JP2002207026A - Nucleic acid aptamer self-integrated biosensor and chip device equipped therewith as detection part - Google Patents
Nucleic acid aptamer self-integrated biosensor and chip device equipped therewith as detection partInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、過酸化水素などの
化学物質の定量に用いることのできるバイオセンサー
と、そのようなバイオセンサーを検出部として備えたチ
ップデバイスに関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a biosensor which can be used for quantifying a chemical substance such as hydrogen peroxide, and a chip device provided with such a biosensor as a detection unit.
【０００２】[0002]
【従来の技術】過酸化水素などの化学物質を検出するバ
イオセンサーとしては、酵素を電極に固定したものが使
用されている。分析化学の分野、例えば環境分析、臨
床、医薬品などの分野において、極微量成分を正確に、
かつ迅速に分析する手法として、キャピラリー電気泳動
（ＣＥ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）又はフロー
インジェクション分析（ＦＩＡ）等が用いられている。
それらの検出計として、微量の液体試料中の成分を検出
するのに適した検出計セルが求められている。それらの
分析計で用いられる検出計セルは、通常、分析対象とな
る液体試料を導入するための試料導入口、液体試料の流
路及びその流路を通過した液体試料を排出する試料排出
口を備え、その流路中に液体試料と紫外あるいは可視領
域の検出光との相互作用領域となる試料室を有し、上に
示したような分析手法に用いられる分析カラムの出口に
接続されて使用される。その測定室となる流路部分には
検出光が照射され、検出光は試料室に存在する液体試料
を透過した後、測定光学系により検出される。2. Description of the Related Art As a biosensor for detecting a chemical substance such as hydrogen peroxide, a sensor in which an enzyme is immobilized on an electrode is used. In the field of analytical chemistry, for example, environmental analysis, clinical, pharmaceuticals, etc.
Capillary electrophoresis (CE), liquid chromatography (LC), flow injection analysis (FIA), or the like is used as a technique for rapid analysis.
As such a detector, a detector cell suitable for detecting components in a small amount of liquid sample is required. The detector cell used in these analyzers usually has a sample inlet for introducing a liquid sample to be analyzed, a flow path for the liquid sample, and a sample outlet for discharging the liquid sample passing through the flow path. It has a sample chamber in the flow path that serves as an interaction area between the liquid sample and the detection light in the ultraviolet or visible range, and is used by being connected to the outlet of the analytical column used in the analysis method described above. Is done. A detection light is applied to a flow path portion serving as the measurement chamber, and the detection light is detected by a measurement optical system after passing through a liquid sample existing in the sample chamber.
【０００３】近年、取扱いが煩雑なガラスキャピラリー
に代わって、分析の高速化、装置の小型化が期待できる
形態として、D. J. Harrison et al./ Science, Vol.26
1, p.895-897 (1993) に示されているように、２枚の基
板を接合して形成されたキャピラリー電気泳動に用いる
チップデバイスが提案されている。そのチップデバイス
は、ガラス基板を材料とした電気泳動部材上に液体試料
を導入するための流路と、液体試料を分離するための流
路を半導体製造技術を基盤とするマイクロマシニング技
術を用いて形成されたものである。チップデバイスを用
いた電気泳動装置は、従来のキャピラリー電気泳動装置
と比較して、高速分析が可能、溶媒消費量が極めて少な
い、必要とするサンプルが極微量、装置の小型化が可能
などの利点を有する。これの特徴は、上に述べた分析化
学の分野において、従来の分析装置では実現が困難であ
った現場（オンサイドやベッドサイド）分析を可能とす
るものとして、またＤＮＡ（デオキシリボ核酸）分析な
どの分野に対しては、高速分析の視点からスクリーニン
グに有利なものとして有望視されている。[0003] In recent years, instead of glass capillaries which are complicated to handle, DJ Harrison et al./Science, Vol.
