JP2002238559A - Method for producing extraneous gene-expressed product in egg of bird - Google Patents
Method for producing extraneous gene-expressed product in egg of birdInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、鳥類の卵内で外来遺伝
子発現産物を生産する方法に関する。本発明は、医薬品
等として用いられる組換えタンパク質の生産に利用する
ことができる。The present invention relates to a method for producing a foreign gene expression product in avian eggs. INDUSTRIAL APPLICATION This invention can be utilized for production of the recombinant protein used as a pharmaceutical etc.
【０００２】[0002]
【従来の技術】医薬品、研究材料等として有用な組換え
タンパク質を、動物の生体を利用して生産する試みがな
されている。その一つとして、トランスジェニックアニ
マルを利用した方法がある。この方法では、発生段階で
遺伝子操作を行うことにより、ゲノム内に外来遺伝子が
組込まれた動物（トランスジェニックアニマル）を作出
し、これを用いて組換えタンパク質の生産を行う。外来
遺伝子は、特定の細胞（組織）において発現するように
予め組込まれ、当該細胞（組織）において組換えタンパ
ク質が産生される。分泌系の細胞（組織）で発現するよ
うに外来遺伝子を組込めば、当該細胞（組織）の分泌機
能を利用して組換えタンパク質を生体外へと取り出すこ
とができる。例えば、乳腺組織で発現可能に外来遺伝子
を組込むことにより、乳内に組換えタンパク質を生産す
ることが可能なトランスジェニックヒツジやトランスジ
ェニックウシを作出したという報告がある。2. Description of the Related Art Attempts have been made to produce recombinant proteins that are useful as pharmaceuticals, research materials, and the like by using living organisms of animals. As one of them, there is a method using a transgenic animal. In this method, an animal (transgenic animal) in which a foreign gene has been incorporated into the genome is produced by performing genetic manipulation at the developmental stage, and is used to produce a recombinant protein. The foreign gene is integrated in advance so as to be expressed in a specific cell (tissue), and the recombinant protein is produced in the cell (tissue). If a foreign gene is incorporated so as to be expressed in a cell (tissue) of the secretory system, the recombinant protein can be taken out of the living body using the secretory function of the cell (tissue). For example, there is a report that a transgenic sheep or transgenic cow capable of producing a recombinant protein in milk has been produced by incorporating a foreign gene so that it can be expressed in mammary gland tissue.
【０００３】一方、トランスジェニックアニマルを利用
するのではなく、動物の成体に対して遺伝子導入を行い
組換えタンパク質を生産する方法がある。例えば、産卵
を開始した鳥類に外来遺伝子を導入し、卵内に組換えタ
ンパク質を蓄積させる方法の開発が検討されている。鳥
類では、卵管の内壁を形成する卵管粘膜細胞より分泌さ
れたタンパク質等の成分により、卵白の形成が行われ
る。したがって、外来遺伝子を卵管粘膜細胞内に導入し
て発現させ、発現産物を卵管内に分泌させることができ
れば、外来遺伝子発現産物である組換えタンパク質を卵
白内に蓄積させることができる。即ち、卵内で組換えタ
ンパク質を生産することが可能となる。On the other hand, there is a method of producing a recombinant protein by introducing a gene into an adult animal instead of using a transgenic animal. For example, development of a method for introducing a foreign gene into birds that have started laying eggs and accumulating the recombinant protein in the eggs has been studied. In birds, egg white is formed by components such as proteins secreted from the fallopian tube mucosal cells that form the inner wall of the fallopian tube. Therefore, if the foreign gene can be introduced into the fallopian tube mucosal cells and expressed, and the expression product can be secreted into the fallopian tube, the recombinant protein that is the foreign gene expression product can be accumulated in egg white. That is, it becomes possible to produce a recombinant protein in eggs.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】本発明者は、鳥類の卵
内で外来遺伝子発現産物を生産するシステムの構築を目
指して研究を行い、先の特許出願（特願平８−９５１７
８号）において、産卵を開始したニワトリの卵管粘膜部
細胞に外来遺伝子を導入し、当該細胞内で外来遺伝子を
発現させることができたことを報告した。しかしなが
ら、外来遺伝子の発現産物を卵管粘膜細胞から分泌さ
せ、卵内に移行させることには成功していなかった。即
ち、鳥類の卵内において外来遺伝子発現産物を生産する
システムを構築するには至っていなかった。そこで、本
発明は、鳥類、特にニワトリの卵内で外来遺伝子発現産
物を生産する方法を提供することを目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present inventor has conducted research with the aim of constructing a system for producing a foreign gene expression product in avian eggs, and has filed an earlier patent application (Japanese Patent Application No. 8-9517).
