JP2002027977A - 肝臓細胞培養素材 - Google Patents
肝臓細胞培養素材Info
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- JP2002027977A JP2002027977A JP2000212577A JP2000212577A JP2002027977A JP 2002027977 A JP2002027977 A JP 2002027977A JP 2000212577 A JP2000212577 A JP 2000212577A JP 2000212577 A JP2000212577 A JP 2000212577A JP 2002027977 A JP2002027977 A JP 2002027977A
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- liver cell
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】ガラクトースを提示する容易に調製できる
糖脂質アナログ化合物を、肝臓細胞の培養方法、およ
び、肝臓細胞培養素材に使用する。 【効果】本発明は、容易に調製できる糖脂質アナログ化
合物を用いた肝臓細胞の培養方法、および、容易に調製
できる糖脂質アナログ化合物を有効成分とする肝臓細胞
培養素材を提供する。
糖脂質アナログ化合物を、肝臓細胞の培養方法、およ
び、肝臓細胞培養素材に使用する。 【効果】本発明は、容易に調製できる糖脂質アナログ化
合物を用いた肝臓細胞の培養方法、および、容易に調製
できる糖脂質アナログ化合物を有効成分とする肝臓細胞
培養素材を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、肝臓細胞の培養方
法、および、肝臓細胞培養のための素材に関するもので
ある。
法、および、肝臓細胞培養のための素材に関するもので
ある。
【０００２】より詳細には、本発明は、容易に調製でき
る糖脂質アナログ化合物を用いる肝臓細胞培養法、およ
び、容易に調製できる糖脂質アナログ化合物を有効成分
とする肝臓細胞培養素材に関するものである。
る糖脂質アナログ化合物を用いる肝臓細胞培養法、およ
び、容易に調製できる糖脂質アナログ化合物を有効成分
とする肝臓細胞培養素材に関するものである。
【０００３】
【従来の技術】細胞表層や細胞外マトリックスに、糖脂
質、糖蛋白質等の複合糖質として存在する糖鎖は、細胞
間コミュニケーションを通じて、生命現象に重要な役割
を果たしていると考えられている。
質、糖蛋白質等の複合糖質として存在する糖鎖は、細胞
間コミュニケーションを通じて、生命現象に重要な役割
を果たしていると考えられている。
【０００４】肝臓中の肝実質細胞は類洞内皮細胞の上に
あるディッセ腔と呼ばれるベッドの上に横たわって組織
化している。このディッセ腔には、コラーゲン、フィブ
ロネクチン、ラミニンといった糖蛋白質や、ヘパラン硫
酸、デルマタン硫酸等を持つプロテオグリカン等の細胞
外マトリックスが含まれている。これらの細胞外マトリ
ックスと肝実質細胞が相互作用して、細胞の接着と様々
な情報交換が行われていると考えられている。
あるディッセ腔と呼ばれるベッドの上に横たわって組織
化している。このディッセ腔には、コラーゲン、フィブ
ロネクチン、ラミニンといった糖蛋白質や、ヘパラン硫
酸、デルマタン硫酸等を持つプロテオグリカン等の細胞
外マトリックスが含まれている。これらの細胞外マトリ
ックスと肝実質細胞が相互作用して、細胞の接着と様々
な情報交換が行われていると考えられている。
【０００５】糖鎖を肝臓細胞の培養に利用しようという
試みは、主に糖鎖を結合した高分子を材料として行われ
てきた（例えば、赤池敏宏ら、１１４−１２９ページ、
別冊日経サイエンス１１１「糖鎖と細胞」、入村達郎
編、日経サイエンス社、東京、１９９４年）。しかし、
高分子を用いる場合、糖鎖の密度や提示様式等を制御す
ることは難しい。
試みは、主に糖鎖を結合した高分子を材料として行われ
てきた（例えば、赤池敏宏ら、１１４−１２９ページ、
別冊日経サイエンス１１１「糖鎖と細胞」、入村達郎
編、日経サイエンス社、東京、１９９４年）。しかし、
高分子を用いる場合、糖鎖の密度や提示様式等を制御す
