JP2002504802A - Urocortin peptide - Google Patents

Urocortin peptide

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ジョアン ヴォーン
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ポール ソウチェンコ
ジーン イー エフ リヴィア
マリリン エイチ パーリン
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ザ ソルク インスティテュート フォア バイオロジカル スタディース
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Abstract

(57)【要約】 ウロコルチン（Urocortin，Ucn）はウロテンシン１およびコルチコトロピン遊離因子(CRF)と一般的な関係を有する天然の哺乳類ペプチドである。ヒトＵｃｎは以下の式を有する： ラット由来Ｕｃｎは、Ａｓｎ2の代わりにＡｓｐ2およびＳｅｒ4の代わりにＰｒｏ4が置換されているという２つの置換を除いて同一である。Ｕｃｎまたはその類似体または医薬的に許容できるその塩はヒトおよび他の哺乳類に投与して、ＡＣＴＨ、β−エンドルフィン、β−リポトロピン、その他のプロ−オピオメラノコルチン遺伝子産物およびコルチコステロンの実質的な上昇を達成することができる。それらはまた、長期にわたって血圧を低下させるために用い、気分を高揚させ、さらに記憶および学習成果を改善する刺激物質として用いることができるとともに、診断的にも用いることができる。短縮フラグメントは、脳内および末梢で内在的ＣＲＦおよび／またはＵｃｎを遊離させるために投与することができる。Ｕｃｎ拮抗物質は、Ｕｃｎに対する抗体のように、Ｕｃｎおよび／またはＣＲＦの作用を封鎖するために用いることができる。標識Ｕｃｎ作動薬および拮抗物質は、ＣＲＦレセプターとともに薬剤スクリーニングアッセイで用いることができる。それらはまた、Ｕｃｎ抗体とともに診断的に用いることができる。 (57) [Summary] Urocortin (Urocortin, Ucn) is a naturally occurring mammalian peptide with a general relationship to urotensin 1 and corticotropin releasing factor (CRF). Human Ucn has the following formula: Rat-derived Ucn is, Pro 4 instead of Asp 2 and Ser 4 instead of Asn 2 are identical except for two substitutions that are substituted. Ucn or an analog thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered to humans and other mammals to produce ACTH, β-endorphin, β-lipotropin, other pro-opiomelanocortin gene products and substantially the same as corticosterone. A climb can be achieved. They can also be used as stimulants to lower blood pressure over time, enhance mood, and improve memory and learning outcomes, as well as diagnostically. Truncated fragments can be administered to release endogenous CRF and / or Ucn in the brain and peripherally. Ucn antagonists, like antibodies to Ucn, can be used to block the effects of Ucn and / or CRF. Labeled Ucn agonists and antagonists can be used in drug screening assays with CRF receptors. They can also be used diagnostically with Ucn antibodies.

Description

【発明の詳細な説明】 ウロコルチンペプチド 本発明は、国立予防衛生研究所により付与されたグラント番号DK-26741の下に 政府の支援を受けて達成された。合衆国政府は本発明において一定の権利を有す る。 本出願は、暫定出願第60/002223号（1995年8月11日出願）および、暫定出願と なった出願第08/490314号（1995年6月13日出願）を基に優先権を主張する。 本発明は、ペプチドホルモン、そのようなペプチドホルモンを使用するヒトを 含む哺乳類の治療方法、そのようなペプチドと結合する抗体、そのようなペプチ ドおよび／または抗体を使用する診断および薬剤スクリーニングの方法、並びに そのようなペプチドをコードする核酸に関する。より具体的には、本発明は、ウ ロテンシンおよびＣＲＦと同様な幾つかの薬理学的特性を有する、ウロコルチン （Ｕｃｎ）と称される天然のペプチド、その類似体およびフラグメント（広くＵ ｃｎ様ペプチドと称される）、そのようなＵｃｎペプチドを含む医薬組成物、並 びにそのようなＵｃｎペプチドおよびそれに対する抗体を使用する哺乳類の治療 方法、診断方法およびスクリーニング方法に関する。 発明の背景 実験的および臨床的に得られた知見は、視床下部は、副腎皮質向性腺下垂体細 胞の分泌機能の調節に中心的な役割を果たすという考えを支持する。４０年以上 も前に、Guillemin，RosenbergとSaffranおよびSchallyはそれぞれ別個に、イン ビトロで保温するかまたは器官培養で維持した脳下垂体によるＡＣＴＨ分泌の速 度を高める因子が視床下部に存在することを示したが、生理学的なコルチコトロ ピン遊離因子（ＣＲＦ）の性状は、ヒツジのＣＲＦ(ｏＣＲＦ)の性状が１９８１ 年に明らかにされるまで不明であった。これは、以下のアミノ酸配列(配列番号 ：１)を有するものとして米国特許第4415558号に開示された： 当初はこの視床下部−下垂体−副腎（ＨＰＡ）軸におけるその役割を基に分離 され性状を決定されたけれども、ＣＲＦは、中枢神経とともに神経外組織（例え ば副腎、胎盤および精巣）全体に広範囲に分布することが発見された。これらの 場所でＣＲＦはまたパラクリン調節物質また神経伝達物質として作用する可能性 がある。さらにまた、情動疾患（例えば不安、抑うつ、アルコール中毒および神 経性食欲不振）における、さらに生殖と免疫反応調節におけるＣＲＦの関与の高 い可能性は、ＣＲＦ発現の変化は重要な生理学的、病的生理学的帰結をもたらす かもしれないことを示唆した。例えば、ＨＰＡ軸を含む調節環における混乱は、 しばしば循環コルチコイドレベルの慢性的上昇をもたらし、そのような患者は、 体幹肥満、筋肉るいそう、生殖能低下を含むクッシング症候群における身体的特 徴を示す。 視床下部−下垂体−副腎の活性化を仲介するその役割に加えて、ＣＲＦはまた 自律性および行動における変化（それらのいくつかはストレス反応時に発生する ）を調節することも示された。これらの行動変化の多くは、デキサメタゾン処理 で繰り返されることはなく、さらに下垂体切除に反応しないという点でＨＰＡ活 性化とは別個に発生することが示唆された。さらに、ＣＮＳにＣＲＦを直接輸液 することによって種々のストレスに対する自律性反応および行動反応が再現され る。ＣＲＦまたはＣＲＦ拮抗物質の末梢投与ではこれら変化の幾つかに影響を与 えることができないので、ＣＲＦは、そのような機能（食欲抑制、覚醒と学習能 力の増加を含む）に関して脳に直接作用するように思われる。しかしながら、末 梢的に与えられるＣＲＦ拮抗物質はＡＣＴＨ分泌のストレス仲介増加を減弱させ 、脳室に送られる場合は自立性活動および行動におけるストレス誘発変化を軽減 させることができる。 ＣＲＦの広範囲の解剖学的分布と多数の生物学的作用の結果として、この調節 ペプチドは、多くの生物学的過程の調節に必要であると考えられている。ＣＲＦ はまた炎症反応の調節にも関与している。ＣＲＦは幾つかの動物モデルで前炎症 的役割を果たすことが認められたが、ＣＲＦは損傷によって誘発される血管透過 性の上昇を減少させることによって他の動物では炎症を抑制するようである。 １９８１年頃に、ＣＲＦにおおよそ類似する４０残基のアミド化ペプチドが南 アメリカのカエルPhyllomedusa sauvageiの皮膚から分離された。それはソーバ ジン(sauvagine)と呼ばれ、Erspamerらによって性状が調べられ報告された(Regu latory Peptides，2:1-13(1981))。ソーバジンは以下のアミノ酸配列を有する（ 配列番号：２）： 静脈内（ｉｖ）投与された場合、ソーバジンおよびｏＣＲＦは腸間膜動脈の血管 拡張を惹起して哺乳類の血圧を低下させ、さらにまたＡＣＴＨおよびβ−エンド ルフィンの分泌刺激を低下させることが報告された。しかしながら、脳室内（ｉ ｃｖ）に投与された場合は、心拍数および平均動脈圧上昇があり、これらは交感 神経系の活性化に対して二次的である。 １９８２−１９８３年頃にラットＣＲＦ（ｒＣＲＦ）が分離精製され、以下の アミノ酸配列（配列番号：３）を有するヘンテトラコンタペプチドとしてその性 状が明らかにされた： ヒトＣＲＦの公式はその後ｒＣＲＦのそれと同じであることが分かった。この化 合物はしばしばｒ／ｈＣＲＦと呼ばれ、米国特許第4489163号に含まれる。 ほぼ同じ時期に、２つの同種のポリペプチドが魚類の種々の種のウロフィス(u rophyses)から分離された。分離されたこれらのペプチドは総じてＣＲＦと同種 （すなわち約５４％の相同性）で、ウロテンシンＩ（ＵＩ）と命名された。Cato stomus commersoni (ホワイトサッカーまたはサッカーフィッシュ)のＵＩは、以 下のアミノ酸配列（配列番号：４）を有するポリペプチドである：これは時にサッカーフィッシュ（ｓｆ）ウロテン シンまたはｓｆＵＩと呼ばれる。精製と性状決定については文献に記載されてい る(Lederisら、Science 218(4568)：162-164(1982/8/8))。その同族体（コイの ウロテンシン）はCyprinus carpioから得られ、以下のアミノ酸配列（配列番号 ：５）を有する： また別のウロテンシン同族体は以下のアミノ酸配列（配列番号：６）を有する： これは、後にHippoglossoldes elassodonまたはコチ(Flathesd(Maggy)Sole)のウ ロフィスから分離され、時にコチウロテンシンと呼ばれる。合成ＵＩもインビト ロおよびインビボでＡＣＴＨおよびβ−エンドルフィン活性を刺激し、さらにＣ ＲＦやソーバジンと同じ一般的な生物学的活性の多くを有することが判明した。 哺乳類でのＣＲＦ、魚類でのウロテンシンの最初の発見以来、ＣＲＦは他の動 物でも存在することが示されてきた。例えば、魚類のＣＲＦはｒ／ｈＣＲＦと高 い相同性をもつ４１残基のペプチドであることが分かった。そのアミノ酸配列（ 配列番号：７）は以下の通りである：合成魚類ＣＲＦ（ｆＣＲＦ）はＡＣＴＨおよびβエンドルフィン活性をインビト ロ並びにインビボで刺激し、さらに哺乳類ＣＲＦと同様な生物学的活性を有する 。ｆＣＲＦとｒ／ｈＣＲＦ間の高い相同性のために、ウロテンシンおよび／また はソーバジンの対応物となるような他の哺乳類ホルモンが存在する可能性がある と考えられる。 発明の要旨 長さが４０残基のまた別のペプチドを発見した。これはウロテンシンおよびＣ ＲＦと関係を有し、任意にウロコルチン（Ｕｃｎ）と呼ぶ。ウロコルチンはラッ ト／ヒトＣＲＦとの相同性は５０％未満である。長さはソーバジンと同じである が、ソーバジンとは相同性は４０％未満である。もっとも近いウロテンシン配列 （すなわちコイウロテンシン）との相同性は６２．５％である。したがって、Ｕ ｃｎは、これまでに知られた天然の他の全てのペプチドと約８０％未満の相同性 を有する。ラットＵｃｎは以下のアミノ酸配列（配列番号：８）を有する： ヒトＵｃｎは以下のアミノ酸配列（配列番号：１５の残基８３−１２２）を有す る： したがって、ｈＵｃｎはＡｓｎ2およびＳｅｒ4を除いてｒＵｃｎと同じである。 Ｕｃｎは、既知のＣＲＦ、ウロテンシンおよびソーバジンの生物学的特性と全般 的に類似すると考えられる生物学的特性を有するが、多くの点においてより高い 生物学的能力を有する。 本発明は、既知のＣＲＦの実質的に全ての特性を有する、ヒトおよびラットＵ ｃｎ並びにそれらの類似体を含むＵｃｎ様ペプチドを提供する。これらのＵｃｎ 様ペプチドは強力な降圧剤であるだけでなく、それらは、これまで知られていた ＣＲＦの薬理学的生理学的特性を越える新たな特性を有する。より具体的には、 既知ＣＲＦレセプター（ＣＲＦ−Ｒと呼ぶ）、すなわちＣＲＦ−Ｒ１およびＣＲ Ｆ−Ｒ２並びにそれらの短縮（スプライス）変種とともにＵｃｎに対する仮定的 新規レセプターを刺激する作動薬が提供される。 ＣＲＦ−Ｒおよび仮定的Ｕｃｎレセプターと高い親和性で結合するがそのよう なレセプターを顕著には刺激または活性化しない、Ｕｃｎと競合する拮抗物質も また提供される。そのような拮抗物質は、Ｕｃｎのアミノ酸配列またはそれと実 質的に同じ配列をもつ類似体配列からＮ−末端で始まる７から１０残基の配列を 欠落させることによって広く作出される。好ましくは９または１０残基、最も好 ましくは９残基が除かれる。短縮Ｎ−末端は、７またはそれ未満の炭素原子をも つ基でアシル化(例えば〔Ａｃ−Ｔｈｒ10〕−Ｕｃｎ(１０−４０))されるのが 望ましく、他の１、２または３残基をＮ−末端に付加しても（例えばＰｒｏ10） 生物学的能力には顕著な影響を与えない。以下で述べるように他の置換も有効で あろう。特にＤ−Ｐｈｅ11またはＤ−Ｔｙｒ11が、Ｎ−末端および／または残基 ２９と３２の間に作出したラクタム結合に存在してもよい。これらの拮抗物質は 、既知ＣＲＦ拮抗物質と同じ生理学的作用を達成するために投与され、したがっ てより効果的な治療方法が提供される。 さらに、ＣＲＦ結合蛋白（ＣＲＦ−ＢＰ）を阻害するために有用なＵｃｎおよ びＵｃｎ類似体のフラグメントが提供されるが、これらは、結合蛋白によって通 常は取り除かれる内因性ペプチドのレベルを上昇させるために有効である。より 具体的には、これらのＵｃｎ様ペプチドおよび阻害フラグメントは高い親和性で ヒトＣＲＦ結合蛋白と結合して、ヒトＣＲＦおよびヒトＵｃｎ（ｈＵｃｎ）とｈ ＣＲＦ−ＢＰとの複合体形成により効果的に競合する。このような態様で、それ らは、内因性ｈＣＲＦおよび／またはｈＵｃｎのインビボ有効濃度とともに一切 のＣＲＦ作動薬またはＣＲＦ拮抗物質（これらは特定の治療目的を達成するため に場合によって上記とともに投与されることがある）の有効濃度を高める。ＣＲ Ｆ−ＢＰの作用を阻害する結果として、これらのフラグメントは、ＣＲＦ−ＢＰ が通常存在する身体の領域で内因性ＣＲＦの濃度を高める。 本発明はまた、医薬的に許容できる液体または固体担体に分散させたそのよう なＵｃｎ様ペプチドまたは無毒なその塩を含む医薬組成物を提供する。本発明の そのようなペプチドまたは医薬的に許容できるその塩の哺乳類（特にヒト）への 投与は、ＡＣＴＨ、β−エンドルフィン、β−リポトロピン、他のプロオピオメ ラノコルチン（ＰＯＭＣ）遺伝子生成物およびコルチコステロイドの分泌調節、 および／または血圧の低下もしくは冠状血流の増加、および／または浮腫および 炎症の減少、および／または学習、気分、行動、食欲、胃腸および腸機能、並び に自律神経系の活動に影響を与えるために実施することができる。 本発明はまた、Ｕｃｎを認識する抗体、Ｕｃｎおよび類似体および／またはそ のような抗体を実際に用いるアッセイを提供する。これらのアッセイは、下垂体 、心脈管、生殖器、肝臓、免疫、胃腸または中枢神経系の機能の状態を評価する ために用いられる。例えば、そのような抗体は、治療的に投与されたＵｃｎのレ ベルをモニターするために、その治療的有効量を維持させるために診断的に用い られるとともに、異常レベルのＵｃｎによって生じる潜在的な生理学的疾患の診 断のために用いることができる。本発明の抗体は、内因性Ｕｃｎを中和させるた めに治療的に投与することができる。また別には、そのような抗体をコードする ＤＮＡを遺伝子治療として用いることができる。抗Ｕｃｎ抗体はまた、ＣＲＦ− Ｒ蛋白の精製とともに、インビボでＵｃｎの生物学的活性に対抗させるためにも 用いることができる。 本発明はまた競合的結合アッセイを提供する。本アッセイは、試薬候補物質の スクリーニングのために、例えばＵｃｎよりもＣＲＦレセプターおよび／または ＣＲＦ−ＢＰに対してさらに強くさらに選択性を有する、したがって潜在的に薬 剤として有用な新規なＵｃｎ様ペプチドまたは他の化合物を特定するために特に 有用である。そのようなスクリーニングアッセイはＵｃｎの潜在的作動薬のスク リーニングに用いることができる。さらに高い親和性をもつ標識Ｕｃｎ拮抗物質 を用いる他のアッセイはＵｃｎのより強力な拮抗物質のスクリーニングに用いる ことができる。さらにまた、ＣＲＦおよびＵｃｎと結合するＣＲＦ−ＢＰの能力 を阻害し、したがってｈＣＲＦ−ＢＰが存在する場所でＣＲＦおよび／またはＵ ｃｎの濃度を高める特に効果的なペプチドまたは他の化合物をスクリーニングす る方法が提供される。 本発明はさらに、ラットＵｃｎをコードする分離核酸および天然のヒトＵｃｎ をコードする分離核酸の形状にした核酸ハイブリダイゼーションプローブを提供 する。これらのプローブは、また別の天然のＵｃｎもしくはＵｃｎ様ペプチドを 特定するために、生物学的サンプル中または他の種のライブラリー中の他のＵｃ ｎコード核酸の検出に有用である。そのようなヌクレオチド配列はまた、完全な Ｕｃｎ様ペプチドまたは所望の生物学的活性をもつそのフラグメントの組換え体 発現のためのコード配列として用いることができる。Ｕｃｎコード核酸のフラグ メントはまた、ＵｃｎコードＤＮＡのＰＣＲ増幅用プライマーとして用いること ができる。さらに、Ｕｃｎまたはその類似体をコードする配列に由来する配列は また、有用な遺伝子を含むベクターの発現を特定の細胞タイプに限定するために 遺伝子治療で用いることができる。さらにまたＵｃｎｍＲＮＡとハイブリダイズ するアンチセンスポリヌクレオチドを用いてＵｃｎレベルを減少させ、ある種の 条件（例えばＵｃｎ分泌腫瘍）と対抗させることができる。より具体的には、本 発明ははさらに、天然の２０アミノ酸のＬ型異性体を含むＵｃｎおよびＵｃｎ類 似体をコードする分離核酸を提供する。そのような核酸には以下が含まれる： （ａ）配列番号：８で示したラットＵｃｎのアミノ酸配列をコードする核酸およ び配列番号：１５で示したヒトＵｃｎのアミノ酸配列をコードする核酸； （ｂ）核酸（ａ）とハイブリダイズし、この場合当該ハイブリダイズ核酸が生物 学的に活性なＵｃｎ様ペプチドをコードする核酸； （ｃ）Ｕｃｎのフラグメントまたはその類似体をコードし、ＣＲＦ拮抗物質また はＣＲＦ−ＢＰ阻害物質である核酸。 好ましい実施態様の詳細な説明 他で特に規定しないかぎり、本明細書で用いられる全ての技術的学術的用語は 当業者が通常理解する通りの意味を有する。ペプチドを規定するために用いた命 名法は、Schroder & Lubke（“The Peptide(ペプチド)”、アカデミックプレス 刊(1965)）によって明記されたもので、通常の表現方法にしたがってアミノ基は 左側に、カルボキシル基は右側に位置する。標準的な３文字の省略形はα−アミ ノ酸を表し、該アミノ酸が異性型を有する場合は、表示されているアミノ酸は特 に指定されないかぎりＬ型アミノ酸である（例えばＳｅｒ＝Ｌ−セリン）。種々 の核酸に見出されるヌクレオチドは、当技術分野で通常用いられる標準的な１文 字表記で表示される。 “相同性”という用語は、配列内の構成体間の一致（例えばアミノ酸（ＡＡ） レベルまたはヌクレオチドレベル）を指す周知で通常の意味で用いられる。本出 願の目的のためには、“相同”という場合は少なくとも約７０％の一致を指し、 “実質的に相同”という場合は少なくとも約８０％の一致を指し、“高度に相同 ”という場合は少なくとも約９０％または好ましくは約９５％もしくはそれ以上 の一致を指す。“同族体”という用語は、一般に他の哺乳類の種に由来する類似 の蛋白、ペプチドおよびＤＮＡ配列を含むと考えられ、この場合、些細な変化が 発生しているが相同性によって実質的に同じ態様で同じ生物学的機能が発揮され る。 蛋白、ポリペプチドおよびペプチドは、隣接残基のα−アミノ基およびα−カ ルボキシ基間のペプチド結合によって互いに結合されたアミノ酸残基の直線状配 列を表示するために用いられる。ポリペプチドという用語は、ペプチドおよび蛋 白と言う用語と相互に用いることができる。別に限定されなければ、一般に蛋白 は約７５またはそれ以上の残基の配列をいう場合に用いられる。 “類似体”という用語は、本明細書で具体的に示す配列（例えばｒＵｃｎまた はｈＵｃｎ）と全般的に同一であるアミノ酸残基配列を有する一切のポリペプチ ドを含み、この場合、１つまたは２つ以上の残基が置換されていて（少なくとも 約８０％、好ましくは少なくとも約９０％の残基は同じである）、該類似体は、 ある特定の機能において本明細書で述べるように親分子を生物学的に模倣する能 力を発揮する。好ましくは、そのような置換の（全てでないとしたら）ほとんど は機能的に同様な残基による残基の置換（すなわち保存的置換）である。そのよ うな保存的置換の例には以下が含まれる：１つの非極性（疎水性）残基（例えは イソロイシン、バリン、アラニン、グリシン、ロイシンまたはメチオニン）の別 の非極性残基との置換：１つの極性（親水性）残基の別の極性残基との置換（例 えばリジンの代わりにアルギニン、アスパラギンの代わりにグルタミン、セリン の代わりにスレオニン）：１つの塩基性残基（例えばリジン、アルギニンまたは ヒスチジンによる別の塩基性残基の代用）：および１つの酸性残基（すなわちア スパラギン酸またはグルタミン酸による他方の代用）。“保存的置換”という語 句はまた、結果として生じるポリペプチドが必須の生物学的活性（例えば結合活 性）を発揮するということを条件に非誘導化残基の代わりに化学的に誘導した残 基を使用することもまた含まれる。本出願の目的のためには、２つのペプチドが 保存的置換によって互いに相違する堤合はそれらは実質的に同じであると考えら れる。好ましい保存的置換の例は表１で示される。 “化学的誘導体”とは側鎖官能基の反応によって化学的に誘導された１つまた は２つ以上の残基をもつ対象ポリペプチドを指す。そのような誘導ポリペプチド は、例えば遊離アミノ基が、アミンヒドロクロリド、ｐ−トルエンスルホニル基 、クロロアセチル基またはホルミル基を形成するように誘導されたものを含む。 遊離カルボキシル基は、塩、メチルおよびエチルエステルもしくは他のタイプの エステル、またはヒドラジドを形成するように誘導することができる。遊離ヒド ロキシル基は、ｏ−アシルまたはｏ−アルキル誘導体を形成するように誘導する ことができる。ヒスチジンのイミダゾル窒素はＮ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを 形成するように誘導することができる。化学誘導体はまた、２０の標準アミノ酸 の天然に存在する１つまたは２つ以上のアミノ酸誘導体を含むペプチドも含む。 例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンの代りに、５−ヒドロキシリジンは リジンの代りに、３−メチルヒスチジンはヒスチジンの代りに、さらにオルニチ ンはリジンの代りに用いることができる。本発明に包含されるペプチドはまた、 改変ペプチドが必須の生物学的活性を維持するかぎり、本明細書にその配列を示 す個々のペプチドに対して１つまたは２つ以上の残基の付加および／または欠失 を有するペプチドも含む。 本明細書で用いられる“医薬的に許容できる”“生理学的に許容できる”とい う用語は、それらが組成物、担体、希釈剤および試薬を指す場合は互換的に用い られ、さらに当該物質が望ましくない生理学的作用（例えば吐き気、眩量、胃の 不快感など）を生じることなく哺乳類に投与可能であることを表す。 本明細書で用いられる“生物学的に活性なフラグメント”とは、（ａ）Ｎ−末 端、Ｃ−末端または両方のいずれかにおいて短縮された本発明のペプチドのフラ グメント、または（ｂ）ｒＵｃｎまたは高度に相同性を有する別の種の天然ペプ チドのコード領域に対応する核酸でその５’もしくは３’末端またはその両方で 短縮され、さらにアンチセンス利用において有用なフラグメントを指す。記載し たペプチドフラグメントは、親ペプチドと実質的に同じ機能または正の相関性を 有する生物学的機能を発揮する。 本明細書で用いられる“ＣＲＦレセプターのトランス型活性化を調節する”と いう語句は、生理学的に許容可能なＵｃｎ様ペプチド含有組成物の有効量を投与 し、その結果ＣＲＦレセプター（ＣＲＦ−Ｒ）との直接的または誘発的な拮抗（ 競合）的会合という手段によって哺乳類でＣＲＦ作用を調節することを意味する 。 ＣＲＦ−Ｒは、ＣＲＦおよびＵｃｎ様リガンドに対するＧ蛋白共役反応に加わ るレセプター蛋白のサブタイプ類を指すために用いられる。ＣＲＦ−Ｒは、異種 三量体Ｇ蛋白によって種々の細胞内酵素、イオンチャンネルおよび輸送物質と共 役する。Ｇ蛋白は形質膜の細胞内側面でレセプター蛋白と会合する。ＣＲＦ−Ｒ と結合する作動薬は、α−サブユニット上でＧＤＰのＧＴＰへの交換を触媒し（ Ｇ蛋白“活性化”）、その解離と種々のシグナル誘導(signal-transducing)酵素 およびチャンネルの１つ（または２つ以上）の刺激をもたらす。Ｇ蛋白は、優 先的に特定のエフェクターを刺激し、したがってシグナル誘導の特異性は、Ｇ蛋 白／レセプター相互作用の特異性によって決定できる。ＣＲＦ−Ｒ蛋白は、アデ ニレートシクラーゼの調節を介して、さらにおそらくはＰＩターンオーバーを介 してシグナル誘導を仲介する。例えば、ＣＲＦまたはＵｃｎがＣＲＦ−Ｒと結合 しこれを活性化する場合、アデニレートシクラーゼは細胞内ｃＡＭＰレベルの上 昇を引き起こす。被験化合物が細胞内ｃＡＭＰを上昇させることができるか否か を調べる有効なバイオアッセイは、ＣＲＦレセプター蛋白のシグナル誘導活性を 調節する能力を調べようとしている作動薬または拮抗物質の存在下で、ＣＲＦレ セプター蛋白を発現するｃＤＮＡを含む細胞を培養することによって実施される 。そのような形質転換細胞は、被験作動薬または拮抗物質の有効性を決定するこ とができる細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇または減少のいずれかについてモニター される。細胞内ｃＡＭＰレベルの測定方法またはシクラーゼ活性の測定方法は当 技術分野で周知である。 ヒトＣＲＦレセプターは報告された最初のものであり、Chenら(R．Chenら、P. N.A.S.，90:8967-8971(1993))が報告したようにヒトのクッシング下垂体腫瘍か らクローニングされた。これはｈＣＲＦ−Ｒ１またはｈＣＲＦ−ＲＡと呼ばれ、 ４１５アミノ酸を有し、そのスプライス変形体は２９アミノ酸の挿入を含む。ラ ットＣＲＦレセプターは、ほぼ同時期にラットの脳ｃＤＮＡライブラリーからハ イブリダイゼーションによって分離された。これはｒＣＲＦ−Ｒ１と呼ばれ、配 列番号：１０として以下で説明する４１５アミノ酸配列を有する。これは、Perr inらが開示した(M．Perrinら、Endocrinology，133:3058-3061(1993))。これは 、アミノ酸レベルでヒトＣＲＦ−Ｒ１と９７％同一で、わずかに１２アミノ酸が 異なっていることが判明した。それ以後このレセプターは脳および下垂体全体に 広く分布し、おそらく副腎および脾臓にも存在するであろうと報告された。 ＣＲＦレセプターの第二のサブクラスはずっと最近になって発見されたが、そ のようなレセプターは本明細書では任意にＣＲＦ−Ｒ２と称するが、時にＣＲＦ −ＲＢと呼ぶ。配列番号：１１として以下で説明するアミノ酸配列を有するその ようなレセプターの１つが、マウスの心臓のｃＤＮＡライブラリーのクローニン グとｃＤＮＡの性状決定によって得られた。このレセプターは長さが４３１アミ ノ酸残基で、その詳細は文献に記載されている(M．Perrinら、P.N.A.S.，92:296 9-2973(1995))。このレセプターは以下ではＣＲＦ−Ｒ２βと呼ぶが、かつては ＣＲＦ−ＲＢLと称された。 この第二のサブクラスのまた別のわずかに短いレセプターが、ラットの視床下 部のｃＤＮＡライブラリーから別個に得られた。これは本明細書ではＣＲＦ−Ｒ ２αと呼び、配列番号：１２として以下で説明するように４１１アミノ酸残基配 列を有する。そのクローニングの詳細は文献（T．Lovenbergら、P.N.A.S.，92:8 36-840(1995)）に記載されているが、その中で、上記で述べたｍＣＲＦ−Ｒ２β のラット同族体であろうと思われる４３１アミノ酸の仮定的蛋白として第二の短 縮変形体がまたＰＣＲによって特定された。この４３１アミノ酸配列は配列番号 ：１３として以下で説明するが、ｍＣＲＦ−Ｒ２βと相同であることが理解され るであろう。ラットの脳全体にＵｃｎが分布していることは、それがＣＲＦ−Ｒ ２に対する内因性リガンドであることと一致し、このことは、そのレセプター、 特に脳内の主要なＣＲＦ−Ｒであると考えられているＲ２に対してそれがＣＲＦ よりもはるかに強い結合親和性を示すという事実の通りである。 Ｕｃｎ様ペプチド（ｒＵｃｎおよびその類似体を含む）は以下の実施例Ｉで説 明するように容易に合成することができ、続いて個々に結合親和性について検査 することができる。結合親和性はリガンドとレセプター間の相互作用の強さを指 す。ＣＲＦレセプターに対する結合親和性を表すために、本発明のペプチドは、 当技術分野で周知の結合アッセイ実験で既知の親和性をもつトレーサーリガンド （例えば125Ｉ標識ｏＣＲＦ）を用いて容易に調べることができる。そのような アッセイの結果は、各Ｕｃｎ様リガンドがＣＲＦレセプターに結合する親和性を 示すが、それはＫi（そのような既知の標準物質に対する結合親和性抑制定数） によって表される。Ｋi（結合親和性抑制定数）は、“標準物質”または“トレ ーサー”の放射性リガンドを用いて決定され、したがってトレーサーのレセプタ ーまたは結合蛋白からの置換を測定する。Ｋiは、このようなトレーサーをリフ ァレンスとして最も適切に表される。これらのアッセイが比較的低い濃度のレセ プターなどを用いる特定の条件下で注意深く実施されるかぎり、算出Ｋiは、そ の解離定数ＫDと実質的に同じである。ただ１つのトレーサーの標識（例えば放 射能ヨード標識）が必要であるだけなのでこのアッセイはＫiの試験に特に有効 である。解離定数ＫDは、レセプターなどの結合部位の１／２（５０％）を占有 するために必要なリガンドの濃度を表す。ＣＲＦレセプターに対して高い結合親 和性を有するあるリガンドは、利用可能な結合部位の少なくとの５０％と結合す るために極めてわずかのリガンドの存在を必要とし、その結果当該リガンドおよ びレセプターに対するＫD値は小さい数となろう。他方、特定のＣＲＦレセプタ ーに対して低い結合親和性を有するリガンドは、結合部位の５０％に結合するた めに比較的高レベルのリガンドを必要とし、その結果当該リガンドに対するＫD 値は大きい数となろう。 特定のレセプター蛋白に関して約１０ｎＭまたはそれ未満のＫDを有するＵｃ ｎ様ペプチドとは、約１０ｎＭ未満のリガンド（すなわちＵｃｎ様ペプチド）濃 度が当該レセプター蛋白の活性な結合部位の少なくとも５０％を占有するために 必要であることを意味する。そのような値は、放射性ヨード標識標準物質および 約０．８ｎＭ未満のレセプター（約１０−２０ｐＭレセプター／ｍｇ膜蛋白）を 用いて得られる結果から比較的正確に決定できるであろう。好ましいＵｃｎ様ペ プチドは、約１０ｎＭまたはそれ未満のリガンド濃度が少なくとも５０％のレセ プター結合部位の占有（または結合）のために必要とされるような結合親和性（ ＫD）を有し、特に好ましいＵｃｎ様ペプチドは０．１ｎＭまたはそれ未満の結 合親和性を有する。一般に、約５ｎＭまたはそれ未満の解離定数はかなり強い親 和性を示し、約１ｎＭまたはそれ未満のＫDは極めて強い親和性を示す。例えば 、ｒＵｃｎはＣＲＦ−Ｒ１と極めて強い親和性で結合してＫD＝約０．１８ｎＭ で、さらにＣＲＦ−Ｒ２βと同様な強い親和性で結合する。ＣＲＦ−Ｒ１と比較 してＣＲＦ−Ｒ２に対して実質的により高い親和性を有し、したがってその生物 学的作用において選択的であるＵｃｎ様ペプチドを提供することは特に有益であ ろうと考えられる。ＣＲＦ−Ｒ２レセプターは体全体に広く分布するので、Ｕｃ ｎは、多くの末梢作用の調節にＣＲＦよりも実質的により強い効果を有するであ ろうし、さらに天然のペプチドまたはそのフラグメントは免疫原性をもたないは ずであるので、Ｕｃｎは生理学的に極めて有益な薬剤であろう。 ＣＲＦレセプターを用いるこれらの結合アッセイは実施が容易で、さらにその ようなペプチドがＣＲＦの作動薬であるか否かを決定するために、また別に他の 短縮候補物質がＣＲＦの有効な拮抗物質であるか否かを決定するために最初に特 定しまたは合成したペプチドを用いて容易に実施することができる。そのような 結合アッセイは、当業者に周知の方法と合わせて種々の方法で実施することがで きる。そのようなアッセイの詳細な例は文献に記載されている(M．Perrinら、En docrinology，118:1171-1179(1986))。Ｕｃｎを用いる競合的結合アッセイは、 候補ペプチドが、先に述べたレセプターの各々（すなわちＣＲＦ−Ｒ１、ＣＲＦ −Ｒ２およびＣＲＦ−Ｒ２α）について有効な作動薬であるか否かを調べるため に特に意図されるが、同様に候補物質が有効な拮抗物質であるか否かを決定する ためにＵｃｎ拮抗物質を用いたアッセイも意図される。そのようなアッセイでは 、Ｕｃｎは、容易に検出できる物質（例えば放射性同位元素（例えば125Ｉ）ま たは酵素または他のいくつかの適切なタグ）で適切に標識することができる。例 えば、適切に標識した作動薬（例えば125Ｉ−Ｔｙｒ0−Ｕｃｎ）または適切に標 識した拮抗物質(例えば125Ｉ−（シクロ２９−３２）〔Ｄ−Ｔｙｒ11、Ｇｌｕ29 、Ｌｙｓ32〕−Ｕｃｎ(１１−４０))は、そのようなレセプターアッセイで使用 するために特に有用なトレーサーである。そのようなレセプターアッセイは、Ｃ ＲＦおよび／またはＣＲＦレセプターと相互作用する可能性を有する薬剤の篩と して用いることができる。 極めて一般的には、本発明は、配列番号：８および配列番号：１５に基づく以 下のアミノ酸配列と実質的に同じであるアミノ酸配列を有するＵｃｎ様ペプチド （ＵｃｎおよびＵｃｎの類似体を含む）とともにその無毒な塩を提供する： ここで、Ｙは７もしくは７未満の炭素原子を有するアシル基（好ましくはアセチ ル）または水素で、Ｒ1はＡｓｐ−ＡｓｐまたはＡｓｐ−ＡｓｎまたはＡｓｐま たはＡｓｎまたはｄｅｓＲ1で、さらにＲ4はＰｒｏまたはＳｅｒである。Ｎ−末 端が２残基の欠失によって短縮されている場合は、それは好ましくはアシル化、 例えばアセチル化される。これらのペプチドは、ｏＣＲＦまたはｒ／ｈＣＲＦの 薬理学的特性にいくぶん類似する特性および下記に述べる 別の特性を有する。前述したように、ｈＵｃｎまたはｒＵｃｎのいずれかのアミ ノ酸配列と少なくとも約８０％の相同性を有する上記の類似体が本発明のＵｃｎ 様ペプチドとして好ましいが、ｈＵｃｎまたはｒＵｃｎのいずれかと少なくとも ６６％の相同性を有し、置換の全てまたは１つ以外の置換の全てが保存的置換で あるペプチドは生物学的に活性を有し、さらに既知のＣＲＦよりも利点を有する と考えられる。特に好ましいものは、ｈＵｃｎまたはｒＵｃｎのいずれかと実質 的に同じである類似体（前記で定義）およびＤ異性体アミノ酸置換および／また は配列内の特定の残基の側鎖間に環化結合をもつ（これらはＣＲＦレセプターに 対するリガンド結合親和性を高めることが知られている）類似体である。 前述のＵｃｎ様ペプチドの一般群に加えて、ＣＲＦ−Ｒと結合するリガンドに 関して一般的領域で実施した関連する合成および検査を基に新たな２つの群を以 下で開示する。 以下の群のＵｃｎ類似体は単に１つまたは２つ以上の保存的置換を含むもので はない。それどころか、生物学的に活性なＵｃｎ類似体が、以下のアミノ酸配列 にしたがって規定されることが分かった： ここで、Ｙは７もしくは７未満の炭素原子を有するアシル基（好ましくはアセチ ル）または水素で：Ｒ2はＡｓｐまたはＡｓｎで；Ｒ4はＰｒｏまたはＳｅｒで； Ｒ19はＧｌｕまたはＡｌａで；Ｒ29はＡｒｇ、Ｇｌｕ、ＬｙｓまたはＯｒｎで； Ｒ32はＧｌｎ、Ｌｙｓ、ＯｒｎまたはＧｌｕで；Ｒ36はＩｌｅ、ＣaＭｅＩｌｅ またはＣaＭｅＬｅｕで；Ｒ38はＡｓｐまたはＡｌａであるが；その条件はＲ29 がＧｌｕのときＲ32はＬｙｓまたはＯｒｎのいずれかで、その側鎖はアミド結合 によって連結され、さらにＲ32がＧｌｕのときＲ29はＬｙｓまたはＯｒｎのいず れかで、その側鎖はアミド結合によって連結され；さらにＤ−Ｐｈｅ11は別のＤ −異性体アミノ酸、好ましくは天然のアミノ酸のＤ−異性体、例えばＤ−Ｌｅｕ 、より好ましくはＤ−Ｃｙｓ以外のものによって置換されることを条件とし；３ １位のＧｌｕはＤ−アミノ酸、例えばＤ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ａｒｇ、（ ｉｍＢｚｌ）Ｄ−Ｈｉｓ、β−（２ナフチル）−Ｄ−Ａｌａなど、好ましくは同 じく Ｄ−Ｃｙｓ以外の天然のアミノ酸のＤ−異性体という条件に従い；さらにＮ−末 端で１つまたは２つの残基が短縮できるという条件に従う。特に好ましいＵｃｎ 類似体は、（シクロ２９−３２）〔Ｌｙｓ29、Ｄ−Ｇｌｕ31、Ｇｌｕ32〕−Ｕｃ ｎで、ＵｃｎはｈＵｃｎまたはｒＵｃｎのいずれかである。他の類似体について は以下の実施例で述べる。Ｎ−末端で７から１０残基が短縮されている場合は、 これらのＵｃｎ類似体は有効な拮抗物質である。 過去１０年間の重点的な合成と検査は、ＣＲＦレセプターに対するリガンドは 、生物学的活性における顕著な変化（得られた類似体がもはやＣＲＦレセプター （特にＣＲＦ−Ｒｌ）に結合および／またはこれを活性化できないことを示すよ うなもの）をもたらすことのない天然のｒ／ｈＣＲＦのアミノ酸配列における多 くの変化を許容することができることを示した。これらの重点的な初期の研究の 結果、下記に説明するように一定の制限内で、Ｕｃｎアミノ酸配列において１つ 、２つまたは３つの置換を実施することができる。これらの置換は、Ｕｃｎの生 物学的活性を保持し、幾つかの事例ではより望ましい薬理学的特性すら有するＵ ｃｎ類似体を生じる。 Ｕｃｎのアミノ酸配列を参照に用いるならば、これらの類似体では、配列番号 ：８または配列番号：１５との相違は１つ、２つまたは３つの置換のみである。 したがって本発明は、以下のアミノ酸配列（配列番号：１４）のＵｃｎ類似体を 提供する：ここで、Ｙは７もしくは７未満の炭素原子を有するアシル基（好ましくはアセチ ル）または水素で：Ｘａａ1はＡｓｐ、ＧｌｕまたはＧｌｎで；Ｘａａ2はＡｓｎ 、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＧｌｙで；Ｘａａ4はＳｅｒまたはＰｒｏで；Ｘａａ5は Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＭｅｔで；Ｘａａ7はＩｌｅまたはＬｅｕで；Ｘａａ10は ＴｈｒまたはＳｅｒで；Ｘａａ11はＰｈｅまたはＬｅｕで；Ｘａａ12はＨｉｓま たはＧｌｕで；Ｘａａ13はＬｅｕまたはＭｅｔで；Ｘａａ16はＴｈｒ、Ａｓｎ、 ＧｌｕまたはＬｙｓで；Ｘａａ17はＬｅｕ、ＭｅｔまたはＶａｌで；Ｘａａ18は ＬｅｕまたはＩｌｅで；Ｘａａ19はＧｌｕまた はＨｉｓで；Ｘａａ20はＬｅｕ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＡｒｇで；Ｘａａ21はＡ ｌａ、ＧｌｕまたはＴｈｒで；Ｘａａ22はＡｒｇまたはＬｙｓで；Ｘａａ23は天 然のアミノ酸のいずれか、および好ましくはＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、 Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕま たはＡｓｐで、Ｘａａ24はＧｌｎ、ＧｌｕまたはＡｓｐで；Ｘａａ25は天然のア ミノ酸のいずれか、および好ましくはＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ 、Ｖａｌ、Ａｓｎ、ＧｌｎＮ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕまたは Ａｓｐで；Ｘａａ26はＧｌｎ、ＬｅｕまたはＧｌｕで；Ｘａａ27はＡｒｇ、Ａｌ ａまたはＬｙｓで；Ｘａａ28はＧｌｕまたはＧｌｎで；Ｘａａ29はＡｒｇまたは Ｇｌｎで；Ｘａａ31は天然のアミノ酸のいずれか、および好ましくはＡｌａ、Ｉ ｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｕまたはＡｓｐで；Ｘａａ32は天然のアミノ酸のいずれか、および好ましくは Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、 Ｌｅｕ、ＧｌｕまたはＡｓｐで；Ｘａａ35はＩｌｅ、Ｌｙｓ、ＬｅｕまたはＡｓ ｎで；Ｘａａ36はＩｌｅ、Ｔｙｒ、ＭｅｔまたはＬｅｕで；Ｘａａ37はＰｈｅ、 ＬｅｕまたはＭｅｔで；Ｘａａ38はＡｓｐまたはＧｌｕで；Ｘａａ39はＳｅｒ、 Ｉｌｅ、ＧｌｕまたはＴｈｒで：さらにＸａａ40はＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅまた はＡｌａで：ｈＵｃｎまたはｒＵｃｎのアミノ酸配列と異なる残基は３残基未満 であり、さらにＮ−末端で１つまたは２つの残基が短縮できるという条件に従う 。さらにまた、Ｎ−末端で７から１０残基が短縮されている場合はこれらＵｃｎ 類似体は有効な拮抗物質を構成する。 本発明のＵｃｎ類似体は、適切な何れの方法によっても化学的に合成可能で、 そのような方法は、例えば完全固相法、部分固相法、フラグメント濃縮法または 古典的溶液付加である。 Ｕｃｎはまた、その類似体が天然のアミノ酸のみを含む場合は組換えＤＮＡ技 術で合成することができる。ｒＵｃｎのアミノ酸配列（配列番号：８）は、ラッ トの脳ｃＤＮＡライブラリーから分離した部分的ｃＤＮＡクローンから推定され た。Ｕｃｎをコードする天然のラット核酸配列（配列番号：９）は以下の表２で 示す。天然の配列の末端に存在するグリシンをコードする付加コドンは、ｒＵｃ ｎのＣ−末端のアミド化のためと予想される。 プローブとしてｒＵｃｎをコードする核酸を用いて、成熟ｈＵｃｎをコードす る核酸をヒトゲノム胎盤ライブラリーから分離した。成熟Ｕｃｎペプチドをコー ドする天然のヒト核酸配列（配列番号：１６参照）の部分を下記表２Ａに示すが 、Ｃ−末端のアミド化のためと予想される末端のグリシンをコードする付加コド ンをもつ。 この出願の目的ために組換えＤＮＡ技術を用いる合成では、現時点の当技術分 野で周知のようにＵｃｎまたは適切な類似体をコードする分離核酸を適切に利用 することが必要であることは理解されよう。下記で詳細に説明するように、合成 Ｕｃｎペプチドは、Ｕｃｎ様ペプチドをコードする核酸と連繋させた適切な調節 配列を含む発現ベクターを用いて微生物を形質転換させ、さらにそのような形質 転換微生物に該Ｕｃｎペプチドを発現させることによって得ることができる。Ｕ ｃｎ様ペプチドは比較的短いために（約４０残基またはそれ未満）、化学的合成 またはチェーン伸長合成が現時点では選択されるべき方法であるように思われる 。１つまたは２つ以上の置換を有するｈＵｃｎまたはｒＵｃｎの類似体はこの態 様で容易に合成でき、さらに直接的な態様で生物学的活性を検査してそのような 置換による具体的な生物学的作用を調べることができる。そのようなペプチドの 化学的合成にとって共通のことは、種々のアミノ酸部分の不安定な側鎖基の適切 な保護基による保護である。この保護基によって、その基が完全に除去されるま で当該不安定な部位での化学反応の発生が防止される。さらにまた一般的なこと は、アミノ酸または短いペプチドフラグメント上のアルファ−アミノ基を保護す ることであり、一方、当該物質自体は遊離カルボキシル基で反応させてチェーン を伸長させ、続いてアルファ−アミノ保護基を選択的に除去しその位置でそれに 続く反応を起こさせる。したがって、合成の１段階として、側鎖保護基を有する これら種々の残基をもつペプチド鎖内に、所望の配列で配置されたアミノ酸残基 の各々を含む中間化合物が通常製造される。 したがってそのような化学合成では、保護アミノ酸配列を有する中間体、例え ばｈＵｃｎの配列番号：１５（式ＩＩ）を基にした以下のものが形成される： （または適切にＮ−末端が短縮されたその変形体）。 ここで、Ｘ1は水素またはアルファ−アミノ保護基である。Ｘ1によって表され るアルファ−アミノ保護基は、１段階ずつのポリペプチド合成において当技術分 野で有用であることが知られているものである。Ｘ1に包含されるアルファ−ア ミノ保護基の種類には（１）アシル型保護基、例えばホルミル、アクリリル（Ａ ｃｒ）、ベンゾイル（Ｂｚ）およびアセチル（Ａｃ）で、これらは好ましくは Ｎ−末端でのみ用いられる；（２）芳香族ウレタン型保護基、例えばベンジルオ キシカルボニル（Ｚ）および置換Ｚ、例えばｐ−クロロベンジルオキシカルボニ ル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニ ル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル；（３）脂肪族ウレタン保護基、例 えばｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ジイソプロピルメトキシカルボニ ル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、アリルオキシカルボ ニル；（４）シクロアルキルウレタン型保護基、例えばフルオレニルメチルオキ シカルボニル（ＦＭＯＣ）、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオ キシカルボニルおよびシクロヘキシルオキシカルボニル；並びに（５）チオウレ タン型保護基、例えばフェニルチオカルボニル。アルファ−アミノ保護基の除去 に酸触媒が用いられる場合は、好ましいアルファ−アミノ保護基はＢＯＣである が、塩基触媒型除去手段を用いる合成ではＦＭＯＣが好ましい。この場合には、 より酸に不安定な側鎖保護基（ＢＯＣと同様ｔ−ブチルエステルまたはエーテル を含む）を用いることが可能である。 Ｘ2は、水素またはＴｈｒもしくはＳｅｒのヒドロキシル基のための保護基で 、好ましくはアセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ｔｅｒｔ−ブチル、トリ フェニルメチル（トリチル）、テトラヒドロピラニル、ベンジルエーテル（Ｂｚ ｌ）または２，６−ジクロロベンジル（ＤＣＢ）である。最も好ましい保護基は Ｂｚｌである。 Ｘ3は、水素またはＡｒｇのグアニジノ基のための保護基で、好ましくはニト ロ、ｐ−トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、Ｚ、アダマンチルオキシカルボニルお よびＢＯＣから選ばれる。ＴｏｓはＢＯＣを用いる場合に好ましく、さらに４− メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル（ＭＴＲ）またはペンタ メチルクロマン−６−スルホニル（ＰＭＣ）はＦＭＯＣを用いる場合に好ましい 。 Ｘ4は、水素またはＡｓｎもしくはＧｌｎの側鎖アミノ基のための保護基で、 好ましくはキサンチル（Ｘａｎ）である。ＡｓｎまたはＧｌｎは、好ましくはヒ ドロキシベンゾトリアゾル（ＨＯＢＴ）の存在下で側鎖保護基なしに共役される 。 Ｘ5は、水素またはＡｓｐもしくはＧｌｕのβまたはγ−カルボキシル基のた めのエステル形成保護基で、好ましくはシクロヘキシル（ＯＣｈｘ）、ベンジル （ＯＢｚｌ）、２，６−ジクロロベンジル、メチル、エチルおよびｔ−ブチルエ ステル（ｏｔ−Ｂｕ）である。ＣｈｘはＢＯＣ法の場合に好ましく、ｏｔ−Ｂｕ はＦＭＯＣ法の場合に好ましい。 Ｘ6は、水素またはＨｉｓの側鎖イミダゾル窒素の保護基、例えばＴｏｓであ る。 側鎖アミノ保護基の選択は、保護基が合成中にアルファ−アミノ基の脱保護時 に除去されない基である場合を除いて重要なことではない。したがって、アルフ ァ−アミノ保護基および側鎖アミノ保護基は同じではない。 Ｘ7はＮＨ2、保護基（例えばエステル）であるか、または固相合成で固体樹脂 支持体に合成されるペプチドを連結するために用いられるタイプの固定結合であ る。好ましくはこの固定結合は以下の式で表される： −ＮＨ−ベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）樹脂支持体、および −ＮＨ−パラメチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂支持体。 ＢＨＡまたはＭＢＨＡ樹脂から除去することによって、アミド付加形のＵｃｎ様 ペプチドが直接得られる。そのような樹脂のメチル誘導体を用いることによって 、所望の場合には対応する同等のメチル置換アミドを製造することができる。ま た別に当技術分野で周知のとおり、適切な樹脂支持体を用いて、これもまた同等 であると考えられるエチルアミドを製造することができる。 中間体の式においてＸ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6のうち少なくとも１つ は保護基である。これらペプチドの合成で用いられるべき特有の側鎖保護基の選 択では以下の規則に従う：（ａ）該保護基は試薬に対して安定でなければならず 、さらに個々の合成段階でアルファ−アミノ保護基を除去するためにその反応条 件の下で選択されなければならない、（ｂ）保護基はその保護特性を保持してい なければならず、共役条件下で分断されてはいけない、（ｃ）保護基は、ペプチ ド鎖に変化を与えない反応条件下で合成終了時に除去できなければならない。 Ｕｃｎ様作動薬ペプチドのＮ−末端のアシル基（これはＹで表される）には、 アセチル、ホルミル、アクリリルおよびベンゾイルが好ましい。さらにまた前記 で述べたように、当該末端の残基の除去またはＮ−末端の最初の２つのＮ−末端 残基の除去によって、Ｕｃｎ作動薬としての機能に対してその生物学的能力に顕 著な影響を与えることなくＮ−末端をわずかに短縮することができる。さらにそ のように短縮させる場合は、短縮Ｎ−末端の残基のアシル化を実施することが好 ましい。７から１１残基の配列の除去によるより広範囲のＮ−末端の短縮によっ て、以下に述べるようにレセプターを活性化させることなく強力にＣＲＦ−Ｒに 結合するＵｃｎ拮抗物質が製造される。 全般的に式Ｉによって規定されるペプチドまたはその類似体を製造する、以下 の工程を含む方法が提供される：（ａ）式ＩＩの中間体ペプチドまたはその類似 体を形成し、式中、各々が水素または保護基のいずれかであるＸ1、Ｘ2、Ｘ3、 Ｘ4、Ｘ5およびＸ6、並びに保護基または樹脂支持体もしくはＮＨ2に対する固定 結合のいずれかであるＸ7について少なくとも１つの保護基が存在し、さらに（ ｂ）該保護基または固定結合を式ＩＩの中間体ペプチドから切離し、さらに（ｃ ）所望の場合には、得られたペプチドをその無毒な塩に変換する。 