JP2002257808A - レチノイドの分離分析方法 - Google Patents
レチノイドの分離分析方法Info
- Publication number
- JP2002257808A JP2002257808A JP2001062273A JP2001062273A JP2002257808A JP 2002257808 A JP2002257808 A JP 2002257808A JP 2001062273 A JP2001062273 A JP 2001062273A JP 2001062273 A JP2001062273 A JP 2001062273A JP 2002257808 A JP2002257808 A JP 2002257808A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- retinoic acid
- cis
- retinol
- retinal
- trans
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 レチノールからレチノイン酸を生成する２段
階の酸化プロセスを十分に評価することができる新しい
ＨＰＬＣ条件を確立すること。 【解決手段】 表面積が４００〜４６０ｍ２／ｇのシリ
カゲルが充填されているカラムを用いて、サンプル中に
存在する複数の種類のレチノイドを分画することを特徴
とする、液体クロマトグラフィーによるレチノイドの分
離分析方法。
階の酸化プロセスを十分に評価することができる新しい
ＨＰＬＣ条件を確立すること。 【解決手段】 表面積が４００〜４６０ｍ２／ｇのシリ
カゲルが充填されているカラムを用いて、サンプル中に
存在する複数の種類のレチノイドを分画することを特徴
とする、液体クロマトグラフィーによるレチノイドの分
離分析方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、種々のレチノイド
の分離分析方法に関し、より詳細には、種々のレチノイ
ドを液体クロマトグラフィーにより分離分析する方法に
関する。
の分離分析方法に関し、より詳細には、種々のレチノイ
ドを液体クロマトグラフィーにより分離分析する方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】レチノイドは、正常な細胞分化および増
殖のための重要な因子である（C. Hofmann, C. Thalle
r, T. Melia, G. Eichele, in M.A. Livrea, G. Vidali
(Editors), Retinoids: From Basic Science to Clini
cal Applications, BirkhauserVerlag, Boston, 199
4）。種々のレチノイドには幾何異性体があり、各異性
体の生物学的作用は異なることが知られている。従っ
て、レチノイドの生物学の全容を理解するためには、各
レチノイドを個別に分析することが重要である。最近、
ランバースらは、13-シス-レチノイン酸、9-シス-レチ
ノイン酸、オール-トランス-レチノイン酸、13-シス-レ
チノール、オール-トランス-レチノール、オール-トラ
ンス-4-オキソ-レチノイン酸および13-シス-4-オキソ-
レチノイン酸を含む種々のレチノイドを同時に分析する
ための高速液体クロマトグラフ（以下、「ＨＰＬＣ」と
記す）システムを確立した(C. Lanvers, G. Hempel, G.
Blaschke, JBoos, J Chromatogr B Biomed Appl 685
(1996) 233.)。このシステムは、これらのレチノイド異
性体の濃度を決定する有効な手段であるが、レチナール
異性体はこのＨＰＬＣ分析では調べられていなかった。
殖のための重要な因子である（C. Hofmann, C. Thalle
r, T. Melia, G. Eichele, in M.A. Livrea, G. Vidali
(Editors), Retinoids: From Basic Science to Clini
cal Applications, BirkhauserVerlag, Boston, 199
4）。種々のレチノイドには幾何異性体があり、各異性
体の生物学的作用は異なることが知られている。従っ
て、レチノイドの生物学の全容を理解するためには、各
レチノイドを個別に分析することが重要である。最近、
ランバースらは、13-シス-レチノイン酸、9-シス-レチ
ノイン酸、オール-トランス-レチノイン酸、13-シス-レ
チノール、オール-トランス-レチノール、オール-トラ
ンス-4-オキソ-レチノイン酸および13-シス-4-オキソ-
レチノイン酸を含む種々のレチノイドを同時に分析する
ための高速液体クロマトグラフ（以下、「ＨＰＬＣ」と
記す）システムを確立した(C. Lanvers, G. Hempel, G.
Blaschke, JBoos, J Chromatogr B Biomed Appl 685
(1996) 233.)。このシステムは、これらのレチノイド異
性体の濃度を決定する有効な手段であるが、レチナール
異性体はこのＨＰＬＣ分析では調べられていなかった。
【０００３】レチノイン酸はレチノール（ビタミンＡ）
から２段階の酸化プロセスにより生成される。アルコー
ル脱水素酵素（ＡＤＨ）のある種のアイソザイムはレチ
ノール（アルコール）をレチナール（アルデヒド）に酸
化し、アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）のアイソザイ
ムおよびレチナール脱水素酵素（ＲＤＨ）のアイソザイ
ムはレチナールをレチノイン酸に酸化することが証明さ
れている（G. Duester, Biochemistry 35 (1996) 1222
1）。この経路を評価するためには、レチノール、レチ
ナールおよびレチノイン酸を同時に分析することが重要
である。この経路を評価する目的で、本発明者らは、ラ
ンバースらの方法を適用してみた。しかしながら、この
方法は、オール-トランスレチナールと13-シス-レチノ
イン酸を明確に分離することができず、不十分なもので
あった。
から２段階の酸化プロセスにより生成される。アルコー
ル脱水素酵素（ＡＤＨ）のある種のアイソザイムはレチ
ノール（アルコール）をレチナール（アルデヒド）に酸
化し、アルデヒド脱水素酵素（ＡＬＤＨ）のアイソザイ
ムおよびレチナール脱水素酵素（ＲＤＨ）のアイソザイ
ムはレチナールをレチノイン酸に酸化することが証明さ
れている（G. Duester, Biochemistry 35 (1996) 1222
1）。この経路を評価するためには、レチノール、レチ
ナールおよびレチノイン酸を同時に分析することが重要
である。この経路を評価する目的で、本発明者らは、ラ
