JP2002504806A

JP2002504806A - Diabetes mediating proteins and their therapeutic use

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Publication number: JP2002504806A
Application number: JP52118298A
Authority: JP
Inventors: ラルセン，ペーテルモーゼ; ジェイ．フェイ，スティーブン; ネルプ，ジョーン; イー．カールセン，アラン; クリステンセン，ウラブジェリー; ポシオト，フレミング; ユー．アンダーセン，ヘンリク
Original assignee: ラルセン，ペーテルモーゼ; ジェイ．フェイ，スティーブン; ネルプ，ジョーン; イー．カールセン，アラン; クリステンセン，ウラブジェリー; ポシオト，フレミング; ユー．アンダーセン，ヘンリク
Priority date: 1996-10-25
Filing date: 1997-10-24
Publication date: 2002-02-12
Also published as: WO1998020124A2; EP0934409A2; CA2269646A1; WO1998020124A3; AU5407098A; JP2008195721A

Abstract

(57)【要約】保護的および有害な糖尿病媒介タンパク質およびそれをコードするポリヌクレオチド、糖尿病媒介タンパク質を発現するトランスジェニック動物、糖尿病媒介タンパク質の発現を変化し得る試験化合物を同定するための薬物スクリーニング法、および糖尿病媒介タンパク質の発現を変化子得る化合物を投与することによって糖尿病を予防または回復させる方法が提供される。 (57) Abstract: Protective and harmful diabetes-mediating proteins and polynucleotides encoding the same, transgenic animals expressing the diabetes-mediating protein, drug screening to identify test compounds capable of altering the expression of the diabetes-mediating protein And methods for preventing or ameliorating diabetes by administering a compound capable of altering the expression of a diabetes-mediating protein.

Description

【発明の詳細な説明】糖尿病媒介タンパク質およびその治療的使用発明の背景発明の分野本発明は一般に、糖尿病媒介タンパク質、糖尿病媒介タンパク質を同定する方法、本発明のアッセイにおいて有用なトランスジェニック動物、糖尿病媒介タンパク質の発現に影響を与える薬物のスクリーニングのための方法、および糖尿病の処置および予防のための治療化合物に関する。関連技術ヒトおよびヒトの疾患の動物モデルにおけるインシュリン依存性糖尿症（IDDM ）の発症は、単核細胞の浸潤、および膵臓島（インシュリン島、insulitis）でのβ細胞の崩壊によって特徴付けられる。β細胞の崩壊の機構は知られていない。蓄積している証拠は、マクロファージおよび単球によって主に産生されるサイトカインインターロイキン-1,6（IL−1β）が、島のβ細胞崩壊の媒介因子であり得ることを示す。ヒト糖尿病の動物モデルとして、糖尿病の傾向があるBB（BB-DP）ラットおよび非肥満糖尿病（NOD）マウスが挙げられる。ラットの島タンパク質の２次元（2 D）ゲルマップが構築され、そしてIL−1βへのラットの島細胞のインビトロでの暴露によって生じる、タンパク質合成における定性的および定量的変化を決定するために使用されている（Andersenら、Diabetes 44:400-407(1995)）。ヒト糖尿病のトランスジェニック動物モデルが知られている。例えば、ヒト糖尿病の１つのモデルは、ラットのインシュリンプロモーターの制御下で膵臓のβ 細胞中でウイルスタンパク質を発現するトランスジェニックマウスである（van Herrathら、J．Clin．Invest．98:1324-1331(1996)）。２％未満のトランスジェニックマウスが、内発的に糖尿病を発症する；しかし、ウイルスでの２ヵ月のチャレンジ後、IDDMは95％以上のマウスで生じる。発明の要旨本発明は、一部、糖尿病媒介（DM）タンパク質の発見および同定に基づき、DM タンパク質は、糖尿病の発症、または糖尿病の発症の危険がある被験体における糖尿病の発症の予防に関連するタンパク質である。そして、DMタンパク質は、疾患の発症の存在下と非存在下のと間の異なる発現によって同定される。糖尿病の発症には、臨床的に検出可能な段階に進行する全ての段階が含まれる。従って、本発明の１つの局面において、糖尿病の発症の非存在下での発現と比較して、糖尿病の発症の間の変化した発現を示す、実質的に精製された糖尿病媒介タンパク質が特徴である。本発明の精製された糖尿病媒介タンパク質は、表１および２に列挙されたタンパク質から選択される。新規の糖尿病媒介タンパク質は、分子量、pI、および図６〜40に示されるような質量スペクトルによる特徴によって特徴づけられる。これらのタンパク質は、10％ IEFまたはNEPHG ２次元ゲル（図1A-IB）上のそれらの位置を参照して、NEPHGE 7、9、102、123、129、130 、174、181、182、211、231、236、253、298、およびIEF 665、939、941、950、 1196からなる群より選択される。 DMタンパク質はさらに、防御（protective）または有害（deleterious）DMタンパク質として特徴づけられる。防御糖尿病媒介タンパク質（「防御タンパク質」）は、糖尿病の発症を防御し得、そして／または糖尿病の発症の危険性を有する被験体において糖尿病の発症を遅延し得るか、または糖尿病を罹患している被験体において糖尿病の症状を緩和し得るタンパク質として特徴づけられる。防御タンパク質はまた、糖尿病の発症の間には発現が変化しないが、糖尿病の発症を避ける糖尿病の危険性を有する被験体において変化した発現を示すタンパク質であり得る。有害糖尿病媒介タンパク質（「有害タンパク質」）は、糖尿病の発症を増強し得る、被験体の糖尿病を発症する危険性を増大し得る、または糖尿病の発症の危険性を有する被験体において糖尿病の発症に必要とされる時間を短縮し得るタンパク質として特徴づけられる。有害タンパク質はまた、糖尿病の発症の間に発現を変化しないが、糖尿病の発症を避ける、糖尿病の危険性を有する被験体において変化した発現を示すタンパク質であり得る。本発明の糖尿病媒介タンパク質は、ゲル電気泳動、イムノブロッティング、質量スペクトル分析、またはクロマトグラフィーを含む、当該分野で公知の任意の手段によって同定され得、そして糖尿病の発症の非存在下で発現される同じタンパク質と比較して、糖尿病の発症の間の変化したタンパク質発現によって特徴づけられる。米国仮特許出願第60/029,324号は、分子量およびpIによって同定された、膵臓の島細胞中で発現されるタンパク質を同定している（図1Aおよび1B）。本出願は、表１および２ならびに図６〜40に列挙される、糖尿病媒介タンパク質として同定されたこれらのタンパク質の選択を提供する。本発明の糖尿病媒介タンパク質は、糖尿病の発症を調節し得る化合物を同定するための薬物スクリーニングアッセイに有用であり、糖尿病の処置または予防のための治療薬として有用であり、そして糖尿病媒介タンパク質の発現を調節することによって糖尿病を予防し得るかまたは緩和し得る治療薬の標的として有用である。特異的なDMタンパク質の発現における変化は、糖尿病の発症の指標として診断的に有用である。従って、本発明の1つの局面において、表１に列挙された糖尿病媒介タンパク質からなる群から選択される１つ以上のタンパク質におけるタンパク質発現の増大、および表２に列挙された糖尿病媒介タンパク質からなるリストから選択される1つ以上のタンパク質のタンパク質発現における減少を測定することによって、糖尿病の発症を診断する方法が特徴である。タンパク質発現における変化は、糖尿病を発症している疑いがあるか、または糖尿病の発症の危険性を有する試験被験体において測定され、そして正常な非糖尿病のコントロールにおけるタンパク質発現と比較して示される。好ましい実施態様において、表１および２の１つ以上のタンパク質の組み合わせの変更は、糖尿病の発症の指標である。さらに好ましい実施態様において、表１および／または２のタンパク質の５つ以上の組み合わせの変更は、糖尿病の発症の指標である。なおさらに好ましい実施態様において、表１および／または２の10以上のタンパク質の組み合わせの変更が、糖尿病の発症の指標である。１つの局面において、本発明は、疾患（例えば、糖尿病）の発症に関連するタンパク質を同定するためのインビボのアッセイ方法を特徴とする。本発明のインビボのアッセイ方法の特異的な実施態様において、インシュリンを分泌するかまたはインシュリン産生細胞に成長し得る細胞は、糖尿病の発症の危険性を有する動物である、免疫学的に適台性の宿主動物に移植される。タンパク質発現は、移植から疾患の発症までの間の時点でレスキューした移植した細胞において分析され、そして糖尿病の発症の非存在下でのそれらの発現と比較して糖尿病の発症の間に変化した発現を示すタンパク質が同定される。特異的な実施態様において、移植された細胞は、糖尿病の発症の危険性を有する動物モデルに移植された新産の島細胞である。１つの特異的な実施態様において、新産の島細胞は新産のBB-D Pラットから採取され、そして宿主動物はBB-DPラットである。別の実施態様において、移植細胞の供給源および宿主細胞は、NODマウスである。本発明は、防御または有害タンパク質としてさらに特徴づけられ得る、同定した糖尿病媒介タンパク質を提供する。本発明の1つの実施態様において、候補防御タンパク質または有害タンパク質は、候補防御タンパク質または有害タンパク質をコードするポリヌクレオチドで培養細胞をトランスフェクトすることによって、インビトロで同定される。そして、IL-1βでのチャレンジの際のインビトロでの細胞の機能性に対する糖尿病媒介性タンパク質の発現の効果が決定される。ポリヌクレオチドは、誘導性のプロモーターに作動可能に連結され得、その結果、候補の防御タンパク質または有害タンパク質の発現は、外因的な制御下にある。外因的な制御は、薬剤（例えば、インターフェロン）によって発揮され得、このような薬剤は、選択されるプロモーターによって決定される。特異的な実施態様において、細胞の機能性は、一酸化窒素（NO）産生、インシュリンの分泌、細胞の生存性、および／または住IL-1βへの暴露の際の細胞傷害性の測定によって決定される。防御または有害糖尿病媒介タンパク質を同定するためのインビボの方法において、候補タンパク質を発現するトランスジェニック哺乳動物が作成される。ここで、トランスジェニック哺乳動物は、糖尿病を発症する危険性を有しており、そして糖尿病の発症および発症のタイミングに対するトランスジーン発現の効果が決定される。防御タンパク質は、糖尿病の危険性を有する被験体において糖尿病の発症を予防、阻害、または遅延させるタンパク質である。そして有害タンパク質は、糖尿病の発症を生じるか、糖尿病の発症の危険性を増大させるか、または糖尿病の発症の危険性を有する被験体において糖尿病の発症に必要な時間を短縮するタンパク質である。有害タンパク質はまた、防御タンパク質の発現を妨げるかまたは妨害するタンパク質でもある。本発明は、実質的に精製された防御または有害糖尿病媒介タンパク質、および本発明の糖尿病媒介タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。１つの限定的でない実施態様において、防御タンパク質は、ガレタチン-3（galectin -３）である（図４および５）（配列番号１〜２）。別の限定的でない実施態様において、有害タンパク質は、モルタリン（mortalin)である（図２〜３）（配列番号３〜４）である。１つの局面において、本発明は、そのゲノムに挿入された外因性の糖尿病媒介タンパク質遺伝子（単数または複数）を有するトランスジェニック哺乳動物を特徴とする。本発明のトランスジェニック哺乳動物は、糖尿病の発症における糖尿病媒介タンパク質の発現の効果を決定するため、および防御タンパク質または有害タンパク質を同定するためのアッセイ方法において有用である。トランスジーンは、天然の、または部分的にもしくは完全に人工的な糖尿病媒介遺伝子であり得、そして内因性の糖尿病媒介タンパク質遺伝子と異なり得るかまたは同じであり得る。１つの実施態様において、トランスジーンは、誘導性プロモーターの制御下にある。関連する局面において、本発明は、外因性の有害遺伝子を有し、そして予想される時間内に増大した自発的な糖尿病の発症の発病率を示す、トランスジェニック哺乳動物を特徴とする。好ましい実施態様において、トランスジェニック哺乳動物は、50％以上の発病率、より好ましくは、60％以上の発病率、なおさらに好ましくは70％以上の発病率、なおさらに好ましくは80％以上の発病率、そして最も好ましくは90以上の糖尿病の発病率を示す。本発明の1つの実施態様において、本発明のトランスジェニック哺乳動物は、有害糖尿病媒介タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子についてトランスジェニックである。別の実施態様において、トランスジェニック哺乳動物は、さらに、１つ以上の内因性糖尿病媒介タンパク質遺伝子が除去されている。一般に、トランスジェニック哺乳動物は、インシュリン、CMV、インターフェロン、またはMHCプロモーターの制御下にトランスジェニック遺伝子を有する。さらに特異的な実施態様において、トランスジェニック哺乳動物は、増強されたプロモーターによって得られた内因性糖尿病媒介遺伝子を上昇したレベルで発現するか、または高コピー数の内因性の糖尿病媒介遺伝子を発現する。さらに特異的な実施態様において、トランスジェニック哺乳動物は、破壊された糖尿病媒介タンパク質遺伝子を有する。本発明はさらに、内因性の糖尿病媒介タンパク質遺伝子が当該分野で公知の方法によって（例えば、米国特許第5,641,670号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載された遺伝子活性化技術の適用によって）外因的に変化される哺乳動物を含む。１つの局面において、本発明は、１つ以上の糖尿病媒介タンパク質の発現に影響を与える化合物をスクリーニングするためのアッセイを特徴とする。１つの実施態様において、糖尿病の自発的な発症の危険性を有する動物が、１つ以上の糖尿病媒介タンパク質（単数または複数）の発現に影響を与える化合物の能力を決定するためのアッセイにおいて使用される。好ましい実施態様において、アッセイ動物は、糖尿病の発症の高い危険性を有する本発明のトランスジェニック動物である。用語「糖尿病媒介タンパク質の発現に影響を与える」は、内因性の糖尿病媒介タンパク質の発現を誘導する、増強する、阻害する、または減少させる化合物を意味する。特異的な実施態様において、本発明は、内因性の防御タンパク質の発現を誘導し得るかまたは増強し得、従って、糖尿病の発症を遅延させ得るかまたは阻害し得る化合物を同定するためのアッセイを提供する。別の特異的な実施態様において、本発明のアッセイ方法は、有害糖尿病媒介タンパク質の発現を抑制し得るかまたは阻害し得、従って、糖尿病の発症を遅延させ得るかまたは阻害し得る化合物の同定に有用である。関連する局面において、本発明は、糖尿病媒介タンパク質の活性を調節する化合物（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト）を同定するためのアッセイ、または糖尿病媒介タンパク質の活性化に必要とされる翻訳後の工程をブロックすることによるアッセイを提供する。特異的なDMタンパク質の発現における変化は、DM タンパク質の発現を調節し得る化合物を同定するためのスクリーニング方法において有用である。１つ以上の糖尿病媒介タンパク質の発現を調節する化合物は、糖尿病の処置または予防における潜在的な治療薬として有用である。従って、本発明の１つの局面は、１つ以上の糖尿病媒介タンパク質を発現する細胞または組織と試験化合物とを接触させる工程、および１つ以上の糖尿病媒介タンパク質の発現に対する試験化合物の効果を決定する工程を有する、糖尿病媒介タンパク質の発現を調節し得る化合物を同定するための方法アッセイ方法を特徴とする。化合物の効果の決定は、プローブもしくは他のオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーション、抗体認識（例えば、免疫拡散（immunodiffusion）、免疫蛍光、ELISA、RIA、ブロッティング、免疫沈降、免疫電気泳動、またはクロマトグラフィー）、および電気泳動を含む、当該分野で公知の種々の方法によって行われ得る。表１および２に列挙される糖尿病媒介タンパク質からなる群より選択される１つ以上のタンパク質の発現を増大し得る化合物、ならびに表１および２に列挙される糖尿病媒介タンパク質からなるリストより選択される１つ以上のタンパク質の発現を減少させ得る化合物が、糖尿病の予防または処置のための候補治療薬である。タンパク質の発現における変化は、試験化合物の非存在下での発現と比較して決定される。別の局面において、本発明は、糖尿病の危険性を有する被験体において糖尿病を予防するための治療方法、または治療有効量の防御糖尿病媒介タンパク質を投与することによって糖尿病の被験体における糖尿病の症状を緩和する方法を提供する。好ましくは、被験体はヒトである。本発明はまた、防御糖尿病媒介タンパタ質をコードするポリヌクレオチドを提供することによる遺伝子治療を含む。本発明はさらに、有害糖尿病媒介タンパク質のインビボでの発現を阻害する、有効量のポリヌクレオチドを投与することによる、糖尿病の予防および／または処置のための治療方法を含む。候補の治療化合物は、表１および２のタンパク質から選択される。関連する局面において、本発明は、内因性の有害糖尿病媒介タンパク質の発現を抑制し得るかまたは低下させ得る治療有効量の化合物を投与することによる、糖尿病の危険性を有する被験体において糖尿病を予防および／または処置する治療方法を提供する。別の実施態様において、本発明は、内因性の防御糖尿病媒介タンパク質の発現を誘導し得るかまたは増強し得る治療有効量の化合物を投与することによる、糖尿病の予防および／または処置のための治療方法を提供する。関連する局面において、本発明は、糖尿病媒介タンパク質の活性を調節し得る治療有効量の化合物（例えば、アゴニストアンタゴニスト）を投与することによるか、または糖尿病媒介タンパク質の活性化を妨げることによる、糖尿病の危険性を有する被験体において糖尿病を予防および／または処置する治療方法を提供する。本発明の治療方法として、必要している被験体に治療薬を提供するための、当該分野で公知のエキソビボの方法が挙げられる。本発明の１つの目的は、糖尿病の発病を媒介するタンパク質を同定することである。本発明の１つの目的は、糖尿病媒介タンパク質の同定のためのインビボでのアッセイを提供することである。本発明の別の目的は、被験体における糖尿病を予防、遅延、または緩和し得る試験化合物を同定するためのアッセイにおいて有用な、糖尿病媒介タンパク質を提供することである。本発明の別の目的は、防御または有害糖尿病媒介タンパク質を同定するためのアッセイにおいて有用なトランスジェニック動物を提供することである。本発明の別の目的は、糖尿病媒介タンパク質の発現に影響を与え得る試験化合物を同定するためのアッセイにおいて有用なトランスジェニック動物を提供することである。本発明の別の目的は、天然の、または部分的にもしくは完全に人工的な糖尿病媒介遺伝子を含む、マウス、ラット、またはハムスターのようなトランスジェニック宿主哺乳動物（小さく（例えば、完全に成長した場合に１kg未満である）、そして維持が安価である）を提供することである。本発明の１つの利点は、トランスジェニック哺乳動物が、現在利用可能なアッセイ方法よりも実質的により早く、より効果的に、そして安価である様式で、疾患の発症を予防または阻害し得る防御タンパク質を同定するために使用され得ることである。別の利点は、トランスジェニック哺乳動物が、糖尿病を罹患しているかまたは糖尿病の発症の危険性を有するヒトの処置に有効である、試験薬物に対して試験動物として使用され得ることである。本発明の別の目的は、糖尿病媒介タンパク質の発現に影響を与え、そしてその疾患の発症の危険を有する被験体における糖尿病の発病を妨げ得る試験化合物を同定するため、または糖尿病の被験体における糖尿病の症状を緩和するためのアッセイを提供することである。本発明のこれらおよび他の目的、利点、および特徴は、以下および請求の範囲によってさらに完全に記載される、糖尿病媒介遺伝子（単数または複数）およびタンパク質（単数および複数）、アッセイ方法、ならびにトランスジェニックマウスの詳細を読むことによって、当業者に明らかになる。図面の簡単な説明図1Aおよび1Bは、RPMI 1640＋0．5％の正常なヒト血清中で24時間インキュベートし、続いて［³⁵S］-メチオニンで４時間標識した新産のラットの島細胞中で発現されたタンパク質の２次元ゲルの蛍光写真を示す。図1Aは、等電収束ゲルである（IEF；pH3．5〜７）。図1Bは、非平衡pH勾配電気泳動ゲルである（NEPHGE ；pH6.5〜10.5）。矢印は、105個の糖尿病媒介タンパク質を示す。図２は、マウスのモルタリンのアミノ酸配列である。図３は、ヒトのモルタリンのアミノ酸配列である。図４は、ラットのガレクチンのアミノ酸配列である。図５は、ヒトのガレクチンのアミノ酸配列である。図６は、図に示すパラメーターを使用して決定した、糖尿病媒介タンパク質GR 75 (モルタリン）、IEF Spot No．340の質量スペクトルである。図７は、示したように決定した、ラミンIEF Spot No．655として仮に同定された糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図８〜10は、示したように決定した、ピルビン酸キナーゼNEPHGE Spot No．1 として仮に同定された糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図11は、示したように決定した、6-ホスホブルクトース-2-キナーゼNEPHGE S pot No．169として仮に同定された糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図12は、示したように決定した、トリオースリン酸イソメラーゼNEPHGE Spot No．334として仮に同定された糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図13は、示したように決定した、フルクトース二リン酸アルドラーゼNEPHGE S pot No．668として仮に同定された糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図14〜15は、示したように決定した、分子量42,243ダルトンおよびpI 5.82を有する、「IEF Spot No．665」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図16は、示したように決定した、分子量25,851ダルトンおよびpI 5.09を有する、「IEF Spot No．939」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図17〜18は、示したように決定した、分子量22,704ダルトンおよびpI 5.15を有する、「IEF Spot No．941」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図19は、示したように決定した、分子量25,753ダルトンおよびpI 4.53を有する、「IEF Spot No．950」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図20〜23は、示したように決定した、分子量143,064ダルトンおよびpI 5.41を有する、「IEF Spot No．1196」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図24は、示したように決定した、分子量65,522ダルトンおよびpI 7.28を有する、「IEF Spot No．７」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図25は、示したように決定した、分子量115,709ダルトンおよびpI 8.33を有する、「IEF Spot No．９」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図26は、示したように決定した、分子量63,560ダルトンおよびpI 7.26を有する、「IEF Spot No．102」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図27は、示したように決定した、分子量57,040ダルトンおよびpI 8.17を有する、「IEF Spot No．123」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図28は、示したように決定した、分子量57,609ダルトンおよびpI 7.72を有する、「IEF Spot No．129」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図29は、示したように決定した、分子量55,734ダルトンおよびpI 8.07を有する、「IEF Spot No．130」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図30〜31は、示したように決定した、分子量53,830ダルトンおよびpI 7.92を有する、「IEF Spot No．174」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図32〜33は、示したように決定した、分子量49,422ダルトンおよびpI 7.40を有する、「IEF Spot No．181」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図34〜35は、示したように決定した、分子量54,098ダルトンおよびpI 7.61を有する、「IEF Spot No．182」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図36は、示したように決定した、分子量47,925ダルトンおよびpI 7.28を有する、「IEF Spot No．211」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図37は、示したように決定した、分子量44,362ダルトンおよびpI 8.34を有する、「IEF Spot No．231」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図38は、示したように決定した、分子量43,162ダルトンおよびpI 7.90を有する、「IEF Spot No．236」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図39〜40は、示したように決定した、分子量39,160ダルトンおよびpI 9.05を有する、「IEF Spot No．253」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図41は、示したように決定した、分子量34,600ダルトンおよびpI 4.76を有する、「IEF Spot No．831」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図42〜43は、示したように決定した、分子量26,800ダルトンおよびpI 4.49を有する、「IEF Spot No．949」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図44〜46は、示したように決定した、分子量57,600ダルトンおよびpI 7.72を有する、「IEF Spot No．129」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図47は、示したように決定した、分子量35,800ダルトンおよびpI 7.57を有する、「IEF Spot No．310」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。図48は、示したように決定した、分子量34,500ダルトンおよびpI 8.62を有する、「IEF Spot No．326」と呼ばれる新規の糖尿病媒介タンパク質の質量スペクトルである。好ましい実施態様の詳細な説明アッセイで使用される本発明の糖尿病媒介タンパク質および遺伝子、アッセイ方法論、およびトランスジェニックが記載される前に、本発明が、記載される特定のアッセイ方法、糖尿病媒介タンパク質および遺伝子、試験化合物、またはトランスジェニック哺乳動物には限定されず、従って、方法、遺伝子、調製物、および動物は、もちろん、変更し得ることが理解されべきである。本明細書中で使用される用語は、特定の実施態様のみを記載する目的のためであり、そして、本発明の範囲は添付の請求の範囲によってのみ制限されるので、限定することを意図しないこともまた理解される。本明細書および添付の請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「an」、および「the」は、文脈で他に明らかに指示されない限りは複数の意味を含む。従って、例えば、「糖尿病媒介タンパク質（diabete-mediating protein）」または「糖尿病媒介タンパク質（a diabete-mediating protein）」に関しては、このような糖尿病媒介タンパク質の混合物を含み、「処方物（the formulation ）」または「方法（the method）」に関しては、１つ以上の処方物、方法、ならびに／あるいは本明細書中で記載される型の工程および／または本開示を読んで、その結果、当業者に明らかである工程を含む。他に規定されない限りは、本明細書中で使用される全ての技術および科学的な用語は、本発明が属する分野で当業者に通常理解されているものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと同様または等価な任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が、ここで記載される。本明細書中で記載される全ての刊行物が、開示を参照して本明細書中に参考として援用され、そして引用される刊行物と組合わせて方法および／または材料を記載する。定義用語「タンパク質」は、全ての翻訳後の改変体（例えば、プロセシング、短縮、グリコシル化、またはリン酸化）を含む、タンパク質、ポリペプチド、およびアミノ酸の鎖であるペプチドを含み、これはしばしば、タンパク質機能の調節において決定的な役割を果たす。この用語はまた、天然のタンパク質、ならびに合成または組換えタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを含む。用語「糖尿病」は、インシュリン依存型糖尿症（IDDM）およびＩ型糖尿病を含む。用語「糖尿病関連疾患」は、肥満、循環系の不全、インシュリン耐性、Ｘ症候群、糖尿病網膜症、糖尿病神経障害、ならびに神経障害およびアテローム性動脈硬化症における進行した糖化最終産物（advanced glycation end products、A GE）の併発のような症状を含む。用語「糖尿病媒介タンパク質」は、糖尿病の発症に関連するタンパク質を意味する。糖尿病媒介タンパク質は、糖尿病の発症の間に変化した発現を示すタンパク質であり、すなわち、糖尿病が発症していないときの同じタンパク質の発現と比較して、糖尿病の発症の間に、アップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされるタンパク質、またはその発現が上方調節または下方調節されるタンパク質である。糖尿病媒介タンパク質はまた、糖尿病または糖尿病関連疾患の発達に付随して改変されるタンパク質も意味する。さらに、インターロイキン 1α（IL-1α）は、インシュリンを分泌するランゲルハンス島に対して、インビボおよびインビトロの両方で有害な影響を有し、そして糖尿病の発症において主要な役割を果たすと予想される。島の処置は、それらの発現をアップまたはダウンレギュレートする106個のタンパク質の改変を生じる。本発明の目的のために、用語「糖尿病媒介タンパク質」は、米国仮出願第60/029,324号、（1996年10月 25日出願）、同第60/030,186号（1996年11月５日出願）、および同第60/030,088 号（1996年11月５日出願）（これらの全ての内容が本明細書中で参考として援用される）にさらに記載されるように、インビトロでラットの島においてIL-αによって調節されることが示されている全てのタンパク質（およびそれらの改変産物の全て）もまた含むと定義される。用語「タンパク質改変」は、タンパク質の構造における任意の変化（例えば、定性的変化）を含む。このような改変体は、アミノ酸配列における変化、転写または翻訳のスプライシング変異体、DNAまたはRNA配列に対する翻訳前または翻訳後改変体、DNA、RNA、またはタンパク質に対する巨大分子または低分子（例えば、当該分野で周知のペプチド、イオン、ビタミン、原子、糖含有分子、脂質含有分子、低分子など）の付加を含み得るが、これらに限定されない。本発明のタンパク質改変体の１つの型は、アミノ酸配列の１つ以上の変化（置換、欠失、または挿入）による。このような変化は、１つ以上のアミノ酸での、荷電したアミノ酸から別の荷電したアミノ酸への変化、荷電していないアミノ酸から荷電したアミノ酸への変化、荷電したアミノ酸から荷電していないアミノ酸への変化（例えば、pIまたは可能な分子量における差異を生じさせる）を含み得る。アミノ酸配列における任意の他の変化もまた、本発明に含まれ得る。荷電したアミノ酸配列を有する改変したタンパク質のゲル中での全体的な位置変化はまた、当該分野で公知であるように、タンパク質中に存在する全電荷の数に依存する。ゲルの分解能の変更（例えば、ゲルのpHまたは他の勾配成分における変更）は、主要なまたは主要でないアミノ酸配列の変化の検出を可能にし得る。この型の分析はまた、例えば、配列決定、質量スペクトル、標識抗体の結合を使用して、どのような変化が検出されるかに影響を与え得る。別の型の改変は、細胞内でオープンリーディングフレームが読まれる方法に影響を与える、タンパク質をコードするDNAまたはRNAの長さ、構造、または方向における変化による。これは、ゲル上のスポットの位置において大きな変化を生じ得、そしてタンパク質型およびゲル中での位置の分析に影響を与え得る。別の型のタンパク質の改変は、細胞内でのタンパク質のプロセスにおける変化による。限定的でない例は、いくつかのタンパク質が「アドレス標識」を有する（ここでは、細胞の内部（または外部）でそれらが使用されるのを特定する）。このような標識またはタグは、タンパク質に付加するかまたはタンパク質から取り出して、タンパク質が細胞内のどこに位置するかを決定する場合、ペプチド、糖、または脂質の形態であり得る。さらなる型のタンパク質の改変は、他の巨大分子のタンパク質への付着による。この群は、このような巨大分子の任意の付加／除去を含み得るが、これらに限定されない。これらの分子は、多くの型であり得、そして永久的または一時的のいずれかであり得る。例として、以下が挙げられる：（ｉ）ポリリボシル化；（ ii）DNA／RNA（一本鎖または二本鎖）；（iii）脂質およびリン脂質（例えば、膜付着物）；（iV）糖類／多糖；ならびに（ｖ）グリコシル化（多数の変異体の可能性を増大させるような、多数の種々の型の糖およびシアル酸−種々の一本鎖および分岐構造、の付加）。別の型のタンパク質の改変は、他の低分子のタンパク質への付着による。例として、以下が挙げられれるが、これらに限定されない：（ｉ）リン酸化；（ii）アセチル化；（iii）ウリジル化：（iv）アデニル化；（ｖ）メチル化、および（vi）キャッピング（分類の理由のために、タンパク質のＮ末端の複雑な改変を区別する）。これらの変化のほとんどはしばしば、タンパク質の活性を調節するために使用される。（ｖ）および（vi）はまた、タンパク質自体の半減期を変更するために使用される。これらのタンパク質の変化は、いくつかの方法（例えば、標識、pIの変化、抗体、または当該分野で公知の分子自体に指向する他の特異的技術）を使用して2Dによって検出され得る。分子量の変化は、2DGEによって検出され得るが、必ずしもそうでなくても良く、MALD（逃避質量分析法のマトリックス補助レーザー放出、matrix assisted laser desorption of flight mass spec trometry）が、これらの改変を検出および特徴づけるために好ましい。用語「発現」は、タンパク質の生理的な発現だけではなく、発現されたタンパク質の活性の測定も含むことを意味する。例えば、タンパク質は、不活性な形態で発現され得、これは、リン酸化によって活性化される。タンパク質の実際の発現は変化しないが、その有効な発現（活性）は改変されている。ゲル上では、活性における変化が、改変された形態のタンパク質の発現の変化として測定され得る。用語「影響を受けたタンパク質」は、発現において改変されたタンパク質または構造的に改変されたタンパク質を意味する。従って、影響を受けたタンパク質は、その発現が、タンパク質が由来する細胞内または細胞外での、１つ以上の化合物での処置、疾患状態もしくは病理学的状態、および／または免疫学的変化によって改変された、タンパク質であり得る。あるいはまたはさらに、影響されたタンパク質はまた、アップレギュレートされたかまたはダウンレギュレートされた変化した発現を示すタンパク質、またはその発現が、このような処置、疾患、もしくは免疫学的変化の非存在下での同じタンパク質（すなわち、「影響を受けていないタンパク質」）の発現と比較して、本発明の方法によっては検出され得ない任意の方法で構造が改変されているタンパク質であり得る。用語「糖尿病媒介遺伝子またはポリペプチド」は、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質のフラグメントをコードする遺伝子物質を意味し、これは、完全な糖尿病媒介タンパク質または糖尿病媒介タンパク質のフラグメントをコードする。この用語は、糖尿病媒介タンパク質をコードする任意の種由来の任意の遺伝子を含む。糖尿病媒介遺伝子またはポリヌクレオチドは、天然に存在し得るか、または部分的もしくは全部が合成であり得る。ポリペプチドについて言及する場合、用語「実質的に純粋」は、少なくとも60 重量％が、タンパク質および天然に存在する有機分子（天然に付随する）を含まない、ポリペプチドを意味する。実質的に純粋な糖尿病媒介タンパク質は、少なくとも75％重量が、より好ましくは、少なくとも90重量％が、そして最も好ましくは、少なくとも99重量％が、糖尿病媒介タンパク質である。実質的に純粋な糖尿病媒介タンパク質は、天然の供給源から抽出によって；糖尿病媒介タンパク質をコードする組換え核酸の発現によって、またはタンパク質の化学的合成によって得ることができる。純度は、任意の適切な方法（例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析）によって測定され得る。本明細書中で使用される「ポリヌクレオチド」は、大きな構築物の別々のフラグメントまたは成分の形態における、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの核酸配列をいう。本発明のポリペプチドの一部または全てをコードするDNAは、組換え転写ユニット中で発現され得る合成遺伝子を提供する、cDNAフラグメントからまたはオリゴヌクレオチドから組み立てられ得る。本発明のポリヌクレオチド配列は、DNA、RNA、およびcDNA配列を含み、そして天然の供給源または当該分野で公知の方法によって合成される合成配列由来であり得る。本明細書中で使用される「単離された」ポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドが由来する生物の天然に存在するゲノム中で、そのポリヌクレオチドがすぐに連続する（すなわち、共有結合する）コード配列のいずれとも（すなわち、一方は5'末端で、そして他方は3'末端で）すぐに連続しない、ポリヌクレオチドである。従って、この用語は、例えば、ベクター、自律複製性プラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中に組み込まれる組換えポリヌクレオチド、あるいは他の配列とは独立して別々の分子として存在する組換えポリヌクレオチドを含む。これはまた、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である、組換えDNAを含む。本発明の単離されたおよび精製されたポリヌクレオチド配列はまた、本明細書中で特定されたポリヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を含む。用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイズするポリヌクレオチド配列間の特異性を保証する、ハイブリダイゼーション条件を意味する。当業者は、非特異的ハイブリダイゼーションの数を減少させ、その結果、高度に相補的な配列のみが同定される、温度および塩濃度を含むハイブリダイゼーション後の洗浄条件を選択し得る（Sambrookら、Molecula r Cloning、第２版；Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harb or，NY（1989）、本明細書中で参考として特に援用される）。例えば、このような条件は、特殊化された条件下でのハイブリダイゼーション（例えば、5×SSC中での予備浸透、ならびに20％ホルムアミド、5×デンハルト溶液、50mMのリン酸ナトリウム（pH6.8）、および50μgの変性した超音波処理ウシ胸腺DNA溶液中で約40℃にて１時間の予備ハイブリダイゼーション、続く100μMのATPを補充した同じ溶液中で約40℃にて18時間のハイブリダイゼーションを含む）である（Samb rookら、前出(1989)）。本発明の単離および精製されたポリヌクレオチド配列はまた、糖尿病媒介タンパク質をコードするポリヌクレオチドに相補的な配列（アンチセンス配列）およびリボザイムを含む。用語「宿主動物」および「宿主哺乳動物」は、ドナー細胞が移植される動物を記載するために使用される。簡便な宿主動物として、マウス、ハムスター、およびラットが挙げられる。用語「除去された糖尿病媒介タンパク質遺伝子」、「破壊された糖尿病媒介遺伝子」などは、遺伝子を非作動性にするような様式で変更（例えば、ヌクレオチドの付加および／または除去）されている、内因性の糖尿病媒介タンパク質遺伝子を意味するように、本明細書中で互換的に使用される。これはまた、それらもまた遺伝子を非作動性にする、制御配列または調節遺伝子の除去または改変を含むように使用される。用語「糖尿病の発症の増大した危険性」などは、遺伝的に糖尿病を発症する傾向があり、好ましくは、50％よりも大きい危険性、より好ましくは、60％より大きい危険性、なおさらに好ましくは、70％より大きい危険性、なおさらに好ましくは、80％より大きい危険性、そして最も好ましくは90％より大きい糖尿病の発症の危険性を有する動物を意味する。「変化したタンパク質」または「変化したタンパク質発現」は、糖尿病の発症の間にその発現が増大される（「アップレギュレート」）、減少される（「ダウンレギュレート」）、阻害される（すなわち、オフにされる）または誘導される（すなわち、オンにされる）タンパク質を意味する。用語「活性を調節する」などは、例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、として、その通常の活性を妨げるかまたは増強するようにタンパク質の活性を変化させること、あるいは、タンパク質の活性に必要とされる翻訳後の改変工程をブロックすることによりタンパク質の活性を変化させることを意味する。用語「有効量」または「治療有効量」は、所望の生理学的効果（例えば、糖尿病の発症の抑制または遅延）を得るために十分な化合物の量を意味する。本明細書中で使用される用語「処置」、「処置する」などは、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを一般に意味する。この効果は、これらの疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防することに関して予防的であり得、そして／あるいは疾患および／または疾患に寄与する有害な影響を部分的、または完全に治癒することに関して治療的であり得る。本明細書中で使用される「処置」は、哺乳動物（特に、ヒト）における疾患の任意の処置を含み、そして以下を含む：（ａ）疾患の傾向があり得るがまだ疾患を有するとは診断されていない被験体において、疾患の発病を予防すること；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわちその発症を阻止すること；または（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の退行を生じること。本発明は、糖尿病、および糖尿病に媒介される関連する状態、インシュリン不全症、またはインシュリン耐性を発症しているかまたはその危険性を有する患者を処置することに関する。より詳細には、「処置」は、糖尿病の危険性を有するかまたは糖尿病を罹患している患者に、治療的に検出可能なそして有用な効果を提供することを意味することが意図される。「処置」は、治療的処置、および予防的（prophylactic）または予防的（prev entative）測定の両方をいい、ここで、その目的は、疾患の発症を妨げるかまたは遅延させることである。処置を必要とするものとして、障害をすでに有しているもの、および障害を有する傾向にあるもの、または障害が予防されているものが挙げられる。用語「相乗」「相乗効果」などは、１つ以上の治療薬を併用することによって得られる、改善された処置効果を記載するように本明細書中で使用される。いくつかの分野での相乗効果は足し算以上の（例えば、１＋１＝３）効果を意味するが、医療の分野では、足し算（１＋１＝２）または足し算未満の（例えば、１＋１＝1.6）効果が相乗的であり得る。例えば、2つの薬物のそれぞれが、個体に与えられた場合に50％までの糖尿病の発症を阻害する場合、併用された２つの薬物が糖尿病の発症を完全に停止することは期待できない。多くの例において、受容できない副作用のために、２つの薬物は一緒に投与し得ない。他の例において、一緒に投与された場合、薬物は互いに相殺し、50％未満の糖尿病の発症を遅延させる。従って相乗効果は、２つの薬物が50％より多くの糖尿病の発症を遅延させるが、受容できない有害な副作用の増大を伴わない場合に得られると言われる。本明細書中で使用される略語として以下が挙げられる：IDDM＝インシュリン依存性糖尿症；BB-DP＝糖尿病の傾向がある人工交配（Bio-Breeding）ラット；NOD ＝非肥満糖尿病マウス。発明の一般的な局面本発明は、以下のいくつかの局面を含む：（１）糖尿病の発症の存在下および非存在下での異なる発現によって同定される、糖尿病媒介タンパク質；（２）糖尿病の発症を予想するため、および所望の様式でDMタンパク質の組み合わせに影響を与え得る化合物を同定するために有用なDMタンパク質のパターンおよび組み合わせ；（３）防御糖尿病媒介タンパク質；（４）有害糖尿病媒介タンパク質；（５）体液中の１つ以上のDMタンパク質、それらの翻訳後改変体、または分解産物の検出に基づく糖尿病の発病または発症の診断のための方法；（６）糖尿病媒介タンパク質を同定するためのインビボの方法；(７)糖尿病媒介タンパク質をコードする外因性遺伝子を含むトランスジェニック哺乳動物；（８）防御または有害糖尿病媒介タンパク質を同定するためのインビボアッセイにおいて有用なトランスジェニック哺乳動物；（９）防御または有害糖尿病媒介タンパク質を同定するために有用な糖尿病媒介タンパク質を発現する形質導入した培養細胞を使用するインビトロアッセイ；(10)防御または有害糖尿病媒介タンパク質を同定するために有用な糖尿病媒介タンパク質を発現する形質導入された島細胞を使用するインビボアッセイ；（11）予想される時間内に糖尿病の高い発症率を示す動物である、ヒト疾患の改良された動物モデル；（12）１つ以上の防御タンパク質の発現を誘導または増強し得る試験化合物を同定するためのインビボのアッセイ方法；（13）有害タンパク質の発現を阻害または減少し得る試験化合物を同定するためのインビボのアッセイ方法；(14)防御糖尿病媒介タンパク質の治療有効量を提供することによって、哺乳動物における糖尿病を処置、および／または糖尿病の発症を予防もしくは遅延させるための方法；（15）防御糖尿病媒介タンパク質の発現を誘導もしくは増強し得るか、または糖尿病媒介タンパク質の活性を調節し得る化合物の治療有効量を提供することによって、哺乳動物における糖尿病を処置、および／または糖尿病の発症を予防もしくは遅延させるための方法；ならびに(16)有害糖尿病媒介タンパク質の発現を阻害もしくは減少し得るか、または糖尿病媒介タンパク質の活性を調節し得る化合物の治療有効量を提供することによって哺乳動物における糖尿病を処置、および／または糖尿病の発症を予防もしくは遅延させるための方法。Ｉ．糖尿病媒介タンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体。本発明は、糖尿病媒介タンパク質、すなわち、糖尿病の発症に関連するかまたは糖尿病の発症の間に影響を受けると同定されたタンパク質を提供する。糖尿病媒介タンパク質は、その発現が、糖尿病の発症の非存在下でのそれらの発現と比較して、糖尿病の発症の間に変化されるタンパク質として特徴づけられる。本発明の開示は、膵臓の島細胞タンパク質の２次元ゲルデータベースにより糖尿病媒介タンパク質を同定する。糖尿病媒介タンパク質には、防御糖尿病媒介タンパク質および有害糖尿病媒介タンパク質を含む。本発明は、サイトカイン媒介細胞傷害性におけるそれらの有害または防御的役割を確立するために、トランスフェクトされた細胞中のセンスまたはアンチセンス構築物としての、クローニングされたcDNAの発現による機能的評価を含む、糖尿病媒介タンパク質を同定するためのインビトロの方法を提供する。ランゲルハント島のＢ細胞は、サイトカインの毒性効果に特に敏感である。熱ショックタンパク質70（HSP 70）でのラットβ細胞のリポフェクション、およびIL-1に暴露された細胞のインビトロの生存性を改善された、ヘミンに対する暴露によるヘムオキシゲナーゼ（HO）の誘導が以前に示されている（Karlsenら、Insulin Secreti on and Pancreatic B Cell Research、P.R．FlatｔおよびS．Lenzen編；Smith-G ordon、USA、499-507頁(1994)）。細胞は、多数の当該分野で公知の方法（例えば、アデノウイルスベクター法）でトランスフェクトされ得る。例えば、Korbut tら、Transplantation Proceedings 27:3414（1995）；Cseteら、26:756-757（1 994）；Beckerら、J．Biol．Chem．269.21234-21238（1994）を参照のこと。安定なトランスフェクトされたβ細胞クローンの確立に続いて、糖尿病媒介タンパク質の発現の効果が、サイトカインの非存在下および存在下で培養されたクローンの機能的分析によって決定され得る。機能的分析は、窒素として測定される一酸化窒素の産生（NO）（Greenら、Anal．Biochem．126.131-138（1982））、インシュリンの分泌（Id）、細胞傷害性、および2Dゲル電気泳動を含む。細胞傷害性は、以下を含む当該分野で公知の種々の方法によって測定され得る：（１）乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）の放出に基づく比色アッセイ（cytoTox、Promeg a）、（２）生細胞のカルセインの取り込みおよび蛍光、ならびに死細胞の核のエチジウムブロマイド染色に基づく生死アッセイ（Molecular Probes）、（３）非放射活性細胞増殖アッセイ（MTT、Promega）、アポトーシス(Nerupら、IDDM,S ．BabaおよびT．Kaneko編、Elsevier Science、15-21頁(1994))、および／または遺伝子発現の半定量的複合PCR分析。２次元ゲルは、応答するタンパク質を同定するために、コントロールとサイトカインで刺激した島とを比較するために使用され得、これによって細胞応答において役割を果たすタンパク質を同定する。内部結合分析は、タンパク質の機能的な群を定義し、そしてそれらを調節する（例えば、キナーゼリン酸化または他の翻訳後改変による）ために使用され得る。このようなアッセイにおける使用について好ましい細胞は、インシュリン分泌細胞（例えば、MSLまたはRIN細胞）である。MSL細胞株は、多能性または幹細胞様転移性ラット島細胞腫細胞株である。インビトロおよびインビボでの培養および／または継代条件に依存して、MSL細胞は、ランゲルハンス島の特徴である、全部で４つのホルモン分泌表現系をもたらし得る(Mandrup-Poulsenら、Eur．J． Endocrinology 133:660-671 （1995）；Eur．J．Endocrinology編、134:21-30(1 996))。RIN細胞は、島細胞肺細胞の培養株である（Nielsen、Exp．Clin．Endocr inol．93:277-285(1989)）。防御糖尿病媒介タンパク質。本発明は、糖尿病の発症の危険性を有する被験体における糖尿病の発症に対して防御し得るか、または糖尿病を罹患している被験体において糖尿病の症状を緩和し得ると特徴づけられる、実質的に精製された防御糖尿病媒介タンパク質（「防御タンパク質」）を提供する。本発明の防御タンパク質は、糖尿病に対して防御するように直接作用し得るか、あるいは第２の防御タンパク質の合成を誘導もしくは増大するか、または有害タンパク質の合成を減少もしくは阻害することによって間接的に作用し得る。特異的な実施態様において、本発明は、実質的に純粋な防御タンパク質ガレクチン-3を提供する。ラットのガレクチンの配列（配列番号３）を図４に示し、ヒトのガレクチンの配列（配列番号４）を図５に示す。以下に示すように、トランスフェクトした細胞中で発現されるgal-3は、IL-1βでのチャレンジの際に細胞の生存性を増大する。ガレクチンは、胎児および生体の膵臓の島細胞中に存在する、βガラクトシド糖または糖結合体に特異的なレクチンである。本明細書中で使用される用語「実質的に純粋な」は、他のタンパク質、脂質、炭水化物、または天然に付随する他の物質を実質的に含まないgal-3をいう。当業者は、タンパク質精製のための標準的な技術を使用して、gal-3を精製し得る。gal-3ポリペプチドの純度はまた、アミノ末端のアミノ酸配列分析によって決定され得る。gal- 3タンパク質は、防御活性を維持している限りは、ポリペプチドの機能的フラグメントを含む。gal-3の生物学的活性を有するより小さいペプチドが、本発明に含まれる。本発明はさらに、配列番号４の全長のアミノ酸配列に対して、少なくとも80％、好ましくは90％、より好ましくは95％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。相同性または同一性の割合は、例えば、University of Wisconsin Gene tics Computer Group（UWGCG）から入手可能なGAPコンピュータープログラム（バージョン6.0）を使用して配列情報を比較することによって決定され得る。GAP プログラムは、SmithおよびWaterman、Adv．Appl．Math．2:482（1981）によって改訂された、NeedlemannおよびWunsch、J．Mol．Biol．48:443(1970)のアラインメント法を利用する。簡潔には、GAPプログラムは、２つの配列の短い方の記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の総数で割り算した、類似であるアラインメントした記号の数として類似性を定義する。GAPプログラムのための好ましいデフォルトパラメーター（default parameter）として、以下が挙げられる：（１）SchwartzおよびDayhoff編、Atlas of Proteli Sequence and S tructure、National Biomedical Research Foundation、353-358頁（1979）に記載されるような、一元比較マトリックス（同一性について１、そして非同一性について０の値を有する）ならびにGribsovおよびBurgess、Nucl．Acids Res．14: 6745(1986)の質量測定比較マトリックス；（２）各ギャップについて3.0のペナルティーおよび各ギャップ中の各記号について0.10のぺナルティー；ならびに（３）末端のギャップについてはペナルティーなし。本発明はまた、コンピューターシステムまたは本発明の方法によって同定されるかまたは特徴づけられる、精製されたタンパク質を提供する。ここで、タンパク質は、以下からなる群から選択され得る：（ａ）表８に示される、対応する分子量およびpIを有する影響を受けていないタンパク質；（ｂ）表９に示される、対応する分子量およびpIを有する影響を受けたタンパク質；および（ｃ）表10に示される、対応する分子量およびpIを有するマーカータンパク質、そしてここで、少なくとも１つの上記のタンパク質が、必要に応じて以下からさらに選択される：（ｉ）表11に示される、対応する分子量およびpIを有する影響を受けていないタンパク質；（ii）表12に示される、対応する分子量およびpIを有する影響を受けたタンパク質；および（iii）表13に示される、対応する分子量およびpIを有するマーカータンパク質。本発明に従って、影響を受けたタンパク質または影響を受けていないペプチドは、影響を受けたペプチドまたは影響を受けていないペプチド（例えば１〜40ドメイン、またはその中の任意の範囲もしくは値）に対応する２つ以上のポリペプチドドメイン（例えば、膜貫通ドメイン、細胞質ドメイン、疎水性ドメイン、親水性ドメイン、リガンド結合ドメイン、または孔内層ドメイン）またはそのフラグメントの会合を含む。本発明の影響を受けたペプチドまたは影響を受けていないペプチドのこのようなドメインは、少なくとも74％の相同性（例えば、全体で 74〜100％の相同性または同一性）を有し得るか、あるいは本明細書中に記載される、１つ以上の対応する、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドドメインに対して、その中の任意の範囲または値を有し得る。当業者に理解されるように、上記のドメインの立体配置は、本発明の影響を受けたペプチドまたは影響を受けていないペプチドの一部として提供され、その結果、機能的に影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドは、適切な細胞中で発現される場合、島細胞型に影響を与えることが見出される生物学的活性に関連し得る。このような活性は、適切な影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドの活性アッセイによって測定される場合、本発明の１つ以上の影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドの、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチド活性を確立する。従って、あるいは、本発明の影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドは、少なくとも１つの20〜10,000アミノ酸のフラグメントに実質的に対応する影響を受けたかまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドアミノ酸配列の一部を有するペプチド、および／あるいは影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドあるいは影響を受けたがまたは影響を受けていないペプチド群のコンセンサス配列を含む。ここで、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドは、少なくとも74〜99％（例えば、88〜99％（またはその中の任意の範囲もしくは値（例えば、87〜99、88〜99、89〜99、90〜99、91〜99、 92〜99、93〜99、94〜99、95〜99、96〜99、97〜99、または98〜99％））の相同性または同一性を、本発明に従って１つ以上のタンパク質の質量スペクトル特徴を有する、表８〜13の１つ以上に示されるかまたは図２〜７に示されるとして特徴付けられる、少なくとも１つのタンパク質の少なくとも１つの配列またはコンセンサス配列に対して有する。 1つの局面において、このような影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドは、影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質またはペプチドの生物学的活性を維持し得る。本発明の影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドは、天然に存在しないか、または天然に存在するが天然には存在しない形態で精製または単離されることが好ましい。好ましくは、本発明の影響を受けたかまたは影響を受けていないペプチドは、実質的に、本発明に従って１つ以上のタンパク質の質量スペクトル特徴を有する、配列番号を含む表８〜13の１つ以上において特徴付けられる、少なくとも10個の連続するアミノ酸のタンパク質を有する、本発明の影響を受けたまたは影響を受けていないタンパク質のドメインの任意のセットに実質的に対応する。あるいはまたはさらに、本発明の影響を受けたまたは影響を受けていないペプチドは、既知のタンパク質のドメイン（例えば、74〜100％の全体の相同性、またはその中の任意の範囲もしくは値を有する、細胞質ドメイン、細胞内ドメイン膜貫通ドメイン、細胞外ドメイン、または公知の他のドメイン）に対応する少なくとも１つのドメインを含む。別のドメインもまた、本発明に従って１つ以上のタンパク質の質量スペクトル特性を有する、配列番号を含む表８〜13、図２〜７の１つ以上において特徴付けられる、少なくとも10個の連続するアミノ酸のタンパク質をコードするか、またはそれに対して74％の相同性を有するか、または置換されたコドンを有し、それにより、特定のコドンについて同じアミノ酸をコードする、少なくとも30個の連続するヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによってコードされる。さらに、リン酸化（例えば、P KAおよびPKC）ドメインはまた、当業者によって認識される場合、本発明に従って影響を受けたかまたは影響を受けていないペプチドまたはコードする核酸配列が提供される場合に考慮される。この限定的でない例は、表12のタンパク質672- 674に示され、ここで同じタンパク質が別々にリン酸化される。本発明はさらに、DNA、cDNA、およびRNA配列を含む、本発明の糖尿病媒介タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。糖尿病媒介タンパク質の全てまたは一部をコードする全てのポリヌクレオチドもまた、それらが糖尿病媒介活性を有するポリペプチドをコードする限りは、本明細書中に含まれる。このようなポリヌクレオチドは、天然に存在する、合成の、および意図的に操作されたポリヌクレオチドを含む。例えば、このようなポリヌクレオチドは、部位特異的変異誘発に供され得る。本発明のポリヌクレオチド配列はまた、アンチセンス配列を含む。アンチセンス配列は、改変されたオリゴヌクレオチドを用いて合成された配列を含む。本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子コードの結果として縮重している配列を含む。これらは、20の天然のアミノ酸であり、これらのほとんどは、１を超える^**コドンによって特定される。従って、全ての縮重ヌクレオチド配列が、そのヌクレオチド配列によってコードされる糖尿病媒介ポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変化していない限りは、本発明に含まれる。本発明のDNA配列は、いくつかの方法によって得ることができる。例えば、DNA は、当該分野で周知のハイブリダイゼーション技術を使用して単離され得る。これらは以下を含むが、それらに限定されない：１）相同ヌクレオチド配列を検出するための、プローブとのゲノムまたはcDNAライブラリーのハイブリダイゼーション、２）目的のDNA配列にアニーリングし得るプライマーを使用する、ゲノムD NAまたはcDNAについてのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、および３）共有する構造特性を有するクローニングしたDNAフラグメントを検出するために、発現ライブラリーの抗体スクリーニング。好ましくは、本発明のDNA配列は、哺乳動物の器官由来であり、そして最も好ましくは、ヒト由来である。適切なプローブが入手可能である限り、核酸ハイブリダイゼーションによるスクリーニング手順によって、任意の生物からの任意の遺伝子配列の単離が可能になる。目的のタンパク質をコードする配列の一部に対応するオリゴペプチドプローブが、化学合成され得る。これは、アミノ酸配列の短いオリゴヌクレオチドストレッチが公知でなければならないことを必要とする。タンパク質をコードするDNA配列は、遺伝子コードから推定され得るが、しかし、コードの縮重を考慮しなければならない。生物のコドン偏向は、最も可能性のあるヌクレオチドのトリプレットを選択するために考慮され得る。配列が縮重する場合、混合した付加反応を行うことが可能である。これは、変性した二本鎖 DNAの異種混合物を含む。このようなスクリーニングについて、好ましくは、ハイブリダイゼーションは、一本鎖DNAまたは変性させた二本鎖DNAのいずれかについて行われる。ハイブリダイゼーションは、目的のポリペプチドに関連するmRNA配列が極微量で存在する場合、供給源に由来するcDNAクローンの検出に特に有用である。言い換えれば、非特異的結合を避けるためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用することによって、例えば、その完全な相補物である混合物中の単一のプローブに対する標的DNAのハイブリダイゼーションによって、特異的なcDNAクローンのオートラジオグラフィーによる可視化が可能である（Sa mbrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第２版、Cold Sprlng Ha rbor Laboratory Press、Plainview、NY(1989)）。本発明の糖尿病媒介タンパク質をコードする特異的DNA配列の生成は、以下によっても得ることができる：１）ゲノムDNA由来の二本鎖DNA配列の単離；２）目的のポリペプチドに必要なコドンを提供するための、DNA配列の化学的な操作；および３）真核生物ドナー細胞から単離されたmRNAの逆転写による、二本鎖DNA 配列のインビトロ合成。最後の場合、mRNAに相補的な二本鎖DNAが最終的に形成され、これは一般にcDNAと呼ばれる。組換え手順での使用のための特異的DNA配列を産生するための上記の３つの方法のうち、ゲノムDNA単離物の単離は最もまれである。これは特に、哺乳動物ポリペプチドの微生物での発現を得ることが所望される場合に特に正しく、イントロンの存在に起因する。 DNA配列の合成はしばしば、所望のポリペプチド産物のアミノ酸残基の完全な配列が既知である場合の方法の選択である。所望のポリペプチドのアミノ酸残基の配列の全体が未知である場合、DNA配列の直接の合成は不可能であり、そして選択される方法は、cDNA配列の合成である。目的のcDNA配列を単離するための標準的な手順は、目的のタンパク質について高レベルの遺伝子発現を有するドナー細胞中に豊富な、mRNAの逆転写に由来するプラスミド保有cDNAまたはファージ保有cDNAライブラリーの形成である。ポリメラーゼ連鎖反応技術が組み合わせて使用される場合、さらにまれな発現産物がクローニングされ得る。ポリペプチドのアミノ酸配列の有意な部分が既知である場合において、標的cDNA中に存在すると推定される配列を二倍にする、標識された一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAプローブ配列の生成は、一本鎖形態に変性されているcDNAのクローニングされたコピーについて行われる、DNA/DNAハイブリダイゼーション手順において使用され得る（Jayら、Nucl．Acid．Res．11:2325(1983)）。 cDNA発現ライブラリー（例えば、λgtll）は、糖尿病媒介タンパク質に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つのエピトープを有する糖尿病媒介ペプチドについて間接的にスクリーニングし得る。このような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルのいずれかで得られ、そして所望のcDNAの存在の指標である発現産物に由来し、そしてそれを検出するために使用され得る。糖尿病媒介因子をコードするDNA配列は、適切な宿主細胞中へのDNA移入によってインビトロで発現され得る。「宿主細胞」は、ベクターが増殖され得るかまたはそのDNAが発現される細胞である。この用語はまた、被験体の宿主細胞の任意の子孫を含む。全ての子孫が、親細胞にと同一でなくてもよいことが理解され得る。なぜなら、複製の間に生じる変異が存在し得るからである。しかし、このような子孫は、用語「宿主細胞」が使用される場合、含まれる。安定な導入方法とは、外来DNAが宿主中で連続的に維持されることが当該分野で公知であることを意味する。本発明において、糖尿病媒介タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、組換え発現ベクター中に挿入され得る。用語「組換え発現ベクター」は、プラスミド、ウイルス、またはXi30遺伝子配列の挿入または取り込みによって操作されている当該分野で公知の他のビヒクルをいう。このような発現ベクターは、宿主の挿入された遺伝子配列の効率的な転写を容易にする、プロモーター配列を含む。発現ベクターは代表的には、複製起点、プロモーター、および形質転換された細胞の表現系の選択を可能にする特異的な遺伝子を含む。本発明での使用に適切なベクターとして、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細菌中での発現のためのT7に基づく発現ベクター（Rosenbergら、Gene 56:125(1987)）、哺乳動物細胞中での発現のためのpMSXND発現ベクター（LeeおよびNathans、J．Bio l．Chem．2633521(1988)）、および昆虫細胞中での発現のためのバキュロウイルス由来ベクター。DNAセグメントは、調節エレメント（例えば、プロモーター(例えば、T7、メタロチオネインＩ、またはポリヘドロンプロモーター)）に作動可能に連結されて、ベクター中に存在し得る。糖尿病媒介タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、原核生物または真核生物のいずれかで発現され得る。宿主は、微生物、酵母、昆虫、および哺乳動物の器官を含み得る。真核生物またはウイルス配列を有するDNA配列を原核細胞中で発現させるための方法は、当該分野で周知である。宿主中で発現および複製し得る生物学的に機能的なウイルス、およびプラスミドDNAベクターが、当該分野で公知である。このようなベクターは、本発明のDNA配列を取り込むために使用される。組換えDNAでの宿主細胞の形質転換は、当業者に周知である従来の方法によって行われ得る。宿主が原核生物（例えば、E．coli）である場合、DNAを取り込み得るコンピテント細胞が、当該分野で周知の手順を使用して、対数増殖期後に細胞を回収し、その後CaCl₂法によって処理することによって調製され得る。あるいは、MgCl₂またはRbClが使用され得る。形質転換はまた、所望される場合、宿主細胞のプロトプラストを形成した後に行われ得る。宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈、従来の機械的手順（例えば、マイクロインジェクション）、エレクトロポレーション、リポソーム中に包埋されたプラスミドの挿入のようなDNAのトランスフェクションまたはウイルスベクターの方法が使用され得る。真核生物細胞はまた、本発明の糖尿病媒介タンパク質をコードするDNA配列、および選択可能な表現系をコードする第２の外来D NA分子（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子）で同時形質転換され得る。別の方法は、真核生物ウイルスベクター（例えば、シミアンウイルス40（SV 40）、またはウシ乳頭腫ウイルス）を、真核生物細胞を感染、形質転換、または形質導入させ、そしてタンパク質を発現させるために使用することである（例えば、Eukaryotic Viral Vectors、Cold Spring Harbor Laboratory、Gluzman編、 1982を参照のこと）。本発明によって提供される、微生物発現されるポリペプチドまたはそのフラグメントの単離および精製は、予備クロマトグラフィーおよび免疫学的分離（モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む）を含む、従来の手段によって行われ得る。2DGEは、互いからのタンパク質の改変変異体の精製のための好ましい方法である。糖尿病媒介有害タンパク質。糖尿病媒介有害タンパク質（「有害タンパク質」）は、糖尿病の発症を増強するか、または被験体の糖尿病を発症する危険性を増大させると特徴づけられる。本発明は、実質的に精製された防御糖尿病媒介タンパク質、およびこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。好ましい実施態様において、有害タンパク質はモルタリンである。マウスのモルタリンのアミノ酸配列（配列番号１）を図２に示す、そしてヒトのモルタリンのアミノ酸配列（配列番号２）を図３に示す。糖尿病媒介タンパク質に特異的な抗体。本発明の糖尿病媒介タンパク質はまた、糖尿病媒介タンパク質のエピトープに免疫反応性であるか、または結合する抗体を産生するために使用され得る。抗体は本質的に、種々のエピトープ特異性を有するプールされたモノクローナル抗体、および異なるモノクローナル抗体調製物からなり得る。モノクローナル抗体は、当該分野で周知の方法によってタンパク質のフラグメントを含む抗原から作成される（Kohlerら、Nature 256:495(197 5)；Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、1989）。本明細書中で使用される用語「抗体」は、完全な分子およびそのフラグメント（例えば、Fab、F(ab')2、およびFv）を含み、これらは、エピトープ決定基に結合し得る。これらの抗体フラグメントは、その抗原またはレセプターに選択的に結合するいくつかの能力を維持しており、そして以下のように定義される：（１）Fab（抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含むフラグメント）は、インタクトな軽鎖および１つの重鎖の一部を生じるための、酵素であるパパインでの抗体全体の消化によって産生され得る；（２）Fab'（抗体分子のフラグメント）は、インタクトな軽鎖および重鎖の一部を生じるための、ペプシンでの抗体全体の処理、続く還元によって、得ることができる；１つの抗体分子あたり２つのFab'フラグメントが得られる；（３）(Fab')2（抗体のフラグメント）は、続く還元を伴わない酵素ペプシンでの抗体全体の処理によって得ることができる；F(ab')2は、２つのジスルフィド結合で互いに結合した２つのFab'フラグメントの二量体である；（４）Fvは、２つの鎖として発現される、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；そして（５）単鎖抗体（「SCA」）は、遺伝的に融合された単鎖分子として適切なポリペプチドリンカーによって連結された、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子操作された分子として定義される。これらのフラグメントを作成する方法は、当該分野で公知である。例えば、Ha rlowおよびLane，Antibodies；A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Labo ratory、New York（1988）(本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。本明細書中で使用される用語「エピトープ」は、抗体のパラトープが結合する、抗原の任意の抗原性決定基を意味する。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性な表面基からなり、そして通常は、特異的な三次元構造特性および特異的な電荷特性を有する。本発明の糖尿病媒介ポリペプチドに結合する抗体は、免疫抗原としての目的の小ペプチドを含む完全なポリペプチドまたはフラグメントを使用して調製され得る。動物を免疫するために使用されるポリペプチドまたはペプチドは、翻訳されたcDNA、または所望される場合は、キャリアタンパク質に結合され得る化学合成物由来であり得る。ペプチドに化学結合されるこのように一般的に使用されるキャリアとして、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（BSA）、および破傷風毒素が挙げられる。次いで、結合されたペプチドが、動物（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）を免疫するために使用される。所望される場合は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、例えば、抗体が惹起されるポリペプチドまたはペプチドが結合されるマトリックスに結合させるかおよびマトリックスからの溶出によってさらに精製され得る。当業者は、ポリクローナル抗体、およびモノクローナル抗体の精製および／または濃度について免疫学的分野で一般的な種々の技術を知っている。例えば、Coliganら、第９章、Current Protocols in Immunology、Wiley Interscience（1994）(本明細書中で参考として具体的に援用される)を参照のこと。エピトープを模倣するモノクローナル抗体を産生するために、抗イディオタイプ技術を使用することもまた可能である。例えば、第一のモノクローナル抗体を作成するための抗イディオタイプモノクローナル抗体は、第一のモノクローナル抗体によって結合されるエピトープの「典型（image）」である、超可変領域中の結合ドメインを有する。本発明の目的のために、糖尿病媒介タンパク質に特異的な抗体または核酸プローブは、生物学的液体または組織中の糖尿病媒介タンパク質を検出するため（抗体を使用して）またはコードするポリヌクレオチドを検出するため（核酸プローブを使用して）に使用され得る。