JP2002200161A - Method of manufacturing cultured skin substitute and cultured skin substitute obtained thereby - Google Patents

Method of manufacturing cultured skin substitute and cultured skin substitute obtained thereby

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JP2002200161A
JP2002200161A JP2001325404A JP2001325404A JP2002200161A JP 2002200161 A JP2002200161 A JP 2002200161A JP 2001325404 A JP2001325404 A JP 2001325404A JP 2001325404 A JP2001325404 A JP 2001325404A JP 2002200161 A JP2002200161 A JP 2002200161A
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JP
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Patent type
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wound healing
production
effective
matrix
cultured
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Pending
Application number
JP2001325404A
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Japanese (ja)
Inventor
Yasuko Inai
Takeshi Moriyama
Masayo Nomura
Naotaka Yamamoto
直香 山本
剛 森山
靖子 稲井
昌代 野村
Original Assignee
Menicon Co Ltd
株式会社メニコン
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a cultured skin substitute having a safe, stable and high wound healing power. SOLUTION: A method of manufacturing a cultured skin substitute having stable wound healing power comprises allowing a matrix to contain a human fibroblast producing a material effective against wound healing in an amount effective against wound healing and the method of manufacturing further comprises specifying the production amount of a material effective against wound healing for the cell.

Description

【発明の詳細な説明】 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】 [0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、創傷治癒に有効であるヒト線維芽細胞を前培養し、その創傷治癒に有効な産生物質の産生能が高い状態の細胞を用いて培養皮膚代替物を製造する方法に関する。 The present invention relates to the human fibroblasts are effective in wound healing precultured, cultured skin substitutes using the production capacity of the high state cells effective produced substance in the wound healing It relates to a method for manufacturing.

【0002】 [0002]

【従来の技術】従来創傷治療においては、一般的に抗生物質により患部の細菌の増殖を抑制し自然治癒を待つ方法、肉芽、表皮形成促進剤を投与する方法、コラーゲン、キチン、キトサンなどの細胞外マトリックスを生着する方法および人工皮膚を生着する方法などが用いられてきた。 In a conventional wound treatment, methods of administration by general antibiotics method to inhibit the proliferation of the affected bacterial wait for natural healing, granuloma, skin formation promoter, collagen, chitin, cells and chitosan methods and artificial skin engraft the outer matrix or a method of engraftment have been used.

【0003】近年では、特定の細胞が産生している細胞増殖因子や、サイトカインなどが創傷治癒に有効であることから、創傷治癒に使用することが報告されている。 In recent years, and cell growth factors specific cells are produced, since such cytokines are effective in wound healing, it has been reported to be used in wound healing.
しかしながら、サイトカインや細胞増殖因子は、細胞内で複雑なネットワークを形成しているため、単独のサイトカインや細胞増殖因子を生体に高濃度投与することは副作用の増大をもたらすため非常に危険である。 However, cytokines and cellular growth factors, because it forms a complex network in a cell, to a high concentration administered cytokines and cellular growth factors alone vivo is very dangerous to bring an increase in side effects.

【0004】これに対して、サイトカインや細胞増殖因子を直接生体に投与するのではなく、これら物質を産生する細胞を利用する方法が報告されている。 [0004] On the contrary, instead of administering to the living body of cytokines and growth factors directly, methods utilizing cells that produce these substances have been reported. たとえば、 For example,
特開平6−142185には、血管内細胞を増殖させる物質を産生する細胞としてヒト卵巣腫瘍樹立細胞を基材に担持した骨形成促進剤が開示されている。 The JP 6-142185, osteogenesis promoter of the human ovarian tumor established cell supported on a substrate as a cell producing a substance of proliferating vascular cells are disclosed. また、創傷治癒に有効な産生物質の一種である細胞成長因子を産生する細胞を組み込んだ形の医療材料が、特開平8−19 The medical material in the form incorporating cells producing growth factor, which is a kind of effective production material wound healing, JP-8-19
8763に開示されている。 Disclosed in 8763.

【0005】また、特開平11−246420には、コラーゲンのマトリックスに血小板が埋入されていることを特徴とする創傷治癒促進剤が開示されている。 Further, in Japanese Patent Laid-Open 11-246420, wound healing promoting agent characterized in that the platelets are embedded in a matrix of collagen is disclosed. これは血小板中に含まれる、血小板由来成長因子(PDG This is contained in the platelet, platelet-derived growth factor (PDG
F)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、上皮成長因子(EGF)の創傷治癒促進効果によるものである。 F), vascular endothelial growth factor (VEGF), is due to a wound healing promotion effect of epidermal growth factor (EGF). しかし、この方法は血小板を含有することが必須で、血小板は細胞外マトリックスに粘着し血栓を形成する。 However, this method is required to contain platelets, platelets forming the pressure-sensitive thrombus in the extracellular matrix. これは創傷治癒超早期での凝固反応には都合がよいが、一般に細毛管が新生して栄養分を運搬する時期、あるいは培養皮膚を使用するような創面では不都合なことが多い。 This is is convenient to the coagulation reaction in wound healing very early, generally timing fine capillary for transporting nutrients and newborn, or it is often inconvenient in wound surface such as using cultured skin.
また、創傷治癒後期に血小板の脱顆粒が生じると、過度の創傷治癒因子を含むことにより線維芽細胞の増殖が衰えず、また細胞外マトリックスの生産が分解を極端に上回ることになり、瘢痕組織を形成する結果になるという問題点がある。 Further, when the wound healing late degranulation of platelets occurs, growth of fibroblasts unabated by including excessive wound healing factors, also results in production of extracellular matrix exceeds the extreme degradation, scar tissue it is disadvantageously result in the formation of.

【0006】これら創傷治癒に有効な物質を産生する細胞を用いた方法は、いずれも該物質が生体由来の物質であるため、個体差が著しく大きく、一定した治癒力を有する人工皮膚を安定に生産することが難しいという欠点があった。 [0006] method using cells that produce substances effective for these wound healing, since both the substance is a substance derived from a living organism, the individual difference is significantly large, stable artificial skin having a constant healing that there has been a drawback that it is difficult to produce.

【0007】 [0007]

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明は、安全で、安定した高い創傷治癒力を有する培養皮膚代替物を提供することを課題とする。 [SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, the present invention is safe, and to provide a cultured skin substitutes having stable and high wound healing.

【0008】 [0008]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意努力した結果、創傷治癒に有効な物質を産生しているヒト線維芽細胞を用い、さらに創傷治療に有効な物質の有効な産生量を特定することにより、安定な創傷治癒力を有する培養皮膚代替物を提供できることを新規に見出し発明を完成させた。 Means for Solving the Problems The present inventors have found, as a result of extensive studies to solve the above problems, using human fibroblast cells producing an active substance to the wound healing, more effective for wound treatment by specifying the effective production of such material was newly completed headlines invention can provide cultured skin substitutes with stable wound healing.

