JP2001522229A

JP2001522229A - Antioxidant protein 2, genes and methods of using them

Info

Publication number: JP2001522229A
Application number: JP53515698A
Authority: JP
Inventors: ペイジエン，ビバリー; ベイアー，デイビツド・アール
Original assignee: ザ・ジヤクソン・ラボラトリー; ザ・ブリガム・アンド・ウイメンズ・ホスピタル・インコーポレーテツド
Priority date: 1997-04-02
Filing date: 1998-04-01
Publication date: 2001-11-13
Also published as: EP1005360A4; CA2285631A1; WO1998043666A1; EP1005360A1

Abstract

(57)【要約】本発明は今回抗酸化剤タンパク質２と称した新規な遺伝子及びタンパク質（それぞれ、Ａｏｐ２及びＡＯＰ２）の同定に関する。研究から、Ｌｔｗ４及びＡｏｐ２が単一の遺伝子であることが示される。さらに、Ａｏｐ２はアテローム性動脈硬化疾患の素因のマウスにおけるＡｔｈ１形質を招く遺伝子でもあるようである。この遺伝子のヒト相同物も同定されている。この発見によりＡＯＰ２及び対応する遺伝子の様々な使用、例えば、アテローム性動脈硬化症及び関連疾患状態の診断及び処置に用いることができる試薬の開発（抗体、発現ベクター、細胞系、コンジェニック及びトランスジェニックマウス）が可能になる。 (57) SUMMARY The present invention relates to the identification of novel genes and proteins ( Aop2 and AOP2, respectively), now referred to as antioxidant protein 2. Studies indicate that Ltw4 and Aop2 are single genes. Furthermore, AOP2 appears to be also a gene lead to At h1 traits in mice predisposition to atherosclerotic disease. Human homologs of this gene have also been identified. This discovery has led to the development of reagents that can be used for various uses of AOP2 and the corresponding genes, for example, in the diagnosis and treatment of atherosclerosis and related disease states (antibodies, expression vectors, cell lines, congenic and transgenic). Mouse) becomes possible.

Description

【発明の詳細な説明】抗酸化剤タンパク質２、遺伝子及びそれらの使用方法発明の背景政府は国立衛生研究所からの以下の助成：ＨＬ−３２０８７及びＤＫ−４５６３９下の本出願またはそれについて発行されるあらゆる特許に権利を所することができる。Ｉ．発明の分野本発明は医薬品、分子生物学及び生化学の分野に関する。より具体的には、本発明は心臓発作及び脳卒中を導く可能性がある臨床的に重要な疾患のアテローム性動脈硬化症に関係する遺伝子のクローニング、分析及び使用に関する。特に、本発明は一つの態様として新規な遺伝子及び遺伝子産物、それぞれ、Ａｏｐ２及びＡＯＰ２に、そしてアテローム性動脈硬化症に対する防護の抗酸化剤としてのＡＯＰ２の新規な役割に関する。 II．関連する技術分野アテローム性動脈硬化症は米国における死亡の主な原因である心疾患の主要な寄与原因である。それはアテロームと呼ばれる盛り上がった内膜の繊維脂肪斑の形成を特徴とし、それらは動脈管腔を狭くし、基礎をなす媒質に損傷を与え、そして石灰沈着、上に血栓形成を有する潰瘍化及び斑内出血を初めとする追加した合併症を被る傾向がある。これらの斑の中心はしばしば顕著にコレステロール及びコレステロールエステルを含有する脂質に富んだ残骸を含む。アテローム性動脈硬化症は冠状動脈並びに脳及び心臓への動脈供給を好むためにかなりの医学的重要性を得ている。冠状動脈のアテローム包含は心疾患の主要な型、すなわち、虚血性心疾患としても知られている冠動脈性心疾患を引き起こし、その最も重要な型は心筋梗塞症である。虚血性心疾患は全ての型の心疾患の約９０％に相当し、心筋梗塞症はアテローム性動脈硬化症を起こしやすい集団における死亡の最も一般的な原因である。アテローム性動脈硬化症は北米、欧州及びソビエト連邦の個体群間で事実上遍在する。それに反して、中南米、アフリカ、アジア及び東洋では罹患率がかなり低い。虚血性心疾患での最も高い死亡率を有するフィンランドと日本の比較は１０倍以上の差を示す。米国は虚血性心疾患での死亡率の上位１０位中を占めている。遺伝的素因が存在することは明らかであるが、診断及び処置の主な焦点は環境の影響、特に喫煙、定住性生活様式、肥満、高血圧、飲食物及び血漿コレステロールレベルに関係する。血漿中のコレステロールの高いレベルは心疾患の増加した危険を有することはよく知られている。しかしながら、このコレステロールは低密度リポタンパク質（ＬＤＬ−Ｃ）及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ−Ｃ）の両方中に保有される。心疾患に対する増加した危険を有するものはＬＤＬ−Ｃのレベルであり；ＨＤＬ−Ｃの高いレベルは実際にはアテローム性動脈硬化症及び心疾患から防御する。高いＬＤＬ−Ｃがどのようにして動脈においてアテローム性動脈硬化の形成をもたらすかという機構を理解するためには、アテローム性動脈硬化斑の前駆体である線状脂肪沈着の形成における最も初期の事象を調べなければならない。線状脂肪沈着の形成の第一段階は動脈の内皮細胞層の下の泡沫細胞の蓄積である。泡沫細胞は脂肪で満たされた単球由来のマクロファージであり、これらの細胞は線状脂肪沈着における主要な細胞型である。泡沫細胞の形成をもたらす重要な段階はＬＤＬ−Ｃの酸化である（Ｓｔｃｉｎｂｅｒｇ等、１９８９；Ｎｅｔｔｏ等、１９９６；Ｗｉｔｚｕｍ＆Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ、１９９１により概説される）。マクロファージは主として酸化されたＬＤＬを取り込み、従って、泡沫細胞及び線状脂肪沈着の形成をもたらすものは酸化されたＬＤＬである。ビタミンＥのような食物抗酸化剤または体の中の天然抗酸化剤はＬＤＬを酸化から防御することができるはずである。また、ＨＤＬ−ＣもＬＤＬ−Ｃを酸化から防御するが（Ｂａｎｋａ、１９９６により概説される）、その過程でＨＤＬ自体が酸化されるようになる。酸化されると、ＨＤＬは血漿中の脂質過酸化生成物の大部分を保有し（Ｂｏｗｒｙ等、１９９２；Ｈａｈｎ等、１９９４）、そのアポタンパク質は酸化的損傷により架橋される（Ｍａｒｃｅｌ等、１９８９）。この損傷を受け且つ酸化されたＨＤＬは本来のＨＤＬより迅速に血漿から取り除かれる（Ｇｕｅｒｔｉｎ等、１９９４；Ｓｅｎａｕｌｔ等、１９９０）。ＨＤＬがＬＤＬを酸化から防御する結果、ＬＤＬの非常に少量の酸化が起こっている場合には比較的高い血漿ＨＤＬをもたらすが、より多くの酸化が起こっている場合、ＨＤＬは酸化されるようになり、より迅速に血漿から取り除かれ、ＨＤＬの血漿レベルは減少する。アテローム性動脈硬化症はヒト集団に特有ではない。Ａｔｈ１はマウスの近交系間で高密度リポタンパク質コレステロールの濃度及びアテローム性動脈硬化症への感受性に影響を及ぼす以前に記述された遺伝子座である。アテローム性動脈硬化症感受性対立遺伝子は系統Ｃ５７ＢＬ／６Ｊにより保有され、耐性対立遺伝子は系統Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ及びＢＡＬＢ／ｃＪにより保有される。Ａｔｈ１の感受性表現型は、高脂肪及び高コレステロール食餌を与えられた雌性マウスの血漿における比較的低い濃度（３５−４５ｍｇ／ｄｌ）の高密度リポタンパク質−コレステロール（ＨＤＬ）及び大動脈に沿った多数の場所での線状脂肪沈着損傷の発生を特徴とする（Ｐａｉｇｅｎ、１９８５）。これらの線状脂肪沈着は最終的に成熟したアテローム性動脈硬化斑に発達する（Ｐａｉｇｅｎ等、１９９０）。系統ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ３Ｈに見いだされるＡｔｈ１の耐性表現型は、アテローム形成食餌をマウスに与える場合に、より高い濃度（６０−９０ｍｇ／ｄｌ）の血漿ＨＤＬ及び大動脈における線状脂肪沈着損傷の欠如を特徴とする。Ａｔｈ１表現型は系統Ｃ５７ＢＬ／６とＣ３Ｈの間及び同様に系統Ｃ５７ＢＬ／６とＢＡＬＢ／ｃの間の単一の遺伝子の違いによりもたらされる。この結論は最初に組み換え近系（ＲＩ）系ＢＸＨ及びＣＸＢの試験に基づき（Ｐａｉｇｅｎ、１９８７ａ）、そしてＣ５７ＢＬ／６と２つの耐性系統間の戻し交配により確かめられた（Ｐａｉｇｅｎ、１９８７ｂ、１９８７ｃ）。Ａｔｈ１はアポリポタンパク質ＡII（ａｐｏａ２）の遺伝子から６ｃＭの距離でマウス第１染色体の末端部に位置した。ＢＡＬＢ／ｃからのａｐｏＡII遺伝子を保有するがＢ６からのＡｔｈ１感受性遺伝子を保有しないコンジェニック系統Ｂ６．Ｃ−Ｈ２５^c／Ｂｙの分析により示されるように、Ａｔｈ１はＡｐｏａ２から明らかに離れている（Ｐａｉｇｅｎ、１９８７ａ）。Ａｔｈ１はヒトにおいて染色体１ｑ２４−２５に相同な領域に位置する。この有用な情報にもかかわらず、アテローム性動脈硬化疾患におけるこの遺伝子の役割に関して直接分かっていることはほとんどない。遺伝子の正体が分からないだけでなく、その機能も単に推論的なままである。結果として、Ａｔｈ１と心疾患との椴能的関連を樹立する証拠及びＡｔｈ１の遺伝子産物の構造特質に関する情報に対するかなりの必要性が本分野においてある。発明の要約それ故、アテローム性動脈硬化疾患におけるＡｔｈ１遺伝子の役割に関するさらなる情報を提供することが本発明の目的である。Ａｔｈ１関連疾患状態の診断及び処置に用いるための組成物及び方法を提供することは本発明のもう一つの目的である。また、Ａｔｈ１と関係する病理学的状態に取り組むためにそれに関連する機能を刺激するかまたは抑制することができる試薬を開発することも本発明の目的である。これらの目的を満たすために、ＡＯＰ２と称する単離されたポリペプチドが提供される。そのポリペプチドはあらゆる種、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトまたはマウスからであってもよい。一つの特定の態様として、ポリペプチドは配列番号：２に記述される配列を有する。別の特定の態様として、ポリペプチドは配列番号：４に記述される配列を有する。別の態様として、Ａｏｐ２ポリペプチドまたはそのフラグメント及び製薬学的に許容しうるバッファーまたは希釈剤を含んでなる抗原組成物が提供される。再び、ポリペプチドはヒトまたはマウスであってもよく、より具体的にはそれぞれ配列番号：２または配列番号：４の配列から得ることができる。さらに別の態様として、ＡＯＰ２ポリペプチドをコードする核酸が提供される。核酸は他の哺乳類及び非哺乳類ポリペプチドの中でヒトポリペプチドまたはマウスポリペプチドをコードすることができる。核酸は配列番号：２または配列番号：４のポリペプチドをコードすることができ、より具体的には、核酸は配列番号：１または配列番号：３に記述される配列を有することができる。なおさらに別の態様として、配列番号：１または配列番号：３に記述される核酸配列の少なくとも約１０連続塩基を含んでなるオリゴヌクレオチドが提供される。オリゴヌクレオチドはより長く、例えば、配列番号：１または配列番号：３に記述される核酸の少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０連続塩基であってもよい。さらになおさらなる態様として、（ｉ）患者からサンプルを取り；そして（ii ）ＡＯＰ２ポリペプチドの存在に関して該サンプルを評価することを含んでなる、該患者におけるアテローム性動脈硬化損傷の素因の診断方法が提供される。心臓、動脈、静脈、皮膚、筋肉、顔、脳、前立腺、胸、子宮内膜、肺、膵臓、小腸、血液細胞、肝臓、精巣、卵巣、結腸、皮膚、胃、食道、脾臓、リンパ節、骨髄または腎臓、リンパ液、腹水、漿液、胸膜滲出液、痰、脳脊髄液、涙液、便及び尿よりなる群からサンプルを選択することができる。患者はヒトであってもよい。評価は該サンプルのＡＯＰ２ポリペプチドの抗酸化剤活性を測定すること、該サンプルの細胞中のＡＯＰ２ポリペプチドのレベルを測定することまたはＡＯＰ２ポリペプチドをコードする該サンプルからの核酸の配列を決定することを含んでなることができる。測定は定量的ＰＣＲまたはＡＯＰ２ポリペプチドに免疫学的に結合する抗体と該サンプルを接触させることを含んでなることができる。さらになおさらなる態様として、（ｉ）抗酸化剤活性を有するＡＯＰ２ポリペプチドを準備し；（ii）該ＡＯＰ２ポリペプチドを候補刺激剤と接触させ；そして（iii）該候補刺激剤の有無で該ＡＯＰ２ポリペプチドの抗酸化剤活性を測定することを含んでなる、ＡＯＰ２刺激活性に関する化合物のスクリーニング方法が提供される。さらに別の態様として、（ｉ）活性ＡＯＰ２ポリペプチドをコードする核酸を含んでなる細胞を準備し；（ii）該細胞を候補刺激剤と接触させ；そして（iii ）該候補刺激剤の有無で該細胞における抗酸化剤活性を測定することを含んでなる、抗酸化剤刺激活性に関する化合物のスクリーニング方法が提供される。なおさらに別の態様として、（ｉ）脂質を準備し；（ii）該脂質を候補抗酸化剤と接触させ；そして（iii）該脂質の酸化状態を測定することを含んでなる、抗アテローム動脈硬化活性に関する化合物のスクリーニング方法が提供される。さらになお他の態様として、ＡＯＰ２ポリペプチドに免疫学的に結合するモノクローナル抗体及び抗体がＡＯＰ２ポリペプチドに免疫学的に結合するポリクローナル抗血清が提供される。なおさらなる態様は、核酸がプロモーターに対して機能的に配置された、ＡＯＰ２ポリペプチドをコードする該核酸を含んでなる発現ベクター及び核酸がプロモーターに対して機能的に配置された、ＡＯＰ２ポリペプチドをコードする該核酸を含んでなる組み換え宿主細胞を含む。なおさらなる態様として、（ｉ）抗酸化剤活性を有するＡＯＰ２ポリペプチドをコードする核酸を準備し、該核酸がプロモーターに対して機能的に配置され；そして（ii）該核酸を取り込ませる条件下で該核酸を細胞と接触させることを含んでなる、該細胞におけるＡＯＰ２機能を高めるための方法が提供される。ＡＯＰ２ポリペプチドは例えば配列番号：２に記述されるようなヒトポリペプチドであってもよい。核酸はさらに発現ベクターを含んでなることができ、発現ベクターはリポソーム中に包膜化されていてもよい。発現ベクターはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターのようなウイルスベクターであってもよい。細胞はヒト患者中、実験動物中に位置してもよい。核酸を静脈内に投与してもよい。プロモーターはＣＭＶ、ＲＳＶまたはＥ１Ａであってもよい。別の態様として、抗酸化剤組成物と化合物を患者に投与することを含んでなる、該患者におけるアテローム性動脈硬化損傷を減じる方法が提供される。抗酸化剤は脂質を直接防御するようにまたは実際には脂質組成物を酸化する可能性がある遊離基を分解し、それにより間接的に脂質を防御するように機能する可能性があると認められる。図面の簡単な説明以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明のある態様をさらに示すために含まれる。本明細書に示される特定の態様の詳細な説明と組み合わせて１つまたはそれ以上のこれらの図面を参照することにより本発明をよりよく理解することができる：図１：ＬＴＷ４タンパク質アイソフォーム．Ｃ５７ＢＬ／６（上のパネル）及びＤＢＡ／２（下のパネル）からの肝臓ホモジェネートの銀染色した２次元電気泳動ゲルの対応する領域を示す。ＬＴＷ４のＣ５７ＢＬ／６アイソフォームは２６ｋＤのＭＷ及び５．９のｐＩを有する。ＬＴＷ４のＤＢＡ／２アイソフォームは２６ｋＤのＭＷ及び５．６のｐＩを有する。図２：Ａｏｐ２の共通配列．（ボールド体で示される）ヌクレオチド３８９はＤＢＡ／２Ｊ、Ｃ３Ｈ及びＢＡＬＢ／ｃではアデニンであり、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊではシトシンである。この多型ヌクレオチドを含有するコドンはＤＢＡ／２Ｊではアスパラギン酸に、そしてＣ５７ＢＬ／６Ｊではアラニンに対応する。マイクロシークエンス分析により得られたＮ末端アミノ酸配列に下線を引く。図３Ａ＆３Ｂ：Ａｏｐ２のＳＳＣＰマッピング分析．（図３Ａ）Ａｏｐ２の３ ’ＵＴＲから得られたＳＳＣＰを用いた親系統コントロール及びＢＳＳ種間交配からの２２子孫からのゲノムＤＮＡの分析。これは（Ｃ５７ＢＬ／６ＪＸＭ．ｓｐｒｅｔｕｓ）Ｆ１ＸＭ．ｓｐｒｅｔｕｓ戻し交配であるので、全ての子孫は少なくとも１つのＭ．ｓｐｒｅｔｕｓ対立遺伝子を保有する。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ対立遺伝子も保有するヘテロ接合体に印をつける。Ｂ：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊコントロール；Ｓ；Ｍ．ｓｐｒｅｔｕｓコントロール；Ｈ：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｍ．ｓｐｒｅｔｕｓヘテロ接合体。（図３Ｂ）ＢＳＳ交配におけるＡｏｐ２の位置を左側に示し、それを右側の第１染色体共通地図¹⁰上のＬｔｗ４の位置と比較する。遺伝子座間距離はｃＭ単位で示される。Ａｐｏａ２：アポリポタンパク質ＡII 。図４：マウス抗酸化剤タンパク質のアミノ酸類似性．Ｂｌｏｃｋｓプログラム（ｈｔｔｐ：//ｗｗｗ．ｂｌｏｃｋｓ．ｆｈｃｒｃ．ｏｒｇ¹⁸）を用いてマウス抗酸化剤タンパク質ファミリーの４つのメンバーを分析した。保存されたアミノ酸の３つのドメインが同定され、それらを示す。アミノ酸同一性をボールド体で示す。ＴＳＡファミリーの大部分のメンバーに保存されている２個のシステインに星印をつけ；２番目のシステインはＡＯＰ２またはそのヒト相同物に存在しない。図５：マウス第１染色体の高解像度地図．多型マーカーを示す。図６：（Ａ）マウスＡｏｐ２遺伝子のゲノム構造．エキソンを箱により表し；肉細部分は非翻訳領域を示し、肉太部分はコーディング領域を示す。エキソン及びイントロンの大きさの相対的割合を示す。５個のエキソン及び４個のイントロンが約１０．７ｋｂに及ぶ。（Ｂ）エキソン及びイントロンの大きさ並びにスプライス連結部配列．図７：マウスＡｏｐ２遺伝子の５’隣接領域のヌクレオチド配列．ヌクレオチド位直＋１はマウスｍＧＰｘｃＤＮＡ（Ｍｕｎｚ等、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２６：５７９−５８５（１９９７）の５’末端に対応し、マイナス数字は５’隣接配列をさす。翻訳開始コドンＡＴＧに下線を引き、推定上の転写因子結合部位を四角に囲む。図８：（Ａ）Ａｏｐ２ヌクレオチド配列とＡｏｐ２−ｒｓ１及びＡｏｐ２−ｒｓ２のものとの整列．報告される配列はＡｏｐ２の対応するコーディング領域に及ぶ。矢印は翻訳の開始を示す。ダッシュはＡｏｐ２とのヌクレオチド同一性を表し；点は配列中のギャップを表す。（Ｂ）Ａｏｐ２−ｒｓ１及びＡｏｐ２−ｒｓ２によりコードされる予測アミノ酸配列とＡｏｐ２タンパク質の整列．ダッシュはＡｏｐ２とのアミノ酸同一性を表す。好ましい態様の詳細な説明Ｉ．本発明本発明はＡｏｐ２と称した新規な遺伝子の同定に関し、それは以前に記述されたアテローム性動脈硬化症感受性遺伝子座、Ａｔｈ１に位置する。今回ＡＯＰ２と称したＡｏｐ２遺伝子産物は抗酸化剤であり、抗酸化剤タンパク質の高度に相関するファミリーに属する。本発明者等はマウス系統間でアテローム性動脈硬化症感受性の違いを招くＡｔｈ１の２つの異なる対立遺伝子を同定した。感受性及び耐性マウス系統からのＡｏｐ２ｃＤＮＡのシークエンシングにより、２つの対立遺伝子の配列中の単一の塩基対の違いを同定した。本発明者等はさらにＡｏｐ２遺伝子の構造を決定した。近交マウス系統Ｃ３Ｈ及びＢＡＬＢ／ｃにより保有されるＡｔｈ１耐性対立遺伝子は抗酸化剤として十分に機能するＡＯＰ２タンパク質をコードするはずであり、一方、系統Ｃ５７ＢＬ／６により保有されるＡｔｈ１感受性対立遺伝子は抗酸化剤としてあまり十分に機能しないＡＯＰ２タンパク質をコードするはずであり、より多くのＬＤＬが酸化され、より多くの泡沫細胞が形成し、より多くの線状脂肪沈着が起こり、そしてより多くのＨＤＬ−Ｃに酸化生成物で損傷を与え、従って、血漿におけるＨＤＬのより迅速なクリアランス及びより低いＨＤＬレベルをもたらす。他の態様として、表現型の違いがＡｏｐ２発現の違いにも起因する可能性があり、タンパク質構造だけではないことが示された。より具体的には、新たな実施例７において説明されるデータはＡｏｐ２ｍＲＮＡレベルの違いを示す。実施例８はプロモーター領域中の潜在的に重要な調節成分を含むゲノム配列情報を開示する。１０００匹以上のマウスの高解像度マッピング交配を用いて、本発明者等は、遺伝子座Ｄ１Ｍｉｔ４２４との明らかな組み換え体なしに、アテローム性動脈硬化症感受性遺伝子座Ａｔｈ１を位置付け、マウス第１染色体上の遺伝子領域を狭めることができた。交配はアテローム性動脈硬化症に感受性である系統Ｃ５７ＢＬ／６とＣ５７ＢＬ／６にアテローム性動脈硬化症耐性系統Ｓｐｒｅｔｕｓを数世代戻し交配することにより構築したコンジェニック系統の間であった。コンジェニック系統は少なくともマーカーＤ１Ｍｉｔ１４からＤ１Ｍｉｔ１５までに及ぶ第１染色体上のＳｐｒｅｔｕｓ遺伝子の小さい領域を除いて大部分はＣ５７ＢＬ／６遺伝子を保有する。Ｃ５７ＢＬ／６とＣ５７ＢＬ／６．Ｓｐ−Ａｔｈ１ ^rと命名されたコンジェニック系統の間の交配からのヘテロマウスをＣ５７ＢＬ／６に交配させた。得られた戻し交配子孫を大動脈におけるそれらの線状脂肪沈着損傷の大きさに関して表現型分類し、マウス第１染色体の関係のある領域中の遺伝子座に関して遺伝型分類した。このように、Ａｔｈ１を非常に小さい領域に狭めた。この領域に位置する１つの遺伝子は、以前に２次元ゲル電気泳動を用いて変異体（ｖａｒｉａｎｔ）ポリペプチドにより同定されたＬｔｗ４である（Ｅｌｌｉｏｔｔ、１９７９ａ；Ｅｌｌｉｏｔｔ、１９７９ｂ；Ｅｌｌｉｏｔｔ等、１９８０）。このタンパク質は肝臓において発現され、２０−３０ｋＤの分子量を有する。本発明者等は分析及び分取２次元ゲル電気泳動を用い、ＬＴＷに元来記述されたもの（Ｉａｋｏｕｂｏｖａ等、１９９７）に類似したパターンで系統Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２の間で等電点が異なる２６ｋＤポリペプチドの変異体を同定した。マイクロシークエンシングによりＮ末端アミノ酸配列を得、全長コーディング配列に相当する重複する発現配列標識（ＥＳＴ）を同定した。一本鎖構造多型（ＳＳＣＰ）を用いた遺伝子のマッピングにより同一性を確認し；地図位置は以前にＬｔｗ４に記述されたものに一致した。次に、この遺伝子をＡｔｈ１の高解像度マッピングのために用いた同じマウスにおいて位置付け；この遺伝子とＡｔｈ１の間で組み換え体は見いだされず、Ａｔｈ１とＬｔｗ４が同じものであることを強く示唆した。Ｌｔｗ４に相当するｃＤＮＡはシークエンスされ、酸化的ストレスにより引き起こされる損傷から保設するチオール特異的抗酸化剤として特性化されたタンパク質の種類に相同性を有することが見いだされた（Ｃｈａｅ等、１９９４）。また、マウスＭＥＲ５遺伝子もこの遺伝子ファミリーのメンバーであり（Ｙａｍａｍｏｔｏ等、１９８９）、最近、その機能的特性化に基づいて抗酸化剤タンパク質１またはＡｏｐ１と改名されている（Ｔｓｕｊｉ等、１９９５）。従って、本発明者等は、Ｌｔｗ４遺伝子を抗酸化剤タンパク質２またはＡｏｐ２と称し、対応するタンパク質をＡＯＰ２と称することを提案する。Ａｏｐ２のｃＤＮＡをアテローム性動脈硬化耐性及び感受性系統からシークエンスし、サブセットが単一塩基のヌクレオチド３８９で異なることが見いだされ、それは残基１２４のアミノ酸変異に対応する。この残基はアテローム性動脈硬化症に感受性であるＣ５７ＢＬ／６マウスではアミノ酸アラニンであり、アテローム性動脈硬化症に耐性であるＣ３Ｈマウスではアスパラギン酸である。このアミノ酸変異はＬＴＷ４に見られる違いに一致する等電点の変化をもたらす。従って、本発明者等は、Ａｔｈ１によりもたらされるアテローム性動脈硬化症感受性の違いが耐性と感受性の系統間で異なる抗酸化剤タンパク質ＡＯＰ２により決定されることを提示する。この提示は（ｉ）高解像度マッピング交配におけるＡｔｈ１とＡｏｐ２の一致、（ii）Ａｔｈ１感受性及びＡｔｈ１耐性系統間で異なるｃＤＮＡの単離及びシークエンシング、（iii）それぞれのタンパク質産物が感受性と耐性系統間で１アミノ酸異なるという結果、並びに（iv）血漿リポタンパク質の酸化がアテローム性動脈硬化過程において主として重要であることを考慮した、アテローム性動脈硬化症において重要な役割を有する抗酸化剤の生物学的妥当性（ｐｌａｕｓａｂｉｌｉｔｙ）に基づく。ＡＯＰ２が耐性及び感受性系統間で機能が異なるという仮説は、酸化されたＬＤＬがより多くの泡沫細胞を形成させ、従って、より多くの線状脂肪沈着を起こさせるということに信憑性を与える。ＨＤＬはＬＤＬを酸化から防御し、そしてＨＤＬが酸化生成物により損傷を受けるようになると、それは血漿からより容易に取り除かれる。重要なことに、Ａｔｈ１耐性及び感受性系統の間の主要な違いは脂肪損傷の大きさ及び血漿ＨＤＬのレベルにおいてである。アテローム性動脈硬化症に寄与する因子としてＡｏｐ２遺伝子を同定すると、多数の異なる用途が可能になる。例えば、この遺伝子の異常をスクリーニングすることにより、今度は遺伝子またはタンパク質レベルでアテローム性動脈硬化疾患の素因を確かめることが可能である。さらに、抗酸化剤活性とこの遺伝子の関連は、インビボで抗酸化剤活性を調節する化合物をスクリーニングするためにＡｔｈ１マウス系統を用いることを示唆する。また、酸化的損傷、アテローム性動脈硬化症及び心疾患の処置においてタンパク質及びＤＮＡ組成物の両方を用いることも可能である。後者の利用に関して、重要な天然のゲノム調節成分、特に増加した発現と関係するものの同定は最も重要である。実施例８において示される配列情報はそのような重要な調節配列の同定を可能にする。より具体的には、実施例８において表示される図７は、既知の転写因子のいくつかの共通認識配列が推定上の近位プロモーター中に見いだされることを示す。これらはＵＳＦ（上流刺激因子）及びＳＲＥＢＰ（ステロール応答配列結合タンパク質）の可能性がある結合部位を含む。これらのＤＮＡ結合タンパク質は両方とも遺伝子発現の調節において重要であることが示されている。記述される特定のプロモーター配列は特に高いＡｏｐ２転写レベルと関係しないが、共通調節配列が同定されると、当業者は増加したレベルのｍＲＮＡ生産を特徴とする対立遺伝子からプロモーター配列を単離し、そのような配列を図７に開示されるものと比較することができるはずである。そのような分析は本明細書に提供されるＡｏｐ２発現の違いを招く重要な調節配列の本質を明らかにすると思われる。そのような調節配列の同定を遺伝子治療プロトコルにおいて治療的に利用することができる。ＡＯＰ２活性はサイトゾルに局在化されるようである。Ａｔｈ１感受性個体の処置のための治療方法は、個体の関係のある細胞にＡｔｈ１耐性を与えるＡｏｐ２対立遺伝子を保有する哺乳類発現ベクターを導入することである。アテローム性動脈硬化症に関して、関係のある標的細胞は動脈壁（低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）酸化の場所）の細胞である。通常の哺乳類発現ベクターを以下により詳細に説明する。先の研究から、そのような通常の哺乳類ベクターによる遺伝子の送達が動脈壁の細胞において発現をもたらすことができることが示されている。これに関連して、Ａｏｐ２が少なくとも２３の異なる組織において広く発現されることに注目することは重要である。このいくぶん遍在する発現様式を考慮すると、標的細胞以外の細胞におけるＡｏｐ２の発現と関係する有害作用はきわめてないと考えられる。 II．ＡＯＰ２ポリペプチド及びそのフラグメント従って、本発明の一つの態様により、本発明者等はポリペプチドＡＯＰ２の一次配列を提供する。この分子は様々な異なる状況で有用となる。例えば、ＡＯＰ２を抗原として用いて抗体を作製することができ、次に、それらを用いてＡＯＰ２に関係する疾病状態を研究し、診断することがでぎる。また、ＡＯＰ２をスクリーニングアッセイの一部として用いてインビトロまたはインビボで試薬をＡＯＰ２の機能に影響を及ぼすそれらの能力に関して調べることもできる。最後に、例えば、体の外部で血液に酸素が供給される心臓手術中に、インビボで酸化的損傷を防ぐためにＡＯＰ２を用いることができる。全ＡＯＰ２分子に加えて、本発明は抗酸化剤（または他の）活性を保持するかまたはしなくてもよいそのポリペプチドのフラグメントにも関する。コーディング領域内の翻訳終止部位の遺伝子工学により分子のＮ末端を含むフラグメントを作製することができる（以下に説明する）。あるいはまた、プロテアーゼとして知られているタンパク質分解酵素でのＡＯＰ２分子の処理により、様々なＮ末端、Ｃ末端及び内部フラグメントを生成することができる。フラグメントの例は６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００またはそれ以上のアミノ酸の長さの配列番号：２または配列番号：４に示されるＡｔｈ１配列の連続残基を含むことができる。沈殿（例えば、硫酸アンモニウム）、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、（免疫アフィニティークロマトグラフィーを初めとする）アフィニティークロマトグラフィーまたは様々な大きさ分離（沈降、ゲル電気泳動、ゲル濾過）のような既知の方法によりこれらのフラグメントを精製することができる。Ａ．ポリペプチドの構造特徴Ａｏｐ２の遺伝子は２２４アミノ酸のポリペプチドをコードする。この分子の予測される分子量は２６ｋＤである。従って、最低でも、分子量を調べるアッセイにおける基準としてこの分子を用いることができるＢ．機能的特徴本出願がＡｏｐ２の機能または「野生型」活性をさす場合、それは当該分子が脂質、タンパク質、特に低及び高密度リポタンパク質のような様々な生物学的分子の酸化を防ぐ能力を有することを意味する。具体的には、ＡＯＰ２はチオール依存性の金属触媒酸化による損傷から酵素を防御することができるタンパク質のファミリーのメンバーである。当業者によく知られているアッセイを用いて、どのポリペプチドがこの活性を保有するかを決定することができる。例えば、機能的なＡｏｐ２産物を持たず、従って、過剰の酸化を示す細胞中にＡｏｐ２またはその変異体をコードする遺伝子を導入することにより、ＡＯＰ２機能を有する分子が同定される。例えば、金属触媒酸化からの酵素の防御に関して細胞抽出物をアッセイすることができる。また、Ａｏｐ２遺伝子との相補性研究に用いることができるＡＯＰ２様機能を欠いている少なくとも１つの酵母株もある。特定の実施例として、そのタンパク質に特異的な抗体での免疫アッセイを用いてタンパク質を測定することができるはずである。また、このタンパク質の活性を酸化からＬＤＬを防御するその能力によっても測定することができるはずである。そのようなアッセイは酸化されたＬＤＬの量に基づき；抗酸化剤が十分に機能している場合、酸化されたＬＤＬの量は少なく、逆に、抗酸化剤があまり機能しない場合、酸化されたＬＤＬは多量である。生成されたチオバルビツール酸反応性物質（ＴＢＡＲＳ）の量を５３２ｎｍの吸光度で測定することにより、酸化されたＬＤＬを直接見積もることができる（Ｏｈｋａｗａ等、１９７９）。このアッセイはアテローム性動脈硬化症研究において広く用いられる（Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ等、１９９０）。酸化されたＬＤＬの直接見積もりの別の方法は、記述されたように（Ｋｌｉｍｏｖ等、１９９３）、共役ジエン及びトリエンである脂質過酸化の生成物を測定することである。酸化されたＬＤＬを測定する間接的方法はマクロファージによる取り込みである。マクロファージは酸化されたＬＤＬを取り込むが、本来のＬＤＬは取り込まないので、¹²⁵Ｉで標識されたＬＤＬを分解するマクロファージの能力を用いる（Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ等、１９９０）。最後に、チオール依存性金属触媒酸化系による酸化的不活化からグルタミンシンテターゼを防御する能力により、この種類の抗酸化剤のメンバーをアッセイすることができる（Ｎｅｔｔｏ等、１９９６）。これは酸化系からの過酸化水素の除去を伴う。Ｃ．ＡＯＰ２の変異体ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は置換、挿入または欠失変異体であってもよい。欠失変異体は機能または免疫原活性に必須でない天然タンパク質の１個またはそれ以上の残基を欠いている。挿入突然変異体は典型的にポリペプチド中の末端でない位置での物質の付加を含む。これは免疫反応性エピトープまたは単に単一残基の挿入を含むことができる。融合タンパク質と呼ばれる末端の付加は以下に説明する。置換変異体は典型的にタンパク質内の１個またはそれ以上の位置でのあるアミノ酸の別のものでの置換を含み、そして他の機能または特性を失なわずに、タンパク質分解開裂に対する安定性のようなポリペプチドの１つまたはそれ以上の特性を調節するためにそれらを設計することができる。この種類の置換は好ましくは保存的であり、すなわち、あるアミノ酸を類似した形状及び電荷のもので置換する。保存的置換は当該技術分野においてよく知られており、例えば：アラニン→セリン；アルギニン→リシン；アスパラギン→グルタミンまたはヒスチジン；アスパルテート→グルタメート；システイン→セリン；グルタミン→アスパラギン；グルタメート→アスパルテート；グリシン→プロリン；ヒスチジン →アスパラギンまたはグルタミン；イソロイシン→ロイシンまたはバリン；ロイシン→バリンまたはイソロイシン；リシン→アルギニン；メチオニン→ロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニン→チロシン、ロイシンまたはメチオニン；セリン→トレオニン；トレオニン→セリン；トリプトファン→チロシン；チロシン→トリプトファンまたはフェニルアラニン；及びバリン→イソロイシンまたはロイシンの変異を含む。以下のものは、タンパク質のアミノ酸を変えることに基づいて同等なまたはさらに改善された第二世代の分子を作製するための説明である。例えば、抗体の抗原結合部位または基質分子上の結合部位のような構造との相互作用結合能力をあまり失わずに、例えば、タンパク質構造のあるアミノ酸を他のアミノ酸で置換することができる。タンパク質の生物学的機能活性を特定するのはタンパク質の相互作用能力及び性質であるので、あるアミノ酸置換をタンパク質配列及びその基礎を成すＤＮＡコーディング配列中に作製し、それにもかかわらず類似した特性を有するタンパク質を得ることができる。従って、以下に説明するように、生物学的有用性または活性をあまり失わずに遺伝子のＤＮＡ配列中に様々な変異を作製できることが本発明者等により意図される。表１に特定のアミノ酸をコードするコドンを示す。そのような変異を作製する際に、アミノ酸の疎水親水指数を考慮することができる。タンパク質に相互作用する生物学的機能を与える際の疎水親水アミノ酸指数の重要性は当該技術分野で一般に理解されている(Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２)。アミノ酸の相対的疎水親水特性が得られるタンパク質の二次構造に寄与し、それが次にそのタンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原等との相互作用を特定することが一般に認められている。各アミノ酸はそれらの疎水性及び電荷特性に基づいて疎水親水指数が定められており（Ｋｙｔｅ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）、これらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。あるアミノ酸を類似した疎水親水指数または得点を有する他のアミノ酸で置換し、それにもかかわらず類似した生物学的活性を有するタンパク質をもたらす、すなわち、生物学的機能的に同等なタンパク質を得ることができることが当該技術分野で知られている。そのような変異を作製する際に、疎水親水指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらにより特に好ましい。また、類似したアミノ酸の置換を親水性に基づいて効果的に作製できることも当該技術分野で分かっている。引用することにより本明細書に組み込まれる米国特許４，５５４，１０１は、隣接するアミノ酸の親水性により決定されるような、タンパク質の最も大きい局所的平均親水性がタンパク質の生物学的特性と相関することを記述している。米国特許４，５５４，１０１中に詳細に記述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に対して定められている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アルパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（＊−０．５）；システイン（ −１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（ −２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸を類似した親水性値を有する別のもので置換し、それにもかかわらず生物学的に同等な免疫学的に同等なタンパク質を得ることができることが分かっている。そのような変異において、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらにより特に好ましい。上に略述したように、通例、アミノ酸置換はアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、大きさ等に基づく。様々な上記の特徴を考慮する代表的な置換は当業者によく知られており、アルギニンとリシン：グルタメートとアスパルテート；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；及びバリン、ロイシンとイソロイシンを含む。本発明のポリペプチドの製造のための別の態様はペプチド模倣物の使用である。模倣物はタンパク質二次構造の成分を真似るペプチド含有分子である。例えば、ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＡＮＤＰＨＡＲＭＡＣＹ、Ｐｅｚｚｕｔｏ等、編集、ＣｈａｐｍａｎａｎｄＨａｌｌ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９３）中のＪｏｈｎｓｏｎ等、「ＰｅｐｔｉｄｅＴｕｒｎＭｉｍｅｔｉｃｓ」を参照。ペプチド模倣物の使用の裏の基礎をなす論理的根拠は、タンパク質のペプチド主鎖が主に抗体と抗原のもののような分子相互作用を容易にするようにアミノ酸側鎖を配置するために存在することである。ペプチド模倣物は天然の分子に類似した分子相互作用を可能にすると考えられる。上に略述した原理と共にこれらの原理を用いてＡＯＰ２の本来の特性の多くを有するが、改変されさらに改善された特性を有する第二世代分子を作製することができる。Ｄ．ドメイン交換実施例において記述するように、本発明者等はＡｏｐ２遺伝子の推定上のマウス及びヒト相同物を同定した。さらに、ＡＯＰ２中（例えば、残基１２２）にその機能を変えると考えられる突然変異を同定した。これらの研究は少なくとも２つの理由から重要である。第一に、それらはこの遺伝子のさらに他の相同物、対立遺伝子変異体及び突然変異体がイヌ、ラット、ウサギ、サル、テナガザル、チンパンジー、類人猿、ヒヒ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ及びネコのような同類の種において存在する可能性があるという理にかなった予想を与える。これらの相同物、変異体及び突然変異体の単離により、他の分析と連携して、ある活性または機能ドメインを同定することができる。第二に、これは分子のさらなる突然変異分析の出発点を与える。この情報を利用することができる１つの方法は「ドメイン交換」においてである。ドメイン交換は、異なるが、この場合、関連するポリペプチドを用いるキメラ分子の作製を含む。Ａｏｐ２のマウス及びヒト配列を他の種のＡｏｐ２と、そしてこれらのポリペプチドの突然変異体及び対立遺伝子変異体と比較することにより、これらの分子の機能的に重要な領域に関して予測することができる。次に、ＡＯＰ２機能に対するこれらの領域の重要性を決定しようとしてこれらの分子の関連したドメインを交換することが可能である。おそらく同じ機能を与えながら、これらの「キメラ」を天然の分子と区別することができる点でこれらの分子は付加価値を有する可能性がある。マウス、イヌ及びヒト配列のアミノ酸レベルでの配列同一性に基づくと、分子の一次配列のわずかな変異でさえ機能に影響を及ぼすことを推論することができる。突然変異体及び二次構造に対するそれらの予測される影響のさらなる分析はこの理解を増す。Ｅ．融合タンパク質挿入変異体の特殊化した種類は融合タンパク質である。通例、この分子はもう一つのポリペプチドの全部または一部にＮまたはＣ末端で連結した全部または実質的な部分の天然分子を有する。例えば、融合は典型的には異種起源の宿主においてタンパク質の組み換え発現を可能にするために他の種からのリーダー配列を用いる。別の有用な融合は、融合タンパク質の精製を容易にするために、抗体エピトープのような免疫学的に活性のあるドメインの付加を含む。融合連結部にまたはその近くに開裂部位を含むことは精製後の外来ポリペプチドの除去を容易にする。他の有用な融合は酵素からの活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞ターゲッティングシグナルまたは膜貫通領域のような機能的ドメインの連結を含む。Ｆ．タンパク質の精製ＡＯＰ２またはその変異体を精製することが望ましい。タンパク質精製技術は当業者によく知られている。これらの技術はある水準でポリペプチド及び非ポリペプチド画分への細胞環境の粗分画を含む。他のタンパク質からポリペプチドを分離すると、クロマトグラフィー及び電気泳動技術を用いて目的のポリペプチドをさらに精製して部分的または完全な精製（または均質までの精製）を実施することができる。純粋なペプチドの調製に特に適した分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に効率のよい方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィーまたはまさにＨＰＬＣである。本発明のある態様はコードされるタンパク質またはペプチドの精製、特定の態様として実質的な精製に関する。本明細書に用いられる場合、「精製されたタンパク質またはペプチド」という用語は、タンパク質またはペプチドがその天然で得ることができる状態に対してある程度精製されている、他の成分から単離できる組成物をさすと考えられる。それ故、精製されたタンパク質またはペプチドは、それが天然で存在することができる環境から離れたタンパク質またはペプチドもさす。一般に、「精製された」は様々な他の成分を除くために分画に供したタンパク質またはペプチド組成物をさし、その組成物はその発現された生物学的活性を実質的に保持する。「実質的に精製された」という用語が用いられる場合、この明示はタンパク質またはペプチドが組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％またはそれ以上を構成するような、組成物の主成分を形成する組成物をさす。タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量するための様々な方法は本開示を考慮して当業者に理解される。これらは例えば活性画分の比活性を測定することまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により画分内のポリペプチドの量を評価することを含む。画分の純度を評価するための好ましい方法は、画分の比活性を計算し、それを初めの抽出物の比活性と比較し、そしてそのように純度を計算することであり、本明細書において「−倍精製数」で評価される。活性の量を表すために用いられる実際の単位は、もちろん、精製及び発現されたタンパク質またはペプチドが検出できる活性を示すかどうかをたどるために選択される特定のアッセイ技術により決まる。タンパク質精製に用いるために適当な様々な技術は当業者によく知られている。これらは例えば硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体等または熱変性での沈殿及びそれに続く遠心分離；イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト及びアフィニティークロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー工程；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；並びにそのような及び他の技術の組み合わせを含む。当該技術分野において一般に知られているように、様々な精製工程を実施する順序を変えることができること、またはある工程を省き、それにもかかわらず実質的に精製されたタンパク質もしくはペプチドの謂製のために適当な方法をもたらすことできることが考えられる。タンパク質またはペプチドがそれらの最も精製された状態でいつも与えられるという一般要求はない。実際、あまり実質的に精製されていない生成物はある態様において有用性があると考えられる。より少ない精製工程を組み合わせて用いることにより、または同じ一般精製スキームの異なる形態を利用することにより部分精製を成し遂げることができる。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して実施する陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、通例、低圧クロマトグラフィー系を利用する同じ技術より大きい「一倍」精製をもたらすと理解される。より低い相対的精製度を示す方法はタンパク質生成物の全回収においてまたは発現されたタンパク質の活性を維持することにおいて利点を有する可能性がある。ポリペプチドの移動はＳＤＳ−ＰＡＧＥの異なる条件で時折著しく変わる可能性があることが知られている（Ｃａｐａｌｄｉ等、１９７７）。それ故、異なる電気泳動条件下で、精製されたまたは部分的に精製された発現産物の見かけの分子量が変わる可能性があることが理解される。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）はピークの並外れた分解能を有する非常に迅速な分離を特徴とする。適切な流速を維持するために非常に細かい粒子及び高圧を用いることによりこれを実施する。数分またはせいぜい１時間のうちに分離を成し遂げることができる。さらに、粒子は非常に小さく、密に充填され、その結果、ボイド容積はベッド容積の非常に小さい割合であるので、ほんのわずかな容量のサンプルが必要とされる。また、バンドは非常に狭く、その結果、サンプルの希釈がほとんどないので、サンプルの濃度は非常に大きい必要はない。ゲルクロマトグラフィーまたは分子ふるいクロマトグラフィーは分子の大きさに基づく分配クロマトグラフィーの特別な型である。ゲルクロマトグラフィーを裏付ける理論は、小孔を含有する不活性物質の小さい粒子で調製されるカラムが、分子の大きさにより、それらが孔を通るかまたは迂回して通過するので、より大きい分子をより小さい分子から分離することである。粒子を作る物質が分子を吸着しないかぎり、流速を決定する唯一の因子は大きさである。従って、形状が比較的一定であるかぎり、分子は減少する大きさでカラムから溶出される。ゲル濾過は、分離がｐＨ、イオン強度、温度等のような全ての他の因子に関係しないので異なる大きさの分子を分離するために卓越している。また、事実上、吸着がなく、帯域拡張が少なく、そして溶出容量は単純に分子量に関係する。アフィニティークロマトグラフィーは、単離される物質とそれが特異的に結合できる分子の間の特異的親和性によるクロマトグラフィー方法である。これは受容体−リガンド型相互作用である。不溶性マトリックスに結合相手の一方を共有結合的に連結することによりカラム材料を合成する。次に、カラム材料は溶液から物質を特異的に吸着することができる。結合が起こらない条件に変える（ｐＨ、イオン強度、温度等を変える）ことにより溶出が起こる。炭水化物を含有する化合物の精製に有用な特定の型のアフィニティークロマトグラフィーはレクチンアフィニティークロマトグラフィーである。レクチンは様々な多糖類及び糖タンパク質に結合する物質の種類である。通常、レクチンは臭化シアンによりアガロースに連結される。セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）に連結されたコンカナバリンＡは用いられるこの種類の最初の物質であり、多糖類及び糖タンパク質の単離に広く使用されている。用いられている他のレクチンはヒラマメレクチン、Ｎ−アセチルグルコサミニル残基の精製において有用であるコムギ胚凝集素、及びヘリックス・ポマチア（Ｈｅｌｉｘｐｏｍａｔｉａ）レクチンを含む。レクチン自体は炭水化物リガンドでアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製される。ヒマ及びラッカセイからレクチンを精製するためにラクトースが用いられており；マルトースはヒラマメ及びタチナタマメからレクチンを抽出することにおいて有用であり；ダイズからレクチンを精製するためにＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンが用いられ；Ｎ−アセチルグルコサミニルはコムギ胚からのレクチンに結合し；Ｄ−ガラクトサミンは二枚貝からレクチンを得ることに用いられており；そしてＬ−フコースはミヤコグサからのレクチンに結合する。マトリックスはそれ自体いかなる有意な程度にも分子を吸着せず且つ広い範囲の化学的、物理的及び熱安定性を有する物質であるべきである。リガンドはその結合特性に影響を及ぼさないように連結されるべきである。また、リガンドは比較的堅い結合も与えるべきである。そしてそれはサンプルまたはリガンドを壊さずに物質を溶出することが可能であるべきである。アフィニティークロマトグラフィーの最も一般的形態の一つは免疫アフィニティークロマトグラフィーである。本発明による使用のために適当な抗体の作製は以下に説明される。Ｇ．合成ペプチド本発明は本発明の様々な態様における使用のためのより小さいＡＯＰ関連ペプチドも記述する。比較的小さい大きさのために、本発明のペプチドを通常の技術に従って溶液中または固体支持体上で合成することもできる。様々な自動合成機が市販されており、既知のプロトコルに従ってそれらを用いることができる。例えば、各々、引用することにより本明細書に組み込まれる、Ｓｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ、（１９８４）；Ｔａｍ等（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９８６）；並びにＢａｒａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７９）を参照。本明細書に記述される選択領域に対応する、通常、約６から約３５〜５０アミノ酸までの短いペプチド配列または重複するペプチドのライブラリーを容易に合成することができ、次に、反応性ペプチドを同定するために考案されたスクリーニングアッセイにおいてスクリーニングすることができる。あるいはまた、組み換えＤＮＡ技術を用いてもよく、その場合、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクター中に挿入し、適切な宿主細胞中に形質転換するかまたはトランスフェクトし、発現のために適当な条件下で培養する。Ｈ．抗原組成物本発明は抗体の生産に関係する動物の免疫のための抗原としてのＡＯＰ２タンパク質またはペプチドの使用も規定する。リンカー、ポリリンカーまたは誘導化アミノ酸により１つまたはそれ以上の薬剤にＡＯＰ２またはその一部のいずれかを連結するか、つなぐか、化合させるか、結合させるかまたは化学的に連結させることが予見される。二特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）または多価の組成物またはワクチンが生成されるようにこれを実施してもよい。さらに、これらの組成物の調製に用いられる方法は当業者によく知られており、そして動物への投与のために適している、すなわち、製薬学的に許容しうるべきであることが予見される。好ましい薬剤はスカシガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ）のヘモシアニン（ＫＬＨ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような担体である。 III．核酸本発明は別の態様としてＡＯＰ２をコードする遺伝子も提供する。ヒト及びマウスＡＯＰ２分子の遺伝子が同定されている。しかしながら、当業者はこれらの２つの核酸を用いて様々な他の種（例えば、イヌ、ラット、ウサギ、サル、テナガザル、チンパンジー、類人猿、シシ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ及び他の種）の関係のある相同物を容易に同定することができるはずであるので、本発明はこれらの遺伝子に範囲が限定されない。この遺伝子のマウス相同物の発見から、よりヒトに近縁の他の種も実際に相同物を有することが有望になる。これらの遺伝子を診断及び治療処方計画の一部として用いることができる。さらに、本発明は本明細書に開示される特定の核酸に限定されないことも明らかであるはずである。以下に説明するように、「Ａｏｐ２遺伝子」は様々な異なる塩基を含有し、それにもかかわらず本明細書に開示されるヒト及びマウス遺伝子と機能的に、ある場合には構造的に区別できない対応するポリペプチドをなお生産することができる。同様に、核酸に対するあらゆる言及は、その核酸を含有し、そしてある場合にはその核酸の産物を発現することができる宿主細胞を包含すると解釈されるべきである。治療的重要性に加えて、本発明の核酸を発現する細胞は、Ａｏｐ２の機能を誘導するか、抑制するか、阻害するか、増大するか、妨げるか、阻むか、阻止するか、刺激するかまたは高める薬剤のスクリーニングに関連して有用となる可能性がある。Ａ．Ａｏｐ２をコードする核酸配列番号：１に開示されるヒト遺伝子及び配列番号：３に開示されるマウス遺伝子は本発明のＡｏｐ２遺伝子である。本発明の核酸は全ＡＯＰ２産物、ＡＯＰ２のドメインまたは本明細書に記述されるＡＯＰ２配列あらゆる他のフラグメントをコードしてもよい。核酸をゲノムＤＮＡから得る、すなわち、特定の生物のゲノムから直接クローン化することができる。しかしながら、好ましい態様として、核酸は相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含んでなる。また、意図されるものはＤＮＡと本来のイントロンまたは別の遺伝子に由来するイントロンであり；そのように作製された分子は時折「ミニ遺伝子」と呼ばれる。最低でも、本発明のこれら及び他の核酸を例えばゲル電気泳動における分子量基準として用いることができる。「ｃＤＮＡ」という用語は鋳型としてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を用いて調製されるＤＮＡをさすと考えられる。ゲノムＤＮＡまたはゲノムのプロセシングされていないかもしくは部分的にプロセシングされたＲＮＡ鋳型から重合されたＤＮＡに対して、ｃＤＮＡを用いることの利点は、ｃＤＮＡが対応するタンパク質のコーディング配列を主に含有することである。非コーディング領域が最適発現のために必要とされる場合またはイントロンのような非コーディング領域がアンチセンス法において標的とされる場合のような、完全なまたは部分的ゲノム配列が好ましい場合がある。また、わずかに異なる核酸配列を有するが、それにもかかわらず、同じタンパク質をコードする天然の変異体により、既定の種からの既定のＡｏｐ２遺伝子が示される可能性があることも考えられる（以下の表１を参照）。本出願に用いられる場合、「Ａｏｐ２をコードする核酸」という用語は、全細胞核酸を含んでいない単碓されている核酸分子をさす。好ましい感様として、本発明は本質的に配列番号：１または配列番号：３に記述されるような核酸配列に関する。「配列番号：１または配列番号：３に記述されるような」という用語は、核酸配列が配列番号：１または配列番号：３の一部に実質的に相当することを意味する。「機能的に同等なコドン」という用語は、アルギニンまたはセリンの６個のコドンのような同じアミノ酸をコードするコドンをさすため（以下の表１）及び以下のページに説明するように生物学的に同等なアミノ酸をコードするコドンをさすためにも本明細書において用いられる。遺伝暗号の縮重を考慮して、配列番号：１または配列番号：３のヌクレオチドに同一である少なくとも約５０％、一般的には少なくとも約６０％、より一般的には約７０％、最も一般的には約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは約９５％のヌクレオチドを有する配列は、「配列番号：１または配列番号：３に記述されるような」配列である。また、図Ｘに記述されるものと本質的に同じである配列を、標準条件下で配列番号：１または配列番号：３の相補物を含有する核酸セグメントにハイブリダイズすることができる配列として機能的に特定することもできる。本発明のＤＮＡセグメントは、上記のように、生物学的に機能的な同等なＡＯＰ２タンパク質及びペプチドをコードするものを含む。そのような配列は、核酸配列及びそのようにコードされるタンパク質内に天然に存在することが知られているコドンの重複性及びアミノ酸の機能的等価の結果として生じる可能性がある。あるいはまた、機能的に同等なタンパク質またはペプチドを組み換えＤＮＡ技術の適用により作製することができ、その場合、交換されるアミノ酸の特性の考察に基づいて、タンパク質構造中の変異を作製することができる。ヒトにより設計された変異を部位特異的突然変異誘発技術の適用により導入することができ、または以下に記述するように、無作為に導入し、その後で適切な機能に関してスクリーニングすることができる。Ｂ．オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーもちろん、本発明は配列番号：１または配列番号：３に記述される配列に相補的なまたは本質的に相補的なＤＮＡセグメントも包含する。「相補的な」核酸配列は標準ワトソン−クリック相補性規則に従って塩基対合することができるものである。本明細書に用いられる場合、「相補的配列」という用語は、上に記述した同じヌクレオチド比較により評価できるような、または本明細書に記述されるもののような比較的厳しい条件下で配列番号：１または配列番号：３の核酸セグメントにハイブリダイズできると特定されるような、実質的に相補的な核酸配列を意味する。そのような配列は全Ａｏｐ２タンパク質またはその機能的もしくは非機能的フラグメントをコードしてもよい。あるいはまた、ハイブリダイズするセグメントはより短いオリゴヌクレオチドであってもよい。１７塩基の長さの配列はヒトゲノムにおいて１度だけ存在するはずであり、それ故、独特な標的配列を特定するために十分である。より短いオリゴマーは作製するのがより容易であり、インビボでの到達容易性を増すが、多数の他の因子がハイブリダイゼーションの特異性を決定することに関与する。オリゴヌクレオチドのその相補的標的への結合親和性及び配列特異性は両方とも長さを増すにつれて増加する。別のものが考えられるが、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上の塩基対の代表的なオリゴヌクレオチドを用いることが意図される。２５０、５００、１０００、１２１２、１５００、２０００、２５００、３０００または３４３１塩基及びそれより長いものをコードするより長いポリヌクレオチドも同様に意図される。そのようなオリゴヌクレオチドは、例えば、サザン及びノーザンブロットにおけるプローブとして、そして増幅反応におけるプライマーとしての用途がある。適当なハイブリダイゼーション条件は当業者によく知られている。ある用途、例えば、部位特異的突然変異誘発によるアミノ酸の置換では、より低いストリンジェンシー条件が必要とされることが理解される。これらの条件下では、たとえプローブと標的鎖の配列が完全に相補的ではなく、１つまたはそれ以上の位置でミスマッチであってもハイブリダイゼーションが起こることができる。塩濃度を増し、温度を下げることにより条件をより低いストリンジェンシーにすることができる。例えば、約３７℃ ないし約５５℃の温度で約０．１ないし０．２５ＭのＮａＣｌにより中間のストリンジェンシー条件を与えることができ、一方、約２０℃から約５５℃までの範囲の温度で約０．１５Ｍないし約０．９Ｍの塩により低いストリンジエンシー条件を与えることができる。このように、ハイブリダイゼーション条件を容易に操作することができ、従って、通例、それらは所望する結果により一般に好まれる方法である。他の態様として、例えば、約２０℃ないし約３７℃の間の温度で、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭＫＣｌ、３ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭジチオトレイトールの条件下でハイブリダイゼーションを実施することができる。利用される他のハイブリダイゼーション条件は約４０℃から約７２℃までの範囲の温度で約１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、１．５μＭＭｇＣｌ₂、を含むことができる。また、ハイブリダイゼーション条件を変えるためにホルムアミド及びＳＤＳを用いてもよい。本発明のプローブ及びプライマーを用いる一つの方法は、Ａｏｐ２に関連した遺伝子、またはより具体的には他の種からのＡｏｐ２の相同物の探索においてである。マウス相同物の存在は、マウスより近縁、そしておそらく遠縁の種においてヒトＡｏｐ２の他の相同物が見いだされることを示唆する。スクリーニングはＲＮＡ分子の分析を含むことができるが、通常、標的ＤＮＡはゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーである。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー及びプローブの領域を変えることにより、異なる程度の相同性を見いだすことができる。本発明のプローブ及びプライマーを利用する別の方法は部位指定または部位特異的突然変異誘発である。部位特異的突然変異誘発は、基礎をなすＤＮＡの特定の突然変異による、個々のペプチドまたは生物学的に機能的な同等なタンパク質もしくはペプチドの調製において有用な技術である。その技術はさらに、ＤＮＡ中に１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列変異を導入することにより、１つまたはそれ以上の前記の考察を取り入れて、配列変異体を調製し、試験する便利な能力を与える。部位特異的突然変異誘発は、掛け渡される欠失連結点の両側で安定な二本鎖を形成するために十分な大きさ及び配列の複雑さのプライマー配列を与えるように、所望する突然変異のＤＮＡ配列及び十分な数の隣接するヌクレオチドをコードする特定のオリゴヌクレオチド配列を使用することにより突然変異体を生成することができる。典型的には、約１７ないし２５ヌクレオチドの長さのプライマーが好ましく、配列の連結点の両側の約５ないし１０残基が変えられる。その技術は典型的に一本鎖及び二本鎖の両方の形態で存在するバクテリオファージベクターを用いる。部位特異的突然変異誘発において有用な典型的なベクターはＭ１３ファージのようなベクターを含む。これらのファージベクターは市販されており、それらの使用は一般に当業者によく知られている。また、二本鎖のプラスミドも部位特異的突然変異誘発に通常用いられており、それはファージからプラスミドに目的の遺伝子を移す工程を除く。通例、まず、適切なタンパク質をコードするＤＮＡ配列を配列内に含む一本鎖ベクターを得るかまたは二本鎖ベクターの二本鎖を融解することにより部位特異的突然変異誘発を実施する。所望する突然変異された配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成的に調製する。次に、ハイブリダイゼーション条件を選択する場合にミスマッチの程度を考慮に入れて、このプライマーを一本鎖ＤＮＡ調製物とアニーリングさせ、突然変異を保有する鎖の合成を完了するためにエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリメラーゼＩクレノウフラグメントのようなＤＮＡ重合酵素に供する。このようにして、一方の鎖が元の突然変異されていない配列をコードし、そしてもう一方の鎖が所望する突然変異を保有するヘテロ二本鎖を形成する。次に、このヘテロ二本鎖ベクターを用いてエシェリキア・コリ細胞のような適切な細胞を形質転換し、突然変異された配列配置を保有する組み換えベクターを含むクローンを選択する。部位特異的突然変異誘発を用いた選択遺伝子の配列変異体の調製は、潜在的に有用な種類を生成する手段として提供され、そして遺伝子の配列変異体を得ることができる他の方法があるので、限定していることを意味しない。例えば、配列変異体を得るために、適切な遺伝子をコードする組み換えベクターをヒドロキシルアミンのような突然変異誘発剤で処理してもよい。Ｃ．アンチセンス構築物ある場合において、突然変異体タンパク質が非機能的でない可能性がある。むしろ、「野生型」分子が突然変異体ポリペプチドよりも多い量で発現される場合でさえ、それらは置換遺伝子治療により克服することができない異常な機能を有する可能性がある。アンチセンス処置はこの状況に取り組む一つの方法である。また、研究、診断及びスクリーニング目的のための細胞系またはトランスジェニックマウスの開発においてＡＯＰ２の機能を「ノックアウト」させるためにアンチセンス技術を用いてもよい。アンチセンス方法論は、核酸が「相補的」配列と対合する傾向があることを利用する。相補的は、ポリヌクレオチドが標準ワトソン−クリック相補性規則に従って塩基対合できるものであることを意味する。すなわち、大きい方のプリンは小さい方のピリミジンと塩基対合してシトシンと対合したグアニン（Ｇ：Ｃ）及びＤＮＡの場合にはチミンと対合したアデニン（Ａ：Ｔ）またはＲＮＡの場合にはウラシルと対合したアデニン（Ａ：Ｕ）の組み合わせを形成する。ハイブリダイズする配列中にイノシン、５−メチルシトシン、６−メチルアデニン、ヒポキサンチン等のようなあまり一般的でない塩基を含むことは対合を妨げない。ポリヌクレオチドで二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを標的とすることは三重らせん形成をもたらし；ＲＮＡを標的とすることは二重らせん形成をもたらす。アンチセンスポリヌクレオチドは、標的細胞中に導入されると、それらの標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し、転写、ＲＮＡプロセシング、輸送、翻訳及び／または安定性を妨げる。ヒト患者を初めとする宿主動物内のような、インビトロまたはインビボのいずれかで、宿主細胞内で遺伝子の転写または翻訳またはその両方を妨げるためにアンチセンスＲＮＡ構築物またはそのようなアンチセンスＲＮＡのものをコードするＤＮＡを用いることができる。遺伝子のプロモーター及び他の調節領域、エキソン、イントロンまたはさらにエキソン−イントロン境界に結合するようにアンチセンス構築物を設計することができる。最も有効なアンチセンス構築物はイントロン／エキソンスプライス連結点に相補的な領域を含むと考えられる。従って、好ましい態様はイントロン− エキソンスプライス連結点の５０−２００塩基内の領域に相補性を有するアンチセンス構築物を含むことが提示される。標的選択性に重大に影響を及ぼさずに構築物中にいくつかのエキソン配列を含有できることが認められている。含まれるエキソン物質の量は用いられる特定のエキソン及びイントロン配列により変わる。正常な細胞機能が影響を受けるかどうかまたは相補的配列を有する関連する遺伝子の発現が影響を受けるかどうかを決定するために単にインビトロで構築物を試験することにより多すぎるエキソンＤＮＡが含まれているかどうかを容易に試験することができる。上に記述したように、「相補的」または「アンチセンス」は全長にわたって実質的に相補的であり且つ非常に少数の塩基ミスマッチを有するポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、１５塩基の長さの配列が１３または１４の位置で相補的ヌクレオチドを有する場合にそれを相補的と呼ぶことができる。とりわけ、完全に相補的な配列は、全長にわたって完全に相補的であり且つ塩基ミスマッチがない配列である。また、より低い程度の相同性を有する他の配列も意図される。例えば、高い相同性の限られた領域を有するが、非相同領域も含有するアンチセンス構築物（例えば、リボザイム；以下参照）を設計することができる。これらの分子は、５０％未満の相同性を有するが、適切な条件下で標的配列に結合する。特定の構築物を作製するためにゲノムＤＮＡの一部をｃＤＮＡまたは合成配列と組み合わせることが好都合であることがある。例えば、イントロンが最終構築物中に所望される場合、ゲノムクローンを用いる必要がある。ｃＤＮＡまたは合成されたポリヌクレオチドは構築物の残りの部分により便利な制限部位を与えることができ、それ故、配列の残りに用いられる。Ｄ．リボザイム「ドミナントネガティブ」突然変異体に取り組みための別の方法はリボザイムの使用による。伝統的にタンパク質が核酸の触媒反応に用いられているが、別の種類の巨大分子がこの試みにおいて有用であるとして持ち上がっている。リボザイムは核酸を部位特異的に開裂するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムはエンドヌクレアーゼ活性を保有する特定の触媒ドメインを有する（Ｋｉｍ及びＣｅｃｈ、１９８７；Ｇｅｒｌａｃｈ等、１９８７；Ｆｏｒｓｔｅｒ及びＳｙｍｏｎｓ、１９８７）。例えば、多数のリボザイムが高度の特異性でリン酸エステル転移反応を促進し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質中のいくつかのリン酸エステルの１つのみを開裂する（Ｃｅｃｈ等、１９８１；Ｍｉｃｈｅｌ及びＷｅｓｔｈｏｆ、１９９０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−Ｈｕｒｅｋ及びＳｈｕｂ、１９９２）。この特異性は、化学反応の前に基質が特定の塩基対合相互作用によりリボザイムの内部誘導配列（「ＩＧＳ」）に結合するという必要条件に起因すると考えられている。リボザイム触媒反応は核酸を伴う配列特異的開裂／ライゲーション反応の一部として最初に認められた（Ｊｏｙｃｅ、１９８９；Ｃｅｃｈ等、１９８１）。例えば、米国特許第５，３５４，８５５号はある種のリボザイムが既知のリボヌクレアーゼのものより大きく且つＤＮＡ制限酵素のものに匹敵する配列特異性でエンドヌクレアーゼとして作用できることを報告している。従って、配列特異的リボザイムによりもたらされる遺伝子発現の抑制は治療用途に特に適している可能性がある（Ｓｃａｎｌｏｎ等、１９９１；Ｓａｒｖｅｒ等、１９９０）。最近、リボザイムがそれらを用いたいくつかの細胞系において遺伝的変化を引き出すことが報告され；改変された遺伝子は癌遺伝子Ｈ−ｒａｓ、ｃ−ｆｏｓ及びＨＩＶの遺伝子を含んだ。この研究の大部分は特定のリボザイムにより開裂される特定の突然変異体コドンに基づく標的ｍＲＮＡの改変を含んだ。Ｅ．クローニング、遺伝子導入及び発現のためのベクターある種の態様内では、発現ベクターを用いてＡｏｐ２ポリペプチド産物を発現させ、次に、それを精製することができ、そして例えば動物にワクチン接種するために用いて抗血清またはモノクローナル抗体を作製することができ、それを用いてさらなる研究を実施することができる。他の態様として、発現ベクターを遺伝子治療において用いる。発現は適切なシグナルがベクター中に与えられることを必要とし、それは宿主細胞において目的の遺伝子の発現を導くウイルス及び哺乳類の両方の起源からのエンハンサー／プロモーターのような様々な調節成分を含む。また、宿主細胞におけるメッセンジャーＲＮＡの安定性及び翻訳能力（ｔｒａｎｓｌａｔａｂｉｌｉｔｙ）を最適化するように考案される成分も特定される。また、薬剤選択マーカーの発現をポリペプチドの発現に連結する成分と同様に、産物を発現する恒久的安定細胞クローンを樹立するための多数の優性薬剤選択マーカーの使用条件も与えられる。（ｉ）調節成分本出願の全体にわたって、「発現構築物」という用語は、遺伝子産物をコードする核酸を含有するあらゆる型の遺伝子構築物を含むことを意味し、その場合、配列をコードする核酸の一部または全部を転写することができる。転写産物はタンパク質に翻訳されてもよいが、そうである必要はない。ある態様として、発現は遺伝子の転写及び遺伝子産物へのｍＲＮＡの翻訳の両方を含む。別の態様として、発現は目的の遺伝子をコードする核酸の転写を含むだけである。ある態様として、発現構築物は天然においてＡｏｐ２遺伝子に対して機能的関係で見いだされる調節配列を含んでなる。ある態様として、これらの調節配列をルシフェラーゼまたはＬａｃＺのようなレポーターまたは標識遺伝子に融合する。他の態様として、これらの調節配列をそれらが天然において見いだされるようにかまたは改変されたようにのいずれかでＡｏｐ２遺伝子に機能的に連結する。好ましい態様として、遺伝子産物をコードする核酸はプロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」は、遺伝子の特異的転写を開始するために必要な、細胞の合成機構により認識されるかまたは合成機構に導入されるＤＮＡ配列をさす。「転写制御下」という語句は、ＲＮＡポリメラーゼの開始及び遺伝子の発現を制御するためにプロモーターが核酸に関して適切な位置及び方向にあることを意味する。プロモーターという用語はＲＮＡポリメラーゼIIの開始部位の辺りに集まる一群の転写制御モジュールをさすために本明細書において用いられる。プロモーターがどのように構成されるかについての見解の多くは、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）及びＳＶ４０初期転写単位のものを初めとするいくつかのウイルスプロモーターの分析に由来する。より最近の研究で増大したこれらの研究から、プロモーターが異なる機能的モジュールから構成され、各々、約７−２０ｂｐのＤＮＡからなり、そして転写アクチベーターまたはレプレッサータンパク質の１つまたはそれ以上の認識部位を含有することが示されている。各プロモーターの少なくとも１つのモジュールはＲＮＡ合成の開始部位を定めるように機能する。この最もよく知られている例はＴＡＴＡボックスであるが、哺乳類のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター及びＳＶ４０後期遺伝子のプロモーターのようにＴＡＴＡボックスを欠いているあるプロモーターでは、開始部位自体に重なる別の成分が開始の場所を固定するのに寄与する。さらなるプロモーター成分は転写開始の頻度を調節する。多数のプロモーターが開始部位の下流にも機能的成分を含有することが最近示されているが、典型的には、これらは開始部位の３０−１１０ｂｐ上流の領域に位置する。プロモーター成分間の間隔はしばしば自由に変えられ、その結果、成分を逆にするかまたは相互に対して動かす場合にプロモーター機能は保持される。ｔｋプロモーターでは、プロモーター成分間の間隔を５０ｂｐ離れるまで増すことができ、その後活性は減少し始める。プロモーターにより、個々の成分は転写を活性化するために協同でまたは独立して機能できるようである。目的の核酸配列の発現を制御するために用いられる特定のプロモーターは、それが標的細胞において核酸の発現を導くことができる限り、重要であると考えられない。従って、ヒト細胞を標的とする場合、ヒト細胞において発現することができるプロモーターに隣接して且つその制御下に核酸コーディング領域を配置することが好ましい。一般的に言えば、そのようなプロモーターはヒトまたはウイルスプロモーターのいずれかを含んでもよい。各種態様として、目的のコーディング配列の高レベル発現を得るためにヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列、ラットインシュリンプロモーター及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼを用いることができる。発現のレベルが与えられた目的のために十分であるならば、目的のコーディング配列の発現を得るために当該技術分野でよく知られている他のウイルスまたは哺乳類細胞またはバクテリアファージプロモーターの使用も同様に意図される。周知の特性を有するプロモーターを用いることにより、トランスフェクションまたは形質転換後の目的のタンパク質の発現のレベル及びパターンを最適化することができる。さらに、特定の生理的シグナルに応答して調節されるプロモーターの選択は遺伝子産物の誘導性発現を可能にすることができる。表２及び３に目的の遺伝子の発現を調節するために本発明に関連して用いることができるいくつかの成分／プロモーターを挙げる。この表は遺伝子発現の促進に関与する全ての可能な成分の包括ではなく、単にそれらの例示であると考えられる。エンハンサーはｃＤＮＡの同じ分子上の離れた位置に位置するプロモーターからの転写を増す遺伝子成分である。エンハンサーはほとんどプロモーターのように構成される。すなわち、それらは多数の個々の成分から構成され、それらの各々は１つまたはそれ以上の転写タンパク質に結合する。エンハンサーとプロモーターの基本的な区別は機能上である。エンハンサー領域は全体として離れた地点で転写を刺激できなければならず；これはプロモーター領域またはその成分要素に当てはまる必要はない。