本発明のペプチドが化学合成で製造される場合、それらは好ましくは例えばメ リフィールド（Merrifield，J．Am．Chem．Soc.，85:2149(1964)）が記載したよ うな固相合成を用いて調製されるが、当技術分野で既知の他の同等な化学合成も 先に述べたように用いることができる。したがって、Ｕｃｎ様ペプチドは直接的 な態様で製造され、続いて簡単に生物学的活性を検査することができる。このこ とは、ｈＵｃｎまたはｒＵｃｎの類似体であるＵｃｎ様ペプチドの容易な製造と 評価を促進する。固相合成は、好ましくは保護されたアルファ−アミノ酸を遊離 カルボキシル基と共役させて適切な樹脂に共役させることによって、ペプチドの Ｃ−末端から開始することができる（米国特許第4244946号(Rivierら、1981年１ 月21日発行))に一般的に記載）。Ｕｃｎの合成は、塩化メチレンおよびジメチル ホルムアミド（ＤＭＦ）を用いてアルファ−アミノ保護ＶａｌをＢＨＡ樹脂に共 役させることによって開始することができる。ＢＯＣ−Ｖａｌの樹脂支持体への 共役に続いて、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ＴＦＡ単独また はジオキサン中のＨＣｌとともに用いてこのアルファ−アミノ保護基を除去す ることができる。好ましくは、塩化メチレン中の５０容量％のＴＦＡを０−５重 量％の１，２エタンジチオールとともに用いる。脱保護は約０℃から室温の間の 温度で実施する。他の標準的な切断試薬および特定のアルファ−アミノ保護基の 除去条件は文献にしたがって用いることができる(Schroder & Lubke，“The Pep tides”，1:72-75(Academic Press刊、1965))。 Ｖａｌのアルファ−アミノ保護基の除去後、残存するアルファ−アミノ保護ア ミノ酸および側鎖保護アミノ酸を所望の順序で１段階ずつ共役させ、式ＩＩの中 間化合物を得る。合成時に各アミノ酸を別々に付加する代わりに、固相反応器に 付加する前にそれらのいくつかを互いに共役させてもよい。適切な共役試薬の選 択は当技術分野で知られている。共役試薬として特に適切なものは、Ｎ，Ｎ’− ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミ ド（ＤＩＣＩ）である。 本発明のペプチドの固相合成で用いられる活性化試薬はペプチド分野で周知で ある。適切な活性化試薬の例はカルボジイミド、例えばＮ，Ｎ’−ジイソプロピ ルカルボジイミドおよびＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カ ルボジイミドである。他の活性化試薬およびペプチド共役でのそれらの使用につ いては文献に記載されている（Schroder & Lubke，上掲書の第３章：Kapoor，J. Phar．Sci.，59:1-27(1970)）。ｐ−ニトロフェニルエステル（ＯＮｐ）もまた 共役のためにＡｓｎまたはＧｌｎのカルボキシル末端の活性化に用いることがで きる。例えば、ＢＯＣ−Ａｓｎ（ＯＮｐ）は、ＤＭＦおよび塩化メチレンの５０ ％混合物中で１価のＨＯＢｔを用いて一晩共役させることができるが、この場合 ＤＣＣＩは添加されない。 各保護アミノ酸またはアミノ酸配列は、約４倍過剰で固相反応器に導入され、 共役は、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）：ＣＨ2Ｃｌ2（１：１）の媒体中また はＤＭＦ中またはＣＨ2Ｃｌ2単独で実施される。共役を手動で実施する場合、合 成の各段階における共役反応の完成は、文献に記載されたようにニンヒドリン反 応によってモニターする(E．Kaiserら、Anal．Biochem，34:595(1970))。共役が 不完全な場合、次のアミノ酸を共役させる前にアルファ−アミノ保護基の除去に 先立ってこの共役工程を繰り返す。共役反応は、リビエーら(Rivierら、 Biopolymers，17:1927-1938(1978))が報告したようなプログラムを用いてベック マン９９０自動合成装置で自動的に実施してもよい。 所望のアミノ酸配列が完成した後、適切な切断試薬で処理してこの中間体ペプ チドを樹脂支持体から除去する。切断試薬は例えば液体フッ化水素で、これは該 ペプチドを樹脂から切断するだけでなく、全ての残存する側鎖保護基（Ｘ2、Ｘ3 、Ｘ4、Ｘ5およびＸ6）およびアルファ−アミノ保護基Ｘ1（それが、最終ペプチ ドに残存することを意図されたアシル基でない場合）を切断する。切断にフッ化 水素を用いる場合は、好ましくはアニゾールまたはクレゾールおよび硫化メチル エチルがスカベンジャーとして反応容器に加えられる。Ｎ−末端のＢＯＣ保護基 は、樹脂からペプチドを切断する前に好ましくはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／ エタンジチオールで切断される。 長さが約４０残基のＵｃｎ様ペプチドまたはそのフラグメントまたはその拮抗 物質型変形体のいずれが所望の薬理学的特性を有しているか否かの決定は、直接 的な態様で行われる。まず第一に、アッセイは、異なるＣＲＦレセプターについ て候補作動薬または拮抗物質のペプチドの作用を決定するために行われ、続いて 該ペプチドのＡＣＴＨ産生促進または抑制能力が決定される。ＣＲＦ−ＢＰ封鎖 物質として機能するフラグメントは、ｈＣＲＦ−ＢＰおよび既知の標識リガンド を用いる抑制結合アッセイにより同様にアッセイされる。 候補ペプチドは、ペリンら(M．Perrinら、Endocrinology，118:1171-1179(198 6))が記載したアッセイを用いて前述の種々のＣＲＦレセプターによる結合アッ セイで容易に評価できる。ヒトＣＲＦ−Ｒ１を用いる結合アッセイは、好ましく は放射性リガンドｏＣＲＦ類自体を用いて実施される。ＣＲＦ−Ｒ１レセプター を利用するそのような結合アッセイはチェンらが報告した(Chenら、P.N.A.S.，9 0(上掲書))。 ラットの腹側下垂体細胞の単層培養を用いる直接的アッセイは、その候補ペプ チドがＣＲＦ作動薬として機能し、そのような細胞でＣＲＦレセプターを活性化 させることによってＡＣＴＨ分泌を刺激するか否かを決定するために実施するこ とができる。使用される方法は上掲書(Endocrinology，91)に全般的に記載され ているものである。拮抗物質の特性を調べるためにはｏＣＲＦなどのチャレンジ 用量を用いて極めて類似のアッセイが使用される。 ヒトＣＲＦ結合蛋白に対して高い親和性を有し、したがってｈＣＲＦ−ＢＰと の結合について内在性ＣＲＦおよびＵｃｎと競合するペプチドの哺乳類へのイン ビボ投与によって、ＣＲＦ−ＢＰは効果的に封鎖される。これによって、利用可 能な内在性ＣＲＦおよびＵｃｎがより高濃度残存し、全身、特に該ペプチドが投 与され、および／またはＣＲＦ−ＢＰが存在する局所領域でそれらの通常の生物 学的機能を遂行することができる。 より具体的には、ＵｃｎのフラグメントまたはＵｃｎの類似体（長さが約１９ から２８残基）はｈＣＲＦ−ＢＰに対して非常に強い親和性を有するが、ＣＲＦ レセプターとの結合については一般に比較的低い傾向を示す。結果として、これ ら阻害フラグメントは、身体の特定領域から内在性ＣＲＦおよび／またはＵｃｎ の除去を防止し、それによってＣＲＦおよび／またはＵｃｎのインビボでの生物 学的作用を刺激するために投与することができる。いくつかの例では、ＣＲＦま たはＵｃｎまたはその作動薬とともに投与することは有益であろう。これらフラ グメントのほかならぬ特性は、潜在的に望ましくない免疫学的な副作用が最小限 になるか、または全面的に排除されるということである。それらはまた、拮抗物 質とともに投与して、ｈＣＲＦ−ＢＰに対して相応に高い結合親和性を有する拮 抗物質が標的領域から排除されるのを防止することができる。これらの阻害フラ グメントは、分娩促進、呼吸系の刺激、肥満の克服、アルツハイマー病および慢 性疲労症候群の影響を相殺するための治療措置として有用で、好ましくは脳に送 達されるような態様で投与される。 Ｕｃｎペプチドは、身体サンプル中に存在するＵｃｎレベルを検出する診断法 とともに、Ｕｃｎのエピトープと免疫反応を生じる抗体を調製する接種物におい て用いることができる。Ｕｃｎに対して作製した抗体は、診断、治療などに用い ることができる。そのような抗体は、抗原としてＵｃｎまたはそのフラグメント を用いて当業者に周知の標準的技術を用いて調製することができる。本発明の抗 体は典型的には、哺乳類（例えばウサギ、ヒツジ、ヤギなど）をＵｃｎまたはそ のフラグメントを含む接種物で免疫し、それによって該免疫誘導物質に対して、 免疫特異性を有する抗体分子の産生を誘導することによって製造される。 Ｕｃｎを認識する抗体は、完全な４０残基のアミノ酸配列または少なくとも約 ５残基もしくは好ましくは６残基の合成フラグメントのいずれかに対して作製さ れる。例えばそのような抗体は、Ｎ−末端の６残基またはＣ−末端の６残基また は内部配列（例えば残基１８−２３を囲む配列）に対して作製できる。そのよう な抗体はＵｃｎと結合し、したがってその存在を表示するために用いることがで き、それゆえにそのような抗体はアッセイに有用である。さらにまた、これらの 抗体のいくっかはＵｃｎと結合してそれを生物学的に不活化させる。さらにその ような抗体は、内在性Ｕｃｎを中和させるために動物に投与することができる。 Ｕｃｎと結合するような内在性抗体が産生される事例では、Ｕｃｎ由来の短いア ミノ酸配列を抗体阻害剤として投与することができる。そのような封鎖抗体を作 製するために、完全な４０残基配列を用いるか、または特定の関心がもたれる領 域を構成する短いペプチド配列を合成することができる。そのような合成単鎖ペ プチドは、一般に大きな担体分子に結合させ、続いてこの結合物をウサギまたは ヒツジなどの哺乳類の免疫系を誘導する接種物として用いる。そのような多クロ ーン性抗体の製造についての詳細は、米国特許第4864019号(9/5/89)で詳述され ている。多クローン性抗体に代わって単クローン性抗体を作製することを所望す る場合は、当技術分野で既に確立されたハイブリドーマ技術を用いて同様な接種 物を使用して直接的な態様で作製することができる。代表的な単クローン性抗体 産生についての詳細は米国特許第5032521号(7/16/91)および米国特許第5051364 号(9/24/91)で詳述されている。 そのようにして産生された抗体は、ヒトまたは他の哺乳類の身体サンプル（例 えば組織または体液）中に存在するＵｃｎレベルを検出する診断方法および系で 用いることができる。抗Ｕｃｎ抗体はまた、その詳細が当技術分野でよく知られ ているＵｃｎの免疫親和性精製またはアフィニティークロマトグラフィー精製に 用いることができる。さらに、抗Ｕｃｎ抗体はヒトの治療手段に用いることがで きる。さらに、そのような抗体をコードするＤＮＡは遺伝子治療手段を介して注 射し、患者の体内で所望の抗体を産生させるか、また別に適切な条件では抗体封 鎖物質を提供することができる。 ラットおよびヒトにおける４１残基ＣＲＦの生物学的メッセンジャーのアミノ 酸配列（これらの配列は同一である）に関して進化的逸脱がないということは、 哺乳類の種、例えばヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネズミ、イヌ、ネコ、ヒ ヒ、サル、ウサギなどにおけるＵｃｎの対応するアミノ酸配列において保存領域 の蓋然性を相応に示唆する。その帰結するところは、哺乳類の１つの種のＵｃｎ の核酸配列、すなわち本明細書で開示するラットの配列の重要な部分をいったん 入手すれば、同族体をコードする他の動物種の天然に生じる種々の同種の核酸配 列を入手するための練習となる。同族体は、例えばＣＲＦ結合蛋白（Potterら、 Nature，349:423-426(1991)を参照のこと）で、この文献では、ヒトの血清由来 ＣＲＦ結合蛋白のｃＤＮＡコード領域は、ラットｃＤＮＡのコード領域を特定す ることができるほど後者と充分な相同性を有していた。最初に開示された核酸配 列（配列番号：９）は天然のラット種のもので、Ｕｃｎペプチドを発現する発現 ベクターとして有用であることに加えて、それはまた、対応するそれぞれのＵｃ ｎペプチドをコードする哺乳類の他の種のＤＮＡを得るためにも有用である。こ のような点から、当技術分野で現在周知のように対応する哺乳類の配列を得るた めに、完全な核酸配列または長さが少なくとも約１４ヌクレオチドの核酸配列の いずれかをハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。同様に 、適切なＤＮＡ源を用いて哺乳類の他の種の核酸配列を増幅させるために、前述 の核酸配列を基にしたプライマーをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）技術で用い ることができる。 本明細書で用いるように、核酸“プローブ”は、配列番号：９で示した１４ま たはそれ以上の連続した塩基のいずれかと同じ（または相補的）である、少なく とも１４、好ましくは少なくとも２０またはそれ以上の連続した塩基のヌクレオ チド配列を有する一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであろう。 Ｕｃｎまたはそのフラグメントをコードする標識核酸は、Ｕｃｎ類に属する他 の新規な哺乳類の配列をコードする別の新たなヌクレオチド配列についてｃＤＮ Ａライブラリー、ゲノムライブラリーなどをプローブで探索するために用いるこ とができる。そのようなスクリーニングは、先ず最初にストリンジェントな（高 い配列相同性を必要とする）条件下で実施することができる。この条件は、温度 が約４２．５℃、ホルムアミド濃度が約２０％、および塩濃度が約５×ＳＳＣ( standard saline citrate)である。２０×ＳＳＣは３Ｍ塩化ナトリウム、０．３ Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）を含む。そのような条件は、完全な相同性 を要求せずに、プローブ配列と実質的な類似性を有する配列の特定を可能にする であろう。“実質的な類似性”とは、少なくとも約５０％の相同性を共有するヌ クレオチド配列を意味する。プローブと少なくとも７０％の相同性を有する配列 のみを特定し、一方、プローブとより低い相同性を有する配列を区別するハイブ リダイゼーション条件を選択することが望ましいであろう。そのような条件は、 当分野で周知のように上記の条件を越えるように、使用するストリンジェンシー の度合いを高めることによって達成される。 例えば、当業者に周知の確立された方法で（「分子クローニング：実験室マニ ュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」、Sambrookら、第２版、(19 89)、第８章：ｃＤＮＡライブラリーの構築と分析(Construction and Analysis of cDNA Libraries)）、完全な配列番号：９または長さが少なくとも約１４もし くは１７もしくは２０ヌクレオチドであるその部分を哺乳類のゲノムライブラリ ーまたはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いて、ヒトおよび哺乳類の 他の種からＵｃｎをコードする同種の核酸を特定し分離することができる。約１ ４または１７または２０ヌクレオチドまたはそれより長いヌクレオチドをもつオ リゴヌクレオチド配列は慣用的なインビトロ合成技術によって調製できる。プロ ーブとしてそのようなオリゴヌクレオチドを用いるスクリーニングは、Sambrook ら（上掲書、第１１章、pp.11.45-11.57）が規定したように好ましくは高ストリ ンジェンシー条件下実施される。 上記で示したように、哺乳類の１つの種の特定のペプチドホルモンをコードす る天然のＤＮＡ配列を所有することは、他の哺乳類の種の同種のＤＮＡ配列を入 手することを可能にする。他の種のＵｃｎペプチドをコードするヌクレオチド配 列の分離には、しばしばゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー（Ｕｃ ｎを含む組織から分離したＲＮＡから作製される）のいずれかの利用を必要とす る。そのような分離源が利用可能である場合は、イントロン／エクソンの境界を 決定しようとするときに生じるおそれがある一切の問題を避けるために、Ｕｃｎ をコードするヌクレオチド配列の分離のためにｃＤＮＡを作製することが一般に 好ましい。ライブラリーは、真核または原核宿主細胞で作製することができる。 広く利用可能なクローニングベクター（例えばプラスミド、コスミド、ファージ など）を用いて、Ｕｃｎペプチドをコードするヌクレオチド配列の分離に適切な 遺伝学的ライブラリーを作製することができる。 既知ヌクレオチド配列の配列を基にしたプローブを用いる、標的ヌクレオチド 配列の存在について遺伝学的ライブラリーをスクリーニングする方法は上掲書（ Sambrookら、第１１章）に詳細に記載されている。現在の状況では、そのような 遺伝学的ライブラリーをスクリーニングするプローブとして、放射性核種、酵素 、ビオチン、蛍光などで標識した完全な長さのラットヌクレオチド配列、配列番 号：９を用いることが好ましいであろう。 ハイブリダイゼーションは、染色体ＤＮＡで天然に存在する結合と同様な水素 結合を介する核酸の相補鎖の相互結合（すなわち、センス：アンチセンス鎖また はプローブ：標的ＤＮＡ）をいう。当業者は、あるプローブと標的核酸とをハイ ブリダイズさせるために用いられるストリンジェンシーレベルを容易に変動させ ることができる。本明細書で用いるように、“高ストリンジェンシー”という語 句は、標的核酸に対して少なくとも約８０％相同性を有する相補的核酸に該標的 核酸を結合させることができる条件をいう。そのようなストリンジェンシー条件 の例は、５０％ホルムアミド、５×デンハルト氏液、５×ＳＳＰＥ、０．２％Ｓ ＤＳ（４２℃）中でのハイブリダイゼーションとそれに続く０．２×ＳＳＰＥ、 ０．２％のＳＤＳ（６５℃）中での洗浄に最小限で匹敵する条件である。デンハ ルト氏溶液は「分子クローニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Lab oratory Manual)」（Sambrookら、（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Pre ss刊）で推奨され、当業者には周知である。使用できる他の適切なハイブリダイ ゼーション緩衝液も存在する。標的ＤＮＡに対して約９０％以上の相同性を要求 するストリンジェンシー条件を用いることが好ましいであろう。 例として、Ｕｃｎのヒト型はヒト胎盤ゲノムライブラリーからクローニングす ることができた。ＥＭＢＬ３ＳＰ６／Ｔ７ベクター（Clontech）中のヒト胎盤ゲ ノムライブラリーから約０．６×１０6のファージプラークを、ラットＵｃｎの 成熟ペプチド領域に対応するプローブを用いてハイブリダイゼーションによって スクリーニングした。ラットＵｃｎの成熟ペプチドをコードする１６０ｂｐのプ ローブを以下のオリゴを用いてＰＣＲで合成した：センス：５’−ＴＧＣＡＧＧ ＣＧＡＧＣＧＧＣＡＡＣＧＡＣＧＡＧＡＣＧＡ−３’およびアンチセンス：５’ −ＡＴＡＣＧＧＧＧＣＣＧＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＣＡＣＣＧＡＧ−３’および〔 α32Ｐ−ｄＣＴＰ〕。ハイブリダイゼーションは２０％ホルムアミドを含む標準 緩衝液で４２℃で実施した。最終洗浄は、４２℃で２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ 中で実施した。クローンのために個々の陽性プラークから得たファージＤＮＡを 精製し、続いてpBluescript(Strategene)でサブクローニングした。ジデオキシ 配列決定法をシークェナーゼキット（US Biochemical）を用いて実施した。 ヒトＵｃｎの遺伝子を含むライブラリーから分離したゲノムクローンは約１５ ｋｂの挿入サイズを有する。ヒトＵｃｎの前駆体および成熟ペプチド領域に対応 する領域で挿入塩基対の多くの配列が決定された（配列番号：１６参照）。成熟 ラットＵｃｎペプチドと比較しながら最初に配列決定された成熟ヒトＵｃｎペプ チドをコードする部分的ヌクレオチド配列は、前述の表２Ａに示されている。成 熟ヒトＵｃｎペプチドのヌクレオチド配列は、ラットＵｃｎペプチドのヌクレオ チド配列と８８％類似性を有する。この領域によってコードされたアミノ酸配列 はヒトＵｃｎとラットＵｃｎとの間で９５％類似性を示す。成熟ヒトペプチド（ 配列番号：１５の残基８３−１２２を参照）は１２４残基の全体の４０残基であ る。 現在の状況で用いることができる別の適切な技術は、ラットＵｃｎ核酸から得 た配列を基にしたプライマーの使用と標的核酸増幅のためのポリメラーゼ連鎖反 応（ＰＣＲ）の使用を必要とする。続いてこの標的を、増幅セグメントを基にし た固有のハイブリダイゼーションプローブを用いて分離することができる。さら に標的をその全体配列およびそれによってコードされるポリペプチドについて分 析する。 組換えＤＮＡによって本発明のペプチドを合成するために、所望のペプチドを コードする二本鎖ＤＮＡを合成によって構築することができる。ＰＣＲ技術は今 日ＤＮＡ配列を製造するために最良の方法であるかもしれないが、例えば配列番 号：９（ＵｃｎをコードするＤＮＡ）は、あるタイプの生物でポリペプチドを発 現させるために特に有効ないくつかのコドンを用いてデザインすることができる 。すなわち、そのタイプの生物（組換えベクターの宿主として機能する）での発 現に極めて効果的なコドンが選択で用いられるであろう。しかしながら、おそら くはわずかに効率は低いが、正しいコドンセットのいずれも所望の生成物をコー ドするであろう。コドンの選択はまたベクター構築を考えることによっても左右 されるであろう。例えば、コード配列の挿入に続いて該ベクターが特定の制限部 位を切断する制限酵素を用いて製作される場合は、該コード配列内にそのような 制限部位を配置することは避けなければならないであろう。該組換えベクターで 形質転換される宿主生物が、該ＤＮＡ鎖内のそのような制限部位で切断を行なう 制限酵素を産生することが知られている場合、該ＤＮＡコード配列内にそのよう な部位を配置することはもちろん当業者は避けるであろう。 Ｕｃｎおよびその類似体をコードする分離ヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ による方法またはインビトロポリペプチド合成技術のいずれかによって精製Ｕｃ ｎを製造するために用いることができる。“分離（された）”という用語は、人 力で製造され、その天然（インビボ）の細胞環境から離され、同じタイプの他の 生物学的分子が実質的に存在しない状態で存在するヌクレオチド配列またはポリ ペプチド配列を指す。この人間の介入の結果として、本発明の組換え体、分離お よび／または実質的に純粋なＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドおよび蛋白質は大量 に製造され、さらにこれらは、当該ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチドまたは蛋白質 が天然に存在するときには有用でないような態様、例えば優れた薬剤または化合 物の特定に役立つ。合成された非染色体性核酸配列を結合させるために、慣用的 な方法（例えばSambrookらの上掲書に記載されたような方法）でオリゴヌクレオ チドは構築される。約７０ヌクレオチド残基までの長さのセンスおよびアンチセ ンスオリゴヌクレオチド鎖を、好ましくは当技術分野で周知の自動合成装置で合 成する。センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが相補的な塩基対を介し て水素結合によって互いに結合し、それによって二本鎖を形成して（ほとんどの 場合鎖内にギャップを含む）これらオリゴヌクレオチドの部分がオーバーラップ するように、オリゴヌクレオチド鎖を構築する。続いて、鎖内のこのギャップを 充填し、さらに適切なＤＮＡポリメラーゼの存在下でおよび／またはリガーゼと ともにヌクレオチド三燐酸を用いて各鎖のオリゴヌクレオチドを末端と末端で連 結させる。そのような合成核酸配列の１段階ずつの構築に代わるものとして、ラ イブラリーをスクリーニングすることによって得られる完全な構造の天然ポリペ プチドをコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡが用いられる。前記で示したように、 好ましくは増幅はＰＣＲを用いることによって実施され、続いて分離され精製さ れたＤＮＡを組換え分子に取り込ませる。 ベクターに挿入されるべき配列をコードする所望の核酸は、好ましくはその末 端にリンカーを有し、該クローニングベクター内の制限部位への挿入を促進させ る。場合によって、核酸のコード配列は、融合ポリペプチドの一部分として所望 のペプチドをコードするように構築してもよい。そのような場合には、このコー ド配列は、一般に蛋白分解処理部位として機能するアミノ酸残基配列をコードす る末端配列を含むであろう。この末端配列によって、該コードされたポリペプチ ドは融合ポリペプチドの残余部分から蛋白分解によって切断される。核酸のコー ド配列の末端部分はまた、適切な開始および終止シグナルを含むことができる。 核酸のコード配列をベクターに機能的に挿入した後、続いて所望のペプチドを 組換え技術によって発現させる。“機能的に挿入”とは、当業者にはよく理解さ れているとおり適切な読み枠と方向性にあることを意味する。例えば、完全なＵ ｃｎの読み枠を含む遺伝学的構築物を作製する場合、好ましい出発物質は、ゲノ ムライブラリー分離物よりむしろＵｃｎをコードするｃＤＮＡライブラリー分離 物である。典型的には、Ｕｃｎコード配列はプロモーターから下流側に挿入され 、終止コドンが後に続くであろう。ただし所望の場合には、後で切断が行なわれ るハイブリッド蛋白のような製造も用いることができる。一般に、Ｕｃｎの産生 収量を改善する宿主−細胞固有配列が用いられ、適切な制御配列、例えばエンハ ンサー配列、ポリアデニル化配列、およびリボソーム結合部位が発現ベクターに 付加される。 Ｕｃｎの製造は原核細胞および真核細胞の両方で実施可能で、生物学的、治療 的用途のための蛋白質が提供される。Ｕｃｎ合成は細菌細胞または酵母細胞株の いずれかを用いて容易に行なわれるが、一方、この合成遺伝子はまた高等動物細 胞で発現させるために挿入することができる。上掲書（Sambrookら）に詳細に記 載されているとおり、高等細胞は、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ ）細胞または哺乳類の腫瘍細胞である。いくつかの哺乳類細胞は、例えば宿主動 物で腹腔腫瘍として増殖させることができ、Ｕｃｎは腹腔液から採集できる。哺 乳類発現系、バキュロウイルス発現系、細菌発現系および酵母発現系に関する記 載は米国特許第5212074号(5/18/93)に示されている。 以下の実施例は、固相鎖伸長法によってＵｃｎ、Ｕｃｎ類似体、Ｕｃｎフラグ メントおよびＵｃｎ拮抗物質を合成する好ましい化学的方法を詳述する。 実施例Ｉ を有するラットＵｃｎの合成を、約０．１から０．５mmol/g樹脂の置換値を有す るＭＢＨＡ塩酸塩樹脂（例えばBachem，Inc.,より入手可能）上で実施する。合 成は、ベックマン９９０Ｂ自動ペプチド合成装置で例えば以下のような適切なプ ログラムを用いて実施される。 ＢＯＣ−Ｖａｌの共役は、樹脂１ｇにつき約０．３５mmolのＶａｌの置換を生じ る。全ての使用溶媒は、好ましくは不活性ガス（例えばヘリウムまたは窒素）を 散布することによって注意深く脱気し、酸素が存在しないことを確認する。 脱保護および中和の後、ペプチド鎖を樹脂上で１段階ずつ構築する。一般に、 塩化メチレン中のＢＯＣ保護アミノ酸の１から２mmolを樹脂１ｇにっき使用し、 塩化メチレン中の２モルのＤＣＣＩを１当量加え、各付加残基の共役を２時間実 施する。ＢＯＣ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）が共役される場合、５０％ＤＭＦおよび塩化 メチレンの混合物が用いられる。Ｂｚｌは、ＳｅｒおよびＴｈｒのためのヒドロ キシル側鎖保護基として用いられる。ＡｓｎまたはＧｌｎのアミド基はＸａｎで 保護することができるが、必ずしもそうである必要はない。ＢＯＣ−Ａｓｎまた はＢＯＣ−Ｇｌｎは、ＤＭＦと塩化メチレンの５０％混合物中でＤＣＣの１当量 およびＨＯＢｔの２当量を用いて一晩共役される。Ｔｏｓは、Ａｒｇのグアニジ ノ基をさらにＨｉｓのイミダゾル窒素を保護するために用いられる。Ｇｌｕまた はＡｓｐの側鎖カルボキシル基はＯＣｈｘによって保護される。合成の終了時に 以下の組成物が得られる： 生じたペプチドを切断し脱保護するために、ペプチド−樹脂１ｇにつき１．５ ｍｌのアニゾール、０．５ｍｌの硫化メチルエチルおよび１５ｍｌのフッ化水素 （ＨＦ）で、最初−２０℃で２０分、続いて０℃で１時間３０分該ペプチド−樹 脂を処理する。強い真空下でＨＦを除去した後、樹脂−ペプチドを乾燥ジエチル エーテルで洗浄し、さらにこのペプチドアミドを脱気した２Ｎの酢酸水またはア セトニトリルと水の１：１混合物で抽出する。抽出物を濾過によって樹脂から分 離し、その後凍結乾燥させる。 文献の記載にしたがってこの凍結乾燥ペプチドアミドを調製用または半調製用 ＨＰＬＣで精製する(Rivierら、J．Chromatography，288:303-328(1984);Hoeger ら、Biochromatography，2(3):134-142(1987))。クロマトグラフィーの分画をＨ ＰＬＣで注意深くモニターし、実質的に純粋であることが示された分画のみをプ ールする。 分離精製Ｕｃｎペプチドの固有の旋光度をパーキンエルマーモデル２４１旋光 計で〔α〕D＝−６２．５°±１．０として測定する（Ｈ2ＯおよびＴＦＡの存在 のための補正なしで１％酢酸中でｃ＝１）。それは約９５％よりも高い純度を有 する。純度はさらに質量分光分析および毛細管ゾーン電気泳動（ＣＺＥ）で確認 する。液体二次イオン質量分析（ＬＳＩＭＳ）の質量スペクトルは、Ｃｓ+ガン を装備したＪＥＯＬモデルＪＭＳ−ＨＸ１１０二重焦点質量分光計で測定する。 １０ｋＶの加速電圧および２５から３０ｋＶのＣｓ+ガン電圧を用いる。ＬＳＩ ＭＳを用いて得られた４７０５．３６Ｄａの測定値は４７０５．５２Ｄａの計算 値と一致する。 正確な配列を実証するために、Ｕｃｎペプチドを常時沸騰させたＨＣｌ、３μ ｌのチオグリコール／ｍｌおよび１nmolのＮｌｅ（内部標準物質として）を含む 封入真空チューブで１４０℃で９時間加水分解する。標準的アミノ酸分析装置を 用いた加水分解産物のアミノ酸分析は予想されたアミノ酸比を示し、目的とする 配列を構成する想定アミノ酸配列を有する４０残基のペプチド構造体が得られる ことが確認される。 アッセイ（結合アッセイなどを含む）で使用する標識Ｕｃｎペプチドを提供す るために、合成を延長しＮ−末端でＴｙｒとＡｓｐを連結し〔Ｔｙｒ0〕−Ｕｃ ｎと称する４１残基ペプチドを生成する。これは容易に125Ｉでヨード付加し、 続いて診断アッセイおよび薬剤スクリーニングアッセイで用いることができる。 精製ＵｃｎまたはＣＲＦ作動薬として機能し、さらにＡＣＴＨ産生および／ま たは分泌を促進する別のＵｃｎ様候補ペプチドの能力をテストするために、文献 （Valeら、Meth．Enzym.，103:565-577(1983);Endocrinology，91:562(1972)） に一般的に記載されたとおり分散させたネズミ腹側下垂体細胞の初代培養(０． １５×１０6細胞／培養穴(ウェル))を使用する。これらの培養を２％ウシ胎児血 清を含むβ−ＰＪ（Kansa City Biochemicalsより入手可能な試薬、０／５ｍ ｌ／ウェル）で維持する。培養５日目の朝に、０．１％のウシ血清アルブミン含 有β−ＰＪで細胞を３回洗浄し、続いて同じ培養液で３７℃で１時間保温する。 続いてこの培養液をＵｃｎまたはその類似体（０．１％ウシ血清アルブミン含有 β−ＰＪで希釈）と交換する。保温は３時間後に終了させ、この時培養液を取り 出し、ＡＣＴＨの放射性免疫アッセイまで−２０℃で保存する。放射性免疫アッ セイは、適切なキット（例えばDiagnostlic Products Corporation(ロサンゼル ス、カリフォルニア)から市販されているようなもの）を用いて実施される。分 泌ＡＣＴＨは、Allfitコンピュータプログラムを用いて測定し、結果は同一検体 の３回繰り返しバイオアッセイの平均±標準偏差として表される。 ｒＵｃｎペプチドは、培養ゲッ歯類下垂体細胞でＡＣＴＨおよびβエンドルフ ィンの分泌を強く刺激する。ｒＵｃｎは、ｒ／ｈＣＲＦまたはソーバジンよりも 強い生物学的能力を有し、それぞれ約０．０４３±０．０１２ｎＭおよび約０． ０３３±０．０１０ｎＭのＥＣ50と比較して約０．００６±０．００３ｎＭのＥ Ｃ50を有する。ｒＵｃｎはまたｏＣＲＦよりも強い能力を有する。さらに、それ はまた、ＥＣ50が０．０１７±０．００３のサッカーフィッシュＵＩ（ｓｆＵＩ ）より強力である。ｒＵｃｎはまた、ラットでＡＣＴＨおよびβエンドルフィン のインビボ分泌をｒ／ｈＣＲＦよりも強く刺激する。実際、文献（Science，218 :377(1982)）に記載されたアッセイを用いた場合１μｇ／ｋｇ投与量のｒＵｃｎ は血漿ＡＣＴＨレベルを５μｇ／ｋｇ投与量のｒ／ｈＣＲＦ（４２２±６６ｐｇ ／ｍｌ）よりも実質的に強く（６５９±５３ｐｇ／ｍｌ）上昇させる。そのよう なより強い効果は１時間および２時間持続する。末梢的（例えば静脈内）に投与 した場合このペプチドはまた、２５０ｎｇの用量で標準的研究用ラット（約２５ ０から２７５ｇ）の平均動脈血圧の顕著な下降をもたらす。約３．７７μｇ／ｋ ｇの用量で、ｒＵｃｎは、血圧をｓｆＵＩまたはｒ／ｈＣＲＦの２−３倍、さら により長時間低下させる。 さらにまた、ネズミＣＲＦ−Ｒ１を発現する細胞およびネズミＣＲＦ−Ｒ２β を発現する細胞の細胞内ｃＡＭＰレベルの上昇をもたらすＵｃｎの能力について 、チエンら（Chenら、Expression Cloning of a Human Corticotropin Releasin g Factor（CRF）Receptor(ヒトコルチコトロピン遊離因子(CRF)レセプターの発 現クローニング)、P.N.A.S.，90:8967-8971(1993)）が一般的に記載したアッセ ィを用いて調べた。ｒＵｃｎは、ｍＣＲＦ−Ｒ１を発現している細胞でｃＡＭＰ レベルを上昇させることにおいてｒ／ｈＣＲＦまたはｓｆＵＩよりもわずかに強 力である。しかしながら、その作用はｍＣＲＦ＝Ｒ２βを発現する細胞を利用す るアッセイではもっと劇的である。このアッセイでは、ｒＵｃｎのＥＤ50は、ｒ ／ｈＣＲＦのＥＤ50の１．７±０．４ｎＭおよびウロテンシンのＥＤ50の０．７ ４±０．１ｎＭに対して０．１８±０．０４ｎＭである。ｒＵｃｎはまた、０． ５±０．２ｎＭのＥＤ50を示すソーバジンよりも強力である。 ヒトＣＲＦ−Ｒ１を発現している細胞を用いる結合アッセイを上掲書（Chenら 、P.N.A.S.）の記載にしたがって実施する。ＣＨＯ細胞で安定的に発現されるＣ ＲＦ−Ｒ１およびＣＲＦ−Ｒ２βに対する被験ペプチドの親和性は、記載された ように、125Ｉ−（Ｎｌｅ21、Ｔｙｒ32）ヒツジＣＲＦ（ＣＲＦ−Ｒ１のため） または〔125Ｉ−Ｔｙｒ0〕Ｕｃｎ（ＣＲＦ−Ｒ２βのため）の競合的置換によっ て決定した。少なくとも３回の実験から得たデータを合わせ、抑制解離定数（Ｋi ）値（９５％信頼限界）をマンソンとロッドバード(Munson & Rodbard，Anal． Biochem.，107:220-239(1980))のＬＩＧＡＮＤプログラムを用いて算出した。ク ローニングしたｈＣＲＦ−Ｒｌは、結合放射性リガンドの競合的置換によって測 定した場合高い親和性でＵｃｎと結合する。ｒＵｃｎのＫiは、ｒ／ｈＣＲＦの 約０．９５（０．４７−２．０）ｎＭ、ｓｆＵＩの約０．４３（０．２３−０． １８）ｎＭおよびソーバジンの約１．２（０．５４−２．５）と比較したとき、 約０．１６（０．０８−０．３２）ｎＭであることが分かった。さらにまた、ヒ トＣＲＦ−Ｒ２βを発現している安定に核酸感染させた同様なＣＨＯ細胞ではこ の違いはもっと劇的である。この場合それぞれの結果は、０．４１（０．２６− ０．６６）ｎＭ、１７（１０−２９）ｎＭ、３．０（１．８−４．８）ｎＭおよ び２．０（１．１−３．６）ｎＭであった。試験結果はまた、放射性125Ｉ〔Ｎ ｌｅ21、Ｔｙｒ32〕−ｏＣＲＦによる競合的ｈＣＲＦ−ＢＰリガンド結合アッセ イを用いた場合、ｒＵｃｎは、ｒ／ｈＣＲＦよりももっと強く約２の係数でヒト ＣＲＦ結合蛋白（ｈＣＲＦ−ＢＰ）と結合し、またソーバジンよりもさらに強く 、ｓｆＵＩよりは弱く結合することを示した。実施例ＩＡ の式（配列番号：１５参照）をもつヒトＵｃｎ（１−４０）を実施例Ｉで述べた 態様で合成する。ＬＳＩＭＳは４６９４．３１Ｄａという値を示し、これは計算 値４６９４．５１Ｄａと一致する。実施例Ｉで説明した腹側下垂体細胞培養を用 いたＡＣＴＨ分泌についてのインビトロ試験は、このペプチドがｒ／ｈＣＲＦよ り約３倍有効(すなわち３．１０(１．４１−６．６５))であることを示した。こ のペプチドはまた、全身的血圧低下およびＡＣＴＨ分泌刺激を含む哺乳類の顕著 な血管拡張−血圧低下活性を有する。 実施例ＩＢ のアミノ酸配列（配列番号：８参照）を有するペプチド〔Ｔｙｒ0〕ｒＵｃｎ（ １−４０）を実施例Ｉで述べた態様で合成する。 ＬＳＩＭＳは４８６８．５８Ｄａという値を示し、これは計算値４６６８．５８ Ｄａと完全に一致する。実施例Ｉで説明した腹側下垂体細胞培養を用いたＡＣＴ Ｈ分泌についてのインビトロ試験は、このペプチドはｒ／ｈＣＲＦより約２倍有 効(すなわち２．２０(１．２８−３．８８))であることを示した。このペプチド はまた、全身的血圧低下およびＡＣＴＨ分泌刺激を含む哺乳類の顕著な血管拡張 −血圧低下活性を有する。 実施例ＩＣ の式を有するペプチド〔Ｄ−Ｔｙｒ0〕ｈＵｃｎ（１−４０）を実施例Ｉで述べ た態様で合成する。ＬＳＩＭＳは４８５７．３７Ｄａという値を示し、これは計 算値４８５７．５８Ｄａと一致する。実施例Ｉで説明した腹側下垂体細胞培養を 用いたＡＣＴＨ分泌についてのインビトロ試験は、このペプチドはｒ／ｈＣＲＦ より約１．２５倍有効(すなわち１．２３(０ ６０−２．５４))であることを示した。このペプチドはまた、全身的血圧低下お よびＡＣＴＨ分泌刺激を含む哺乳類の顕著な血管拡張−血圧低下活性を有する。 実施例ＩＩ のアミノ酸配列（配列番号：１５参照）を有するペプチド〔Ａｃ−Ｐｒｏ3〕− ｈＵｃｎ（３−４０）を実施例Ｉで述べた態様で合成するが、ただしＮ−末端は 、ＢＯＣ保護基を除去した後無水酢酸で処理してアセチル化を施す。得られたペ プチドは同様にＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、全身的血圧低 下を含む血管拡張−血圧低下活性を惹起する。 実施例ＩＩＡ のアミノ酸配列を有するペプチド（シクロ２９−３０）〔Ａｃ−Ｐｒｏ3、Ｄ− Ｐｈｅ11、Ｇｌｕ29、Ｄ−Ｇｌｕ31、Ｌｙｓ32〕−ｈＵｃｎ（３−４０）を実施 例Ｉで一般的に述べた態様で合成するが、ただしＮ−末端は、ＢＯＣ保護基を除 去した後無水酢酸で処理してアセチル化を施す。環状ラクタム結合は米国特許第 5064939号の実施例Ｉに記載されたように形成される。 ＬＳＩＭＳは４５６２．３６Ｄａという値を示し、これは計算値４４６２．４２ Ｄａと一致する。実施例Ｉで説明した腹側下垂体細胞培養を用いたＡＣＴＨ分泌 についてのインビトロ試験は、このペプチドはｒ／ｈＣＲＦより約６倍有効(す なわち６．１４(２．８３−１４．０５))であることを示した。得られたペプチ ドは同様にＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、全身的血圧低下を 含む血管拡張−血圧低下活性を惹起する。 実施例ＩＩＢ のアミノ酸配列を有するペプチド（シクロ２９−３０ ）〔Ａｃ−Ｐｒｏ3、Ｄ−Ｐｒｏ4、Ｄ−Ｐｈｅ11、Ｇｌｕ29、Ｌｙｓ32〕−ｈＵ ｃｎ（３−４０）を実施例Ｉで一般的に述べた態様で合成するが、ただしＮ−末 端は、ＢＯＣ保護基を除去した後、無水酢酸で処理してアセチル化を施す。環状 ラクタム結合は米国特許第5064939号の実施例Ｉに記載されているように形成さ れる。ＬＳＩＭＳは４４７２．４０Ｄａという値を示し、これは計算値４４７２ ．４４Ｄａと一致する。実施例Ｉで説明した腹側下垂体細胞培養を用いたＡＣＴ Ｈ分泌についてのインビトロ試験は、このペプチドはｒ／ｈＣＲＦより約１０倍 有効(すなわち９．９０(４．４８−２２．８５))であることを示した。得られた ペプチドは同様にＡＣＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、全身的血圧 低下を含む血管拡張−血圧低下活性を惹起する。 実施例ＩＩＣ のアミノ酸配列を有するペプチド（シクロ２９−３０）〔Ａｃ−Ｐｒｏ3、Ｄ− Ｓｅｒ4、Ｄ−Ｐｈｅ11、Ｇｌｕ29、Ｌｙｓ32〕−ｈＵｃｎ（３−４０）を実施 例Ｉで一般的に述べた態様で合成するが、ただしＮ−末端は、ＢＯＣ保護基を除 去した後無水酢酸で処理してアセチル化を施す。環状ラクタム結合は米国特許第 5064939号の実施例Ｉに記載されたように形成される。ＬＳＩＭＳは４４６２． ３３Ｄａという値を示し、これは計算値４４６２．４２Ｄａと一致する。実施例 Ｉで説明した腹側下垂体細胞培養を用いたＡＣＴＨ分泌についてのインビトロ試 験は、このペプチドはｒ／ｈＣＲＦより約５．７５倍有効(すなわち５．６９(２ ．４３−１４．４９))であることを示した。得られたペプチドは同様にＡＣＴＨ およびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を刺激し、全身的血圧低下を含む血管拡張−血圧 低下活性を惹起する。 実施例ＩＩＩ のアミノ酸配列（配列番号：１５参照）を有するペプチドｈＵｃｎ（２−４０） を実施例Ｉで述べた態様で合成する。このペプチドは、全 身的血圧低下およびＡＣＴＨの分泌刺激を含む哺乳類の顕著な血管拡張−血圧低 下活性を有する。 実施例ＩＶ のアミノ酸配列を有するペプチド〔Ｄ−Ｐｈｅ11〕−ｈＵｃｎを実施例Ｉで述べ た態様で合成する。このペプチドは、全身的血圧低下およびＡＣＴＨの分泌刺激 を含む哺乳類の顕著な血管拡張−血圧低下活性を有する。 実施例Ｖ 以下で説明するｈＵｃｎのペプチド作動薬類似体（これらはｈＵｃｎと実質的 に同じアミノ酸配列を有すると考えられる）を合成する。 前述のＵｃｎ様ペプチド作動薬の各々は、全身的血圧低下およびＡＣＴＨの分 泌刺激を含む哺乳類の顕著な血管拡張−血圧低下活性を有する。 実施例ＶＩ 以下のアミノ酸配列内に分類されるＵｃｎ様ペプチド作動薬のまた別の群を合 成する： 式中、Ｙは７もしくそれ未満の炭素原子をもつアシル基であるかまたは水素で ；Ｒ19はＧｌｕまたはＡｌａで；Ｒ29はＡｒｇ、ＧｌＵ、ＬｙｓまたはＯｒｎで ；Ｒ32はＧｌｎ、Ｌｙｓ、ＯｒｎまたはＧｌｕで；Ｒ36はＩｌｅ、ＣaＭｅＩｌ ｅまたはＣaＭｅＬｅｕで；Ｒ38はＡｓｐまたはＡｌａで；Ｒ29がＧｌｕのとき Ｒ32はＬｙｓまたはＯｒｎのいずれかで、その側鎖はアミド結合によって連結さ れており、さらにＲ29がＬｙｓまたはＯｒｎのいずれかのときＲ32はＧｌｕで、 その側鎖はアミド結合によって連結されていることを条件とする。この群では、 Ｄ−Ｐｈｅ11はＤ−Ｌｅｕまたは別の天然のα−アミノ酸のＤ−異性体で置換す ることができ、３１位のＧｌｕはＤ−異性体、例えばＤ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ａｒｇ、 ｉｍＢｚｌＤ−Ｈｉｓなどで置換でき、さらにＮ−末端は１または２残基が短縮 されていてもよい。 これらの具体的ペプチドは以下の通りである。 〔Ａｃ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｐｈｅ〕−ｈＵｃｎ（３−４０） 〔Ｄ−Ｌｅｕ、Ａｌａ〕−ｈＵｃｎ 〔Ｄ−Ｐｈｅ11、Ａｌａ38〕−ｈＵｃｎ 〔Ｄ−Ｔｙｒ11、ＣaＭｅｌｌｅ36〕−ｈＵｃｎ 〔Ｄ−Ｐｈｅ11、ＣaＭｅＬｅｕ36〕−ｈＵｃｎ 〔Ａｃ−Ａｓｐ1、Ｄ−Ｐｈｅ11、Ａｌａ19.38〕−ｈＵｃｎ （シクロ２９−３２）〔Ｄ−Ｌｅｕ11、Ｇｌｕ29、Ｌｙｓ32〕−ｈＵｃｎ （シクロ２９−３２）〔Ｄ−Ｐｈｅ11、Ｇｌｕ29、Ｏｒｎ32〕−ｈＵｃｎ（２− ４０） （シクロ２９−３２）〔Ａｃ−Ｐｒｏ3、Ｄ−Ｐｈｅ11、Ｌｙｓ29、Ｇｌｕ32〕 −ｈＵｃｎ（３−４０） （シクロ２９−３２）〔Ｄ−Ｔｙｒ11、Ｏｒｎ29、Ｇｌｕ32〕−ｈＵｃｎ（３− ４０） （シクロ２９−３２）〔Ｄ−Ｐｈｅ11、Ｇｌｕ29、Ｄ−Ｇｌｕ31、Ｌｙｓ32〕− ｈＵｃｎ （シクロ２９−３２）〔Ｄ−Ｐｈｅ11、Ｇｌｕ29、Ｄ−Ａｒｇ31、Ｌｙｓ32〕− ｈＵｃｎ （シクロ２９−３２）〔Ｄ−Ｔｙｒ11、Ｇｌｕ29、ｉｍＢｚＤ−Ｈｉｓ31、Ｌｙ ｓ32〕−ｈＵｃｎ 前述のＵｃｎ様ペプチド作動薬の各々は、全身的血圧低下およびＡＣＴＨの分 泌刺激を含む哺乳類の顕著な血管拡張−血圧低下活性を有する。 実施例ＶＩＩ 以下のアミノ酸配列（配列番号：１４）内に分類されるＵｃｎ様ペプチド作動 薬のさらにまた別の群を合成する： 式中、Ｙは７もしくは７未満の炭素原子を有するアシル基または水素で；Ｘａ ａ1はＡｓｐ、ＧｌｕまたはＧｌｎで；Ｘａａ2はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕまたは Ｇｌｙで；Ｘａａ4はＳｅｒまたはＰｒｏで；Ｘａａ5はＬｅｕ、ＩｌｅまたはＭ ｅｔで；Ｘａａ7はＩｌｅまたはＬｅｕで；Ｘａａ10はＴｈｒまたはＳｅｒで； Ｘａａ11はＰｈｅまたはＬｅｕで；Ｘａａ12はＨｉｓまたはＧｌｕで；Ｘａａ13 はＬｅｕまたはＭｅｔで；Ｘａａ16はＴｈｒ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＬｙｓで； Ｘａａ17はＬｅｕ、ＭｅｔまたはＶａｌで；Ｘａａ18はＬｅｕまたはＩｌｅで； Ｘａａ19はＧｌｕまたはＨｉｓで；Ｘａａ20はＬｅｕ、Ｍｅｔ、ＩｌｅまたはＡ ｒｇで；Ｘａａ21はＡｌａ、ＧｌｕまたはＴｈｒで；Ｘａａ22はＡｒｇまたはＬ ｙｓで；Ｘａａ23は天然のアミノ酸のいずれか、さらに好ましくはＴｈｒ、Ｓｅ ｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｈｉ ｓ、Ｌｅｕ、ＧｌｕまたはＡｓｐで；Ｘａａ24はＧｌｎ、ＧｌｕまたはＡｓｐで ；Ｘａａ25は天然のアミノ酸のいずれか、さらに好ましくはＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａ ｌａ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｌ ｅｕ、ＧｌｕまたはＡｓｐで；Ｘａａ26はＧｌｎ、ＬｅｕまたはＧｌｕで；Ｘａ ａ27はＡｒｇ、ＡｌａまたはＬｙｓで；Ｘａａ28はＧｌｕまたはＧｌｎで；Ｘａ ａ29はＡｒｇまたはＧｌｎで；Ｘａａ31は天然のアミノ酸のいずれか、さらに好 ましくはＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｌｙ ｓ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、またはＡｓｐで；Ｘａａ32は天然のアミノ酸のい ずれか、さらに好ましくはＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、 Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、またはＡｓｐで；Ｘａａ35はＩｌｅ 、Ｌｙｓ、ＬｅｕまたはＡｓｎで；Ｘａａ36はＩｌｅ、Ｔｙｒ、ＭｅｔまたはＬ ｅｕで；Ｘａａ37はＰｈｅ、ＬｅｕまたはＭｅｔで；Ｘａａ38はＡｓｐまたはＧ ｌｕで；Ｘａａ39はＳｅｒ、Ｉｌｅ、ＧｌｕまたはＴｈｒで；さらにＸａａ40は Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＡｌａで；ｈＵｃｎと異なる残基は３残基未満で あり、さらにＮ−末端は１つまたは２つの残基が短縮されていてもよいという条 件に従う。 以下の個々のペプチドが合成される： 前述のＵｃｎ様ペプチド作動薬の各々は、全身的血圧低下およびＡＣＴＨの分 泌刺激を含む哺乳類の顕著な血管拡張−血圧低下活性を有する。 以下の実施例群では、拮抗特性を有するＮ−末端短縮変形体（例えば７−１０ 残基が短縮される）を対象とする。その化学的性状および／またはＵｃｎ類似体 の合成に関する前述の全ての記載はこれら拮抗物質に同様に適用されると考えら れ、したがって繰り返すことはしない。すなわちこれら拮抗物質は当該作動薬の 単なるＮ−末端短縮変形体である。以下の実施例で説明する個々のペプチドは、 少なくともそのＣＲＦレセプター、ＣＲＦ−Ｒ１およびＣＲＦ−Ｒ２上でＵｃｎ の作用に関して拮抗的な生物学的特性を示す。この点に関して、これらＵｃｎ拮 抗物質は、米国特許第5245009号でＣＲＦ拮抗物質として開示されたものと同様 な特性および用途を少なくとも一般的に有すると考ええられる。 実施例ＶＩＩＩ のアミノ酸配列（配列番号：８参照）を有するペプチドＵｃｎ（１１−４０）を 実施例Ｉで述べた態様で合成する。候補ペプチドのＵｃｎ拮抗物質としての生物 学的能力（これはＣＲＦレセプターへのその有効な結合によって示されるであろ う）を評価するために、先に述べたアッセイ(Endocrinologu，91巻、上掲書)を チャレンジ用量のヒツジＣＲＦの存在下で実施する。このアッセイでのそのよう な候補物質の効能を、極めて強力な直線状のＣＲＦ拮抗物質、〔Ｄ−Ｐｈｅ12、 Ｎｌｅ21.38〕−ｒ／ｈＣＲＦ（１２−４１）（以下では標準拮抗物質と呼ぶ） の効能と日常的な態様で比較する。ｉｖ注射の結果としての平均動脈血圧の上昇 を測定するインビボ試験もまた簡単で直接的な態様で実施される。このＵｃｎ（ １１−４０）ペプチドは、既知のＣＲＦ拮抗物質のように、平均動脈血圧の上昇 を惹起する哺乳類の顕著な血管収縮活性を示す。 この合成を２回繰り返し、Ｕｃｎ（１０−４０）および〔Ａｃ−Ｔｈｒ10〕Ｕ ｃｎ（１０−４０）を製造したが、両ペプチドともＵｃｎ拮抗物質としての生物 学的活性を示した。 実施例ＩＸ のアミノ酸配列を有するペプチド〔Ｄ−Ｐｈｅ11〕−Ｕｃｎ（１１−４０）を実 施例Ｉで述べた態様で合成する。その固有の旋光度を前述の条件下で〔α〕D＝ −６２°±１．０として測定する。ＬＳＩＭＳは３６３８．８８Ｄａという値を 示し、これは計算値３６３９．００Ｄａと一致する。実施例ＶＩＩＩで述べたよ うにインビトロ試験を実施する。この試験は、このペプチドは生物学的に活性で 、極めて強力な標準拮抗物質と比較して０．５５１（０．３３３−０．８５７） という値を示した。このペプチドは哺乳類の顕著な血管収縮活性を有し、平均動 脈血圧の上昇を惹起して、それがＵｃｎ拮抗物質であることを示した。 実施例Ｘ のアミノ酸配列を有するペプチド〔Ｄ−Ｔｙｒ11〕−Ｕｃｎ（１１−４０）を実 施例Ｉで述べた態様で合成する。このペプチドは哺乳類の顕著な血管収縮活性を 有して平均動脈血圧の上昇を惹起し、それがＵｃｎ拮抗物質であることを示した 。このペプチドはまた効果的にヨード付加され、スクリーニングアッセイなどで 用いられる〔125Ｉ−Ｄ−Ｔｙｒ11〕−Ｕｃｎ（１１−４０）を提供する。 