JP2002159296A

JP2002159296A - 後天性免疫不全症候群の非ヒト霊長類モデル

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Publication number: JP2002159296A
Application number: JP2000360274A
Authority: JP
Inventors: Katsuaki Shinohara; 克明篠原; Hiroharu Sakai; 弘治阪井; Mitsuo Honda; 三男本多
Original assignee: National Institute of Infectious Diseases; Iyakuhin Fukusayou Higai Kyuusai Kenkyu Shinko Chosa Kiko
Current assignee: National Institute of Infectious Diseases; Iyakuhin Fukusayou Higai Kyuusai Kenkyu Shinko Chosa Kiko
Priority date: 2000-11-27
Filing date: 2000-11-27
Publication date: 2002-06-04
Anticipated expiration: 2020-11-27
Also published as: JP4709968B2

Abstract

(57)【要約】【課題】病原性キメラウイルスSHIV-C2/1株を均一な
クローンとして提供すること、およびこの病原性キメラ
ウイルスSHIV-C2/1株を利用したAIDSの非ヒト霊長類実
験モデルを提供することを課題とする。【解決手段】 SHIV-C2/1株を感染させたM8166細胞（CD
4陽性ヒトT細胞株）より抽出した全細胞DNAを鋳型とし
たポリメラーゼ連鎖反応を利用してSHIV-C2/1株のウイ
ルスゲノムDNAを調製した。調製したDNAを感染させたCO
S7細胞の培養上清から高力価のウイルスを回収した。該
ウイルスを接種したカニクイザルは、AIDSの症状を示し
た。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、後天性免疫不全症
候群（AIDS）の非ヒト霊長類モデルに関する。

【０００２】

【従来の技術】AIDSは、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）
が原因となり発症する疾患である。AIDSはHIVの感染
後、数年から十数年の潜伏期を経て発症し、その後免疫
機能が低下し、一般的に、発症後数年で患者は死に至
る。エイズの免疫不全では、リンパ球の一種であるT細
胞の減少をはじめ、B細胞、単球、マクロファージなど
のその他の免疫系細胞の異常、サイトカイン産生の異常
などが見られる。

【０００３】AIDSの予防と治療には様々なアプローチが
なされている。治療方法としては、種々の抗HIV薬（逆
転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド同
類体など）の開発により、現在ではHAART療法（highly
active antiretroviral therapy、多剤併用抗HIV療法）
がある程度の効果を示しトいる。HIV感染の予防として
は、ワクチンの開発が国内外にて積極的に行われている
(Fauci, A. S., and P. I. Fischinger. 1988. Public
Health Rep. 103:230-236.、Fauci, A. S.et al., Ann
Intern Med. 110:373-85.)。多くのワクチンは、HIVの
表面部位に発現する主要中和サイトであるEnv領域を標
的としているが、最近ではGagを標的としたワクチンの
有用性も検討されている。

【０００４】AIDSワクチンや治療薬の評価のためには、
免疫機構や代謝系がヒトと近似である霊長類を用いたin
vivoの評価系が確立されていなければならない。ヒト
のAIDSウイルスであるHIVは、ポリオやその他のワクチ
ン評価に汎用されているカニクイザル（Macaca fascicu
laris）やアカゲザル（Macaca mulatta）のようなMacaq
ue属のサルには感染が成立しにくく、唯一チンパンジー
においてのみ感染が成立するだけである(Alter, H. J.e
t al., 1984. Science. 226: 549-52.、Eichberg, J.
W.et al., J Med Primatol. 14:317-26.、Saxinger, C.
et al., AIDS ResHum Retroviruses. 3:375-85.)。AIDS
ワクチン候補や薬剤の開発と研究には、より手軽なサル
モデル系が必要である(Desrosiers, R. C., and N. L.
Letvin. 1987. Rev, Infect. Dis. 9:438-446.、Fultz,
P. N. 1993. Clin. Infect. Dis.17:230-235.、Joag,
S. V. 2000. Microbes. Infect. 2:223-9.、Letvin, N.
L.1992. Immunodefic. Rev. 3:247-260.、Lewis, A.
D., and P. R. Johnson. 1995. Trends. biotechnol. 1
3:142-150.、Lu, Y. 1997. Crit. rev. Oncog. 8:273-2
91.、Nath, B. M.et al., 2000. Trends Microbiol. 8:
426-431、Schultz, A. M., and S. L. Hu. 1993. AIDS.
7:S161-170.)。

【０００５】Macaque属のサルに感染が成立するのは、
サルのAIDSウイルスであるSimian Immunodeficiency Vi
rus（SIV）数種のみであった(Chakrabarti, L.et al.,
Nature. 328:543-547.)。しかしながら、SIVはサルのウ
イルスであり、宿主免疫系の点においても、ヒトのモデ
ルとはなり難い。

【０００６】そこでSIVとHIVのキメラウイルスが注目さ
れてきた。ヒトのワクチンの標的部位であるEnv領域はH
IVとし、さらにサルに感染させるために他の主要部位を
サルのSIVとしたキメラウイルスが作製された(Sakurag
i, S.et al.,1992. J. Gen. Virol. 73:2983-2987.、Sh
ibata, R.et al., 1991. J Virol. 65:3514-20.、Shiba
ta, R.et al., 1990. J Virol. 64:5861-5868.)。SIVと
HIVのキメラウイルス（Simian-Human Immunodeficiency
Virus、SHIV）により、in vivo 系においてサルに感染
が成立し、なおかつHIVのEnvに対する免疫反応やワクチ
ンの評価ができるモデル系が目指された。また、ウイル
ス感染から発症までの霊長類のモデル系が完成すれば、
ヒトにおけるHIVの病原性や病態、感染様式、免疫応答
などの解明にも有用である。

【０００７】しかしながら、これまでのキメラウイルス
は感染は成立するものの、CD4陽性リンパ球の減少を主
とするヒトのAIDS病態を発現できていなかった(Igarash
i, T.et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses. 10:1021-
1029.、Li, J.et al., J Acquir Immune Defic Syndr.
5:639-646.、Li, J. T.et al., 1995. J Virol. 69:706
1-7.、Lu, Y.et al., 1996. J Acquir Immune Defic Sy
ndr Hum Retrovirol.12:99-106.、Miller, C. J. et a
l., 1997. J Virol. 71:1911-21.)。AIDSワクチンや薬
剤の効力評価には、ヒトと同様なAIDS発症モデルが必要
であるが、確立したモデル系は存在しなかった。

【０００８】近年になり、病原性を示すキメラウイルス
が作製されてきた(Dunn, C. S.et al., Virology. 223:
351-61.、Harouse, J. M. et al., 1998. J Med Primat
ol.27:81-6.、Joag, S. V.et al., 1997. J Virol. 71:
4016-23.、Joag, S. V. etal., 1996. J Virol. 70:318
9-97.、Joag, S. V.et al., 1998. J Med Primatol. 2
7:59-64.、Liu, Z. Q.et al.,1999. Virology. 260:295
-307.、Luciw, P. A.et al., 1999. Virology. 263:112
-27.、Luciw, P. A.et al., 1995. Proc NatlAcad Sci
U S A. 92:7490-4.)。その中の一つとして、米国におい
てHIV-1 89.6株とSIV mac 239株のキメラウイルスとし
て、SHIV-89.6が作製された(Reimann,K. A.et al., 199
6. J Virol. 70:3198-206.)。このキメラウイルスは、
臨床分離HIV-1 Clade B株のenv領域を発現したキメラウ
イルスである。さらに、このSHIV-89.6をアカゲザルに
て3代in vivo継代し、病原性を示すSHIV-89.6Pが得られ
た(Karlsson, G. B.et al., 1997. J Virol. 71:4218-
25.、Lu, Y.et al., 1998. J Acquir Immune Defic Syn
dr Hum Retrovirol. 19:6-18.、Reimann, K. A.et al.,
1996. J Virol. 70:6922-8.)。

