JP2002500501A

JP2002500501A - Human calcium sensor protein, fragments thereof and DNA encoding the same

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Publication number: JP2002500501A
Application number: JP51705696A
Authority: JP
Inventors: ゴーランアケルストロム; クラエスユーリン; ラースラスク; ゴーランヒアルム; クラレンスシーモース; エドワードエムマーレイ; グレッグアールクラムリー
Original assignee: アヴェンティスファーマシューティカルズプロダクツインコーポレイテッド
Priority date: 1994-11-23
Filing date: 1995-11-22
Publication date: 2002-01-08

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒト胎盤内のカルシウムセンサーをコードするｃＤＮＡクローンの単離並びに続くヒト副甲状腺及び尿細管細胞におけるｍＲＮＡ発現をも確認するノーザンブロットに関する。ラットヘイマン腎炎抗原、カルシウム結合能力を有する尿細管刷子縁の糖タンパク質について、密接な配列類似性が証明される。免疫組織化学は、ヘイマン抗原についてすでに報告されている組織分布に類似した、カルシウムセンサータンパク質の組織分布を明らかにする。同定されたカルシウムセンサータンパク質は、細胞外カルシウムの変動の認識に対する汎用のセンサーを構成し、異なる組織系を経たカルシウム調節に対して鍵となる役割を果たすことが提案される。カルシウムセンサータンパク質は、糖タンパク質のＬＤＬ−スーパーファミリーに属し、タンパク質受容体としての機能が第一に主張されるが、機能的に重要なカルシウム結合能力を有する。 (57) [Summary] The present invention relates to the isolation of a cDNA clone encoding a calcium sensor in the human placenta and subsequent Northern blots that also confirm mRNA expression in human parathyroid and tubular cells. Close sequence similarity is demonstrated for the rat Hayman nephritis antigen, a tubular brush border glycoprotein with calcium binding capacity. Immunohistochemistry reveals a tissue distribution of the calcium sensor protein similar to the tissue distribution previously reported for the Hayman antigen. The identified calcium sensor proteins constitute a versatile sensor for the recognition of extracellular calcium variability and are proposed to play a key role in calcium regulation through different tissue systems. Calcium sensor proteins belong to the LDL-superfamily of glycoproteins and are primarily claimed for function as protein receptors, but have functionally important calcium binding capacity.

Description

【発明の詳細な説明】ヒトカルシウムセンサータンパク質、その断片及びそれをコードするＤＮＡ本出願は、１９９４年５月２４日に出願された第ＰＣＴ／ＳＥ９４／００４８３号の一部継続出願である、１９９４年１１月２３日に出願された第０８／３４４，８３６号の一部継続出願である、１９９５年６月７日に出願された第０８／４８７，３１４号の一部継続出願である。背景技術本発明は、副甲状腺、胎盤及び尿細管細胞のヒトカルシウムセンサータンパク質をコードするｃＤＮＡクローンに関する。国際出願第ＷＯ８８／０３２７１号パンフレットには、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）放出のカルシウム調節に重要に関係している副甲状腺細胞膜結合カルシウム受容体（parathyroid cell membrane-bound calcium receptor）又はセンサーを同定するモノクローナルの抗副甲状腺抗体が記載されている（１、２）。受容体機能は、正常な血漿カルシウム濃度の維持に必須であり、副甲状腺機能亢進症（ＨＰＴ）患者の増殖性副甲状腺細胞内における低下した受容体発現は、ＰＴＨ分泌のカルシウム非感受性及び不定の重症の高カルシウム血症を引き起こす（３〜６）。又、抗副甲状腺抗体に対する反応性も、基部の尿細管細胞及びヒト胎盤の細胞栄養芽層細胞について証明されており、細胞栄養芽層は、副甲状腺とほぼ同一の細胞質カルシウム〔Ｃａ²⁺ｉ〕の調節を示すことが証明されている（７、８）。抗体反応性構造は、細胞栄養芽層においてもカルシウムセンシング機能（ calcium sensing function）を発揮することが見出されており、これらの細胞は合胞体の一部を構成するので、カルシウムセンサーは、胎児のカルシウムのホメオスタシスに積極的に関係していることが提案されている（７、８）。基部の尿細管細胞の抗体反応性構造は、類似したカルシウムセンシング機能を示し、したがって、カルシウムセンサーは、臓器系を経たカルシウム調節においてより一般的な役割を果たすことが示唆されている（１、７、９、１０）。高カルシウム血症を患うＨＰＴ患者において、１以上の副甲状腺(parathyroid gland)を除去するための手術が行われる。ＨＰＴは非常に一般的な障害であることが立証されており、かつ手術はかなり費用がかかり、時には患者に対するある種の危険を必然的に伴うので、この手術処置に対する代替処置を有することは非常に好ましい。カルシウムセンサー／受容体は、５００ｋＤａの単鎖の糖タンパク質として明らかになっている（７）。しかしながら、アミノ酸配列及びその対応するＤＮＡ配列は現在まで知られていない。発明の概要それゆえ、本発明の目的は、カルシウムセンサー／受容体の完全な特徴付けを可能にするのに充分な、カルシウムセンサー／受容体の構造データを提供することであった。１つの態様において、本発明は、副甲状腺、胎盤及び尿細管細胞のヒトカルシウムセンサータンパク質の完全なアミノ酸配列を提供する。別の態様において、本発明は、ヒトカルシウムセンサーをコードする核酸配列及びその他の新規なカルシウムセンサータンパク質を同定するための核酸プローブを提供する。別の目的は、新規な治療法並びにカルシウム関連障害を治療する化合物及び組成物を設計するための前記構造データの使用である。その他の態様において、本発明は、シグナル伝達経路に含まれるＳＨ２及びＳＨ３結合部分（motif）と相同的な、カルシウムセンサータンパク質の細胞質ドメイン内のペプチド領域の同定を提供する。カルシウムイオンのホメオスタシスの動揺（perturbation）に関連した２つの重要なヒトの疾患は、甲状腺機能亢進症及び骨粗鬆症である。したがって、１つの態様において、カルシウムセンサータンパク質若しくはその断片を発現する細胞又は本発明のカルシウムセンサータンパク質をコードするｃＤＮＡを含む細胞を、センサーの活性に関連したシグナル伝達系路を含む、カルシウムセンサータンパク質の活性をブロック又は亢進する分子を同定するためのアッセイに使用してもよい。これらの分子は、ＰＴＨレベル、ビタミンＤ３合成、エストロゲン、破骨細胞活性又は骨芽細胞活性（それゆえ、骨吸収及び／又は骨形成）、カルシウム分泌及びカルシウムイオンのホメオスタシスにおける動揺に関連した哺乳類の病理学的状態の治療において有用であろう。本発明は、ヒト胎盤のカルシウムセンサー／受容体をコードするｃＤＮＡクローンの単離及び特徴づけ並びに副甲状腺及び腎臓内の対応するｍＲＮＡの存在を立証するノーザンブロットに関する。カルシウムセンサーとラットヘイマン腎炎抗原であるｇｐ３３０（１１、６７）との間の密接な配列の類似性は、胎盤、副甲状腺及び尿細管に共通のカルシウムセンサーはこの抗原に関係しており、ｇｐ３３０のヒト相同体を示し、かつ受容体機能及びカルシウム結合能力を有する巨大な糖タンパク質ファミリーに属することを示唆している。それゆえ、本発明の更なる目的は、ヒトｇｐ３３０に基づいた診断測定方法及び治療方法を提供することである。図面の簡単な説明図１．カルシウムセンサータンパク質をＬｙｓ−Ｃエンドプロテアーゼを用いて消化した後得られたペプチドのＨＰＬＣによる単離（実線）。点線はカルシウムセンサーを省略した同一反応のクロマトグラフィーを表わす。流速は１００μｌ／分に維持した。容易に解釈することできる配列を与える２つのペプチド画分を矢印で示す。図２．カルシウムセンサータンパク質のＨＰＬＣにより単離した、２つのＬｙｓ −Ｃペプチド（配列番号１及び２）の配列。図３．カルシウムセンサータンパク質の一部をコードするｃＤＮＡクローンであるｐＣＡＳ−２の、部分ヌクレオチド配列（配列番号３）及び推論されるアミノ酸配列（配列番号４）。ペプチド２９２及び２９３と同一である推論されるアミノ酸配列部分に下線を引いた。図４．カルシウムセンサータンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）の、ヘイマン抗原（ヘイマン、配列番号５）、低密度リポタンパク質受容体（LDL-RC、配列番号６）及びＬＤＬ関連受容体タンパク質（LDLRRP、配列番号７）の対応部分に対する整列化(alignment)。星印は、カルシウムセンサータンパク質とその他の配列のいずれかとの間で同一の残基を示している。Ｘは、同一性が示されなかったヘイマン抗原における位置を示している。図５．副甲状腺腺腫（１）、腎臓（２）、肝臓（３）、胎盤（４）、膵臓（５）、副腎（６）、小腸（smallgut）（７）由来の全ＲＮＡのノーザンブロット解析。フィルターを２．８ｋｂのｐＣＡＳ−２挿入プローブとハイブリダイズし、次いで反応をホスホールイメージャー（phosphorimager）により可視化した。２８Ｓ及び１８ＳリボソームＲＮＡの位置を示した。図６．ヒトカルシウムセンサーの２．８ｋｂのｃＤＮＡクローンの完全ヌクレオチド配列（配列番号１１）及びアミノ酸配列（配列番号１２）。センサーの膜貫通ドメインを太字（bold type）で示す。３つのＳＨ３結合領域には下線を引き( underline or overline)、ＳＨ２結合領域には上書き線を引いた(strikethru)。図７．カルシウムセンサー細胞質ドメインのアミノ酸配列（配列番号１３）及び既知のＳＨ３結合部分（配列番号２０〜３７）に対する３つのカルシウムセンサーＳＨ３結合領域（配列番号１４〜１６）の比較。図８．カルシウムセンサーのＳＨ３結合領域と、ＳＨ３ドメインを含む種々のＧＳＴ融合タンパク質との間の相対的な結合力（binding strength）の比較。図９．カルシウムセンサーのＳＨ２結合領域（配列番号１９）と、ＰＩ３Ｋのｐ８５調節サブユニットのＳＨ２領域（配列番号３８〜７８）との相互作用に必要なアミノ酸配列条件（amino acid sequence requirement）との比較。図１０．ＥＧＦリピート（EGF repeat）、成長因子リピート及びＹＷＴＤスペーサー領域を含むヒトｇｐ３３０の構造。Ｎはタンパク質のアミノ末端を示し、Ｃはカルボキシ末端を示す。矢印は膜貫通領域の位置を示す。図１１．ｐＣＡＳ−２からＣＡＳ配列を伸長する（extend）戦略。図１２．アミノ酸配列の差異が明らかな異なるＣＡＳのｃＤＮＡ配列内の同一領域の比較。発明の詳細な説明本明細書において別に示さない限り、以下に示す用語は示された意味を有する。「ポリペプチド」という用語は、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合により互いに結合したアミノ酸の直鎖配列を意味する。本明細書において「実質的に精製された」とは、「実質的に均一」を意味するように用いられ、これは、標準的な状態では通常結合している化合物（例えば、他のタンパク質又はペプチド、炭水化物、脂質）を実質的に含まない物質として定義される。「実質的に精製された」とは、他の化合物との人工又は合成の混合物を除外することを意味しない。又、この用語は、生物学的活性を妨げない不純物の存在を除外することも意味せず、例えば不完全な精製又は医薬的に許容しうる調製物と混合により、不純物が存在していてもよい。「生物学的に活性なポリペプチド」という用語は、それ天然起源のポリペプチド（naturally occurring polypeptide）自身、合成的に製造したポリペプチド及びその類似体ならびに天然かつ医薬的に許容しうる塩及び医薬的に許容しうるその誘導体を含む生物学的に活性なポリペプチドの類似体を意味する。又、「生物学的に活性なポリペプチド」は、その生物学的に活性な断片及び「その生物学的に活性な配列の類似体」をも包含している。異なる型のペプチドが存在してもよい。これらの変異は、同一の生物学的機能を有するタンパク質をコードする構造遺伝子のヌクレオチド配列における差異によって特徴付けられるだろう。「生物学的に活性な配列の類似体」は、単一又は複数のアミノ酸置換（substi tution）、欠失、付加又は置換（replacement）を有する天然起源の類似体を含む。１以上の天然の生物学的活性の特質を保持する変異体を生じる、そのような全ての対立遺伝子の変異体、修飾体及び類似体は本発明の範囲に含まれる。本出願では、ヌクレオチドを、以下に示す標準的な１文字の略語を用いた塩基によって示す。グアニンＧアデニンＡチミンＴシトシンＣ不明Ｎ本出願では、アミノ酸残基を、以下に示す標準的な１文字の略語を用いて示す。アラニンＡシステインＣアスパラギン酸Ｄグルタミン酸ＥフェニルアラニンＦグリシンＧヒスチジンＨイソロイシンＩリジンＫロイシンＬメチオニンＭアスパラギンＮプロリンＰグルタミンＱアルギニンＲセリンＳトレオニンＴバリンＶトリプトファンＷチロシンＹ不明Ｘ本明細書において使用する「アミノ酸」という用語は、前記に列挙した天然アミノ酸及びその機能的同等物を示すことを意味する。本発明は、副甲状腺、胎盤、尿細管細胞の共通のカルシウムセンサータンパク質をコードし、かつ、配列番号３、配列番号１１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７及び配列番号８９からなる群より選ばれるコード配列からなる、単離した核酸分子を提供する。更に本発明は、カルシウムセンサータンパク質又はセンサーの機能的領域をコードするその断片をコードする、単離した核酸分子からなるベクターを提供する。更に本発明は、カルシウムセンサータンパク質の製造方法であって、カルシウムセンサー又はその断片をコードする核酸配列を適当なベクターに入れ、得られたベクターを適当な宿主細胞に挿入し、得られた細胞によって産生したカルシウムセンサータンパク質を回収し、次いで回収したカルシウムセンサータンパク質を精製することからなる方法を提供する。カルシウムセンサータンパク質又はその断片を製造するこの方法は、当該技術分野において周知である組換えＤＮＡ技術法を使用する。代わりに、ペプチド合成の標準的な固相方法論（methodology ）を使用して調製してもよい。又、本発明は、インビトロ、半ビボ、又はインビボのいずれで、カルシウムセンサータンパク質の発現を下方制御（down regulate）又はブロックするために使用することができるアンチセンス核酸を提供する。遺伝子発現の下方制御は、翻訳又は転写レベルの両方で行うことができる。本発明のアンチセンス核酸は、より好ましくは、配列番号３、配列番号１１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７及び配列番号８９からなる群より選ばれる配列の全部若しくは一部又は対応するメッセンジャーＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるＲＮＡ断片である。これらのアンチセンスは、例えば欧州特許出願第ＥＰ９２５７４号に記載されているように、適宜、選択性の安定性を改善するよう修飾されていてもよい、配列番号３、配列番号１１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７及び配列番号８９からなる群より選ばれる配列に基づいて調製した合成オリゴヌクレオチドであってもよい。又、細胞内における発現によりカルシウムセンサータンパク質のｍＲＮＡの全部又は一部に相補的なＲＮＡを産生するＤＮＡ配列であってもよい。これらのアンチセンスは、反対の配向性の状態にある（欧州特許出願第ＥＰ１４０３０８号）、配列番号３、配列番号１１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７及び配列番号８９からなる群より選ばれる配列の全部又は一部の発現により調製されてもよい。材料及び方法組織標本ヒト副甲状腺のサンプルを、初期のＨＰＴ患者の手術において得た。他のヒト組織標本（腎臓、精巣上体、肝臓、膵臓、副腎、小腸、脾臓、肺及び横紋筋）を、手術時に取り除いた臓器から採取した。ヒト胎盤組織を、全期間無併発性の妊娠（uncomplicated pregnancy）に関係して集めた。全てのサンプルをイソペンタン中で直ちに急速凍結し、−７０℃で貯蔵した。ヒト胎盤からのカルシウムセンサータンパク質の単離５００ｋＤａのカルシウムセンサータンパク質を、全部で２５のヒト胎盤より、すでに記載された手順（７）に従い、免疫吸着及びイオン交換クロマトグラフィーにより分離し、精製した。この手順に、２つの異なるモノクローナル抗副甲状腺抗体（１、７）であり、カルシウムセンシングタンパク質の異なる抗原決定基に結合することが知られているＥ１１及びＧ１１を利用した。Ｅ１１は機能的な作用を発揮しなかったが、一方Ｇ１１は、副甲状腺及び胎盤の細胞の両者においてカルシウム調節を効率的にブロックした（１、７）。精製後、カルシウムセンサータンパク質調製物を、酵素による消化の前に、ゾルバックス（Zorbax）ＧＦ２５ゲルカラム（９.２×２５０ｍｍ）中のゲルクロマトグラフィーに付した。単離したペプチドの切断及び配列決定アクロマバクター・リティカス（Achromabacter lyticus）から得たエンドプロテアーゼＬｙｓＣを用いて５００ｋＤａのタンパク質を切断し、ブラウンリーマイクロボアー（Brownlee microbore）Ｃ₄カラム（２.２×３０ｍｍ）中での分離に付し、次いで０.０２％トリフルオロ酢酸中の５％アセトニトリル中で平衡化した。０.０２％トリフルオロ酢酸中の５〜６０％アセトニトリルの直線勾配をペプチドの溶出に用い、ウォーターズ（Waters）９９０ダイオードアレイ検出器（ミリポアコーポレーション（Millipore Corporation）、ミルフォード（M illford）、マサチューセッツ（Mass））を使用して、２１４ｎｍでモニターした。ペプチドのアミノ末端配列を、ＡＢＩ１２０ＡＰＴＨ−アミノ酸クロマトグラフを装備したＡＢＩ４７０Ａ気相シークエネーター（アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)、フォスターシティー(Foster City)、カリフォルニア（Ca）、アメリカ合衆国（USA））で決定した。オリゴヌクレオチド合成ＡＢＩ３８１オリゴヌクレオチドシンセサイザー（アプライドバイオシステムズ）を用いて、オリゴヌクレオチドを合成した。以下に示すオリゴヌクレオチド混合物を、胎盤ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング用プローブとして利用した。以下に示す２つのオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応における使用のために合成した。最初の９ヌクレオチドはそれぞれＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位を含んでおり、残りのヌクレオチドはペプチド２９３の１〜６のアミノ酸残基及びペプチド２９２の８残基に対応する。混合オリゴヌクレオチドプロープを用いて、胎盤のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。胎盤１ｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック（Clontech）、カリフォルニア、アメリカ合衆国）を、２０×２５ｃｍの寒天平板に、約２×１０⁵プラークの密度でプレーティングした。１０枚の平板の複製フィルター(Hybond-N+、アマシャム（Amersham））を、５×ＳＳＰＥ（ＳＳＰＥ、１２０ｍＭＮａＣｌ、８ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、０.８ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７.４）、５×デンハート液（１２）、0.5％ＳＤＳ、２０μｇ／ｍｌ１本鎖サケ精子ＤＮＡ（シグマケミカルコーポレーション（Sigma Chemical Co.）、Ｓ：ｔルイス（S:t Louis）、オハイオ（Ohio））中でプレハイブリダイズした。γ−[³²p]−ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼ（アマシャム）を用いて末端を標識（endlabel）処理した混合オリゴヌクレオチドプローブを、ハイブリダイゼーション混合物に添加し（５０ｍｌ中に３０×１０⁶ｃｐｍ）、４２℃で終夜ハイブリダイゼーションを行った。フィルターを２×ＳＳＰＥ中で２回、０．１×ＳＳＰＥ中で１回洗浄し、オートラジオグラフィースクリーンにさらし、次いでホスホールイメージャー（モレキュラーダイナミックス（Mole cular Dynamics）、イメージカウントＳ．Ｗ（Image Count S.W.）、サンヴァレー（Sun Valley）、カリフォルニア（Ca））により解析した。ＰＣＲ反応 λｇｔ１１ｃＤＮＡクローンであるＣＡＳ−１の一部を、ペプチド２９２及び２９３部分に相当する２種の変性プローブを用いたＰＣＲにより増幅した。以下に示す条件を用いた。１７０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、プライマーとしての各オリゴヌクレオチドの混合物１ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ３ｍＭ、Ｔａｑポリメラーゼ０.７５ｕ。反応を、パーキン−エルマー（Perkin-Elmer）９６００ＰＣＲマシン（パーキン−エルマー、ノーウォーク(Norwalk)、アメリカ合衆国）における、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌの２０μｌ、ｐＨ８.０、1.5ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＫＣｌ中で行った。９４℃で２分間の変性、４７℃で１分間のアニーリング及び７２℃で１分３０秒間の伸長の２サイクルに続いて、９４℃で１分間、５４℃で４５秒間、７２℃で１分間、次いで７２℃で１０分間の最終伸長のサイクルを３３回行った。プローブとしてＰＣＲ断片を用いた胎盤ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング胎盤λＺＡＰ−ＩＩｃＤＮＡライブラリーを、ランダムプライミング（random priming）により標識した、ｃＤＮＡクローンＣＡＳ−１由来のＰＣＲ断片をプローブとして用いてスクリーニングした。スクリーニングを前記のようにして行った。２０×２５ｃｍの寒天平板上に分布した２×１０⁶プラークがスクリーニングされた。ヌクレオチド配列の決定ファージクローンＣＡＳ−２の挿入物を、ヘルパーファージ（ストラタジーン（Stratagene）、ラジョッラ（La Jolla）、カリフォルニア）を用いて、ファージベクターから、ブルースクリプト＋（Bluescript+）ベクター内に解離した。