一方、プロモーターは特定の位置で且つ特定の方向でＲＮＡ合成の開始を導く１つまたはそれ以上の成分を有しなければならず、一方、エンハンサーはこれらの特殊性を欠いている。プロモーター及びエンハンサーはしばしば重なり、連続しており、しばしば、非常に類似したモジュール体系を有するようである。以下のものは発現構築物において目的の遺伝子をコードする核酸と組み合わせて用いることができるウイルスプロモーター、細胞性プロモーター／エンハンサー及び誘導性プロモーター／エンハンサーの表である（表２及び表３）。さらに、（真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢによるような）あらゆるプロモーター／エンハンサーの組み合わせも遺伝子の発現を導くために用いることができるはずである。送達複合体の一部またはさらなる遺伝子発現構築物のいずれかとして、適切なバクテリアポリメラーゼが与えられる場合、真核細胞はある種のバクテリアプロモーターからの細胞質転写を与えることができる。ｃＤＮＡインサートを用いる場合、典型的に、遺伝子転写産物の適切なポリアデニル化をもたらすためにポリアデニル化シグナルを含むことが所望される。ポリアデニル化シグナルの性質は本発明の成功した実施に重要であると考えられず、ヒト成長ホルモン及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのようなあらゆるそのような配列を用いることができる。また、発現カセットの成分として意図されるものはターミネーターである。これらの成分はメッセージレベルを増大するため及びカセットから他の配列への読み過しを最小限にするために役立つことができる。（ii）選択マーカー本発明のある態様として、細胞は本発明の核酸構築物を含有し、発現構築物中にマーカーを含むことによりインビトロまたはインビボで細胞を同定することができる。そのようなマーカーは細胞に同定できる変化を与え、発現構築物を含有する細胞の容易な同定を可能にする。通常、薬剤選択マーカーの含有はクローニング及び形質転換体の選択に役立ち、例えば、ネオマイシ、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン及びヒスチジノールに対する耐性を与える遺伝子が有用な選択マーカーである。あるいはまた、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のような酵素を用いてもよい。また、免疫学的マーカーを用いることもできる。用いられる選択マーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時にそれを発現できる限り、重要であると考えられない。選択マーカーのさらなる例は当業者によく知られている。（iii）複数遺伝子構築物及びＩＲＥＳ本発明のある態様として、複数遺伝子またはポリシストロン性メッセージを作製するために内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）成分の使用が用いられる。ＩＲＥＳ成分は５’メチル化されたＣａｐ依存性翻訳のリボソーム走査モデルを回避し、内部の位置で翻訳を開始することができる（Ｐｅｌ１ｅｔｉｅｒ及びＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）。哺乳類のメッセージからのＩＲＥＳと同様に（Ｍａｃｅｊａｋ及びＳａｒｎｏｗ、１９９１）、ピカノウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオ及び脳心筋炎）からのＩＲＥＳ成分が記述されている（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ及びＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）。ＩＲＥＳ成分を異種起源のオープンリーディングフレームに連結することができる。各々ＩＲＥＳにより分離された複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写することができ、ポリシストロン性メッセージを作る。ＩＲＥＳ成分により、各オープンリーディングフレームは効率よい翻訳のためにリボソームを利用できる。単一のメッセージを転写するために単一のプロモーター／エンハンサーを用いて複数の遺伝子を効率よく発現させることができる。あらゆる異種起源のオープンリーディングフレームをＩＲＥＳ成分に連結することができる。これは分泌タンパク質、別個の遺伝子によりコードされる複数サブユニットタンパク質、細胞内または膜結合タンパク質及び選択マーカーの遺伝子を含む。このようにして、単一の構築物及び単一の選択マーカーを用いていくつかのタンパク質の発現を同時に細胞中で実施することができる。（iv）発現ベクターの送達発現ベクターを細胞中に導入することができる多数の方法がある。本発明のある態様として、発現構築物はウイルスまたはウイルスゲノムに由来する設計構築物を含んでなる。ある種のウイルスが受容体により媒介されるエンドサイトーシスにより細胞に入り、宿主細胞ゲノム中に組込み、そしてウイルス遺伝子を安定に且つ効率よく発現する能力は、それらを哺乳類細胞中に外来遺伝子を導入するための魅力的な候補にしている（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；Ｎｉｃｏｌａｓ及びＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｔｅｍｉｎ、１９８６）。遺伝子ベクターとして用いられた最初のウイルスはパポーバウイルス（シミアンウイルス４０、ウシパピローマウイルス及びポリオーマ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６）並びにアデノウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６）を初めとするＤＮＡウイルスであった。これらは外来ＤＮＡ配列の比較的低い容量を有し、そして限られた宿主範囲を有する。さらに、許容細胞におけるそれらの腫瘍形成潜在能力及び細胞変性作用は安全性の懸念を提起する。それらは８ｋｂまでのみの外来遺伝物質を受け入れることができるが、それらを様々な細胞系及び実験動物に容易に導入することができる（Ｎｉｃｏｌａｓ及びＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；Ｔｅｍｉｎ、１９８６）。インビボ送達のための好ましい方法の一つはアデノウイルス発現ベクターの使用を含む。「アデノウイルス発現ベクター」は（ａ）構築物のパッケージングを助けるため及び（ｂ）その中にクローン化されているアンチセンスポリヌクレオチドを発現させるために十分なアデノウイルス配列を含有する構築物を含むことを意味する。これに関連して、発現は遺伝子産物が合成されることを必要としない。発現ベクターはアデノウイルスの遺伝子工学設計された形態を含んでなる。３６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡウイルスのアデノウイルスの遺伝子構成の知識により、７ｋＢまでの外来配列でアデノウイルスＤＮＡの大きい断片を置換することができる（Ｇｒｕｎｈａｕｓ及びＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２）。レトロウイルスと対照的に、アデノウイルスＤＮＡは潜在的遺伝毒性なしにエピソームのように複製することができるので、宿主細胞のアデノウイルス感染は染色体組込みをもたらさない。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、多くの増幅後にゲノム再編成は検出されていない。アデノウイルスは細胞周期の時期の如何にかかわらず実質的に全ての上皮細胞に感染することができる。これまでのところ、アデノウイルス感染はヒトにおける急性呼吸器疾患のような軽い疾病にのみ関連するようである。アデノウイルスは、その中間の大きさのゲノム、操作の容易さ、高い力価、広い標的細胞範囲及び高い感染力のために遺伝子導入ベクターとしての使用のために特に適している。ウイルスゲノムの両末端は１００−２００塩基対の逆方向反復配列（ＩＴＲ）を含有し、それらはウイルスＤＮＡ複製及びパッケージングのために必要なシス成分である。ゲノムの初期（Ｅ）及び後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始により分けられる異なる転写単位を含有する。Ｅ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）はウイルスゲノムの転写の調節のためのタンパク質及び少数の細胞遺伝子をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２Ａ及びＥ２Ｂ）の発現はウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質はＤＮＡ複製、後期遺伝子発現及び宿主細胞遮断に関与する（Ｒｅｎａｎ、１９９０）。ウイルスキャプシドタンパク質の大部分を初めとする後期遺伝子の産物は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）により出される単一の一次転写産物の著しいプロセシング後にのみ発現される。ＭＬＰ（１６．８ｍ．ｕ．に位置する）は感染の後期中に特に効率よく、このプロモーターから出される全てのｍＲＮＡは５’の３深裂（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー（ＴＰＬ）配列を保有し、それはそれらを翻訳のために好ましいｍＲＮＡにする。現在の系において、組み換えアデノウイルスはシャトルベクターとプロウイルスベクター間の相同組み換えから作製される。２つのプロウイルスベクター間の可能な組み換えのために、この工程から野生型アデノウイルスが作製される可能性がある。それ故、個々のプラークからウイルスの単一クローンを単離し、そのゲノム構造を調べることが重要である。複製能力を欠いている現在のアデノウイルスベクターの作製及び増殖は２９３と呼ばれる独特なヘルパー細胞系に依存し、それはＡｄ５ＤＮＡフラグメントによりヒト胚腎臓細胞から形質転換され、構成的にＥ１タンパク質を発現する（Ｇｒａｈａｍ等、１９７７）。Ｅ３領域はアデノウイルスゲノムからなくてもよいので（Ｊｏｎｅｓ及びＳｈｅｎｋ、１９７８）、２９３細胞の助けを有する、現在のアデノウイルスベクターはＥ１、Ｅ３またはその両方の領域のいずれか中に外来ＤＮＡを保有する（Ｇｒａｈａｍ及びＰｒｅｖｅｃ、１９９１）。事実上、アデノウイルスは野生型ゲノムの約１０５％をパッケージングすることができ（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ等、１９８７）、約２ｋｂ余分のＤＮＡの容量を与える。Ｅ１及びＥ３領域中に置き換えることができる約５．５ｋＢのＤＮＡと合わせて、現在のアデノウイルスベクターの最大容量は７．５ｋＢ未満またはベクターの全長の約１５％である。８０％より多くのアデノウイルスウイルスゲノムはベクターバックボーン中に残り、ベクターが媒介する細胞毒性の源である。また、Ｅ１欠失ウイルスの複製欠陥も不完全である。例えば、ウイルス遺伝子発現の漏出が現在利用できるベクターで高い感染多重度（ＭＯＩ）で観察されている（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３）。ヒト胚腎臓細胞、筋肉細胞、造血細胞または他のヒト胚間充織もしくは上皮細胞のようなヒト細胞からヘルパー細胞系を得ることができる。あるいはまた、ヒトアデノウイルスを許容する他の哺乳類種の細胞からヘルパー細胞を得ることができる。そのような細胞は、例えば、Ｖｅｒｏ細胞または他のサル胚間充織もしくは上皮細胞を含む。上に記述したように、好ましいヘルパー細胞系は２９３である。最近、Ｒａｃｈｅｒ等（１９９５）は２９３細胞を培養し、アデノウイルスを増殖させるための改善された方法を開示した。一つの形態として、１００−２００ｍｌの培地を含有する１リットルのシリコン処理されたスピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）中に個々の細胞を接種することにより天然の細胞集団を増殖させる。４０ｒｐｍで撹拌した後、細胞生存度をトリパンブルーで概算する。別の形態として、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌマイクロキャリア（ＢｉｂｂｙＳｔｅｒｌｉｎ、Ｓｔｏｎｅ、ＵＫ）（５ｇ／ｌ）を以下のように用いる。５ｍｌの培地中に再懸濁した細胞接種材料を２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中のキャリア（５０ｍｌ）に添加し、時折撹拌しながら１ないし４時間静置する。次に、培地を５０ｍｌの新しい培地で置き換え、振盪を開始する。ウイルス生産のためには、細胞を約８０％融合まで増殖させ、その後、培地を（最終容量の２５％に）置き換え、アデノウイルスを０．０５のＭＯＩで添加する。培養物を一晩静置し、その後、容量を１００％まで増やし、もう７２時間振盪を開始する。アデノウイルスベクターが複製欠陥であるかまたは少なくとも条件付きで欠陥であるという必要条件以外に、アデノウイルスベクターの性質は本発明の成功した実施のために重要であると考えられない。アデノウイルスは４２の異なる既知の血清型または亜群Ａ−Ｆのいずれのものであってもよい。本発明における使用のための条件付き複製欠陥アデノウイルスベクターを得るためには亜群Ｃのアデノウイルス５型が好ましい出発材料である。これはアデノウイルス５型が多量の生化学的及び遺伝学的情報が知られているヒトアデノウイルスであり、そしてベクターとしてアデノウイルスを用いる大部分の構築物に歴史的に用いられているからである。上記のように、本発明の典型的なベクターは複製欠陥であり、アデノウイルスＥ１領域をもたない。従って、Ｅ１−コーディング配列が除かれた位置に目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入することが最も好都合である。しかしながら、アデノウイルス配列内の構築物の挿入の位置は本発明にとって重要ではない。また、Ｋａｒｌｓｓｏｎ等（１９８６）により記述されたようにＥ３置換ベクター中の除かれたＥ３領域の代わりにまたはヘルパー細胞系またはヘルパーウイルスがＥ４欠失を補う場合にはＥ４領域中に目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを挿入してもよい。アデノウイルスは増殖及び操作が容易であり、インビトロ及びインビボで広い宿主範囲を示す。この群のウイルスを高い力価、例えば、１０⁹−１０¹¹プラーク形成単位／ｍｌで得ることができ、それらは非常に感染性である。アデノウイルスの生活環は宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。アデノウイルスベクターにより送達される外来遺伝子はエピソーム的であり、それ故、宿主細胞に対して低い遺伝毒性を有する。野生型アデノウイルスでのワクチン接種の研究においていかなる副作用も報告されておらず（Ｃｏｕｃｈ等、１９６３；Ｔｏｐ等、１９７１）、インビボ遺伝子導入ベクターとしてのそれらの安全性及び治療能力を示している。アデノウイルスベクターは真核生物遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏ等、１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ等、１９９２）及びワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ及びＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２；Ｇｒａｈａｍ及びＰｒｅｖｃｃ、１９９２）において用いられている。最近、動物研究から、組み換えアデノウイルスを遺伝子治療に使用できることが示唆された（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ及びＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ等、１９９０；Ｒｉｃｈ等、１９９３）。異なる組織に組み換えアデノウイルスを投与することの研究は気管点滴注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ等、１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ等、１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔ等、１９９３）、抹消静脈内注射（Ｈｅｒｚ及びＧｅｒａｒｄ、１９９３）及び脳への定位固定接種（ＬｅＧａｌＬａＳａｌｌｅ等、１９９３）を含む。レトロウイルスは逆転写の工程により感染細胞においてそれらのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに転化する能力を特徴とする一群の一本鎖ＲＮＡウイルスである（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。次に、得られたＤＮＡはプロウイルスとして細胞の染色体中に組込み、ウイルスタンパク質の合成を導く。組込みは受容体細胞及びその子孫においてウイルス遺伝子配列の保持をもたらす。レトロウイルスゲノムはそれぞれキャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素及びエンベロープ成分をコードする３つの遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖを含有する。ｇａｇ遺伝子から上流に見いだされる配列はビリオンへのゲノムのパッケージングのためのシグナルを含有する。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列がウイルスゲノムの５’及び３ ’末端に存在する。これらは強いプロモーター及びエンハンサー配列を含有し、宿主細胞ゲノムにおける組込みのためにも必要である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。レトロウイルスベクターを構築するために、目的の遺伝子をコードする核酸をあるウイルス配列の場所でウイルスゲノム中に挿入して複製能力がないウイルスを生成する。ビリオンを生成するために、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を含有するがＬＴＲ及びパッケージング成分を含まないパッケージング細胞系を構築する（Ｍａｎｎ等、１９８３）。ｃＤＮＡを含有する組み換えプラスミドをレトロウイルスＬＴＲ及びパッケージング配列と一緒に（例えば、リン酸カルシウム沈殿により）この細胞系中に導入すると、パッケージング配列は組み換えプラスミドのＲＮＡ転写産物をウイルス粒子中にパッケージングすることができ、次に、それらは培養培地中に分泌される（Ｎｉｃｏｌａｓ及びＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；Ｔｅｍｉｎ、１９８６；Ｍａｎｎ等、１９８３）。次に、組み換えレトロウイルスを含有する培地を集め、場合により濃縮し、遺伝子導入のために用いる。レトロウイルスベクターは多種多様な細胞型に感染することができる。しかしながら、組込み及び安定な発現は宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄ等、１９７５）。ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学的改変に基づいて、レトロウイルスベクターの特異的ターゲッティングを可能にするように考案された新規な方法が最近開発された。この改変はシアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞の特異的感染を可能にすることができるはずである。組み換えレトロウイルスのターゲッティングのための異なる方法が考案され、その場合、レトロウイルスエンベロープタンパク質及び特定の細胞受容体に対するビオチン化抗体が用いられた。ストレプトアビジンを用いることによりビオチン成分を介して抗体を連結させた（Ｒｏｕｘ等、１９８９）。主要細織適合遺伝子複合体クラスＩ及びクラスII抗原に対する抗体を用いて、インビトロでそれらの表面抗原を保有する様々なヒト細胞の同種指向性ウイルスでの感染が示された（Ｒｏｕｘ等、１９８９）。本発明の全ての態様におけるレトロウイルスベクターの使用にはある制限がある。例えば、レトロウイルスベクターは、通常、細胞ゲノムの任意の位置に組込む。これは宿主遺伝子の遮断によるかまたは隣接する遺伝子の機能を妨げる可能性があるウイルス調節配列の挿入により挿入突然変異誘発をもたらす可能性がある（Ｖａｒｍｕｓ等、１９８１）。欠陥レトロウイルスベクターの使用に伴う別の懸念は、パッケージング細胞における野生型の複製能力のあるウイルスの潜在的出現である。これは組み換えウイルスからの損なわれていない配列が宿主細胞ゲノム中に組み込まれたｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖから上流に挿入するという組み換え事象から生じる可能性がある。しかしながら、組み換えの可能性を非常に減少するはずである新しいパッケージング細胞系が現在利用できる（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ等、１９８８；Ｈｅｒｓｄｏｒｆｆｅｒ等、１９９０）。他のウイルスベクターを本発明における発現構築物として用いることができる。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒ等、１９８８）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｈｅｒｍｏｎａｔ及びＭｕｚｙｃｓｋａ、１９８４）及びヘルペスウイルスのようなウイルス由来のベクターを用いることができる。それらは様々な哺乳類細胞にいくつかの魅力的な特徴を与える（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌ及びＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒ等、１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈ等、１９９０）。欠陥Ｂ型肝炎ウイルスの最近の認識から、異なるウイルス配列の構造−機能の関係に新しい洞察が得られた。インビトロ研究から、ウイルスがそのゲノムの８０％までの欠失にもかかわらずヘルパー依存性パッケージング及び逆転写の能力を保持できることが示された（Ｈｏｒｗｉｃｈ等、１９９０）。これはゲノムの大部分を外来遺伝物質で置換できることを示唆した。肝臓親和性及び持続性（組込み）は肝臓特異的遺伝子導入のための特に魅力的な特性であった。Ｃｈａｎｇ等は、最近、ポリメラーゼ、表面及び前表面（ｐｒｅ−ｓｕｒｆａｃｅ）コーディング配列の場所でカモＢ型肝炎ウイルスゲノム中にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を導入した。ニワトリ肝癌細胞系中にそれを野生型ウイルスと共に共トランスフェクトした。高い力価の組み換えウイルスを含有する培養培地を用いてカモ肝細胞に一次（ｐｒｉｍａｒｙ）感染させた。トランスフェクション後少なくとも２４日間安定なＣＡＴ遺伝子発現が検出された（Ｃｈａｎｇ等、１９９１）。センスまたはアンチセンス遺伝子構築物の発現をもたらすために、発現構築物は細胞中に送達されなければならない。細胞系を形質転換するための実験方法におけるようにインビトロで、またはある疾病状態の処置におけるようにインビボもしくはエクスビボでこの送達を成し遂げることができる。送達の一つの機構はウイルス感染により、その場合、発現構築物は感染性ウイルス粒子中に包膜化される。また、培養した哺乳類細胞中への発現構築物の導入のためのいくつかのウイルス以外の方法も本発明により意図される。これらはリン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ及びＶａｎＤｅｒＥｂ、１９７３；Ｃｈｅｎ及びＯｋａｙａｍａ、１９８７；Ｒｉｐｐｅ等、１９９０）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐａｌ、１９８５）、エレクトロボレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ等、１９８６；Ｐｏｔｔｅｒ等、１９８４）、直接微量注入（Ｈａｒｌａｎｄ及びＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５）、ＤＮＡ装填リポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕ及びＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙ等、１９７９）及びリポフェクトアミン−ＤＮＡ複合体、細胞超音波処理（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ等、１９８７）、高速微小発射体を用いた遺伝子衝撃（Ｙａｎｇ等、１９９０）並びに受容体を介したトランスフェクション（Ｗｕ及びＷｕ、１９８７；Ｗｕ及びＷｕ、１９８８）を含む。これらの技術のいくつかをインビボまたはエクスビボ用途のためにうまく適合させることができる。いったん発現構築物が細胞中に送達されると、目的の遺伝子をコードする核酸を異なる位置に配置し、発現させることができる。ある態様として、遺伝子をコードする核酸を細胞のゲノム中に安定に組込ませることができる。この組込みは相同組み換えによる同種の位置及び方向であってもよく（遺伝子置換）、またはそれは任意の不特定の位置に組込まれてもよい（遺伝子増幅）。なおさらなる態様として、核酸は別個のエピソーム的セグメントのＤＮＡとして細胞において安定に維持されてもよい。そのような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期と独立してまたは同調して維持及び複製できるために十分な配列をコードする。発現構築物がどのように細胞に送達されるか及び細胞のどこに核酸がとどまるかは用いられる発現構築物の型により決まる。本発明のさらに別の態様として、発現構築物は単に生の組み換えＤＮＡまたはプラスミドからなってもよい。細胞膜を物理的または化学的に透過性にする上記の方法のいずれかにより構築物の導入を実施することができる。これはインビトロでの導入に特に適用できるが、インビボでの使用にも同様に利用することができる。Ｄｕｂｅｎｓｋｙ等（１９８４）は成体及び新生児マウスの肝臓及び脾臓中にリン酸カルシウム沈殿物の形態でポリオーマウイルスＤＮＡをうまく注入し、活発なウイルス複製及び急性感染を示した。また、Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ及びＮｅｓｈｉｆ（１９８６）もリン酸カルシウム沈殿させたプラスミドの直接腹腔内注入がトランスフェクトされた遺伝子の発現をもたらすことを示した。目的の遺伝子をコードするＤＮＡをインビボで同様に導入し、遺伝子産物を発現させることができると予見される。本発明のさらに別の態様として、細胞中に生のＤＮＡ発現構築物を導入するために粒子衝撃を含むことができる。この方法はＤＮＡで被覆された微小発射体を高速に加速して細胞を殺さずにそれらを細胞膜を貫通させて細胞に入れる能力に依存する（Ｋｌｅｉｎ等、１９８７）。小粒子を加速するためのいくつかの装置か開発されている。一つのそのような装置は高電圧放電により電流を生成し、それは次に推進力を与える（Ｙａｎｇ等、１９９０）。用いられる微小発射体はタングステンまたは金ビーズのような生物学的に不活性の物質からなった。ラット及びマウスの肝臓、皮膚及び筋肉組織を初めとする選択された器官にインビボで衝撃を与えた（Ｙａｎｇ等、１９９０；Ｚｅｌｅｎｉｎ等、１９９１）。これは銃と標的器官の間のあらゆる介在組織を除く、すなわち、エクスビボ処置のために組織または細胞の外科的露出を必要とする可能性がある。再び、特定の遺伝子をコードするＤＮＡをこの方法により送達することができ、やはり本発明により含まれる。本発明のさらなる態様として、発現構築物をリポソームに閉じ込めることができる。リポソームはリン脂質二重層膜及び内部水性媒質を特徴とする小胞構造である。多重層リポソームは水性媒質により分けられた複数の脂質層を有する。過剰の水溶液中にリン脂質を懸濁させるとそれらは自然に形成する。密閉構造の形成前に脂質成分は自己再転位を受け、脂質二重層の間に水及び溶解した溶質を閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ及びＢａｃｈｈａｗａｔ、１９９１）。また、意図されるものはリポフェクトアミン−ＤＮＡ複合体である。インビトロでのリポソームによる核酸送達及び外来ＤＮＡの発現は非常に成功している。Ｗｏｎｇ等（１９８０）は培養したヒヨコ胚、ＨｅＬａ及び肝臓癌細胞において外来ＤＮＡのリポソームによる送達及び発現の実現可能性を示した。Ｎｉｃｏｌａｕ等（１９８７）は静脈内注射後にラットにおいて成功したリポソームによる遺伝子導入を成し遂げた。本発明のある態様として、リポソームをセンダイウイルス（ＨＶＪ）と複合体形成させることができる。これは細胞膜との融合を容易にし、リポソームに包膜化されたＤＮＡの細胞侵入を促進することが示されている（Ｋａｎｅｄａ等、１９８９）。他の態様として、リポソームを核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体形成させるかまたはそれらと共に用いることができる（Ｋａｔｏ等、１９９１）。なおさらなる態様として、リポソームをＨＶＪ及びＨＭＧ− １の両方と複合体形成させるかまたはそれらと共に用いることができる。そのような発現構築物はインビトロ及びインビボで核酸の導入及び発現にうまく用いられているので、それらは本発明に適用できる。バクテリアのプロモーターがＤＮＡ構築物中に用いられる場合、リポソーム内に適切なバクテリアポリメラーゼを含むことも望ましい。細胞中に特定の遺伝子をコードする核酸を送達するために用いることができる他の発現構築物は、受容体を介した送達媒体である。これらはほとんど全ての真核細胞における受容体を介したエンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取り込みを利用する。様々な受容体の細胞型特異的分布のために、送達は非常に特異的であることができる（Ｗｕ及びＷｕ、１９９３）。受容体を介した遺伝子ターゲッティング媒体は、通例、２つの成分：細胞受容体特異的リガンド及びＤＮＡ結合剤からなる。いくつかのリガンドが受容体を介した遺伝子導入に用いられている。最も詳細に特性化されたリガンドはアシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）（Ｗｕ及びＷｕ、１９８７）及びトランスフェリン（Ｗａｇｎｅｒ等、１９９０）である。最近、ＡＳＯＲと同じ受容体を認識する合成の新糖タンパク質が遺伝子送達媒体として用いられており（Ｆｅｒｋｏｌ等、１９９３；Ｐｅｒａｌｅｓ等、１９９４）、そして上皮増殖因子（ＥＧＦ）も扁平上皮癌細胞に遺伝子を送達するために用いられている（Ｍｙｅｒｓ、ＥＰＯ０２７３０８５）。他の態様として、送達媒体はリガンド及びリポソームを含んでなってもよい。例えば、Ｎｉｃｏｌａｕ等（１９８７）はリポソーム中に取り込んだガラクトース末端アシアルガングリオシドのラクトシル−セラミドを用い、肝細胞によるインシュリン遺伝子の取り込みの増加を認めた。従って、リポソームを含むまたは含まない多数の受容体−リガンド系により、肺、上皮または腫瘍細胞のような細胞型に特定の遺伝子をコードする核酸を特異的に送達もできることは実現可能である。例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）受容体のアップレギュレーションを示す多数の腫瘍細胞において遺伝子をコードする核酸の送達を介在するための受容体としてＥＧＦを用いることができる。肝細胞上のマンノース受容体を標的とするためにマンノースを用いることができる。また、ＣＤ５（ＣＬＬ）、ＣＤ２２（リンパ腫）、ＣＤ２５（Ｔ細胞白血病）及びＭＡＡ（黒色腫）に対する抗体を同様にターゲッティング成分として用いることができる。ある態様として、エクスビボ条件下で遺伝子導入をより容易に実施することができる。エクスビボ遺伝子治療は、動物から細胞を単離し、インビトロでそれらの細胞中に核酸を送達し、次に、改変された細胞を動物中に戻すことをさす。これは動物からの組織／器官の外科的切除または細胞及び組織の一次培養を含むことができる。一次哺乳類細胞培養物を様々な方法で調製することができる。細胞がインビトロで発現構築物と接触しながら生存し続けるためには、細胞が適切な割合の酸素と二酸化炭素及び栄養素との接触を保つが微生物汚染から防護されることを確実にすることが必要である。細胞培養技術は十分に実証され、引用することにより本明細書に開示される（Ｆｒｅｓｈｎｅｒ、１９９２）。前記のものの一つの態様はタンパク質の生産のために細胞を不死化するための遺伝子導入の使用を含む。適切な宿主細胞中に上記のように目的のタンパク質の遺伝子を導入することができ、続いて、適切な条件下で細胞を培養する。実質的にあらゆるポリペプチドの遺伝子をこのように用いることができる。組み換え発現ベクターの作製及びその中に含まれる成分は上に説明される。あるいはまた、生産されるタンパク質は当該細胞により通常合成される内因性タンパク質であってもよい。有用な哺乳類宿主細胞系の例はＶｅｒｏ及びＨｅＬａ細胞並びにチャイニーズハムスター卵巣の細胞系、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、ＮＩＨ３Ｔ３、ＲＩＮ及びＭＤＣＫ細胞である。さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望するように遺伝子産物を修飾し、プロセシングする宿主細胞系を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、開裂）はタンパク質の機能のために重要である可能性がある。異なる宿主細胞はタンパク質の翻訳後プロセシング及び修飾の独特の特定の機構を有する。発現される外来タンパク質の適切な修飾及びプロセシングを保証するために適切な細胞系または宿主系を選択することができる。それぞれ、ｔｋ ^-、ｈｇｐｒｔ ^-またはａｐｒｔ ^-細胞において、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を初めとするがそれらに限定されない多数の選択系を用いることができる。また、耐性を与えるｄｈｆｒ；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ；アミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ；及びハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏの選択の基礎として代謝拮抗物質耐性を用いることもできる。２つの形態で：培養の大部分にわたって懸濁して増殖する足場非依存性細胞としてまたは増殖のために固体支持体への付着を必要とする足場依存性細胞（すなわち、単層型の細胞増殖）としてインビトロで動物細胞を増殖させることができる。連続樹立細胞系からの足場非依存性または懸濁培養は、細胞及び細胞生成物の大規模生産の最も広く用いられる手段である。しかしながら、懸濁培養細胞は腫瘍発生潜在能力及び付着しているＴ細胞より低いタンパク質生産のような制限を有する。撹拌タンクにおける哺乳類細胞の大規模懸濁培養は組み換えタンパク質の生産の一般法である。２つの懸濁培養反応器設計、撹拌反応器及び空気吸い上げ（ａｉｒｌｉｆｔ）反応器が広く用いられている。撹拌設計はインターフェロンの生産のために８０００リットル容量でうまく用いられている。１：１ないし３：１の高さ対直径を有するステンレス鋼タンク中で細胞を増やす。通常、羽根のついた円板または船舶用プロペラ型に基づいた１つまたはそれ以上の撹拌機で培養物を混合する。羽根より弱い剪断力を与える撹拌機系が記述されている。磁気的に連結された駆動装置により撹拌機を直接的または間接的のいずれかで動かすことができる。間接運転は撹拌機軸上のシールを通した微生物混入の危険を下げる。同様に最初微生物発酵のために記述され、後に哺乳類細胞に適用された空気吸い上げ反応器は、培養の混合及び酸素注入の両方のためにガス流に依存する。ガス流は反応器の上昇管部分に入り、循環を導く。気体は培養表面で離れ、気泡を含まないより濃い液体を反応器の降水管部分において下側に移動させる。この設計の主な利点は簡単さと機械的撹拌の必要がないことである。典型的に、高さ対直径の比率は１０：１である。空気吸い上げ反応器は比較的容易にスケールアップし、気体の十分な物質移動を有し、そして比較的低い剪断力を生成する。本発明の抗体は免疫沈降による抗原の単離のために特に有用である。免疫沈降は複合混合物からの標的抗原成分の分離を含み、微量のタンパク質を識別または単離するために用いられる。膜タンパク質の単離のためには細胞は洗剤ミセルに可溶化されなけらばならない。胆汁塩のような他の薬剤は酸性ｐＨでまたは二価の陽イオンの存在下で沈殿するので、非イオン性塩が好ましい。抗体及びそれらの用途を以下にさらに説明する。 IV．ＡＯＰ２と反応性の抗体の作製別の態様として、本発明は本発明のＡＯＰ２分子またはそのあらゆる部分と免疫反応性である抗体を意図する。抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってもよい。好ましい態様として、抗体はモノクローナル抗体である。抗体を作製し、特性決定するための方法は当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｈｏｗｅｌｌ及びＬａｎｅ、１９８８を参照）。簡潔に言えば、本発明のポリペプチドを含んでなる免疫原で動物を免疫し、その免疫された動物から抗血清を集めることによりポリクローナル抗体を作製する。抗血清の生産のために多種多様な動物種を用いることができる。典型的に抗− 抗血清の生産のために用いられる動物はウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ブタまたはウマを初めとするヒト以外の動物である。ウサギの比較的大きい血液容量のために、ウサギがポリクローナル抗体の生産のための好ましい選択である。当業者に一般に知られているように、通常の免疫技術を用いて抗原のアイソフォームに特異的なポリクローナル及びモノクローナルの両方の抗体を作製することができる。本発明の化合物の抗原性エピトープを含有する組成物を用いてウサギまたはマウスのような１またはそれ以上の実験動物を免疫することができ、次に、それらは本発明の化合物に対する特定の抗体を生産し始める。抗体作製に時間を与えた後、単に動物から血液を抜き取り、全血から血清サンプルを調製することにより、ポリクローナル抗血清を得ることができる。本発明のモノクローナル抗体はＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット法のような標準的免疫化学方法並びに組織染色のような免疫組織化学方法並びにＡＯＰ２関連抗原エピトープに特異的な抗体を利用することができる他の方法において有用な用途があることが提示される。さらに、異なる種の特定のＡＯＰ２に特異的なモノクローナル抗体を他の有用な用途に利用できることが提示される。通例、ＡＯＰ２に対するポリクローナル及びモノクローナルの両方の抗体を様々な態様に用いることができる。例えば、他のＡＯＰ２をコードするｃＤＮＡまたは遺伝子を得るために抗体クローニングプロトコルにおいてそれらを用いることができる。また、細胞または動物におけるＡＯＰ２関連ペプチドの作用を分析するために阻害研究においてそれらを用いてもよい。また、抗−ＡＯＰ２抗体は様々な細胞事象中にＡＯＰ２の分布を分析するため、例えば、細胞周期の異なる時点でＡＯＰ２ポリペプチドの細胞または組織特異的分布を決定するために免疫位置測定研究においても有用である。そのような抗体の特に有用な用途は、例えば、抗体アフィニティーカラムを用いて、天然または組み換えＡＯＰ２を精製することにおいてである。全てのそのような免疫学的技術の操作は本開示を考慮に入れて当業者に理解される。抗体を調製し、特性決定するための方法は当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、１９８８を参照；引用することにより本明細書に組み込まれる）。モノクローナル抗体調製のより特定の例は以下の実施例において示される。当該技術分野においてよく知られてるように、与えられる組成物はその免疫原性が変わる可能性がある。それ故、担体にペプチドまたはポリペプチド免疫原を連結することにより得ることができるように、宿主免疫系を高めることがしばしば必要である。代表的な好ましい担体はスカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。また、オボアルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミンのような他のアルブミンも担体として用いることができる。担体タンパク質にポリペプチドを結合させるための方法は当該技術分野でよく知られており、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンコイル −Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミド及びビス−ビアゾ化ベンジジンを含む。同様に当該技術分野でよく知られているように、アジュバントとして知られている、免疫応答の非特異的刺激剤の使用により特定の免疫原組成物の免疫原性を高めることができる。代表的な好ましいアジュバントは完全フロインドアジュバント（死菌のマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含有する免疫応答の非特異的刺激剤）、不完全フロインドアジュバント及び水酸化アルミニウムアジュバントを含む。ポリクローナル抗体の生産において用いられる免疫原組成物の量は免疫原の性質及び免疫のために用いられる動物により変わる。免疫原を投与するために様々な経路を用いることができる（皮下、筋肉内、皮内、静脈内及び腹腔内）。免疫後の様々な時点で免疫動物の血液をサンプリングすることによりポリクローナル抗体の生産を調べることができる。また、２回目のブースター注射を与えてもよい。適当な力価が得られるまでブースター及び滴定を繰り返す。適切なレベルの免疫原性が得られると、免疫動物から血液を抜き取り、血清を単離し、保存することができ、そして／または動物を用いてｍＡｂを作製することができる。引用することにより本明細書に組み込まれる米国特許４，１９６，２６５中に例示されるもののような、よく知られている技術の使用によりｍＡｂを容易に調製することができる。典型的に、この技術は選択された免疫原組成物、例えば、精製されたまたは部分的に精製されたＡＯＰ２タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドまたは高レベルのＡＯＰ２を発現する細胞で適当な動物を免疫することを含む。抗体産生細胞を刺激するために有効なように免疫する組成物を投与する。マウス及びラットのような齧歯類が好ましいが、しかしながら、ウサギ、ヒツジ、カエル細胞の使用も可能である。ラットの使用はある種の利点を与える可能性があるが（Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６）、マウスが好ましく、ＢＡＬＢ／ｃマウスは最も日常的に用いられ、そして一般により高いパーセンテージの安定な融合物を与えるのでこれが最も好ましい。免疫後に、ｍＡｂ作製プロトコルにおいて用いるために抗体を生産する能力を有する体細胞、特にＢリンパ球（Ｂ細胞）を選択する。生検を実施した脾臓、扁桃もしくはリンパ節から、または抹末梢血サンプルからこれらの細胞を得ることができる。脾臓細胞及び末梢血細胞が好ましく、前者はそれらが分裂する血漿芽細胞期（ｐｌａｓｍａｂｌａｓｔｓｔａｇｃ）である抗体産生細胞の豊富な源であるからであり、後者は末梢血が容易に入できるからである。しばしば、一団の動物を免疫し、最も高い抗体力価を有する動物の脾臓を取り出し、注射器で脾臓を均質化することにより脾臓リンパ球を得る。典型的に、免疫動物からの脾臓は約５ｘ１０⁷ないし２ｘ１０⁸のリンパ球を含有する。次に、通例、免疫された動物と同種のものの不死の骨髄腫細胞の細胞と免疫動物からの抗体産生Ｂリンパ球を融合させる。ハイブリドーマを生成する融合方法における使用のために適当な骨髄種細胞系は好ましくは抗体を産生せず、高い融合効率及び所望する融合細胞（ハイブリドーマ）のみの生育を与えるある種の選択培地において次に生育できないようにする酵素欠失を有する。当業者に知られているように、多数の骨髄種細胞のいずれを用いてもよい（Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６；Ｃａｍｂｅｌｌ、１９８４）。例えば、免疫動物がマウスである場合、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４１、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ−１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７及びＳ１９４／５ＸＸ０Ｂｕｌを用いることができ；ラットには、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ及び４Ｂ２１０を用いることができ；そしてＵ−２６６、ＧＭ１５００ −ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２及びＵＣ７２９−６は全て細胞融合に関連して有用である。抗体を産生する脾臓またはリンパ節細胞と骨髄種細胞の雑種の作製方法は、通常、細胞膜の融合を促進する薬剤または複数の薬剤（化学的または電気的）の存在下で、比率がそれぞれ約２０：１から約１：１まで変わる可能性があるが、２：１の比率で体細胞を骨髄種細胞と混合することを含んでなる。センダイウイルスを用いる融合方法（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｃｉｎ、１９７５；１９７６）及びＧｅｆｔｅｒ等（１９７７）による３７％（ｖ／ｖ）ＰＥＧのようなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いるものが記述されている。また、電気的に誘導される融合方法の使用も適切である（Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６）。融合方法は、通常、約１ｘ１０^-6ないし１ｘ１０^-8の低い頻度で生存できる雑種を生じる。しかしながら、選択培地で培養することにより生存できる融合した雑種は親の非融合細胞（特に、通常無限に分裂し続ける融合していない骨髄種細胞）から区別されるので、これは問題ではない。選択培地は、通例、組織培養培地中にヌクレオチドの新生合成を妨げる薬剤を含有するものである。代表的な好ましい薬剤はアミノプテリン、メトトレキセート及びアザセリンである。アミノプテリン及びメトトレキセートはプリン及びピリミジンの両方の新生合成を妨げ、一方、アザセリンはプリン合成のみを妨げる。アミノプテリンまたはメトトレキセートを用いる場合、ヌクレオチドの供給源としてヒポキサンチン及びチミジンを培地に補足する（ＨＡＴ培地）。アザセリンを用いる場合、ヒポキサンチンを培地に補足する。好ましい選択培地はＨＡＴである。ヌクレオチド再利用経路を動かすことができる細胞のみＨＡＴ培地で生き残ることができる。骨髄種細胞は再利用経路の重要な酵素、例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を欠いており、それらは生き残ることができない。Ｂ細胞はこの経路を動かすことができるが、それらは培養において限られた寿命を有し、通例、約２週以内に死ぬ。それ故、選択培地で生き残ることができる唯一の細胞は骨髄種及びＢ細胞から形成される雑種である。この培養はハイブリドーマの集団を与え、それから特定のハイブリドーマを選択する。典型的には、マイクロタイタープレートにおける単一クローン希釈により細胞を培養し、続いて、（約２ないし３週後に）個々のクローン上清を所望する反応性に関して試験することによりハイブリドーマの選択を実施する。放射線免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイ等のように、アッセイは高感度で簡単で迅速であるべきである。次に、選択したハイブリドーマを連続希釈して、個々の抗体産生細胞系にクローン化し、次に、それらのクローンを無限に増殖させてｍＡｂを与えることができる。２つの基本的方法でｍＡｂ生産にそれらの細胞系を利用することができる。最初の融合のために体細胞及び骨髄種細胞を提供するために用いた型の組織適合性動物に（しばしば腹腔中に）ハイブリドーマのサンプルを注入できる。注入された動物は融合細胞雑種により生産される特定のモノクローナル抗体を分泌する腫瘍を生じる。次に、血清または腹水液のような動物の体液を取って高濃度のｍＡｂをもたらすことができる。また、個々の細胞系をインビトロで培養することもでき、その場合、ｍＡｂは培養培地中に自然に分泌され、それから容易に高濃度で得ることができる。必要な場合、濾過、遠心分離及びＨＰＬＣまたはアフィニティークロマトグラフィーのような様々なクロマトグラフィー方法を用いて、いずれかの方法により生産されたｍＡｂをさらに精製することができる。Ｖ．ＡＯＰ２を含む疾病状態の診断本発明はＡＯＰ２及び関連遺伝子の改変がアテローム性動脈硬化症と関係することを決定した。それ故、アテローム性動脈硬化症及び関連疾患状態の診断または予後指標としてＡＯＰ２及び対応する遺伝子を用いることができる。より具体的には、ＡＯＰ２に関する点突然変異、欠失、挿入または調節混乱（ｐｅｒｔｕｂａｔｉｏｎ）はアテローム性動脈硬化症または関連疾患を引き起こすかまたは促進する可能性がある。Ａ．遺伝子診断本発明の一つの態様はＡＯＰ２の発現の変動を検出するための方法を含んでなる。これは細胞において発現されたＡＯＰ２のレベルを測定することまたは発現産物の特定の変化を測定することを含んでなることができる。明らかに、この種のアッセイはアテローム性動脈硬化症及び関連疾患の診断において重要性を有する。関連疾患状態は冠動脈性心疾患、虚血性心疾患及び脳卒中を含む。生物学的サンプルはあらゆる組織または体液であってもよい。様々な態様は心臓の細胞、血液循環系（あらゆる血管の動脈、静脈内皮細胞裏層）、皮膚、筋肉、顔、脳、前立腺、胸、子宮内膜、肺、頭及び首、膵臓、小腸、血液細胞、肝臓、精巣、卵巣、結腸、皮膚、胃、食道、脾臓、リンパ節、骨髄、腎臓または免疫細胞（例えば、単球、マクロファージ）を含む。他の態様は末梢血、リンパ液、腹水、漿液、胸膜滲出液、痰、脳脊髄液、涙液、便または尿のような体液サンプルを含む。標準的な方法論（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９）に従って、生物学的サンプル中に含まれる細胞から用いられる核酸を単離する。核酸はゲノムＤＮＡまたは分画もしくは全細胞ＲＮＡてあってもよい。ＲＮＡを用いる場合、ＲＮＡを相補的ＤＮＡに転化することが適切である可能性がある。ある態様としてＲＮＡは全細胞ＲＮＡであり；別の態様としてそれはポリ−ＡＲＮＡである。通常、核酸を増幅する。形態により、増幅を用いて直接的にまたは増幅後にもう一つの既知の核酸を用いてサンプル中の目的の特定の核酸を同定する。次に、同定された産物を検出する。ある用途では、視覚的方法（例えば、ゲルの臭化エチジウム染色）により検出を実施することができる。あるいはまた、検出は化学発光、放射性標識の放射能シンチグラフィーもしくは蛍光標識によるかまたはさらに電気的もしくは熱衝撃シグナル（ＡｆｆｙｍａｘＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｂｅｌｌｕｓ、１９９４）を用いる系による生成物の間接的的同定を含むことができる。検出後に、与えられた患者において見られた結果を正常患者及びＡＯＰ２関連病状を有する患者の統計的に有意な対照群と比較することができる。このようにして、様々な臨床状態で検出されるＡＯＰ２の量もしくは種類または臨床状態の素因に相関させることが可能である。様々な型の欠失が同定されるはずである。従って、「変化」は欠失、挿入、点突然変異及び重複を含むと解釈されるべきである。点突然変異は終止コドン、フレームシフト突然変異またはアミノ酸置換をもたらす。体細胞突然変異は生殖細胞以外の組織に起こるものである。生殖細胞組織はいずれの組織にも存在することができ、受け継がれる。コーディング領域中及び外側の突然変異も、遺伝子の転写を改変するかまたは不安定にするかまたはそうでなければ転写産物（ｍＲＮＡ）もしくはタンパク質のいずれかのプロセシングを改変することの両方により、生産されるＡＯＰ２の量に影響を及ぼす可能性がある。蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、直接ＤＮＡシークエンシング、ＰＦＧＥ分析、サザンまたはノーザンブロッティング、一本鎖構造分析（ＳＳＣＡ）、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ドットブロット分析、変性勾配ゲル電気泳動、ＲＦＬＰ及びＰＣＲ−ＳＳＣＰを初めとするがそれらに限定されない様々な異なるアッセイがこれに関連して意図される。（ｉ）プライマー及びプローブプライマーという用語は、本明細書において定義される場合、鋳型に依存する工程において発生期核酸の合成をプライミングできるあらゆる核酸を包含することを意味する。典型的に、プライマーは１０から２０塩基対までの長さのオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列を用いることができる。一本鎖形態が好ましいが、二本鎖または一本鎖形態でプライマーを与えることができる。プローブはプライマーのように働くことができるが、それらを異なって定義する。プローブは、おそらくプライミングできるが、標的ＤＮＡまたはＲＮＡに結合するように設計され、増幅工程に用いられる必要はない。好ましい態様として、プローブまたはプライマーを放射性種（³²Ｐ、¹⁴Ｃ、³⁵ Ｓ、³Ｈもしくは他の標識）、発蛍光団（ローダミン、フルオレセイン）または化学発光（ルシフェラーゼ）で標識する。（ii）鋳型依存的増幅方法与えられた鋳型サンプル中に存在するマーカー配列を増幅するために多数の鋳型依存的方法が利用できる。最もよく知られている増幅方法の一つは米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００、１５９号中並びにＩｎｎｉｓ等、１９９０中に詳細に記述される（ＰＣＲ^TM （商標）と呼ばれる）ポリメラーゼ連鎖反応であり、それらの各々は全部引用することにより本明細書に組み込まれる。簡潔に言えば、ＰＣＲでは、マーカー配列の向かい合う相補鎖上の領域に相補的な２つのプライマー配列を準備する。過剰のデオキシヌクレオシド３リン酸をＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼと共に反応混合物に添加する。マーカー配列がサンプル中に存在する場合、プライマーはマーカーに結合し、ポリメラーゼはヌクレオチドを付加することによりマーカー配列に沿ってプライマーを伸長させる。反応混合物の温度を上げたり下げたりすることにより、伸長したプライマーはマーカーから解離して反応産物を生じ、過剰のプライマーはマーカー及び反応産物に結合し、工程が繰り返される。増幅されるｍＲＮＡの量を定量するために逆転写酵素ＰＣＲ増幅方法を実施することができる。ｃＤＮＡにＲＮＡを逆転写する方法はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９中に記述されている。逆転写のための別の方法は熱安定性のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを利用する。これらの方法は１９９０年１２月２１日に出願されたＷＯ９０／０７６４１中に記述されている。ポリメラーゼ連鎖反応方法論は当該技術分野においてよく知られている。別の増幅方法は、全部引用することにより本明細書に組み込まれるＥＰＯ第３２０３０８号に開示されたリガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）である。ＬＣＲでは、２つの相補的プローブ対を準備し、標的配列の存在下で、各対はそれらが隣接するように標的の向かい合う相補鎖に結合する。リガーゼの存在下で、２つのプローブ対は連結して単一単位を形成する。温度サイクリングにより、ＰＣＲにおけるように、結合して連結合された単位は標的から解離し、次に、過剰のプローブ対のライゲーションの「標的配列」として働く。米国特許４，８８３，７５０は標的配列にプローブ対を結合させるためのＬＣＲに類似した方法を記述する。ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ第８７／００８８０号中に記述されたＱβレプリカーゼも本発明におけるさらに別の増幅方法として用いることができる。この方法では、標的のものに相補的な領域を有するＲＮＡの複製可能な配列をＲＮＡポリメラーゼの存在下でサンプルに添加する。ポリメラーゼは複製可能な配列をコピーし、それを次に検出することができる。また、制限部位の一方の鎖にヌクレオチド５’−［α−チオ］−３リン酸を含有する標的分子の増幅を実施するために制限エンドヌクレアーゼ及びリガーゼを用いる等温増幅方法も、本発明における核酸の増幅に有用である可能性がある、Ｗａｌｋｅｒ等（１９９２）。鎖置換増幅（ＳＤＡ）は複数回の鎖置換及び合成、すなわち、ニックトランスレーションを伴う核酸の等温増幅を実施する別の方法である。修復鎖反応（ＲＣＲ）と呼ばれる類似した方法は、増幅の標的とされる領域にわたっていくつかのプローブをアニーリングさせること及びそれに続く４塩基のうち２つのみが存在する修復反応を含む。残りの２つの塩基を容易な検出のためにビオチン化誘導体として添加することができる。類似した方法はＳＤＡにおいて用いられる。また、環状プローブ反応（ＣＰＲ）を用いて標的特異的配列を検出することもできる。ＣＰＲでは、非特異的ＤＮＡの３’及び５’配列及び特異的ＲＮＡの中間配列を有するプローブをサンプル中に存在するＤＮＡにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションすると、反応をＲＮアーゼＨで処理し、プローブの生成物を消化後に遊離される特有の生成物として同定する。元の鋳型を別のサイクリングプローブにアニーリングさせ、反応を繰り返す。各々、全部引用することにより本明細書に組み込まれる、ＧＢ出願第２２０２３２８号及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ第８９／０１０２５号中に記述されるさらに別の増幅反応を本発明により用いることができる。前者の出願では、「修飾された」プライマーをＰＣＲ様の鋳型及び酵素依存的合成に用いる。捕獲成分（例えば、ビオチン）及び／または検出成分（例えば、酵素）で標識することによりプライマーを修飾することができる。後者の出願では、過剰の標識されたプローブをサンプルに添加する。標的配列の存在下で、プローブは結合し、触媒的に開裂される。開裂後に、標的配列は元のまま遊離されて過剰のプローブにより結合される。標識されたプローブの開裂は標的配列の存在をシグナルで知らせる。他の核酸増幅方法は核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）及び３ＳＲ（Ｋｗｏｈ等、１９８９；Ｇｉｎｇｅｒａｓ等、ＰＣＴ出願ＷＯ８８／１０３１５、全部引用することにより本明細書に組み込まれる）を初めとする転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）を含む。ＮＡＳＢＡでは、標準的フェノール／クロロホルム抽出、臨床サンプルの熱変性、溶解バッファーでの処理並びにＤＮＡ及びＲＮＡの単離のためのミニスピンカラムまたはＲＮＡの塩化グアニジニウム抽出により核酸を増幅のための調製することができる。これらの増幅技術は標的特異的配列を有するプライマーのアニーリングを含む。重合後に、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドをＲＮアーゼＨで消化し、一方、二本鎖ＤＮＡ分子を再び熱変性する。いずれの場合にも、第二の標的特異的プライマーの添加及びそれに続く重合により一本鎖ＤＮＡを完全に二本鎖にする。次に、二本鎖ＤＮΛ分子をＴ７またはＳＰ６のようなＲＮＡポリメラーゼにより何倍にも転写する。等温サイクル反応おいて、ＲＮＡのものを一本鎖ＤＮＡに逆転写し、次にそれを二本鎖ＤＮＡに転化し、次に、Ｔ７またはＳＰ６のようなＲＮＡポリメラーゼでもう一度転写する。得られる生成物は欠失または完全であろうと標的特異的配列を示す。Ｄａｖｅｙ等、ＥＰＯ第３２９８２２号（全部引用することにより本明細書に組み込まれる）は、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮΛ及び二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を周期的に合成することを含む核酸増幅方法を開示し、それを本発明により用いることができる。ｓｓＲＮＡは第一プライマーオリゴヌクレオチドの鋳型であり、それは逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）により伸長されるる。次に、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかと二本鎖のＲＮＡに特異的なＲＮアーゼ）の作用により、得られたＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖からＲＮＡを取り除く。得られたｓｓＤＮＡは第二プライマーの鋳型であり、それは鋳型へのその相同性の５’に（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより例示される）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列も含む。次に、（エシェリキア・コリＤＮＡポリメラーゼＩのラージ「クレノウ」フラグメントにより例示される）ＤＮＡポリメラーゼによりこのプライマーを伸長させ、プライマー間に元のＲＮＡのものと同一の配列を有し且つ一方の末端にさらにプロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）分子をもたらす。このプロモーター配列は適切なＲＮＡポリメラーゼにより用いられてＤＮＡの多数のＲＮＡコピーを作製することができる。次に、これらのコピーをサイクルに再び入ることができ、非常に速い増幅をもたらす。酵素を適切に選択して、各サイクルで酵素を添加せずにこの増幅を等温で実施することができる。この方法の周期性のために、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの形態であるように出発配列を選択することができる。Ｍｉｌｌｅｒ等、ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０６７００（全部引用することにより本明細書に組み込まれる）は標的の一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのプロモーター／プライマー配列のハイブリダイゼーション及びそれに続く配列の多数のＲＮＡコピーの転写に基づく核酸配列増幅スキームを開示している。このスキームは周期的ではなく、すなわち、得られるＲＮＡ転写産物から新しい鋳型は生成されない。他の増幅方法は「ＲＡＣＥ」及び「片側ＰＣＲ」（Ｆｒｏｈｍａｎ、Ｍ．Ａ．、ＰＣＲＰＲＯＴＯＣＯＬＳ：ＡＧＵＩＤＥＴＯＭＥＴＨＯＤＳＡＮＤＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ中、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、１９９０；Ｏｈａｒａ等、１９８９；各々全部引用することにより本明細書に組み込まれる）を含む。得られる「ジ−オリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下で２つ（またはそれ以上）のオリゴヌクレオチドを連結し、それによりジ−オリゴヌクレオチドを増幅することに基づく方法も本発明の増幅工程に用いることができる。Ｗｕ等（１９８９）、全部引用することにより本明細書に組み込まれる。（iii）サザン／ノーザンブロッティングブロッティング技術は当業者によく知られている。サザンブロッティングは標的としてＤＮＡの使用を含み、一方、ノーザンブロッティングは標的としてＲＮＡの使用を含む。ｃＤＮＡブロッティングは多くの点でＲＮＡ種のブロッティングに類似するが、各々異なるタイプの情報を与える。簡潔に言えば、適当なマトリックス、しばしばニトロセルロースのフィルター上に固定されているＤＮＡまたはＲＮＡ種を標的とするためにプローブが用いられる。異なる種類は分析を容易にするために空間的に分離されるべきである。これはしばしば核酸種のゲル電気泳動及びそれに続くフィルター上への「ブロッティング」により成し遂げられる。続いて、変性及び再ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、ブロットされた標的を（通常、標識された）プローブとインキュベートする。プローブは標的と塩基対合するように設計されるので、再生条件下でプローブは標的配列の一部に結合する。次に、結合していないプローブを除き、上記のように検出を成し遂げる。（iv）分離方法通常、ある段階で、特異的増幅が起こったかどうかを決定する目的のために鋳型及び過剰のプライマーから増幅産物を分離することが望ましい。一つの態様として、標準法を用いてアガロース、アガロース−アクリルアミドまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動により増幅産物を分離する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９を参照。あるいはまた、分離を実施するためにクロマトグラフィー技術を用いることができる。本発明において用いることができる多くの種類のクロマトグラフィー：吸着、分配、イオン交換及び分子ふるい、並びにカラム、ペーパー、薄層及びガスクロマトグラフィーを初めとするそれを用いるための多数の特殊化した技術がある（Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ、１９８２）。（ｖ）検出方法マーカー配列の増幅を確かめるために産物を視覚化することができる。ある典型的な視覚化方法は臭化エチジウムでのゲルの染色及びＵＶ光下での視覚化を含む。あるいはまた、増幅産物が放射性または蛍光測定法的に標識されたヌクレオチドで全体的に標識される場合、分離後に、増幅産物を次にｘ線フィルムに露出するか、または適切な刺激スペクトル下で視覚化することができる。一つの態様として、視覚化を間接的に実施する。増幅産物の分離後に、標識された核酸プローブを増幅されたマーカー配列と接触させる。好ましくはプローブを発色団に結合させるが、放射性標識してもよい。別の態様として、抗体またはビオチンのような結合相手にプローブを結合させ、結合対のもう一方のメンバーが検出可能な成分を保有する。一つの態様として、検出は標識されたプローブによる。関係する技術は当業者によく知られており、分子プロトコルに関する多数の標準的な本に見いだすことができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９を参照。例えば、発色団または放射性標識プローブまたはプライマーは増幅中または後に標的を同定する。前記のものの一つの例は、引用することにより本明細書に組み込まれる米国特許第５，２７９，７２１号中に記述されており、それは核酸の自動電気泳動及び移行のための装置及び方法を開示する。その装置はゲルの外部操作なしに電気泳動及びブロッティングを可能にし、本発明の方法を実施するために理想的に適している。さらに、標準的な配列分析技術を用いて特定の種類の変異を同定するために上記の増幅産物を配列分析に供することができる。ある方法内では、最適シークエンシングのために設計されたプライマー組を用いた配列分析により遺伝子の完全な分析を実施する（Ｐｉｇｎｏｎ等、１９９４）。本発明はこれらの型の分析のいずれかまたは全てを用いることができる方法を提供する。本明細書に開示される配列を用いて、Ａｏｐ２遺伝子の全体にわたって配列が増幅できるようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができ、次に直接シークエンス法によりそれらを分析することができる。（vi）キット成分Ａｏｐ２及びその変異体を検出し、シークエンスするために必要な全ての必須物質及び試薬をキットに一緒に組み立てることができる。通例、これらは前以て選択したプライマー及びプローブを含んでなる。また含まれるものは、各種ポリメラーゼ（ＲＴ、Ｔａｑ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ^TM（商標）等）を初めとする核酸を増幅するために適当な酵素、デオキシヌクレオチド及びバッファーであってもよく、増幅のために必要な反応混合物を与える。また、通例、そのようなキットは適当な方法で各個々の試薬及び酵素並びに各プライマーまたはプローブのための別個の容器も含んでなる。（vii）相対的定量ＲＴ−ＰＣＲの設計及び理論的考察患者から単離された特定のｍＲＮＡ種の相対的濃度を測定するためにｃＤＮＡへのＲＮＡの逆転写（ＲＴ）及びそれに続く相対的定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いることができる。特定のｍＲＮＡ種の濃度が変わることを測定することにより、特定のｍＲＮＡ種をコードする遺伝子が異なって発現されることが示される。ＰＣＲでは、増幅された標的ＤＮＡの分子の数は、ある試薬が制限するようになるまで反応のサイクル毎でほぼ２倍増加する。その後、サイクル間で増幅された標的の増加がなくなるまで増幅の割合はしだいに減少するようになる。サイクル数がＸ軸であり、増幅された標的ＤＮＡの濃度のｌｏｇがＹ軸であるグラフをブロットする場合、ブロットされた点をつなぐことにより特徴的な形の曲線が形成される。第一サイクルから出発して、線の傾きは正で一定である。これは曲線の直線状部分であると呼ばれる。試薬が制限するようになった後、線の傾きは減少し始め、最終的にゼロになる。この時点で増幅された標的ＤＮＡの濃度はある固定値に漸近的になる。これは曲線のプラトー部分であると呼ばれる。ＰＣＲ増幅の直線状部分における標的ＤＮＡの濃度は、反応を始める前の標的の出発濃度に直接比例する。同じサイクル数を完了し且つ直線状範囲にあるＰＣＲ反応における標的ＤＮＡの増幅産物の濃度を測定することにより、元のＤＮＡ混合物中の特定の標的配列の相対濃度を決定することが可能である。ＤＮＡ混合物が異なる組織または細胞から単離されたＲＮＡから合成されたｃＤＮＡである場合、標的配列が得られた特定のｍＲＮＡの相対量をそれぞれの組織または細胞に対して決定することができる。ＰＣＲ産物の濃度と相対的ｍＲＮＡ量の間のこの直接対応はＰＣＲ反応の直線状範囲においてのみ当てはまる。曲線のプラトー部分の標的ＤＮＡの最終濃度は反応混合物中の試薬の利用性により決定され、標的ＤＮＡの最初の濃度に関係しない。それ故、ＲＮＡ集団の収集に対してＲＴ−ＰＣＲによりｍＲＮＡ種の相対量を測定することができる前に満たされなければならない第一条件は、ＰＣＲ反応がそれらの曲線の直線状部分にある時に増幅されたＰＣＲ産物の濃度のサンプリングをしなければならないことである。特定のｍＲＮＡ種の相対量をうまく測定するためにＲＴ−ＰＣＲ実験が満たさなければならない第二の条件は、増幅できるｃＤＮＡの相対濃度がある独立した基準に標準化されなければならないことである。ＲＴ−ＰＣＲ実験の目的はサンプル中の全てのｍＲＮＡ種の平均量に対する特定のｍＲＮＡ種の量を測定することである。以下に記述する実験において、β−アクチン、アスパラギンシンテターゼ及びリポコルチンIIのｍＲＮＡを外部及び内部基準として用い、それらに他のｍＲＮＡの相対量を比較する。競合ＰＣＲの大部分のプロトコルは標的とほぼ同量である内部ＰＣＲ基準を利用する。これらの方法はＰＣＲ増幅の産物がそれらの直線期中にサンプリングされる場合に有効である。反応がプラトー期に近づいている時に産物がサンプリングされる場合、量が少ない方の産物は比較的過剰に示されるようになる。示差的発現に関してＲＮＡサンプルを調べる場合であるように、多数の異なるＲＮＡサンプルに対して実施される相対量の比較は、ＲＮＡの相対量の差が実際より少なく見えるようにゆがめられるようになる。内部基準が標的よりかなり多量である場合これは重大な問題ではない。内部基準が標的より多量である場合、ＲＮＡサンプル間で直接一次比較を実施することができる。上記の説明は臨床的に得られる物質のＲＴ−ＰＣＲアッセイのための理論的考察を記述する。臨床サンプルに固有の問題は、それらが様々な量のものであること（標準化を難しくする）及びそれらが様々な質のものであること（好ましくは標的より大きい大きさの、信頼でいる内部コントロールの共増幅を必要とする）である。内部基準が標的ｃＤＮＡフラグメントより大きい増幅可能なｃＤＮΛフラグメントであり、そして内部基準をコードするｍＲＮＡの量が標的をコードするｍＲＮＡよりほぼ５−１００倍多い、内部基準との相対的定量ＲＴ−ＰＣＲとしてＲＴ−ＰＣＲが実力也される場合これらの問題の両方とも克服される。このアッセイは相対量を測定し、それぞれのｍＲＮＡ種の絶対量ではない。外部基準プロトコルでより一般的な相対的定量ＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて他の研究を実施することができる。これらのアッセイはＰＣＲ産物をそれらの増幅曲線の直線状部分でサンプリングする。サンプリングのために最適なＰＣＲサイクルの数を各標的ｃＤＮＡフラグメントに対して実験的に決定しなければならない。さらに、様々な組織サンプルから単離された各ＲＮＡ集団の逆転写酵素産物を等濃度の増幅可能なｃＤＮＡに対して注意深く標準化しなければならない。アッセイは絶対的ｍＲＮＡ量を測定するのでこの考察は非常に重要である。標準化されたサンプルにおいてのみ示差的遺伝子発現の尺度として絶対ｍＲＮＡ量を用いることができる。増幅曲線の直線状範囲の実験による決定及びｃＤＮＡ調製物の標準化は単調で時間がかかる工程であるが、得られるＲＴ−ＰＣＲアッセイは内部基準での相対的定量ＲＴ−ＰＣＲアッセイから得られるものより優れている可能性がある。この利点の１つの理由は、内部基準／競合相手なしに、試薬の全てを増幅曲線の直線状範囲の単一のＰＣＲ産物に転化できることであり、従って、アッセイの感度を増す。もう一つの理由は、一つのＰＣＲ産物のみで、電気泳動ゲルでの産物の表示または他の表示方法があまり複雑でなくなり、より低いバックグラウンドを有し、解釈するのがより容易であることである。（viii）チップ技術本発明により特に意図されるものはＨａｃｉａ等（１９９６）及びＳｈｏｅｍａｋｅｒ等（１９９６）により記述されたもののようなチップに基づくＤＮＡ技術である。簡潔に言えば、これらの技術は多数の遺伝子を迅速に且つ正確に分析するための定量法を含む。オリゴヌクレオチドを遺伝子につけるかまたは固定されたプローブ配置を用いることにより、高密度配置として標的分子を分離し、これらの分子をハイブリダイゼーションに基づいてスクリーニングするためにチップ技術を用いることができる。Ｐｅａｓｅ等、（１９９４）；Ｆｏｄｏｒ等（１９９１）も参照。Ｂ．免疫診断ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロッティングのような技術により、健康及び罹病組織のＡＯＰ２含有量を特性化することに本発明の抗体を用いることができる。これは抗酸化剤活性の有無またはアテローム性動脈硬化症の予測変数としてのスクリーニングを提供することができる。ＥＬＩＳＡアッセイにおける本発明の抗体の使用が意図される。例えば、抗− ＡＯＰ２抗体を選択した表面、好ましくはポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルのようなタンパク質親和性を示す表面上に固定する。不完全に吸着した物質を除くために洗浄した後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたは粉末ミルクの溶液のような試験抗血清に関して抗原的に中性であることが知られている非特異的タンパク質をアッセイプレートウェルに結合させるかまたは被覆することが望ましい。これは固定する表面上の非特異的吸着部位のブロッキングを可能にし、従って、表面上への抗原の非特異的結合による生じるバックグラウンドを下げる。ウェルに抗体を結合さぜ、バックグラウンドを下げるために非反応性物質で被覆し、結合していない物質を除くために洗浄した後、免疫複合体（抗原／抗体）形成を導くように固定する表面に試験されるサンプルを接触させる。試験サンプルと結合抗体の間の特異的免疫複合体の形成及びそれに続く洗浄後に、一次抗体と異なるＡＯＰ２に対する特異性を有する二次抗体にそれを供することにより免疫複合体形成の出現及びさらに量を測定することができる。適切な条件は好ましくはＢＳＡ、ウシγグロブリン（ＢＧＧ）及びリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）Ｔｗｅｅｎ^R（商標）のような希釈剤でサンプルを希釈することを含む。これらの添加される薬剤は非特異的バックグラウンドの減少にも役立つ傾向がある。次に、重ねた抗血清を好ましくは約２５℃ないし約２７℃の水準の温度で約２から約４時間までインキュベートさせる。インキュベーション後に、免疫複合体を形成していない物質を除くために抗血清接触表面を洗浄する。好ましい洗浄方法はＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ^Rまたはホウ酸バッファーのような溶液での洗浄を含む。検出手段を与えるために、二次抗体は好ましくは結合した酵素を有し、それは適切な発色基質とインキュベートすると発色を生じる。