【０００９】一方、本発明者らは、カニクイザルとキメ
ラウイルスを用いたAIDS発症モデルを樹立した（Shinoh
ara et al.,Journal of General Virology,80,1231-124
0,1999）。しかしながら、このモデルで用いられる、SI
Vmac239、Clade B HIV-1/HXBc2およびHIV-1/89.6より構
成される病原性キメラウイルスSHIV-C2/1株は、現在、
サル血漿として供給されており、複数の遺伝子型のウイ
ルスを含んでいる。このためこのモデルを利用してワク
チン評価や抗HIV/AIDS物質の評価をする場合に、成績の
安定性に問題があった。また、特に多クローンなウイル
スでは、接種経路の違いや宿主側のサルの状態により感
染効率が異なる可能性があり、この事から抗ウイルス作
用に関する成績の解釈が、抗ウイルス物質の効果による
ものか、あるいは宿主側のウイルスクローンの選択によ
る感染効率の相違によるものか判断できないという問題
点があった。このため、病原性キメラウイルスSHIV-C2/
1株を均一なクローンとして提供することが、優れたAID
S発症モデルの開発において望まれていた。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、病原性
キメラウイルスSHIV-C2/1株を均一なクローンとして提
供することにある。さらに、本発明は、この病原性キメ
ラウイルスSHIV-C2/1株を利用した、AIDSの非ヒト霊長
類実験モデルを提供することをも目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために、まず、SHIV-C2/1株のウイルスクロ
ーンの作製を行なった。SHIV-C2/1株を感染させたM8166
細胞（CD4陽性ヒトT細胞株）より全細胞DNAを抽出し、
これを鋳型とし、プロウイルスゲノムを3分割するよう
に設計した特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖
反応（PCR）を行なった。増幅した3断片を、pUC系プラ
スミドにクローニングし、さらに再構成することによ
り、プロウイルス型のDNAクローンを作製することに成
功した。得られた分子クローンの塩基配列の決定を行な
った結果、この遺伝子型はこれまで発表されたSHIVとは
異なるユニークなものであった。本発明者らは、さら
に、作成したウイルスDNAを、COS7細胞にトランスフェ
クションし、培養上清を採取してウイルス標品を調製し
た。この培養上清中のウイルス力価を測定した結果、サ
ル血漿を遥かに上回る高い力価を示した。また、このウ
イルスは、M8166細胞等で良好に増殖し、合胞体を形成
した。

【００１２】次いで、本発明者らは、回収した均一なク
ローンウイルスを利用してサル実験モデルの作製を行な
った。Macaque属サルの静脈または直腸に回収したクロ
ーンウイルスを接種し、その病原性を検証した結果、ウ
イルス接種によりサルへの感染が成立し、感染したサル
はCD4陽性T細胞の枯渇を主とするAIDSの症状を示した。

【００１３】即ち、本発明者らは、SHIV-C2/1株の均一
なウイルスクローンを調製することに成功すると供に、
該クローンを利用してAIDSの非ヒト霊長類実験モデルを
作製することにも成功し、これにより本発明を完成する
に至った。本発明は、より詳しくは、（１）ヒト免疫
不全ウイルスおよびサル免疫不全ウイルスに由来する単
離されたDNAであって、下記（ａ）から（ｃ）のいずれ
かに記載のDNA、（ａ）配列番号：２から１１に記載のアミノ酸配列から
なる全てのタンパク質をコードするDNA。（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含
む、（ａ）に記載のDNA。（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列において1若しく
は複数の塩基が置換、欠失、付加および／または挿入さ
れた塩基配列を含むDNAであって、（ｉ）その真核生物
細胞への導入および発現により、該細胞の培養上清から
感染性のウイルスを回収することができ、かつ(ii)該ウ
イルスがカニクイザルにおいてCD4陽性リンパ球を減少
させることができる、DNA。（２）（ｃ）における真核生物細胞が哺乳動物細胞で
ある、（１）に記載のDNA、（３）（ｃ）において回
収されるウイルスが10^３TCID₅₀/ml以上の力価を有す
る、（１）に記載のDNA、（４）（１）から（３）の
いずれかに記載のDNAの転写産物の塩基配列をそのゲノ
ムに含む、実質的に純粋なヒト免疫不全ウイルスおよび
サル免疫不全ウイルスのキメラウイルス、（５）
（４）に記載のキメラウイルスの製造方法であって、
（ａ）（１）から（３）のいずれかに記載のDNAを真核
生物細胞へ導入し、発現させる工程、および（ｂ）該細
胞の培養上清からウイルスを回収する工程、を含む方
法、（６）真核生物細胞が哺乳動物細胞である、
（５）に記載の方法、（７）（４）に記載のキメラウ
イルスで感染された非ヒト霊長類、（８）サルであ
る、（７）に記載の非ヒト霊長類、（９）後天性免疫
不全症候群の予防または治療に有効な薬剤を同定または
評価するための、（７）または（８）に記載の非ヒト霊
長類の使用、を提供するものである。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明は、ヒトとサルの免疫不全
ウイルスのキメラウイルスSHIV-C2/1株由来の単離され
たDNAを提供する。SHIV-C2/1株のゲノムDNAの塩基配列
を配列番号：1に示す。該DNAがコードするgag、pol、vi
f、vpx、vpr、tat、rev、vpu、env、nefのアミノ酸配列
を順に配列番号：2から11に示す。SHIV-C2/1のゲノムに
は、SHIV-C2/1のHIV-1由来の領域、特にenv遺伝子に親
株 SHIV-89.6と比較して、多数の変異が存在する。この
うち、Gagの1個所、Polの3個所、Tatの2個所、Envの16
個所及びNefの1個所の変異は、アミノ酸置換を伴う。ま
た、env遺伝子3'末端を含む140bpの欠失により、HIV-1
Env gp41 C末端がSIVmac239由来の同等領域に置換して
いる。これら遺伝子変異は、SHIV-C2/1のMacaque属への
適応に関与していると推定される。

【００１５】また、SHIV-C2/1のゲノムのEnvには、病原
性分子クローンSHIV-89.6P KB9 （Cayabyab, M.et al.,
1999. J Virol. 73:976-84.）および他系統の病原性分
子クローンSHIV-HXBc2P3.2（Shinohara, K.et al, 200
0. A Pathogenic SHIV-C2/1-Cynomolgus Monkey Model
for Evaluation of HIV Vaccine Candidates., p. 247-
250. XIII International AIDS conference., Basic S
cience, Clinical Science, Epidemiology, Prevention
and Public Health, Durban, South Africa.）と共通
の変異が認められた。第一は、C2領域のアスパラギン結
合糖鎖の消失である。この部位はHIVウイルスレセプタ
ーCD4との結合に関与しており、ウイルスの細胞への結
合などの相互作用に変化をもたらす可能性が考えられ
る。第二は、V3ループ内の連続する塩基性アミノ酸の一
部の、全く極性の異なるアミノ酸への変化である。V3領
域はコレセプターを介した宿主域の決定に大きく関与し
ており、極性変化を伴うアミノ酸変異は宿主域に影響を
与える可能性が考えられる。

【００１６】SHIV-C2/1において、アカゲザルで病原性
を示すSHIV-89.6P KB9並びにブタオザルから得られたSH
IV-HXBC2P3.2と共通の変異が認められたことは、これら
の共通の遺伝子変異部位が病原性SHIVの遺伝子の特徴で
あり、不可欠なものであることを示す。さらに、この共
通の変異以外に、SHIV-C2/1独自の変異が認められたこ
とは、この独自の変異がカニクイザルに対する特異な変
異である可能性を示すものである。

【００１７】本発明は、SHIV-C2/1株を構成するこれら
変異を有するタンパク質（配列番号：2から11）をコー
ドする単離されたDNA（例えば、配列番号：1に記載の塩
基配列のコード領域を含むDNA）を含む。本発明におい
て「単離されたDNA」とは、本来の環境（即ち、天然の
ウイルス）から人為的に取り出されたDNAまたはそのコ
ピーを意味する。従って、「単離されたDNA」には、例
えば、ベクターに組み込まれた形態のDNAが含まれる。

【００１８】本発明のDNAは、配列番号：1に記載のSHIV
-C2/1由来のゲノムDNAの塩基配列情報を基に設計したプ
ライマーを利用し、SHIV-C2/1（カニクイザル血漿）の
全DNAを鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応を行なうこと
により調製することができる（実施例１参照）。

【００１９】本発明のDNAは、その真核生物細胞、好ま
しくはCOS7細胞などの哺乳動物細胞への導入および発現
により、該細胞の培養上清から感染性のウイルスを回収
することができる（実施例１参照）。本発明において回
収される感染性のウイルスは、好ましくは10^３TCID₅₀/m
l以上の力価を有し、さらに好ましくは10^４TCID₅₀/ml以
上の力価を有し、最も好ましくは10⁵TCID₅₀/ml以上の力
価を有する。驚くべきことに、COS7細胞の培養上清から
回収されたウイルスの力価は、5×10⁵TCID₅₀/mlに達
し、これは従来用いられてきたカニクイザル血漿材料の
SHIV-C2/1株の力価6.6×10^２TCID₅₀/mlの約750倍に値す
る。また、この回収されたウイルスは、カニクイザルに
おいてCD4陽性リンパ球を減少させることができる。