実施例ＸＩ のアミノ酸配列を有するペプチド（シクロ２９−３２）〔Ｄ−Ｐｈｅ11、Ｇｌｕ29 、Ｌｙｓ32〕−Ｕｃｎ（１１−４０）を実施例Ｉで述べた態様で合成し、米国 特許第5064939号の実施例Ｉ(11/121991発行)に記載されたように作製したラクタ ム結合を環状化させる。その固有の旋光度を前述の条件下で〔α〕D＝−４９° ±１．０として測定する。ＬＳＩＭＳは３５９３．９７Ｄａという値を示し、こ れは計算値３５９３．９７Ｄａと一致する。実施例ＶＩＩＩで述べたように腹側 下垂体細胞培養を用いたＡＣＴＨ分泌についてのインビトロ試験は、このペプチ ドは標準拮抗物質の約１０倍有効(すなわち１０．３４(４．２７−２５．５８)) であること を示した。このペプチドはまた哺乳類の顕著な血管収縮活性を有し、平均動脈血 圧の上昇を惹起して、それがＵｃｎ拮抗物質であることを示した。 実施例ＸＩＩ のアミノ酸配列を有するペプチド（シクロ２９−３２）〔Ｄ−Ｔｙｒ11、Ｇｌｕ29 、Ｌｙｓ32〕−Ｕｃｎ（１１−４０）を実施例Ｉで述べた態様で合成し、米国 特許第5064939号の実施例Ｉ(11/121991発行)に記載されたように作製したラクタ ム結合を環状化させる。ＬＳＩＭＳは３６０９．８２Ｄａという値を示し、これ は計算値３６０９．９６Ｄａと一致する。実施例ＶＩＩＩで述べたように腹側下 垂体細胞培養を用いたＡＣＴＨ分泌についてのインビトロ試験は、このペプチド は標準拮抗物質の約４倍有効(すなわち４．０１(２．３２−７．０５))であるこ とを示した。このペプチドはまた哺乳類の顕著な血管収縮活性を有し、平均動脈 血圧の上昇を惹起して、それがＵｃｎ拮抗物質であることを示した。このペプチ ドはまたヨード付加されて、スクリーニングアッセイなどで用いられる125Ｉ− Ｄ−Ｔｙｒ11環状類似体を提供する。 実施例ＸＩＩＡ のアミノ酸配列を有するペプチド（シクロ２９−３２）〔Ｄ−Ｔｙｒ11、Ｇｌｕ29 、Ｄ−Ｇｌｕ31、Ｌｙｓ32〕−Ｕｃｎ（１１−４０）を実施例Ｉで述べた態様 で合成し、米国特許第5064939号の実施例Ｉ(11/121991発行)に記載されたように 作製したラクタム結合を環状化させる。このペプチドは哺乳類の顕著な血管収縮 活性を有し、平均動脈血圧の上昇を惹起して、それがＵｃｎ拮抗物質であること を示した。このペプチドはまたヨード付加されて、スクリーニングアッセイなど で用いられる125Ｉ−Ｄ−Ｔｙｒ11環状類似体を提供する。 実施例ＸＩＩＩ のアミノ酸配 列を有するペプチド（シクロ２９−３２）〔Ｄ−Ｐｈｅ11、Ｇｌｕ29、Ｄ−Ｇｌ ｕ31、Ｌｙｓ32〕−Ｕｃｎ（１１−４０）を実施例Ｉで述べた態様で合成し、米 国特許第5064939号の実施例Ｉ(11/121991発行)に記載されたように作製したラク タム結合を環状化させる。ＬＳＩＭＳは３５９３．８０Ｄａという値を示し、こ れは計算値３５９３．９７Ｄａと一致する。実施例ＶＩＩＩで述べたように腹側 下垂体細胞培養を用いたＡＣＴＨ分泌についてのインビトロ試験は、このペプチ ドは標準拮抗物質の約４．７５倍有効（すなわち４．７２(２．１９−１０．０ ０))であることを示した。このペプチドはまた哺乳類の顕著な血管収縮活性を有 し、平均動脈血圧の上昇を惹起して、それがＵｃｎ拮抗物質であることを示した 。この合成を２回繰り返し、Ｄ−Ｐｈｅの代わりにＤ−ＬｅｕおよびＤ−Ｈｉｓ で置換する。これらのペプチドはＵｃｎ拮抗物質として同様な生物学的活性を示 した。 実施例ＸＩＩＩＡ のアミノ酸配列を有するペプチド（シクロ２９−３２）〔Ｄ−Ｔｙｒ11、Ｇｌｕ29 、Ｄ−Ｇｌｕ31、Ｌｙｓ32〕−Ｕｃｎ（１１−４０）を実施例Ｉで述べた態様 で合成し、米国特許第5064939号の実施例Ｉ(11/121991発行)に記載されたように 作製したラクタム結合を環状化させる。ＬＳＩＭＳは３６９０．９１Ｄａという 値を示し、これは計算値３６９１．０２Ｄａと一致する。実施例ＶＩＩＩで述べ たように腹側下垂体細胞培養を用いたＡＣＴＨ分泌についてのインビトロ試験は 、このペプチドは標準拮抗物質の約２．７５倍有効(すなわち２．７４(１．０２ −８．０２))であることを示した。このペプチドはまた哺乳類の顕著な血管収縮 活性を有し、平均動脈血圧の上昇を惹起して、それがＵｃｎ拮抗物質であること を示した。このような合成および検査によって、Ｎ−末端のＬ型異性体の付加は Ｕｃｎ拮抗物質としての生物学的活性に顕著な変化を与えないことが示される。 実施例ＸＩＩＩＢ のアミ ノ酸配列を有するペプチド（シクロ２９−３２）〔Ｄ−Ｐｒｏ10、Ｄ−Ｐｈｅ11 、Ｇｌｕ29、Ｄ−Ｇｌｕ31、Ｌｙｓ32〕−Ｕｃｎ（１０−４０）を実施例Ｉで述 べた態様で合成し、米国特許第5064939号の実施例I(11/121991発行)に記載され たように作製したラクタム結合を環状化させる。ＬＳＩＭＳは３６９１．００Ｄ ａという値を示し、これは計算値３６９１．０２Ｄａと一致する。実施例ＶＩＩ Ｉで述べたように腹側下垂体細胞培養を用いたＡＣＴＨ分泌についてのインビト ロ試験は、このペプチドは標準拮抗物質の約５倍有効(すなわち４．９９(２．２ ６−１１．５５))であることを示した。このペプチドはまた哺乳類の顕著な血管 収縮活性を有し、平均動脈血圧の上昇を惹起して、それがＵｃｎ拮抗物質である ことを示した。このような合成および検査は、ペプチドＸＩＩＩと比較すること によって、Ｎ−末端のＤ型異性体の付加はＵｃｎ拮抗物質の生物学的活性に顕著 な変化を与えないことを示す。 実施例ＸＩＶ のアミノ酸配列を有するペプチド（シクロ２９−３２）〔Ｄ−Ｐｈｅ11、Ｇｌｕ29 、Ｄ−Ａｒｇ31、Ｏｒｎ32〕−Ｕｃｎ（１１−４０）を実施例Ｉで述べた態様 で合成し、米国特許第5064939号の実施例Ｉ(11/121991発行)に記載されたように 作製したラクタム結合を環状化させる。このペプチドは哺乳類の顕著な血管収縮 活性を有し、平均動脈血圧の上昇を惹起して、それがＵｃｎ拮抗物質であること を示した。 この合成を２回繰り返してＤ−ＡｒｇをｉｍＢｚｌＤ−ＨｉｓおよびＤ−２Ｎ ａｌに置き換え、さらにこれらの置換物のＮ−末端にＡｃ−Ｔｈｒ付加を２回繰 り返した。４種のペプチドは全て、Ｕｃｎ拮抗物質として良好な生物学的活性を 示す。 実施例ＸＶ のアミノ酸配列を有するペプチド（シクロ２９−３２）〔Ｄ−Ｐｈｅ11、Ｌｙｓ29 、Ｄ−Ｇｌｕ31、Ｇｌｎ32〕−Ｕｃｎ（１１−４０）を実施例Ｉで述べた態様 で合成し、米国 特許第5064939号の実施例Ｉ(11/121991発行)に記載されたように作製したラクタ ム結合を環状化させる。このペプチドは哺乳類の顕著な血管収縮活性を有し、平 均動脈血圧の上昇を惹起して、それがＵｃｎ拮抗物質であることを示した。 実施例ＸＶＩＩ 以下に示すようなさらに別のＵｃｎ拮抗ペプチド（それらの多くは実質的にＵ ｃｎ（１１−４０）と同じであると考えられる）を実施例Ｉで述べた態様で合成 する。 前述のＵｃｎ様拮抗ペプチドの各々は哺乳類の顕著な血管収縮活性を有し、平 均動脈血圧の上昇を惹起して、それがＵｃｎ拮抗物質であることを示した。 以下の実施例群は、ＣＲＦ−ＢＰと複合体を形成することによって内在性ＣＲ ＦおよびＵｃｎの利用可能量を増加させるＣＲＦ−ＢＰ封鎖物質の合成を目的と する。 実施例ＸＶＩＩＩ のアミノ酸配列（配列番号：８参照）を有するペプチドＵｃｎ（５−３２）を実 施例Ｉで述べた態様で合成する。 仮のペプチド封鎖物は、競合的ｈＣＲＦ−ＢＰリガンド結合アッセイを用いて 評価される。〔125Ｉ−ＤＴｙｒ0〕ｈＣＲＦの可溶性ｈＣＲＦ−ＢＰへの結合は 、２５ｍＭのＥＤＴＡ、０．２５％のウシ血清アルブミンおよび０．０１％のト リトンＸ−１００を含む燐酸緩衝食塩水中で、ｈＣＲＦ−ＢＰ源として組換えＣ ＨＯ細胞によって濃度を高めた培養液を用いて実施する。反応は全容積を４００ μｌ（５００００ＣＰＭの〔125Ｉ−ＤＴｙｒ0〕ｈＣＲＦを含む）として実施す る。一定量の放射能活性ｈＣＲＦとｈＣＲＦ−ＢＰさらに量を変えたサンプルペ プチドを用いて競合的結合アッセイを実施する。室温で一晩保温した後、ウサギ 抗ｈＣＲＦ−ＢＰ抗血清（最終希釈１：９０００）および２００μｌのヒツジ抗 ウサギＩｇＧ溶液を用いて沈降させる。一次血清および二次血清で各々３０分保 温した後、１ｍｌの食塩水洗浄液を加え、試験管を２０００×ｇで２０分４℃で 遠心する。沈殿物をガンマカウンターで計測する。抑制結合親和性定数（Ｋi） 値をＬＩＧＡＮＤコンピュータプログラム(Munsonら、Anal．Biochem.，107:220 (1980))およびＶａｘ／ＶＭＳコンピュータシステムで算出したパラメーターを 用いて決定する。 ＣＲＦ−ＢＰ封鎖Ｕｃｎ（５−３２）はｈＣＲＦ（９−３３）のそれより小さ いＫiを有し、したがってＣＲＦおよび／またはＵｃｎの利用可能量を高める潜 在的に優れた封鎖物質である。 実施例ＸＩＸ のアミノ酸配列（配列番号：８参照）を有するペプチドＵｃｎ（８−３２）を実 施例Ｉで述べた態様で合成する。ＬＤＭＳは３０２３．４８Ｄａという値を示し 、これは計算値３０２３．６５Ｄａと一致する。検査の結果は、このペプチドは ｈＣＲＦ（９−３３）のそれより小さいＫiを有し、したがってＣＲＦおよび／ またはＵｃｎの利用可能量を高める潜在的に優れた封鎖物質であることを示す。 実施例ＸＸ のアミノ酸配列（配列番号：８参照）を有するペプチドＵｃｎ（３−２７）を実 施例Ｉで述べた態様で合成する。このペプチド はｈＣＲＦ（９−３３）のそれより小さいＫiを有し、したがってＣＲＦおよび ／またはＵｃｎの利用可能量を高める潜在的に優れた封鎖物質である。 実施例ＸＸＩ のアミノ酸配列（配列番号：８参照）を有するペプチド〔Ｉｌｅ18〕−Ｕｃｎ（ ６−２９）を実施例Ｉで述べた態様で合成する。このペプチドは、ｈＣＲＦ（９ −３３）のそれより小さいＫiを有し、したがってＣＲＦおよび／またはＵｃｎ の利用可能量を高める潜在的に優れた封鎖物質である。 Ｕｃｎは下垂体−副腎皮質軸を強く刺激し、内在性グルココルチコイド産生の 低いあるタイプの患者でこの軸の機能を刺激するために有用であると考えられる 。例えば、Ｕｃｎおよびその類似体は、下垂体−副腎皮質機能が抑制されている 患者で外部からグルココルチコイドを投与されている場合、下垂体−副腎機能の 回復に役立つであろう。 他のほとんどの調節ペプチドは、中枢神経系および胃腸管に対して作用を有す ることが分かっている。ＡＣＴＨおよび交感神経系活性化分泌は、哺乳類のスト レスに対する反応の“必須条件”であるので、ＣＲＦが身体のストレス反応の仲 介物質として脳に対して顕著な作用を有するということは驚くことではないであ ろう。したがって、Ｕｃｎおよびその類似体は、気分、学習、記憶並びに健常人 および精神的疾患の患者の行動を調節するためにもまた利用することができると 考えられる。Ｕｃｎは、ＡＣＴＨ、β−ＥＮＤ、β−リポトロピン、他のプロー オピオメラノコルチン遺伝子産物およびコルチコステロンのレベルを上昇させる ので、Ｕｃｎの投与は、脳における前述のＰＯＭＣ由来ペプチドの作用を誘発す るために用いて、それによって記憶、気分、痛みの認識などに影響を与え、より 具体的には警戒心、抑うつおよび／または不安に影響を及ぼし、さらにまた末梢 でそれらの作用を誘発するために用いることができる。例えば、脳室に直接投与 するとき、ＣＦＲはラットで身体的活動を高め、さらに学習成果を改善し、した がって自然な刺激物として機能することができる。すなわちＵｃｎはＣＲＦレセ プターを同様に活性化させるので、それは同じように機能するであろう。 ＣＲＦ−Ｒ２は心臓で（特に血管と結合して）豊富に発現されることが判明し ており、さらに分離して灌流させた心臓の左心房へのＣＲＦの添加は、冠状動脈 に対する長期の拡張作用を誘発し、一過性に陽性の筋変力作用を生じ、心房性の ナトリウム排泄増加ペプチドの分泌を刺激することが知られているので、今やＵ ｃｎは、ＣＲＦ−Ｒ２に対するその特に高い親和性のために少なくとも部分的に は心臓の灌流の調節に必要であると考えられる。さらにまた、他の血管床（例え ば上方腸間膜）は、Ｕｃｎおよびその類似体によって拡張されることが予想され る。心臓におけるこれらの生物学的作用のために、Ｕｃｎおよびその作動物質／ 拮抗物質は、（抗Ｕｃｎ抗体とともに）選択的に心臓の灌流を調節するために効 果的に用いることができる。 さらにまた、血管におけるＣＲＦ−Ｒ２の局在のために、本発明のＵｃｎ様作 動および拮抗ペプチドは、多くの種々の血管床および特に所望の組織および器官 における血流を調節する治療に有用であると考えられる。全てのＣＲＦ関連ペプ チドは腸間膜の血管床を拡張させることが示されたので、Ｕｃｎおよびその作動 薬類似体は、動物（特にヒトおよび他の哺乳類）の胃腸管への血流を増加させる ために使用できると考えられる。ＣＲＦおよび一定のフラグメントは血管透過性 を調節することが示された(E.T．Weiら、“Peripheral anti-inflammatory acti ons of corticotropin-releasing factor”（コルチコトロピン遊離因子の末梢 抗炎症作用）、Corticotropin-Releasing Factor(Ciba財団シンポジウム172)、J ohn Wiley & Sons刊、pp.258-276，1993))。Ｕｃｎおよびそのフラグメントはま た血管の漏出を減少させ、損傷性または外科手術誘発性組織腫脹および炎症に対 して有益な作用を有する。したがって、Ｕｃｎ並びに作動薬として作用するその 類似体およびフラグメントは非経口的に投与して、炎症、腫脹および浮腫を減少 させ、さらに熱傷後の体液の損失を減少させることができる。 ｏＣＲＦ、ｒ／ｈＣＲＦ、ウロテンシンＩおよびソーバジンは、胃酸の産生を 抑制することが示され、Ｕｃｎおよびその類似体はまた、哺乳類で胃酸産生を低 下させ、および／またはいくつかの胃腸機能を抑制することによって胃潰瘍の治 療に有効であると考えられる。Ｕｃｎおよびその類似体は、腸の通加速度を増加 させる作用を有し、急性便秘症の治療に有用であろう。 ＧＩ管に対するＣＲＦの多くの直接的刺激作用は以前に記載されてきた。例え ば、ＣＲＦは、インビトロで腸に作用して小腸の腸管筋ニューロンを脱分極させ る。ＣＲＦおよびＣＲＦ拮抗物質の静脈内投与に関するインビボ実験の結果は、 ＣＲＦの胃を空にし、腸の自動運動性を調節する作用の発見と一致した。本発明 のＵｃｎ様ペプチドは、腸および胃の疾患（例えば刺激性腸症候群）の治療に有 用であると考えられる。ＣＲＦ拮抗物質は、刺激性腸症候群の治療に以前に用い られ、Ｕｃｎを基にした拮抗物質（これはＣＲＦ−Ｒ２に対して選択性を有する ）は一層有用であろうと考えられる。これらの拮抗物質はまた、痙攣性大腸症お よびクローン病の治療に用いることができる。 これらのＵｃｎ様ペプチドはまた、適切な投与とその後の身体機能のモニタリ ングによって、内分泌または中枢神経系の病的変化が疑われる哺乳類の視床下部 下垂体副腎機能を調べるために使用することができる。例えば、クッシング病お よび情動疾患（例えばうつ病）を調べる診断ツールとして投与に用いることがで きる。 医薬組成物を生成するために医薬としてまたは動物薬として許容可能な担体と 合わせてＵｃｎ、その類似体または無毒な塩を、動物（ヒトおよび他の哺乳類を 含む）に静脈内、皮下、筋肉内、経皮的（例えば鼻内）、脳脊髄内または経口的 に投与することができる。この分離ペプチドは少なくとも約９０％純粋で、好ま しくは少なくとも９８％純粋であるべきである。しかしながらより低い純度も有 効で、ヒト以外の哺乳類に用いることができる。この純度は、目的のペプチドが 、存在する全ての同じようなペプチドおよびペプチドフラグメントの表示重量％ を構成することを意味する。ヒトへの投与は、血圧を低下させるために、または 内在性グルココルチコイド産生を刺激するために医師によって実施される。必要 とされる用量は、処置される個々の症状、症状の重篤度および所望される治療期 間にしたがって変化するであろう。ＵｃｎまたはＵｃｎ類似体は例えばｉｃｖで 投与して、脳内のＵｃｎの増加をもたらし、それによって（ａ）アルツハイマー 病に罹患している対象者の短、中期の記憶の改善、（ｂ）慢性疲労症候群の緩和 、（ｃ）食欲抑制、（ｄ）呼吸系の刺激、（ｅ）学習成果改善、（ｆ）記憶の改 善、（ｇ）警戒心の改善、（ｈ）抑うつの軽減および／または（ｉ）不安の軽減 を惹起する。特に有効なものは食欲の抑制で示される。 そのようなペプチドは、医薬としてまたは動物薬として許容可能な無毒の塩の 形（例えば酸付加塩または、例えば亜鉛、鉄、カルシウム、バリウム、マグネシ ウム、アルミニウムなどによる金属複合体）としてしばしば投与される。そのよ うな無毒な塩の実例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、タンニン酸 塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、アルギン酸塩、マレイン酸塩、酢 酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、 酒石酸塩などである。活性成分が錠剤形で投与される場合は、この錠剤は、結合 剤（例えばトラガカント、トウモロコシ澱粉またはゼラチン）；分解剤（例えば アルギン酸）；および潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム）を含むことが できる。液体形の投与を所望する場合は、甘味料および／または香料を用いるこ とができ、さらに等張食塩水、燐酸緩衝溶液などでの静脈内投与を実施すること ができる。 Ｕｃｎまたはその類似体を、長期間にわたって（例えば１回の投与で１週間か ら１年間）送達させることもできる。さらに徐放性のデポットまたは埋め込み投 与形も当技術分野で周知のように用いることができる。例えば、投薬形は、体液 中で溶解度が低い化合物の医薬的に許容可能な無毒の塩、例えば多塩基酸による 酸付加塩；多価金属陽イオンによる塩；またはこれら２種の塩の組み合わせを含 むことができる。比較的不溶性の塩もまたゲル（例えばステアリン酸アルミニウ ムゲル）中で製剤化することができる。適切な徐放性の注射用デポット製剤もま た、緩徐に分解する無毒または非抗原性ポリマー（例えばポリ酢酸／ポリグリコ ール酸ポリマー、例えば米国特許第3773919号に開示）中に分散または被包化さ れたＵｃｎまたは類似体またはその塩を含むことができる。 このペプチドの治療的有効量は医師の指導の下で投与されるべきで、医薬的組 成物は通常、慣用的な医薬用または動物薬用として許容可能な担体と合わせてこ のペプチドを含むであろう。治療的有効量は、所望の作用を達成するために、例 えば患者のＡＣＴＨの量を増減させるために算出した予め定めた量であると考え られる。必要とされる用量は、個々の処置および所望される治療期間によって変 動するであろう。しかしながら、約１０マイクログラムから約１ミリグラム／ｋ ｇ体重／日が治療的処置として用いられるであろう。上記で述べたように、デポ ットまたは長期持続形の化合物を投与することは特に有利であろう。治療的有効 量は典型的には、生理学的に許容できる組成物として末梢投与した場合に、約０ ．１１μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１μｇ／ｍｌから約５ ０μｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約２μｇ／ｍｌ、通常は５から１０μ ｇ／ｍｌの血漿濃度を達成するために十分なＵｃｎまたはその類似体量である。 抗体またはアンチセンスポリヌクレオチドではまた、当技術分野で実施されてい る前例にしたがって対応する適切な量が投与される。患者で存在する（特に血漿 の）ＡＣＴＨレベルは日常的な臨床検査によって容易に測定することができる。 ＡＣＴＨレベルの変化は治療期間中にモニターし、投与したＵｃｎ様ペプチドの 経過時間に対する有効性を決定することができる。いくつかの事例では、このよ うなペプチドによる対象者の治療は、ＡＣＴＨまたはコルチコステロイドの投与 の代わりに実施され、そのような事例では、約１０ｎｇ／ｋｇ体重の用量が用い られる。 本発明をその好ましい実施態様（これらは発明者が現時点で知っている最良の 態様である）という点に関してこれまで詳述してきたが、当業者には明白なよう に種々の変更および改変が、添付の請求の範囲で説明する本発明の範囲を越える ことなく行なうことができることは理解されよう。本請求の範囲はペプチド配列 という点に関して様々に範囲を明らかにしているが、そのようなペプチド配列は 、完全に同等であることが周知で、さらにきわめて頻繁に投与されるその無毒な 塩を含むことは理解されよう。Ｃ−末端の単純なアミドの代わりに、低級アルキ ル置換アミド（例えばメチルアミド、エチルアミドなど）を含むことができ、ま たこのＣ−末端はペプチド分野で周知のように他の方法で封鎖されていてもよい ことは理解されよう。本明細書で特に示したＵｃｎの配列と実質的に同一である アミノ酸残基配列を有するポリペプチド（この場合、１つまたは２つ以上が機能 的に同様な残基で保存的に置換されている）は、それらがＣＲＦの生物学的機能 を模倣するかぎり、Ｕｃｎと同等物であると考えられる。そのようなペプチドお よびその塩は、本発明の請求の範囲内に含まれると考えられる。 前述の全ての特許および出版物は、先の２つの出願とともに参照により本明細 書に含まれる。本明細書で用いられるように、全ての温度は℃で、液体物質の割 合および％は全て容積によるものである。 配列表の概要 配列番号１は、Ｃ末端をアミド化したとき、ヒツジＣＲＦのアミノ酸配列であ る。 配列番号２は、ｐＧｌｕがＮ末端に存在しかつＣ末端をアミド化したとき、カ エルソービジーン(frog sauvagine)のアミノ酸配列である。 配列番号３は、Ｃ末端をアミド化したとき、ラット／ヒトＣＲＦのアミノ酸配 列である。 配列番号４は、Ｃ末端をアミド化したとき、サッカーフィッシュ(suckerfish) ウロテンシンのアミノ酸配列である。 配列番号５は、Ｃ末端をアミド化したとき、コイ(carp)ウロテンシンのアミノ 酸配列である。 配列番号６は、Ｃ末端をアミド化したとき、フラッドヘッド(flathead)ソール (Maggy)のアミノ酸配列である。 配列番号７は、Ｃ末端をアミド化したとき、サカナＣＲＦのアミノ酸配列であ る。 配列番号８は、Ｃ末端をアミド化したとき、ラット由来ウロコーチン(Ucn)の アミノ酸配列である。 配列番号９は、核酸配列であって、そこから配列番号８を演繹した。 配列番号１０は、“ｒＣＲＦ−Ｒ１”といわれるラット由来ＣＲＦレセプター のアミノ酸配列である。 配列番号１１は、“ｍＣＲＦ−Ｒ２β”といわれるマウス由来ＣＲＦレセプタ ーのアミノ酸配列である。 配列番号１２は、“ｒＣＲＦ−Ｒ２α”といわれるラット由来ＣＲＦレセプタ ーのアミノ酸配列である。 配列番号１３は、“ｒＣＲＦ−Ｒ２β”といわれるラット由来ＣＲＦレセプタ ーのアミノ酸配列である。 配列番号１４は、Ｕｃｎのある種の類縁体を規定する４０残基ペプチドのアミ ノ酸配列である。 配列番号１５は、プレカーサーに成熟したヒトＵｃｎペプチドをプラスしたア ミノ酸配列である。 配列番号１６は、核酸配列であって、そこから配列番号１５を演繹した。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION                           Urocortin peptide   This invention is under grant number DK-26741 awarded by the National Institutes of Health. Achieved with government support. United States Government has certain rights in this invention. You.   This application is a provisional application No. 60/002223 (filed August 11, 1995) Claim priority based on application No. 08/490314 (filed June 13, 1995).   The present invention relates to peptide hormones, humans using such peptide hormones. Methods for treating mammals, including antibodies that bind such peptides, such peptides Diagnostic and drug screening methods using antibodies and / or antibodies, and It relates to nucleic acids encoding such peptides. More specifically, the present invention relates to Urocortin with some pharmacological properties similar to rotensin and CRF (Ucn), its analogs and fragments (broadly U cn-like peptides), pharmaceutical compositions containing such Ucn peptides, And the treatment of mammals using such Ucn peptides and antibodies thereto Methods, diagnostic methods and screening methods.                                Background of the Invention   Experimental and clinical findings suggest that the hypothalamus is adrenocortical pituitary glandular Supports the idea that it plays a central role in regulating the secretory function of the vesicle. More than 40 years Earlier, Guillemin, Rosenberg and Saffran and Schally each separately Rate of ACTH secretion by the pituitary gland maintained in vitro or maintained in organ culture. It has been shown that a factor that enhances the presence of hypothalamus exists in physiological corticotrophy. The properties of the pin release factor (CRF) were similar to those of sheep CRF (oCRF) in 1981. It was unknown until revealed in the year. It has the following amino acid sequence (SEQ ID NO: US Pat. No. 4,415,558 disclosed as having 1):   Initially separated based on its role in the hypothalamus-pituitary-adrenal (HPA) axis The CRF, together with the central nervous system, has extraneural tissues (e.g., (Adrenal gland, placenta and testis). these Where in place CRF may also act as a paracrine modulator and neurotransmitter There is. Furthermore, emotional disorders such as anxiety, depression, alcoholism and gods Transfiguration) and the increased involvement of CRF in reproductive and immune response regulation Possibly, alterations in CRF expression have important physiological and pathophysiological consequences Suggested that it might be. For example, confusion in the regulatory ring containing the HPA axis is: Often results in a chronic elevation of circulating corticoid levels, and such patients Physical features in Cushing's syndrome, including trunk obesity, muscle wasting, and reduced fertility Show signs.   In addition to its role in mediating hypothalamic-pituitary-adrenal activation, CRF also Changes in autonomy and behavior (some of which occur during stress reactions ) Has also been shown to regulate. Many of these behavioral changes are due to dexamethasone treatment. HPA activity in that it is not repeated and does not respond to hypophysectomy It was suggested that it occurred separately from sex. In addition, infusion of CRF directly into the CNS Can reproduce autonomic and behavioral responses to various stresses You. Peripheral administration of CRF or CRF antagonist affects some of these changes CRF is not able to obtain such functions (appetite suppression, arousal and learning ability). (Including increased power) appear to act directly on the brain. However, the end Topically applied CRF antagonist attenuates stress-mediated increase in ACTH secretion Reduces stress-induced changes in independence activity and behavior when sent to the ventricle Can be done.   As a result of the wide anatomical distribution of the CRF and numerous biological effects, this regulation Peptides are thought to be necessary for the regulation of many biological processes. CRF Is also involved in regulating the inflammatory response. CRF is pro-inflammatory in several animal models Has been shown to play a critical role, but CRF Other animals appear to suppress inflammation by reducing sexual elevation.   Around 1981, a 40-residue amidated peptide roughly similar to the CRF American frogPhyllomedusa sauvageiIsolated from skin. It is a soba It is called gin (sauvagine) and its properties have been investigated and reported by Erspamer et al. (Regu latory Peptides, 2: 1-13 (1981)). Sorvagin has the following amino acid sequence ( SEQ ID NO: 2): When administered intravenously (iv), sorbazine and oCRF are vascularized in the mesenteric artery Induces dilation to lower blood pressure in mammals and also ACTH and β-endo It has been reported to reduce the stimulation of secretion of ruffin. However, intraventricular (i When administered to cv), there is an increase in heart rate and mean arterial pressure, which are Secondary to nervous system activation.   Around 1982-1983, rat CRF (rCRF) was separated and purified. Hentetracontapeptide having an amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) The condition was revealed: The formula for human CRF was subsequently found to be the same as that for rCRF. This transformation The compound is often called r / hCRF and is included in US Pat. No. 4,489,163.   At about the same time, two homologous polypeptides were introduced into urofilus (u) of different species of fish. rophyses). These isolated peptides were generally homologous to CRF (Ie, approximately 54% homology) and was named urotensin I (UI).Cato stomus commersoni (White Soccer or Soccer Fish) UI A polypeptide having the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 4):This is sometimes soccer fish (sf) uroten Called thin or sfUI. Purification and characterization are described in the literature. (Lederis et al., Science 218 (4568): 162-164 (1982/8/8)). Its congeners (carp Urotensin)Cyprinus carpioAnd the following amino acid sequence (SEQ ID NO: Having: 5): Another urotensin homolog has the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 6): This will beHippoglossoldes elassodonOr click here (Flathesd (Maggy) Sole) It is separated from the Lofice and is sometimes called Cochiurotensin. Synthetic UI is also inbit Stimulates ACTH and β-endorphin activity in vivo and in vivo; It has been found to have many of the same general biological activities as RF and sorbazine.   Since the first discovery of CRF in mammals and urotensin in fish, CRF has Things have also been shown to exist. For example, the CRF of fish is r / hCRF as high as The peptide was found to be a 41-residue peptide with high homology. Its amino acid sequence ( SEQ ID NO: 7) is as follows:Synthetic Fish CRF (fCRF) Inhibits ACTH and β-Endorphin Activity Stimulates as well as in vivo, and has biological activity similar to mammalian CRF . Due to the high homology between fCRF and r / hCRF, urotensin and / or May have other mammalian hormones that may be equivalent to sorbazine it is conceivable that.                                Summary of the Invention   Another peptide was found that is 40 residues in length. This is urotensin and C It has a relationship with RF and is arbitrarily called urocortin (Ucn). Urocortin G / human CRF is less than 50% homologous. The length is the same as Sorvagin However, it is less than 40% homologous to sorbazine. Closest urotensin sequence (I.e. carp urotensin) has a homology of 62.5%. Therefore, U cn has less than about 80% homology to all other natural peptides known to date Having. Rat Ucn has the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 8): Human Ucn has the following amino acid sequence (residues 83-122 of SEQ ID NO: 15) RU: Therefore, hUcn is AsnTwoAnd SerFourIs the same as rUcn except for Ucn describes the biological properties and general properties of known CRFs, urotensin and sorbazine Have biological properties that are thought to be similar in nature, but are higher in many respects Has biological ability.   The present invention relates to human and rat U that have substantially all of the properties of known CRFs. Ucn-like peptides comprising cn as well as analogs thereof are provided. These Ucn -Like peptides are not only potent antihypertensive agents, they are previously known It has new properties that go beyond the pharmacological and physiological properties of CRF. More specifically, Known CRF receptors (referred to as CRF-R), namely CRF-R1 and CR Hypothesis for Ucn with F-R2 and their truncated (splice) variants Agonists that stimulate new receptors are provided.   Binds with high affinity to CRF-R and the putative Ucn receptor Antagonists that compete with Ucn that do not significantly stimulate or activate Also provided. Such antagonists may comprise the amino acid sequence of Ucn or A sequence of 7 to 10 residues starting at the N-terminus from an analog sequence having qualitatively the same sequence Widely produced by dropping. Preferably 9 or 10 residues, most preferred Preferably 9 residues are removed. Truncated N-termini also have 7 or less carbon atoms. Acylation (for example, [Ac-ThrTen-Ucn (10-40)) Desirably, one, two or three other residues may be added to the N-terminus (eg, ProTen) Has no significant effect on biological performance. Other permutations are also valid as described below. There will be. Especially D-Phe11Or D-Tyr11Is the N-terminal and / or residue It may be present in the lactam bond created between 29 and 32. These antagonists Administered to achieve the same physiological effects as known CRF antagonists, And a more effective treatment method is provided.   In addition, Ucn and Ccn useful for inhibiting CRF binding protein (CRF-BP) And fragments of the Ucn analog are provided, which are accessible by the binding protein. It is usually effective to increase the level of endogenous peptide that is removed. Than Specifically, these Ucn-like peptides and inhibitory fragments have high affinity Human CRF and human Ucn (hUcn) bind to human CRF binding protein and h It competes more effectively by complex formation with CRF-BP. In this manner, it Et al., With any in vivo effective concentrations of endogenous hCRF and / or hUcn. CRF agonists or CRF antagonists (these are used to achieve specific therapeutic goals) May be administered together with the above). CR As a result of inhibiting the action of F-BP, these fragments are converted to CRF-BP Increases the concentration of endogenous CRF in areas of the body where it is normally present.   The invention also relates to such a dispersion dispersed in a pharmaceutically acceptable liquid or solid carrier. A pharmaceutical composition comprising a novel Ucn-like peptide or a non-toxic salt thereof. Of the present invention Delivery of such peptides or pharmaceutically acceptable salts thereof to mammals (especially humans) Administration was ACTH, β-endorphin, β-lipotropin, other pro-opiome. Regulating the secretion of lanocortin (POMC) gene products and corticosteroids, And / or decreased blood pressure or increased coronary blood flow, and / or edema and Reduced inflammation and / or learning, mood, behavior, appetite, gastrointestinal and intestinal function, Can be implemented to affect the activity of the autonomic nervous system.   The present invention also provides antibodies, Ucns and analogs and / or Assays that actually use antibodies such as These assays are pituitary Assess the status of cardiovascular, genital, liver, immune, gastrointestinal or central nervous system function Used for For example, such antibodies can be used to treat therapeutically administered Ucn. Used diagnostically to monitor the bell and maintain its therapeutically effective dose Diagnosis of potential physiological disorders caused by abnormal levels of Ucn Can be used for disconnection. The antibodies of the present invention neutralize endogenous Ucn. Can be administered therapeutically. Alternatively, encode such an antibody DNA can be used as gene therapy. The anti-Ucn antibody also provides CRF- Along with purification of the R protein, also to counteract the biological activity of Ucn in vivo Can be used.   The invention also provides for competitive binding assays. This assay is a For screening, for example, CRF receptor and / or Have stronger and more selective for CRF-BP, and thus potentially Especially for identifying novel Ucn-like peptides or other compounds useful as agents Useful. Such a screening assay will screen for potential agonists of Ucn. Can be used for leaning. Labeled Ucn antagonist with higher affinity Other assays using are used to screen for more potent antagonists of Ucn be able to. Furthermore, the ability of CRF-BP to bind CRF and Ucn And thus inhibits CRF and / or U at locations where hCRF-BP is present. Screen for particularly effective peptides or other compounds that increase the concentration of cn A method is provided.   