ヌクレオチド配列決定反応を、アプライドバイオシステムズ社製のキットを利用して、サイクルシークエンシング（cycle sequencing）手順に従い行った。配列を、データコレクションプログラムＶＩＩＩソフトウェア(Data Collection Program VIII software）（アプライドバイオシステムズ）を用いたＡＢＩ３７３ＡＤＮＡシークエンサーにおいて解析した。ＣＡＳ−２２.８ｋｂｃＤＮＡ配列の完成を、シークエナーゼ（Sequenase）(ユナイテッドステイツバイオケミカル(United States Biochemical))を用いたジデオキシヌクレオチド連鎖停止法（dideoxynucleotide chain-termination method）により達成し、図６（配列番号１１）に示す。多重配列決定解析(multiple sequencing analysis)を、ＣＡＳ−２の両方の鎖について行い、配列を確認した。ｃＤＮＡ配列から推論されるアミノ酸配列を、マックベクターＤＮＡ／ＲＮＡソフトウェアアナリシスパッケージ（Macvector DNA/RNA software analysis pack age）(マッキントッシュ(Macintosh))により解析した。逆転写酵素ＰＣＲ増幅及びヒトラムダ腎臓ｃＤＮＡライブラリーの³²Ｐ標識プローブスクリーニングを用いてＣＡＳのｃＤＮＡ(配列番号８３)のクローニングを完了した。完全長のヒト胎盤（配列番号８５）、腎臓（配列番号８７）及び副甲状腺（配列番号８９）のＣＡＳのｃＤＮＡ配列を、ＰＣＲ増幅したヒト胎盤、腎臓及び副甲状腺ｃＤＮＡライブラリーから以下に記載するようにして得た。特異的にプライムした第一の鎖状ｃＤＮＡ（specifically primed first-strand cDNA）を、配列番号８３、全ＲＮＡＲＮＡｚｏｌＢ法（テル−テスト（Tel-Test））及びｃＤＮＡ合成キット（プロメガ（Promega））を用いて調製した。示された配列の位置を有する以下のプライマーを反応に用いた。４つの別の逆転写酵素（ＲＴ）反応を、以下に示すプライマーを用いて行った。ＲＴ反応１（ＲＴ１）プライマーＧ２９ａｓＲＴ反応１（ＲＴ２）プライマーＥ２ａｓＲＴ反応１（ＲＴ３）プライマー２３．５ＲＴ反応１（ＲＴ４）プライマーＧ３１ａｓ以下に示すプライマーを、列挙したＲＴ反応と共にＰＣＲ反応に用いた。プライマーＲＴ反応Ｆｌｓ／Ｇ７ａｓＲＴ１Ｇ２０ｓ／Ｇ２９ａｓＲＴ１Ｇ２６ｓ／Ｇ１６ａｓＲＴ２Ｇ１６ｓ／Ｅ２ａｓＲＴ２Ｅ４ｓ／Ｂ９ａｓＲＴ３Ｂ５ｓ／２３．５ＲＴ３Ｇ１９ｓ／Ｇ３６ａｓＲＴ４Ｇ３５ｓ／Ｇ３１ａｓＲＴ４第一の鎖状ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を、以下に示すプログラムを用いて、パーキン−エルマー９６００サーマルサイクラー（Thermal Cycler）中で行った。９４℃で２分間の変性サイクル１回、９４℃で１５秒間の変性サイクル４０回、５１℃で１０秒間のアニーリング及び７２℃で３分間の伸長、その後、反応生成物を、電気泳動により分離し、ゲル精製した(gel purify)(キアゲン(QIAGEN)) 。ＰＣＲ試薬をパーキン−エルマー社より購入し、製造者の提案に従い使用した。次いで、ＰＣＲ断片を、ジデオキシヌクレオチド連鎖停止法（パーキン−エルマープリズムダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングキット（Prism Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit）及びＡＢＩ３７３自動ＤＮＡシークエンサー（アプライドバイオシステムズ）を用いてヌクレオチド配列決定を行った。４つの別の反応より得たＰＣＲ断片を、両方の鎖について配列決定し、配列データを確認した。コンピューター生成ＤＮＡ配列解析を、オートーアセンブラ（Auto-Assembler）及びファクチュラ（Factura）（アプライドバイオシステムズ）、並びにマックベクター（MacVector）及びアセンブリリグン（AssemblyLIGN）（イーストマンコダックカンパニー(Eastm an Kodak Company)）ソフトウェアプログラムを使用して行った。データベース検索ＦＡＳＴＤＢアルゴリズムを使用して、インテリジェネティックスフォーマット（Intelligenetics format）（Intelligenetics Rel.5.4）のＥＭＢＬ− ３１データベースで、胎盤ｃＤＮＡに対する配列の類似性を検索した（１３）。免疫染色及びノーザンブロット免疫組織化学的研究を、モノクローナル抗副甲状腺抗体であるＥ１１及びＧ１１を５μｇ／ｍｌの濃度で、マウスペルオキシダーゼアンチペルオキシダーゼ（ mouse peroxidase antiperoxidase）技術と共に利用して、ヒト胎盤、副甲状腺、腎臓、精巣上体標本及びその他のヒト組織に対して、アセトン固定した６μｍ厚の凍結切片について行った。前記参照（１、７）。コラーゲンＩＩ型（collag en-type II）に対するモノクローナル抗体を負の対照として用いた。酸フェノール／クロロホルム（acid phenol/chloroform）法により、組織サンプルから全ＲＮＡを抽出した。ノーザンブロット解析のために、約１０μｇの全ＲＮＡを、１.５％／３７％アガロース／ホルムアルデヒドゲル中で電気泳動し、ナイロン膜（キアブレン（Qiabrane）、ダイアゲンゲーエムベーハー（Di agen GmbH）、デュッセルドルフ、ドイツ）上にブロットし、ランダムブライミング法により標識化した２.３ｋｂのクローンを用いて探索した（結果参照）。ハイブリダイゼーションを、５０％ホルムアミド、４×クエン酸ナトリウム塩類溶液（ＳＳＣ、３００ｍＭＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７.０）、２×デンハート液、１０％デキストラン硫酸（カビ−ファルマシア（Kabi-P harmacia）、ウプサラ、スウェーデン）及び１００μｇ／サーモン精子ＤＮＡ中、４２℃で１８〜２４時間かけて行った。フィルターを、１×ＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ、４２℃で３０シン（sin）の最終的な厳密性で洗浄し、次いで前記のホスホールイメージャー内でさらした。ＣＡＳペプチドの結合解析ある推定上のＣＡＳＳＨ３結合領域に相当するペプチド（ＡＴＰＰＰＳＰＳＬＰＡＫＰＫＰＰＳＲＲ）（配列番号１８）を、ファーストモック（商標）（Fa stMoc^tm）ケミストリーを用い、ＡＢＩモデル４３０Ａシンセサイザーで合成した。ペプチドを、ＨＰＬＣで精製し、質量分析装置により解析した。５ｍｇのペプチドを、供給者により記載されたようにして、５００μｌのアミノリンク（Amino Link）（ピアス（Pierce））アガロースと結合させた。結合の効率を、結合前後のペプチド溶液のＲＰ−ＨＰＬＣ及び波長２２０ｎｍにおいて分光光度的にチェックした。両方の方法共に＞７０％の結合効率を示した。樹脂をＴＴＢＳで大規模に洗浄する前に、結合したペプチドを、種々のＧＳＴ−ＳＨ３融合タンパク質の５μｇのアリコートと、室温下で１時間反応させた。樹脂を色素添加ＳＤＳ（SDS loading dye）中で煮沸し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で電気泳動した。ペプチドに対する種々のＳＨ３タンパク質の結合能力を、ＳＤＳゲル上のクーマシーブルーに染まったバンドの強度により判断した。ＧＳＴタンパク質単独を、対照として単独で用いた。ＧＳＴ−ＳＨ３融合タンパク質の発現及び精製種々のＧＳＴ−ＳＨ３含有融合クローンは、I.Gout博士（ルートヴィヒ大学(L udwig Inst.）、癌研究所（Cancer Research）、ロンドン、イギリス）より提供を受けた。融合タンパク質は、１ｍＭＩＰＴＧを用いてのＸＬ１−ブルー大腸菌（XL1-bule E.coli）における発現の誘導により全て生成した。融合タンパク質を含む細胞を、１０ｍＭＥＤＴＡ及び１％トリトン−Ｘ１００（Triton-X 100）を含むＰＢＳ中で超音波処理した。細胞片をペレット状にした（pellet）後、清澄な溶菌液を、グルタチオン−セファロースカラム（ファルマシア(Pharmacia)）に適用し、結合した融合タンパク質を、５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８.０）中の１０ｍＭ還元型グルタチオンを用いて溶出した。次いでこれらの精製した融合タンパク質を、続く全ての実験に用いる前に、ＰＢＳに対して広範に透析した。２８０ｎｍにおける吸光度を測定することによりタンパク質を定量し、続いてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動による特徴付けを行った。結果カルシウムセンサータンパク質の単離、ペプチドの切断及び配列決定ペクチンクロマトグラフィー、固定化モノクローナル抗副甲状腺抗体を利用した免疫吸着及び最後のイオン交換クロマトグラフィーにより、胎盤組織よりカルシウムセンサータンパク質を精製した（１、７）。同一の抗体をサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて使用し、精製をモニターした（７）。低分子量のペプチドの混入を避けるために、５００ｋＤａのタンパク質鎖（７）２００μｇからなる全最終調製物を、グアニジン−ＨＣｌに関して６Ｍとし、２Ｍグアニジン−ＨＣｌ、０.１ＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８.５）を用いて平衡化したゲルクロマトグラフィーカラムに適用した。カラムに同一の緩衝液を用いて溶出した。実質的に、全てのタンパク質材料は、５００ｋＤａの分子量を有するタンパク質のための期待される位置における空隙容量に近い事が明らかになった。この材料を含む分離した画分を組み合わせ、次いでエンドプロテアーゼＬｙｓＣ（１μｇ）を添加した。３７℃で消化を終夜進行させた。断片化したタンパク質を、０.１％β−メルカプトエタノールを用い、３７℃で３０分間インキュベートすることにより還元し、続いて４−ビニルピリジン（０.３％）を用い、室温かで２時間アルキル化した。次いでペプチド混合物を、０.２％トリフルオロ酢酸中の５％アセトニトリルで平衡化した逆相Ｃ４カラムに適用した。ペプチドを、０.０２％トリフルオロ酢酸中の５〜６０％直線勾配により溶出した（図１）。多数のペプチドのため、溶離パターンは複雑であった。幾つかのペプチド画分を、気相シークエンサー中で配列決定し、２つの画分について、容易に解釈できる配列を得た（図２、配列番号１及び２）。５００ｋＤａのカルシウムセンサーをコードするｃＤＮＡクローンの単離配列決定したペプチド２９２のアミノ酸残基２〜１７をコードするオリゴヌクレオチド混合物（４８ｂｐ）を構築した。オリゴヌクレオチド混合物の複雑性を減少させるために、ヒトにおけるコドン用法からガイダンスが得られない変性位置に５つのイノシン塩基を挿入した。２種の塩基の可能性がある９つの位置において、塩基のうちの１種が、コドン用法から７０％を超える可能性をもって示唆され、それゆえ、その塩基をオリゴヌクレオチド混合物に使用した。混合オリゴヌクレオチドを、放射性標識し、ヒト胎盤λｇｔ１１ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにプローブとして使用した。約２×１０⁶のプラークがスクリーニングされ、単一の陽性クローンであるＣＡＳ−１を見出した。制限酵素地図作成により、このクローンの挿入物を２.３ｋｂであると推定した。クローンの認識できる配列を速やかに得るために、ペプチド２９２及び２９３の一部に相当する変性オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いＰＣＲ増幅を試みた。約４３０ｂｐの明確なＤＮＡ断片より、ペプチド２９２はペプチド２９３のカルボキシ末端に位置しているとの推定を得た。ペプチド２９３に相当するオリゴヌクレオチド混合物をプライマーとして用いて、断片を部分的に配列決定した。得られた配列の１つの読み枠において、ペプチド２９３のカルボキシ末端の５つのアミノ酸残基と非常に一致する、配列ＶＧＲＨＩを推論した。巨大な挿入物を有するクローンを得るために、巨大な挿入物を有するクローンを含むことが報告されているヒト胎盤λＺＡＰ−ＩＩｃＤＮＡライブラリーを、ＰＣＲ断片をプローブとして用いてスクリーニングした。約２×１０⁶のプラークから、単一の陽性クローンであるＣＡＳ−２を見出した。２.８ｋｂであることが推定されるこのクローン挿入物を、ヘルパーファージを用いてブルースクリプト＋（Bluesc ript+）ベクター内に解離した。このクローン挿入物の一部であるｐＣＡＳ−２を、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて配列決定した(図３、配列番号３)。ペプチド２９２及び２９３共に読み枠を含んでいることを見出した。ペプチド配列とｃＤＮＡクローンから予想されるアミノ酸配列（配列番号４）とは完全に一致した。２.８ｋｂのＣＡＳ−２の完全な配列を図６に示す（配列番号１１）。標準的な方法論を用いて、ＣＡＳ−２配列を伸長した。逆転写酵素ＰＣＲ増幅及び³²Ｐ標識化プローブを用いたヒトラムダ腎臓ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを用い、ＣＡＳのｃＤＮＡのクローニングを完了した（配列番号８３）。適当なクローンのためのプローブ断片をクローンｐＣＡＳ−２（図１１）から設計し、重複しているが５’側は伸長したクローンをこれらのライブラリーから単離した。このｃＤＮＡウォーキング（walking）操作を、クローンｐＭｅｇ２、ｐＨＰ１Ｃ８、ｐＨＰ１Ｂ１及びｐＭ４Ｂ１を除くすべてのｃＤＮＡクローンの単離に使用した。これらのクローンを、ラット腎臓の全ＲＮＡから調製したラットｃＤＮＡを用いて調製したラットｇｐ３３０ＰＣＲ増幅プローブ断片（ヌクレオチド数(nts.)、１４８〜１２４９、２８９２〜３８７３、４５５３〜５６９３及び５８６８〜６９６８）を用いて、ヒト腎臓のｃＤＮＡライブラリーから単離した。３つの小さいクローニングギャップ(cloninggap)(アミノ酸(aa)５６４〜９９７、１６２２〜１８３６及び２２１２〜２３１２)を、特定のヒトｇｐ３３０オリゴヌクレオチドプライマー及びヒト腎臓全ＲＮＡから調製したｃＤＮＡを用いた、これらの領域を通した直接ＰＣＲ増幅により完成させた（ＣＡＳ−１７５０、−１２１０及び−７００）。伸長したカルシウムセンサー配列を配列番号１７に示す。完全なヒトカルシウムセンサー配列を配列番号８３及び８４に示す。前記のクローニング操作に基づいて、配列番号８４のアミノ酸１〜３７１１を、ヒト腎臓ｃＤＮＡより決定し、一方、アミノ酸３７１２〜４６５５をＣＡＳ−２胎盤ｃＤＮＡクローンより同定した（図１１）。完全長のヒト胎盤（配列番号８５及び８６）、腎臓（配列番号８７及び８８）及び副甲状腺（配列番号８９及び９０）のＣＡＳのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を、材料と方法の項に記載した配列番号８３のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー、全ＲＮＡＲＮＡｚｏ１Ｂ法及びｃＤＮＡ合成キットを使用して調製した、特異的にプライムした第一の鎖であるヒト胎盤、腎臓及び副甲状腺のｃＤＮＡから得た配列決定ＰＣＲ断片により決定した。ここまでに得られた全てのＣＡＳ配列の比較により、完全アミノ酸配列を通してわずか４つの可能性のある差異が明らかになる。Ａｌａ¹²⁸⁷がＡｌａ／Ｐｒｏ、Ａｌａ²⁸⁷²がＴｈｒ、Ｌｙｓ⁴⁰⁹⁴がＬｙｓ／Ｇｌｕ及びＩｌｅ⁴²¹⁰がＩｌｅ／Ｌｅｕ（図１２）。あいまいな位置及び少数のアミノ酸の差異は、ほとんどｃＤＮＡライブラリー構築に使用したｃＤＮＡの材料（source）に反映する、標準的なエスニック（ethnic）及び／又はアレリック（allelic）な変異の差異とほとんど関係していた。５００ｋＤａの胎盤のカルシウムセンサーはＬＤＬ−受容体スーパーファミリーに属する図３（配列番号３）から推論されるアミノ酸配列を用いたデータベースの検索により、胎盤の５００ｋＤａのタンパク質はＬＤＬ−受容体スーパーファミリーに属する受容体と相同であることが明らかになった。最も高い類似性はラットヘイマン腎炎抗原について見出された(１１、６７)。図４は、胎盤の５００ｋＤａのタンパク質配列の、ヘイマン抗原配列（配列番号５）並びに同一のタンパク質スーパーファミリーの他の２つのメンバーであるＬＤＬ−受容体(配列番号６)及びＬＤＬ受容体関連タンパク質（α₂−マクログロブリン受容体と同一、（１１、１５、１６）、配列番号７））に対する整列化を示している。比較した領域（２３６個のアミノ酸残基）における胎盤のカルシウムセンサー及びヘイマン抗原ｇｐ３３０との間の配列の同一性は８２％であると推定した。ヒトカルシウムセンサータンパク質の完全配列を配列番号８３に示す。ラットｇｐ３３０とヒト相同体との間の全体の同一性は７７％であった。ヒトｇｐ３３０の構造を図１０に示す。タンパク質は長さ４６５５個のアミノ酸であり、２５個のアミノ酸のＮ末端シグナルペプチド、４３９８個のアミノ酸の細胞外ドメイン、２３個のアミノ酸の膜貫通ドメイン及び２０９個のアミノ酸のＣ末端ドメインからなる。図１０に示すように、ヒトｇｐ３３０の構造は、ラット相同体の構造と密接に相関している（参考文献６７の図３）。免疫組織化学及びノーザンブロット胎盤の５００ｋＤａのカルシウムセンサータンパク質とラットヘイマン腎炎抗原との間の密接な類似性により、本研究の拡張した免疫組織化学研究を試みた。ヘイマン抗原と反応する抗体について既に証明されている（１７〜２０）ように、抗副甲状腺抗体（Ｅ１１及びＧ１１）は、副甲状腺、胎盤及び基部の尿細管細胞だけでなく精巣上体細胞も染色することが見出された。プローブとして同定された２．８ｋｂのクローンを用いた、ヒト腎臓、胎盤及び副甲状腺由来の全ＲＮＡ（約１０μｇ／レーン）のノーザンブロット解析により、これら全ての組織における約１５，０００塩基の、ハイブリダイズする、１つの主要なＲＮＡ種が明らかになった（図５）。ヒト肝臓、膵臓、副腎、小腸（図５）並びに脾臓、肺及び横紋筋（データは示さない）は、ハイブリダイズする種を欠いていた。カルシウムセンサーの細胞質ドメインにおけるＳＨ２及びＳＨ３結合領域の同定Ｓｒｃ−相同領域２及び３（ＳＨ２及びＳＨ３）は、それぞれ約１００個及び６０個のアミノ酸残基から構成される保存された配列部分であり、多様な機能を有する多数の真核生物のタンパク質に見出される（４２〜４４）。ＳＨ３ドメインは、例えばｐ８０／ｐ８５、ミオシン１ｂ、スペクトリン、好中球ＮＡＤＰＨオキシダーゼ関連タンパク質ｐ４７及びｐ６７等の種々の細胞骨格関連タンパク質、並びに形態形成に重要な幾つかの酵母タンパク質（即ち、Ｂｅｍｌｐ及びＡＢＰ−１）、連絡（mating）に重要な酵母タンパク質（ＦＵＳ１）又はｒａｓ活性の調節に重要な酵母タンパク質（ｃｄｃ２５及びｓｔｅ６（総説は、Mussachi oら、（４５）を参照））において同定されている。多数のＳＨ３含有タンパク質は細胞骨格関連であるという知見は、ＳＨ３ドメインは細胞質膜上又はその近くにおける多量体タンパク質複合体生成の役割を果たしているという示唆を導いた。ＳＨ２及びＳＨ３ドメインを含むあるタンパク質は、活性化された受容体チロシンキナーゼとｐ２１ｒａｓグアニンヌクレオチドー放出タンパク質(guanine nucleotide-releasing protein)(ＧＮＲＰ)とを結合することにより、アダプター分子の機能を果たしている。例えば、Ｇｒｂ２及びその相同体は、活性化された膜固定化（membrane-anchored）受容体チロシンキナーゼ上のホスホチロシンと、そのＳＨ２ドメインを介して結合し、かつＳＯＳと、そのアミノ末端及びカルボキシ末端のＳＨ３ドメインを介して結合する（４６〜５０）。これらのプロセスは、ｒａｓタンパク質が相互作用し、続いて活性化される原形質膜への、ＳＯＳの転位置を誘導する。したがって、ＳＨ２／ＳＨ３含有及びＳＨ２／ＳＨ３結合タンパク質は、活性化された受容体からの高度に保存されたシグナル伝達経路に関係している。２.８ｋｂのヒトｃＤＮＡクローンＣＡＳ−２（図６）(配列番号１１及び１２ )の完全な核酸配列決定及び翻訳により、ＣＡＳ−ＰＥＰ１（配列番号１４）、ＣＡＳ−ＰＥＰ２（配列番号１５）、ＣＡＳ−ＰＥＰ３（配列番号１６）として示す、少なくとも３種の可能性のあるＳＨ３結合領域の存在が証明された。これらＣＡＳ−２細胞質ペプチド領域の３つ全ては、ＳＨ３結合領域の必要な共通配列を有しており、これを図７にＣＡＳペプチドと共に示す（５３）。ＣＡＳ−２の細胞質ドメインがＳＨ３領域に結合することの更なるサポートを図８の証拠に示す。ＣＡＳ−ＰＥＰ１（ＰＳＬＰＡＫＰ、図７）を含むＣＡＳ−２細胞質ドメイン領域（ＡＴＰＰＰＳＰＳＬＰＡＫＰＫＰＰＳＲＲ）（配列番号１８）を合成した。ペプチドを種々の精製したＧＳＴ−ＳＨ３融合タンパク質と共にインキュベートし、融合タンパク質の相対的な結合強度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図８）。データは、ＳＨ３領域含有タンパク質は、ＣＡＳ−ＰＥＰ１含有ペプチドに対する親和性を有することを、以下に示す減少する親和性の相対的な順ではっきりと示す。レーン６：ＳＨ３−ＰＩ３Ｋ（ホスホイノシトール−３キナーゼのｐ８５サブユニットのＳＨ３、（５４、５５））＞レーン７：ＳＨ３− ＰＬＣ−ガンマ（ホスホリパーゼ−Ｃガンマ、（５６））＞レーン２：ＳＨ３ −ＦＹＮ（ｓｒｃファミリー可溶性チロシンキナーゼ、（５７））＞レーン４：ＳＨ３−ＧＲＢ２（成長因子受容体結合タンパク質のＮ末端のＳＨ３）及びレーン５（ＧＲＢ２のＣ末端のＳＨ３）（５８、５９）。有意に、図８に示す陽性に反応するＳＨ３含有タンパク質は、シグナル伝達及び細胞成長の刺激と密接に関連している（５４〜５９）。ＰＩ３Ｋは２つのＳＨ２領域及び１つのＳＨ３領域を含む。ＰＩ３Ｋは、シグナル伝達分子ファミリーに対してかなり新しく、グルコーストランスポーターを介するインスリンシグナル伝達と関係しているらしく、かつｒａｓタンパク質と直接関係していると信じられている。ＰＬＣ−ガンマは２つのＳＨ２領域を含む周知のシグナル伝達分子であり、リガンド活性化成長因子受容体により刺激を受けたとき、膜脂質をその他の強力な下流情報伝達分子（downstream signaling molecule）(例えばＩＰ３及びジアシルグリセロール)に加水分解することが知られている。ＦＹＮは、細胞成長及び分化と密接に関係していることが知られている可溶性チロシンキナーゼのｓｒｃファミリーの高度に特徴付けられたメンバーである。ＦＹＮは１つのＳＨ２及び２つのＳＨ３領域を含み、リガンド活性化成長因子受容体により刺激を受けることも知られている。ＧＲＢ２は２つのＳＨ２及び１つのＳＨ３領域を含み、既知の内因性の酵素能力を有しない点でアダプター分子として知られている。ＧＲＢ２分子はリガンド活性化成長因子受容体により刺激を受けることも知られている。ＳＨ３−ＧＡＰ（ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質、レーン３、（６０、６１））及びＳＨ３−ＮＣＦ（好中球細胞障害性因子１型、レーン８、又は２型、レーン９（６２、６３））は、ＣＡＳ−ＰＥＰ１含有ペプチドに対してほとんど又は全く親和性を有しないことは注目する価値がある。この証拠は、ＣＡＳ−ＰＥＰ１と種々のＳＨ３ドメインとの間の相互作用の特異性を支持している。更に、図８のレーン１に示すように、ＣＡＳ−ＰＥＰ１は対照のＧＳＴ融合タンパク質に結合しない。ＣＡＳ−２の細胞質ドメインもｐ８５−ＳＨ２結合領域からなる。異なるＳＨ２含有タンパク質は全て相互作用のためにリン酸化チロシン残基を必要とするけれども、チロシン残基を囲むアミノ酸残基は相互作用の特異性及び強度を指図することがよく証明されている（６４）。図９は、ＰＩ３Ｋのｐ８５調節サブユニットのＳＨ２領域との相互作用に必要なアミノ酸配列条件を定義している。証拠は、ｐ８５のＳＨ２領域との結合相互作用を起こすために、チロシン残基は、アミノ酸配列部分ＹＸＸＭ（「Ｘ」はあらゆるアミノ酸であってよい）に含まれ、ＹＸＸＭ部分のいずれかの方向に約３〜５個の残基の酸性アミノ酸残基（Ｄ又はＥ）を有していなければならないことを明確に示している。この正確なアミノ酸配列条件は、ＣＡＳ−２の細胞質ドメイン（ＦＥＮＰＩＹＡＱＭＥＮＥ）（配列番号１９）に存在し、図９の上部のＣＡＳ−２細胞質配列に下線を引いた。全体で、証拠は、本発明のカルシウムセンサータンパク質の細胞質ドメインは３つの共通ＳＨ３結合領域及びｐ８５のＳＨ２領域により認識される型の１つの可能性のあるＳＨ２認識領域を含むことを証明し、かつ、多分ＰＩ３Ｋを介した、カルシウムセンサータンパク質の生物学的活性に対するＳＨ２及びＳＨ３を介したシグナル伝達の関与を支持している。