ンバースらの方法を適用してみた。しかしながら、この
方法は、オール-トランスレチナールと13-シス-レチノ
イン酸を明確に分離することができず、不十分なもので
あった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、ラ
ンバースらの方法を改良して、レチノールからレチノイ
ン酸を生成する２段階の酸化プロセスを十分に評価する
ことができる新しいＨＰＬＣ条件を確立することを目的
とする。また、本発明は、この新たなＨＰＬＣシステム
を適用して、ヒト血清中の種々のレチノイドを検出する
ことも目的とする。
ンバースらの方法を改良して、レチノールからレチノイ
ン酸を生成する２段階の酸化プロセスを十分に評価する
ことができる新しいＨＰＬＣ条件を確立することを目的
とする。また、本発明は、この新たなＨＰＬＣシステム
を適用して、ヒト血清中の種々のレチノイドを検出する
ことも目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、表面積が
４００〜４６０ｍ２／ｇのシリカゲルが充填されている
カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより、サンプ
ル中に存在する種々のレチノイドを十分に分離して、そ
の濃度を測定することができることを見出し、本発明を
完成させるに至った。
４００〜４６０ｍ２／ｇのシリカゲルが充填されている
カラムを用いた液体クロマトグラフィーにより、サンプ
ル中に存在する種々のレチノイドを十分に分離して、そ
の濃度を測定することができることを見出し、本発明を
完成させるに至った。
【０００６】すなわち、本発明は、表面積が４００〜４
６０ｍ２／ｇのシリカゲルが充填されているカラムを用
いて、サンプル中に存在する複数の種類のレチノイドを
分画することを特徴とする、液体クロマトグラフィーに
よるレチノイドの分離分析方法を提供する。カラムの表
面積は、好ましくは４５０〜４６０ｍ２／ｇであり、よ
り好ましくは４５０ｍ２／ｇである。本明細書におい
て、シリカゲルの表面積とは、シリカゲル（球状）一つ
の表面積／シリカゲル一つの重さを意味する。
６０ｍ２／ｇのシリカゲルが充填されているカラムを用
いて、サンプル中に存在する複数の種類のレチノイドを
分画することを特徴とする、液体クロマトグラフィーに
よるレチノイドの分離分析方法を提供する。カラムの表
面積は、好ましくは４５０〜４６０ｍ２／ｇであり、よ
り好ましくは４５０ｍ２／ｇである。本明細書におい
て、シリカゲルの表面積とは、シリカゲル（球状）一つ
の表面積／シリカゲル一つの重さを意味する。
【０００７】レチノイドは、レチノール、レチナールお
よびレチノイン酸の異性体からなる群より選択されると
よい。
よびレチノイン酸の異性体からなる群より選択されると
よい。
【０００８】カラムの直径は４ｍｍ以上であるとよく、
好ましくは４〜５ｍｍであり、より好ましくは４．６ｍ
ｍである。
好ましくは４〜５ｍｍであり、より好ましくは４．６ｍ
ｍである。
【０００９】カラムの長さは２４ｃｍ以上であるよく、
好ましくは２４〜３０ｃｍであり、より好ましくは２５
ｃｍである。
好ましくは２４〜３０ｃｍであり、より好ましくは２５
ｃｍである。
【００１０】本発明の方法において、０〜Ｔ１の時間は
ｎ−ヘキサン：イソプロパノール：酢酸＝１０００：
４．０〜５．０：０．５〜１．０の混合比のＡ液を、Ｔ
２〜Ｔ ３の時間はｎ−ヘキサン：イソプロパノール：酢
酸＝１０００：１７．０〜１８．０：０．５〜１．０の
混合比のＢ液を、Ｔ４〜Ｔ５の時間はｎ−ヘキサン：イ
ソプロパノール：酢酸＝１０００：４．０〜５．０：
０．５〜１．０の混合比のＡ液を０．８〜１．２ｍｌ／
分の流速でカラムに流すが、ここで、Ｔ１、Ｔ２、
Ｔ３、Ｔ４およびＴ５は、それぞれ、分析開始後１４〜
１６分のいずれかの時点、２４〜２６分のいずれかの時
点、３４〜３６のいずれかの時点、４４〜４６分のいず
れかの時点および５８〜６０分のいずれかの時点である
とよい。
ｎ−ヘキサン：イソプロパノール：酢酸＝１０００：
４．０〜５．０：０．５〜１．０の混合比のＡ液を、Ｔ
２〜Ｔ ３の時間はｎ−ヘキサン：イソプロパノール：酢
酸＝１０００：１７．０〜１８．０：０．５〜１．０の
混合比のＢ液を、Ｔ４〜Ｔ５の時間はｎ−ヘキサン：イ
ソプロパノール：酢酸＝１０００：４．０〜５．０：
０．５〜１．０の混合比のＡ液を０．８〜１．２ｍｌ／
分の流速でカラムに流すが、ここで、Ｔ１、Ｔ２、
Ｔ３、Ｔ４およびＴ５は、それぞれ、分析開始後１４〜
１６分のいずれかの時点、２４〜２６分のいずれかの時
点、３４〜３６のいずれかの時点、４４〜４６分のいず
れかの時点および５８〜６０分のいずれかの時点である
とよい。
【００１１】本発明の方法は、種々のレチノイドの定性
分析（検出・同定）および定量分析に利用することがで
きる。
分析（検出・同定）および定量分析に利用することがで
きる。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】本発明の方法に使用する分離カラムとして
は、乾燥状態での平均粒径が３〜６μｍ、好ましくは
３．４〜５．６μｍ、比表面積が４００〜４６０ｍ２/
ｇ、好ましくは４４０〜４６０ｍ２/ｇであるシリカゲ
ルを充填したものをあげることができる。また、シリカ
ゲルの細孔径は、８０〜１２０オングストロームである
とよく、好ましくは９０〜１１０オングストロームであ
る。
は、乾燥状態での平均粒径が３〜６μｍ、好ましくは
３．４〜５．６μｍ、比表面積が４００〜４６０ｍ２/
ｇ、好ましくは４４０〜４６０ｍ２/ｇであるシリカゲ
ルを充填したものをあげることができる。また、シリカ
ゲルの細孔径は、８０〜１２０オングストロームである
とよく、好ましくは９０〜１１０オングストロームであ
る。
【００１４】本発明の最も好ましい態様においては、平
均粒径が５μｍ、比表面積が４５０ｍ２/ｇ、細孔径が
１００オングストローム、結合基無し、２次シリル化無
し、含有炭素無しのシリカゲルが充填剤として用いられ
る。
均粒径が５μｍ、比表面積が４５０ｍ２/ｇ、細孔径が
１００オングストローム、結合基無し、２次シリル化無
し、含有炭素無しのシリカゲルが充填剤として用いられ
る。
【００１５】充填剤であるシリカゲルの粒径は、走査型
電子顕微鏡写真を撮影したり、コールターカウンタ法に
より測定することができる。シリカゲルの比表面積はBE
T法により測定できる。
電子顕微鏡写真を撮影したり、コールターカウンタ法に
より測定することができる。シリカゲルの比表面積はBE
T法により測定できる。
【００１６】分離カラムとしては、直径が４ｍｍ以上、
好ましくは４〜５ｍｍ、より好ましくは４．６ｍｍ、長
さが２４ｃｍ以上、好ましくは２４〜３０ｃｍであり、
より好ましくは２５ｃｍの円筒形のものが望ましい。
