synthesis, restriction endonucleases. Cleavage of DNA or RNA with enzymes or other enzymes or chemicals, and And amplified polynucleotides using polymerase chain reaction technology Can arise from a sample. The method of the present invention relates to a double-stranded polynucleotide having from about 1500 to 2000 base pairs. Can be used to separate In many cases, the method involves up to 600 bases. Or a base having 5 to 80 bases or base pairs. Used to separate oligonucleotides. In a preferred embodiment, the separation is by MIPC. Non-porous beads of the present invention Works with counterion agents and solvent gradients to effect DNA separation Used as a reversed phase material. In MIPC, DNA fragments are counterions Reversed phase using the non-porous beads of the invention, then matched with the agent It is chromatographed. Trialkylamine acetate, trialkyl carbonate Volatile counterion agents such as amines and trialkylamine phosphates Preferred for use in the above method, triethylammonium acetate (TEAA) and Triethylammonium hexafluoroisopropyl alcohol is most preferred . Optimal peak fraction during separation of DNA by MIPC using beads of the invention To achieve separation, the method should produce a back pressure no greater than 10,000 psi. It is carried out at a temperature in the range from 20 ° C to 90 ° C. Generally, separation of single-stranded fragments is Should be performed at elevated temperatures. We believe that the temperature at which the separation is performed will affect the choice of solvent used in the separation. I found it to be lost. Water-soluble if the separation is performed at a temperature in the upper range Organic solvents such as alcohols, nitriles, dimethylformamide (DMF), Esters and ethers are preferably used. A water-soluble solvent is used in the operation of the present invention. Are defined as existing as an aqueous system and a single phase under all conditions. In the method of the present invention Particularly preferred solvents for use are methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, Acetonitrile, including tetrahydrofuran (THF) and acetonitrile Is most preferred. The two compounds (in this case, DNA fragments of different sizes) are different It can only be separated if it has a distribution coefficient (K). Nernst's distribution coefficient is moving It is defined as the concentration (A) of the analyte in the stationary phase divided by its concentration in the phase. You The word The distribution coefficient (K) and the retention coefficient (k) are given by the following equations: Are related by Quotient V_m/ V_sIs also called the phase volume ratio (Φ). Therefore: k = KΦ To calculate the sorption enthalpy, the following basic thermodynamic equations are needed: is there. Ie By transforming the last two equations, we find the Van Hoff equation: Get. From the plot 1nk vs. 1 / T, the sorption enthalpy ΔH_sorpIs obtained from the slope of the graph (If a straight line is obtained). Δ_sorpIs the phase volume It can be calculated if the ratio (Φ) is known. Experiments with silica beads coated with poly (styrene-divinylbenzene) It also gives a negative slope for the 1nk vs. 1 / T plot, but this plot The bow is slightly curved. When acetonitrile is replaced by methanol, the retention factor k increases with increasing temperature. It decreases with temperature, and the mechanism of the retention is the heat generation process (ΔH_sorp<0). Thermodynamic data (as shown in the examples below) was obtained from Figure 5 shows the relative affinity of the DNA-counter ion agent conjugate for the solvent. Endothermic reaction pro The dots indicate the preference of the DNA complex for the beads. The exothermic reaction plot depends on the solvent 2 shows the preference of the DNA complex over the corresponding beads. Plots shown here Is on alkylated and non-alkylated surfaces as described in the Examples. About Most liquid chromatographic separations show exothermic reaction plots . In addition to the essentially metal-free beads themselves, we also use RPIPC In order to achieve optimal peak separation during All process solutions carried or flowing through the column contain polycationic contaminants. Quality (eg Fe (III), Cr (III) and colloidal metal contaminants) It should also not be