従って、例えば、免疫複合体形成の発生を与える期間及び条件下でウレアーゼまたはペルオキシダーゼが結合した抗−ヒトＩｇＧと二次抗体結合表面を接触させ、インキュベートすること（例えば、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ^RのようなＰＢＳを含有する溶液中で室温で２時間のインキュベーション）が所望される。酵素標識された二次抗体とのインキュベーション及びそれに続く結合していない物質を除くための洗浄後に、酵素標識としてペルオキシダーゼの場合、尿素及びブロモクレゾールパープルまたは２，２’−アジノ−ジ−（３−エチルーベンズチアゾリン）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）及びＨ₂Ｏ₂のような発色基質とのインキュベーションにより標識の量を定量する。次に、例えば、可視スペクトル分光光度計を用いて、発色の量を測定することにより定量を実施する。まずサンプルをアッセイプレートに結合させることにより先の形態を変えることができる。次に、一次抗体をアッセイプレートとインキュベートし、続いて、一次抗体に対する特異性を有する標識された二次抗体を用いて結合した一次抗体を検出する。本発明の抗体組成物は免疫ブロットまたはウェスタンブロット分析において大きい用途がある。ニトロセルロース、ナイロンまたはそれらの組み合わせのような固体支持体マトリックス上に固定されたタンパク質の同定のための高親和性一次試薬として抗体を用いることができる。免疫沈降及びそれに続くゲル電気泳動と関連して、抗原の検出に用いられる二次試薬が不都合なバックグラウンドを生じる抗原の検出に用いるための単一工程試薬としてこれらを用いることができる。ウェスタンブロッティングに関連する使用のための免疫学的に基づく検出方法は毒素成分に対する酵素的、放射性標識または蛍光的に標識された二次抗体を含み、これに関連して特に有用であると考えられる。 VI．活性化合物をスクリーニンするための方法本発明はＡＯＰ２活性を刺倣するか、ＡＯＰ２の欠如を克服するかまたは突然変異体ＡＯＰ２分子のマイナス作用を妨げるかのいずれかの活性に関して化合物をスクリーニングすることにおけるＡＯＰ２及び活性フラグメント及びそれらをコードする核酸の使用も意図する。これらのアッセイは様々な異なる形態を利用することができ、スクリーニングが実旋される「活性」の種類により決まることができる。無細胞系で活性をアッセイすることができ、通例、タンパク質または脂質の酸化または酸化の防止を調べることを含んでなる。具体的には、チオールを含有する還元剤（例えば、ＤＴＴ）及び金属（例えば、Ｆｅ⁺³）の添加後に不活化からのグルタミンシンターゼの保護を測定する。また、チオールを含有する還元剤及び金属イオンとインキュベートした場合にＯ₂消費を妨げるＡＯＰ２の能力により無細胞系において活性を測定することもできる（Ｎｅｔｔｏ等、１９９６）。Ａ．インビトロアッセイ一つの態様として、本発明はＡＯＰ２分子またはそのフラグメントに結合する化合物のスクリーニングのために用いられる。ポリペプチドまたはフラグメントは溶液中に遊離するか、支持体に固定されるか、細胞中または表面上に発現されるかのいずれであってもよい。ポリペプチドまたは化合物のいずれかを標識することができ、それにより結合の測定を可能にする。別の態様として、アッセイは天然もしくは人工基質または結合相手へのＡＯＰ２の結合の阻害を測定することができる。薬剤のいずれか（ＡＯＰ２、結合相手または化合物）が標識される競合的結合アッセイを実施することができる。通常、ポリペプチドが標識される種である。遊離した標識対結合した標識の量を測定して結合または結合の阻害を測定することができる。化合物の高処理量スクリーニングのための別の技術はＷＯ８４／０３５６４中に記述されている。プラスチックピンまたはなんらかの他の表面のような固体支持体上に多量の小ペプチド試験化合物を合成する。ペプチド試験化合物をＡＯＰ２と反応ざせ、洗浄する。様々な方法により結合したポリペプチドを検出する。上記の薬剤スクリーニング技術における使用のために精製されたＡＯＰ２をプレート上に直接被覆することができる。しかしながら、固相にポリペプチドを固定するためにポリペプチドに対する非中和抗体を用いることができる。また、固相にＡＯＰ２活性領域を連結するために反応性領域（好ましくは末端領域）を含有する融合タンパク質を用いてもよい。ＡＯＰ２の様々な機能特質及び候補化合物がこれらの特質にどのように作用するかを調べるために、野生型またはＡＯＰ２の天然のもしくは設計された突然変異体を含有する様々な細胞系を用いることができる。突然変異体を設計するための方法は、ＡＯＰ２の天然に存在する突然変異体と同様に本書類の他の場所で記述される。そのようなアッセイにおいて、化合物をその生化学的性質を考慮して適切に配合し、標的細胞と接触させる。アッセイにより、培養が必要とされる可能性がある。次に、多数の異なる生理学的アッセイにより細胞を調べることができる。あるいはまた、分子分析を実施することができ、その場合、ＡＯＰ２の機能または関連する経路を調べることができる。これはタンパク質発現、酵素機能、基質利用、ＡＯＰ２を初めとする様々な分子のリン酸化状態、ｃＡＭＰレベル、（全細胞またはポリＡＲＮＡの示唆的表示を初めとする）ｍＲＮＡ発現等のもののようなアッセイを含むことができる。また、レポーター遺伝子がＡｏｐ２コーディング配列または調節配列に連結されている構築物を用いてもよい。このようにして、例えば、抗酸化剤活性より測定することが容易なレポーターと関連した別の機能を調べることにより発現の増加を測定することができる。レポーター遺伝子の例はＣＡＴ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ及びグリーン蛍光タンパク質を含む。Ｂ．インビボアッセイ本発明は様々な動物モデルの使用も包含する。本明細書において、ヒトとマウスＡＯＰ２間で見られる高度の相同性は、それが通常発現されている全動物系においてＡＯＰ２の機能を調べる優れた機会を与える。正常なＡＯＰ２を発現することができない突然変異体細胞系を開発するかまたは単離することにより、ヒト及び他の哺乳類におけるアテローム性動脈硬化症を初めとする疾病を非常に予示する動物モデルを作製することができる。最後に、野生型ＡＯＰ２を欠いているトランスジェニックまたはコンジェニック動物（以下に説明する）をアテローム性動脈硬化疾の発症及び処置のモデルとして利用することができる。試験化合物での動物の処置は適切な形態の化合物の動物への投与を含む。投与は経口、鼻、頬、直腸、膣または局部を初めとするがそれらに限定されない臨床または臨床以外の目的のために利用することができるあらゆる経路による。あるいはまた、投与は気管内点滴注入、気管支点滴注入、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射によってもよい。特に意図されるものは全身的静脈内注入、血液またはリンパ液供給による局部投与及び腫瘍内注入である。インビボでの化合物の有効性の決定は様々な異なる規準を含む可能性がある。そのような規準は生存、増加した活性レベル、タンパク質またば脂質の減少した酸化、下げられたＨＤＬレベル、減少した酸化的生成物、減少したアテローム性助脈硬化、減少した酸化されたＬＤＬ、減少した老化及び減少した脳病状を含むがそれらに限定されない。Ｃ．合理的薬剤設計合理的薬剤設計の目的はそれらが相互作用する生物学的に活性のあるポリペプチドまたは化合物の構造類似体を生成することである（アゴニスト、アンタゴニスト、インヒビター、結合相手等）。そのような類似体を作製することにより、天然分子より活性があるかもしくは安定であるか、変化に対して異なる感受性を有するかまたは様々な他の分子の機能に影響を及ぼすことができる薬剤を作ることが可能である。クローン化されたＡｏｐ２配列が利用できることにより、結晶学的研究を実施するために十分な量のＡＯＰ２を生産することができる。さらに、ペプチド配列の知識から構造−機能の関係のコンピューターを用いた予測ができる。ある方法として、ＡＯＰ２またはそのフラグメントの３次元構造を作製する。ｘ線結晶学、コンピューターモデリングまたは両方の方法の組み合わせによりこれを成し遂げることができるはずである。別の方法の「アラニン走査」はアラニンでの分子全体にわたる残基の任意の置換を含み、機能に対して得られる影響を測定する。また、機能的アッセイにより選択される、ＡＯＰ２特異的抗体を単離し、次にその結晶構造を解明することも可能である。原則として、この方法は次の薬剤設計が基づくことができる薬剤コアをもたらす。機能的な薬理学的に活性のある抗体に対して抗−イディオタイプ抗体を作製することによりタンパク質結晶学を完全に回避することが可能である。鏡像の鏡像として、抗−イディオタイプの結合部位は元の抗原の類似体であると予想される。次に、抗−イディオタイプを用いて化学的または生物学的に作製されたペプチドのバンク（ｂａｎｋ）からペプチドを同定し、単離することができるはずである。選択されたペプチドは次に薬剤コアとして役立つ。抗体を抗原として用いて、抗体を製造するために本明細書に記述した方法を用いて抗−イディオタイプを作製することができる。従って、向上したＡＯＰ２活性を有するかまたはＡＯＰ２の刺激剤、インヒビター、アゴニスト、アンタゴニストもしくはＡＯＰ２機能により影響を受ける分子として働く薬剤を設計することができる。別の薬剤設計方法はＡＯＰ２の機能的特徴、すなわち、抗酸化剤としてのその推定上の役割に関する。抗酸化剤であるか、抗酸化剤活性を促進するかまたは酸化生成物を直接防ぐ化合物を用いて、ＡＯＰ２と関連して機能する新規な化合物を設計することができる。 VII．ＡＯＰ２関連疾患状態を処置するための方法本発明は、別の態様として、アテローム性動脈硬化症の処置も含む。この処置はＡＯＰ２の供給またはＡｏｐ２遺伝子を含有する発現構築物の供給を含んでなることができる。Ａ．遺伝子に基づく治療本発明者等により意図される治療的態様の一つはアテローム性動脈硬化症の発症に関与する事象における分子レベルでの介入である。具体的には、本発明者等は適切な標的細胞にその細胞にＡＯＰ２を供給することができる発現構築物を与えることを意図する。発現ベクター及びそれらの中に用いられる遺伝子成分の長い説明は引用することによりこの節中に徂み込まれる。特に好ましい発現ベクターはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス及びレトロウイルスのようなウイルスベクターである。また好ましいものはリボソームに包膜化された発現ベクターである。当業者はインビボ及びエクスビボ状況に遺伝子送達をどのように適用するかをよく知っている。ウイルスベクターには、通例、ウイルスベクターストックを調製する。ウイルスの種類及び得ることができる力価により、１ｘ１０⁴、１ｘ１０⁵、１ｘ１０⁶、１ｘ１０⁷、１ｘ１０⁸、１ｘ１０⁹、１ｘ１０¹⁰、１ｘ１０¹¹ または１ｘ１０¹²の感染性粒子を患者または動物に送達する。相対的取り込み効率を比較することにより、リポソームまたは他のウイルス以外の製剤にも類似した数値を予測することができる。製薬学的に許容しうる組成物としての製剤を以下に説明する。Ｂ．タンパク質治療別の治療方法はＡＯＰ２ポリペプチド、活性フラグメント、合成ペプチド、模倣物またはその他の類似体の患者への供給である。組み換え発現方法によりタンパク質を生産することができ、または十分に小さい場合、自動ペプチド合成機により作製することができる。投与の経路及び目的に基づいて、リポソーム製剤及び古典的製薬学的製剤を初めとするがそれらに限定されない製剤を選択する。Ｃ．伝統的抗−アテローム性動脈硬化治療との併用治療現在の研究の１つの目的はアテローム性動脈硬化症を減少するために考案される製薬の効能を高めるための方法を見いだすことである。１つの方法は遺伝子治療とそのような伝統的治療を併用することによる。本発明に関連して、Ａｏｐ２置換治療を伝統的製薬学的介入と共に同様に用いることができると考えられる。通例、「標的細胞」をＡｏｐ２発現構築物及び少なくとも１つの他の薬剤と接触させる。これらの組成物は動物のアテローム性動脈硬化負担を減少するために有効な総合量で与えられる。この方法は発現構築物及び薬剤または因子と細胞を同時に接触させることを含むことができる。両方の薬剤を含む単一の組成物もしくは薬理学的製剤と細胞を接触させることによるか、または一方の組成物が発現構築物を含み、もう一方が薬剤を含む２つの異なる組成物もしくは製剤と細胞を同時に接触させることによりこれを実施することができる。あるいはまた、遺伝子治療処置は数分から数週までの範囲の間隔で他の薬剤処置に先立つかまたは続いてもよい。他の薬剤及び発現構築物が別個に細胞に用いられる態様では、薬剤及び発現構築物がなおかつ細胞に対して都合よく併用作用を及ぼすことができるように、通例、著しい期間が各送達の時間の間を切らないことを確実にする。そのような場合、相互の約１２−２４時間以内に、より好ましくは相互の約６−１２時間以内に両方の薬剤を細胞を接触させることが意図され、約１２時間のみの遅延時間が最も好ましい。しかしながら、ある状況には、処置の期間を著しく延ばすことが望ましい可能性があり、数日（２、３、４、５、６または７）ないし数週（１、２、３、４、５、６、７または８）がそれぞれの投与の間に経過する。また、Ａｏｐ２発現構築物または他の薬剤のいずれかの１回より多い投与が所望されることも考えられる。以下に例示するように、Ａｏｐ２が「Ａ」であり、他の薬剤が「Ｂ」である様々な組み合わせを用いることができる：他の組み合わせが考えられる。併用治療における使用のために適当な薬剤または因子は、宿主に対するアテローム性動脈硬化負担を減少するかまたはコレステロールもしくはリポタンパク質レベルを改変するあらゆる化学的化合物または処置方法である。上記のように、Ａｏｐ２発現構築物と組み合わせることにより併用治療組成物またはキットとして薬剤を調製し、用いることができる。当業者は「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、第３３章、特にｐ６２４−６５２に従う。処置される患者の状態により投薬量のいくらかの変動が必ず起こる。投与の責任を負う人物があらゆる場合で個々の患者の適切な投与量を決定する。さらに、ヒト投与のためには、製剤はＦＤＡ生物製剤局（ＯｆｆｉｃｅｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃｓ）基準により必要とされるような滅菌性、発熱性（ｐｙｒｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）、一般安全性及び純度基準を満たさなければならない。本発明者等はＡｏｐ２関連疾患にかかっている患者へのＡｏｐ２発現構築物の限局性送達が病理疾患を相殺するために治療的に有用な遺伝子を送達するための非常に効率よい方法であることを提示する。同様に、患者の体の特定の冒された部位に治療を向けてもよい。あるいはまた、起こったある状況では発現構築物及び／または薬剤の全身送達が適切である可能性がある。Ｄ．患者への投与のための製剤及び経路臨床用途が意図される場合、意図される用途のために適切な形態の製薬学的組成物−発現ベクター、ウイルスストック、タンパク質、抗体及び薬剤を調製することが必要である。通例、これはパイロジェン及びヒトまたは動物に有害な可能性がある他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴う。通例、送達ベクターを安定にし、そして標的細胞による取り込みを与えるために適切な塩及びバッファーを用いることが望まれる。また、組み換え細胞を患者に導入する場合にもバッファーを用いる。本発明の水性組成物は製薬学的に許容しうる担体または水性媒質中に溶解されるかまたは分散された、細胞に対して有効量のベクターを含んでなる。そのような組成物は接種材料とも呼ばれる。「製薬学的または薬理学的に許容しうる」という語句は、動物またはヒトに投与した場合に不都合な、アレルギー性のまたは他の都合の悪い反応を生じない分子存在及び組成物をさす。本明細書に用いられる場合、「製薬学的に許容しうる担体」はいずれか及び全ての溶媒、分散剤、媒質、被覆、抗菌剤及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤等を含む。製薬学的に活性のある物質のためのそのような媒質及び薬剤の使用は当該技術分野においてよく知られている。いずれかの通常の媒質及び薬剤は本発明のベクターまたは細胞と配合禁忌でない限り、治療徂成物におけるその使用が意図される。また、補足的有効成分を組成物中に混和することもできる。本発明の活性組成物は古典的製薬学的製剤を含むことができる。本発明のこれらの組成物の投与は、その経路により標的組織が利用できる限りあらゆる一般経路による。これは経口、鼻、頬、直腸、膣または局部を含む。あるいはまた、投与は定常位、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内注射によってもよい。そのような組成物は、通常、上記の製薬学的に許容しうる組成物として投与される。また、活性化合物を非経口的または腹腔内に投与してもよい。遊離塩基または薬理学的に許容しる塩としての活性化合物の溶液をヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適当に混合した水中に調製することができる。また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物中並びに油中に分散液を調製することもできる。貯蔵及び使用の通常条件下で、これらの製剤は微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含有する。注入可能な用途のために適当な製薬学的形態は、滅菌水溶液または分散液及び滅菌した注入可能な溶液または分散液の必要に応じた調製のための滅菌粉末を含む。全ての場合において形態は無菌でなければならず、そして容易な注入がみられる程度に流動性でなければならない。それは製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、バクテリア及び真菌のような微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物及び植物油を含有する溶媒または分散媒質であってもよい。例えば、レシチンのような披覆の使用により、分散液の場合には必要な粒度の維持により、そして界面活性剤の使用により、適切な流動性を保つことができる。様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、バラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により微生物の作用の防止をもたらすことができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。吸収を遅らせる薬剤、例えば、アルミニウムモノステアレート及びゼラチンを組成物中に用いることにより注入可能組成物の長い吸収をもたらすことができる。適切な溶媒中の必要な量の活性化合物を必要な場合上に挙げた様々な他の成分と混和し、続いて滅菌濾過することにより滅菌した注入可能溶液を調製する。通例、基礎分散媒質及び上に挙げたものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に様々な滅菌した有効成分を混和することにより分散液を調製する。滅菌した注入可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、先に滅菌濾過した有効成分及びあらゆる付加的な適切な成分の溶液からそれらの粉末をもたらす真空乾燥及び凍結乾燥技術である。本明細書に用いられ場合、「製薬学的に許容しうる担体」はいずれか及び全ての溶媒、分散媒質、被覆、抗菌剤及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤等を含む。製薬学的活性物質のためのそのような媒質及び薬剤の使用は当該技術分野でよく知られている。あらゆる通常の媒質または薬剤が有効成分と配合禁忌でない限り、治療組成物におけるその使用が意図される。また、補足的有効成分を組成物中に混和することもできる。経口投与のために、本発明のポリペプチドを賦形剤と混和し、摂取しない口内洗浄剤及び歯磨き剤の形態で用いることができる。ホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）のような適切な溶媒に必要量の有効成分を混和して口内洗浄剤を調製することができる。あるいはまた、ホウ酸ナトリウム、グリセリン及び重炭酸カリウムを含有する滅菌洗浄剤中に有効成分を混和することができる。また、有効成分をゲル、ペースト、粉末及びスラリーを初めとする歯磨き剤中に分散してもよい。水、結合剤、研磨剤、香料剤、発泡剤及び保湿剤を含有してもよいペースト歯磨き剤に有効成分を治療的に有効な量で添加することができる。本発明の組成物を中性または塩形態で調合することができる。製薬学的に許容しうる塩は（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）酸付加塩を含み、そしてそれらは例えば塩酸もしくはリン酸のような無機塩または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸と形成される。また、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄のような無機塩基及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基から遊離カルボキシル基と形成される塩を得ることもできる。調合時に、投薬製剤と適合するように、そして治療的に有効であるような量で溶液を投与する。製剤は注入可能溶液、薬剤放出カプセル等のような様々な剤形で容易に投与される。水溶液中の非経口投与のために、例えば、必要な場合、溶液を適当に緩衝液処理すべきであり、液体希釈剤をまず十分な食塩水またはグルコースで等張にすべきである。これらの特定の水溶液は静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与のために特に適している。これに関連して、用いることができる滅菌水性媒質は本開示を考慮に入れて当業者に理解される。例えば、１投薬量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍｌの皮下注入液に添加するかまたは注入の計画部位で注入することができる（例えば、「Ｒｃｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｃｎｃｃｓ」、第１５版、ｐ１０３５− １０３８及び１５７０−１５８０を参照）。処置される患者の状態により投薬量のいくらかの変動が必ず起こる。投与の責任を負う人物があらゆる場合で個々の患者の適切な投与量を決定する。さらに、ヒト投与のためには、製剤はＦＤＡ生物製剤局基準により必要とされるような滅菌性、発熱性、一般安全性及び純度基準を満たさなければならない。 VIII．コンジェニック、トランスジェニック及びノックアウト動物本発明の一つの態様として、「正常」または突然変異体Ａｏｐ２遺伝子を有するコンジェニック動物を作り出す。これらの動物はＡＯＰ２発現または機能を刺激するかまたは抑制する化合物のインビボでの試験において用途がある。例えば、上記のような様々な異なる機能的読み出しを用いて、これらのコンジェニック動物を用いて、ＡＯＰ２の抗酸化剤活性を高める化合物を同定することができる。コンジェニック系統を交配させるための方法は当業者によく知られている。別の態様として、機能的ＡＯＰ２ポリペプチドまたはその変異体をコードする機能的または非機能的（例えば、突然変異体）導入遺伝子を含有するトランスジェニック動物を作り出す。Ａｏｐ２導入遺伝子を発現するトランスジェニック動物、そのような動物から得られる組み換え細胞系及びトランスジェニック胚は、ＡＯＰ２の機能を誘導するかまたは抑える薬剤をスクリーニング及び同定するための方法に有用である可能性がある。また、本発明のトランスジェニック動物をアテローム性動脈硬化症のような徴候を研究するためのモデルとしても用いることができる。本発明の一つの態様として、ヒトまたはマウスＡｏｐ２遺伝子を発現するトランスジェニック動物を作り出すためにＡｏｐ２導入遺伝子をヒト以外の宿主に導入する。導入遺伝子が発現できるようにゲノム中に導入遺伝子を組込むことによりトランスジェニック動物を作り出す。トランスジェニック動物の作製方法はＷａｇｎｅｒ及びＨｏｐｐｅ（米国特許第４，８７３，１９１号；引用することにより本明細書に組み込まれる）、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ等、１９８５（全部引用することにより本明細書に組み込まれる）により、そして「ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏ；ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」、第２版（編集、Ｈｏｇａｎ、Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、Ｃｏｓｔａｎｔｉｍｉ及びＬｏｎｇ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、１９９４；全部引用することにより本明細書中に組み込まれる）中に一般的に記述されている。導入遺伝子と内因性遺伝子の間の相同組み換えにより内因性Ａｏｐ２を置換することが望ましい可能性があり；または「ノックアウト」動物の作製におけるように欠失により内因性遺伝子を除くことができる。典型的には、ゲノム配列が隣接するＡｏｐ２遺伝子を微量注入により受精卵に導入する。微量注入した卵を宿主のメスに移植し、導入遺伝子の発現に関して子孫をスクリーニングする。爬虫類、両生類、鳥類、哺乳類及び魚類を初めとするがそれらに限定されない多数の動物からの受精卵からトランスジェニック動物を生み出すことができる。特に好ましい態様内では、ＡＯＰ２を過剰発現するかまたはポリペプチドの突然変異体型を発現するトランスジェニックマウスを作製する。あるいはまた、「ノックアウト」マウスにおけるＡｏｐ２の欠如により、ＡＰＯ２タンパク質の欠如がインビボで細胞に対して有する影響を研究することができる。また、ノックアウトマウスはＡＯＰ２閂連疾患の発症のモデルも与える。上記のように、トランスジェニック動物及びそのような動物から得られる細胞系はある種の試験実験において用途がある可能性がある。これに関連して、野生型または突然変異体ＡＯＰ２を発現することができるトランスジェニック動物及び細胞系を試験物質にさらすことができる。野生型ＡＯＰ２発現及び／もしくは機能を高めるかまたは突然変異体ＡＯＰ２の発現もしくは機能を損なう能力に関してこれらの試験物質をスクリーニングすることができる。 IX．実施例以下の実施例は本発明の好ましい態様を示すために含まれる。以下の実施例中に開示される技術は本発明の実施において十分に機能することが本発明者等により見いだされた技術であり、従って、その実施のための好ましい形態を構成すると考えることができることを当業者は理解するはずである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮に入れて、開示される特定の態様において多数の改変を実施し、それにもかかわらず本発明の概念、趣旨及び範囲からそれずに同様なまたは類似した結果を得ることができることを認識するはずである。より具体的には、同じまたは類似した結果を得るが、本明細書に記述される薬剤の代わりに化学的及び生理学的の両方で関係するある薬剤を代用することができることが明らかである。当業者に明らかな全てのそのような類似した置換及び改変は、付加される請求の範囲により特定されるような本発明の趣旨、範囲及び概念の範囲内であると考えられる。実施例１−材料及び方法マウス．Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＤＢＡ／２Ｊ及び８ＢＸＤ組み換え近交系系統（ＢＸＤ１、ＢＸＤ２、ＢＸＤ５、ＢＸＤ６、ＢＸＤ８、ＢＸＤ９、ＢＸＤ１１、ＢＸＤ２５）をＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＢａｒＨａｒｂｏｒ、Ｍａｉｎｅ）から入手した。２次元ゲル電気泳動：Ｗｉ１ｓｏｎ等（１９７７）の方法の改変により腎臓及び肝臓からタンパク質を抽出した。１０％メルカプトエタノール、１％ＳＤＳ、８Ｍ尿素を含有する６８μｌの溶解バッファー中で上で２００ｍｇの組織を均質化した。５００μｌの沸騰しているサンプルバッファー１（０．３％ＳＤＳ、２００ｍＭＤＴＴ、２８ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、２２ｍＭＴｒｉｓ−塩基）を添加し、続いて、１００℃で５分間インキュベートした。サンプルを氷上で５分間冷やし、５０μｌのサンプルバッファー２（２４ｍＭＴｒｉｓ−塩基、４７６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍｇ／ｍｌＤＮＡｓｅＩ、２５ｍｇ／ｍｌＲＮＡｓｅＡ）と混合し、氷上で８分間インキュベートし、８０％アセトンで０℃で２０分間タンパク質を沈殿させた。懸濁液を微量遠心分離し（１０，０００ｇ、５分）、沈殿物を５００μｌの添加バッファー（７．９２Ｍ尿素、０．０６％ＳＤＳ、１．７６％両性電解質溶液ｐＨ３−７、１２０ｍＭＤＴＴ、３．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２２．４ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ及び１７．６ｍＭＴｒｉｓ−塩基）中に再懸濁した。１５μｌの各サンプル（約１０μｇのタンパク質）を電気泳動した。ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐ．から購入した装置、プロトコル及び２−Ｄ等級試薬を用いて分析及び分取２次元電気泳動を実施した。等電点及び分子量基準（ＢｉｏＲａｄ）を分析されるタンパク質サンプルと同時に泳動した。タンパク質ブロッティング及びタンパク質マイクロシークエンシング．製造業者により提供されるプロトコルに従って０．５ＸＴｒｉｓ−グリシンＴｏｗｂｉｎバッファー中でミリブロットグラファイトセミ−ドライエレクトロブロッターシステム（ＭｉｌｌｉＢｌｏｔＧｒａｐｈｉｔｅＳｅｍｉ−ＤｒｙＥｌｅｃｔｒｏｂｌｏｔｔｅｒＳｙｓｔｅｍ）及びイモビロン−Ｐ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ）（ＰＶＤＦ）トランスファー膜（ＴｒａｎｓｆｅｒＭｅｍｂｒａｎｅ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて分取２次元電気泳動ゲルからタンパク質を移した。移動後に膜を０．２５％クーマシーブリリアントブルーで染色し、タンパク質スポットを同定し、乾燥した膜から切り出した。Ｔｅｍｐｓｔ及びＲｉｖｉｅｒｅ²⁴により記述されたように改変して、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏｄｅｌ４７７Ａタンパク質シーケンサーを用いてＮ末端アミノ酸配列を得た。Ｇｅｎｐｅｔ及びｄｂＥＳＴデータベースに対して相同性検索を実施した。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ３．０（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ）を用いてＥＳＴ配列の配列整列及び共通配列分析を実施した。配列整列のために用いたＥＳＴのジーンバンク受託番号は：Ｗ７０９１３、Ｗ７１８１８、Ｗ１４４００、Ｗ５１０６４、Ｗ５９４０７、Ｗ８３６０６，Ｗ８３４６４、ＡＡ００２９７０を含む。製造業者の説明書に従ってＳｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢ）を用いて末端３’ＵＴＲ配列を得た。ＳＳＣＰマッピング：遺伝子マッピングのために推定上のＬｔｗ４遺伝子の３ ’ＵＴＲの一本鎖構造多型（ＳＳＣＰ）分析を用いた（Ｇｕｅｒｔｉｎ等、１９９４；Ｈａｈｎ＆Ｓｕｂｂｉａｈ、１９９４）。プライマー：５'−ＧＣＧＡＧＣＧＡＴＣＴＡＣＡＧＧＡＣＣ−３'（配列番号：９）及び５'−ＴＧＡＴＧＧＴＡＧＴＴＣＣＣＡＣＣＣＴＣ−３'（配列番号：１０）のＰＣＲ増幅を用いてＣ５７ＢＬ／６ＪとＭ．ｓｐｒｅｔｕｓ系統間の多型を同定した。以下のようにＢＳＳ種間戻し交配（Ｉａｋｏｕｂｏｖａ等、１９９７）からの９４ＤＮＡのパネルを用いてマッピングを実施した：１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、５０ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ₂及び０．００１％ゼラチンを含有する１２μｌの全容量のＰＣＲバッファー中で³²Ｐ末端標識したフォワード及びリバースプライマー（０．３μＭの各プライマー）で９６ウェルマイクロタイタープレート中で３０ｎｇのＤＮＡを増幅させた。９４℃で５分間の変性後、０．２ｍＭｄＮＴＰ及び０．５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを添加した。２５サイクルの増幅（２分間の５５℃アニーリング、３分間の７２℃伸長、１分間の９４℃変性）を７分の最終伸長工程で実施した。ＰＣＲ産物をＵＳＢ停止溶液と１：４混合し、９５℃で変性し、氷上に移し、４℃、４０Ｗ定電力で０．５ＸＴＢＥバッファー中で５％非変性ポリアクリルアミドゲルにより２μｌの各サンプルを２−３時間電気泳動した。ＭａｐＭａｎａｇｅｒコンピュータープログラムを用いて系統分布パターンを分析した。実施例２−結果Ｅｌｌｉｏｔｔ、１９７９により最初に記述されたものに類似した多型タンパク質に関して肝臓及び腎臓ホモジェネートの２次元電気泳動後に得られた約１０００の銀染色されたタンパク質スポットを調べることによりＬＴＷ４タンパク質を同定した。２６ｋＤのポリペプチドが同定ざれ、そのＣ５７ＢＬ／６Ｊ対立遺伝子は５．９のｐ１を有し、そしてそのＤＢＡ／２Ｊ対立遺伝子は５．６のｐＨを有した（図１）。同定された多型タンパク質がＬＴＷ４に相当することを確実にするために、８ＢＸＤＲＩ系統を２次元ゲル電気泳動を用いて分析し、これらの系統におけるこのタンパク質の系統分布パターンがＬｔｗ４に対して記述されたものと同一であることを確認した。ＤＢＡ／２Ｊ系統から抽出した肝臓タンパク質を用いて分取２−Ｄ電気泳動を実施し、それはＬＴＷ４のこの変異体がＣ５７ＢＬ／６Ｊ関連アイソフォームより容易に他のタンパク質から分離されたからである。２次元での電気泳動後、タンパク質を膜に移し、ＬＴＷ４タンパク質スポットを同定し、単離した。タンパク質スポットのマイクロシークエンシングにより２４個のＮ末端アミノ酸がもたらされ、それはチオール特異的抗酸化剤（ＴＳＡ）タンパク質（Ｅｌｌｉｏｔｔ等、１９８０）の大ファミリーのメンバーであると思われる以前に同定されたヒト仮定タンパク質（ＨＵＭＯＲＦ０６、ジーンバンク受託番号：Ｄ１４６６２）の残基２−２６と９２％の同一性を有した。ｄｂＥＳＴデータベースに対するＢＬＡＳＴＮ検索を用いて相同なマウス部分ｃＤＮＡ配列を同定するためにＨＵＭＯＲＦ０６のヌクレオチド配列を用いた。Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ３．０配列整列ソフトウェアを用いてこれらのＥＳＴからの共通配列を得た（図２）。この共通配列の翻訳産物はＨＵＭＯＲＦ０６と８９％の同一性及び９３％の類似性を有する。以下に説明するように、もう一つのＴＳＡファミリーメンバーの最近抗酸化剤タンパク質１（Ａｏｐ１）と改名されたマウスＭＥＲ５遺伝子は、ここで特性化された遺伝子との保存された相同性の領域を有し；それ故、この遺伝子を抗酸化剤タンパク質２（Ａｏｐ２）と称した。単離された多型タンパク質をコードする遺伝子がＬｔｗ４と同じ位置に位置するかどうかを評価するためにＳＳＣＰ分析を以前に記述されたように用いた（Ｇｕｅｒｔｉｎ等、１９９４；Ｈａｈｎ＆Ｓｕｂｂｉａｈ、１９９４）。Ｃ５７ＢＬ／６ＪとＭ．ｓｐｒｅｔｕｓの間のＳＳＣＰをＡｏｐ２の３’ＵＴＲから得られたプライマーを用いて同定し、次に、これらのプライマーをＢＳＳ種間戻し交配において試験した（図３Ａ及びＢ）（Ｉａｋｏｕｂｏｖａ等、１９９７）。Ａｏｐ２は２７．４のＬＯＤ可能性で第１染色体に位置付けられた。９１の戻し交配子孫においてＡｏｐ２とＰｍｘ１間で組み換え体は見られず、隣接するマイクロサテライトマーカーに対するこれらの遺伝子座の位置はＤ１Ｍｉｔ１４−３．２±１．８ｃＭ−（Ａｏｐ２、Ｐｍｘ１）−２．２±１．５ｃＭ−Ｄ１Ｍｉｔ１１０である。ＢＸＤＲＩシリーズにおけるＬｔｗ４の地図位置はＤ１Ｍｉｔ１１ −２３±１１ｃＭ−（Ｌｔｗ４、Ａｔ３）−３．１±３．２ｃＭ−Ｄ１Ｍｉｔ１６である。Ｄ１Ｍｉｔ１６はＤ１Ｍｉｔ１１０に１．１ｃＭ近接しているので、これらの遠位Ｍｉｔマイクロサテライトマーカーに対するＡｏｐ２及びＬｔｗ４の位置は同じ９５％信頼区間内である。さらに、ＢＸＤシリーズにおいてＬｔｗ４と組み換えがないＡｔ３はＤ１Ｍｉｔ１４とＤ１Ｍｉｔ１１０の間に位置する（Ｍａｒｃｅｌ等、１９８９）。最後に、Ｌｔｗ４が位置付けられている第１染色体の領域はヒト染色体１ｑ２３−２５とシンテニィの保存を示す。ＨＵＭＯＲＦ０６（Ａｏｐ２のヒト相同物）から得られたＳＴＳのＷＩ−７２３７は放射線ハイブリッド及びＹＡＣ物理的地図でこの領域に位置付けられている（Ｏｈｋａｗａ等、１９７９）。これらのマッピング研究はＡｏｐ２がＬｔｗ４に相当することを裏付ける。実旋例３−説明ＬＴＷ４タンパク質は多種多様な生物において同定されているチオール特異的抗酸化剤（ＴＳＡ）タンパク質の種類のメンバーとアミノ酸類似性を共有する（Ｅｌｌｉｏｔｔ等、１９８０）。これらのタンパク質のうち最もよく特性化されたものは酵母ＴＳＡを含み、それは反応性酸素のみを生成する系からではなく、反応性硫黄種を生成することができる系からの酸化的損傷に対して細胞性成分を保護することが示されている（Ｐａｉｇｅｎ等、１９８７ａ）。また、この活性は（Ｃ２２とも呼ばれる）サルモネラ・チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）からのアルキルヒドロペルオキシド還元酵素の触媒成分、ＡｈｐＣに対しても見いだされている（Ｅｌｌｉｏｔｔ等、１９８０）。このタンパク質ファミリーの哺乳類メンバーは脳ＴＳＡ（Ｅｌｌｉｏｔｔ等、１９８０）、ＥＲ５（Ｐａｉｇｅｎ等、１９８７ｂ）、骨芽細胞特異的因子３（ＯＳＦ３）（Ｐａｉｇｅｎ等、１９８７ｃ）、ナチュラルキラーエンハンサー因子Ａ及びＢ（ＮＫＥＦＡ及びＮＫＥＦＢ）（Ｐａｉｇｅｎ等、１９９０）、増殖関連因子（ＰＡＧ）（Ｐａｒｔｈａｓａｒａｔｈｙ等、１９９０）及びマクロファージ２３ｋＤストレスタンパク質（ＭＳＰ２３）（Ｓｅｎａｕｌｔ等、１９９０）を含む。（ＯＳＦ３、ＮＫＥＦＡ、ＰＡＧ及びＭＳＰ２３は非常に相同であり、同じタンパク質の変異体である可能性がある。）Ｂｌｏｃｋｓプログラム（ｈｔｔｐ:// ｗｗｗ．ｂｌｏｃｋｓ．ｆｈｃｒｃ．ｏｒｇ）を用いたＡＯＰ２、ＭＥＲ５、ＭＳＰ２３及びＴＳＡのアミノ酸比較から３つの保存ドメインが示される（図４）。ＡＯＰ２がこれらのタンパク質のうちで最も類似性か低いものであることが明らかであり；特に興味深いのは他の３つのマウスタンパク質及びＴＳＡ遺伝子ファミリーの大部分のメンバーで保存されている２番目のシステインをＡＯＰ２が共有しないことである（Ｅｌｌｉｏｔｔ等、１９８０）。これらの遺伝子の特定の機能はまだ解明されていないが、ＭＳＰ２３が酸化的ストレスに応答して誘導されるタンパク質として最初に単離されたことは重要である。さらに、ＭＥＲ５をコードする遺伝子がＡｈｐＣの突然変異のためであるエシェリキア・コリにおけるアルキルヒドロペルオキシド還元酵素活性の欠失を相補できることが示されている（Ｙａｍａｍｏｔｏ等、１９８９）、この結果に基づいて、Ｍｅｒ５遺伝子は抗酸化剤タンパク質１（Ａｏｐ１）と改名されている。Ａｏｐ２によりコードされるタンパク質は肝臓、腎臓及び脳のホモジェネート中の豊富な生成物であると最初に見いだされた（Ｃｈａｅ等、１９９４；Ｅｌｌｉｏｔｔ、１９７９）。Ａｏｐ２ｃＤＮＡは広く発現されるようであり：ＴＩＧＲデータベース（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ｔｄｂ．ｈｔｍ１）はＨＵＭＯＲＦ０６（Ａｏｐ２のヒト相同物）に相当する仮のヒト共通配列（ＴＨＣ１２２８７３）を同定し、このＴＨＣは２４の異なる組織から得られたｃＤＮＡライブラリーにおいて同定されている１１６のＥＳＴを含んでなる。実施例４−材料及び方法ＳＳＣＰマッピング．コンジェニックＡｔｈ１系統における遺伝子マッピングのためにＡｏｐ２迫伝子の３’非口訳領域の一本鎖惜造多型（ＳＳＣＰ）分析を用いた（Ｂｅｉｅｒ等、１９９２；Ｂｃｉｅｒ、１９９３）。プライマー・５'−ＧＣＧＡＧＣＧＡＴＣＴＡＣＡＧＧＡＣＣ−３'（配列番号：９）及び５'−ＴＧＡＴＧＧＴＡＧＴＴＣＣＣＡＣＣＣＴＣ−３'（配列番号：１０）のＰＣＲ増幅を用いてＣ５７ＢＬ／６ＪとＭ．ｓｐｒｅｔｕｓ系統間の多型を同定した。以下のようにＳｐｒｅｔｕｓに戻し交配した（Ｃ５７ＢＬ／６ＸＳｐｒｅｔｕｓ）Ｆ１マウスの戻し交配から得られた戻し交配マウスのＢＳＳＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙパネルを用いてマッピングを実施した：１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．０、５０ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ₂及び０．００１％ゼラチンを含有する１２ｍｌの全容量のＰＣＲバッファー中で０．３ｍＭの³²Ｐ末端標識したフォワード及びリバースプライマーで９６ウェルマイクロタイタープレート中で３０ｎｇのＤＮＡを増幅させた。９４℃で５分間の変性後、０．２ｍＭｄＮＴＰ及び０．５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを添加した。２５サイクルの増幅（２分間の５５℃アニーリング、３分間の７２℃伸長、１分間の９４℃変性）を７分の最終伸長工程で実施した。ＰＣＲ産物をＵＳＢ停止溶液と１：４混合し、９５℃で変性し、氷に移し、４℃、４０Ｗ定電力で０．５ＸＴＢＥバッファー中で５％非変性ポリアクリルアミドゲルにより２ｍｌの各サンプルを２−３時間電気泳動した。この方法を用いて、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ及びＭ．ｓｐｒｅｔｕｓ対立遺伝子がヘテロのマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊ対立遺伝子がホモのマウスから区別することができた。Ａｏｐ２のＣ５７ＢＬ／６Ｊ対立遺伝子のホモ接合住とアテローム動脈硬化症に対する感受性はこれらのマウスの１００％で一致した。これは０−ｘｃＭの遺伝的距離に相当する。配列分析．標準技術によりＣ５７ＢＬ／６Ｊ、ＤＢＡ／２Ｊ及びＣ３Ｈ／ＦｅＪマウスの腎職及び肝朧から調製したｃＤＮＡからＲＴ−ＰＣＲ増幅を用いて全長オープンリーディングフレームを含有するクローンを得た。この増幅のために用いたプライマーはＡＯＰ２ｏｒｆフォワード：５’−ＡＧＣＧＴＣＡＣＣＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＴＧ−３’（配列番号：１１）及びＡＯＰ２ｏｒｆリバース：５’−ＧＴＡＣＴＧＧＡＴＧＴＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＣＣ−３’（配列番号：１２）であった。各系統に対して複数の独立したＰＣＲ反応を実施し、増幅されたフラグメントをｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化し、製造業者の説明書に従ってＳｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢ）を用いてシークエンスした。実施例５−結果コンジェニック系統の構築．宿主系統として感受性Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６）及び存在するコンジェニックＢ６．Ｃ−Ｈ２５^c／Ｂｙより多くのＢ６との多型差を有する別の系統からのＡｔｈ１の耐性対立遺伝子でコンジェニック系統を構築するために、Ｓｐｒｅｔｕｓゲノムの領域をＢ６中に導入し、それはこれら２つの系統が近縁であるが異なる種からであるからである。マーカ−Ｄ１Ｍｉｔ１４及びＤ１Ｍｉｔ１３６を用いてＳｐｒｅｔｕｓからのＡｔｈ１領域をＢ６中に５世代間戻し交配し、次に、異系交配させてＦ１世代を得た。Ｎ５Ｆ１世代をホモ接合性に交配させる試みは失敗し；ホモのＦ２マウスは得られたが、Ｎ５Ｆ２に交配しなかった。Ｆ２のオスは明らかに精子の欠陥があり、これらの精子はインビトロ受精によってさえ卵を受精させない。ヘテロ接合体コンジェニックを凍結胚として保存している。Ａｔｈ１の高解像度マッピング．Ａｔｈ１を高解像度で位置付けるために、Ｃ５７ＢＬ／６とヘテロのコンジェニック系統Ｂ６．Ｓｐｒｅｔ−Ａｔｈ１ ^r/5間で戻し交配を実施した。この交配は１１７６の子孫を含み、Ａｔｈ１領域に隣接するマーカーＤ１Ｍｉｔ１４とＤ１Ｍｉｔ３５６間で８９の乗換えが得られた。乗換えを保有するマウスをＢ６に交配させ、そのメス子孫を集め、高脂肪食餌を１８週間与えた。各マウスの損傷の大きさを測定し、各々の乗換え親からの全ての子孫に対して平均し、その親がＡｔｈ１の耐性または感受性の対立遺伝子を保有するかどうかを決定した。多型遺伝子座を乗換え動物において分類し；高解像度地図を図５に示す。各乗換えは１７６３／１００または０．０５７ｃＭの遺伝的距離に相当する。Ａｔｈ１とＳＳＬＰ遺伝子座Ｄ１Ｍｉｔ１０５、Ｄ１Ｍｉｔ２６６及びＤ１Ｍｉｔ４２４間で組み換えマウスは見られなかった。Ａｏｐ２はマウス第１染色体のこの領域に位置したので、Ａｏｐ２の３’非翻訳領域中の多型差を認識するプライマー対を利用した。高解像度戻し交配の子孫において独特な乗換えを保有する一団のマウスでこれらを位置付けた。Ａｔｈ１とＡｏｐ２の間で組み換え体は見られず、Ａｏｐ２がＡｔｈ１であることを示唆する。Ａｔｈ１／Ａｏｐ２ｃＤＮＡのシークエンシング．Ａｔｈ１／Ａｏｐ２の推定上のコーディング領域に隣接するプライマーを利用してＣ５７ＢＬ／６Ｊ、ＤＢＡ／２Ｊ及びＣ３Ｈ／ＦｅＪ近交マウス系統から調製した腎臓及び肝臓ｃＤＮＡからこの領域を増幅し、クローン化し；これらのクローンの配列を図２に示す。この遺伝子のＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＤＢＡ／２Ｊ対立遺伝子は単一アミノ酸の違いを有するタンパク質をコードし；アミノ酸１２２はＤＢＡ／２Ｊではアスパラギン酸に、そしてＣ５７ＢＬ／６Ｊではアラニンに相当する。全長コーディング配列の翻訳産物はヒト配列ＨＵＭＯＲＦ０６と８９％の同一性及び９３％の類似性を有する。Ａｏｐ２によりコードされるタンパク質は肝臓、腎臓及び脳のホモジェネート中の豊富な生成物であると最初に見いだされた（Ｅｌｌｉｏｔｔ、１９７９；Ｒａｃｉｎｅ及びＬａｎｇｌｅｙ、１９８０；Ｇｏｌｄｍａｎ及びＰｉｋｕｓ、１９８６）。実施例６−説明Ａｏｐ２はＪｃｋｍ２変更遺伝子遺伝子座の候補として最初に特性化された。多発性嚢胞腎の進行における抗酸化剤タンパク質の可能な役割は明らかではない。しかしながら、高脂肪食餌を与えられた場合にアテローム性動脈硬化斑の発生に対するＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス系統の相対的感受性の違いを決定することに役割を果たすことが示唆されている遺伝子座のアテローム性動脈硬化症１（Ａｔｈ１）が同定された領域にＡｏｐ２が位置することは重要である。アテローム性動脈硬化症の病因における脂質酸化の役割はよく知られており、最近の研究はＡｔｈ１が組織における脂質過酸化物の蓄積またはそのような脂質過酸化物に対する細胞応答のいずれかに関与することを示している。Ａｏｐ２タンパク質産物はＣ５７ＢＬ／６ＪとＣ３Ｈ／ＨｅＪ間で多型であり、そしてこの遺伝子ファミリーの他のメンバーの生化学的機能は過酸化物の還元を含むので（Ｉａｋｏｕｂａｖａ等、１９９７）、Ａｏｐ２はＡｔｈ１の候補とみなされるべきである。Ａｏｐ２ｃＤＮＡは広く発現されるようである。ＴＩＧＲデータベース（ｈｔｔｐ://ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ｔｄｂ．ｈｔｍｌ）はＡｏｐ２のヒト相同物のＨＵＭＯＲＦ０６に相当する仮のヒト共通配列（ＴＨＣ１２２８７３）を同定する。このＴＨＣは２４の異なる組織から得られたｃＤＮＡライブラリーにおいて同定されている１１６のＥＳＴを含んでなる。実施例７上に説明したように、血漿ＨＤＬレベルのいかなる変化も示さず且つアテローム性動脈硬化損傷の欠如を示すＡｔｈ１耐性マウスに比較した場合に、Ａｔｈ１は高脂肪食餌を与えられた場合に感受性マウスにおいて減少した血漿ＨＤＬレベル及び増加したアテローム性動脈硬化損傷形成と関係する。マウスゲノムの第１染色体ｃＭ８３．６へのこの遺伝子座のマッピングはＡｏｐ２のクローニング及びマッピングと一致した。アミノ酸相同性に基づくと、Ａｏｐ２は高度に保存されている（Ｃｈａｅ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：７０１７−７０２１（１９９４）チオール特異的抗酸化剤（ＴＳＡ）の大ファミリーの新規なメンバーをコードするようである。これらのタンパク質は金日により触媒される酸化系に起因する酸化的損傷から細胞を保護する活性を保有し、従って、酸化的ストレスに対する複雑な細胞防御の重要な部分であると考えられる。Ａｏｐ２ｃＤＮＡを肝臓及び腎臓から単離したが、多種多様な組織においても発現されることが見いだされた（Ｉａｋｏｕｂｏｖａ等、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４２：４７４−４７８（１９９７）。この遺伝子は先に特性化されたＬｔｗ− ４タンパク質をコードすることが見いだされ、それはマウスのＣ５７ＢＬ／６ＪとＤＢＡ／２Ｊ系統間で多型であることが示された。Ａｏｐ２に相当するｃＤＮＡは２つの他の研究室により独立して単離されており、それらの一方はそのウシ毛様体グルタチオンペルオキシダーゼ（Ｆｒａｎｋ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１４：９１５−９２１（１９９７）；Ｍｕｎｚ等、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２６：５７９−５８５（１９９７））との高い同一性のためにそれをグルタチオンペルオキシダーゼと呼んでおり、もう一方はセリン加水分解酵素活性（Ｋｉｍ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２５４２−２５５０（１９９７））を連想させる「ＧＸＳＸＧ」モチーフの存在のためにそれをホスホリパーゼと呼んでいる。しかしながら、Ａｏｐ２はいかなる他の既知のグルタチオンペルオキシダーゼとも著しい相同性を示さず、また同定されているいかなるホスホリパーゼにも似ていない。それに反して、Ａｏｐ２は５０以上の既知のチオール特異的抗酸化剤と著しい相同性を示す。さらに、ＴＳＡ活性が実際にＡｏｐ２のヒト相同物に対して示されている。それ故、Ａｏｐ２はＴＳＡ遺伝子ファミリーのメンバーであると思われる。ＬＤＬ酸化は動脈壁における泡沫細胞形成及びアテローム性動脈硬化損傷発生に関与しているので、Ａｏｐ２をＡｔｈ１の候補遺伝子として調べた。Ａｔｈ１遺伝子座は以前に組み換え近交系を用いて第１染色体上の３ｃＭ領域に位置付けられた。Ｂ６及びＣ３Ｈの間には多型マーカーが不十分であるので、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドに対して、アテローム性動脈硬化症耐性の野生由来の系統、Ｓｐｒｅｔｕｓ及びＰＥＲＡからのＡｔｈ１対立遺伝子を保有する２つの独立したコンジェニックを作製した。Ｂ６バックグラウンドに対するコンジェニックを用いることはＨＤＬ及びアテローム性動脈硬化症に影響を及ぼすこれらの野生由来の系統の全ての他の遺伝子の問題を回避するが、Ａｔｈ１の領域中の多数の多型マーカーという利点を付加する。ｓｐｒｅｔｕｓから得られるＮ５初期コンジェニックから乗換え子孫を集め；理論的に第五世代のコンジェニックは第１染色体上の選択領域を除いて約３％のみのＳｐｒｅｔｕｓ遺伝子を有する。それ故、Ｂ６との交配においてＡｔｈ１以外の他のＳｐｒｅｔｕｓ遺伝子がＨＤＬ−Ｃ及び損傷に影響を及ぼす可能性は非常に下げられる。この交配から１７６３の戻し交配子孫を集め、ＭＩＴ地図に基づいて１０ｃＭの遺伝的距離のＤ１Ｍｉｔ１４とＤ１Ｍｉｔ３５６の間の組み換え事象を有する子孫に関して試験した。全部で１６２の組み換えマウスを集め、２段階の工程で分析した。段階１：この量的形質の高い多様性のために各個々のマウスからの表現型によることができないということを認めて、メス組み換え体を損傷に関して試験した。これは領域をＤ１Ｍｉｔ１４− Ｄ１Ｍｉｔ１１０の３−４ｃＭの領域に狭めた。工程２：この３−４ｃＭ領域に組み換え事象を有するオスマウスを交配させ、メス子孫をアテローム形成表現型に関して試験した。単一組み換えマウスの表現型を決定するために子孫マウスの群を試験することにより、この子孫試験は高い多様性の問題を回避する。この２段階の方法は領域をかなり狭めた。各組み換えは１／１７６３または０．０５ｃＭの距離に等しい。１ｃＭが１．７５メガ塩基に等しい場合、各乗換え間の物理的距離を約８７．５ｋｂであると概算することができる。（遺伝子が多い領域及び遺伝子が少ない領域があるが）遺伝子は平均して４０ｋｂ毎に存在すると概算される。この領域の微細構造地図から、Ａｔｈ１がＤ１Ｍｉｔ１０５、Ｄ１Ｍｉｔ２６６及びＤ１Ｍｉｔ４２４と組み換えを示さず、０．１５ｃＭの長さであるＤ１Ｍｉｔ１５９とＤ１Ｍｉｔ３９８の間の領域にあることが示される。これは候補として地図位置がこの領域より下であるアポリポタンパク質Ａ２を除く。また、この領域より上に位置する、貯蔵分子のコレステロールエステルにコレステロールを代謝する酵素ＡＣＡＴをコードする遺伝子のＡｃａｃｔ（アシル補酵素Ａ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ）も除く。Ａｏｐ２はＣ５７ＢＬ／６ＪとＳｐｒｅｔｕｓの間で多型であることが以前に示されたので、Ａｔｈ１領域において組み換え体である３７のマウスをそれらがどのＡｏｐ２対立遺伝子を保有するかに関して直接アッセイした。これらの結果から、Ａｔｈ１との組み換えは示されなかった。抗酸化剤タンパク質はアテローム性動脈硬化症の魅力的な候補遺伝子であるので、次の段階はＡｏｐ２が実際にＡｔｈ１であるかどうかを決定することである。耐性及び感受性表現型が異なるＡｏｐ２対立遺伝子と相関するかどうかを決定するために、感受性のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統、４つのアテローム性動脈硬化症耐性近交系（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、ＢＡＬＢ／ｃＪ、ＤＢＡ及び１２９／ＳｖＪ）並びにＡｔｈ１コンジェニックを独立して導くために用いられた２つのアテローム性動脈硬化症耐性野生系統のＳｐｒｅｔｕｓ及びＰＥＲＡからＡｏｐ２ｃＤＮＡを増幅し、シークエンスした。各系統においてＡｏｐ２のコーディング領域に相当するヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列を決定した。全ての４つの耐性近交系は感受性のＢ６系統と（アミノ酸番号１２４で）単一のアミノ酸の違いを保有した。このアミノ酸は感受性のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統ではアラニンであり、４つの耐性近交系の各々ではアスパラギン酸である。このアミノ酸の違いの機能的意義は分からないが、この違いの先の分析から、ぞれがＢ６とＤＢＡ系絞間で以前に報告されたＡｏｐ２タンパク質の２Ｄゲル移動パターンの迫いを説明できることが示されている。それに反して、分析された２つのアテローム性動脈硬化症耐性野生系統、ＰＥＲΛ及びｓｐｒｅｔｕｓはこのアミノ酸の違いを保有せず、感受性のＣ５７ＢＬ／６Ｊと同じＡｏｐ２対立遺伝子を保有すると思われる。それ故、このアミノ酸の違いの単なる存在は全ての系統における耐性を説明することができなかった。この理由のために、Ａｏｐ２ｍＲＮＡ発現の特性化を試み、これらの系統がＡｏｐ２発現の差異を示すかどうかを決定した。食餌または高脂肪食餌の両方で４または１０週間、感受性Ｂ６系統、耐性ＢＡＬＢ／ｃＪ系統並びに２つの耐性Ａｔｈ１コンジェニック系統、Ｂ６．ＰＥＲＡ及びＢ６．Ｓｐｒｅｔｕｓの肝臓組織からのＡｏｐ２ｍＲＮＡレベルを比較した。個々の肝臓から全ＲＮＡを単離し、そして食餌または高脂肪食餌の両方で各系統から２匹の個々のマウスからのＲＮＡ及び１０匹のマウスのプールを分析した。アミノ酸位置１２４でアスパラギン酸を有するＡｏｐ２対立遺伝子を保有する耐性系統では肝臓におけるＡｏｐ２発現は食餌及び高脂肪食餌で類似していた。それに反して、アミノ酸位債１２４でアラニンをコードするＡｏｐ２対立遺伝子を保有する全ての系統は高脂肪食餌でＡｏｐ２の著しい誘導を示した。食餌で４週までに全ての３系統で誘導が起こった。しかしながら、感受性のＣ５７ＢＬ／６Ｊに比較した場合に、食餌及び高脂肪食餌の両方でのＡｏｐ２発現のレベルは耐性系統で著しく大きかった。Ａｏｐ２がＡｔｈ１であるという結論をさらに裏付けるために、高脂肪食餌を課した重要な乗摸え剪物におけるＡｔｈ１表現型とＡｏｐ２発関係を調べた。これらの個体におけるアテローム性動脈硬化損傷の有無を肝職におけるそれらのＡｏｐ２発現と比較した。２匹の耐性Ｂ６．Ｓｐｒｅｔｕｓコンジェニック動物（Ｎ６）は、高脂肪食餌で１４週後に高レベルのＡｏｐ２発現を示した。これらの動物は損傷を受けなかった。さらに、損傷を欠いた４匹の乗換え動物及び高脂肪食餌で１４週までにアテローム性動脈硬化損傷を生じた４匹を直接比較した。損傷に対して耐性であった動物は損傷を生じたものより高脂肪食餌で１４週後により高レベルのＡｏｐ２を発現した。それ故、アテローム性動脈硬化損傷の発生とＡｏｐ２の発現レベルの間に相関関係がある。実施例８−材料及び方法（ａ）Ａｏｐ２ゲノムクローンの単離及びサブクローニングマウスＡｏｐ２遺伝子のゲノムクローンを単離するために、Ａｏｐ２ｏｒｆフォワード（５’−ＡＧＣＧＴＣＡＣＣＡＣＴＧＣＣＧＣＣＡＴＧ−３’）及びＡｏｐ２ｏｒｆリバース（５’−ＧＴＡＣＴＧＧＡＴＧＴＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＣＣ−３’）プライマーを用いてＰＣＲによりＤＢＡマウス系統からマウスＡｏｐ２ｃＤＮＡの全コーディング領域に及ぶ０．７ｋｂｃＤＮＡフラグメントを増幅した。このフラグメントを単離し、ランダムプライミング（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＲｅｄｉＰｒｉｍｅＫｉｔ）により³²Ｐで放射性標識し、１２９／ＳｖＪＩＦＩＸＲIIゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）をスクリーニングするためにプローブとして用いた。約１．８ｘ１０⁶プラークをスクリーニングした。２回目のスクリーニング後に個々の陽性クローンを選択し、標準技術を用いて各クローンからファージＤＮＡを単離した。特有の配列を区別するために³²Ｐで放射性標識したＡｏｐ２ｃＤＮＡプローブを用いてＥｃｏＲＩ消化したゲノムクローンに対してサザンブロッティングを実旋した。Ｍ１３フォワード及びリバースの両方のプライマー並びに公開されたＡｏｐ２ｃＤＮＡ配列（Ｉａｋｏｕｂｏｖａ等、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４２：４７４−４７８（１９９７））に従って設計された特定のプライマーでジデオキシチェーンターミネーション法を用いてラムダクローンで予備シークエンシングを実施した。唱性クローンをＮｏｔＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）中にサブクローン化し、ジデオキシチェーンターミネーション法（ＵＳＢ）を用いてシークエンスした。（ｂ）イントロン／エキソン連結点、イントロンの大きさ及びプロモーター配列の決定各イントロンに隣接するエキソン特異的プライマーを用いてサブクローン化されたゲノムフラグメントをシークエンスすることによりＡｏｐ２のイントロン／エキソン連結点を決定した。これらはエキソン１Ｆ（５’−ＧＡＧＧＡＴＴＧＣＴＴＣＴＣＧＧＧＧ−３’）、エキソン２Ｒ（５’−ＣＣＧＴＧＧＧＴＧＧＧＡＡＡＡＧＡＧ−３’）、エキソン２Ｆ（５’−ＣＡＴＴＣＴＣＴＴＴＴＣＣＣＡＣ−３’）、エキソン３Ｒ（５’−ＴＴＴＣＣＧＴＧＧＧＴＧＴＴＴＣＡＣ−３ ’）、エキソン４Ｆ（５’−ＣＣＴＣＴＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＣＡＣ−３’）、エキソン５Ｒ（５’−ＡＣＣＡＴＣＡＣＧＣＴＣＴＣＴＣＣＣ−３’）を含んだ。完全にシークエンスしたイントロン番号４を除いて全てのイントロンを以下のプライマーの組み合わせ：エキソン１Ｆとエキソン２Ｒ；エキソン２Ｆとエキソン３Ｒ：エキソン４Ｆとエキソン５Ｒを用いてＰＣＲ産物の大きさの概算により大きさを定めた。以下のパラメーター：９４℃、１分；５５℃、１分；７２℃、２分の３０サイクルで桿準条件を用いてＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルで分離し、λ／ＨｉｎｄIII及びλ／ＢｓｔＩ分子量基準（Ｐｒｏｍｅｇａ）との比較に基づいて大きさを見積もった。エキソン１リバースプライマー（５’−ＧＴＣＣＣＣＧＡＧＡＡＧＣＡＡＡＣＣ−３’）、上記のエキソン２Ｒプライマー及びシークエンスした上流領域に対して設計した上流フォワードブライマー（５’−ＣＣＣＡＣＧＴＣＡＣＡＡＧＴＣＴＧＧ− ３’）を用いて５’非コーディング配列を得た。少なくとも３つの別個のシークエンシング反応により、報告した推定上のプロモーター配列を確かめた。結果マウスＡｏｐ２ｃＤＮＡのコーディンッグ領域から作製したプローブを用いて１２９／ＳｖＪマウス系統から作製されたゲノムライブラリーをスクリーニングした。２１個の別個の陽性クローンを同定し、サザンブロッティングを用いて特有の配列を区別した。この分析からの結果は少なくとも３つの異なる遺伝子を示唆し；これらはＡｏｐ２及び２つの非常に関連したイントロンのない遺伝子を含んだ。マウスのＣ５７ＢＬ／６Ｊ及びＤＢＡ／２Ｊ系統から単離されたＡｏｐ２ｃＤＮＡに対する９９％以上のヌクレオチドの同一性により示されるように、ファージクローンの１つの群は真のＡｏｐ２遺伝子の重複する配列を含有した。Ａｏｐ２ｃＤＮＡの最初の公開はＤＢＡ／２ＪとＣ５７ＢＬ／６Ｊ系統間で相違するコーディング領域中の２個のヌクレオチドを報告し；それらの一つはｃＤＮＡ位復番号８０であり、それはコードされるアミノ酸を変えず、そしてもう一つはヌクレオチド番号４３９であり、それはＤＢＡ／２Ｊではアデニンであり、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊではシトシンである。この位置の対応するアミノ酸はＤＢＡ／２Ｊではアスパラギン酸であり、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊではアラニンである。ＤＢＡ／２Ｊのもののように、１２９／ＳｖＪ系統からのＡｏｐ２遺伝子はヌクレオチド番号４３９でアスパラギン酸をコードする。１２９／ＳｖＪからのＡｏｐ２対立遺伝子は、１２９／ＳｖＪではグアニンである変異体ヌクレオチド番号８０でのみＤＢＡ／２Ｊと異なり、分析した他の系統の全てと同じアミノ酸をコードする。これらのクローンのさらなる配列分析から、遺伝子が５個のエキソン及び４個のイントロンからなり、約１０．７ｋｂに及ぶことが示された。マウスＡｏｐ２遺伝子のゲノム構造を図６に示す。Ａｏｐ２遺伝子内のエキソンの位置をパネルＡに示す。示されるように、全ての４個のイントロンは遺伝子のコーディング領域内に含まれる。エキソン及びイントロンの正確な大きさ及び位置並びにイントロン／エキソン境界の確認された配列をパネルＢに示す。ヌクレオチド番号は以前に報告された（Ｍｕｎｚ等、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２６：５７９−５８５（１９９７）；Ｆｒａｎｋ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１４：９１５−９２１（１９９７））椎定上の全長Ａｏｐ２ｃＤＮＡに対応する。イントロンの大きさは４７１ｂｐから約３．５ｋｂの長さまで変わるが、最初の４個のエキソンは比較的大きさが近く、１４７ないし１６３ｂｐの間である。コーディング領域の３’末端及び６６７ｂｐの３’ＵＴＲが最後のエキソン内に見いだされる。また、１２９／ＳｖＪ系統からのＡｏｐ２の３’ＵＴＲを我々がＣ５７ＢＬ／６系統から単離した部分的３’ＵＴＲ及び以前に報告されたＢＡＬＢ／ｃＪからの全長３’ＵＴＲ［Ｍｕｎｚ等、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２６：５７９−５８５（１９９７）、＃２６７２］とも比較した。ヌクレオチド番号１０３７で単一ヌクレオチドの違いが見いだされ、それはＣ５７ＢＬ／６Ｊではチミンであり、１２９／ＳｖＪ及びＢＡＬＢ／ｃＪではシトシンである。これらはＡｏｐ２の３’ＵＴＲが既知である唯一の系統である。Ａｏｐ２がインビボでどのように調節される可能性があるかを理解し始めるために、以前に報告されたように（Ｍｕｎｚ等、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２６：５７９−５８５（１９９７）；Ｆｒａｎｋ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１４：９１５− ９２１（１９９７））、最も５’のｃＤＮＡ配列の上流の領域を単離し、シークエンスした。この上流領域の約５００ヌクレオチドを図７に示す。この配列の分析により、共通ＴＡＴＡ−ボックスは同定されなかった。しかしながら、いくつかの可能性があるＳＰ１結合部位が推定上の＋１転写開始部位の上流６０ヌクレオチド以内に位置し、多数の他の遍在的に発現される遺伝子のように、Ａｏｐ２の基礎転写がこれらの転写因子により調節される可能性があることを示唆する。また、ＴＡＴＡのないプロモーターに一般に見いだされる転写開始配列（ＣＴＣＡＮＴＣＴ）に似た配列もある。実際の配列はこの共通配列と単一ヌクレオチド挿入で異なる。しかしながら、この成分は以前に報告されたように推定上の転写開始部位の２０ヌクレオチド下流に位置する。既知の転写因子のいくつかのさらなる共通認識配列が推定上の近位プロモーター中に見いだされる。図７に示されるように、これらはＵＳＦ（上流刺激因子）及びＳＲＥＢＰ（ステロール応答配列結合タンパク質）、脂質代謝に関与する多数の迫伝子の謂節において重要であることが示されている２つのＤＮＡ結合タンパク質の可能性がある結合部位を含む。推定上のＵＳＦ認識配列は既知の結合部位に１００％一致し、一方、推定上のＳＲＥＢＰ結合部位は１２ヌクレオチドの共通配列のうち１１を含有する。また、既知の結合部位と同一であるＡＤＲ１（アルコールデヒドロゲナーゼ調節遺伝子１）の共通認識配列もある。さらに、この領域は熱ショック転写因子（ＨＳＦ）のいくつかの可能性がある結合部位を含み、それらの全てが共通認識配列に完全に一致する。Ａｏｐ２遺伝子に加えて、最初のスクリーニングから２つの非常に関連する遺伝子も同定した。これらの遺伝子はＡｏｐ２−ｒｓ１及びＡｏｐ２−ｒｓ２（Ａｏｐ２関連配列１及び２）と命名されている。図８ＡにＡｏｐ２のコーディング領域に対応する３つ全ての遺伝子のヌクレオチド配列の比較を示す。示されるように、Ａｏｐ２−ｒｓ１はコーディング領域においてＡｏｐ２と９３％のヌクレオチド同一性を共有する。Ａｏｐ２−ｒｓ１の各ヌクレオチドの違いは塩基置換の結果であり、いくつかのアミノ酸変異をもたらすが、元のままのオープンリーディングフレームをもたらす。それに反して、Ａｏｐ２−ｒｓ２はかなり相違するようであり、Ａｏｐ２と８０％のみのヌクレオチド同一性を共有し、６７のヌクレオチド置換、２４のヌクレオチド欠失及び３９のヌクレオチド挿入を含む。第一のヌクレオチド欠失はコドン番号１１４を妨げ、読み枠を壊し、１１９アミノ酸の長さである欠失タンパク質をもたらす。既知のＡｏｐ２タンパク質配列と推定されるタンパク質産物の整列を図８Ｂに示す。推定されるＡｏｐ２−ｒｓ１タンパク質はＡｏｐ２に８６％の同一性を示すが、Ａｏｐ２−ｒｓ２は４２％のみのアミノ酸同一性を共有する。Ｘ．参考文献以下の参考文献は、本明細書に記述されたものを補足する代表的な方法または他の詳細を与えるので、引用することにより本明細書に特に組み込まれる： DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Antioxidant protein 2, genes and methods of using them Background of the Invention The government has provided the following grants from the National Institutes of Health: HL-32087 and DK-456. 