好ましくは４〜５ｍｍ、より好ましくは４．６ｍｍ、長
さが２４ｃｍ以上、好ましくは２４〜３０ｃｍであり、
より好ましくは２５ｃｍの円筒形のものが望ましい。
【００１７】カラムへ充填剤を充填する方法は、均一な
状態に充填でき、充填率を制御できる方法であれば従来
公知の方法でよい。充填率の制御は充填時の溶媒の送液
流量を充填開始時より時間経過に従って増大させること
などによって行われる。
状態に充填でき、充填率を制御できる方法であれば従来
公知の方法でよい。充填率の制御は充填時の溶媒の送液
流量を充填開始時より時間経過に従って増大させること
などによって行われる。
【００１８】分離カラムにサンプルをアプライし、次い
で溶離液を流通させて種々のレチノイドを分離する。
で溶離液を流通させて種々のレチノイドを分離する。
【００１９】レチノイドとしては、レチノール、レチナ
ールおよびレチノイン酸の異性体（例えば、13-シスレ
チノイン酸、オール-トランスレチノイン酸、9-シスレ
チノイン酸、オール-トランス-4-オキソレチノイン酸、
9-シス-4-オキソレチノイン酸、13-シス-4-オキソレチ
ノイン酸、13-シスレチナール、9-シスレチナール、オ
ール-トランスレチナール、13-シスレチノール、オール
-トランスレチノール）、β−カロテンなどを挙げるこ
とができる。9-シスレチノールについても、本発明の方
法で分離が可能であると考えられる。
ールおよびレチノイン酸の異性体（例えば、13-シスレ
チノイン酸、オール-トランスレチノイン酸、9-シスレ
チノイン酸、オール-トランス-4-オキソレチノイン酸、
9-シス-4-オキソレチノイン酸、13-シス-4-オキソレチ
ノイン酸、13-シスレチナール、9-シスレチナール、オ
ール-トランスレチナール、13-シスレチノール、オール
-トランスレチノール）、β−カロテンなどを挙げるこ
とができる。9-シスレチノールについても、本発明の方
法で分離が可能であると考えられる。
【００２０】サンプルとしては、ヒトまたは動物の血
清、各組織などを例示することができる。サンプルは、
有機溶媒（例えば、ｎ−ヘキサン、エタノール、イソプ
ロパノール）などで希釈しておくとよく、例えば、血清
サンプルの場合は、ｎ−ヘキサンなどで希釈するとよ
い。サンプルには、内部標準となる物質（例えば、エチ
ルp[(E)-2-(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチ
ル-2-ナフチル)-1-プロペニル]フェニルスルホン）を添
加しておくとよい。
清、各組織などを例示することができる。サンプルは、
有機溶媒（例えば、ｎ−ヘキサン、エタノール、イソプ
ロパノール）などで希釈しておくとよく、例えば、血清
サンプルの場合は、ｎ−ヘキサンなどで希釈するとよ
い。サンプルには、内部標準となる物質（例えば、エチ
ルp[(E)-2-(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチ
ル-2-ナフチル)-1-プロペニル]フェニルスルホン）を添
加しておくとよい。
【００２１】また、レチノール・レチナールとレチノイ
ン酸とをよりよく分離して分析するためには、まず、ア
ルカリ条件下でレチノール・レチナールを有機溶媒で抽
出した画分Ａを回収した後、アルカリを中和し、次い
で、レチノイン酸を有機溶媒で抽出した画分Ｂを回収
し、（必要により、有機溶媒を蒸発させ、残留分を再度
有機溶媒に溶解する）画分ＡおよびＢをＨＰＬＣ分析に
かけるとよい。有機溶媒としては、ｎ−ヘキサン、エタ
ノール、イソプロパノール、またはｎ−ヘキサン・エタ
ノール・イソプロパノールの混合物を例示することがで
きる。
ン酸とをよりよく分離して分析するためには、まず、ア
ルカリ条件下でレチノール・レチナールを有機溶媒で抽
出した画分Ａを回収した後、アルカリを中和し、次い
で、レチノイン酸を有機溶媒で抽出した画分Ｂを回収
し、（必要により、有機溶媒を蒸発させ、残留分を再度
有機溶媒に溶解する）画分ＡおよびＢをＨＰＬＣ分析に
かけるとよい。有機溶媒としては、ｎ−ヘキサン、エタ
ノール、イソプロパノール、またはｎ−ヘキサン・エタ
ノール・イソプロパノールの混合物を例示することがで
きる。
【００２２】レチノイドは光で分解しやすいため、サン
プルの調整およびＨＰＬＣ分析は遮光条件下で行うとよ
い。
プルの調整およびＨＰＬＣ分析は遮光条件下で行うとよ
い。
【００２３】溶離液としては、有機溶媒（例えば、ｎ−
ヘキサン、イソプロパノール、酢酸）およびそれらの混
合物を挙げることができる。溶離液の組成は、液体クロ
マトグラフィーによりレチノイドを分析する際に、必ず
しも一定である必要はない。例えば、連続的勾配方式あ
るいは段階的勾配方式によって変化させてもよい。ま
た、溶離液の送液流量も一定である必要はなく、時間経
過に従って連続的あるいは段階的に変化させてもよい。
分離カラムにより分離された溶出液中のレチノイドは波
長３５０ｎｍの紫外光の吸収を測定することにより検出
でき、分離・定量を容易に行うことができる。
ヘキサン、イソプロパノール、酢酸）およびそれらの混
合物を挙げることができる。溶離液の組成は、液体クロ
マトグラフィーによりレチノイドを分析する際に、必ず
しも一定である必要はない。例えば、連続的勾配方式あ
るいは段階的勾配方式によって変化させてもよい。ま
た、溶離液の送液流量も一定である必要はなく、時間経
過に従って連続的あるいは段階的に変化させてもよい。
分離カラムにより分離された溶出液中のレチノイドは波
長３５０ｎｍの紫外光の吸収を測定することにより検出
でき、分離・定量を容易に行うことができる。
【００２４】
【実施例】以下、本発明を実施例によって具体的に説明
する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するため
のものであって、本発明の範囲を限定するものではな
い。
する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するため
のものであって、本発明の範囲を限定するものではな
い。
【００２５】［実施例１］材料および方法標準レチノイ
ド 13-シスレチノイン酸、オール-トランスレチノイン酸、
13-シスレチナール、9-シスレチナール、オール-トラン
スレチナール、および13-シスレチノールをSigma Chemi
cal社(St Louis, MO, USA)から購入した。9-シスレチノ
イン酸(Ro 04-4079)、オール-トランスレチノール(Ro 0
1-4955)、オール-トランス-4-オキソレチノイン酸(Ro 1
2-4824)、9-シス-4-オキソレチノイン酸(Ro 47-8078)、
13-シス-4-オキソレチノイン酸(Ro 22-6595)、およびエ
チルp[(E)-2-(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメ
チル-2-ナフチル)-1-プロペニル]フェニルスルホン(Ro
15-1570)はHoffmann-La Roche (Basel Switzerland)か
ら好意により提供された。
ド 13-シスレチノイン酸、オール-トランスレチノイン酸、
13-シスレチナール、9-シスレチナール、オール-トラン
スレチナール、および13-シスレチノールをSigma Chemi
cal社(St Louis, MO, USA)から購入した。9-シスレチノ
イン酸(Ro 04-4079)、オール-トランスレチノール(Ro 0
1-4955)、オール-トランス-4-オキソレチノイン酸(Ro 1
2-4824)、9-シス-4-オキソレチノイン酸(Ro 47-8078)、
13-シス-4-オキソレチノイン酸(Ro 22-6595)、およびエ
チルp[(E)-2-(5,6,7,8-テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメ
チル-2-ナフチル)-1-プロペニル]フェニルスルホン(Ro
15-1570)はHoffmann-La Roche (Basel Switzerland)か
ら好意により提供された。
【００２６】ＨＰＬＣ条件 すべての実験は遮光条件下で行った。自動サンプラー(A
S-4000)、ポンプ(L-6300)、紫外線(UV)検出器(L-400
0)、およびシリカゲル吸着カラム(Inertsil SILICA 100
-5; 4.6 mm I.D. x 25cm, GL-Science Inc., Tokyo Jap
an)を備えたクロマトインテグレーター(D-2500)から構
成される日立ＨＰＬＣシステムを実験に用いた。ｎ−ヘ
キサン(Sigma Chemical社、St. Louis, MO)、2-プロパ
ノール(SigmaChemical社)および氷酢酸(Sigma Chemical
社)を１０００：４．３：０．６７５の比率で含有する
溶媒（Ａ液）に種々のレチノイドを溶解した。新しいＨ
ＰＬＣ条件を表１にまとめた。Ａ液ともう一つの溶媒で
あるＢ液（ｎ−ヘキサン、2-プロパノールおよび氷酢酸
を１０００：１７．５：０．６７５の比率で含有）との
直線勾配でサンプルを分離した。注入容積は各回５０マ
イクロリットルであり、分離は1 ml/分の流速で６０分
間、２５+/-１℃で行ったが、サンプルは分析に供する
まで１０℃に保存した。各レチノイドは、波長３５０ｎ
ｍでＵＶ検出器により検出した。
S-4000)、ポンプ(L-6300)、紫外線(UV)検出器(L-400
0)、およびシリカゲル吸着カラム(Inertsil SILICA 100
-5; 4.6 mm I.D. x 25cm, GL-Science Inc., Tokyo Jap
an)を備えたクロマトインテグレーター(D-2500)から構
成される日立ＨＰＬＣシステムを実験に用いた。ｎ−ヘ
キサン(Sigma Chemical社、St. Louis, MO)、2-プロパ
ノール(SigmaChemical社)および氷酢酸(Sigma Chemical
社)を１０００：４．３：０．６７５の比率で含有する
溶媒（Ａ液）に種々のレチノイドを溶解した。新しいＨ
ＰＬＣ条件を表１にまとめた。Ａ液ともう一つの溶媒で
あるＢ液（ｎ−ヘキサン、2-プロパノールおよび氷酢酸
を１０００：１７．５：０．６７５の比率で含有）との
直線勾配でサンプルを分離した。注入容積は各回５０マ
イクロリットルであり、分離は1 ml/分の流速で６０分
間、２５+/-１℃で行ったが、サンプルは分析に供する
まで１０℃に保存した。各レチノイドは、波長３５０ｎ
ｍでＵＶ検出器により検出した。
【００２７】
【表１】種々のレチノイドを同時に分離するための新し
いＨＰＬＣ条件
いＨＰＬＣ条件
【００２８】レチノイドの定量 種々の濃度のレチノイドをＨＰＬＣ分析にかけた。ヒト血清中のレチノイドの検出 健常人の血液試料を集めた。各試料を３０００ｇで５分
間遠心分離し、３．５ｍｌの血清を採取した。この血清
画分に、３．５ｍｌのエタノール(Sigma Chemical社)、
１．５ｍｌの２Ｍ水酸化ナトリウム(Sigma Chemical社)
および０．４ｍｌの５０ｍＭエチルp[(E)-2-(5,6,7,8-
テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-2-ナフチル)-1-プ
ロペニル]フェニルスルホン（アロテノイド）（内部標
準）、および４ｍｌのｎ−ヘキサンを添加した。１０分
間振とうした後、上記の混合物を２００ｇで５分間遠心
分離した。３ｍｌの上層（有機層；画分Ａ）および３ｍ
ｌの下層（水層）を別々に回収した。この水層画分に、
３ｍｌの２Ｍ塩酸(Sigma Chemical社)および４ｍｌのｎ
−ヘキサンを添加した。１０分間振とうした後、上記の
混合物を２００ｇで５分間遠心分離し、３ｍｌの最上層
（有機層；画分Ｂ）を回収した。画分Ａおよび画分Ｂか
ら窒素ガスで有機溶媒を蒸発させ、各残留分を２００μ
ｌのｎ−ヘキサンに再溶解し、ＨＰＬＣ分析にかけた。統計分析 値を平均+/-S.D.で表現した。各パラメーターのばらつ
きは、偏差分析係数により評価した。各レチノイド濃度
の高さと各ピークの曲線下の面積との関係は、線形最小
二乗回帰分析により調べた。
間遠心分離し、３．５ｍｌの血清を採取した。この血清
画分に、３．５ｍｌのエタノール(Sigma Chemical社)、
１．５ｍｌの２Ｍ水酸化ナトリウム(Sigma Chemical社)
および０．４ｍｌの５０ｍＭエチルp[(E)-2-(5,6,7,8-
テトラヒドロ-5,5,8,8-テトラメチル-2-ナフチル)-1-プ
ロペニル]フェニルスルホン（アロテノイド）（内部標
準）、および４ｍｌのｎ−ヘキサンを添加した。１０分
間振とうした後、上記の混合物を２００ｇで５分間遠心
分離した。３ｍｌの上層（有機層；画分Ａ）および３ｍ
ｌの下層（水層）を別々に回収した。この水層画分に、
３ｍｌの２Ｍ塩酸(Sigma Chemical社)および４ｍｌのｎ
−ヘキサンを添加した。１０分間振とうした後、上記の
混合物を２００ｇで５分間遠心分離し、３ｍｌの最上層
（有機層；画分Ｂ）を回収した。画分Ａおよび画分Ｂか
ら窒素ガスで有機溶媒を蒸発させ、各残留分を２００μ
ｌのｎ−ヘキサンに再溶解し、ＨＰＬＣ分析にかけた。統計分析 値を平均+/-S.D.で表現した。各パラメーターのばらつ
きは、偏差分析係数により評価した。各レチノイド濃度
の高さと各ピークの曲線下の面積との関係は、線形最小
二乗回帰分析により調べた。
【００２９】結果および考察 本発明者らは、２段階の酸化プロセスによるレチノール
からのレチノイン酸の生成に興味がある。このプロセス
においては、レチノールはレチナールに酸化され、次い
で、レチナールはレチノイン酸に酸化される。このプロ