The present invention further provides isolated nucleic acids encoding rat Ucn and native human Ucn. Provided is a nucleic acid hybridization probe in the form of a separated nucleic acid encoding I do. These probes also recognize another natural Ucn or Ucn-like peptide. Other Uc in biological samples or libraries of other species to identify Useful for detecting n-encoded nucleic acids. Such a nucleotide sequence also Recombinant Ucn-like peptide or fragment thereof having desired biological activity It can be used as a coding sequence for expression. Ucn encoding nucleic acid flag Should also be used as primers for PCR amplification of Ucn-encoded DNA. Can be. Furthermore, the sequence derived from the sequence encoding Ucn or an analog thereof is To limit the expression of vectors containing useful genes to specific cell types, It can be used in gene therapy. Furthermore, it hybridizes with UcnmRNA Reducing Ucn levels using antisense polynucleotides Conditions (eg, Ucn-secreting tumors). More specifically, the book The invention further relates to Ucn and Ucns comprising the naturally occurring 20 amino acid L-isomer. An isolated nucleic acid encoding an analog is provided. Such nucleic acids include: (A) a nucleic acid encoding the amino acid sequence of rat Ucn represented by SEQ ID NO: 8; A nucleic acid encoding the amino acid sequence of human Ucn represented by SEQ ID NO: 15; (B) hybridizing with the nucleic acid (a), wherein the hybridizing nucleic acid A nucleic acid encoding a chemically active Ucn-like peptide; (C) encoding a fragment of Ucn or an analog thereof, comprising a CRF antagonist or Is a nucleic acid that is a CRF-BP inhibitor.                       Detailed Description of the Preferred Embodiment   Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein are It has the meaning as commonly understood by those skilled in the art. Life used to define the peptide Nomenclature is Schroder & Lubke (“The Peptide”, Academic Press) Published (1965)). According to the usual expression method, the amino group is On the left, the carboxyl group is on the right. The standard three letter abbreviation is α- Represents an amino acid, and when the amino acid has an isomeric form, L-amino acids unless otherwise specified (eg, Ser = L-serine). varied The nucleotides found in the nucleic acids of the standard are the standard single sentence commonly used in the art. Displayed in alphabetical notation.   The term "homology" refers to matches between members of a sequence (eg, amino acids (AA) Level or nucleotide level). Book For the purposes of this application, "homologous" refers to at least about 70% identity, “Substantially homologous” refers to at least about 80% identity and “highly homologous” At least about 90%, or preferably about 95% or more. Points to a match. The term “homolog” generally refers to analogs derived from other mammalian species Protein, peptide and DNA sequences, in which case minor changes Occurs but has the same biological function in substantially the same manner due to homology You.   Proteins, polypeptides and peptides are referred to as α-amino groups of adjacent residues and α- Linear arrangement of amino acid residues linked together by peptide bonds between ruboxyl groups Used to display columns. The term polypeptide refers to peptides and proteins. It can be used interchangeably with the term white. Unless otherwise specified, proteins are generally Is used when referring to a sequence of about 75 or more residues.   The term "analog" refers to a sequence specifically set forth herein (eg, rUcn or Is any polypeptide having an amino acid residue sequence that is generally identical to hUcn) Where one or more residues are substituted (at least About 80%, preferably at least about 90% of the residues are the same), The ability to biologically mimic the parent molecule as described herein for a particular function Demonstrate power. Preferably most (if not all) of such substitutions Is a substitution of a residue with a functionally similar residue (ie, a conservative substitution). That's it Examples of such conservative substitutions include: one non-polar (hydrophobic) residue (eg, Isoleucine, valine, alanine, glycine, leucine or methionine) For non-polar residues: substitution of one polar (hydrophilic) residue for another (eg, For example, arginine instead of lysine, glutamine, serine instead of asparagine Instead of threonine): one basic residue (eg lysine, arginine or Substitution of another basic residue by histidine): and one acidic residue (ie The other alternative with spargic or glutamic acid). The word "conservative substitution" The phrase also states that the resulting polypeptide has an essential biological activity (eg, binding activity). Is chemically derivatized in place of the non-derivatized residue, provided that The use of groups is also included. For the purposes of this application, two peptides are Dies that differ from each other by conservative substitutions are considered to be substantially the same. It is. Examples of preferred conservative substitutions are shown in Table 1.   A "chemical derivative" is one or more chemically derived by the reaction of a side chain functional group. Refers to a subject polypeptide having two or more residues. Such derived polypeptides For example, a free amino group is an amine hydrochloride, a p-toluenesulfonyl group , A chloroacetyl group or a formyl group. Free carboxyl groups can be used as salts, methyl and ethyl esters or other types of Esters can be induced to form esters, or hydrazides. Free hide Roxyl groups are derived to form o-acyl or o-alkyl derivatives be able to. The imidazole nitrogen of histidine is N-im-benzylhistidine. Can be guided to form. Chemical derivatives also contain 20 standard amino acids And peptides comprising one or more naturally occurring amino acid derivatives of the present invention. For example, 4-hydroxyproline replaces proline and 5-hydroxylysine In place of lysine, 3-methylhistidine is replaced by histidine and ornithine Can be used in place of lysine. The peptides encompassed by the present invention also include As long as the modified peptide retains the requisite biological activity, its sequence is provided herein. Addition and / or deletion of one or more residues to each individual peptide And peptides having the formula:   As used herein, "pharmaceutically acceptable" and "physiologically acceptable" The terms are used interchangeably when they refer to compositions, carriers, diluents and reagents. In addition, the substance may cause undesired physiological effects (eg, nausea, glare, Discomfort) can be administered to mammals without causing discomfort.   As used herein, "biologically active fragment" refers to (a) N-terminal Of a peptide of the invention truncated at either the end, the C-terminus, or both. Or (b) rUcn or another species of highly homologous natural pep A nucleic acid corresponding to the coding region of the peptide at its 5 'or 3' end or both Refers to fragments that are shortened and are also useful in antisense applications. Describe Peptide fragment has substantially the same function or positive correlation as the parent peptide. It exerts its biological function.   As used herein, “modulates trans-activation of the CRF receptor” The phrase administers an effective amount of a physiologically acceptable Ucn-like peptide containing composition. Resulting in direct or induced antagonism of the CRF receptor (CRF-R) ( Modulating CRF action in mammals by means of competitive association .   CRF-R participates in G protein-coupled reactions to CRF and Ucn-like ligands. Used to refer to the receptor protein subtypes. CRF-R is heterogeneous The trimeric G protein cooperates with various intracellular enzymes, ion channels and transport substances. Play a role. The G protein associates with the receptor protein on the intracellular side of the plasma membrane. CRF-R Agonists that catalyze the exchange of GDP for GTP on the α-subunit ( G protein "activation"), its dissociation and various signal-transducing enzymes And one (or more) of the channels. G protein is excellent It stimulates specific effectors first, and thus the specificity of signal induction is It can be determined by the specificity of the white / receptor interaction. CRF-R protein Via the regulation of nitrate cyclase, and possibly via PI turnover To mediate signal induction. For example, CRF or Ucn binds to CRF-R When activated, adenylate cyclase increases intracellular cAMP levels. Causes a rise. Whether the test compound can increase intracellular cAMP An effective bioassay for examining is that the signal-inducing activity of the CRF receptor protein is In the presence of agonists or antagonists whose capacity to modulate is being investigated, Performed by culturing cells containing cDNA expressing the sceptor protein . Such transformed cells can be used to determine the efficacy of the test agonist or antagonist. Monitor for either increased or decreased intracellular cAMP levels Is done. Methods for measuring intracellular cAMP levels or cyclase activity Well known in the art.   The human CRF receptor was the first to be reported and was described by Chen et al. (R. Chen et al. N.A.S., 90: 8967-8971 (1993)) Cloned. This is called hCRF-R1 or hCRF-RA, It has 415 amino acids, the splice variant of which contains an insertion of 29 amino acids. La Approximately at the same time, CRF receptor was obtained from rat brain cDNA library. Separated by hybridization. This is called rCRF-R1, It has the 415 amino acid sequence described below as Column No. 10. This is Perr (M. Perrin et al., Endocrinology, 133: 3058-3061 (1993)). this is 97% identical to human CRF-R1 at the amino acid level, with only 12 amino acids Turned out to be different. Since then, this receptor has been found throughout the brain and pituitary gland. It was reported to be widely distributed and probably also present in the adrenal gland and spleen.   The second subclass of CRF receptor was discovered much more recently, Such a receptor is arbitrarily referred to herein as CRF-R2, but sometimes CRF-R2. -Called RB. Having the amino acid sequence set forth below as SEQ ID NO: 11, One such receptor is the clonin of the mouse heart cDNA library. And cDNA characterization. This receptor is 431 amino acids in length. Acid residues, the details of which are described in the literature (M. Perrin et al., P.N.A.S., 92: 296). 9-2973 (1995)). This receptor is referred to below as CRF-R2β, but once CRF-RBLWas called.   Another slightly shorter receptor of this second subclass is found in rat hypothalamus. Obtained separately from some cDNA libraries. This is referred to herein as CRF-R 2α and 411 amino acid residues as described below as SEQ ID NO: 12. With columns. Details of the cloning are described in the literature (T. Lovenberg et al., P.N.A.S., 92: 8). 36-840 (1995)), wherein mCRF-R2β mentioned above is described. As a putative protein of 431 amino acids likely to be a rat homolog of Contractile variants were also identified by PCR. This 431 amino acid sequence is represented by SEQ ID NO: : 13, which is understood to be homologous to mCRF-R2β. Will be. The distribution of Ucn throughout the rat brain indicates that CRF-R 2, which is consistent with being an endogenous ligand for Especially for R2, which is considered to be the major CRF-R in the brain, This is due to the fact that it shows much stronger binding affinity than that.   Ucn-like peptides (including rUcn and its analogs) are described in Example I below. Can be easily synthesized as described, and then individually tested for binding affinity can do. Binding affinity refers to the strength of the interaction between ligand and receptor You. To express the binding affinity for the CRF receptor, the peptides of the invention Tracer ligand with known affinity in binding assay experiments well known in the art (For example,125(I-labeled oCRF). like that The assay results indicate the affinity of each Ucn-like ligand for binding to the CRF receptor. Shows that it is Ki(Binding affinity suppression constant for such known standard) Represented by Ki(Binding affinity suppression constant) Determined using the radioligand of the “tracer” and thus the receptor of the tracer Or displacement from the binding protein is measured. KiRiff such a tracer Best described as a reference. These assays have relatively low concentration As long as it is carefully performed under certain conditions, such as with a putter, the calculated KiIs Dissociation constant KDIs substantially the same as Only one tracer sign (eg Radioactive iodine labeling) is required,iEspecially effective for testing It is. Dissociation constant KDOccupies 1/2 (50%) of binding site such as receptor Represents the concentration of ligand required to perform High binding parent for CRF receptor Certain compatible ligands bind at least 50% of the available binding sites Requires the presence of very few ligands, and as a result And the K for the receptorDThe value will be a small number. On the other hand, certain CRF receptors Ligands that have low binding affinity for binding to 50% of the binding sites Requires a relatively high level of ligand, resulting in a KD The value will be a large number.   K of about 10 nM or less for a particular receptor proteinDUc with An n-like peptide is a ligand (ie, a Ucn-like peptide) concentration of less than about 10 nM. To occupy at least 50% of the active binding sites of the receptor protein It means that it is necessary. Such values are based on radioiodinated standards and Less than about 0.8 nM receptor (about 10-20 pM receptor / mg membrane protein) It could be determined relatively accurately from the results obtained using. Preferred Ucn-like pair The peptide has a receptor concentration of at least 50% with a ligand concentration of about 10 nM or less. Binding affinity as required for occupation (or binding) of the pter binding site (or KD), And particularly preferred Ucn-like peptides have a binding of 0.1 nM or less. Has affinity. Generally, dissociation constants of about 5 nM or less are significantly stronger for parents. Showing compatibility and a K of about 1 nM or lessDShows a very strong affinity. For example , RUcn binds to CRF-R1 with extremely strong affinity andD= About 0.18 nM Further binds with the same strong affinity as CRF-R2β. Compare with CRF-R1 Have a substantially higher affinity for CRF-R2 and It is particularly beneficial to provide Ucn-like peptides that are selective in biological action It is thought. Because the CRF-R2 receptor is widely distributed throughout the body, Uc n has a substantially stronger effect than CRF in regulating many peripheral effects. Wax, or the naturally occurring peptide or fragment thereof is not immunogenic As such, Ucn may be a very physiologically beneficial agent.   These binding assays using the CRF receptor are easy to perform and furthermore To determine whether such a peptide is an agonist of CRF, To determine whether a shortening candidate is an effective antagonist of CRF, first identify It can be easily carried out using defined or synthesized peptides. like that Binding assays can be performed in a variety of ways, in conjunction with methods well known to those skilled in the art. Wear. Detailed examples of such assays are described in the literature (M. Perrin et al., En. docrinology, 118: 1171-1179 (1986)). A competitive binding assay using Ucn Candidate peptides are identified by each of the previously described receptors (ie, CRF-R1, CRF -R2 and CRF-R2α) to determine if they are effective agonists To determine if the candidate is also an effective antagonist Thus, assays using Ucn antagonists are also contemplated. In such an assay , Ucn are readily detectable substances (eg, radioisotopes (eg,125I) Or an enzyme or some other suitable tag). An example For example, a properly labeled agonist (eg,125I-Tyr0-Ucn) or appropriately Known antagonists (e.g.,125I- (cyclo 29-32) [D-Tyr11, Glu29 , Lys32-Ucn (11-40)) is used in such receptor assays. It is a particularly useful tracer to do. Such a receptor assay is based on C A sieve for a drug that has the potential to interact with RF and / or CRF receptors; Can be used.   Quite generally, the invention relates to the following based on SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 15: Ucn-like peptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence below (Including Ucn and analogs of Ucn) to provide its non-toxic salts: Here, Y is an acyl group having 7 or less than 7 carbon atoms (preferably acetyl R) or hydrogen, R1Is Asp-Asp or Asp-Asn or Asp Or Asn or desR1And then RFourIs Pro or Ser. N-end If the ends are truncated by the deletion of two residues, it is preferably acylated, For example, it is acetylated. These peptides are either oCRF or r / hCRF Properties somewhat similar to pharmacological properties and described below Has another characteristic. As described above, either hUcn or rUcn The above analogs having at least about 80% homology to the amino acid sequence Like peptides, but at least with either hUcn or rUcn Has 66% homology, and all or all but one of the substitutions are conservative substitutions Certain peptides are biologically active and have additional advantages over known CRFs it is conceivable that. Particularly preferred are those substantially equivalent to either hUcn or rUcn. Analogous (as defined above) and D-isomer amino acid substitutions and / or Have cyclizing bonds between the side chains of particular residues in the sequence (these are the CRF receptors Analogs that are known to increase ligand binding affinity).   In addition to the aforementioned general group of Ucn-like peptides, ligands that bind to CRF-R Two new groups based on relevant synthesis and testing performed in the general area Disclosed below.   The following group of Ucn analogs simply contain one or more conservative substitutions: There is no. Instead, the biologically active Ucn analog has the following amino acid sequence: Was found to be defined according to: Here, Y is an acyl group having 7 or less than 7 carbon atoms (preferably acetyl Or with hydrogen: RTwoIs Asp or Asn; RFourIs Pro or Ser; R19Is Glu or Ala; R29Is Arg, Glu, Lys or Orn; R32Is Gln, Lys, Orn or Glu; R36Is Ile, CaMeIle Or CaAt MeLeu; R38Is Asp or Ala;29 When Glu is R32Is either Lys or Orn and the side chain is an amide bond And R32When Glu is R29Is either Lys or Orn Thus, the side chains are linked by amide bonds; furthermore, D-Phe11Is another D -Isomeric amino acids, preferably D-isomers of natural amino acids, such as D-Leu , More preferably, if replaced by something other than D-Cys; 3 Glu at position 1 is a D-amino acid such as D-Glu, D-Asp, D-Arg, ( imBzl) D-His, β- (2naphthyl) -D-Ala, etc. Spit Subject to the requirement of the D-isomer of a natural amino acid other than D-Cys; Subject to the condition that one or two residues can be truncated at the ends. Particularly preferred Ucn Analogs include (cyclo 29-32) [Lys29, D-Glu31, Glu32] -Uc In n, Ucn is either hUcn or rUcn. About other analogs Will be described in the following examples. If 7 to 10 residues are truncated at the N-terminus, These Ucn analogs are effective antagonists.   Focused synthesis and testing over the past decade has shown that ligands for CRF receptors are , A significant change in biological activity (the analogue obtained is no longer a CRF receptor (Especially CRF-Rl) to indicate that it cannot bind and / or activate it. In the natural r / hCRF amino acid sequence without It has been shown that many changes can be tolerated. Of these focused early studies As a result, within certain limits, as described below, one in the Ucn amino acid sequence Two or three substitutions can be made. These substitutions are U that retains its physical activity and in some cases even has more desirable pharmacological properties This produces a cn analog.   If the amino acid sequence of Ucn is used for reference, these analogs will have the SEQ ID NO: : 8 or SEQ ID NO: 15 with only one, two or three substitutions. Accordingly, the present invention provides a Ucn analog having the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 14): provide:Here, Y is an acyl group having 7 or less than 7 carbon atoms (preferably acetyl Or) with hydrogen: Xaa1Is Asp, Glu or Gln; XaaTwoIs Asn , Asp, Glu or Gly; XaaFourIs Ser or Pro; XaaFiveIs In Leu, Ile or Met; Xaa7Is Ile or Leu; XaaTenIs At Thr or Ser; Xaa11Is Phe or Leu; Xaa12Is His Or Glu; Xaa13Is Leu or Met; Xaa16Is Thr, Asn, With Glu or Lys; Xaa17Is Leu, Met or Val; Xaa18Is In Leu or Ile; Xaa19Is Glu Is His; Xaa20Is Leu, Met, Ile or Arg; Xaatwenty oneIs A la, Glu or Thr; Xaatwenty twoIs Arg or Lys; Xaatwenty threeIs heaven Any of the natural amino acids, and preferably Thr, Ser, Ala, Ile, Met, Val, Asn, Gln, Gly, Lys, His, Leu, Glu Or Asp, Xaatwenty fourIs Gln, Glu or Asp; Xaatwenty fiveIs a natural Any of the amino acids, and preferably Ser, Thr, Ala, Ile, Met , Val, Asn, GlnN, Gly, Lys, His, Leu, Glu or In Asp; Xaa26Is Gln, Leu or Glu; Xaa27Is Arg, Al a or Lys; Xaa28Is Glu or Gln; Xaa29Is Arg or Gln; Xaa31Is any of the natural amino acids, and preferably Ala, I le, Met, Val, Asn, Gln, Gly, Lys, His, Leu, G Lu or Asp; Xaa32Is any of the natural amino acids, and preferably Ala, Ile, Met, Val, Asn, Gln, Gly, Lys, His, With Leu, Glu or Asp; Xaa35Is Ile, Lys, Leu or As n; Xaa36Is Ile, Tyr, Met or Leu; Xaa37Is Phe, In Leu or Met; Xaa38Is Asp or Glu; Xaa39Is Ser, On Ile, Glu or Thr: Plus Xaa40Are Val, Ile, Phe and Is Ala: less than 3 residues differing from the amino acid sequence of hUcn or rUcn Subject to the condition that one or two residues at the N-terminus can be further shortened . Furthermore, if the N-terminus is shortened by 7 to 10 residues, these Ucn Analogs constitute effective antagonists.   The Ucn analogs of the present invention can be chemically synthesized by any suitable method, Such methods include, for example, complete solid phase, partial solid phase, fragment enrichment or Classic solution addition.   Ucn can also be used in recombinant DNA technology if the analog contains only natural amino acids. It can be synthesized by surgery. The amino acid sequence of rUcn (SEQ ID NO: 8) is Deduced from partial cDNA clones isolated from the human brain cDNA library. Was. The native rat nucleic acid sequence encoding Ucn (SEQ ID NO: 9) is shown in Table 2 below. Show. An additional codon encoding glycine at the end of the native sequence is rUc Expected due to amidation of C-terminal of n.   