【0009】すなわち、本発明は創傷治療に有効な産生物質を、創傷治癒に有効な量産生しているヒト線維芽細胞を、マトリックスに含有させることを特徴とする培養皮膚代替物の製造方法(請求項1)、前記ヒト線維芽細胞をマトリックスに含有させる前に、前記創傷治癒に有効な産生物質の産生量を特定することを特徴とする請求項1記載の製造方法(請求項2)、前記ヒト線維芽細胞が、播種密度が2×10 3 〜5×10 3 cells/cm 2において4日以上9日以下の期間前培養後、マトリックスに含有させる前に、創傷治療に有効な産生物質の産生量を特定することを特徴とする請求項1記載の製造方法(請求項3)、前記創傷治癒に有効な産生物質が、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、インターロイキン−6(IL Accordingly, the present invention provides an effective production material wound care, human fibroblasts are effective scale production in wound healing, method for producing a cultured skin substitute characterized in that it is contained in the matrix ( claim 1), wherein the human fibroblast cells prior to inclusion in the matrix, the method according to claim 1, wherein the identifying the production of effective produced substance to the wound healing (claim 2), said human fibroblasts, seeding density of 2 × 10 3 ~5 × 10 3 cells / cm 2 in 4 days or more after 9 days following period preculture, prior to be contained in a matrix, effective production materials for wound treatment the process according to claim 1, wherein the identifying the production quantity (claim 3), effective produced substance to the wound healing, vascular endothelial growth factor (VEGF), interleukin -6 (IL
-6)およびI型コラーゲンである請求項1記載の製造方法(請求項4)、前記創傷治癒に有効な産生物質が血管内皮細胞増殖因子(VEGF)であり、前培養期間における細胞密度6×10 4 〜4×10 5 cells/mlの細胞培養液において、前記産生量が0.1〜1ng/ml/日である請求項2記載の製造方法(請求項5)、前記創傷治癒に有効な産生物質がインターロイキン−6(IL- -6) and manufacturing method of claim 1 wherein the type I collagen (Claim 4), effective produced substance to the wound healing is vascular endothelial growth factor (VEGF), a cell density in the pre-culture period 6 × in 10 4 ~4 × 10 5 cells / ml of cell culture method according to claim 2, wherein the production amount is 0.1~1ng / ml / day (claim 5), effective on the wound healing produced substance is interleukin -6 (IL-
6)であり、前培養期間における細胞密度6×10 4 6), and the cell density 6 × 10 4 ~ before incubation period
4×10 5 cells/mlの細胞培養液において、前記産生量が0.1〜10ng/ml/日である請求項2記載の製造方法(請求項6)、前記創傷治癒に有効な産生物質がI型コラーゲンであり、前培養期間における細胞密度6×1 In 4 × 10 5 cells / ml of cell culture medium, the production amount is 0.1~10ng / ml / day The method of claim 2, wherein is (Claim 6), valid produced substance in the wound healing a type I collagen, cell density in the preculture period 6 × 1
4 〜4×10 5 cells/mlの細胞培養液において、前記産生量が100〜1000ng/ml/日である請求項2記載の製造方法(請求項7)、前記マトリックスがアテロコラーゲン、コラーゲン、ゼラチン、コンドロイチン硫酸またはヒアルロン酸である請求項1記載の製造方法(請求項8)、(1)血清入りの培地でヒト線維芽細胞を前培養し、(2)(1)で培養された、創傷治療に有効な産生物質を創傷治癒に有効な量産生しているヒト線維芽細胞をマトリックス上に播種し、(3)(2)のマトリックス上のヒト線維芽細胞を無血清または血清を含む培地で培養する工程からなる請求項1記載の製造方法(請求項9)、前記培養皮膚代替物が培養真皮代替物である請求項1記載の製造方法(請求項10)、請求項1 0 In 4 ~4 × 10 5 cells / ml of cell culture method according to claim 2, wherein the production amount is 100~1000ng / ml / day (claim 7), wherein the matrix atelocollagen, collagen, gelatin the method according to claim 1 wherein the chondroitin sulfate or hyaluronic acid (claim 8), (1) in medium containing serum was pre-cultured human fibroblasts, cultured in (2) (1), wound medium effective produced substance in the treatment of human fibroblasts are effective scale production wound healing seeded onto a matrix, comprising a matrix on human fibroblasts serum or serum of (3) (2) in the manufacturing method according to claim 1, wherein comprising a step of culturing (claim 9), wherein the cultured skin substitute manufacturing method of claim 1 wherein the culture dermal substitute (claim 10), according to claim 1
記載の製造方法によって得られる培養皮膚代替物(請求項11)、および前記皮膚が真皮である請求項11記載の培養皮膚代替物(請求項12)に関する。 Cultured skin substitutes obtained by the process according (claim 11), and the skin is dermal claim 11 cultured skin substitutes described for (claim 12).

【0010】 [0010]

【発明の実施の形態】本発明の培養皮膚代替物の製造方法は、創傷治療に有効な産生物質を、創傷治癒に有効な量産生しているヒト線維芽細胞を、マトリックスに含有させることを特徴とする。 Method for producing a cultured skin substitutes of the embodiment of the present invention is effective produced substance in wound care, human fibroblasts are effective scale production to wound healing, that is contained in the matrix and features.

【0011】前記創傷治癒に有効な産生物質の具体例としては、たとえば血管内皮細胞増殖因子(以下、VEG [0011] Examples of useful produced substance in the wound healing, such as vascular endothelial growth factor (hereinafter, VEG
Fという)、インターロイキン−6(以下、IL−6という)またはI型コラーゲン、フィブロネクチン、血小板由来増殖因子(PDGF)、上皮増殖因子(EG As F), interleukin-6 (hereinafter, IL-6 hereinafter) or type I collagen, fibronectin, platelet derived growth factor (PDGF), epidermal growth factor (EG
F)、線維芽細胞増殖因子(FGF)およびインターロイキン−1(IL−1)などがあげられるが、本発明の目的を達成し得るものであればどのようなものであってもよい。 F), but like fibroblast growth factor (FGF) and interleukin -1 (IL-1) are mentioned, the purpose may be of any type as long as it can achieve the present invention.

【0012】前記創傷治癒に有効な物質の創傷治癒に有効な量とは、その物質に応じて適宜決定することができる。 [0012] The A wound healing effective amount of the active substance to the wound healing, it can be appropriately determined depending on the material. たとえば前培養期間における細胞密度6×10 4 Cell density 6 × 10 for example in the preculture period of 4 to
4×10 5 cells/mlの細胞培養液において、VEGFの場合、好ましくは0.1〜1ng/ml/日、より好ましくは0.1〜0.5ng/ml/日であり、0.1ng/ml/日以下では充分な創傷治癒効果が得られない傾向があり、 In cell cultures of 4 × 10 5 cells / ml, the case of VEGF, preferably 0.1~1ng / ml / day, more preferably 0.1~0.5ng / ml / day, 0.1 ng / ml / day or less in there is not tend to give sufficient wound healing effect,
1ng/ml/日以上になると創傷部位の細胞のVEGFを産生する能力が、負のフィードバック機構により減少してしまい創傷治癒を促進することができない傾向がある。 1 ng / ml / day becomes more when the ability to produce cells of VEGF wound site tends to not be able to accelerate the reduction to cause wound healing by a negative feedback mechanism. IL−6の場合、好ましくは0.1〜10ng/ml/ For IL-6, preferably 0.1~10ng / ml /
日、より好ましくは0.1〜1ng/ml/日であり、0. Day, more preferably 0.1~1ng / ml / day, 0.
1ng/ml/日以下では充分な創傷治癒効果が得られない傾向があり、10ng/ml/日以上になると創傷部位の細胞のIL−6を産生する能力が、負のフィードバック機構により減少してしまい創傷治癒を促進することができない傾向がある。 1 ng / ml / day or less there is no tendency for acquired sufficient wound healing effect, 10 ng / ml / day capacity to produce cells of IL-6 of the composed the wound site or, reduced by the negative feedback mechanism there is a tendency to not be able to promote wound healing and sisters. I型コラーゲンの場合、好ましくは1 For type I collagen, preferably 1
00〜1000ng/ml/日、より好ましくは100〜5 00~1000ng / ml / day, more preferably 100 to 5
00ng/ml/日であり、100ng/ml/日以下では充分な創傷治癒効果が得られない傾向があり、1000ng/ And at 00ng / ml / day, 100 ng / ml / day or less there is no tendency for acquired sufficient wound healing effect, 1000 ng /
ml/日以上になると創傷部位の細胞のI型コラーゲンを産生する能力が、負のフィードバック機構により減少してしまい創傷治癒を促進することができない傾向がある。 ml / day ability to produce type I collagen to become the wound site of a cell or, tends not to be able to promote reduced to cause wound healing by a negative feedback mechanism.