セスを理解するために、レチノール、レチナールおよび
レチノイン酸の各異性体を同時に定量する必要がある。
最近、ランバースらは、種々のレチノイド異性体を同時
に分離するための優れたＨＰＬＣ条件を報告している
(C. Lanvers, G. Hempel, G. Blaschke, J Boos, J Chr
omatogr B Biomed Appl 685 (1996) 233.)。本発明者ら
は、この方法を前記の２段階酸化プロセスの評価に適用
した。しかしながら、この条件ではオール-トランスレ
チナールおよび13-シスレチノイン酸を明確に分離する
ことができなかったので、評価には不十分であることが
わかった。そこで、ＨＰＬＣ条件を改良した。
からのレチノイン酸の生成に興味がある。このプロセス
においては、レチノールはレチナールに酸化され、次い
で、レチナールはレチノイン酸に酸化される。このプロ
セスを理解するために、レチノール、レチナールおよび
レチノイン酸の各異性体を同時に定量する必要がある。
最近、ランバースらは、種々のレチノイド異性体を同時
に分離するための優れたＨＰＬＣ条件を報告している
(C. Lanvers, G. Hempel, G. Blaschke, J Boos, J Chr
omatogr B Biomed Appl 685 (1996) 233.)。本発明者ら
は、この方法を前記の２段階酸化プロセスの評価に適用
した。しかしながら、この条件ではオール-トランスレ
チナールおよび13-シスレチノイン酸を明確に分離する
ことができなかったので、評価には不十分であることが
わかった。そこで、ＨＰＬＣ条件を改良した。
【００３０】そのために、移動層のイソプロパノールの
濃度および勾配条件を変更したが、その効果はなかっ
た。次に、カラムを新しいものに変更した。すなわち、
表面積が４５０ｍ２／ｇのカラムを使用した。ランバー
スらの条件で使用されたカラムの表面積は３５０ｍ２／
ｇであった。この変更により、他の分離を損なうことな
く、オール-トランスレチナールと13-シス-レチノイン
酸とを分離することができた。さらに、この新しいカラ
ムにより、今回検討したすべてのレチノイドを単純な勾
配で分離することができた。この勾配は、ランバースら
の条件のかなり複雑な多数ステップの勾配とは異なる。
濃度および勾配条件を変更したが、その効果はなかっ
た。次に、カラムを新しいものに変更した。すなわち、
表面積が４５０ｍ２／ｇのカラムを使用した。ランバー
スらの条件で使用されたカラムの表面積は３５０ｍ２／
ｇであった。この変更により、他の分離を損なうことな
く、オール-トランスレチナールと13-シス-レチノイン
酸とを分離することができた。さらに、この新しいカラ
ムにより、今回検討したすべてのレチノイドを単純な勾
配で分離することができた。この勾配は、ランバースら
の条件のかなり複雑な多数ステップの勾配とは異なる。
【００３１】図１に示すように、この新しい条件によ
り、13-シスレチナール（１）、9-シスレチナール
（２）、オール-トランスレチナール（３）、13-シスレ
チノイン酸（４）、9-シスレチノイン酸(５)、オール-
トランスレチノイン酸（６）、13-シスレチノール
（７）、オール-トランスレチノール(８)、オール-トラ
ンス-4-オキソレチノイン酸(９)、9-シス-4-オキソレチ
ノイン酸(１０)、13-シス-4-オキソレチノイン酸(１１)
およびRo 15-1570(I.S.)を分離することができた。この
新しいＨＰＬＣ分析は、レチノールからレチノイン酸が
生産される２段階の酸化プロセスを評価するのに有効で
ある。
り、13-シスレチナール（１）、9-シスレチナール
（２）、オール-トランスレチナール（３）、13-シスレ
チノイン酸（４）、9-シスレチノイン酸(５)、オール-
トランスレチノイン酸（６）、13-シスレチノール
（７）、オール-トランスレチノール(８)、オール-トラ
ンス-4-オキソレチノイン酸(９)、9-シス-4-オキソレチ
ノイン酸(１０)、13-シス-4-オキソレチノイン酸(１１)
およびRo 15-1570(I.S.)を分離することができた。この
新しいＨＰＬＣ分析は、レチノールからレチノイン酸が
生産される２段階の酸化プロセスを評価するのに有効で
ある。
【００３２】各レチノイドの保持時間は、１日以内では
十分に再現性があった。各レチノイドの偏差係数は０．
１１％〜１．０８％であった。しかしながら、その偏差
は、日が変わると若干大きくなり、各レチノイドの偏差
係数は０．８０％〜５．７４％であった。特に、13-シ
スレチノイン酸、9-シスレチノイン酸、およびオール-
トランスレチノイン酸については大きかった（それぞ
れ、５．７４％、５．４６％および４．９６％）。日々
の分析のこの誤差を解決するためには、標準レチノイド
を少なくとも１日に１回分析して、各レチノイドの保持
時間を毎日測定しなければならない。そのような偏差が
生じる正確な理由はわからないが、少なくとも一部に
は、カラム条件の変化によるものと推定される。実際の
ところ、レチノイン酸のピークは、分析を繰り返すとブ
ロードになり、再度使用するためには、カラムをエタノ
ールで洗浄する必要がある。
十分に再現性があった。各レチノイドの偏差係数は０．
１１％〜１．０８％であった。しかしながら、その偏差
は、日が変わると若干大きくなり、各レチノイドの偏差
係数は０．８０％〜５．７４％であった。特に、13-シ
スレチノイン酸、9-シスレチノイン酸、およびオール-
トランスレチノイン酸については大きかった（それぞ
れ、５．７４％、５．４６％および４．９６％）。日々
の分析のこの誤差を解決するためには、標準レチノイド
を少なくとも１日に１回分析して、各レチノイドの保持
時間を毎日測定しなければならない。そのような偏差が
生じる正確な理由はわからないが、少なくとも一部に
は、カラム条件の変化によるものと推定される。実際の
ところ、レチノイン酸のピークは、分析を繰り返すとブ
ロードになり、再度使用するためには、カラムをエタノ
ールで洗浄する必要がある。
【００３３】濃度と各レチノイドピークの曲線下の面積
との相関を検討した。最小二乗回帰分析の結果は、この
ＨＰＬＣ分析により２．５ｎｇ／ｍｌ〜６００ｎｇ／ｍ
ｌのレチノイン酸、２．５ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／
ｍｌのレチナール、５ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ
のレチノールを定量できることを証明した。
との相関を検討した。最小二乗回帰分析の結果は、この
ＨＰＬＣ分析により２．５ｎｇ／ｍｌ〜６００ｎｇ／ｍ
ｌのレチノイン酸、２．５ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／