【００２０】本発明のDNAには、このような特性を有す
る限り、SHIV-C2/1株の単離されたDNAの塩基配列（配列
番号：１）において1もしくは複数の塩基が変異した塩
基配列を有するDNAを含む。このようなDNAは、当業者で
あれば、例えば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Go
toh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275、Zoller, M
J, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-5
00、Kramer, W. et al.(1984) Nucleic Acids Res. 12,
9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods.
Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Proc Natl A
cad Sci USA. 82, 488-492、Kunkel (1988) Methods En
zymol. 85, 2763-2766）などを利用して調製することが
できる。変異数は、上記本発明のDNAの特性を保持し得
る限り特に制限はないが、人為的な変異の導入は、一般
的には、50塩基以下であることが好ましく、30塩基以下
（例えば、10塩基以下、5塩基以下）であることがより
好ましいと考えられる。

【００２１】また、本発明は、上記本発明のDNAの転写
産物（RNA）の塩基配列をそのゲノム（ゲノムRNA）に含
む、実質的に純粋なSHIV-C2/1株を提供する。本発明に
おいて「実質的に純粋なウイルス」とは、従来のサル血
漿として供給されているSHIV-C2/1株のように複数の遺
伝子型のウイルスを含まない、単一の遺伝子型のウイル
スを意味する。本発明のSHIV-C2/1株の調製物は、上記
したように本発明のDNAの真核生物細胞への導入及び発
現により、その培養上清から均一なクローンとして回収
することができ、サル血漿のウイルスと比較して高い力
価を有する。

【００２２】本発明のSHIV-C2/1株の調製物は、アカゲ
ザルのみならず、カニクイザルにおいても感染性を有す
る。また、これらサルにおいてAIDSの症状（例えば、CD
4陽性リンパ球の減少）を引き起こすことができる。こ
のような特性から、本発明のSHIV-C2/1株の調製物は、A
IDSの実験モデルの作製に好適に用いることができる。

【００２３】本発明は、このようにSHIV-C2/1株の感染
によりAIDSの症状を示す非ヒト霊長類実験モデルを提供
する。本発明のAIDSの実験モデルは、好ましくはサルで
ある。特に好ましくは、Macaque属に属するサル（例え
ば、カニクイザル、アカゲザル）である。本発明のAIDS
実験モデルは、例えば、本発明のSHIV-C2/1株の調製物
を実験モデル動物の静脈や直腸へ接種することにより作
製することができる（実施例２参照）。このようにして
作製されたAIDS実験モデルは、AIDSの予防や治療のため
の薬剤の同定や評価において好適に用いることができ
る。例えば、前もってワクチン候補を免疫した非ヒト霊
長類に、本発明のウイルスを接種して、ワクチンの防御
効果を見ることができる。また、本発明のウイルスは、
静脈内接種でも直腸内接種でも、どちらの経路において
も感染が成立することから、該ウイルスで感染された実
験モデルは、粘膜ワクチンの評価にも用いることができ
有用性が高い。また、AIDSの治療薬候補化合物を本発明
のウイルスを感染させた実験モデルに投与して、その後
のAIDS症状の改善を観察することにより、AIDS治療薬と
なりうる化合物を同定することも可能である。

【００２４】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではな
い。

【００２５】[実施例１] SHIV-C2/1分子クローンの作
製（1）クローニング SHIV-C2/1（カニクイザル血漿）（Shinohara et al.,Jo
urnal of General Virology,80,1231-1240,1999）を感
染させたM8166細胞（CD4陽性ヒトT細胞株）よりグアニ
ジン／セシウム超遠心法にて全DNAを分離・抽出後、フ
ェノール／クロロホルム法にて精製した。このDNAを鋳
型とし、Expand High Fidelity PCR SystemKit（Roche
Diagnostics, Indianapolis, IN, USA）を用い、（Pwo
+ Taq）DNAポリメラーゼ混合酵素にて、94℃2分を1サイ
クル、94℃15秒・50℃30秒・68℃5分を10サイクル、94
℃15秒・50℃30秒・68℃5分20秒（20秒／サイクルで増
加）を20サイクル、68℃7分を1サイクルの条件でPCRを
行った。PCRプライマーは、プロウイルスゲノムを制限
酵素Sse8387 IとSph Iにて３分割、5'および3'末端に人
為的にNot IとEcoRIの制限酵素部位を加えた形になるよ
うに設計した（図１）。即ち、5' Not I - Sse8387 I
断片増幅用プライマーとしてフォワードプライマー「AA
AAGCGGCCGCTGGAAGGGATTTATTACAGTGC／配列番号：１２」
とリバースプライマー「CCAGTACTGTAATTCTTTTCCTTTT／
配列番号：１３」を、Sse8387 I - Sph I断片増幅用プ
ライマーとしてフォワードプライマー「CCCCGACCAATCCA
TACAACAC／配列番号：１４」とリバースプライマー「TT
TGATAGAGAAGCTTGATGAGTC／配列番号：１５」を、Sph I
- 3' EcoR I 断片増幅用プライマーとしてフォワードプ
ライマー「GCATTGCAAGAAAGGCTGTAG／配列番号：１６」
とリバースプライマー「GGCGGAATTCTGCTAGGGATTTTCCTGC
TTCG／配列番号：１７」を用いた。

【００２６】PCR産物は、それぞれ制限酵素Not I + Sse
8387 I、Sse8387 I + Sph I、Sph I+ EcoR Iにて消化
後、アガロースゲルにて電気泳動、QIAquick Gel Extra
ctionKitを用いたシリカカラム法にて精製し、pUC-18を
改変したプラスミドにクローニングした。ゲノム3領
域各々5クローン前後を配列決定し、先に決定していたS
HIV-C2/1ゲノムの配列と一致するものを選抜し、それら
を再構築してプロウイルス型（10,501bp）のクローンを
作製した。これによりSHIV-C2/1のウイルスクローンSHI
V-C2/1 KS661が得られた。

【００２７】（2）ウイルスの回収クローンDNAをCOS 7細胞（アフリカミドリザル腎臓由来
の細胞株）にLIPOFECTAMINE PLUS Reagent（Life Techn
ologies, Rockville, MD, USA）を用いたリポソーム法
にてトランスフェクションし、3時間後に培地を10%牛胎
児血清含有Dulbecco's Modified Eagle Medium（D-ME
M）培地に交換し、48時間後に培養上清を採取した。こ
れを1,200 回転で5分の遠心をした後、ウイルスを含む
培養上清を回収し、0.45-μm孔のフィルターを通して細
胞の破片を取り除き、ウイルスストックとした。このウ
イルスストックの感染力価を、M8166細胞を用いて測定
し、TCID₅₀で表した。その結果、カニクイザル血漿材料
の力価である6.6 X10²TCID₅₀/mlを遥かに上回る5 x 10
⁵ TCID₅₀/mlの高力価を得た。また、クローンウイルス
はM8166細胞で良好に増殖し、SHIV-C2/1血漿ウイルス感
染細胞と同様の合胞体形成が観察できた。

【００２８】[実施例２] SHIV-C2/1 KS661の病原性の
検証実施例１により回収したウイルスを12、000TCID₅₀、カ
ニクイザル及びアカゲザルに静脈内接種した。接種後1
日目より、麻酔したサルから経時的に抹消血（ヘパリン
あるいはEDTA加）を採血し、通常3日おきに、3週目以降
は週1回程度を継続して採血した。これを比重 1.070 の
Percole に重層後、遠心分離してPBMCs（peripheral bl
ood mononuclear cells、末梢血単核球）と血漿を分離
した。

【００２９】血漿よりウイルスRNAを抽出し、RT-PCRに
よりSIVmac239のgag領域を増殖し、その生成物の濃度よ
り血漿中のウイルスRNAコピー数を算出した。血漿中の
ウイルスRNAはQIAamp Viral RNA Mini kit（QIAGEN, Va
lencia, CA）を利用して抽出・精製した。RNA量の算出
は、SIVmac239のgag領域を標的としたプライマーとプロ
ーブを設計し、TaqManTMシステム（PE Biosystems, Fos
ter City, CA, USA）を用いて行った。ウイルスRNAは、
TaqManTM EZ RT-PCR Kit（PE Biosystems）を用いて、
増殖及び検出を行った。プライマー及び鋳型は以下のも
のを設計した。即ち、フォワードプライマーとして、
「AATGCAGAGCCCCAAGAAGAC／配列番号：１８」を、リバ
ースプライマーとして「GGACCAAGGCCTAAAAAACCC／配列
番号：１９」を、プローブとして「 Fam-ACCATGTTATGGC
CAAATGCCCAGAC-Tamra／配列番号：２０」を用いた。RT-
PCR産物はABI7700（PE Biosystems）によって蛍光染色
を行い、その量決定した。対照としてのSIVmac239のgag
領域のRNAは、T7 プロモーターの下流にSIVmac239のgag
領域を挿入したプラスミドpKS460を鋳型として、MEGAsc
riptTM（Ambion, Austin, Texas, USA）を用いて作製し
た。血漿中のウイルス量は、各3回ずつ測定をくり返し
た後、コントロールRNAにて作成した検量線より換算し
て求めた。