included. Commonly owned co-pending US As described in application Ser. No. 08 / 748,376 (filed on Nov. 13, 1996) This is to be kept inside the column to protect the column from polyvalent cation contamination. Do not release polyvalent cations into the process solution carried or flowing through it. Components with process solution contact surfaces made of different materials This can be accomplished by supplying and feeding the incoming solution. this The process solution contact surfaces of the system components are preferably titanium, coated stainless steel, A material selected from the group consisting of passivated stainless steel and organic polymers. For example, metals found in stainless steel are those that have been oxidized or It does not damage the separation unless it is in the idly partially oxidized state. For example, 31 6 Stainless steel frit is acceptable in column hardware, however, Surface oxidized stainless steel frit impairs DNA separation. For additional protection, multivalent in eluent and sample solutions entering the column Cations are used by these solutions to protect the resin bed from polyvalent cation contamination. By contacting these solutions with a polycation-trapping resin before entering the ram Can be removed. The polyvalent capture resin is preferably a cation exchange resin and / or Is a chelating resin. Other features of the present invention may become apparent during the following description of the exemplary embodiments, These are given for illustrative purposes of the present invention and are intended to be limiting thereof. Not done. All references cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety. It is impregnated. The treatment described in the past tense in the examples below was performed in the laboratory. Current tense The procedures described were not performed in the laboratory and may be performed in the application for this application. It is reduced in configuration. Example 1 Standard phase of C-18 bonded phase In a 1000 mL round bottom flask, 200 g of non-porous 2 μm silica and one Add a small stirring egg. Transfer the flask containing silica to Oven And heat at 125 ° C. overnight (ie a minimum of 8 hours). Heating mantle and Install a cooler. C-18 binding reagent n-octadecyldimethylsilane is a waxy white solid at room temperature Or semi-solid. Open the jar in the hood for transfer, and gently heat it with a heat gun. Warm quickly (Note: pressure can build up in stored chlorosilane bottles, , They should be treated as if they were hydrochloric acid. Because Hydrochloric acid is a by-product on contact with moisture). In a second flask, 125 g of n-octadecylmethylchlorosilane reagent, 10 mL Transfer chloroform, 400 mL toluene and 65 mL pyridine. Go around the liquid reagent Mix by swirling and then dried silica And swirl until all of the silica is suspended. Reflux cooling A vessel is attached and the mixture is brought to reflux for 15 hours. The mixture will stop refluxing Let cool. 20 mL of trimethylchlorosilane, 6 mL of toluene in 20 mL of toluene Add the capping reagent package of xamethylsilane. Resuspend the mixture It becomes cloudy and the system is returned to reflux for 6 hours. Allow the mixture to cool to room temperature. Transfer to a Buchner funnel and add three 200 mL aliquots of methanol, then Wash with three 200 mL aliquots of Seton. Air dry for a minimum of 0.5 hours, and then Dry in oven at 100 ° C overnight. Submit the sample for elemental analysis and carbon percent. The dried bonded phase is now ready for column packing. Example 2 CN bonded phase, cyano phase To a 1000 mL round bottom flask, add 200 g of non-porous 2 μm silica and one stirring egg Add and dry in an oven at 125 ° C overnight (ie at least 8 hours) . On dried silica, 100 mL of 3-cyanopropylmethyldichlorosilane, 10 m Add L chloroform, 450 mL toluene and 50 mL pyridine. The mixture Suspend and bring to reflux for 15 hours. Cool filter and then buchna -In a funnel, one 200 mL aliquot of toluene, then two 200 mL aliquots of methanol Wash with mL aliquots. Transfer to beaker and add 300 mL of 50:50 medium containing hydrochloric acid. Tanol: Add water, pH 5.5. Suspend and leave for 1 hour at room temperature Let Filter on a Buchner funnel and wash the phases with methanol and acetone You. Transfer to a 1000 mL