【0013】また、細胞密度が6×10 4 cells/mlより低い前培養初期の場合は、細胞間相互作用による細胞の増殖刺激が充分に伝達されず、また、充分に細胞が活性化されないため、たとえ前記濃度範囲の産生物質を産生していても、培養皮膚代替物用の細胞として用いた場合、その後の細胞増殖や産生する物質の生理活性が低下してしまう傾向がある。 Further, if the cell density is preculture initial lower than 6 × 10 4 cells / ml, growth stimulation of cells by cell-cell interactions is not sufficiently transmitted, also sufficiently because cells are not activated , even if not produce the production material of the density range, when used as a cell for the cultured skin substitutes, physiological activity of subsequent cell growth and production substances tend to deteriorate. したがって前培養時の細胞密度が6×10 4 〜4×10 5 cells/mlである細胞を用いるのが好ましく、さらに1×10 5 〜2×10 5 cells/ml Therefore it is preferable to use cells that are prior to cell density of 6 × 10 4 ~4 × 10 5 cells / ml of the culture, further 1 × 10 5 ~2 × 10 5 cells / ml
であることが好ましい。 It is preferable that.

【0014】前記「マトリックス」は、人工皮膚を患者に適用(貼付)した場合に患者の免疫機能によって拒絶されることがないように、生体適合性に優れた材質でなければならない。 [0014] The "matrix", so as not to be rejected by the patient's immune function when the artificial skin is applied (pasted) to the patient, must be a material having excellent biocompatibility. また生分解性の材料であれば適用後に取り除く必要性もない。 Also there is no need to remove after application if biodegradable material. マトリックスは、生体由来材料としてコラーゲン、ゼラチン、キチン、キトサン、フィブリン、コンドロイチンもしくはコンドロイチン硫酸またはヒアルロン酸などのムコ多糖類、生分解性の高分子であるポリグリコール酸、ポリ乳酸およびこれらの混合物、ならびに非生分解性の高分子のうちポリウレタン、 Matrix, collagen as biological materials, gelatin, chitin, chitosan, fibrin, mucopolysaccharides such as chondroitin or chondroitin sulfate or hyaluronic acid, polyglycolic acid is a biodegradable polymer, polylactic acid and mixtures thereof, and polyurethane of the non-biodegradable polymer,
ポリスチレン、ポリアクリレートなどの細胞接着性のよいもの、またはこれらの混合物からなるものが好ましい。 Polystyrene, having good cell adhesiveness, such as polyacrylates, or those consisting of mixtures thereof are preferred. より生体適合性に優れ、細胞がマトリックス内に留まりやすいように多孔質でスポンジ状の形態をもつアテロコラーゲン、コラーゲン、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸がより好ましい。 More excellent in biocompatibility, cell has a sponge-like form porous to facilitate remain in the matrix atelocollagen, collagen, gelatin, chondroitin sulfate, hyaluronic acid and more preferred. 細胞を播種する際に細胞がスポンジ内に浸透しやすいように、孔は細胞の播種面に対して垂直であることが望ましい。 As cells are likely to penetrate into the sponge at the time of seeding cells, it is desirable that the hole is perpendicular to the seeded surface of the cell. 孔径は、播種面に細胞が浸透しやすくかつ気泡が入りにくくするため、通常20μm〜1000μmの範囲が好ましい。 Pore ​​size, since the cell seeding surface is prevented from entering the easy and bubble penetration, usually in the range of 20μm~1000μm are preferred. ただし、本発明の目的を達成しうるかぎり必ずしもこれらの数値範囲に限定されるものではない。 However, it not necessarily limited to these numerical ranges as long as capable of achieving the object of the present invention.

【0015】前記マトリックスの形態は、本発明の目的を達成し得るものであればどのような形態でも使用できるが、好ましくは多孔質のシート、スポンジまたはゲルなどの形態で使用される。 [0015] form of the matrix, which can be used for the purpose any form as long as it can achieve the present invention are preferably used in the form of a porous sheet, sponge or gel.

【0016】前記ヒト線維芽細胞の前培養期間は、細胞が高い物質産生能を保持している期間であり、好ましくは4〜9日間、より好ましくは5〜9日間、さらに好ましくは6日〜8日である。 The preculture period of the human fibroblasts, a period in which cells retain high mass production ability, preferably between 4 to 9 days, more preferably between 5-9 days, more preferably from 6 days to it is 8 days. 前培養期間が4日より短い場合および9日より長い場合には、共に、創傷治癒に有効な物質の産生能が劣る傾向がある。 If longer shorter if and 9 days from preculture period 4 days, both tend to ability to produce substances effective wound healing is poor. 前培養初期では、充分な成熟細胞数が得らず、前述のように、たとえ充分な量の産生物質を産生していても、培養皮膚代替物用の細胞として用いた場合、生理活性の低い物質が産生されてしまう傾向がある。 The pre-culture early, sufficient mature cell number obtained regardless, as described above, even if not produce even sufficient amount of production materials, when used as a cell for the cultured skin substitutes, low bioactivity there is a tendency that the material will be produced.

【0017】なお、この前培養初期では、細胞の創傷治癒に有効な物質を測定すると高い結果が得られる場合がある。 [0017] In this pre-culture initial, there is a case where the measured substances effective in wound healing cells high results. これは、産生物質の測定では細胞膜およびその内側に貯留していた産生物質の前駆体物質が共に測定されてしまうが、この時期に測定した場合、その前培養の直前まで貯留していた前駆体物質の割合が高いためである。 This is precursor material produced substance in the measurement of the produced substance that has been stored in the cell membrane and inside thereof from being measured together, when measured at this time, the precursor which has been stored until immediately before the preculture the proportion of materials is for high. よって、創傷治癒に有効な産生物質の産生量が正確に特定することができない傾向がある。 Therefore, there is a tendency that production of effective production material wound healing can not be accurately specified.

【0018】前記創傷治癒に有効な産生物質の産生能の測定は、特異抗体を用いた酵素免疫測定法(以下、EL [0018] Measurement of the ability to produce effective produced substance in the wound healing, the enzyme immunoassay using a specific antibody (hereinafter, EL
ISA法という)による、比色定量により行なわれる。 According to that ISA method) is carried out by colorimetry.

【0019】本発明で用いられる培地としては、線維芽細胞を培養する際に、当業者が使用する慣用のものであればどのようなものでもよい。 [0019] The medium used in the present invention, in culturing fibroblasts, may be any as long as conventional used by those skilled in the art. 具体例としては、ダルべッコ改変イーグル培地(以下、DE培地という)があげられる。 As a specific example, Dar Beck co-modified Eagle's medium (hereinafter referred to as DE medium), and the like. また血清を含む培地としては、たとえばDE培地に10容量%のウシ血清(以下、FBSという)を加えたもの(以下、DE+10%FBSという)があげられる。 As a medium containing serum can also, for example, 10% by volume of bovine serum DE media (hereinafter, referred to as FBS) plus (hereinafter, referred to as DE + 10% FBS) and the like.

【0020】本発明における培養は、すべて血清を含む培地で行なうことができるが、前培養を血清を含む培地で行ない、そののち、培地を交換して血清を取り除き、 The culture in the present invention, all can be carried out in a medium containing serum, a pre-culture performed in a medium containing serum, and then to remove the serum medium was changed,
マトリックス上に播種し、無血清の培地で培養するのが好ましい。 They were seeded onto the matrix, preferably cultured in a serum-free medium.

【0021】以下、本発明を詳細に説明する。 [0021] In the following, the present invention will be described in detail.

【0022】ヒト線維芽細胞を、血清を含む培地を用いて前培養する。 [0022] The human fibroblasts, pre-cultured in a medium containing serum. 創傷治癒に有効な産生物質が最も多く産生される時期を選択して採取する。 Valid produced substance in wound healing is taken to select the time to be produced most produced. 採取した細胞をマトリックス1cm 2に対し1×10 4 〜5×10 5 cells/cm 2 The harvested cells to matrix 1cm 2 1 × 10 4 ~5 × 10 5 cells / cm 2
の密度で播種し、2〜20時間、好ましくは4時間から16時間、室温(20℃程度)〜37℃、好ましくは3 Were seeded at a density of 2 to 20 hours, preferably 4 hours to 16 hours, at room temperature (about 20 ° C.) to 37 ° C., preferably 3
7℃で静置する。 7 allowed to stand at ℃. そののち、マトリックス1cm 2に対し培地0.1〜1.0ml、好ましくは0.1〜0.25ml After that, the culture medium to the matrix 1 cm 2 0.1 to 1.0 ml, preferably 0.1~0.25ml
を加えて、室温〜37℃、好ましくは37℃で、1〜2 It was added at room temperature to 37 ° C., preferably at 37 ° C., 1 to 2
0日間、好ましくは1〜3日間、培養し目的とする培養皮膚代替物を得る。 0 days, preferably for 1-3 days, to obtain a cultured skin substitutes to be cultured purposes.