No. 8) reported that a foreign gene was introduced into the oviduct mucosal cells of a chicken that had started laying eggs, and that the foreign gene could be expressed in the cells. However, it has not been successful to secrete the expression product of the foreign gene from the fallopian tube mucosal cells and transfer it into the egg. That is, a system for producing a foreign gene expression product in an avian egg has not been constructed yet. Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for producing a foreign gene expression product in birds, especially chicken eggs.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】本発明者は上記目的に鑑
み研究を重ねた。その結果、ニワトリ卵管粘膜部細胞内
で産生された組換えタンパク質を細胞外へと分泌させ、
最終的に卵内に移行させることができ、本発明を完成す
るに至った。本発明の構成は次の通りである。 [１] 以下のステップを含んでなる、鳥類の卵内で外来
遺伝子発現産物を生産する方法 a)エレクトロポレーション法により、外来遺伝子を鳥類
の卵管粘膜部細胞に導入するステップ、 b)導入された前記外来遺伝子を前記卵管粘膜部細胞内で
発現させるステップ、 c)ステップb)で得られた前記外来遺伝子の発現産物を、
前記卵管粘膜部細胞から分泌させて卵白内に移行させる
ステップ。 [２] 前記エレクトロポレーション法を、印加電圧２５
V〜２５０Vの範囲にあるパルスを用いて行う、ことを特
徴とする[１]に記載の方法。 [３] 前記エレクトロポレーション法を、パルス幅が２
０msec〜１５０msecの範囲にあるパルスを用いて行う、
ことを特徴とする[１]又は[２]に記載の方法。 [４] 前記エレクトロポレーション法を、パルス回数が
２回〜１０回の範囲の条件で行う、ことを特徴とする
[１]〜[３]のいずれかに記載の方法。 [５] 前記ステップa)において、前記外来遺伝子の発現
効率を上昇させる作用のある物質を、前記外来遺伝子と
ともに前記卵管粘膜部細胞に導入する、ことを特徴とす
る[１]〜[４]のいずれかに記載の方法。 [６] 前記鳥類が、ニワトリ又はウズラである、ことを
特徴とする[１]〜[５]のいずれかに記載の方法。 [７] 前記鳥類がニワトリである、ことを特徴とする
[１]〜[５]のいずれかに記載の方法。 [８] 前記外来遺伝子が、ヒトエリスロポエチン遺伝
子、ヒトフィブリノーゲン遺伝子、ヒト血清アルブミン
遺伝子、ヒトラクトフェリン遺伝子、ヒトプロテイン
C、及びヒトα-グルコシダーゼ遺伝子からなる群より選
択される遺伝子である、ことを特徴とする[１]〜[７]の
いずれかに記載の方法。 [９] [１]〜[８]のいずれかに記載の方法により生産さ
れる、前記外来遺伝子発現産物を含む鳥類の卵。 [１０] [９]に記載の卵から得られる前記外来遺伝子発
現産物。Means for Solving the Problems The present inventor has made repeated studies in view of the above objects. As a result, the recombinant protein produced in the chicken oviduct mucosal cells was secreted out of the cells,
Eventually, it could be transferred into the egg, and the present invention was completed. The configuration of the present invention is as follows. [1] A method for producing an exogenous gene expression product in avian eggs, comprising the following steps: a) a step of introducing an exogenous gene into avian oviduct mucosal cells by electroporation, b) introduction Expressing the foreign gene in the cells of the fallopian tube mucosa, c) the expression product of the foreign gene obtained in step b),
A step of allowing the cells to be secreted from the cells of the fallopian tube mucosa and transferred into egg white. [2] The electroporation method was performed at an applied voltage of 25
The method according to [1], wherein the method is performed using a pulse in a range of V to 250V. [3] The electroporation method is performed using a pulse width of 2
Performed using a pulse in the range of 0 msec to 150 msec,
The method according to [1] or [2], wherein [4] The electroporation method is performed under the condition that the number of pulses is in a range of 2 to 10 times.
The method according to any one of [1] to [3]. [5] In the step a), a substance having an effect of increasing the expression efficiency of the foreign gene is introduced into the cells of the fallopian tube mucosa together with the foreign gene [1] to [4]. The method according to any of the above. [6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the bird is a chicken or a quail. [7] The bird is a chicken
The method according to any one of [1] to [5]. [8] The foreign gene is a human erythropoietin gene, a human fibrinogen gene, a human serum albumin gene, a human lactoferrin gene, a human protein.
C. and the gene selected from the group consisting of human α-glucosidase genes. [9] An avian egg containing the foreign gene expression product produced by the method according to any one of [1] to [8]. [10] The exogenous gene expression product obtained from the egg according to [9].
【０００６】本発明の方法では、遺伝子導入後数日で外
来遺伝子発現産物が蓄積された卵を得ることができる。
即ち、上記トランスジェニックアニマルを利用する方法
に比較して、極めて短時間で所望の組換えタンパク質を
生産することが可能である。また、本発明の方法は、動
物の有効利用の観点からも好ましいものである。即ち、
現状では、外来遺伝子を適切に組込んだトランスジェニ
ックアニマルの作出効率は低く、目的とする組換えタン
パク質の生産に利用できない個体を無用に発生させてし
まう。これに対して、本発明の方法では、遺伝子導入が
適切に行われなかったことが判明した場合には、再度同
一の個体に対して遺伝子導入を行い組換えタンパク質の
生産を試みることができる。したがって、仮に遺伝子導
入が成功しない場合であっても別の個体を発生させる必
要がない。一方、本発明の方法では、染色体に組込まれ
ない状態で外来遺伝子を導入することができる。このよ
うに導入された外来遺伝子は一過的に発現され、その結
果、一定期間のみ所望の組換えタンパク質を卵内に蓄積
させることができる。このことから、間隔を空けて複数
の外来遺伝子を導入すれば、同一の個体を用いて複数種
類の組換えタンパク質を生産することが可能となる。し
たがって、医薬品の開発等のように、複数種類の組換え
タンパク質を試験的に生産する必要がある場合において
本発明の方法を好適に用いることができる。即ち、本発
明の方法は、単に組換えタンパク質の生産方法としてだ
けではなく、組換えタンパク質のスクリーニングアッセ
イの一手段としても用いることができる。また、トラン
スジェニックアニマルではゲノム内に外来遺伝子が組込
まれるため、意図しない組織において外来遺伝子が発現
し、個体の生体機能に悪影響を及ぼすことが考えられる
が、本発明の方法では、特定の細胞（組織）にのみ外来
遺伝子を導入してこれを発現させるため、このような惧
れがない。According to the method of the present invention, an egg in which a foreign gene expression product has been accumulated can be obtained several days after gene transfer.
That is, it is possible to produce a desired recombinant protein in a very short time as compared with the method using the transgenic animal. The method of the present invention is also preferable from the viewpoint of effective use of animals. That is,
At present, the efficiency of producing transgenic animals into which a foreign gene has been appropriately incorporated is low, and individuals that cannot be used for production of a target recombinant protein are generated unnecessarily. On the other hand, in the method of the present invention, when it is found that gene transfer was not properly performed, gene transfer can be performed again to the same individual to try to produce a recombinant protein. Therefore, even if gene transfer is not successful, it is not necessary to generate another individual. On the other hand, in the method of the present invention, a foreign gene can be introduced without being integrated into a chromosome. The foreign gene thus introduced is transiently expressed, and as a result, the desired recombinant protein can be accumulated in the egg only for a certain period of time. From this, if a plurality of foreign genes are introduced at intervals, it becomes possible to produce a plurality of types of recombinant proteins using the same individual. Therefore, the method of the present invention can be suitably used when it is necessary to experimentally produce a plurality of types of recombinant proteins, such as in the development of pharmaceuticals. That is, the method of the present invention can be used not only as a method for producing a recombinant protein, but also as a means for screening assays for recombinant proteins. In addition, since a foreign gene is incorporated into the genome of a transgenic animal, the foreign gene may be expressed in unintended tissues and adversely affect the biological function of an individual. However, in the method of the present invention, a specific cell ( There is no such fear because the foreign gene is introduced into only the tissue and expressed.