39. Title to this application or any patent issued in connection therewith Can be. I. Field of the invention The present invention relates to the fields of medicine, molecular biology and biochemistry. More specifically, the book The invention is atheroma of a clinically significant disease that can lead to heart attack and stroke The present invention relates to the cloning, analysis and use of genes related to atherosclerosis. In particular, The present invention provides, as one embodiment, novel genes and gene products,Aop2Passing And AOP2 and as antioxidants in protection against atherosclerosis Regarding the new role of AOP2. II. Related technical fields Atherosclerosis is a major cause of heart disease, the leading cause of death in the United States It is a contributing cause. It's a raised intimal fibrous fat spot called atheroma Characterized by the formation, they narrow the arterial lumen, damage the underlying medium, and Added including calcification, ulceration with thrombus formation on and ecchymosis It is prone to complications. The center of these plaques is often markedly cholesterol and And lipid-rich debris containing cholesterol esters. Atherosclerosis favors coronary arteries and arterial supply to the brain and heart Has gained considerable medical importance. Atherosclerotic sac of coronary artery Contains the main type of heart disease, namely coronary artery, also known as ischemic heart disease It causes heart disease, the most important type of which is myocardial infarction. Ischemic heart disease is all Myocardial infarction causes atherosclerosis, representing about 90% of all types of heart disease. It is the most common cause of death in vulnerable populations. Atherosclerosis is virtually universal among North American, European and Soviet Union populations Exist. On the other hand, the prevalence is quite high in Latin America, Africa, Asia and the East. Low. Finland and Japan have the highest mortality rate in ischemic heart disease It shows a difference of 0 times or more. US ranks in top 10 in mortality from ischemic heart disease You. It is clear that a genetic predisposition exists, but the primary focus of diagnosis and treatment is Environmental impacts, especially smoking, sedentary lifestyle, obesity, hypertension, food and plasma cholesterol Related to role level. High levels of cholesterol in plasma may have an increased risk of heart disease well known. However, this cholesterol is low-density lipoprotein (LDL-C) and high density lipoprotein (HDL-C) . What has an increased risk for heart disease is the level of LDL-C; HD High levels of LC actually protect against atherosclerosis and heart disease . How high LDL-C can increase the formation of atherosclerosis in arteries In order to understand the mechanism of the effect, The earliest events in the formation of certain linear fat deposits must be examined. Linear The first step in the formation of fat deposits is the accumulation of foam cells below the endothelial cell layer of the artery. foam Spray cells are monocyte-derived macrophages filled with fat, These cells are the major cell type in linear fat deposition. The formation of foam cells An important step in the oxidation is the oxidation of LDL-C (Stcinberg et al., 1989). Netto et al., 1996; Witzum & Steinberg, 1991; More outlined). Macrophages mainly take up oxidized LDL and Thus, it is the oxidized LDL that results in the formation of foam cells and linear fat deposits. You. Food antioxidants such as vitamin E or natural antioxidants in the body reduce LDL by acid. Should be able to protect against HDL-C also oxidizes LDL-C (Reviewed by Banka, 1996), but in the process It itself becomes oxidized. When oxidized, HDL produces lipid peroxidation in plasma Possess most of the goods (Bowry et al., 1992; Hahn et al., 1994); Apoproteins are cross-linked by oxidative damage (Marcel et al., 1989). This damaged and oxidized HDL is removed from plasma more quickly than the original HDL (Guertin et al., 1994; Senault et al., 1990). HDL Protects LDL from oxidation, resulting in very little oxidation of LDL. Results in relatively high plasma HDL but more oxidation is occurring , HDL becomes oxidized and is more quickly cleared from plasma, Plasma levels are reduced. Atherosclerosis is not unique to the human population.Ath1Is a mouse inbreeding High-density lipoprotein cholesterol levels and atherosclerosis among systems A previously described locus that affects susceptibility to Atherosclerotic artery The sclerosis susceptibility allele is carried by line C57BL / 6J, Children are strains C3H / HeJ and BAL Owned by B / cJ.Ath1Sensitive phenotypes are high fat and high cholesterol Relatively low concentrations (35-45) in the plasma of female mice fed a roll diet mg / dl) high density lipoprotein-cholesterol (HDL) and aorta It is characterized by the occurrence of linear fatty deposition damage at numerous locations along the way (Paigen, 1 985). These linear fat deposits eventually lead to mature atherosclerotic plaques Develop (Paigen et al., 1990). Found in strains BALB / c and C3H Be doneAth1The resistant phenotype of is that when mice are fed an atherogenic diet, Higher concentrations (60-90 mg / dl) of plasma HDL and linear fat in the aorta It is characterized by a lack of fat deposition damage. Ath1The phenotype is between lines C57BL / 6 and C3H, and similarly for line C57BL. / 6 and a single gene difference between BALB / c. This conclusion is First, based on tests of recombinant near-line (RI) BXH and CXB (Paigen 1987a) and confirmed by backcrossing between C57BL / 6 and two resistant lines. It was bitten (Paigen, 1987b, 1987c).Ath1Is Apolipota Protein AII (apoa2) At the end of mouse chromosome 1 at a distance of 6 cM from the gene Located at the end. Carrying the apoAII gene from BALB / c but not from B6Ath1 Congenic strain B6 without the susceptibility gene C-H25^c/ B As shown by the analysis of y,Ath1IsApoa2Clearly away from (Paigen, 1987a).Ath1Is chromosome 1q24-25 in humans Located in a region homologous to Despite this useful information, this inheritance in atherosclerotic disease Little is known directly about the child's role. Heredity Not only is the identity of the child unknown, but its function remains simply speculative. Results and do it,Ath1For establishing a functional association between thyroid and heart disease andAth1Gene production of There is a considerable need in the art for information regarding the structural characteristics of objects. Summary of the Invention Therefore, in atherosclerotic diseaseAth1About the role of genes It is an object of the present invention to provide such information.Ath1Diagnosis of related disease states It is another object of the present invention to provide compositions and methods for use in treatment. It is a target. Also,Ath1Related to addressing pathological conditions related to It is also an object of the present invention to develop reagents capable of stimulating or inhibiting the function of Is the purpose. To meet these goals, an isolated polypeptide designated AOP2 has been proposed. Provided. The polypeptide may be of any species, preferably a mammal, more preferably It may be from humans or mice. In one particular embodiment, a polypeptide Has the sequence described in SEQ ID NO: 2. In another particular embodiment, a polypeptide Has the sequence described in SEQ ID NO: 4. In another aspect,Aop2Polypeptide or fragment thereof and pharmaceutical An antigen composition comprising a buffer or a diluent that is acceptable to a subject. Again And the polypeptide may be human or mouse, more specifically It can be obtained from the sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4. In yet another aspect, there is provided a nucleic acid encoding an AOP2 polypeptide. . Nucleic acids are human polypeptides among other mammalian and non-mammalian polypeptides. It can encode a peptide or a mouse polypeptide. Nucleic acid is SEQ ID NO : 2 or the polypeptide of SEQ ID NO: 4, and more specifically Is that the nucleic acid can have the sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. Wear. In yet another aspect, the nucleus described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 Oligonucleotides comprising at least about 10 contiguous bases of an acid sequence are provided. You. The oligonucleotide is longer, for example, SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. At least about 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or more of the nucleic acids described in Or 50 consecutive bases. In still yet a further embodiment, (i) taking a sample from the patient; and (ii) And e.) Evaluating said sample for the presence of AOP2 polypeptide. A method for diagnosing a predisposition to atherosclerotic damage in said patient is provided. heart Organ, artery, vein, skin, muscle, face, brain, prostate, breast, endometrium, lung, pancreas, small intestine , Blood cells, liver, testis, ovaries, colon, skin, stomach, esophagus, spleen, lymph nodes, bone marrow Or kidney, lymph, ascites, serum, pleural effusion, sputum, cerebrospinal fluid, tears, stool and The sample can be selected from the group consisting of urine. Patient may be human . The evaluation comprises measuring the antioxidant activity of the AOP2 polypeptide of the sample, Determining the level of AOP2 polypeptide in the cells of the sample or AOP Determining the sequence of the nucleic acid from said sample encoding the two polypeptides Can be. Measurement is quantitative PCR or immunology to AOP2 polypeptide Contacting the sample with an antibody that specifically binds. In still yet a further aspect, (i) an AOP having antioxidant activity (Ii) contacting the AOP2 polypeptide with a candidate stimulant And (iii) antioxidant activity of the AOP2 polypeptide in the presence or absence of the candidate stimulant. Screening of a compound for AOP2 stimulating activity, comprising measuring the sexual activity A method is provided. In yet another aspect, (i) the nucleic acid encoding the active AOP2 polypeptide is Providing a cell comprising; (ii) contacting the cell with a candidate stimulant; and (iii) And b) determining the antioxidant activity in said cells in the presence or absence of said candidate stimulant. Methods for screening compounds for antioxidant stimulating activity are provided. In yet another embodiment, (i) preparing a lipid; (ii) converting the lipid to a candidate antioxidant Contacting with an agent; and (iii) measuring the oxidation state of the lipid, Methods for screening compounds for anti-atherosclerotic activity are provided. In still yet another aspect, the invention provides a method for immunologically binding to an AOP2 polypeptide. Clonal antibodies and polyclones in which the antibodies immunologically bind to the AOP2 polypeptide An internal antiserum is provided. A still further aspect is an AO wherein the nucleic acid is operably positioned relative to the promoter. Expression vectors and nucleic acids comprising the nucleic acids encoding P2 polypeptides The nucleus encoding an AOP2 polypeptide operatively positioned relative to a motor And recombinant host cells comprising an acid. In a still further aspect, (i) an AOP2 polypeptide having antioxidant activity Providing a nucleic acid encoding the nucleic acid, wherein the nucleic acid is operably positioned relative to a promoter; And (ii) contacting the nucleic acid with a cell under conditions for incorporating the nucleic acid. To increase AOP2 function in the cells. A method is provided for determining The AOP2 polypeptide is described, for example, in SEQ ID NO: 2. It may be a human polypeptide as described. Nucleic acids can also be And the expression vector may be encapsulated in a liposome. . Expression vectors include adenovirus vector, retrovirus vector, vaccinia Virus vector, adeno-associated virus vector or herpes virus vector It may be a viral vector such as a vector. Cells in human patients and experimental animals May be located. The nucleic acid may be administered intravenously. Promoter is CMV, R It may be SV or E1A. Another embodiment comprises administering the antioxidant composition and the compound to a patient. A method for reducing atherosclerotic damage in said patient is provided. Antioxidant Agents may protect lipids directly or may actually oxidize lipid compositions. May break down free radicals, thereby acting indirectly to protect lipids It is recognized that there is. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES The following drawings form part of the present specification and are provided to further illustrate certain aspects of the present invention. included. One or more in combination with the detailed description of certain aspects set forth herein. Will understand the invention better by referring to these further figures Can: Figure 1:LTW4 protein isoform. C57BL / 6 (upper panel) and Silver-stained two-dimensional electricity of liver homogenates from Escherichia coli and DBA / 2 (bottom panel) The corresponding area of the running gel is shown. The C57BL / 6 isoform of LTW4 is 2 It has a MW of 6 kD and a pI of 5.9. LTA4 DBA / 2 isoform Is a MW of 26 kD and a p of 5.6 I. Figure 2:Aop2 consensus sequence. Nucleotide 389 (shown in bold) In DBA / 2J, C3H and BALB / c, it is adenine and C57BL / 6J Then it is cytosine. The codon containing this polymorphic nucleotide is DBA / 2J Corresponds to aspartic acid and in C57BL / 6J to alanine. Microphone The N-terminal amino acid sequence obtained by the loss sequencing is underlined. Figures 3A & 3B:Aop2 SSCP mapping analysis. (FIG. 3A)Aop23 Parental control using SSCP obtained from 'UTR and cross between BSS species Analysis of genomic DNA from 22 progeny from A. This is (C57BL / 6J XM. spretus ) F1 XM. spretusAll descendants because they are backcrossed Is at least oneM. spretusCarry allele. C57BL / 6 Mark heterozygotes that also carry the J allele. B: C57BL / 6J Con Troll; S;M. spretusControl; H: C57BL / 6J-M. spretus Heterozygotes. (FIG. 3B) Position of Aop2 in BSS cross Shown on the left, it is a common map of chromosome 1 on the right^TenupperLtw4Compare with position . The distance between loci iscMShown in units.Apoa2: Apolipoprotein AII . Figure 4:Amino acid similarity of mouse antioxidant proteins. Blocks program (Http://www.blocks.fhrc.org)¹⁸Mouse with) Four members of the antioxidant protein family were analyzed. Conserved amino Three domains of the acid have been identified and indicated. Amino acid identity in bold Show. Most of the TSA family Asterisk the two cysteines stored by members of the second; Is not present in AOP2 or its human homolog. Figure 5:High resolution map of mouse chromosome 1. 2 shows a polymorphic marker. Figure 6: (A)Genomic structure of mouse Aop2 gene. Exons are represented by boxes; A thin portion indicates an untranslated region, and a thick portion indicates a coding region. Exons and And the relative proportions of intron and intron size. 5 exons and 4 intros Covers about 10.7 kb. (B)Exons and introns Rice connection section . Figure 7:Nucleotide sequence of 5 'flanking region of mouse Aop2 gene. Nucleoti +1 is the mouse mGPx cDNA (Munz et al.,J. Biochem.3 26 : 579-585 (1997), corresponding to the 5 'end; Refers to the tangent array. The translation initiation codon ATG is underlined and putative transcription factor binding sites Is enclosed in a square. Figure 8: (A)Aop2 nucleotide sequence and Aop2-rs1 and Aop2-r Align with s2 . The sequence reported isAop2To the corresponding coding area Reach. Arrows indicate the start of translation. The dash isAop2Nucleotide identity with Represents; points represent gaps in the sequence. (B)Aop2-rs1 and Aop2-r Alignment of predicted amino acid sequence encoded by s2 with Aop2 protein . Dash The column indicates amino acid identity with Aop2. Detailed description of preferred embodiments I. The present invention The present inventionAop2With respect to the identification of a novel gene, referred to as Atherosclerosis susceptibility locus,Ath1Located in You. This time I called AOP2Aop2The gene product is an antioxidant, It belongs to a highly correlated family of proteins. The present inventors have found that Induces differences in loam atherosclerosis susceptibilityAth1Two different alleles of the same Specified. From susceptible and resistant mouse strainsAop2 cDNA sequencing The method identified a single base pair difference in the sequences of the two alleles. The present invention Are moreAop2The structure of the gene was determined. Inbred mouse strains C3H and BA Owned by LB / cAth1Resistance alleles function well as antioxidants Should encode the AOP2 protein, whereas the strain C57BL / 6 More retainedAth1Sensitive alleles function less well as antioxidants Should encode no AOP2 protein and more LDL is oxidized More foam cells form, more linear fat deposition occurs, and more Many HDL-Cs are damaged by oxidation products and therefore have a higher HDL content in plasma. Resulting in faster clearance and lower HDL levels. In another aspect, The difference in phenotypeAop2Differences in expression may also be due to differences in protein structure It was just not shown. More specifically, it is described in the new embodiment 7. DataAop2 Shows differences in mRNA levels. Example 8 is a promoter Disclose genomic sequence information including potentially important regulatory components in the region. Using high-resolution mapping crosses of more than 1000 mice, we Without apparent recombination with the locus D1Mit424, atherosclerotic Sclerosis susceptibility locusAth1To narrow the gene region on mouse chromosome 1. I was able to The cross is a strain C57B susceptible to atherosclerosis Athero for L / 6 and C57BL / 6 Of the atherosclerosis resistant strain Spletus by backcrossing several generations Were among the congenic strains. Congenic strains should be at least markers Spletus on chromosome 1 spanning D1Mit14 to D1Mit15 Except for a small region of the gene, most carry the C57BL / 6 gene. C57B L / 6 and C57BL / 6. Sp-Ath1 ^rOf the congenic strain named Hetero mice from the interbreeding were crossed to C57BL / 6. Backcross obtained Progeny are phenotyped with respect to the magnitude of their linear fat deposition damage in the aorta And genotyped for loci in the relevant region of mouse chromosome 1. This like,Ath1To a very small area. One gene located in this region was previously mutated using two-dimensional gel electrophoresis. Identified by a variant polypeptideLtw4(Elli ott, 1979a; Elliott, 1979b; Elliott et al., 198 0). This protein is expressed in the liver and has a molecular weight of 20-30 kD You. We used analytical and preparative two-dimensional gel electrophoresis and originally described LTW. Strain C57 in a pattern similar to that of strain C57 (Iakoubova et al., 1997). A 26 kD polypeptide variant having a different isoelectric point between BL / 6 and DBA / 2 Specified. The N-terminal amino acid sequence is obtained by microsequencing, Overlapping expressed sequence tags (ESTs) corresponding to the quenching sequence were identified. Single-stranded structure Identity is confirmed by gene mapping using polymorphism (SSCP); map location PreviouslyLtw4In the description. Next, this geneAth1of Position in the same mouse used for high resolution mapping;Ath1 No recombinants found between NotAth1WhenLtw4Strongly suggested that they were the same. Ltw4CDNA corresponding to is sequenced and pulled by oxidative stress. Tamper characterized as a thiol-specific antioxidant to preserve from induced damage It has been found to have homology to the type of protein (Chae et al., 1994). Ma The mouse MER5 gene is also a member of this gene family (Yama Moto et al., 1989), recently based on their functional characterization, antioxidant proteins. Quality 1 orAop1(Tsuji et al., 1995). Therefore, the book The inventors,Ltw4The gene to antioxidant protein 2 orAop2And called It is proposed that the corresponding protein be called AOP2. Aop2CDNA from atherosclerotic resistant and susceptible strains And the subsets were found to differ by a single base at nucleotide 389. , Which corresponds to the amino acid mutation at residue 124. This residue is atherosclerotic In C57BL / 6 mice susceptible to keratosis, the amino acid is alanine, It is aspartic acid in C3H mice that are resistant to atherosclerosis. This The amino acid mutation results in a change in isoelectric point consistent with the differences seen in LTW4. Therefore, the present inventorsAth1Atherosclerosis caused by The difference in susceptibility is due to the antioxidant protein AOP2 which differs between the resistant and susceptible strains. To be determined. This presentation is (i) in high-resolution mapping mating ToAth1WhenAop2Matches, (ii)Ath1Sensitivity andAth1Among resistant strains Isolation and sequencing of different cDNAs, (iii) production of each protein That the product differs by 1 amino acid between the susceptible and resistant strains, and (iv) Oxidation of protein Atherosclerosis, taking into account its primary importance in the process of atherosclerosis Validity of antioxidants with important role in atherosclerosis (pl ausability). The hypothesis that AOP2 functions differently between resistant and susceptible lines is that the oxidized L DL causes more foam cells to form and thus causes more linear fat deposition Gives credibility to let them do it. HDL protects LDL from oxidation, and As HDL becomes damaged by oxidation products, it is easier to remove from plasma Removed. Importantly,Ath1Key differences between resistant and susceptible strains Is the magnitude of fat damage and the level of plasma HDL. As a factor contributing to atherosclerosisAop2Once the genes are identified, Many different applications are possible. For example, screening for abnormalities in this gene This time, at the gene or protein level, It is possible to confirm the predisposition to the disease. In addition, the relationship between antioxidant activity and this gene The Rens to screen for compounds that modulate antioxidant activity in vivoA th1 Suggests using a mouse strain. It is also useful in treating oxidative damage, atherosclerosis and heart disease. It is also possible to use both protein and DNA compositions. Regarding the use of the latter, Identification of key natural genomic regulatory elements, especially those associated with increased expression, is the most important It is important. The sequence information provided in Example 8 is identical to that of such important regulatory sequences. Enable More specifically, FIG. 7 displayed in Example 8 Some consensus recognition sequences for transcription factors are found in the putative proximal promoter Indicates that This These include USF (upstream stimulating factor) and SREBP (sterol response element binding protein). And a potential binding site. These DNA binding proteins are both Have also been shown to be important in regulating gene expression. Specific described Promoter sequences are particularly highAop2Unrelated to transcription level, but common regulatory sequence Once identified, those skilled in the art will recognize alleles characterized by increased levels of mRNA production. The promoter sequence was isolated from the offspring and such sequences were compared to those disclosed in FIG. You should be able to compare. Such an analysis is provided herein.Aop 2 It will clarify the nature of the important regulatory sequences that lead to differences in expression. Utilizing the identification of such regulatory sequences therapeutically in gene therapy protocols be able to. AOP2 activity appears to be localized in the cytosol.Ath1 Therapeutic methods for treatment of susceptible individuals depend on the relevant cells of the individual.Ath1Resistance giveAop2Is to introduce a mammalian expression vector carrying the allele . For atherosclerosis, the relevant target cells are the arterial wall (low density liposome). The site of protein (LDL) oxidation). Ordinary mammalian expression vector This will be described in more detail below. From previous studies, such normal mammalian vectors Gene delivery can result in expression in cells of the arterial wall Have been. In this connection,Aop2In at least 23 different organizations It is important to note that it is widely expressed. This somewhat ubiquitous expression-like Considering the formula, in cells other than the target cellAop2Harms related to the onset of It is unlikely to be very useful. II. AOP2 polypeptide and fragments thereof Thus, according to one aspect of the present invention, we provide the polypeptide AO Provides the primary sequence of P2. This molecule is useful in a variety of different situations. For example , AOP2 can be used as an antigen to produce antibodies, To study and diagnose disease states associated with AOP2. Also, AOP 2 in vitro or in vivo using as part of a screening assay Drugs can also be tested for their ability to affect AOP2 function. Finally, in vivo, for example, during cardiac surgery where blood is oxygenated outside the body AOP2 can be used to prevent oxidative damage. In addition to all AOP2 molecules, does the present invention retain antioxidant (or other) activity? Or a fragment of the polypeptide that may or may not be required. Cordin Fragment containing the N-terminus of the molecule by genetic engineering of the translation termination site in the Can be fabricated (described below). Alternatively, as a protease Treatment of AOP2 molecules with known proteolytic enzymes results in various N-terminal , C-terminal and internal fragments can be generated. Example fragment is 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 , 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 40 As shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 with a length of zero or more amino acids ToAth1Consecutive residues of the sequence may be included. Precipitation (eg, ammonium sulfate ), HPLC, ion-exchange chromatography, (immunity affinity chromatography) Affinity chromatography or various large Known methods such as size separation (sedimentation, gel electrophoresis, gel filtration) Purify fragments be able to. A. Structural features of polypeptides Aop2Encodes a polypeptide of 224 amino acids. Of this molecule Expected molecular weight is 26 kD. Therefore, at a minimum, the assay for molecular weight This molecule can be used as a reference in B B. Functional features This applicationAop2When a molecule refers to a function or “wild-type” activity, Various biological components such as lipids, proteins, especially low and high density lipoproteins It means having the ability to prevent oxidation of offspring. Specifically, AOP2 is a thiol Of proteins that can protect enzymes from damage by metal-catalyzed oxidation Be a member of the family. Using assays well known to those of skill in the art, Can be determined to possess this activity. For example, the function TypicalAop2In cells that have no products and therefore exhibit excessive oxidationAop2Or By introducing a gene encoding the mutant, a gene having AOP2 function can be obtained. Offspring are identified. For example, cell extracts can be assayed for protection of the enzyme from metal-catalyzed oxidation. Can be. Also,Aop2AOP that can be used for complementation studies with genes There is also at least one yeast strain that lacks a two-like function. As a specific example, Measuring the protein using an immunoassay with antibodies specific for the protein Should be able to. In addition, the activity of this protein protects LDL from oxidation. It should also be possible to measure it by its ability. Such an assay is Based on the amount of oxidized LDL; if the antioxidant is performing well, LDL If the antioxidants do not perform well, the oxidized LDL will be It is. The amount of thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) produced Oxidized LDL can be estimated directly by measuring the absorbance in nm. (Ohkawa et al., 1979). This assay is based on Atherosclerosis (Partatharathy et al., 1990). Oxidation Another method of direct estimation of the estimated LDL is as described (Klimov et al. 1993), measuring the products of lipid peroxidation, conjugated dienes and trienes. And An indirect method for measuring oxidized LDL is the collection by macrophages. It is included. Macrophages take up oxidized LDL, but the original LDL is Because it does not take in,¹²⁵Of macrophages to degrade LDL labeled with I (Partatharathy et al., 1990). Finally, thiol dependence Ability to Protect Glutamine Synthetase from Oxidative Inactivation by Reactive Metal-Catalyzed Oxidation System By force, members of this class of antioxidants can be assayed (Net to et al., 1996). This involves the removal of hydrogen peroxide from the oxidation system. C. Mutants of AOP2 Amino acid sequence variants of the polypeptide may be substitution, insertion or deletion variants. Good. Deletion variants may include one or more native proteins that are not essential for function or immunogenic activity. Or no more residues. Insertional mutants are typically found in polypeptides. Includes addition of material at non-terminal positions. This is an immunoreactive epitope or simply It can include a single residue insertion. The addition of the terminus called the fusion protein This is described below. Substitution variants are typically found at one or more positions in a protein. Involving substitution of one amino acid for another and without losing other functions or properties One or more of the polypeptides, such as stability against proteolytic cleavage They can be designed to adjust these properties. This kind of replacement is It is preferably conservative, i.e., one amino acid has a similar shape and charge. So replace it. Conservative substitutions are well known in the art, for example: Alanine → serine; arginine → lysine; asparagine → glutamine or hiss Thidine; Aspartate → Glutamate; Cysteine → Serine; Glutamine → A Sparagine; Glutamate → Aspartate; Glycine → Proline; Histidine → asparagine or glutamine; isoleucine → leucine or valine; Syn-> valine or isoleucine; lysine-> arginine; methionine-> leucine Or isoleucine; phenylalanine → tyrosine, leucine or methionine Serine → threonine; threonine → serine; tryptophan → tyrosine; Syn → tryptophan or phenylalanine; and valine → isoleucine or Contains a leucine mutation. The following are equivalent or based on changing the amino acids of the protein It is an explanation for producing a second generation molecule that has been further improved. For example, the antibody The ability to interact with structures such as the original binding site or the binding site on the substrate molecule. For example, replacing one amino acid in the protein structure with another amino acid Can be It is the protein phase that determines the biological functional activity of a protein Because of the ability and nature of interaction, certain amino acid substitutions Created in the foundational DNA coding sequence and nevertheless have similar properties Can be obtained. Therefore, as described below, Make various mutations in the DNA sequence of a gene without losing significant biological utility or activity. It is contemplated by the inventors that they can be made. Table 1 encodes specific amino acids Indicates a codon. When making such mutations, the hydropathic index of amino acids can be considered. Wear. Hydrophobic hydrophilic amino acid fingers in conferring biological functions that interact with proteins The importance of numbers is generally understood in the art (Kyte & Doolit) tle, 1982). Two types of proteins that provide the relative hydrophobic / hydrophilic properties of amino acids Contributes to the next structure, which in turn contributes to the protein and other molecules, such as enzymes, substrates, It is generally accepted to identify interactions with receptors, DNA, antibodies, antigens, etc. I have. Each amino acid is assigned a hydropathic index based on its hydrophobicity and charge characteristics. (Kyte & Doolittle, 1982), which are: (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); cysteine / cystine (+2.5); methionine (+1.9) Alanine (+1.8); glycine (-0.4); threonine (-0.7); Phosphorus (-0.8); tryptophan (-0.9); tyrosine (-1.3); Phosphorus (-1.6); Histidine (-3.2); Glutamate (-3.5); Tamine (-3.5); Aspartate (-3.5); Asparagine (-3.5) Lysine (-3.9); and arginine (-4.5). Substitution of one amino acid with another having a similar hydropathic index or score Resulting in a protein with similar biological activity nonetheless, That is, the ability to obtain a biologically equivalent protein Known in the art. Make such a mutation In the production, substitution of amino acids having a hydrophobicity index within ± 2 is preferable, and Among them, those within the range are particularly preferred, and those within ± 0.5 are even more particularly preferred. It also demonstrates that similar amino acid substitutions can be made effectively based on hydrophilicity. It is known in the art. United States incorporated herein by reference. Patents 4,554,101 disclose, as determined by the hydrophilicity of adjacent amino acids , The largest local average hydrophilicity of a protein correlates with the biological properties of the protein It describes that you do. It is described in detail in US Pat. No. 4,554,101. Thus, the following hydrophilicity values are defined for amino acid residues: arginine (+ 3.0); lysine (+3.0); aspartate (+ 3.0 ± 1); G (+ 3.0 ± 1); Serine (+0.3); Asparagine (+0.2); Gluta Min (+0.2); Glycine (0); Threonine (-0.4); Proline (-0 . Alanine (-0.5); histidine (* -0.5); cysteine ( -1.0); methionine (-1.3); valine (-1.5); leucine (-1. 