The nucleic acid encoding rUcn is used as a probe to encode mature hUcn. Nucleic acids were isolated from a human genomic placental library. Coat mature Ucn peptide The portion of the natural human nucleic acid sequence (see SEQ ID NO: 16) that is encoded is shown in Table 2A below. , An additional code encoding a terminal glycine expected for C-terminal amidation With   Syntheses using recombinant DNA technology for the purposes of this application Appropriate use of isolated nucleic acids encoding Ucn or a suitable analog as is well known in the art It will be understood that it is necessary to As described in detail below, Ucn peptide is a suitable regulatory linked nucleic acid encoding a Ucn-like peptide. A microorganism is transformed with an expression vector containing the sequence, It can be obtained by expressing the Ucn peptide in a transformed microorganism. U Because cn-like peptides are relatively short (about 40 residues or less), they are chemically synthesized. Or chain extension synthesis seems to be the method of choice at this time . Analogs of hUcn or rUcn having one or more substitutions are in this form And can be easily synthesized and tested for biological activity in a straightforward manner. The specific biological effect of the substitution can be determined. Of such a peptide What is common to chemical synthesis is the appropriateness of labile side groups on various amino acid moieties. Protection by various protecting groups. This protecting group is used until the group is completely removed. Thus, the occurrence of a chemical reaction at the unstable portion is prevented. More general Protects the alpha-amino group on amino acids or short peptide fragments On the other hand, the substance itself reacts with a free carboxyl group to form a chain. Followed by the selective removal of the alpha-amino protecting group and the The following reaction takes place. Therefore, it has a side chain protecting group as one step of the synthesis. Amino acid residues arranged in a desired sequence in a peptide chain having these various residues Intermediate compounds containing each of the following are commonly prepared.   Thus, in such chemical synthesis, intermediates having a protected amino acid sequence, such as For example, the following are formed based on hUcn SEQ ID NO: 15 (Formula II): (Or its N-terminally truncated variants appropriately).   Where X1Is hydrogen or an alpha-amino protecting group. X1Represented by Alpha-amino protecting groups are known in the art for one-step polypeptide synthesis. It is known to be useful in the field. X1Alpha-A included in Types of mino protecting groups include (1) acyl-type protecting groups such as formyl, acrylyl (A cr), benzoyl (Bz) and acetyl (Ac), which are preferably Used only at the N-terminus; (2) aromatic urethane-type protecting groups such as benzyl Xycarbonyl (Z) and substituted Z, such as p-chlorobenzyloxycarbonyl , P-nitrobenzyloxycarbonyl, p-bromobenzyloxycarbonyl , P-methoxybenzyloxycarbonyl; (3) aliphatic urethane protecting group, eg For example, t-butyloxycarbonyl (BOC), diisopropylmethoxy carbonyl , Isopropyloxycarbonyl, ethoxycarbonyl, allyloxycarbo (4) cycloalkyl urethane-type protecting group, for example, fluorenylmethyloxy Cicarbonyl (FMOC), cyclopentyloxycarbonyl, adamantyl Xycarbonyl and cyclohexyloxycarbonyl; and (5) thioure Tan-type protecting groups such as phenylthiocarbonyl. Removal of alpha-amino protecting group When an acid catalyst is used, the preferred alpha-amino protecting group is BOC However, FMOC is preferred for synthesis using base catalyzed removal means. In this case, More acid-labile side chain protecting groups (t-butyl esters or ethers as in BOC) ) Can be used.   XTwoIs a protecting group for hydrogen or the hydroxyl group of Thr or Ser , Preferably acetyl (Ac), benzoyl (Bz), tert-butyl, tri Phenylmethyl (trityl), tetrahydropyranyl, benzyl ether (Bz 1) or 2,6-dichlorobenzyl (DCB). Most preferred protecting groups are Bzl.   XThreeIs a protecting group for hydrogen or the guanidino group of Arg, preferably nitro B, p-toluenesulfonyl (Tos), Z, adamantyloxycarbonyl and And BOC. Tos is preferred when using BOC, and 4-s Methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl (MTR) or penta Methylchroman-6-sulfonyl (PMC) is preferred when using FMOC .   XFourIs a protecting group for hydrogen or a side chain amino group of Asn or Gln; Xanthyl (Xan) is preferred. Asn or Gln is preferably Conjugated without side-chain protecting groups in the presence of droxybenzotriazole (HOBT) .   XFiveRepresents hydrogen or the β or γ-carboxyl group of Asp or Glu. Ester-forming protecting groups, preferably cyclohexyl (OChx), benzyl (OBzl), 2,6-dichlorobenzyl, methyl, ethyl and t-butyl ether It is a stet (ot-Bu). Chx is preferable in the case of the BOC method, and ot-Bu Is preferred in the case of the FMOC method.   X6Is a protecting group for hydrogen or the side chain imidazole nitrogen of His, such as Tos You.   The choice of the side chain amino protecting group depends on whether the protecting group is deprotected during the synthesis of the alpha-amino group. It is not important except when the group is not removed. Therefore, Alf The a-amino protecting group and the side chain amino protecting group are not the same.   X7Is NHTwo, A protecting group (eg an ester) or a solid resin in solid phase synthesis A fixed bond of the type used to link peptides synthesized to a support. You. Preferably, this fixed bond is represented by the following formula:   -NH-benzhydrylamine (BHA) resin support, and   -NH-paramethylbenzhydrylamine (MBHA) resin support. Removal from BHA or MBHA resin allows the amide addition form of Ucn-like The peptide is obtained directly. By using methyl derivatives of such resins If desired, corresponding equivalent methyl-substituted amides can be prepared. Ma Alternatively, as is well known in the art, using a suitable resin support, this is also equivalent. Can be prepared.   X in the intermediate formula1, XTwo, XThree, XFour, XFiveAnd X6At least one of Is a protecting group. Selection of unique side-chain protecting groups to be used in the synthesis of these peptides Alternatively, the following rules are followed: (a) the protecting group must be stable to the reagent And the reaction conditions to remove the alpha-amino protecting group at each individual synthesis step. (B) the protecting group retains its protective properties (C) the protecting group must be a peptide It must be able to be removed at the end of the synthesis under reaction conditions that do not change the chain.   The N-terminal acyl group of the Ucn-like agonist peptide (which is represented by Y) has Acetyl, formyl, acrylyl and benzoyl are preferred. Further still Removal of the terminal residue or the first two N-terminals of the N-terminal Removal of the residue reveals its biological ability relative to its function as a Ucn agonist. The N-terminus can be slightly shortened without significant effect. More In such a case, it is preferable to perform acylation of the shortened N-terminal residue. Good. A wider N-terminal truncation by removing the sequence of 7 to 11 residues Thus, as described below, CRF-R is strongly activated without activating the receptor. A binding Ucn antagonist is produced.   To produce a peptide generally defined by Formula I or an analog thereof, Provided are: (a) an intermediate peptide of Formula II or an analog thereof X, wherein each is either hydrogen or a protecting group1, XTwo, XThree, XFour, XFiveAnd X6And a protecting group or a resin support or NHTwoFixed against X that is any of the bonds7At least one protecting group is present; b) cleaving the protecting group or fixed bond from the intermediate peptide of formula II and further (c) 3.) If desired, convert the resulting peptide to its non-toxic salt.   If the peptides of the invention are produced by chemical synthesis, they are preferably, for example, Refield (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1964)) Prepared using such solid phase synthesis, but other equivalent chemical syntheses known in the art may also be used. It can be used as described above. Thus, Ucn-like peptides are directly Manufactured in a simple manner and subsequently can be easily tested for biological activity. this child Refers to the facile production of Ucn-like peptides that are analogs of hUcn or rUcn. Promote evaluation. Solid phase synthesis preferably releases protected alpha-amino acids By conjugating to a carboxyl group and conjugating to an appropriate resin, It is possible to start from the C-terminus (U.S. Pat. No. 4,244,946 (Rivier et al., 1981 Jan.). Published on March 21))). The synthesis of Ucn consists of methylene chloride and dimethyl Using alpha-amino protected Val with BHA resin with formamide (DMF) You can start by letting it work. BOC-Val to resin support Following conjugation, trifluoroacetic acid (TFA) in methylene chloride, TFA alone or Is used with HCl in dioxane to remove this alpha-amino protecting group. Can be Preferably, 50% by volume of TFA in methylene chloride is 0-5 times Used with 1% of 1,2 ethanedithiol. Deprotection between about 0 ° C and room temperature Perform at temperature. Other standard cleavage reagents and specific alpha-amino protecting groups Removal conditions can be used according to the literature (Schroder & Lubke, “The Pep tides ", 1: 72-75 (Academic Press, 1965)).   After removal of the alpha-amino protecting group of Val, the remaining alpha-amino protecting The amino acid and side-chain protected amino acid are conjugated one step at a time in the desired order, To obtain the compound. Instead of adding each amino acid separately during synthesis, use a solid-phase reactor. Some of them may be conjugated to each other before addition. Choosing the right conjugate reagent Alternatives are known in the art. Particularly suitable as conjugating reagents are N, N'- Dicyclohexylcarbodiimide and N, N'-diisopropylcarbodiimid (DICI).   Activating reagents used in solid phase synthesis of the peptides of the invention are well known in the peptide art. is there. Examples of suitable activating reagents are carbodiimides, such as N, N'-diisopropyl Rucarbodiimide and N-ethyl-N '-(3-dimethylaminopropyl) ca Rubodiimide. Other activating reagents and their use in peptide conjugation (Schroder & Lubke, supra, Chapter 3: Kapoor, J. et al. Phar. Sci., 59: 1-27 (1970)). p-Nitrophenyl ester (ONp) is also It can be used to activate the carboxyl terminus of Asn or Gln for conjugation. Wear. For example, BOC-Asn (ONp) is a 50% solution of DMF and methylene chloride. % Conjugation with monovalent HOBt in a 1% mixture. No DCCI is added.   Each protected amino acid or amino acid sequence is introduced into the solid-state reactor in about 4-fold excess, Conjugate is dimethylformamide (DMF): CHTwoClTwoIn the (1: 1) medium Is in DMF or CHTwoClTwoPerformed alone. If conjugation is performed manually, The completion of the conjugation reaction at each stage of the synthesis is determined by the ninhydrin reaction as described in the literature. (E. Kaiser et al., Anal. Biochem, 34: 595 (1970)). Conjugate If incomplete, remove the alpha-amino protecting group before conjugating the next amino acid This conjugation step is repeated first. Conjugation reactions are described by Rivier et al. Beck using a program such as that reported by Biopolymers, 17: 1927-1938 (1978). It may be carried out automatically by a Mann 990 automatic synthesizer.   After completion of the desired amino acid sequence, the intermediate peptide is treated with an appropriate cleavage reagent. The tide is removed from the resin support. The cleavage reagent is, for example, liquid hydrogen fluoride, which is Not only is the peptide cleaved from the resin, but all remaining side-chain protecting groups (XTwo, XThree , XFour, XFiveAnd X6) And an alpha-amino protecting group X1(It's the final pepti (If it is not an acyl group intended to remain in the bond). Fluoride for cutting If hydrogen is used, preferably anisole or cresol and methyl sulfide Ethyl is added to the reaction vessel as a scavenger. N-terminal BOC protecting group Is preferably trifluoroacetic acid (TFA) / Cleaved with ethanedithiol.   Ucn-like peptide having a length of about 40 residues, or a fragment or antagonist thereof Determining which of the substance variants has the desired pharmacological properties is straightforward. Is performed in a typical manner. First of all, the assay is for different CRF receptors. Performed to determine the effect of the candidate agonist or antagonist peptide, followed by The ability of the peptide to promote or suppress ACTH production is determined. CRF-BP blockade The fragment that functions as a substance includes hCRF-BP and a known labeled ligand. Is also assayed by an inhibitory binding assay using   Candidate peptides are described in Perin et al. (M. Perrin et al., Endocrinology, 118: 1171-1179 (198 Using the assay described in 6)), the binding uptake by the various CRF receptors was described. Easy to evaluate with Say. Binding assays using human CRF-R1 are preferred Is carried out using the radioligands oCRFs themselves. CRF-R1 receptor Such a binding assay utilizing the method described by Chen et al. (Chen et al., P.N.A.S., 9 0 (cited above)).   A direct assay using a monolayer culture of rat ventral pituitary cells is a candidate Tide functions as a CRF agonist and activates the CRF receptor in such cells To determine whether or not it stimulates ACTH secretion. Can be. The methods used are generally described in the above-cited title (Endocrinology, 91). Is what it is. Challenges such as oCRF to investigate the properties of antagonists A very similar assay is used with doses.   It has a high affinity for human CRF binding protein, and Of peptides that compete with endogenous CRF and Ucn for binding of Vivo administration effectively blocks CRF-BP. This makes it available Higher levels of endogenous CRF and Ucn remain, and the whole body, especially And / or their normal organisms in local areas where CRF-BP is present Can perform biological functions.   More specifically, fragments of Ucn or analogs of Ucn (about 19 To 28 residues) have a very strong affinity for hCRF-BP, The binding to the receptor generally shows a relatively low tendency. As a result, this Inhibitory fragments from endogenous CRF and / or Ucn from specific regions of the body Of CRF and / or Ucn in vivo organisms Can be administered to stimulate a biological effect. In some cases, CRF or Or it may be beneficial to administer with Ucn or an agonist thereof. These hula The unique properties of GMENT are minimal in potentially unwanted immunological side effects. Or be totally excluded. They are also antagonists Administered with the antibody, has an antagonist with a correspondingly high binding affinity for hCRF-BP. Anti-substances can be prevented from being excluded from the target area. These inhibition flags May accelerate labor, stimulate the respiratory system, overcome obesity, Alzheimer's disease and Useful as a therapeutic measure to offset the effects of sexual fatigue syndrome, preferably sent to the brain Is administered in such a way as to be achieved.   Ucn peptide is a diagnostic method for detecting Ucn levels present in body samples Together with the inoculum to prepare an antibody that produces an immune reaction with the Ucn epitope Can be used. Antibodies raised against Ucn are used for diagnosis, treatment, etc. Can be Such an antibody may comprise Ucn or a fragment thereof as an antigen. Can be prepared using standard techniques well known to those skilled in the art. The present invention The body typically treats mammals (eg, rabbits, sheep, goats, etc.) with Ucn or the like. Immunized with an inoculum containing a fragment of It is produced by inducing the production of antibody molecules with immunospecificity.   An antibody that recognizes Ucn has a complete 40 residue amino acid sequence or at least about Generated for either 5 or preferably 6 synthetic fragments It is. For example, such antibodies may have six N-terminal residues or six C-terminal residues or Can be made to an internal sequence (eg, a sequence surrounding residues 18-23). Like that Antibodies bind Ucn and can therefore be used to indicate their presence. Thus, such antibodies are useful in assays. Furthermore, these Some of the antibodies bind Ucn and inactivate it biologically. Moreover Such antibodies can be administered to animals to neutralize endogenous Ucn. In cases where endogenous antibodies are produced that bind to Ucn, short antibodies derived from Ucn may be used. The amino acid sequence can be administered as an antibody inhibitor. Creating such blocked antibodies To produce a complete 40 residue sequence or to create a region of particular interest. Short peptide sequences that make up the region can be synthesized. Such a synthetic single chain pair The peptide is generally conjugated to a large carrier molecule, which is then conjugated to a rabbit or Used as an inoculum to induce the immune system of mammals such as sheep. Such polychrome Further details on the production of immunogenic antibodies are detailed in U.S. Pat.No. 4,864,019 (9/5/89). ing. Wants to produce monoclonal antibodies instead of polyclonal antibodies Similar inoculation using hybridoma techniques already established in the art. It can be made in a straightforward manner using an object. Representative monoclonal antibodies For details on production see U.S. Pat.No. 5,032,521 (7/16/91) and U.S. Pat. No. (9/24/91).   Antibodies so produced can be used in human or other mammalian body samples (eg, Diagnostic methods and systems for detecting Ucn levels present in, for example, tissue or body fluids). Can be used. Anti-Ucn antibodies are also well known in the art for details. For immunoaffinity purification or affinity chromatography purification of Ucn Can be used. Furthermore, anti-Ucn antibodies can be used in human therapeutics. Wear. In addition, DNA encoding such antibodies is injected via gene therapy. Injection to produce the desired antibody in the patient's body, or, if appropriate, to seal the antibody. Chain material can be provided.   Amino acid, a biological messenger of 41-residue CRF in rat and human The absence of evolutionary deviations with respect to the acid sequences (these sequences are identical) Mammalian species such as humans, cows, pigs, sheep, goats, rats, dogs, cats, chicks Conserved regions in the corresponding amino acid sequence of Ucn in humans, monkeys, rabbits, etc. Suggests the probability of The consequence is that Ucn, a species of mammal Once the nucleic acid sequence of the present invention, i.e., a significant portion of the rat sequence disclosed herein, When obtained, various naturally occurring nucleic acid sequences of other animal species that encode homologs are available. Practice to get the line. Homologs include, for example, CRF binding proteins (Potter et al., Nature, 349: 423-426 (1991)). The cDNA coding region of CRF binding protein specifies the coding region of rat cDNA. It had sufficient homology with the latter to the extent possible. First disclosed nucleic acid sequence The sequence (SEQ ID NO: 9) is from the native rat species and is an expression that expresses the Ucn peptide. In addition to being useful as vectors, it also has the corresponding respective Uc It is also useful to obtain DNA from other species of mammals that encode the n-peptide. This In view of the above, obtaining the corresponding mammalian sequence as is currently known in the art. For complete nucleic acid sequences or nucleic acid sequences of at least about 14 nucleotides in length Either can be used as a hybridization probe. Likewise In order to amplify nucleic acid sequences of other mammalian species using appropriate DNA sources, Primers based on the nucleic acid sequence of PCR are used in PCR (polymerase chain reaction) technology Can be   As used herein, nucleic acid "probes" may include the 14 or 14 shown in SEQ ID NO: 9. Or at least the same (or complementary) to any of the contiguous bases And 14, preferably at least 20 or more nucleobases of consecutive bases It may be a single-stranded DNA or RNA having a tide sequence.   Labeled nucleic acid encoding Ucn or a fragment thereof may be a member belonging to Ucns. CDN for another novel nucleotide sequence encoding a novel mammalian sequence of A library, genomic library, etc. Can be. Such screening is initially stringent (high (Requiring high sequence homology). This condition depends on the temperature Is about 42.5 ° C., the formamide concentration is about 20%, and the salt concentration is about 5 × SSC ( standard saline citrate). 20 × SSC is 3M sodium chloride, 0.3 M sodium citrate (pH 7.5). Such conditions require perfect homology Allows identification of sequences with substantial similarity to probe sequences without requiring Will. "Substantial similarity" refers to nucleic acids that share at least about 50% homology. Means a nucleotide sequence. Sequences having at least 70% homology with the probe A hive that identifies only those sequences while distinguishing sequences with lower homology to the probe It may be desirable to select the redidation conditions. Such conditions are: The stringency used should be such as to exceed the above conditions, as is well known in the art. Is achieved by increasing the degree of   For example, using established methods well known to those skilled in the art (“Molecular cloning: Manual (Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Sambrook et al., 2nd edition, (19 89), Chapter 8: Construction and Analysis of cDNA Library of cDNA Libraries)), complete SEQ ID NO: 9 or at least about 14 in length A portion of which is 17 or 20 nucleotides into a mammalian genomic library Or human and mammalian libraries The same type of nucleic acid encoding Ucn can be identified and separated from other species. About 1 O having 4 or 17 or 20 nucleotides or longer Ligonucleotide sequences can be prepared by conventional in vitro synthesis techniques. Professional Screening using such oligonucleotides as probes is described in Sambrook (Supra, Chapter 11, pp. 11.45-11.57), preferably at high Under the same conditions.   As indicated above, one particular species of mammal encodes a particular peptide hormone. Possessing a native DNA sequence requires the entry of a homologous DNA sequence from another mammalian species. Make it possible to handle. Nucleotide sequences encoding Ucn peptides of other species Sequence isolation often involves genomic or cDNA libraries (Uc (made from RNA isolated from tissue containing n) You. If such sources are available, the intron / exon boundary is To avoid any problems that may arise when trying to decide, Ucn It is common to generate cDNA for the isolation of nucleotide sequences encoding preferable. Libraries can be made in eukaryotic or prokaryotic host cells. Widely available cloning vectors (eg, plasmids, cosmids, phage Appropriate for the separation of nucleotide sequences encoding Ucn peptides Genetic libraries can be created.   