【００３０】また、鋳型DNAやその他の混入DNAはDNAase
Iにて処理し、精製したRNA中への混入率は0.1％以下で
あった。さらに測定時には10⁵のコントロールRNAを常に
用い、精度管理を行った。各測定においてRNAの回収率
は安定していた。この測定系の感度は1,000コピー数/ml
であった。この測定の結果、これらサルの血漿において
ウイルスRNAの存在が検出された。このことから、これ
らサルがウイルス感染していることが判明した。

【００３１】また、ウイルス感染後のカニクイザルがAI
DSの症状を示すか否かの検討を行なった。具体的には、
CD4陽性リンパ球及びCD8陽性リンパ球数の計測を以下の
方法により行なった。FITC-CD3 mAb（Biosouce Interna
tional Inc.,Camarillo, CA,USA）、PE-CD4 mAb（Becto
n Dickinson Immunocytometry System）、PerCP-CD8（B
ecton Dickinson Immunocytometry System）と採取全血
50μlを、4℃にて15分間インキュベートした。その後、
赤血球をFACS lysing solution（Becton Dickinson Imm
unocytometry System）を用いて4℃で15分間溶解し、50
μlのFlow-CountTM（Beckman Coulter Inc., Hialeah,
FL,USA）を添加した。染色細胞は1％のパラホルムアル
デヒドにて固定後、FACScalber flow cytometry（Becto
n Dickinson Immunocytometry System）を用いて、ソフ
トウエアCellQuestにより解析した。その結果、ウイル
ス感染後のサルのCD4陽性リンパ球が減少することが確
認された（図２）。さらに、カニクイザルに1,500,000T
CID₅₀を直腸から接種した場合にも、CD4陽性リンパ球の
減少を惹起できた。

【００３２】

【発明の効果】本発明によりSHIV-C2/1株の均一なウイ
ルスクローンおよび該クローンを利用したAIDSの非ヒト
霊長類実験モデルが提供された。COS7細胞の培養上清か
ら回収されるSHIV-C2/1調製物は、均一で極めて高い力
価を有するため、従来の血漿標品に代えて、AIDSの実験
モデルの作製に好適に利用することができる。さらに、
このようにして作製された実験モデルは、安定したAIDS
感染の症状を示すため、抗HIVワクチンや抗HIV薬剤の開
発と評価のために好適に用いることができる。さらに、
本発明のSHIV-C2/1クローンを基盤として用いれば、B以
外のクレードのSHIVキメラウイルスを作製することも可
能であり、全世界に分布する広範囲なHIVに対するワク
チンの評価に必要な非ヒト霊長類モデルの確立に寄与す
ることが期待できる。

【００３３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> National institute of Infectious Diseases The Organization for Pharmaceutical Safety and Research Genox Research, Inc. <120> Non-human primate model for Acquired Immunodeficiency Syndrome <130> OPS-A0002 <140> <141> <160> 20 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 10501 <212> DNA <213> Simian-Human immunodeficiency virus <220> <223> genomic DNA <220> <221> source <222> (1)..(10501) <223> strain="SHIV-C2/1" <220> <221> source <222> (1)..(6455) <223> derived from SIVmac239 <220> <221> LTR <222> (1)..(818) <223> 5' long terminal repeat <220> <221> misc_feature <222> (1)..(517) <223> U3 region <220> <221> repeat_region <222> (518)..(694) <223> R region <220> <221> misc_feature <222> (695)..(818) <223> U5 region <220> <221> gene <222> (1053)..(2585) <223> gag <220> <221> gene <222> (<2228)..(5410) <223> pol <220> <221> gene <222> (5340)..(5984) <223> vif <220> <221> gene <222> (5812)..(6150) <223> vpx <220> <221> gene <222> (6151)..(6456) <223> vpr <220> <221> source <222> (6456)..(9292) <223> derived from HIV-1 <220> <221> gene <222> (6465)..(9097) <223> tat <220> <221> gene <222> (6604)..(9278) <223> rev <220> <221> gene <222> (6696)..(6941) <223> vpu <220> <221> gene <222> (6856)..(9465) <223> env <220> <221> source <222> (9293)..(10501) <223> derived from SIVmac239 <220> <221> gene <222> (9299)..(10090) <223> nef <220> <221> LTR <222> (9684)..(10501) <223> 3' long terminal repeat <220> <221> misc_feature <222> (9684)..(10200) <223> U3 region <220> <221> repeat_region <222> (10201)..(10377) <223> R region <220> <221> misc_feature <222> (10378)..(10501) <223> U5 region <400> 1 tggaagggat ttattacagt gcaagaagac atagaatctt agacatatac ttagaaaagg 60 aagaaggcat cataccagat tggcaggatt atacctcagg accaggaatt agatacccaa 120 agacatttgg ctggctatgg aaattagtcc ctgtaaatgt atcagatgag gcacaggagg 180 atgaggagca ttatttaatg catccagctc aaacttccca gtgggatgac ccttggggag 240 aggttctagc atggaagttt gatccaactc tggcctacac ttatgaggca tatgttagat 300 acccagaaga gtttggaagc aagtcaggcc tgtcagagga agaggttaga agaaggctaa 360 ccgcaagagg ccttcttaac atggctgaca agaaggaaac tcgctgaaac agcagggact 420 ttccacaagg ggatgttacg gggaggtact ggggaggagc cggtcgggaa cgcccacttt 480 cttgatgtat aaatatcact gcatttcgct ctgtattcag tcgctctgcg gagaggctgg 540 cagattgagc cctgggaggt tctctccagc actagcaggt agagcctggg tgttccctgc 600 tagactctca ccagcacttg gccggtgctg ggcagagtga ctccacgctt gtttgcttaa 660 agccctcttc aataaagctg ccattttaga agtaagctag tgtgtgttcc catctctcct 720 agccgccgcc tggtcaactc ggtactcaat aataagaaga ccctggtctg ttaggaccct 780 ttctgctttg ggaaaccgaa gcaggaaaat ccctagcaga ttggcgcccg aacagggact 840 tgaaggagag tgagagactc ctgagtacgg ctgagtgaag gcagtaaggg cggcaggaac 900 caaccacgac ggagtgctcc tataaaggcg cgggtcggta ccagacggcg tgaggagcgg 960 gagaggaaga ggcctccggt tgcaggtaag tgcaacacaa aaaagaaata gctgtctttt 1020 atccaggaag gggtaataag atagagtggg agatgggcgt gagaaactcc gtcttgtcag 1080 ggaagaaagc agatgaatta gaaaaaatta ggctacgacc caacggaaag aaaaagtaca 1140 tgttgaagca tgtagtatgg gcagcaaatg aattagatag atttggatta gcagaaagcc 1200 tgttggagaa caaagaagga tgtcaaaaaa tactttcggt cttagctcca ttagtgccaa 1260 caggctcaga aaatttaaaa agcctttata atactgtctg cgtcatctgg tgcattcacg 1320 cagaagagaa agtgaaacac actgaggaag caaaacagat agtgcagaga cacctagtgg 1380 tggaaacagg aacaacagaa actatgccaa aaacaagtag accaacagca ccatctagcg 1440 gcagaggagg aaattaccca gtacaacaaa taggtggtaa ctatgtccac ctgccattaa 1500 gcccgagaac attaaatgcc tgggtaaaat tgatagagga aaagaaattt ggagcagaag 1560 tagtaccagg atttcaggca ctgtcagaag gttgcacccc ctatgacatt aatcagatgt 1620 taaattgtgt gggagaccat caagcggcta tgcagattat cagagatatt ataaacgagg 1680 aggctgcaga ttgggacttg cagcacccac aaccagctcc acaacaagga caacttaggg 1740 agccgtcagg atcagatatt gcaggaacaa ctagttcagt agatgaacaa atccagtgga 1800 tgtacagaca acagaacccc ataccagtag gcaacattta caggagatgg atccaactgg 1860 ggttgcaaaa atgtgtcaga atgtataacc caacaaacat tctagatgta aaacaagggc 1920 caaaagagcc atttcagagc tatgtagaca ggttctacaa aagtttaaga gcagaacaga 1980 cagatgcagc agtaaagaat tggatgactc aaacactgct gattcaaaat gctaacccag 2040 attgcaagct agtgctgaag gggctgggtg tgaatcccac cctagaagaa atgctgacgg 2100 cttgtcaagg agtagggggg ccgggacaga aggctagatt aatggcagaa gccctgaaag 2160 aggccctcgc accagtgcca atcccttttg cagcagccca acagagggga ccaagaaagc 2220 caattaagtg ttggaattgt gggaaagagg gacactctgc aaggcaatgc agagccccaa 2280 gaagacaggg atgctggaaa tgtggaaaaa tggaccatgt tatggccaaa tgcccagaca 2340 gacaggcggg ttttttaggc cttggtccat ggggaaagaa gccccgcaat ttccccatgg 2400 ctcaagtgca tcaggggctg ataccaactg ctcccccaga ggacccagct gtggatctgc 2460 taaagaacta catgcagttg ggcaagcagc agagagaaaa gcagagagaa agcagagaga 2520 agccttacaa ggaggtgaca gaggatttgc tgcacctcaa ttctctcttt ggaggagacc 2580 agtagtcact gctcatattg aaggacagcc tgtagaagta ttactggata caggggctga 2640 tgattctatt gtaacaggaa tagagttagg tccacattat accccaaaaa tagtaggagg 2700 aataggaggt tttattaata ctaaagaata caaaaatgta gaaatagaag ttttaggcaa 2760 aaggattaaa gggacaatca tgacagggga caccccgatt aacatttttg gtagaaattt 2820 gctaacagct ctggggatgt ctctaaattt tcccatagct aaagtagagc ctgtaaaagt 2880 cgccttaaag ccaggaaagg atggaccaaa attgaagcag tggccattat caaaagaaaa 2940 gatagttgca ttaagagaaa tctgtgaaaa gatggaaaag gatggtcagt tggaggaagc 3000 tcccccgacc aatccataca acacccccac atttgctata aagaaaaagg ataagaacaa 3060 atggagaatg ctgatagatt ttagggaact aaatagggtc actcaggact ttacggaagt 3120 ccaattagga ataccacacc ctgcaggact agcaaaaagg aaaagaatta cagtactgga 3180 tataggtgat gcatatttct ccatacctct agatgaagaa tttaggcagt acactgcctt 3240 tactttacca tcagtaaata atgcagagcc aggaaaacga tacatttata aggttctgcc 3300 tcagggatgg aaggggtcac cagccatctt ccaatacact atgagacatg tgctagaacc 3360 cttcaggaag gcaaatccag atgtgacctt agtccagtat atggatgaca tcttaatagc 3420 tagtgacagg acagacctgg aacatgacag ggtagtttta cagttaaagg aactcttgaa 3480 tagcataggg ttttctaccc cagaagagaa attccaaaaa gatcccccat ttcaatggat 3540 ggggtacgaa ttgtggccaa caaaatggaa gttgcaaaag atagagttgc cacaaagaga 3600 gacctggaca gtgaatgata tacagaagtt agtaggagta ttaaattggg cagctcaaat 3660 ttatccaggt ataaaaacca aacatctctg taggttaatt agaggaaaaa tgactctaac 3720 agaggaagtt cagtggactg agatggcaga agcagaatat gaggaaaata aaataattct 3780 cagtcaggaa caagaaggat gttattacca agaaggcaag ccattagaag ccacggtaat 3840 aaagagtcag gacaatcagt ggtcttataa aattcaccaa gaagacaaaa tactgaaagt 3900 aggaaaattt gcaaagataa agaatacaca taccaatgga gtgagactat tagcacatgt 3960 aatacagaaa ataggaaagg aagcaatagt gatctgggga caggtcccaa aattccactt 4020 accagttgag aaggatgtat gggaacagtg gtggacagac tattggcagg taacctggat 4080 accggaatgg gattttatct caacaccacc gctagtaaga ttagtcttca atctagtgaa 4140 ggaccctata gagggagaag aaacctatta tacagatgga tcatgtaata aacagtcaaa 4200 agaagggaaa gcaggatata tcacagatag gggcaaagac aaagtaaaag tgttagaaca 4260 gactactaat caacaagcag aattggaagc atttctcatg gcattgacag actcagggcc 4320 aaaggcaaat attatagtag attcacaata tgttatggga ataataacag gatgccctac 4380 agaatcagag agcaggctag ttaatcaaat aatagaagaa atgattaaaa agtcagaaat 4440 ttatgtagca tgggtaccag cacacaaagg tataggagga aaccaagaaa tagaccacct 4500 agttagtcaa gggattagac aagttctctt cttggaaagg atagagccag cacaagagga 4560 acatgataaa taccatagta atgtaaaaga attggtattc aaatttggat tacccagaat 4620 agtggccaga cagatagtag acacctgtga taaatgtcat cagaaaggag aggctataca 4680 tgggcaggca aattcagatc tagggacttg gcaaatggat tgtacccatc tagagggaaa 4740 aataatcata gttgcagtac atgtagctag tggattcata gaagcagagg taattccaca 4800 agagacagga agacagacag cactatttct gttaaaattg gcaggcagat ggcctattac 4860 acatctacac acagataatg gtgctaactt tgcttcgcaa gaagtaaaga tggttgcatg 4920 gtgggcaggg atagagcaca cctttggggt accatacaat ccacagagtc agggagtagt 4980 ggaagcaatg aatcaccacc tgaaaaatca aatagataga atcagggaac aagcaaattc 5040 agtagaaacc atagtattaa tggcagttca ttgcatgaat tttaaaagaa ggggaggaat 5100 aggggatatg actccagcag aaagattaat taacatgatc actacagaac aagagataca 5160 atttcaacaa tcaaaaaact caaaatttaa aaattttcgg gtctattaca gagaaggcag 5220 agatcaactg tggaagggac ccggtgagct attgtggaaa ggggaaggag cagtcatctt 5280 aaaggtaggg acagacatta aggtagtacc cagaagaaag gctaaaatta tcaaagatta 5340 tggaggagga aaagaggtgg atagcagttc ccacatggag gataccggag aggctagaga 5400 ggtggcatag cctcataaaa tatctgaaat ataaaactaa agatctacaa aaggtttgct 5460 atgtgcccca ttttaaggtc ggatgggcat ggtggacctg cagcagagta atcttcccac 5520 tacaggaagg aagccattta gaagtacaag ggtattggca tttgacacca gaaaaagggt 5580 ggctcagtac ttatgcagtg aggataacct ggtactcaaa gaacttttgg acagatgtaa 5640 caccaaacta tgcagacatt ttactgcata gcacttattt cccttgcttt acagcgggag 5700 aagtgagaag ggccatcagg ggagaacaac tgctgtcttg ctgcaggttc ccgagagctc 5760 ataagtacca ggtaccaagc ctacagtact tagcactgaa agtagtaagc gatgtcagat 5820 cccagggaga gaatcccacc tggaaacagt ggagaagaga caataggaga ggccttcgaa 5880 tggctaaaca gaacagtaga ggagataaac agagaggcgg taaaccacct accaagggag 5940 ctaattttcc aggtttggca aaggtcttgg gaatactggc atgatgaaca agggatgtca 6000 ccaagctatg taaaatacag atacttgtgt ttaatacaaa aggctttatt tatgcattgc 6060 aagaaaggct gtagatgtct aggggaagga catggggcag ggggatggag accaggacct 6120 cctcctcctc cccctccagg actagcataa atggaagaga gacctccaga aaatgaagga 6180 ccacaaaggg aaccatggga tgaatgggta gtggaggttc tggaagaact gaaagaagaa 6240 gctttaaaac attttgatcc tcgcttgcta actgcacttg gtaatcatat ctataatcgt 6300 cacggagaca ctctagaggg agcaggagaa ctcattagaa tcctccaacg agcgctcttc 6360 atgcatttca gaggcggatg catccactcc agaatcggcc aacctggagg aggaaatcct 6420 ctctcagcta taccgccctc tagaagcatg ctgtagagca agaaatggag ccagtagatc 6480 ctagactaga gccctggaag catccaggga gtaagcctaa aactgcttgt accaattgct 6540 attgtaaaaa gtgttgcttt cattgccaag tttgtttcac aacaaaagcc ttaggcatct 6600 cctatggcag gaagaagcgg agacagcgac gaagagctca tcagaacagt cagactcatc 6660 aagcttctct atcaaagcag taagtagtac atgtaatgca acctatacaa atagcaatag 6720 tagcattagt agtagcaata ataatagcaa tagttgtgtg gtccatagta atcatagaat 6780 ataggaaaat attaagacaa agaaaaatag acaggttaat tgatagacta atagaaagag 6840 cagaagacag tggcaatgag agtgaaggag aaatatcagc acttgtggag atgggggtgg 6900 agatggggca ccatgctcct tgggatgttg atgatctgta gtgctacaga aaaattgtgg 6960 gtcacagtct attatggggt acctgtgtgg agagaagcaa ccaccactct attttgtgca 7020 tcagatgcta aagcctatga tacagaggta cataatgttt gggccacaca tgcctgtgta 7080 cccacagacc ccaacccaca agaagtagta ttgggaaatg tgacagaaaa ttttaacatg 7140 tggaaaaata acatggtaga tcagatgcat gaggatataa tcagtttatg ggatgaaagc 7200 ctaaagccat gtgtaaaatt aaccccactc tgtgttactt taaattgcac taatttgaat 7260 atcactaaga atactactaa tctcactagt agcagctggg gaatgatgga ggaaggagaa 7320 ataaaaaatt gctctttcta tatcaccaca agcataagaa ataaggtaaa gaaagaatat 7380 gcacttttta atagacttga tgtagtacca gtaaaaaata ctagtaatac taagtatagg 7440 ttaataagtt gtaacacctc agtcattaca caggcctgtc caaaggtatc ctttcagcca 7500 attcccatac attattgtgt cccggctggg tttgcgatac taaagtgtaa caataagaca 7560 ttcaatggat caggaccatg cacaaatgtc agcacagtac aatgtacaca tggaattagg 7620 ccagtggtgt caactcaact gctgttaaat ggcagtctag cagaagaaga catagtaatt 7680 agatctgaag atttcacaga caatgttaaa accataatag tacagctaaa tgaatctgta 7740 gtaattaatt gtacaagacc caacaacaat acaagagaaa ggttatctat aggaccaggg 7800 agagcatttt atgcaagaag aaacataata ggagatataa gacaagcaca ttgtaacatt 7860 agtagagcaa aatggaataa cactttacaa cagatagtta taaaattaag agaaaaattt 7920 aggaataaaa caatagcctt taatcaatcc tcaggagggg acccagaaat tgtaatgcac 7980 agttttaatt gtggagggga atttttctac tgtaatacag cacaactgtt taatagtact 8040 tggaatgttg ctggagggac aaatggcact gaaggaaatg acataatcac actccaatgc 8100 agaataaaac aaattataaa tatgtggcag aaagtaggaa aagcaatgta tgcccctccc 8160 atcacaggac aaattagatg ttcatcaaat attacagggc tgctactaac aagagatgga 8220 ggtaatagta ctgagactga gactgagatc ttcagacctg gaggaggaga tatgagggac 8280 aattggagaa gtgaattata taaatataaa gtagtaagaa ttgaaccaat aggagtagca 8340 cccaccaggg caaagagaag aacagtgcaa agagaaaaaa gagcagtggg aataggagct 8400 gtgttccttg ggttcttggg agcagcagga agcactatgg gcgcagcgtc agtgacgctg 8460 acggtacagg ccaggctatt attgtctggt atagtgcagc agcagaacaa tctgctgagg 8520 gctattgagg cgcaacagaa tatgttgcga ctcacagtct ggggcatcaa gcagctccag 8580 gcaagagtcc tggctctgga aagataccta agggatcaac agctcatggg aatttggggt 8640 tgctctggaa aactcatttg caccacttct gtgccttgga atgttagttg gagtaataaa 8700 tctgtggatg atatttggaa taacatgacc tggatggagt gggaaagaga aattgacaat 8760 tacacagact atatatatga cttacttgaa aaatcgcaaa cccaacaaga aaagaatgaa 8820 aaagaattat tggaattgga taaatgggca agtttgtgga attggtttga cataacaaac 8880 tggctgtggt atataagatt attcataatg atagtaggag gcttgatagg tttaagaata 8940 gtttttgctg tactttctat agtaaataga gttaggcagg gatattcacc attatcgttt 9000 cagaccctcc tcccagcctc gaggggaccc gacaggcccg aaggaacaga agaagaaggt 9060 ggagagagag acagagacag atccggtcca tcagtgaacg gatccttggc acttatctgg 9120 gccgatctgc ggagcctgtg cctcttcagc taccaccgct tgagagactt actcttgatt 9180 gtaacgagga ctgtggaact tctgggacgc agggggtggg aagccctcaa atattggtgg 9240 aatctcctac agtattggag tcaggaacta aagaatagtg ctgttagctt gctacaatat 9300 gggtggagct atttccatga ggcggtccag gccgtctgga gatctgcgac agagactctt 9360 gcgggcgcgt ggggagacgt atgggagact cttaggagag gtggaagatg gatactcgca 9420 atccccagga ggattagaca agggcttgag ctcactctct tgtgagggac agaaatacaa 9480 tcagggacag tatatgaata ctccatggag aaacccagct gaagagagag aaaaattagc 9540 atacagaaaa caaaatatgg atgatataga tgaggaagat gatgacttgg taggggtatc 9600 agtgaggcca aaagttcccc taaaaacaat gagttacaaa ttggcaatag acatgtctca 9660 ttttataaaa gaaaaggggg gactggaagg gatttattac agtgcaagaa gacatagaat 9720 cttagacata tacttagaaa aggaagaagg catcatacca gattggcagg attatacctc 9780 aggaccagga attagatacc caaagacatt tggctggcta tggaaattag tccctgtaaa 9840 tgtatcagat gaggcacagg aggatgagga gcattattta atgcatccag ctcaaacttc 9900 ccagtgggat gacccttggg gagaggttct agcatggaag tttgatccaa ctctggccta 9960 cacttatgag gcatatgtta gatacccaga agagtttgga agcaagtcag gcctgtcaga 10020 ggaagaggtt agaagaaggc taaccgcaag aggccttctt aacatggctg acaagaagga 10080 aactcgctga aacagcaggg actttccaca aggggatgtt acggggaggt actggggagg 10140 agccggtcgg gaacgcccac tttcttgatg tataaatatc actgcatttc gctctgtatt 10200 cagtcgctct gcggagaggc tggcagattg agccctggga ggttctctcc agcactagca 10260 ggtagagcct gggtgttccc tgctagactc tcaccagcac ttggccggtg ctgggcagag 10320 tgactccacg cttgtttgct taaagccctc ttcaataaag ctgccatttt agaagtaagc 10380 tagtgtgtgt tcccatctct cctagccgcc gcctggtcaa ctcggtactc aataataaga 10440 agaccctggt ctgttaggac cctttctgct ttgggaaacc gaagcaggaa aatccctagc 10500 a 10501 <210> 2 <211> 510 <212> PRT <213> Simian-Human immunodeficiency virus <220> <223> gag polyprotein <400> 2 Met Gly Val Arg Asn Ser Val Leu Ser Gly Lys Lys Ala Asp Glu Leu 1 5 10 15 Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Asn Gly Lys Lys Lys Tyr Met Leu Lys 20 25 30 His Val Val Trp Ala Ala Asn Glu Leu Asp Arg Phe Gly Leu Ala Glu 35 40 45 Ser Leu Leu Glu Asn Lys Glu Gly Cys Gln Lys Ile Leu Ser Val Leu 50 55 60 Ala Pro Leu Val Pro Thr Gly Ser Glu Asn Leu Lys Ser Leu Tyr Asn 65 70 75 80 Thr Val Cys Val Ile Trp Cys Ile His Ala Glu Glu Lys Val Lys His 85 90 95 Thr Glu Glu Ala Lys Gln Ile Val Gln Arg His Leu Val Val Glu Thr 100 105 110 Gly Thr Thr Glu Thr Met Pro Lys Thr Ser Arg Pro Thr Ala Pro Ser 115 120 125 Ser Gly Arg Gly Gly Asn Tyr Pro Val Gln Gln Ile Gly Gly Asn Tyr 130 135 140 Val His Leu Pro Leu Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Leu 145 150 155 160 Ile Glu Glu 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Ala Pro Val Pro Ile Pro Phe Ala Ala Ala Gln Gln 370 375 380 Arg Gly Pro Arg Lys Pro Ile Lys Cys Trp Asn Cys Gly Lys Glu Gly 385 390 395 400 His Ser Ala Arg Gln Cys Arg Ala Pro Arg Arg Gln Gly Cys Trp Lys 405 410 415 Cys Gly Lys Met Asp His Val Met Ala Lys Cys Pro Asp Arg Gln Ala 420 425 430 Gly Phe Leu Gly Leu Gly Pro Trp Gly Lys Lys Pro Arg Asn Phe Pro 435 440 445 Met Ala Gln Val His Gln Gly Leu Ile Pro Thr Ala Pro Pro Glu Asp 450 455 460 Pro Ala Val Asp Leu Leu Lys Asn Tyr Met Gln Leu Gly Lys Gln Gln 465 470 475 480 Arg Glu Lys Gln Arg Glu Ser Arg Glu Lys Pro Tyr Lys Glu Val Thr 485 490 495 Glu Asp Leu Leu His Leu Asn Ser Leu Phe Gly Gly Asp Gln 500 505 510 <210> 3 <211> 1060 <212> PRT <213> Simian-Human immunodeficiency virus <220> <223> pol polyprotein <400> 3 Val Leu Glu Leu Trp Glu Arg Gly Thr Leu Cys Lys Ala Met Gln Ser 1 5 10 15 Pro Lys Lys Thr Gly Met Leu Glu Met Trp Lys Asn Gly Pro Cys Tyr 20 25 30 Gly Gln Met Pro Arg Gln Thr Gly Gly Phe Phe Arg Pro Trp Ser Met 35 40 45 Gly 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Val Gly Val Leu Asn Trp Ala Ala Gln Ile Tyr Pro 465 470 475 480 Gly Ile Lys Thr Lys His Leu Cys Arg Leu Ile Arg Gly Lys Met Thr 485 490 495 Leu Thr Glu Glu Val Gln Trp Thr Glu Met Ala Glu Ala Glu Tyr Glu 500 505 510 Glu Asn Lys Ile Ile Leu Ser Gln Glu Gln Glu Gly Cys Tyr Tyr Gln 515 520 525 Glu Gly Lys Pro Leu Glu Ala Thr Val Ile Lys Ser Gln Asp Asn Gln 530 535 540 Trp Ser Tyr Lys Ile His Gln Glu Asp Lys Ile Leu Lys Val Gly Lys 545 550 555 560 Phe Ala Lys Ile Lys Asn Thr His Thr Asn Gly Val Arg Leu Leu Ala 565 570 575 His Val Ile Gln Lys Ile Gly Lys Glu Ala Ile Val Ile Trp Gly Gln 580 585 590 Val Pro Lys Phe His Leu Pro Val Glu Lys Asp Val Trp Glu Gln Trp 595 600 605 Trp Thr Asp Tyr Trp Gln Val Thr Trp Ile Pro Glu Trp Asp Phe Ile 610 615 620 Ser Thr Pro Pro Leu Val Arg Leu Val Phe Asn Leu Val Lys Asp Pro 625 630 635 640 Ile Glu Gly Glu Glu Thr Tyr Tyr Thr Asp Gly Ser Cys Asn Lys Gln 645 650 655 Ser Lys Glu Gly Lys Ala Gly Tyr Ile Thr Asp Arg Gly Lys Asp Lys 660 665 670 Val Lys Val Leu 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Gly Ala Asn Phe Ala Ser Gln Glu Val Lys Met Val 885 890 895 Ala Trp Trp Ala Gly Ile Glu His Thr Phe Gly Val Pro Tyr Asn Pro 900 905 910 Gln Ser Gln Gly Val Val Glu