糖尿病媒介タンパク質または核酸プローブと反応性である抗体は、好ましくは、糖尿病媒介タンパク質への結合の検出を可能にする化合物で標識される。検出可能な量の抗原またはポリヌクレオチドを含有する任意の標本が、使用され得る。さらに、特異的タンパク質が、それらのリガンド（例えば、レクチン結合タンパク質へのガレクチン-3の結合）によって選択され得、そして目的のタンパク質の診断および／または精製に有用である。細胞成分が核酸である場合、糖尿病媒介タンパク質特異的プローブとの結合の前に核酸を増幅することが必要であり得る。好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が使用されるが、しかし、他の核酸増幅手順（例えば、リガーゼ連鎖反応、連結活性化転写（LAT）、および核酸配列に基づく増幅（NASBA）が使用され得る。 II．糖尿病媒介タンパク質の同定のための方法インビボの動物移植モデル。本発明は、糖尿病の発症に関連するか、または糖尿病の発症の間に特異的に影響されるタンパク質を検出するインビボのアッセイシステムを提供することにより、糖尿病媒介タンパク質を同定するための方法を特徴とする。本明細書中に記載される本発明のインビボの移植アッセイは、関連するまたは影響を受けるタンパク質の同定を可能にする。本発明の糖尿病媒介タンパク質の同定のための方法において、インシュリン分泌細胞またはインシュリン分泌細胞に成長し得る細胞が、宿主動物に移植される。移植された細胞は、移植と糖尿病の発症との間の時点でレスキューされ、そしてタンパク質発現が決定され、そして移植されていない島細胞および糖尿病を発症していない動物中の相乗移植物とタンパク質発現が比較される。本発明の方法は、糖尿病の発症の間に変化した発現を示すタンパク質を同定することを可能にする。次いで、同定されたタンパク質が単離され、そして防御または有害糖尿病媒介タンパク質としての同定のためにさらに試験される。インシュリン産生細胞に成長し得る細胞として、膵臓島細胞およびβ細胞が挙げられる。移植された細胞は、ヒトを含む目的の任意の種から得ることができる。宿主動物は、好ましくは、移植された細胞が宿主動物中で拒絶されないように、移植される細胞と免疫学的に適合性である動物である。宿主動物は、糖尿病を発症する任意の動物であり得、そして研究に便利である。好ましい宿主動物は、マウス、ラット、およびハムスターであり、ラットおよびマウスが最も好ましい。特に好ましい実施態様において、宿主動物は、糖尿病の発病率の増大のために交配された株（BB−DPラットおよびNODマウスを含む）から選択される。本発明の方法はまた、予め決定された時間に（例えば、特異的抗原への暴露の際に）糖尿病を発症するように操作された宿主動物で使用され得る。例えば、Oldstoneら、APMIS 104:689-97(1996)：von Herrathら、J．Clin． Invest．98:1324-1331(1996)；Morganら、J．Immunol．157:978983(1996)を参照のこと。他の可能性のある宿主動物として、Mus（例えば、マウス）およびRattu s（例えば、ラット）、Oryctolagus（例えば、ウサギ）、およびMesocricetus（例えば、ハムスター）、およびCavia（例えば、モルモット）から選択される属に属する動物が挙げられる。一般に、交配および維持が容易である、１kg未満の正常の完全に成長した成体体重を有する哺乳動物が、使用され得る。タンパク質発現を決定するための方法。タンパク質発現は、一次元または二次元ゲル電気泳動およびイムノブロッティングを含む、当該分野で公知の種々に手段によって評価され得る。二次元ゲル電気泳動（2-DGE）は、タンパク質の混合物を分離するための特に有効な方法である（Andersenら、Diabetes 44:400-407(1995)）。細胞タンパク質抽出物は、ゲル上に載せられ、そして個々のタンパク質は、最初に電荷によって、次いで大きさによって分離される。結果は、それぞれが通常は単一のタンパク質である、1,000〜5,000個程度のスポットの特徴的な写真である。解像度は、ゲルの大きさを大きくすることによって、ならびに放射性標識法、銀染色の使用、および1.5mm以下にゲルの厚さを薄くすることによって感受性を増強することによって改善される。糖尿病媒介タンパク質の単離のための方法。以下の実施例に記載されるように、2Dゲルから回収される単一のタンパク質が、各ペプチドのトリプシン切断パターンおよび正確な分子量を得るために質量スペクトル分析によって同定され得る。次いで、これらの観察された値は、以前に同定されたタンパク質と適合するものが存在するかどうかを決定するために、DNAおよびタンパク質のデータベースを検索するために使用される。同一性は、既知のタンパク質から決定され得るか、または既知のタンパク質に対する高い相同性によって推定され得る。2Dゲル電気泳動が、糖尿病の発症の間の変化した合成を示すタンパク質のスポットを分離および同定するために使用される場合、同定されたタンパク質スポットはゲルから切り出され、そしてペプチドを産生するためにトリプシンで消化される。ペプチドはゲルから回収され、そして質量スペクトル分析（マトリックス補助レーザー吸収／イオン化質量スペクトル分析）（MALDI）に供され、そして得られるMS- プロフィールが、公の配列ベータベース中に見出される全ての配列のコンピューター化されたMS-プロフィールに対して、および適切な配列情報に対して分析される。以前にクローニングされた配列に対するいくらかの適合が得られる場合、対応する遺伝子およびコードされるタンパク質についての情報が集められる。同定された糖尿病媒介タンパク質が以前にクローニングされているタンパク質と適合しない場合は、タンパク質は、当該分野で公知の方法によって微配列決定されて、部分的なアミノ酸配列情報が得られ得る（以下の実施例５を参照のこと）。データベース検索またはアミノ酸配列決定によって得られた結果に基づいて、特異的なまたは縮重プライマーが構築され、そしてラットおよびヒト島ライブラリーをスクリーニングするために使用されるか、またはPCRによる第１鎖cDNAが、対応するcDNA配列の部分的配列をクローニングするために使用される。次いで、得られた配列は、5'-race PCRまたは従来のハイブリダイゼーションスクリーニング技術のいずれかによって完全長のコード領域を得るため、続く組換えタンパク質の発現のために使用される（Karlsenら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:8 337-8341(1991)；Karlsenら、Insulin secretion and pancreatic B-cell resea rch、Flatt，P.R.編、Smith-Gordon、USA；第64章、１〜９頁（1994）；Karlsen ら、D iabetes 44:757-758(1995)）。糖尿病媒介タンパク質は、生物学的材料からの精製、組換えDNAの発現を含む、当該分野で公知の種々の方法で単離され得る（上記を参照のこと）。従来の方法の工程は、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および電気泳動を含む。例えば、糖尿病媒介タンパク質を発現する細胞は、遠心分離によってまたは適切な緩衝液を用いて回収され得、溶解され得、そしてカラムクロマトグラフィー（例えば、DEAE-セルロース、ホスホセルソース、ポリリボシチジル酸アガロース、ヒドロキシアパタイト）、または電気泳動、または免疫沈降によってタンパク質が単離され得る。あるいは、糖尿病媒介タンパク質は、特異的な抗体の使用によって免疫沈降によって単離され得る。 III．糖尿病媒介タンパク質トランスジーンを発現するトランスジェニック動物。１つの局面において、本発明は、糖尿病媒介タンパク質をコードする遺伝子を含むトランスジェニック動物、および本発明のトランスジェニック動物の子孫であるトランスジェニック動物を含む。糖尿病媒介タンパク質をコードする遺伝子は、天然に存在するポリヌクレオチド配列、または部分的にもしくは全体が人工のポリヌクレオチド配列（すなわち、コドン配列が天然の遺伝子配列には存在しない）からなり得る。上昇したレベルの本発明の糖尿病媒介遺伝子の発現を有するトランスジェニック動物は、例えば、増強したプロモーター、および／または高コピー数の天然の遺伝子を用いる遺伝子の過剰発現によって得ることができる。トランスジェニック動物はまた、特に、１つ以上の糖尿病媒介タンパク質遺伝子（単数または複数）が除去されている動物とトランスジェニック動物とを交配させることによって産生される、ハイブリッドトランスジェニック動物を含む。本発明のトランスジェニック動物は、糖尿病の発症の際の候補の防御または有害糖尿病媒介タンパク質の効果を決定するためのアッセイを含む、多数の方法において有用である。例えば、候補防御タンパク質のトランスジーンを有するトランスジェニック動物は、糖尿病の発症の際の防御トランスジーンの発現の効果を決定するために有用である。好ましい宿主動物は、マウス、ラット、およびハムスターであり、ラット、およびマウスは、トランスジェニック動物の産生についての多くの知見が存在する点で最も好ましい。他の可能性のある宿主動物として、Mus（例えば、マウス）、Rattus（例えば、ラット）、Oryctolagus（例えば、ウサギ）、Mesocricetus （例えば、ハムスター）、およびCavia（例えば、モルモット）から選択される属に属する動物が挙げられる。一般に、交配および維持が容易である、１kg未満の正常の完全に成長した生体体重を有する哺乳動物が、使用され得る。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物（好ましくは、ラットまたはマウス）は、哺乳動物またはその哺乳動物の祖先に胚または生殖細胞段階に導入された、糖尿病媒介タンパク質（例えば、１つ以上の防御タンパク質または有害タンパク質）をコードする遺伝子を、有核細胞のいくらかまたは全ての中に有する。この「胚段階」は、胎児の胚発生の全ての段階にわたる、時間の概念による任意の時点（例えば、精子または卵子が外来遺伝子を保有する時）であり得る。本明細書中で使用される「トランスジェニック動物」は、その有核細胞の全てまたはいくらかの中に、同種または異種に由来する１つ以上の遺伝子を有する哺乳動物を示す；外来遺伝子を有する細胞が動物の生殖系細胞を含む場合、遺伝子は、動物の子孫に伝達され得る。本発明の遺伝子構築物および方法論は、それらの遺伝的成り立ちにより糖尿病を発症し、そして予想される時間に疾患の症状を示す動物を作成するために使用され得る。好ましい実施態様において、本発明のトランスジェニック哺乳動物は、70±10日で80％の糖尿病の発病率を示し、より好ましくは、60±５日で90％の糖尿病の発病率を示し；最も好ましくは、55±５日で95％の糖尿病の発病率を示し；そしてなおより好ましくは、50±５日で97％の糖尿病の発症率を示す。本発明の動物は、候補の防御または有害糖尿病媒介タンパク質、または糖尿病の発症を予防、増強、または遅延させる化合物の能力を試験するためのアッセイで使用される。本発明の１つの局面において、本発明の遺伝子構築物および方法論が、候補の防御または有害タンパク質をコードするトランスジーンを有する動物を作成するために使用される。トランスジェニック動物は、糖尿病を発症しやすい遺伝的バックグラウンドによって選択され得るか、または予想可能な糖尿病を、短期間に発症する二重トランスジェニック動物であり得る。本発明のこの実施態様において、動物は、疾患の発病率を阻害するかまたは低下させる候補の防御タンパク質の能力を試験するためのアッセイにおいて使用される。関連する局面において、動物は、防御タンパク質の発現を誘導する化合物の能力を試験するため、およびそれにより疾患の発症から動物を防御するためのアッセイにおいて使用される。本発明の1つの局面において、本発明の遺伝子構築物および方法論は、それらの遺伝的成り立ちにより予想される時間内に糖尿病を発症する動物を作成するために使用される。例えば、1つの実施態様において、例えばモルタリンのような有害な糖尿病媒介疾患を発現するトランスジェニック動物が作成される。本発明の動物は、糖尿病の発症を防止するかまたは遅延することのできる試験化合物のアッセイにおいて使用される。1つの実施態様において、コピー数の増大は疾患の発症に必要な時間を短縮する傾向があるので、比較的高いコピー数でトランスジェニック動物中で有害タンパク質遺伝子を含むことが好ましい。さらに、調整が、コピー数を増大させることなく発現のレベルを上昇させるために、増強プロモーターの特定の型の使用に関してなされ得る。コピー数の増大を伴わずに糖尿病媒介タンパク質トランスジーンの発現の増強を提供する特定の型の増強プロモーターは、公知である。増強プロモーターは、構成的または誘導的に作動し得る。本発明はまた、糖尿病または糖尿病関連疾患についての動物モデルを作成するための手段を提供する。本発明のトランスジェニック動物は、糖尿病の可能性のある治療法を開発および試験する方法を提供し、そして最終的にこの疾患の治癒を導く。 IV．糖尿病媒介タンパク質の発現をもたらし得る薬物のスクリーニングのためのアッセイ。本発明によって提供されるアッセイ方法は、糖尿病媒介タンパク質の発現をもたらし得る、従って、哺乳動物における糖尿病の発症をもたらし得る化合物をスクリーニングするために有用である。１つ以上の糖尿病媒介タンパク質の発現をもたらし得る薬物をスクリーニングするための1つのモデルは、培養物中の細胞に有利な効果を有すると推測される化合物（アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む）の投与である。有用な細胞は、RIN、トランスフェクトされた細胞、または島細胞である。次いで、タンパク質の発現に対する試験化合物の効果は、2Dゲル電気泳動によってアッセイされ得る。別のスクリーニングモデルは、糖尿病の発症の危険性を有する哺乳動物を使用するインビボの方法である。簡潔には、糖尿病の増大した危険性を有する哺乳動物（例えば、糖尿病の傾向があるBBラット、またはNODマウス）が、試験化合物に曝され、そして糖尿病の発症に対する試験化合物への暴露の効果が決定される。糖尿病の発症は、１つ以上の糖尿病媒介タンパク質の発現を決定することによって発症の期間にわたってモニターされ、そして疾患の発病の時間と、疾患の発症の非存在下での発現および時期とを比較することによって比較され得る。１つ以上の糖尿病媒介タンパク質の発現の決定は、糖尿病媒介タンパク質自体、翻訳後の改変産物、および／または糖尿病媒介タンパク質分解産物を含む。１つの実施態様において、糖尿病媒介タンパク質の活性化は、試験サンプル中の糖尿病媒介タンパク質発現のレベルを測定することによって決定される。適切な試験サンプルとして、体液（例えば、血液、尿、または髄液）、またはそれらに由来する液体（例えば、血漿または血清）が挙げられる。特定の実施態様において、試験サンプル中のタンパク質発現のレベルは、ウエスタンブロット分析によって測定される。サンプル中に存在するタンパク質は、ゲル電気泳動によって分画され、メンブレンに移され、そしてタンパク質（単数または複数）に特異的な標識抗体でプローブされる。別の特異的な実施態様において、糖尿病媒介タンパク質の発現レベルは、ノーザンブロット分析によって測定される。ポリアデニル化［poly (A)⁺］mRNAが試験サンプルから単離される。mRNAは、電気泳動によって分画され、そしてメンブレンに移される。メンブレンは、標識cDNAでブローブされる。別の実施態様において、タンパク質発現は、発現されたmRNAに対して適用された定量的PCRによって測定される。より特定の実施態様において、糖尿病を発症し得る哺乳動物は、糖尿病の発病率を増大させるために交配された哺乳動物株から選択される哺乳動物である。好ましくは、哺乳動物は、69±25日で75％の糖尿病の発病の機会を示す株から選択される。より好ましくは、哺乳動物は、予想される時間内に糖尿病の高い発病率を示すように操作されたトランスジェニック哺乳動物である、特定の実施態様において、トランスジェニック哺乳動物は、70±10日で80％の糖尿病の発病率を示し；より好ましくは、60±５日で90％の糖尿病の発病率を示し；最も好ましくは、55±５日で95％の糖尿病の発病率を示し；そしてなおより好ましくは、50±５日で97％の糖尿病の発症率を示す。なお別の局面において、本発明は、内因性の有害タンパク質の発現を抑制または減少させ得る化合物を同定するための方法、および内因性の有害タンパク質の発現を抑制または減少させ得る化合物の治療有効量を投与することによって糖尿病を予防および／または処置する方法を提供する。本発明の糖尿病媒介タンパク質はまた、糖尿病媒介タンパク質活性を調節する試薬をスクリーニングするために有用である。従って、１つの局面において、本発明は、糖尿病媒介タンパク質を発現する細胞を試験試薬とともにインキュベートし、そして糖尿病媒介タンパク質の合成、リン酸化、機能、または活性に対する試験試薬の効果を測定することにより、糖尿病媒介タンパク質の活性を調節する試薬を同定する方法を特徴とする。糖尿病媒介タンパク質の活性化がリン酸化を介する場合、試験試薬は、糖尿病媒介タンパク質と、γ標識-ATPまたは［³⁵S ］メチオニンのいずれかとともにインキュベートされ、そしてリン酸化の速度が決定される。別の実施態様において、試験試薬は、糖尿病媒介タンパク質ポリヌクレオチド発現ベクターでトランスフェクトされた細胞とともにインキュベートされ、そして糖尿病媒介タンパク質の転写に対する試験試薬の効果がノーザンブロット分析によって測定される。さらなる実施態様において、糖尿病媒介タンパク質の合成に対する試験試薬の効果が、糖尿病媒介タンパク質に対する抗体を使用するウェスタンブロット分析によって測定される。なお別の実施態様において、糖尿病媒介タンパク質活性に対する試薬の効果が、糖尿病媒介タンパク質を、試験試薬、［³²P］-ATP、および糖尿病媒介タンパク質経路の基質とともにインキュベートすることによって測定される。全ての実験は、タンパク質発現の調節を決定するために、通常の［₃₅S］メチオニン標識した細胞と比較される。基質のリン酸化の速度は、当該分野で公知の方法によって決定される。用語、糖尿病媒介タンパク質活性の調節は、アゴニストおよびアンタゴニストを含む。本発明は、有害タンパク質の活性を阻害する試薬をスクリーニングするために特に有用である。このような試薬は、糖尿病の処置または予防に有用である。Ｖ．治療適用本発明は、治療有効量の防御糖尿病媒介タンパク質を投与することによる、哺乳動物において糖尿病を予防および／または処置するための方法を提供する。好ましくは、哺乳動物は、糖尿病の危険性を有するヒト被験体である。同定した糖尿病媒介タンパク質および関連する糖尿病治療薬を使用する薬物スクリーニング。本発明の薬物スクリーニングアッセイにおいて、同定した防御または有害糖尿病媒介タンパク質が、それらの発現をもたらし得る試験化合物を同定するために使用される。そのように同定された試験化合物は、危険性を有する被験体における糖尿病の発病を妨げる、緩和する、または遅延させるための候補治療薬である。糖尿病媒介タンパク質の発現をもたらしる試験治療化合物は、以下であり得るがこれらに限定されない：核酸、化合物、タンパク質、エレメント、脂質、抗体、糖類、放射性同位元素、炭水化物、画像化剤、リポタンパク質、糖タンパク質、酵素、検出可能なプローブ、および抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つ。これらは、本明細書中に記載のように、抗体を標識するために検出可能に標識され得る。このような標識として以下が挙げられるが、これらに限定されない：酵素標識、放射性同位元素または放射活性化合物またはエレメント、蛍光化合物または金属、化学発光化合物および生物発光化合物。治療化合物は、防御タンパク質の発現を誘導または増強し、その結果、糖尿病の発症の危険性を有する被験体において疾患の発症を予防または遅延させるその能力によって、本発明の薬物スクリーニングアッセイにおいて同定される。候補の治療化合物がまた、有害タンパク質の発現を妨げるかまたは減少させ、その結果、糖尿病の発症の危険性を有する被験体において疾患の発症を妨げるかまたは遅延させるその能力によって、同定される。治療化合物としての治療用核酸は、標的細胞に対して少なくとも1つの以下の治療効果を有するが、これらに限定されない：有害タンパク質のDNA配列の転写の阻害；有害タンパク質のRNA配列の翻訳の阻害；有害タンパク質に対応するRNA またはDNA配列の逆転写の阻害；タンパク質の翻訳後修飾の阻害；防御タンパク質に対応するDNA配列の転写の誘導；防御タンパク質に対応するRNA配列の翻訳の誘導；防御タンパク質に対応するRNAまたはDNA配列の逆転写の誘導；タンパク質または酵素としての核酸の翻訳；ならびに治療用核酸の構成的または一過性の発現のための標的細胞の染色体への核酸の組み込み。治療用核酸の治療効果は、以下を含み得るが、これらに限定されない：アンチセンスRNAまたはDNAのような、有害遺伝子をオフにするかまたはその発現をプロセシングする；ウイルスの複製または合成を阻害する；治療用タンパク質または対応する欠損タンパク質をコードする異種核酸を発現するような遺伝子治療；hn RNA、mRNA、tRNA、またはrRNAのようなRNAの欠損または過少発現を改変する；薬物、プロドラッグ、または糖尿病媒介タンパク質もしくはペプチドを発現する病理学的細胞もしくは正常細胞中の薬物もしくはプロドラッグのような化合物を生成する酵素をコードする；ならびに任意の他の公知の治療効果。防御糖尿病媒介タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供することによる遺伝子治療もまた、本発明に含まれる。本発明はさらに、インビボでの有害糖尿病媒介タンパク質の発現を阻害するポリヌクレオチドの治療有効量を投与するよって糖尿病を予防するための方法を含む。本発明の治療方法において、治療化合物は、ヒト患者に慢性的または急性的に投与される。必要に応じて、防御タンパク質が、治療化合物とは異なる経路で作用する、有効量の化合物と組み合わせて慢性的に投与される。本発明の治療化合物は、糖尿病の他の処置または糖尿病の管理方法と併用され得る。糖尿病を処置または予防するための治療化合物の治療処方物は、任意の生理学的に受容可能なキヤリア、賦形剤、または安定剤（Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版、Oslo，A.編、1980）を所望の純度で有する化合物と混合されることによって、凍結乾燥された塊または水溶液の形態での貯蔵のために調製される。受容可能なキャリア、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、そして以下を含む：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子（約10残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンのようなアミノ酸；一単糖、二単糖、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；EDTAのようなキレート化剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成カウンターイオン；ならびに／あるいはTween、Pluronics、またはポリエチレングリコール（PEG）のような非イオン性界面活性剤。化合物はまた、種々の非タンパク質ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレン）の１つに適切に、米国特許第4,640,835号、同第4,496,689号；同第4, 301,144号；同第4,670,417号；同第4,791,192号、または同第4,179,337号に示される様式で連結される。処方物中で使用されるキャリアの量は、約１〜99重量％、好ましくは、約80〜99重量％、必要に応じて90〜99重量％の間の範囲であり得る。インビボでの投与に使用される治療化合物は、滅菌でなければならない。これは、当該分野で公知の方法によって（例えば、凍結乾燥および再構成前のまたは後の滅菌の濾過メンブレンを通す濾過によって）容易に達成される。治療化合物は通常、凍結乾燥形態でまたは溶液中におかれる。治療組成物は一般に、滅菌の接触穴を有する容器（例えば、静脈内溶液バッグ、またはストッパー付きの刺し通すことができる皮下注射針のバイアル）内に入れられる。慢性の様式での治療化合物の投与は、例えば、以下の経路の１つである：静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、または病変内経路による注入または注射、経口、あるいはいかに記載されるような徐放システムを使用して。治療化合物は、クリアランス速度が十分に遅い場合は注射または周期的な大量瞬時投与によって連続的に投与されるか、あるいは血流またはリンパへの投与によって投与される。好ましい投与の態様は、目的の組織（β細胞または膵臓細胞）に対して指向され、その結果、供給源に対して分子を標的化し、そして化合物の副作用を最小にする。除放調製物の適切な例として、タンパク質を含有する固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられる。このマトリックスは、成形された粒子（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル）の形態である。徐放マトリックスの例として以下が挙げられる：ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（2-ヒドロキシエチル-メタクリレート）（Langerら、J．Biomed．Mater．Res．15:167-277 (1981)およびLanger Chem．Tech．12:98-105（1982）に記載される）、またはポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号、EP 58,481）、L-グルタミン酸およびγ-エチル-L-グルタミン酸塩のコポリマー（Sidmanら、 Biopolymers 22:547-556(1983)）、非分解性エチレンビニルアセテート（Langer ら、前出(1981)）、Lupron Depot^TMのような分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸-グリコール酸コポリマーおよびロイプロリド酢酸から構成される注射可能なマイクロスフェア）、ならびにポリ-D-(-)-3-ヒドロキシブチル酸（EP 13 3,988）。治療化合物はまた、調製されたマイクロカプセル中に、例えば、以下によって捕捉され得る：コアセルベーション技術または種間（interracial）重合（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセル、およびポリ-［メチルメタクリレート］マイクロカプセル）によって、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中、またはマイクロエマルジョン中。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences（前出）に開示されている。エチレン−ビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーが10 0日以上にわたって分子を放出し得るが、特定のヒドロゲルはより短期間に分子を放出する。カプセル化された分子が長期間体内に維持される場合、それらは、 37℃にて湿気に曝された結果、変性または凝集し得、生物学的活性の欠失および免疫原性の可能な変化を生じる。合理的なストラテジーは、例えば、適切な添加剤の使用および特定のポリマーマトリックス組成物の開発により、関与するメカニズムに依存して安定化のために工夫され得る。徐放組成物はまた、リポソームに捕捉された治療化合物（単数または複数）を含む。治療化合物（単数または複数）を含むリポソームは、それ自体が公知である方法によって調製される：DE 3,218,121；Epsteinら、Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 82:3688-3692（1985）；Hwangら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77：4030 -4034（1980）；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本国特許出願第83-118008号；米国特許第4,485,045号、および同第4,544,545 号；ならびにEP102,324。通常、リポソームは、小さい（約200〜800オングストローム）単層型であり、ここで脂質含量は、約30mol％コレステロールより大きく、選択された比率が、適切なアゴニスト治療のために調節される。適切な徐放処方物の特定の例は、EP647,449にある。治療的に使用される治療化合物の有効量は、例えば、治療目的、投与経路、および患者の状態に依存する。従って、医師は、適切な治療効果を得るために必要な場合は、投与量を滴定することおよび投与経路を改変することが必要である。２つの治療化合物がともに投与される場合、これらは、同じ経路で、そして同じ処方物中で投与される必要はない。しかし、これらは、所望される場合は、１つの処方物中で組み合わされ得る。両方の治療化合物が、それぞれの有効量で、またはそれぞれ最適に満たないが組み合わされた場合は効果である量で、患者に投与され得る。１つの実施態様において、両方の治療化合物の投与は、使用されるタンパク質の型に依存して、例えば、静脈内または皮下手段を使用して注射による。代表的には、医師は、投与量が糖尿病の処置または予防について所望の効果を達成する量に到達するまで、治療化合物（単数または複数）を投与する。例えば、この量は、糖尿病の症状を緩和し、そして正常血糖を回復する量である。この治療の進行は、従来のアッセイによって容易にモニターされる。本発明のこの局面の特異的な実施態様において、治療化合物は、gal-3をコードする防御糖尿病媒介遺伝子および／またはgal-3の翻訳後改変産物である。代表的な、単独で使用される治療化合物の１日の投与量は、上記の因子に依存して患者の体重あたり約１μg/kg/日〜100mg/kg/日の範囲またはそれ以上であり、好ましくは約10μg/kg/日〜50mg/kg/日である。遺伝子治療。本発明はまた、防御ポリペプチドによって改善されるかまたは緩和される糖尿病および糖尿病関連障害の処置のための遺伝子治療を提供する。このような治療は、インシュリン産生細胞への防御ポリヌクレオチドの導入によってその治療効果を達成する。防御ポリヌクレオチドの送達は、キメラウイルスのような組換え発現ベクター、またはコロイド状分散システムを使用して達成され得る。配列の治療的送達には、標的化リポソームの使用が特に好ましい。本明細書中で教示される遺伝子治療のために利用され得る種々のウイルスベクターとして、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、または好ましくは、レトロウイルスのようなRNAウイルスが挙げられる。好ましくは、インビトロの細胞の形質転換のためのレトロウイルスベクターは、マウスまたはトリのレトロウイルスであるアデノウイルスの誘導体である。他のトランスフェクション法と比較してアデノウイルス形質導入の利点は、高いトランスフェクション効率および全島をトランスフェクトする能力である。さらに、発現のレベルが、使用されるウイルスの濃度および形質導入時間によって調節され得る。アデノウイルス媒介発現は一過性であるが、島内での発現は、少なくとも数週間の間安定である（Beckerら、J．Biol．Chem．269:21234(1994)；Korbuttら、Transpl antation Proc．27:3414(1995)）。哺乳動物へのトランスジーンの安定な組み込みのために、レトロウイルスベクターが好ましい。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス（MoMuLV）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（HaMuSV）、マウス乳腫瘍ウイルス（MuMTV）、およびラウス肉腫ウイルス（RSV）。好ましくは、被験体がヒトである場合、gibbonサル白血病ウイルス（GaLV）のようなベクターが利用される。多数のさらなるレトロウイルスベクターが、複数の遺伝子を取り込み得る。これらのベクターの全てが、選択マーカーの遺伝子を導入または取り込み得、その結果、形質導入した細胞が同定および作成され得る。特定の標的細胞に対するレセプターのリガンドをコードする別の遺伝子とともにウイルスベクター中に目的の糖尿病媒介タンパク質を挿入することによって、例えば、ベクターは、ここで標的特異的になる。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質を付着させることによって標的特異的にされ得る。好ましい標的化は、レトロウイルスベクターを標的化する抗体を使用して達成される。当業者は、レトロウイルスゲノムに挿入され得るかまたはウイルスエンベロープに付着され得る特異的なポリヌクレオチド配列が、防御ポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能にするか、または過度の実験を行うことなく容易に確認し得る。組換えレトロウイルスが欠損であるので、これらは、感染性ウイルス粒子を産生するために補助を必要とする。この補助は、例えば、LTR中の調節配列の制御下にレトロウイルスの構造遺伝子の全てをコードするプラスミドを含むヘルパー細胞株を使用することによって、提供され得る。これらのプラスミドは、キャプシド化のためにRNA転写物を認識するパッケージング機構を可能にするヌクレオチド配列を欠いている。パッケージングシグナルの欠失を有するヘルパー細胞株として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：例えば、ψ2、PA317、およびPA12。これらの細胞株は空のビリオンを産生する。なぜなら、ゲノムがパッケージングされないからである。レトロウイルスベクターは、パッケージングシグナルは完全であるが、構造遺伝子は他の目的の遺伝子と置き換えられているこのような細胞に導入される場合、ベクターはパッケージングされ得、そしてベクタービリオンが産生される。あるいは、NIH 3T3または他の組織培養細胞は、従来のリン酸カルシウムトランスフェクションによってレトロウイルス構造遺伝子gag、pol、およびenvをコードするプラスミドで直接トランスフェクトされ得る。次いで、これらの細胞は、目的の遺伝子を含有するベクタープラスミドでトランスフェクトされる。得られる細胞は、培養培地にレトロウイルスベクターを放出する。防御ポリヌクレオチドの別の標的化された送達システムは、コロイド状分散システムである。コロイド状分散システムとして、マクロ分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質に基づくシステムが挙げられる。本発明の好ましいコロイド状システムは、リポソームである。リポソームはインビトロおよびインビボでの送達ビヒクルとして有用な、人工的な膜ビヒクルである。0.2 〜4.0μmの大きさの範囲である大きな単層ベシクル（LW）が、大きなマクロ分子を含有する水性緩衝液の実質的な割合をカプセル化し得る。RNA、DNA、および完全なビリオンは、水溶性の内部にカプセル化され得、そして生物学的に活性な形態で細胞に送達され得る（Fraleyら、Trends Biochem．Sci．6:77(1981)）。哺乳動物細胞に加えて、リポソームは、植物、酵母、および細菌細胞中でポリヌクレオチドを送達するために使用されている。リポソームが有効な遺伝子送達ビヒクルであるために、以下の特性が存在するべきである：（１）それらの生物学的活性を損傷することなく、高い効率で目的の遺伝子をカプセル化する；（２）非標的細胞と比較して、標的細胞に対する、優先的および実質的な結合；（３）高い効率で標的細胞の細胞質にベシクルの水溶性内容物を送達する；および（４）遺伝情報の迅速および効果的な発現（Manningら、Biotechniques 6:682(1988)）。リポソームの組成物は、通常、リン脂質の組み合わせであり、通常は、ステロール（特に、コレステロール）と組み合わせた、特に、高い相転移温度のリン脂質の組み合わせである。他のリン脂質または他の脂質もまた使用され得る。リポソームの生理学的特性は、pH、イオン強度、および二価カチオンの存在に依存する。リポソームの産生に有用な脂質の例として、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジル-グリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシド）が挙げられる。脂質部分が14〜18個の炭素原子（特に、16〜18個の炭素原子）を含み、そして飽和している、ジアシルホスファチジルグリセロールが特に有用である。例示的なリン脂質として、卵のホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン（dipalm itoylphosphatidylcholine）およびジステロイルホスファチジルコリンが挙げられる。リポソームの標的化は、構造的および機械的因子に基づいて分類され得る。構造的分類は、選択性（例えば、器官特異性、細胞特異性、および細胞小器官特異性）のレベルに基づく。機械的標的化は、それが受動的または能動的のいずれであるかに基づいて、区別され得る。受動的な標的化は、シヌソイド毛細血管を含む器官の網内皮系（RES）の細胞に分布するリポソームの天然の傾向を利用する。一方、能動的な標的化は、特異的なリガンド（例えば、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、またはタンパク質）へのリポソームのカップリング、あるいは天然に生じる局在部位よりも、器官および細胞型に対する標的化を達成するためのリポソームの組成物または大きさを変化させることによる、リポソームの変更を含む。標的化送達系の表面は、種々の方法において改変され得る。リポソーム標的化送達系の場合、脂質の群は、リポソーム二重層と安定に会合した標的リガンドを維持するために、リポソームの脂質二重層に取り込まれ得る。種々の架橋基が、標的リガンドへの脂質側鎖の連結のために使用され得る。治療化合物の生物学的活性が、二次的な治療化合物の合成を増強するので、このような二次的なタンパク質の発現に関連する障害への適用を含む、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用する種々の適用が存在する。本発明は、有害糖尿病媒介遺伝子の発現または活性の調節により改善または緩和される、糖尿病および糖尿病関連障害の処置のための方法を提供する。本発明のこの局面の１つの特異的な実施態様において、有害糖尿病媒介遺伝子は、モルタリンをコードする。用語「調節」は、モルタリンの発現の抑制を想定する。有害タンパク質の発現の抑制（例えば、モルタリンの抑制）が所望される場合、翻訳レベルでモルタリンの発現を妨害する核酸配列が、使用され得る。このアプローチは、例えば、アンチセンス核酸、リボザイム、または特異的なモルタリンmRNAの転写もしくは翻訳をブロックする三部（triplex）試薬を、そのmRNAをアンチセンス核酸もしくは三部試薬でマスクするか、またはリボザイムでそれを切断するかのいずれかによって利用し得る。アンチセンス核酸は、特定のmRNA分子の少なくとも一部に相補的である、DNA またはRNA分子である（Weintraub Scient1fic American 262:40(1990)）。細胞中で、アンチセンス核酸は対応するmRNAにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。アンチセンス核酸は、mRNAの翻訳を妨害する。なぜなら、細胞は、二本鎖であるmRNAを翻訳しないからである。約15ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。なぜなら、これらは、容易に合成され、そして標的のモルタリン産生細胞に導入された場合により長い分子よりも問題を生じる可能性が少ないからである。区画（stall）転写のためのオリゴヌクレオチドの使用は、三部ストラテジーとして公知である。なぜなら、オリゴマーが二重らせんのDNAのまわりに撒きついて三本鎖ヘリックスを形成するからである。従って、これらの三部化合物は、選択された遺伝子上の独特の部位を認識するように設計され得る(Maherら、Anti sence Res．and Dev．1:227(1991)；Helene、Anticancer Drug Design、6:569(1 991))。リボザイムは、DNA制限エンドヌクレアーゼに類似な様式で、他の１本鎖RNAを特異的に切断するための能力を保有する、RNA分子である。これらのRNAをコードするヌクレオチド配列の改変を介して、RNA分子中の特異的なヌクレオチド配列を認識し、そしてそれを切断する分子を操作することが可能である（Cech J．Am er.Med.Assn．260:3030（1988））。このアプローチの主要な利点は、それらが配列特異的であるので、特定の配列を有するmRNAのみが不活性化されることである。リボザイムの２つの基本的な型、すなわち、テトラヒメナ型（Hasselhoff Nat ure 334:585（1988））および「ハンマーヘッド」型が存在する。テトラヒメナ型リボザイムは、４塩基長である配列を認識し、一方「ハンマーヘッド」型リボザイムは、11〜18塩基長の塩基配列を認識する。認識配列が長くなるほど、配列が標的mRNA種に排他的に生じる可能性は高くなる。その結果として、ハンマーヘッド型リボザイムは、特定のmRNA種を不活性化するために、テトラヒメナ型リボザイムよりも好ましく、そして18塩基の認識配列は、より短い認識配列よりも好ましい。抗モルタリン抗体、またはモルタリンアンチセンスポリヌクレオチドのいずれかで、モルタリン作用をブロックすることは、糖尿病を遅延または改善するために有用であり得る。防御的なポリヌクレオチドを送達するための上記の方法は、望ましい場合、モルタリンの発現および／または活性を特異的にブロックするためのモルタリンアンタゴニストを送達するために、十分に適用可能である。モルタリンアンタゴニストは、モルタリン抗体、アンチセンスポリヌクレオチド配列、またはモルタリンの発現を抑制もしくは阻害する化合物であり得る。糖尿病媒介性タンパク質の同定および特徴づけ高い分離能の二次元（2D）ゲル電気泳動が、約2500個のタンパク質スポットを分離するために使用され得、各スポットは分子量およびpIに従うタンパク質に相当する。81％の定性再現性を伴って、1373個のWFラットの島タンパク質のコンピューター化された2-Dゲルデータベースが、最近、報告されている（AndersenらD iabetes 44:400-407（1995））（図１Ａ〜１Ｂ）。IL-1βは、インビトロでインキュベートされたBB-DP島細胞において、82個のタンパク質の発現の変化を誘導することが示されている。糖尿病の発病後に動物から採取されたBB-DP島のインビトロインキュベーションは、IL-1βに応答することが決定された82個のタンパク質のうちの33個が、糖尿病の発病時に、発現の有意な変化を示すことを示す。 2Dゲル分析、およびペプチド配列決定、または質量分析解析の結果に基づいて、いくつかの候補糖尿病媒介性タンパク質が同定されて（表１）、そしてラットおよびヒトの島細胞からクローン化されており、iNOS、モルタリン、およびガレクチン-3を含む（MadsenらInsulin secretion and pancreatic B cell research 、P.R.FlattおよびS.Lenzen編、Smith-Gordon、USA、61-68頁（1994））。マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（MnSOD）は、アデノウイルス媒介性の遺伝子移入および発現を使用して、β細胞および全ランゲルハンス島にトランスフェクトされている。トランスフェクションは、安定なまたは一時的にトランスフェクトされた細胞の生成を含む。トランスフェクション、サブクローニング、およびCMVまたはインスリンプロモーターの制御下で、目的のタンパク質のコード領域またはアンチセンス画分を発現する安定なRINクローンの樹立後、目的の糖尿病媒介性タンパク質は、機能的に特徴づけられる。予備的な結果は、RIN細胞における100%の形質導入、および単離された島における70%までの形質導入を示す。最初に、トランスフェクトされた細胞におけるタンパク質の増加または減少した発現が、NO生成、インスリン分泌、および／または細胞傷害性の測定によって、インビトロで特徴づけられる。さらに、細胞周期およびミトコンドリア活性は、FACS分析（Mandrup-Poulse nらDiabetes/Metabolism Reviews 9:295-309（1993））によって、および多重PC R（NerupらAnales Espanoles Pediatria 58:40-41（1994））により特徴づけられる遺伝子発現の半定量的分析によって、決定され得る。さらに、タンパク質の過剰発現または過小発現の、ならびに翻訳後修飾の二次的な細胞影響は、トランスフェクトされた細胞の2Dゲル電気泳動によって特徴づけられ得る。この分析は、タンパク質の発現パターンにおけるIL-1β誘導性の変化における一次的な影響と、二次的な影響との間で区別がなされることを許容する。島細胞におけるIL-1β誘導性の変化を確立するために、NO生成およびインスリン放出を、IL-1β曝露、およびIL-1曝露から生じるタンパク質の変化を検出するための高い分離能の二次元ゲル電気泳動の後、インビトロでBB-DPのランゲルハンス島において測定した（実施例２）。コントロールの島におけるNO生成およびインスリン放出は、WF島において観察されたものに類似した。IL-1βは、NO生成を4.4倍、およびインスリン放出を3.4倍、阻害した。2Dゲル分析は、IL-1βが82 個のタンパク質の発現を変化させたことを示し−22個のタンパク質がアップレギュレートされ、および60個のタンパク質がダウンレギュレートされた。高い分離能の2DGEをまた使用して、30日齢のBB-DPラットに移植されたBB-DP島同族移植片における、タンパク質の変化を検出した（実施例３）。新しく糖尿病を発病したBB-DPラットからのBB-DP島同族移植片において、これらの82個のタンパク質のうち15個が発現のレベルを変化することが見出されたが、WF島同族移植片においては見出されなかった（実施例４）。インビトロでのタンパク質発現におけるIL-1β誘導性の変化を、BB-DP島同族移植片中の疾患発生のプロセスにおける（実施例４）、またはBB-DP島同種移植片拒絶における（実施例６）、タンパク質変化に比較した。新しく糖尿病を発病したBB-DPラットからのBB-DP島同族移植片において、これらの82個のタンパク質のうち15個が発現のレベルを変化することが見出されたが、WF島同族移植片においては見出されなかった。同族移植された島における糖尿病の発病を伴って、変化した発現を示すタンパク質を、さらに特徴づけした（実施例５）。変化したタンパク質のスポットのうちの１つが、アミノ酸配列決定により、熱ショック70タンパク質（モルタリン）に高い相同性を有することが同定された。熱ショック70タンパク質は、核周辺から細胞質領域へのこの構成的に発現されるタンパク質のトランスロケーション後の、細胞死およびアポトーシスに関与することが実証されている（WadhwaらJ.Bi ol.Chem．268:6615および268.22239（1993））。アミノ酸配列に基づいて、モルタリンcDNAは、糖尿病発症におけるその関与のさらなる特徴づけのために、ラットおよびヒトの島からクローン化された。CMVプロモーター下での、ラットインスリノーマ（RIN）β細胞におけるモルタリンの過剰発現は、β細胞に致死的であった。別の糖尿病媒介性タンパク質は、ガレクチン-3として同定された。ガレクチン -3（gal-3）は、2Dゲルにおいて、スポットIS（２回リン酸化された）、スポット16（１回リン酸化された）、およびスポット19（リン酸化されなかった）として同定された（AndersenらDiabetes 44:400-407（1995））（実施例５）。gal-3 は、島発生およびアポトーシスの阻害に関与するタンパク質である。ヌクレオチド配列を用いて、gal-3は、ラットおよびヒトの島からクローン化され、サブクローン化され、そして安定なクローンの選択後、RIN細胞において発現された。g al-3を発現するRIN細胞は、増加した代謝活性および増殖速度を示し、サイトカインのネガティブな影響に対してより耐性になった。gal-3発現のインビボでの影響を、200の新生児の島を、30日齢の糖尿病傾向のBio-Breedingラット（BB-DP ）に移植することによって研究した（実施例８）。 NIGMS（National Institute of General Medical Science）のヒト／ラット体細胞ハイブリッドマッピングパネル番号２、およびgal-3遺伝子の第２イントロンからのプライマーを用いるさらなる研究は、gal-3を第14染色体にマップした。同じプライマーを用いて、P1クローンが、GenomeSystems，Inc.から得られ、F ISHについて使用した。48の測定で得られた最初のFISHの結果は、14q13領域に局在化された6.2%、14q21領域に局在化された54.2%、および14q22領域に局在化された39.6％を示した。これは、14q21.3領域における末端の位置を示す。誘導性の一酸化窒素シンターゼ（iNOS）がクローン化された（KarlsenらDiabe tes44:753（1995））。INOS遺伝子は、マウス第11染色体にマップされ、これはidd4領域の真ん中（糖尿病傾向のNODマウスにおける糖尿病連鎖領域として同定されている領域（GerlingらMammalian Genome 5:318（1994））にある。線維芽細胞において組換えタンパク質として発現された場合、組換えiNOSが酵素的に活性であることが見出された。マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（MnSOD）は、2Dゲル分析によって、ダウンレギュレートされるタンパク質として同定された。MnSODの発現は、アデノウイルス形質導入および移植後、インビトロおよびインビボでβ細胞および島細胞において、さらに特徴づけされた。ミトコンドリアイソクエン酸（isocltat e）デヒドロゲナーゼを糖尿病媒介性タンパク質として同定した。同種移植片拒絶と関連するタンパク質発現における変化がまた、測定された。 30日齢のWKラットへ移植された新生児のBB-DP島細胞は、12日後に回収され、そしてタンパク質の発現が測定された（実施例６）。WKラットにおけるBB-DP島同種移植片において、82個のタンパク質のうちの９個が発現のレベルを変化したことが見出されたが、WF島同族移植片においては見出されなかった。同族移植されたBB-DP島および同種移植されたBB-DP島の両方が、インビトロで BB-DP島のIL-1曝露の間、発現レベルを変化することが見出されたタンパク質に関して、移植されなかったBB-DP島と比較された。移植手順によって誘導されるタンパク質変化について制御するために、200の新生児のWF島が、30日齢のWFラットに移植された。コロニーにおいておよび同族移植されたBB-DPラットにおいて、糖尿病の発病の平均時間に対応する、移植後48日目に、移植片は回収された。IL-1インキュベーションの間に変化されることが以前に見出された105個のタンパク質に関して、WFコントロール島との比較について記載されたように、移植片は、プロセスおよび分析された。これは、IL-1および島同族移植の両方によって誘導性のタンパク質の変化を同定するために、ならびに拒絶特異的タンパク質を同定するためになされた。糖尿病病因論におけるこれらのタンパク質の潜在的な役割をさらに決定するために、ならびに治療的化合物、および治療的化合物の発現を誘導する化合物を同定するために、候補タンパク質をコードする遺伝子を保有し、そして組織特異的プロモーター下で候補タンパク質を発現し得る、トランスジェニック動物が作製される。本発明のトランスジェニック動物は、インスリンプロモーター、アミリンプロモーター、CMVプロモーター、またはHLAプロモーターのような特異的なプロモーター下で、候補タンパク質を発現する。最初に、ベクター誘導性の毒性の不在下での、アデノウイルス媒介性の、ランゲルハンス島への遺伝子移入について、至適な条件を決定するための研究が行われた。実施例Ｘに記載されるように、島のアデノウイルス媒介性の形質導入は、用量依存性の効率の良い遺伝子移入を生じ、毒性の不在下で、導入遺伝子を安定に発現した。実施例以下の実施例は、本発明の、キメラ遺伝子、トランスジェニックマウス、およびアッセイをどのように作製しそして使用するのかの完全な開示および説明を、当業者に提供するために記載され、そして本発明者らが、本発明者らの発明であると考える範囲を制限することを意図しない。使用される数に関して（例えば、量、温度など）正確性を確実するために努力がなされたが、いくつかの実験誤差が考慮されるべきであり、偏差は考慮されるべきである。他に記載しない限り、部は重量による割合であり、分子量は、量平均分子量であり、温度は摂氏においてであり、圧力は大気でまたは大気の近くである。実施例１。材料および方法試薬。ケタミンをPark-Davis（Barcelona、Spain）から、キシラジンをBayer 1、UK）から購入した。RPMI 1640、Hanks平衡化塩溶液（HBSS）、およびDMEMを、Gibco、Paisley、Scotlandから購入した。RPMI 1640は、11mmol D-グルコースを含み、20mM HEPES緩衝液、100,000IU/lペニシリン、および100mg/lストレプトマイシンが補充された。真正の組換えヒトIL-1βは、Novo Nordisk Ltd．(Bagsv aerd、Denmark)から提供され、400U/ngの比活性を有した。使用した他の試薬：2-メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン（BSA）、T ris HCl、Tris塩基、グリシン、（Sigma、St．Louls、USA）；トリクロロ酢酸（TCA）、リン酸、NaOH、グリセロール、n-ブタノール、ブロモフェノールブルー、ニトロプルシドナトリウム（SNP）、H₃PO₄、およびNaNO₂（Merck、Darmstad t、Germany)；フィルター類（HAWP 0.25mmの孔サイズ）（Millipore、Boston、U SA）；RNAse A、DNAse I （Worthington、Freehold、NJ、USA）；[³⁵S]-メチオニン（SJ 204、比活性：>1.000Ci/mmol、0.1% 2-メルカプトエタノールを含有す（Schwarz/Mann、Cambridge、MA、USA）；アクリルアミド、ビスアクリルアミド、TEMED、過硫酸アンモニウム（BioRad、Richmond、CA、USA）；両性電解質類： pH５〜７、pH3.5〜10、pH７〜９、pH8〜9.5（Pharmacia、Uppsala、Sweden）；N onident P-40（BDH、Poole、UK）；両性電解質類：pH５〜７およびドデシル硫酸ナトリウム（Serve、Heidelberg、Germany）；アガロース（Litex、Copenhagen 、Denmark）；エタノール（無水96％）（Danish Distillers、Aalborg、Denmark ）；メタノール（Prolabo、Brione Le Blanc、France）；酢酸（工業用、99％氷状）（Bie & Berntsen、Arhus、Denmark）およびＸ線フイルム（Curix RP-2）（ AGFA）。動物。30（28〜32）日齢のBB/Wor/Mol-BB2（BB-DP）ラット、Wistar Furth（W F）ラットおよびWistar Kyoto（WK）ラットを、Mollegarden、Ll、Skensved、De nmarkから購入した。Mollegardenにおいて、およびSteno Diabetes Center/Hage dorn Research Institute（Gentofte、Denmark）の動物施設において、BB-DPラットは、特定の病原体がいない環境において、別々に飼育された。全てのラットは、移植の５日前から屠殺されるまで、光（午前6:00〜午後6:00までの照明）、湿度（60〜70%）、および温度（20〜22℃）の制御された条件下、飼育された。ラットは、標準的なラットの食事（Altromin、Chr.Petersen A/S、Ringsted、De nmark）、および水道水への自由な接近を与えられた。４〜５日齢のBB-DPラットおよびWFラットを、島単離の日の午前中にMollegardenにて集め、そして動物輸送ボックスにおいて輸送した。移植手順および移植片回収。新生児の島を、以前に記載されるように（Korsgr enらJ.Clin.Invest．75:509-514(1990)）、滅菌条件下で28〜32日齢のレシピエントラットの腎臓被膜下に移植した。糖尿病発病率は、雄性および雌性のBB-DP マウスにおいて同様であったので（PriesらFrontiers in Diabetes Research：8 :19-24（Shafrir，E．編）、Smith-Gordon、London(1991)）、両方の性別を、等しく使用した。任意の性関連の不適合性に起因する移植片拒絶の潜在的な危険性を減少するために、雄性の島を、雄性レシピエントに移植し、および雌性の島を、雌性レシピエントに移植した（SteinerらElectrophoresis 16:1969-1976（199 5））。200（範囲：187〜215）の島を、10ml Transpferpettor（Brand、Germany ）ピペットを使用して、手で集めた。島を沈殿させ、そして可能な限り多くの上清を、１〜２mlの容量の移植のまえに除去した。レシピエントラットを秤量し、そして血液グルコース（BG）を測定した。次いで、ラットを、ケタミン（8.75mg /100g）およびキシラジン（0.7mg/100g）腹腔内で、麻酔した。小切開を、左腎臓上で行い、腎臓を前方に持ち上げ、そしてナイフを用いて小切開を行った。平らな器具を用いて、穴を被膜に穏やかに作製した。島を、腎臓下極に向って、被膜の下に置いた。筋肉および皮膚を縫合し、ラットを手術施設におけるかごの中で回復させ、そして動物施設に戻す前に、首中にTemgesic（0.01mg）皮下を与えた。移植後３日間、ラットに、毎日２回、Temgesicを与えた。血液グルコース（ BG）を、３日毎に測定した。ラットを、頸椎脱臼によって殺傷し、そしてその後即座に、移植された腎臓を取り出した。移植片を、顕微鏡下で腎臓および被膜から注意深く切開し、そしてHBSS中に置いた。移植片および島の標識化。移植片を回収後すぐに標識した。培養した島を、IL -1を伴うまたは伴わない、24時間のインキュベーションの後、標識した。移植片および島を、HBSS中で２回洗浄し、そしてアミノ酸に対して透析された10％ NHS 、および移植片について330mCi[35S]-メチオニン、または島について200mCi[35S ]メチオニンのいずれかを含有する、メチオニン非含有Dulbecco改変Eagle培地（ DMEM）の200ml中で、37℃で４時間、標識した。2-メルカプトエタノールを除去するために、[35]-メチオニンを標識化の前に少なくとも４時間、凍結乾燥した。標識後、移植片および島を、HBSS中で３回洗浄し、上清を除去し、そして組織を即座に-80℃で凍結した。サンプル調製。凍結された移植片を、乳鉢中で破砕した。移植片および島を10 0ml DNAse I/RNAse A溶液中に再懸濁し、そして２回の凍結−解凍によって溶解した。２回目の解凍後、核酸の消化のために、サンプルを氷上で30分間放置し、次いで一晩凍結乾燥した。サンプルを、120ml溶解緩衝液（8.5M尿素、２% Nonid ent P-40、５% 2-メルカプトエタノール、および２%両性電解質、pH範囲７〜９）中で、最小４時間、振とうすることによって溶解した。 [35S]-メチオニン取込みの測定。[35S]-メチオニン取込みの量を、10mg BSA（ 0.2mg/ml H₂O）をタンパク質キャリアとして、各サンプルの1:10希釈物の5mlに２連で添加し、次いで0.5mlの10％ TCAを添加することによって、定量した。これを30分間４℃で沈殿させ、その後0.25mm HAWPフィルターを介して濾過した。フィルターを乾燥し、そしてカウントのためにシンチレーション液中に置いた。 2-Dゲル電気泳動。この手順は、以前に記載されている（O'Farrellら、Cell 1 2:1133-1142(1977)）。簡潔には、１次元ゲルは、４%アクリルアミド、0.25%ビスアクリルアミドおよび両性電解質を含んだ。各サンプルの等数のカウント（10 6cpm）を、ゲルに適用した。より低い量の放射能の場合、比較可能な全体の光学密度が得られるように、ゲルの暴露時間を調節する必要があった。サンプルを、等電点電気泳動（IEF；pH3.5〜７）および非平衡pH勾配電気泳動（NEPHGE；pH6. 5-10.5）ゲルの両方に対して分析した。２次元ゲルは、12.5％アクリルアミドおよび0.063％ビスアクリルアミドを含み、そして一晩電気泳動した。電気泳動後、燥した。ゲルを、Ｘ線フィルムと接触させて置き、そして-70℃で３〜40日間、露光した。各ゲルを少なくとも３回の期間露光し、Ｘ線フィルムの動力学的範囲の損失について補った。 MWおよびpIの測定。タンパク質の分子量を、標準ゲルとの比較によって測定した。ゲル上の個々のタンパク質についてのpIを、pI検定キットによって測定した。目印のタンパク質を、以下の技術：イムノブロッティング、免疫沈降、微量配列決定、またはペプチドマッピングのうちの１つまたはいくつかによって、ゲル上に同定した。蛍光間接撮影のコンピューター解析。SunsparcワークステーションにおけるBi プログラムによって定量した。次いで、アンカーポイントをゲル上に置き（各ゲルにおける同じスポットは、同じアンカーポイントを割り当てられた）、そしてコンピューターでゲルを適合させた。コンピューターでの適合後、手動編集を行って、同定を確実にし、コンピューターの正確な適合によりスポットが見出され、そしてスポットの定量は、最初は、コンピュータープログラムによって見出されョン4.0）における算定のために導き出した。IEFおよびNEPHGE亜群における重複スポットの存在を回避するために、IEFゲルの塩基部分またはNEPHGEゲルの酸性部分のいずれかにおける重複するスポットを、解析から削除した。統計学的解析。Studentのｔ検定を適用し、そしてP<0.01を、有意性のレベルとして選択した。実施例２。インビトロでの亜硝酸塩およびインスリンの測定 BB-DP島におけるIL-1誘導性のタンパク質の変化を調査するために、150の新生児BB-DPラットの島を、150pg/mlのIL-1とともに、またはこれを伴わないで、24 時間インキュベートし、その後、培地を亜硝酸塩およびインスリンの測定のためにサンプリングした。島の２次元ゲル分析を下記のように行い、そして島の蛍光間接撮影をコンピューターで解析し（以下を参照、各群についてｎ=３）、そしてIL-1を曝露されたWFラットの島の以前に確立されたタンパク質データベースと比較した。島の単離および培養。４〜５日齢の近交系BB-DPラットおよびWFラットの膵臓からの島を、Brunstedtら（Methods in Diabetes Research、第１巻、Wiley & S ons、New York、254-288頁(1984)（本明細書中に参考として具体的に援用される））によって記載されるように、コラゲナーゼ消化後、単離した。RPMI 1640＋1 0%胎児ウシ血清中での前培養の４日後、島を以下のように培養した：150のBB-DP 島を、300ml RPMI 1640＋0.5%正常ヒト血清（NHS）中で、150pa/ml IL-18の添加を伴ってまたは伴わないで、24時間、37℃の加湿化された雰囲気の空気においてインキュベートした。別個の実験の系列において、200のBB-DPラットまたはWFラットの島を、300ml RPMI 1640＋0.5% NHS中で、移植の前に24時間インキュベートした。亜硝酸塩およびインスリンの測定。亜硝酸塩を、以前に記載されるように（Gr eenら、Anal．Biochem．126:131-138(1982)）、Griess試薬によって測定した。アッセイの検出限界は、１mmol/lであり、2pmol/島に対応した。島を含有しない対応の培地の亜硝酸塩レベルを、島非含有培地が検出限界を超えた場合、引き算した。実験を、同じアッセイにおいて行った。標準曲線上の３点から算定されたアッセイ内およびアッセイ間の変動係数は：１mmol/l：1.6%、16.3%；10mmol/l ：1.6%、15.3%；25mmol/l：1.5、17.0％であった。インスリンをRIAによって測定した（Yangら、Proc．Natl．Acad．Sci．93:6737-6742(1996)）。検出限界は、35fmol/mlであった。３つの公知のコントロール間のアッセイ内およびアッセイ間の変動係数は、Ａ：5.4%、12.5%；Ｂ：3.6%、10.2%；Ｃ：3.1%、9.4%であった。結果。2-Dゲル分析のために以前に使用された（Andersenら、前出(1995)）、ＢB-DP島とWF島との間の作用（蓄積されたインスリンの放出）およびIL-1に対する応答の点における比較可能性を確実にするために、NO生成およびインスリン放出を、IL-1を伴う、またはこれを伴わない24時間のインキュベーションの後、測定した。基底のインスリン放出およびNO生成は、WF島からのデータに類似した（基底のインスリン放出（WF島）3.3±0.5対（BB-DP島）2.0±1.1pmol^*島-1^*24時間-１、基底のNO生成＜2pmol^*島-１^*24時間-１（BB-DP島およびWF島の両方について）。IL-1は、蓄積された島インスリンの放出を3.4%倍阻害し、そして新生児 WFラットの島を用いて得られる結果に類似して、NO生成を4.4倍増加させた（IL- 1誘導性のNO生成：（WF島）9,29±1,21対（BB-DP島）8.91±1.05pmol^*島-1^*24時間-1、およびインスリン放出：（WF島）1,4±0,3対（BB-DP島）0,6±0.6pmol^*島 -1^*24時間-1、18、19）。 BB-DPラットの島±IL-1からの蛍光間接撮影の分析。新生児BB-DPラットの島ホモジネートの２次元ゲルのコンピューターベースの解析において、全1815（1275 個のIEFおよび540個のNEPHGE）個のタンパク質が12,5％アクリルアミドゲルの３つのうちの３つにおいて、見出された。IL-1とともに、24時間、インキュベートした新生児BB-DPラットの島において、1721（1171個のIEFおよび550個のNEPHGE ）個が３つのゲルのうちの３つにおいて、見出された。IL-1は、コントロール島に比べて、82個のタンパク質の発現レベルを有意に変化させることが見出され (P<0.01)；60個のタンパク質は発現レベルが減少し、および22個のタンパク質は発現レベルが増加した（P<0.01）(表１)。実施例３。動物移植モデル。実験１。最初に、IDDMの発症の間に生じる細胞性事象および分子性事象の調査のために同調モデルを作製するために、200の新生児BB-DPラットの島を単離し、そして30日齢のBB-DPラットの腎臓被膜下に移植した。血液グルコースを３日毎に測定し、そして糖尿病の発病率を測定した。移植後7、12、23、37、48、および173日目に、または糖尿病の発病時に、ラットを屠殺した（各群においてn=６）。移植片をインスリンおよび以下のMHCクラスI、II、αβ-TCR、CD4、CD8、またはED1うちの１つについて二重染色した。染色は、全移植片面積の百分率として（インスリン）またはmm²あたりの染色された細胞の数として、表した。インサイチュの宿主島を、同じ方法で染色し、そして島細胞の全数のうちの炎症を起こした島のパーセントとして表した。統計的解析を、Spearman Rank CorrelationおよびMann-Witneyで行った。結果。糖尿病の発病率（75%）または糖尿病の発症の日（69±25日）は、移植されなかったBB-DPラットと有意に異ならなかった。移植片およびインサイチュの島の両方において、浸潤する細胞の数の２〜３倍の増加が、12日目および37日目に見られた。移植の48日後、糖尿病を発症するラットについて、移植片およびインサイチュの島の両方において、それぞれ、前糖尿病のラットにおける37日目、および48日目での非糖尿病ラットと比較して、細胞の数が増加した（P<0.04）。移植片インスリン染色面積は、非糖尿病移植片において80〜90%であり、および糖尿病移植片において全移植片面積の30%であり、インスリン含量と細胞性浸潤とは逆比例した。全ての細胞型について、および全ての研究された時点で、宿主膵臓スライドガラスにおける浸潤された島の百分率と、同じ動物からの移植片における浸潤する細胞の数との間に、正の相関が見出された（P=0.002〜0.00001 ；r=0.4〜0.7）。実験２．200の新生児BB-DPラットの島を、30日齢のBB-DPラットの腎臓被膜下に移植した。Wister Furth島からWistar Kyotoラットへの同種異系移植を、コントロールとして同様に行った。移植された島は、IDDM発病率および疾患発病の時間に影響を与えなかった。糖尿病発病の日（78±５日）およびコントロールWK動物において17日目に、移植片を免疫組織化学および[³⁵S]-メチオニン標識化のために切り出した。結果。糖尿病BBラットからの移植片の免疫組織化学的実験は、MHCクラスIポジティブ細胞（1982/mm²±534）、マクロファージ（661/mm²±406）、T-ヘルパー細胞（1331/mm²±321）、細胞傷害性Ｔ細胞（449/mm²±117）との広範囲におよぶ炎症を実証し、およびインスリンポジティブ細胞は、移植片の33〜66$に減少した。同種異系移植のコントロールは、線維症を示し、単核細胞、MHCクラスII ポジティブ細胞（152/mm²）、MHCクラスIポジティブ細胞（48/mm²）、マクロファージ（172/mm²）、T-ヘルーパー細胞（254/mm²）、細胞傷害性Ｔ細胞（42/mm² ）の炎症をほとんど示さず、および残存細胞における100%のインスリン含量を示した。 2Dゲルのコンピューター解析はIL-1曝露によってインビトロで変化された33個のタンパク質のうちの18個の発現の、２倍を超える増加を示した。14個は、BB-D P動物における同族移植片に特異的であった。８個のタンパク質は、発現のレベルを特異的に変化した。実施例４。糖尿病発症によって誘導されるタンパク質発現における変化糖尿病発生の間のBB-DP島の同族移植片におけるタンパク質の変化を調査するために、200の新生児BB-DPラットの島を、30日齢のBB-DPラットに移植した。標識、２次元ゲル電気泳動および移植されていないBB-DP島とのコンピューターベースの比較のために、移植片を、糖尿病の発症時に回収した（連続２日間でBG>1 4mmol/lとして規定された、n=５）。新しく糖尿病を発症したBB-DPラットからの同族島移植片からの蛍光間接撮影の分析。新しく糖尿病を発症したBB-DPラットからのBB-DP島同族移植片において、コンピューター解析は、1818個のタンパク質（1259個のIEFおよび577個のNEPH GE）が、５つのゲルのうちの５つに存在することを示した。（これらのデータは、コントロールの新生児BB-DPラット島に比較した場合に、発現レベルが変化した（64個は発現レベルが増加し、そして131個は発現レベルが減少した）（P<0.01 、データ示さず）インビトロでの島および移植片の両方に存在する予備的なタンパク質である）。インビトロでIL-1インキュベーション後にBB-DPラットの島において発現のレベルが変化した、82個のタンパタ質のうちの71個が、移植片において再同定された。71個の再同定されたタンパク質のうちの33個は、糖尿病の発症時での島同族移植片において、発現レベルが有意に変化した（４個がアップレギュレートされ、29個がダウンレギュレートされた）（表２）。島WF同族移植片からの蛍光間接撮影の解析。移植手順自体によって引き起こされるタンパク質発現における変化を制御するために、WF島の同族移植片を、インビトロでWF新生児の島においてIL-1によって引き起こされるタンパク質の変化に比較した。インビトロでIL-1とともにインキュベートされたWF島において発現レベルが変化した、105個のタンパク質のうちの89個のタンパク質が、WFコントロール島と比較した場合、再同定されたのに対し、12個は、WF島移植片において存在しなかった（ｎ=３）。93個の再同定されたタンパク質のうちの42個は、発現のレベルが有意に変化した（27個が減少し、および15個が増加した、ｐ<0.01、表５）。インビトロでのIL-1誘導性のタンパク質は、疾患発生の間、または島− 移植片拒絶の間に、島−移植片において特異的に見られた。インビトロでのIL-1 インキュベーション後に島における発現のレベルが変化することが見出され、および同族移植されたWF島において発現のレベルの有意な変化が見出されなかったタンパク質は、同族移植されたBB-DP島において見出された場合、疾患の発生に特異的であると示されるか、またはWKラットへ同種移植されたBB-DP島において見出された場合、移植片拒絶に特異的であると示された。同族移植されたBB-DP 島における28個のタンパク質、および同種移植されたBB-DP島における29個のタンパク質は、発現のレベルが変化した（データは示さず）。BB-DP同種移植片における14個のタンパク質、およびWKラットにおけるBB-DP同族移植片における８個のタンパク質は、特異的に発現のレベルが変化した。実施例５。糖尿病媒介性タンパク質の特徴づけ合成のIL-1β誘導を示すタンパク質を、以下に記載するように、質量分析および微量配列決定によって分析した。市販のタンパク質データベースを、適合性について検索し、これらは、SWISS-PROT、PIR、NIH、およびGENEBANKを含んだ。微量配列決定。2DGEによって、糖尿病媒介性タンパク質として同定されたタンパク質スポットを、公知の方法に従って、ゲル中でトリプシンで消化し、濃縮し、HPLC分離し、ピークを配列決定し、そして部分配列を、公知の配列と比較することによって、さらに特徴づけした。微量配列決定の結果は、以下のようである：タンパク質22（ピーク22）：AQYEELIANG(D)(M)(配列番号５) （ピーク13）：KKPLVYDEG(K)(配列番号６) タンパク質25（ピーク15）：LLEXTXXLX(配列番号７) （ピーク16）：PSLNSXEX(配列番号８) ガレクチン-3（ピーク22）：IELXEIX(配列番号９) １つのタンパク質（分子量68,700）の直接的な配列決定は、以下の部分配列を生じた：PEAIKGAVVGIDLG(配列番号10)(表２：GR75)。このタンパク質は、75kDグルコース調節タンパク質（GR75、表２）（PBP74、P66mot、モルタリン）に高い相同性を示し；hsp70タンパク質ファミリーの構成メンバーであり、非熱誘導性であり；異なる組織において偏在的に発現され；75kDが66kDにプロセスされるの 46残基のリーダーペプチドを含み；ミトコンドリアにおいて見出され；細胞死と、および抗原提示と関連する。１つのタンパク質は、ガレクチン-3と同定され、これはいくつかの組織に存在する27kDのタンパク質であり、プレmRNAスプライシング因子としての役割を有することが知られている。ヒトgal-3のアミノ酸配列を、図５（配列番号４）に示す。質量分析。インサイチュ消化を、本発明に従う少なくとも１つのゲルにおいて少なくとも１つのタンパク質スポットを含む、少なくとも１つのゲルプラグに対して行う。FeyらElectrophoresis18:1-12(1997)に記載されるように、Rosenfeld らAnal.Biochem.203:173-179(1992)の方法の改変によって（これらの両方は、本明細書中に参考として詳細に援用される）ゲルを調製する。簡潔には、ゲルを迅速に染色し、そして脱染色する。￥メスでタンパク質を含有するゲルバンドを切断し、そしてUHQ水を含有するエッペンドルフチューブに-20℃で保存することによって、目的のタンパク質を得る。40％アセトニトリル／60%消化緩衝液中で、クマシー染色が除去されるまで、少なくとも１時間、ゲルプラグを洗浄することによって、タンパタ質を消化する。この洗浄は、クマシー染色、ゲル緩衝液、 SDS、および塩を除去する。必要であれば、洗浄は反復され得る。次いで、ゲルプラグを、プラグが縮み、そして表面が白くなるまで、真空遠心機で、20〜30分間、乾燥させる。乾燥時間は、ゲルプラグのサイズおよび厚さに依存する。トリプシン（または使用する酵素）を、消化緩衝液に溶解し、そして５mlをゲルプラグに添加する（分析されるべきゲル中のタンパク質の量（0.1mg）に依存する）。さらなる消化緩衝液を、ゲルプラグが、チューブの底において、緩衝液にほとんど覆われるまで添加する（約10ml）。次いで、ゲルプラグを、37℃で６時間または一晩インキュベートし、次いで70〜100ml 160%アセトニトリル／40%水とともに、２〜６時間インキュベートして、ペプチドを抽出する。抽出は、回収を増大するために反復され得る。次いで、抽出物を凍結乾燥し、そしてMALDI-MSによって分析する前に、30%アセトニトリル／２%TFA中で溶解する。図６〜48は、表１および２に示されるタンパク質について得られた、質量分析のデータを提供する。実施例６。同種移植片拒絶の間のインビボでのタンパク質の発現拒絶の間のBB-DP島同種移植片におけるタンパク質の変化を調査するために、2 00の新生仔BB-DPラットの島を、30日齢のWKラットに移植した（N=３）。実質的な単核浸潤が予測される時点の、移植後12日目に移植片を回収した。移植片を、上述のようにプロセスし、そして分析した。 WKラットにおけるBB-DP島同種移植片からの蛍光光度分析。移植後12日目に、移植片において単核細胞の浸潤が観察され(18)、そしてこの時点でサンプリングされたBB-DP島同種移植片からの蛍光光度のコンピューター解析は、1714（1064I EFおよび650 NEPHGE）個のタンパク質が、３つのゲルのうちの３つに存在することを示した。BB-DP島同種移植片のゲルを、インビトロでのIL-１のインキュベーション後にBB-DP島における発現のレベルが有意に変化した82個のタンパク質に関して、新生仔のBB-DPラットの島のゲルに比較した。82個のタンパク質のうちの66個が再び同定された。66個の再び同定されたタンパク質のうちの33個が、発現レベルを変化することが見出された（28個が減少し、そして５個が増大した。p<0.01）。実施例７。島細胞における非毒性のアデノウイルス媒介性の遺伝子移入の確立。ベクター誘導性の毒性の不在下での、ランゲルハンス島へのアデノウイルス媒介性の遺伝子移入についての至適な条件を決定するために、新生仔ラットの島を、島あたり、０、10、100、および1000pfuの感染多重度（moi）の用量で、アデノウイルスベクターβ-ガラクトシダーゼ（AdβGal）を用いて、３連で、25の群において形質導入した。遺伝子移入の効率を、おおまかな検査によって測定し、そして形質導入後１、４、７、および10日目での島分散後の、6-ガラクトシダーゼポジティブ細胞のパーセントによって評価した。簡潔には、島の毒性を、各時点での蓄積されたインスリンレベルを測定することによって、ならびに３および 10日目での高血糖症に応じてインスリン放出を評価することによって、評価した。結果。島への効率の良い用量依存性の遺伝子移入を、形質導入後１、４、７、および10日目で記録した。