ることは難しい。
【０００６】また、糖脂質をプラスチックディッシュに
コートして用いるという簡便な方法も行われてきた
（Ｒ．Ｌ．Ｓｃｈｎａａｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ．、第１７９巻、５４２−５５８ページ、１９
８９年）。この方法を用いれば、糖鎖の密度はコートす
る糖脂質の濃度として制御することが可能であり、糖鎖
の提示様式は細胞膜表面に類似していると考えられる。
しかし、糖脂質のサンプルを自然界から大量に得ること
は難しく、合成にも多くの工程を要することから、肝臓
細胞培養への応用は、ほとんど検討されてこなかった。
コートして用いるという簡便な方法も行われてきた
（Ｒ．Ｌ．Ｓｃｈｎａａｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ．、第１７９巻、５４２−５５８ページ、１９
８９年）。この方法を用いれば、糖鎖の密度はコートす
る糖脂質の濃度として制御することが可能であり、糖鎖
の提示様式は細胞膜表面に類似していると考えられる。
しかし、糖脂質のサンプルを自然界から大量に得ること
は難しく、合成にも多くの工程を要することから、肝臓
細胞培養への応用は、ほとんど検討されてこなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、容易
に調製できる糖脂質アナログ化合物を用いた肝臓細胞の
培養方法、および、容易に調製できる糖脂質アナログ化
合物を有効成分とする肝臓細胞培養素材を提供すること
にある。
に調製できる糖脂質アナログ化合物を用いた肝臓細胞の
培養方法、および、容易に調製できる糖脂質アナログ化
合物を有効成分とする肝臓細胞培養素材を提供すること
にある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、従来の技
術で問題であった、糖鎖密度の制御や化合物の調製を、
合成の容易な糖脂質アナログを用いることで克服すれ
ば、新たな肝臓細胞の培養方法、および、新たな肝臓細
胞培養の素材を提供できるのではないかと考えた。
術で問題であった、糖鎖密度の制御や化合物の調製を、
合成の容易な糖脂質アナログを用いることで克服すれ
ば、新たな肝臓細胞の培養方法、および、新たな肝臓細
胞培養の素材を提供できるのではないかと考えた。
【０００９】そして、式（１）で示されるガラクトース
を提示する糖脂質アナログをコートしたプラスチックデ
ィッシュ、式（２）で示されるグルコースを提示する糖
脂質アナログ化合物をコートしたもの、式（３）で示さ
れる化合物をコートしたもの、何もコートしないもの
を、肝臓細胞の培養に適用して、式（１）で示される化
合物が、ガラクトース構造特異的に、かつ、コートする
化合物密度依存的に、肝臓細胞のアンモニア分解活性を
向上させることを見出し、本発明を完成するに至った。
を提示する糖脂質アナログをコートしたプラスチックデ
ィッシュ、式（２）で示されるグルコースを提示する糖
脂質アナログ化合物をコートしたもの、式（３）で示さ
れる化合物をコートしたもの、何もコートしないもの
を、肝臓細胞の培養に適用して、式（１）で示される化
合物が、ガラクトース構造特異的に、かつ、コートする
化合物密度依存的に、肝臓細胞のアンモニア分解活性を
向上させることを見出し、本発明を完成するに至った。
【化２】
【化３】
【００１０】式（１）、（２）、（３）で示される化合
物は既に報告した方法（佐藤ら、膜、１９９９年、第１
１号、６９−７２ページ）に従って調製した。
物は既に報告した方法（佐藤ら、膜、１９９９年、第１
１号、６９−７２ページ）に従って調製した。
【００１１】これらの化合物は、エタノールに可溶であ
り、エタノール溶液として、容易に様々な疎水性表面に
コーティングすることができ、細胞培養等に利用するこ
とが可能である。
り、エタノール溶液として、容易に様々な疎水性表面に
コーティングすることができ、細胞培養等に利用するこ
とが可能である。
【００１２】式（１）、（２）、（３）で示される化合
物の一分子当りの分子断面積を用いて、モノレイヤーを
形成するのに必要な化合物量が与えられる。プラスチッ
クディッシュに面積に従って、モノレイヤー形成に相当
する量、あるいは、必要に応じて適当な濃度に調製した
サンプルのエタノール溶液を、プラスチックディッシュ
に添加し、エタノールを揮発させれば、コーティングが
行える。
物の一分子当りの分子断面積を用いて、モノレイヤーを
形成するのに必要な化合物量が与えられる。プラスチッ
クディッシュに面積に従って、モノレイヤー形成に相当
する量、あるいは、必要に応じて適当な濃度に調製した
サンプルのエタノール溶液を、プラスチックディッシュ
に添加し、エタノールを揮発させれば、コーティングが
行える。
【００１３】ラット肝臓初代細胞は、たとえば、コラゲ
ナーゼ灌流法（中村敏一、初代培養肝細胞実験法、５−
１０ページ、学会出版センター、東京、１９８７年）を
用いて採取することができる。肝臓初代細胞の培養に適
した培地を用いて、一定時間培養の後、アンモニア消費
速度等を比較することによって、糖脂質アナログ化合物
の肝臓細胞培養に関する有用性を検討することができ
る。
ナーゼ灌流法（中村敏一、初代培養肝細胞実験法、５−
１０ページ、学会出版センター、東京、１９８７年）を
用いて採取することができる。肝臓初代細胞の培養に適
した培地を用いて、一定時間培養の後、アンモニア消費
速度等を比較することによって、糖脂質アナログ化合物
の肝臓細胞培養に関する有用性を検討することができ
る。
【００１４】実際に、検討を行った結果、式（１）で示
される、ガラクトースを提示する化合物に、糖鎖構造特
異的に、かつ、密度依存的に、肝臓細胞の代謝活性を向
上させる機能があることが見出された。
される、ガラクトースを提示する化合物に、糖鎖構造特
異的に、かつ、密度依存的に、肝臓細胞の代謝活性を向
上させる機能があることが見出された。
【００１５】従って、式（１）で示される化合物を加え
ることにより、肝臓細胞培養が効果的に行えること、お
よび、式（１）で示される化合物は、肝臓細胞培養のた
めの素材の有効成分となりえることが明らかとなった。
ることにより、肝臓細胞培養が効果的に行えること、お
よび、式（１）で示される化合物は、肝臓細胞培養のた
めの素材の有効成分となりえることが明らかとなった。
【００１６】
【発明の実施の形態】以下に、本発明を更に具体的に説
明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１７】
【実施例１】（糖鎖構造がアンモニア消費速度に及ぼす
影響）一分子当りの分子断面積を５０Å2と見積もる
と、３．３×１０-10ｍｏｌ／ｃｍ2でモノレイヤーを形
成するのに必要な化合物量が与えられる。プラスチック
ディッシュに面積に従って、モノレイヤー形成に相当す
る量を、プラスチックディッシュに添加し、一晩、クリ
ーンベンチ内でエタノールを揮発させ、コーティングを
行った。
影響）一分子当りの分子断面積を５０Å2と見積もる
と、３．３×１０-10ｍｏｌ／ｃｍ2でモノレイヤーを形
成するのに必要な化合物量が与えられる。プラスチック
ディッシュに面積に従って、モノレイヤー形成に相当す
る量を、プラスチックディッシュに添加し、一晩、クリ
ーンベンチ内でエタノールを揮発させ、コーティングを
行った。
【００１８】ラット肝臓初代細胞は、８〜１２週齢のウ
イスターラットから、コラゲナーゼ灌流法を用いて採取
した。
イスターラットから、コラゲナーゼ灌流法を用いて採取
した。
【００１９】抗生物質（ペニシリン１００単位／ｍｌ、
ストレプトマイシン０．１ｍｇ／ｍｌ、ＳＩＧＭＡ）、
Ｌ−プロリン０．０３ｇ／ｌ（和光純薬）、アスコルビ
ン酸リン酸０．０８ｇ／ｌ（和光純薬）、インスリン
０．５ｍｇ／ｌ（ＳＩＧＭＡ）、デキサメタゾン３９．
２μｇ／ｌ（和光純薬）、および、ＮａＨＣＯ3３．３
３ｇ／ｌ（和光純薬）を含むダルベッコの改良イーグル
培地（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）に
１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を添加した培地を用
い、初代肝臓細胞の生細胞密度をおよそ１．０×１０5
ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2となるように２１ｃｍ2のディッシュ
に入れ、液量１０ｍｌ、温度３７℃、５％ＣＯ2雰囲気
の条件下で２４時間静置培養した。
ストレプトマイシン０．１ｍｇ／ｍｌ、ＳＩＧＭＡ）、
Ｌ−プロリン０．０３ｇ／ｌ（和光純薬）、アスコルビ
ン酸リン酸０．０８ｇ／ｌ（和光純薬）、インスリン
０．５ｍｇ／ｌ（ＳＩＧＭＡ）、デキサメタゾン３９．
２μｇ／ｌ（和光純薬）、および、ＮａＨＣＯ3３．３
３ｇ／ｌ（和光純薬）を含むダルベッコの改良イーグル
培地（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）に
１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を添加した培地を用
い、初代肝臓細胞の生細胞密度をおよそ１．０×１０5
ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2となるように２１ｃｍ2のディッシュ
に入れ、液量１０ｍｌ、温度３７℃、５％ＣＯ2雰囲気
の条件下で２４時間静置培養した。
【００２０】２４時間静置培養を行った初代肝臓細胞の
培養ディッシュをＰＢＳ（−）５ｍｌで洗浄し、初代肝
臓細胞培養培地４０ｍｌに対し、塩化アンモニウム水溶
液（１１ｇ／ｌ）１ｍｌを添加したアンモニア負荷培地
（アンモニア濃度５ｍＭ）を１０ｍｌ加えて、３７℃、
５％ＣＯ2雰囲気下、８時間培養した。経時的に１ｍｌ
ずつサンプリングし、−２０℃のフリーザーに保存し
た。細胞を入れずに培地のみで２４時間インキュベート
したディッシュにおけるアンモニア減少速度との差を肝
臓細胞によるアンモニア比消費速度として算出した。
培養ディッシュをＰＢＳ（−）５ｍｌで洗浄し、初代肝
臓細胞培養培地４０ｍｌに対し、塩化アンモニウム水溶
液（１１ｇ／ｌ）１ｍｌを添加したアンモニア負荷培地
（アンモニア濃度５ｍＭ）を１０ｍｌ加えて、３７℃、
５％ＣＯ2雰囲気下、８時間培養した。経時的に１ｍｌ
ずつサンプリングし、−２０℃のフリーザーに保存し
た。細胞を入れずに培地のみで２４時間インキュベート
したディッシュにおけるアンモニア減少速度との差を肝
臓細胞によるアンモニア比消費速度として算出した。
【００２１】また、細胞密度に関しては、脱核染色液
（クエン酸２１ｇ／ｌ、クリスタルバイオレット１ｇ／
ｌ）１ｍｌをディッシュに加え、セルスクレーパーで細
胞をはがし、エッペンドルフチューブに移した後、血球
計算盤で測定した。
（クエン酸２１ｇ／ｌ、クリスタルバイオレット１ｇ／
ｌ）１ｍｌをディッシュに加え、セルスクレーパーで細
胞をはがし、エッペンドルフチューブに移した後、血球
計算盤で測定した。
【００２２】図１に示すように、ラット初代肝臓細胞の
アンモニア消費速度は、浮遊細胞ディッシュに比べ、式
（３）で示される化合物をコートしたものでほぼ同等、
式（２）で示されるグルコースを提示する化合物をコー
トしたものでは約０．３倍、式（１）で示されるガラク
トースを提示する化合物をコートしたものでは約１．８
倍であり、接着細胞用ディッシュと比較しても、ほぼ同
等の結果が得られた。
アンモニア消費速度は、浮遊細胞ディッシュに比べ、式
（３）で示される化合物をコートしたものでほぼ同等、
式（２）で示されるグルコースを提示する化合物をコー
トしたものでは約０．３倍、式（１）で示されるガラク
トースを提示する化合物をコートしたものでは約１．８
倍であり、接着細胞用ディッシュと比較しても、ほぼ同
等の結果が得られた。
【００２３】コントロールである浮遊細胞用のディッシ
ュと比較して、式（１）で示される化合物をコートした
ものでアンモニア消費速度が高いことから、式（１）で
示される化合物が肝臓細胞培養に有効であることが示さ
れた。
ュと比較して、式（１）で示される化合物をコートした
ものでアンモニア消費速度が高いことから、式（１）で
示される化合物が肝臓細胞培養に有効であることが示さ
れた。
【００２４】
【実施例２】（糖鎖密度がアンモニア消費速度に及ぼす
影響）式（１）で示される化合物のコーティング濃度依
存性を調べ、接着細胞用ディッシュ以上の効果が見られ
るかを検討するために、実施例１で用いた濃度、および
その１／４、１／１０の濃度で、式（１）で示される化
合物を接着細胞用プラスチックディッシュにコーティン
グし、ラット初代肝臓細胞を約２４時間接着させた後、
アンモニア比消費速度を調べた。
影響）式（１）で示される化合物のコーティング濃度依
存性を調べ、接着細胞用ディッシュ以上の効果が見られ
るかを検討するために、実施例１で用いた濃度、および
その１／４、１／１０の濃度で、式（１）で示される化
合物を接着細胞用プラスチックディッシュにコーティン
グし、ラット初代肝臓細胞を約２４時間接着させた後、
アンモニア比消費速度を調べた。
【００２５】図２に示すように、１／４、１／１０の濃
度でコーティングしたディッシュの方が、モノレイヤー
にコーティングしたもの、および、何もコーティングし
ていないものに比べ、約５０％のアンモニア比消費速度
の増大を見せ、効果の濃度依存性が確認できたばかりで
なく、接着細胞用ディッシュよりも効果があることが確
認できた。
度でコーティングしたディッシュの方が、モノレイヤー
にコーティングしたもの、および、何もコーティングし
ていないものに比べ、約５０％のアンモニア比消費速度
の増大を見せ、効果の濃度依存性が確認できたばかりで
なく、接着細胞用ディッシュよりも効果があることが確
認できた。
【００２６】
【発明の効果】本発明は、容易に調製できる糖脂質アナ
ログ化合物を用いた肝臓細胞の培養方法、および、容易
に調製できる糖脂質アナログ化合物を有効成分とする肝
臓細胞培養素材を提供する。
ログ化合物を用いた肝臓細胞の培養方法、および、容易
に調製できる糖脂質アナログ化合物を有効成分とする肝
臓細胞培養素材を提供する。
【図１】糖鎖構造に依存した肝臓細胞活性化を示す図で
ある。
ある。
【図２】糖鎖密度に依存した肝臓細胞活性化を示す図で
ある。
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:89）
Claims (2)
- 【請求項１】式（１）で示される化合物を用いる肝臓細
胞培養法。 【化１】 - 【請求項２】式（１）で示される化合物を有効成分とす
る肝臓細胞培養素材。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000212577A JP2002027977A (ja) | 2000-07-13 | 2000-07-13 | 肝臓細胞培養素材 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000212577A JP2002027977A (ja) | 2000-07-13 | 2000-07-13 | 肝臓細胞培養素材 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002027977A true JP2002027977A (ja) | 2002-01-29 |
Family
ID=18708485
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000212577A Pending JP2002027977A (ja) | 2000-07-13 | 2000-07-13 | 肝臓細胞培養素材 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002027977A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007301029A (ja) * | 2006-05-09 | 2007-11-22 | Tokyo Medical & Dental Univ | 細胞固定化基材被覆膜用材料 |
| JP2011036207A (ja) * | 2009-08-17 | 2011-02-24 | Hokkaido Univ | 軟骨細胞培養基材及び培養方法 |
-
2000
- 2000-07-13 JP JP2000212577A patent/JP2002027977A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007301029A (ja) * | 2006-05-09 | 2007-11-22 | Tokyo Medical & Dental Univ | 細胞固定化基材被覆膜用材料 |
| JP2011036207A (ja) * | 2009-08-17 | 2011-02-24 | Hokkaido Univ | 軟骨細胞培養基材及び培養方法 |
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