【０００７】[0007]
【発明の実施の形態】本発明は、a)エレクトロポレーシ
ョン法により、外来遺伝子を鳥類の卵管粘膜部細胞に導
入するステップ、b)導入された前記外来遺伝子を前記卵
管粘膜部細胞内で発現させるステップ、c)ステップb)で
得られた前記外来遺伝子の発現産物を、前記卵管粘膜部
細胞から分泌させて卵白内に移行させるステップを含ん
でなる、鳥類の卵内で外来遺伝子発現産物を生産する方
法である。本発明における鳥類は特に限定されるもので
はなく、例えば、ニワトリ、ウズラ、アヒル、ガチョ
ウ、七面鳥等である。生産効率の観点からいえば、多産
かつ飼育が容易なものを採用することが好ましく、例え
ばニワトリ、ウズラを用いることが好ましい。特に、ニ
ワトリを用いることが好ましい。ニワトリの中でも入手
が容易であって、より多産かつ飼育が容易な系統（例え
ば、単冠白色レグホン種）を用いることが好ましい。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention comprises a) a step of introducing a foreign gene into cells of a fallopian tube mucosa by electroporation, and b) a step of introducing the introduced foreign gene into the cells of the fallopian tube mucosa. And c) secreting the expression product of the foreign gene obtained in step b) from the cells of the fallopian tube mucosa and transferring it into egg white, the foreign gene in the avian egg. This is a method for producing an expression product. The birds in the present invention are not particularly limited, and include, for example, chickens, quails, ducks, geese, turkeys and the like. From the standpoint of production efficiency, it is preferable to employ those that are prolific and easy to breed. For example, it is preferable to use chickens and quail. In particular, it is preferable to use chicken. Among chickens, it is preferable to use a line that is easily available, is more prolific, and is easier to breed (for example, a single crown white leghorn).
【０００８】外来遺伝子とは、それが導入される鳥類自
体の遺伝子以外の遺伝子をいう。したがって、種の異な
る遺伝子（例えば、ヒト、ウシ、豚等の遺伝子）が含ま
れることは勿論のこと、同種の遺伝子（例えば、他の鳥
類の遺伝子）をも含む意味である。好ましくは、ヒトの
遺伝子である。ヒトの遺伝子を用いることにより、ヒト
の生体内に存在するタンパク質と同等の機能を有する組
換えタンパク質を生産することができる。ヒトの遺伝子
としては、ヒトエリスロポエチン遺伝子、ヒトフィブリ
ノーゲン遺伝子、ヒト血清アルブミン遺伝子、ヒトラク
トフェリン遺伝子、ヒトプロテインC、ヒトα-グルコシ
ダーゼ遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されるも
のではない。また、ヒトのタンパク質と同等の機能を有
するタンパク質を他の種が有する場合には、当該他の種
のタンパク質をコードする遺伝子を外来遺伝子として用
いることも好ましい。[0008] A foreign gene refers to a gene other than the gene of the bird itself into which it is introduced. Therefore, it means that genes of different species (eg, genes of humans, cows, pigs, etc.) are included, and also genes of the same type (eg, genes of other birds) are included. Preferably, it is a human gene. By using a human gene, it is possible to produce a recombinant protein having a function equivalent to a protein present in a human body. Examples of human genes include, but are not limited to, human erythropoietin gene, human fibrinogen gene, human serum albumin gene, human lactoferrin gene, human protein C, human α-glucosidase gene, and the like. When another species has a protein having a function equivalent to that of a human protein, it is also preferable to use a gene encoding a protein of the other species as a foreign gene.
【０００９】尚、天然に存在する遺伝子に限らず、天然
の遺伝子の塩基配列を一部改変したDNA又は周知ないし
公知の技術により合成したDNAを、本発明における外来
遺伝子として用いることができる。一本鎖DNA、二本鎖D
NA、また、線状、環状の形状の外来遺伝子を用いること
ができる。[0009] Not only a naturally occurring gene, but also a DNA obtained by partially modifying the base sequence of a natural gene or a DNA synthesized by a known or known technique can be used as a foreign gene in the present invention. Single-stranded DNA, double-stranded D
An exogenous gene having a NA or a linear or circular shape can be used.
【００１０】外来遺伝子は、鳥類の卵管粘膜部細胞に導
入された後、卵管粘膜部細胞内で発現するような形態に
調製される。即ち、卵管粘膜部細胞内での発現に適した
プロモーター配列の下流域に外来遺伝子のオープンリー
ディングフレーム（ORF）が存在するように調製するこ
とができる。このようなプロモーターとしては、鳥類の
卵管粘膜細胞内での発現に適していればよく、例えば、
SV40のプロモーター、鳥類の卵管粘膜細胞内で産生され
るタンパク質をコードする遺伝子のプロモーター等が用
いられる。特に、鳥類の卵管粘膜部細胞内での転写効率
の高いプロモーターを選択することが好ましい。プロモ
ーターと併せてエンハンサーを用いることもできる。エ
ンハンサーを用いることにより、外来遺伝子の転写効率
を上昇させることが可能である。エンハンサーはプロモ
ーターとの組合せを考慮して適当なものが選択される。
例えば、SV40のプロモーターに組み合わせてSV40のエン
ハンサーを用いる。[0010] The exogenous gene is prepared in such a form that it is introduced into avian oviduct mucosal cells and then expressed in the oviduct mucosal cells. That is, it can be prepared so that an open reading frame (ORF) of a foreign gene exists in a downstream region of a promoter sequence suitable for expression in cells of the fallopian tube mucosa. Such a promoter may be suitable as long as it is suitable for expression in avian oviduct mucosal cells.
An SV40 promoter, a promoter of a gene encoding a protein produced in avian oviduct mucosal cells, and the like are used. In particular, it is preferable to select a promoter having a high transcription efficiency in avian oviduct mucosal cells. An enhancer can be used in combination with a promoter. By using an enhancer, the transcription efficiency of a foreign gene can be increased. An appropriate enhancer is selected in consideration of the combination with the promoter.
For example, an SV40 enhancer is used in combination with the SV40 promoter.