Target nucleotide using a probe based on the sequence of a known nucleotide sequence Methods for screening a genetic library for the presence of sequences are described above ( Sambrook et al., Chapter 11). In the current situation, such Probes for screening genetic libraries include radionuclides, enzymes Length rat nucleotide sequence labeled with, biotin, fluorescence, etc., SEQ ID NO: It would be preferable to use No. 9   Hybridization involves hydrogenation similar to the naturally occurring bonds in chromosomal DNA. Interconnection of the complementary strands of the nucleic acids via linkage (ie, sense: antisense strand or Means probe: target DNA). One of ordinary skill in the art can Easily vary the stringency levels used for bridging Can be As used herein, the term "high stringency" The phrase refers to a target nucleic acid that has at least about 80% homology to the target nucleic acid. It refers to conditions under which nucleic acids can be bound. Such stringency conditions Examples are 50% formamide, 5x Denhardt's solution, 5x SSPE, 0.2% S Hybridization in DS (42 ° C.) followed by 0.2 × SSPE, Conditions that are at least comparable to washing in 0.2% SDS (65 ° C.). Denha Ruto's solution is described in "Molecular Cloning: A Lab oratory Manual) "(Sambrook et al., (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Pre ss) and is well known to those skilled in the art. Other suitable hybrids that can be used A zation buffer is also present. Requires about 90% homology to target DNA It may be preferable to use stringency conditions that are as follows.   As an example, the human form of Ucn is cloned from a human placental genomic library. I was able to. Human placenta gene in EMBL3SP6 / T7 vector (Clontech) About 0.6 × 10 from Nom Library6Of phage plaques from rat Ucn By hybridization using a probe corresponding to the mature peptide region Screened. 160 bp encoding the mature peptide of rat Ucn Lobes were synthesized by PCR using the following oligos: Sense: 5'-TGCAGG CGAGCGGCAACGACGAGACGA-3 'and antisense: 5' -ATACGGGGCGATCACTTGCCACCCGAG-3 'and [ α32P-dCTP]. Hybridization is performed using a standard containing 20% formamide. Performed at 42 ° C. with buffer. Final wash at 42 ° C. with 2 × SSC / 0.1% SDS Conducted in Phage DNA from individual positive plaques for cloning Purification was followed by subcloning with pBluescript (Strategene). Dideoxy Sequencing was performed using a Sequenase kit (US Biochemical).   Genomic clones isolated from the library containing the human Ucn gene are about 15 kb insertion size. For the precursor and mature peptide regions of human Ucn A number of sequences of the inserted base pairs were determined in the region of interest (see SEQ ID NO: 16). Mature Mature human Ucn pep first sequenced compared to rat Ucn peptide The partial nucleotide sequence encoding the tide is shown in Table 2A above. Success The nucleotide sequence of mature human Ucn peptide is the nucleotide sequence of rat Ucn peptide. It has 88% similarity to the peptide sequence. Amino acid sequence encoded by this region Shows 95% similarity between human and rat Ucn. Mature human peptide ( SEQ ID NO: 15 (see residues 83-122) is a total of 40 residues of 124 residues. You.   Another suitable technique that can be used in the current context is to obtain from rat Ucn nucleic acid. Of primers based on sequence mismatches and polymerase chain reaction for amplification of target nucleic acids Requires the use of PCR. The target is then Can be separated using a unique hybridization probe. Further Target in terms of its entire sequence and the polypeptide encoded thereby. Analyze.   In order to synthesize the peptide of the present invention by recombinant DNA, a desired peptide is synthesized. The encoding double-stranded DNA can be constructed synthetically. PCR technology is now May be the best method for producing DNA sequences, No. 9 (DNA encoding Ucn) produces polypeptides in certain types of organisms Can be designed with some codons that are particularly effective to manifest . That is, development in that type of organism (functioning as a host for the recombinant vector) In fact very effective codons will be used in the selection. However, probably Or slightly less efficient, but any of the correct codon sets encodes the desired product. Will do. Codon choice can also be influenced by vector construction Will be done. For example, following insertion of a coding sequence, the vector may When produced using restriction enzymes that cleave the position, such Placing restriction sites would have to be avoided. With the recombinant vector The transformed host organism cuts at such restriction sites within the DNA strand. If it is known to produce a restriction enzyme, such a DNA coding sequence Those skilled in the art will, of course, avoid arranging various parts.   An isolated nucleotide sequence encoding Ucn and its analogs comprises recombinant DNA Purified by either the method of n can be used to produce n. The term “separated” refers to a person Manufactured by force, separated from its natural (in vivo) cellular environment, A nucleotide sequence or polynucleotide that is present in the substantial absence of a biological molecule. Refers to a peptide sequence. As a result of this human intervention, the recombinant of the present invention, Large amounts of substantially pure DNA, RNA, polypeptides and proteins Which are DNA, RNA, polypeptide or protein Are not useful when naturally occurring, e.g., excellent drugs or compounds. Helps identify things. Conventional methods for joining synthesized non-chromosomal nucleic acid sequences Oligonucleotides by any convenient method (eg, as described in Sambrook et al., Supra). The tide is built. Sense and antisense sequences up to about 70 nucleotide residues in length The oligonucleotide strands are combined, preferably on an automated synthesizer well known in the art. To achieve. Sense and antisense oligonucleotides are linked via complementary base pairs. Bond to each other by hydrogen bonds, thereby forming a duplex (mostly (Including gaps in the strands) These oligonucleotides overlap The oligonucleotide chain is constructed as follows. Then, this gap in the chain Filling and further in the presence of a suitable DNA polymerase and / or with a ligase In both cases, oligonucleotide triphosphates are used to link oligonucleotides of each chain at the ends. Tie. As an alternative to such step-by-step construction of synthetic nucleic acid sequences, Fully-structured natural polypeptides obtained by screening libraries DNA or cDNA encoding the peptide is used. As indicated above, Preferably, amplification is performed by using PCR, followed by separation and purification. The obtained DNA is incorporated into the recombinant molecule.   The desired nucleic acid encoding the sequence to be inserted into the vector is preferably A linker at the end to facilitate insertion into restriction sites in the cloning vector You. In some cases, the coding sequence of the nucleic acid is desired as part of a fusion polypeptide. May be constructed to encode the peptide. In such a case, Sequence generally encodes an amino acid residue sequence that functions as a proteolytic processing site. End sequence. With this terminal sequence, the encoded polypeptide The peptide is proteolytically cleaved from the remainder of the fusion polypeptide. Nucleic acid The terminal portion of the sequence may also include appropriate start and stop signals.   After functionally inserting the nucleic acid coding sequence into the vector, the desired peptide is then Expressed by recombinant technology. “Functionally inserted” is well understood by those skilled in the art. The appropriate reading frame and direction as indicated. For example, complete U When making a genetic construct containing a cn reading frame, the preferred starting material is genotype. Of cDNA libraries encoding Ucn rather than library isolates Things. Typically, the Ucn coding sequence is inserted downstream from the promoter. , Followed by a stop codon. However, if desired, the cut is made later. Production such as hybrid proteins can also be used. Generally, production of Ucn Host-cell specific sequences that improve yield are used and appropriate regulatory sequences, e.g. Sensor sequence, polyadenylation sequence, and ribosome binding site Will be added.   Ucn production can be performed on both prokaryotic and eukaryotic cells, and is biologically and therapeutically possible. Provided are proteins for strategic use. Ucn synthesis is dependent on bacterial or yeast cell lines. Easily performed using either, while the synthetic gene is also used in higher animal cells. Can be inserted for expression in cells. Details in the above book (Sambrook et al.) As noted, the higher cells are, for example, Chinese hamster ovary (CHO) ) Cells or mammalian tumor cells. Some mammalian cells, for example, Can grow as peritoneal tumors and Ucn can be collected from peritoneal fluid. Nursing Notes on milk, baculovirus, bacterial and yeast expression systems The listing is shown in U.S. Pat. No. 5,210,274 (5/18/93).   The following examples demonstrate that Ucn, Ucn analog, Ucn flag Preferred chemical methods for synthesizing ment and Ucn antagonists are detailed.                                 Example I Of rat Ucn having a substitution value of about 0.1 to 0.5 mmol / g resin On MBHA hydrochloride resin (eg, available from Bachem, Inc.). Combination The synthesis was performed on a Beckman 990B automated peptide synthesizer, for example with the appropriate This is performed using a program. Conjugation of BOC-Val results in about 0.35 mmol of Val substitution per gram of resin. You. All solvents used are preferably inert gases (eg helium or nitrogen) Carefully degas by sparging, making sure no oxygen is present.   After deprotection and neutralization, the peptide chains are built on the resin step by step. In general, Using 1-2 mmol of the BOC protected amino acid in methylene chloride per gram of resin, One equivalent of 2 moles of DCCI in methylene chloride was added and conjugation of each additional residue was performed for 2 hours. Give. When BOC-Arg (Tos) is conjugated, 50% DMF and chloride A mixture of methylene is used. Bzl is a hydro for Ser and Thr Used as a protecting group for xyl side chains. The amide group of Asn or Gln is Xan Can be protected, but need not be. BOC-Asn or Is BOC-Gln, one equivalent of DCC in a 50% mixture of DMF and methylene chloride. And 2 equivalents of HOBt. Tos is the guanidi of Arg The amino group is further used to protect the imidazole nitrogen of His. Glu also Indicates that the side chain carboxyl group of Asp is protected by OChx. At the end of the synthesis The following composition is obtained:   1.5 g / g of peptide-resin to cleave and deprotect the resulting peptide ml anisole, 0.5 ml methylethyl sulfide and 15 ml hydrogen fluoride (HF) at -20 ° C for 20 minutes, then at 0 ° C for 1 hour 30 minutes. Treat the fat. After removal of HF under strong vacuum, the resin-peptide was dried in diethyl After washing with ether, the peptide amide was degassed with 2N aqueous acetic acid or water. Extract with a 1: 1 mixture of setonitrile and water. The extract is separated from the resin by filtration. Release and then freeze-dry.   Preparation or semi-preparation of this lyophilized peptide amide as described in the literature Purify by HPLC (Rivier et al., J. Chromatography, 288: 303-328 (1984); Hoeger Et al., Biochromatography, 2 (3): 134-142 (1987)). Chromatographic fractionation Carefully monitor by PLC, and only fractions that are shown to be substantially pure To   The intrinsic optical rotation of the separated and purified Ucn peptide was determined using the Perkin Elmer model 241 optical rotation. In total [α]D= -62.5 ° ± 1.0 (HTwoO and the presence of TFA C = 1) in 1% acetic acid without correction for). It has a purity higher than about 95% I do. Purity is further confirmed by mass spectrometry and capillary zone electrophoresis (CZE) I do. The mass spectrum of liquid secondary ion mass spectrometry (LSIMS) is Cs+gun Measured with a JEOL model JMS-HX110 dual focus mass spectrometer equipped with 10 kV acceleration voltage and 25-30 kV Cs+Use gun voltage. LSI The measured value of 4705.36 Da obtained using MS is a calculated value of 4705.52 Da. Matches the value.   To verify the correct sequence, the Ucn peptide was constantly boiled with HCl, 3μ 1 thioglycol / ml and 1 nmol Nle (as internal standard) Hydrolyze at 140 ° C. for 9 hours in a sealed vacuum tube. A standard amino acid analyzer Amino acid analysis of the hydrolyzate used shows the expected amino acid ratio, A 40-residue peptide structure having the predicted amino acid sequence constituting the sequence is obtained. It is confirmed that.   Provide labeled Ucn peptides for use in assays (including binding assays, etc.) In order to extend the synthesis and link Tyr and Asp at the N-terminus [Tyr0] -Uc This produces a 41 residue peptide designated as n. This is easy125I add iodine, It can then be used in diagnostic and drug screening assays.   It functions as a purified Ucn or CRF agonist, and additionally produces ACTH and / or Or to test the ability of another Ucn-like candidate peptide to promote secretion or secretion (Vale et al., Meth. Enzym., 103: 565-577 (1983); Endocrinology, 91: 562 (1972)). Primary culture of murine ventral pituitary cells dispersed as described generally in (. 15 × 106Cells / culture wells). These cultures were transformed with 2% fetal bovine blood. Β-PJ (reagent available from Kansa City Biochemicals, 0 / 5m 1 / well). On the morning of the fifth day of culture, 0.1% bovine serum albumin was added. The cells are washed three times with β-PJ, followed by incubation in the same medium at 37 ° C. for 1 hour. Subsequently, this culture was used as Ucn or its analog (containing 0.1% bovine serum albumin). (diluted with β-PJ). The incubation was terminated after 3 hours, at which time the culture was removed. Remove and store at −20 ° C. until ACTH radioimmunoassay. Radioimmune Say uses appropriate kits (eg, Diagnostlic Products Corporation (Los Angeles) (Commercially available from Texas, CA). Minute Lactation ACTH was measured using the Allfit computer program and the results were identical. Of triplicate bioassays ± standard deviation.   The rUcn peptide is active in cultured rodent pituitary cells with ACTH and β-endorf. It strongly stimulates the secretion of ind. rUcn is higher than r / hCRF or sorbazine It has strong biological capacity, about 0.043 ± 0.012 nM and about 0.23 nM, respectively. 033 ± 0.010 nM EC50About 0.006 ± 0.003 nM E compared to C50Having. rUcn also has stronger capabilities than oCRF. Furthermore, it Is also EC50Is 0.017 ± 0.003 soccer fish UI (sfUI ) More powerful. rUcn is also active in rats with ACTH and β-endorphin. Stimulates in vivo secretion of r / hCRF more strongly than r / hCRF. In fact, literature (Science, 218 : 377 (1982)) at a 1 μg / kg dose of rUcn. Measured plasma ACTH levels at 5 μg / kg dose of r / hCRF (422 ± 66 pg / Ml) is substantially stronger (659 ± 53 pg / ml). Like that The stronger effect lasts for one and two hours. Peripheral (eg intravenous) administration The peptide was also given a standard laboratory rat (approximately 25 0 to 275 g) resulting in a significant drop in mean arterial blood pressure. About 3.77 μg / k At doses of g, rUcn increases blood pressure by 2-3 times that of sfUI or r / hCRF, and For a long time.   Furthermore, cells expressing murine CRF-R1 and murine CRF-R2β Ability of Ucn to increase intracellular cAMP levels in cells expressing Chen et al., Expression Cloning of a Human Corticotropin Releasin g Factor (CRF) Receptor (Human corticotropin releasing factor (CRF) receptor Current cloning), P.N.A.S., 90: 8967-8971 (1993)). It was examined using rUcn is cAMP in cells expressing mCRF-R1. Slightly stronger than r / hCRF or sfUI in increasing levels Power. However, its effect utilizes cells expressing mCRF = R2β. It is even more dramatic in such assays. In this assay, the ED of rUcn50Is r / HCRF ED501.7 ± 0.4 nM and ED of urotensin500.7 0.18 ± 0.04 nM for 4 ± 0.1 nM. rUcn is also 0. ED of 5 ± 0.2 nM50Is more powerful than sorbazine.   The binding assay using cells expressing human CRF-R1 is described above (Chen et al. , P.N.A.S.). C stably expressed in CHO cells The affinity of the test peptide for RF-R1 and CRF-R2β was described like,125I- (Nletwenty one, Tyr32) Sheep CRF (for CRF-R1) Or [125I-Tyr0By competitive substitution of Ucn (for CRF-R2β) Decided. The data from at least three experiments were combined and the inhibition dissociation constant (Ki ) Values (95% confidence limit) were determined by Munson & Rodbard, Anal. Biochem., 107: 220-239 (1980)). K Roned hCRF-Rl is measured by competitive displacement of bound radioligand. Binds Ucn with high affinity when specified. rUcn KiIs the r / hCRF About 0.95 (0.47-2.0) nM, about 0.43 (0.23-0. 18) When compared to about 1.2 (0.54-2.5) of nM and sorbazine: It was found to be about 0.16 (0.08-0.32) nM. Furthermore, In similar stably transfected CHO cells expressing CRF-R2β, The difference is more dramatic. In this case, each result is 0.41 (0.26- 0.66) nM, 17 (10-29) nM, 3.0 (1.8-4.8) nM and And 2.0 (1.1-3.6) nM. The test results are also radioactive125I [N letwenty one, Tyr32-Competitive hCRF-BP ligand binding assay by oCRF When using a, rUcn is much stronger than r / hCRF and a factor of about 2 Binds to CRF binding protein (hCRF-BP) and is even stronger than sorbazine , Weaker binding than sfUI.Example IA (See SEQ ID NO: 15), described in Example I. Synthesize in an embodiment. LSIMS shows a value of 4694.31 Da, which is calculated This corresponds to the value 4694.51 Da. Using the ventral pituitary cell culture described in Example I In vitro studies on ACTH secretion showed that this peptide was better than r / hCRF. About three times as effective (i.e., 3.10 (1.41-6.65)). This Are also significant in mammals, including systemic blood pressure reduction and ACTH secretion stimulation. Vasodilation-has blood pressure lowering activity.                                Example IB Having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (see SEQ ID NO: 8) [Tyr0RUcn ( 1-40) are synthesized in the manner described in Example I. LSIMS shows a value of 4868.58 Da, which is a calculated value of 4668.58. It completely matches with Da. ACT using ventral pituitary cell culture described in Example I In vitro tests for H secretion show that this peptide is about twice as high as r / hCRF (I.e., 2.20 (1.28-3.88)). This peptide Also show significant vasodilation in mammals, including systemic blood pressure reduction and ACTH secretion stimulation -Has blood pressure lowering activity.                                Example IC [D-Tyr having the formula:0HUcn (1-40) is described in Example I. Synthesized in the manner described above. LSIMS shows a value of 4857.37 Da, which is a total The calculated value is equal to 4857.58 Da. The ventral pituitary cell culture described in Example I In vitro tests for ACTH secretion used showed that this peptide was r / hCRF About 1.25 times more effective (ie, 1.25 (0 60-2.54)). This peptide also reduces systemic blood pressure and And has significant vasodilator-blood pressure lowering activity in mammals, including stimulation of ACTH secretion.                                Example II [Ac-Pro having the amino acid sequence (see SEQ ID NO: 15)Three]- hUcn (3-40) is synthesized in the manner described in Example I, except that the N-terminus is After the removal of the BOC protecting group, acetylation is performed by treating with acetic anhydride. The obtained pe Peptides also stimulate the secretion of ACTH and β-END-LI, and reduce systemic blood pressure. Vasodilation, including below-causing blood pressure lowering activity.                               Example IIA (Cyclo29-30) [Ac-ProThree, D- Phe11, Glu29, D-Glu31, Lys32] -HUcn (3-40) Synthesized in the manner generally described in Example I, except that the N-terminus is free of the BOC protecting group. After removal, the mixture is treated with acetic anhydride for acetylation. Cyclic lactam linkages are U.S. Pat. Formed as described in Example I of 5064939. LSIMS shows a value of 4562.36 Da, which is a calculated value of 4462.42. Coincides with Da. ACTH secretion using ventral pituitary cell culture as described in Example I In vitro tests for, have shown that this peptide is approximately 6 times more effective than r / hCRF That is, it was 6.14 (2.83-14.05). The resulting pepti Also stimulates the secretion of ACTH and β-END-LI, causing a decrease in systemic blood pressure. Including vasodilation-causing blood pressure lowering activity.                               Example IIB A peptide having the amino acid sequence of ) [Ac-ProThree, D-ProFour, D-Phe11, Glu29, Lys32] -HU cn (3-40) is synthesized in the manner generally described in Example I except that the N-terminal The ends are acetylated by treatment with acetic anhydride after removal of the BOC protecting group. Ring The lactam linkage was formed as described in Example I of U.S. Pat. No. 5,064,939. It is. LSIMS shows a value of 4472.40 Da, which is a calculated value of 4472 . 44Da. ACT using ventral pituitary cell culture described in Example I In vitro tests for H secretion show that this peptide is about 10-fold higher than r / hCRF Effective (ie, 9.90 (4.48-22.85)). Got The peptide also stimulates the secretion of ACTH and β-END-LI, Vasodilation, including lowering-causing blood pressure lowering activity.                               Example IIC (Cyclo29-30) [Ac-ProThree, D- SerFour, D-Phe11, Glu29, Lys32] -HUcn (3-40) Synthesized in the manner generally described in Example I, except that the N-terminus is free of the BOC protecting group. After removal, the mixture is treated with acetic anhydride for acetylation. Cyclic lactam linkages are U.S. Pat. Formed as described in Example I of 5064939. LSIMS is 4462. A value of 33 Da is shown, which is consistent with the calculated value of 4462.42 Da. Example In vitro assay for ACTH secretion using ventral pituitary cell culture described in I Studies have shown that this peptide is approximately 5.75 times more effective than r / hCRF (ie, 5.69 (2 . 43-14.49)). The resulting peptide is likewise ACTH And vasodilation which stimulates secretion of β-END-LI and includes systemic blood pressure reduction Causes reduced activity.                               Example III HUcn (2-40) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 (see SEQ ID NO: 15) Is synthesized in the manner described in Example I. This peptide is Significant vasodilation in mammals including reduced physical blood pressure and stimulated secretion of ACTH-hypotension Has lower activity.                                Example IV [D-Phe11] -HUcn described in Example I Synthesized in the manner described above. This peptide is used to reduce systemic blood pressure and stimulate secretion of ACTH. Has significant vasodilator-blood pressure lowering activity in mammals, including:                                 Example V   Peptide agonist analogs of hUcn, described below, which are substantially identical to hUcn Are considered to have the same amino acid sequence).  Each of the aforementioned Ucn-like peptide agonists has reduced systemic blood pressure and ACTH levels. Has pronounced vasodilator-blood pressure lowering activity in mammals, including stimulation of secretion.                                Example VI   Combining another group of Ucn-like peptide agonists classified within the following amino acid sequences: Accomplish:   Wherein Y is an acyl group having 7 or less carbon atoms or is hydrogen R19Is Glu or Ala; R29Is Arg, GlU, Lys or Orn R32Is Gln, Lys, Orn or Glu; R36Is Ile, CaMeIl e or CaAt MeLeu; R38Is Asp or Ala; R29Is Glu R32Is either Lys or Orn, the side chains of which are linked by amide bonds. And R29Is either Lys or Orn;32Is Glu Provided that the side chains are connected by an amide bond. In this group, D-Phe11Is replaced with D-Leu or the D-isomer of another naturally occurring α-amino acid. Glu at position 31 is a D-isomer such as D-Glu, D-Arg, ImBzlD-His, etc., and N-terminal is shortened by 1 or 2 residues It may be.   These specific peptides are as follows. [Ac-Pro, D-Phe] -hUcn (3-40) [D-Leu, Ala] -hUcn [D-Phe11, Ala38] -HUcn [D-Tyr11, CaMelle36] -HUcn [D-Phe11, CaMeLeu36] -HUcn [Ac-Asp1, D-Phe11, Ala19.38] -HUcn (Cyclo 29-32) [D-Leu11, Glu29, Lys32] -HUcn (Cyclo 29-32) [D-Phe11, Glu29, Orn32] -HUcn (2- 40) (Cyclo 29-32) [Ac-ProThree, D-Phe11, Lys29, Glu32] -HUcn (3-40) (Cyclo 29-32) [D-Tyr11, Orn29, Glu32] -HUcn (3- 40) (Cyclo 29-32) [D-Phe11, Glu29, D-Glu31, Lys32]- hUcn (Cyclo 29-32) [D-Phe11, Glu29, D-Arg31, Lys32]- hUcn (Cyclo 29-32) [D-Tyr11, Glu29, ImBzD-His31, Ly s32] -HUcn   Each of the aforementioned Ucn-like peptide agonists has reduced systemic blood pressure and ACTH levels. Has pronounced vasodilator-blood pressure lowering activity in mammals, including stimulation of secretion.                               Example VII   Ucn-like peptide action classified within the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 14) Synthesize yet another group of drugs:  Wherein Y is an acyl group having 7 or less than 7 carbon atoms or hydrogen; Xa a1Is Asp, Glu or Gln; XaaTwoIs Asn, Asp, Glu or In Gly; XaaFourIs Ser or Pro; XaaFiveIs Leu, Ile or M et at; Xaa7Is Ile or Leu; XaaTenIs Thr or Ser; Xaa11Is Phe or Leu; Xaa12Is His or Glu; Xaa13 Is Leu or Met; Xaa16Is Thr, Asn, Glu or Lys; Xaa17Is Leu, Met or Val; Xaa18Is Leu or Ile; Xaa19Is Glu or His; Xaa20Is Leu, Met, Ile or A at rg; Xaatwenty oneIs Ala, Glu or Thr; Xaatwenty twoIs Arg or L in ys; Xaatwenty threeIs any of the natural amino acids, more preferably Thr, Se r, Ala, Ile, Met, Val, Asn, Gln, Gly, Lys, Hi s, Leu, Glu or Asp; Xaatwenty fourIs Gln, Glu or Asp Xaatwenty fiveIs any of the natural amino acids, more preferably Ser, Thr, A la, Ile, Met, Val, Asn, Gln, Gly, Lys, His, L eu, Glu or Asp; Xaa26Is Gln, Leu or Glu; Xa a27Is Arg, Ala or Lys; Xaa28Is Glu or Gln; Xa a29Is Arg or Gln; Xaa31Is any of the natural amino acids, even better Preferably Ala, Ile, Met, Val, Asn, Gln, Gly, Ly s, His, Leu, Glu, or Asp; Xaa32Is a natural amino acid Or more preferably Ala, Ile, Met, Val, Asn, Gln, At Gly, Lys, His, Leu, Glu, or Asp; Xaa35Is Ile , Lys, Leu or Asn; Xaa36Is Ile, Tyr, Met or L eu; Xaa37Is Phe, Leu or Met; Xaa38Is Asp or G lua; Xaa39Is Ser, Ile, Glu or Thr; furthermore, Xaa40Is Val, Ile, Phe or Ala; no more than 3 residues differ from hUcn And that the N-terminus may be truncated by one or two residues. Follow the matter.   The following individual peptides are synthesized:   Each of the aforementioned Ucn-like peptide agonists has reduced systemic blood pressure and ACTH levels. Has pronounced vasodilator-blood pressure lowering activity in mammals, including stimulation of secretion.   In the following group of examples, N-terminal truncated variants having antagonistic properties (eg, 7-10 Residues are shortened). Chemical properties and / or Ucn analogues All of the above statements regarding the synthesis of is believed to apply equally to these antagonists. And therefore will not repeat. That is, these antagonists are It is simply a N-terminal truncation variant. The individual peptides described in the examples below, Ucn on at least its CRF receptors, CRF-R1 and CRF-R2 Exhibit antagonistic biological properties with respect to the action of. In this regard, these Ucn antagonists Antibodies are similar to those disclosed as CRF antagonists in US Pat. Is believed to have at least general properties and uses.                            Example VIII Peptide Ucn (11-40) having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (see SEQ ID NO: 8) Synthesized in the manner described in Example I. Organisms as Ucn antagonists of candidate peptides Capacity, which may be indicated by its effective binding to the CRF receptor In order to evaluate the above, the above-mentioned assay (Endocrinologu, vol. 91, supra) is used. Performed in the presence of a challenge dose of sheep CRF. Such in this assay The efficacy of a novel candidate substance was demonstrated by using an extremely potent linear CRF antagonist, [D-Phe12, Nle21.38] -R / hCRF (12-41) (hereinafter referred to as standard antagonist) In a routine manner. Increase in mean arterial blood pressure as a result of iv injection In vivo tests to measure are also performed in a simple and straightforward manner. This Ucn ( 11-40) Peptides, like known CRF antagonists, increase mean arterial blood pressure Shows a pronounced vasoconstrictor activity in mammals that cause vasoconstriction.   This synthesis was repeated twice, Ucn (10-40) and [Ac-ThrTenU cn (10-40) was produced, but both peptides were used as organisms as Ucn antagonists. Biological activity.                                Example IX [D-Phe11] -Ucn (11-40) Synthesized in the manner described in Example I. Under the above conditions, the specific optical rotation is [α]D= Measure as −62 ° ± 1.0. LSIMS has a value of 3638.88 Da. And this is in agreement with the calculated value 3639.00 Da. As described in Example VIII Perform in vitro tests as described above. This test shows that this peptide is biologically active 0.551 (0.333-0.857) compared to the very potent standard antagonist The value was shown. This peptide has significant mammalian vasoconstrictor activity, Evoked an increase in pulse blood pressure, indicating that it was a Ucn antagonist.                                 Example X [D-Tyr having an amino acid sequence of11] -Ucn (11-40) Synthesized in the manner described in Example I. This peptide has significant mammalian vasoconstrictor activity. Caused an increase in mean arterial blood pressure, indicating that it was a Ucn antagonist . This peptide can also be effectively iodinated and used in screening assays and the like. Used [125ID-Tyr11] -Ucn (11-40).                                Example XI (Cyclo 29-32) [D-Phe11, Glu29 , Lys32-Ucn (11-40) was synthesized in the manner described in Example I, and Lactor prepared as described in Example I of Japanese Patent No. 5064939 (issued 11/121991) Cyclize the bond. Under the above conditions, the specific optical rotation is [α]D= -49 ° Measure as ± 1.0. LSIMS shows a value of 3593.97 Da. This is in agreement with the calculated value of 3593.97 Da. Ventral as described in Example VIII An in vitro test for ACTH secretion using pituitary cell cultures was performed using this peptide. Is about 10 times more effective than the standard antagonist (ie 10.34 (4.27-25.58)) Being showed that. This peptide also has significant mammalian vasoconstrictor activity and is associated with average arterial blood Evoked an increase in pressure, indicating that it was a Ucn antagonist.                               Example XII A peptide having the amino acid sequence of (Cyclo 29-32) [D-Tyr11, Glu29 , Lys32-Ucn (11-40) was synthesized in the manner described in Example I, and Lactor prepared as described in Example I of Japanese Patent No. 5064939 (issued 11/121991) Cyclize the bond. LSIMS shows a value of 3609.82 Da, which is Is in agreement with the calculated value 3609.96 Da. Ventral lower as described in Example VIII In vitro studies on ACTH secretion using pituitary cell cultures show that this peptide Is about four times as effective (ie, 4.01 (2.32-7.05)) as a standard antagonist. Was shown. This peptide also has significant vasoconstrictor activity in mammals, Evoked an increase in blood pressure, indicating that it was a Ucn antagonist. This pepti Is also iodinated for use in screening assays, etc.125I- D-Tyr11A cyclic analog is provided.                            Example XIIA A peptide having the amino acid sequence of (Cyclo 29-32) [D-Tyr11, Glu29 , D-Glu31, Lys32-Ucn (11-40) as described in Example I And as described in Example I of U.S. Pat. No. 5,064,939 (issued 11/121991). The created lactam bond is cyclized. This peptide is a significant mammalian vasoconstrictor Have activity and cause an increase in mean arterial blood pressure, which is a Ucn antagonist showed that. This peptide can also be iodinated for screening assays, etc. Used in125ID-Tyr11A cyclic analog is provided.                              Example XIII Amino acid distribution Peptide having a sequence (cyclo 29-32) [D-Phe11, Glu29, D-Gl u31, Lys32] -Ucn (11-40) was synthesized in the manner described in Example I, A lacquer prepared as described in Example I of National Patent No. 5064939 (issued 11/121991) Cyclize the tom bond. LSIMS shows a value of 3593.80 Da. This is in agreement with the calculated value of 3593.97 Da. Ventral as described in Example VIII An in vitro test for ACTH secretion using pituitary cell cultures was performed using this peptide. Is approximately 4.75 times more effective than the standard antagonist (i.e., 4.72 (2.19-10.0). 0)). This peptide also has significant mammalian vasoconstrictor activity. Caused an increase in mean arterial blood pressure, indicating that it was a Ucn antagonist . This synthesis was repeated twice, replacing D-Phe with D-Leu and D-His. Replace with These peptides show similar biological activity as Ucn antagonists did.                             Example XIIIA A peptide having the amino acid sequence of (Cyclo 29-32) [D-Tyr11, Glu29 , D-Glu31, Lys32-Ucn (11-40) as described in Example I And as described in Example I of U.S. Pat. No. 5,064,939 (issued 11/121991). The created lactam bond is cyclized. LSIMS is 3690.91 Da Value, which is consistent with the calculated value of 3691.02 Da. As described in Example VIII Thus, in vitro tests for ACTH secretion using ventral pituitary cell culture This peptide is approximately 2.75 times more effective than the standard antagonist (ie, 2.74 (1.02 −8.02)). This peptide also has significant vasoconstriction in mammals Have activity and cause an increase in mean arterial blood pressure, which is a Ucn antagonist showed that. With such synthesis and testing, the addition of the N-terminal L-isomer is It shows no significant change in biological activity as a Ucn antagonist.                             Example XIIIB Ami Peptide having a no acid sequence (cyclo 29-32) [D-ProTen, D-Phe11 , Glu29, D-Glu31, Lys32] -Ucn (10-40) in Example I Synthesized in a solid manner and described in Example I of U.S. Pat.No. 5,064,939 issued 11/121991. The lactam bond prepared as above is cyclized. LSIMS is 3691.00D a, which is consistent with the calculated value of 3691.02 Da. Example VII In vivo for ACTH secretion using ventral pituitary cell culture as described in I The test shows that this peptide is approximately 5 times more effective than the standard antagonist (ie, 4.99 (2.2) 6-11.55)). This peptide is also a prominent blood vessel in mammals It has contractile activity and causes an increase in mean arterial blood pressure, which is a Ucn antagonist That was shown. Such synthesis and testing should be compared to peptide XIII Due to the addition of the N-terminal D-isomer, the biological activity of the Ucn antagonist is remarkable. No significant change.                               Example XIV (Cyclo 29-32) [D-Phe11, Glu29 , D-Arg31, Orn32-Ucn (11-40) as described in Example I And as described in Example I of U.S. Pat. No. 5,064,939 (issued 11/121991). The created lactam bond is cyclized. This peptide is a significant mammalian vasoconstrictor Have activity and cause an increase in mean arterial blood pressure, which is a Ucn antagonist showed that.   This synthesis was repeated twice to convert D-Arg to imBzlD-His and D-2N. al, and addition of Ac-Thr to the N-terminus of these substitutions was repeated twice. I returned. All four peptides have good biological activity as Ucn antagonists Show.                                Example XV (Cyclo 29-32) [D-Phe11, Lys29 , D-Glu31, Gln32-Ucn (11-40) as described in Example I Synthesized in the United States Lactor prepared as described in Example I of Japanese Patent No. 5064939 (issued 11/121991) Cyclize the bond. This peptide has significant vasoconstrictor activity in mammals and is Evoked an increase in arterial blood pressure, indicating that it was a Ucn antagonist.                            Example XVII   Additional Ucn antagonist peptides as shown below (many of which are substantially U cn (11-40) is synthesized in the manner described in Example I. I do.   Each of the aforementioned Ucn-like antagonist peptides has significant vasoconstrictor activity in mammals and Evoked an increase in arterial blood pressure, indicating that it was a Ucn antagonist.   The following groups of examples demonstrate the formation of endogenous CR by forming a complex with CRF-BP. With the aim of synthesizing CRF-BP sequestering substances that increase the available amount of F and Ucn I do.                             Example XVIII The peptide Ucn (5-32) having the amino acid sequence of Synthesized in the manner described in Example I.   The provisional peptide sequestrant was determined using a competitive hCRF-BP ligand binding assay. Be evaluated. [125I-DTyr0The binding of hCRF to soluble hCRF-BP is , 25 mM EDTA, 0.25% bovine serum albumin and 0.01% Recombinant C as a source of hCRF-BP in phosphate buffered saline containing Liton X-100 It is performed using a culture solution enriched by HO cells. The reaction was performed with a total volume of 400 μl (50,000 CPM [125I-DTyr0] Including hCRF) You. A certain amount of radioactive hCRF and hCRF-BP A competitive binding assay is performed using the peptide. After overnight incubation at room temperature, the rabbit Anti-hCRF-BP antiserum (final dilution 1: 9000) and 200 μl of sheep antiserum Precipitate with rabbit IgG solution. 30 minutes each for primary and secondary serum After warming, 1 ml of saline washing solution was added, and the test tube was 2,000 xg for 20 minutes at 4 ° C. Centrifuge. The precipitate is counted with a gamma counter. The inhibitory binding affinity constant (Ki) Values are calculated using the LIGAND computer program (Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220). (1980)) and parameters calculated by the Vax / VMS computer system. Determine using   CRF-BP blockade Ucn (5-32) is smaller than that of hCRF (9-33). KiAnd thus increase the availability of CRF and / or Ucn It is an excellent sequestering substance.                               Example XIX A peptide Ucn (8-32) having the amino acid sequence of Synthesized in the manner described in Example I. LDMS shows a value of 3023.48 Da. , Which is in agreement with the calculated value 3023.65 Da. Test results show that this peptide K smaller than that of hCRF (9-33)iAnd thus the CRF and / or Alternatively, it is a potentially excellent sequestering substance that increases the available amount of Ucn.                                Example XX The peptide Ucn (3-27) having the amino acid sequence of Synthesized in the manner described in Example I. This peptide Is K smaller than that of hCRF (9-33)iAnd thus the CRF and And / or potentially superior sequestrants that increase the available amount of Ucn.                               Example XXI [Ile having an amino acid sequence (see SEQ ID NO: 8)18] -Ucn ( 6-29) is synthesized in the manner described in Example I. This peptide has the hCRF (9 −33) K smaller than that ofiAnd thus the CRF and / or Ucn Potentially superior sequestering material that increases the available amount of.   Ucn strongly stimulates the pituitary-adrenal cortex axis, producing endogenous glucocorticoid production. May be useful for stimulating the function of this axis in certain types of patients . For example, Ucn and its analogs have impaired pituitary-adrenal cortex function If glucocorticoids are administered externally to the patient, pituitary-adrenal function Will help recovery.   Most other regulatory peptides have effects on the central nervous system and gastrointestinal tract I know that ACTH and sympathetic nervous system-activating secretions are CRF is a “necessary condition” for the response to Not surprisingly, it has a significant effect on the brain as a mediator. Would. Therefore, Ucn and its analogs can be used for mood, learning, memory and healthy individuals. And can also be used to regulate the behavior of patients with mental illness Conceivable. Ucn is used for ACTH, β-END, β-lipotropin, Increases opiomelanocortin gene product and corticosterone levels Thus, administration of Ucn induces the action of the aforementioned POMC-derived peptide in the brain To affect memory, mood, perception of pain, etc. Specifically affecting vigilance, depression and / or anxiety and also peripheral Can be used to elicit their effects. For example, administration directly to the ventricle CFR increased physical activity and improved learning outcomes in rats when Therefore, it can function as a natural stimulus. That is, Ucn is Since it activates the putter as well, it will function the same.   CRF-R2 was found to be abundantly expressed in the heart, especially in association with blood vessels. And addition of CRF to the left atrium of a separately perfused heart was Induces a long-term dilatation effect on It is now known that it stimulates the secretion of natriuretic peptides, cn is at least partially due to its particularly high affinity for CRF-R2. May be required for regulation of cardiac perfusion. Furthermore, other vascular beds (eg, Is expected to be extended by Ucn and its analogs You. Because of these biological effects in the heart, Ucn and its agonists / Antagonists are effective (along with anti-Ucn antibodies) to selectively modulate cardiac perfusion. It can be used effectively.   Furthermore, due to the localization of CRF-R2 in blood vessels, the Ucn-like Kinetic and antagonist peptides can be found in many different vascular beds and especially in desired tissues and organs. Is thought to be useful in the treatment of regulating blood flow in All CRF related pep Since Uide was shown to dilate the mesenteric vascular bed, Ucn and its action Drug analogs increase blood flow to the gastrointestinal tract of animals, especially humans and other mammals It could be used for: CRF and certain fragments are vascular permeable (E.T. Wei et al., "Peripheral anti-inflammatory acti ons of corticotropin-releasing factor ” Anti-inflammatory effect), Corticotropin-Releasing Factor (Ciba Foundation Symposium 172), J Ohn Wiley & Sons, pp.258-276, 1993)). Ucn and its fragments Reduced blood vessel leakage and reduced damage or surgically induced tissue swelling and inflammation And has a beneficial effect. Therefore, Ucn as well as its acting as an agonist Analogs and fragments administered parenterally reduce inflammation, swelling and edema And further reduce the loss of bodily fluids after the burn.   oCRF, r / hCRF, urotensin I and sorbazine inhibit gastric acid production Ucn and its analogs also reduce gastric acid production in mammals. Healing of gastric ulcer by lowering and / or inhibiting some gastrointestinal functions It is thought that it is effective for medical treatment. Ucn and its analogues increase intestinal tract acceleration It may be useful for treating acute constipation.   Many direct stimulatory effects of CRF on the GI tract have been described previously. example For example, CRF acts on the intestine in vitro to depolarize intestinal myenteric neurons in the small intestine. You. The results of in vivo experiments on intravenous administration of CRF and CRF antagonists Consistent with the finding that CRF empties the stomach and modulates intestinal motility. The present invention Ucn-like peptides are useful in the treatment of intestinal and stomach disorders (eg, irritable bowel syndrome) It is considered to be useful. CRF antagonist previously used in the treatment of irritable bowel syndrome And a Ucn-based antagonist, which has selectivity for CRF-R2 ) Is believed to be more useful. These antagonists may also cause spastic colitis and And treatment of Crohn's disease.   These Ucn-like peptides can also be used for proper administration and subsequent monitoring of bodily functions. Hypothalamus in mammals suspected of causing pathological changes in the endocrine or central nervous system Can be used to determine pituitary adrenal function. For example, Cushing's disease Can be used as a diagnostic tool to look at and affective disorders (eg, depression) Wear.   A pharmaceutically or veterinarily acceptable carrier to produce a pharmaceutical composition; Together, Ucn, its analogs or non-toxic salts can be used in animals (humans and other mammals). Intravenously, subcutaneously, intramuscularly, transdermally (eg, intranasally), cerebrospinal or oral Can be administered. This isolated peptide is at least about 90% pure and preferably Or at least 98% pure. However, lower purity is available Effective for mammals other than humans. This purity indicates that the target peptide is The indicated weight% of all similar peptides and peptide fragments present It means to configure. Administration to humans to lower blood pressure, or Performed by physicians to stimulate endogenous glucocorticoid production. necessary The dosage given will depend on the particular condition being treated, the severity of the condition and the desired therapeutic period. Will vary according to time. Ucn or Ucn analog can be e.g. Administration results in an increase in Ucn in the brain, whereby (a) Alzheimer's Improve short- and mid-term memory of subjects suffering from the disease, (b) relieve chronic fatigue syndrome , (C) appetite suppression, (d) respiratory stimulation, (e) improved learning outcomes, (f) improved memory Good, (g) improved alertness, (h) reduced depression and / or (i) reduced anxiety Cause. Particularly effective are shown by suppression of appetite.   