1, pp. 895-897 (1993), there has been proposed a chip device formed by bonding two substrates and used for capillary electrophoresis. The chip device uses micromachining technology based on semiconductor manufacturing technology to provide a flow path for introducing a liquid sample onto an electrophoresis member made of a glass substrate and a flow path for separating the liquid sample. It was formed. Compared to conventional capillary electrophoresis devices, the electrophoresis device using a chip device has the following advantages: high-speed analysis, extremely low solvent consumption, extremely small amount of sample required, and miniaturization of the device. Having. The feature of this is that in the field of analytical chemistry described above, it is possible to perform on-site (onside or bedside) analysis that was difficult to achieve with conventional analyzers, and also to analyze DNA (deoxyribonucleic acid). In the field of (1), from the viewpoint of high-speed analysis, it is promising as an advantage for screening.
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】従来のバイオセンサー
は酵素で構成されているが、酵素は変成しやすいため、
安定性の向上が大きな課題となっている。また、酵素を
用いたバイオセンサーの場合、酵素は分子量が大きいた
め、電極表面との間で直接的な電子移動が困難な場合が
多い。そのため、電子移動のためのメディエーター（中
間媒体）を共存させる必要があるため、そのための試薬
も必要になる。その結果、バイオセンサーの製作にあた
って、複雑な製造工程が必要となる。The conventional biosensor is composed of an enzyme, but the enzyme is easily denatured.
Improving stability is a major issue. In the case of a biosensor using an enzyme, since the enzyme has a large molecular weight, direct electron transfer between the enzyme and the electrode surface is often difficult. For this reason, a mediator (intermediate medium) for electron transfer needs to coexist, and a reagent for that is also required. As a result, a complicated manufacturing process is required to manufacture the biosensor.
【０００５】そこで、本発明の第１の目的は、メディエ
ーターを必要とせず、安定性にもすぐれて、しかも製作
も容易なバイオセンサーを提供することである。本発明
の第２の目的は、そのようなバイオセンサーを検出部と
して備えた、微量分析装置の分析計セルやチップデバイ
スを提供することである。Accordingly, a first object of the present invention is to provide a biosensor which does not require a mediator, has excellent stability, and is easy to manufacture. A second object of the present invention is to provide an analyzer cell or a chip device of a microanalyzer equipped with such a biosensor as a detection unit.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】本発明のバイオセンサー
は、触媒機能を有する核酸アプタマーの一端に金属との
親和性のある官能基が導入されており、その官能基によ
り電極表面に自己集積化されているものである。核酸ア
プタマーは、酵素に比べて高い耐熱性、耐酸性、耐アル
カリ性を備えている。また、核酸アプタマーは分子量が
低いため、空間的に電極表面に近づくことができるの
で、メディエーターなしでも高い感度を有する。核酸ア
プタマーの一端に金属との親和性のある官能基を導入す
ることにより、電極表面にも容易に固定化が可能にな
る。本発明のチップデバイスは、検出部にこのバイオセ
ンサーを備えたものである。In the biosensor of the present invention, a functional group having an affinity for metal is introduced at one end of a nucleic acid aptamer having a catalytic function, and the functional group is self-integrated on the electrode surface. Is what is being done. Nucleic acid aptamers have higher heat resistance, acid resistance, and alkali resistance than enzymes. Further, since the nucleic acid aptamer has a low molecular weight, it can spatially approach the electrode surface, and thus has high sensitivity even without a mediator. By introducing a functional group having an affinity for a metal into one end of the nucleic acid aptamer, it can be easily immobilized on the electrode surface. The chip device of the present invention includes the biosensor in the detection unit.
【０００７】[0007]
【発明の実施の形態】核酸アプタマーの一例は、ＤＮＡ
・ヘミン錯体であり、官能基はＤＮＡの５’端に導入さ
れたチオール基である。ＤＮＡ・ヘミン錯体が酸化還元
反応に対する触媒活性をもつことは知られている（例え
ば、Chemistry & Biology, 1998, Vol.5, No.9, 505-51
7参照）。しかし、ＤＮＡ・ヘミン錯体などの核酸アプ
タマーを電極に固定したり、さらにその固定された核酸
アプタマーを分析計の検出部に用いることは知られてい
ない。チオール化した核酸は金属電極表面に容易に固定
化できる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION An example of a nucleic acid aptamer is DNA
-It is a hemin complex, and the functional group is a thiol group introduced at the 5 'end of DNA. It is known that a DNA / hemin complex has a catalytic activity for a redox reaction (for example, Chemistry & Biology, 1998, Vol. 5, No. 9, 505-51).