１日目で、moi10、100、1000にて、それぞれ、分散された島における8.3%、34.1%、および58.6%の細胞が、導入遺伝子を発現した。導入遺伝子発現は、実験の持続時間について安定であった。インスリン蓄積は、各時点で、形質導入された島と形質導入されない島との間で、差異はなく；そして 10日目で発現された蓄積されたインスリンは、島あたりのインスリンnmolとして、14.3±1.5（0のmoiで）、15.0±2.6（10のmoiで）、22.0±7.8（100のmoiで）、および15.3±1.5（1,000のmoiで）であった。同様に、グルコースに対するインスリン分泌応答は、高いグルコースインキュベーションに対するインスリン応答を、低いグルコースインキュベーションに対するインスリンの応答で割ることによって得られ、研究した全ての用量で、３日目での形質導入された島および形質導入されない島において、類似であった（mo d０；12.7±4.1；moi10、14.9±7.9；moi100、15.7±0.7；およびmoi1,000．22. 3±6.7）。形質導入後10日目で、形質導入された細胞および形質導入されない細胞における比率は類似であった。実施例８。IDDMの自然発症におけるガレクチン-3の発現。 200の新生仔BB-DPラットの島を、30日齢のBB-DPラットの腎臓被膜下に移植した。移植片を、移植の７日後（前糖尿病、n=６）、糖尿病発病時（n=６）、または移植の174日後（糖尿病を免れた動物、n=３）に回収し、そしてIL-1β刺激しした新生仔BB-DP島およびIL-1β刺激しなかった新生仔BB-DP島を、[35S]-メチオニンで標識し、そして高い分離度の２次元ゲル電気泳動のために調製した。各サンプルを、等電点電気泳動（IEF、pH3.5〜７）および非平衡pH勾配電気泳動（NEPHGE、pH6.5〜10.5）について行った。ゲルの蛍光光度を、上述のように分析した。タンパク質の発現レベルにおける変化は、0.01よりも低いｐ値で有意性を考慮された（Studentのｔ検定）。結果。インビトロで11-1βで刺激された新生仔BB-DP島は、82個のタンパク質における変化を示した。これらのタンパク質のうちの97〜98％は、全ての時点で、全ての移植片において同定された。インビトロでの刺激されない正常なBB-DP 島と比較された移植片タンパク質の発現レベルは、以下の変化を示した：新生仔島細胞をインビトロでIL-βで処理した場合、増大した発現を示す82個のタンパク質のうちの42個が７日目の移植島において増大し、31個が糖尿病の発病とともに増大し、そして14個が糖尿病を発症しなかった動物において増大した。増大したタンパク質のうち、それらのうち４個が、IDDMの発病時にのみ見られ、そして詳述される時点で見られない。７日目に、インビトロでのIL-8曝露で変化しない５個のタンパク質が、変化することが観察されたが、２個のタンパク質は、糖尿病の発症時に変化することが観察され、そして３個のタンパク質が、糖尿病を発症しなかった動物において観察された。インビボで変化するが、インビトロで変化しないことが観察されたタンパク質のうちの、これらの１個が、IDDM特異的であるとして同定された。Gel-3発現は、７日目およびIDDMの開始時で、顕著にダウンレギュレートされた。対照的に、gal-3発現は、インビトロでIL-1β刺激された島において、および糖尿病を発症しなかった動物からの移植片において、増大された。実施例９。インスリン産生細胞における、IL-1変換酵素（ICE）、誘導性の一酸化窒素シンターゼ（iNOS）、およびアポトーシスのサイトカイン誘導。 ICE、iNOSの発現、およびアポトーシスの誘導を調査した。ラットインスリノーマおよび多能性細胞株のRIN-SAHおよびMSL-G2を、20時間、サイトカインの混合物（IL-1β、TNFoα、およびIFNγ）とともに培養し、RNAを単離し、そしてIC E、iNOS、およびSP-1（正規化のためのハウスキーピングコントロールとして使用される、一般的な転写因子）に対するプライマーを用いて、多重PCR分析（27 サイクル）を形成した。ゲル電気泳動分離、およびPhosphorImager定量後、結果を、SP-1 mRNA発現に対して正規化し、そしてケイ酸した。結果。ICE発現もiNOS発現も、コントロール細胞において見出されなかった。S P-1遺伝子産物のアップレギュレーションのレベルに対して顕著なアップレギュレーションが、サイトカイン曝露の20時間後に、ICEおよびiNOSの両方において見られた。RIN細胞において、ICEはSP-1の98％で産生され、およびiNOSはSP-1の 97%で産生された。アポトーシスもNOS産生も、コントロール細胞において観察されなかったが、サイトカインで誘導されたiNOS産生は、その後アポトーシス頻度およびNO産生を高度に増大した。RIN細胞において、蓄積された亜硝酸塩は、３日後に19.7±0.7μMであると測定された。実施例８：ラット島におけるタンパク質発現のインターロイキン-1DF誘導した変化：コンピューター処理化データベース要約膵臓島タンパク質の２次元（2-D）ゲル電気泳動は、インスリン依存性糖尿病の分子的病原性の研究を容易にする重要なツールであり得る。インスリン依存性糖尿病は、ランゲルハンス島のβ細胞の自己免疫破壊によって引き起こされる。サイトカインのインターロイキン1βはインスリン放出を阻害し、そして単離された膵臓のラット島におけるβ細胞に対して選択的に細胞傷害性である。免疫応答の引き金になる１つまたは複数の抗原、ならびにインターロイキン1βが媒介したβ細胞細胞傷害性の作用の細胞内メカニズムは、知られていない。しかし、これまでの研究は、タンパク質合成の変化に関連することを見いだしている。したがって、島タンパク質の2-Dゲル電気泳動は、1)β細胞の免疫破壊を開始する一次抗原（単数または複数）の同定、2)サイトカインによって誘導される特定の島タンパク質の定性的および定量的変化の決定、および3)サイトカイン作用を調節する薬剤の効果の決定を導き得る。したがって、この研究の目的は、標準化された培養条件下で標識された、新生仔ラット島における10％および15％アクリルアミド2-Dゲル（10％および15％DB）上のすべての再生可能に検出可能なタンパク質スポットのデータベースを作製することであった。1792スポットが、15％DB における５つのゲルのうちの５つに存在したが、1373スポットが、10％DBにおける５つのゲルのうちの５つに存在し、75.2％と91.7％との間の定量的再生性を得た。両方のDBでは、すべてのゲルに存在するスポットについての積分した光学密度のパーセントの変動（％IODのCV％）の平均係数は、42.4％と45.7％との間であった。同じ試料を、異なる日に、ゲルの連続的セットで分析した場合（アッセイ間分析）、％IODの平均CV％は、35.5％〜36.1％であった。同じ試料をゲルの１つのセットで繰り返して分析した場合（アッセイ内分析）、％IODの平均CV％は、IEFゲルでは30.2％であったが、％IODの平均CV％は、NEPHGEゲルでは変わらなかった（45.7％）。IL-1βによって発現が変化したタンパク質を区別するために10％DBを適用すると、105の現在未同定のタンパク質スポットは、IL-1βによって新たにアップ／ダウンレギュレートまたは合成されることを見いだした。結果として、本発明者らは、ランゲルハンスの新生仔ラット島の第１の10％および 15％アクリルアミド2-Dゲルタンパク質データベースを示し、そしてIL-1βによって発現が変化したタンパク質を同定するための利用を証明する。序論サイトカインのインターロイキン1βは、インスリン放出を阻害し、そして単離された膵臓ラット島においてβ細胞に対して選択的に細胞傷害性である（Mand rup-Poulsen，T，Diabetologia in press(1996)）。活性タンパク質合成は、サイトカインのような発作後のβ細胞破壊、防御、および修復の重要な部分である。遊離ラジカル一酸化窒素（NO）は、島α細胞におけるサイトカインの有害な効果の重要なメディエーターであることが証明されている（Southernら，FEBS．Le tt．276:42-44(1990)；Welshら，Endocrinol．129:3167-3173(1991)；Corbettら，J．Biol．Chem．266:21351-21354(1991)）。したがって、NO産生のための基質であるL-アルギニンのアナログは、インターロイキン1β（IL-1β）の有害な効果を防止し（Southernら，FEBS．Lett．276:42-44(1990)；Welshら，Endocrinol ．129:3167-3173(1991):Corbettら，J．Biol．Chem．266:21351-21354(1991)）、そしてサイトカイン誘導性イソ型のNOシンターゼ（iNOS）についてのmRNAは、 β細胞でIL-1βによって誘導されるがα細胞では誘導されない（Corbettら，J． Clin．Invest．90:2384-2391(1992)）。本発明者らは、最近、新生仔ラット島からiNOSをクローニングし、そして２次元（2-D）ゲル上の一連のスポットとして、おそらくリン酸化したイソ型としての組換えiNOSの発現を証明し、131kDaの予測分子量および6.8〜7.0の範囲のpI値を有する（Karlsenら，Diabetes 44:753-7 58(1995)）。さらに、タンパク質合成のインヒビターは、島機能におけるIL-1βの阻害効果をブロックし（Hughesら，J．Clin．Invest．86:856-863(1990)）、このことは新たなタンパク質合成がIL-1βの有害な効果に必要であることを示す。IL-1βはまた、熱ショックタンパク質（HSP）HSP32（ヘムオキシゲナーゼ）およびHSP70 の合成を誘導し（Helqvistら，Acta Endocrinol.（Copenh.）121:136-140(1989) ；Helqvistら，Diabetologia 34:150-156(1991)；Welshら，Autoimmunity 9: 33-40(1991)）、細胞性ストレスに対する防御および細胞修復において役割を果たすことが公知である（Kaufmann，Immunol．Today 11:129-136(1990)）。さらに、IL-1βは、島における45、50（Hughesら，J．Clin．Invest．86:856-863(19 90)）、75、85、95、および120kDa（Welshら，Autoimmunity 9:33-40(1991)）の分子量を有する多くの未知のタンパク質の合成を阻害する。2-Dゲル電気泳動を使用して、本発明者らは、最近、IL-1βが、新生仔ラット島においてそれぞれ29 および３タンパク質をアップレギュレートおよびダウンレギュレートすることを証明した。内分泌島細胞は、β細胞破壊およびおそらく生存に重要な役割を果たし得る。島細胞の分散およびソーティングは、タンパク質合成パターンに影響を及ぼし得る潜在的に有害な手順である。選択した島細胞材料の不都合は、他の細胞からの合成によって希釈されるので、１つの細胞タイプにおけるタンパク質発現の何らかの変化が、より小さく現れることである。したがって、この研究の目的は、スポット検出再現性を決定すること、およびすべての(³⁵S)-メチオニン標識した島タンパク質データベーススポットについて積分した光学密度のパーセントの変動（％IODのCV％）の係数を算出することであった。さらに、本発明者らは、スポットの％IODの総CV％に対するゲル調製のアッセイ内およびアッセイ間変動の寄与を研究する必要があった。最後に、本発明者らは、コンピュータ分析によって島タンパク質パターンのIL-1β誘導された変化の数を定義する必要があった。材料および方法試薬。DMEM、RPMI 1640、およびハンクス平衡化塩溶液（HBSS）を、Gibco，Pa isley，Scotlandから購入した。RPMI 1640に、20mM HEPES緩衝液、100,000IU/I ペニシリン、および100mg/Lストレプトマイシンを補充した。認証された組換えヒトIL-1βは、Novo Nordisk Ltd．(Bagsvaerd，Denmark)によって提供された。比活性は、400U/ngであった（Moelvigら，Scand．J．Immunol．31:225-235(1990 )）。以下の他の試薬を使用した：2-メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン（BSA）、Tris HCl、Tris塩基、グリシン（Sigma，St．Louis USA）；トリクロロ酢酸（TCA）、リン酸、NaOH、グリセロール、n-ブタノール、ブロモフェノールブルー（Merck，Darmstadt，Germany）；(³⁵S)-メチオニン（SJ204，比（Amersham International.Amersham，UK）；フィルター（HAWP 0.25μm孔サイズ）（Millipore，Boston，USA）；RNA'se A、DNA'se I（Worthington，Freehol d，NJ，USA）；尿素（超純粋）（Schwartz/Mann，Cambridge，MA，USA）；アクリルアミド、ビスアクリルアミド、TEMED、過硫酸アンモニウム（BioRad，Richm ond，CA，USA）；両性電解質：pH 5-7、pH 3.5-10,pH 7-9、pH 8-9.5（Pharmaci a，Uppsala，Sweden）；Nonidet P-40（BDH，Poole，UK）；両性電解質：pH 5-7 およびドデシル硫酸ナトリウム（Serva，Heidelberg，Germany）：アガロース（ Litex，Copenhagen，Denmark）；エタノール（無水96％）（Danish Distillers ，Aalborg，Denmark）；メタノール（Prolabo，Brione Le Blanc，France）；酢酸（技術品質、99％氷酢酸）（Bie & Berntsen，Århus，Denmark）、およびＸ線フィルム（Curix RP-2）（AGFA）。島単離および培養。データベースおよびアッセイ変動実験について、12の異なる島単離（データベースについては10、アッセイ内分析については１、およびアッセイ間分析については１）を行った。IL-1βに関する研究については、３つのさらなる島単離を行った。 k）の膵臓からの島を、コラゲナーゼ切断後に単離した(Brunstedt，Larner，J， Polh，S.L.(編)，Methods In Diabetes Research，1巻(Laboratory methods，Pa rt C)．Wiley & Sons，New York，254-288頁(1984)）。RPMI 1640+10％ウシ胎児血清中での４日間の前培養後、150島を、300μl RPMI 1640＋0.5％正常ヒト血清（NHS）中で24時間インキュベートした。別のシリーズの実験では、150島を、15 0pg/ml IL-1βの添加ありまたはなしで、300μl RPMI 1640＋0.5％NHS中で24時間インキュベートした。島標識。培養の24時間後、150島細胞を採取し、HBSSで２回洗浄し、そしてアミノ酸について透析した10％NHSを含む200μlのメチオニン非含有ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、および200μCi(³⁵S)-メチオニン中で４時間標識した。2-メルカプトエタノールを除去するために、(³⁵S)-メチオニンを、標識前に少なくとも４時間凍結乾燥した。標識後、島をHBSSで３回洗浄し、ペレットにし、そして−80℃で凍結した。試料調製。凍結した島を、100μl DNAse I/RNAse A溶液に再懸濁し、そして２回凍結融解することによって溶解した。２回目の融解後、それらを核酸の切断のために30分間氷上に放置した。次いで、溶解した試料を一晩凍結乾燥した。試料を、最大４時間120μl溶解緩衝液（8.5M尿素、２％Nonidet P-40、５％ 2-メルカプトエタノール、および２％両性電解質pH範囲7-9）中で振盪することによって溶解した。 (³⁵S)-メチオニン取り込みの決定。(³⁵S)-メチオニン取り込みの量を、各試料の1:10希釈の５μlにキャリアとして10μg BSA（0.2μg/ml H₂O）を、次いで0.5 mlの10％TCAを添加することによって、二連で定量した。これを、0.25μmフィルターを通して濾過する前に、40℃にて30分間沈殿させるために放置した。HAWPフィルターを乾燥し、そしてカウントのためにシンチレーション液に入れた。 2-Dゲル電気泳動。手順は、本質的に、O'Farrellら，Cell 12:1133-1142(1977 )およびFey，S.J.ら，The protein variation in basal cells and certain bas al cell related benign and malignant diseases，Faculty of Natural Scienc e，University of Aarhus，Denmark(1984)に記載のとおりであった。簡単にいえば、第一次元ゲルは、４％アクリルアミド、0.25％ビスアクリルアミド、および両性電解質（実際の比はバッチに依存する）を含み、そして175mm長および1.55m m直径であった。各試料の等しい数のカウント（10⁶cpm）を、ゲルにアプライした。より低い量の放射活性の場合、比較できる総光学密度を得るようにゲルの曝露時間を調節する必要があった。試料を、等電点電気泳動（IEF；pH3.5-7）および非平衡pHグラジエント電気泳動（NEPHGE；pH 6.5-10.5）ゲルの両方で分析した。IEFゲルを、140μA/ゲル（限界電流）で約４時間プレフォーカシングし、次いで、試料をアプライし、そして1200V(限界電圧）にて18時間フォーカシングした。NEPHGEゲルを、限界パラメータとして140μA/ゲルおよび1200Vを使用して約 6.5時間フォーカシングした。第二次元ゲルは、１mm厚、200mm長、および185mm幅であり、これは15％アクリルアミドおよび0.075％ビスアクリルアミド、または10％アクリルアミドおよび0 . 05％ビスアクリルアミドのいずれかを含み、そして一晩泳動した。電気泳動後、ゲルを、45％エタノールおよび7.5％酢酸中で45分間固定し、そして乾燥前に45 て置き、そして−70℃で1〜40日間曝露した。各ゲルを、少なくとも３倍の期間曝露して、Ｘ線フィルムのダイナミックレンジの欠乏を補った。分子量およびpIの決定。タンパク質の分子量を、標準ゲルとの比較によって決定した（Fey，S.J.ら，The protein variation in basal cells and certain ba sal cell related benign and malignant diseases，Faculty of Natural Scien ce，University of Aarhus，Denmark(1984)）。ゲル上の個々のタンパク質のpI を、pI較正キットの使用によって決定した。目標タンパク質を、以下の技法の１つまたはいくつかによってゲルで同定した：免疫ブロッティング、免疫沈降法、マイクロ配列決定、またはペプチドマッピング。実験的設計。研究は、以下の３つの異なるシリーズの分析を含んだ：データベース分析、アッセイ内分析、およびアッセイ間分析。各分析について、IEFおよびNEPHGEゲルを、第二次元で10％および15％アクリルアミドを使用して流した。これは４つの亜群を提供した：10％IEF；15％IEF；10％NEPHGE；15％NEPHGE。10 ％アクリルアミドゲルでは、検出のおおよその分子量範囲は20と250kDaとの間であったが、15％アクリルアミドゲルでの検出のおおよその範囲は６と125kDaとの間であった。結果として、20と125kDaとの間の分子量を有するタンパク質は両方のデータベースに含まれるが、より低いおよびより高い分子量を有するタンパク質は、それぞれ15％および10％DBに特定された。10％および15％DBの比較は、10 ％IEFおよびNEPHGE亜群の両方で検出可能なより低い数の検出スポットを示した（結果を参照のこと）。結果として、アッセイ内およびアッセイ間分析（以下を参照のこと）を、15％IEFおよびNEPHGEゲルでのみ行った。データベースは、ゲルの１つのセットにおいて分析した10の異なる単離物に基づいた。2-Dゲル電気泳動後、最良の技術的品質および比較可能な光学密度を有する５つのゲルを、コンピュータ分析のために選択した。コンピュータ分析前に、各亜群における１つのゲルを、他の４つのデータベースゲル、５つのアッセイ内ゲル、および５つのアッセイ間ゲルでの比較のために使用した「マスターゲル」であるように任意に選択した。データベース「マスターゲル」を、アッセイ内およびアッセイ間分析についてマスターとして使用して、所定のスポットが、３つのシリーズの分析において同じ適合数を有することを確実にした。「マスターゲル」からのデータは、データベース分析にのみ含まれる。「マスターゲル」は、すべての４つの亜群における同じ単離物からであるが、４つの他のデータベースゲルを生じる単離物の同定は、亜群から亜群までわずかに変化した（表３）。アッセイ内分析について、同じ試料の10ゲルを、１つのセットのゲルで分析した。2-Dゲル電気泳動後、最良の技術的品質および比較可能な光学密度を有する５つのゲルを、コンピュータ分析のために選択した（表３）。アッセイ間分析について、同じ試料を、異なる日に10の連続したセットのゲルで分析した。2-Dゲル電気泳動後、最良の技術的品質および比較可能な光学密度を有する５つのゲルを、コンピュータ分析のために選択した（表３）。 IL-1βによって発現が変化したタンパク質同定について、これまでに可視的に分析された(Andersenら，Diabetes 44:400-407(1995))、IL-1βで曝露した島の1 0％IEFおよびNEPHGEゲルを、10％IEFおよびNEPHGE DBに適合した。蛍光写真のコンピュータ分析。コンピュータ分析を、Sunsparcワークステーシ Biolmage，Ann Arbor，MA，USAによって定量した。次に、各非マスターゲルを、「マスターゲル」と比較し、そしてコンピュータプログラムによって最初に見いだされないスポットの同定および定量を確実にするために手動で編集した。この性を検査し、そして同じ観察者によって修正した。最後に、データを、Quattro IEFおよびNEPHGE亜群の二重スポットの存在を避けるために、IEFゲルの塩基性部分またはNEPHGEゲルの酸性部分のいずれかの重複スポットを、データベースにおける解析およびアッセイ解析から除いた。統計学的解析。２つの異なる解析を、IL-1βによる発現で変化したタンパク質を区別するために適用した。第一の解析では、IL-1β曝露ゲルにおけるスポットの平均％IODが、DBにおける同じスポットの平均％IOD±2SDより高いかまたは低い場合、変化が有意であると見なした。二群間の第二の比較では、スチューデントｔ検定を適用し、ｐ＜0.01を有意性のレベルとして選択した。新生仔ラット島タンパク質データベースおよびアッセイ解析の質的再現性。12 93〜1411個（IEF）および605〜764個（NEPHGE）のスポットが15％DBを構築するために用いた個々のゲルにおいて見出され、一方、1101〜1200個（IEF）および4 62〜577個（NEPHGE）のスポットが10％DBについて用いたゲルにおいて見出された（表４および表５）。「マスターゲル」を10％のIEFおよびNEPHGE DBのために作製した。全体で、1792個のスポットが15％DBにおいて５つのゲルの内５つに存在し、一方、1373個のスポットが10％DBにおいて５つのゲルの内５つに存在した。このことは、75.2％（NEPHGE 10％）〜91.7％（IEF 15％）の間の亜群における質的再現性（５つのゲルの内５つに見出されるスポットの百分率の平均）を生じた（表４および５）（５つのゲルの内５つに存在する各スポットについて、データベースは、スポット適合数、５つの個々のスポットに対する％IOD、平均％I OD、％IODの標準偏差、％IODのCV％、MW、およびpIからなる）。表４および５に示されるように、個々のゲル中のスポットの総数、ならびに５つのゲルのうち５つに存在するスポットの数および百分率は、10％DBにおいて１ 5％DBにおけるよりも少なかった。しかし、データベースを５つのゲルのうち少なくとも３つのゲルに存在するスポットを含むように拡張する場合、２つのデータベース間では、存在するスポットの百分率において差異は見られなかった（IE F：15％：98.8±1.2；10％：97.4±1.5；NEPHGE：15％：94.8±5.7；10％：94.1 ±3.5、表４および５）。両データベースにおいて、５つのゲルの内５、４、３、または２つに存在するスポットの百分率は、NEPHGEゲルにおいてIEFゲルにおけるより低かった（表４および５）。５未満のゲルに存在するスポットの空間的位置を調査した。これは、スポットが１、２、３または４つのゲルに存在するか否かに依存してゲルの特定の領域において群分けされなかったことを示す。アッセイ内解析およびアッセイ間解析を15％ゲルにおいてのみ実施した。なぜなら、検出可能なスポットの数がこのデータベースにおいてより高かったからであった。両解析において、個々のゲル中のスポットの数ならびに５つのゲルの内５つに存在するスポットの数および百分率は、15％DBに比較してわずかに（９％〜19％）減少した（表４および６を比較する）。新生仔ラット島タンパク質データベースおよびアッセイ解析の量的再現性。量的再現性を、５つのゲルのうち５つに存在する各スポットについての％IODのCV ％の平均として定義した。データベースについて、平均CV％は、ゲルの10％および15％の両方のIEFならびにNEPHGE亜群において相当のレベルであった（42.4％〜45.7％）（表７）。全DB亜群について、CV％は、3.0％〜167.9％の間の範囲であった（表７）。アッセイ間解析について、平均CV％は、IEFおよびNEPHGEゲル亜群の両方について35.5％〜36.1％であった。一方、平均CV％は、IEFゲルのアッセイ内解析について30.2％であり、そしてNEPHGEゲルについて45.7％であった。続いて、全てのゲル中に存在するデータベーススポットを、％IODのCV％の桁を増大させて階級付けした。これは、４つのデータベース亜群全てにおいて、スポットに対して同様のシグモイド型曲線を生じる。従って、スポットの30％は、 29.7％〜32.5％より低いCV％を有し、スポットの50％は、37.8％〜42.8％より低いCV％を有し、スポットの90％は、68.4％〜80.6％より低いCV％を有した。曲線の傾斜は、最高CV％を伴う５％〜10％のスポットが％IODの平均CV％に有意に寄与することを示している。これは、データベースの亜群のメジアン値が、亜群の平均値より2.3％〜5.5％低いという事実によって支持される（表７）。データベース亜群における各スポットに対する平均％IODと％IODのCV％との間の回帰解析。NEPHGEの10％および15％のDB亜群において、最高平均IOD％を伴う1 0個のスポットのうちそれぞれ２個および６個が最低CV％を伴うパーセント点において見出された（上記を参照のこと）。最高平均IOD％を伴う10個のスポットのどれもがIEF DB亜群においてはこのパーセント点で見出されなかったが、回帰解析を行ってスポットの平均％IODとCV％との間に相関があるか否かを調べた。回帰解析は、これらの２つのパラメーター間で有意な負の相関があることを示した（範囲：ｐ＝０（IEF 10％）−ｐ＝0.00288（IEF 15％））。しかし、Ｒ²値は全ての亜群に対して非常に低かったので（範囲：Ｒ²＝0.0072（IEF 15％）Ｒ² ＝0.0317（IEF 10％））、CV％の可変性の大部分は、平均％IODの変動によっては説明されない。 IL-1βによる発現において変化したタンパク質を区別するための10％IEFおよびNEPHGE DBの適用。近年の論文で、本発明者らは、IL-1βＢが新生仔ラット島タンパク質の2-Dゲルにおいて、29個のタンパク質をアップレギュレートし、そして４つのタンパク質をダウンレギュレートすることをそれぞれ示した（Anders enら、Diabetes 44:400-407(1991)）。10％ゲルを、本研究と類似の条件下で培養した（35S）メチオニン標識Wistar Furth新生仔ラット島から調製した。従って、ラット島の10％のIEFおよびNEPHGE DBを、以前の論文（Andersenら、Diabet es 44:400-407(1991)）で可視解析したIL-1β曝露島のコンピューター解析ゲルとの比較のために使用した。各DBスポットのIOD％の±2SDをカットオフレベルとして用いて（可視解析における有意なアップまたはダウンレギュレーションのための基準に匹敵する）、10％DBとの比較は、これらの変化の32個を確認し、そして予期されるようにいくつかの新規なタンパク質変化を同定した。従って、IL-1 βによって、全部で183個のスポットがアッブレギュレートされ、113個がダウンレギュレートされ、そして34個が新規に合成された（結果は示さず）。スチューデントｔ検定においてｐ＜0.01をカットオフレベルとして用いた場合、最終的な解析は、IL-1βによって、52個のスポットがアップレギュレートされ、47個がダウンレギュレートされ、そして６個が新規に合成されることを示し、これらのうち13個は、可視解析により選択された33個のスポット中に含まれた。考察：本研究において、本発明者らは、新生仔ラットランゲルハンス島の10％および 15％のアクリルアミド2-Dゲルタンパク質DBを提示する。これは、任意の種における島またはインスリン分泌細胞の第一のタンパク質データベースを含む。1792 個のスポットが15％DBにおいて５つのゲルのうち５つに存在したが、一方、1373 個のスポットが10％DBにおいて５つのゲルのうち５つに存在した。このことは、 75.2％〜91.7％の間の質的再現性を生じている。両データベースにおいて、％IO Dの平均CV％は、42.4％〜45.7％の間であった。IL-1βによる発現で変化したタンパク質を区別するために10％DBを適用し、105個の現在未同定のタンパク質スポットが、IL-1βによりアップ／ダウンレギュレートされるかまたは新規に合成されることが分かった。新生仔Wistar Furthラット島の特徴。可変性を減少させるために、ラットの同系繁殖Wistar Furth系を本発明者らのデータベースの島供給者として選択した。この系統は、本発明者らの研究所において島実験のために日常的に使用されている異系交配Wistarの同系繁殖変種である（Andersenら、Diabetes 43:770-777(19 94)）。本発明者らは、IL-1βを用いてまたは用いずに培養したWistar Furth新生仔ラット島の機能がWistar新生仔ラット島の機能に匹敵することを以前に決定し（Andersenら、Diabetes 44:400-407(1995)；Andersenら、Acta Endocrinol． 120:92-98(1989)）、そしてWistar Furth島の2-Dゲルタンパク質パターンに対するIL-1βの効果を決定した（Andersenら、Diabetes 44:400-407(1995)）。本データベースは新生仔ラット島に基づくのであって、成体ラット島には基づいていないので、本発明者らは、成体島のタンパク質パターンが異なることを排除できない。しかし、異系交配Wistarラット由来の成体および新生仔島は、IL-1の有害な影響に対して同等に感受性である（Mandrup-Poulsenら、Diabetes 36:641-647 (1987)）。島単離のために使用される新生仔ラットの各同腹仔は、代表的には、種々の頻度で雄または雌である８〜12の仔ラットからなる。雄および雌の異系交配Wistar ラット由来の肝臓タンパク質のクマシーブルー染色ゲルの比較は、250個の解析したスポットのうち７個において量的差異を示し、そして６つのタンパク質が雄において独占的に見出され、そして１つのタンパク質が雌において独占的に見出された（Steinerら、Electrophoresis 16:1969-1976(1995)）ので、本発明者らのデータベースにおけるタンパク質のいくつかは、性特異的または性調節的であると考えられる。従って、本発明者らのデータベースにおけるスポットのいくつかの高い変動は、本発明者らが雄および雌のラット由来の島の別個のデータベースを作成するために選択した場合減少され得る。しかし、肝臓タンパク質のゲルを、非培養細胞において実施した。これは、性決定タンパク質可変性は、循環性ステロイドによって誘導され得、肝細胞自体の固有の形質ではないことを意味し得る。循環ホルモンは、本発明者らのタンパク質パターンに干渉しないと思われる。なぜなら、Ｉ）本発明者らは、実験前に４日間島を予備培養し、そしてII）性ステロイドの血清濃度における差異は思春期前には見られないからである。さらに、本発明者らは、雄および雌異系交配Wistarラット由来の島は、IL-1の有害な影響に対して同等に感受性であることを以前に示した（Steinerら、Electroph oresis 16:1969-1976(1995)）。島タンパク質の検出。本発明者らのデータベースにおいて検出された全てのスポットが、異なるタンパク質体(entity)を表しているわけではない。なぜなら、いくつかのスポットは他のタンパク質の改変（例えば、アセチル化、メチル化、リン酸化、またはカルバミル化）を表し得るからである。しかし、スポットの検出数は、島タンパク質の総数の低めの見積もりである。なぜなら、タンパク質データベースは、感度限界未満のタンパク質、メチオニンを含まないタンパク質、 6kDaより低いかもしくは250kDaより高い分子量を有するタンパク質、または3.5 より低いかもしくは10.5より高いpHを有するタンパク質を含まない。さらに、検出限界を上回るIODを有するスポットの約40％は、以前には、それらが他のスポットに覆われているので失われていると見積もられていた（Garrels、J．Biol． Chem．264.5269-5282(1989)）。最後に、４時間の標識化期間が、高い合成速度でのタンパク質の標識化を与えるが、より長い標識化期間が、全てのタンパク質が定常状態にあるデータベースを作成するために必要とされ得る。質的再現性。2-Dゲルタンパク質データベースの質的再現性の以前の報告は少なく、結果は可変である：クマシーブルー染色2-Dゲルのマウス肝臓タンパク質データベースでは、826個のスポットがマスター画像に存在し、平均して500個のスポットが他のマウス肝臓パターンの85％において適合した（Giomettiら、Elec trophoresis 13:970-991(1992)）。（³⁵Ｓ）-メチオニン標識マウス胚のタンパク質データベースでは、４つのゲル画像の各々において80％以上のスポットが、自動的に標準画像に適合された（Shiら、Molec．Reprod．Develop．37:34-47(19 94)）。本発明者らの研究では、1792個のスポット（75.2％〜91.7％）が15％DB 中の５つのゲルの内５つに存在したが、５つのゲルの内５つに存在するスポットの平均百分率は10％DBにおけるより５〜10％低かった。これは、おそらく10％ゲルでのみ解析可能な高分子量領域には、15％ゲルでのみ解析可能な低分子量領域におけるよりも、より少ないタンパク質が存在するという事実に起因する。解析した全ての群において、NEPHGEゲルの質的再現性は、IEFゲルにおける再現性より低かった。NEPHGEゲルは、IEFゲルとは反対に、非平衡性ゲルなので、同一のスポットがわずかに異なる水平位置を有する危険性が増大する。しかし、本発明者らの手動編集は、この問題が可能な限り取り除かれていることを確認した。量的再現性。量的再現性に関しては、他の研究との比較は困難である。なぜなら、スポット同定のために用いられる方法は同一ではないからである。さらに、以前に公開されたデータベースのほとんどにおける％IODのCV％の計算に含まれるスポットは、種々の基準に従って適合スポットの総数から選択される。雄および雌のWistarラット肝タンパク質の10個のクーマシーブルー染色ゲルにおいて、「マスターゲル」に存在する1,000個より多くのスポットのうち250個を、良好な形状、大きさ、および解像度、ならびに以前の実験における存在および良好な質に従って選択した（Steinerら、Electrophoresis 16:1969-1976(1995)）。これらの基準を用いて、スポットの３分の１は、20％を下回るCV％を有し、半分より多くは、30％を下回るCV％を有し、そして４分の３は40％を下回るCV％を有した（Steinerら、Electrophoresis 16:1969-1976(1995)）。緻密八細胞(compacted eight-cell;CEC）マウス胚の５つのゲルおよび胞胚期(BS)マウス胚の４つのゲルからなる（³⁵Ｓ）-メチオニン標識マウス胚のタンパク質データベースでは、それぞれ1,674個のスポットおよび1,653個のスポットが、全てのゲルにおいて適合した（Shiら、Molec．Reprod．Develop．37:34-47(1994)）。全ての適合スポットに基づいて算定すると、これらのスポットの74％（CEC）または79％（BS）の百分率誤差（SEM×100/平均として定義）は50％未満であり、そしてスポットの４5％（CEC）または47％（BS）は30％を下回る百分率誤差を有した（Shiら、Mol ec．Reprod．Develop．37:34-47(1994)）。比較のために、SDのSEMへの変換（SE M=SD/√n）が、島IEFの15％DBにおいて20.3％の平均CV％を与え、スポットの97. 7％および83.2％は、それぞれ50％および30％を下回る百分率誤差を有する。本発明者らの研究の量的再現性は、マウス胚における研究（Shiら、Molec．Re prod．Develop．37:34-47(1994)）に匹敵するか、またはずっとより良好であるが、本発明者らのデータベースにおける％IODの平均CV％はなお相対的に高い。以前に述べたように、島の異種細胞集団および島単離の異なる雄／雌比がゲル可変性に寄与し得る。本発明者らは、匹敵する全光学密度を有するゲルを用いるよう試みた（各亜群内の最大差異は3.5の係数(factor)であった（ゲルDB10対ゲルD B3、IEF 15％DB、表３)）が、Ｘ線フィルムの非線形飽和が全データベーススポットについてのCV％の大きさに寄与する。ホスホイメージング（本研究が開始されたとき本発明者らの研究室では利用可能ではなかった技術）の適用は、この現象のCV％の大きさへの寄与を減少させた。最後に、コンピューター解析における電気ノイズおよびスポット境界規定の差異が、CV％の大きさに奇与し得る。いくのために局所的であって、全体的ではないバックグラウンドを使用し、後者の因子のCV％への寄与を減少させる。複製ゲルの研究。（³⁵Ｓ）-メチオニン標識REF 52細胞の10の複製ゲルの研究において、Garrelsは、全体で約2,000スポットのうち最も優勢なスポットの1109 個を選択し、そして＜５％および＞100％の間の範囲ならびに10％と15％との間の様式値(modal value)では、平均CV％が26.5％であることを見出した（Garrels 、J．Biol．Chem．264：5269-5282(1989)）。試料を連続して解析したか同じセットのゲルで解析したかは明確ではない。スポットの質（Gaussian形状への適合、隣接スポットの重複）に従ってスポットを群分けし、そして全てのゲルにおいて低密度を有するスポットを省くとき、最高の質の19.1％のスポットは、13.0％の平均CV％を有した（Garrels、J．Biol．Chem．264：5269-5282(1989)）。予期されるように、％IODの平均CV％は、15％IEFおよびNEPHGEアッセイ間解析を15％ IEF DBに比較したとき減少した。この減少は、約９％である。アッセイ内解析ではゲル調製物の日毎の変動を除いたので、平均CV％はよりずっと減少すると予期された。15％IEF亜群において、CV％は、データベースに比較して約15％減少したが、15％NEPHGE亜群では減少は見られなかった。15％NEPHGEアッセイ内亜群（これはまた、全ての亜群のうち最も低い質的再現性を有する(表４〜６)）における高い平均CV％の理由は、不明である。データベースゲルもまた１セットのゲルにおいて解析したとき、生物学的変動に起因するCV％の部分は、データベースと所定のスポットに対するアッセイ内解析との間のCV％における差異によって与えられるべきである。従って、15％NEPHGEアッセイ内解析の結果が無視される場合、IOD％の平均CV％の約３分の１は、生物学的変動に起因する。島タンパク質発現に対するIL-1βの影響。IL-1βは、105個のこれまで同定されていないタンパク質の発現を変化させた。島細胞におけるIL-1β作用機構は十分に解明されていないが、３つの異なるタンパク質群は重要な役割を果たしている：シグナル伝達に関与するタンパク質およびいわゆる初期応答および後期応答遺伝子によりコードされたタンパク質（Eizirikら、Diabetologia 39:875-890(1 996)）。標的細胞におけるIL-1β誘導シグナル伝達は、４つの主要なシグナル伝達経路を包含すると思われる：核因子-κb、ストレス活性化タンパク質キナーゼ（SAPK/JNK）、タンパク質キナーゼＣ、およびチロシンキナーゼ（Mandrup-Poul sen，T.、Diabetologia 39:1005-1029(1996)；Eizirikら、Diabetologia 39:875 -890(1996)）。３つの経路は、c-fos、c-jun、およびインターフェロン応答因子 -1が島細胞におけるサイトカイン作用に関与している初期応答遺伝子の迅速でかつ一過的な誘導を導く。初期応答遺伝子は、島において有害な可能性のある作用（iNOS、シクロキシゲナーゼ-2、およびリポキシゲナーゼ）および保護的作用（ HSP72、ヘムオキシゲナーゼ、Mnスーパーオキシドジスムターゼ）を伴う特定の遺伝子を活性化する（Mandrup-Poulsen，T.、Diabetologia 39:1005-1029(1996) ；Eizirikら、Diabetologia 39:875-890(1996)）。従って、島細胞におけるIL-1 β作用機構に関する情報はなお限定されており、そしてIL-1βによる発現で変化された105個のタンパク質の同定は、シグナル伝達ならびに保護作用および有害作用を伴うタンパク質に関する新たな知識を導き得る。結論本発明者らは、他の細胞および組織において以前に公開されたデータベースを改善する、高い質的再現性および量的再現性を有する新生仔ラットランゲルハンス島のタンパク質データベースを確立した。さらに、本発明者らは、新生仔ラット島タンパク質データベースのアッセイ内変動およびアッセイ間変動を決定した。このデータベースはさらに、IL-1βによる発現において変化したタンパク質（ IL-1β作用機構において重要な役割を有し得る）を同定するために適用される。 IL-1βは、インスリン産生ラットＢ細胞に対して細胞傷害性であるので、現在、質量分析法および微量配列決定により行われているこれらのタンパク質の同定は、インスリン依存性糖尿病の病原に関して重要な知識を生じると期待される。本明細書中において引用されるすべての参考文献（ジャーナル論文もしくは要約、公開もしくは係属中の米国もしくは外国の特許出願、発行された米国もしくは外国の特許、または任意の他の参考文献を含む）は、その全体（その引用された参考文献のすべてのデータ、表、図、および文章を含むが本明細書中において参考として援用される。さらに、本明細書中で引用された参考文献において引用された参考文献の全内容もまた、その全体が参考として援用される。公知の方法工程、従来の方法工程、公知の方法、または従来の方法の参照は、本発明の任意の局面、説明、または実施態様が、関連する技術において開示されるか、教示されるか、または示唆されるという承認では決してない。特定の実施態様の先述の説明は、本発明の一般的な性質を十分に示すので、他の人々が、当該分野の技術内の知識（本明細書中において引用された参考文献の内容を含む）を適用することによって、過度の実験なしに、本発明の一般的な概念から逸脱することなしに、種々の適用のためにそのような特定の実施態様を容易に改変および／または応用し得る。従って、そのような応用および改変は、本明細書中において示される教示および案内に基づいて、開示された実施態様の等価物の意味および範囲内であることが意図される。本明細書の術語または専門用語が、当業者の知識と組み合わせて、本明細書中に示される教示および案内を考慮して、当業者によって解釈されるように、本明細書中における専門用語または術語は、説明の目的であり、限定の目的ではないことが理解されるべきである。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Diabetes mediating proteins and their therapeutic use Background of the Invention Field of the invention The present invention generally relates to diabetes-mediating proteins, methods for identifying diabetes-mediating proteins. Methods, transgenic animals useful in the assays of the invention, Methods for screening for drugs that affect the expression of protein and diabetes Therapeutic compounds for the treatment and prevention of Related technology Insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) in humans and animal models of human disease ) Is caused by infiltration of mononuclear cells and pancreatic islets (insulinitis) Is characterized by the breakdown of beta cells. The mechanism of beta cell destruction is unknown . Accumulating evidence suggests that cells produced primarily by macrophages and monocytes. Tokain interleukin-1,6 (IL-1β) is a mediator of islet β cell destruction Show that you can. As animal models of human diabetes, BB (BB-DP) rats and And non-obese diabetic (NOD) mice. Two-dimensional rat islet protein (2 D) A gel map is constructed and rat islet cells in vitro for IL-1β Determine qualitative and quantitative changes in protein synthesis caused by exposure (Andersen et al., Diabetes 44: 400-407 (1995)). Transgenic animal models of human diabetes are known. For example, human sugar One model of urinary disease is pancreatic β-β under the control of the rat insulin promoter. Transgenic mice expressing viral proteins in cells (van Herrath et al. Clin. Invest. 98: 1324-1331 (1996)). Less than 2% transge Nick mice develop diabetes endogenously; however, two months of virus After arrangement, IDDM occurs in over 95% of mice. Summary of the Invention The present invention is based, in part, on the discovery and identification of diabetes-mediated (DM) proteins. The protein is expressed in subjects at, or at risk of developing, diabetes. It is a protein involved in the prevention of the development of diabetes. And DM protein is Identified by differential expression between the presence and absence of the onset of the disease. Diabetic Onset includes any stage that progresses to a clinically detectable stage. Thus, in one aspect of the invention, expression and ratio in the absence of the onset of diabetes A substantially purified diabetic vehicle that exhibits altered expression during the onset of diabetes in comparison Mediated proteins are characteristic. The purified diabetes-mediating proteins of the present invention are listed in Table 1. And 2 are selected from the proteins listed. Novel diabetes mediating proteins Shows the molecular weight, pI, and mass spectral features as shown in FIGS. Therefore, it is characterized. These proteins are 10% IEF or NEPHG two-dimensional NEPHGE 7, 9, 102, 123, 129, 130 with reference to their location on the , 174, 181, 182, 211, 231, 236, 253, 298, and IEF 665, 939, 941, 950, Selected from the group consisting of 1196. DM proteins are further protected or deleterious DM Characterized as protein. Protective Diabetes Mediating Protein ("Protective Protein ") May protect against and / or be at risk for developing diabetes A subject that can delay the onset of diabetes in a subject, or who has diabetes. It is characterized as a protein that can alleviate the symptoms of diabetes in a subject. defense The protein also does not change expression during the onset of diabetes, but Avoid proteins with altered expression in subjects at risk for diabetes possible. Noxious diabetes-mediating proteins ("noxious proteins") are the pathogenesis of diabetes May increase the subject's risk of developing diabetes, or may increase the risk of developing diabetes. Reduce the time required to develop diabetes in subjects at risk of developing Characterized as the resulting protein. Harmful proteins also contribute to the development of diabetes Subjects at risk for diabetes that do not change expression in the meantime but avoid developing diabetes It can be a protein that shows altered expression in the body. Diabetes vector of the present invention Proteins can be analyzed by gel electrophoresis, immunoblotting, mass spectrometry, Can be identified by any means known in the art, including chromatography. And compared to the same protein expressed in the absence of the onset of diabetes It is characterized by altered protein expression during the onset of the disease. U.S. provisional patent issued Application No. 60 / 029,324 was developed in pancreatic islet cells, identified by molecular weight and pI. The proteins that appear are identified (FIGS. 1A and 1B). This application is based on Tables 1 and 2. And those identified as diabetes-mediating proteins, listed in FIGS. Provides a selection of proteins. Diabetes mediating proteins of the invention identify compounds that can modulate the onset of diabetes Useful in drug screening assays for the treatment or prevention of diabetes And regulates expression of diabetes-mediating proteins Useful as a target for therapeutics that can prevent or alleviate diabetes is there. Changes in expression of specific DM proteins are diagnosed as indicators of the onset of diabetes Is useful. Thus, in one aspect of the present invention, the diabetes listed in Table 1 Tan in one or more proteins selected from the group consisting of disease-mediated proteins Increased protein expression and a squirrel consisting of the diabetes-mediating proteins listed in Table 2. Measure the decrease in protein expression of one or more proteins selected from Thus, a method of diagnosing the onset of diabetes is characteristic. For protein expression Changes in the suspicion of developing diabetes or the risk of developing diabetes Control in normal non-diabetic control Is shown relative to protein expression in In a preferred embodiment, Table 1 And changes in the combination of one or more proteins of 2 are indicators of diabetes development is there. In a further preferred embodiment, the proteins of Table 1 and / or 2 Changes in five or more combinations are indicators of the onset of diabetes. Still more preferred In some embodiments, combinations of 10 or more proteins of Tables 1 and / or 2 Is an indicator of the onset of diabetes. In one aspect, the invention provides a method for treating a disease (eg, diabetes). It features an in vivo assay method for identifying proteins. The present invention In specific embodiments of the in vivo assay method, insulin secreting Or cells that can grow into insulin-producing cells are at risk for developing diabetes The animal is transplanted into an immunologically competent host animal. Protein expression is Analyzed in transplanted cells rescued at time points between transplantation and disease onset And the onset of diabetes as compared to their expression in the absence of the onset of diabetes Proteins exhibiting altered expression in between are identified. In specific embodiments, The transplanted cells are newly transplanted into an animal model at risk for developing diabetes. Islet cells. In one specific embodiment, the neonatal islet cells are neonatal BB-D Collected from P rats, and the host animal is a BB-DP rat. In another embodiment, And the source of the transplanted cells and the host cells are NOD mice. The present invention provides a method for identifying and identifying proteins that may be further characterized as protective or deleterious proteins. A diabetes-mediating protein. In one embodiment of the present invention, the candidate defense Your protein or harmful protein is a candidate defense protein or harmful protein Transfecting cultured cells with a polynucleotide encoding Identified in vitro. And in vitro during IL-1β challenge The effect of the expression of the diabetes-mediating protein on the functionality of the cells in the cell is determined. The polynucleotide can be operably linked to an inducible promoter, such that , The expression of a candidate protective or deleterious protein is under exogenous control . Extrinsic control can be exerted by drugs (eg, interferons). Such agents are determined by the promoter selected. Specific implementation In a similar manner, the functionality of the cell may be dependent on nitric oxide (NO) production, insulin secretion, By measuring cell viability and / or cytotoxicity upon exposure to resident IL-1β It is determined. In vivo methods for identifying protective or adverse diabetes mediating proteins Thus, a transgenic mammal expressing the candidate protein is created. here Therefore, transgenic mammals are at risk for developing diabetes, and Effects of transgene expression on the onset and timing of onset of diabetes It is determined. Protective proteins can be used in subjects at risk for diabetes Is a protein that prevents, inhibits or delays the onset of And harmful proteins Quality causes the onset of diabetes, increases the risk of developing diabetes, or Reduce the time required to develop diabetes in subjects at risk for developing diabetes Is a protein that Noxious proteins also prevent expression of protective proteins Or interfering proteins. The present invention provides a substantially purified protective or noxious diabetes mediating protein, and It includes a polynucleotide sequence encoding a diabetes-mediating protein of the invention. One In a non-limiting embodiment of the present invention, the protective protein is galectin-3 (galectin). -3) (FIGS. 4 and 5) (SEQ ID NOS: 1 and 2). Another non-limiting embodiment , The harmful protein is mortalin (FIGS. 2-3) Column numbers 3 and 4). In one aspect, the invention relates to an exogenous diabetes mediator inserted into its genome. Identify transgenic mammals that have the protein gene (s) Sign. The transgenic mammal of the present invention can be used for diabetes in the onset of diabetes. To determine the effect of expression of the disease-mediated protein, and Useful in assay methods for identifying harmful proteins. Transgy Is a natural, or partially or completely artificial, diabetes-mediating gene. And may be different or the same as the endogenous diabetes-mediating protein gene. Can get. In one embodiment, the transgene is regulated by an inducible promoter. It is under you. In a related aspect, the invention has an exogenous deleterious gene and Transgenics showing an increased incidence of spontaneous diabetes Characterized by mammals. In a preferred embodiment, the transgenic mammal The animal has a disease incidence of 50% or more, more preferably 60% or more, and even more preferably. Preferably, the incidence is 70% or more, even more preferably 80% or more, and Also preferably, it shows an incidence of diabetes of 90 or more. In one embodiment of the present invention The transgenic mammal of the present invention encodes a noxious diabetes-mediating protein. Is transgenic for one or more genes that In another embodiment Thus, the transgenic mammal further comprises one or more endogenous diabetes-mediating proteins. The protein gene has been removed. Generally, transgenic mammals are Sh Transgenes under the control of a phosphorus, CMV, interferon, or MHC promoter Has a nick gene. In a more specific embodiment, the transgenic Mammals have endogenous diabetes-mediated genes obtained with enhanced promoters Endogenous diabetes-mediated genes that express at elevated levels or have high copy numbers Is expressed. In a more specific embodiment, the transgenic mammal is Has a disrupted diabetes-mediating protein gene. The present invention further relates to a method wherein the endogenous diabetes-mediating protein gene is known in the art. By law (eg, US Pat. No. 5,641,670, which is hereby incorporated by reference in its entirety). Exogenously altered by the application of the gene activation techniques described in Mammals. In one aspect, the invention relates to the expression of one or more diabetes-mediating proteins. It features an assay for screening for compounds that have an effect. One fruit In embodiments, the animal at risk for spontaneous onset of diabetes comprises one or more sugars. Determine the ability of the compound to affect the expression of the urinary mediator protein (s) Used in assays to determine In a preferred embodiment, the assembly The animal is a transgenic animal of the present invention having a high risk of developing diabetes. It is. The term "affecting the expression of diabetes-mediating proteins" is used to describe endogenous diabetes. Inducing, enhancing, inhibiting, or reducing the expression of a disease-mediated protein Means compound. In a specific embodiment, the present invention induces expression of an endogenous defense protein. Or may enhance or thus delay or inhibit the onset of diabetes An assay is provided for identifying the resulting compound. In another specific embodiment Therefore, Can the Assay Method of the Present Invention Suppress Expression of Harmful Diabetes-Mediating Proteins? Or a compound that can delay or inhibit the onset of diabetes Useful for object identification. In a related aspect, the invention relates to a method for modulating the activity of a diabetes-mediating protein. Assays to identify compounds (eg, agonists, antagonists) Blocks the post-translational steps required for the activation of diabetes-mediating proteins. And an assay is provided. Changes in the expression of specific DM proteins Screening methods to identify compounds that can regulate protein expression And useful. Compounds that modulate the expression of one or more diabetes mediating proteins are It is useful as a potential therapeutic in the treatment or prevention of diabetes. Therefore, the book One aspect of the invention is a cell or set that expresses one or more diabetes-mediating proteins. Contacting the tissue with a test compound; and one or more diabetes-mediating proteins. Diabetes-mediating protein comprising determining the effect of a test compound on expression Methods for identifying compounds capable of modulating the expression of is characterized by an assay method. Conversion Determining the effect of the compound depends on the hybridization to the probe or other oligonucleotide. Redidation, antibody recognition (eg, immunodiffusion, immunofluorescence) Light, ELISA, RIA, blotting, immunoprecipitation, immunoelectrophoresis, or chromatography Laffy), and electrophoresis, by various methods known in the art. Can be Selected from the group consisting of the diabetes-mediating proteins listed in Tables 1 and 2 Compounds capable of increasing the expression of one or more proteins, and Tables 1 and 2 One or more proteins selected from the list consisting of the listed diabetes mediating proteins Compounds capable of reducing the expression of protein are potential candidate treatments for the prevention or treatment of diabetes It is a remedy. Changes in protein expression can be expressed in the absence of the test compound. Is determined by comparing with. In another aspect, the invention provides a method for treating diabetes in a subject at risk for diabetes. A therapeutic method to prevent cancer, or a therapeutically effective amount of a protective diabetes mediating protein. Providing a method of alleviating the symptoms of diabetes in a diabetic subject by administering I do. Preferably, the subject is a human. The present invention also provides a protective diabetes mediator. Gene therapy by providing a polynucleotide encoding a protein. Book The invention further provides a method of inhibiting the expression of a noxious diabetes-mediating protein in vivo. Prevention and / or treatment of diabetes by administering an amount of a polynucleotide Including treatment methods for Candidate therapeutic compounds are from the proteins in Tables 1 and 2. Selected. In a related aspect, the invention relates to the expression of endogenous noxious diabetes-mediating proteins. By administering a therapeutically effective amount of a compound capable of inhibiting or reducing Treatment for preventing and / or treating diabetes in a subject at risk for diabetes Provide treatment methods. In another embodiment, the present invention provides an endogenous protective diabetes mediator. Administering a therapeutically effective amount of a compound capable of inducing or enhancing protein expression Thereby provide a therapeutic method for the prevention and / or treatment of diabetes. In a related aspect, the invention relates to a treatment that can modulate the activity of a diabetes-mediating protein. By administering a therapeutically effective amount of a compound (eg, an agonist antagonist) The risk of diabetes by preventing activation of diabetes-mediating proteins A method of preventing and / or treating diabetes in a subject having You. As a treatment method of the present invention, for providing a therapeutic agent to a subject in need thereof, Ex vivo methods known in the art may be mentioned. One object of the present invention is to identify proteins that mediate the pathogenesis of diabetes. is there. One object of the present invention is to provide an in vivo approach for the identification of diabetes-mediating proteins. Essay. Another object of the invention may prevent, delay or alleviate diabetes in a subject Diabetes-mediated proteins useful in assays to identify test compounds To provide. Another object of the invention is to identify protective or noxious diabetes mediating proteins. It is to provide a transgenic animal useful in the assay. Another object of the present invention is to provide a test compound capable of affecting the expression of a diabetes-mediating protein. Provide transgenic animals useful in assays to identify organisms That is. It is another object of the present invention to provide a method for treating natural or partially or completely artificial diabetes. A transgenic gene, such as a mouse, rat, or hamster, containing a mediator gene Host mammals (small (eg, less than 1 kg when fully grown) And maintenance is cheaper). One advantage of the present invention is that transgenic mammals are In a manner that is substantially faster, more effective, and cheaper than the Say method, Can be used to identify protective proteins that can prevent or inhibit the development of the disease That is. Another advantage is that the transgenic mammal has diabetes or Tested against test drugs that are effective in treating humans at risk of developing diabetes It can be used as an animal. Another object of the invention is to affect the expression of diabetes-mediating proteins and to A test compound that can prevent the onset of diabetes in a subject at risk of developing the disease. To identify or alleviate the symptoms of diabetes in a diabetic subject. Essay. These and other objects, advantages and features of the present invention are described below and in the claims. Diabetes-mediated gene (s) and more fully described by Protein (s), Assay Methods, and Transgenic Ma Reading the details of the mouse will become apparent to those skilled in the art. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIGS. 1A and 1B show a 24-hour incubation in RPMI 1640 + 0.5% normal human serum. And then [³⁵In newborn rat islet cells labeled with [S] -methionine for 4 hours 2 shows a fluorescence photograph of a two-dimensional gel of the expressed protein. Figure 1A shows an isoelectric focusing gel. Yes (IEF; pH3. 5-7). FIG. 1B is a non-equilibrium pH gradient electrophoresis gel (NEPHGE PH 6. 5-10. Five). Arrows indicate 105 diabetes-mediating proteins. FIG. 2 is the amino acid sequence of mouse mortalin. FIG. 3 is the amino acid sequence of human mortalin. FIG. 4 is the amino acid sequence of rat galectin. FIG. 5 is the amino acid sequence of human galectin. FIG. 6 shows the diabetes-mediating protein GR determined using the parameters shown in the figure. 75 (mortarin), IEF Spot No. 340 is a mass spectrum. FIG. 7 shows Ramin IEF Spot No. determined as indicated. Tentatively identified as 655 4 is a mass spectrum of a diabetic mediating protein. Figures 8-10 show pyruvate kinase NEPHGE Spot No. determined as indicated. 1 2 is a mass spectrum of a diabetes-mediating protein tentatively identified as FIG. 11 shows 6-phosphoburg tose-2-kinase NEPHGE S determined as indicated. pot No. 169 is the mass spectrum of a diabetes-mediating protein tentatively identified as 169. You. FIG. 12 shows the triosephosphate isomerase NEPHGE Spot determined as indicated. No. 1 is a mass spectrum of a diabetes mediating protein tentatively identified as 334. FIG. 13 shows fructose diphosphate aldolase NEPHGE S determined as indicated. pot No. 668 is the mass spectrum of a diabetes-mediating protein tentatively identified as 668. You. Figures 14-15 show molecular weights of 42,243 daltons and pIs determined as indicated. 82 to "IEF Spot No. 665, a novel diabetes-mediating protein mass It is a vector. FIG. 16 shows the molecular weight of 25,851 daltons and pI determined as indicated. Has 09 "IEF Spot No. 939 ", a novel diabetic mediator protein mass spec It is torr. Figures 17-18 show molecular weight 22,704 daltons and pI 5.determined as indicated. 15 to "IEF Spot No. 941 ”, a novel diabetes-mediating protein It is a vector. FIG. 19 shows molecular weights of 25,753 daltons and pIs determined as indicated. Has 53 "IEF Spot No. Mass spectrometry of a novel diabetes-mediating protein called "950" It is torr. Figures 20-23 show molecular weights of 143,064 daltons and pIs determined as indicated. 41 to "IEF Spot No. Mass of a novel diabetes-mediating protein called 1196 It is a spectrum. FIG. 24 shows the molecular weight of 65,522 daltons and pI 7. determined as indicated. Has 28 "IEF Spot No. Mass spectrometry of a novel diabetes-mediating protein called "7" It is torr. FIG. 25 shows the molecular weight of 115,709 daltons and pI 8. determined as indicated. Has 33 "IEF Spot No. Mass spec of a novel diabetes-mediating protein called "9" It is torr. FIG. 26 shows a molecular weight of 63,560 daltons and a pI of 7, determined as indicated. Has 26 "IEF Spot No. Mass spec of a novel diabetes-mediating protein called 102 It is torr. FIG. 27 shows a molecular weight of 57,040 daltons and pI 8. determined as indicated. Has 17 "IEF Spot No. Mass spectrometry of a novel diabetes-mediating protein called 123 " It is torr. Figure 28 shows a molecular weight of 57,609 daltons and a pI of 7, determined as indicated. Has 72 "IEF Spot No. Mass spectrometry of a novel diabetes-mediating protein called "129" It is torr. FIG. 29 shows a molecular weight of 55,734 daltons and pI 8. determined as indicated. Has 07 "IEF Spot No. 130 ”mass spectrometry of a novel diabetes-mediating protein It is torr. Figures 30-31 show molecular weights 53,830 daltons and pI 7. determined as indicated. 92 to "IEF Spot No. 174, a novel diabetes-mediating protein mass It is a vector. Figures 32-33 show molecular weights of 49,422 daltons and pI 7. determined as indicated. 40 to "IEF Spot No. 181 ", a novel diabetes-mediating protein It is a vector. Figures 34-35 show molecular weights of 54,098 daltons and pIs of 7, determined as indicated. 61 to "IEF Spot No. 182 ", a novel diabetes-mediating protein It is a vector. FIG. 36 shows a molecular weight of 47,925 daltons and a pI of 7, determined as indicated. Has 28 "IEF Spot No. Mass spec of a novel diabetes-mediating protein called 211 It is torr. FIG. 37 shows a molecular weight of 44,362 daltons and pI 8. determined as indicated. Has 34 "IEF Spot No. Mass spectrometry of a novel diabetes-mediating protein called 231 " It is torr. FIG. 38 shows a molecular weight of 43,162 daltons and a pI of 7, determined as indicated. Has 90 "IEF Spot No. 236 ”mass spectrometry of a novel diabetes-mediating protein It is torr. Figures 39-40 show molecular weights of 39,160 daltons and pi determined as indicated. 05 to "IEF Spot No. 253, a novel diabetes-mediating protein mass It is a vector. FIG. 41 shows a molecular weight of 34,600 daltons and pI 4. determined as indicated. Has 76 "IEF Spot No. 831 ”mass spectrometry of a novel diabetes-mediating protein It is torr. Figures 42-43 show molecular weights of 26,800 daltons and pIs determined as indicated. 49 to "IEF Spot No. 949, a novel diabetes-mediating protein mass It is a vector. Figures 44-46 show a molecular weight of 57,600 daltons and a pI of 7, determined as indicated. 72 to "IEF Spot No. 129 ", a novel diabetes-mediating protein mass It is a vector. FIG. 47 shows a molecular weight of 35,800 daltons and a pI of 7, determined as indicated. Has 57 "IEF Spot No. 310 ”mass spectrometry of a novel diabetes-mediating protein It is torr. FIG. 48 shows a molecular weight of 34,500 daltons and pI 8. determined as indicated. Has 62 "IEF Spot No. 326 "mass spectrometry of a novel diabetes-mediating protein It is torr. Detailed Description of the Preferred Embodiment Diabetes Mediating Proteins and Genes of the Invention Used in Assays, Assays Before the methodology and transgenics are described, the invention has been described in terms of the features described. Routine assay methods, diabetes-mediating proteins and genes, test compounds, or It is not limited to transgenic mammals, and therefore includes methods, genes, preparations, It should be understood that and animals can, of course, vary. Used in this specification The terms used are for the purpose of describing particular embodiments only, and It is intended that the scope of the invention be limited only by the appended claims. It is also understood that it is not shown. As used herein and in the appended claims, the singular forms “a”, “an”, And "the" have plural meanings unless the context clearly indicates otherwise. Thus, for example, "diabete-mediating protein" Or "diabete-mediating protein" Such a mixture of diabetes-mediating proteins comprises a "formulation (the formulation )) Or "the method" means one or more formulations, methods, And / or reading processes of the type described herein and / or And, consequently, steps which will be apparent to those skilled in the art. Unless otherwise specified, all technical and scientific Terms have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. I do. Any methods and materials similar or equivalent to those described herein can be used. Although preferred methods and materials can be used in the practice or testing of the present invention, , Described here. All publications mentioned herein are, with reference to the disclosure, Methods and methods in combination with the publications cited herein and cited herein. And / or describe the material. Definition The term “protein” refers to any post-translational variant (eg, processing, truncation) , Glycosylation, or phosphorylation); Includes peptides, which are chains of amino acids, which are often used to regulate protein function. Play a decisive role in The term also covers natural proteins, as well as Includes synthetic or recombinant proteins, polypeptides, and peptides. The term “diabetes” includes insulin dependent diabetes mellitus (IDDM) and type I diabetes. No. The term “diabetes related disease” refers to obesity, circulatory failure, insulin resistance, X disease Syndrome, diabetic retinopathy, diabetic neuropathy, and neuropathy and atheromatous movement Advanced glycation end products in pulse sclerosis (A GE) complications. The term "diabetes-mediated protein" refers to a protein involved in the development of diabetes I do. Diabetes-mediating proteins are proteins that show altered expression during the onset of diabetes. Expression of the same protein in the absence of diabetes Is up-regulated or down-regulated during the onset of diabetes as compared to Regulated protein, or its expression is up-regulated or down-regulated It is a protein. Diabetes-mediating proteins can also be used for diabetes or diabetes-related diseases. It also means a protein that is modified in accordance with the development of E. coli. In addition, interleukins 1α (IL-1α) inhibits insulin secretion in Langerhans Has adverse effects both in vivo and in vitro, and is It is expected to play an important role. Islet treatments increase their expression or dow This results in a modification of 106 proteins that regulates. For the purposes of the present invention , The term “diabetes mediating protein” is described in US Provisional Application No. 60 / 029,324, (October 1996 No. 60 / 030,186 (filed on November 5, 1996) and No. 60 / 030,088 No. (filed on Nov. 5, 1996) (all of which are incorporated herein by reference. In vitro, IL-α is expressed in rat islets as described in Therefore, all proteins that have been shown to be regulated (and their modified products) All) are also defined to include. The term “protein modification” refers to any change in the structure of a protein (eg, Qualitative changes). Such variants may have changes in amino acid sequence, transcription or Or translational splicing variants, pre- or translational to DNA or RNA sequences Macromolecules or small molecules to post-variants, DNA, RNA, or proteins (eg, , Peptides, ions, vitamins, atoms, sugar-containing molecules, lipid-containing Molecules, small molecules, etc.). One type of protein variant of the invention is characterized by one or more changes in the amino acid sequence. Replacement, deletion, or insertion). Such a change may be at one or more amino acids, Change from a charged amino acid to another charged amino acid, uncharged amino acid To charged amino acids, charged to uncharged amino acids (Eg, causing a difference in pi or possible molecular weight) You. Any other changes in the amino acid sequence can also be included in the present invention. Charged The overall position change in the gel of the modified protein having Also depends on the number of total charges present in the protein, as is known in the art. You. Changes in gel resolution (eg, changes in gel pH or other gradient components) May allow detection of major or minor amino acid sequence changes. This type The analysis of DNA can also be performed using, for example, sequencing, mass spectrometry, binding of labeled antibodies. , What changes are detected. Another type of modification affects how open reading frames are read in cells. Affect the length, structure, or direction of the DNA or RNA that encodes the protein Change. This causes large changes in the location of the spot on the gel And can affect the analysis of protein type and location in the gel. Another type of protein modification is a change in the protein's process in the cell. by. A non-limiting example is that some proteins have "address tags" (Here we identify their use inside (or outside) the cells). Such labels or tags may be added to or removed from the protein. To determine where the protein is located in the cell It can be in sugar or lipid form. Further types of protein modification are due to the attachment of other macromolecules to the protein . This group may include, but is not limited to, any addition / removal of such macromolecules. Not determined. These molecules can be of many types and can be permanent or temporary. It can be either. Examples include: (i) polyribosylation; ( ii) DNA / RNA (single or double stranded); (iii) lipids and phospholipids (eg, (I.e., membrane attachments); (iV) saccharides / polysaccharides; and (v) glycosylation (of many mutants Numerous different types of sugars and sialic acids-various single chains, increasing the possibilities And the addition of a branched structure). Another type of protein modification is by attachment to other small proteins. Examples and And including, but not limited to: (i) phosphorylation; (ii) Acetylation; (iii) uridylation: (iv) adenylation; (v) methylation, and (Vi) capping (for classification reasons, complex modifications of the N-terminus of the protein Distinguish). Most of these changes often regulate protein activity Used for (V) and (vi) also alter the half-life of the protein itself Used to Changes in these proteins can be achieved in several ways (eg, , Labels, changes in pI, antibodies, or other specificities directed to the molecule itself known in the art. Target Technology) can be detected by 2D. Changes in molecular weight are detected by 2DGE MALD (matrix of escape mass spectrometry) Matrix assisted laser desorption of flight mass spec trometry) is preferred for detecting and characterizing these modifications. The term “expression” refers to not only the physiological expression of a protein, but also the expressed It is meant to include the measurement of the activity of the protein. For example, proteins are in an inactive form Which is activated by phosphorylation. The actual source of protein Although it does not change at present, its effective expression (activity) has been modified. On the gel A change in sex can be measured as a change in expression of the altered form of the protein. You. The term "affected protein" refers to a protein that has been altered in expression or Means a structurally modified protein. Therefore, the affected protein Is the expression of one or more of the proteins in or out of the cell from which the protein is derived. Treatment with the compound, a disease or pathological condition, and / or an immunological change Thus, the protein may be modified. Alternatively or additionally, affected Proteins can also be up-regulated or down-regulated A protein that exhibits altered expression, or expression thereof, Or the same protein in the absence of immunological changes (ie, Not detectable by the method of the present invention as compared to the expression of The protein may be a protein whose structure has been modified by any method. The term “diabetes-mediated gene or polypeptide” refers to a protein, peptide, or Or genetic material that encodes a fragment of a protein, Encoding a novel diabetes-mediating protein or a fragment of a diabetes-mediating protein You. The term refers to any genetic material from any species that encodes a diabetes-mediating protein. Including children. The diabetes-mediating gene or polynucleotide can be naturally occurring, Or, some or all may be synthetic. When referring to a polypeptide, the term "substantially pure" means at least 60 % By weight contains protein and naturally occurring organic molecules (naturally associated) No, means polypeptide. Substantially pure diabetes-mediating proteins At least 75% by weight, more preferably at least 90% by weight, and most preferably Alternatively, at least 99% by weight is a diabetes mediating protein. Substantially pure Diabetes mediating proteins are extracted from natural sources; Diabetes mediating proteins By expression of a recombinant nucleic acid encoding the protein or by chemical synthesis of the protein Can be obtained. Purity can be determined by any appropriate method (eg, column chromatography). Raffy, polyacrylamide gel electrophoresis, or HPLC analysis) Can be As used herein, a "polynucleotide" is a separate fragment of a large construct. Deoxyribonucleotides or ribonucleic acids in the form of Refers to the nucleic acid sequence of leotide. Encodes part or all of the polypeptide of the present invention. DNA provides a synthetic gene that can be expressed in a recombinant transcription unit. It can be assembled from fragments or from oligonucleotides. The poly of the present invention Nucleotide sequences include DNA, RNA, and cDNA sequences, and can be from natural sources. Or from synthetic sequences synthesized by methods known in the art. As used herein, an "isolated" polynucleotide is the polynucleotide The polynucleotide is found in the naturally occurring genome of the organism from which the otide is derived. With any of the immediately contiguous (ie, covalently linked) coding sequences (ie, A polynucleotide that is not immediately continuous (one at the 5 'end and the other at the 3' end) It is. Thus, the term is used, for example, in vectors, autonomously replicating plasmids or Is a virus, or a set that is integrated into prokaryotic or eukaryotic genomic DNA Exist as separate polynucleotides, independent of other polynucleotides or other sequences Recombinant polynucleotides. This also codifies additional polypeptide sequences. Recombinant DNA that is part of the hybrid gene to be loaded. The isolated and purified polynucleotide sequences of the present invention are also described herein. Under stringent conditions to a polynucleotide sequence identified in The polynucleotide sequence to be released. The term "stringent conditions" Hybridization that guarantees specificity between hybridizing polynucleotide sequences Condition. One skilled in the art will reduce the number of non-specific hybridizations. Temperature and salt concentration so that only highly complementary sequences are identified. Post-hybridization washing conditions can be selected including (Sambrook et al., Molecula r Cloning, 2nd edition; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harb or, NY (1989), which is specifically incorporated herein by reference). For example, like this Conditions include hybridization under specialized conditions (eg, 5 × SSC Pre-osmosis with 20% formamide, 5x Denhardt's solution, 50 mM phosphoric acid Sodium (pH 6. 8), and in 50 μg of denatured sonicated bovine thymus DNA solution Prehybridization for 1 hour at about 40 ° C. followed by supplementation with 100 μM ATP (Including hybridization for 18 hours at about 40 ° C. in the same solution) (Samb rook et al., supra (1989)). The isolated and purified polynucleotide sequences of the present invention In addition, a sequence complementary to a polynucleotide encoding a diabetes mediating protein (A) Antisense sequences) and ribozymes. The terms "host animal" and "host mammal" refer to the animal into which the donor cells are transplanted. Used to describe. As simple host animals, mice, hamsters, and And rats. The terms “depleted diabetes-mediating protein gene” and “disrupted diabetes-mediating gene” "Gene" or the like is altered in a manner that renders the gene inoperable (eg, nucleotides). Endogenous diabetes-mediating protein genetics that have been added and / or removed) Are used interchangeably herein to mean a child. This is also It also includes removal or modification of regulatory sequences or regulatory genes that render the gene inoperable. Used for Terms such as "increased risk of developing diabetes" include genetically inclined to develop diabetes. Risk, preferably greater than 50%, more preferably greater than 60% Critical danger, even more preferably danger greater than 70%, even more preferred Or a risk of diabetes greater than 80%, and most preferably greater than 90% Means an animal at risk of disease. "Altered protein" or "altered protein expression" is an indication of the onset of diabetes During which its expression is increased ("up-regulated") and decreased ("Dow Regulated)), inhibited (ie, turned off) or induced Means a protein (ie, turned on). The term “modulates activity” and the like, for example, refers to agonists, antagonists, Alter the activity of the protein to prevent or enhance its normal activity. Or post-translational modification steps required for protein activity. This means that the activity of the protein is changed by checking. The terms “effective amount” or “therapeutically effective amount” refer to a desired physiological effect (eg, (Suppression or delay of the onset of the disease). As used herein, the terms “treatment”, “treat”, etc., refer to the desired pharmacological And / or generally to obtain a physiological effect. This effect Prophylaxis with regard to the complete or partial prevention of the disease or its symptoms. And / or partially reduce the disease and / or its harmful effects. , Or can be therapeutic with respect to complete healing. As used herein “Treatment” includes any treatment of a disease in a mammal, especially a human, and Including: (A) may be prone to disease but not yet diagnosed as having the disease Preventing the onset of the disease in the subject; (B) inhibiting the disease, ie preventing its onset; or (C) Alleviating the disease, ie, causing regression of the disease. Departure Ming describes diabetes, and related conditions mediated by diabetes, insulin deficiency, Or treating patients who have or are at risk for developing insulin resistance About doing. More specifically, "treatment" involves the risk of diabetes or Provides therapeutically detectable and useful effects in patients with diabetes It is intended to mean "Treatment" refers to therapeutic treatment and prophylactic or prophylactic (prev entative) measurement, where the purpose is to prevent the development of the disease or Is to delay. If you already have a disability as requiring action And those who are prone to have a disability or have a disability prevented Is mentioned. The terms “synergy”, “synergy” and the like are defined as the combination of one or more therapeutic agents. It is used herein to describe the resulting improved treatment effect. I Synergy in some areas means more than addition (eg, 1 + 1 = 3) However, in the medical field, addition (1 + 1 = 2) or less than addition (for example, 1 + 1 = 1. 6) The effects can be synergistic. For example, each of the two drugs Two drugs in combination if they prevent the development of diabetes by up to 50% when given Nothing can be expected to completely stop the onset of diabetes. In many cases, Due to unacceptable side effects, the two drugs cannot be administered together. In other examples When administered together, drugs offset each other and delay the onset of diabetes by less than 50% Let it. Therefore, the synergistic effect is that the two drugs delay the onset of diabetes by more than 50% But is said to be obtained without increasing unacceptable harmful side effects . Abbreviations used herein include: IDDM = Insulin dependent Diabetes mellitus; BB-DP = Diabetes-prone artificially mated (Bio-Breeding) rat; NOD = Non-obese diabetic mice. General aspects of the invention The invention includes several aspects: (1) in the presence of the onset of diabetes and Diabetes-mediated proteins identified by differential expression in the absence; (2) sugars To predict the onset of urinary illness and to influence the combination of DM proteins in the desired manner Patterns and combinations of DM proteins useful for identifying compounds that can affect (3) protective diabetes mediating protein; (4) adverse diabetes mediating protein; (5) one or more DM proteins in body fluids, their post-translational variants, or degradation products A method for diagnosing the onset or onset of diabetes based on the detection of an object; In vivo methods for identifying mediated proteins; A transgenic mammal containing an exogenous gene to be loaded; Useful tigers in in vivo assays to identify diabetics-mediated proteins Transgenic mammals; (9) identifying protective or noxious diabetes-mediating proteins Use transduced cultured cells that express useful diabetes-mediating proteins to In vitro assays; (10) for identifying protective or adverse diabetes mediating proteins Using transduced islet cells expressing useful diabetes-mediating proteins for In vivo assay; (11) Animals showing high incidence of diabetes within the expected time An improved animal model of human disease; (12) one or more protective proteins In vivo assays for identifying test compounds capable of inducing or enhancing expression (13) identifying test compounds that can inhibit or reduce the expression of harmful proteins Vivo assay method for (14) determining the therapeutically effective amount of protective diabetes mediating protein Treating diabetes in a mammal and / or providing diabetes For preventing or delaying the onset of diabetes; (15) protective diabetes-mediating protein Can induce or enhance expression of or modulate the activity of diabetes-mediating proteins By providing a therapeutically effective amount of a compound capable of treating diabetes in a mammal. A method for treating and / or preventing or delaying the onset of diabetes; (16) can inhibit or reduce the expression of noxious diabetes mediating proteins, or Providing a therapeutically effective amount of a compound capable of modulating the activity of a diabetes-mediating protein Thus, treating and / or preventing the onset of diabetes in a mammal. Or a way to delay. I. Diabetes mediating proteins, polypeptides, polynucleotides, and antibodies. The present invention relates to diabetes-mediating proteins, that is, Provides proteins identified as being affected during the onset of diabetes. Diabetes The mediator proteins have an expression whose ratio is relative to their expression in the absence of the onset of diabetes. In comparison, it is characterized as a protein that is altered during the onset of diabetes. Departure Ming's disclosure suggests that a two-dimensional gel database of pancreatic islet cell Identify mediated proteins. Diabetes mediating proteins include protective diabetes mediating proteins Quality and adverse diabetes mediating proteins. The present invention relates to their harmful or protective role in cytokine-mediated cytotoxicity. Sense or antisense in transfected cells to establish Sugars, including functional evaluation by expression of cloned cDNA as In vitro methods are provided for identifying a urinary mediated protein. Wrangellha Islet B cells are particularly sensitive to the toxic effects of cytokines. Heat shock tongue Lipofection of rat β cells with protein 70 (HSP 70) and exposure to IL-1 Exposure to hemin improved the in vitro viability of the isolated cells Xigenase (HO) induction has been previously shown (Karlsen et al., Insulin Secreti on and Pancreatic B Cell Research, P. R. Flatt and S.M. Lenzen edition; Smith-G ordon, USA, 499-507 (1994)). Cells can be obtained using a number of methods known in the art (eg, For example, by the adenovirus vector method). For example, Korbut et al., Transplantation Proceedings 27: 3414 (1995); Csete et al., 26: 756-757 (1 994); Becker et al. Biol. Chem. 269. See 21234-21238 (1994). Following the establishment of a stable transfected β-cell clone, The effect of protein expression is significant for proteins cultured in the absence and presence of cytokines. It can be determined by a functional analysis of the loan. Functional analysis is measured as nitrogen Nitric oxide production (NO) (Green et al., Anal. Biochem. 126. 131-138 (1982)) , Insulin secretion (Id), cytotoxicity, and 2D gel electrophoresis. cell Injury can be measured by various methods known in the art, including: (1 ) Colorimetric assay based on lactate dehydrogenase (LDH) release (cytoTox, Promeg a), (2) Calcein uptake and fluorescence in living cells, and nuclei in dead cells Viability assay based on ethidium bromide staining (Molecular Probes), (3) Non-radioactive cell proliferation assay (MTT, Promega), apoptosis (Nerup et al., IDDM, S . Baba and T.S. Edited by Kaneko, Elsevier Science, pp. 15-21 (1994)), and / or Is a semi-quantitative combined PCR analysis of gene expression. Two-dimensional gels identify responding proteins Used to compare controls with islets stimulated with cytokines. To identify proteins that play a role in the cellular response. Internal binding analysis defines functional groups of proteins and regulates them ( (Eg, by kinase phosphorylation or other post-translational modifications). Preferred cells for use in such assays are insulin secretion Cells (eg, MSL or RIN cells). MSL cell lines are pluripotent or stem cells Is a metastatic rat islet cell tumor cell line. In vitro and in vivo culture and And / or depending on the passage conditions, the MSL cells are characteristic of the islets of Langerhans, A total of four hormonal secretion phenotypes can result (Mandrup-Poulsen et al., Eur. J. Endocrinology 133: 660-671 (1995); Eur. J. Endocrinology, 134: 21-30 (1 996)). RIN cells are a culture of islet cell lung cells (Nielsen, Exp. Clin. Endocr inol. 93: 277-285 (1989)). Protective diabetes mediator protein. The present invention relates to a subject at risk of developing diabetes. Subjects capable of protecting against or developing diabetes in A substantially purified defense characterized by being able to alleviate the symptoms of diabetes in the body Provide diabetes-mediating proteins ("protection proteins"). Defense tank of the present invention Parkin can act directly to protect against diabetes, or it can act as a secondary defense Induces or increases the synthesis of control proteins, or It can act indirectly by reducing or inhibiting. In a specific embodiment, the invention relates to a substantially pure defense protein galect. Provides Chin-3. The sequence of the rat galectin (SEQ ID NO: 3) is shown in FIG. The galectin sequence (SEQ ID NO: 4) is shown in FIG. As shown below, Gal-3, expressed in the transfected cells, is transformed into cells upon challenge with IL-1β. Increase the survival of Galectins are present in fetal and living pancreatic islet cells Lectins specific for β-galactoside sugars or sugar conjugates. In this specification The term "substantially pure" as used refers to other proteins, lipids, carbohydrates, Refers to gal-3 that is substantially free of other naturally associated substances. Those skilled in the art Gal-3 can be purified using standard techniques for protein purification. gal-3 polypep Pide purity can also be determined by amino-terminal amino acid sequence analysis. gal- (3) As long as the protein maintains the protective activity, the functional flag of the polypeptide Including statements. Smaller peptides with gal-3 biological activity are included. The present invention further relates to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, Amino acid sequences having 80%, preferably 90%, and more preferably 95% identity including. The percentage of homology or identity can be determined, for example, by the University of Wisconsin Gene GAP computer program available from the tics Computer Group (UWGCG) ( Version 6. 0) can be determined by comparing the sequence information. GAP The program is available from Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981) Needlemann and Wunsch, J .; Mol. Biol. 48: 443 (1970) Arai Use the agreement method. Briefly, the GAP program is the shorter of the two sequences Similar to, divided by the total number of symbols (ie, nucleotides or amino acids) Define similarity as the number of certain aligned symbols. The GAP program The following are the preferred default parameters for (1) edited by Schwartz and Dayhoff, Atlas of Proteli Sequence and S tructure, National Biomedical Research Foundation, pages 353-358 (1979) One-way comparison matrix (1 for identity and non-identity About 0) and Gribsov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986) mass measurement comparison matrix; (2) 3. 