Ala Met Asn His His Leu Lys Asn Gln 915 920 925 Ile Asp Arg Ile Arg Glu Gln Ala Asn Ser Val Glu Thr Ile Val Leu 930 935 940 Met Ala Val His Cys Met Asn Phe Lys Arg Arg Gly Gly Ile Gly Asp 945 950 955 960 Met Thr Pro Ala Glu Arg Leu Ile Asn Met Ile Thr Thr Glu Gln Glu 965 970 975 Ile Gln Phe Gln Gln Ser Lys Asn Ser Lys Phe Lys Asn Phe Arg Val 980 985 990 Tyr Tyr Arg Glu Gly Arg Asp Gln Leu Trp Lys Gly Pro Gly Glu Leu 995 1000 1005 Leu Trp Lys Gly Glu Gly Ala Val Ile Leu Lys Val Gly Thr Asp Ile 1010 1015 1020 Lys Val Val Pro Arg Arg Lys Ala Lys Ile Ile Lys Asp Tyr Gly Gly 1025 1030 1035 1040 Gly Lys Glu Val Asp Ser Ser Ser His Met Glu Asp Thr Gly Glu Ala 1045 1050 1055 Arg Glu Val Ala 1060 <210> 4 <211> 214 <212> PRT <213> Simian-Human immunodeficiency virus <220> <223> vif protein <400> 4 Met Glu Glu Glu Lys Arg Trp Ile Ala Val Pro Thr Trp Arg Ile Pro 1 5 10 15 Glu Arg Leu Glu Arg Trp His Ser Leu Ile Lys Tyr Leu Lys Tyr Lys 20 25 30 Thr Lys Asp Leu Gln Lys Val Cys Tyr Val Pro His Phe Lys Val Gly 35 40 45 Trp Ala Trp Trp Thr Cys Ser Arg Val Ile Phe Pro Leu Gln Glu Gly 50 55 60 Ser His Leu Glu Val Gln Gly Tyr Trp His Leu Thr Pro Glu Lys Gly 65 70 75 80 Trp Leu Ser Thr Tyr Ala Val Arg Ile Thr Trp Tyr Ser Lys Asn Phe 85 90 95 Trp Thr Asp Val Thr Pro Asn Tyr Ala Asp Ile Leu Leu His Ser Thr 100 105 110 Tyr Phe Pro Cys Phe Thr Ala Gly Glu Val Arg Arg Ala Ile Arg Gly 115 120 125 Glu Gln Leu Leu Ser Cys Cys Arg Phe Pro Arg Ala His Lys Tyr Gln 130 135 140 Val Pro Ser Leu Gln Tyr Leu Ala Leu Lys Val Val Ser Asp Val Arg 145 150 155 160 Ser Gln Gly Glu Asn Pro Thr Trp Lys Gln Trp Arg Arg Asp Asn Arg 165 170 175 Arg Gly Leu Arg Met Ala Lys Gln Asn Ser Arg Gly Asp Lys Gln Arg 180 185 190 Gly Gly Lys Pro Pro Thr Lys Gly Ala Asn Phe Pro Gly Leu Ala Lys 195 200 205 Val Leu Gly Ile Leu Ala 210 <210> 5 <211> 112 <212> PRT <213> Simian-Human immunodeficiency virus <220> <223> vpx protein <400> 5 Met Ser Asp Pro Arg Glu Arg Ile Pro Pro Gly Asn Ser Gly Glu Glu 1 5 10 15 Thr Ile Gly Glu Ala Phe Glu Trp Leu Asn Arg Thr Val Glu Glu Ile 20 25 30 Asn Arg Glu Ala Val Asn His Leu Pro Arg Glu Leu Ile Phe Gln Val 35 40 45 Trp Gln Arg Ser Trp Glu Tyr Trp His Asp Glu Gln Gly Met Ser Pro 50 55 60 Ser Tyr Val Lys Tyr Arg Tyr Leu Cys Leu Ile Gln Lys Ala Leu Phe 65 70 75 80 Met His Cys Lys Lys Gly Cys Arg Cys Leu Gly Glu Gly His Gly Ala 85 90 95 Gly Gly Trp Arg Pro Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gly Leu Ala 100 105 110 <210> 6 <211> 101 <212> PRT <213> Simian-Human immunodeficiency virus <220> <223> vpr protein <400> 6 Met Glu Glu Arg Pro Pro Glu Asn Glu Gly Pro Gln Arg Glu Pro Trp 1 5 10 15 Asp Glu Trp Val Val Glu Val Leu Glu Glu Leu Lys Glu Glu Ala Leu 20 25 30 Lys His Phe Asp Pro Arg Leu Leu Thr Ala Leu Gly Asn His Ile Tyr 35 40 45 Asn Arg His Gly Asp Thr Leu Glu Gly Ala Gly Glu Leu Ile Arg Ile 50 55 60 Leu Gln Arg Ala Leu Phe Met His Phe Arg Gly Gly Cys Ile His Ser 65 70 75 80 Arg Ile Gly Gln Pro Gly Gly Gly Asn Pro Leu Ser Ala Ile Pro Pro 85 90 95 Ser Arg Ser Met Leu 100 <210> 7 <211> 102 <212> PRT <213> Simian-Human immunodeficiency virus <220> <223> tat protein <400> 7 Met Glu Pro Val Asp Pro Arg Leu Glu Pro Trp Lys His Pro Gly Ser 1 5 10 15 Lys Pro Lys Thr Ala Cys Thr Asn Cys Tyr Cys Lys Lys Cys Cys Phe 20 25 30 His Cys Gln Val Cys Phe Thr Thr Lys Ala Leu Gly Ile Ser Tyr Gly 35 40 45 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala His Gln Asn Ser Gln Thr 50 55 60 His Gln Ala Ser Leu Ser Lys Gln Pro Ser Ser Gln Pro Arg Gly Asp 65 70 75 80 Pro Thr Gly Pro Lys Glu Gln Lys Lys Lys Val Glu Arg Glu Thr Glu 85 90 95 Thr Asp Pro Val His Gln 100 <210> 8 <211> 116 <212> PRT <213> Simian-Human immunodeficiency virus <220> <223> rev protein <400> 8 Met Ala Gly Arg Ser Gly Asp Ser Asp Glu Glu Leu Ile Arg Thr Val 1 5 10 15 Arg Leu Ile Lys Leu Leu Tyr Gln Ser Asn Pro Pro Pro Ser Leu Glu 20 25 30 Gly Thr Arg Gln Ala Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Trp Arg Glu Arg 35 40 45 Gln Arg Gln Ile Arg Ser Ile Ser Glu Arg Ile Leu Gly Thr Tyr Leu 50 55 60 Gly Arg Ser Ala Glu Pro Val Pro Leu Gln Leu Pro Pro Leu Glu Arg 65 70 75 80 Leu Thr Leu Asp Cys Asn Glu Asp Cys Gly Thr Ser Gly Thr Gln Gly 85 90 95 Val Gly Ser Pro Gln Ile Leu Val Glu Ser Pro Thr Val Leu Glu Ser 100 105 110 Gly Thr Lys Glu 115 <210> 9 <211> 81 <212> PRT <213> Simian-Human immunodeficiency virus <220> <223> vpu protein <400> 9 Met Gln Pro Ile Gln Ile Ala Ile Val Ala Leu Val Val Ala Ile Ile 1 5 10 15 Ile Ala Ile Val Val Trp Ser Ile Val Ile Ile Glu Tyr Arg Lys Ile 20 25 30 Leu Arg Gln Arg Lys Ile Asp Arg Leu Ile Asp Arg Leu Ile Glu Arg 35 40 45 Ala Glu Asp Ser Gly Asn Glu Ser Glu Gly Glu Ile Ser Ala Leu Val 50 55 60 Glu Met Gly Val Glu Met Gly His His Ala Pro Trp Asp Val Asp Asp 65 70 75 80 Leu <210> 10 <211> 869 <212> PRT <213> Simian-Human immunodeficiency virus <220> <223> env polyprotein <400> 10 Met Arg Val Lys Glu Lys Tyr Gln His Leu Trp Arg Trp Gly Trp Arg 1 5 10 15 Trp Gly Thr Met Leu Leu Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Ala Thr Glu 20 25 30 Lys Leu Trp Val Thr Val Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Arg Glu Ala 35 40 45 Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu 50 55 60 Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn 65 70 75 80 Pro Gln Glu Val Val Leu Gly Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp 85 90 95 Lys Asn Asn Met Val Asp Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp 100 105 110 Asp Glu Ser Leu Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Thr 115 120 125 Leu Asn Cys Thr Asn Leu Asn Ile Thr Lys Asn Thr Thr Asn Leu Thr 130 135 140 Ser Ser Ser Trp Gly Met Met Glu Glu Gly Glu Ile Lys Asn Cys Ser 145 150 155 160 Phe Tyr Ile Thr Thr Ser Ile Arg Asn Lys Val Lys Lys Glu Tyr Ala 165 170 175 Leu Phe Asn Arg Leu Asp Val Val Pro Val Lys Asn Thr Ser Asn Thr 180 185 190 Lys Tyr Arg Leu Ile Ser Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys 195 200 205 Pro Lys Val Ser Phe Gln Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Val Pro Ala 210 215 220 Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys Asn Asn Lys Thr Phe Asn Gly Ser Gly 225 230 235 240 Pro Cys Thr Asn Val Ser Thr Val Gln Cys Thr His Gly Ile Arg Pro 245 250 255 Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Asp 260 265 270 Ile Val Ile Arg Ser Glu Asp Phe Thr Asp Asn Val Lys Thr Ile Ile 275 280 285 Val Gln Leu Asn Glu Ser Val Val Ile Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn 290 295 300 Asn Thr Arg Glu Arg Leu Ser Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ala 305 310 315 320 Arg Arg Asn Ile Ile Gly Asp Ile Arg Gln Ala His Cys Asn Ile Ser 325 330 335 Arg Ala Lys Trp Asn Asn Thr Leu Gln Gln Ile Val Ile Lys Leu Arg 340 345 350 Glu Lys Phe Arg Asn Lys Thr Ile Ala Phe Asn Gln Ser Ser Gly Gly 355 360 365 Asp Pro Glu Ile Val Met His Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe Phe 370 375 380 Tyr Cys Asn Thr Ala Gln Leu Phe Asn Ser Thr Trp Asn Val Ala Gly 385 390 395 400 Gly Thr Asn Gly Thr Glu Gly Asn Asp Ile Ile Thr Leu Gln Cys Arg 405 410 415 Ile Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Lys Val Gly Lys Ala Met Tyr 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Thr Phe Gly Trp Leu Trp Lys 165 170 175 Leu Val Pro Val Asn Val Ser Asp Glu Ala Gln Glu Asp Glu Glu His 180 185 190 Tyr Leu Met His Pro Ala Gln Thr Ser Gln Trp Asp Asp Pro Trp Gly 195 200 205 Glu Val Leu Ala Trp Lys Phe Asp Pro Thr Leu Ala Tyr Thr Tyr Glu 210 215 220 Ala Tyr Val Arg Tyr Pro Glu Glu Phe Gly Ser Lys Ser Gly Leu Ser 225 230 235 240 Glu Glu Glu Val Arg Arg Arg Leu Thr Ala Arg Gly Leu Leu Asn Met 245 250 255 Ala Asp Lys Lys Glu Thr Arg 260 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized primer sequence <400> 12 aaaagcggcc gctggaaggg atttattaca gtgc 34 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized primer sequence <400> 13 ccagtactgt aattcttttc ctttt 25 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized primer sequence <400> 14 ccccgaccaa tccatacaac ac 22 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized primer sequence <400> 15 tttgatagag aagcttgatg agtc 24 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized primer sequence <400> 16 gcattgcaag aaaggctgta g 21 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized primer sequence <400> 17 ggcggaattc tgctagggat tttcctgctt cg 32 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized primer sequence <400> 18 aatgcagagc cccaagaaga c 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized primer sequence <400> 19 ggaccaaggc ctaaaaaacc c 21 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: artificially synthesized probe sequence <400> 20 accatgttat ggccaaatgc ccagac 26