カルシウムセンシングはＧ−タンパク質活性化、ＰＫＣ活性化及びイノシトールリン酸塩生成と関連があるらしく、これらの全てはＰＩ３Ｋシグナル伝達カスケードと関係することができる活性であるので、ＰＩ３Ｋとカルシウムセンサータンパク質との可能性のある相互作用は、ヒト副甲状腺組織におけるＣＡＳ−２タンパク質のカルシウムセンシングへの関連の最近の証拠に照らしてより興味深い。それゆえ、これらの領域は、カルシウムセンサータンパク質が使用するシグナル伝達系路を刺激又は阻害する化合物を同定するアッセイにおける有用なツールを供給する。当業者に既知のアッセイ技術の使用による、カルシウムセンサータンパク質のＳＨ２／ＳＨ３領域の活性を模倣又は阻害する作用薬又は拮抗薬は、例えは初期の副甲状腺機能亢進症（ＨＰＴ）（５２）及び骨粗鬆症等のセンサーに密接に関係した疾患の治療に有用であろう。カルシウムセンサータンパク質とタンパク質のＬＤＬ−受容体スーパーファミリーとの関係を前記に記載した。ＬＤＬ−受容体スーパーファミリーの全てのメンバーは「スカベンジャー（scavenger）」タンパク質である。これらのスカベンジャータンパク質のなかに、認識されたシグナル伝達領域を有するものはなく、ＳＨ領域を有するスカベンジャータンパク質も存在しない。それゆえ、カルシウムセンサータンパク質のシグナル伝達において活性なＳＨ２及びＳＨ３結合領域を同定することは全く予期していなかった。これらの領域の出現は、たとえスカベンジャータンパク質のＬＤＬ−受容体スーパーファミリーと相同の領域を有していても、カルシウムセンサータンパク質はスカベンジャータンパク質ではないことの更なる徴候である。ラットヘイマン腎炎抗原であるｇｐ３３０は、巨大な、多機能性糖タンパク質であるＬＤＬ受容体スーパーファミリーに属する（６８、６９、７０）。ラットｇｐ３３０のヒトにおける相同体としてのカルシウムセンサータンパク質の同定は、ヒトの疾患に対する新規な診断及び治療薬を可能にする。ｇｐ３３０又はその生物学的に活性な断片対する診断及び治療用途の例は欧州特許出願ＥＰ３５８，９７７号に開示されており、これの全内容は本明細書に参考文献として組み込まれている。例えは、ヒトｇｐ３３０又はその断片をヒト膜性糸球体腎炎と関係した自己抗体を検出するためのアッセイに使用してもよい。適当なアッセイは、例えばＥＬＩＳＡ等のイムノアッセイを含む。代わりに、ヒトｇｐ３３０配列に基づく合成ペプチドを、主要抗原Ｂ−又はＴ−リンパ球認識部位の局在化に使用してもよい。それゆえ、本発明は、ｇｐ３３０特異的自己抗体、ヘルパー、細胞障害性又はサプレッサーＴ細胞の検出を可能にする。本発明は、突発性自己免疫性膜性糸球体腎炎が進行している（develop）患者及び腎臓の同種移植へと続く自己免疫性膜性糸球体腎炎の疑いのある患者の同定を可能にする。ヒトｇｐ３３０は、種々の方法に従うヒト膜性糸球体腎炎治療に有用であり、例えば、ｇｐ３３０をポリフェノールに結合させ、続いて、その全内容が本明細書に参考文献として組み込まれている米国特許第４，７０２，９０７号明細書に従い患者を免疫化してもよい。この方法による治療は、結果として、ｇｐ３３０に特異的な抗体の選択的な免疫抑制を生じる。代替の治療法法として、固体担体上にｇｐ３３０又はその断片を固定化し、担体中に血清を通過させることによりｇｐ３３０反応性自己抗体を血清から除去し、これによって、ヒト膜性糸球体腎炎に特徴的な自己抗体を効率的に除去することもできる。代わりに、免疫複合体の形成を動揺させるために、ヒトｇｐ３３０又はその断片を患者に直接投与することができる。ヒトｇｐ３３０配列に基づく合成ペプチドも治療学的に有用である。免疫原性ペプチドの投与は、ｇｐ３３０特異的ヘルパー及び細胞障害性Ｔ細胞の活性化又は機能化を阻害する。ヒトｇｐ３３０構造は、隣接した細胞外膜近傍領域(immediate extracellular juxtamembrane region)に８つのＹＷＴＤスペーサー領域により分けられる１６の成長因子リピート及び１つの上皮成長因子リピートを含む（図１１）。それゆえ、成長因子活性を有するｇｐ３３０又はその断片の投与は、例えば火傷及び擦過傷等の創傷治療に有用である。上皮成長因子は、可能性のある胃酸分泌阻害剤でもある。それゆえ、上皮成長因子活性を有するｇｐ３３０又はその断片は胃潰瘍の治療又は防止に有用である。投与用の治療薬の有効量の決定は、開業医の技術の範囲内にある。考察カルシウムのホメオスタシスの鍵となる制御因子としての副甲状腺の重要な役割は、細胞外Ｃａ²⁺イオン濃度の変動を感知し、応答する精巧な能力に関係してきた。外側のカルシウムの変化の認識に必須なのは、副甲状腺細胞膜のカチオン受容体又はセンサーであり、その存在は、副甲状腺細胞調節に関する一連のインビトロにおける研究に含まれている（implicate）（９、１０、２１〜２４）。モノクローナル抗副甲状腺抗体が副甲状腺細胞のカルシウムセンシングを認識し、かつ妨害することを見出したとき、細胞膜受容体の概念は更に実証された（１〜６）。証拠の別の重要な部分は、抗副甲状腺抗体との反応性により選ばれた、ヒト胎盤の細胞栄養芽層細胞が、外側のカルシウムの変化に対する副甲状腺様センシングを発揮し、その機能は抗副甲状腺抗体の１種によってブロックすることができることが見出されたとき、得られた（７、８）。引き続いて、胎盤のカルシウムセンサーを免疫吸着及びイオン交換クロマトグラフィーにより単離し、それは約５００ｋＤａの分子の大きさを有する巨大な糖タンパク質からなることを示した（７）。同一の大きさを有するタンパク質が、副甲状腺及び尿細管細胞内で抗副甲状腺抗体と反応することが免疫沈降により証明された(公開される(２５ ))。副甲状腺のカルシウムセンサー又は受容体は、通常の結合能力を示し、二価のカチオンにより活性化されるけれども、細胞の活性化に対する他のほとんどの古典的な受容体共通した特徴を有することが知られている。カチオン結合は、おそらく分結合したＧタンパク質を介して、［Ｃａ²⁺ｉ］及び同時のホスホリパーゼＣの活性化における二相性の増加（biphasic rise）の引き金を引き、結果として、イノシトールリン酸の蓄積を引き起こす(２、５、９、１０)。［Ｃａ²⁺ｉ］の初期の一時的な増加は、イノシトール三リン酸（Ｉｐ３）誘導による、細胞内ソースからのＣａ²⁺の移動によるものであり、一方、［Ｃａ²⁺ｉ］の定常状態における上昇（steady-state elevation）の保証は、おそらくイノシトール四リン酸（Ｉｐ４）の増加により介される、原形質膜を通したカルシウムゲーティング（gating）により引き起こされる。部分ｃＤＮＡクローンの配列解析及び推論したアミノ酸のデータベースによる比較は、胎盤のカルシウムセンサータンパク質は、タンパク質のＬＤＬ−受容体スーパーファミリーに属することを示し、入手できる配列は、ラットヘイマン腎炎抗原と密接な類似性を示した（１１、１５、１６）。この抗原は当初、３３０ｋＤａの糖タンパク質（ｇｐ３３０）として記載されており、基部の尿細管の刷子縁内及び胎盤並びに精巣上体細胞に存在するが、しかし、特別の染色技術によっても、ラット腎糸球体細胞、肺細胞並びに肝臓及び小腸の散発性細胞に低密度で発生することが証明されている（１７〜１９）。タンパク質の分子の大きさは過小評価されおり、実際５００ｋＤａの範囲にあることが後に示唆された(２０) 。ヘイマン抗原は、ラットにおいて、粗製の尿細管タンパク質画分を用いて免疫した後の、膜性の、自己免疫性糸球体腎炎を引き起こす支配的抗原(dominating antigen)であることが明らかになった（１７、１９）。抗ｇｐ３３０抗体を用いて、推定される４００ｋＤａより大きい分子の大きさを有するタンパク質をヒトにおいて同定した（２０）。ヒト胎盤の５００ｋＤａカルシウムセンサータンパク質とラットヘイマン腎炎抗原との間の７７％の配列同一性は、２つの異なる種において、カルシウムセンサータンパク質の関連した型を表わすことを示した。この見解は、本研究の免疫組織化学によって明らかになった、２つのタンパク質の組織分布における近い類似性により支持される。したがって、カルシウムセンサータンパク質と反応する抗体Ｅ１１及びＧ１１は、副甲状腺細胞、基部の尿細管細胞、胎盤の細胞栄養芽層及び精巣上体細胞を染色する。更に、本発明者らは、被覆小窩及び基部の尿細管の微絨毛内の、１つの抗副甲状腺抗体を用いた優先的な染色を最近発表したが、これはｇｐ３３０タンパク質に対する抗体についての既存の記載に等しい（１９、２６）。同様の大きさを有する、尿細管の刷子縁内の認識された糖タンパク質である、腎臓マルターゼは主に微絨毛膜に位置し、被覆小窩内には配置しない（１８）。ＬＤＬ受容体スーパーファミリー、ＬＤＬ受容体、ＬＤＬ受容体関連タンパク質及びヘイマン抗原の更に認識されたメンバーは、タンパク質に対する受容体として機能すると考えられているが、全てのメンバーは機能的に重要なＣａ²⁺結合活性を示す。このようにして、Ｃａ²⁺結合は、ＬＤＬ受容体とａｐｏ−Ｂとの相互作用に必要である（２７）。ＬＤＬ受容体関連タンパク質（α₂マクログロブリン受容体）もＣａ²⁺への結合し、立体配置的な変化を誘導することが知られており、Ｃａ²⁺は活性化α₂マクログロブリンの受容体への結合に必要である（１６）。最近、Ｃａ²⁺と相互作用するブロッティング技術により、ヘイマン抗原が示された（２８）。カルシウムセンサータンパク質のＣａ²⁺結合部分は同定されたままである。センサータンパク質（ヘイマン抗原と同様）は、ＬＤＬ受容体スーパーファミリーの他のメンバー（１１、１６、２７）と同様、ＥＧＦ様モジュールを含み、これは推定上のＣａ²⁺結合部位を表わすかもしれない。このようにして、凝固因子ＩＸ、凝固因子Ｘ及びプロテインＣが存在するとき、個々のＥＧＦ様モジュールは１つのＣａ²⁺イオンに結合することが知られており（２９〜３４）、ＥＧＦ様モジュールは、Ｃａ²⁺依存タンパク質／タンパク質相互作用（protein/protein in teraction）を仲介することが知られている（３５）。動力学的データは、カルシウムセンサーは、Ｃａ²⁺との相互作用において、正の協同作用、すなわち細胞外カルシウムの生理的範囲内の非常に高い関係（steep relation）を有する［Ｃａ²⁺ｉ］のＳ字型調節（sigmoidal regulation）及びＰＴＨ放出に必須であろう現象を発揮することを示唆した。正の協同作用は、おそらく、通常、ＬＤＬ受容体スーパーファミリー分子に存在する反復性ＥＧＦ様モジュールから得られる、Ｃａ²⁺に対する複数の結合部位を必要とする（１１、１６、２７）。しかしながら、ＥＧＦ様ドメインへのＣａ²⁺の結合は、三次元構造の微量の、局在化した動揺を誘導することが知られており（３２）、それゆえカルシウムセンサーは他のＣａ²⁺結合部位をも含むことは可能である。４３ｋＤａの膜タンパク質（α₂マクログロブリン受容体関連タンパク質又はヘパリン結合タンパク質）（２８、３６）は、ＬＤＬ受容体関連タンパク質及びラットヘイマン抗原の両者と、Ｃａ²⁺依存した様式で相互作用することが知られている（２８）。このタンパク質に対して、生理学的機能は全く割り当てられていないが、ヘイマン抗原及びＬＤＬ受容体関連タンパク質が発現していない組織においても現れるだろう（２８）。ロイシンジッパー部分は膜のイオンチャンネルの開口と閉鎖に影響を与えると示唆されていることを考慮すると（３７）、興味をそそる知見は、４３ｋＤａのタンパク質のアミノ末端部分の推定上のロイシンジッパー部分の存在である。４３ｋＤａのタンパク質はヘイマン抗原と相互作用するので、Ｃａ²⁺依存した様式で、カルシウムセンサータンパク質と複合体を形成することが推定される。４３ｋＤａのタンパク質との相互作用は、分子の細胞外部分におけるＣａ²⁺誘導の立体配置的な変化の細胞内部への伝達にとって重要であろう。Ｃａ²⁺依存した様式で、カルシウムセンサータンパク質との更なる相互作用も可能であり、そのような相互作用は、センサーの応答の調節にとって重要である。本発明者らは免疫沈降を利用した予備的な実験を行い、［³²ｐ］− オルトリン酸塩を用いて負荷をかけた、分散した副甲状腺細胞のセンサータンパク質のリン酸化型を単離したけれども、活性化されたカルシウムセンサーが細胞内部への更なるシグナル伝達の引き金を引くメカニズムは不明である（未公開の見解）。胎盤のカルシウムセンサータンパク質は、多分副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）合成及び/又は１，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃代謝のカルシウム調節を仲介することによる、胎児母性（feto-maternalno）Ｃａ²⁺勾配及びＣａ²⁺輸送の維持に関係しているかもしれない（８）。胚盤胞内における存在（未公開の見解）は、接着分子としての機能を示し、ヘイマン抗原について示唆されるように（３８）、分化又は成長の調節における関係を関係づけるかもしれない。尿細管の刷子縁内のカルシウムセンサーの機能は充分に調査されていない。しかしながら、細胞外のカルシウムによって調節される胎盤及び基部の尿細管に存在する酵素１−α−ヒドロキシラーゼは、したがって、カルシウムセンサーは１，２５（ＯＨ）₂Ｄ₃代謝を調節するだろうが、糸球体ろ過からのＣａ²⁺再吸収に影響を与える可能性があるかもしれないことに注意すべきである（７〜９）。精巣上体及びラット肺、肝臓及び腸細胞におけるカルシウムセンサータンパク質の存在の重要性は、ヘイマン抗原の分布により関係づけられるように（１８、１９）、不明のままである。しかしながら、一般的なカルシウムのホメオスタシスとは離れて、発達中又は分化した状態のいずれの間、幾つかの細胞の型が種々の機能を調節するためのＣａ²⁺センシング能力を発揮することが示唆されている(１０)。自己免疫腎炎との関連は、ヘイマン抗原が免疫原性分子であることを実証している。本発明者らは、循環する副甲状腺自己抗体の存在及び初期のＨＰＴ患者の病理学的副甲状腺組織におけるクラスＩＩ移植抗原（class II transplantation antigen）の誘導を最近報告しているので、副甲状腺の障害においてもこのことが暗示される。これらの知見は、自己免疫現象はＨＰＴ（３９）に関係していることが示唆され、自己免疫も希な突発性副甲状腺機能低下症において暗示されている（１０）。カルシウムセンサーに対するｃＤＮＡクローンの有効性は、副甲状腺障害の病理学の広範な研究及び家族性低カルシウム尿症性高カルシウム血症（familial hypocalciuric hypercalcemia）（ＦＨＨ）家系における副腎及び尿細管のカルシウムセンシング機能に影響を与える、可能な遺伝子異常（genetic abberration）の調査を可能にするだろう（４０、４１）。当該技術分野の当業者は、配列番号３、１１、８３、８５、８７及び８９から得られる情報を、カルシウムセンサーをコードする遺伝配列の単離のために使用することができる。好ましくは、ＰＣＲ技術と組み合わせた重複するｃＤＮＡ配列の解析が用いられる。遺伝子配列は、重複する遺伝ゲノム製コスミド及び／又はラムダファージクローンから得ることができる。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Human calcium sensor protein, its fragment and DNA encoding it This application is No. PCT / SE94 / 0048 filed May 24, 1994. No. 08/34, filed on November 23, 1994, which is a continuation-in-part of No. 3 No. 08 / filed Jun. 7, 1995, which is a continuation-in-part of U.S. Pat. No. 487,314 is a continuation-in-part application. Background art The present invention relates to a human calcium sensor protein for parathyroid, placental and tubular cells. For cDNA clones encoding quality. International Application No. WO 88/03271 discloses a parathyroid hormone (P TH) Parathyroid membrane-associated calcium is critically involved in calcium regulation of release Cell receptor (parathyroid cell membrane-bound calcium receptor) or sensor Monoclonal anti-parathyroid antibodies have been described (1, 2). Acceptance Body function is essential for maintaining normal plasma calcium levels, and hyperparathyroidism (HPT) Reduced receptor expression in proliferating parathyroid cells of patients It causes secreted calcium insensitivity and indefinite severe hypercalcemia (3 ~ 6). In addition, the reactivity against antiparathyroid antibodies was also observed in the base tubule cells and human placenta. Has been demonstrated for cytotrophoblast cells in Identical cytoplasmic calcium [Ca²⁺i] (7, 8). The antibody-reactive structure has a calcium sensing function ( calcium sensing function), and these cells As part of the syncytia, the calcium sensor is a home for fetal calcium. It has been proposed to be actively involved in ostasis (7, 8). Base urine Antibody-reactive structure of tubule cells showed similar calcium sensing function Thus, calcium sensors are more common in calcium regulation through the organ system Have been suggested to play a critical role (1, 7, 9, 10). In HPT patients with hypercalcemia, one or more parathyroid (parathyroid) gland) is removed. HPT is a very common obstacle And surgery is quite expensive, sometimes Having an alternative to this surgical procedure, as it entails some danger, Very preferred. The calcium sensor / receptor is identified as a single-chain 500 kDa glycoprotein. It is clear (7). However, the amino acid sequence and its corresponding DNA The sequence is not known to date. Summary of the Invention Therefore, it is an object of the present invention to provide a complete characterization of the calcium sensor / receptor. Provide enough calcium sensor / receptor structural data to enable And In one aspect, the invention relates to human calci of parathyroid, placental and tubular cells. The complete amino acid sequence of the um sensor protein is provided. In another aspect, the invention provides a nucleic acid sequence encoding a human calcium sensor Nucleic acid probes for the identification of and other novel calcium sensor proteins Offer Another object is to provide novel therapies and compounds and combinations for treating calcium-related disorders. The use of said structural data to design a product. In other aspects, the present invention relates to SH2 and S3 involved in signaling pathways. Cytoplasmic domain of calcium sensor protein homologous to H3 binding moiety (motif) Provides identification of peptide regions within the main. Two related to the perturbation of calcium ion homeostasis Important human diseases are hyperthyroidism and osteoporosis. Therefore, one In one embodiment, the cell expressing a calcium sensor protein or a fragment thereof Cells containing cDNA encoding the calcium sensor protein of the present invention Calcium sensor, including signaling pathways related to sensor activity Used in assays to identify molecules that block or enhance protein activity You may. These molecules are responsible for PTH levels, vitamin D3 synthesis, estrogen, Osteoclast or osteoblast activity (hence bone resorption and / or bone formation), calci Mammals associated with perturbations in um secretion and calcium ion homeostasis May be useful in treating pathological conditions of The present invention provides a cDNA clone encoding a human placental calcium sensor / receptor. Isolation and characterization and the presence of the corresponding mRNA in the parathyroid and kidney For the Northern blot to prove. Calcium sensor and rat Hayman nephritis Close sequence similarity with the antigen gp330 (11,67) indicates that A calcium sensor common to the thyroid and tubules is related to this antigen, gp A human homologue having 330 human homologs and having receptor function and calcium binding ability It suggests that it belongs to a large glycoprotein family. Therefore, the present invention A further object is to provide a diagnostic measurement method and a treatment method based on human gp330. That is. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. Calcium sensor protein using Lys-C endoprotease Isolation by HPLC of the peptide obtained after digestion (solid line). The dotted line is calcium Represents the chromatography of the same reaction without the sensor. Flow rate is 100 μl / Min. Two peptide fractions giving sequences that can be easily interpreted Indicated by arrows. FIG. Two Lys isolated by HPLC of calcium sensor protein -Sequence of the C peptide (SEQ ID NOs: 1 and 2). FIG. CDNA clone encoding a part of calcium sensor protein Partial nucleotide sequence of pCAS-2 (SEQ ID NO: 3) and the deduced amino acid Acid sequence (SEQ ID NO: 4). Inferred amino acids identical to peptides 292 and 293 The no acid sequence is underlined. FIG. Heima of the amino acid sequence of the calcium sensor protein (SEQ ID NO: 4) Antigen (Hayman, SEQ ID NO: 5), low-density lipoprotein receptor (LDL-RC, sequence No. 6) and the corresponding parts of the LDL-related receptor protein (LDLRRP, SEQ ID NO: 7) Alignment. Stars indicate calcium sensor proteins and other Identical residues are indicated between any of the sequences. X indicates no identity The position in Heyman antigen is shown. FIG. Parathyroid adenoma (1), kidney (2), liver (3), placenta (4), pancreas (5) Blot analysis of total RNA derived from, adrenal gland (6) and small intestine (smallgut) (7) . The filter was hybridized with a 2.8 kb pCAS-2 insertion probe, and The reaction was then visualized with a phosphorimager. 28 The positions of S and 18S ribosomal RNA are indicated. FIG. Complete nucleotide of 2.8 kb cDNA clone of human calcium sensor Pide sequence (SEQ ID NO: 11) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 12). Sensor transmembrane The communication domain is shown in bold type. The three SH3 binding regions are underlined ( Underline or overline), an overwrite line was drawn in the SH2 binding region (strikethru). FIG. The amino acid sequence of the calcium sensor cytoplasmic domain (SEQ ID NO: 13); Three calcium sensors for known SH3 binding moieties (SEQ ID NOs: 20-37) -Comparison of SH3 binding regions (SEQ ID NOs: 14-16). FIG. SH3 binding region of calcium sensor and various G containing SH3 domain Comparison of relative binding strength with ST fusion proteins. FIG. The SH2 binding region of the calcium sensor (SEQ ID NO: 19) and the p3 of PI3K Required for interaction of the 85 regulatory subunit with the SH2 region (SEQ ID NOs: 38-78) Comparison with various amino acid sequence requirements. FIG. EGF repeat, growth factor repeat and YWTD space Structure of human gp330 containing a sir region. N indicates the amino terminus of the protein; Indicates a carboxy terminal. The arrow indicates the position of the transmembrane region. FIG. A strategy to extend the CAS sequence from pCAS-2. FIG. Identical regions in different CAS cDNA sequences with distinct amino acid sequence differences Area comparison. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Unless otherwise indicated herein, the terms set forth below have the indicated meanings . The term "polypeptide" refers to the amino acid Means a linear sequence of amino acids linked together by a peptide bond between the sil group You. As used herein, "substantially purified" means "substantially homogeneous." Which are compounds that are normally bound under standard conditions (eg, Other proteins or peptides, carbohydrates, lipids) Defined. "Substantially purified" means an artificial or synthetic mixture with other compounds. It does not mean to exclude things. The term also implies impurities that do not interfere with biological activity. It does not mean to exclude the presence of a substance, e.g. incomplete purification or pharmaceutically acceptable Due to the preparation and mixing, impurities may be present. The term "biologically active polypeptide" refers to a naturally occurring polypeptide. (Naturally occurring polypeptide) itself, a synthetically produced polypeptide And analogs thereof and natural and pharmaceutically acceptable salts and pharmaceutically acceptable A biologically active polypeptide analog, including derivatives thereof, is meant. Also, "raw "Physically active polypeptides" are biologically active fragments thereof and "biologically active polypeptides". Analogues of the sequence that are active in the sense ". Even if different types of peptides exist Good. These mutations are structures that encode proteins with the same biological function. It will be characterized by differences in the nucleotide sequence of the gene. "Biologically active sequence analogs" refer to single or multiple amino acid substitutions (substi tution), deletions, additions or replacements. No. Such mutants that retain one or more of the properties of the natural biological activity. All allelic variants, modifications and analogs are included within the scope of the present invention. In this application, nucleotides are referred to as bases using the standard one-letter abbreviations shown below. Indicated by Guanine G Adenine A Thymine T Cytosine C Unknown N In this application, amino acid residues are indicated using the standard one-letter abbreviations shown below. . Alanine A Cysteine C Aspartic acid D Glutamic acid E Phenylalanine F Glycine G Histidine H Isoleucine I Lysine K Leucine L Methionine M Asparagine N Proline P Glutamine Q Arginine R Serine S Threonine T Valine V Tryptophan W Tyrosine Y Unknown X The term "amino acid" as used herein refers to the natural amino acids listed above. It is meant to indicate amino acids and their functional equivalents. The present invention provides a common calcium sensor protein for parathyroid, placental, and tubular cells. SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85 Consisting of a coding sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 87 and SEQ ID NO: 89, An isolated nucleic acid molecule is provided. Further, the present invention provides for the functional area of a calcium sensor protein or sensor A vector comprising an isolated nucleic acid molecule encoding a fragment thereof to be encoded . Further, the present invention relates to a method for producing a calcium sensor protein, The nucleic acid sequence encoding the sensor or its fragment is placed in a suitable vector and obtained. The resulting vector is inserted into a suitable host cell, and Recovered calcium sensor protein, and then recovered calcium sensor protein A method comprising purifying Calcium sensor protein or its This method of producing a fragment of a recombinant DNA technology is well known in the art. Use surgical techniques. Instead, standard solid-phase methodologies for peptide synthesis are used. ) May be prepared. The present invention also relates to calcium secretion in vitro, ex vivo, or in vivo. To down regulate or block the expression of the sensor protein An antisense nucleic acid is provided that can be used. Down-regulation of gene expression It can be performed at both the translation or transcription level. The antisense nucleic acid of the present invention, More preferably, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, All or part of the sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 87 and SEQ ID NO: 89, or Is an R that can specifically hybridize with the corresponding messenger RNA NA fragment. These antisenses are described, for example, in European patent application EP 9257. No. 4, as appropriate, modified to improve selectivity stability SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: No. 87 and SEQ ID NO: 89, prepared based on a sequence selected from the group consisting of It may be a oligonucleotide. In addition, calcium expression is DNA producing RNA complementary to all or a part of mRNA of a sensor protein It may be an array. These antisenses are in the opposite orientation (Europe). (State Patent Application No. EP140308), SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: No. 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, and SEQ ID NO: 89. It may be prepared by expressing all or part of the sequence. Materials and methods Tissue specimen A sample of the human parathyroid gland was obtained during surgery on an early HPT patient. Other human Tissue specimens (kidney, epididymis, liver, pancreas, adrenal gland, small intestine, spleen, lung and striated muscle) And collected from organs removed during surgery. Human placental tissue is used for Collected in connection with uncomplicated pregnancy. All samples are isopen Snap frozen immediately in tan and stored at -70 ° C. Isolation of calcium sensor protein from human placenta 500 kDa calcium sensor protein from a total of 25 human placentas Immunoadsorption and ion exchange chromatography according to procedure (7) already described. And purified. This procedure involves two different monoclonal Thyroid antibodies (1,7), different antigen determination of calcium sensing protein E11 and G11, which are known to bind to groups, were utilized. E11 is functional G11, on the other hand, showed no effect on both parathyroid and placental cells. Effectively blocked calcium regulation (1,7). After purification, Prior to enzymatic digestion, Zorbax G Gel chromatography in F25 gel column (9.2 × 250 mm) Was. Cleavage and sequencing of isolated peptides Endops obtained from Achromabacter lyticus Cleavage of the 500 kDa protein using the Rotase LysC Microbore (Brownlee microbore) C_FourIn a column (2.2 × 30 mm) Separation and then trituration in 5% acetonitrile in 0.02% trifluoroacetic acid Balanced. Linear gradient of 5-60% acetonitrile in 0.02% trifluoroacetic acid Distribution Was used for peptide elution, using a Waters 990 diode array test. Dispensers (Millipore Corporation, Milford (M illford, Mass.) at 214 nm. Was. The amino terminal sequence of the peptide was converted to ABI 120A PTH-amino acid chromatograph. ABI 470A Gas Phase Sequenator equipped with Applied Biosystems, Foster City, California Fornia (Ca), United States (USA)). Oligonucleotide synthesis ABI 381 oligonucleotide synthesizer (Applied Biosystems) Oligonucleotides were synthesized using Thames). Oligonucleotides shown below The mixture of peptides is used as a probe for screening a placental cDNA library. Used. The following two oligonucleotides are synthesized for use in a PCR reaction did. The first 9 nucleotides contain the EcoRI and BamHI sites, respectively. , The remaining nucleotides are 1-6 amino acid residues of peptide 293 and peptide 2 It corresponds to 92 8 residues. Using a mixed oligonucleotide probe, the placental cDNA library Cleaning was performed. Placental 1 gt 11 cDNA library (claw Clontech, California, United States of America) About 2 × 10^FivePlated at plaque density. 