0 pena 0 for each symbol in the tee and each gap. 10 penalties; and ( 3) No penalty for terminal gaps. The invention also relates to a computer system or a method according to the invention. Or purified or characterized. Where tampa The quality may be selected from the group consisting of: (A) Influenced by corresponding molecular weight and pI shown in Table 8 Not protein; (B) Affected with corresponding molecular weight and pI, as shown in Table 9 Protein; and (C) Marker tan with corresponding molecular weight and pI shown in Table 10. Parka, And here, at least one of the above proteins is, if necessary, Selected by: (I) affected by the corresponding molecular weight and pI shown in Table 11 Not protein; (Ii) affected with the corresponding molecular weight and pI, as shown in Table 12 Protein; and (Iii) marker markers having the corresponding molecular weight and pI shown in Table 13. Protein. Affected proteins or unaffected peptides according to the invention Are the affected or unaffected peptides (eg, 1-40 Two or more polypeps corresponding to the main or any range or value therein Tide domains (eg, transmembrane domains, cytoplasmic domains, hydrophobic domains, parent Aqueous domain, ligand binding domain, or pore lining domain) or its Includes Gment meetings. Peptides affected by the invention or unaffected Such domains of a new peptide should have at least 74% homology (eg, 74-100% homology or identity) or as described herein. One or more corresponding, affected or unaffected proteins Or, for a peptide domain, it may have any range or value therein. This As will be appreciated by those of skill in the art, the configuration of the above domains was affected by the present invention. Provided as part of the peptide or unaffected peptide, so that Proteins or peptides that are functionally affected or unaffected are Organisms found to affect islet cell types when expressed in appropriate cells Biological activity. Such activity may be affected or affected as appropriate. As determined by the activity assay of the uncoated protein or peptide, One or more affected or unaffected proteins or peptides of the invention Affected or unaffected protein or peptide activity of the peptide Establish the nature. Thus, or alternatively, an affected or unaffected peptide of the invention Is the shadow substantially corresponding to at least one fragment of 20 to 10,000 amino acids. Affected or unaffected protein or peptide amino acid sequence And / or affected or affected Of unaffected peptides or affected or unaffected peptides Includes consensus sequences. Where the affected or unaffected tamper The protein or peptide is at least 74-99% (eg, 88-99% (or Any range or value of (e.g., 87-99, 88-99, 89-99, 90-99, 91-99, 92-99, 93-99, 94-99, 95-99, 96-99, 97-99, or 98-99%)) homology Gender or identity can be determined according to the invention by the mass spectral characteristics of one or more proteins And as shown in one or more of Tables 8-13 or as shown in FIGS. At least one sequence or cons of at least one protein to be characterized Has for the census sequence. In one aspect, such affected or unaffected pep Pide is the production of affected or unaffected proteins or peptides. Physical activity can be maintained. Pep affected or unaffected by the present invention Tide is a non-naturally occurring or naturally occurring but non-naturally occurring form Preferably, it is purified or isolated by Preferably affected by the present invention Or the unaffected peptide is substantially one or more types according to the invention. In one or more of Tables 8-13, including SEQ ID NOs, having the mass spectral characteristics of the protein Has a protein of at least 10 contiguous amino acids, characterized in that The domain of the protein affected or unaffected by the invention. Substantially corresponds to the desired set. Alternatively or additionally, a pep affected or unaffected by the invention Tides are known domains of the protein (eg, 74-100% overall homology, or Or a cytoplasmic domain, an intracellular domain having any range or value therein. Transmembrane, extracellular, or other known domains) Contains at least one domain. Another domain may also include one or more Tables 8-13, FIGS. 2-7, including SEQ ID NOs, with mass spectral properties of the protein At least 10 contiguous amino acids characterized in one or more of the following: Encodes or has 74% homology to or Have codons replaced so that the same amino acid is encoded for a particular codon. At least 30 contiguous nucleotides under stringent conditions Encoded by DNA that hybridizes with In addition, phosphorylation (eg, P KA and PKC) domains may also be used in accordance with the present invention, as will be appreciated by those skilled in the art. Affected or unaffected peptides or encoding nucleic acid sequences Will be considered if provided. A non-limiting example of this is the protein 672- 674, where the same protein is separately phosphorylated. The invention further relates to a diabetes-mediating protein of the invention comprising DNA, cDNA and RNA sequences. Includes a polynucleotide sequence encoding the protein. All Diabetes Mediating Proteins Or all of the polynucleotides that code for a part of them, As long as it encodes a polypeptide having the property, it is included in the present specification. like this Polynucleotides are naturally occurring, synthetic, and intentionally engineered polynucleotides. Contains nucleotides. For example, such polynucleotides may be It can be subject to catastrophe. The polynucleotide sequence of the present invention may also comprise an antisense sequence including. Antisense sequences are synthesized using modified oligonucleotides. Including sequences. The polynucleotides of the present invention are degenerate as a result of the genetic code. Including the sequence These are the 20 natural amino acids, most of which are More than one^**Identified by codon. Therefore, all degenerate nucleotide sequences The sequence is an array of diabetes-mediating polypeptides encoded by the nucleotide sequence. As long as the amino acid sequence is not functionally altered, it is included in the present invention. The DNA sequence of the present invention can be obtained by several methods. For example, DNA Can be isolated using hybridization techniques well known in the art. This These include, but are not limited to: 1) Detect homologous nucleotide sequences Genomic or cDNA library hybridization with probes 2) Genome D using primers that can anneal to the target DNA sequence Polymerase chain reaction (PCR) for NA or cDNA, and 3) shared structure Expression lines to detect cloned DNA fragments with Bally antibody screening. Preferably, the DNA sequence of the present invention is from a mammalian organ, and is most preferably Preferably, it is of human origin. As long as the appropriate probe is available, Any screening from any organism can be performed by screening This allows the isolation of the gene sequence. A part of the sequence encoding the protein of interest The corresponding oligopeptide probe can be chemically synthesized. This is the amino acid sequence Requires that short oligonucleotide stretches must be known . The DNA sequence encoding a protein can be deduced from the genetic code, but only And code degeneracy must be considered. Biological codon bias is most likely Can be considered to select triplets of certain nucleotides. Array is degenerate In this case, it is possible to perform a mixed addition reaction. This is a denatured double strand Contains a heterogeneous mixture of DNA. For such screening, preferably, Eve Redidation is performed on either single-stranded DNA or denatured double-stranded DNA. Done. Hybridization is performed using mRNA sequences related to the polypeptide of interest. Is particularly useful for the detection of cDNA clones from a source when present in trace amounts. You. In other words, stringent hybrids to avoid non-specific binding The use of isomerization conditions allows, for example, a mixture that is its perfect complement. By hybridization of the target DNA to a single probe in the compound, Autoradiographic visualization of specific cDNA clones is possible (Sa mbrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Sprlng Ha rbor Laboratory Press, Plainview, NY (1989)). The generation of a specific DNA sequence encoding the diabetes-mediating protein of the present invention is described below. Thus, it can also be obtained: 1) isolation of a double-stranded DNA sequence derived from genomic DNA; Chemically manipulating the DNA sequence to provide the necessary codons for the desired polypeptide; And 3) double-stranded DNA by reverse transcription of mRNA isolated from eukaryotic donor cells In vitro synthesis of sequences. In the last case, double-stranded DNA complementary to the mRNA is finally formed This is commonly referred to as cDNA. Specific DNA arrangements for use in recombination procedures Of the three methods described above for producing sequences, isolation of genomic DNA isolates is the most complete. It is. This is particularly necessary for obtaining expression of a mammalian polypeptide in a microorganism. Especially correct where desired, due to the presence of introns. The synthesis of DNA sequences often involves the completion of the complete amino acid residue of the desired polypeptide product. This is the choice of method when the sequence is known. Amino acid residues of the desired polypeptide If the entire sequence of is unknown, direct synthesis of the DNA sequence is not possible, and The method of choice is the synthesis of a cDNA sequence. A standard for isolating the cDNA sequence of interest The standard procedure is a donor with a high level of gene expression for the protein of interest. Plasmid-containing cDNA or phage storage derived from reverse transcription of mRNA, abundant in cells This is the formation of a cDNA library. Polymerase chain reaction technology If used, more rare expression products can be cloned. Polypeptide When a significant portion of the amino acid sequence is known, it may be present in the target cDNA. A labeled single- or double-stranded DNA or RNA probe that doubles the predicted sequence The generation of the probe sequence is based on the cloned copy of the cDNA that has been denatured to single-stranded form. Used in DNA / DNA hybridization procedures (Jay et al., Nucl. Acid. Res. 11: 2325 (1983)). cDNA expression libraries (eg, λgtll) are specific for diabetes-mediating proteins Diabetes-Mediating Peptides Having At least One Epitope Using Different Antibodies Can be screened indirectly. Such antibodies can be polyclonal or Is obtained in any of the monoclonals and is indicative of the presence of the desired cDNA. It can be derived from the current product and used to detect it. The DNA sequence encoding the diabetes mediator is obtained by transfer of the DNA into an appropriate host cell. Can be expressed in vitro. A “host cell” is used to determine whether a vector can be propagated. Is the cell in which the DNA is expressed. The term also refers to any of the subject's host cells. Including descendants of It can be appreciated that not all progeny need be identical to the parent cell. You. This is because there may be mutations that occur during replication. But this Eel progeny are included when the term "host cell" is used. Stable introduction method and Indicates that it is known in the art that foreign DNA is continuously maintained in a host. means. In the present invention, the polynucleotide sequence encoding the diabetes-mediating protein is Can be inserted into a recombinant expression vector. The term "recombinant expression vector" Manipulated by insertion or incorporation of a sumid, virus, or Xi30 gene sequence Refers to other known vehicles in the art. Such an expression vector Includes a promoter sequence to facilitate efficient transcription of the primary inserted gene sequence. No. Expression vectors typically contain an origin of replication, a promoter, and a transformed vector. Specific genes that allow for selection of the phenotype of the cells in which they have been expressed. Suitable for use in the present invention Clear vectors include, but are not limited to, the following: Expression vectors based on T7 for expression (Rosenberg et al., Gene 56: 125 (1987)), PMSXND expression vector for expression in mammalian cells (Lee and Nathans, J. Bio l. Chem. 2633521 (1988)), and baculoyl for expression in insect cells. Derived vectors. The DNA segment is a regulatory element (eg, a promoter (eg, For example, T7, metallothionein I, or polyhedron promoter)) And may be present in a vector. The polynucleotide sequence encoding a diabetes-mediating protein may be prokaryotic or It can be expressed in any eukaryote. Hosts include microorganisms, yeast, insects, and mammals. May include animal organs. Prokaryotic DNA sequences with eukaryotic or viral sequences Methods for expression in cells are well known in the art. Expression and replication in the host Biologically functional viruses and plasmid DNA vectors that can be produced Known in the art. Such vectors are used to incorporate the DNA sequences of the present invention. used. Transformation of the host cell with the recombinant DNA can be accomplished by conventional methods well known to those skilled in the art. Can be done. If the host is a prokaryote (eg, E. coli), take up the DNA The resulting competent cells are isolated after exponential growth using procedures well known in the art. Vesicles are recovered and then CaCl_TwoIt can be prepared by processing according to the method. is there No, MgCl_TwoOr RbCl can be used. Transformation can also be performed if desired, This can be done after forming the protoplasts of the main cell. If the host is eukaryotic, calcium phosphate co-precipitation, conventional mechanical procedures (eg, Microinjection), electroporation, encapsulation in liposomes DNA transfection or virus, such as insertion of a buried plasmid Vector methods can be used. Eukaryotic cells also include the diabetes-mediating proteins of the present invention. DNA sequence encoding the protein and a second foreign D encoding the selectable expression system Can be co-transformed with an NA molecule (eg, herpes simplex thymidine kinase gene) You. Another method is to use eukaryotic viral vectors (eg, Simian Virus 40 (SV 40) or bovine papilloma virus) to infect, transform, or Transduction and use to express proteins (eg, For example, Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman, 1982). Microbial-expressed polypeptide or its flag provided by the present invention Isolation and purification are accomplished by preparative chromatography and immunological separation (mono (Including clonal or polyclonal antibodies) Can be done. 2DGE is preferred for the purification of engineered variants of proteins from each other It is a good method. Diabetes-mediated harmful proteins. Diabetes-mediated harmful proteins ("harmful proteins" ) Enhances the development of diabetes or increases the subject's risk of developing diabetes. It is characterized by increasing. The present invention relates to a substantially purified protective diabetes mediator tan. Including proteins and polynucleotide sequences encoding such proteins . In a preferred embodiment, the deleterious protein is mortalin. Mouse mouse The amino acid sequence of lutarin (SEQ ID NO: 1) is shown in FIG. 2, and human mortalin The amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) is shown in FIG. Antibodies specific for diabetes-mediating proteins. The diabetes-mediating protein of the present invention also comprises Anti-immunoreactive, or binds to an epitope of a diabetes-mediating protein It can be used to produce the body. Antibodies have essentially different epitope specificities Pooled monoclonal antibodies with different monoclonal antibody preparations Can consist of things. Monoclonal antibodies can be prepared by any method known in the art. Made from antigens containing fragments of proteins (Kohler et al., Nature 256: 495 (197 5); Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel et al., 1989). As used herein, the term "antibody" refers to an intact molecule and fragments thereof. (Eg, Fab, F (ab ') 2, and Fv), which bind to an epitope determinant. Can match. These antibody fragments selectively bind to its antigen or receptor. It retains some ability to combine and is defined as: (1) Fab (fragment containing a monovalent antigen-binding fragment of an antibody molecule) G) is an enzyme for producing part of an intact light chain and one heavy chain It can be produced by digestion of whole antibodies with papain; (2) Fab '(fragment of the antibody molecule) is composed of intact light chains and heavy Treatment of the whole antibody with pepsin to produce part of the chain, followed by reduction, results in Two Fab 'fragments per antibody molecule are obtained; (3) (Fab ') 2 (antibody fragment) is an enzyme fragment without subsequent reduction. Can be obtained by treatment of the whole antibody with Psin; F (ab ') 2 A dimer of two Fab 'fragments linked together by sulfide bonds; (4) Fv is expressed as two chains, the light chain variable region and the heavy chain Defined as a genetically engineered fragment containing the variable region; and (5) Single chain antibodies (“SCA”) are suitable as genetically fused single chain molecules. Variable region of the light chain and variable region of the heavy chain connected by a unique polypeptide linker Region is defined as a genetically engineered molecule. Methods for making these fragments are known in the art. For example, Ha rlow and Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labo ratory, New York (1988), incorporated herein by reference. . The term "epitope" as used herein refers to the paratope of an antibody to which it binds , Any antigenic determinant of an antigen. Epitopic determinants are usually Or chemically-active surface groups of molecules such as sugar side chains, and usually Three-dimensional structural characteristics and specific charge characteristics. An antibody that binds to the diabetes-mediating polypeptide of the present invention can be used as an immunizing antigen. Can be prepared using whole polypeptides or fragments, including small peptides You. The polypeptide or peptide used to immunize the animal is translated CDNA, or, if desired, chemical synthesis that can be coupled to a carrier protein Product. Such a commonly used key that is chemically bonded to a peptide Keyhole limpet hemocyanin (KLH), thyroglobulin, Bovine serum albumin (BSA), and tetanus toxin. Then joined The resulting peptide is used to immunize an animal (eg, a mouse, rat, or rabbit). Used for If desired, polyclonal or monoclonal antibodies can be, for example, Binds to the matrix to which the polypeptide or peptide from which the antibody is raised is bound. Or further purified by elution from the matrix. Skilled person Is the purification and / or concentration of polyclonal and monoclonal antibodies Know various techniques common in the field of immunology. For example, Coligan et al. , Chapter 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience (1994) (Book See, specifically, incorporated herein by reference). To produce monoclonal antibodies that mimic an epitope, anti-idiotypic It is also possible to use loop technology. For example, the first monoclonal antibody Anti-idiotypic monoclonal antibodies to create the first monoclonal In the hypervariable region, which is the "image" of the epitope bound by the antibody Has a binding domain of For the purposes of the present invention, antibodies or nucleic acid probes specific for diabetes-mediating proteins Probes to detect diabetes-mediating proteins in biological fluids or tissues (antibodies) To detect the encoding polynucleotide (using the nucleic acid probe). Can be used). Anti-diabetic protein or nucleic acid probe Antibodies that are reactive preferably allow for the detection of binding to a diabetes-mediating protein. Labeled with a compound. Contains detectable amounts of antigen or polynucleotide Any specimen that can be used. In addition, specific proteins are (Eg, galectin-3 binding to lectin binding protein) And is useful for diagnosis and / or purification of the protein of interest. When the cellular component is a nucleic acid, it binds to a diabetes-mediated protein-specific probe. It may be necessary to amplify the nucleic acid before. Preferably, the polymerase chain reaction (PCR) is used, but other nucleic acid amplification procedures (eg, ligase-linked In response, ligation-activated transcription (LAT) and nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) are used. obtain. II. Methods for identification of diabetes-mediating proteins In vivo animal transplantation model. The present invention relates to the development of diabetes or sugars. In vivo assays to detect proteins specifically affected during the development of urinary illness Methods for identifying diabetes-mediating proteins by providing a system Features. The in vivo transplantation assays of the invention described herein are of interest To identify proteins affected or affected. In a method for identifying a diabetes-mediating protein of the present invention, the method comprises the steps of: Cells that can grow into secretory or insulin-secreting cells are transplanted into the host animal . The transplanted cells are rescued at a point between the transplant and the onset of diabetes, and Protein expression is determined and develops non-transplanted islet cells and diabetes Synergistic implants and protein expression in non-diseased animals are compared. The method of the present invention Can identify proteins that show altered expression during the onset of diabetes I do. The identified protein is then isolated and used as a protective or adverse diabetes mediator. Further testing for identification as protein. Cells that can grow into insulin-producing cells include pancreatic islet cells and β cells. I can do it. The transplanted cells can be obtained from any species of interest, including humans . The host animal is preferably such that the transplanted cells are not rejected in the host animal. An animal that is immunologically compatible with the cells to be transplanted. The host animal can be any animal that develops diabetes and is convenient for research . Preferred host animals are mice, rats, and hamsters; And mice are most preferred. In a particularly preferred embodiment, the host animal is diabetic. Strains (including BB-DP rats and NOD mice) bred for increased disease incidence Is selected from The method of the present invention can also be used at predetermined times (eg, specific Can be used in a host animal that has been engineered to develop diabetes (during exposure to antigen). You. See, for example, Oldstone et al., APMIS 104: 689-97 (1996): von Herrath et al. Clin. Invest. 98: 1324-1331 (1996); Morgan et al. Immunol. 157: 978983 (1996) That. Other potential host animals include Mus (eg, mouse) and Rattu s (eg, rat), Oryctolagus (eg, rabbit), and Mesocricetus (eg, A genus selected from, for example, hamsters), and Cavia (eg, guinea pigs) And animals belonging to Generally less than 1 kg, easy to breed and maintain Mammals with normal, fully grown adult weight can be used. A method for determining protein expression. Protein expression can be one-dimensional or secondary Various techniques known in the art, including preparative gel electrophoresis and immunoblotting. Can be evaluated by rank. Two-dimensional gel electrophoresis (2-DGE) is especially useful for separating protein mixtures. This is an effective method (Andersen et al., Diabetes 44: 400-407 (1995)). Cell protein Quality extract is loaded on the gel, and the individual proteins are initially charged And then separated by size. The result is that each is usually a single tamper It is a characteristic photograph of about 1,000 to 5,000 spots, which are quality. The resolution is By increasing the size of the gel, as well as using radiolabelling, silver staining , And increasing sensitivity by reducing gel thickness to 1.5 mm or less To Therefore, it is improved. A method for the isolation of a diabetes mediating protein. As described in the examples below In addition, a single protein recovered from the 2D gel is used for the trypsin cleavage pattern of each peptide. And accurate molecular weight can be identified by mass spectrometry . These observed values are then compatible with previously identified proteins. DNA and protein databases to determine if any are present Used to search for. Can identity be determined from known proteins Or high homology to known proteins. 2D gel electricity Electrophoresis separates protein spots showing altered synthesis during the onset of diabetes And when used for identification, is the identified protein spot a gel? And excised with trypsin to produce the peptide. Pep The tide is recovered from the gel and analyzed by mass spectroscopy (matrix assisted laser -MS / MS subjected to absorption / ionization mass spectrometry (MALDI) Profiles are computed for all sequences found in the public sequence database. Analyzed for localized MS-profiles and for appropriate sequence information. It is. If you get some fit to a previously cloned sequence, Information about the corresponding gene and the encoded protein is gathered. same The defined diabetes-mediating protein matches the previously cloned protein. If not, the protein is microsequenced by methods known in the art. Thus, partial amino acid sequence information can be obtained (see Example 5 below). Based on results obtained from database searches or amino acid sequencing, Different or degenerate primers are constructed and rat and human islet libraries The first strand cDNA used to screen for Used to clone a partial sequence of the corresponding cDNA sequence. Then The resulting sequence can be used for 5'-race PCR or conventional hybridization screens. In order to obtain the full-length coding region by any of the Used for expression of proteins (Karlsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8). 337-8341 (1991); Karlsen et al., Insulin secretion and pancreatic B-cell resea rch, Flatt, PR, Ed., Smith-Gordon, USA; Chapter 64, pp. 1-9 (1994); Karlsen D iabetes 44: 757-758 (1995)). Diabetes-mediated proteins include purification from biological material, expression of recombinant DNA Can be isolated by various methods known in the art (see above). Conventional person The steps of the method are extraction, precipitation, chromatography, affinity chromatography And electrophoresis. For example, cells expressing diabetes-mediating proteins Can be recovered, dissolved by centrifugation or using a suitable buffer, and Column chromatography (eg, DEAE-cellulose, phosphocellose, Polyribocytidylate agarose, hydroxyapatite) or electrophoresis, Alternatively, the protein can be isolated by immunoprecipitation. Alternatively, diabetes-mediated tamper The proteins can be isolated by immunoprecipitation by use of specific antibodies. III. Transgenic animals expressing diabetes-mediated protein transgene . In one aspect, the present invention provides a gene encoding a diabetes mediating protein. Transgenic animals, and the progeny of the transgenic animals of the invention Including certain transgenic animals. Genes encoding diabetes-mediating proteins Is a naturally occurring polynucleotide sequence, or partially or wholly artificial Polynucleotide sequence (ie, where the codon sequence is present in the native gene sequence) No). Has elevated levels of expression of the diabetes-mediating gene of the invention The transgenic animal can be, for example, an enhanced promoter, and / or Can be obtained by gene overexpression using high copy number natural genes . Transgenic animals may also specifically include one or more diabetes-mediated protein genetics. Mating between the transgenic animal and the offspring (s) And hybrid transgenic animals. The transgenic animals of the present invention can be used to protect or possess a candidate in the onset of diabetes. Numerous methods, including assays to determine the effects of diabetes-mediated proteins It is useful in For example, a tiger having a transgene of a candidate defense protein Transgenic animals have been shown to have the effect of protective transgene expression during the onset of diabetes. Useful for making decisions. Preferred host animals are mice, rats, and hamsters; And mice have a lot of knowledge about the production of transgenic animals Most preferred in that respect. Mus (eg, mouse) as another potential host animal , Rattus (eg, rat), Oryctolagus (eg, rabbit), Mesocricetus (Eg, hamsters), and Cavia (eg, guinea pigs) Animals belonging to the genus are included. Generally less than 1 kg, easy to breed and maintain A mammal having a normal, fully grown living body weight can be used. The transgenic non-human mammal of the present invention (preferably, rat or mouse) ) Is introduced into the mammal or its ancestors at the embryonic or germ cell stage In addition, diabetes mediating proteins (eg, one or more protective proteins or harmful proteins) The gene encoding the protein is located in some or all of the nucleated cells. This “embryonic stage” is an arbitrary time concept based on all stages of fetal embryo development. (Eg, when the sperm or egg carries the foreign gene). Honcho A "transgenic animal" as used in the textbook is all or its nucleated cells or A mammal having, in some, one or more genes of the same or different species If the cells having the foreign gene include germline cells of an animal, the gene is It can be transmitted to descendants of things. The genetic constructs and methodologies of the present invention provide Used to create animals that develop and show symptoms of the disease at expected times Can be done. In a preferred embodiment, the transgenic mammal of the invention comprises Show an 80% incidence of diabetes in 70 ± 10 days, more preferably 90% in 60 ± 5 days Shows the incidence of diabetes; most preferably, shows a 95% incidence of diabetes in 55 ± 5 days And even more preferably exhibits a 97% incidence of diabetes in 50 ± 5 days. Departure Ming animals may be candidate protective or noxious diabetes-mediating proteins, or developing diabetes Used in assays to test the ability of a compound to prevent, enhance, or delay Is done. In one aspect of the invention, the genetic constructs and methodologies of the present invention are Creating animals with transgenes that encode protective or deleterious proteins Used for Transgenic animals are genetically susceptible to developing diabetes. Diabetes that can be selected or predictable by the background It can be a double transgenic animal that develops. In this embodiment of the invention Animal is a candidate protective protein that inhibits or reduces the incidence of the disease Used in assays to test the ability of In related aspects, The animal is used to test the ability of the compound to induce expression of a protective protein, and It is used in assays to protect animals from developing disease. In one aspect of the invention, the genetic constructs and methodologies of the invention To create animals that develop diabetes within the time expected by the genetic makeup of Used for For example, in one embodiment, such as, for example, mortalin Transgenic animals expressing adverse diabetes-mediated diseases are created. The present invention Of animals have test compounds that can prevent or delay the onset of diabetes. Used in assays. In one embodiment, the increase in copy number is a disease. Tend to reduce the time required for the onset of It is preferred to include a deleterious protein gene in the transgenic animal. In addition, modulation can increase the level of expression without increasing copy number. For example, it can be done with respect to the use of a particular type of enhanced promoter. Increasing the number of copies Specific that provides enhanced expression of the diabetes-mediated protein transgene without Types of enhanced promoters are known. Enhanced promoters are constitutive or inducible It can work in a proper way. The present invention also creates animal models for diabetes or diabetes-related diseases. To provide the means for: The transgenic animals of the present invention have the potential for diabetes. Provide a way to develop and test certain therapies, and ultimately cure the disease Lead. IV. For screening drugs that can result in the expression of diabetes-mediating proteins Assay. The assay method provided by the present invention also provides for the expression of diabetes-mediating proteins. Compounds that can produce diabetes and, thus, cause the development of diabetes in mammals. Useful for cleaning. Expression of one or more diabetes-mediating proteins One model for screening for potential drugs is to use cells in culture Compounds that are presumed to have beneficial effects on antisense oligonucleotides Administration). Useful cells include RIN, transfected cells, and Is an islet cell. The effect of the test compound on the expression of the protein is then Can be assayed by electrophoresis. Another screening model uses mammals at risk for developing diabetes In vivo method. Briefly, mammals with increased risk of diabetes (For example, BB rats or NOD mice that are prone to diabetes) Exposure, and the effect of exposure to the test compound on the development of diabetes is determined . Diabetes onset is determined by determining the expression of one or more diabetes-mediating proteins. The time of onset of the disease and the time of onset of the disease, It can be compared by comparing the onset and timing in the absence of the disease. One The above-mentioned determination of the expression of the diabetes-mediated protein is determined by the And later modified products, and / or diabetes-mediated proteolytic products. One fruit In embodiments, the activation of the diabetes-mediating protein is the activity of the diabetes mediator in the test sample. Determined by measuring the level of mediated protein expression. Appropriate test sun As a pull, body fluids (eg, blood, urine, or cerebrospinal fluid) or derived from them Liquids (eg, plasma or serum) are included. In certain embodiments, the test The level of protein expression in the sample is determined by Western blot analysis Is done. The proteins present in the sample are fractionated by gel electrophoresis, Labeled antibodies transferred to membrane and specific for protein (s) Probed with In another specific embodiment, the expression of the diabetes-mediating protein is Current levels are measured by Northern blot analysis. Polyadenylation [poly (A)⁺] MRNA is isolated from the test sample. mRNA is fractionated by electrophoresis , And transferred to a membrane. The membrane is probed with the labeled cDNA. Another In one embodiment, the protein expression is determined by applying a constant to the expressed mRNA. It is measured by quantitative PCR. In a more particular embodiment, the mammal capable of developing diabetes is developing diabetes. A mammal selected from a mammal strain that has been bred to increase the rate. Good Preferably, the mammal is selected from a strain that exhibits a 75% chance of developing diabetes in 69 ± 25 days. Is done. More preferably, the mammal has a high incidence of diabetes within the expected time period. In certain embodiments, the transgenic mammal is engineered to exhibit Transgenic mammals show an 80% incidence of diabetes in 70 ± 10 days More preferably, shows a 90% incidence of diabetes in 60 ± 5 days; most preferably Show an incidence of 95% diabetes in 55 ± 5 days; and even more preferably 50 ± 5 It shows a 97% diabetes incidence every day. In yet another aspect, the present invention provides a method for inhibiting the expression of endogenous harmful proteins or Is a method for identifying compounds that can be reduced, and a method for identifying endogenous harmful proteins. Administration of a therapeutically effective amount of a compound capable of suppressing or reducing the expression of Methods for preventing and / or treating a disease are provided. The diabetes-mediating proteins of the invention also modulate diabetes-mediating protein activity Useful for screening reagents. Thus, in one aspect, the book The invention involves incubating cells expressing a diabetes-mediating protein with a test reagent. Control the synthesis, phosphorylation, function, or activity of diabetes-mediating proteins Modulate the activity of diabetes-mediating proteins by measuring the effects of different test reagents And a method for identifying a reagent. Phosphorylation activates diabetes-mediated proteins , The test reagent is a diabetic mediating protein and γ-labeled-ATP or [³⁵S ] Incubated with any of the methionines, and the rate of phosphorylation It is determined. In another embodiment, the test reagent is a diabetes mediating protein polynucleotide. Incubate with cells transfected with the nucleotide expression vector And the effect of test reagents on the transcription of diabetes Measured by lot analysis. In a further embodiment, the diabetes-mediated tamper The effect of test reagents on protein synthesis was determined by using antibodies against diabetes-mediating proteins. As determined by Western blot analysis. In still another embodiment, The effect of the reagent on the activity of the diabetes-mediated protein is Test reagent, [³²P] -ATP, and substrates for the diabetes-mediated protein pathway Measured by cubating. All experiments involve the regulation of protein expression To determine the normal [₃₅[S] methionine labeled cells. Substrate The rate of phosphorylation of is determined by methods known in the art. The term modulation of diabetes-mediated protein activity can be defined as agonists and antagonists including. The present invention screens a reagent that inhibits the activity of a harmful protein Especially useful for. Such reagents are useful for treating or preventing diabetes. You. V. Treatment application The present invention provides a method of administering a therapeutically effective amount of a protective diabetes mediating protein to a mammal. Provided are methods for preventing and / or treating diabetes in a dairy animal. Good Preferably, the mammal is a human subject at risk for diabetes. Drugs using identified diabetes mediating proteins and related diabetes therapeutics cleaning. In the drug screening assays of the present invention, Or a test compound that a noxious diabetes-mediating protein can cause their expression. Used to determine Test compounds so identified are at risk Candidate to prevent, alleviate or delay the onset of diabetes in the subject It is a therapeutic drug. Test therapeutic compounds that result in the expression of diabetes-mediating proteins can be But not limited to: nucleic acids, compounds, proteins, elements, lipids, antibodies , Sugars, radioisotopes, carbohydrates, imaging agents, lipoproteins, glycoproteins , Enzymes, detectable probes, and antibodies or fragments thereof, or At least one selected from any combination thereof. These are referred to herein as Can be detectably labeled to label the antibody, as described in. Such a mark Knowledge includes, but is not limited to: enzyme labeling, radioisotope Element or radioactive compound or element, fluorescent compound or metal, chemiluminescence Compounds and bioluminescent compounds. Therapeutic compounds induce or enhance the expression of protective proteins, resulting in diabetes Preventing or delaying the onset of the disease in a subject at risk of developing The ability to identify in the drug screening assays of the invention. Candidate Of therapeutic compounds also prevent or reduce the expression of deleterious proteins, Preventing the onset of the disease in a subject at risk for developing diabetes or Identified by its ability to delay. Therapeutic nucleic acids as therapeutic compounds have at least one of the following: Has therapeutic effect, but not limited to: transcription of DNA sequence of harmful protein Inhibition of RNA sequence translation of harmful proteins; RNA corresponding to harmful proteins Or reverse transcription of DNA sequences; inhibition of post-translational modifications of proteins; protective proteins Induction of transcription of DNA sequences corresponding to quality; translation of RNA sequences corresponding to defense proteins Induction; induction of reverse transcription of an RNA or DNA sequence corresponding to a protective protein; protein Or translation of nucleic acids as enzymes; and constitutive or transient expression of therapeutic nucleic acids Integration of the nucleic acid into the chromosome of the target cell for development. The therapeutic effect of a therapeutic nucleic acid can include, but is not limited to, the following: Turn off harmful genes, such as sense RNA or DNA, or Inhibiting; inhibiting the replication or synthesis of the virus; Gene therapy to express a heterologous nucleic acid encoding the corresponding defective protein; hn Alters the deficiency or underexpression of RNA, such as RNA, mRNA, tRNA, or rRNA; , Prodrugs, or diseases that express diabetes-mediating proteins or peptides Produce compounds such as drugs or prodrugs in physical or normal cells Encoding the resulting enzyme; as well as any other known therapeutic effects. By providing a polynucleotide encoding a protective diabetes mediating protein Gene therapy is also included in the present invention. The present invention further provides a method for inhibiting the expression of noxious diabetes-mediating proteins in vivo. Includes a method for preventing diabetes by administering a therapeutically effective amount of a oligonucleotide. No. In the method of treatment of the invention, the therapeutic compound is administered to a human patient chronically or acutely. Is administered. If necessary, the protective protein is produced by a different route than the therapeutic compound. It is administered chronically in combination with an effective amount of the compound used. Therapeutic compounds of the invention The object can be used in conjunction with other treatments for diabetes or methods of managing diabetes. A therapeutic formulation of a therapeutic compound for treating or preventing diabetes can be administered to any physiological Acceptable carriers, excipients, or stabilizers (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Oslo, A., ed., 1980) with a compound having the desired purity. Prepared for storage in the form of a lyophilized mass or aqueous solution by It is. Acceptable carriers, excipients, or stabilizers determine the dosage used and Non-toxic to recipients at concentrations and include: phosphate, que Buffers, such as phosphates and other organic acids; antioxidants, including ascorbic acid; Molecule (less than about 10 residues) polypeptide; serum albumin, gelatin, or immuno Proteins such as globulin; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone An amino acid such as glycine, glutamine, asparagine, arginine, or lysine; Amino acids; mono-, di-, and glucose, mannose, or dextrin Other carbohydrates, including; Chelating agents such as EDTA; Mannitol or sorbitol Sugar-alcohols such as sodium chloride; salt-forming counterions such as sodium; And / or Tween, Pluronics, or polyethylene glycol (PEG) Nonionic surfactant. Compounds can also be made of various non-protein polymers (eg, For example, polyethylene glycol, polypropylene glycol, or polyoxya No. 4,640,835, U.S. Pat. No. 4,496,689; No. 301,144; 4,670,417; 4,791,192 or 4,179,337 Linked in a manner that is The amount of carrier used in the formulation is about 1-99% by weight Preferably between about 80-99% by weight, optionally between 90-99% by weight You. Therapeutic compounds used for in vivo administration must be sterile. this Can be prepared by methods known in the art (eg, prior to lyophilization and reconstitution or It is easily achieved (by later filtration through a sterile filtration membrane). Therapeutic compounds Is usually in lyophilized form or in solution. Therapeutic compositions generally comprise a container having a sterile contact hole, for example, an intravenous solution bag. Or into a piercable hypodermic needle vial with a stopper) Can be Administration of a therapeutic compound in a chronic manner is, for example, one of the following routes: intravenous Injection by intra-, intra-peritoneal, intra-cerebral, intra-muscular, ocular, intra-arterial, or intralesional route or Injection, oral, or using a sustained release system as described. Treatment Compounds can be injected or periodic bolus if clearance rate is slow enough Is administered continuously, or by administration to the bloodstream or lymph. Given. The preferred mode of administration is based on the target tissue (β cells or pancreatic cells). To target the molecule to the source, and the side effects of the compound To a minimum. Suitable examples of sustained-release preparations include solid hydrophobic polymers containing proteins. A semipermeable matrix. This matrix is composed of shaped particles (eg, (Eg, a film or a microcapsule). Example of sustained release matrix Examples include: polyesters, hydrogels (eg, poly (2-hydro Xyethyl-methacrylate) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277). (1981) and Langer Chem. Tech. 12: 98-105 (1982)), or Li (vinyl alcohol), polylactide (US Patent No. 3,773,919, EP 58,481) , A copolymer of L-glutamic acid and γ-ethyl-L-glutamate (Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983)), non-degradable ethylene vinyl acetate (Langer Lupron Depot, supra (1981))^TMDegradable lactic acid-glycolic acid copolymer such as -(Injection composed of lactic acid-glycolic acid copolymer and leuprolide acetic acid Microspheres), as well as poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid (EP 13 3,988). The therapeutic compound may also be in the prepared microcapsules, for example by Can be captured: coacervation technology or interracial polymerization (eg, For example, respectively, hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules , And poly- [methyl methacrylate] microcapsules) Drug delivery systems (eg, liposomes, albumin microspheres, Microemulsions, nanoparticles and nanocapsules) or microemers During Rejon. Such techniques are described in Remington's Pharmaceutical Sciences (supra). ). Polymers such as ethylene-vinyl acetate and lactic acid-glycolic acid Although molecules can release molecules for more than 0 days, certain hydrogels Release. If the encapsulated molecules are maintained in the body for a long time, they Exposure to moisture at 37 ° C. can result in denaturation or aggregation, loss of biological activity and This results in a possible change in immunogenicity. Reasonable strategies include, for example, The use of agents and the development of specific polymer matrix compositions have It can be devised for stabilization depending on the nuism. Sustained-release compositions also include delivery of therapeutic compound (s) entrapped in liposomes. Including. Liposomes containing the therapeutic compound (s) are known per se. Prepared by the following method: DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci . USA 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030 -4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Japanese Patent Application No. 83-118008; U.S. Patent Nos. 4,485,045 and 4,544,545 No .; and EP102,324. Usually, liposomes are small (about 200-800 Å Rohm) monolayer type, where the lipid content is greater than about 30 mol% cholesterol In addition, the selected ratio is adjusted for appropriate agonist treatment. Proper sustained release Specific examples of formulations are in EP 647,449. An effective amount of a therapeutic compound used therapeutically will depend, for example, on the therapeutic purpose, route of administration, and And the condition of the patient. Therefore, physicians need to obtain appropriate therapeutic effects. In such cases, it is necessary to titrate the dose and modify the route of administration. If the two therapeutic compounds are administered together, they will be by the same route and It need not be administered in the same formulation. However, these may be 1 if desired. May be combined in one formulation. Both therapeutic compounds, at their respective effective doses, Or less than optimal but effective when combined Can be administered. In one embodiment, the administration of both therapeutic compounds is used. Depending on the type of protein used for injection, for example, using intravenous or subcutaneous means According to Typically, a physician will suggest that the dosage be the desired effect for treatment or prevention of diabetes. The therapeutic compound (s) are administered until an amount is reached that achieves the desired result. An example For example, the amount is an amount that alleviates the symptoms of diabetes and restores euglycemia. The progress of this therapy is easily monitored by conventional assays. In a specific embodiment of this aspect of the invention, the therapeutic compound encodes gal-3. And post-translational modification products of protective diabetes mediating genes and / or gal-3. Teens A typical daily dose of a therapeutic compound used alone will depend on the factors described above. In the range of about 1 μg / kg / day to 100 mg / kg / day or more per patient's body weight, Preferably it is about 10 μg / kg / day to 50 mg / kg / day. Gene therapy. The present invention also relates to a method for improving or reducing a protective polypeptide. Gene therapy for the treatment of diabetes and diabetes-related disorders is provided. This Such treatments include the introduction of protective polynucleotides into insulin-producing cells. Achieve its therapeutic effect. Delivery of the protective polynucleotide is dependent on the chimeric virus. Achieved using a recombinant expression vector, or a colloidal dispersion system, such as obtain. For therapeutic delivery of sequences, the use of targeted liposomes is particularly preferred. Various viral vectors that can be utilized for gene therapy taught herein Adenovirus, herpes virus, vaccinia virus, or Preferably, an RNA virus such as a retrovirus is used. Preferably, Retroviral vectors for the transformation of cells in vitro may be mouse or It is a derivative of the avian retrovirus, adenovirus. Other transfer The advantage of adenovirus transduction over the transfection method is that Efficiency and the ability to transfect the entire island. In addition, the level of expression Can be adjusted by the concentration of virus used and the transduction time. Ade Virus-mediated expression is transient, but expression in islets is It is stable (Becker et al., J. Mol. Biol. Chem. 269: 21234 (1994); Korbutt et al., Transpl. antation Proc. 27: 3414 (1995)). For stable integration of the transgene into mammals, retroviral vectors Are preferred. Examples of retroviral vectors into which a single foreign gene can be inserted Include, but are not limited to: Moloney mouse leukemia Ills (MoMuLV), Harvey mouse sarcoma virus (HaMuSV), mouse mammary tumor Lus (MuMTV), and Rous sarcoma virus (RSV). Preferably, the subject is a human , A vector such as gibbon simian leukemia virus (GaLV) is used . Many additional retroviral vectors can incorporate multiple genes. This All of these vectors can introduce or incorporate the gene for the selectable marker, As a result, transduced cells can be identified and generated. For specific target cells C Together with another gene encoding the ligand of the By inserting a diabetes-mediating protein, for example, the vector may now be labeled Become specific. Retroviral vectors include, for example, sugars, glycolipids, or proteins. It can be made target specific by attaching the protein. Preferred targeting is This is accomplished using an antibody that targets the torovirus vector. Those skilled in the art Can be inserted into the viral envelope or attached to the viral envelope Retrovirus in which the specific polynucleotide sequence contains a protective polynucleotide Allows for target-specific delivery of the vector or can be performed without undue experimentation It can be easily confirmed. Because recombinant retroviruses are defective, they produce infectious virions. Need assistance to live. This assistance can, for example, control regulatory sequences in the LTR. Helpers containing plasmids encoding all of the retrovirus structural genes below It can be provided by using a cell line. These plasmids are Nucleotide enables a packaging mechanism that recognizes RNA transcripts for scidation Lacks the tide sequence. Helper cell line with deletion of packaging signal Include, but are not limited to, for example, $ 2, PA317, and And PA12. These cell lines produce empty virions. Because the genome is This is because caging is not performed. Retrovirus vector is used for packaging The signal is complete, but the structural gene has been replaced with another gene of interest. The vector can be packaged when introduced into a cell such as Turvilions are produced. Alternatively, NIH 3T3 or other tissue culture cells can be The retroviral structural genes gag, pol, and env Can be directly transfected with the plasmid to be loaded. These cells then Transfected with a vector plasmid containing the gene of interest. Get Cells release the retroviral vector into the culture medium. Another targeted delivery system for protective polynucleotides is a colloidal dispersion system. Stem. Macromolecule complex, nanocapsule as colloidal dispersion system , Microspheres, beads, and oil-in-water emulsions, micelles, and mixtures Micelle and lipid-based systems, including liposomes. Of the present invention A preferred colloidal system is a liposome. Liposomes are used in vitro And artificial membrane vehicles useful as delivery vehicles in vivo. 0. Two ~Four. Large single-layer vesicles (LW) in the size range of 0 μm A substantial proportion of the aqueous buffer containing RNA, DNA, and complete Whole virions can be encapsulated within a water-soluble interior, and (Fraley et al., Trends Biochem. Sci. 6:77 (1981). Nursing In addition to mammalian cells, liposomes can be used in plant, yeast, and bacterial cells It has been used to deliver leotide. Liposome-effective gene delivery To be a creature, the following properties should be present: (1) their biological Encapsulates the gene of interest with high efficiency without damaging its activity; Preferential and substantial binding to target cells compared to target cells; (3) high Delivering the water soluble content of the vesicles to the cytoplasm of the target cells with high efficiency; and (4) Rapid and effective expression of genetic information (Manning et al., Biotechniques 6: 682 (1988)) . The composition of the liposome is usually a combination of phospholipids, usually , Especially high phase transition temperature phospholipids in combination with cellulose (especially cholesterol) It is a combination of quality. Other phospholipids or other lipids can also be used. Lipo Physiological properties of the somes depend on pH, ionic strength, and the presence of divalent cations You. Examples of lipids useful for producing liposomes include phosphatidyl compounds (eg, Phosphatidyl-glycerol, phosphatidylcholine, phosphatidylserine , Phosphatidylethanolamine, sphingolipids, cerebroside, and gas Ngrioside). The lipid moiety has 14-18 carbon atoms (especially 16-18 Diacylphosphatidylglycerol containing and saturated with Is particularly useful. Exemplary phospholipids include egg phosphatidylcholine, di Palmitoylphosphatidylcholine and dipalm itoylphosphatidylcholine And disteroylphosphatidylcholine. Liposomal targeting can be categorized based on structural and mechanical factors. Structure Structural classification is based on selectivity (eg, organ-specific, cell-specific, and organelle-specific) Gender) level. Mechanical targeting is either passive or active. A distinction can be made based on whether there is. Passive targeting involves sinusoidal capillaries Takes advantage of the natural tendency of liposomes to be distributed in cells of the reticuloendothelial system (RES) of organs . On the other hand, active targeting involves specific ligands (eg, monoclonal antibodies, Coupling of liposomes to sugars, glycolipids or proteins) or natural Resources to achieve targeting to organs and cell types rather than localization sites Includes modification of liposomes by changing the composition or size of the posome No. The surface of the targeted delivery system can be modified in various ways. Liposome targeting In the case of delivery systems, the group of lipids comprises a target ligand stably associated with the liposome bilayer. For maintenance, it can be incorporated into the lipid bilayer of the liposome. Various crosslinking groups, Can be used for linking lipid side chains to target ligands. This is because the biological activity of the therapeutic compound enhances the synthesis of secondary therapeutic compounds. Of the present invention, including application to disorders associated with the expression of secondary proteins such as There are a variety of applications that use polypeptides or polynucleotides. The present invention provides an improvement or moderation by regulating the expression or activity of a noxious diabetes-mediating gene. Provided are methods for treating diabetes and diabetes-related disorders. The present invention In one specific embodiment of this aspect of the invention, the noxious diabetes mediating gene is Code Tallinn. The term “modulation” envisages suppression of mortalin expression. When suppression of harmful protein expression (for example, suppression of mortalin) is desired Nucleic acid sequences that interfere with the expression of mortalin at the translational level may be used. This The approach can be, for example, an antisense nucleic acid, a ribozyme, or a specific maltari A triplex reagent that blocks transcription or translation of mRNA Mask with antisense nucleic acid or tripartite reagent, or ribozyme Available by either cutting. An antisense nucleic acid is a DNA that is complementary to at least a portion of a particular mRNA molecule. Or an RNA molecule (Weintraub Scient1fic American 262: 40 (1990)). cell In, the antisense nucleic acid hybridizes to the corresponding mRNA to form a double-stranded molecule I do. Antisense nucleic acids interfere with the translation of mRNA. Because cells are double-stranded Is not translated. Antisense oligomer of about 15 nucleotides Is preferred. Because they are easily synthesized and target mortalin Are they less likely to cause problems than longer molecules when introduced into producer cells? It is. The use of oligonucleotides for stall transcription is a three-part strategy. It is known as This is because oligomers spread around double-stranded DNA This forms a triple-stranded helix. Thus, these three-part compounds are: It can be designed to recognize unique sites on selected genes (Maher et al., Anti sence Res. and Dev. 1: 227 (1991); Helene, Anticancer Drug Design, 6: 569 (1 991)). Ribozymes bind other single-stranded RNA in a manner similar to DNA restriction endonucleases. An RNA molecule that has the ability to specifically cleave. Code for these RNAs Specific nucleotide sequence in an RNA molecule through alteration of the nucleotide sequence It is possible to manipulate the molecule that recognizes and cleaves it (Cech J. et al. Am er. Med. Assn. 260: 3030 (1988)). The main advantage of this approach is that they Because it is sequence-specific, only the mRNA having a particular sequence is inactivated. You. Two basic types of ribozymes, the tetrahymena type (Hasselhoff Nat) ure 334: 585 (1988)) and the "hammerhead" type. Tetrahymena Ribozymes recognize sequences that are four bases long, while “hammerhead” ribozymes Zyme recognizes base sequences of 11 to 18 bases in length. The longer the recognition sequence, the more Is more likely to occur exclusively in the target mRNA species. As a result, the hammer Ribozymes are used to inactivate certain mRNA species. Preferred over Zymes, and an 18 base recognition sequence is preferred over shorter recognition sequences. Good. Either anti-mortalin antibody or mortalin antisense polynucleotide By blocking the action of mortalin, it is possible to delay or improve diabetes May be useful for The above method for delivering a protective polynucleotide comprises: If desired, to specifically block mortalin expression and / or activity Applicable for delivering mortalin antagonists for Mole Talin antagonists include mortalin antibodies, antisense polynucleotide sequences Or a compound that suppresses or inhibits the expression of mortalin. Identification and characterization of diabetes-mediating proteins High resolution two-dimensional (2D) gel electrophoresis results in approximately 2500 protein spots Each spot can be used for separation, with each spot corresponding to a protein according to molecular weight and pI. Hit. Complementation of 1373 WF rat islet proteins with 81% qualitative reproducibility Recently, a compiled 2-D gel database has been reported (Andersen et al. D iabetes 44: 400-407 (1995)) (FIGS. 1A-1B). IL-1β is in vitro Induced changes in expression of 82 proteins in cubated BB-DP islet cells It is shown to be. BB-DP islands collected from animals after the onset of diabetes In vitro incubation was performed with 82 proteins determined to respond to IL-1β. We show that 33 of the proteins show significant changes in expression at the onset of diabetes. Based on the results of 2D gel analysis and peptide sequencing or mass spectrometry analysis Several candidate diabetes-mediating proteins have been identified (Table 1) and And iNOS, mortalin, and gale Including Kuching-3 (Madsen et al., Insulin secretion and pancreatic B cell research , P. R. Flatt and S. Lenzen ed., Smith-Gordon, USA, 61-68 (1994)). man Cancer superoxide dismutase (MnSOD) is an adenovirus-mediated gene Transfer to beta cells and whole islets of Langerhans using offspring transfer and expression Has been cut. Transfection is stable or transient. Includes the production of isolated cells. Transfection, subcloning, and CMV or insulin pro Under the control of a motor, the coding region of the protein of interest or the antisense fraction After establishing a stable RIN clone to express, the diabetes-mediated protein of interest will function Characteristically. Preliminary results indicate that 100% transduction in RIN cells and And up to 70% transduction in isolated and isolated islets. First, transfect Increased or decreased expression of proteins in isolated cells is indicative of NO production, insulin Characterized in vitro by measuring secretion and / or cytotoxicity. You. In addition, cell cycle and mitochondrial activity were determined by FACS analysis (Mandrup-Poulse n et al. Diabetes / Metabolism Reviews 9: 295-309 (1993)), and multiple PCs R (Nerup et al. Anales Espanoles Pediatria 58: 40-41 (1994)) Can be determined by semi-quantitative analysis of gene expression. In addition, protein The secondary cellular effects of overexpression or underexpression, as well as post-translational modifications, are It can be characterized by 2D gel electrophoresis of the transfected cells. This analysis , Primary effects on IL-1β-induced changes in protein expression patterns And secondary effects are allowed. To establish IL-1β-induced changes in islet cells, NO production and insulin Release is detected by IL-1β exposure and protein changes resulting from IL-1 exposure BB-DP in vitro after 2D gel electrophoresis with high resolution The measurement was performed on the island (Example 2). NO production on control islands and Insulin release was similar to that observed on WF islets. IL-1β produces NO 4. 4.times and insulin release 3. Inhibited 4 times. 2D gel analysis showed that IL-1β was 82 Shows that the expression of 22 proteins was changed. And 60 proteins were down-regulated. BB-DP islands implanted in 30-day-old BB-DP rats, also using high resolution 2DGE Changes in protein in the cognate graft were detected (Example 3). Newly Diabetes In BB-DP island cognate grafts from BB-DP rats with disease, these 82 Fifteen of the proteins were found to alter the level of expression, but WF island cognate transplants Not found in the strip (Example 4). IL-1β-induced changes in protein expression in vitro were assessed by BB-DP In the process of disease development in grafts (Example 4) or BB-DP island allograft Compared to protein changes in one rejection (Example 6). New onset of diabetes Of these 82 proteins in BB-DP islet cognate grafts from BB-DP rats Of the WF island cognate were found to have altered levels of expression. Was not found. Tamper showing altered expression with the onset of diabetes in a cognate transplanted islet The quality was further characterized (Example 5). The spot of the changed protein One of them is to determine the heat shock 70 protein (mortalin) by amino acid sequencing. Was identified to have high homology. Is heat shock 70 protein perinuclear? After translocation of this constitutively expressed protein to the cytoplasmic region Have been demonstrated to be involved in cell death and apoptosis (Wadhwa et al. Bi ol. Chem. 268: 6615 and 268. 22239 (1993)). Based on the amino acid sequence, Tallinn cDNA has been identified for further characterization of its involvement in diabetes development. And human islets. Rat-in under CMV promoter Overexpression of mortalin in Sulinoma (RIN) beta cells is lethal to beta cells there were. Another diabetes-mediating protein has been identified as galectin-3. Galectin -3 (gal-3) is spot IS (twice phosphorylated), spot on the 2D gel. To 16 (single phosphorylated) and spot 19 (not phosphorylated) (Andersen et al., Diabetes 44: 400-407 (1995)) (Example 5). gal-3 Is a protein involved in islet development and inhibition of apoptosis. Nucleoti Using the nucleotide sequence, gal-3 was cloned from rat and human islets and After selection of cloned and stable clones, they were expressed in RIN cells. g RIN cells expressing al-3 show increased metabolic activity and growth rate, Become more resistant to the negative effects of Inn. In vivo expression of gal-3 The effects of 200 neonatal islets on 30-day-old diabetic prone bio-Breeding rats (BB-DP ) Was studied (Example 8). NIGMS (National Institute of General Medical Science) human / rat body Cell hybrid mapping panel No. 2 and second intro of gal-3 gene Further studies using primers from chromosomes mapped gal-3 to chromosome 14. . Using the same primers, P1 clone was cloned from GenomeSystems, Inc. Obtained from F Used for ISH. Initial FISH results from 48 measurements were localized to the 14q13 region. 6. 2%, localized to the 14q21 region54. 2%, and localized to 14q22 region 39. 6%. This is 14q21. The terminal positions in the three regions are shown. An inducible nitric oxide synthase (iNOS) has been cloned (Karlsen et al. Diabe tes44: 753 (1995)). The INOS gene maps to mouse chromosome 11, which Is the middle of the idd4 region (identical as the diabetic linkage region in diabetic NOD mice). Region (Gerling et al., Mammalian Genome 5: 318 (1994)). Fiber When expressed as a recombinant protein in blast cells, recombinant iNOS is enzymatically It was found to be active. Manganese superoxide dismutase (MnSOD), by 2D gel analysis, Identified as a down-regulated protein. MnSOD expression is Β-cells and islets in vitro and in vivo after virus transduction and transplantation In cells, it was further characterized. Mitochondrial isocitrate (isocltat e) Dehydrogenase was identified as a diabetes-mediating protein. Changes in protein expression associated with allograft rejection were also measured. Neonatal BB-DP islet cells transplanted into 30-day-old WK rats were harvested 12 days later, Then, the expression of the protein was measured (Example 6). BB-DP island in WK rats In seed transplants, 9 out of 82 proteins had altered levels of expression. But not in WF island cognate grafts. Both cognate and allografted BB-DP islets are in vitro Proteins found to change expression levels during BB-DP island IL-1 exposure BB-DP was not transplanted. Induced by transplantation procedure To control for protein changes, 200 neonatal WF islands were converted to 30-day-old WF Was transplanted to In colonies and in cognately transplanted BB-DP rats At 48 days post-transplant, corresponding to the mean time to onset of diabetes, grafts were harvested . 105 cells previously found to be altered during IL-1 incubation For protein, transplant as described for comparison with WF control islets The strips were processed and analyzed. This is due to both IL-1 and islet cognate transplants. To identify protein-induced protein changes, as well as rejection-specific proteins Was made to identify To further determine the potential role of these proteins in the etiology of diabetes And therapeutic compounds and compounds that induce the expression of therapeutic compounds. To carry the gene encoding the candidate protein, and Generate transgenic animals that can express candidate proteins under promoter Is done. The transgenic animal of the present invention comprises an insulin promoter, Specific promoters such as promoters, CMV promoters, or HLA promoters. Under a promoter, a candidate protein is expressed. First, an adenovirus-mediated, run in the absence of vector-induced toxicity Research to determine optimal conditions for gene transfer to Gelhans Island Was. As described in Example X, islet adenovirus-mediated transduction Produces dose-dependent efficient gene transfer and stabilizes transgenes in the absence of toxicity Was expressed. Example The following examples illustrate chimeric genes, transgenic mice, and For a complete disclosure and explanation of how to make and use assays and assays, see It is described for the purpose of providing to those skilled in the art, and It is not intended to limit the range considered. Regarding the number used (for example, Efforts have been made to ensure accuracy (e.g., amount, temperature, etc.) but some experimental errors have been made. Should be taken into account, and the deviation should be taken into account. Unless stated otherwise, Parts are percentages by weight, molecular weight is weight average molecular weight, and temperature is in degrees Celsius. And the pressure is at or near atmospheric. Example 1 Materials and methods reagent. Ketamine from Park-Davis (Barcelona, Spain), xylazine from Bayer 1, UK). RPMI 1640, Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), and DMEM , Gibco, Paisley, Scotland. RPMI 1640 contains 11 mmol D-glucose 20 mM HEPES buffer, 100,000 IU / l penicillin, and 100 mg / l strept Mycin was supplemented. Authentic recombinant human IL-1β was obtained from Novo Nordisk Ltd. (Bagsv aerd, Denmark) and had a specific activity of 400 U / ng. Other reagents used: 2-mercaptoethanol, bovine serum albumin (BSA), T ris HCl, Tris base, glycine, (Sigma, St. Louls, USA); trichloroacetic acid (TCA), phosphoric acid, NaOH, glycerol, n-butanol, bromophenol blue ー, sodium nitroprusside (SNP), H_ThreePO_Four, And NaNO_Two(Merck, Darmstad t, Germany); filters (HAWP 0.25 mm pore size) (Millipore, Boston, U SA); RNAse A, DNAse I (Worthington, Freehold, NJ, USA);³⁵S] -Metio Nin (SJ 204, specific activity:> 1.000 Ci / mmol, containing 0.1% 2-mercaptoethanol (Schwarz / Mann, Cambridge, MA, USA); acrylamide, bisacrylamide , TEMED, ammonium persulfate (BioRad, Richmond, CA, USA); amphoteric electrolytes: pH 5-7, pH 3.5-10, pH 7-9, pH 8-9.5 (Pharmacia, Uppsala, Sweden); N onident P-40 (BDH, Poole, UK); ampholytes: pH 5-7 and dodecyl sulfate Sodium (Serve, Heidelberg, Germany); Agarose (Litex, Copenhagen) , Denmark); ethanol (96% anhydrous) (Danish Distillers, Aalborg, Denmark) ); Methanol (Prolabo, Brione Le Blanc, France); acetic acid (industrial, 99% ice) (Bie & Berntsen, Arhus, Denmark) and X-ray film (Curix RP-2) ( AGFA). animal. 