【0023】得られた培養皮膚代替物は、そのまま臨床に使用することができる。 [0023] The resulting cultured skin substitutes may be used as such in the clinic. 臨床に使用するまでに時間がある場合は、4℃または、凍結保存用の培地に交換して−20〜−196℃、好ましくは−20℃で保存する。 If there is time to use the clinical, 4 ° C. or, -20 to-196 ° C. to replace the medium for cryopreservation, preferably stored at -20 ° C..
−20℃以上では長期間(数ヵ月以上)保存すると生存率が低下する傾向がある。 In -20 ° C. or higher long-term (several months or more) and viability stored tends to decrease. このように低温で保存した場合は、室温に戻してから移植に使用する。 If this were stored at low temperatures as, for use in transplantation After returning to room temperature.

【0024】本発明に用いる凍結保存用の培地としては、具体的には、20容量%のFBSおよび、10容量%のグリセロールを含有するDE培地などがあげられるが、本発明の目的を達成し得る限りどのようなものでもよい。 [0024] As a medium for cryopreservation used in the present invention, specifically, of 20 volume% FBS and the like DE medium containing 10% by volume glycerol and the like, to achieve the object of the present invention it may be any kind as long as to obtain.

【0025】 [0025]

【実施例】以下実施例をもって本発明を詳細に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES has the following examples illustrate the present invention in detail, but the present invention is not limited to these examples.

【0026】実施例1〜22および比較例1〜15の前培養 実施例1〜13および比較例1〜8ではヒト線維芽細胞(HF21、PN6)を、実施例14〜24および比較例9〜17ではヒト線維芽細胞(HF8、PN21) [0026] The preculture Examples 1-13 and Comparative Examples 1-8 In human fibroblasts in Examples 1 to 22 and Comparative Examples 1~15 (HF21, PN6), Examples 14-24 and Comparative Example 9 In 17 human fibroblasts (HF8, PN21)
を、実施例25〜27ではヒト線維芽細胞(HF8 The Example 25-27 In human fibroblasts (HF8
(2)、PN6)を、0.25%トリプシンで処理したのち回収し、T80フラスコに播種し前培養を行なった。 (2), the PN6), recovered after treatment with 0.25% trypsin and subjected to precultured were inoculated into T80 flask. 播種密度は5×10 3 cells/cm 2 (4×10 5 cells Seeding density 5 × 10 3 cells / cm 2 (4 × 10 5 cells
/枚)とし、培地はDE+10%FBSを15ml/枚使用した。 / Sheet), and the medium was used 15ml / seeded DE + 10% FBS.

【0027】実施例1〜3および比較例1〜5 <VEGF産生量の測定>前記の前培養条件と同様な条件にて表1に示す期間培養した培養上清15mlをその都度回収して、細胞数を0.25%トリプシンで処理後剥離し測定した。 [0027] Examples 1-3 and Comparative Examples 1-5 culture supernatants 15ml that period cultures are shown in Table 1 at <Measurement of VEGF production amount> before the culture conditions similar conditions to recover each time, cell numbers were exfoliated after treatment measured with 0.25% trypsin. また、先の採取した培養上清(15ml) In addition, culture supernatants were earlier taken (15ml)
を3000r.pm、4℃で5分間遠心分離して不要物を除去したのち、ELISA法によりVEGFの濃度を測定した。 The 3000 rpm, after removing the by centrifugation for 5 min at 4 ° C. unnecessary matter to determine the concentration of VEGF by ELISA. なお、培養方法としては培養期間開始後、1、 Incidentally, after the start of culture period as the culture method, 1,
2、3、4、5、6、7、8日にその都度新しいDE+ 2, 3, 4, 5, 6, 7, each time a new DE in 8 days +
10%FBS培地に交換して行なった。 It was carried out and replaced with 10% FBS medium.

【0028】表1および図1に、培養期間、T80フラスコの培地15ml中の細胞数およびその培養期間終了前24時間に細胞が分泌した培地1mlあたりのVEGF産生量を示す。 [0028] Table 1 and FIG. 1, the culture period, indicating VEGF production per medium 1ml of the cells secreted the cell number and the culture period 24 hours before the end of the medium 15ml of T80 flasks. 図1において、細胞数は対数の折れ線グラフで、VEGF産生量は棒グラフで示す。 In Figure 1, cell number in the logarithmic line graph, VEGF production amount is indicated by a bar graph.

【0029】 [0029]

【表1】 [Table 1]

【0030】播種直後の24時間のVEGF産生量は2 [0030] VEGF production amount of 24 hours immediately after seeding 2
48pg/mlと非常に多く、しかも播種後8時間の産生量は215pg/mlであり、24時間中の産生量の約87% 48 pg / ml and a very large, yet production of 8 hours after seeding is 215pg / ml, about 87% of the production volume in 24 hours
が分泌されていた。 There had been secreted. そして、活発な対数増殖期にあると思われる培養2、3、4日後では約30〜90pg/mlと低下し、停滞期にある7日後以降に再び約400pg/ml The culture appears to be the active logarithmic growth phase 2, 3, than after 4 days decreased to about 30~90pg / ml, again about 400 pg / ml after 7 days after in plateau
以上と多くなった。 It became a lot more. すなわち、播種直後に非常に多量に産生し、対数増殖期はほとんど産生せず、コンフルエントとなって細胞の増殖速度が低下すると再び産生が徐々に始まった。 In other words, very large amount of produce immediately after seeding, the logarithmic growth phase hardly production, growth rate of the cells began gradually to again decreased production become confluent. 播種後7〜9日培養した状態で、細胞数が約5×10 6 cells/15ml、VEGF産生量が約400 While culture 7-9 days after seeding, cell number of about 5 × 10 6 cells / 15ml, the VEGF production amount about 400
〜600pg/mlであった。 Was ~600pg / ml.

【0031】実施例4〜9および比較例6〜7 <IL−6産生量の測定>前記培養条件で、前培養期間を表2に示す日数にしたほかは、実施例1〜3および比較例1〜5と同様にして細胞を培養し、細胞数およびI [0031] In the culture conditions <Measurement of IL-6 production level> Examples 4-9 and Comparative Examples 6-7, the preculture period addition to the number of days shown in Table 2, Examples 1-3 and Comparative Examples in the same manner as in 1-5 culturing cells, cell number and I
L−6産生量を測定した。 It was measured L-6 production amount.

【0032】表2および図2に、培養期間、T80フラスコの培地15ml中の細胞数およびその培養期間終了前24時間に細胞が分泌した培地1mlあたりのIL−6産生量を示す。 [0032] Table 2 and FIG. 2, the culture period, indicating a cell number and IL-6 production per medium 1ml of cells were secreted into the culture period 24 hours before the end of the medium 15ml of T80 flasks. 図2において、細胞数は対数の折れ線グラフで、IL−6産生量は棒グラフで示す。 2, cell number in the logarithmic line graph, IL-6 production amount are indicated by a bar graph.

【0033】 [0033]

【表2】 [Table 2]

【0034】播種直後の24時間のIL−6産生量は3 [0034] IL-6 production level of 24 hours immediately after sowing 3
467pg/mlと非常に多く、しかも播種8時間後の産生量は2371pg/mlであり、24時間中の産生量の約7 467pg / ml and a very large, yet produced amount after seeding 8 hours was 2371pg / ml, about the production of 24 hours 7
0%が産生された。 0% was produced. そして、活発な対数増殖期にあると思われる培養2,3日後では約400pg/mlと10分の1程度に低くなり、停滞期にある7日後以降に再び約2 The culture appears to be the active logarithmic growth phase 2, after 3 days is lowered about one to about 400 pg / ml and 10 minutes, about stagnation again after 7 days after in 2
000pg/mlと多くなった。 It became more and 000pg / ml. すなわち、播種直後に非常に多量に産生し、対数増殖期はほとんど産生せず、コンフルエントとなって細胞の増殖速度が低下すると再び産生が始まった。 In other words, very large amount of produce immediately after seeding, the logarithmic growth phase hardly production, growth rate of the cells began again the production and decreases confluent.