10 flats A duplicate filter (Hybond-N +, Amersham) of the plate was added to 5 × SSPE ( SSPE, 120 mM NaCl, 8 mM NaH_TwoPO_Four, 0.8 mM EDTA PH 7.4), 5 × Denhardt's solution (12), 0.5% SDS, 20 μg / ml Single-stranded salmon sperm DNA (Sigma Chemical Corporation) Co.), prehybridized in S: t Louis, Ohio) Soy. γ- [³²p] -ATP and polynucleotide kinase (Amersham) The mixed oligonucleotide probe end-labeled using Add to the hybridization mixture (30 x 10 in 50 ml)⁶cpm), Hybridization was performed overnight at 42 ° C. Filter in 2 × SSPE Wash twice, once in 0.1 × SSPE and place on autoradiography screen Exposed, then Phosphor Imager (Molecular Dynamics (Mole cular Dynamics), image counting W (Image Count S.W.), Sambu (Sun Valley, California (Ca)). PCR reaction A part of the λgt11 cDNA clone CAS-1 was replaced with peptide 292 and Amplification was performed by PCR using two denatured probes corresponding to the 293 portion. Less than The following conditions were used. 170 ng of template DNA, each oligonucleotide as a primer 1 pmol mixture of nucleotides, 3 mM dNTPs, 0.7 Taq polymerase 5u. Reactions were run on a Perkin-Elmer 9600 PCR machine ( Perkin-Elmer, Norwalk, USA) 20 μl of 0 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1.5 mM MgCl_Two, 50 Performed in mM KCl. Denaturation at 94 ° C for 2 minutes, Anilin at 47 ° C for 1 minute 2 cycles of extension and 1 minute 30 seconds at 72 ° C., followed by 5 minutes at 94 ° C. for 5 minutes. Cycle of final extension at 4 ° C for 45 seconds, 72 ° C for 1 minute, then 72 ° C for 10 minutes. Was performed 33 times. Screening of placental cDNA library using PCR fragment as probe A placental λZAP-II cDNA library was prepared by random priming (random priming). priming) and a PCR fragment derived from cDNA clone CAS-1. Screened using as lobe. Perform screening as described above. Was. 2 × 10 distributed on a 20 × 25 cm agar plate⁶Plaque is screenini Was done. Determination of nucleotide sequence The insert of the phage clone CAS-2 was transferred to a helper phage (Stratagene). (Stratagene), La Jolla, California) Dissociated into the Bluescript + vector . Nucleotide sequencing reactions using Applied Biosystems kits Utilization was performed according to the cycle sequencing procedure. The sequence was transferred to the Data Collection Program VIII software (Data Collection ABI3 using Program VIII software (Applied Biosystems) Analyzed on a 73 A DNA sequencer. CAS-2 2.8 kb Completion of the cDNA sequence is performed using Sequenase (United Stay Dideoxynucleotides using United States Biochemical By the dideoxynucleotide chain-termination method Achieved and is shown in FIG. 6 (SEQ ID NO: 11). Multiple sequencing analysis analysis) was performed on both strands of CAS-2 to confirm the sequence. cDNA The amino acid sequence deduced from the sequence is converted to a Mac vector DNA / RNA software Wear analysis package (Macvector DNA / RNA software analysis pack age) (Macintosh). Reverse transcriptase PCR amplification and human lambda kidney cDNA library³²P label Cloning of CAS cDNA (SEQ ID NO: 83) Using Lobe Screening Completed. Full-length human placenta (SEQ ID NO: 85), kidney (SEQ ID NO: 87) and parathyroid gland (SEQ ID NO: 89) was obtained by PCR amplification of the cDNA sequence of human placenta, kidney and Obtained from a thyroid cDNA library as described below. Specific plastic The first-strand cDNA (specifically primed first-strand cDNA) SEQ ID NO: 83, total RNA RNAzol B method (Tel-Test) and And cDNA synthesis kit (Promega). Indicated distribution The following primers with row positions were used in the reaction. Four additional reverse transcriptase (RT) reactions were performed using the primers shown below. . RT reaction 1 (RT1) Primer G29as RT reaction 1 (RT2) Primer E2as RT reaction 1 (RT3) Primer 23.5 RT reaction 1 (RT4) Primer G31as The following primers were used in a PCR reaction with the listed RT reactions.Primer RT reaction Fls / G7as RT1 G20s / G29as RT1 G26s / G16as RT2 G16s / E2as RT2 E4s / B9as RT3 B5s / 23.5 RT3 G19s / G36as RT4 G35s / G31as RT4 PCR amplification of the first linear cDNA was performed using the program shown below. Performed in a N-Elmer 9600 Thermal Cycler . One denaturation cycle at 94 ° C for 2 minutes, 40 denaturation cycles at 94 ° C for 15 seconds Annealing at 51 ° C. for 10 seconds and extension at 72 ° C. for 3 minutes, followed by reaction The products were separated by electrophoresis and gel purified (QIAGEN) . PCR reagents were purchased from Perkin-Elmer and used as suggested by the manufacturer . Subsequently, the PCR fragment was subjected to the dideoxynucleotide chain termination method (Perkin-L). Ma ー Prism Die Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Prism Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit) and ABI 3 73 Using an automatic DNA sequencer (Applied Biosystems) Nucleotide sequencing was performed. PCR fragments from four separate reactions were combined on both strands. Were sequenced and the sequence data was confirmed. Computer generated DNA sequencing The analysis is performed using Auto-Assembler and Factura ( Applied Biosystems), MacVector (MacVector) and AssemblyLIGN (Eastman Kodak Company (Eastm an Kodak Company)). Database search Using the FAST DB algorithm, EMBL- of mat (Intelligenetics format) (Intelligenetics Rel. 5.4) 31 databases were searched for sequence similarity to placental cDNA (13). Immunostaining and Northern blot Immunohistochemical studies were performed on monoclonal antiparathyroid antibodies E11 and G1. 1 at a concentration of 5 μg / ml with mouse peroxidase antiperoxidase ( Mouse peroxidase (antiperoxidase) technology together with human placenta, parathyroid gland Acetone-fixed 6 μm for, kidney, epididymis and other human tissues Thick frozen sections were performed. See above (1, 7). Collagen type II (collag A monoclonal antibody against en-type II) was used as a negative control. Tissue sans by acid phenol / chloroform method Total RNA was extracted from the pull. For Northern blot analysis, approximately 10 μg of total RNA is electrophoresed in 1.5% / 37% agarose / formaldehyde gel And nylon membrane (Qiabrane), Diagen G.M. agen GmbH), Düsseldorf, Germany) Search was performed using a 2.3 kb clone labeled by the marking method (see results). Hybridization was performed with 50% formamide, 4 × sodium citrate solution (SSC, 300 mM NaCl, 30 mM sodium citrate, pH 7.0 ), 2x Denhardt's solution, 10% dextran sulfate (Kabi-Pharmacia) harmacia), Uppsala, Sweden) and 100 μg / salmon sperm DNA At 42 DEG C. for 18-24 hours. Filter 1 × SSC / 0.1% Wash with SDS, a final stringency of 30 sin at 42 ° C., then Exposed in the Shole Imager. CAS peptide binding analysis A peptide corresponding to a putative CAS SH3 binding region (ATPPPSPS LPAKPKPPSRR) (SEQ ID NO: 18) was converted to Fastmock ™ (Fa stMoc^tm) Using ABI Model 430A synthesizer with chemistry Synthesized. Peptides were purified by HPLC and analyzed by mass spectrometry. 5m g of peptide as described by the supplier Amino Link (Pierce) was combined with agarose. The efficiency of the coupling , RP-HPLC of peptide solution before and after binding and spectroscopy at 220 nm wavelength Checked frequently. Both methods showed binding efficiencies of> 70%. TT resin Prior to extensive washing with BS, the conjugated peptides were combined with various GST-SH3 fusions. A 5 μg aliquot of the protein was reacted for 1 hour at room temperature. Pigment resin Boil in SDS (SDS loading dye) and then run in SDS-PAGE gel. It was electrophoresed. The binding ability of various SH3 proteins to peptides was Judgment was made based on the intensity of the band stained with Coomassie blue on the band. GST tampa Quality alone was used as a control alone. Expression and purification of GST-SH3 fusion protein Various GST-SH3 containing fusion clones were obtained from Dr. I. Gout (Ludwig University (L. udwig Inst.), Cancer Research (London, UK) Received. The fusion protein was XL1-blue colon using 1 mM IPTG. All were produced by induction of expression in a fungus (XL1-bule E. coli). Fusion protein The cells containing the quality were treated with 10 mM EDTA and 1% Triton-X100. (Triton-X 100) in PBS. Cell debris pelleted After the (pellet), the clarified lysate is applied to a glutathione-Sepharose column (Pharma Pharmacia) and bound fusion protein was added to 50 mM Tris Elution was performed using 10 mM reduced glutathione in (pH 8.0). Then this The purified fusion proteins were used against PBS before use in all subsequent experiments. Extensive dialysis. The protein is determined by measuring the absorbance at 280 nm. Quantification was followed by characterization by SDS polyacrylamide gel electrophoresis . result Isolation, peptide cleavage and sequencing of calcium sensor proteins Pectin chromatography, using immobilized monoclonal anti-parathyroid antibody Immunoadsorption and final ion exchange chromatography The sensorium protein was purified (1,7). Sandwich E with the same antibody Used in LISA to monitor purification (7). Mixing low molecular weight peptides To avoid contamination, a total of 200 μg of the 500 kDa protein chain (7) The final preparation was made 6M with respect to guanidine-HCl, 2M guanidine-HCl Gel chromatography equilibrated with 0.1 M Tris-Cl (pH 8.5) Applied to fee column. The column was eluted with the same buffer. In effect, All protein materials are suitable for proteins with a molecular weight of 500 kDa. It became clear that it was close to the void volume at the expected position. Separation containing this material The fractions obtained were combined and then endoprotease LysC (1 μg) was added. Was. Digestion proceeded overnight at 37 ° C. The fragmented protein was purified with 0.1% β-medium. Return by incubating at 37 ° C for 30 minutes with lucaptoethanol. Followed by alkylation with 4-vinylpyridine (0.3%) at room temperature for 2 hours. It has become. The peptide mixture was then diluted with 5% acetonitrile in 0.2% trifluoroacetic acid. Applied to a reverse phase C4 column equilibrated with toril. Peptide was replaced with 0.02% Elution was by a linear gradient of 5-60% in fluoroacetic acid (FIG. 1). Of many peptides Therefore, the elution pattern was complicated. Some peptide fractions were subjected to gas phase sequencing. The sequence was determined in the sir and the two fractions yielded easily interpretable sequences (FIG. 2). , Array Numbers 1 and 2). Isolation of a cDNA clone encoding a 500 kDa calcium sensor Oligonucleotides encoding amino acid residues 2-17 of sequenced peptide 292 