7). However, it is not known that a nucleic acid aptamer such as a DNA / hemin complex is immobilized on an electrode or that the immobilized nucleic acid aptamer is used for a detection unit of an analyzer. The thiolated nucleic acid can be easily immobilized on the surface of the metal electrode.
【０００８】図１に核酸アプタマーの一例としてＤＮＡ
とヘミンとの錯体を使用した例を示す。この核酸アプタ
マー２０はＤＮＡオリゴヌクレオチドとヘミンとの錯体
から形成されており、ＤＮＡの一端に導入されたチオー
ル基（ＳＨ）が金電極２２に吸着することにより、核酸
アプタマーが電極２２に固定されている。ＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドの分子量は低いため、ヘミンは金電極２２
に対し空間的に接近した位置に固定されている。この核
酸アプタマー２０はペルオキシダーゼ活性をもってお
り、Ｈ2Ｏ2に対する酸化還元反応の触媒として作用す
る。FIG. 1 shows DNA as an example of a nucleic acid aptamer.
The following shows an example using a complex of and hemin. The nucleic acid aptamer 20 is formed from a complex of a DNA oligonucleotide and hemin, and the thiol group (SH) introduced at one end of the DNA is adsorbed to the gold electrode 22 so that the nucleic acid aptamer is fixed to the electrode 22. I have. Because of the low molecular weight of DNA oligonucleotides, hemin is
Is fixed at a position spatially close to. This nucleic acid aptamer 20 has peroxidase activity and acts as a catalyst for a redox reaction on H 2 O 2 .
【０００９】この核酸アプタマー２０を金電極２２に自
己集積化（固定）する工程を図２に示す。使用するＤＮ
Ａオリゴヌクレオチドの塩基配列は、図４の上部に示さ
れるようなＳＨ−ＰＳ２．Ｍ又はＳＨ−２０ｍｅｒ−１
である。何れかのＤＮＡを１ｍＭの濃度になるように調
整して、９５℃で５分間加熱する（ステップＳ１）。FIG. 2 shows a process of self-integrating (fixing) the nucleic acid aptamer 20 on the gold electrode 22. DN to use
The nucleotide sequence of the A-oligonucleotide is as shown in the upper part of FIG. M or SH-20mer-1
It is. One of the DNAs is adjusted to a concentration of 1 mM and heated at 95 ° C. for 5 minutes (step S1).
【００１０】その溶液をバッファ液で１μＭに希釈する
（ステップＳ２）。バッファ液としては２５ｍＭのＨＥ
ＰＥＳ（ＰＨ８.０）、２０ｍＭのＫＣｌ及び０.０５％
のＴｒｉｔｏｎＸ−１００の混合溶液である。その希釈
された溶液を室温で３０分間放置する（ステップＳ
３）。その後、そのＤＮＡ溶液に、ヘミンを１０μＭの
濃度になるように加え（ステップＳ４）、２０分間イン
キュベーションを行なう（ステップＳ５）。インキュベ
ーションは３７℃で浸透しながら行なう。The solution is diluted to 1 μM with a buffer solution (step S2). 25 mM HE as buffer solution
PES (PH 8.0), 20 mM KCl and 0.05%
Is a mixed solution of Triton X-100. The diluted solution is left at room temperature for 30 minutes (Step S)
3). Thereafter, hemin is added to the DNA solution to a concentration of 10 μM (step S4), and incubation is performed for 20 minutes (step S5). Incubation is performed at 37 ° C. with shaking.
【００１１】その後、その溶液を金電極の上に１μｌ載
せ（ステップＳ６）、１時間放置した後、イオン交換水
で洗う（ステップＳ７）。以上の操作により、図１に示
されたように、核酸アプタマー２０が金電極２２に固定
化されたバイオセンサーが得られる。Thereafter, 1 μl of the solution is placed on the gold electrode (step S6), left for 1 hour, and washed with ion-exchanged water (step S7). By the above operation, as shown in FIG. 1, a biosensor in which the nucleic acid aptamer 20 is immobilized on the gold electrode 22 is obtained.