8); Isoleucine (-1.8); Tyrosine (-2.3); Phenylalanine ( -2.5); tryptophan (-3.4). Replacing an amino acid with another having a similar hydrophilicity value and nevertheless It turns out that biologically equivalent immunologically equivalent proteins can be obtained ing. In such a mutation, the substitution of an amino acid having a hydrophilicity value within ± 2 Preferably, those within ± 1 are particularly preferred, and those within ± 0.5 are even more preferred. Particularly preferred. As outlined above, amino acid substitutions are usually relative similarities of amino acid side-chain substituents. Properties, such as their hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, etc. Good. Representative substitutions that take into account various of the above features are well known to those skilled in the art, and Luginine and lysine: glutamate and aspartate; serine and threonine; glue Including Tamine and Asparagine; and Valine, Leucine and Isoleucine. Another embodiment for the production of a polypeptide of the invention is the use of a peptidomimetic . Mimetics are peptide-containing molecules that mimic components of the protein secondary structure. For example ,BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto, etc. , Editing, Chapman and Hall, New York (1993) See Johnson Turn et al., "Peptide Turn Mimetics" . The rationale behind the use of peptidomimetics is that the protein peptide Amino acids so that the main chain facilitates molecular interactions primarily like those of antibodies and antigens Is to place the side chains. Peptidomimetics resemble natural molecules It is believed that this allows for molecular interactions. These along with the principles outlined above It has many of the original properties of AOP2 using principles, but has been modified and further improved Second-generation molecules with improved properties can be produced. D. Domain exchange As described in the examples, the present inventorsAop2Putative mau of the gene And human homologs were identified. In addition, in AOP2 (eg, residue 122) Mutations that are thought to alter the function of are identified. These studies have at least two Is important for two reasons. First, they are still other homologs of this gene, Progenitor mutants and mutants are dogs, rats, rabbits, monkeys, gibbon, Similar species such as mumpsies, apes, baboons, cows, pigs, horses, sheep and cats Present in species Give a reasonable expectation that there is a possibility. Homologues, variants and sudden Naturally, the isolation of a variant, in conjunction with other analyses, allows the identification of an active or functional domain. Can be specified. Second, it provides a starting point for further mutation analysis of the molecule. I can. One way that this information can be used is in "domain exchange" It is. Domain exchange is different, but in this case chimeras with related polypeptides Including making molecules.Aop2Mouse and human sequences from other speciesAop2And that By comparing mutants and allelic variants of these polypeptides. Thus, predictions can be made about functionally important regions of these molecules. next, In an effort to determine the importance of these regions for AOP2 function, It is possible to exchange related domains. Probably while giving the same function These molecules differ in that they can distinguish these “chimeras” from natural molecules. May have added value. Based on the amino acid sequence identity of mouse, dog and human sequences, Can infer that even small variations in the primary sequence affect function You. Further analysis of mutants and their predicted effects on secondary structure Increase this understanding. E. FIG. Fusion protein A specialized type of insertion mutant is a fusion protein. Usually this molecule is no longer All or part of a single polypeptide linked at the N or C terminus to all or a portion thereof It has a qualitative part of the natural molecule. For example, fusions are typically performed on heterologous hosts. To incorporate leader sequences from other species to enable recombinant expression of the protein Used. Another useful fusion is the fusion tag. To facilitate protein purification, immunologically active Including the addition of a domain. Including a cleavage site at or near the fusion junction Facilitates the removal of foreign polypeptides after purification. Another useful fusion is from enzymes Active site, glycosylation domain, cell targeting signal or transmembrane Includes the joining of functional domains such as regions. F. Protein purification It is desirable to purify AOP2 or a variant thereof. Protein purification technology It is well known to those skilled in the art. These techniques have, to a certain extent, been developed for polypeptides and non-polypeptides. Includes crude fractionation of the cellular environment into peptide fractions. Polypeptides from other proteins Once separated, the polypeptide of interest can be purified using chromatography and electrophoresis techniques. To perform a partial or complete purification (or purification to homogeneity) be able to. An analytical method particularly suitable for the preparation of pure peptides is ion-exchange chromatography. Chromatography, exclusion chromatography; polyacrylamide gel electrophoresis; Isoelectric focusing. A particularly efficient method for purifying peptides is high speed Liquid chromatography or just HPLC. One embodiment of the invention is the purification of a protein or peptide encoded, in certain embodiments. For substantial purification. As used herein, "purified tan The term "protein or peptide" refers to the protein or peptide Can be isolated from other components, to some degree purified to the state available The composition is considered to refer to Therefore, the purified protein or peptide is , A protein or peptide away from the environment where it can naturally exist Also Generally, “purified” refers to protein that has been fractionated to remove various other components. Or peptide composition, which composition exhibits its expressed biological activity. Keep qualitatively. Where the term "substantially purified" is used, The indication is that the protein or peptide is about 50%, about 60% of the protein in the composition, A set comprising about 70%, about 80%, about 90%, about 95% or more Refers to a composition that forms the main component of the composition. Various methods for quantifying the degree of protein or peptide purification are disclosed herein. Will be understood by those skilled in the art in view of These can be used, for example, to determine the specific activity of the active fraction. Or to evaluate the amount of polypeptide in the fraction by SDS-PAGE analysis including. A preferred method for assessing the purity of a fraction is to calculate the specific activity of the fraction, By comparing it to the specific activity of the original extract and calculating the purity accordingly Yes, and it is evaluated by "-fold purification number" in the present specification. Used to represent the amount of activity The actual unit used will, of course, be the purified and expressed protein or peptide. The specific assay technique chosen to track whether the It depends on the technique. Various techniques suitable for use in protein purification are well known to those skilled in the art. . These include, for example, ammonium sulfate, PEG, antibodies, etc. Subsequent centrifugation; ion exchange, gel filtration, reverse phase, hydroxylapatite and Chromatographic steps such as affinity chromatography; isoelectric point Electrophoresis; gel electrophoresis; and combinations of such and other techniques. The order in which the various purification steps are performed, as is generally known in the art. Changing the order Omit or eliminate certain steps and nevertheless substantially purify Providing a suitable method for the so-called production of proteins or peptides Can be considered. Proteins or peptides are always given in their most purified state There is no general requirement. In fact, some products are not substantially purified Is likely to be useful in Uses fewer purification steps in combination By utilizing different forms of the same general purification scheme Partial purification can be achieved. For example, using an HPLC device Cation exchange column chromatography typically uses low pressure chromatography systems. It is understood that this results in a "one-fold" purification that is greater than the same technique utilized. Lower phase Methods for indicating the degree of purification are based on the total recovery of the protein product or on the It may have advantages in maintaining the activity of the protein. Polypeptide migration can occasionally change significantly under different conditions of SDS-PAGE (Capaldi et al., 1977). Therefore different Under electrophoresis conditions, the apparent fraction of purified or partially purified expression products It is understood that child mass may vary. High performance liquid chromatography (HPLC) has extraordinary resolution of peaks It is characterized by a very rapid separation. Very fine particles to maintain proper flow rate And by using high pressure. In a few minutes or at most an hour Separation can be achieved. In addition, the particles are very small and tightly packed , And consequently, the void volume is a very small fraction of the bed volume, A small volume of sample is required. Also, the band is very narrow, Sample dilution Since there is little, the concentration of the sample does not need to be very large. Gel chromatography or molecular sieve chromatography is the size of a molecule. Is a special type of partition chromatography based on Gel chromatography The supporting theory is that columns prepared with small particles of inert material containing small pores , Depending on the size of the molecules, because they pass through or bypass pores, The separation of large molecules from smaller ones. The substance that creates the particles Unless adsorbed, the only factor that determines flow rate is size. Therefore, the shape As long as they are relatively constant, molecules are eluted from the column in decreasing size. gel Filtration means that the separation is independent of all other factors like pH, ionic strength, temperature etc. So it is outstanding for separating molecules of different sizes. Also, in effect, adsorption , Less band broadening, and elution volume is simply related to molecular weight. Affinity chromatography binds the substance to be isolated to A chromatographic method with specific affinity between the resulting molecules. This is It is a receptor-ligand type interaction. Sharing one of the binding partners with the insoluble matrix The column material is synthesized by associative connection. Next, is the column material a solution? Can specifically adsorb substances. Change to conditions where binding does not occur (pH , Ionic strength, temperature, etc.). Certain types of affinity chromatography useful for purification of compounds containing carbohydrates The chromatography is lectin affinity chromatography. Lectin A type of substance that binds to various polysaccharides and glycoproteins. Lectins usually smell Linked to agarose by cyanide. C Concanavalin A linked to Sepharose is used It is the first substance of its kind and is widely used for the isolation of polysaccharides and glycoproteins. I have. Other lectins used are lentil lectin, N-acetylglucosa Wheat embryo agglutinin useful in the purification of minyl residues, and helix pomachi A (Helix pomatia) Contains lectins. Lectin itself is a carbohydrate Purified using affinity chromatography in Gand. Castor and Lac Lactose has been used to purify lectins from Lactobacillus casei; maltose Is useful in extracting lectins from lentil and jack bean; N-acetyl-D-galactosamine was used to purify lectins from soybean N-acetylglucosaminyl binds to lectins from wheat embryos; Lactosamine has been used to obtain lectins from bivalves; The course binds lectins from Lotus japonicus. The matrix itself does not adsorb molecules to any significant extent and Should be of a chemical, physical and thermal stability. The ligand is They should be linked so as not to affect the binding properties. In addition, the ligand A relatively tight bond should also be given. And it breaks the sample or ligand It should be possible to elute the substance without. Affinity chromatography One of the most common forms of fees is immunoaffinity chromatography . The production of antibodies suitable for use according to the invention is described below. G. FIG. Synthetic peptide The present invention relates to a smaller AOP for use in various aspects of the invention. Related peptides are also described. Due to their relatively small size, the peptides of the invention It can also be synthesized in solution or on a solid support according to conventional techniques. Various self Dynamic synthesizers are commercially available and can be used according to known protocols. Wear. For example, Stewa, each of which is incorporated herein by reference. rt and Young, (1984); Tam et al. (1983); Merrifie. ld (1986); and Barany and Merrifield (1979). See Usually from about 6 to about 35-5, corresponding to the selection areas described herein. A library of short peptide sequences up to 0 amino acids or overlapping peptides Can be easily synthesized and then devised to identify reactive peptides. It can be screened in a cleaning assay. Or also Alternatively, recombinant DNA technology may be used, in which case the peptide of the invention may be encoded. Insert the nucleotide sequence into an expression vector and transform it into a suitable host cell. Or transfected and cultured under conditions appropriate for expression. H. Antigen composition The present invention relates to an AOP2 protein as an antigen for immunization of animals involved in the production of antibodies. It also stipulates the use of proteins or peptides. Linker, polylinker or derivatized AOP2 or any part thereof into one or more drugs by amino acids Connect, connect, combine, combine, or chemically link Is foreseen. Bispecific or multivalent compositions Alternatively, this may be done so that a vaccine is produced. In addition, these compositions The methods used to prepare the products are well known to those of skill in the art, and are useful for administering to animals. Suitable for It is foreseeable that they should be pharmaceutically acceptable. Like New drugs are keyhole hemocyanin (KLH) or bovine A carrier such as serum albumin (BSA). III. Nucleic acid The present invention also provides, as another aspect, a gene encoding AOP2. Human and ma The gene for the mouse AOP2 molecule has been identified. However, those skilled in the art Various other species (eg, dogs, rats, rabbits, monkeys, tenas) can be used with the two nucleic acids. Gazal, chimpanzee, ape, sis, cow, pig, horse, sheep, cat and others Species) should be able to easily identify related homologues. Ming is not limited in scope to these genes. Finding a mouse homolog of this gene? Thus, it seems promising that other species more closely related to humans actually have homologs. these Can be used as part of a diagnostic and therapeutic regimen. Further, it is clear that the present invention is not limited to the particular nucleic acids disclosed herein. It should be. As explained below,Aop2"Gene" is a variety of different Human and mouse genetics disclosed herein. The corresponding polypeptide, which is functionally and in some cases structurally indistinguishable from the Can be produced. Similarly, any reference to a nucleic acid includes the nucleic acid, and in some cases Should be interpreted to include host cells capable of expressing the product of the nucleic acid It is. In addition to therapeutic importance, cells expressing the nucleic acids of the inventionAop2Machine Induce, suppress, inhibit, increase, prevent, prevent, prevent Useful in connection with screening for drugs that stop, stimulate or enhance there is a possibility.A. Nucleic acid encoding Aop2 The human gene disclosed in SEQ ID NO: 1 and the mouse gene disclosed in SEQ ID NO: 3 The gene of the present inventionAop2Is a gene. The nucleic acids of the present invention are all AOP2 products, AOP 2 domain or any other fragment of the AOP2 sequence described herein May be coded. Nucleic acids are obtained from genomic DNA, that is, Can be cloned directly from the genome. However, in a preferred embodiment Thus, the nucleic acid comprises complementary DNA (cDNA). Also, what is intended is D NA and the original intron or an intron from another gene; Molecules created in this way are sometimes called "minigenes." At a minimum, this And other nucleic acids can be used, for example, as molecular weight standards in gel electrophoresis. Wear. The term "cDNA" uses messenger RNA (mRNA) as a template DNA prepared by the above method. Genomic DNA or genomic processing Polymerization from unmodified or partially processed RNA templates The advantage of using a cDNA for a given DNA is that the cDNA It mainly contains the coding sequence of the protein. Non-coding areas Non-coding regions such as those required for optimal expression or introns Complete or partial gain, such as when the region is targeted in antisense methods Nome sequences may be preferred. They also have slightly different nucleic acid sequences, but nevertheless Natural variants that encode proteinsAop2Gene is (Table 1 below) See). As used in this application,Aop2The term nucleic acid encoding A nucleic acid molecule that does not contain cell nucleic acid. As a preferred feeling, books The invention essentially relates to nucleic acid sequences as described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. Related. The term "as described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3" That the nucleic acid sequence substantially corresponds to a part of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. means. The term “functionally equivalent codon” refers to arginine or serine. To refer to codons encoding the same amino acid, such as six codons (Table 1 below) ) And those encoding bioequivalent amino acids as described on the following page. It is also used herein to refer to don. Considering the degeneracy of the genetic code, the nucleotide of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 At least about 50%, generally at least about 60%, more generally Has about 70%, most typically about 80%, preferably at least about 90%, and Most preferably, the sequence having about 95% nucleotides is "SEQ ID NO: 1 or Is the sequence as described in SEQ ID NO: 3. Also, those described in FIG. An array that is essentially the same as Nucleic acid segment containing the complement of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 under standard conditions Can also be functionally identified as a sequence that can hybridize to . The DNA segment of the present invention is, as described above, a biologically functional equivalent AO. Includes those encoding P2 proteins and peptides. Such a sequence is a nucleic acid Sequence and known to occur naturally in the protein so encoded Possible codon duplication and functional equivalents of amino acids . Alternatively, a functionally equivalent protein or peptide is It can be made by applying surgery, in which case the characteristics of the amino acids to be exchanged should be considered. Based on insight, mutations in the protein structure can be made. Set by humans The measured mutation can be introduced by applying a site-directed mutagenesis technique, Or, as described below, introduce them randomly and then scan for appropriate features. Can be cleaned. B. Oligonucleotide probes and primers Of course, the present invention is complementary to the sequence described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. Also included are DNA segments that are complementary or essentially complementary. "Complementary" nucleic acid sequences Sequence can base pair according to standard Watson-Crick complementation rules It is. As used herein, the term "complementary sequence" is defined above. As described by the same nucleotide comparison, or as described herein. The nucleic acid segment of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 under relatively harsh conditions such as A substantially complementary nucleic acid sequence as specified to be capable of hybridizing to the Means Such an array isAop2Protein or its functional or Non-machine Functional fragments. Alternatively, the hybridizing segment is a shorter oligonucleotide It may be. A 17 base long sequence occurs only once in the human genome Should be, and therefore sufficient to identify unique target sequences. Shorter o Rigomers are easier to make and increase accessibility in vivo, but A number of other factors are involved in determining the specificity of the hybridization. Oh Both binding affinity and sequence specificity of a lignonucleotide to its complementary target are long It increases as it grows. Others are conceivable, but 8, 9, 10, 11, 1 2, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 4, 0, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 1 Intended to use representative oligonucleotides of 00 or more base pairs Is done. 250, 500, 1000, 1212, 1500, 2000, 2500 Longer poly-encoding 3000 or 3431 bases and longer Nucleotides are also contemplated. Such oligonucleotides are, for example, As a probe in Southern and Northern blots and in amplification reactions There are uses as primers. Suitable hybridization conditions are well known to those skilled in the art. Some uses, For example, substitution of amino acids by site-directed mutagenesis results in lower stringency. It will be appreciated that gency conditions are required. Under these conditions, even if The probe and target strand sequences are not completely complementary and Hybridization can occur even with mismatches. Salt concentration To increase and lower the temperature More conditions can be lower stringency. For example, about 37 ° C Between about 0.1 and 0.25M NaCl at a temperature between about Linguistic conditions can be provided, while ranges from about 20 ° C to about 55 ° C. About 0.15M to about 0.9M salt at ambient temperature to reduce stringency Can be given. Thus, the hybridization conditions can be easily controlled. Can be made, thus they are generally preferred by the desired result Is the way. In another embodiment, for example, at a temperature between about 20 ° C. and about 37 ° C., 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl_Two, 10 Hybridization can be performed under the condition of mM dithiothreitol. Wear. Other hybridization conditions utilized may range from about 40 ° C. to about 72 ° C. 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl at a temperature in the range of , 1.5 μM MgCl_Two, Can be included. Also, hybridization Formamide and SDS may be used to change the conditions. One method using the probes and primers of the present invention isAop2Related to Gene, or more specifically, from another speciesAop2In the search for homologues of is there. Presence of mouse homologues in closely related and possibly far-related species HumanAop2Suggests that other homologs of are found. Screening is Although analysis can include analysis of RNA molecules, usually the target DNA is genomic or cD NA library. Hybridization stringency and By varying the region of the lobe, different degrees of homology can be found . Another method of using the probes and primers of the present invention is site designation or Is site-directed mutagenesis. Site-directed mutagenesis is the underlying DN Individual peptides or biologically functional equivalents due to specific mutations in A This is a useful technique for preparing proteins or peptides. The technology is further By introducing one or more nucleotide sequence mutations into the DNA Preparing and testing sequence variants, incorporating one or more of the above considerations. Give you useful abilities. Site-directed mutagenesis Primers of sufficient size and sequence complexity to form stable duplexes on both sides DNA sequence of the desired mutation and a sufficient number of adjacent By using specific oligonucleotide sequences that encode nucleotides Mutants can be generated. Typically, about 17 to 25 nucleotides And a primer of about 5 to 10 residues on both sides of the junction of the sequence. be changed. The technology typically involves bacteriophages that exist in both single-stranded and double-stranded forms. Page vector. Typical vectors useful in site-directed mutagenesis Contains vectors such as M13 phage. These phage vectors are commercially available And their use is generally well known to those skilled in the art. Also, double-stranded Plasmids are also commonly used for site-directed mutagenesis, The step of transferring the target gene to the plasmid is eliminated. Typically, first, a single-stranded DNA sequence containing a DNA sequence encoding the appropriate protein Site-specific by obtaining the vector or melting the duplex of a double-stranded vector Perform mutagenesis. Oligonucleotides carrying the desired mutated sequence A reotide primer is prepared synthetically. Next The degree of mismatch when choosing hybridization conditions. The primers are then annealed with the single-stranded DNA preparation to preserve the mutation. Escherichia coli to complete the synthesis of the chainE. FIG. coli) Polymer And subjected to a DNA polymerase such as Klenow fragment. Like this , One strand encodes the original unmutated sequence, and the other strand Form a heteroduplex carrying the desired mutation. Next, this heteroduplex The vector is used to transform appropriate cells, such as Escherichia coli cells, and A clone containing the recombinant vector carrying the mutated sequence arrangement is selected. The preparation of sequence variants of the selected gene using site-directed mutagenesis has potential Provided as a means to generate useful species, and to obtain sequence variants of the gene. It is not meant to be limiting, as there are other ways to do so. For example, an array To obtain the mutant, the recombinant vector encoding the It may be treated with a mutagen such as luamine. C. Antisense construct In some cases, the mutant protein may not be non-functional. M However, when the "wild-type" molecule is expressed in higher amounts than the mutant polypeptide Even they have unusual functions that cannot be overcome by replacement gene therapy. there's a possibility that. Antisense treatment is one way to address this situation. Also, cell lines or transgenics for research, diagnostic and screening purposes In order to “knock out” the function of AOP2 in the development of Chisense technology may be used. Antisense methodology takes advantage of the fact that nucleic acids tend to pair with “complementary” sequences. To use. Complementarity is when the polynucleotide complies with standard Watson-Crick complementation rules. Means that they can base-pair. That is, the larger pudding Guanine (G: C) and base paired with the smaller pyrimidine and paired with cytosine For DNA and adenine (A: T) paired with thymine for RNA or for RNA Forms a combination of adenine (A: U) paired with uracil. Hybrida Inosine, 5-methylcytosine, 6-methyladenine, hypoki Including less common bases, such as Santin, does not prevent pairing. Targeting double-stranded (ds) DNA with polynucleotides creates triple helix formation Targeting RNA results in double helix formation. Antisen When introduced into a target cell, the polynucleotides are exposed to their target polynucleotides. Specifically binds to transcription, RNA processing, transport, translation and / or Hinder qualification. In vitro or in vivo, such as in a host animal including a human patient. Either in vivo prevents the transcription and / or translation of the gene in the host cell Antisense RNA constructs or such antisense RNA Can be used. Gene promoters and other regulatory regions, exons, introns or even Designing antisense constructs to bind to exon-intron boundaries Can be. The most effective antisense construct is the intron / exon splice junction It is considered to include a region complementary to the junction. Thus, a preferred embodiment is an intron- An anti-complementary region in the region within 50-200 bases of the exon splice junction It is recommended to include a sense construct Is shown. Some exons in constructs without significantly affecting target selectivity It has been recognized that sequences can be included. The amount of exon material contained is used It depends on the particular exon and intron sequences. Normal cell function is affected Whether the expression of related genes with complementary sequences is affected Too much simply by testing the construct in vitro to determine if One can easily test for the presence of exon DNA. As described above, "complementary" or "antisense" Polynucleotides that are qualitatively complementary and have very few base mismatches Means an array. For example, a sequence 15 bases long is complementary at position 13 or 14. If it has a target nucleotide, it can be called complementary. Above all, Fully complementary sequences are completely complementary over their entire length and have base mismatches. There is no array. Other sequences having a lower degree of homology are also contemplated. For example, antisequences that have regions of high homology but that also contain non-homologous regions A sense construct (eg, a ribozyme; see below) can be designed. these Molecules have less than 50% homology, but bind to the target sequence under appropriate conditions . A portion of the genomic DNA can be replaced with a cDNA or synthetic sequence to create a particular construct. It may be convenient to combine with For example, the intron is the final construction If desired in the product, a genomic clone must be used. cDNA or synthesis The resulting polynucleotide provides a more convenient restriction site for the rest of the construct And can therefore be used for the rest of the sequence.D. Ribozyme Another way to tackle "dominant negative" mutants is ribozymes By the use of Traditionally, proteins have been used to catalyze nucleic acids, A variety of macromolecules are emerging as useful in this effort. Riboza Im is an RNA-protein complex that cleaves nucleic acids in a site-specific manner. Ribozai Have specific catalytic domains that possess endonuclease activity (Kim and And Cech, 1987; Gerlach et al., 1987; Forster and Sy. mons, 1987). For example, many ribozymes are highly specific Promotes the tellurium transfer reaction, often with some phosphorus in the oligonucleotide substrate Cleave only one of the acid esters (Cech et al., 1981; Michel and W. esthof, 1990; Reinhold-Hurek and Shub, 199. 2). This specificity is attributed to the fact that the substrate undergoes a specific base-pairing interaction before the chemical reaction. Attributed to the requirement to bind to the internal inducible sequence of Zyme ("IGS"). Has been obtained. Ribozyme catalysis is part of sequence-specific cleavage / ligation reactions involving nucleic acids (Joyce, 1989; Cech et al., 1981). An example For example, US Pat. No. 5,354,855 discloses that certain ribozymes are known ribonucleic acids. The sequence specificity is greater than that of the DNAse enzyme and comparable to that of the DNA restriction enzyme. It reports that it can act as a nuclease. Therefore, sequence-specific resources Bozyme-induced suppression of gene expression may be particularly suitable for therapeutic applications (Scanlon et al., 1991; Sarver et al., 1990). Recently, Ribozymes can elicit genetic changes in some cell lines using them When Have been reported; modified genes include the oncogenes H-ras, c-fos and HIV. Gene included. Most of this work is based on specific ribozymes Includes a modification of the target mRNA based on the mutant codon. E. FIG. Vectors for cloning, gene transfer and expression In certain embodiments, the expression vector is used toAop2Express polypeptide products Allow it to be purified and then vaccinated, for example, into animals Can be used to produce antisera or monoclonal antibodies that can be used For further research. In another embodiment, the expression vector is Used in gene therapy. Expression requires that appropriate signals be provided in the vector That are responsible for the expression of the gene of interest in the host cell. Various regulatory components such as enhancers / promoters from both mammalian sources Including. Also, the stability and translation ability of messenger RNA in host cells (t ingredients that are designed to optimize lanslatability are also identified. You. Also, similar to the component that links the expression of the drug selectable marker to the expression of the polypeptide First, a number of dominant drug screens to establish permanent stable cell clones expressing the product The conditions for using the selection marker are also given. (I) regulatory component Throughout this application, the term "expression construct" encodes a gene product Mean to include any type of genetic construct containing the nucleic acid Some or all of the nucleic acid encoding the sequence can be transcribed. Transcripts are It may be translated into protein, but need not be. In some embodiments, expression Is the transcription of genes and gene products Includes both translations of mRNA. In another embodiment, the expression encodes a gene of interest. It only involves the transcription of the nucleic acid. In some embodiments, the expression construct is naturally occurring.Aop2Functional relationship to genes It comprises a regulatory sequence found in the field. In one embodiment, these regulatory sequences are Luciferase orLacZFused to a reporter or marker gene such as . In another embodiment, these regulatory sequences are used as they are found in nature. Either as modified or as modifiedAop2Functionally linked to a gene. In a preferred embodiment, the nucleic acid encoding the gene product is a promoter that regulates transcription. Below. A "promoter" is required to initiate specific transcription of a gene, A DNA sequence recognized by or introduced into the synthetic machinery of a cell. You. The phrase "under transcriptional control" refers to the initiation of RNA polymerase and the expression of a gene. That the promoter is in the proper position and orientation with respect to the nucleic acid to control means. The term promoter gathers around the start site of RNA polymerase II Used herein to refer to a group of transcription control modules. Promoter Many of the views on how DNA is constructed are based on HSV thymidine kinase. (tk) And several viral proteins, including those of the SV40 early transcription unit. Derived from motor analysis. From these studies, which have increased in more recent studies, The motors are composed of different functional modules, each with about 7-20 bp DN A and one of the transcription activator or repressor proteins Or more recognition sites. At least one module for each promoter is the start of RNA synthesis It works to determine the rank. The best-known example of this is the TATA box There is a mammalian terminal deoxynucleotidyl transferase gene TATA box like promoter of SV40 promoter and promoter of SV40 late gene In some promoters lacking a starter, another component that overlaps the start site itself is Helps fix place. Additional promoter components regulate the frequency of transcription initiation. Many promoters Has recently been shown to contain a functional component also downstream of the start site, but typically These are located in the region 30-110 bp upstream of the start site. Promoter -The spacing between components is often free to change, so that the components are reversed or Promoter function is retained when moved relative to each other. with tk promoter Can increase the spacing between promoter components up to 50 bp apart and then activate Sex begins to decrease. The promoter allows individual components to activate transcription Seems to be able to work together or independently. The particular promoter used to control the expression of the nucleic acid sequence of interest is It is considered important as long as it can guide nucleic acid expression in target cells. Not. Therefore, when targeting human cells, it may be expressed in human cells. Place the nucleic acid coding region adjacent to and under the control of a possible promoter. Preferably. Generally speaking, such promoters are human or It may include any of the promoters. In various embodiments, human sources are used to obtain high-level expression of the coding sequence of interest. Itomegalovirus (CMV) immediate early gene promoter, SV40 early promoter Rous sarcoma virus long terminal repeat, Toinsulin promoter and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogena Can be used. The level of expression is sufficient for the given purpose Is well known in the art to obtain expression of the coding sequence of interest. Other viral or mammalian cell or bacterial phage promoters Use is likewise contemplated. Transfection by using a promoter with known properties Or optimize the expression level and pattern of the protein of interest after transformation be able to. Furthermore, promoters that are regulated in response to specific physiological signals Selection can allow for inducible expression of the gene product. Table 2 and 3 Can be used in connection with the present invention to regulate the expression of a target gene These components / promoters are listed. This table shows all the genes involved in promoting gene expression. It is not intended to be an exhaustive list of possible components, but merely as exemplifications thereof. Are enhancers located at distant promoters on the same molecule of cDNA? It is a gene component that increases their transcription. Enhancers are almost like promoters It is composed of That is, they are composed of a number of individual components, each of which Each binds to one or more transcribed proteins. The basic distinction between enhancers and promoters is functional. Enhancer territory The region must be able to stimulate transcription at discrete points as a whole; this is a promoter It does not need to apply to the domain or its component elements. On the other hand, the promoter is specific One or more components that direct the initiation of RNA synthesis at Must, while enhancers lack these specialties. Professional Motors and enhancers Often have overlapping, continuous, and often very similar It seems to have. The following are combined with the nucleic acid encoding the gene of interest in the expression construct Promoters and cellular promoters / enhancers that can be used And Table of inducible promoters / enhancers (Tables 2 and 3). further , Any promoter (such as by the eukaryotic promoter database EPDB) The combination of a promoter / enhancer can also be used to direct gene expression. You should be able to. Either part of the delivery complex or a further gene expression construct As such, given the appropriate bacterial polymerase, eukaryotic cells can Cytoplasmic transcription from a bacterial promoter can be provided. When using cDNA inserts, typically the appropriate polymerase of the gene transcript is used. It is desirable to include a polyadenylation signal to effect denylation. Po The nature of the rearenylation signal is not considered to be important for the successful implementation of the present invention , Human growth hormone and any such as SV40 polyadenylation signal Such an arrangement can be used. Also contemplated as a component of an expression cassette Things are terminators. These components increase the message level And can help to minimize overreading from cassette to other sequences You. (Ii) Selectable marker In one embodiment of the present invention, the cell contains the nucleic acid construct of the present invention and is contained in an expression construct. Identifying cells in vitro or in vivo by including a marker in it can. Such markers will give the cells an identifiable change and will contain an expression construct Allows easy identification of cells to be used. Usually, the drug selection marker will be And selection of transformants, for example, neomycium, puromycin, Resistant to hygromycin, DHFR, GPT, zeocin and histidinol Genes that confer sex are useful selectable markers. Or alternatively, herpes simplex Illthymidine kinase (tk) Or chloramphenicol acetyl trans An enzyme such as ferase (CAT) may be used. In addition, immunological markers It can also be used. The selectable marker used is a nucleic acid encoding the gene product At the same time, it is not considered important as long as it can be expressed. Selection marker Further examples are well known to those skilled in the art. (Iii) Multiple gene constructs and IRES In one embodiment of the invention, a multi-gene or polycistronic message is created. The use of an internal ribosome binding site (IRES) component is used to make. I The RES component follows a ribosome scanning model of 5'-methylated Cap-dependent translation. Translations can be started at internal positions (Pelettier and So nenberg, 1988). Like IRES from mammalian messages (M acejak and Sarnow, 1991), two members of the Picanovirus family Components (Polio and encephalomyocarditis) have been described (Pe lletier and Sonenberg, 1988). Heterogeneous IRES components Can be linked to an open reading frame. Each by IRES Multiple isolated open reading frames can be transcribed together, Create a polycistronic message. Each open-ready by IRES component Framing can utilize ribosomes for efficient translation. Single message Multiple genes using a single promoter / enhancer to transcribe It can be expressed efficiently. Link any heterologous open reading frame to the IRES component be able to. It is a secreted protein, a multiple protein encoded by distinct genes. Inheritance of buunit proteins, intracellular or membrane-bound proteins and selectable markers Including children. Thus, using a single construct and a single selectable marker The expression of several proteins can be performed simultaneously in the cell. (Iv) Delivery of expression vector There are a number of ways in which expression vectors can be introduced into cells. Of the present invention In one embodiment, the expression construct is a design construct derived from a virus or viral genome. Things. Certain viruses are receptor-mediated endocytosis Enter the cell, integrate into the host cell genome, and stabilize viral genes Ability to express exogenously into mammalian cells Attractive candidates for (Ridgeway, 1988; Nicolas And Rubenstein, 1988; Baichwal and Sugden, 1 986; Temin, 1986). The first window used as a gene vector Russ is a papova virus (simian virus 40, bovine papilloma wi Ruth and Polyoma) (Ridgeway, 1988; Baichwal and S) ugden, 1986) and adenovirus (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986). there were. These have a relatively low capacity of foreign DNA sequences and have a limited host Having a range. In addition, their tumorigenic potential and cellular alterations in permissive cells Sexual effects raise safety concerns. They receive only up to 8 kb of foreign genetic material. But can be easily introduced into various cell lines and laboratory animals (Nicolas and Rubenstein, 1988; Temi). n, 1986). One of the preferred methods for in vivo delivery is to use adenovirus expression vectors. Including "Adenovirus expression vector" is used for (a) the packaging of the construct. To help and (b) the antisense polynucleotide cloned therein Including a construct containing sufficient adenovirus sequences to express the tide Means In this context, expression does not require that the gene product be synthesized. No. The expression vector comprises a genetically engineered form of an adenovirus. 3 With knowledge of the adenovirus gene organization of the 6 kb linear double-stranded DNA virus Replacing large fragments of adenovirus DNA with foreign sequences up to 7 kB (Grunhaus and Horwitz, 1992). With retrovirus In contrast, adenovirus DNA replicates episomally without potential genotoxicity. Adenovirus infection of host cells has chromosomal integration I don't. Also, adenoviruses are structurally stable and, after many amplifications, Reorganization Not detected. Adenovirus is substantial regardless of cell cycle time Can infect all epithelial cells. So far, adenovirus Infection appears to be associated only with mild illnesses such as acute respiratory illness in humans . Adenoviruses have an intermediate size genome, ease of manipulation, high titer, For use as gene transfer vector due to high target cell range and high infectivity Especially suitable for Both ends of the viral genome are 100-200 base pairs in reverse. And contains repeat sequences (ITRs) that are responsible for viral DNA replication and packaging. Is a necessary cis component. The early (E) and late (L) regions of the genome It contains different transcription units that are separated by the initiation of the ruth DNA replication. E1 area ( E1A and E1B) are proteins and small numbers for the regulation of transcription of the viral genome. Encodes a cellular gene. Expression of the E2 region (E2A and E2B) This results in the synthesis of proteins for NA replication. These proteins are DNA And is involved in late gene expression and host cell blockade (Renan, 1990). C The products of late genes, including most of the ilscapsid proteins, Processing of a single primary transcript driven by the early phase promoter (MLP) Expressed only after aging. MLP (located at 16.8 mu) is late in infection It is particularly efficient that all mRNAs emanating from this promoter are 5 ' It carries the tripartite leader (TPL) sequence, which Make it the preferred mRNA for translation. In the current system, the recombinant adenovirus contains a shuttle vector and a provirus. It is produced from homologous recombination between sub-vectors. Two Proui Wild-type adenovirus from this step due to possible recombination between May be produced. Therefore, single cloning of the virus from individual plaques It is important to isolate the protein and examine its genomic structure. The construction and propagation of current adenovirus vectors lacking replication competence is 293. Dependent on a unique helper cell line called the Ad5 DNA fragment Transforms human embryonic kidney cells and constitutively expresses the E1 protein ( Graham et al., 1977). The E3 region does not have to be from the adenovirus genome (Jones and Shenk, 1978) with the help of 293 cells, Current adenovirus vectors are in either the E1, E3, or both regions. Carries foreign DNA (Graham and Prevec, 1991). in fact Adenovirus can package about 105% of the wild-type genome (Ghosh-Choudhury et al., 1987), an approximately 2 kb extra DNA volume. Give the amount. Approximately 5.5 kB DN that can be replaced in the E1 and E3 regions A together with the maximum capacity of the current adenovirus vector is less than 7.5 kB or Is about 15% of the total length of the vector. More than 80% of adenovirus virus The genome remains in the vector backbone and is a source of vector-mediated cytotoxicity. You. Also, the replication defect of the E1-deleted virus is incomplete. For example, viral inheritance Leakage of offspring expression is observed at high multiplicity of infection (MOI) with currently available vectors (Mulligan, 1993). Human embryonic kidney cells, muscle cells, hematopoietic cells or other human embryonic mesenchymal or epithelial cells Helper cell lines can be obtained from human cells, such as vesicles. Alternatively, helper cells from cells of other mammalian species that allow human adenovirus Cells can be obtained. Such cells include, for example, Vero cells or other Includes monkey embryonic mesenchymal or epithelial cells. As described above, a preferred helper The cell line is 293. Recently, Racher et al. (1995) cultured 293 cells and expressed adenovirus. An improved method for growing has been disclosed. In one embodiment, 100-20 1 liter siliconized spinner flask containing 0 ml medium (T (Ekne, Cambridge, UK) Propagate the natural cell population. After stirring at 40 rpm, the cell viability was Estimate in blue. As another form, Fibra-Cel microcarriers (B ibby Sterlin, Stone, UK) (5 g / l) as follows I have. The cell inoculum resuspended in 5 ml of medium was mixed with 250 ml of Erlenmeyer. -Add to the carrier (50 ml) in the flask, stirring occasionally for 1 to 4 o'clock Let sit for a while. The medium is then replaced with 50 ml of fresh medium and shaking is started. For virus production, the cells are grown to approximately 80% fusion and then the medium is (To 25% of final volume) and add adenovirus at an MOI of 0.05 . The culture is left overnight, after which the volume is increased to 100% and shaken for another 72 hours To start. Adenovirus vector is replication defective or at least conditionally defective In addition to the requirement that the adenovirus vector be Is not considered important for implementation. Adenovirus has 42 different known Serotype or subgroups AF. Use in the present invention Replication defective adenosis for Subgroup C adenovirus type 5 is preferred starting material for obtaining the ils vector It is. This is because adenovirus type 5 has a large amount of biochemical and genetic information. Human adenovirus, and using adenovirus as a vector Because it has been used historically in most constructions. As noted above, typical vectors of the invention are replication defective and adenovirus It has no E1 region. Therefore, the position of interest in which the E1-coding sequence has been removed is It is most convenient to introduce a polynucleotide encoding the gene. Only However, the position of insertion of the construct within the adenovirus sequence is important for the present invention. There is no. Also, as described by Karlsson et al. (1986), the E3 Instead of a deleted E3 region in a replacement vector or a helper cell line or helper -If the virus compensates for the E4 deletion, the virus encoding the gene of interest in the E4 region A polynucleotide may be inserted. Adenoviruses are easy to grow and manipulate, and are widespread in vitro and in vivo Shows host range. This group of viruses has a high titer, eg, 10⁹-10¹¹Puller And are very infectious. Adenowi Lus's life cycle does not require integration into the host cell genome. Adenovirus vector The foreign gene delivered by the receptor is episomal and therefore Low genotoxicity. Research on vaccination with wild-type adenovirus And no side effects have been reported (Couch et al., 1963; Top et al. 1971), their safety and therapeutic potential as in vivo gene transfer vectors Is shown. Adenovirus vectors are used for eukaryotic gene expression (Leverro et al., 1991). Gomez-Foix et al., 1992) and vaccine development (Grunhaus and And Horwitz, 1992; Graham and Prevcc, 1992). Used. Recently, animal studies have shown that recombinant adenovirus (Stratford-Perricaude) t and Perricaudet, 1991; Stratford-Perric audet et al., 1990; Rich et al., 1993). Recombinant ad for different organizations Studies on the administration of virus have been reported in tracheal instillations (Rosenfeld et al. 91; Rosenfeld et al., 1992), intramuscular injection (Ragot et al., 1993). ), Peripheral intravenous injection (Herz and Gerard, 1993) and stereotactic fixation to the brain. Includes constant inoculation (Le Gal La Salle et al., 1993). Retroviruses duplicate their RNA in infected cells by a process of reverse transcription. A group of single-stranded RNA viruses characterized by their ability to convert to strand DNA (Co fin, 1990). Next, the obtained DNA is used as a provirus to stain cells. Integrates in the body, directing the synthesis of viral proteins. Integration is in the recipient cell and its This results in retention of the viral gene sequence in the offspring. The retroviral genome is Encodes capsid protein, polymerase enzyme and envelope components, respectively Contains three genes, gag, pol and env. Up from gag gene Sequences found in the stream are signals for packaging the genome into virions It contains. Two long terminal repeat (LTR) sequences are 5 'and 3 of the viral genome. 'Terminal. These are strong promoters and enhancers Sequence and is also required for integration in the host cell genome (Coff in, 1990). To construct a retroviral vector, a nucleic acid encoding the gene of interest A virus that does not replicate when inserted into the viral genome at a certain viral sequence Generate To generate virions, include gag, pol and env genes A packaging cell line that has but does not contain LTR and packaging components (Mann et al., 1983). Recombinant plasmid containing cDNA Together with the rovirus LTR and packaging sequence (eg, calcium phosphate When introduced into this cell line (by precipitation), the packaging sequence becomes recombinant plus The RNA transcript of the mid can be packaged into viral particles and then Are secreted into the culture medium (Nicolas and Rubenstein). 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). Next, recombination The medium containing the retrovirus is collected, optionally concentrated, and used for gene transfer. Used. Retroviral vectors can infect a wide variety of cell types. However, integration and stable expression require the division of host cells (Pask ind et al., 1975). Retrovirus by chemical addition of lactose residues to the viral envelope Specific targeting of retroviral vectors based on chemical modification of New methods have been recently developed that are designed to make it possible. This modification is a sialo sugar Should be able to allow specific infection of hepatocytes via protein receptors is there. Different methods have been devised for targeting of recombinant retroviruses, In that case, the retroviral envelope protein and the specific Biotinylated antibodies to cell receptors were used. Use streptavidin Antibodies were thereby linked via the biotin component (Roux et al., 1989). Using antibodies against the major tissue-matched gene complex class I and class II antigens, A variety of human cell allotrophic viruses that carry their surface antigens in vitro (Roux et al., 1989). There are certain restrictions on the use of retroviral vectors in all aspects of the invention. You. For example, retroviral vectors usually integrate at any location in the cell genome. No. This can be due to host gene shutoff or interfere with the function of adjacent genes Insertion of potential viral regulatory sequences may result in insertional mutagenesis (Varmus et al., 1981). Separate with the use of defective retroviral vectors Concerns about the potential of wild-type replication-competent viruses in packaging cells. Appearance. This means that the intact sequence from the recombinant virus is A set that inserts upstream from gag, pol and env integrated in the genome Could result from a change event. However, the possibility of recombination is greatly reduced New packaging cell lines are now available that should be reduced (Markow itz et al., 1988; Hersdorfer et al., 1990). Other viral vectors can be used as the expression construct in the present invention . Vaccinia virus (Ridgeway, 1988; Baichwal and S) ugden, 1986; Coupar et al., 1988), adeno-associated virus (A AV) (Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1 986; Hermonat and Muz ycska, 1984) and vectors derived from viruses such as herpes virus. Can be used. They provide several attractive features to various mammalian cells Giving (Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Bai) Chwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horw. ich et al., 1990). Recent recognition of defective hepatitis B virus suggests that the structure-function of different viral sequences New insights into relationships. From in vitro studies, the virus found that 8 Ability of helper-dependent packaging and reverse transcription despite deletion of up to 0% Can be retained (Horwich et al., 1990). This is the genomic It suggested that most could be replaced with foreign genetic material. Liver affinity and persistence (group Was a particularly attractive property for liver-specific gene transfer. Chang Have recently described polymerase, surface and pre-surface code. Chloramphenicol acetate in the duck hepatitis B virus genome at the location of the The chill transferase (CAT) gene was introduced. In chicken liver cancer cell line It was co-transfected with the wild-type virus. High titer recombinant wi Primary infection of duck hepatocytes using culture medium containing Ruth Was. Stable CAT gene expression detected for at least 24 days after transfection (Chang et al., 1991). Expression constructs to effect expression of a sense or antisense gene construct Must be delivered into cells. Experimental methods for transforming cell lines In vitro, as in, or in vivo, as in the treatment of certain disease states. Alternatively, this delivery can be accomplished ex vivo. One mechanism of delivery is In that case, the virus The current construct is encapsulated in infectious virus particles. Also, some viruses for introduction of the expression construct into cultured mammalian cells. Other methods are also contemplated by the present invention. These are calcium phosphate precipitates (Gr aham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1 987; Rippe et al., 1990), DEAE-dextran (Gopal, 1). 985), electroporation (Tur-Kaspa et al., 1986; Pot). Ter et al., 1984), direct microinjection (Harland and Weintraub). , 1985), DNA-loaded liposomes (Nicolau and Sene, 1982). Fraley et al., 1979) and lipofectamine-DNA complexes, supercellular Sonication (Fechheimer et al., 1987), genetics using high-speed microprojectiles Child bombardment (Yang et al., 1990) and receptor-mediated transfection ( Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988). These technologies Some can be well adapted for in vivo or ex vivo applications . Once the expression construct is delivered into the cell, a nucleic acid encoding the gene of interest Can be located at different locations and expressed. In one embodiment, the gene is The nucleic acid to be loaded can be stably integrated into the genome of the cell. This integration is May be in the same position and orientation by homologous recombination (gene replacement), or It may be integrated at any unspecified location (gene amplification). Still further In a similar manner, nucleic acids are safe in cells as DNA in separate episomal segments. It may be kept constant. Such nucleic acid segments or "episomes" Coding sufficient sequences to maintain and replicate independently or synchronously with the main cell cycle ー Do. How the expression construct is delivered to the cell and where in the cell The decision will depend on the type of expression construct used. In yet another aspect of the present invention, the expression construct is simply live recombinant DNA or It may consist of a plasmid. Above that makes the cell membrane physically or chemically permeable The introduction of the construct can be carried out by any of the methods described above. This is Inbit It is particularly applicable to introduction in vivo, but can be used for in vivo use as well. Wear. (1984) describe liver and spleen of adult and neonatal mice. The polyomavirus DNA in the form of calcium phosphate precipitate , Active virus replication and acute infection. Also, Benvenisty and Nesif (1986) also used calcium phosphate-precipitated plasmids directly in the peritoneal cavity. Was shown to result in expression of the transfected gene. Objective DNA encoding the gene is similarly introduced in vivo to express the gene product Foreseeable to be able to. In yet another aspect of the invention, a method for introducing a live DNA expression construct into a cell is provided. Particle impact can be included. This method uses microprojectiles coated with DNA. The ability to accelerate through high speed and penetrate them into the cell without killing the cell (Klein et al., 1987). Some devices for accelerating small particles Or has been developed. One such device generates current by high voltage discharge, which This in turn provides the propulsion (Yang et al., 1990). The microprojectiles used are It consisted of a biologically inert substance such as Ngustene or gold beads. Selected organs, including rat and mouse liver, skin and muscle tissue Shocked in vivo (Yang et al., 1990; Zeleni) n et al., 1991). This excludes any intervening tissue between the gun and the target organ, i.e. May require surgical exposure of tissue or cells for ex vivo treatment is there. Again, DNA encoding a particular gene can be delivered by this method. And are also included by the present invention. In a further aspect of the invention, the expression construct can be entrapped in liposomes. Wear. Liposomes are vesicular structures characterized by a phospholipid bilayer membrane and an internal aqueous medium. is there. Multilamellar liposomes have multiple lipid layers separated by an aqueous medium. Excessive They form spontaneously when the phospholipids are suspended in excess aqueous solution. Shape of closed structure Prior to formation, lipid components undergo self-rearrangement, closing off water and dissolved solutes between lipid bilayers. (Ghosh and Bachhawat, 1991). Also intended One is a lipofectamine-DNA complex. In vitro liposome delivery of nucleic acids and expression of foreign DNA is very successful are doing. Wong et al. (1980) describe cultured chick embryos, HeLa and liver cancer cells. The feasibility of liposome delivery and expression of foreign DNA in vesicles was demonstrated. Nicolau et al. (1987) describe successful liposomes in rats after intravenous injection. Gene transfer was achieved. In one embodiment of the present invention, the liposome is complexed with Sendai virus (HVJ). Can be formed. This facilitates fusion with cell membranes and encapsulation in liposomes. Have been shown to promote the invasion of the converted DNA into cells (Kaneda et al., 1). 989). In another embodiment, the liposome is a nuclear non-histone chromosomal protein (HM G-1) can be complexed or used with them (Kat o et al., 1991). In a still further aspect, the liposomes are HVJ and HMG- Complex with both 1 Can be formed or used with them. Such an expression construct It has been successfully used for the transfer and expression of nucleic acids in vitro and in vivo. These can be applied to the present invention. Bacterial promoter used in DNA constructs If possible, it is also desirable to include the appropriate bacterial polymerase in the liposome. No. Can be used to deliver nucleic acids encoding specific genes into cells Other expression constructs are delivery vehicles via the receptor. These are almost all true Selective uptake of macromolecules by receptor-mediated endocytosis in nuclear cells Take advantage of Delivery is highly specific due to cell type specific distribution of various receptors (Wu and Wu, 1993). Receptor-mediated gene targeting vehicles typically involve two components: cellular receptor Consists of a body-specific ligand and a DNA binding agent. Some ligands are mediated by receptors Used for gene transfer. The most well characterized ligand is Asialo Orosomucoid (ASOR) (Wu and Wu, 1987) and transferrin (Wagner et al., 1990). Recently, recognizes the same receptor as ASOR Synthetic new glycoproteins have been used as gene delivery vehicles (Ferkol et al. Perales et al., 1994), and also epidermal growth factor (EGF). It has been used to deliver genes to squamous cell carcinoma cells (Myers, EPO 0230855). In another aspect, the delivery vehicle may comprise a ligand and a liposome. For example, Nicolau et al. (1987) describe galactose incorporated in liposomes. Lactosyl-cerami of terminal argial ganglioside In addition, increased uptake of the insulin gene by hepatocytes was observed. Therefore Multiple receptor-ligand systems, with or without liposomes, allow lung, epithelial Or specifically deliver nucleic acids encoding specific genes to cell types such as tumor cells What can be done is feasible. For example, the epidermal growth factor (EGF) receptor Delivery of nucleic acids encoding genes in a large number of tumor cells exhibiting regulation EGF can be used as a receptor to mediate the infection. Man on hepatocyte Mannose can be used to target the North receptor. Also CD 5 (CLL), CD22 (lymphoma), CD25 (T cell leukemia) and MAA ( Antibodies against melanoma) can also be used as targeting components . In one embodiment, gene transfer can be performed more easily under ex vivo conditions. it can. Ex vivo gene therapy involves isolating cells from animals and Delivering the nucleic acid into the cells, and then returning the modified cells back into the animal. This This may include surgical removal of tissues / organs from animals or primary culture of cells and tissues. Can be. Primary mammalian cell cultures can be prepared in various ways. Cells are inviting In order for cells to survive contact with the expression construct in Maintains contact with carbon dioxide and nutrients but ensures that they are protected from microbial contamination It is necessary to Cell culture techniques are well documented and, by reference, Disclosed herein (Freshner, 1992). One embodiment of the foregoing is for immortalizing cells for protein production. Including the use of gene transfer. In a suitable host cell as described above Cells can be introduced under appropriate conditions Incubate. Virtually any polypeptide gene can be used in this way. Wear. The construction of the recombinant expression vector and the components contained therein are described above. . Alternatively, the protein produced is an endogenous protein normally synthesized by the cell. It may be a protein. Examples of useful mammalian host cell lines include Vero and HeLa cells and Chinese. Hamster ovary cell line, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2 , NIH3T3, RIN and MDCK cells. In addition, the source of the inserted sequence Modulates expression or modifies and processes gene products as desired A host cell line can be chosen. Such modifications of the protein product (eg, , Glycosylation) and processing (eg, cleavage) Could be important to Different host cells use post-translational processing of proteins And has a unique specific mechanism of modification. Appropriate modification of expressed foreign protein And selecting the appropriate cell or host system to ensure processing it can. Respectively,tk ^-,hgprt ^-Orappt ^-In cells, HSV thymiji Kinase, hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase and Adenine phosphoribosyltransferase gene and other genes Numerous selection systems can be used. Also gives resistancedhfr; Mi Provides resistance to cophenolic acidgptFor the aminoglycoside G418 Confer resistanceneoAnd confer resistance to hygromycinhygro Antimetabolites resistance can also be used as a basis for selection. In two forms: anchorage-independent cells, which grow in suspension over most of the culture; Anchorage-dependent cells that require attachment to a solid support for growth or That is, animal cells can be grown in vitro as monolayer cell growth). You. Anchorage-independent or suspension cultures from continuously established cell lines can It is the most widely used means of large-scale production. However, cell suspension cultures Limitations such as tumorigenic potential and lower protein production than attached T cells Have. Large-scale suspension culture of mammalian cells in a stirred tank produces recombinant protein Is a general law. Two suspension culture reactor designs, a stirred reactor and air wicking (a Irlift reactors are widely used. Stirring design is interferon raw It has been successfully used at 8000 liter capacity for production. 1: 1 to 3: 1 The cells in a stainless steel tank having a height to diameter of 1.5 mm. Usually with feathers Culture with one or more agitators based on a disc or marine propeller type Mix. A stirrer system that provides less shear than a blade is described. Magnetically Moving the stirrer either directly or indirectly by means of a coupled drive Can be. Indirect operation reduces the risk of microbial contamination through seals on the agitator shaft. Similarly, an air wick initially described for microbial fermentation and later applied to mammalian cells The lift reactor relies on a gas flow for both culture mixing and oxygen injection. Moth The stream enters the riser section of the reactor and guides the circulation. The gas separates at the culture surface, creating bubbles The thicker liquid free is moved down in the downcomer section of the reactor. This setting The main advantages of the meter are simplicity and mechanical agitation There is no need for. Typically, the height to diameter ratio is 10: 1. air The suction reactor scales up relatively easily and has sufficient gas mass transfer And produce relatively low shear forces. The antibodies of the present invention are particularly useful for the isolation of antigen by immunoprecipitation. Immunoprecipitation Involves the separation of target antigen components from complex mixtures to identify trace proteins or Used to isolate. Cells are transformed into detergent micelles for isolation of membrane proteins Must be solubilized. Other drugs such as bile salts may be at acidic pH or divalent Nonionic salts are preferred because they precipitate in the presence of cations of Antibodies and their The use of is described further below. IV. Preparation of antibodies reactive with AOP2 In another aspect, the invention relates to an AOP2 molecule of the invention or any portion thereof. Antibodies that are epidemiologically reactive are contemplated. Antibodies can be polyclonal or monoclonal It may be a body. In a preferred embodiment, the antibodies are monoclonal antibodies. Anti Methods for making and characterizing bodies are well known in the art (eg, See Howell and Lane, 1988). Briefly, an animal is immunized with an immunogen comprising a polypeptide of the invention, and Of polyclonal antibodies by collecting antisera from immunized animals . A wide variety of animal species can be used for the production of antisera. Typically anti- Animals used for the production of antisera are rabbits, mice, rats, hamsters, Non-human animals such as pigs or horses. Rabbit relatively large blood Due to capacity, rabbits are a preferred choice for the production of polyclonal antibodies . As is generally known to those of skill in the art, the isolation of antigen To generate both polyclonal and monoclonal antibodies Can be. Using a composition containing an antigenic epitope of a compound of the invention One or more laboratory animals, such as a giant or a mouse, can be immunized; In turn, they begin to produce specific antibodies against the compounds of the present invention. Time for antibody production After a delay, simply draw blood from the animal and prepare a serum sample from whole blood Thereby, a polyclonal antiserum can be obtained. The monoclonal antibodies of the invention can be used in ELISA and Western blot methods. Standard immunochemical methods and immunohistochemical methods such as tissue staining and AOP2 Useful in other methods where antibodies specific to the streak epitope can be used It is suggested that there are various uses. In addition, different species specific to specific AOP2 It is proposed that monoclonal antibodies can be used for other useful applications. Typically, both polyclonal and monoclonal antibodies to AOP2 are identified. It can be used in various aspects. For example, cDNA encoding other AOP2 Or use them in antibody cloning protocols to obtain genes. Can be. Analysis of AOP2-related peptide action in cells or animals They may be used in inhibition studies to do so. In addition, anti-AOP2 antibody To analyze the distribution of AOP2 during various cellular events, for example, at different cell cycles Immunize to determine cell or tissue specific distribution of AOP2 polypeptide at time points It is also useful in position measurement research. A particularly useful use of such antibodies is, for example, For example, using an antibody affinity column, natural or recombinant AOP2 In the purification of The operation of all such immunological techniques is disclosed herein. Will be understood by those skilled in the art in light of the above. Methods for preparing and characterizing antibodies are well known in the art ( See, for example, Harlow and Lane, 1988; Incorporated in the booklet). More specific examples of monoclonal antibody preparation are described in the Examples below. Shown in As is well known in the art, a given composition may be immunogenic. Gender may change. Therefore, a peptide or polypeptide immunogen is used as a carrier. Enhancement of the host immune system, as can be obtained by ligation, is often Is necessary. Typical preferred carriers are keyhole limpet hemocyanin (KLH) and And bovine serum albumin (BSA). Ovalbumin and mouse serum Other albumins such as albumin or rabbit serum albumin may also be used as carriers. Can be Methods for binding polypeptides to carrier proteins are described in Glutaraldehyde, m-maleimidobencoyl, well known in the art -N-hydroxysuccinimide ester, carbodiimide and bis-biazotization Contains benzidine. Also known as an adjuvant, as is well known in the art. The use of non-specific stimulators of the immune response to increase the immunogenicity of a particular immunogenic composition. Can be enhanced. A typical preferred adjuvant is complete Freund's adjuvant (The dead bacteria Mycobacterium tuberculosis (Mycobacteri) um tuberculosis), a non-specific stimulator of the immune response), Includes complete Freund's adjuvant and aluminum hydroxide adjuvant. The amount of immunogen composition used in the production of polyclonal antibodies depends on the immunogenicity It depends on the quality and the animal used for immunization. Various to administer immunogen Different routes can be used (subcutaneous, intramuscular, intradermal, intravenous and intraperitoneal). Immunity Polyclonal by sampling the blood of the immunized animal at various later times Antibody production can be checked. You may also give a second booster injection No. Repeat booster and titration until appropriate titer is obtained. At the right level Once immunogenicity is obtained, blood is drawn from the immunized animal, serum is isolated and stored And / or animals can be used to make mAbs. In US Pat. No. 4,196,265, which is incorporated herein by reference, MAbs are easily prepared using well-known techniques, such as those exemplified. Can be manufactured. Typically, this technique involves selecting the immunogenic composition, e.g., Purified or partially purified AOP2 protein, polypeptide or Immunize appropriate animals with peptides or cells expressing high levels of AOP2. And Administer a composition that immunizes effectively to stimulate antibody-producing cells You. Rodents such as mice and rats are preferred, however, rabbits, Use of azalea and frog cells is also possible. The use of rats can provide certain benefits. (Goding, 1986), but mice are preferred, and BALB / c Mice are most commonly used and generally have a higher percentage of stable fusion. This is most preferred as it gives a compound. Following immunization, the ability to produce antibodies for use in mAb production protocols Somatic cells, particularly B lymphocytes (B cells). Spleen, flattened biopsy From a peach or lymph node or from a peripheral blood sample These cells can be obtained. Spleen cells and peripheral blood cells are preferred, the former Is the plasmablast stage at which they divide Is the abundant source of antibody-producing cells, and is the latter easily accessible to peripheral blood? It is. Often, the spleen of the animal that immunized the panel of animals and had the highest antibody titer The spleen is removed and the spleen lymphocytes are obtained by homogenizing the spleen with a syringe. Typical Typically, the spleen from an immunized animal is about 5 × 10⁷Or 2x10⁸Contains lymphocytes . Next, cells and immune cells of immortal myeloma cells, typically of the same species as the immunized animal, are The antibody-producing B lymphocytes from the product are fused. Fusion methods for producing hybridomas Myeloid cell lines suitable for use in Certain selections that provide synthesizing efficiency and growth of only the desired fused cells It has an enzyme deletion that renders it unable to grow next on selective media. As is known to those skilled in the art, any of a number of myeloid cells may be used (G oding, 1986; Cambell, 1984). For example, if the immunized animal P3-X63 / Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1 / 1. Ag 41, Sp210-Ag14, FO, NSO / U, MPC-11, Use MPC-11-X45-GTG 1.7 and S194 / 5XX0 Bul Rats; R210. RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR 983F and 4B210 can be used; and U-266, GM1500 -GRG2, LICR-LON-HMy2 and UC729-6 are all involved in cell fusion Useful in connection. How to make a hybrid between antibody-producing spleen or lymph node cells and myeloid cells The method usually involves an agent or agents that promote cell membrane fusion (chemical or electrical). In the presence of the target, the ratios can vary from about 20: 1 to about 1: 1 respectively. But mixing the somatic cells with myeloid cells in a 2: 1 ratio. Sender A fusion method using the virus (Kohler and Milstcin, 1975; (1976) and 37% (v / v) PEG by Getter et al. (1977). Those using polyethylene glycol (PEG) are described. Also, The use of electrically induced fusion methods is also appropriate (Goding, 1986). The fusion method is typically about 1 × 10^-6Or 1 x 10^-8Can survive less frequently Produce hybrids. However, fusions that can survive by culturing in selective media The resulting hybrids are derived from parental unfused cells, especially unfused bone marrow, which usually divides indefinitely. This is not a problem, as it is distinguished from seed cells. Selection media is usually tissue culture The nutrient medium contains an agent that prevents the neosynthesis of nucleotides. Typical Particularly preferred agents are aminopterin, methotrexate and azaserine. A Minopterin and methotrexate regulate the nascent synthesis of both purines and pyrimidines Azaserine, on the other hand, only blocks purine synthesis. Aminopterin or met When using trexate, hypoxanthine and thionate may be used as nucleotide sources. The medium is supplemented with the medium (HAT medium). When using azaserine, hypoxane The tin is supplemented to the medium. A preferred selection medium is HAT. Moving the nucleotide reuse pathway Only viable cells can survive in HAT medium. Myeloid cells play an important role in the recycling pathway Essential enzymes such as hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPR T) lacks and they can survive Can not. B cells can drive this pathway, but they are limited in culture. Have a limited life span and typically die within about two weeks. Therefore, survive on selective media The only cells that can be produced are hybrids formed from myeloid and B cells. This culture gives a population of hybridomas from which to select specific hybridomas. Select. Typically, single clone dilutions in microtiter plates are used. The cells are then cultured and the individual clonal supernatants are subsequently desired (after about 2-3 weeks). Hybridoma selection is performed by testing for different reactivity. radiation Immunoassay, enzyme immunoassay, cytotoxicity assay, plaque assay, Assays should be sensitive, simple and rapid, such as in immuno-binding assays. You. Next, the selected hybridomas are serially diluted and cloned into individual antibody-producing cell lines. Clones and then grow those clones indefinitely to give the mAb. Wear. Utilizing these cell lines for mAb production in two basic ways . Tissue adaptation of the type used to provide somatic and myeloid cells for initial fusion The synovial animal can be infused (often into the peritoneal cavity) with a sample of the hybridoma. Injection Animals secrete specific monoclonal antibodies produced by fused cell hybrids Tumors. The animal's body fluid, such as serum or ascites fluid, is then can result in a mAb. Individual cell lines can also be cultured in vitro. In that case, the mAb is naturally secreted into the culture medium and then Concentration can be obtained. If necessary, filter, centrifuge and HPLC or Using various chromatographic methods, such as affinity chromatography The mAb produced by either method It can be further purified. V. Diagnosis of disease states involving AOP2 The present invention relates to the modification of AOP2 and related genes is associated with atherosclerosis I decided that. Therefore, the diagnosis or diagnosis of atherosclerosis and related disease states Can use AOP2 and corresponding genes as prognostic indicators. More specific Specifically, point mutations, deletions, insertions or perturbations in regulation of AOP2 (pertu b) cause atherosclerosis or related diseases or May promote. A. Genetic diagnosis One embodiment of the present invention does not include a method for detecting a change in AOP2 expression. You. This measures the level of AOP2 expressed in the cell or Measuring a particular change in the product. Obviously this species Assays are important in the diagnosis of atherosclerosis and related diseases You. Related disease states include coronary heart disease, ischemic heart disease and stroke. The biological sample can be any tissue or body fluid. Various aspects are mind Organ cells, blood circulatory system (arteries of all blood vessels, lining of venous endothelial cells), skin, muscle , Face, brain, prostate, breast, endometrium, lung, head and neck, pancreas, small intestine, blood cells, liver , Testis, ovary, colon, skin, stomach, esophagus, spleen, lymph node, bone marrow, kidney or immunity Cells (eg, monocytes, macrophages). Other embodiments are peripheral blood, lymph, Body fluid sumps such as ascites, serum, pleural effusion, sputum, cerebrospinal fluid, tears, stool or urine Including Biological sampling is performed according to standard methodology (Sambrook et al., 1989). The nucleic acid used is isolated from the cells contained in the kit. Nucleic acids It may be nome DNA or fractionated or total cellular RNA. A place to use RNA If so, it may be appropriate to convert the RNA to complementary DNA. Some aspects As RNA is total cellular RNA; in another embodiment it is poly-A RNA is there. Usually, nucleic acids are amplified. Depending on the form, another known nucleic acid is used either directly with amplification or after amplification. To identify the specific nucleic acid of interest in the sample. Next, the identified product is detected. You. In some applications, inspection is by visual means (eg, ethidium bromide staining of gels). Exit can be carried out. Alternatively, detection is chemiluminescence, radiolabel emission By active scintigraphy or fluorescent labeling or even electrical or thermal shock Attacking signal (Affymax Technology; Bellus, 1994) ) Can be included for indirect identification of the product by the system. After detection, the results seen in a given patient were compared to normal patients and AOP2 related It can be compared to a statistically significant control group of patients with the condition. in this way The amount or type of AOP2 detected in various clinical conditions or It is possible to correlate with a predisposition. Various types of deletions should be identified. Thus, "changes" are deletions, insertions, It should be understood to include mutations and duplications. Point mutation is a stop codon, This results in a frameshift mutation or amino acid substitution. Somatic mutation is reproductive It occurs in tissues other than the vesicle. Germ cell tissue may be present in any tissue. And can be inherited. Mutations in and outside the coding region are also Modifies or renders transcription unstable or otherwise transcripts (mRN A) or by altering either the processing of the protein Is produced AOP2 may be affected. Fluorescence in situ hybridization (FISH), direct DNA seek Ensing, PFGE analysis, Southern or Northern blotting, single-stranded structure Analysis (SSCA), RNase protection assay, allele specific Gonucleotide (ASO), dot blot analysis, denaturing gradient gel electrophoresis, RF A variety of different approaches, including but not limited to LP and PCR-SSCP. Essays are intended in this context. (I) Primers and probes The term primer, as defined herein, depends on the template Include any nucleic acid that can prime the synthesis of nascent nucleic acid in the process. Means Typically, primers are oligonucleotides from 10 to 20 base pairs in length. Although nucleotides, longer sequences can be used. Single-stranded form preferred Alternatively, primers can be provided in double-stranded or single-stranded form. probe Can work like primers, but define them differently. Plow Can probably prime, but not bind to target DNA or RNA. And need not be used in the amplification step. In a preferred embodiment, the probe or primer is a radioactive species (³²P,¹⁴C,³⁵ S,^ThreeH or other labels), fluorophores (rhodamine, fluorescein) or Label with chemiluminescence (luciferase). (Ii) Template-dependent amplification method Multiple templates are used to amplify the marker sequences present in a given template sample. Type-dependent methods are available. Of the most well-known amplification methods One is U.S. Pat. Nos. 4,683,195, 4,683,202 and 4,8. No. 00,159 and in Innis et al., 1990 (PCR^TM Polymerase Chain Reaction (called "trademarks"), each of which is fully quoted. And is incorporated herein. Briefly, in PCR, complementary to the region on the opposite complementary strand of the marker sequence Prepare two primer sequences. Excess deoxynucleoside triphosphate A DNA polymerase, such as Taq polymerase, is added to the reaction mixture. If the marker sequence is present in the sample, the primer binds to the marker and Remerase is a primer that adds primers along the marker sequence by adding nucleotides. To elongate. By increasing or decreasing the temperature of the reaction mixture, The excess primer dissociates from the marker to produce a reaction product, and excess primer The process is repeated, binding to the car and the reaction product. Perform a reverse transcriptase PCR amplification method to quantify the amount of mRNA to be amplified Can be Methods for reverse transcribing RNA to cDNA are well known and are described in Sa. mbrook et al., 1989. Another method for reverse transcription is heat Utilizes a qualitative RNA-dependent DNA polymerase. These methods were introduced in 1990 It is described in WO 90/07641 filed on December 21. Polymer Lase chain reaction methodology is well known in the art. Another amplification method is described in EPO No. 3 which is incorporated herein by reference in its entirety. Ligase chain reaction (“LCR”) disclosed in US Pat. In LCR Prepares two complementary probe pairs, in the presence of the target sequence, each pair Binds to complementary strands of target so that they are in contact I do. In the presence of ligase, the two probe pairs ligate to form a single unit. With temperature cycling, as in PCR, the linked and linked units are Dissociates from the target and then becomes the “target sequence” for ligation of the excess probe pair. Work. U.S. Pat. No. 4,883,750 discloses binding a probe pair to a target sequence. A method similar to that of LCR is described. Qβ replica as described in PCT application PCT / US87 / 00880 Ze can also be used as yet another amplification method in the present invention. using this method Converts RNA replicable sequences with regions complementary to those of the target to RNA Add to the sample in the presence of the enzyme. Polymerase copies replicable sequences And it can then be detected. In addition, one strand of the restriction site contains the nucleotide 5 '-[α-thio] -3-phosphate. Restriction endonucleases and ligases to perform amplification of target molecules having The isothermal amplification method used may also be useful for nucleic acid amplification in the present invention, Walker et al. (1992). Strand displacement amplification (SDA) involves multiple strand displacements and synthesis, ie, nick trans 5 is another method for performing isothermal amplification of nucleic acids with translation. Repair chain reaction (RC A similar method, called R), involves several steps over the region targeted for amplification. Annealing the probe and only two of the following four bases are present Repair reaction. Biotinylated derivatives for easy detection of the remaining two bases Can be added. A similar method is used in SDA. Also The target-specific sequence can also be detected using the circular probe reaction (CPR) . In CPR, 3 'and 5' sequences of non-specific DNA and intermediate sequences of specific RNA Is hybridized to the DNA present in the sample. Yes Upon hybridization, the reaction is treated with RNase H and the product of the probe is Identified as a unique product released after digestion. Another cycling the original mold Anneal the probe and repeat the reaction. GB Application 2202, each of which is incorporated herein by reference in its entirety. 328 and PCT Application No. PCT / US89 / 01025. Alternatively, another amplification reaction can be used according to the present invention. In the former application, "qualified Primers are used for PCR-like templates and enzyme-dependent synthesis. Capture component (example For example, by labeling with biotin) and / or a detection component (eg, an enzyme) Primers can be modified. In the latter application, an excess of labeled probe Add the sample to the sample. In the presence of the target sequence, the probe binds and opens catalytically. Torn. After cleavage, the target sequence is released intact and bound by excess probe Is done. Cleavage of the labeled probe signals the presence of the target sequence. Other nucleic acid amplification methods include nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) and 3SR (Kwo Gingeras et al., PCT Application WO 88/10315, all. Transcription-based amplifications, which are incorporated herein by reference). System (TAS). For NASBA, standard phenol / chloroform extraction, Thermal denaturation of clinical samples, treatment with lysis buffer and isolation of DNA and RNA Nucleic acids by guanidinium chloride extraction of RNA or mini spin columns for RNA Can be prepared for amplification. These amplification techniques have target-specific sequences Primer Includes annealing. After polymerization, the DNA / RNA hybrid is converted to RNase. Digestion with H, while heat denaturing the double-stranded DNA molecule again. In either case, Complete single-stranded DNA by addition of two target-specific primers and subsequent polymerization Into a double strand. Next, the double-stranded DNA molecule is ligated to an RNA vector such as T7 or SP6. It is transcribed many times by remerase. In the isothermal cycle reaction, remove the RNA Reverse transcribe to single stranded DNA, then convert it to double stranded DNA, then T7 or Re-transcribe with an RNA polymerase such as SP6. The resulting product is deleted Alternatively, it indicates a target-specific sequence, whether complete. Davey et al., EPO 329 822 (herein incorporated by reference in its entirety). ) Are single-stranded RNA (“ssRNA”), ssDNΛ and double-stranded A nucleic acid amplification method comprising periodically synthesizing DNA (dsDNA) is disclosed. It can be used according to the invention. ssRNA is the first primer oligonucleotide Reotide template, which is reverse transcriptase (RNA-dependent DNA polymerase) To be extended. Next, ribonuclease H (RNase H, DNA or RNase specific to any of the RNAs and the double-stranded RNA) DNA: Remove RNA from RNA duplex. The obtained ssDNA is used in the second step. Is the template of a primer, which is 5 'of its homology to the template (T7 RNA poly It also includes the sequence of the RNA polymerase promoter (exemplified by merase). Next In addition, the large "Klenow" fragment of Escherichia coli DNA polymerase I This primer is extended by a DNA polymerase (exemplified by It has the same sequence as that of the original RNA between the primers, and further Two with motor arrangement Resulting in a strand DNA ("dsDNA") molecule. This promoter sequence has the appropriate R Making multiple RNA copies of DNA used by NA polymerase Can be. Then these copies can re-enter the cycle, very fast Produces amplification. With the proper choice of enzyme, this increase without the addition of enzyme in each cycle. The width can be carried out isothermally. Due to the periodicity of this method, DNA or R The starting sequence can be selected to be in any form of NA. Miller et al., PCT Application WO 89/06700 (by reference). (Incorporated herein) is a process for target single-stranded DNA ("ssDNA") Hybridization of motor / primer sequences followed by a large number of sequences Discloses a nucleic acid sequence amplification scheme based on the transcription of an RNA copy. This Is not periodic, i.e. a new template is generated from the resulting RNA transcript. Not done. Other amplification methods are "RACE" and "one-sided PCR" (Frohman , M .; A. ,PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHO DS AND APPLICATIONS Medium, Academic Press, N. Y. , 1990; Ohara et al., 1989; (Incorporated in the specification). In the presence of the resulting nucleic acid having the sequence "di-oligonucleotide", two (or two) Or more), thereby linking the di-oligonucleotides Methods based on amplifying the tide can also be used in the amplification step of the present invention. W u et al. (1989), which is incorporated herein by reference in its entirety. (Iii) Southern / Northern blotting Blotting techniques are well known to those skilled in the art. Southern blotting Involves the use of DNA as a target, while Northern blotting Including the use of A. cDNA blotting is a method of blocking RNA species in many respects. , But each gives a different type of information. Briefly, a suitable matrix, often a nitrocellulose filter Probes are used to target DNA or RNA species immobilized on It is. Different types should be spatially separated to facilitate analysis. This This is often due to gel electrophoresis of nucleic acid species and subsequent “blotting” on filters. Wings. " Subsequently, blotting is performed under conditions that promote denaturation and rehybridization. The labeled target is incubated with the (usually labeled) probe. Probe is standard The probe is designed to base-pair with the target so that the probe To the part. Next, detection is performed as described above, except for unbound probes. Do it. (Iv) Separation method Usually, at some stage, the casting is performed for the purpose of determining whether specific amplification has occurred. It is desirable to separate the amplification product from the type and excess primer. One aspect and Agarose, agarose-acrylamide or polyacylose using standard methods. Separate the amplification products by rilamide gel electrophoresis. Sambrook et al., 19 See 89. Alternatively, the use of chromatography techniques to perform the separation it can. Many types of chromatography that can be used in the present invention: Adsorption, partitioning, ion exchange and molecular sieving, To use it, including paper, paper, thin layers and gas chromatography There are a number of specialized technologies (Freifelder, 1982). (V) Detection method The product can be visualized to confirm the amplification of the marker sequence. A scripture Typical visualization methods include staining of the gel with ethidium bromide and visualization under UV light. No. Alternatively, the amplified product is radioactively or fluorometrically labeled After separation, the amplification product is then exposed to x-ray film if fully labeled with Or can be visualized under the appropriate stimulus spectrum. In one embodiment, the visualization is performed indirectly. After separation of the amplification products, Contacting the amplified nucleic acid probe with the amplified marker sequence. Preferably a probe Is attached to the chromophore, but may be radiolabeled. In another embodiment, the antibody or The probe is bound to a binding partner such as biotin, and the other member of the binding pair is Carry a detectable component. In one embodiment, the detection is by a labeled probe. Related technology Well-known and found in numerous standard books on molecular protocols Can be. See Sambrook et al., 1989. Eg chromophore or radioactive Labeled probes or primers identify the target during or after amplification. One example of the foregoing is disclosed in U.S. Pat. No. 5,279,721, which describes automated electrophoresis of nucleic acids and An apparatus and method for transition are disclosed. The device is capable of electric swimming without external manipulation of the gel Movement and blotting, and Ideally suited for performing the method. In addition, standard sequence analysis techniques are used to identify particular types of mutations. The above amplification product can be subjected to sequence analysis. Within one method, the optimal seque Sequence analysis using primer sets designed for An analysis is performed (Pignon et al., 1994). The present invention relates to these types of analysis. Methods are provided that can use any or all. Disclosed herein Using an arrayAop2Orient so that the sequence can be amplified throughout the gene. Oligonucleotide primers and then direct sequencing And analyze them. (Vi) Kit components Aop2And all essentials required to detect and sequence its variants The substances and reagents can be assembled together in a kit. Usually, these are Comprising selected primers and probes. Also included are various poly Merase (RT, Taq, Sequenase^TM(Trademarks) and other nucleic acids Suitable enzymes, deoxynucleotides and buffers to amplify Well, give the necessary reaction mixture for amplification. Also, usually such kits For each individual reagent and enzyme and each primer or probe in the appropriate manner A separate container. (Vii) Design and theoretical consideration of relative quantitative RT-PCR CDNA to determine the relative concentration of specific mRNA species isolated from patients Reverse transcription of RNA into RNA (RT) followed by relative quantitative PCR (RT-PCR) Can be used. Changes in the concentration of specific mRNA species By measuring the difference, the gene encoding a specific mRNA species may be different. Is expressed. In PCR, the number of amplified target DNA molecules may be limited by certain reagents. It increases almost twice in each cycle of the reaction until it is. It is then amplified between cycles The rate of amplification will gradually decrease until there is no increase in the target. Cycling The graph in which the number of cells is on the X axis and the log of the concentration of the amplified target DNA is on the Y axis. When blotting, connecting the blotted points creates a characteristic curve. Is done. Starting from the first cycle, the slope of the line is positive and constant. This is a curve Is referred to as a linear portion. After the reagent becomes limiting, the slope of the line decreases. Start a bit and eventually go to zero. At this point the concentration of the amplified target DNA is It becomes asymptotic to a fixed value. This is called the plateau portion of the curve. The concentration of the target DNA in the linear portion of the PCR amplification depends on the target before starting the reaction. Is directly proportional to the starting concentration of PCs that have completed the same number of cycles and are in a linear range By measuring the concentration of the amplification product of the target DNA in the R reaction, the original DNA It is possible to determine the relative concentration of a particular target sequence in a mixture. DNA mixing Is cDNA synthesized from RNA isolated from different tissues or cells The relative amount of the particular mRNA from which the target sequence was obtained Can be determined for The difference between the concentration of the PCR product and the relative amount of mRNA Directly applies only in the linear range of the PCR reaction. The final concentration of target DNA in the plateau of the curve depends on the availability of reagents in the reaction mixture. Irrespective of the initial concentration of the target DNA. Therefore, the collection of RNA population RT-PCR was used to measure the relative amount of mRNA The first condition that must be met before it can be determined is that the PCR reaction Sampling of the concentration of the amplified PCR product when it is in the linear part of these curves That is what you have to do. RT-PCR experiments were successful to successfully determine the relative amount of a particular mRNA species The second condition that must be met is that there is an independent It has to be standardized into standards. The purpose of the RT-PCR experiment was Determining the amount of a particular mRNA species relative to the average amount of all mRNA species in the pull And In the experiments described below, β-actin, asparagine synthetase MRNA for lipase and lipocortin II were used as external and internal The relative amounts of mRNAs are compared. Most protocols for competitive PCR utilize internal PCR standards that are approximately the same amount as the target. To use. These methods require that the products of the PCR amplification be sampled during their linear phase. This is effective when When the reaction approaches the plateau phase, the product If so, the lower amount of the product becomes relatively overrepresented. Differential Many different RNA sources, such as when examining RNA samples for expression. The comparison of the relative amounts performed on the samples indicates that the differences in relative amounts of RNA are less than It can be distorted to look good. Internal standards are significantly higher than target In this case this is not a serious problem. If the internal reference is higher than the target, Primary comparisons can be made directly between samples. The above description is of a theoretical consideration for the RT-PCR assay of clinically obtained substances. Write your thoughts. The problem inherent in clinical samples is that they are of varying amounts. (Which makes standardization difficult) and (Reliable internal control, preferably larger than the target) Requires co-amplification). Internal reference is greater than target cDNA fragment MR that is a highly amplifiable cDN fragment and encodes an internal reference The amount of NA is approximately 5-100 times greater than the mRNA encoding the target, When RT-PCR is used as a relative quantitative RT-PCR, Both are overcome. This assay measures the relative amounts and determines the amount of each mRNA species. Not an absolute quantity. Using a more common relative quantitative RT-PCR assay with an external reference protocol Other studies can be performed. These assays extend PCR products to their Sampling is performed at the linear portion of the width curve. Optimal PCR support for sampling The number of cycles must be determined experimentally for each target cDNA fragment Absent. In addition, reverse transcriptase production of each RNA population isolated from various tissue samples The product must be carefully normalized to an equal concentration of amplifiable cDNA. This consideration is very important because the assay measures absolute mRNA levels. standard Absolute mRNA levels as a measure of differential gene expression only in Can be used. Experimental determination of linear range of amplification curve and cDNA preparation Product standardization is a tedious and time-consuming process, but the resulting RT-PCR assay Is better than that obtained from a relative quantitative RT-PCR assay on an internal basis. May be One reason for this advantage is that all of the reagents are amplified without internal standards / competitors. Can be converted to a single PCR product in a linear range of Increase sensitivity. Another reason is that only one PCR product can be used for electrophoresis gel production. The display of objects or other display methods is less complex And has a lower background and is easier to interpret is there. (Viii) Chip technology Particularly contemplated by the present invention are Hacia et al. (1996) and Shoem. chip-based DNA techniques such as those described by Aker et al. (1996). It is art. In short, these techniques analyze large numbers of genes quickly and accurately. And quantification methods. Attach or fix oligonucleotide to gene By using the probe arrangement, target molecules can be separated in a high-density arrangement. Click to screen these molecules for hybridization-based screening. Loop technology can be used. Pease et al. (1994); Fodor et al. (1 991). B. Immunodiagnosis Techniques such as ELISA and Western blotting provide health and morbidity The antibodies of the invention can be used to characterize the AOP2 content of a tissue. This may be due to the presence or absence of antioxidant activity or Cleaning can be provided. The use of the antibodies of the invention in an ELISA assay is contemplated. For example, anti- AOP2 antibody selected surface, preferably polystyrene microtiter plate Immobilized on a surface exhibiting protein affinity, such as the wells of a protein. Incompletely adsorbed After washing to remove substances, bovine serum albumin (BSA), casein and Is known to be antigenically neutral for test antisera, such as solutions of powdered milk. Non-specific protein bound to the assay plate wells or Want to overturn New This allows blocking of non-specific adsorption sites on the surface to be fixed, Thus, the background caused by non-specific binding of the antigen on the surface is reduced. Allow antibody to bind to wells and coat with non-reactive material to reduce background. Immune complex (antigen / antibody) after covering and washing to remove unbound material The sample to be tested is brought into contact with the surface to be fixed to guide formation. After the formation of a specific immune complex between the test sample and the bound antibody and subsequent washing To provide a secondary antibody having a specificity for AOP2 different from the primary antibody. This makes it possible to determine the appearance and further the amount of immune complex formation. Appropriate The conditions are preferably BSA, bovine gamma globulin (BGG) and phosphate buffered saline ( PBS) Tween^RIncludes diluting the sample with a diluent such as TM . These added drugs also tend to help reduce non-specific background is there. Next, the overlaid antisera is preferably treated at a temperature of about 25 ° C to about 27 ° C. Allow to incubate for about 2 to about 4 hours. After incubation, The antiserum contact surface is washed to remove unincorporated material. Preferred wash Purification method is PBS / Tween^ROr wash with a solution like borate buffer Including. To provide a means of detection, the secondary antibody preferably has an attached enzyme, which is Incubation with an appropriate chromogenic substrate produces color. Thus, for example, Urease or peroxidase may be present for a period and under conditions that give rise to coalescence. Contacting and incubating the secondary antibody binding surface with the bound anti-human IgG (For example, PBS / Tween^Rof For 2 hours at room temperature in a solution containing PBS. It is. Incubation with enzyme-labeled secondary antibody followed by unbound After washing to remove unwanted substances, if peroxidase is used as an enzyme label, urea and And bromocresol purple or 2,2'-azino-di- (3-ethyl-ben (Thithiazoline) -6-sulfonic acid (ABTS) and H_TwoO_TwoWith a chromogenic substrate such as The amount of label is quantified by incubation. Then, for example, the visible spectrum Quantitation is performed by measuring the amount of color development using a spectrophotometer. First, change the form by binding the sample to the assay plate. Can be. Next, the primary antibody is incubated with the assay plate, followed by: Primary antibody bound using a labeled secondary antibody with specificity for the primary antibody Is detected. The antibody composition of the present invention is useful for immunoblot or Western blot analysis. There are critical uses. Like nitrocellulose, nylon or a combination thereof High-affinity proteins for the identification of proteins immobilized on a solid solid support matrix An antibody can be used as the next reagent. Immunoprecipitation followed by gel electrophoresis Secondary reagents used to detect antigens can create undesirable background These can be used as single-step reagents for use in detecting antigens . Immunologically based detection method for use in connection with western blotting Contains enzymatically, radioactively or fluorescently labeled secondary antibodies to the toxin component. However, it is considered particularly useful in this context. VI. Method for screening active compounds The present invention is directed toward mimicking AOP2 