A reotide mixture (48 bp) was constructed. Reduce the complexity of oligonucleotide mixtures Guidance is not available from codon usage in humans to reduce Five inosine bases were inserted into the positions. Nine possible positions for two bases And one of the bases has a potential of more than 70% from codon usage Therefore, the base was used in the oligonucleotide mixture. The mixed oligonucleotide was radiolabeled and the human placenta λgt11 cDNA It was used as a probe in the screening of the library. About 2 × 10⁶Plaque Was screened and found a single positive clone, CAS-1. Restriction The insert of this clone was estimated to be 2.3 kb by enzyme mapping. K In order to obtain a sequence that is recognizable by the lawn, one of peptides 292 and 293 was used. PCR amplification using denatured oligonucleotide corresponding to the part as a primer Was. From a distinct DNA fragment of about 430 bp, peptide 292 An estimate was obtained that it was located at the carboxy terminus. Ori equivalent to peptide 293 Fragments were partially sequenced using a mixture of oligonucleotides as primers . In one reading frame of the resulting sequence, the 5 The sequence VGRHI was inferred, which was very consistent with two amino acid residues. Huge insert To obtain clones with large inserts. The reported human placenta λZAP-II cDNA library was Screened using as lobe. About 2 × 10⁶From a single plaque CAS-2, a positive clone, was found. Estimated to be 2.8 kb This clone insert was transformed with Bluescript + (Bluesc ript +) dissociated into the vector. PCAS-2 which is part of this clone insert Was sequenced using a synthetic oligonucleotide as a primer (FIG. 3, sequence Column number 3). Both peptides 292 and 293 were found to contain reading frames. . Amino acid sequence predicted from peptide sequence and cDNA clone (SEQ ID NO: 4) What is Perfectly matched. The complete sequence of the 2.8 kb CAS-2 is shown in FIG. 11). The CAS-2 sequence was extended using standard methodology. Reverse transcriptase PCR amplification as well as³²Screening of human lambda kidney cDNA library using P-labeled probe The cloning of the cDNA of CAS was completed by using the following method (SEQ ID NO: 83). . A probe fragment for the appropriate clone was obtained from clone pCAS-2 (FIG. 11). Designed and duplicated but 5'-extended clones from these libraries Isolated. This cDNA walking operation was performed using clone pMeg2. All cDNA clones except pHP1C8, pHP1B1 and pM4B1 Was used for isolation. These clones were obtained from rat kidney prepared from total RNA. Rat gp330 PCR amplified probe fragment prepared using Reotide number (nts.), 148 to 1249, 2892 to 3873, 4553 to 569 3 and 5868-6968) from a human kidney cDNA library. Released. Three small cloning gaps (amino acid (aa) 564) 997, 1622-1836, and 2212-2312) to specific human gp3 CDNA prepared from 30 oligonucleotide primers and human kidney total RNA Was completed by direct PCR amplification through these regions using (CAS-1) 750, -1210 and -700). The extended calcium sensor sequence is shown in SEQ ID NO: 17. Complete human calciu The sensor sequence is shown in SEQ ID NOs: 83 and 84. Based on the above cloning operation And amino acids 1 to 3711 of SEQ ID NO: 84 were determined from human kidney cDNA, On the other hand, amino acids 3712 to 4655 were identified from the CAS-2 placenta cDNA clone. (FIG. 11). Full length human placenta (SEQ ID NOs: 85 and 86), kidney (SEQ ID NOs: 87 and 88) And the cDNA and amino acid sequence of CAS of parathyroid gland (SEQ ID NOs: 89 and 90) Oligonucleotides designed for SEQ ID NO: 83 as described in Materials and Methods Using primers, total RNA RNAzo1 B method and cDNA synthesis kit Placenta, kidney and parathyroid glands, specifically primed first strand, prepared Determined by sequencing PCR fragments obtained from the cDNA of By comparing all the CAS sequences obtained so far, Only four possible differences become apparent. Ala¹²⁸⁷Is Ala / Pro , Ala²⁸⁷²Is Thr, Lys⁴⁰⁹⁴Are Lys / Glu and Ile⁴²¹⁰Is Ile / Leu (FIG. 12). Ambiguous positions and a few amino acid differences show almost no cD Standardized to reflect the cDNA source used for NA library construction Ethnic and / or allelic variation differences and most Mostly related. 500 kDa placental calcium sensor is the LDL-receptor superfamily Belongs to Database search using amino acid sequence deduced from FIG. 3 (SEQ ID NO: 3) Indicates that the placental 500 kDa protein is an LDL-receptor superfamily It was found to be homologous to a receptor belonging to. The highest similarity is to rats Found for the Iman nephritis antigen (11,67). FIG. 4 shows 500 kDa of placenta. Heyman antigen sequence (SEQ ID NO: 5) and the same protein The other two members of the superfamily, the LDL-receptor (SEQ ID NO: 6) and And LDL receptor-related protein (α_Two-Identical to macroglobulin receptor, (11 , 15, 16), alignment to SEQ ID NO: 7)). Compared area ( Placental calcium sensor and Heyman antigen at 236 amino acid residues) Sequence identity with gp330 was estimated to be 82%. Human calcium chloride The complete sequence of the sensor protein is shown in SEQ ID NO: 83. Rat gp330 and human phase The overall identity with the same was 77%. Figure 10 shows the structure of human gp330. Show. The protein is 4655 amino acids in length and the N-terminal of 25 amino acids End signal peptide, extracellular domain of 4398 amino acids, 23 amino acids It consists of an acid transmembrane domain and a C-terminal domain of 209 amino acids. FIG. As shown in the figure, the structure of human gp330 closely correlates with the structure of the rat homolog. (FIG. 3 in reference 67). Immunohistochemistry and Northern blot Placental 500 kDa calcium sensor protein and anti-rat Heymann nephritis Due to the close similarity to Hara, an expanded immunohistochemical study of this study was attempted. As previously demonstrated for antibodies that react with the Hayman antigen (17-20) , Anti-parathyroid antibodies (E11 and G11) are used to detect parathyroid, placental and basal tubular tubules. It was found to stain epididymal cells as well as vesicles. Using a 2.8 kb clone identified as a probe, human kidney, placenta and Blot analysis of total RNA (about 10 μg / lane) derived from Of about 15,000 bases in all these tissues Two major RNA species were revealed (FIG. 5). Human liver, pancreas, adrenal gland, small intestine ( FIG. 5) and the spleen, lung and striated muscle (data not shown) hybridize. Lacked seeds. Identification of SH2 and SH3 binding regions in cytoplasmic domain of calcium sensor About 100 Src-homologous regions 2 and 3 (SH2 and SH3) respectively and A conserved sequence consisting of 60 amino acid residues, Found in many eukaryotic proteins (42-44). SH3 Domain For example, p80 / p85, myosin 1b, spectrin, neutrophil NADPH Various cytoskeletal-related proteins such as oxidase-related proteins p47 and p67 Quality and several yeast proteins important for morphogenesis (ie, Bemlp and A BP-1), a yeast protein important for mating (FUS1) or ras activity Yeast proteins important for sex control (cdc25 and ste6 (reviewed by Mussachi o et al. (45))). Many SH3-containing proteins The finding that cytoplasm is cytoskeletal-related indicates that SH3 domains are located on or near the plasma membrane. To play a role in the formation of multimeric protein complexes in Was. Certain proteins, including SH2 and SH3 domains, activate activated receptor proteins. Rosin kinase and p21ras guanine nucleotide-releasing protein (guanine Adapter by combining nucleotide-releasing protein (GNRP) -Performs molecular functions. For example, Grb2 and its homologs are active. On phospho-membrane-anchored receptor tyrosine kinase Binds tyrosine via its SH2 domain, and binds SOS to its amino terminal Binds via terminal and carboxy terminal SH3 domains (46-50). this These processes involve the plasma membrane where ras proteins interact and are subsequently activated. To induce the SOS translocation. Therefore, SH2 / SH3 content and SH2 / SH3 binding protein is a highly conserved signal from activated receptors Related to the transmission path. The 2.8 kb human cDNA clone CAS-2 (FIG. 6) (SEQ ID NOS: 11 and 12) ) By complete nucleic acid sequencing and translation, CAS-PEP1 (SEQ ID NO: 14), CAS-PEP2 (SEQ ID NO: 15) and CAS-PEP3 (SEQ ID NO: 16) The presence of at least three possible SH3 binding regions shown was demonstrated. this All three of the CAS-2 cytoplasmic peptide regions share the necessary common arrangement of the SH3 binding region. Columns, which are shown in FIG. 7 along with the CAS peptide (53). CAS-2 Further support for the binding of the cytoplasmic domain of the SH3 region to the evidence in FIG. Show. CAS-2 cytoplasmic domain containing CAS-PEP1 (PSLPAKP, FIG. 7) Synthesize the in-region (ATPPPSPSLPAKPKPPSRR) (SEQ ID NO: 18) did. The peptides were incubated with various purified GST-SH3 fusion proteins. And the relative binding strength of the fusion proteins was analyzed by SDS-PAGE. (FIG. 8). The data show that the SH3 region-containing protein is CAS-PEP1-containing Having an affinity for the peptide is indicated by the relative order of decreasing affinity shown below. Is clearly indicated. Lane 6: SH3-PI3K (phosphoinositol-3 SH3 of the p85 subunit of the enzyme, (54, 55))> lane 7: SH3- PLC-gamma (phospholipase-C gamma, (56))> lane 2: SH3 -FYN (src family soluble tyrosine kinase, (57))> lane 4: SH3-GRB2 (N-terminal SH3 of growth factor receptor binding protein) 5 (SH3 at the C-terminus of GRB2) (58, 59). Significantly, the positively reacting SH3-containing proteins shown in FIG. And is closely associated with stimulation of cell growth (54-59). PI3K has two SHs Includes two regions and one SH3 region. PI3K is a family of signaling molecules Is quite new to insulin signaling via the glucose transporter Believed to be related to ras transmission and directly to ras protein Have been. PLC-gamma is a well-known signaling molecule containing two SH2 regions When stimulated by a ligand-activated growth factor receptor, the membrane lipids Other powerful downstream signaling molecules (eg, IP3 And diacylglycerol). FYN is thin Soluble tyrosine kinase, known to be closely associated with vesicle growth and differentiation Is a highly characterized member of the src family of zeolites. FYN has one Contains SH2 and two SH3 regions, stimulated by ligand-activated growth factor receptor It is also known to receive GRB2 combines two SH2 and one SH3 regions And is known as an adapter molecule in that it has no known endogenous enzymatic capacity. You. It is also known that GRB2 molecule is stimulated by ligand-activated growth factor receptor. Have been. SH3-GAP (GTPase activating protein, lane 3, (6 0, 61)) and SH3-NCF (neutrophil cytotoxic factor type 1, lane 8, or Type 2, lane 9 (62, 63)) is almost free of CAS-PEP1 containing peptides. It is worth noting that it