ｍｌのレチナール、５ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌ
のレチノールを定量できることを証明した。
【００３４】レチノイドサンプルを遮光下で−２０℃に
保存した場合、レチノール、レチナールおよびレチノイ
ン酸の定量は、１日以内でも（表２）、日が変わっても
（表３）、十分再現性があった。
保存した場合、レチノール、レチナールおよびレチノイ
ン酸の定量は、１日以内でも（表２）、日が変わっても
（表３）、十分再現性があった。
【００３５】
【表２】新しいＨＰＬＣ条件によるレチノイドの定量の
再現性（１日以内の場合）
再現性（１日以内の場合）
【００３６】
【表３】新しいＨＰＬＣ条件によるレチノイドの定量の
再現性（日が変わった場合）
再現性（日が変わった場合）
【００３７】その後、本発明者らは、この新しいＨＰＬ
Ｃ条件がヒト血清中の種々のレチノイドの検出に適して
いるか否かについて検討した。レチノールおよびレチナ
ールをヒト血清から画分Ａとしてのｎ−ヘキサンにより
抽出し、レチノイン酸を最初にアルカリ条件下で水層中
に回収し、それから、中和後、画分Ｂとしてのｎ−ヘキ
サンにより抽出した。
Ｃ条件がヒト血清中の種々のレチノイドの検出に適して
いるか否かについて検討した。レチノールおよびレチナ
ールをヒト血清から画分Ａとしてのｎ−ヘキサンにより
抽出し、レチノイン酸を最初にアルカリ条件下で水層中
に回収し、それから、中和後、画分Ｂとしてのｎ−ヘキ
サンにより抽出した。
【００３８】図２に示すように、少なくとも、オール-
トランスレチナール、13-シスレチノール、およびオー
ル-トランスレチノールを画分Ａ中に検出することがで
きた。さらに、図３に示すように、オール-トランスレ
チノイン酸、13-シスレチノイン酸を画分Ｂ中に検出す
ることができたが、9-シスレチノイン酸はこの条件で検
出することはできなかった。オール-トランスレチノイ
ン酸は、特定の白血病の治療に使用される（S. Castaig
ne, C. Chomienne, M.T. Daniel, P. Ballerini, R. Be
rger, P. Fenaux, and L. Degos, Blood 76 (1990) 170
4）が、オール-トランスレチノイン酸症候群と呼ばれる
致死的な副作用をもたらすことがある（S.R.Frankel,
A. Eardley, G. Lauweres, M. Weiss, and RR Warrell
Jr, Ann Intern Med 117 (1992) 292）。従って、この
副作用を回避するためには、オール-トランスレチノイ
ン酸が投与されている患者において、ヒト血清中のオー
ル-トランスレチノイン酸レベルを監視することは重要
である。今回確立したＨＰＬＣ分析はそのための有効な
手段となる。
トランスレチナール、13-シスレチノール、およびオー
ル-トランスレチノールを画分Ａ中に検出することがで
きた。さらに、図３に示すように、オール-トランスレ
チノイン酸、13-シスレチノイン酸を画分Ｂ中に検出す
ることができたが、9-シスレチノイン酸はこの条件で検
出することはできなかった。オール-トランスレチノイ
ン酸は、特定の白血病の治療に使用される（S. Castaig
ne, C. Chomienne, M.T. Daniel, P. Ballerini, R. Be
rger, P. Fenaux, and L. Degos, Blood 76 (1990) 170
4）が、オール-トランスレチノイン酸症候群と呼ばれる
致死的な副作用をもたらすことがある（S.R.Frankel,
A. Eardley, G. Lauweres, M. Weiss, and RR Warrell
Jr, Ann Intern Med 117 (1992) 292）。従って、この
副作用を回避するためには、オール-トランスレチノイ
ン酸が投与されている患者において、ヒト血清中のオー
ル-トランスレチノイン酸レベルを監視することは重要
である。今回確立したＨＰＬＣ分析はそのための有効な
手段となる。
【００３９】
【発明の効果】本発明の方法により、種々のレチノイド
を明確に分離分析することができる。本発明の方法は、
レチノールからレチノイン酸が生成する２段階の酸化プ
ロセスの評価に利用することができる。また、本発明の
方法は、白血病に治療薬であるオール-トランスレチノ
イン酸の血清濃度の監視に利用することもできる。
を明確に分離分析することができる。本発明の方法は、
レチノールからレチノイン酸が生成する２段階の酸化プ
ロセスの評価に利用することができる。また、本発明の
方法は、白血病に治療薬であるオール-トランスレチノ
イン酸の血清濃度の監視に利用することもできる。
【図１】ＨＰＬＣによる種々のレチノイドの分離を示
す。新たに確立したＨＰＬＣ条件により、13-シスレチ
ナール（１）、9-シスレチナール（２）、オール-トラ
ンスレチナール（３）、13-シスレチノイン酸（４）、9
-シスレチノイン酸(５)、オール-トランスレチノイン酸
（６）、13-シスレチノール（７）、オール-トランスレ
チノール(８)、オール-トランス-4-オキソレチノイン酸
(９)、9-シス-4-オキソレチノイン酸(１０)、13-シス-4
-オキソレチノイン酸(１１)およびRo 15-1570(I.S.)を
分離することができた。
す。新たに確立したＨＰＬＣ条件により、13-シスレチ
ナール（１）、9-シスレチナール（２）、オール-トラ
ンスレチナール（３）、13-シスレチノイン酸（４）、9
-シスレチノイン酸(５)、オール-トランスレチノイン酸
（６）、13-シスレチノール（７）、オール-トランスレ
チノール(８)、オール-トランス-4-オキソレチノイン酸
(９)、9-シス-4-オキソレチノイン酸(１０)、13-シス-4
-オキソレチノイン酸(１１)およびRo 15-1570(I.S.)を
分離することができた。
【図２】血清中のレチノイドの分離を示す。オール-ト
ランスレチナール（１）、13-シスレチノール（２）、
およびオール-トランスレチノール（３）を画分Ａ中に
検出することができた。
ランスレチナール（１）、13-シスレチノール（２）、
およびオール-トランスレチノール（３）を画分Ａ中に
検出することができた。
【図３】血清中のレチノイドの分離を示す。13-シスレ
チノイン酸（１）およびオール-トランスレチノイン酸
（２）を画分Ｂ中に検出することができたが、9-シスレ
チノイン酸はこの条件で検出することはできなかった。
チノイン酸（１）およびオール-トランスレチノイン酸
（２）を画分Ｂ中に検出することができたが、9-シスレ
チノイン酸はこの条件で検出することはできなかった。
Claims (5)
- 【請求項１】 表面積が４００〜４６０ｍ２／ｇのシリ
カゲルが充填されているカラムを用いて、サンプル中に
存在する複数の種類のレチノイドを分画することを特徴
とする、液体クロマトグラフィーによるレチノイドの分
離分析方法。 - 【請求項２】 レチノイドが、レチノール、レチナール
およびレチノイン酸の異性体からなる群より選択される
請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 カラムの直径が４ｍｍ以上である請求項
１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 カラムの長さが２４ｃｍ以上である請求
項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 ０〜Ｔ１の時間はｎ−ヘキサン：イソプ
ロパノール：酢酸＝１０００：４．０〜５．０：０．５
〜１．０の混合比のＡ液を、Ｔ２〜Ｔ３の時間はｎ−ヘ
キサン：イソプロパノール：酢酸＝１０００：１７．０
〜１８．０：０．５〜１．０の混合比のＢ液を、Ｔ４〜
Ｔ５の時間はｎ−ヘキサン：イソプロパノール：酢酸＝
１０００：４．０〜５．０：０．５〜１．０の混合比の
Ａ液を０．８〜１．２ｍｌ／分の流速でカラムに流す
が、ここで、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４およびＴ５は、そ
れぞれ、分析開始後１４〜１６分のいずれかの時点、２
４〜２６分のいずれかの時点、３４〜３６のいずれかの
時点、４４〜４６分のいずれかの時点および５８〜６０
分のいずれかの時点である請求項１〜４のいずれかに記
載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001062273A JP2002257808A (ja) | 2001-03-06 | 2001-03-06 | レチノイドの分離分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001062273A JP2002257808A (ja) | 2001-03-06 | 2001-03-06 | レチノイドの分離分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002257808A true JP2002257808A (ja) | 2002-09-11 |
Family
ID=18921434
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001062273A Pending JP2002257808A (ja) | 2001-03-06 | 2001-03-06 | レチノイドの分離分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002257808A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108061773A (zh) * | 2018-02-02 | 2018-05-22 | 邵宏超 | 高效液相色谱技术测定维生素a的方法 |
| CN111208252A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-05-29 | 山东良福制药有限公司 | 一种人血浆中维a酸的定量检测方法 |
| WO2020249606A1 (en) | 2019-06-12 | 2020-12-17 | Trinseo Europe Gmbh | Styrenic polymers having reduced trimer content |
| CN113759039A (zh) * | 2021-08-26 | 2021-12-07 | 杨艳玲 | β-胡萝卜素和维生素A的同步检测方法及其检测装置 |
| CN114814051A (zh) * | 2022-04-02 | 2022-07-29 | 重庆市妇幼保健院(重庆市妇产科医院、重庆市遗传与生殖研究所) | 一种定量检测视黄酸异构体的方法 |
| CN117269375A (zh) * | 2023-11-22 | 2023-12-22 | 湖南科锐斯医药科技有限公司 | 一种测定维生素a醋酸酯粉中有关物质的方法 |
| CN118393055A (zh) * | 2024-07-01 | 2024-07-26 | 杭州度安医学检验实验室有限公司 | 一种基于hplc-ms/ms的全反式视黄醇和11-顺式视黄醇的分离检测方法 |
-
2001
- 2001-03-06 JP JP2001062273A patent/JP2002257808A/ja active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108061773A (zh) * | 2018-02-02 | 2018-05-22 | 邵宏超 | 高效液相色谱技术测定维生素a的方法 |
| CN108061773B (zh) * | 2018-02-02 | 2019-04-12 | 湖南山水检测有限公司 | 高效液相色谱技术测定维生素a的方法 |
| WO2020249606A1 (en) | 2019-06-12 | 2020-12-17 | Trinseo Europe Gmbh | Styrenic polymers having reduced trimer content |
| CN111208252A (zh) * | 2020-01-19 | 2020-05-29 | 山东良福制药有限公司 | 一种人血浆中维a酸的定量检测方法 |
| CN113759039A (zh) * | 2021-08-26 | 2021-12-07 | 杨艳玲 | β-胡萝卜素和维生素A的同步检测方法及其检测装置 |
| CN114814051A (zh) * | 2022-04-02 | 2022-07-29 | 重庆市妇幼保健院(重庆市妇产科医院、重庆市遗传与生殖研究所) | 一种定量检测视黄酸异构体的方法 |
| CN117269375A (zh) * | 2023-11-22 | 2023-12-22 | 湖南科锐斯医药科技有限公司 | 一种测定维生素a醋酸酯粉中有关物质的方法 |
| CN117269375B (zh) * | 2023-11-22 | 2024-02-13 | 湖南科锐斯医药科技有限公司 | 一种测定维生素a醋酸酯粉中有关物质的方法 |
| CN118393055A (zh) * | 2024-07-01 | 2024-07-26 | 杭州度安医学检验实验室有限公司 | 一种基于hplc-ms/ms的全反式视黄醇和11-顺式视黄醇的分离检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Miwa et al. | High-performance liquid chromatographic analysis of serum long-chain fatty acids by direct derivatization method | |