【００１２】次に、このバイオセンサーを用いて、Ｈ2
Ｏ2の酸化還元反応を測定した例を説明する。試料とし
てＨ2Ｏ2をリン酸バッファとＫＣｌで希釈して６００μ
Ｍとなるように調製する。その試料溶液に、上のように
作成したバイオセンサーを浸し、ＣＶ（サイクリックボ
ルタノメトリ）測定を行った。ＣＶ測定では、０Ｖから
−１.０Ｖに向かって電圧を低下させ、再び０Ｖへ戻す
サイクルで、その走査速度を０.１Ｖ／秒とした。Next, using this biosensor, H 2
An example in which the oxidation-reduction reaction of O 2 is measured will be described. Dilute H 2 O 2 with phosphate buffer and KCl as a sample and add
Prepare to be M. The biosensor prepared as above was immersed in the sample solution, and CV (cyclic voltametry) measurement was performed. In the CV measurement, the scanning speed was set to 0.1 V / sec in a cycle in which the voltage was reduced from 0 V toward -1.0 V and returned to 0 V again.
【００１３】その結果を図３に示す。は上に示した本
発明のＤＮＡ・ヘミン錯体によるＣＶ測定結果であり、
それに対し、は試料溶液にヘミンのみを加えた場合の
測定結果である。ヘミンのみの場合はヘミンは電極に固
定されていない。図３の結果から、ヘミンのみの測定結
果とＤＮＡ・ヘミン錯体の測定結果とでは、還元ピーク
の位置がずれている。このことから、ヘミンをＤＮＡと
錯体とし、ＤＮＡを金電極上に固定することにより、金
電極上での状態が変化し、その影響で還元ピークの位置
がずれたものと考えられる。FIG. 3 shows the result. Is a CV measurement result using the DNA / hemin complex of the present invention shown above,
On the other hand, is a measurement result when only hemin is added to the sample solution. In the case of only hemin, hemin is not fixed to the electrode. From the results of FIG. 3, the position of the reduction peak is shifted between the measurement result of hemin only and the measurement result of the DNA / hemin complex. From this, it is considered that the state on the gold electrode was changed by immobilizing DNA on the gold electrode by combining hemin with the DNA, and the position of the reduction peak was shifted due to the influence.
【００１４】次に、ＤＮＡ・ヘミン錯体を金電極に固定
した実施例におけるＨ2Ｏ2に対する応答性を調べた結果
を図４（Ａ）と（Ｂ）に示す。（Ａ）はＤＮＡオリゴヌ
クレオチドが配列表の配列番号１に示したＳＨ−ＰＳ
２．Ｍの場合、（Ｂ）はＤＮＡオリゴヌクレオチドが配
列表の配列番号２に示したＳＨ−２０ｍｅｒ−１の場合
である。上に記載したように金電極へＤＮＡ・ヘミン錯
体を固定した後、バッファで希釈した各濃度のＨ2Ｏ2の
試料でＣＶ測定を行なった結果を示している。Ｈ2Ｏ2試
料溶液の濃度は６０、６００、６０００μＭであった。
図４（Ａ）と（Ｂ）の結果から、ＤＮＡの種類により応
答特性が異なることがわかる。また、１００℃で３０分
間加熱した後も図４（Ａ）と（Ｂ）と同じ応答特性を示
したことから、核酸アプタマーは高い耐熱性を備えてい
ることがわかる。Next, FIGS. 4A and 4B show the results of examining the responsiveness to H 2 O 2 in an example in which the DNA / hemin complex was immobilized on a gold electrode. (A) shows that the DNA oligonucleotide has the SH-PS shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
2. In the case of M, (B) is a case where the DNA oligonucleotide is SH-20mer-1 shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. As shown above, the results of immobilizing the DNA / hemin complex on the gold electrode and performing CV measurement on H 2 O 2 samples of various concentrations diluted with a buffer are shown. The concentrations of the H 2 O 2 sample solution were 60, 600, and 6000 μM.
From the results of FIGS. 4A and 4B, it can be seen that the response characteristics differ depending on the type of DNA. In addition, even after heating at 100 ° C. for 30 minutes, the same response characteristics as those shown in FIGS. 4A and 4B were shown, indicating that the nucleic acid aptamer has high heat resistance.