has little or no affinity. This evidence is from CA Supports the specificity of the interaction between S-PEP1 and various SH3 domains . Further, as shown in lane 1 of FIG. 8, CAS-PEP1 was a control GST fusion tag. Does not bind to proteins. The cytoplasmic domain of CAS-2 also consists of the p85-SH2 binding region. Different SH All 2 containing proteins require phosphorylated tyrosine residues for interaction. However, the amino acid residues surrounding tyrosine residues dictate the specificity and strength of the interaction Has been well proven (64). FIG. 9 shows p3 regulatory subunit of PI3K. Amino acid sequence conditions required for interaction with the SH2 region of the kit are defined. evidence Indicates that a tyrosine residue is required to form a binding interaction with the SH2 region of p85. Included in the amino acid sequence portion YXXM ("X" can be any amino acid); About three to five acidic amino acid residues (D or E) must be clearly indicated. This exact amino acid The sequence conditions were determined in the cytoplasmic domain of CAS-2 (FENPIYAQMENE) (sequence No. 19) and the CAS-2 cytoplasmic sequence at the top of FIG. 9 is underlined. Overall, the evidence is that the cytoplasmic domain of the calcium sensor protein of the invention is One of the types recognized by the three common SH3 binding regions and the SH2 region of p85 Prove to contain a potential SH2 recognition region and possibly via PI3K , Via SH2 and SH3 on the biological activity of calcium sensor proteins Support the involvement of signaling. Calcium sensing is a G-protein It appears that there is a relationship between the activation of cytokines, the activation of PKC, and the production of inositol phosphate. All of these are activities that can be involved in the PI3K signaling cascade. So the possible interaction between PI3K and the calcium sensor protein is Regulates CAS-2 protein calcium sensing in human parathyroid tissue More interesting in light of recent evidence of relevance. Therefore, these areas are Compound that stimulates or inhibits the signal transduction pathway used by the um sensor protein Provides a useful tool in assays to identify Assays known to those skilled in the art Activity of SH2 / SH3 region of calcium sensor protein by using technology Agents or antagonists that mimic or inhibit, for example, early hyperparathyroidism (H PT) (52) and useful for the treatment of diseases closely related to sensors such as osteoporosis There will be. LDL-receptor superfamily of calcium sensor protein and protein The relationship with Lee was described above. All members of the LDL-receptor superfamily Members are "scavenger" proteins. These scuba No ginger protein has a recognized signaling domain , There are no scavenger proteins with SH regions. Therefore, Karsi SH2 and SH3 binding regions active in signaling of Identifying the area was completely unexpected. The appearance of these areas, even if Contains a region homologous to the LDL-receptor superfamily of avenger proteins However, calcium sensor proteins are not scavenger proteins. It is a further sign of the fact. The rat Heymann nephritis antigen, gp330, is a large, multifunctional glycoprotein (68, 69, 70). Rat Identification of a calcium sensor protein as a human homolog of gp330 Enables new diagnostic and therapeutic agents for human diseases. Examples of diagnostic and therapeutic uses for gp330 or biologically active fragments thereof are in Europe It is disclosed in patent application EP 358,977, the entire contents of which are incorporated herein by reference. It is incorporated as a bibliography. For example, human gp330 or a fragment thereof It may be used in assays to detect autoantibodies associated with sex glomerulonephritis. Suitable assays include, for example, immunoassays such as ELISA. Instead, A synthetic peptide based on the togp330 sequence can be used to recognize major antigen B- or T-lymphocytes. It may be used for site localization. Therefore, the present invention provides a gp330-specific autoantibody. Allows detection of body, helper, cytotoxic or suppressor T cells. The present invention In patients with idiopathic autoimmune membrane glomerulonephritis (develop) and kidney Enables identification of suspected autoimmune membranous glomerulonephritis following allogeneic transplantation I do. Human gp330 is useful for treating human membranous glomerulonephritis according to various methods, For example, gp330 is attached to polyphenols, and then its entire contents are described herein. No. 4,702,907, incorporated herein by reference. Accordingly, the patient may be immunized. Treatment by this method results in gp330 Results in selective immunosuppression of antibodies specific for As an alternative treatment, solid carriers By immobilizing gp330 or a fragment thereof on top and passing the serum through a carrier gp330-reactive autoantibodies are removed from the serum, thereby reducing human membrane glomerular kidney Autoantibodies characteristic of flames can also be efficiently removed. Instead, the immune complex Administration of human gp330 or a fragment thereof directly to a patient to upset the formation of be able to. Synthetic peptides based on the human gp330 sequence are also therapeutically useful. You. Administration of the immunogenic peptide may be dependent on gp330-specific helper and cytotoxic T cells. Inhibits vesicle activation or functioning. The human gp330 structure is located in the adjacent extracellular membrane region (immediate extracellular juxtamembrane region) divided by eight YWTD spacer regions And one epidermal growth factor repeat (FIG. 11). Soy sauce For example, administration of gp330 or a fragment thereof having growth factor activity can be performed by, for example, burning and abrasion. It is useful for treating wounds such as injuries. Epidermal growth factor is a potential gastric acid secretion inhibitor But also. Therefore, gp330 or a fragment thereof with epidermal growth factor activity is It is useful for treating or preventing ulcers. Determining the effective amount of therapeutic agent for administration will depend on the skills of the practitioner. Be within the scope of surgery. Consideration Critical role of parathyroid gland as a key regulator of calcium homeostasis The percentage is extracellular Ca²⁺In relation to the sophisticated ability to sense and respond to changes in ion concentration Came. Essential for recognition of changes in outer calcium is the cation of the parathyroid cell membrane Receptor or sensor, the presence of which is a series of inputs related to parathyroid cell regulation. It has been implicated in studies in vitro (9, 10, 21-24). Monoclonal anti-parathyroid antibody recognizes calcium sensing in parathyroid cells , And when found to interfere, the concept of cell membrane receptors was further demonstrated (1 ~ 6). Another important piece of evidence was selected for reactivity with anti-parathyroid antibodies, Human placental cytotrophoblasts provide a parathyroid like response to external calcium changes. Exerts its sensing and its function is blocked by one of the anti-parathyroid antibodies Was obtained when it was found to be possible (7, 8). Then, the placenta cal The sensor was isolated by immunoadsorption and ion exchange chromatography. It consists of a giant glycoprotein with a molecular size of about 500 kDa. (7). Proteins of the same size are found in parathyroid and tubular cells Reacts with anti-parathyroid antibodies in immunoprecipitation (published (25 )). Parathyroid calcium sensors or receptors exhibit normal binding capacity and are divalent Although activated by cations, most other anti-cells activate cells. It is known that typical receptors have common features. Cationic bonds are [Ca] via the covalently bound G protein²⁺i] and simultaneous phospholipase Trigger the biphasic rise in the activation of C and consequently Cause the accumulation of inositol phosphate (2, 5, 9, 10). [Ca²⁺i] The initial transient increase in intracellular activity is due to inositol triphosphate (Ip3) induction. Ca from source²⁺, While [Ca²⁺i] in the steady state Guarantee of steady-state elevation is probably inositol tetraphosphate Calcium gating across the plasma membrane mediated by increased acid (Ip4) (Gating). Sequence analysis of partial cDNA clones and database of inferred amino acids In comparison, the placental calcium sensor protein is a protein LDL-receptor The sequence available, indicating that it belongs to the superfamily, is rat Hayman kidney It showed close similarity to the flame antigen (11, 15, 16). This antigen was initially 330 Described as a kDa glycoprotein (gp330) and prints the proximal tubule Present in the offspring and in the placenta and epididymis, but due to special staining techniques Low density in rat kidney glomerular cells, lung cells and sporadic cells in liver and small intestine (17-19). The size of the protein molecule is It was underestimated and was later suggested to be in the range of 500 kDa (20) . Hayman antigen is immunized in rats using crude tubular protein fractions. Dominating antigen (dominating) that causes membranous, autoimmune glomerulonephritis after antigen) (17, 19). Using anti-gp330 antibody A protein having a molecular size greater than the estimated 400 kDa (20). 