【図面の簡単な説明】

【図１】 M8166細胞からのSHIV-C2/1の分子クローニン
グを示す図である。

【図２】 SHIV-C2/1 KS661を接種したカニクイザルに
おけるCD4陽性リンパ球数の減少を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ // Ｇ０１Ｎ 33/569 (Ｃ１２Ｎ 7/00 (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:93）Ｃ１２Ｒ 1:93） (Ｃ１２Ｎ 7/02 (Ｃ１２Ｎ 7/02 Ｃ１２Ｒ 1:93）Ｃ１２Ｒ 1:93）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者本多三男東京都三鷹市下連雀２−５−11 Ｆターム(参考） 2G045 AA29 AA34 AA35 AA40 CB01 CB17 CB21 DA77 4B024 AA01 AA14 CA04 DA02 EA02 GA11 HA11 HA14 HA20 4B065 AA90X AA93Y AA97X AB01 CA45 CA46 CA60

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト免疫不全ウイルスおよびサル免疫不
全ウイルスに由来する単離されたDNAであって、下記
（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNA。（ａ）配列番号：２から１１に記載のアミノ酸配列から
なる全てのタンパク質をコードするDNA。（ｂ）配列番号：１に記載の塩基配列のコード領域を含
む、（ａ）に記載のDNA。（ｃ）配列番号：１に記載の塩基配列において1若しく
は複数の塩基が置換、欠失、付加および／または挿入さ
れた塩基配列を含むDNAであって、（ｉ）その真核生物
細胞への導入および発現により、該細胞の培養上清から
感染性のウイルスを回収することができ、かつ(ii)該ウ
イルスがカニクイザルにおいてCD4陽性リンパ球を減少
させることができる、DNA。
【請求項２】（ｃ）における真核生物細胞が哺乳動物
細胞である、請求項１に記載のDNA。
【請求項３】（ｃ）において回収されるウイルスが10
^３TCID₅₀/ml以上の力価を有する、請求項１に記載のDN
A。
【請求項４】請求項１に記載のDNAの転写産物の塩基
配列をそのゲノムに含む、実質的に純粋なヒト免疫不全
ウイルスおよびサル免疫不全ウイルスのキメラウイル
ス。
【請求項５】請求項４に記載のキメラウイルスの製造
方法であって、（ａ）請求項１に記載のDNAを真核生物
細胞へ導入し、発現させる工程、および（ｂ）該細胞の
培養上清からウイルスを回収する工程、を含む方法。
【請求項６】真核生物細胞が哺乳動物細胞である、請
求項５に記載の方法。
【請求項７】請求項４に記載のキメラウイルスで感染
された非ヒト霊長類。
【請求項８】サルである、請求項７に記載の非ヒト霊
長類。
【請求項９】後天性免疫不全症候群の予防または治療
に有効な薬剤を同定または評価するための、請求項７ま
たは８に記載の非ヒト霊長類の使用。