【００１１】外来遺伝子を卵管粘膜部細胞に導入する
際、外来遺伝子の発現効率を上昇させる作用のある物質
を併せて導入することが好ましい。発現産物の生産効率
を向上させるためである。例えば、mRNAの翻訳を阻害す
る分子の活性を抑制する作用のある物質を用いることが
できる。このような物質としては、mRNAの翻訳を阻害す
る酵素の活性を抑制することで知られるアデノウイルス
VI RNA遺伝子、アデノウイルスVII RNA遺伝子を用い
ることができる。これらの遺伝子は、適当なベクターに
組込んだ状態で卵管細胞内に共導入することができる。
また、シグナルペプチドをN末端側に有する組換えタン
パク質が得られるように、予めシグナルペプチドをコー
ドする配列を外来遺伝子に連結しておくこともできる。When a foreign gene is introduced into cells of the fallopian tube mucosa, it is preferable to introduce a substance having an effect of increasing the expression efficiency of the foreign gene. This is for improving the production efficiency of the expression product. For example, a substance capable of suppressing the activity of a molecule that inhibits translation of mRNA can be used. Such substances include adenoviruses known to suppress the activity of enzymes that inhibit mRNA translation.
VI RNA gene and adenovirus VII RNA gene can be used. These genes can be co-introduced into fallopian tube cells in the state of being integrated into an appropriate vector.
In addition, a sequence encoding a signal peptide can be linked to a foreign gene in advance so that a recombinant protein having a signal peptide on the N-terminal side is obtained.
【００１２】上記のように調製した外来遺伝子を、イン
ジェクション等により卵管粘膜部細胞の周囲に存在させ
る。この状態でエレクトロポレーション法を行い、外来
遺伝子を卵管粘膜部細胞に導入する。エレクトロポレー
ション法は、電圧を瞬間的に印加することにより細胞膜
に一時的に微小な孔（pore）をあけ、当該孔を介して細
胞内へと遺伝子を導入する方法であって(Molecular Clo
ning, Third Edition, 16.33, Cold Spring Harbor Lab
oratory Press, New York等）、大量の細胞に対して同
時に遺伝子導入を行うことができる。エレクトロポレー
ション法の基本的な操作は、周知の方法に従って行うこ
とができる。エレクトロポレーション法の条件（印加電
圧、パルス幅、パルス回数等）は、遺伝子導入効率及び
鳥類への負担（ストレス）を考慮して設定される。例え
ば、印加電圧が、２５Ｖ〜２５０ Vの範囲にあるパルス
を用いることが好ましい。５０Ｖ〜２００Ｖの範囲にあ
るパルスを用いることがさらに好ましい。パルス幅につ
いては、２０ msec〜１５０ msecの範囲にあるパルスを
用いることが好ましく、さらに好ましくは、パルス幅５
０ msec〜 １００ msecのパルスを用いる。尚、トータ
ルパルス時間を４００ｍsec〜８００msecの範囲とする
ことが好ましい。電圧を印加する回数、即ちパルス回数
については、２回〜１０回の範囲が好ましい。さらに好
ましくは、４回〜６回の範囲である。電極としては、ピ
ンセット型のもの用いることができる。また、平板状、
メッシュ状（網状）の電極を用いることもできる。The exogenous gene prepared as described above is caused to exist around the fallopian tube mucosal cells by injection or the like. In this state, electroporation is performed to introduce a foreign gene into cells of the fallopian tube mucosa. The electroporation method is a method in which a micropore is temporarily made in a cell membrane by instantaneously applying a voltage, and a gene is introduced into a cell through the pore (Molecular Cloth).
ning, Third Edition, 16.33, Cold Spring Harbor Lab
oratory Press, New York, etc.). The basic operation of the electroporation method can be performed according to a known method. The conditions of the electroporation method (applied voltage, pulse width, number of pulses, etc.) are set in consideration of the gene transfer efficiency and the burden (stress) on birds. For example, it is preferable to use a pulse whose applied voltage is in the range of 25 V to 250 V. More preferably, a pulse in the range of 50V to 200V is used. As for the pulse width, it is preferable to use a pulse in a range of 20 msec to 150 msec, and more preferably, a pulse width of 5 msec.
A pulse of 0 msec to 100 msec is used. It is preferable that the total pulse time be in the range of 400 msec to 800 msec. The number of times of voltage application, that is, the number of pulses is preferably in a range of 2 to 10 times. More preferably, the range is 4 to 6 times. A tweezers type electrode can be used as the electrode. Also, flat,
Mesh-like (net-like) electrodes can also be used.
【００１３】エレクトロポレーション法により導入され
た外来遺伝子は、卵管粘膜部細胞の核内に取り込まれ、
その後一過的に発現する。外来遺伝子の形態（設計）如
何によっては、外来遺伝子を卵管粘膜部細胞のゲノム内
に組込ませることができ、この場合には長期間に渡って
外来遺伝子を発現させることができる。続いて、発現産
物を卵管粘膜部細胞から分泌させる。発現産物の分泌
は、卵管粘膜部細胞の備える分泌機構を利用して行われ
る。分泌された発現産物は、卵白内に移行し卵内に蓄積
される。以上の方法により、外来遺伝子発現産物（組換
えタンパク質）が蓄積された卵が得られる。この卵を回
収し、周知の分離、精製方法により、外来遺伝子発現産
物を得ることができる。尚、上記の方法により生産され
る外来遺伝子発現産物を含む鳥類の卵、及び当該卵から
分離、精製された外来遺伝子発現産物も本発明に含まれ
るものである。The foreign gene introduced by the electroporation method is taken into the nuclei of the cells of the fallopian tube mucosa,
Thereafter, it is transiently expressed. Depending on the form (design) of the foreign gene, the foreign gene can be integrated into the genome of the cells of the fallopian tube mucosa, and in this case, the foreign gene can be expressed over a long period of time. Subsequently, the expression product is secreted from the cells of the fallopian tube mucosa. The secretion of the expression product is performed using the secretion mechanism of the cells of the fallopian tube mucosa. The secreted expression product migrates into the egg white and accumulates in the egg. By the above method, an egg in which a foreign gene expression product (recombinant protein) is accumulated can be obtained. The eggs are collected, and a foreign gene expression product can be obtained by well-known separation and purification methods. In addition, bird eggs containing the foreign gene expression product produced by the above method, and the foreign gene expression product separated and purified from the egg are also included in the present invention.
【００１４】[0014]
【実施例】以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説
明する。 [エレクトロポレーション法の条件検討]ニワトリ卵管粘
膜部細胞への遺伝子導入効率を高めるために、遺伝子導
入条件を検討した。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. [Examination of conditions for electroporation] In order to enhance the efficiency of gene transfer into chicken oviduct mucosal cells, gene transfer conditions were examined.
【００１５】(1)エレクトロポレーションにおける印加
電圧の検討 まず、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を組込んだベクター
（pmiwluc）を、DNA濃度10μg、5mM CaCl2、145ｍM NaC
lとなるようにCaCl2及びNaClを含むバッファー50μlに
溶解してDNA溶液を調製した。図１に、pmiwlucの構成を
模式的に示した。pmiwlucは、ホタルルシフェラーゼ遺
伝子の上流にβ−アクチンエンハンサー、ＲＳＶ（ラウ
ス肉腫ウイルス）プロモーター、及びβ−アクチンプロ
モータを有し、下流にはlucZターミネータ配列を有する
ベクターである。尚、pmiwlucは、論文（Muramatsu et
al. (1997) Muramatsu et al. (1997) Biochemical
and Biophycal Research Communications, 233: 45-4
9.）に記載の方法に従い作製した。(1) Examination of Applied Voltage in Electroporation First, a vector (pmiwluc) into which a firefly luciferase gene has been incorporated was placed in a DNA concentration of 10 μg, 5 mM CaCl 2 , 145 mM NaC
The resulting solution was dissolved in 50 μl of a buffer containing CaCl 2 and NaCl to prepare a DNA solution. FIG. 1 schematically shows the structure of pmiwluc. pmiwluc is a vector having a β-actin enhancer, an RSV (Rous sarcoma virus) promoter and a β-actin promoter upstream of a firefly luciferase gene, and a lucZ terminator sequence downstream. In addition, pmiwluc is based on a paper (Muramatsu et.
al. (1997) Muramatsu et al. (1997) Biochemical
and Biophycal Research Communications, 233: 45-4
It was prepared according to the method described in 9.).
【００１６】次に、産卵鶏（１７〜１８ヶ月齢の単冠白
色レグホン）をエーテル麻酔下開腹して卵管を露出させ
た。続いて、卵管膨大部を切開して卵管粘膜部を暴露し
た。次に、注射筒を用いて上記DNA溶液を粘膜部に注入
した。DNAの注入量は、一羽当たり10μgとした。DNA溶
液注入後、直ちにDNA溶液注入部をピンセット型電極で
挟み、エレクトロポレーターを用いてエレクトロポレー
ションを行った。印加する電圧の違いにより３群に分
け、各群所定の印加電圧（25V、50V、及び75V）のパル
スを用いてエレクトロポレーションを行った。印加電圧
以外の条件は各群同一とした（矩形直流パルス、パルス
幅100msec、パルス回数６回）。図２は、以上の操作を
模式的に示した図である。エレクトロポレーション後２
４時間経過したところで、遺伝子導入を行った卵管粘膜
部を摘出し、ホモゲナイザーで細胞を粉砕した。続い
て、ホモジェネートを遠心分離し、得られた上清を用い
てルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性
の測定は次のように行った。まず、上記の上清にBuffer
A（Pothier et al. (1992) DNA Cell Biol., 11:83-9
0）を3倍量加えて希釈した後20μlを採取し、その中に
発光基質（20mMトリシン(和光純薬工業、大阪)、1.07mM
(MgCO3)4Mg(OH)25H2O(Aldrich. Chem. Co.)、2.67mM M
gSO4(和光純薬工業、大阪)、0.1mM EDTA、33.3mM DTT、
270μＭ Co-A(オリエンタル酵母)、470μM D-ルシフェ
リンナトリウム(和光純薬工業、大阪)、530μM ATP(和
光純薬工業、大阪)）100μlを加えた。そして、ルミノ
メータ（Auto Lumat, LB933, Berthod, Germany）を用
いて蛍光発光を10秒間隔で１分間測定した。Next, the laying hen (17- to 18-month-old single-legged white leghorn) was laparotomized under ether anesthesia to expose the oviduct. Subsequently, the oviduct ampulla was incised to expose the oviduct mucosa. Next, the DNA solution was injected into the mucous membrane using a syringe. The amount of DNA injected was 10 μg per bird. Immediately after the injection of the DNA solution, the DNA solution injection portion was sandwiched between tweezers-type electrodes, and electroporation was performed using an electroporator. Each group was divided into three groups according to the difference in applied voltage, and electroporation was performed using pulses of predetermined applied voltages (25 V, 50 V, and 75 V) in each group. The conditions other than the applied voltage were the same for each group (rectangular DC pulse, pulse width 100 msec, pulse number 6 times). FIG. 2 is a diagram schematically showing the above operation. After electroporation 2
After a lapse of 4 hours, the oviduct mucosa into which the gene had been introduced was excised, and the cells were crushed with a homogenizer. Subsequently, the homogenate was centrifuged, and luciferase activity was measured using the obtained supernatant. The luciferase activity was measured as follows. First, add Buffer to the above supernatant.
A (Pothier et al. (1992) DNA Cell Biol., 11: 83-9
0) was diluted by adding 3 times the amount, and 20 μl was collected, into which luminescent substrate (20 mM Tricine (Wako Pure Chemical Industries, Osaka), 1.07 mM
(MgCO 3 ) 4 Mg (OH) 2 5H 2 O (Aldrich.Chem. Co.), 2.67 mM M
gSO 4 (Wako Pure Chemical Industries, Osaka), 0.1 mM EDTA, 33.3 mM DTT,
100 μl of 270 μM Co-A (Oriental Yeast), 470 μM D-luciferin sodium (Wako Pure Chemical Industries, Osaka), and 530 μM ATP (Wako Pure Chemical Industries, Osaka) were added. Fluorescence was measured at 10-second intervals for 1 minute using a luminometer (Auto Lumat, LB933, Berthod, Germany).
【００１７】図３のグラフに、各群のルシフェラーゼ活
性を測定した結果をまとめた。グラフより、75Vの印加
電圧を用いてエレクトロポレーションを行うことによ
り、高い効率で遺伝子導入できることがわかった。FIG. 3 summarizes the results of measuring the luciferase activity of each group. From the graph, it was found that gene transfer can be performed with high efficiency by performing electroporation using an applied voltage of 75 V.