【００１５】[0015]
【実施例】図５は本発明をチップデバイスに適用した一
実施例を表わしたものであり、（ａ）はその上面図、
（ｂ）はそのＡ−Ａ線位置での断面図である。このチッ
プデバイスは、板状部材の内部に形成された微小断面積
の流路８を備え、その流路８の少なくとも一部を検出部
としており、その検出部には本発明のバイオセンサーが
設けられている。FIG. 5 shows an embodiment in which the present invention is applied to a chip device.
(B) is a cross-sectional view taken along the line AA. This chip device includes a flow path 8 having a minute cross-sectional area formed inside a plate-like member, and at least a part of the flow path 8 is used as a detection unit. The detection unit is provided with the biosensor of the present invention. Have been.
【００１６】具体的に示すと、石英にてなるガラス基板
１，２が貼り合わされ、その貼り合わされた面のガラス
基板１側には数１００μｍ以下の幅と深さをもつ液体試
料用流路用の微小な流路溝８が形成されている。流路溝
８の一端には試料導入口９ａがガラス基板２を貫通して
設けられ、流路溝８の他端には試料排出口９ｂがガラス
基板２を貫通して設けられている。Specifically, glass substrates 1 and 2 made of quartz are bonded together, and a liquid sample flow path having a width and a depth of several hundred μm or less is provided on the bonded glass substrate 1 side. Are formed. At one end of the flow channel 8, a sample inlet 9 a is provided through the glass substrate 2, and at the other end of the flow channel 8, a sample outlet 9 b is provided through the glass substrate 2.
【００１７】流路溝８の試料排出口側には、金電極１０
が形成されており、金電極１０につながるリード部分１
２が基板１の側端面まで伸びている。リード部分１２の
端部では、基板２の一部が切りかかれて凹部１４が形成
され、リード部分１２の端部がその凹部１４に露出して
測定回路と接続できるようになっている。金電極１０及
びリード部分１２は金をマスク蒸着することにより、５
０〜３００ｎｍの厚さに形成されている。その金電極１
０には、ＤＮＡ・ヘミン錯体などの触媒機能を有する核
酸アプタマーが、その一端に導入されたチオール基など
金属との親和性のある官能基によって固定されてバイオ
センサーを構成している。そのバイオセンサーが検出部
となっている。両基板１，２は、接合すべき面を向かい
合わせて密着させ、接着剤により、又はフッ酸溶液によ
る接合で、気密に接合することにより流路溝８を形成し
ている。A gold electrode 10 is provided on the sample outlet side of the flow channel 8.
Is formed, and a lead portion 1 connected to the gold electrode 10 is formed.
2 extends to the side end surface of the substrate 1. At the end of the lead portion 12, a part of the substrate 2 is cut away to form a concave portion 14, and the end of the lead portion 12 is exposed to the concave portion 14 so that it can be connected to a measurement circuit. The gold electrode 10 and the lead portion 12 are formed by depositing gold by mask evaporation.
It is formed to a thickness of 0 to 300 nm. The gold electrode 1
In No. 0, a nucleic acid aptamer having a catalytic function such as a DNA / hemin complex is immobilized by a functional group having an affinity for a metal such as a thiol group introduced at one end to constitute a biosensor. The biosensor is the detection unit. The two substrates 1 and 2 are brought into close contact with the surfaces to be joined facing each other, and are air-tightly joined with an adhesive or a hydrofluoric acid solution to form the flow channel 8.
【００１８】図６は本発明を電気泳動装置のチップデバ
イスに適用した実施例を示したものである。（ａ）は一
方の基板３１の平面図、（ｂ）は他方の基板の平面図、
（ｃ）は両基板３１，３２を組み合わせてチップデバイ
スとした状態の正面図である。このチップデバイスは電
気泳動により試料を分離し分析する電気泳動チップであ
り、その板状部材にはその内部に電気泳動による分析流
路３５と分析流路３５に交差して分析流路３５に試料を
導入するためのサンプル流路３４が形成され、この板状
部材の一表面には分析流路３５又はサンプル流路３４に
達する穴３３が形成されており、分析流路３５の下流側
の一部が検出部となって、その検出部には本発明のバイ
オセンサーが設けられている。FIG. 6 shows an embodiment in which the present invention is applied to a chip device of an electrophoresis apparatus. (A) is a plan view of one substrate 31, (b) is a plan view of the other substrate,
(C) is a front view of a state in which both substrates 31 and 32 are combined into a chip device. This chip device is an electrophoresis chip that separates and analyzes a sample by electrophoresis, and has a plate-like member in which an analysis flow path 35 for electrophoresis intersects an analysis flow path 35 and a sample is inserted into the analysis flow path 35. A sample channel 34 for introducing the sample is formed, and a hole 33 reaching the analysis channel 35 or the sample channel 34 is formed on one surface of the plate-shaped member. The unit serves as a detection unit, and the detection unit is provided with the biosensor of the present invention.