【0035】実施例10〜13および比較例8 <I型コラーゲン産生量の測定>前記の前培養条件にて表3に示す日数培養したのち、ヒトI型コラーゲン測定系は培地中にFBSが存在することにより交差反応を生じるため、培地を新しいFBSを含まないDE培地に交換し24時間培養した。 [0035] After the number of days culture is shown in Table 3 in Examples 10 to 13 and <Measurement of type I collagen production amount> Comparative Example 8 wherein the pre-culture conditions, there is a FBS in human type I collagen measurement system medium to produce a cross-reaction by, cultured medium was replaced with DE medium without new FBS 24 hours. ついで、培養上清を回収したのち、実施例1〜3および比較例1〜5と同様に、細胞数およびI型コラーゲン産生量を測定した。 Then, after the culture supernatant was recovered, in the same manner as Examples 1-3 and Comparative Examples 1-5 were measured cell number and type I collagen production amount.

【0036】表3および図3に、培養期間、T80フラスコの培地15ml中の細胞数およびその培養期間終了前24時間に細胞が分泌した培地1mlあたりのI型コラーゲン産生量を示す。 [0036] Table 3 and Figure 3, the culture period, indicating the type I collagen production per medium 1ml of the cells secreted the cell number and the culture period 24 hours before the end of the medium 15ml of T80 flasks. 図3において、細胞数は対数の折れ線グラフで、I型コラーゲン産生量は棒グラフで示す。 3, number of cells in the logarithmic line graph, I type collagen production amount are indicated by a bar graph.

【0037】 [0037]

【表3】 [Table 3]

【0038】I型コラーゲン産生量は細胞数あたりの産生量量が培養3日目から8日目で2倍程度に増加した。 [0038] Type I collagen production amount of production amount per cell number was increased to 2 times in 8 days from the third day culture.

【0039】実施例14〜16および比較例9〜12 <VEGFの測定>前記培養期間を表4に示す日数にしたほかは、実施例1〜3および比較例1〜5と同様にして細胞を培養し、細胞数およびVEGF産生量を測定した。 [0039] except that the number of days shown in Table 4 the culture period <Measurement of VEGF> Examples 14-16 and Comparative Examples 9-12, the cells in the same manner as in Examples 1-3 and Comparative Examples 1-5 cultured and cell numbers were determined and VEGF production amount.

【0040】表4に、培養期間、T80フラスコの培地15ml中の細胞数およびその培養期間終了前24時間に細胞が分泌した培地1mlあたりのVEGF産生量を示す。 [0040] Table 4, culture period, indicating VEGF production per medium 1ml of the cells secreted the cell number and the culture period 24 hours before the end of the medium 15ml of T80 flasks.

【0041】 [0041]

【表4】 [Table 4]

【0042】表4の結果から、VEGFの産生量はPN [0042] From the results of Table 4, the production amount of VEGF PN
21においても前記PN6における細胞のVEGF産生量と同様な傾向を示した。 Also in 21 showed a similar tendency as VEGF production amount of cells in the PN6.

【0043】実施例17〜20および比較例13〜15 <IL−6の測定>前記培養期間を表5に示す日数にしたほかは、実施例4〜9および比較例6〜7と同様にして細胞を培養し、細胞数およびIL−6産生量を測定した。 [0043] except that the number of days shown in Table 5. The culture period <Measurement of IL-6> Examples 17 to 20 and Comparative Examples 13 to 15, in the same manner as in Example 4-9 and Comparative Examples 6-7 cells were cultured and cell numbers were determined and IL-6 production level.

【0044】表5に、培養期間、T80フラスコの培地15ml中の細胞数およびその培養期間終了前24時間に細胞が分泌した培地1mlあたりのIL−6産生量を示す。 [0044] Table 5, the culture period, indicating a cell number and IL-6 production per medium 1ml of cells were secreted into the culture period 24 hours before the end of the medium 15ml of T80 flasks.

【0045】 [0045]

【表5】 [Table 5]

【0046】表5の結果から、IL−6の産生量はPN [0046] From the results of Table 5, the production amounts of IL-6 PN
21においても前記PN6における細胞のIL−6産生量と同様な傾向を示した。 Also showed similar trend as IL-6 production amount of cells in the PN6 at 21.

【0047】実施例21〜24および比較例16ならびに17 <I型コラーゲンの測定>表6に示す日数培養したのち、実施例10〜13および比較例8と同様に細胞数およびI型コラーゲン産生量を測定した。 [0047] Examples 21 to 24 and Comparative Examples 16 and 17 After days culture is shown in <I type measuring collagen> Table 6 likewise number of cells as in Example 10 to 13 and Comparative Examples 8 and type I collagen production amount It was measured.

【0048】表6に培養期間、T80フラスコの培地1 The culture period in Table 6, T80 medium of flask 1
5ml中の細胞数およびその培養期間終了前24時間に細胞が分泌した培地1mlあたりのI型コラーゲン産生量を示す。 Number of cells in 5ml and showing the type I collagen production per medium 1ml of cells were secreted into the culture period 24 hours before the end.

【0049】なお、本実施例および比較例群のI型コラーゲン産生量の測定に関しては、2倍希釈液についてのデータから濃度を決定した。 [0049] Regarding the measurement of the examples and comparative examples group of type I collagen production amount, concentration was determined from the data for the 2-fold dilutions. したがって、測定範囲が2 Therefore, the measurement range is 2
〜200ng/mlであることから検出限界が400ng/ml The detection limit because it is ~200ng / ml is 400 ng / ml
となった。 It became.

【0050】 [0050]

【表6】 [Table 6]

【0051】I型コラーゲン産生量は培養4日目から急激に増加し、培養8日目には検出限界(400ng/ml) [0051] Type I collagen production amount was abruptly increased from 4 days of culture, the detection limit on day 8 culture (400 ng / ml)
以上の産生量を示した。 It showed the production of more. 本実施例および比較例群においても、前記記載のPN6における細胞のI型コラーゲン産生量と同様な傾向を示した。 In this embodiment and the comparative example group showed a similar tendency as type I collagen production amount of cells in PN6 of the description.

【0052】前記実施例および比較例のほかに、PN1 [0052] In addition to the above examples and comparative examples, PN1
2、15、18の細胞においても実施した結果、VEG Result was also performed in cells of 2,15,18, VEG
F、IL−6およびI型コラーゲンの産生量は、培養期間に関連して前記実施例と同様な結果を示した(未記載)。 F, production of IL-6 and type I collagen showed results similar to Example in connection with the culture period (not described).

【0053】以上のことから、本発明は継代数の多い細胞を用いた場合においても安定した効果を有するのである。 [0053] From the foregoing, the present invention is to have a stable effect in the case of using the large cells of passage number.

【0054】実施例25 <培養皮膚代替物のVEGF産生量>2.5cm×2.5 [0054] <VEGF production amount of cultured skin substitutes> Example 25 2.5 cm × 2.5
cm(面積:約6.3cm 2 )にカットしたコラーゲンスポンジを、浮遊細胞用6穴プレートの各穴に1枚ずつ入れ電子線滅菌した。 cm: The collagen sponge was cut into (an area of about 6.3 cm 2), and electron beam sterilization placed one by one into each well of the floating cells for a 6-well plate.