【００１８】（２）pAdVantageベクター共導入の検討 次に、pAdVantageベクター（Promega社製、Madison, WI
53711-5399 USA）を用いて遺伝子導入効率の向上を試
みた。図４は、pAdVantageを模式的に示した図である。
pAdVantageベクターは、アデノウイルスVA I-RNA遺伝
子、アデノウイルスVA II-RNA遺伝子を有し、mRNAから
タンパク質への翻訳を阻害する機構に作用してこれを抑
制する。(2) Examination of pAdVantage vector cotransfection Next, the pAdVantage vector (Promega, Madison, WI)
53711-5399 USA). FIG. 4 is a diagram schematically showing pAdVantage.
The pAdVantage vector has an adenovirus VA I-RNA gene and an adenovirus VA II-RNA gene, and acts on and suppresses the mechanism that inhibits translation of mRNA into protein.
【００１９】まず、上記と同様の方法により、pmiwluc
及びpAdVantageを溶解したDNA溶液（pmiwluc濃度10μ
g、pAdVantage濃度5μg、5mM CaCl2、145ｍM NaCl）50
μlを調製した。次に、上記と同様の方法で、産卵鶏
（１７〜１８ヶ月齢の単冠白色レグホン）の卵管粘膜部
に、DNA溶液の注入及びエレクトロポレーションを行っ
た。DNAの注入量は、一羽当たりpmiwluc及びpAdVantage
をそれぞれ10μg及び5μgとした。また、エレクトロポ
レーションの条件は、印加電圧75V、パルス幅100msec、
パルス回数６回とした。尚、対照として、pmiwlucのみ
を含むDNA溶液を注入（DAN量10μg）してエレクトロポ
レーションを行った群（luc群）、及びpmiwZを注入して
エレクトロポレーションを行った群（control群）を用
いた。First, pmiwluc was prepared in the same manner as described above.
And a DNA solution in which pAdVantage is dissolved (pmiwluc concentration 10μ)
g, pAdVantage concentration 5 μg, 5 mM CaCl 2 , 145 mM NaCl) 50
μl was prepared. Next, the DNA solution was injected and electroporated into the fallopian tube mucosa of laying hens (17- to 18-month-old white leghorn) in the same manner as described above. The amount of DNA injected was pmiwluc and pAdVantage per bird.
Was 10 μg and 5 μg, respectively. The electroporation conditions were as follows: applied voltage 75 V, pulse width 100 msec,
The number of pulses was six. As a control, a group in which a DNA solution containing only pmiwluc was injected (DAN amount: 10 μg) and subjected to electroporation (luc group), and a group in which pmiwZ was injected and electroporated (control group) were used. Using.
【００２０】エレクトロポレーション後２４時間経過し
たところで、遺伝子導入を行った卵管粘膜部を摘出して
ルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性の
測定は上記と同様の方法で行った。測定結果を図５に示
した。図５のグラフにおいて、AdV+Luc、Luc、及びcont
rolは、それぞれ、pmiwluc及びpAdVantageを共導入した
群、pmiwlucのみ導入した群、及びcontrolの群を表す。
グラフから明らかなように、pAdVantageベクターを共導
入することにより、ルシフェラーゼ遺伝子の導入効率が
顕著に上昇した。Twenty-four hours after the electroporation, the mucosal part of the oviduct into which the gene had been introduced was excised, and the luciferase activity was measured. The luciferase activity was measured in the same manner as described above. The measurement results are shown in FIG. In the graph of FIG. 5, AdV + Luc, Luc, and cont
rol represents a group into which pmiwluc and pAdVantage were co-introduced, a group into which only pmiwluc was introduced, and a control group, respectively.
As is clear from the graph, the co-transfection of the pAdVantage vector significantly increased the luciferase gene transfection efficiency.
【００２１】[産卵鶏の卵内での組換えタンパク質の生
産] （１）卵管粘膜部細胞への遺伝子導入 以下の手順により、ニワトリ卵管粘膜部細胞にヒトアル
カリフォスファターゼ遺伝子（SEAP）を導入した。発現
ベクターとして、ヒトアルカリフォスファターゼ遺伝子
を組込んだpSEAPcontrol（ Clontech Laboratories, Pa
lo Alto, CA 94303-4230 USA）を用いた。図６にpSEAP
controlの構成を模式的に示した。pSEAPは、ヒトアルカ
リフォスファターゼ遺伝子（SEAP）の上流にSV40プロモ
ーターを有し、さらに、SV40ポリA配列及びSV40エンハ
ンサーを有する。まず、pSEAP controlとpAdVantage
を、pSEAP control濃度150μg、pAdVantage濃度10μg、
5mM CaCl2、145ｍM NaClとなるようにCaCl2及びNaClを
含むバッファー200μlに溶解し、DNA溶液を調製した。
次に、これまでの卵管粘膜部への注入とは異なり、膨大
部の切開による卵管粘膜の暴露は避け、直接漿膜下の粘
膜層へ数カ所にわたって広い範囲でDNA溶液を注射し
た。この処置によって産卵低下への影響を軽減した。そ
の後、直ちにエレクトロポレーションを行った。DNAの
注入量は、一羽当たりpSEAP control及びpAdVantageを
それぞれ150μg及び10μgとした。また、エレクトロポ
レーションの条件は、矩形直流パルス、印加電圧75V、
パルス幅100msec、パルス回数６回とした。エレクトロ
ポレーション後、直ちに切開部を縫合した。[Production of Recombinant Protein in Eggs of Laying Hens] (1) Gene Transfer into Tubal Mucosal Cells The human alkaline phosphatase gene (SEAP) is introduced into chicken mucosal cells by the following procedure. did. PSEAPcontrol (Clontech Laboratories, Pa.) Incorporating the human alkaline phosphatase gene as an expression vector
lo Alto, CA 94303-4230 USA). Figure 6 shows pSEAP
The configuration of the control is schematically shown. pSEAP has an SV40 promoter upstream of the human alkaline phosphatase gene (SEAP), and further has an SV40 polyA sequence and an SV40 enhancer. First, pSEAP control and pAdVantage
PSEAP control concentration 150μg, pAdVantage concentration 10μg,
It was dissolved in 200 μl of a buffer containing CaCl 2 and NaCl to give 5 mM CaCl 2 and 145 mM NaCl to prepare a DNA solution.