Such peptides can be prepared from non-toxic pharmaceutically or veterinarily acceptable salts. Form (eg acid addition salts or eg zinc, iron, calcium, barium, magnesium) Metal complex with aluminum, aluminum, etc.). That's it Examples of such non-toxic salts are hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, tannic acid Salt, oxalate, fumarate, gluconate, alginate, maleate, vinegar Acid, citrate, benzoate, succinate, malate, ascorbate, And tartrate. If the active ingredient is administered in tablet form, the tablet Agents (eg tragacanth, corn starch or gelatin); disintegrants (eg Alginic acid); and lubricants (eg, magnesium stearate). it can. If administration in liquid form is desired, sweetening and / or flavoring agents may be used. Intravenous administration with isotonic saline, phosphate buffer solution, etc. Can be.   Ucn or an analog thereof can be administered over an extended period of time (eg, One year). For more sustained release depots or implants Shaped forms can also be used as is known in the art. For example, the dosage form may be a body fluid Pharmaceutically acceptable non-toxic salts of compounds with low solubility in water, for example by polybasic acids Acid addition salts; salts with polyvalent metal cations; or combinations of these two salts. Can be taken. Relatively insoluble salts may also be gels (eg, aluminum stearate). Mugel). Appropriate sustained-release injectable depot preparations are also Non-toxic or non-antigenic polymers that degrade slowly (eg, polyacetic acid / polyglycol) Dispersed or encapsulated in a carboxylic acid polymer, such as disclosed in US Pat. No. 3,773,919). Ucn or an analog or salt thereof.   A therapeutically effective amount of this peptide should be administered under the guidance of a physician, The composition is usually combined with a conventional pharmaceutical or veterinary acceptable carrier. Will be included. A therapeutically effective amount is selected to achieve the desired effect. For example, it is considered to be a predetermined amount calculated to increase or decrease the amount of ACTH in a patient. Can be The required dosage will vary with the particular treatment and the desired duration of treatment. Will work. However, from about 10 micrograms to about 1 milligram / k g body weight / day will be used as a therapeutic treatment. As mentioned above, the depot It may be particularly advantageous to administer the compound in a cut or long-acting form. Therapeutically effective The amount is typically about 0% when administered peripherally as a physiologically acceptable composition. . 11 μg / ml to about 100 μg / ml, preferably about 1 μg / ml to about 5 0 μg / ml, more preferably at least about 2 μg / ml, usually 5 to 10 μg A sufficient amount of Ucn or an analog thereof to achieve a plasma concentration of g / ml. Antibodies or antisense polynucleotides are also practiced in the art. The corresponding appropriate amount is administered according to the precedent. Present in patients (especially plasma ACTH levels can be readily measured by routine laboratory tests. Changes in ACTH levels were monitored during the treatment period, and the Validity over elapsed time can be determined. In some cases, this Treatment of a subject with such a peptide may include administration of ACTH or corticosteroids. And in such cases a dose of about 10 ng / kg body weight is used. Can be   The invention is described in its preferred embodiments (these are the best Has been described in detail above, but will be apparent to those skilled in the art. Various changes and modifications are beyond the scope of the present invention as set forth in the appended claims. It will be appreciated that this can be done without any changes. The scope of the claims is a peptide sequence Although various ranges have been defined in that respect, such peptide sequences Is known to be completely equivalent, and moreover its non-toxic It will be understood that it includes salts. Instead of a simple amide at the C-terminus, a lower alkyl Amides such as methylamide, ethylamide, etc. The C-terminus may be otherwise blocked as is well known in the peptide art. It will be understood. Substantially identical to the sequence of Ucn as specifically indicated herein A polypeptide having an amino acid residue sequence (in this case, one or more Which are conservatively substituted with similar residues) indicate that they have the biological function of CRF. Is considered to be equivalent to Ucn as long as Such peptides and And salts thereof are considered to be within the scope of the present invention.   All of the foregoing patents and publications are hereby incorporated by reference, along with their two earlier applications. Included in the book. As used herein, all temperatures are in ° C. and All combinations and percentages are by volume.                             Overview of Sequence Listing   SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of sheep CRF when the C-terminal is amidated You.   SEQ ID NO: 2 shows that when pGlu is present at the N-terminus and the C-terminus is amidated, It is an amino acid sequence of Elsorubi Gene (frog sauvagine).   SEQ ID NO: 3 shows the amino acid sequence of rat / human CRF when the C-terminal is amidated. Column.   SEQ ID NO: 4 shows that when the C-terminus is amidated, soccerfish It is an amino acid sequence of urotensin.   SEQ ID NO: 5 shows the amino acid of carp urotensin when amidated at the C-terminus It is an acid sequence.   SEQ ID NO: 6 shows a flathead sole when amidated at the C-terminus. (Maggy) amino acid sequence.   SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence of fish CRF when the C-terminal is amidated. You.   SEQ ID NO: 8 shows that when amidated at the C-terminus, rat-derived urocortin (Ucn) Amino acid sequence.   SEQ ID NO: 9 is the nucleic acid sequence from which SEQ ID NO: 8 was deduced.   SEQ ID NO: 10 is a rat-derived CRF receptor called "rCRF-R1" Is the amino acid sequence of   SEQ ID NO: 11 is a mouse-derived CRF receptor called “mCRF-R2β” -The amino acid sequence of   SEQ ID NO: 12 is a rat-derived CRF receptor called "rCRF-R2α" -The amino acid sequence of   SEQ ID NO: 13 is a rat-derived CRF receptor called "rCRF-R2β". -The amino acid sequence of   SEQ ID NO: 14 is an amino acid sequence of a 40 residue peptide defining certain analogs of Ucn. No acid sequence.   SEQ ID NO: 15 is an precursor obtained by adding a mature human Ucn peptide to a precursor. Amino acid sequence.   SEQ ID NO: 16 is the nucleic acid sequence from which SEQ ID NO: 15 was deduced.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/10 Ａ６１Ｐ 25/22 9/12 25/28 15/04 29/00 25/22 37/02 25/28 43/00 29/00 １１１ 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/575 43/00 16/26 １１１ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ０７Ｋ 14/575 33/50 Ｚ 16/26 33/53 Ｆ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/24 33/53 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ヴォーン ジョアン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92057 オーシャンサイド モジアク サ ークル 729 (72)発明者 ドナルドソン シンシア ジェイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92110 サン ディエゴ リンウッド ス トリート 1767 (72)発明者 ルイス カーシー エイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92110 サン ディエゴ モンテシト ウ ェイ 1760 (72)発明者 ソウチェンコ ポール アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92024 エンシニタス オータム プレイ ス 1820 (72)発明者 リヴィア ジーン イー エフ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92037 ラ ジョラ ブラックゴールド ロード 9674 (72)発明者 パーリン マリリン エイチ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92037 ラ ジョラ ロビンフッド レー ン 8844──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 9/10 A61P 25/22 9/12 25/28 15/04 29/00 25/22 37/02 25 / 28 43/00 29/00 111 37/02 C07K 14/575 43/00 16/26 111 G01N 33/15 Z C07K 14/575 33/50 Z 16/26 33/53 F G01N 33/15 C12N 15 / 00 ZNAA 33/50 A61K 37/24 33/53 37/02 (81) Designated country EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC , NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, S) Z, UG), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, U, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, I L, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ, VN. Inventor Donaldson Cynthia Jay United States of America 92110 San Diego Linwood Street 1767 (72) Inventor Louis Carsey A United States of America 92110 San Francisco Diego Montecito Way 1760 (72) Inventor Sauchenko Pole United States of America 92024 Encinitas Autumn Place 1820 (72) Inventor Revere Jean EF United States of America 92037 La Jolla Black Gold Road 9674 (72) Inventor Perlin Marilyn H. United States 92037 California La Jolla Robin Hood Lane 8844

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．ＣＲＦレセプター２（ＣＲＦ−Ｒ２）と結合し、ＡＣＴＨの産生を促進し、 ラット／ヒトＣＲＦ（ｒ／ｈＣＲＦ）よりも大型ＣＲＦ−Ｒ２に対してより強 い親和性を示し、さらにｒ／ｈＣＲＦ（配列番号：３）、ヒツジＣＲＦ（配列 番号：１）またはコイウロテンシン（配列番号：５）と約８０％未満の相同性 を有するという特徴をもつ分離ペプチド。 ２．配列番号：１５の残基８３−１２２と実質的に同じアミノ酸配列を含む請求 の範囲第１項のペプチドまたはその生物学的な機能性フラグメント。 ３．配列番号：１５のアミノ酸配列の残基８３−１２２を含む請求の範囲第１項 のペプチドまたはその生物学的な機能性フラグメント。 ４．配列番号：１５のアミノ酸配列のＮ−末端が短縮された機能性フラグメント で、当該フラグメントのＣ−末端がアミド化されている請求の範囲第３項のペ プチド。 ５．該Ｎ−末端がアシル化されている請求の範囲第４項のペプチド。 ６．請求の範囲第３項のペプチドまたは長さが少なくとも約５残基のそのフラグ メントと結合する抗体。 ７．当該ペプチドと結合し、さらにこれを生物学的に不活化させる請求の範囲第 ６項の抗体。 ８．配列番号：１５の残基８３−１２２と少なくとも６６％の相同性を有し、配 列番号：１５の残基についての当該置換の全てが保存的置換である請求の範囲 第１項のペプチド。 ９．以下のアミノ酸配列と実質的に同じ配列を含み、式中、Ｙは７もしくはそれ 未満の炭素原子をもつアシル基であるかまたは水素で；Ｒ1はＡｓｎまたはｄ ｅｓＲ1である請求の範囲第１項のペプチド。 10．以下のアミノ酸を含む請求の範囲第１項のペプチドで、式中、Ｙは７もしく はそれ未満の炭素原子をもつアシル基であるかまたは水素で；Ｒ19はＧｌｕま たはＡｌａで；Ｒ29はＡｒｇ、Ｇｌｕ、ＬｙｓまたはＯｒｎで；Ｒ32はＧｌｎ 、Ｌｙｓ、ＯｒｎまたはＧｌｕで；Ｒ36はＩｌｅ、ＣaＭｅＩｌｅまたはＣaＭ ｅＬｅｕで；Ｒ38はＡｓｐまたはＡｌａで；Ｒ29がＧｌｕのときＲ32はＬｙｓ またはＯｒｎのいずれかで、その側鎖はアミド結合によって連結されているこ とを条件とし；さらにＲ32がＧｌｕのときＲ29はＬｙｓまたはＯｒｎのいずれ かで、その側鎖はアミド結合によって連結されていることを条件とし；さらに １２位のＤ−ＰｈｅはＤ−Ｌｅｕまたは別のＤ−アミノ酸でもよいということ を条件とし；さらに３１位のＧｌｕはＤ−Ｇｌｕまたは別のＤ−アミノ酸でも よいということを条件とし；さらにＮ−末端は１または２残基が短縮されてい てもよいということを条件とする。 11．以下のアミノ酸配列（配列番号：１４）を有する請求の範囲第１項のペプチ ドで、式中、Ｙは７もしくは７未満の炭素原子を有するアシル基または水素で ；Ｘａａ1はＡｓｐ、ＧｌｕまたはＧｌｎで；Ｘａａ2はＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌ ｕまたはＧｌｙで：Ｘａａ4はＳｅｒまたはＰｒｏで；Ｘａａ5はＬｅｕ、Ｉｌ ｅまたはＭｅｔで；Ｘａａ7はＩｌｅまたはＬｅｕで；Ｘａａ10はＴｈｒまた はＳｅｒで；Ｘａａ11はＰｈｅまたはＬｅｕで；Ｘａａ12はＨｉｓまたはＧｌ ｕで；Ｘａａ13はＬｅｕまたはＭｅｔで；Ｘａａ16はＴｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ またはＬｙｓで；Ｘａａ17はＬｅｕ、ＭｅｔまたはＶａｌで；Ｘａａ18はＬｅ ｕまたはＩｌｅで；Ｘａａ19はＧｌｕまたはＨｉｓで；Ｘａａ20はＬｅｕ、Ｍ ｅｔ、ＩｌｅまたはＡｒｇで；Ｘａａ21はＡｌａ、ＧｌｕまたはＴｈｒで；Ｘ ａａ22はＡｒｇまたはＬｙｓで；Ｘａａ23はＣｙｓ以外の天然のアミノ酸のい ずれか；Ｘａａ24はＧｌｎ、ＧｌｕまたはＡｓｐで；Ｘａａ25はＣｙｓ以外の 天然のアミノ酸のいずれか；Ｘａａ26はＧｌｎ、ＬｅｕまたはＧｌｕで；Ｘａ ａ27はＡｒｇ、ＡｌａまたはＬｙｓで；Ｘａａ28はＧｌｕまたはＧｌｎで；Ｘ ａａ29はＡｒｇまたはＧｌｎで；Ｘａａ31はＣｙｓ以外の天然 のアミノ酸のいずれか；Ｘａａ32はＣｙｓ以外の天然のアミノ酸のいずれか： Ｘａａ35はＩｌｅ、Ｌｙｓ、ＬｅｕまたはＡｓｎで；Ｘａａ36はＩｌｅ、Ｔｙ ｒ、ＭｅｔまたはＬｅｕで；Ｘａａ37はＰｈｅ、ＬｅｕまたはＭｅｔで；Ｘａ ａ38はＡｓｐまたはＧｌｕで；Ｘａａ39はＳｅｒ、Ｉｌｅ、ＧｌｕまたはＴｈ ｒで；さらにＸａａ40はＶａｌ、Ｉｌｅ、ＰｈｅまたはＡｌａで；ｈＵｃｎと 異なる残基は３残基未満であり、さらにＮ−末端は１つまたは２つの残基が短 縮されていてもよいという条件に従う。 12．請求の範囲第１項のペプチドをコードする分離ＤＮＡ。 13．残基８３−１２２をコードする、配列番号：１６に示したものと実質的に同 じヌクレオチド配列を有するＤＮＡを含む請求の範囲第１２項の分離ＤＮＡ。 14．残基８３−１２２をコードする、配列番号：１６のヌクレオチド配列を含む 請求の範囲第１２項の分離ＤＮＡ。 15．請求の範囲第１４項の当該分離ＤＮＡの連続した少なくとも１４ヌクレオチ ドを含むＤＮＡプローブまたはその相補物。 16．高いストリンジェンシー条件下で請求の範囲第１４項の当該分離ＤＮＡまた はその相補物とハイブリダイズすることができる分離ＤＮＡ。 17．請求の範囲第１項のペプチドをコードするＤＮＡと高いストリンジェンシー 条件下でハイブリダイズすることができる分離ＤＮＡ。 18．請求の範囲第２項のペプチドをコードする分離ＤＮＡ。 19．ＣＲＦレセプター、適切な標識を含む請求の範囲第１項のペプチドおよび候 補リガンドを用いて競合的結合アッセイを実施し、さらに当該標識ペプチドと とって代わることができる当該候補リガンドの能力を決定することを含む、Ｃ ＲＦレセプターに対するリガンドをスクリーニングする方法。 20．当該ＣＲＦレセプターがＣＲＦレセプター２であり、さらに当該標識ペプチ ドが125Ｉ−Ｔｙｒ0−Ｕｃｎである請求の範囲第１９項のスクリーニング方法 。 21．請求の範囲第１項のペプチドの有効用量をヒトに投与し、さらにＡＣＴＨレ ベルの上昇について当該対象者の血流をモニターすることを含む視床下部下垂 体疾患を診断する方法。 22．請求の範囲第１項のペプチドまたはその無毒な塩の有効量および医薬的に許 容できるその担体を哺乳類に末梢的に投与することを含む、当該哺乳類でＡＣ ＴＨおよびβ−ＥＮＤ−ＬＩの分泌を促進する方法。 23．請求の範囲第１項のペプチドまたはその拮抗ペプチドの有効量を投与するこ とを含む血流および／または血圧を調節する方法。 24．当該有効なペプチド量を末梢的に投与することを含む所望の脈管床の血流を 調節する請求の範囲第２３項の方法。 25．請求の範囲第１項のペプチドの有効量を末梢的に投与することを含む冠状血 流を増加させる方法。 26．請求の範囲第１項のペプチドの有効量を末梢的に投与することを含む腫脹お よび／または炎症および／または血管透過性を減少させる方法。 27．医薬的に許容できる担体と合わせて請求の範囲第１項のペプチドの有効量を 含み、当該量がＣＲＦレセプターのトランスアクチベーションを調節するため に有効である医薬組成物。 28．当該量が腸の通過速度を増すために有効である請求の範囲第２７項の医薬組 成物。 29．以下のアミノ酸配列を含むＵｃｎ拮抗ペプチドで、式中、Ｒ10はＰｒｏ、Ｄ −Ｐｒｏ、ＴｈｒまたはＤ−Ｔｙｒで；Ｒ11はＤ−ＰｈｅまたはＤ−Ｔｙｒま たは別のＤ−アミノ酸で；Ｒ19はＧｌｕまたはＡｌａで；Ｒ29はＡｒｇ、Ｇｌ ｕ、ＬｙｓまたはＯｒｎで；Ｒ32はＧｌｎ、Ｌｙｓ、ＯｒｎまたはＧｌｕで； Ｒ36はＩｌｅ、ＣaＭｅＩｌｅまたはＣaＭｅＬｅｕで；Ｒ38はＡｓｐまたはＡ ｌａで；Ｒ29がＧｌｕのときＲ32はＬｙｓまたはＯｒｎのいずれかで、その側 鎖はアミド結合によって連結されていて、さらにＲ32がＧｌｕのときＲ29はＬ ｙｓまたはＯｒｎのいずれかで、その側鎖はアミド結合によって連結されてい ることを条件とし：さらに３１位のＧｌｕはＤ−Ｇｌｕまたは別のＤ−アミノ 酸でもよく、さらにＮ−末端は１、２または３残基が短縮されていて もよいということを条件とする。 30．（ｃｙｃｌｏ２９−３２）Ｄ−Ｐｈｅ11、Ｇｌｕ29、Ｌｙｓ32−Ｕｃｎ（１ １−４０）である請求の範囲第２９項のＵｃｎ拮抗ペプチド。 31．高い親和性でＣＲＦレセプターと結合するが、そのようなレセプターを実質 的に活性化しないＣＲＦレセプターの拮抗物質をスクリーニングする方法であ って、当該方法が、ＣＲＦレセプター、適切な標識を含む請求の範囲第３０項 のペプチドおよび候補拮抗物質を用いて競合的結合アッセイを実施し、さらに 当該標識ペプチドととって代わることができる当該候補拮抗物質の能力を決定 することを含む前記ＣＲＦレセプターの拮抗物質のスクリーニング方法。 32．Pro-Ser-Leu-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Thr-Leu-Leu-Glu- Leu-Ala-Arg-Thr-Gln-Ser-Gln-Arg-Glu-Arg-Ala-Glu-Gln(配列番号：１５の残 基３−３２)と実質的に同じアミノ酸配列を有するペプチドまたは、そのＮ− 末端から配列の１から８残基が、またはＣ−末端から配列の１から５残基がま たはその両方が欠落することによって形成される前記ペプチドの生物学的に活 性なフラグメントであって、ＣＲＦ結合蛋白を封鎖し、それによって内在性Ｃ ＲＦおよび／またはＵｃｎの利用可能性を高めるために有用なペプチド。 33．Ｕｃｎ（５−３２）、Ｕｃｎ（８−３２）およびｈＵｃｎ（３−２７）から 成る群から選ばれる請求の範囲第３２項のペプチド。 34．請求の範囲第３２項のペプチドの有効量を投与することを含む、ＣＲＦおよ び／またはＵｃｎのインビボレベルを高める方法。 35．当該有効量が妊娠女性の分娩を促進するために十分である、請求の範囲第３ ４項の方法。 36．（ａ）アルツハイマー病に罹患している対象者の短、中期の記憶の改善、（ ｂ）慢性疲労症候群の緩和、（ｃ）食欲抑制、（ｄ）呼吸系の刺激、（ｅ）学 習成果改善、（ｆ）記憶の改善、（ｇ）警戒心(alertness)の改善、（ｈ）抑 うつの軽減および／または（ｉ）不安の軽減を惹起する、脳内の内在性遊離Ｃ ＲＦおよび／またはＵｃｎの増加をもたらすために当該投与ペプチド量が有 効である請求の範囲第３４項の方法。 37．当該ペプチドが脳に到達することができるように投与される請求の範囲第３ ６項の方法。[Claims] 1. It binds to CRF receptor 2 (CRF-R2), promotes the production of ACTH, exhibits a stronger affinity for large CRF-R2 than rat / human CRF (r / hCRF), and further exhibits r / hCRF ( SEQ ID NO: 3), an isolated peptide characterized by having less than about 80% homology with sheep CRF (SEQ ID NO: 1) or carrot tensin (SEQ ID NO: 5). 2. 2. The peptide of claim 1 comprising an amino acid sequence substantially the same as residues 83-122 of SEQ ID NO: 15, or a biologically functional fragment thereof. 3. The peptide of claim 1 comprising residues 83-122 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, or a biologically functional fragment thereof. 4. 4. The peptide according to claim 3, which is a functional fragment wherein the N-terminal of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 is shortened, and the C-terminal of the fragment is amidated. 5. 5. The peptide of claim 4, wherein said N-terminus is acylated. 6. An antibody that binds to the peptide of claim 3 or a fragment thereof that is at least about 5 residues in length. 7. 7. The antibody according to claim 6, which binds to the peptide and further inactivates the peptide biologically. 8. The peptide of claim 1 having at least 66% homology with residues 83-122 of SEQ ID NO: 15, wherein all of said substitutions for residues of SEQ ID NO: 15 are conservative substitutions. 9. A substantially amino acid sequence, wherein Y is an acyl group having 7 or less carbon atoms or is hydrogen; and R 1 is Asn or desR 1 . Item 1. The peptide of item 1. Ten. A peptide according to claim 1 comprising the following amino acids, wherein Y is an acyl group having 7 or fewer carbon atoms or is hydrogen; R 19 is Glu or Ala; R 29 is Arg, Glu, at Lys or Orn; R 32 is Gln, Lys, in Orn or Glu; R 36 is Ile, C a MeIle or C a M eLeu; is R 29; R 38 is Asp or Ala R 32 when Glu is either Lys or Orn, the side chain with the proviso that you are linked by an amide bond; in R 29 when more R 32 is Glu either Lys or Orn, the Provided that the side chains are linked by an amide bond; further provided that D-Phe at position 12 may be D-Leu or another D-amino acid; With the proviso that more N- terminus may be 1 or 2 residues have been reduced; is a condition that may be D-Glu or another D- amino acids. 11． A peptide according to claim 1 having the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 14), wherein Y is an acyl group having 7 or less than 7 carbon atoms or hydrogen; Xaa 1 is Asp, Glu or in Gln; Xaa 2 is Asn, Asp, Gl u or Gly: Xaa 4 is Ser or Pro at; Xaa 5 is Leu, Il e or Met; Xaa 7 is Ile or Leu; Xaa 10 is Thr or Ser Xaa 11 is Phe or Leu; Xaa 12 is His or Glu; Xaa 13 is Leu or Met; Xaa 16 is Thr, Asn, Glu or Lys; Xaa 17 is Leu, Met or Val; 18 is Le u or Ile; Xaa 19 is Glu or His; Xaa 20 is Leu, M et, Ile or Arg; Xa a 21 is Ala, with Glu or Thr; X aa 22 is Arg or Lys at; Xaa 23 is had either the natural amino acid other than Cys; Xaa 24 is Gln, with Glu or Asp; Xaa 25 is naturally except Cys Xaa 26 is Gln, Leu or Glu; Xaa 27 is Arg, Ala or Lys; Xaa 28 is Glu or Gln; Xaa 29 is Arg or Gln; Xaa 31 is other than Cys Xaa 32 is any of the natural amino acids other than Cys; Xaa 35 is Ile, Lys, Leu or Asn; Xaa 36 is Ile, Tyr, Met or Leu; Xaa 37 is Phe; Xaa 38 is Asp or Glu; Xaa 39 is Ser, Ile, Glu or Thr; In addition, Xaa 40 is Val, Ile, Phe or Ala; there are fewer than three residues that differ from hUcn, and the N-terminus is subject to the condition that one or two residues may be shortened. 12． An isolated DNA encoding the peptide of claim 1. 13. 13. The isolated DNA of claim 12, comprising DNA encoding residues 83-122 and having substantially the same nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 16. 14. 13. The isolated DNA of claim 12, comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16, encoding residues 83-122. 15． 15. A DNA probe comprising at least 14 contiguous nucleotides of the isolated DNA of claim 14, or a complement thereof. 16． 15. An isolated DNA capable of hybridizing under high stringency conditions to the isolated DNA of claim 14 or a complement thereof. 17． An isolated DNA capable of hybridizing under high stringency conditions with a DNA encoding the peptide of claim 1. 18． An isolated DNA encoding the peptide according to claim 2. 19. A competitive binding assay is performed using the CRF receptor, the peptide of claim 1 containing a suitable label and the candidate ligand, and further determining the ability of the candidate ligand to displace the labeled peptide. A method for screening a ligand for a CRF receptor. 20. The CRF receptor is CRF receptor 2, further said labeled peptide is 125 I-Tyr 0 -Ucn ranges paragraph 19 of the screening method according to which. twenty one. A method for diagnosing hypothalamic pituitary disease, comprising administering to a human an effective dose of the peptide of claim 1, and monitoring the subject's blood flow for elevated ACTH levels. twenty two. Claims 1. Secretion of ACTH and β-END-LI in a mammal, comprising peripherally administering to the mammal an effective amount of the peptide of claim 1 or a non-toxic salt thereof and a pharmaceutically acceptable carrier thereof. How to promote. twenty three. A method for regulating blood flow and / or blood pressure, comprising administering an effective amount of the peptide of claim 1 or an antagonist peptide thereof. twenty four. 24. The method of claim 23, wherein the method comprises modulating the desired vascular bed blood flow comprising peripherally administering the effective amount of peptide. twenty five. A method for increasing coronary blood flow, comprising peripherally administering an effective amount of the peptide of claim 1. 26. A method of reducing swelling and / or inflammation and / or vascular permeability comprising peripherally administering an effective amount of the peptide of claim 1. 27. A pharmaceutical composition comprising an effective amount of the peptide of claim 1 in combination with a pharmaceutically acceptable carrier, said amount being effective for modulating CRF receptor transactivation. 28. 28. The pharmaceutical composition according to claim 27, wherein said amount is effective to increase intestinal transit speed. 29. A Ucn antagonist peptide comprising the following amino acid sequence, wherein R 10 is Pro, D-Pro, Thr or D-Tyr; R 11 is D-Phe or D-Tyr or another D-amino acid; R 19 is Glu or Ala; R 29 is Arg, Gl u, Lys or Orn; R 32 is Gln, Lys, in Orn or Glu; R 36 is Ile, C a MeIle or C a MeLeu in; R 38 is Asp or a la; when R 29 is Glu R 32 is either Lys or Orn, the side chain have been joined by an amide bond, further R 32 is the R 29 when Glu of L ys or Orn In either case, provided that the side chains are linked by an amide bond: Glu at position 31 may be D-Glu or another D-amino acid, and the N-terminus may be 1 With the proviso that 2 or 3 residues may be shortened. 30. (Cyclo29-32) D-Phe 11, Glu 29, Lys 32 -Ucn (1 1-40) ranges paragraph 29 Ucn antagonist peptide according it. 31. A method for screening for an antagonist of a CRF receptor that binds to a CRF receptor with high affinity but does not substantially activate such a receptor, said method comprising the CRF receptor, an appropriate label. 31. An antagonist of the CRF receptor, comprising performing a competitive binding assay using the peptide of claim 30 and the candidate antagonist and further determining the ability of the candidate antagonist to displace the labeled peptide. Screening method. 32. Pro-Ser-Leu-Ser-Ile-Asp-Leu-Thr-Phe-His-Leu-Leu-Arg-Thr-Leu-Leu-Glu-Leu-Ala-Arg-Thr-Gln-Ser-Gln-Arg- A peptide having substantially the same amino acid sequence as Glu-Arg-Ala-Glu-Gln (residues 3-32 of SEQ ID NO: 15), or 1 to 8 residues of the sequence from the N-terminus, or C- A biologically active fragment of the peptide formed by the deletion of one to five residues or both of the sequences from the terminus, which blocks the CRF binding protein and thereby the endogenous C Peptides useful for increasing the availability of RF and / or Ucn. 33. 33. The peptide of claim 32 selected from the group consisting of Ucn (5-32), Ucn (8-32) and hUcn (3-27). 34. 33. A method for increasing the in vivo level of CRF and / or Ucn, comprising administering an effective amount of the peptide of claim 32. 35. 51. The method of claim 34, wherein said effective amount is sufficient to promote delivery of a pregnant woman. 36. (A) Improving short- and medium-term memory of subjects suffering from Alzheimer's disease, (b) relieving chronic fatigue syndrome, (c) suppressing appetite, (d) stimulating the respiratory system, (e) learning outcomes Improved endogenous free CRF and / or in the brain, causing (f) improving memory, (g) improving alertness, (h) reducing depression and / or (i) reducing anxiety. 35. The method of claim 34, wherein the amount of peptide administered is effective to cause an increase in Ucn. 37. 37. The method of claim 36, wherein said peptide is administered such that it can reach the brain.
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