round bottom flask and dry in an oven overnight. Next, 20 mL of trimethylchlorosilane, 6 mL of hexamethyldisilazane, 350 m L of toluene, 10 mL of chloroform and 25 mL of pyridine to the dried bonded phase Endcap by addition and bring to reflux for 6 hours. Arising The mixture was cooled, transferred to a Buchner funnel, and three 200 mL aliquots of methanol were added. Wash the coat, then with three 200 mL aliquots of acetone. Air-dry for at least 0.5 hours And then dried overnight in an oven at 100 ° C. Submit the sample for elemental analysis. The bonded phase is now ready for column packing. Example 3 Dioctylsilyl phase-C-8 × 2 Repeat all of the steps for the CN bonded phase, but with the 3-cyanopropylmethyl Replace rudichlorosilane with 100 mL dioctyldichlorosilane. Example 4 Acid cleaning treatment The procedure of Example 1 is repeated, but the silica is dried to 500 mL prior to drying. With 100 mM hydrochloric acid and then with water. After cooling the product and methanol Wash with 500 mL of 100 mM hydrochloric acid prior to washing. Example 5 The product of Example 1 was combined with 1 gram of divinylbenzene and 10 mg of benzoic peroxide. With 100 mL of dichloromethane containing toluene. Dichloromethane as the monomer Is removed by rotary evaporation until is coated on the beads. Non The temperature is raised to 70 ° C. for 8 hours, always rotating slowly. The product is methanol Wash with. This procedure is repeated with the product of Example 4. Example 6 The procedure of Example 5 was repeated except that divinylbenzene was replaced with stearyldivinylbenzene. Repeat with. This procedure is repeated with the product of Example 4. Example 7 15 grams of non-porous silica particles, 50 mL of 2,2,4-trimethylpentane and And 25 mL of vinyltrichlorosilane are refluxed for 2 hours. Then the modified silica , 2,2,4-trimethylpentane and acetone several times, and 80 Dry at ℃. Round bottom 5 grams of vinyl coated silica particles produced as described above. Put in flask. 2 g of vinyl monomer (divinylbenzene, styrene, Rilonitrile, acrylic acid, butyl methacrylate or 2-hydroxymeth Acrylate) and add the mixture thoroughly. Disperse. Add 25 mL of acetonitrile containing 0.2 g of dibenzoyl peroxide And reflux the mixture for 2 hours. The product is extracted with acetonitrile and then with acetone to remove unreacted monomer. -And oligomers are removed from the particles. In the case of silica modified with acrylic acid, an extraction with water is also carried out. The filling material is dried at 80 ° C. prior to filling. Example 8 Standard procedure for testing the performance of separation media Packing the separation particles into an HPLC column and separating the standard DNA mixture Test for their ability. Standard mixtures are 11, 18, 80, 102, 174, 25 respectively PUC1 containing 11 fragments with 7, 267, 298, 434, 458 and 587 base pairs 8 DNA-HaeIII digest (Sigma-Aldrich, D62 93). Dilute standard with water and contain 0.25 μg total DNA 5 μL. Depending on the loading volume and loading polarity, the procedure involves a driving solvent (driving solvent). ) Requires selection of concentration, pH and temperature. Separation conditions for 257 and 267 peaks Adjust so that the retention time is about 6 to 10 minutes. The following solvents: methano , Ethanol, 2-propanol, 1-propanol, tetrahydrofuran Either (THF) or acetonitrile can be used. Counter ion agent , Trialkylamine acetate, trialkylamine carbonate, trialkylamine phosphate Or Polynuk Any other that can form a matched ion with the reotide anion Cations of the type As an example of this procedure, FIG. 4 shows an octadecyl-modified non-porous poly ( Ethylvinylbenzene-divinylbenzene) Standard DNA mixture using beads Shows a high degree of separation. This separation was performed under the following conditions. That is, eluent A: 0. 1 M TEAA, pH 7.0; Eluent B: 0.1 M TEAA, 25% acetonitrile; Gradient: The flow rate is 0.75 mL / min, detection UV at 260 nm, column temperature 50 ° C. pH 7.0 there were. As another example of this procedure using the same separation conditions as in FIG. Non-porous 2.1 micron vials of unmodified poly (styrene-divinylbenzene) High resolution separation of a standard DNA mixture on a column containing a column. Example 9 This example demonstrates a non-porous modified with octadecyl as described in Example 1. High resolution separation of DNA restriction fragments using silica reversed-phase materials Prove it. This experiment is performed under the following conditions. That is, column: 50 x 4.6mm diameter. Mobile phase: 0.1 M TEAA, pH 7.0. Gradient: 8.75-11.25% acetonitrile in 2 minutes Lyl followed by 11.25-14.25% acetonitrile in 10 minutes and 14.5-15.25% acetate in 4 minutes. Tonitrile, and 15.25-16.25% acetonitrile in 4 minutes. Flow rate 1 mL / min. Kara Temperature: 50 ° C. Detection: UV at 254 nm. Sample: 0.75 μg of pBR322 DNA HaeIII restriction digest and 0.65 μg of Φ × 174 DNA-HincII restriction digest Mixture of compounds. Separation with high resolution is due to the concentration of triethylammonium acetate (TEAA), gradient curve It is obtained by optimizing the line shape, column temperature and flow rate. Minute of peak Separation is continuously increased in changing from 25 mM to a minimum of 125 mM TEAA. It is. The gradient increases the fragment length of the DNA molecule and increases the steepness of the gradient curve. Optimized by reducing. The best separation of double-stranded DNA molecules is about 30 ° C Can be achieved at 50 ° C. Denaturation of DNA above about 50 ° C. Prevents the use of higher column temperatures for strips, but allows for the separation of single-stranded DNA. Separation can be performed up to 80 ° C. and at higher temperatures. Example 10 If gradient delay volume is minimized, survival and Dead organisms (animals and plants) and parts of such organisms (eg blood cells PCR products from a variety of sources including DNA, biopsy, sperm, etc. Non-porous poly- (ethylvinyl) modified with octadecyl of hybrid DNA Separation time with less than 2 minutes. (run time). Analysis of PCR products and hybrid DNA is usually performed at a known length. Only one or two separations and detections are required. Therefore, the resolution requirement is Much less strict about the separation of restriction fragments of DNA. These less Strict separation requirements allow the use of steep gradients, and consequently It also leads to shorter driving times. The recovery of DNA fragments containing 404 base pairs is About 97.5%. Unlike capillary electrophoresis (CE), PCR samples are analyzed by MIPC. It does not need to be desalted prior to precipitation. This is the decisive advantage of MIPC over CE. Represents a point. In MIPC, therefore, when an automatic autosampler is used It is possible to achieve a fully automated analysis of PCR samples. further In contrast to CE, quantification over several orders of magnitude is It can be achieved without the requirement for internal standards, thus quantifying gene expression and Enables the determination of virus titers in tissues and body fluids. Completely of the method of the present invention Automated reversion (version) distinguishes normal from mutated gene ( Distinctions) and for diagnostic purposes, the genomes of oncogenes, bacteria and viruses Polynucleotides (Hepatitis C virus, HIV, tuberculosis) Can be In addition, adjusting the column temperature reduces the severity of the hybridization reaction. Softening or separating heteroduplexes from homoduplex DNA species Enable. The adaptation of the polymer coated beads of the invention for clinical use is described under the following conditions Is done. That is, column: 50 × 4.6 mm diameter. Mobile phase: 0.1 M TEAA, pH 7.0. Gradient: 11.25-13.75% acetonitrile in 1 minute, then 22.5% acetonitrile for 6 seconds And 11.25% acetonitrile for 54 seconds. Flow rate: 3 mL / min. Column temperature: 50 ° C . Detection: UV at 256 nm. Samples: 2 0 μl PCR sample. The separation gives the following elution order: That is, 1 = non Specific PCR product, PCR product with 2 = 120 base pairs, 3 = with 132 base pairs PCR product, and 4 = PCR product with 167 base pairs. The method and steps of PCR are described in Science, 23): 1350-1354 (1985) by Pike (R.K. iki) et al. and U.S. Patent No. 4,863,202 by K.B. Is described. These references provide PCR that can be separated using the methods of the invention. The specification is hereby incorporated by reference for a more complete description of the methods and steps for obtaining a sample. Will be incorporated into the book. Iterative analysis of PCR products using the method of the invention is highly efficient under the described analytical conditions. Is reproducible. The result is not affected in any way by the previous injection. The method is highly suitable for routine use in the real-world situation of laboratory tests. Example 11 The following describes the separation of single-stranded DNA. 1.5 mi as described in Example 1 Ron, a 30 × 4.6 mm diameter silica-C18 column at 1 mL / min and 40 ° C. for 40 min. With a linear gradient of 2.5-12.5% acetonitrile in 0.1 M triethylammonium acetate use. Oligonucleotides of p (dC) 12-18 and p (dT) 12-18 The mixture of tides is separated and the first mixture elutes between 5 and 15 minutes and the second mixture Mixtures elute between 15 and 30 minutes. Example 12 Sorption enthalpy measurement Four fragments of the DNA digest (in 5 μl of pUC18 DNA-HaeIII digest) 174, 257, 267 and 298 base pairs found in 0.04 μg DNA / μl) was combined with C-18 alkylated poly (styrene-divinyl). Nylbenzene) polymer beads using isocratic conditions at different temperatures To separate. The conditions used for this separation are: eluent: 0.75 mL / min 0.1 M triacetate Ethyl ammonium, 14.25% (v / v) acetonitrile, UV detection at 250 nm , At temperatures of 35, 40, 45, 50, 55 and 60 ° C., respectively. 1nk vs 1 / T pro The plot (FIG. 6) shows that the retention factor k increases with increasing temperature. Show. This is because the holding mechanism is an endothermic reaction process (ΔH_sorp> 0) Show. Identical results on non-alkylated poly (styrene-divinylbenzene) beads The experiment (FIG. 7) gives a negative slope for the plot of 1nk vs. 1 / T, although This plot is slightly curved. With alkylated poly (styrene-divinylbenzene) beads, but The same experiment (FIG. 8) in which the cetonitrile solvent was replaced with methanol showed a retention factor k Plot 1 nk vs. 1 / T shows that decreases with increasing temperature. give. This is because the holding mechanism is an exothermic reaction process (ΔH_sorpBased on <0) Is shown. Alkylated and non-alkylated polymer beads Poly (styrene-divinylbenzene) and unalkylated alkyl Having a coated poly (styrene-divinylbenzene) coating Replacing with beads can give the same result. Example 13 Separation on alkylated poly (styrene-divinylbenzene) beads The eluent was used to determine the desorption capacity of the elution solvent to attract beads to the DNA-counter ion complex. Select to match the pull characteristics. Bead polarity decreases Requires stronger (more organic) or higher concentrations of solvent be able to. Weaker organic solvents such as methanol are generally acetonitrile Higher concentrations are required than stronger organic solvents such as FIG. 9 shows a non-porous poly (ethylvinylbenzene-modified) modified with octadecyl. 2 shows high resolution separation of DNA restriction fragments using (divinylbenzene) beads. This experiment was performed under the following conditions. Column: 50 x 4.6mm diameter; mobile phase 0.1M tet Laethyl acetic acid (TEAA), pH 7.2; Gradient: 33-55% acetonitrile in 3 minutes, 55-66% acetonitrile in 7 minutes, 65% acetonitrile in 2.5 minutes; 65-100% in 1 minute Acetonitrile; and 100-35% acetonitrile in 1.5 minutes. The flow rate is 0.75mL / min Yes, detection UV at 260 nm, column temperature 51 ° C. 5 μl of sample (= 0.2 μg of pUC 18 HaeIII digest). Replace the above procedure by replacing acetonitrile in 0.1 M TEAA with 50.0% methanol. Iterating gives the separation shown in FIG. Replace the above procedure by replacing acetonitrile in 0.1 M TEAA with 25.0% ethanol. Repeating gives the separation shown in FIG. Acetonitrile in 0.1 M TEAA is replaced with 25% vodka (Stlichnaya) , 100 proof) and repeating the above procedure replaces the separation shown in FIG. give. The separation shown in FIG. 13 is a non-porous modified with octadecyl as follows. Obtained using poly (ethylvinylbenzene-divinylbenzene) beads. sand Column: 50 x 4.6 mm diameter; mobile phase 0.1 M TEAA, pH 7.3; gradient: 12 in 3 minutes -18% 0.1M TEAA and 25.0% 1-propa Nol (eluent B), 18-22% B for 7 minutes, 22% B for 2.5 minutes; 22-100% B for 1 minute; 100-12% B in 1.5 minutes. The flow rate is 0.75 mL / min, detection UV at 260 nm, and Column temperature 51 ° C. The sample was 5 μl (= 0.2 μg of pUC18 DNA-HaeIII) Digestion). The separation shown in FIG. 14 is a non-porous modified with octadecyl as follows. Obtained using poly (ethylvinylbenzene-divinylbenzene) beads. sand Column: 50 × 4.6 mm diameter; mobile phase 0.1 M TEAA, pH 7.3; gradient: 15 in 2 minutes -18% 0.1 M TEAA and 25.0% 1-propanol (eluent B), 18-21 in 8 minutes % B, 21% B for 2.5 minutes; 21-100% B for 1 minute: and 100-15% B for 1.5 minutes. Flow velocity is 0 .75 mL / min, detection UV at 260 nm, and column temperature 51 ° C. Sample is 5μ1 (= 0.2 μg of pUC18 DNA-HaeIII digest). The separation shown in FIG. 15 is a non-porous modified with octadecyl as follows. Obtained using poly (ethylvinylbenzene-divinylbenzene) beads. sand Column: 50 × 4.6 mm diameter; mobile phase 0.1 M TEAA, pH 7.3; gradient: 35 in 3 minutes -55% 0.1M TEAA and 10.0% 2-propanol (eluent B), 55-65 in 10 minutes % B, 65% B for 2.5 minutes; 65-100% B for 1 minute; and 100-35% B for 1.5 minutes. Flow velocity is 0 .75 mL / min, detection UV at 260 nm, and column temperature 51 ° C. 5 μl sample (= 0.2 μg of pUC18 DNA-HaeIII digest). The separation shown in FIG. 16 is a non-porous modified with octadecyl as follows. Obtained using poly (ethylvinylbenzene-divinylbenzene) beads. sand In other words, column: 50 x 4.6 mm diameter: mobile phase 0.05 MTEA_TwoHPO_FourPH 7.3; Gradient: 35-55% 0.05MTEA in 3 minutes_TwoHPO_FourAnd 1 0.0% 2-propanol (eluent B), 55-65% B for 7 minutes, 65% B for 2.5 minutes; 1 minute 65-100% B at 1.5 min and 100-65% B at 1.5 min. The flow rate is 0.75 mL / min, 260 nm Detection UV, and column temperature 51 ° C. 5 μl of sample (= 0.2 μg of pUC18 DNA-HaeIII digest). The separation shown in FIG. 17 is a non-porous modified with octadecyl as follows. Obtained using poly (ethylvinylbenzene-divinylbenzene) beads. sand Column: 50 × 4.6 mm diameter; mobile phase 0.1 M TEAA, pH 7.3; gradient: 6 in 3 minutes -9% 0.1 M TEAA and 25.0% THF (eluent B), 9-11% B) in 7 minutes 2.5 11% B for 1 minute; 11-100% B for 1 minute; and 100-6% B for 1.5 minutes. The flow rate is 0.75mL / Min, detection UV at 260 nm, and column temperature 51 ° C. 5 μl of sample (= 0.2 μg of pUC18 DNA-HaeIII digest). Example 14 Isocratic / gradient separation of dsDNA The following is an illustration of dsDNA on a polystyrene-coated silica base material. Isocratic / gradient separation. Isocratic separation is achieved by using D DNA separation due to large differences in selectivity of NA / alkyl ammonium ion pairs Has not been implemented. However, a set of gradient and isocratic elution conditions By using combination, the separation power of the system can be reduced for DNA of a certain size range. Can be enhanced. For example, a range of 250 to 300 base pairs is a 50 × 4.6 mm crosslinked polystyrene. Reversed phase column of silica coated with silica, 2.0 micron, 0.1 M at 0.75 mL / min at 40 ° C. Targeting was achieved by using an eluent of TEAA and 14.25% acetonitrile. Can be The pUC18 DNA-HaeIII digest was subjected to isocratic stripping. And 257, 267 and 298 base pairs of DNA are completely separated and dissolved. Issued. The column was then increased with 0.1 M TEAA / 25% acetonitrile in 9 minutes. I wiped out the fragments. FIG. 18 uses the same elution conditions but with a poly (styrene) 1 shows the separation performed on a column based on (di-vinylbenzene) polymer. Another example is the early isocratic stage (conditioning the column) ), Followed by a gradient step (removing or marking a first group of DNA of a particular size). Then the isocratic stage (target substances of different size range (To separate), and finally a gradient step for purifying the column. While the foregoing has presented specific aspects of the present invention, these aspects are presented by way of example only. It should be understood that this was done. While others are different from the foregoing, Changes that do not depart from the spirit and scope of the invention as described and claimed. It is expected that the features can be recognized and implemented.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｃ 30/88 30/88 Ｅ (31)優先権主張番号６０／０５９，５２７ (32)優先日平成９年９月22日(1997．9．22) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／０６２，１２３ (32)優先日平成９年10月15日(1997．10．15) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／０６２，３０３ (32)優先日平成９年10月17日(1997．10．17) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／０６３，６１９ (32)優先日平成９年10月27日(1997．10．27) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／０６９，３１３ (32)優先日平成９年12月５日(1997．12．5) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号６０／０７７，９９８ (32)優先日平成10年３月13日(1998．3．13) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０９／０５８，３３７ (32)優先日平成10年４月10日(1998．4．10) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme court ゛ (Reference) G01N 30/48 G01N 30/48 C 30/88 30/88 E (31) Priority claim number 60/059, 527 (32) Priority date September 22, 1997 (September 22, 1997) (33) Priority claim country United States (US) (31) Priority claim number 60 / 062,123 (32) Priority date 1997 October 15, 1997 (Oct. 15, 1997) (33) Priority country United States (US) (31) Priority claim number 60 / 062,303 (32) Priority date October 17, 1997 (1997. 10.17) (33) Priority claim country United States (US) (31) Priority claim number 60 / 063,619 (32) Priority date October 27, 1997 (Oct. 27, 1997) (33) Priority Claiming country United States (US) (31) Priority number 60 / 069,313 (32) Priority date Heisei Heisei December 5, 1997 (12.5 December 1997) (33) Priority claim country United States (US) (31) Priority claim number 60 / 077,998 (32) Priority date March 13, 1998 (1998. 3.13) (33) Priority claim country United States (US) (31) Priority claim number 09 / 058,337 (32) Priority date April 10, 1998 (1998. 4.10) (33) Priority Claimed State United States (US) (81) Designated State EP (AT, BE, CH, CY, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE ), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, GM, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, C U, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, GH, GM, GW, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR , LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW

Claims

[Claims] 1. A method for separating a mixture of polynucleotides, having up to 1500 base pairs Mixtures of polynucleotides with beads having an average diameter of 0.5 to 100 microns Flowing through a separation column containing Or non-porous particles coated with a polymer substituted with a non-polar hydrocarbon, or Reacts essentially all polar groups with non-polar or substituted hydrocarbon groups Containing particles, and the beads have a DNA separation factor of at least 0.05 Separating the mixture of polynucleotides. The method that consists of. 2. Wherein the beads have a DNA separation factor of at least 0.5. The method of range 1. 3. The separation is performed by matched ion polynucleotide chromatography. The method of claim 1. 4. 2. The method of claim 1, wherein said beads are subjected to an acid wash treatment. 5. 2. The method of claim 1, wherein said beads are essentially free of multivalent cations. 6. The method of claim 1 wherein said beads have an average diameter of about 1-5 microns. 7. The non-porous particles include silica, silica carbide, silica nitrite, and titanium oxide. , Aluminum oxide, zirconium oxide, carbon, insoluble polysaccharide and diatomaceous earth 2. The method of claim 1, wherein said member is a member selected from the group consisting of: 8. The method of claim 1 wherein said non-porous particles are silica. 9. A non-porous bead comprising essentially no unreacted silanol groups; The method of claim 8 wherein 10. 2. The method of claim 1, wherein said non-porous particles are coated with a polymer. 11. The polymer is polystyrene, polymethacrylate, polyethylene, poly Urethane, polypropylene, polyamide, cellulose, polydimethylsiloxa Claim 10 selected from the group consisting of ethylene and polydialkylsiloxanes. the method of. 12. 11. The method of claim 10, wherein said polymer is unsubstituted. 13. The polymer reduces adsorption of polynucleotides to the beads. Sufficient to be alkylated with an alkyl group having 1 to 100 carbon atoms, The method of claim 10. 14． 14. The method of claim 13, wherein said alkyl group contains 1 to 24 carbon atoms. . 15. The non-porous particles are displaced and then block any remaining reactive sites. 3. The method of claim 1, wherein the endcapping is performed. 16. The non-porous particles are end-capped so as to block the remaining reactive sites. 2. The method of claim 1, wherein the method is alkylated with a signaling reagent. 17． The non-porous particles are reacted with an alkyl-substituted silane; and The product is trimethylchlorosilane or dichlorotetraisopropyldisilaza 2. The method of claim 1, wherein the method is end-capped. 18. 2. The method of claim 1, wherein said polynucleotide has about 80-600 base pairs. . 19. 2. The method of claim 1, wherein said polynucleotide has about 5-80 base pairs. 20. 2. The method of claim 1, wherein said polynucleotide comprises RNA. Law. 21. 2. The method of claim 1, wherein said polynucleotide comprises DNA. 22. Wherein the mixture of polynucleotides is a product of a polymerase chain reaction. The method of range 1. 23. 2. The method of claim 1, wherein said method is performed at a temperature in the range of 20C to 90C. Method. 24. Claims wherein said temperature is selected to produce a back pressure not exceeding 10,000 psi. Box 23. 25. Claims: The method uses an organic solvent, wherein the organic solvent is water-soluble. Method 1. 26. The solvent is alcohol, nitrile, dimethylformamide, ester or 26. The method of claim 25, selected from the group consisting of: and ether. 27. If the mixture of polynucleotides is trialkylamine acetate, trialkyl carbonate, Counterion agents selected from the group consisting of ruamines and trialkylamine phosphates 2. The method of claim 1, comprising: 28. If the counterion agent is triethylammonium acetate or triethylammonium Claims selected from the group consisting of The method of box 27. 29. A bead comprising non-porous particles coated with a polymer, The beads have an average diameter of 0.5 to 100 microns and the beads are DNA separation factor of at least 0.05 using on-polynucleotide chromatography A bead comprising: 30. 30. The bead of claim 29, wherein said beads have a DNA separation factor of at least 0.5. Z. 31. 30. The bead of claim 29, wherein said bead is subjected to an acid wash treatment. 32. 30. The beads of claim 29, wherein the beads are essentially free of polycationic contaminants. Beads. 33. 30. The bead of claim 29, wherein said bead has a diameter of about 1-5 microns. . 34. The non-porous particles are silica, silica carbide, silica nitrite, titanium oxide. Tan, aluminum oxide, zirconium oxide, carbon, insoluble polysaccharides and diatoms 30. The bead of claim 29 selected from the group consisting of soil. 35. The non-porous particles are reacted to create a reversed-phase material. 30. The bead of claim 29, which is mosquito. 36. The claim wherein the non-porous beads are essentially free of unreacted silanol groups. Box 35 beads. 37. 30. The bead of claim 29, wherein said bead is coated with a polymer. 38. The polymer is polystyrene, polymethacrylate, polyethylene, poly Urethane, polypropylene, polyamide, polydimethylsiloxane and poly 38. The bead of claim 37, wherein the bead is selected from the group consisting of a dialkylsiloxane. 39. The polymer is alkylated with an alkyl group having 1 to 100 carbon atoms 38. The beads of claim 37, wherein 40. The polymer is alkylated with an alkyl group containing from 8 to 18 carbon atoms 38. The beads of claim 37, wherein 41. Essentially all surface substrate groups are non-polar hydrocarbon or substituted With beads comprising non-porous particles end-capped with hydrocarbon groups Wherein the beads have an average diameter of 0.5 to 100 microns and the beads Of at least 0.05 using matched ion polynucleotide chromatography. Beads having a DNA separation coefficient. 42. 42. The bead of claim 41, wherein said bead has a diameter of about 1-5 microns. . 43. The beads are acid washed to essentially remove polyvalent metal ion contaminants 42. The bead of claim 41, which has been subjected to a treatment. 44. The non-porous particles are silica, silica carbide, silica nitrite, titanium oxide. Tan, aluminum oxide, zirconium oxide, carbon, insoluble polysaccharides and diatoms 42. The bead of claim 41 selected from the group consisting of soil. 45. The non-porous particles are reacted to create a reversed-phase material. 42. The bead of claim 41, which is mosquito. 46. 46. The method of claim 45, wherein said beads have minimal silanol groups. 47. The end capping of the porous particles is performed by using trimethylchlorosilane or Is achieved by the reaction of non-porous particles with dichlorotetraisopropyldisilazane. 42. The method of claim 41, wherein