Next, unlike the conventional injection into the fallopian tube mucosa, the intestinal mucosa was not exposed by incision of the ampulla, and the DNA solution was directly injected into the mucosal layer directly below the serosa in several places over a wide area. This treatment reduced the effect on egg production. Then, electroporation was immediately performed. The injection amount of DNA was 150 μg and 10 μg for pSEAP control and pAdVantage, respectively, per bird. The electroporation conditions were rectangular DC pulse, applied voltage 75V,
The pulse width was 100 msec and the number of pulses was 6 times. Immediately after electroporation, the incision was sutured.
【００２２】（２）組換えタンパク質発現の確認 エレクトロポレーション後の一定時間ごとにそれぞれ４
羽のニワトリよりDNA注入部（卵管粘膜部細胞）を摘出
し、当該部のヒトフォスファターゼ（SEAP）活性を測定
した。併せて、産み落とされた卵から卵白を回収し、卵
白中のヒトフォスファターゼ活性を測定した。(2) Confirmation of recombinant protein expression
The DNA-injected portion (tubal mucosal cells) was excised from the chicken of the feather, and the human phosphatase (SEAP) activity of the portion was measured. At the same time, egg white was collected from the laid eggs, and the human phosphatase activity in the egg white was measured.
【００２３】図７に測定結果をまとめたグラフを示し
た。グラフ中、横軸はエレクトロポレーション後の経過
日数、縦軸はヒトフォスファターゼ活性（SEAP Activit
y）である。DNA注入部（卵管粘膜部細胞）では、エレク
トロポレーション後1〜４日経過した時点でSEAP活性が
認められ、ヒトフォスファターゼ遺伝子が発現している
のがわかる。また、エレクトロポレーション後６日〜７
日経過した時点で産卵された卵の卵白中にもSEAP活性が
認められる。FIG. 7 shows a graph summarizing the measurement results. In the graph, the horizontal axis represents the number of days elapsed after electroporation, and the vertical axis represents human phosphatase activity (SEAP Activit
y). In the DNA injection part (tubal mucosal cells), SEAP activity was observed 1 to 4 days after electroporation, indicating that the human phosphatase gene was expressed. 6 to 7 days after electroporation
SEAP activity is also observed in the egg white of the eggs laid at the time when the day has elapsed.
【００２４】これらの結果から、導入されたSEAP遺伝子
がエレクトロポレーション後１〜４日の間に卵管細胞内
で発現し、その後、発現産物であるSEAPが当該細胞より
分泌されて卵白内に移行し、エレクトロポレーション後
６〜７日経過後に産卵された卵内に蓄積したものと予想
された。このように、エレクトロポレーション法を用い
て卵管粘膜部に遺伝子導入を行うことにより、外来遺伝
子であるヒトアルカリフォスファターゼ遺伝子（SEAP）
が卵管粘膜部で発現し、発現産物が卵内に蓄積されるこ
とが確認された。From these results, it was found that the introduced SEAP gene was expressed in oviduct cells between 1 and 4 days after electroporation, and then the expressed product, SEAP, was secreted from the cells and placed in egg white. It was expected that they migrated and accumulated in eggs laid 6 to 7 days after electroporation. Thus, by introducing the gene into the fallopian tube mucosa using electroporation, the foreign gene, human alkaline phosphatase gene (SEAP)
Was expressed in the fallopian tube mucosa, and it was confirmed that the expression product was accumulated in the egg.
【００２５】この発明は、上記発明の実施の形態及び実
施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の
範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲
で種々の変形態様もこの発明に含まれる。The present invention is not at all limited to the description of the above-described embodiments and examples. Various modifications are included in the present invention without departing from the scope of the claims and within the scope of those skilled in the art.
【００２６】[0026]
【発明の効果】本発明により、鳥類、特にニワトリの卵
内で外来遺伝子発現産物を生産することが可能となる。
本発明を利用することにより、鳥類の卵内において外来
遺伝子発現産物を生産するシステムを構築することが可
能となり、このシステムによれば、トランスジェニック
アニマルを用いた方法に比較して、極めて短時間で所望
の組換えタンパク質を生産することができる。また、本
発明では繰り返し同一の個体に対して遺伝子導入を行う
ことができるので、動物の有効利用の観点からも本発明
は好ましいものである。Industrial Applicability According to the present invention, it is possible to produce a foreign gene expression product in birds, especially chicken eggs.
By utilizing the present invention, it is possible to construct a system for producing an exogenous gene expression product in an avian egg. According to this system, it is possible to construct a system in a very short time as compared with a method using a transgenic animal. Can produce a desired recombinant protein. In addition, in the present invention, since the gene can be repeatedly introduced into the same individual, the present invention is preferable from the viewpoint of effective use of animals.
【図１】図１は、pmiwlucの構成を模式的に示した図で
ある。pmiwlucは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（Firef
ly luciferase）の上流にβ−アクチンエンハンサー
（β-act）、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモータ
ー（RSV）、及びβ−アクチンプロモータ（β-act）を
有し、下流にはlucZターミネータ配列（lucZ）を有する
ベクターである。FIG. 1 is a diagram schematically showing a configuration of pmiwluc. pmiwluc is the firefly luciferase gene (Firef
has a β-actin enhancer (β-act), an RSV (Rous sarcoma virus) promoter (RSV), and a β-actin promoter (β-act) upstream of ly luciferase, and a lucZ terminator sequence (lucZ) downstream. This is a vector having
【図２】図２は、実施例における、ニワトリ卵管粘膜部
細胞への遺伝子導入操作を模式的に示した図である。[FIG. 2] FIG. 2 is a diagram schematically showing a gene transfer operation to chicken oviduct mucosal cells in an example.
【図３】図３は、エレクトロポレーション法における印
加電圧の相違による遺伝子導入効率の変化を示す図であ
る。印加電圧をそれぞれ25V、50V、75Vで行った場合の
ルシフェラーゼ活性（Luciferase Activity）が示され
る。FIG. 3 is a diagram showing a change in gene transfer efficiency due to a difference in applied voltage in the electroporation method. The luciferase activity when the applied voltage is 25 V, 50 V, and 75 V, respectively, is shown.