500 kDa calcium sensor tamper of human placenta 77% sequence identity between protein and rat Heymann nephritis antigens indicates that two different species , A related type of calcium sensor protein. This view has been clarified by the immunohistochemistry of this study, which describes two proteins. Is supported by close similarities in tissue distribution. Therefore, calcium Antibodies E11 and G11, which react with circulatory proteins, are found in parathyroid cells, Duct cells, placental cytotrophoblasts and epididymal cells are stained. In addition, we have Priority using one anti-parathyroid antibody within the coated pits and microtubules of the proximal tubules Recently announced a specific staining for antibodies to the gp330 protein. (19, 26). Tubular brush border of similar size Kidney maltase, a recognized glycoprotein within, is located primarily in the microvillous membrane, Do not place in covered pits (18). LDL receptor superfamily, LDL receptor, LDL receptor-related protein Further recognized members of the quality and Heyman antigens are receptors for proteins. It is believed that all members have functionally important Ca²⁺Join Show activity. In this way, Ca²⁺Binding is the phase between LDL receptor and apo-B Required for interaction (27). LDL receptor-related protein (α_TwoMacro glob Phosphorus receptor) also Ca²⁺And is known to induce conformational changes And Ca²⁺Is activated α_TwoRequired for macroglobulin binding to the receptor (1 6). Recently, Ca²⁺The Heymann antigen is Indicated (28). Calcium sensor protein Ca²⁺The binding moiety remains identified. C Protein (similar to Hayman antigen) is in the LDL receptor superfamily As well as other members (11, 16, 27) of the Is the estimated Ca²⁺May represent a binding site. Thus, coagulation factor I When X, coagulation factor X and protein C are present, individual EGF-like modules One Ca²⁺It is known to bind to ions (29-34), Joule is Ca²⁺Dependent protein / protein interaction teraction) is known (35). The kinetic data is The calcium sensor is Ca²⁺Positive interaction in the interaction with Have a very high steep relation within the physiological range of extracalcium [C a²⁺i] may be essential for sigmoidal regulation and PTH release It suggested that the phenomenon was exhibited. Positive synergy is probably normal for LDL receptor Obtained from a repetitive EGF-like module present in a body superfamily molecule, Ca²⁺(11, 16, 27). However Et al., Ca to EGF-like domain²⁺Binding is responsible for trace, localized movement of three-dimensional structures. It is known to induce shaking (32), and therefore calcium sensors are Ca²⁺It is also possible to include a binding site. 43 kDa membrane protein (α_TwoMacroglobulin receptor-related protein or Heparin binding proteins) (28, 36) are LDL receptor-related proteins and Both rat Heyman antigen and Ca²⁺Known to interact in a dependent manner (28). No physiological function has been assigned to this protein Tissue that is not expressed but does not express Hayman antigen and LDL receptor-related protein Will also appear at (28). The leucine zipper is the ion channel of the membrane Considering what has been suggested to affect opening and closing of An intriguing finding is the putative leucine at the amino-terminal portion of the 43 kDa protein. The presence of a zipper part. 43kDa protein interacts with Hayman antigen Use Ca²⁺Complex with the calcium sensor protein in a dependent manner It is presumed to form. Interaction with the 43 kDa protein is a molecular detail. Ca in extracellular part²⁺Important for transmission of induced conformational changes into cells It will be important. Ca²⁺Further interaction with calcium sensor proteins in a dependent manner Interactions are also possible, and such interactions may be is important. The present inventors conducted preliminary experiments using immunoprecipitation,³²p]- Dispersed parathyroid cell sensor tamper loaded with orthophosphate Although the phosphorylated form of protein was isolated, the activated calcium sensor The mechanism that triggers further signaling internally is unknown (unpublished). View). Placental calcium sensor protein is probably a parathyroid hormone-related peptide (PTHrP) synthesis and / or 1,25 (OH)_TwoD_ThreeMediates calcium regulation of metabolism Feto-maternalno Ca²⁺Gradient and Ca²⁺Transport May be related to maintenance (8). Presence in blastocysts (unpublished opinion) ) Indicates a function as an adhesion molecule, as suggested for Hayman antigen ( 38), may implicate relationships in the regulation of differentiation or growth. Tubular The function of the calcium sensor in the brush border has not been fully investigated. However Enzymes located in placenta and basal tubules, regulated by extracellular calcium The 1-α-hydroxylase, therefore, the calcium sensor is 1,25 (O H)_TwoD_ThreeIt may regulate metabolism, but Ca from glomerular filtration²⁺Affect resorption Note that there may be a possibility (7-9). Epididymis and Significance of the presence of calcium sensor proteins in rat lung, liver and intestinal cells Sex is unknown, as related by the distribution of the Heyman antigen (18, 19). Remains. However, it departs from general calcium homeostasis. In some cases, during development or in a differentiated state, some cell types perform various functions. Ca to adjust²⁺It has been suggested to exert sensing ability (10). Association with autoimmune nephritis demonstrates that Hayman antigen is an immunogenic molecule I have. We consider the presence of circulating parathyroid autoantibodies and the Class II transplantation antigen in pathological parathyroid tissue antigen) has recently been reported, and this is true even in parathyroid disorders. Is implied. These findings indicate that the autoimmune phenomenon is related to HPT (39) Autoimmunity is also implicated in rare idiopathic hypoparathyroidism (10). The effectiveness of cDNA clones for calcium sensor Extensive study of the pathology of thyroid disorders and familial hypocalciuric hypercalcemia Adrenal gland and urine in (familial hypocalciuric hypercalcemia) (FHH) families Possible genetic abnormalities that affect tubule calcium sensing abberration) (40, 41). One of skill in the art will recognize from SEQ ID NOs: 3, 11, 83, 85, 87 and 89 Use the obtained information to isolate the genetic sequence encoding the calcium sensor can do. Preferably, overlapping cDNA sequences combined with PCR technology Column analysis is used. The gene sequence may have overlapping genetic genome cosmids and / or Can be obtained from a lambda phage clone.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １１１Ｃ０７Ｋ 7/06 Ｃ０７Ｋ 5/00 7/08 7/06 14/47 7/08 Ｃ１２Ｎ 1/15 14/47 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 ＺＣ１２Ｑ 1/68 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 33/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ラスクラーススウェーデンエス−75263 ウップサラサーヴェスヴァーグ 14 (72)発明者ヒアルムゴーランスウェーデンエス−75234 ウップサラステューデントヴィーイェム１ (72)発明者モースクラレンスシーアメリカ合衆国ペンシルバニア州 19468 ロイアーズフォードブックウォルターロード 34 (72)発明者マーレイエドワードエムアメリカ合衆国ペンシルバニア州 19026 ドレクセルヒルアンダーソンアベニュー 911 (72)発明者クラムリーグレッグアールアメリカ合衆国ペンシルバニア州 19147 フィラデルフィアクリスチャンストリート 620 アパートメント１エイ──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI Theme coat ゛ (Reference) A61P 43/00 111 C07K 7/06 C07K 5/00 7/08 7/06 14/47 7/08 C12N 1 / 15 14/47 1/19 C12N 1/15 1/21 1/19 C12Q 1/68 A 1/21 G01N 33/15 Z 5/10 33/50 Z C12Q 1/68 33/68 G01N 33/15 C12N 15/00 ZNAA 33/50 A61K 37/02 33/68 C12N 5/00 A (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD) , SZ, UG), AL, AM, AT, AU, B , BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TT, UA , UG, US, UZ, VN (72) Inventor Rusk Lars Sweden S-75263 Uppsala Saves Vag 14 (72) Inventor Hyalum Goran Sweden S-75234 Uppsala Student Viej 1 (72) Inventor Morse Clarence Sea United States of America Pennsylvania 19468 Royersford Bookwalter Road 34 (72) Inventor Murray Edward M. United States of America Pennsylvania 19026 Drexel Hill Anderson Ave 911 (72) Inventor Cramley Greg Earl United States Pennsylvania 19147 Philadelphia Christian Street 620 Apartment 1A

Claims

[Claims] 1. A human calcium sensor protein or a biologically active sequence analog thereof. Encoding cDNA. 2. Nuku selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3, 11, 83, 85, 87 and 89 2. The cDNA according to claim 1, comprising the whole or a part of the reotide sequence. 3. A vector comprising the cDNA according to claim 1. 4. A host cell that expresses the cDNA according to claim 1. 5. The cells block or enhance the activity of the calcium sensor protein 5. The host cell according to claim 4, which is useful in an assay for identifying a molecule that binds. 6. The isolated and purified human calcium sensor protein or its biologically active Sexual sequence analogs. 7. An amino acid selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4, 12, 84, 86, 88 and 90 7. The isolated and purified human calcium salt according to claim 6, which comprises a noic acid sequence. Sensor protein. 8. A fragment of the human calcium sensor protein according to claim 6. 9. 9. The fragment according to claim 8, wherein said fragment is immunogenic. Ten. The fragment binds to an antibody against the human calcium sensor protein. 10. The fragment according to claim 9, wherein 11． Consists of the cytoplasmic domain of human calcium sensor protein or a fragment thereof A fragment according to claim 8. 12． 12. The method according to claim 11, wherein the fragment binds to an SH2 and / or SH3 domain. The fragment described. 13. About 4 to about 12 amino acids from the human calcium sensor protein sequence Wherein the peptide binds to an SH2 or SH3 domain Peptide. 14. Amino acid sequence selected from the group consisting of LPAKP, LPALP and LPKLP 14. The peptide according to claim 13, comprising a sequence. 15． Claims consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of ENPIYAQMENE 14. The peptide according to claim 13, wherein 16． Has about 20 amino acids, wherein the amino acids have the sequence ATPPPSPSLPAKP 13. The fragment according to claim 12, comprising all or part of KPPSRR. 17． 10. The fragment of claim 9, wherein said fragment has growth factor activity. 18． Identify agonists and / or antagonists of human calcium sensor protein activity A potential agonist or antagonist for the calcium sensor protein. Contacting with a protein or a biologically active sequence analog thereof, An agonist or antagonist of the calcium sensor protein or its biological Determining the ability to block or enhance the activity of an active sequence analog Method. 19. Down-regulating or blocking human calcium sensor protein expression Antisense nucleic acids that can 20. The antisense nucleic acid comprises SEQ ID NO: 3, 11, 83, 85, 87 and 89. Hive specifically to all or part of the sequence or the corresponding messenger RNA The antisense according to claim 19, which is an RNA that can be rediscovered. Nucleic acids. twenty one. A method for down-regulating or blocking the expression of a calcium sensor protein. Thus, to down-regulate or block the expression of calcium sensor proteins Administering a sufficient amount of the antisense nucleic acid of claim 19. A method for down-regulating or blocking expression of a calcium sensor protein. twenty two. Identify agonists and / or antagonists of human calcium sensor protein activity Method a) expressing the cDNA of claim 1 in a host cell; b) contacting a potential agonist or antagonist with said host cell; c) Activity of the agonist or antagonist of the calcium sensor protein or a fragment thereof. Determine the ability to block or enhance sex, A method consisting of: twenty three. The human calcium sensor protein according to claim 6, or a biology thereof. A pharmaceutical composition comprising an active sequence analog. twenty four. A fragment of the human calcium sensor protein according to claim 8. Pharmaceutical composition. twenty five. 24. A human comprising administering an effective amount of the pharmaceutical composition according to claim 23. A method for treating membranous glomerulonephritis. 26. There is a way to treat human membranous glomerulonephritis, a) the human calcium sensor protein according to claim 6 or an organism thereof; Immobilizing a biologically active sequence analog on a solid support, b) passing the patient's serum containing autoantibodies to human gp330 through the carrier; Return serum to the patient, A method consisting of: