JP2002179683A - Reactional reagent for nucleic acid-related substance comprising polyamino acid derivative - Google Patents
Reactional reagent for nucleic acid-related substance comprising polyamino acid derivativeInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な試薬に関
し、特に、核酸関連物質と反応するポリアミノ酸誘導体
から成る核酸関連物質反応試薬に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a novel reagent, and more particularly to a reagent for reacting a nucleic acid-related substance comprising a polyamino acid derivative which reacts with a nucleic acid-related substance.
【０００２】[0002]
【従来の技術とその課題】ポリアミノ酸（ポリペプチ
ド）およびその誘導体は、タンパク質のモデル物質とし
てタンパク質の構造や特性の研究に用いられるととも
に、新しい機能性高分子としての応用の可能性も探究さ
れている。例えば、ポリアミノ酸に酵素を結合させた酵
素樹脂（固定化酵素）、あるいは抗菌性や薬剤誘導能を
もつ高分子医薬としてのポリアミノ酸誘導体の利用可能
性などについて研究、開発が進められている。2. Description of the Related Art Polyamino acids (polypeptides) and their derivatives are used as a model substance of proteins for studying the structure and properties of proteins, and the possibility of application as new functional polymers is also being explored. ing. For example, research and development are being conducted on the possibility of using an enzyme resin in which an enzyme is bound to a polyamino acid (immobilized enzyme) or a polyamino acid derivative as a high-molecular-weight drug having antibacterial properties and drug-inducing ability.
【０００３】本発明は、今までに試みられなかったポリ
アミノ酸の新しい用途に向けられたものであり、ヌクレ
オシド等の核酸関連物質と反応（相互作用）してそれら
と結合し、この性質に基づき核酸や核酸関連物質の挙動
や構造解析などに用いられ得るような試薬を提供するこ
とにある。[0003] The present invention is directed to a new use of a polyamino acid, which has not been attempted so far, and reacts (interacts) with nucleic acid-related substances such as nucleosides and binds to them. An object of the present invention is to provide a reagent which can be used for analyzing the behavior and structure of nucleic acids and nucleic acid-related substances.
【０００４】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明に従えば、上述の
ごとき目的を達成するものとして、ポリペプチド結合を
形成するアミノ基とカルボキシル基以外に側鎖に、水酸
基、カルボキシル基またはアミノ基から成る反応性官能
基を有するアミノ酸を構成単位とし、前記アミノ酸側鎖
の反応性官能基を介して、下記の式（Ｉ）で表わされる
フェニルボロン酸基が結合されているポリアミノ酸誘導
体から成る核酸関連物質反応試薬が提供される。According to the present invention, in order to achieve the above-mentioned object, a hydroxyl group, a carboxyl group or an amino group is added to a side chain in addition to an amino group and a carboxyl group forming a polypeptide bond. A nucleic acid comprising a polyamino acid derivative having, as a structural unit, an amino acid having a reactive functional group having a phenylboronic acid group represented by the following formula (I) via the reactive functional group of the amino acid side chain: Related substance reactive reagents are provided.
【０００５】[0005]
【化６】 Embedded image
【０００６】本発明の核酸関連物質反応試薬の特に好ま
しい１態様においては、ポリアミノ酸が下記の式（II）
で表わされるフェニルボロン酸を有するリジンを構成単
位として含む。In one particularly preferred embodiment of the nucleic acid-related substance reaction reagent of the present invention, the polyamino acid has the following formula (II):
Lysine having a phenylboronic acid represented by the following formula:
【０００７】[0007]
【化７】 Embedded image
【０００８】[0008]
【発明の実施の形態】ボロン酸基Ｂ（ＯＨ）２が水性液
（水溶液）中で水酸基（ＯＨ）と共有結合的に反応し結
合することは知られている。本発明の試薬は、ポリアミ
ノ酸の基本骨格にボロン酸基を有する側鎖が導入された
ポリアミノ酸から成り、このボロン酸基が各種の核酸関
連物質の糖部位の水酸基と反応することによって該核酸
関連物質を結合させることができる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION It is known that a boronic acid group B (OH) 2 reacts and bonds covalently with a hydroxyl group (OH) in an aqueous liquid (aqueous solution). The reagent of the present invention comprises a polyamino acid in which a side chain having a boronic acid group has been introduced into the basic skeleton of the polyamino acid, and the boronic acid group reacts with a hydroxyl group of a sugar moiety of various nucleic acid-related substances to react with the nucleic acid. Related substances can be bound.
【０００９】ここで、本発明において用いられる「核酸
関連物質」とは、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびこ
れらに類似の化学構造を有し核酸塩基（プリン塩基また
はピリミジン塩基）にジオールを有する糖が結合した構
造の化合物を指称する。すなわち、本発明の試薬が対象
とする核酸関連物質としては、アデノシン、グアノシ
ン、イノシン、キサントシンなどのプリンヌクレオシ
ド；シチジン、ウリジン、リボチミジンなどのピリミジ
ンヌクレオシド；ならびにこれらのヌクレオシドのリン
酸エステルである各種のヌクレオチドが挙げられる。さ
らに、これらの天然（生体）に存在するヌクレオシドま
たはヌクレオチドに類似の化学構造を有し核酸塩基とジ
オールを有する糖とが結合した構造の合成化合物も、ポ
リアミノ酸誘導体から本発明の試薬が対象とする核酸関
連物質として含まれる。後述するようにポリアミノ酸誘
導体から成る本発明の試薬の好ましい使用態様として核
酸様ポリマー（擬似ＤＮＡまたは擬似ＲＮＡ）として機
能させる場合には、核酸関連物質として一般にヌクレオ
シドを用いることが好ましい。As used herein, the term "nucleic acid-related substance" refers to a nucleoside, a nucleotide or a structure in which a sugar having a diol is bonded to a nucleic acid base (purine base or pyrimidine base) having a chemical structure similar thereto. Are referred to. That is, the nucleic acid-related substances targeted by the reagent of the present invention include purine nucleosides such as adenosine, guanosine, inosine and xanthosine; pyrimidine nucleosides such as cytidine, uridine and ribothymidine; and various phosphates of these nucleosides. Nucleotides. Furthermore, synthetic compounds having a chemical structure similar to those of nucleosides or nucleotides existing in nature (living organisms) and having a structure in which a nucleobase and a sugar having a diol are bonded are also applicable to the reagents of the present invention from polyamino acid derivatives. Included as nucleic acid-related substances. As described below, when the reagent of the present invention comprising a polyamino acid derivative is used as a nucleic acid-like polymer (pseudo-DNA or pseudo-RNA), it is generally preferable to use a nucleoside as a nucleic acid-related substance.
【００１０】本発明の試薬のポリアミノ酸（ポリペプチ
ド）誘導体を構成するアミノ酸は、側鎖に反応性官能基
を有するものであれば特に制限はない。すなわち、主鎖
となるポリペプチド結合を形成するためのアミノ基とカ
ルボキシル基以外に、側鎖にアミノ基、水酸基またはカ
ルボキシル基を有するアミノ酸から構成されるものであ
れば、いずれも本発明試薬を構成するポリアミノ酸に包
含される。具体的には、側鎖にアミノ基を有するポリリ
ジン、ポリアスパラギン、ポリグルタミンおよびポリア
ルギニン、水酸基を有するポリセリン、ポリトレオニン
およびポリチロシン、ならびに、カルボキシル基を有す
るポリアスパラギン酸およびポリグルタミン酸などが挙
げられる。そして、本発明試薬のポリアミノ酸誘導体
は、それらのアミノ酸側鎖の反応性官能基を介して、上
述の式（Ｉ）で表わされるフェニルボロン酸基が結合さ
れている構造から成る。ここで、式（Ｉ）のＲは、アミ
ノ酸側鎖の反応性官能基である水酸基、カルボキシル基
またはアミノ基に応じて、それぞれ、上述の（Ａ）、
（Ｂ）または（Ｃ）で示されるような原子団から成る。
なお、（Ｉ）で表わされるフェニルボロン酸基を構成す
るベンゼン環には、ボロン酸基の他、水酸基（ＯＨ）、
アミノ基（ＮＨ２）、ニトロ基（ＮＯ２）、アルキル
基、ハロゲン原子、−ＲＮＨ２（Ｒ：アルキル）などが
置換されていてもよい。The amino acid constituting the polyamino acid (polypeptide) derivative of the reagent of the present invention is not particularly limited as long as it has a reactive functional group on a side chain. That is, in addition to an amino group and a carboxyl group for forming a polypeptide bond serving as a main chain, any of the reagents of the present invention can be used as long as it is composed of an amino acid having an amino group, a hydroxyl group or a carboxyl group in a side chain. It is included in the constituent polyamino acids. Specifically, polylysine having an amino group in the side chain, polyasparagine, polyglutamine and polyarginine, polyserine having a hydroxyl group, polythreonine and polytyrosine, and polyaspartic acid and polyglutamic acid having a carboxyl group, etc. . The polyamino acid derivative of the reagent of the present invention has a structure in which the phenylboronic acid group represented by the above formula (I) is bonded via a reactive functional group of the amino acid side chain. Here, R in the formula (I) represents the above-mentioned (A) or (A) depending on a hydroxyl group, a carboxyl group, or an amino group, which is a reactive functional group of an amino acid side chain.
It consists of atomic groups as shown in (B) or (C).
The benzene ring constituting the phenylboronic acid group represented by (I) has, in addition to the boronic acid group, a hydroxyl group (OH),
Amino group (NH 2), nitro group (NO 2), alkyl group, halogen atom, -RNH 2 (R: alkyl), etc. may be substituted.
【００１１】本発明の核酸関連物質反応試薬を構成する
ポリアミノ酸誘導体の分子量は、特に制限されるもので
はなく任意に選択することができるが、分子量が小さい
と、導入される（結合される）ヌクレオシド等の核酸関
連物質の量が少なくそれらを分析する手段として不充分
であり、また、後述するような擬似核酸として使用する
場合の他のＤＮＡやＲＮＡとの相互作用が弱くなり、一
方、分子量が大きいと合成が困難となるので、一般に、
重量平均分子量（Ｍｗ）として１，０００〜３００，０
００の間のものを選択することが好ましい。The molecular weight of the polyamino acid derivative constituting the reagent for reacting a nucleic acid-related substance of the present invention is not particularly limited and can be arbitrarily selected, but if the molecular weight is small, it is introduced (bound). The amount of nucleic acid-related substances such as nucleosides is small and inadequate as a means for analyzing them, and when used as a pseudonucleic acid as described below, the interaction with other DNA or RNA is weakened, while the molecular weight Is large, the synthesis becomes difficult.
1,000 to 300,0 as weight average molecular weight (Mw)
It is preferable to select one between 00.
【００１２】本発明試薬を構成するポリアミノ酸誘導体
は、基本骨格となるポリアミノ酸に、フェニルボロン酸
化合物を反応させることにより、簡単に合成することが
できる。反応は室温下において実施される。原料となる
ポリアミノ酸は、市販のものを使用すればよいが、新た
に調製する場合には、一般に、Ｎ−カルボキシアミノ酸
無水物の脱炭酸重縮合による。The polyamino acid derivative constituting the reagent of the present invention can be easily synthesized by reacting a polyamino acid serving as a basic skeleton with a phenylboronic acid compound. The reaction is performed at room temperature. A commercially available polyamino acid may be used as a raw material, but when it is newly prepared, it is generally obtained by decarboxylation polycondensation of an N-carboxyamino acid anhydride.
【００１３】このようにして得られ本発明の試薬を構成
するポリアミノ酸誘導体（ポリペプチド誘導体）は、水
溶液（水性液）中で、その側鎖に存在するボロン酸基が
核酸関連物質の糖部位の水酸基と反応して該核酸関連物
質と結合する。そして、このポリアミノ酸誘導体は、ポ
リペプチドによく見られるように、ｐＨ、温度、溶液の
組成などの環境条件によりコンフォメーション（立体構
造）が変化する。The polyamino acid derivative (polypeptide derivative) thus obtained, which constitutes the reagent of the present invention, has a boronic acid group present in its side chain in an aqueous solution (aqueous liquid), and the boronic acid group of the nucleic acid-related substance has a sugar moiety. Reacts with a hydroxyl group of the nucleic acid to bind to the nucleic acid-related substance. The conformation (steric structure) of the polyamino acid derivative changes depending on environmental conditions such as pH, temperature, and composition of the solution, as is often found in polypeptides.
【００１４】例えば、前述の式（II）で表わされるボロ
ン酸基を有するポリリジンから成るポリアミノ酸誘導体
は、中性から弱塩基性のｐＨ下でα−ヘリックス構造を
呈し、これよりも低ｐＨでβ−シート構造、高ｐＨでラ
ンダムコイル構造を呈することが見出されている。そし
て、このようなポリアミノ酸誘導体のコンフォメーショ
ン変化に応じて、これに結合されるヌクレオシド等の核
酸関連物質の量や形態も変化する。For example, a polyamino acid derivative composed of a polylysine having a boronic acid group represented by the above formula (II) exhibits an α-helical structure under a neutral to weakly basic pH, and at a lower pH, It has been found that the β-sheet structure exhibits a random coil structure at high pH. Then, according to the conformational change of such a polyamino acid derivative, the amount and form of a nucleic acid-related substance such as a nucleoside bound thereto also change.
【００１５】かくして、ボロン酸基を側鎖に有するポリ
アミノ酸誘導体から成る本発明の試薬は、ヌクレオシド
などの核酸関連物質を分析したりその挙動を調べる研究
試薬として用いることができる。ここで、本発明の試薬
の特筆すべき用途は、天然の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）に
類似する核酸様ポリマーとして機能させることができる
ことである。すなわち、ヘリックス構造を呈するような
条件下で、本発明の試薬を構成するポリアミノ酸誘導体
に各種の核酸関連物質を反応させることにより、ヘリッ
クス構造のポリアミノ酸誘導体に核酸塩基を有する核酸
関連物質が結合してスタッキングされた、ＤＮＡまたは
ＲＮＡに類似のポリマー（擬似ＤＮＡまたは擬似ＲＮ
Ａ）が形成される（図１参照）。Thus, the reagent of the present invention comprising a polyamino acid derivative having a boronic acid group in the side chain can be used as a research reagent for analyzing a nucleic acid-related substance such as a nucleoside or examining its behavior. Here, a remarkable use of the reagent of the present invention is that it can function as a nucleic acid-like polymer similar to natural nucleic acids (DNA, RNA). That is, by reacting various nucleic acid-related substances with the polyamino acid derivative constituting the reagent of the present invention under conditions that exhibit a helical structure, the nucleic acid-related substance having a nucleobase binds to the helical polyamino acid derivative. Polymers similar to DNA or RNA (pseudo-DNA or pseudo-RN)
A) is formed (see FIG. 1).
【００１６】このような擬似ＤＮＡまたは擬似ＲＮＡ
は、その核酸関連物質の種類を変えることにより、様々
なＤＮＡやＲＮＡと相互作用することができるので、そ
の相互作用を調べてＤＮＡやＲＮＡの性質や構造等を解
析することにより遺伝子の研究ツールとして資すること
ができる。さらに、本発明の試薬から形成される擬似Ｄ
ＮＡまたは擬似ＲＮＡは、ｐＨなどの環境条件の変化に
応じて核酸関連物質が脱着し、その結果、ＤＮＡやＲＮ
Ａとの相互作用も変化するので、例えば、適当な薬効成
分等を結合させることによりＤＤＳ（ドラックデリバリ
ーシステム）として応用展開することも期待される。し
かも、このような擬似ＤＮＡまたは擬似ＲＮＡは、ポリ
アミノ酸誘導体と核酸関連物質を適当な条件下で混合す
ることにより簡単に形成する。Such pseudo DNA or pseudo RNA
Can interact with various DNAs and RNAs by changing the type of the nucleic acid-related substance. Therefore, by examining the interaction and analyzing the properties and structure of DNAs and RNAs, a tool for gene research Can serve as. Further, pseudo-D formed from the reagent of the present invention
NA or pseudo RNA desorbs nucleic acid-related substances in response to changes in environmental conditions such as pH, resulting in DNA or RN.
Since the interaction with A also changes, it is expected to be applied and developed as a DDS (drug delivery system) by, for example, binding an appropriate pharmaceutically active ingredient. Moreover, such pseudo DNA or pseudo RNA can be easily formed by mixing a polyamino acid derivative and a nucleic acid-related substance under appropriate conditions.
【００１７】[0017]
【実施例】次に、本発明の特徴をさらに具体的に説明す
るため実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によっ
て制限されるものではない。なお、本明細書および図面
に示す化学構造式においては、慣用的な表現法に従い炭
素原子や水素原子を省略していることがある。実施例１：ポリアミノ酸誘導体の合成 前述の式（II）で表わされるフェニルボロン酸基含有ポ
リリジンから成るポリアミノ酸誘導体（以下、ＰＬＢと
略記することがある）を次のように合成した。Next, the features of the present invention will be described more specifically.
Therefore, the present invention is not limited to these embodiments.
There is no restriction. This specification and drawings
In the chemical structural formula shown in,
Elementary atoms and hydrogen atoms may be omitted.Example 1: Synthesis of polyamino acid derivative The phenylboronic acid group-containing polyamine represented by the aforementioned formula (II)
Polyamino acid derivative composed of lysine (hereinafter referred to as PLB)
(May be abbreviated) was synthesized as follows.
【００１８】窒素気流下で４−カルボキシフェニルボロ
ン酸３００ｍｇ（１．８１ｍｍｏｌ）を塩化チオニル
６．６ｍｌ（９０．５ｍｍｏｌ）に溶解し、ＤＭＦを数
滴加え、２時間還流した。溶媒を減圧濃縮し、得られた
固体を１５ｍｌＴＨＦに溶解した。ポリ−Ｌ−リジン
（ＨＢｒ塩、Ｍｗ＝１５０００−３００００：和光純薬
製）１００ｍｇ（０．４８unitｍｍｏｌ）、トリエチル
アミン０．７５ｍｌ（５．４３ｍｍｏｌ）を乾燥メタノ
ール１５ｍｌに溶解し、０℃で先の溶液をゆっくり滴下
し、その後、室温で１２時間攪拌した。その後、反応溶
液を減圧留去し、得られた固体を少量のメタノールに溶
解した。アセトンから再沈殿を行い、淡黄色粉末状固体
６７ｍｇ（収率５１％）を得た。1Ｈ−ＮＭＲより目的
物であることを確認した。1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）：1.02−2.09(m, 6H, CH2),
3.16(bs, 2H, CH2), 3.86(bs, 1H, CH), 7.29(bs, 4H,
ArH)Under a nitrogen stream, 300 mg (1.81 mmol) of 4-carboxyphenylboronic acid was dissolved in 6.6 ml (90.5 mmol) of thionyl chloride, several drops of DMF were added, and the mixture was refluxed for 2 hours. The solvent was concentrated under reduced pressure, and the obtained solid was dissolved in 15 ml of THF. 100 mg (0.48 unit mmol) of poly-L-lysine (HBr salt, Mw = 15000-30000: manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and 0.75 ml (5.43 mmol) of triethylamine are dissolved in 15 ml of dry methanol, and the above solution is dissolved at 0 ° C. Was slowly added dropwise, followed by stirring at room temperature for 12 hours. Thereafter, the reaction solution was distilled off under reduced pressure, and the obtained solid was dissolved in a small amount of methanol. Reprecipitation was performed from acetone to obtain 67 mg of a pale yellow powdery solid (yield: 51%). It was confirmed by 1 H-NMR that the product was the target compound. 1 H-NMR (CD3OD): 1.02 to 2.09 (m, 6H, CH 2 ),
3.16 (bs, 2H, CH 2 ), 3.86 (bs, 1H, CH), 7.29 (bs, 4H,
ArH)
【００１９】また、得られた生成物２．５ｍｇ（９．０
５×１０−6ｍｏｌ／unit）を０．１N ＮａＯＨ水溶液
０．１８ｍｌ（２ｅｑ）に溶かし、水１ｍｌピクリルス
ルホン酸ナトリウム６．３６ｍｇ（２ｅｑ）を加えて３
０℃で５時間攪拌した。限外ろ過により得られた残渣
を、水で洗浄後０．１Ｎ ＮａＯＨ水溶液に溶かして紫
外可視スペクトルの測定（日本分光Ｖ−５７０）を行
い、ＴＮＰ法により側鎖のフェニルボロン酸基の修飾率
（導入率）を求めたところ９９．８％であった。Further, 2.5 mg of the obtained product (9.0 mg) was obtained.
5 × 10 −6 mol / unit) was dissolved in 0.18 ml (2 eq) of 0.1N NaOH aqueous solution, and 1 ml of water was added to 6.36 mg (2 eq) of sodium picrylsulfonate to give 3
Stirred at 0 ° C. for 5 hours. The residue obtained by ultrafiltration was washed with water, dissolved in a 0.1N NaOH aqueous solution, and subjected to ultraviolet-visible spectrum measurement (JASCO V-570). The modification ratio of the phenylboronic acid group in the side chain was determined by the TNP method. (Introduction ratio) was 99.8%.
【００２０】実施例２：擬似ＲＮＡの形成 この実施例は、実施例１で調製したポリアミノ酸誘導体
（ＰＬＢ）が核酸関連物質（アデノシン）と結合して、
ＲＮＡに類似するポリマー（擬似ＲＮＡ）を形成するこ
とを示すものである。それらの相互作用や構造解析には
円二色性（ＣＤ）スペクトル測定装置（日本分光Ｊ−７
２０ＷＩ）を用いた。なお、以下に示すｐＨ値は測定値
である。[0020]Example 2: Formation of pseudo RNA This example relates to the polyamino acid derivative prepared in Example 1.
(PLB) binds to a nucleic acid-related substance (adenosine),
Forming a polymer (pseudo-RNA) similar to RNA
Is shown. For their interaction and structural analysis
Circular dichroism (CD) spectrum measuring device (JASCO J-7
20 WI). The pH values shown below are measured values.
It is.
【００２１】図２に、２０℃水溶液（１．４−エリスト
ール５０ｍｍｏｌ／ｄｍ3含有）中でのＰＬＢ（０．１
７ｍＭ）のＣＤスペクトルの極小値（−[θ]208）をｐ
Ｈに対してプロットしたものを示す。−[θ]208は、α
−ヘリックス構造を呈するＰＬＢの量の目安となる。図
に示されるように、ＰＬＢは中性から弱塩基性の領域で
α−ヘリックスを形成していることが理解される。FIG. 2 shows that PLB (0.1%) in a 20 ° C. aqueous solution (containing 1.4 mmol of erythol 50 mmol / dm 3 ).
The minimum value of the CD spectrum (− [θ] 208 ) of p.
Shown is a plot against H. − [Θ] 208 is α
-It is a measure of the amount of PLB exhibiting a helical structure. As shown in the figure, it is understood that PLB forms an α-helix in a neutral to weakly basic region.
【００２２】次に、水溶液（水／ＤＭＳＯ＝１／１）
中、２０℃で、ＰＬＢの存在下（０．１７ｍＭ）および
非存在下におけるアデノシンのＣＤスペクトルを測定し
た。図３にＣＤスペクトルの極小値（−[θ]252）をｐ
Ｈに対してプロットしたものを示す。アデノシン（Ａ
ｄ）はスタッキングすると２５０−２６０ｎｍの負のバ
ンドの強度が増加することが知られている。アデノシン
単独の場合には、測定ｐＨ領域においては、ＣＤスペク
トル値は、ほぼ一定の値を示すが、ＰＬＢ存在下（Ａｄ
＋ＰＬＢ）では、中性から弱塩基性のｐＨにかけてピー
クが存在し、それより低ｐＨ領域および高ｐＨ領域で低
下している。このように、図３のプロットは図２のプロ
ットと形状がよく似ており、アデノシンはＰＬＢがα−
ヘリックス構造を呈するｐＨ域において、ＰＬＢに結合
してスタッキングし、ヘリックス状の主鎖にアデノシン
が結合した、ＲＮＡに類似のポリマーが形成されるもの
と考えられる。Next, an aqueous solution (water / DMSO = 1/1)
At 20 ° C., the CD spectra of adenosine were measured in the presence (0.17 mM) and absence of PLB. FIG. 3 shows the minimum value (− [θ] 252 ) of the CD spectrum as p.
Shown is a plot against H. Adenosine (A
d) is known to increase the intensity of the negative band at 250 to 260 nm when stacked. In the case of adenosine alone, the CD spectrum value shows a substantially constant value in the measured pH region, but in the presence of PLB (Ad
+ PLB), there is a peak from neutral to weakly basic pH, and the peak is lower in the lower pH range and the higher pH range. Thus, the plot of FIG. 3 is very similar in shape to the plot of FIG.
It is considered that a polymer similar to RNA, in which adenosine is bound to a helical main chain, is formed by binding to PLB and stacking in a pH region exhibiting a helical structure.
【００２３】実施例３：核酸との相互作用 この実施例は、実施例２で示したように、ＰＬＢとアデ
ノシンは特定のｐＨ域で結合し擬似ＲＮＡとして、核酸
と相互作用することを示すものである。ＨＣｌとＮａＯ
ＨでｐＨを５．０（ＰＬＢとアデノシンが結合しないｐ
Ｈ域）および８．０（ＰＬＢがα−ヘリックス構造を呈
しアデノシンがＰＬＢに結合してスタッキングするｐＨ
域）に調整した水溶液（ＤＭＳＯ２０％）中でのアデノ
シン（５ｍＭ）、ＰＬＢ（２．５ｍＭ）およびpolyＵ
（２．５ｍＭ：モデル核酸）の挙動をＣＤスペクトル測
定により観察した。その結果を図４に示す。[0023]Example 3: Interaction with nucleic acid In this embodiment, the PLB and the
Nosin binds at a specific pH range and forms
And interact with it. HCl and NaO
PH at pH 5.0 (p at which PLB and adenosine do not bind)
H region) and 8.0 (PLB exhibits α-helical structure)
PH at which adenosine binds to PLB and stacks
In aqueous solution (DMSO 20%) adjusted to
Syn (5 mM), PLB (2.5 mM) and polyU
(2.5 mM: model nucleic acid) behavior by CD spectrum measurement
Observed by constant. The result is shown in FIG.
【００２４】図に示されるように、ＰＬＢとアデノシン
が結合するｐＨ８においては、Ａｄ（アデノシン）＋po
lyＵ系にＰＬＢが存在するとＣＤスペクトルの顕著な変
化が見られ、お互いに相互作用していることが理解され
る。これに対して、ＰＬＢとアデノシンが結合しないｐ
Ｈ５においては、このような相互作用は認められない。As shown in the figure, at pH 8 at which PLB and adenosine bind, Ad (adenosine) + po
When PLB is present in the lyU system, a remarkable change in the CD spectrum is observed, and it is understood that they interact with each other. On the other hand, pB where adenosine does not bind to PLB
In H5, no such interaction is observed.
【図１】ボロン酸基を側鎖に有するポリアミノ酸誘導体
から成る本発明の試薬が核酸関連物質と結合して形成さ
れる擬似核酸を模式的に示す。FIG. 1 schematically shows a pseudonucleic acid formed by combining a reagent of the present invention comprising a polyamino acid derivative having a boronic acid group in a side chain with a nucleic acid-related substance.
【図２】本発明の試薬を構成するポリアミノ酸誘導体の
１例のｐＨに応じたコンフォメーション変化を調べるた
めに、２０８ｎｍにおけるＣＤスペクトルの極小値をｐ
Ｈに対してプロットしたものである。FIG. 2 shows the minimum value of the CD spectrum at 208 nm as p
It is plotted against H.
【図３】本発明の試薬が対象とする核酸関連物質の１例
であるアデノシンの（本発明試薬の存在下および非存在
下における）コンフォメーション変化を調べるために、
２５２ｎｍにおけるＣＤスペクトルの極小値をｐＨに対
してプロットしたものである。FIG. 3 In order to examine the conformational change (in the presence and absence of the reagent of the present invention) of adenosine, which is an example of the nucleic acid-related substance targeted by the reagent of the present invention,
It is the minimum value of the CD spectrum at 252 nm plotted against pH.
【図４】ポリアミノ酸誘導体から成る本発明の試薬が核
酸関連物質と結合して、核酸と相互作用することを示す
ＣＤスペクトル図の１例である。FIG. 4 is an example of a CD spectrum diagram showing that the reagent of the present invention comprising a polyamino acid derivative binds to a nucleic acid-related substance and interacts with a nucleic acid.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小林 秀輝 茨城県つくば市二の宮４−13−１−２− 402 Ｆターム(参考） 4B063 QA05 QA20 QQ42 QQ52 QR48 QS04 QX01 4H045 AA30 BA52 EA50 EA61 EA65 FA41 FA52 GA05 4H048 AA03 AB81 AC53 VA75 VB10 VB90 ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (72) Inventor Hideki Kobayashi 4-13-1-2-402 Ninomiya, Tsukuba, Ibaraki Prefecture F-term (reference) 4B063 QA05 QA20 QQ42 QQ52 QR48 QS04 QX01 4H045 AA30 BA52 EA50 EA61 EA65 FA41 FA52 GA05 4H048 AA03 AB81 AC53 VA75 VB10 VB90
Claims (2)
カルボキシル基以外に側鎖に水酸基、カルボキシル基ま
たはアミノ基から成る反応性官能基を有するアミノ酸を
構成単位とし、前記アミノ酸側鎖の反応性官能基を介し
て、下記の式（Ｉ）で表わされるフェニルボロン酸基が
結合されているポリアミノ酸誘導体から成ることを特徴
とする核酸関連物質反応試薬。 【化１】 〔式（Ｉ）において、ｎは０から５の整数を表わし、Ｒ
は、前記アミノ酸側鎖の反応性官能基が水酸基のときは
下記（Ａ）に示される原子団のうちの１つ、カルボキシ
ル基のときは下記（Ｂ）に示される原子団のうちの１
つ、アミノ基のときは下記（Ｃ）に示される原子団の１
つを表す。〕 【化２】 【化３】 【化４】 1. An amino acid having a reactive functional group comprising a hydroxyl group, a carboxyl group or an amino group in a side chain in addition to an amino group and a carboxyl group forming a polypeptide bond as a constitutional unit, and a reactive function of the amino acid side chain. A reagent for a nucleic acid-related substance, comprising a polyamino acid derivative to which a phenylboronic acid group represented by the following formula (I) is bonded through a group. Embedded image [In the formula (I), n represents an integer of 0 to 5, and R
Is one of the atomic groups shown in the following (A) when the reactive functional group of the amino acid side chain is a hydroxyl group, and one of the atomic groups shown in the following (B) when the reactive functional group is a carboxyl group.
In the case of an amino group, one of the atomic groups shown in the following (C)
Represents one. [Chemical formula 2] Embedded image Embedded image
ロン酸基を有するリジンを構成単位として含むポリアミ
ノ酸誘導体から成ることを特徴とする請求項１の核酸関
連物質反応試薬。 【化５】 2. The nucleic acid-related substance reaction reagent according to claim 1, comprising a polyamino acid derivative containing lysine having a phenylboronic acid group represented by the following formula (II) as a constituent unit. Embedded image
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