JP2002505588A - 殺虫性微生物の同定方法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、有用な活性を有する微生物を発見するための手段に関する。さらに詳細には、本発明は、バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）または他のバチルス属（Bacilli）などの新規微生物株を発見するための出発材料として線虫を使用することを含む。線虫は、微生物を回収するためのバチルス単離法によって処理される。
Description
【発明の詳細な説明】
殺虫性微生物の同定方法
関連出願の相互参照
本出願は、1997年6月20日に提出された米国仮出願第60/050,374号の優先権を
請求するものである。
発明の背景
土壌細菌バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）（B.t.
）は、パラ胞子結晶封入体を特徴とするグラム陽性の胞子形成性細菌である。こ
れらの封入体はしばしば、顕微鏡下で独特な形態の結晶として観察される。この
蛋白質は害虫に対して非常に毒性であり、毒素活性が特異的でありうる。あるB.
t.毒素遺伝子が単離、配列決定され、組換えDNAに基づくB.t.産物が製造され、
使用が認可されている。さらに、遺伝子操作技術を用いて、これらのB.t.内毒素
を農業環境へ送達する新規なアプローチが開発中であり、それには、昆虫に耐性
のある内毒素遺伝子を用いて遺伝的に改変した植物の使用、およびB.t.内毒素送
達の担体として安定化された完全な細菌細胞の使用が含まれる（Gaertner，F.H.
，L.Kim［1988］TIBTECH 6:S4-S7）。したがって、単離されたB.t.内毒素遺伝子
が商業的に価値のあるものとなりつつある。
１０年前まで、B.t.農薬の商業的使用は、鱗翅目害虫（幼虫）という非常に狭
い範囲に限られていた。B.チューリンギエンシス亜種クルスタキ（kurstaki）の
胞子および結晶の調製物が、鱗翅目害虫の商業的殺虫剤として長い間用いられて
いた。例えば、B.チューリンギエンシス変種クルスタキHD-1は、多くの鱗翅目昆
虫の幼虫に対して毒性である結晶性δ-内毒素を産生する。
しかし近年、研究により、はるかに広範囲の害虫に対する特異性を有するB.t.
農薬が開発された。例えば、B.t.の他の種、すなわちイスラエレンシス（israel
ensis）およびモリソニ（morrisoni）（テネブリオニス(tenebrionis)、B.t.M-7
としても知られる）が、それぞれ双翅目および鞘翅目の昆虫を制御するために商
業的に用いられている。例えば、ガートナー（Gaertner,F.H.）[1989]「殺虫性
蛋白質の細胞送達系：生微生物および死微生物（Cellular Delivery Systems fo
r Inssecticidal Proteins:Living and Non-Living Microorganisms）」穀物保
護剤の制御送達（Controlled Delivery of Crop Protection Agents）より、R.M
.Wilkins編、Taylor and Francis,New York and London，1990 pp.245-255；ま
たカウチ（Couch T.L.）(1980)「バチルス・チューリンギエンシス・イスラエレ
ンシス変種の蚊病原性（Mosquito Pathogenicity of Bacillus thuringiensis v
ar．israelensis）」（Developments in Industrial Microbiology 22:61-76）
およびビーグル（Beegle,C.C.）(1978)「農業経済系における虫性細菌の使用（U
se of Entomogenous Bacteria in Agroecosystems）」（Developments in Indu
strial Microbiology 20:97-104も参照されたい。クリークらは、バチルス・チ
ューリンギエンシス・テネブリオニス変種について報告しており（Krieg,A.、A.
M.Huger、G.A.Langenbruch、W.Schnetter（1983）Z.ang.Ent.96:500-508）、該B
.t.種は鞘翅目の二つの甲虫に対して有効である。これらは、コロラドポテト甲
虫、レプチノタルサ・デセムリネアータ（Leptinotarsa decemlineata）および
アゲラスチカ・アルニ（Agelastica alni）である。
最近、B.t.の新規亜種が同定され、活性なδ-内毒素蛋白質の遺伝子が単離さ
れた（Hofte,H.、H.R.Whiteley［1989］Microbiological Revies 52(2):242-255
）。ヒュフテ（Hofte）およびホワイトリー（Whiteley）は、B.t.結晶蛋白質を
四つの主要クラスに分類した。そのクラスとは、Cryl（鱗翅目特異的）、CryII
（鱗翅目および双翅目特異的）、CryIII（鞘翅目特異的）、およびCryIV（双翅
目特異的）である。その他の害虫に特異的に毒性である菌株の発見が報告されて
いる（Feitelson,J.S.,J.Payne,L.Kim［1992］Bio/Technology 10:271-275）。
線虫特異的な毒素遺伝子のクラスを称するため、CryVが提唱されている。
望ましくない生物の化学的駆除を定期的に使用すると化学薬品耐性株を選択す
ることがある。化学薬品耐性は経済的に重要な多数の種の昆虫で生じ、羊、山羊
および馬の線虫にも生じている。化学薬品耐性の形成は、作用様式が異なる新規
駆除剤の絶え間ない探求を必要とする。
ゼノラブダス種（Xenorhabdus spp.）は、線虫ベクター宿主を介して種々の昆
虫の幼虫に感染することができる商業的に重要な病原菌群である。これらの細菌
は病原性線虫であるネオアプレクターナ（Neoaplectana）属、スタイネルネーマ
（Steinernema）属およびヘテロラブディティス（Heterorhabditis）属と共生関
係にある。（バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）など
の）多数の他の生物制御剤とは異なり、線虫は餌である幼虫を探し出すので、こ
のような系は外注の生物学的制御にとっていくつかの利点をもたらす。
ゼノラブダス種（Xenorhabdus spp.）は、現在では腸内細菌科に指定されるグ
ラム陽性通性嫌気性桿菌である。2種（X．nematophilusおよびX．luminescens）
と4亜種（X.nematophilus、bovienii、poinariiおよびbeddingii）のX.ネマトフ
ィラス（nematophilus）が記載されている。
ゼノラブダス種（Xenorhabdus spp.）は、ヘテロラブディティス（Heterorhab
ditis）などの第3齢で、感染性のある幼生線虫の閉鎖腸に保菌される。ヘテロラ
ブディティス（Heterorhabditis）種は特殊化した前歯を有し、これによって線
虫は血体腔に接近するために昆虫の硬い外クチクラに傷をつけて破ることが可能
となる。ネオアプレクターナ（Neoaplectana）種およびスタイネルネーマ（Stei
nernema）種は高水圧頭部を有し、その前方部は直径が極めて細く、これによっ
てこれらの線虫は昆虫の比較的軟らかい内部部分を通って穴を開けることが可能
となる。血体腔に到達すると、これらの線虫は、昆虫誘導性免疫系を阻害する毒
素を分泌し、昆虫に病原性を示す共生細菌を放出することによって、宿主である
昆虫を殺す。
異なる宿主に対する各線虫種/株の感染性の程度はかなり異なる。多種多様の
昆虫宿主のほとんどに感染性のある種/株は全くない。また、線虫の各属は特定
の種の細菌の宿主となる。ヘテロラブディティス（Heterorhabditis）属の線虫
では、共生細菌はフォトラブダス ルミネッセンス（Photorhabdus luminescens
）である。細菌ゼノラブダス（Xenorhabdus）と宿主線虫との相互作用も特殊で
ある。明らかに、X．ネマトフィラス（nematophilus）はスタイネルネーマティ
ダエ（Steinernematidae）と共生関係にあり、X.ルミネッセンス（luminescens
）はヘテロラブディティデア（Heterorhabditidea）と共生関係にある。感染性
線虫から単離されたX．ネマトフィラス（nematophilus）は他の線虫のごくわず
かな集団にしか保菌されない。この特異性の理由は完全には理解されていないが
、これは細菌細胞表面成分（例えば、線毛）の生成に関連すると思われる。
鱗翅目（Lepidopteran）および甲虫目（Coleopteran）昆虫の幼虫に注入した
と
きのみ活性を有するフォトラブダス ルミネッセンス（Photorhabdus luminesce
ns）由来の殺虫性毒素が公知である。国際公開公報第97/17432号（Ensignら）は
、フォトラブダス（Photorhabdus）属由来のタンパク質は経口暴露により昆虫に
毒性を示すことを報告している。そこに報告されているように、フォトラブダス
・ルミネッセンス（Photorhabdus luminescens）（正式には、ゼノラブダス ル
ミネッセンス（Xenorhabdus luminescens））は哺乳類の臨床試料中に見いださ
れ、またヘテロラブディティス（Heterorhabditis）属の昆虫病原性線虫の共生
細菌として見いだされた。
上記は当技術分野において公知であるが、他の殺虫性細菌（好ましくは、グラ
ム陽性菌で、好ましくはバチルス属（Bacillus）の菌で、好ましくはバチルス・
チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）種である）の原料としての線
虫の利用性はこれまでは知られていなかった。当技術は上記のように特定の線虫
とある種の細菌の共生について開示しているが、当技術は、他の種類の殺虫細菌
である非常に独特な菌株、特に独特な菌株バチルス・チューリンギエンシス（Ba
cillus thuringiensis）株を単離するための優れた原料として線虫を使用できる
可能性があることは教示も示唆もしていない。
発明の簡単な概要
本発明は、有用な特性を有する微生物を単離するための方法に関する。これら
の微生物は好ましくはグラム陽性菌である。バチルス（Bacillus）細菌が好まし
い。好ましい態様において、本発明は新規なバチルス・チューリンギエンシス（
Bacillus thuringiensis）（B.t.）菌株を発見するための独特で有利な方法に関
する。さらに詳細には、本発明は、例えば土壌、植物、動物または水から単離し
た線虫を、新規なB.t.または他のバチルス（Bacillus）株を得るための原料とし
て使用する方法を提供する。線虫は環境中に多数存在するので、それらの収集は
容易に実施できる。線虫は新規であっても、公知であってもよい。好ましくは、
線虫は土壌および植物原料から単離される。最も好ましくは原料は土壌である。
線虫に関連のあるB.t.または他のバチルス（Bacillus）微生物は容易に単離、
精製され、それらの特徴を決定するために、周知のバチルス（Bacillus）単離技
法と本明細書において提供される開示内容とを組み合わせたものを使用して処理
される。
本発明は、有用な殺虫特性を有する非常に独特な細菌を得るための優れた原料
として線虫を使用することができるという驚くべき発見に関する。本発明の方法
は、生物学的殺虫剤として作用するのに有用なB.t.または他のバチルス属（Baci
lli）などの新規な微生物、並びに殺虫活性を担う遺伝子および毒素を提供する
。
発明の詳細な説明
本発明は、有用な特性を有する微生物を発見するための新規な方法を提供する
。好ましい態様において、これらの微生物はバチルス（Bacillus）細菌である。
特に好ましい態様において、これらの微生物は、害虫を制御するために使用する
ことができるバチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）であ
る。さらに詳細には、本発明の方法はB.t.微生物を単離するための新規な原料と
して線虫を使用する。好ましい態様において、線虫は土壌および／または植物原
料から得られる。しかし、線虫の原料はこれらの領域に限定されない。むしろ、
B.t.微生物の存在を同定するために、いかなる線虫をも処理することができる。
線虫から得られたB.t.または他のバチルス（Bacillus）微生物の単離および特
徴づけは、標準的で、当技術分野において周知の方法と本明細書に提供する開示
内容とを組み合わせたものを使用して実施することができる。
具体的な態様において、本発明の方法を使用して、土壌試料からB.t.または他
のバチルス（Bacillus）株を得ることができる。線虫は、例えば、バーマン（Ba
ermann）のフィルター抽出技法を使用して、種々の土壌および植物挿木試料から
新鮮な状態で単離することができる。土壌または植物組織から線虫を効率的に抽
出するためのこの方法および他の方法は、カリフォルニア州の食糧農業省（Cali
fornia Department of Food and Agriculture）によって出版された、十分に説
明が成されている詳細なマニュアルである、アヨウブ（S.Ayoub）著、表題「植
物線虫学：農業訓練の助け（Plant Nemetology:An Agricultural Training Aid
）」（1980年）に記載されている。抽出直後の線虫からB.t.胞子を効率的に回収
するために低温殺菌法を使用することができる。次いで、胞子形成寒天上で増殖
中の単一コロニーの顕微鏡調査を使用して、土壌線虫に関連していることが判明
しているB.t.または他のバチルス（Bacillus）株を同定することができる。
本明細書に提供される開示内容により利益を得る当業者は、土壌試料などの試
料から線虫を単離するために別の方法が利用可能であることを認識していると思
われる。例えば、篩い分けとショ糖浮遊法を組み合わせたものを使用して、土壌
試料から線虫を抽出することができる。
本発明の方法は、有利なことに、殺虫活性を含む生物的特徴が大きく異なるB.
t.または他のバチルス（Bacillus）微生物を単離するために使用することができ
る。本発明の方法を使用して得られたB.t.単離株において観察された差には、B.
t.単離株のδ-エンドドキシンの結晶形態の差が含まれる。毒素タンパク質の分
子量プロフィールの差も観察されている。
好ましい態様において、細菌は生きている線虫から得られる。本発明の開示内
容によると、これらの線虫はその線虫に関連する大多数のB.t.および／または他
のバチルス（Bacillus）株を有することが見出されている。
当業者に周知の標準的な手順を使用することにより、本発明により単離される
B.t．（または他のバチルス（Bacillus）株）並びにそれから得られる毒素およ
び遺伝子を使用して、害虫を駆除することができる。これらの手順には、微生物
および／または毒素を直接害虫に適用することが含まれる。微生物はB.t.もしく
は他のバチルス（Bacillus）株そのもの、またはB.t.もしくは他のバチルス（Ba
cillus）毒素を発現する組換え微生物であってもよい。また、B.t.または他のバ
チルス（Bacillus）毒素を発現するポリヌクレオチド配列によって植物を形質転
換することができる。これらの開示内容は周知で、当業者に容易に実施され、例
えば、国際公開公報第97/12980号に開示されている。
本明細書に記載されている実施例および態様は例示のみを目的とするものであ
り、それらを鑑みて様々な修飾もしくは変更が当業者には想起され、それらも本
出願の精神および範囲、ならびに添付の請求の範囲内に含まれることを理解され
るべきである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ
(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:085）
Ｃ１２Ｒ 1:085） (Ｃ１２Ｑ 1/04
(Ｃ１２Ｑ 1/04
(Ｃ１２Ｑ 1/04
(Ｃ１２Ｑ 1/04
Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，
ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ
Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ
，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ
，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，
ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，Ｉ
Ｓ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ
，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，
ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，Ｖ
Ｎ，ＹＵ，ＺＷ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1．新規の殺虫性微生物を同定するための方法であって、該微生物がフォトラブ ダス（Photorhabdus）およびゼノラブダス（Xenorhabdus）からなる群より選択 される属の微生物以外であり、線虫から微生物を単離する段階と、該微生物が新 規微生物であるかどうかを判定するために該微生物を特徴分析する段階とを含む 方法。 2．殺虫活性について微生物を解析する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法 。 3．特徴分析段階に、微生物が新規毒素を発現するかどうかを判定する段階が含 まれる、請求項1に記載の方法。 4．特徴分析段階に、微生物が殺虫毒素をコードする新規遺伝子を含むかどうか を判定する段階が含まれる、請求項1に記載の方法。 5．微生物が細菌である、請求項1に記載の方法。 6．細菌がグラム陽性細菌である、請求項5に記載の方法。 7．細菌がバチルス属である、請求項5に記載の方法。 8．バチルスがバチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）で ある、請求項7に記載の方法。 9．バチルスがバチルス・セレウス（Bacillus cereus）である、請求項7に記載 の方法。 10．線虫が土壌線虫である、請求項1に記載の方法。 11．線虫が植物線虫である、請求項1に記載の方法。 12．線虫が水生線虫である、請求項1に記載の方法。 13．線虫が動物線虫である、請求項1に記載の方法。 14．線虫が生きている線虫である、請求項1に記載の方法。 15．請求項1に記載の方法によって得られる新規微生物。 16．グラム陽性細菌である、請求項15に記載の微生物。 17．バチルス属である、請求項15に記載の微生物。 18．バチルス・チューリンギエンシス（Bacillus thuringiensis）である、請求 項15に記載の微生物。 19．バチルス・セレウス（Bacillus cereus）である、請求項15に記載の微生物 。 20．ウェスタンコーンルートワームに対して毒性である、請求項15に記載の微生 物。 21．線虫に対して毒性である、請求項15に記載の微生物。 22．請求項15に記載の微生物から得られる新規毒素。 23．請求項15に記載の微生物から得られる新規毒素遺伝子。
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-
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