【0055】つぎに、前記前培養条件で8日培養したヒト線維芽細胞(HF8(2)、PN6)を0.25%トリプシンで処理したのち、DE+10%FBS10mlで懸濁してトリプシンを不活性化した。 Next, 8 days cultured human fibroblasts by the previous culture conditions (HF8 (2), PN6) after treatment with 0.25% trypsin, inactivate the trypsin and suspended in DE + 10% FBS10ml did. この細胞懸濁液を300〜500r.pm、4℃で5分間遠心分離し、得られた細胞をDE+10%FBSで懸濁した。 The cell suspension 300~500R.Pm, centrifuged for 5 minutes at 4 ° C., the resulting cells were suspended in DE + 10% FBS. それら細胞懸濁液を50ml遠心管3本に分注し、さらに遠心分離したのち、得られた細胞をDE+10%FBSで1×10 They dispensed cell suspension 50ml centrifuge tubes three minutes, after further centrifugation, 1 resulting cells in DE + 10% FBS × 10
7 cells/mlとなるよう懸濁した。 It was suspended so as to be 7 cells / ml. この細胞懸濁液をスポンジ15枚に600μlずつ播種した。 The cell suspension was seeded by 600μl to 15 sheets sponge. 細胞が均等に接着するように、連続分注ピペットを用いてスポンジ1枚につき50μlずつ(50μl/穴)12回滴下した。 As cells adhere equally, it was dropped one sponge per each 50 [mu] l (50 [mu] l / well) 12 times with continuous dispensing pipette. スポンジ全体に細胞がしみ込むようにさらに培地を300 The more medium so that the cells penetrate the entire sponge 300
μl/穴ずつ加えた。 It was added in μl / hole.

【0056】細胞をスポンジに接着させるため、37 [0056] In order to cells to adhere to a sponge, 37
℃、5%CO 2インキュベーター内で一晩培養した。 ° C., and cultured overnight in 5% CO 2 incubator. そののち、スポンジが十分浸るように培地を2.1ml/穴ずつ加え、インキュベーター内で培養を続け、培養皮膚代替物を作製した。 After that, it added in 2.1 ml / well of medium as sponge soaked sufficiently, continued culture in an incubator, to prepare a cultured skin substitutes. 培養開始から図4に示す日数培養したのちに2mlずつ培地交換を行なった。 It was performed medium change every 2ml in After days culture is shown in Figure 4 from the start of cultivation. 培地交換の際、 During the medium exchange,
作製された培養皮膚代替物を3枚ずつ細胞数計測用サンプルとして取り出した。 Three pieces of fabricated cultured skin substitutes were removed as the cell number measurement sample. 細胞上清もVEGFの測定用として採取した。 Cell supernatants were also collected for the measurement of VEGF.

【0057】<細胞数測定>1000units/mlのコラゲナーゼ溶液6ml(サイズ2.5cm×2.5cmのスポンジに対して)に培養皮膚代替物1枚を入れ、37℃のウォーターバス内でゆっくり振とうした。 [0057] Put one cultured skin substitutes to <cytometric> 1000 units / ml of collagenase solution 6 ml (for the size 2.5 cm × 2.5 cm sponge), slowly shaking at 37 ° C. in a water bath did. 振とう時間は30 The shaking time shaking 30
分から2時間とした。 Was minutes to 2 hours.

【0058】コラーゲンが溶解していることを目視にて観察し、遠心分離(1500r.pm、4℃、5分間)した。 [0058] was visually observed that the collagen is dissolved, centrifuged (1500r.pm, 4 ℃, 5 minutes).

【0059】DE+10%FBSで懸濁し、血球計算盤を用いてトリパンブルー色素排除法により細胞数および生存率を測定した。 [0059] was suspended in DE + 10% FBS, cell number was determined and viability by trypan blue dye exclusion using a hemocytometer.

【0060】<VEGF産生量の測定>細胞計測時に採取した培養皮膚代替物の培養上清について、ELISA [0060] The culture supernatant of <VEGF production amount of measurement> cultured skin substitutes that were collected at the time of cell measurement, ELISA
法を用いてVEGFの濃度を測定した。 The law was to determine the concentration of VEGF using.

【0061】図4に、マトリックス上に播種してからの培養日数に対する細胞数の変化、および培地を交換してから培養日数までの間に分泌した培地1mlあたりのVE [0061] Figure 4, per medium 1ml secreted during changes in cell numbers for cultivation period from seeding on the matrix, and after replacing the medium to culture days VE
GF産生量を示した。 It showed GF production amount. 図4において、細胞数は対数の折れ線グラフで、VEGF産生量は棒グラフで示す。 4, the number of cells in the logarithmic line graph, VEGF production amount is indicated by a bar graph.

【0062】8日間前培養を行なったヒト線維芽細胞は、マトリックスに播種したのちも高度にVEGFの産生を続けていることが示された。 [0062] Human fibroblasts were performed 8 days pre-culture was shown to have continued to produce highly VEGF after seeded on the matrix.

【0063】実施例26 <培養皮膚代替物のIL−6産生量>測定するサイトカインをIL−6とし、培養開始から培地交換および測定用のサンプル採取までの日数を図5に示す日数にしたほかは実施例25と同様に行なった。 [0063] Example 26 <culture IL-6 production of skin substitutes> a cytokine to measure the IL-6, addition to the number of days before sampling for media exchange and measured from the initiation of culture in the number of days shown in FIG. 5 It was carried out in the same manner as example 25.

【0064】<細胞数測定>実施例25と同様にして細胞数を測定した。 [0064] The <cytometric> in the same manner as in Example 25 to measure the number of cells.

【0065】<IL−6産生量の測定>細胞計測時に採取した培養皮膚代替物の培養上清について、ELISA [0065] The culture supernatant of <IL-6 production amount of measurement> cultured skin substitutes that were collected at the time of cell measurement, ELISA
法を用いてIL−6産生量を測定した。 Law was measured IL-6 production amount used.

【0066】図5にマトリックス上に播種してからの培養日数に対する細胞数の変化および培地を交換してから、培養日数までの間に分泌した培地1mlあたりのIL [0066] After replacing the changes and media in cell number on cultured Days Since seeded on the matrix in Figure 5, per medium 1ml secreted until culture days IL
−6産生量を示した。 It showed -6 production amount. 図5において、細胞数は対数の折れ線グラフで、IL−6産生量は棒グラフで示す。 5, cell number in the logarithmic line graph, IL-6 production amount are indicated by a bar graph.

【0067】8日間前培養を行なったヒト線維芽細胞は、マトリックスに播種したのちも高度にIL−6の産生を続けていることが示された。 [0067] Human fibroblasts were performed 8 days pre-culture, was shown to be continued highly production of IL-6 after seeded on the matrix.

【0068】実施例27 <培養皮膚代替物のI型コラーゲン産生量>ヒトI型コラーゲン測定系は培地中にFBSが存在することにより交差反応を生じるため、培地として、すべてFBSを含まないDE培地を用い、培養開始から培地交換および測定用のサンプル採取までの日数を図6に示す日数にしたほかは、実施例25と同様にして細胞上清をI型コラーゲンの測定用として採取した。 [0068] to produce a cross-reaction by FBS is present in human type I collagen assay system in medium <I collagen production amount of cultured skin substitutes> Example 27, as a medium, DE medium without any FBS It was used, except that the number of days shown in FIG. 6 the number of days before sampling for media exchange and measured from the initiation of culture, cell supernatants in the same manner as in example 25 was taken as a measure of type I collagen.

【0069】<細胞数測定>培地としてすべてDE培地を用いたほかは実施例25と同様にして細胞数および生存率を測定した。 [0069] except that <cytometric> all as a medium with a DE medium was measured cell number and viability in the same manner as in Example 25.

【0070】<I型コラーゲン産生量の測定>細胞計測時に採取した培養皮膚代替物の培養上清について、I型コラーゲンの濃度を測定した。 [0070] The culture supernatant of <I collagen production amount of measurement> cultured skin substitutes taken during cell counting to determine the concentration of type I collagen.

【0071】図6にマトリックス上に播種してからの培養日数に対する細胞数の変化および培地を交換してから、培養日数までの間に分泌した培地1mlあたりのI型コラーゲン産生量を示した。 [0071] After replacing the changes and media in cell number on cultured Days Since seeded on the matrix in Fig. 6, showing the type I collagen production per medium 1ml secreted until culture days. 図6において、細胞数は対数の折れ線グラフで、IL−6産生量は棒グラフで示す。 6, the number of cells in the logarithmic line graph, IL-6 production amount are indicated by a bar graph.

【0072】VEGFおよびIL−6と比較してI型コラーゲン産生量は、血清を含まない培地を用いているためマトリックスに播種したのち徐々に低下した。 [0072] Compared to VEGF and IL-6 I collagen production amount it was gradually decreased after seeded on the matrix due to the use of medium without serum. しかし、ヒト線維芽細胞は、マトリックス播種4〜8日のあいだ4日間でも約150ng/mlのI型コラーゲン産生を行なっていることが示された。 However, human fibroblasts has been shown to be doing the type I collagen production to about 150 ng / ml even 4 days between the matrix seeded 4-8 days.

【0073】実施例28 <培養真皮シートの作製および培養上清の採取>ローラーボトルで1週間前培養したヒト線維芽細胞(HF5、 [0073] Example 28 <culture collection of the making and the culture supernatant of the dermis sheet> human fibroblasts (HF5 cultured one week ago in roller bottles,
PN6)を0.25%トリプシンで処理した。 PN6) was treated with 0.25% trypsin. ついで回収した細胞懸濁液をDE+10%FBS10mlで懸濁してトリプシンを不活化し、遠心分離して細胞のみを得た。 Then the collected cell suspension was suspended in DE + 10% FBS10ml inactivate trypsin and centrifuged to obtain only the cells. さらに、FBSを除去するため、DE培地30mlで懸濁して遠心分離した。 In addition, to remove FBS, centrifuged and suspended in DE medium 30 ml. 再度、DE培地で懸濁して7. Again, it was suspended in DE medium 7.
34×10 6 cells/mlになるように調製した。 It was adjusted to 34 × 10 6 cells / ml.

【0074】メッシュなしのコラーゲンスポンジ(9cm [0074] without mesh collagen sponge (9cm
×9cm)2枚(以下、それぞれCD1、CD2という) × 9cm) 2 sheets (hereinafter, referred to respectively CD1, CD2)
に細胞懸濁液15mlをそれぞれ播種した(1×10 5 cel The cell suspension 15ml were seeded respectively in (1 × 10 5 cel
ls/cm 2 )。 ls / cm 2). 播種4時間後に、DE培地をさらに各15m Seeding 4 hours later, and each of DE medium 15m
lずつ加えた。 l was added in portions.

【0075】3日間培養後、各培養上清を採取し、コラゲナーゼによりスポンジCD1およびCD2を消化してそれぞれの細胞数を測定した。 [0075] After 3 days of culture, each culture supernatant was taken to measure the number of each cell was digested sponge CD1 and CD2 by collagenase. 採取した培養上清は遠心分離(3000r.pm、4℃、10分間)により不要物を除去し、−30℃で凍結保存した。 Harvested culture supernatant centrifuged (3000 rpm, 4 ° C., 10 minutes) to remove the unwanted material by and stored frozen at -30 ° C.. CD1またはCD CD1 or CD
2より得られた培養上清を以下、それぞれCDS1、C The culture supernatant obtained from 2 or less, respectively CDS 1, C
DS2という。 That DS2. CD1中の細胞数は3.92×10 6 cel The number of cells in CD1 is 3.92 × 10 6 cel
lsで、CD2中の細胞数は4.61×10 6 cellsであった。 In ls, number of cells in CD2 was 4.61 × 10 6 cells.

【0076】<血管内皮細胞増殖試験>血管内皮細胞[ヒト皮膚微小血管細胞(HMVEC)]を播種密度が1×10 [0076] <vascular endothelial cell growth test> vascular endothelial cells [human dermal microvascular cells (HMVEC)] seeding density of 1 × 10 4 cells/cm 2となるように24穴プレートに播種した。 Such that 4 cells / cm 2 were seeded in 24-well plates. 培地にはEC培地を用い培地量は500μl/ Medium weight using EC medium to the medium 500 [mu] l /
穴とした。 It was a hole.

【0077】前記血管内皮細胞が接着したことを確認後、CDS1またはCDS2、DE培地およびEC用培地+10%FBSを、各割合で加え、最終的に表7に示す混合比となるように調製した。 [0077] After confirming that the endothelial cells had adhered, the CDS1 or CDS2, DE medium and EC medium + 10% FBS, added with each fraction was finally prepared so that the mixing ratio shown in Table 7 .

【0078】 [0078]

【表7】 [Table 7]

【0079】血管内皮細胞数の測定は、培養5日後にM [0079] measurement of the number of vascular endothelial cells, M to 5 days after culture
TT(3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル) TT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl)
−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)アッセイを行なった。 Diphenyltetrazolium bromide) Assays were carried out. 5mg/mlMTT溶液を100μl/穴加えて4時間培養したのち、上清を除去し、DMSO2 5mg / mlMTT solution After 4 hours of culture in addition 100 [mu] l / well and the supernatant was removed, DMSO 2
50μl/穴でホルマザンを抽出して行なった。 It was carried out to extract the formazan at 50μl / hole. プレートリーダー(日本インターメッド(株)社製)を用いて抽出液の540nmにおける吸光度を測定した。 Plate reader (manufactured by Nippon Intermed Co.) and the absorbance was measured at 540nm of the extract used.

【0080】図7および表8に、血管内皮細胞培養時の培地への培養上清CDS1またはCDS2の添加率と、 [0080] Figure 7 and Table 8, the addition rate of the culture supernatant of the medium at the vascular endothelial cell culture CDS1 or CDS2,
各培地で培養5日後の血管内皮細胞数を示す。 Each medium indicates the number of vascular endothelial cells after 5 days of culture. CDS1 CDS1
およびCDS2ともに、添加率が高いほど血管内皮細胞数の増加がみられた。 And CDS2 together, increase of vascular endothelial cell number was observed the higher the addition rate. これはサイトカインの量が血管内皮細胞の増殖に寄与していることを示している。 This indicates that the amount of cytokines contributes to the proliferation of vascular endothelial cells.

【0081】 [0081]

【表8】 [Table 8]

【0082】 [0082]

【発明の効果】創傷治癒に有効な物質を多量に分泌しているヒト線維芽細胞を用いることで、創傷治癒効果の高い培養皮膚代替物を製造することができる。 Substances effective wound healing according to the present invention by using human fibroblasts was largely secrete, it is possible to manufacture a highly wound healing cultured skin substitutes. また前培養時に産生する、創傷治癒に有効な産生物質の産生量を特定することで、最もよいタイミングでマトリックスに組み込むことができる。 The produce before the culture, by specifying the production of effective produced substance in wound healing can be incorporated into the matrix at the best timing. さらに創傷治療に使用する前に、 Further prior to use in wound treatment,
無血清の培地で培養することが可能であるため、様々な有害物質などが混入する危険性の低い安全な培養皮膚代替物を製造することができる。 Since it is possible to culture in serum-free media, it is possible to produce a variety of toxic substances such as low risk of contamination safe cultured skin substitutes.

【図面の簡単な説明】 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

【図1】培地を交換してから、培養日数までのあいだの24時間に分泌した、培養上清1ml中のVEGF産生量を棒グラフで示し、培地15mlを含むT80フラスコ中の細胞数を対数の折れ線グラフで示した図である。 [Figure 1] after replacing the media, was secreted into the 24 hours of between up to the number of days in culture, in the culture supernatant 1ml VEGF production amount shown in the bar graph, the number of cells in T80 flasks containing medium 15ml of logarithmic It illustrates a line graph.

【図2】培地を交換してから、培養日数までのあいだの24時間に分泌した、培養上清1ml中のIL−6産生量を棒グラフで示し、培地15mlを含むT80フラスコ中の細胞数を対数の折れ線グラフで示した図である。 [2] after replacing the medium, secreted 24 hours during the up cultivation period, shows the IL-6 production in the culture supernatant 1ml a bar graph, the number of cells in T80 flasks containing medium 15ml it is a diagram showing a logarithmic line graph.

【図3】培地を交換してから、培養日数までのあいだの24時間に分泌した、培養上清1ml中のI型コラーゲン産生量を棒グラフで示し、培地15mlを含むT80フラスコ中の細胞数を対数の折れ線グラフで示した図である。 [Figure 3] after replacing the medium, secreted 24 hours during the up cultivation period, shows the production of type I collagen in the culture supernatant 1ml a bar graph, the number of cells in T80 flasks containing medium 15ml it is a diagram showing a logarithmic line graph.

【図4】前培養を8日行なったヒト線維芽細胞をマトリックスへ播種したのちの培養日数に対する、細胞数の変化を対数の折れ線グラフで、培養上清1ml中のVEGF For Figure 4 preculture days after seeded with 08 performing human fibroblast cultures to the matrix, a change in cell number in a logarithmic line graph, VEGF in the culture supernatant 1ml
産生量の変化を棒グラフで示した図である。 Is a diagram showing changes in production amount as a bar graph.

【図5】前培養を8日行なったヒト線維芽細胞をマトリックスへ播種したのちの培養日数に対する、細胞数の変化を対数の折れ線グラフで、培養上清1ml中のIL−6 [5] for the previous cultivation period After seeding 08 made human fibroblast cultures to the matrix, a change in cell number in a logarithmic line graph, in the culture supernatant 1 ml IL-6
産生量の変化を棒グラフで示した図である。 Is a diagram showing changes in production amount as a bar graph.

【図6】前培養を8日行なったヒト線維芽細胞をマトリックスへ播種したのちの培養日数に対する、細胞数の変化を対数の折れ線グラフで、培養上清1ml中のI型コラーゲン産生量の変化を棒グラフで示した図である。 For cultivation period after 6 to 8 days before performing human fibroblasts cultures were seeded into the matrix, the change in cell number in a logarithmic line graph of the change in production of type I collagen in the culture supernatant 1ml it is a diagram showing a bar graph.

【図7】図7は、創傷治療に有効な産生物質を、創傷治癒に有効な量産生しているヒト線維芽細胞をマトリックスに播種し培養した培養皮膚代替物の培養上清(CDS Figure 7 is a valid produced substance in wound treatment, the culture supernatant of the human fibroblasts are effective scale production in wound healing were seeded into a matrix cultured skin substitutes cultured (CDS
1(―●―)またはCDS2(―○―))の添加量に対する、内皮細胞の増殖を示す図である。 1 (- ● -) or CDS2 (- ○ -) for the added amount of), showing the proliferation of endothelial cells.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 森山 剛 愛知県春日井市高森台五丁目1番地10 株 式会社メニコン総合研究所内 (72)発明者 稲井 靖子 愛知県春日井市高森台五丁目1番地10 株 式会社メニコン総合研究所内 Fターム(参考) 4C081 AB19 BA12 CD071 CD081 CD121 CD131 CD151 CD34 CE02 DA02 EA02 ────────────────────────────────────────────────── ─── of the front page continued (72) inventor Tsuyoshi Moriyama Kasugai City, Aichi Prefecture Takamoridai chome address 1 10 share, Ltd. Menicon within the Research Institute (72) inventor Yasuko Inai Kasugai City, Aichi Prefecture Takamoridai chome address 1 10 Co., Ltd. Menicon Research Institute in the F-term (reference) 4C081 AB19 BA12 CD071 CD081 CD121 CD131 CD151 CD34 CE02 DA02 EA02

Claims (12)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 創傷治療に有効な産生物質を、創傷治癒に有効な量産生しているヒト線維芽細胞を、マトリックスに含有させることを特徴とする培養皮膚代替物の製造方法。 1. A valid produced substance in wound care, human fibroblasts are effective scale production in wound healing, method for producing a cultured skin substitute characterized in that it is contained in the matrix.
  2. 【請求項2】 前記ヒト線維芽細胞をマトリックスに含有させる前に、前記創傷治癒に有効な産生物質の産生量を特定することを特徴とする請求項1記載の製造方法。 Wherein said human fibroblast cells prior to inclusion in the matrix, The method according to claim 1, wherein the identifying the production of effective produced substance to the wound healing.
  3. 【請求項3】 前記ヒト線維芽細胞を、播種密度2×1 Wherein the human fibroblast, seeding density 2 × 1
    3 〜5×10 3 cells/cm 2において4日以上9日以下の期間前培養後、マトリックスに含有させる前に、創傷治癒に有効な産生物質の産生量を特定することを特徴とする請求項1記載の製造方法。 0 3 ~5 × 10 3 cells / cm 2 in 4 days or more after 9 days following period preculture, prior to be contained in the matrix, claims and specifying the production of effective production material wound healing method of manufacturing in claim 1, wherein.
  4. 【請求項4】 前記創傷治癒に有効な産生物質が、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、インターロイキン−6 4. Effective produced substance in the wound healing, vascular endothelial growth factor (VEGF), interleukin-6
    (IL-6)およびI型コラーゲンである請求項1記載の製造方法。 (IL-6) and a manufacturing method of claim 1 wherein the type I collagen.
  5. 【請求項5】 前記創傷治癒に有効な産生物質が血管内皮細胞増殖因子(VEGF)であり、前培養期間における細胞密度6×10 4 〜4×10 5 cells/mlの細胞培養液において、前記産生量が0.1〜1ng/ml/日である請求項2記載の製造方法。 5. Effective produced substance in the wound healing is vascular endothelial growth factor (VEGF), in cell culture cell density 6 × 10 4 ~4 × 10 5 cells / ml in pre-culture period, the the method of claim 2, wherein the production amount is 0.1~1ng / ml / day.
  6. 【請求項6】 前記創傷治癒に有効な産生物質がインターロイキン−6(IL-6)であり、前培養期間における細胞密度6×10 4 〜4×10 5 cells/mlの細胞培養液において、前記産生量が0.1〜10ng/ml/日である請求項2記載の製造方法。 6. Effective produced substance in the wound healing is an interleukin -6 (IL-6), in cell culture cell density 6 × 10 4 ~4 × 10 5 cells / ml in pre-culture period, the method of claim 2, wherein the production amount is 0.1~10ng / ml / day.
  7. 【請求項7】 前記創傷治癒に有効な産生物質がI型コラーゲンであり、前培養期間における細胞密度6×10 7. Effective produced substance in the wound healing is a type I collagen, cell density 6 × 10 before incubation period
    4 〜4×10 5 cells/mlの細胞培養液において、前記産生量が100〜1000ng/ml/日である請求項2記載の製造方法。 4 in cell cultures of ~4 × 10 5 cells / ml, the production method according to claim 2, wherein the production amount is 100~1000ng / ml / day.
  8. 【請求項8】 前記マトリックスがアテロコラーゲン、 Wherein said matrix is ​​atelocollagen,
    コラーゲン、ゼラチン、コンドロイチン硫酸またはヒアルロン酸である請求項1記載の製造方法。 Collagen, gelatin, a manufacturing method of claim 1 wherein the chondroitin sulfate or hyaluronic acid.
  9. 【請求項9】 (1)血清を含む培地でヒト線維芽細胞を前培養し、(2)(1)で培養された、創傷治療に有効な産生物質を創傷治癒に有効な量産生しているヒト線維芽細胞をマトリックス上に播種し、(3)(2)のマトリックス上のヒト線維芽細胞を無血清または血清を含む培地で培養する工程からなる請求項1記載の製造方法。 9. (1) pre-culturing human fibroblasts in a medium containing serum, (2) (1) was cultured in an effective production materials for wound treatment and effective scale production in wound healing human fibroblasts are seeded on the matrix, (3) (2) according to claim 1 process according consisting step of human fibroblasts on the matrix is ​​cultured in a medium containing serum or serum.
  10. 【請求項10】 前記培養皮膚代替物が培養真皮代替物である請求項1記載の製造方法。 10. The method of claim 1, wherein the cultured skin substitute is cultured dermal substitute.
  11. 【請求項11】 請求項1記載の製造方法によって得られる培養皮膚代替物。 11. The method of claim 1 cultured skin substitutes obtained by the production method described.
  12. 【請求項12】 前記皮膚が真皮である請求項11記載の培養皮膚代替物。 12. The method of claim 11 cultured skin substitute according the skin is dermal.
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