【図４】図４は、pAdVantageベクターの構成を模式的に
示した図である。pAdVantageベクターは、アデノウイル
スVA I-RNA遺伝子（Adenovirus VAI RNA gene）、アデ
ノウイルスVA II-RNA遺伝子（Adenovirus VAII RNA gen
e）を有する。FIG. 4 is a diagram schematically showing a configuration of a pAdVantage vector. The pAdVantage vector contains the adenovirus VA I-RNA gene (Adenovirus VAI RNA gene) and the adenovirus VA II-RNA gene (Adenovirus VAII RNA gene).
e).
【図５】図５は、pAdVantageベクターを共導入した場合
の効果を示す図である。pmiwluc及びpAdVantageを共導
入した群（AdV+Luc）、pmiwlucのみ導入した群（Lu
c）、及びpmiwZを導入した群(control)のルシフェラー
ゼ活性（Luciferase Activity）が示される。[Fig. 5] Fig. 5 is a view showing the effect when a pAdVantage vector is co-transfected. A group into which pmiwluc and pAdVantage were co-introduced (AdV + Luc), a group into which only pmiwluc was introduced (Lu
c) and the luciferase activity of the group (control) into which pmiwZ was introduced.
【図６】図６は、pSEAP controlの構成を模式的に示す
図である。pSEAPは、ヒトアルカリフォスファターゼ遺
伝子（SEAP）の上流にSV40プロモーター（SV40 promote
r）を有し、さらに、SV40ポリA配列（SV40 polyA）及び
SV40エンハンサー（SV40enhancer）を有する。FIG. 6 is a diagram schematically showing a configuration of pSEAP control. pSEAP is an SV40 promoter (SV40 promote) upstream of the human alkaline phosphatase gene (SEAP).
r), further comprising an SV40 polyA sequence (SV40 polyA) and
It has the SV40 enhancer (SV40enhancer).
【図７】図７は、エレクトロポレーション後の卵管粘膜
部（Oviduct）及び卵白（Egg White）におけるヒトアル
カリフォスファターゼ遺伝子（SEAP）の発現を示す図で
ある。グラフ中、横軸はエレクトロポレーション後の経
過日数、縦軸はヒトフォスファターゼ活性（SEAP Activ
ity）である。FIG. 7 is a diagram showing the expression of the human alkaline phosphatase gene (SEAP) in the fallopian tube mucosa (Oviduct) and egg white (Egg White) after electroporation. In the graph, the horizontal axis represents the number of days elapsed after electroporation, and the vertical axis represents human phosphatase activity (SEAP Activate).
ity).
Claims (10)
内で外来遺伝子発現産物を生産する方法 a)エレクトロポレーション法により、外来遺伝子を鳥類
の卵管粘膜部細胞に導入するステップ、 b)導入された前記外来遺伝子を前記卵管粘膜部細胞内で
発現させるステップ、 c)ステップb)で得られた前記外来遺伝子の発現産物を、
前記卵管粘膜部細胞から分泌させて卵白内に移行させる
ステップ。1. A method for producing an exogenous gene expression product in an avian egg, comprising the steps of: a) introducing an exogenous gene into avian oviduct mucosal cells by electroporation; b. ) Expressing the introduced foreign gene in the cells of the fallopian tube mucosa, c) expressing the foreign gene expression product obtained in step b),
A step of allowing the cells to be secreted from the cells of the fallopian tube mucosa and transferred into egg white.
電圧が２５Ｖ〜２５０Ｖの範囲にあるパルスを用いて行
う、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the electroporation method is performed using a pulse having an applied voltage in a range of 25 V to 250 V.
ス幅が２０ msec〜１５０ msecの範囲にあるパルスを用
いて行う、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方
法。3. The method according to claim 1, wherein the electroporation method is performed using a pulse having a pulse width in a range of 20 msec to 150 msec.
ス回数が、２回〜１０回の範囲の条件で行う、ことを特
徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。4. The method according to claim 1, wherein the electroporation method is performed under the condition that the number of pulses ranges from 2 to 10.
子の発現効率を上昇させる作用のある物質を、前記外来
遺伝子とともに前記卵管粘膜部細胞に導入する、ことを
特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。5. The method according to claim 1, wherein in the step a), a substance having an effect of increasing the expression efficiency of the foreign gene is introduced into the cells of the fallopian tube together with the foreign gene. The method according to any of the above.
る、ことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の
方法。6. The method according to claim 1, wherein the bird is a chicken or a quail.
とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。7. The method according to claim 1, wherein the bird is a chicken.
ン遺伝子、ヒトフィブリノーゲン遺伝子、ヒト血清アル
ブミン遺伝子、ヒトラクトフェリン遺伝子、ヒトプロテ
インC、及びヒトα-グルコシダーゼ遺伝子からなる群よ
り選択される遺伝子である、ことを特徴とする請求項１
〜７のいずれかに記載の方法。8. The method according to claim 8, wherein the foreign gene is a gene selected from the group consisting of a human erythropoietin gene, a human fibrinogen gene, a human serum albumin gene, a human lactoferrin gene, a human protein C, and a human α-glucosidase gene. Claim 1.
The method according to any one of claims 1 to 7,
より生産される、前記外来遺伝子発現産物を含む鳥類の
卵。9. An avian egg containing the foreign gene expression product, which is produced by the method according to any one of claims 1 to 8.
外来遺伝子発現産物。10. An exogenous gene expression product obtained from the egg according to claim 9.
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| JP2001039689A JP2002238559A (en) | 2001-02-16 | 2001-02-16 | Method for producing extraneous gene-expressed product in egg of bird |
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006512922A (en) * | 2003-01-21 | 2006-04-20 | トランスジェンアールエックス，インコーポレイテッド | Administration of transposon vectors to the reproductive organs |
| US8071364B2 (en) | 2003-12-24 | 2011-12-06 | Transgenrx, Inc. | Gene therapy using transposon-based vectors |
| US9150881B2 (en) | 2009-04-09 | 2015-10-06 | Proteovec Holding, L.L.C. | Production of proteins using transposon-based vectors |
| US9150880B2 (en) | 2008-09-25 | 2015-10-06 | Proteovec Holding, L.L.C. | Vectors for production of antibodies |
| US9157097B2 (en) | 2008-09-25 | 2015-10-13 | Proteovec Holding, L.L.C. | Vectors for production of growth hormone |
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2001
- 2001-02-16 JP JP2001039689A patent/JP2002238559A/en active Pending
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| US8236294B2 (en) | 2003-12-24 | 2012-08-07 | The Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Gene therapy using transposon-based vectors |
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