30 (28-32) day old BB / Wor / Mol-BB2 (BB-DP) rats, Wistar Furth (W F) Rats and Wistar Kyoto (WK) rats were purchased from Mollegarden, Ll, Skensved, De Purchased from nmark. In Mollegarden and at Steno Diabetes Center / Hage The BB-DP laboratory was installed at the animal facility of the dorn Research Institute (Gentofte, Denmark). The plants were housed separately in a specific pathogen-free environment. All rats Is light (lighting from 6:00 am to 6:00 pm) from 5 days before transplantation until sacrificed, They were raised under controlled conditions of humidity (60-70%) and temperature (20-22 ° C). Rats are fed a standard rat diet (Altromin, Chr. Petersen A / S, Ringsted, nmark), and given free access to tap water. 4-5 day old BB-DP rats And WF rats were collected at Mollegarden in the morning of the day of islet isolation, and Transported in a shipping box. Transplant procedure and graft recovery. Newborn islands as previously described (Korsgr en et al. J. Clin. Invest. 75: 509-514 (1990)), 28-32 days old recipient under sterile conditions It was transplanted under the kidney capsule of the rat. Diabetes incidence is based on male and female BB-DP Similar in mice (Pries et al. Frontiers in Diabetes Research: 8 : 19-24 (Shafrir, E. eds.), Smith-Gordon, London (1991)), both genders, etc. Used properly. Potential risk of graft rejection due to any gender-related incompatibility Transplant male islets into male recipients and reduce female islets to reduce Transplanted into female recipients (Steiner et al., Electrophoresis 16: 1969-1976 (199 Five)). 200 (range: 187-215) islands, 10ml Transpferpettor (Brand, Germany) ) Collected by hand using a pipette. Sediment the island, and as much as possible The rinsing was removed prior to implantation in a volume of 1-2 ml. Weigh the recipient rat, And blood glucose (BG) was measured. The rats were then treated with ketamine (8.75 mg / 100 g) and xylazine (0.7 mg / 100 g) intraperitoneally. Make a small incision in the left kidney Performed on the gut, the kidney was lifted forward and a small incision was made with a knife. flat Holes were gently made in the coating using a razor instrument. Move the island to the lower pole of the kidney Placed under the membrane. Suture muscles and skin and place rat in basket at surgical facility Give Temgesic (0.01 mg) subcutaneously in the neck before returning to the animal facility Was. For three days after transplantation, rats received Temgesic twice daily. Blood glucose ( BG) was measured every three days. The rat is killed by cervical dislocation and then Immediately, the transplanted kidney was removed. Transplant the kidney and capsule under a microscope Were carefully dissected and placed in HBSS. Graft and islet labeling. Implants were labeled immediately after collection. The cultured islets are replaced with IL After 24 hours of incubation with or without -1, labeling was performed. Graft And islets were washed twice in HBSS and dialysed against amino acids for 10% NHS , And 330 mCi [35S] -methionine for grafts, or 200 mCi [35S] for islets ] Methionine-free Dulbecco modified Eagle medium containing any of methionine ( (DMEM) in 200 ml at 37 ° C. for 4 hours. Remove 2-mercaptoethanol [35] -methionine was lyophilized for at least 4 hours prior to labeling . After labeling, the grafts and islets were washed three times in HBSS, the supernatant was removed, and the tissue Was immediately frozen at -80 ° C. Sample preparation. The frozen graft was crushed in a mortar. 10 grafts and islets Resuspend in 0 ml DNAse I / RNAse A solution and thaw by two freeze-thaw cycles did. After the second thawing, the sample is left on ice for 30 minutes for nucleic acid digestion, Then freeze-dried overnight. Samples were dissolved in 120 ml lysis buffer (8.5 M urea, 2% Nonid ent P-40, 5% 2-mercaptoethanol, and 2% ampholyte, pH range 7-9 ) In a minimum of 4 hours by shaking. Measurement of [35S] -methionine incorporation. The amount of [35S] -methionine uptake was reduced to 10 mg BSA ( 0.2mg / ml H_TwoO) as a protein carrier to 5 ml of a 1:10 dilution of each sample Quantification was performed by adding in duplicates and then adding 0.5 ml of 10% TCA. This This was allowed to settle at 4 ° C. for 30 minutes, after which it was filtered through a 0.25 mm HAWP filter. Filters were dried and placed in scintillation fluid for counting. 2-D gel electrophoresis. This procedure has been described previously (O'Farrell et al., Cell 1 2: 1133-1142 (1977)). Briefly, one-dimensional gels are 4% acrylamide, 0.25% Contains acrylamide and ampholytes. Equivalent count of each sample (10 6 cpm) was applied to the gel. For lower amounts of radioactivity, comparable overall optics The gel exposure time had to be adjusted to obtain the density. The sample, Isoelectric focusing (IEF; pH 3.5-7) and non-equilibrium pH gradient electrophoresis (NEPHGE; pH 6. 5-10.5) Analysis was performed on both gels. 2D gel is 12.5% acrylamide And 0.063% bisacrylamide and electrophoresed overnight. After electrophoresis , Dried. The gel is placed in contact with the X-ray film and at -70 ° C for 3-40 days Exposure. Each gel is exposed for at least three periods and the kinetic range of the X-ray film Was compensated for. Measurement of MW and pI. Determine the molecular weight of the protein by comparison to a standard gel. Was. The pI for each protein on the gel was determined by the pI assay kit . Use the following techniques: immunoblotting, immunoprecipitation, microdistribution Gel by one or several of column determination, or peptide mapping Identified above. Computer analysis of fluorescence indirect imaging. Bi on Sunsparc workstation Quantified by program. Then place the anchor points on the gel (each gel The same spot in the file was assigned the same anchor point), and The gel was fitted with a computer. After calibration on the computer, perform manual editing. The spot is found by accurate computer matching , And spot quantification is initially found by a computer program. Re 4.0). Duplication in IEF and NEPHGE subgroups To avoid the presence of spots, acidify the base portion of the IEF gel or the NEPHGE gel. Duplicate spots in any of the sections were removed from the analysis. Statistical analysis. Apply Student's t-test and assign P <0.01 to the level of significance Selected as Example 2 FIG. In vitro determination of nitrite and insulin To investigate IL-1 induced protein changes in BB-DP islands, 150 newborns BB-DP rat islets were isolated for 24 hours with or without 150 pg / ml IL-1. Incubate for a period of time and then culture the medium for nitrite and insulin measurements. Sampled. A two-dimensional gel analysis of the islands was performed as follows, and the fluorescence of the islands The indirect photography was analyzed by computer (see below, n = 3 for each group) and Previously established protein database of islets of WF rats exposed to IL-1 Compared. Islet isolation and culture. Pancreas of 4-5 day old inbred BB-DP and WF rats From Brunstedt et al. (Methods in Diabetes Research, Volume 1, Wiley & S ons, New York, pp. 254-288 (1984), which is specifically incorporated herein by reference. )) And isolated after collagenase digestion. RPMI 1640 + 1 After 4 days of preculture in 0% fetal calf serum, islets were cultured as follows: 150 BB-DP Islets were added in 300 ml RPMI 1640 + 0.5% normal human serum (NHS) with 150pa / ml IL-18 24 hours at 37 ° C in humidified atmosphere air with or without Incubated. In a series of separate experiments, 200 BB-DP rats or WF rats Incubate the islets in 300 ml RPMI 1640 + 0.5% NHS for 24 hours before transplantation Was added. Measurement of nitrite and insulin. Nitrite, as previously described (Gr een et al., Anal. Biochem. 126: 131-138 (1982)). The detection limit of the assay was 1 mmol / l, corresponding to 2 pmol / islet. Does not contain islands Nitrite levels in the corresponding medium are subtracted if the islet-free medium exceeds the detection limit. did. Experiments were performed in the same assay. Calculated from three points on the standard curve Coefficients of variation within and between assays: 1 mmol / l: 1.6%, 16.3%; 10 mmol / l : 1.6%, 15.3%; 25 mmol / l: 1.5, 17.0%. Measure insulin by RIA (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 6737-6742 (1996)). The detection limit is Was 35 fmol / ml. Intraassay and assay between three known controls The coefficient of variation between A was 5.4%, 12.5%; B: 3.6%, 10.2%; C: 3.1%, 9.4%. Was. result. Previously used for 2-D gel analysis (Andersen et al., Supra (1995)), Action between BB-DP and WF islets (release of accumulated insulin) and on IL-1 NO production and insulin release to ensure comparability in terms of After 24 hours of incubation with or without IL-1, Specified. Basal insulin release and NO production were similar to data from WF islets ( Basal insulin release (WF islets) 3.3 ± 0.5 vs. (BB-DP islands) 2.0 ± 1.1 pmol^*Island-1^*24:00 Between -1 and NO formation at the base <2pmol^*Island-1^*24-hour-1 (both BB-DP and WF islands) And) IL-1 inhibits the release of accumulated islet insulin by 3.4%, and Similar to the results obtained using islets of WF rats, NO production was increased by a factor of 4.4 (IL- 1 Inducible NO production: (WF island) 9,29 ± 1,21 vs. (BB-DP island) 8.91 ± 1.05 pmol^*Island-1^*24:00 -1 and insulin release: (WF island) 1,4 ± 0.3 vs. (BB-DP island) 0.6 ± 0.6 pmol^*island -1^*24 hours-1, 18, 19). Analysis of fluorography from islets ± IL-1 of BB-DP rats. Newborn BB-DP rat island In computer-based analysis of two-dimensional gels of mozinates, a total of 1815 (1275 IEF and 540 NEPHGE) proteins were converted to 3 on a 12.5% acrylamide gel. Found in three of the three. Incubate with IL-1 for 24 hours In newborn BB-DP rat islets, 1721 (1171 IEF and 550 NEPHGE ) Individuals were found in three of the three gels. IL-1 is a control Were found to significantly alter the expression levels of 82 proteins compared to islets (P <0.01); 60 proteins have reduced expression levels, and 22 proteins have The expression level increased (P <0.01) (Table 1). Embodiment 3 FIG. Animal transplant model. Experiment 1. First, investigate cellular and molecular events that occur during the onset of IDDM Isolate 200 neonatal BB-DP rat islets to create a synchronized model for Then, they were transplanted under the kidney capsule of 30-day-old BB-DP rats. Blood glucose every 3 days And the incidence of diabetes was determined. On days 7, 12, 23, 37, 48, and 173 after transplantation or when diabetes develops, Were sacrificed (n = 6 in each group). Transfer the implant to insulin and the following MHC Double stained for one of cells I, II, αβ-TCR, CD4, CD8, or ED1. Dye Color is expressed as a percentage of total graft area (insulin) or mm^TwoPer dyed Expressed as the number of cells. In situ host islets are stained in the same manner and And expressed as the percentage of inflamed islets of the total number of islet cells. Statistical solution Analysis was performed with Spearman Rank Correlation and Mann-Witney. result. The incidence of diabetes (75%) or the date of onset of diabetes (69 ± 25 days) BB-DP rats were not significantly different. Implants and in situ In both islets, a 2-3 fold increase in the number of infiltrating cells was observed on days 12 and 37 Was seen in the eyes. 48 days after transplantation, for rats that develop diabetes, Day 37 in pre-diabetic rats on both in situ islets, respectively Cells increased compared to non-diabetic rats at day 48, and 48 (P <0.04) . The graft insulin staining area is 80-90% in non-diabetic grafts, and 30% of the total graft area in diabetic and diabetic grafts, insulin content and cellular infiltration It was inversely proportional to Jun. For all cell types and at all time points studied, Percentage of infiltrated islets in the main pancreatic slide and grafts from the same animal A positive correlation was found with the number of infiltrating cells in P. (P = 0.002-0.00001 R = 0.4-0.7). Experiment 2. 200 newborn BB-DP rat islets were placed under the kidney capsule of 30-day-old BB-DP rats. Transplanted. Allogeneic transplantation from Wister Furth Island to Wistar Kyoto rats Performed similarly as a troll. The transplanted islets did not affect the incidence of IDDM and the time of disease onset. sugar On the day of onset of uremia (day 78 ± 5) and on day 17 in control WK animals, The immunohistochemistry and [³⁵It was excised for S] -methionine labeling. result. Immunohistochemical studies of grafts from diabetic BB rats were positive for MHC class I Tiv cells (1982 / mm^Two± 534), macrophages (661 / mm^Two± 406), T-helper Cells (1331 / mm^Two± 321), cytotoxic T cells (449 / mm^Two± 117) Demonstrates inflammation, and insulin positive cells decrease to 33-66 $ in grafts did. Allograft controls show fibrosis, mononuclear cells, MHC class II Positive cells (152 / mm^Two), MHC class I positive cells (48 / mm^Two), Makrov Large (172 / mm^Two), T-helper cells (254 / mm^Two), Cytotoxic T cells (42 / mm^Two ) Shows little inflammation and 100% insulin content in residual cells did. Computer analysis of 2D gels revealed 33 in vitro altered by IL-1 exposure Showed a more than 2-fold increase in expression of 18 of the proteins. 14 pieces are BB-D It was specific to cognate grafts in P animals. Eight proteins are level of expression Changed specifically. Embodiment 4 FIG. Changes in protein expression induced by diabetes development To investigate protein changes in BB-DP island cognate grafts during diabetes development For this, islets of 200 newborn BB-DP rats were transplanted into 30-day-old BB-DP rats. Mark Knowledge, two-dimensional gel electrophoresis, and computer programming with untransplanted BB-DP islands. Grafts were collected at the onset of diabetes for BG comparison (BG> 1 for 2 consecutive days). N = 5), defined as 4 mmol / l. Fluorescence indirect imaging from cognate islet grafts from newly developed diabetic BB-DP rats Analysis. BB-DP island homologous grafts from newly diabetic BB-DP rats , Computer analysis showed that 1818 proteins (1259 IEFs and 577 NEPHs) GE) was present in five of the five gels. (These data are , Expression levels were altered when compared to control neonatal BB-DP rat islets (64 increased expression levels and 131 decreased expression levels) (P <0.01 (Data not shown) Preliminary tank present in both islets and grafts in vitro It is Parkaceous). BB-DP rat islands after in vitro IL-1 incubation Of the 82 proteins, 71 of which had altered levels of expression in And was re-identified. Thirty-three of the 71 re-identified proteins are responsible for developing diabetes. Expression levels were significantly altered in islet cognate grafts at the time of disease (four were upregulated). (29 were down-regulated) (Table 2). Analysis of fluorography from islet WF cognate. Caused by the transplant procedure itself In order to control for changes in protein expression, WF islet cognate In vitro changes in proteins caused by IL-1 in WF neonatal islets Compared. Expression levels on WF islets incubated with IL-1 in vitro Of the 105 proteins whose bells changed, 89 out of 105 proteins were Twelve were re-identified when compared to islets, whereas 12 were Absent (n = 3). 42 of the 93 re-identified proteins were expressed Significantly changed (27 decreased and 15 increased, p <0.01, Table 5). In vitro IL-1 inducible proteins can be expressed during disease development or during islet- It was found specifically in islet-grafts during graft rejection. In vitro IL-1 After incubation, the level of expression in the islets was found to change, No significant changes in expression levels were found in WF and cognate transplanted islets Protein, when found on cognate transplanted BB-DP islands, is In BB-DP islands shown to be specific or allografted to WK rats If found, it was shown to be specific for graft rejection. BB-DP transplanted with family 28 proteins in islets and 29 in allografted BB-DP islands Protein had altered levels of expression (data not shown). BB-DP allograft Proteins in BB-DP cognate in WK rats and 14 proteins in WK rats Proteins specifically changed the level of expression. Embodiment 5 FIG. Characterization of diabetes-mediating proteins Proteins exhibiting synthetic IL-1β induction were analyzed by mass spectrometry, as described below. And microsequencing. Make commercial protein databases compatible We searched for and included SWISS-PROT, PIR, NIH, and GENEBANK. Microsequencing. Protein identified as a diabetes-mediating protein by 2DGE The protein spot is digested with trypsin in a gel and concentrated according to known methods. HPLC separation, sequence peaks, and compare subsequences to known sequences It was further characterized by: The results of the microsequencing are as follows : Protein 22 (peak 22): AQYEELIANG (D) (M) (SEQ ID NO: 5) (Peak 13): KKPLVYDEG (K) (SEQ ID NO: 6) Protein 25 (peak 15): LLEXTXXLX (SEQ ID NO: 7) (Peak 16): PSLNSXEX (SEQ ID NO: 8) Galectin-3 (peak 22): IELXEIX (SEQ ID NO: 9) For direct sequencing of one protein (molecular weight 68,700), the following partial sequence Resulted: PEAIKGAVVGIDLG (SEQ ID NO: 10) (Table 2: GR75). This protein is 75 kD High in Lucose regulatory protein (GR75, Table 2) (PBP74, P66mot, mortalin) Shows homology; member of the hsp70 protein family, non-thermoinducible Is ubiquitously expressed in different tissues; 75 kD is processed to 66 kD Contains 46 residue leader peptide; found in mitochondria; cell death and , And antigen presentation. One protein was identified as galectin-3, which is present in several tissues 27kD protein that plays a role as a pre-mRNA splicing factor It is known that The amino acid sequence of human gal-3 is shown in FIG. 5 (SEQ ID NO: 4). You. Mass spectrometry. In situ digestion in at least one gel according to the invention For at least one gel plug containing at least one protein spot, Do it. Rosenfeld, as described in Fey et al. Electrophoresis 18: 1-12 (1997). 203, 173-179 (1992) (both of which are described in A gel is prepared (incorporated in detail in the specification). Briefly, the gel Stain quickly and destain. ¥ Protein-containing gel band with scalpel Cut and store at -20 ° C in Eppendorf tubes containing UHQ water Thus, the desired protein is obtained. In 40% acetonitrile / 60% digestion buffer Wash the gel plug for at least 1 hour until the Coomassie stain is removed. By this, the protein is digested. This wash includes Coomassie staining, gel buffer, Remove SDS and salts. If necessary, the washing can be repeated. Then the gel Plug in a vacuum centrifuge for 20-30 minutes until the plug shrinks and the surface turns white Allow to dry for a while. Drying time depends on the size and thickness of the gel plug. bird Psin (or the enzyme used) is dissolved in digestion buffer and 5 ml (Depending on the amount of protein in the gel to be analyzed (0.1 mg)) . Additional digestion buffer was added to the buffer at the bottom of the tube with the gel plug. Add until almost covered (about 10 ml). The gel plug is then placed at 37 ° C for up to 6 hours. Or overnight and then with 70-100 ml of 160% acetonitrile / 40% water. First, the peptide is extracted by incubating for 2 to 6 hours. Extraction increases recovery It can be repeated to increase. The extract is then lyophilized and analyzed by MALDI-MS. Dissolve in 30% acetonitrile / 2% TFA before analyzing. 6-48 show the mass spectra obtained for the proteins shown in Tables 1 and 2. Provide data for Embodiment 6 FIG. Protein expression in vivo during allograft rejection To investigate protein changes in BB-DP island allografts during rejection, 00 newborn BB-DP rat islets were transplanted into 30 day old WK rats (N = 3). Substantive Grafts were harvested 12 days after transplantation, when significant mononuclear infiltration was expected. The graft, Processed and analyzed as described above. Fluorescence analysis from BB-DP island allografts in WK rats. 12 days after transplantation, Mononuclear cell infiltration was observed in the graft (18) and sampling at this point Computer analysis of the fluorescence intensity from the isolated BB-DP islet allograft revealed 1714 (1064I EF and 650 NEPHGE) proteins are present in three of the three gels. Was shown. BB-DP islet allograft gels were incubated with IL-1 in vitro. 82 proteins with significantly altered levels of expression in BB-DP islands after In comparison with islet gels of newborn BB-DP rats. 82 proteins The last 66 were identified again. Thirty-three of the 66 re-identified proteins Were found to alter expression levels (28 decreased and 5 increased) . p <0.01). Example 7 FIG. Establishment of non-toxic adenovirus-mediated gene transfer in islet cells. Adenovirus vehicle for islets of Langerhans in the absence of vector-induced toxicity Neonatal rat islets are used to determine optimal conditions for mediated gene transfer. At doses of multiplicity of infection (moi) of 0, 10, 100, and 1000 pfu per islet, Using the virus vector β-galactosidase (AdβGal), 25 groups in triplicate Was transduced. The efficiency of gene transfer is measured by a rough test, And 6-galactosidase after islet dispersion on days 1, 4, 7, and 10 after transduction Evaluated by percent of positive cells. Briefly, the toxicity of the island each time By measuring the accumulated insulin levels at the points, and 3 and Assessed by assessing insulin release in response to hyperglycemia at 10 days . result. Efficient dose-dependent gene transfer to the islets was achieved 1,4,7, And recorded on day 10. On the first day, at moi10, 100, 1000, respectively, dispersed 8.3%, 34.1%, and 58.6% of cells in isolated islets expressed the transgene. Guidance Transgene expression was stable for the duration of the experiment. Insulin accumulation At time points, there is no difference between the transduced and non-transduced islets; and Accumulated insulin expressed on day 10 is expressed as nmol of insulin per islet , 14.3 ± 1.5 (at 0 moi), 15.0 ± 2.6 (at 10 moi), 22.0 ± 7.8 (at 100 moi) , And 15.3 ± 1.5 (at a moi of 1,000). Similarly, the insulin secretory response to glucose is Response of insulin to low glucose incubation 3 days at all doses studied, obtained by dividing by the insulin response Similar in transduced and untransduced islets in the eyes (mo d0; 12.7 ± 4.1; moi10, 14.9 ± 7.9; moi100, 15.7 ± 0.7; and moi1,000.22. 3 ± 6.7). Ten days after transduction, transduced cells and untransduced cells The ratios in the vesicles were similar. Embodiment 8 FIG. Galectin-3 expression in spontaneous onset of IDDM. 200 newborn BB-DP rat islets were transplanted under the kidney capsule of 30-day-old BB-DP rats. Was. Grafts were implanted 7 days after transplantation (pre-diabetes, n = 6), at onset of diabetes (n = 6), and Were harvested 174 days after transplantation (animals free from diabetes, n = 3) and stimulated with IL-1β Newborn BB-DP islets that were not stimulated with IL-1β and Labeled with nin and prepared for high resolution two-dimensional gel electrophoresis. Each sample is subjected to isoelectric focusing (IEF, pH 3.5-7) and non-equilibrium pH gradient electrophoresis Kinetics (NEPHGE, pH 6.5-10.5). Gel fluorescence intensity as described above analyzed. Changes in protein expression levels are significant at p-values less than 0.01 Gender was considered (Student's t-test). result. Newborn BB-DP islets stimulated in vitro with 11-1β contain 82 proteins Showed a change in. 97-98% of these proteins are , Were identified in all grafts. Normal unstimulated BB-DP in vitro Graft protein expression levels compared to islets showed the following changes: neonates When islet cells are treated with IL-β in vitro, 82 proteins exhibiting increased expression 42 of the tumors grew in the transplanted islets on day 7, and 31 were associated with the onset of diabetes. And 14 increased in animals that did not develop diabetes. Increase Of these proteins, four of them are found only at the onset of IDDM, and Not seen at the time detailed. On day 7, unchanged in vitro with IL-8 exposure Five proteins were observed to change, but two proteins were diabetic. It is observed to change at the onset of the disease, and three proteins develop diabetes. Observed in unaffected animals. Changes in vivo but changes in vitro One of these proteins, which were not observed to be Identified as being. Gel-3 expression was significantly reduced at day 7 and at the start of IDDM. Unregulated. In contrast, gal-3 expression is IL-1β stimulated in vitro. In isolated islands and in grafts from animals that did not develop diabetes. Great. Embodiment 9 FIG. IL-1 converting enzyme (ICE) in insulin-producing cells Nitric oxide synthase (iNOS) and cytokine induction of apoptosis. The expression of ICE, iNOS, and induction of apoptosis were investigated. Rat Insulino RIN-SAH and MSL-G2 from human and pluripotent cell lines for 20 hours. Cultures (IL-1β, TNFoα, and IFNγ), RNA was isolated, and IC E, iNOS, and SP-1 (used as housekeeping controls for normalization) Multiplex PCR analysis (27 Cycle). Results after gel electrophoresis separation and PhosphorImager quantification Was normalized to SP-1 mRNA expression and silicate. result. Neither ICE nor iNOS expression was found in control cells. S Significant upregulation relative to the level of P-1 gene product upregulation 20 hours after cytokine exposure in both ICE and iNOS Was seen. In RIN cells, ICE is produced at 98% of SP-1 and iNOS is Produced in 97%. Apoptosis and NOS production are not observed in control cells. But not cytokine-induced iNOS production, And NO production was highly increased. In RIN cells, the accumulated nitrite is 3%. It was determined to be 19.7 ± 0.7 μM after one day. Example 8: Interleukin-1DF-induced alteration of protein expression in rat islets : Computerized database wrap up Two-dimensional (2-D) gel electrophoresis of pancreatic islet protein is used for insulin-dependent diabetes Can be an important tool to facilitate the study of the molecular pathogenesis of Insulin dependence Diabetes is caused by the autoimmune destruction of beta cells in the islets of Langerhans. The cytokine interleukin-1β inhibits insulin release and is Selectively cytotoxic to β cells in isolated pancreatic rat islets. Immune response One or more antigens that trigger the answer, and interleukin 1β mediated The intracellular mechanism of the effect of the β-cell cytotoxicity is unknown. But, Previous studies have found that they are associated with changes in protein synthesis. I Thus, 2-D gel electrophoresis of islet proteins initiates 1) immune destruction of beta cells Identification of primary antigen (s), 2) specific cytokine induced Determination of qualitative and quantitative changes in islet proteins, and 3) modulation of cytokine action It can lead to a determination of the effect of the moderating drug. Therefore, the purpose of this study was to standardize And 15% acrylic in neonatal rat islets labeled under different culture conditions All reproducibly detectable tampers on amide 2-D gels (10% and 15% DB) The goal was to create a database of quality spots. 1792 spots, 15% DB 1373 spots were present in 5 of the 5 gels in Present in five of the five gels, yielding quantitative reproducibility between 75.2% and 91.7% Was. In both DBs, the integrated optical density for spots present on all gels The average coefficient of variation in percent of degree (% IOD CV%) is between 42.4% and 45.7% there were. If the same sample was analyzed on different days in a continuous set of gels (assay A), the average CV% of% IOD was 35.5% to 36.1%. Gel the same sample Average CV% of% IOD when repeated in one set (intraassay analysis) Was 30.2% in the IEF gel, but the average CV% in% IOD was unchanged in the NEPHGE gel No (45.7%). To distinguish proteins whose expression has been altered by IL-1β Applying a 10% DB to the protein yields 105 currently unidentified protein spots by IL-1β. Is newly up / down regulated or synthesized. Conclusion As a result, we believe that the first 10% of neonatal rat islets of Langerhans and Shows a 15% acrylamide 2-D gel protein database, and Thus, its use to identify proteins with altered expression is demonstrated. Introduction The cytokine interleukin-1β inhibits insulin release and Is selectively cytotoxic to beta cells in isolated pancreatic rat islets (Mand rup-Poulsen, T, Diabetologia in press (1996)). Active protein synthesis It is an important part of post-seizure beta cell destruction, defense, and repair, such as itokines . Free radical nitric oxide (NO) is a deleterious effect of cytokines on islet α cells Have been shown to be important mediators of fruit (Southern et al., FEBS. Le tt. 276: 42-44 (1990); Welsh et al., Endocrinol. 129: 3167-3173 (1991); Corbett et al. , J. et al. Biol. Chem. 266: 21351-21354 (1991)). Therefore, a substrate for NO production Is an analog of L-arginine, a harmful effect of interleukin 1β (IL-1β). Fruit (Southern et al., FEBS. Lett. 276: 42-44 (1990); Welsh et al., Endocrinol . 129: 3167-3173 (1991): Corbett et al. Biol. Chem. 266: 21351-21354 (1991)) And the mRNA for the cytokine-inducible isoform of NO synthase (iNOS) Induced by IL-1β in β cells but not in α cells (Corbett et al., J. Mol. Clin. Invest. 90: 2384-2391 (1992)). The present inventors have recently investigated whether neonatal rat islets Cloned iNOS and sequenced them on a two-dimensional (2-D) gel Demonstrated the expression of recombinant iNOS, possibly as a phosphorylated isoform, with a predicted 131 kDa It has a measured molecular weight and a pI value in the range of 6.8-7.0 (Karlsen et al., Diabetes 44: 753-7 58 (1995)). In addition, inhibitors of protein synthesis have an inhibitory effect of IL-1β on islet function (Hughes et al., J. Clin. Invest. 86: 856-863 (1990)), Figure 4 shows that new protein synthesis is required for the deleterious effects of IL-1β. IL-1β In addition, heat shock proteins (HSP) HSP32 (heme oxygenase) and HSP70 (Helqvist et al., Acta Endocrinol. (Copenh.) 121: 136-140 (1989)). Helqvist et al., Diabetologia 34: 150-156 (1991); Welsh et al., Autoimmunity 9: 33-40 (1991)), playing a role in protection against cellular stress and cell repair. It is known to add (Kaufmann, Immunol. Today 11: 129-136 (1990)). Further In addition, IL-1β was found to be 45, 50 in the islets (Hughes et al., J. Clin. Invest. 86: 856-863 (19 90)), 75, 85, 95, and 120 kDa (Welsh et al., Autoimmunity 9: 33-40 (1991)). Inhibits the synthesis of many unknown proteins with molecular weight. 2-D gel electrophoresis In use, we recently demonstrated that IL-1β was not And 3 proteins up-regulating and down-regulating certified. Endocrine islet cells may play an important role in beta cell destruction and possibly survival. Islet cell dispersion and sorting can affect protein synthesis patterns Is a potentially harmful procedure. The disadvantage of the selected islet cell material is that Diluted by synthesis, so any amount of protein expression in one cell type That change appears to be smaller. Therefore, the purpose of this study was to determine spot detection reproducibility, and All (³⁵About (S) -methionine-labeled islet protein database spot By calculating the coefficient of variation of the percentage of the integrated optical density (CV% of% IOD) there were. In addition, we have determined that gel preparations for the% COD% of the The contribution of intra- and inter-assay variability needed to be studied. Finally, Myo et al. Found IL-1β induction of islet protein pattern by computer analysis The number of changes needed to be defined. Materials and methods reagent. DMEM, RPMI 1640, and Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) were purchased from Gibco, Pa. isley, purchased from Scotland. RPMI 1640, 20 mM HEPES buffer, 100,000 IU / I Penicillin and 100 mg / L streptomycin were supplemented. Certified recombination Human IL-1β was obtained from Novo Nordisk Ltd. (Bagsvaerd, Denmark). The specific activity was 400 U / ng (Moelvig et al., Scand. J. Immunol. 31: 225-235 (1990). )). The following other reagents were used: 2-mercaptoethanol, bovine serum albumin (BSA), Tris HCl, Tris base, glycine (Sigma, St. Louis USA); Loroacetic acid (TCA), phosphoric acid, NaOH, glycerol, n-butanol, bromofe Nord Blue (Merck, Darmstadt, Germany); (³⁵S) -methionine (SJ204, ratio (Amersham International. Amersham, UK); filter (HAWP 0.25μm pore size) (Millipore, Boston, USA); RNA'se A, DNA'se I (Worthington, Freehol d, NJ, USA); urea (ultra pure) (Schwartz / Mann, Cambridge, MA, USA); Rilamide, bisacrylamide, TEMED, ammonium persulfate (BioRad, Richm ond, CA, USA); ampholytes: pH 5-7, pH 3.5-10, pH 7-9, pH 8-9.5 (Pharmaci a, Uppsala, Sweden); Nonidet P-40 (BDH, Poole, UK); amphoteric electrolyte: pH 5-7 And sodium dodecyl sulfate (Serva, Heidelberg, Germany): agarose ( Litex, Copenhagen, Denmark); ethanol (96% anhydrous) (Danish Distillers) , Aalborg, Denmark); methanol (Prolabo, Brione Le Blanc, France); vinegar Acid (technical quality, 99% glacial acetic acid) (Bie & Berntsen, Århus, Denmark), and X Wire film (Curix RP-2) (AGFA). Islet isolation and culture. 12 different database and assay variation experiments Island isolation (10 for database, 1 for in-assay analysis, and For the analysis between essays, 1) was performed. Three studies on IL-1β Further islet isolation was performed. Islets from the pancreas in k) were isolated after collagenase cleavage (Brunstedt, Larner, J. Polh, S.L. (ed.), Methods In Diabetes Research, Volume 1 (Laboratory methods, Pa rt C). Wiley & Sons, New York, pp. 254-288 (1984)). RPMI 1640 + 10% fetal calf After 4 days of pre-culture in serum, 150 islets were harvested with 300 μl RPMI 1640 + 0.5% normal human serum (NHS) for 24 hours. In another series of experiments, 150 islands, 15 24 h in 300 μl RPMI 1640 + 0.5% NHS, with or without the addition of 0 pg / ml IL-1β For a while. Island sign. After 24 hours of culture, 150 islet cells were harvested, washed twice with HBSS, and 200 μl methionine-free Dulbecco's modified with 10% NHS dialyzed for amino acids Modified Eagle's medium (DMEM) and 200μCi (³⁵Labeled in S) -methionine for 4 hours . To remove 2-mercaptoethanol,³⁵S) -Methionine should be added to the label before labeling. Lyophilized for at least 4 hours. After labeling, the islets are washed three times with HBSS, pelleted, And frozen at -80 ° C. Sample preparation. The frozen islets are resuspended in 100 μl DNAse I / RNAse A solution and Thawed by freeze-thawing multiple times. After the second melting, they are For 30 minutes on ice. The dissolved sample was then lyophilized overnight. sample For up to 4 hours in 120 μl lysis buffer (8.5 M urea, 2% Nonidet P-40, 5% 2-mer By shaking in captoethanol and a 2% ampholyte pH range 7-9) Dissolved. (³⁵Determination of S) -methionine incorporation. (³⁵The amount of (S) -methionine incorporation was determined for each sample. 