| Schmidt et al. | Chromatographic analysis of endogenous retinoids in tissues and serum | |
| Kotseridis et al. | Differentiation of the aromas of Merlot and Cabernet Sauvignon wines using sensory and instrumental analysis | |
| van Breemen et al. | Development of a method for quantitation of retinol and retinyl palmitate in human serum using high-performance liquid chromatography–atmospheric pressure chemical ionization–mass spectrometry | |
| Bugge et al. | Determination of isotretinoin or etretinate and their major metabolites in human blood by reversed-phase high-performance liquid chromatography | |
| CN111487336B (zh) | 一种头发中37种芬太尼类新精神活性物质的分析方法 | |
| Hui et al. | High pressure liquid chromatographic determination of putrefactive amines in foods | |
| Kollroser et al. | Simultaneous determination of seven tricyclic antidepressant drugs in human plasma by direct-injection HPLC-APCI-MS–MS with an ion trap detector | |
| CN106872608B (zh) | 同时检测化妆品中24种禁限用过敏原香精物质的方法 | |
| JP2011127905A (ja) | カロテノイド類の定量方法 | |
| Miyagi et al. | Simultaneous quantification of retinol, retinal, and retinoic acid isomers by high-performance liquid chromatography with a simple gradiation | |
| Hosotani et al. | Improved simultaneous determination method of β-carotene and retinol with saponification in human serum and rat liver | |
| van den Velde et al. | Differences between alveolar air and mouth air | |
| Nierenberg et al. | Methods for Determination of Retinoids, α-Tocopherols, and Carotenoids in Human Serum, Plasma, and Other Tissues | |
| Galvão et al. | Plasma eicosanoid profiles determined by high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry in stimulated peripheral blood from healthy individuals and sickle cell anemia patients in treatment | |
| JP2002257808A (ja) | レチノイドの分離分析方法 | |
| Ubhayasekera et al. | A novel, fast and sensitive supercritical fluid chromatography-tandem mass spectrometry (SFC-MS/MS) method for analysis of arachidonic acid metabolites | |
| Gatti et al. | Analysis and stability study of retinoids in pharmaceuticals by LC with fluorescence detection | |
| Lombardi et al. | Measurement of warfarin in plasma by high performance liquid chromatography (HPLC) and its correlation with the international normalized ratio | |
| Krien et al. | Electrochemical determination of femtomole amounts of free reduced and oxidized glutathione: Application to human hair follicles | |
| CN114324219B (zh) | 一种化妆品中视黄醇及6种视黄醇衍生物含量的检测方法 | |
| Wu et al. | Determination of isotretinoin in human plasma by high performance liquid chromatography–electrospray ionization mass spectrometry | |
| JP4088776B2 (ja) | 硝酸ミコナゾール、リドカイン、イソプロピルメチルフェノール、ｌ−メントール及びｄｌ−カンフルの分析方法 | |
| JP2004233312A (ja) | ビタミンａ、その誘導体およびカロテノイドの分析法 | |
| Farajzadeh et al. | Headspace solid-phase microextraction-gas chromatography method for the determination of valproic acid in human serum, and formulations using hollow-fiber coated wire |