【００１９】具体的に示すと、このチップデバイスは一
対の透明ガラス基板３１，３２からなり、一方の基板３
２の表面に互いに交差するサンプル流路３４と分析流路
３５が形成され、分析流路３５の下流側には図５の実施
例と同様に、金電極３７が形成されており、金電極３７
につながるリード部分３８が基板３２の側端面まで伸び
ている。金電極３７及びリード部分３８は金をマスク蒸
着することにより、５０〜３００ｎｍの厚さに形成され
ている。その金電極３７にも、図５の実施例と同様に、
ＤＮＡ・ヘミン錯体などの触媒機能を有する核酸アプタ
マーが、その一端に導入されたチオール基など金属との
親和性のある官能基によって固定されてバイオセンサー
を構成している。そのバイオセンサーが検出部となって
いる。More specifically, this chip device comprises a pair of transparent glass substrates 31 and 32, and one of the substrates 3
A sample flow path 34 and an analysis flow path 35 that intersect each other are formed on the surface of the sample 2, and a gold electrode 37 is formed downstream of the analysis flow path 35, similarly to the embodiment of FIG.
Is extended to the side end surface of the substrate 32. The gold electrode 37 and the lead portion 38 are formed to have a thickness of 50 to 300 nm by vapor-depositing gold using a mask. Similarly to the embodiment of FIG.
A nucleic acid aptamer having a catalytic function, such as a DNA / hemin complex, is immobilized by a functional group having a metal affinity such as a thiol group introduced at one end to constitute a biosensor. The biosensor is the detection unit.
【００２０】他方の基板３１にはサンプル流路３４及び
分析流路３５の両端に対応する位置にリザーバ３３を貫
通穴として設けられている。また、リード部分３８の端
部に該当する位置では、基板３１の一部が切りかかれて
凹部４０が形成され、両基板３１，３２を組み合わせた
とき、リード部分３８の端部がその凹部４０から露出し
て測定回路と接続できるようになる。The other substrate 31 is provided with reservoirs 33 as through holes at positions corresponding to both ends of the sample flow path 34 and the analysis flow path 35. Further, at a position corresponding to the end of the lead portion 38, a part of the substrate 31 is cut out to form a concave portion 40. When the two substrates 31 and 32 are combined, the end of the lead portion 38 is removed from the concave portion 40. It is exposed and can be connected to the measurement circuit.
【００２１】両基板３１，３２は、（ｃ）に示すよう
に、流路３４，３５、電極３７及びリード部分３８が内
側にくるように重ねて張り合わされて、チップデバイス
が形成されている。両基板３１，３２は、接合すべき面
を向かい合わせて密着させ、接着剤により、又はフッ酸
溶液による接合で、気密に接合されている。As shown in FIG. 2C, the two substrates 31 and 32 are overlapped and bonded so that the flow paths 34 and 35, the electrodes 37 and the lead portions 38 are on the inside, and a chip device is formed. The two substrates 31 and 32 are brought into close contact with the surfaces to be joined facing each other, and are hermetically joined by an adhesive or a hydrofluoric acid solution.