5 μl of 1:10 dilution of 10 μg BSA (0.2 μg / ml H_TwoO), then 0.5 Quantification was performed in duplicate by adding ml of 10% TCA. Fill this with 0.25μm Allowed to settle at 40 ° C. for 30 minutes before filtering through a filter. HAWP The filters were dried and placed in scintillation fluid for counting. 2-D gel electrophoresis. The procedure was essentially as described by O'Farrell et al., Cell 12: 1133-1142 (1977 ) And Fey, S.J. et al., The protein variation in basal cells and certain bas. al cell related benign and malignant diseases, Faculty of Natural Scienc e, as described in the University of Aarhus, Denmark (1984). Easy For example, the first dimension gel is 4% acrylamide, 0.25% bisacrylamide, and Contains amphoteric electrolyte (actual ratio depends on the batch) and is 175mm long and 1.55m m diameter. Equal number of counts for each sample (10⁶cpm) to the gel Was. For lower amounts of radioactivity, the gel is exposed to obtain a comparable total optical density. The dew time needed to be adjusted. The sample was subjected to isoelectric focusing (IEF; pH 3.5-7) and And non-equilibrium pH gradient electrophoresis (NEPHGE; pH 6.5-10.5) gels. Was. IEF gel was pre-focused at 140 μA / gel (limit current) for about 4 hours. Then apply the sample and focus at 1200V (limit voltage) for 18 hours. Was. NEPHGE gels were calibrated using 140 μA / gel and 1200 V as limiting parameters. Focused for 6.5 hours. The second dimension gel is 1 mm thick, 200 mm long, and 185 mm wide, which is 15% acrylic. Luamide and 0.075% bisacrylamide, or 10% acrylamide and 0 . It contained either 05% bisacrylamide and ran overnight. After electrophoresis, The gel was fixed in 45% ethanol and 7.5% acetic acid for 45 minutes and dried before drying for 45 minutes. And exposed at -70 ° C for 1 to 40 days. Run each gel at least three times longer Exposure compensated for the lack of dynamic range of the X-ray film. Determination of molecular weight and pI. Determine the molecular weight of the protein by comparison with a standard gel. (Fey, S.J., et al., The protein variation in basal cells and certain ba sal cell related benign and malignant diseases, Faculty of Natural Scien ce, University of Aarhus, Denmark (1984)). PI of individual proteins on the gel Was determined by using a pI calibration kit. The target protein is identified by one of the following techniques: Identified on the gel by one or several: immunoblotting, immunoprecipitation, Micro sequencing or peptide mapping. Experimental design. The study involved three different series of analyses: Source, intra-assay, and inter-assay analysis. For each analysis, the IEF and And NEPHGE gels were run using 10% and 15% acrylamide in the second dimension. This provided four subgroups: 10% IEF; 15% IEF; 10% NEPHGE; 15% NEPHGE. Ten % Acrylamide gel, the approximate molecular weight range of detection is between 20 and 250 kDa However, the approximate range of detection on a 15% acrylamide gel was between 6 and 125 kDa. Was between. As a result, proteins with molecular weights between 20 and 125 kDa are both Proteins with lower and higher molecular weights Quality was specified for the 15% and 10% DB, respectively. 10% and 15% DB comparison is 10% Showed lower number of detectable spots detectable in both% IEF and NEPHGE subgroups (See results). As a result, intra- and inter-assay analysis ( See) was performed only on 15% IEF and NEPHGE gels. The database is based on 10 different isolates analyzed in one set of gels. Based on After 2-D gel electrophoresis, it has the best technical quality and comparable optical density Five gels to run were selected for computer analysis. Before computer analysis One gel in each subgroup, 4 other database gels, 5 assays The “master gel” used for comparison on the inner gel and the five inter-assay gels " Arbitrarily chosen to be The database “Master Gel” is And three spots were used as master for inter-assay analysis. Ensured that they had the same number of matches in the analysis of the series. "Masterge The data from "R" is included only in database analysis. "Master gel" From the same isolate in all four subgroups, but four other databases The identity of the isolate that gave rise to the gel varied slightly from subgroup to subgroup (Table 3). For intra-assay analysis, 10 gels of the same sample were analyzed on one set of gels. Was. Has the best technical quality and comparable optical density after 2-D gel electrophoresis Five gels were selected for computer analysis (Table 3). For inter-assay analysis, run the same sample on 10 different sets of gels on different days. Was analyzed. Best technical quality and comparable optical density after 2-D gel electrophoresis Were selected for computer analysis (Table 3). About protein identification whose expression was changed by IL-1β One of the islands exposed to IL-1β was analyzed (Andersen et al., Diabetes 44: 400-407 (1995)). 0% IEF and NEPHGE gels were fitted with 10% IEF and NEPHGE DB. Computer analysis of fluorescent pictures. Computer analysis on a Sunsparc workstation Quantified by Biolmage, Ann Arbor, MA, USA. Next, each non-master gel is Compare with "Master Gel" and first found by computer program Edited manually to ensure identification and quantification of spots not removed. this Sex was checked and corrected by the same observer. Finally, the data, Quattro To avoid the presence of double spots of IEF and NEPHGE subgroups, Duplicate spots, either on the part or on the acidic part of the NEPHGE gel Analysis and assay analysis. Statistical analysis. Two different analyzes show that proteins altered by expression by IL-1β Was applied to distinguish In the first analysis, spots on gels exposed to IL-1β Average% IOD of the same spot in the DB is higher or lower than the average% IOD of the same spot ± 2SD If not, the change was considered significant. In a second comparison between the two groups, Student A t-test was applied and p <0.01 was selected as the level of significance. Qualitative reproducibility of neonatal rat islet protein database and assay analysis. 12 93-1411 (IEF) and 605-764 (NEPHGE) spots make up a 15% DB Found in the individual gels used, while 1101-1200 (IEF) and 4 62-577 (NEPHGE) spots were found in the gel used for 10% DB (Tables 4 and 5). "Master Gel" for 10% IEF and NEPHGE DB Produced. In total, 1792 spots were found in 5 of 5 gels at 15% DB While 1373 spots were present in 5 of 5 gels at 10% DB . This is true for subgroups between 75.2% (NEPHGE 10%) and 91.7% (IEF 15%). Qualitative reproducibility (average percentage of spots found in 5 of 5 gels) (Tables 4 and 5) (for each spot present in 5 of the 5 gels, Database is the number of spot matches,% IOD for each of the 5 individual spots, average% I (Consisting of OD, standard deviation of% IOD, CV% of% IOD, MW, and pI). As shown in Tables 4 and 5, the total number of spots in individual gels, and 5 The number and percentage of spots present in 5 of the 5 gels was 1 at 10% DB. 5% less than in the DB. However, the database is only one of the five gels If expanding to include spots present in at least three gels, two data There was no difference in the percentage of spots present between the databases (IE F: 15%: 98.8 ± 1.2; 10%: 97.4 ± 1.5; NEPHGE: 15%: 94.8 ± 5.7; 10%: 94.1 ± 3.5, Tables 4 and 5). 5,4,3 out of 5 gels in both databases Or the percentage of spots present in the two are in the NEPHGE gel and in the IEF gel. (Tables 4 and 5). Spatial of spots present in less than 5 gels The location was investigated. Is this a spot on one, two, three or four gels? Indicates no grouping in certain areas of the gel depending on whether or not. Intra- and inter-assay analyzes were performed only on 15% gels. why Then because the number of spots that can be detected was higher in this database there were. In both analyses, the number of spots in each gel as well as 5 out of 5 gels The number and percentage of spots present in 5 are only slightly (9% compared to 15% DB). 1919%) (compare Tables 4 and 6). Quantitative reproducibility of neonatal rat islet protein database and assay analysis. amount Reproducibility was determined by the CV of% IOD for each spot on 5 of 5 gels. % Defined as the average. For the database, the average CV% is 10% of the gel and And 15% of both IEF and NEPHGE subgroups were at substantial levels (42.4% 445.7%) (Table 7). For all DB subgroups, CV% ranges between 3.0% and 167.9% (Table 7). For inter-assay analysis, the average CV% is the IEF and NEPHGE gel 35.5% -36.1% for both subgroups. On the other hand, the average CV% 30.2% for intra-assay analysis and 45.7% for NEPHGE gel . Subsequently, the database spots present in all gels were converted to% IOD CV% digits. Was increased and ranked. This means that in all four database subgroups, A similar sigmoid curve results for the pot. Therefore, 30% of the spots Has 29.7% to 32.5% lower CV%, 50% of spots are 37.8% to 42.8% lower 90% of the spots had a CV% lower than 68.4% to 80.6%. curve The slope of the 5% to 10% spot with the highest CV% is significantly closer to the average CV% of the% IOD. Is given. This means that the median value of a subgroup of the database is Supported by the fact that it is 2.3% to 5.5% lower than the average (Table 7). Between the average% IOD for each spot in the database subgroup and the% IOD CV% Regression analysis. 1 with highest average IOD% in 10% and 15% DB subgroups of NEPHGE 2 and 6 out of 0 spots, respectively, with percentage points with minimum CV% (See above). 10 spots with highest average IOD% None were found at this percentage point in the IEF DB subgroup, Analysis was performed to determine if there was a correlation between the average% IOD of the spot and the CV%. Regression analysis shows a significant negative correlation between these two parameters (Range: p = 0 (IEF 10%)-p = 0.00288 (IEF 15%)). But R^Twovalue is It was very low for all subgroups (Range: R^Two= 0.0072 (IEF 15%) R^Two = 0.0317 (IEF 10%)), the variability of the CV% is largely due to the variation of the average% IOD Is not explained. 10% IEF and 10% to distinguish proteins altered in expression by IL-1β And application of NEPHGE DB. In a recent paper, we found that IL-1βB was In a protein 2-D gel, 29 proteins were up-regulated and And down-regulated four proteins, respectively (Anders en et al., Diabetes 44: 400-407 (1991)). Grow 10% gel under similar conditions to this study It was prepared from cultured (35S) methionine-labeled Wistar Furth neonatal rat islets. Follow 10% of the IEF and NEPHGE DB on rat islets were published in a previous paper (Andersen et al., Diabet es 44: 400-407 (1991)) Computer-analyzed gel of IL-1β-exposed islands visually analyzed Used for comparison with. ± 2SD of IOD% of each DB spot as cutoff level (Significant up or down regulation in visual analysis) Comparison with 10% DB confirms 32 of these changes, and Several new protein changes were identified as expected. Therefore, IL-1 β regulates a total of 183 spots and 113 down It was regulated and 34 were newly synthesized (results not shown). Stew When p <0.01 was used as the cutoff level in the dent t test, the final Analysis showed that 52 spots were up-regulated and 47 were down-regulated by IL-1β. And that 6 were newly synthesized. Thirteen were included in 33 spots selected by visual analysis. Discussion: In this study, we found that 10% of newborn rat islets of Langerhans and Present 15% acrylamide 2-D gel protein DB. This is for any species Includes the first protein database of islets or insulin-secreting cells. 1792 Spots were present in 5 of the 5 gels in the 15% DB, while 1373 Spots were present in 5 of the 5 gels at 10% DB. This means It produces a qualitative reproducibility between 75.2% and 91.7%. % IO in both databases The average CV% of D was between 42.4% and 45.7%. Changes in expression by IL-1β Applying 10% DB to distinguish proteins, 105 105 currently unidentified protein Pots are up / down regulated by IL-1β or newly synthesized It turned out to be. Features of the newborn Wistar Furth rat island. To reduce variability, The line breeding Wistar Furth line was selected as the island supplier for our database. This strain is routinely used in our laboratory for island experiments. Outbreeding Wistar is an inbred breeding variant (Andersen et al., Diabetes 43: 770-777 (19 94)). We have developed a new Wistar Furth culture with or without IL-1β. Previously determined that live rat islet function is comparable to that of Wistar neonatal rat islets (Andersen et al., Diabetes 44: 400-407 (1995); Andersen et al., Acta Endocrinol. 120: 92-98 (1989)) and the 2-D gel protein pattern of Wistar Furth Island The effect of IL-1β was determined (Andersen et al., Diabetes 44: 400-407 (1995)). Book The database is based on neonatal rat islets and not on adult rat islets. The present inventors could exclude the difference in adult island protein patterns. Absent. However, adult and neonatal islets derived from outbred Wistar rats are harmful to IL-1 Are equally susceptible to various effects (Mandrup-Poulsen et al., Diabetes 36: 641-647). (1987)). Each litter of neonatal rat used for islet isolation typically has various frequencies. Consists of 8-12 pups, either male or female in degree. Male and female outbred Wistar Comparison of Coomassie Blue-stained gels of rat liver proteins from 250 analysis 7 showed quantitative differences in 7 of the spots, and 6 proteins were male And one protein is found exclusively in females (Steiner et al., Electrophoresis 16: 1969-1976 (1995)). Some of the proteins in our database are sex-specific or It is thought that. Therefore, some of the spots in our database The high variability is due to the fact that we have separate databases of islets from male and female rats. Can be reduced if you choose to create a resource. However, liver protein gel Was performed on uncultured cells. This is because sex-determining protein variability is circulating Means that it can be induced by steroids and is not an intrinsic trait of the hepatocytes themselves. obtain. Circulating hormone does not appear to interfere with our protein pattern You. Because, I) we pre-cultured the islets for 4 days before the experiment, and II) Differences in serum concentrations of sex steroids are not seen before puberty. Sa In addition, the present inventors reported that islets from male and female outbred Wistar rats Have previously been shown to be equally susceptible to severe effects (Steiner et al., Electrophor oresis 16: 1969-1976 (1995)). Detection of islet proteins. All scans detected in our database Pots do not represent different protein entities. Because Some spots may have other protein modifications (eg, acetylation, methylation, Phosphorylation, or carbamylation). However, spot detection Numbers are lower estimates of the total number of islet proteins. Because protein de Databases include proteins below the sensitivity limit, proteins without methionine, Proteins with a molecular weight below 6 kDa or above 250 kDa, or 3.5 Does not contain proteins having a pH lower or higher than 10.5. In addition, Approximately 40% of spots with an IOD above the exit limit previously had It was estimated to be lost due to its cover (Garrels, J. Biol. Chem. 264.5269-5282 (1989)). Finally, a labeling period of 4 hours results in high synthesis rates. Gives longer protein labeling, but longer labeling periods May be needed to create a steady state database. Qualitative reproducibility. Previous reports of the qualitative reproducibility of the 2-D gel protein database have been limited. No, results are variable: mouse liver protein on Coomassie blue stained 2-D gel In the database, 826 spots exist in the master image, averaging 500 spots Spots matched in 85% of other mouse liver patterns (Giometti et al., Elec trophoresis 13: 970-991 (1992)). (³⁵S) -Methionine-labeled mouse embryo tamper In the quality database, more than 80% of the spots in each of the four gel images Automatically fitted to standard images (Shi et al., Molec. Reprod. Develop. 37: 34-47 (19 94)). In our study, 1792 spots (75.2% to 91.7%) had a 15% DB Spots present in 5 of 5 gels but present in 5 of 5 gels Average percentage was 5-10% lower than in the 10% DB. This is probably 10% The high molecular weight region that can be analyzed only with a low molecular weight region that can be analyzed only with a 15% gel Due to the fact that there are fewer proteins than in. analysis In all groups, the qualitative reproducibility of the NEPHGE gel was lower than that of the IEF gel. It was lower. NEPHGE gels are non-equilibrium gels, as opposed to IEF gels. The risk of spots having slightly different horizontal positions increases. However, the present invention Their manual editing confirmed that this problem had been eliminated as much as possible. Quantitative reproducibility. With regard to quantitative reproducibility, comparison with other studies is difficult. Why This is because the methods used for spot identification are not the same. further, Included in the calculation of% IOD CV% in most previously published databases The selected spot is selected from the total number of matching spots according to various criteria. Male and female And 10 female Coomassie blue stained gels of Wistar rat liver protein, 250 out of more than 1,000 spots in the “Master Gel” Shape, size and resolution, as well as presence and good quality in previous experiments (Steiner et al., Electrophoresis 16: 1969-1976 (1995)). this Using these criteria, one third of the spots have a CV% below 20% and more than half Many had CV% below 30% and three quarters had CV% below 40% (Steiner et al., Electrophoresis 16: 1969-1976 (1995)). Compacted eight cells eight-cell (CEC) 5 gels of mouse embryo and 4 gels of blastula stage (BS) mouse embryo Consists of (³⁵In the protein database of S) -methionine-labeled mouse embryos, 1,674 and 1,653 spots, respectively, match in all gels (Shi et al., Molec. Reprod. Develop. 37: 34-47 (1994)). All compatible spots Calculated based on the percentage of these spots, 74% (CEC) or 79% (BS) of these spots The percent error (defined as SEM x 100 / mean) is less than 50% and the spot 45% (CEC) or 47% (BS) had a percentage error of less than 30% (Shi et al., Mol ec. Reprod. Develop. 37: 34-47 (1994)). Convert SD to SEM for comparison (SE M = SD / √n) gives an average CV% of 20.3% in the 15% DB of the island IEF, with 97. 7% and 83.2% have percentage errors below 50% and 30%, respectively. The quantitative reproducibility of our work was determined by studies in mouse embryos (Shi et al., Molec. Re. prod. Develop. 37: 34-47 (1994)) or much better However, the average CV% of% IOD in our database is still relatively high. As previously mentioned, different male / female ratios of islet heterogeneous cell populations and islet isolation were gel-able. May contribute to denaturation. We will use gels with comparable total optical density. (The maximum difference within each subgroup was a factor of 3.5 (Gel DB10 vs. Gel D B3, IEF 15% DB, Table 3)), but the non-linear saturation of X-ray film Contributes to the magnitude of the CV% for the unit. Phosphoimaging (this study started Technology that was not available in our lab when Reduced elephant contribution to CV% magnitude. Finally, in computer analysis Differences in electrical noise and spot boundary definition can contribute to the magnitude of CV%. Go Use a local but not global background for the Decrease the child's contribution to CV%. Study of replication gel. (³⁵Study of 10 replicate gels of S) -methionine labeled REF 52 cells In Garrels, 1109 was the most dominant spot out of a total of about 2,000 spots Select individuals and range between <5% and> 100% and between 10% and 15% In the modal value of, the average CV% was found to be 26.5% (Garrels J. Biol. Chem. 264: 5269-5282 (1989)). The samples were analyzed consecutively or It is not clear whether the analysis was performed on a gel of the kit. Spot quality (fit to Gaussian shape) , Spots) and overlap on all gels 19.1% of the highest quality spots are 13.0% when omitting spots with low density (Garrels, J. Biol. Chem. 264: 5269-5282 (1989)). Expectation Mean CV% of% IOD, 15% IEF and NEPHGE interassay analysis as Decreased when compared to IEF DB. This reduction is about 9%. In-assay analysis Excluded that the average CV% is expected to decrease much more, since the daily variation of the gel preparation was excluded Was done. In the 15% IEF subgroup, CV% decreased by about 15% compared to the database However, no reduction was seen in the 15% NEPHGE subgroup. 15% NEPHGE assay subgroup ( This also has the lowest qualitative reproducibility of all subgroups (Tables 4-6)). The reason for the higher average CV% is unknown. Database gel is also a set of gels When analyzed in, the portion of CV% due to biological variation is Differences in% CV between in-assay analysis for a given spot Should be given. Therefore, the results of the analysis within the 15% NEPHGE assay are ignored. In some cases, about one-third of the average CV% of the IOD% is due to biological variability. Effect of IL-1β on islet protein expression. IL-1β has been identified in 105 The expression of the unaltered protein was altered. The mechanism of action of IL-1β in islet cells is Although not fully understood, three distinct groups of proteins play important roles : Proteins involved in signal transduction and so-called early and late responses Gene-encoded protein (Eizirik et al., Diabetologia 39: 875-890 (1 996)). IL-1β-induced signaling in target cells consists of four major signaling Likely involvement: nuclear factor-κb, stress-activated protein kinase (SAPK / JNK), protein kinase C, and tyrosine kinase (Mandrup-Poul) sen, T., Diabetologia 39: 1005-1029 (1996); Eizirik et al., Diabetologia 39: 875. -890 (1996)). The three pathways are c-fos, c-jun, and interferon response factor -1 is an early response gene involved in cytokine action in islet cells Leads to one-time induction. Early response genes may have harmful effects on islets (INOS, cycloxygenase-2, and lipoxygenase) and protective effects ( Specific with HSP72, heme oxygenase, Mn superoxide dismutase) Activate the gene (Mandrup-Poulsen, T., Diabetologia 39: 1005-1029 (1996) Eizirik et al., Diabetologia 39: 875-890 (1996)). Thus, IL-1 in islet cells Information on the mechanism of beta action is still limited and changes with expression by IL-1β Identification of 105 proteins identified as signaling and protective and harmful New knowledge about proteins with effects can be derived. Conclusion We have previously published databases in other cells and tissues. Improved neonatal rat Langerhan with improved qualitative and quantitative reproducibility The protein database of the islands was established. In addition, the present inventors have developed a newborn baby rattle. Intra- and inter-assay variability of the Tosoh protein database was determined . This database further includes proteins that have been altered in expression by IL-1β ( (Can play an important role in the mechanism of IL-1β action). Since IL-1β is cytotoxic to insulin-producing rat B cells, quality Identification of these proteins, performed by quantitative analysis and microsequencing, It is expected to generate important knowledge about the pathogenesis of insulin-dependent diabetes. All references (journal articles or required U.S. or foreign patent applications published, pending or pending, U.S. or issued Is the entire patent (including its foreign patents, or any other references) Including all data, tables, figures, and text of the Incorporated as a reference. In addition, references cited in the references cited herein The entire contents of the cited references are also incorporated by reference in their entirety. References to known method steps, conventional method steps, known methods, or conventional methods Any aspect, description, or embodiment of the invention is disclosed in the relevant art. Nor is it an approval to be taught, suggested or suggested. The foregoing description of certain embodiments is sufficient to fully illustrate the general nature of the invention, and is not to be construed as limiting. Have knowledge of the art (see the references cited herein). (Including content), without undue experimentation, Without departing from the spirit, such particular embodiments may be implemented for various applications. It can be easily modified and / or applied. Therefore, such applications and modifications are Based on the teachings and guidance given in the specification, such as the disclosed embodiments It is intended to be within the meaning and range of the valency. Terminology or technical term used in this specification The term, in combination with the knowledge of those skilled in the art, considers the teachings and guidance provided herein. As understood by those skilled in the art, It is to be understood that the terminology is for explanation, not for limitation.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｐ 3/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ０７Ｋ 14/47 33/50 ＺＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/15 5/00 Ｂ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号６０／０３０，１８６ (32)優先日平成８年11月５日(1996．11．5) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／８９７，０９８ (32)優先日平成９年７月18日(1997．7．18) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人ブジェリークリステンセン，ウラデンマーク国デーカ―2830 ビルム，ビルムオーバードレフスブ 27 (71)出願人ポシオト，フレミングデンマーク国デーカ―2700 ブロンシェ，ブロンショホルムサル 48 (71)出願人アンダーセン，ヘンリクユー. デンマーク国デーカ―2880 バグスバード，モエレマルケン 56エイ (72)発明者モーゼラルセン，ペーテルデンマーク国デーカー―8000 アールフスセー，43，ヴェステルバング 10 (72)発明者フェイ，スティーブンジェイ. デンマーク国デーカ―8000 アールフスセー，ヴェステルバング 772 (72)発明者ネルプ，ジョーンデンマーク国デーカ―2840 ホルト，ブジェルガードスバンゲット 13 (72)発明者カールセン，アランイー. デンマーク国デーカ―3450 アレロッド，ビベバング９ (72)発明者ブジェリークリステンセン，ウラデンマーク国デーカ―2830 ビルム，ビルムオーバードレフスブ 27 (72)発明者ポシオト，フレミングデンマーク国デーカ―2700 ブロンシェ，ブロンショホルムサル 48 (72)発明者アンダーセン，ヘンリクユー. デンマーク国デーカ―2880 バグスバード，モエレマルケン 56エイ──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61K 48/00 C07K 14/47 A61P 3/10 G01N 33/15 Z C07K 14/47 33/50 Z C12N 5 / 10 C12N 15/00 ZNAA G01N 33/15 5/00 B 33/50 A61K 37/02 (31) Priority claim number 60 / 030,186 (32) Priority date November 5, 1996 (November 1996) .5) (33) Priority country United States (US) (31) Priority claim number 08 / 897,098 (32) Priority date July 18, 1997 (July 18, 1997) (33) Priority Claimed country United States (US) (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (GH, KE, LS, MW, SD, SZ, UG, ZW), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ) , MD, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI , GB, GE, GH, HU, ID, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, M W, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, SL, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN, YU, ZW ( 71) Applicant Bjerry Christensen, Ura Deca 2830, Denmark Oberrefvsbu 27 (71) Applicant Posioto, Fleming Denmark, Deca-2700 Bronche, Bronshoholmsal 48 (71) Applicant Andersen, Henrik U. Denmark, Decca-2880 Bagsbad, Moermarken 56A (72) ) Inventor Moses Larsen, Peter, Denmark, Dakar-8000 Aalhussee, 43, Westerbang 10 (72) Inventor Fay, Stephen Jay. , Joan, Denmark, Denmark 2840 Holt, Bugelgaardsbanget 13 (72) Inventor Carlsen, Alan E. Denmark, Denmark 3450 Allelod, Vivebang 9 (72) Inventor Buggery Christensen, Ura Deca, 2830 Birm, Denmark , Bilm Overdo Fusubu 27 (72) inventor Poshioto, Fleming Denmark Deka -2700 Buronshi E, Bron sucrose Holm monkey 48 (72) inventor Andersen, Henrik Yu. Denmark Deka -2880 Bagusuba de, Moere Marken 56 Rays

Claims

[Claims] 1. An in vitro method for identifying a diabetes-mediating protein, comprising: Process: (A) cells capable of secreting insulin or developing into insulin-secreting cells; Or obtaining a tissue; (B) transplanting the cells or tissues into a host mammal, wherein the host Wherein the mammal is at risk of developing diabetes; (C) the transplanted cells or tissues at multiple times between transplantation and the onset of diabetes Removing from the host mammal; (D) analyzing the protein expression of the removed cells or tissues; (E) expression of the protein at a certain time in the presence of diabetes onset; Altered as a result of the development of diabetes, compared to the expression of the protein in the absence Identifying a protein that exhibits increased expression, wherein the protein A process that is a disease-mediated protein; A method comprising: 2. 2. The method of claim 1, wherein the cells are pancreatic islet cells or beta cells. How. 3. 2. The method of claim 1, wherein the host mammal comprises the transplanted cells, A method that is immunologically compatible. 4. 2. The method of claim 1, wherein the analysis of protein expression comprises gel electrophoresis. Dynamics, immunoblotting, mass spectrometry, or chromatography. How. 5. 5. The method according to claim 4, wherein the electrophoresis is two-dimensional gel electrophoresis. How. 6. An isolated diabetic mediator identified through the process of claim 1. Protein. 7. A diabetes-mediating protein, wherein the protein is the same protein in the absence of diabetes. Characterized as showing altered expression during the onset of diabetes compared to protein expression Protein, 8. The diabetes-mediating protein according to claim 7, wherein the protein is selected from the group consisting of: And a protein selected from the group consisting of the proteins listed in 2. 9. 8. The diabetes-mediating protein according to claim 7, wherein the protein comprises Tans characterized as having mass spectrometric features of proteins shown in -48 A protein selected from the group of proteins. 10. The protein according to claim 7, wherein the protein is: (A) protection against onset of diabetes in a subject at risk of developing diabetes; To do; (B) delaying the onset of diabetes in a subject at risk for developing diabetes; And; or (C) ameliorating the symptoms of diabetes in a subject at risk for developing diabetes. Is a protective protein characterized as a protein capable of Park quality. 11. 8. The protein according to claim 7, wherein the protein comprises: (A) enhancing the onset of diabetes; (B) increasing the risk that the subject will develop diabetes; (C) in subjects at risk of developing diabetes, Reducing the time spent; or (D) increasing the severity of the subject's symptoms; A protein that is a harmful protein, characterized in that it can 12. A method for predicting the onset of diabetes, comprising the following steps: (A) In the samples obtained from the test subjects, Measuring the expression of one or more of them; (B) In the samples obtained from the test subjects, Measuring the expression of one or more of them; and (C) the steps (a) and (b) Comparing the expression of the proteins, wherein the proteins of Tables 1 and 2 are included. The method wherein the change in one or more of the qualities is indicative of the development of diabetes. 13. 13. The method according to claim 12, wherein the samples are listed in Tables 1 and 2. One cell, multiple cells expressing one or more of the listed diabetes-mediating proteins The method, which is either a number of cells or a tissue. 14． In vitro methods for identifying protective or deleterious diabetes-mediating proteins Wherein the method comprises the following steps: (A) using a polynucleotide encoding a diabetes-mediating protein, Transfect cells under conditions where nucleotides are expressed as proteins Doing; and (B) determining the effect of the expressed protein on the cell. The effect is the alteration of one or more cell functions in the absence or presence of a cytokine The cellular function is measured as nitric oxide (NO) production, insulin secretion, The method, which is one or more of survival, protein expression, and cytotoxicity. 15. In vivo methods for identifying protective or deleterious diabetes-mediating proteins Thus, the method comprises the following steps: (A) expressing a diabetes-mediating protein under conditions in which the protein is expressed Producing a transgenic mammal; and (B) Influence of expression of the protein on the onset and timing of onset of diabetes Determining that the protective protein is in a patient at risk for diabetes. A protein that prevents, inhibits or delays the onset of diabetes, and And harmful proteins can cause diabetes in patients at risk of developing diabetes. Cause the onset, increase the risk of developing diabetes, increase the severity, or A method that is a protein that reduces the time required to develop diabetes. 16. Transgene containing exogenous diabetes-mediating protein transgene Nick non-human mammal. 17． An assay method for screening a compound, comprising: Expression of diabetes-mediating proteins can be achieved, comprising the following steps: (A) administering a test compound to the transgenic mammal according to claim 16; The process; (B) measuring the effect of the compound on the incidence and timing of the onset of diabetes The compound inhibiting, reducing, inducing, or otherwise inhibiting the expression of the protein. Or increase, the way. 18. A compound identified by the assay method according to claim 17, comprising: under: (A) inducing or enhancing the expression of an endogenous protective protein; or (B) suppressing or inhibiting the expression of harmful diabetes-mediating proteins; Wherein the compound is present in patients at risk of developing diabetes. Compounds capable of delaying or preventing the onset of diabetes. 19. A method for treating or preventing diabetes or a diabetes-related disorder. Prevent or delay the onset of diabetes in patients at risk for developing diabetes Compounds that can prolong the symptoms of diabetic in a diabetic subject Administering a substance. 20. 20. The method according to claim 19, wherein said compound is an antisense sequence. How. 21. 20. The method of claim 19, wherein the compound is a diabetes-mediating protein. The method is antibody specific for the antibody. 22. 20. The method of claim 19, wherein said compound is a diabetes-mediated protein. Quality is the way. 23. 23. The method of claim 22, wherein the diabetes mediating protein is And a method selected from the group of proteins of Table 2. 24. 20. The method of claim 19, wherein said compound is a diabetes-mediated protein. The method of enhancing or increasing the expression of quality. 25. 20. The method of claim 19, wherein the compound is a diabetes-mediated protein. A method of inhibiting or reducing the expression of quality. 26. 26. The method of claim 25, wherein the compound is a diabetes-mediated protein. A method of inhibiting in vivo expression of a quality. 27. Methods for identifying compounds that can modulate the activity of diabetes-mediating proteins Testing that may modulate the activity of diabetes-mediating proteins Treating a cell, tissue, or animal with the compound, and one or more mediators of diabetes Determining the effect of the compound on the activity of the sex protein. Law.