【００２２】このチップデバイスを使用するときは、い
ずれかのリザーバ３３から泳動媒体として泳動バッファ
又はゲル溶液をサンプル流路３４及び分析流路３５中に
注入する。その後、サンプル流路３４の一方の端のリザ
ーバ３３にサンプルを注入した後、各リザーバ３３にそ
れぞれ電極を差し込むか、又は予め各リザーバ３３に形
成された電極を用いて、サンプル流路３４の両端に所定
時間だけ所定の高電圧を印加し、これによりサンプルを
サンプル流路３４と分析流路３５の交差部６に導く。次
に、分析流路３５の両端に泳動のための所定の電圧を印
加し、交差部３６に存在するサンプルを分析流路３５内
に導き、分離させる。分析流路３５の下流側の位置に形
成された検出部としてのバイオセンサーにより、分離成
分の検出を行なう。When this chip device is used, an electrophoresis buffer or gel solution as an electrophoresis medium is injected into the sample channel 34 and the analysis channel 35 from one of the reservoirs 33. Then, after injecting a sample into the reservoir 33 at one end of the sample flow path 34, electrodes are inserted into the respective reservoirs 33, or both ends of the sample flow path 34 are formed by using electrodes formed in the respective reservoirs 33 in advance. A predetermined high voltage is applied for a predetermined time to guide the sample to the intersection 6 between the sample flow path 34 and the analysis flow path 35. Next, a predetermined voltage for electrophoresis is applied to both ends of the analysis channel 35, and the sample present at the intersection 36 is guided into the analysis channel 35 and separated. The separation component is detected by a biosensor as a detection unit formed at a position on the downstream side of the analysis channel 35.
【００２３】[0023]
【発明の効果】本発明のバイオセンサーは、触媒機能を
有する核酸アプタマーの一端に金属との親和性のある官
能基を導入し、その官能基により電極表面に自己集積化
したものであるので、製作が容易で、酵素に比べて高い
耐熱性、耐酸性、耐アルカリ性を達成することができ、
メディエーターなしでも高い感度で検出することができ
る。検出部にこのバイオセンサーを備えた本発明のチッ
プデバイスは検出信号を電気信号として直接取り出すこ
とができる。The biosensor of the present invention is obtained by introducing a functional group having an affinity for a metal into one end of a nucleic acid aptamer having a catalytic function and self-assembling the electrode surface with the functional group. It is easy to manufacture and can achieve high heat resistance, acid resistance, and alkali resistance compared to enzymes.
It can be detected with high sensitivity without a mediator. The chip device of the present invention including the biosensor in the detection unit can directly extract a detection signal as an electric signal.
【図１】核酸アプタマーの一例としてＤＮＡとヘミンと
の錯体を使用して本発明を概略的に示す図である。FIG. 1 is a diagram schematically illustrating the present invention using a complex of DNA and hemin as an example of a nucleic acid aptamer.
【図２】核酸アプタマーを金電極２２に自己集積化する
工程を示すフローチャート図である。FIG. 2 is a flowchart showing a process of self-integrating a nucleic acid aptamer on a gold electrode 22.
【図３】ＤＮＡ・ヘミン錯体によるＣＶ測定結果とヘミ
ンのみによる測定結果を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing a CV measurement result using a DNA / hemin complex and a measurement result using only hemin.
【図４】実施例におけるＨ2Ｏ2に対する応答性を調べた
結果を示す図で、（Ａ）はＤＮＡオリゴヌクレオチドが
配列表の配列番号１に示したＳＨ−ＰＳ２．Ｍの場合、
（Ｂ）はＤＮＡオリゴヌクレオチドが配列表の配列番号
２に示したＳＨ−２０ｍｅｒ−１の場合である。FIG. 4 is a diagram showing the results of examining the response to H 2 O 2 in the examples. (A) shows that the DNA oligonucleotide is SH-PS2. In the case of M,
(B) shows the case where the DNA oligonucleotide is SH-20mer-1 shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
【図５】本発明をチップデバイスに適用した一実施例を
示す図で、（ａ）はその上面図、（ｂ）はそのＡ−Ａ線
位置での断面図である。FIGS. 5A and 5B are views showing an embodiment in which the present invention is applied to a chip device, wherein FIG. 5A is a top view thereof, and FIG. 5B is a cross-sectional view taken along line AA.
【図６】本発明を電気泳動装置のチップデバイスに適用
した実施例を示す図で、（ａ）は一方の基板の平面図、
（ｂ）は他方の基板の平面図、（ｃ）は両基板を組み合
わせてチップデバイスとした状態の正面図である。6A and 6B are diagrams showing an example in which the present invention is applied to a chip device of an electrophoresis apparatus, wherein FIG. 6A is a plan view of one substrate,
(B) is a plan view of the other substrate, and (c) is a front view of a state where both substrates are combined to form a chip device.
１，２，３１，３２ ガラス基板 ８ 流路溝 ９ａ 試料導入口 ９ｂ 試料排出口 １０，２２，３７ 金電極 ２０ 核酸アプタマー ３４ サンプル流路 ３５ 分析流路 1, 2, 31, 32 glass substrate 8 channel groove 9a sample inlet 9b sample outlet 10, 22, 37 gold electrode 20 nucleic acid aptamer 34 sample channel 35 analysis channel
【配列表】〈１１０〉Shimadzu Corporation 〈１２０〉a biosensor provided with nucleic acid a
ptamer and a chip device having same as a detectio
n part 〈１３０〉K1000783 〈１６０〉2 〈２１０〉1 〈２１１〉18 〈２１２〉DNA 〈２１３〉Artificial Sequence 〈２２０〉unsure 〈４００〉1 gtg ggt agg gcg ggt tgg 〈２１０〉2 〈２１１〉20 〈２１２〉DNA 〈２１３〉Artificial Sequence 〈２２０〉unsure 〈４００〉2 gcg tgg gtg ggt ggg tgg gt[Sequence List] <110> Shimadzu Corporation <120> a biosensor provided with nucleic acid a
ptamer and a chip device having same as a detectio
n part <130> K1000783 <160> 2 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> unsure <400> 1 gtg ggt agg gcg ggt tgg <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> unsure <400> 2 gcg tgg gtg ggt ggg tgg gt
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｍ 1/34 Ｚ 35/08 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３３１Ｊ 37/00 １０１ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｍ 1/34 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１１Ｅ 27/30 ３５３Ｊ ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) G01N 33/566 C12M 1/34 Z 35/08 G01N 27/26 331J 37/00 101 C12N 15/00 ZNAA / / C12M 1/34 G01N 27/26 311E 27/30 353J
Claims (5)
に金属との親和性のある官能基が導入されており、その
官能基により電極表面に自己集積化されていることを特
徴とするバイオセンサー。1. A biosensor characterized in that a functional group having an affinity for a metal is introduced into one end of a nucleic acid aptamer having a catalytic function, and the functional group is self-integrated on the electrode surface.
体であり、前記官能基はＤＮＡの５’端に導入されたチ
オール基である請求項１に記載のバイオセンサー。2. The biosensor according to claim 1, wherein the nucleic acid aptamer is a DNA / hemin complex, and the functional group is a thiol group introduced at the 5 ′ end of the DNA.
の流路を備え、その流路の少なくとも一部を検出部とし
ているチップデバイスにおいて、 前記検出部には請求項１又は２に記載のバイオセンサー
が設けられていることを特徴とするチップデバイス。3. A chip device comprising: a flow path having a minute cross-sectional area formed inside a plate-like member, wherein at least a part of the flow path serves as a detection unit. A chip device provided with the biosensor according to any one of the preceding claims.
記流路に液体試料を導入する試料導入口と、前記流路を
通過した液体試料を排出する試料排出口が設けられてい
る請求項３に記載のチップデバイス。4. The plate-like member of the chip device is provided with a sample introduction port for introducing a liquid sample into the flow path and a sample discharge port for discharging the liquid sample passing through the flow path. 4. The chip device according to 3.
料を分離し分析する電気泳動チップであり、その板状部
材にはその内部に電気泳動による分析流路とその分析流
路に交差して分析流路に試料を導入するためのサンプル
流路が形成され、前記板状部材の一表面には前記分析流
路又はサンプル流路に達する穴が形成されており、前記
分析流路の下流側の一部が前記検出部となっている請求
項３又は４に記載のチップデバイス。5. The chip device is an electrophoresis chip for separating and analyzing a sample by electrophoresis, and has a plate-like member in which an analysis flow path for electrophoresis and an analysis flow crossing the analysis flow path are provided. A sample channel for introducing a sample into the channel is formed, and a hole reaching the analysis channel or the sample channel is formed on one surface of the plate-like member. The chip device according to claim 3, wherein a unit serves as the detection unit.
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