activity, overcoming AOP2 deficiency or suddenly Compounds for any activity that prevent the negative effects of mutant AOP2 molecules AOP2 and active fragments in screening for Use of the encoding nucleic acid is also contemplated. These assays utilize a variety of different formats That screening depends on the type of "activity" being performed Can be. Activity can be assayed in a cell-free system, typically with protein or Examining lipid oxidation or prevention of oxidation. Specifically, thiol (Eg, DTT) and a metal (eg, Fe)⁺³) After addition of The protection of glutamine synthase from activation is measured. Also contains thiol O when incubated with reducing agents and metal ions_TwoAOP2 that hinders consumption Activity can also be measured in cell-free systems by capacity (Netto et al., 19 96). A. In vitro assay In one embodiment, the invention binds to an AOP2 molecule or a fragment thereof. Used for compound screening. Polypeptide or fragment Is free in solution, fixed to a support, expressed in cells or on the surface Or any of them. Label either polypeptide or compound And thereby allow measurement of binding. In another embodiment, the assay comprises AOP on a natural or artificial substrate or binding partner. The inhibition of binding of 2 can be measured. Any of the drugs (AOP2, binding partner Or a compound) is labeled. Normal , The species to which the polypeptide is labeled. Liberation Measuring the amount of labeled versus bound label to determine binding or inhibition of binding. it can. Another technique for high-throughput screening of compounds is described in WO 84/03564. It is described inside. Solid like a plastic pin or some other surface A large amount of a small peptide test compound is synthesized on the support. AO peptide test compound React with P2 and wash. Detect bound polypeptides by various methods . Purify AOP2 purified for use in the above drug screening techniques. It can be coated directly on the rate. However, the polypeptide is immobilized on the solid phase. Non-neutralizing antibodies to the polypeptide can be used to determine. Also, A reactive region (preferably a terminal region) to link the AOP2 active region to the phase May be used. How the various functional properties of AOP2 and candidate compounds affect these properties To determine if a wild-type or AOP2 natural or engineered A variety of cell lines containing the variant can be used. To design a mutant Is described elsewhere in this document as well as naturally occurring mutants of AOP2. Is described. In such assays, compounds may be considered for their biochemical properties. Properly mix and contact with target cells. Depending on the assay, culture may be required. There is a potential. Second, cells can be examined by a number of different physiological assays. Wear. Alternatively, molecular analysis can be performed, in which case AOP2 Capabilities or related pathways. This is protein expression, enzyme function , Substrate utilization, phosphorylation status of various molecules including AOP2, cAMP levels, mR (including suggestive indication of total cell or poly ARNA) Assays such as those for NA expression can be included. Also, the reporter geneAop2Linked to coding or regulatory sequences A known construct may be used. In this way, for example, from the antioxidant activity Increase expression by examining other functions associated with reporters that are easy to determine Addition can be measured. Examples of reporter genes are CAT, β-galactosida Luciferase and green fluorescent protein.B. In vivo assays The invention also encompasses the use of various animal models. As used herein, human and mouse The high degree of homology found between AOP2 is apparent in all animal systems in which it is normally expressed. Gives an excellent opportunity to examine the function of AOP2. Express normal AOP2 By developing or isolating mutant cell lines that cannot Highly predictive of atherosclerosis and other diseases in mammals and other mammals Animal models can be created. Finally, lacking wild-type AOP2 Atheromatous transgenic or congenic animal (described below) It can be used as a model for the development and treatment of atherosclerosis. Treatment of an animal with a test compound involves the administration of the compound in the appropriate form to the animal. Administration Is clinical, including but not limited to oral, nasal, cheek, rectal, vaginal or local Or by any route available for non-clinical purposes. is there Also, administration is intratracheal instillation, bronchial instillation, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal It may be by intravenous or intravenous injection. Particularly contemplated are systemic intravenous infusions, By blood or lymph supply Local injection and intratumoral injection. Determining the efficacy of a compound in vivo may involve a variety of different criteria. Such criteria are survival, increased activity levels, decreased protein or lipids Oxidation, reduced HDL levels, reduced oxidative products, reduced atherogenicity Including venous sclerosis, reduced oxidized LDL, reduced aging and reduced brain pathology Are not limited to them. C. Rational drug design The goal of rational drug design is to interact with biologically active polypeptides To produce structural analogs of the tide or the compound (agonist, antagoni Strikes, inhibitors, binding partners, etc.). By making such analogs, Different sensitivity to changes, whether more active or more stable than the natural molecule Make drugs that can have or affect the function of various other molecules And it is possible. ClonedAop2The availability of the array allows the crystal AOP2 can be produced in sufficient quantities to perform biological studies. further Computer-based prediction of structure-function relationships from peptide sequence knowledge Wear. One approach is to generate a three-dimensional structure of AOP2 or a fragment thereof. You. by x-ray crystallography, computer modeling or a combination of both methods Should be able to accomplish this. Another method, “alanine scanning,” is Including the optional substitution of residues throughout the molecule with lanine, resulting in shadows on function Measure the sound. Also, isolating AOP2-specific antibodies, selected by functional assays, It is also possible to elucidate its crystal structure. In principle, this method should This provides a drug core on which the meter can be based. functional Of anti-idiotypic antibodies against various pharmacologically active antibodies It is possible to completely avoid protein crystallography. As a mirror image of a mirror image, Anti-idiotype binding sites are expected to be analogs of the original antigen. next, Peptide vans chemically or biologically produced using anti-idiotypes It should be possible to identify and isolate the peptide from the bank. Choice The rendered peptide then serves as the drug core. Using an antibody as an antigen, Making anti-idiotypes using the methods described herein for manufacturing be able to. Thus, stimulants of AOP2 having improved AOP2 activity or inhibitors of AOP2, inhibitors , Agonist, antagonist or AOP2 function You can design a drug to work as a child. Another drug design method is the function of AOP2 With respect to its characteristic role, ie its putative role as an antioxidant. Is an antioxidant Or compounds that promote antioxidant activity or directly prevent oxidation products, Novel compounds can be designed that function in conjunction with AOP2. VII. Methods for treating AOP2-related disease states The invention, in another aspect, also includes the treatment of atherosclerosis. This action Is the supply of AOP2 orAop2Do not include the supply of expression constructs containing the gene. Can beA. Gene-based therapy One of the therapeutic aspects contemplated by the inventors is the development of atherosclerosis. It is a molecular intervention in the events involved in the disease. Specifically, the present inventors Supplies AOP2 to appropriate target cells It is intended to provide an expression construct that can be Expression vectors and in them Long descriptions of the genetic components used are incorporated into this section by reference. . Particularly preferred expression vectors are adenovirus, adeno-associated virus, herpes With viral vectors such as viruses, vaccinia viruses and retroviruses is there. Also preferred is an expression vector encapsulated in ribosomes. One skilled in the art will understand how to apply gene delivery to in vivo and ex vivo situations. I know well. For virus vectors, virus vector stocks are usually prepared. To make. Depending on the type of virus and the titers obtainable, 1 × 10^Four1x1 0^Five, 1x10⁶, 1x10⁷, 1x10⁸, 1x10⁹, 1x10^Ten, 1x10¹¹ Or 1x10¹²Is delivered to a patient or animal. Relative uptake effect By comparing the rates, it is similar to liposomes or other non-viral preparations. Can be predicted. The formulation as a pharmaceutically acceptable composition is as follows: This is described below. B. Protein therapy Other methods of treatment include AOP2 polypeptides, active fragments, synthetic peptides, Supply of a mimetic or other analog to the patient. Depending on the recombinant expression method, If the protein can be produced or is small enough, it can be Can be manufactured. Based on the route and purpose of administration, And, but not limited to, classic pharmaceutical formulations. C. Combination treatment with traditional anti-atherosclerosis treatment One goal of current research is to reduce atherosclerosis The idea is to find ways to enhance the efficacy of the pharmaceuticals devised. One way is By combining gene therapy with such traditional therapies. In connection with the present invention,Aop2 Hope replacement therapy can be used as well with traditional pharmaceutical intervention Can be Usually, "target cells"Aop2Interacts with the expression construct and at least one other agent Touch. These compositions are used to reduce the atherosclerotic burden in animals. Given in the effective total amount. This method involves combining the expression construct and the drug or agent with the cells. Simultaneous contact can be included. A single composition containing both drugs Or by contacting the cells with a pharmacological preparation or one of the compositions is expressed Two different compositions or preparations containing the construct and the other the drug and the cells. This can be done by contacting at the same time. Alternatively, gene therapy treatments are administered at intervals ranging from minutes to weeks. It may precede or follow the placement. Other drugs and expression constructs used separately for cells In certain embodiments, the agent and expression construct are still co-operatively acting on the cells A significant period usually does not break between each delivery time so that Make sure that. In such cases, within about 12-24 hours of each other, more favorable Or to bring the cells into contact with each other within about 6-12 hours of each other. A delay time of only about 12 hours is most preferred. However, in some situations, It may be desirable to extend the duration of the treatment significantly, for several days (2, 3, 4, 5 , 6 or 7) to several weeks (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8) respectively Elapse between the administrations of. Also,Aop2More than once for either the expression construct or the other agent It is also contemplated that administration is desired. As illustrated below,Aop2Is "A" And various combinations where the other agent is "B" can be used: Other combinations are possible. Agents or factors suitable for use in combination therapy may include atherosclerosis in the host. Reduce the burden of atherosclerosis or cholesterol or lipoproteins Any chemical compound or method of treatment that alters the level. As described above,Aop2 Combined with the expression construct to form a combined therapeutic composition or kit To prepare and use the drug. Those skilled in the art can refer to “Remington's Pharmaceutical Sci. ences, 15th edition, Chapter 33, especially p624-652. Be treated Some variation in dosage will necessarily occur depending on the condition of the patient. Person responsible for administration Will determine the appropriate dosage for the individual patient in all cases. In addition, human administration For this purpose, the formulation is available from the FDA Office of Biologics. Sterility, pyrogenicity as required by standards, General safety and purity standards must be met. The present inventorsAop2For patients with related diseasesAop2Expression Localized delivery of constructs delivers therapeutically useful genes to offset pathological disorders It is a very efficient way to Similarly, certain of the patient's body The treatment may be directed to the affected area. Alternatively, in some situations that happened Systemic delivery of the construct and / or drug may be appropriate. D. Formulations and routes for administration to patients If clinical use is intended, the pharmaceutical set in a form appropriate for the intended use Preparation of expression-expression vectors, viral stocks, proteins, antibodies and drugs It is necessary. Usually this can be harmful to pyrogens and humans or animals Involves preparing a composition that is essentially free of other potential impurities. Typically to stabilize the delivery vector and provide for uptake by target cells It is desirable to use appropriate salts and buffers for the reaction. In addition, recombinant cells can be A buffer is also used for the introduction into the cell. The aqueous composition of the present invention is pharmaceutically acceptable To cells, dissolved or dispersed in a carrier or aqueous medium which can be An effective amount of the vector. Such compositions are also called inoculants. "Made "Pharmaceutically or pharmacologically acceptable." The presence of molecules that do not cause undesired, allergic or other untoward reactions And a composition. As used herein, "pharmaceutically acceptable carrier" Are any and all solvents, dispersants, media, coatings, antibacterial and antifungal agents, And absorption delaying agents. Such a medium for pharmaceutically active substances and The use of drugs is well known in the art. Any normal medium and And drugs are not compatible with the vectors or cells of the present invention. Unless it is an excuse, its use in therapeutic Sosei is intended. In addition, Can also be incorporated into the composition. The active compositions of the present invention can include classic pharmaceutical preparations. This of the present invention Administration of these compositions may be by any general route, as long as the target tissue is available by that route. By road. This includes oral, nasal, cheek, rectal, vaginal or topical. Alternatively, Administration may be by stationary, intradermal, subcutaneous, intramuscular, intraperitoneal or intravenous injection. So Such compositions are typically administered as the pharmaceutically acceptable compositions described above. . The active compounds may also be administered parenterally or intraperitoneally. Free base or A solution of the active compound as a pharmacologically acceptable salt is added to hydroxypropyl cellulose. It can be prepared in water appropriately mixed with a surfactant such as water. Also, In lyserol, liquid polyethylene glycols and mixtures thereof and in oils. A liquid dispersion can also be prepared. Under ordinary conditions of storage and use, these preparations may be Contains preservatives to prevent the growth of organisms. Pharmaceutical forms suitable for injectable use include sterile aqueous solutions or dispersions and Contains sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersions. No. In all cases, the form must be sterile and Must be fluid to the extent that It is not stable under the conditions of manufacture and storage. Must be protected from the contaminating action of microorganisms such as bacteria and fungi. I have to. Carriers include, for example, water, ethanol, polyol (eg, glycero Propylene glycol, liquid polyethylene glycol, etc.) It may be a solvent or dispersion medium containing the mixture and the vegetable oil. For example, Resi The use of a coating such as chin, and in the case of dispersions, the maintenance of the required particle size, By using a surfactant, appropriate fluidity can be maintained. Various antibacterial agents And antifungal agents such as parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid , Thimerosal and the like can prevent the action of microorganisms. Many places In such cases, it is preferable to include isotonic agents, for example, sugars or sodium chloride. Drugs that delay absorption, for example, aluminum monostearate and gelatin. Use in compositions can result in prolonged absorption of the injectable composition. The required amount of active compound in a suitable solvent, if required Various other ingredients listed above To prepare a sterile injectable solution by admixing, followed by sterile filtration. Through Example, a sterile vehicle containing the basic dispersion medium and the required other ingredients from those enumerated above. A dispersion is prepared by incorporating the various sterilized active ingredients into a container. Sterilization In the case of sterile powders for the preparation of prepared injectable solutions, the preferred method of preparation is Their powders from a solution of the sterilized filtered active ingredient and any additional suitable ingredients Vacuum drying and freeze drying techniques. As used herein, "pharmaceutically acceptable carrier" can include any and all Solvents, dispersion media, coatings, antibacterial and antifungal agents, isotonic and absorption delaying agents and the like. The use of such media and agents for pharmaceutically active substances is well known in the art. Are known. Unless any usual media or drug is contraindicated with the active ingredient , Its use in therapeutic compositions is contemplated. Also, supplemental active ingredients in the composition Can also be mixed. For oral administration, the polypeptide of the present invention is mixed with excipients and It can be used in the form of detergents and dentifrices. Nato borate Mix the required amount of the active ingredient with a suitable solvent such as An internal cleanser can be prepared. Alternatively, sodium borate, glycerin The active ingredient can be mixed with a sterile detergent containing You. In addition, the active ingredient is a dentifrice including gel, paste, powder and slurry It may be dispersed inside. Contains water, binder, abrasive, fragrance, foaming agent and humectant The active ingredient can be added to the dentifrice in a therapeutically effective amount. You. The compositions of the present invention can be formulated in a neutral or salt form. Pharmaceutically acceptable Possible salts include acid addition salts (formed with the free amino groups of the protein), and They are, for example, inorganic salts such as hydrochloric acid or phosphoric acid or acetic acid, oxalic acid, tartar Formed with organic acids such as acids, mandelic acid, and the like. Also, for example, sodium hydroxide Inorganic bases such as potassium, ammonium, calcium, or iron and isop Organic bases such as ropylamine, trimethylamine, histidine, procaine, etc. To form a salt formed with a free carboxyl group. At the time of dispensing, it should be compatible with the dosage formulation and in such amounts as are therapeutically effective. Administer the solution. Formulations can be in various dosage forms such as injectable solutions, drug release capsules, etc. Is easily administered. For parenteral administration in an aqueous solution, e.g., The solution should be appropriately buffered and the liquid diluent first diluted with sufficient saline or glucose. Should be isotonic on the course. These particular aqueous solutions are available intravenously, intramuscularly, subcutaneously and Particularly suitable for intra- and intraperitoneal administration. In this connection, the destruction that can be used Bacterial aqueous media will be understood by those of skill in the art in light of the present disclosure. For example, one dosage is 1 dissolved in 1 ml of isotonic NaCl solution and added to 1000 ml of subcutaneous infusion or Is It can be injected at the site of the injection (e.g., "Rcmington's Pharmaceutical Scinccss ”, 15th edition, p1035 1038 and 1570-1580). Dosage depending on the condition of the patient being treated Some variation of will necessarily occur. The person responsible for administration should be Determine the appropriate dosage for the patient. Furthermore, for human administration, the formulation is Sterility, pyrogenicity, general safety and purity standards as required by Must meet the standards. VIII. Congenic, transgenic and knockout animals In one embodiment of the invention, a "normal" or mutantAop2Have a gene Produce congenic animals. These animals have AOP2 expression or function. There are uses in testing intense or inhibitory compounds in vivo. For example These congenics, using a variety of different functional reads, as described above Animals can be used to identify compounds that enhance AOP2 antioxidant activity . Methods for crossing congenic lines are well known to those skilled in the art. In another aspect, the invention encodes a functional AOP2 polypeptide or a variant thereof. Transgenes containing functional or non-functional (eg, mutant) transgenes Create engenic animals.Aop2Transgenic expression expressing the transgene Products, recombinant cell lines and transgenic embryos obtained from such animals, Screening and identifying agents that induce or suppress AOP2 function Method may be useful. Further, the transgenic animal of the present invention It can also be used as a model to study symptoms such as atherosclerosis. Can You. In one embodiment of the present invention, a human or mouseAop2 remainsTiger expressing gene To create transgenic animalsAop2Transfer transgene to non-human host Enter. By incorporating the transgene into the genome so that it can be expressed Produce transgenic animals. The method for producing transgenic animals is W Agner and Hoppe (U.S. Pat. No. 4,873,191; incorporated by reference). Brinster et al., 1985 (entirely incorporated by reference). And "Manipulatin." g The Mouse Embryo; A Laboratory Manu al ", 2nd edition (edited by Hogan, Bedington, Costanti) mi and Long, Cold Spring Harbor Laboratory ry Press, 1994; incorporated herein by reference in its entirety. In general). Endogenous due to homologous recombination between transgene and endogenous geneAop2Replace May be desirable; or in the production of “knock-out” animals. Endogenous genes can be removed by deletion. Typically, the genomic sequence is TouchAop2The gene is introduced into the fertilized egg by microinjection. Inn with micro-injected eggs Implanted in the primary female and screening offspring for transgene expression. Reptile And many other species, including, but not limited to, species, amphibians, birds, mammals and fish Transgenic animals can be produced from fertilized eggs from animals. Especially good Within preferred embodiments, AOP2 is overexpressed or a polypeptide mutant Generate transgenic mice expressing the mold. Or, "No "Out" mouseAop2Of APO2 protein due to lack of Can have an effect on cells in vivo. Also knock knock Uto mice also provide a model for the development of AOP2 barabbar disease. As described above, transgenic animals and cells obtained from such animals The system may have applications in certain test experiments. In this connection, wild Transgenic animals capable of expressing a mutant or mutant AOP2 And the cell line can be exposed to the test substance. Wild-type AOP2 expression and / or Ability to enhance function or impair the expression or function of mutant AOP2 To screen for these test substances. IX. Example The following examples are included to demonstrate preferred embodiments of the present invention. In the following examples It has been confirmed by the present inventors that the technology disclosed in Technology that has been discovered, and thus constitutes a preferred form for its implementation. One of ordinary skill in the art should understand that However, this business Those skilled in the art will recognize, in light of the present disclosure, that Without departing from the concept, spirit and scope of the present invention, It should be appreciated that similar results can be obtained. More specifically, Achieves the same or similar results, but with a chemical alternative to the agents described herein. It is clear that certain drugs, both physiologically and physiologically, can be substituted. is there. All such similar substitutes and modifications apparent to those skilled in the art are Within the spirit, scope and concept of the invention as specified by the appended claims it is conceivable that.Example 1-Materials and Methods mouse. C57BL / 6J, DBA / 2J and 8BXD recombinant inbred lines ( BXD1, BXD2, BXD5, BXD6, BXD8, BXD9, BXD11, BXD25) by Jackson Laboratory (Bar Harbor) , Maine). Two-dimensional gel electrophoresis: Kidney and kidney by modification of the method of Wison et al. (1977). Protein from liver and liver. 10% mercaptoethanol, 1% SDS 200 mg of tissue in 68 μl lysis buffer containing 8 M urea Quality. 500 μl of boiling sample buffer 1 (0.3% SDS, 200 mM DTT, 28 mM Tris HCl, 22 mM Tris-base) Addition was followed by incubation at 100 ° C. for 5 minutes. Sample on ice for 5 minutes After cooling, 50 μl of sample buffer 2 (24 mM Tris-base, 47 6 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl_Two, 1 mg / ml DNAseI, 25 mg / ml RNAse A) and incubated on ice for 8 minutes. The protein was precipitated with 0% acetone at 0 ° C. for 20 minutes. Microcentrifuge suspension (10,000 g, 5 minutes) and the precipitate was washed with 500 μl of loading buffer (7.92). M urea, 0.06% SDS, 1.76% amphoteric electrolyte solution pH3-7, 120m M DTT, 3.2% Triton X-100, 22.4 mM Tris HCl And 17.6 mM Tris-base). 15 μl of each sample ( About 10 μg of protein) was electrophoresed. Millipore Corp. Or Analytical and preparative two-dimensional analysis using equipment and protocols purchased from An electrophoresis was performed. Isoelectric point and molecular weight standard (BioRad) Were run simultaneously with the protein sample to be analyzed. Protein blotting and protein microsequencing. 0.5X Tris-Glycine according to the protocol provided by the manufacturer Milli-blot graphite semi-dry electro in Tobin buffer Blotter system (MilliBlot Graphite Semi-Dr y Electroblotter System) and Immobilon-P (Im mobilon-P) (PVDF) transfer membrane (Transfer Me) mbrane) (Millipore) from a preparative two-dimensional electrophoresis gel. Protein was transferred. After transfer, stain membrane with 0.25% Coomassie Brilliant Blue Colored, protein spots were identified and cut from the dried membrane. Tempst And Riviere^{twenty four}Modified as described by Applied Bi N-term using an Ostems Model 477A protein sequencer The terminal amino acid sequence was obtained. Homologous to Genpet and dbEST databases A gender search was performed. Use Sequencher 3.0 (Gene Codes) EST sequence alignment and consensus sequence analysis were performed. Used for sequence alignment EST gene bank accession numbers are: W70913, W71818, W1440 0, W51064, W59407, W83606, W83464, AA0029 70. Using Sequenase (USB) according to the manufacturer's instructions A terminal 3'UTR sequence was obtained. SSCP mapping: Putative for gene mappingLtw4Gene 3 Using single-stranded polymorphism (SSCP) analysis of the 'UTR (Guertin et al., 19 94; Hahn & Subbiah, 1994). Step Limer: 5′-GCGAGCGATCTACAGAGACC-3 ′ (SEQ ID NO: 9) and P of 5'-TGATGGTAGTTCCCACCCTC-3 '(SEQ ID NO: 10) Using CR amplification with C57BL / 6JM. spretusIdentify polymorphisms between strains Was. BSS interspecific backcrossing (Iakoubova et al., 1997) as follows: Mapping was performed using a panel of 94 DNA: 10 mM Tris pH8. . 0, 50 mM KCl, 2 mM MgCl_TwoAnd 0.001% gelatin In a total volume of 12 μl PCR buffer³²P-terminal labeled forward and reverse 96-well microtiter with reverse primer (0.3 μM of each primer) 30 ng of DNA was amplified in the plate. After denaturation at 94 ° C. for 5 minutes, 0.2 mM dNTPs and 0.5 unitsTaqDNA polymerase was added. 2 5 cycles of amplification (2 min 55 ° C. annealing, 3 min 72 ° C. extension, 1 min Denaturation at 94 ° C.) with a final extension step of 7 minutes. PCR product with USB stop solution And denatured at 95 ° C, transferred on ice, and 0.5X at 4 ° C, 40W constant power. 2 μl of each sample was run on a 5% non-denaturing polyacrylamide gel in TBE buffer. The samples were electrophoresed for 2-3 hours. MapManager computer program The phylogenetic distribution pattern was analyzed using ram. Example 2-Results Polymorphic tamper similar to that first described by Elliott, 1979 After two-dimensional electrophoresis of liver and kidney homogenates for proteins By examining about 1000 silver-stained protein spots obtained in The TW4 protein was identified. A 26 kD polypeptide has been identified and its C57 The BL / 6J allele has a p1 of 5.9 and its DBA / 2J allele The pup had a pH of 5.6 (FIG. 1). Identified polymorphic protein matches LTW4 To ensure that the 8BXDRI line is correct, use 2D gel electrophoresis. And analyzed the phylogenetic distribution pattern of this protein in these strains.Ltw4 It was confirmed that it was the same as that described for. Preparative 2-D electrophoresis was performed using liver proteins extracted from the DBA / 2J strain. Performed, indicating that this variant of LTW4 is not a C57BL / 6J-related isoform. This is because they were easily separated from other proteins. After two-dimensional electrophoresis, The protein was transferred to a membrane and the LTW4 protein spot was identified and isolated. Tampa Microsequencing of protein spots yields 24 N-terminal amino acids Which is a thiol-specific antioxidant (TSA) protein (Elliott) Et al., 1980) previously identified humans believed to be members of a large family. G hypothetical protein (HUMORF06, Genebank accession number: D14662) With 92% identity to residues 2-26. B for dbEST database HUM to identify homologous mouse partial cDNA sequences using LASTN search The nucleotide sequence of ORF06 was used. Sequencher 3.0 sequence alignment Consensus sequences from these ESTs were obtained using column software (FIG. 2). This joint The translation product of the common sequence has 89% identity and 93% similarity to HUMORF06. I do. As explained below, another TSA family member's recently Agent 1 (Aop1The mouse MER5 gene, renamed as) is the gene characterized here. Having a region of conserved homology with the antioxidant protein 2 (Aop2). The gene encoding the isolated polymorphic proteinLtw4Located in the same position as SSCP analysis was used as described previously to assess whether Uertin et al., 1994; Hahn & Subbiah, 1994). C57 BL / 6J andM. spretusSSCP betweenAop2From the 3'UTR of Identified using the primers provided, and then resequencing these primers between BSS species Tested in crosses (FIGS. 3A and B) (Iakoubova et al., 1997).Aop2 Was mapped to chromosome 1 with a LOD potential of 27.4. Return of 91 In crossed offspringAop2WhenPmx1No recombinants were found between The location of these loci with respect to the Closatellites markerD1Mit14-3 . 2 ± 1.8 cM- (Aop2,Pmx1) −2.2 ± 1.5 cM−D1Mit 110 It is. In the BXD RI seriesLtw4Map locationD1Mit 11 -23 ± 11cM- (Ltw4,At3) -3.1 ± 3.2 cM−D1Mi t16 It is.D1Mit16IsD1Mit1101.1cM close to In these distalMitAgainst microsatellite markersAop2as well asLt w4 Are within the same 95% confidence interval. Furthermore, in the BXD seriesL tw4 No recombination withAt3IsD1Mit14WhenD1Mit110Located between (Marcel et al., 1989). Finally,Ltw4Is located One chromosome region shows the conservation of human chromosome 1q23-25 and synteny. HUMORF06 (Aop2WI-723 of STS obtained from 7 is located in this area on the radiation hybrid and YAC physical map (Ohkawa et al., 1979). These mapping studies areAop2ButLtw4 Support the equivalent of Actual rotation example 3-explanation LTW4 protein is a thiol-specific protein that has been identified in a wide variety of organisms Shares amino acid similarity with members of the antioxidant (TSA) protein class ( Elliott et al., 1980). The best characterized of these proteins Contain yeast TSA, not from systems that produce only reactive oxygen, Cellular components against oxidative damage from systems capable of producing reactive sulfur species It has been shown to protect (Paigen et al., 1987a). Also this activity Is (also called C22) Salmonella typhimurium (S. typhimur ium A) a catalytic component of the alkyl hydroperoxide reductase fromAhpCTo Have been found (Elliot et al., 1980). This protein fa Millie's mammalian members include brain TSA (Elliott et al., 1980), ER5 ( 1987b), osteoblast-specific factor 3 (OSF3) (Paig 1987c), natural killer enhancer factors A and B (NKEF A and NKEFB) (Paigen et al., 1990), growth-associated factor (PAG) ( Parthasarathy et al., 1990) and a macrophage 23 kD strain. Protein (MSP23) (Senault et al., 1990). (OSF 3, NKEFA, PAG and MSP23 are very homologous and of the same protein It may be a mutant. ) Blocks program (http: // www. blocks. fhrc. org), AOP2, MER5, M Amino acid comparison of SP23 and TSA shows three conserved domains (FIG. 4) . AOP2 proves to be the least similar of these proteins Of particular interest are the other three mouse proteins and the TSA gene family. AOP2 is the second cysteine conserved in most members of the family. Is not shared (Elliott et al., 1980). Identification of these genes Is not yet elucidated, but MSP23 is induced in response to oxidative stress It is important to note that the protein was first isolated. In addition, MER5 The gene encodingAhpCEscherichia coli for mutation of Can be complemented by the loss of alkyl hydroperoxide reductase activity in (Yamamoto et al., 1989), and based on this result,Mer5Heredity The child is antioxidant protein 1 (Aop1) Has been renamed. Aop2Is a homogenate of liver, kidney and brain Was first found to be abundant product in (Chae et al., 1994; Ell iott, 1979).Aop2 The cDNA appears to be widely expressed: TI GR database (http://www.tigr.org/tdb/tdb. htm1) is HUMORF06 (Aop2Human homolog)). A common sequence (THC122873) was identified, which was obtained from 24 different tissues. Should not include the 116 ESTs identified in the identified cDNA library. You. Example 4 Materials and Methods SSCP mapping. CongenicAth1Gene mapping in strains For pingAop2Single-stranded polymorphism (SSCP) in the 3 'non-transcriptional region of Sakodenko The analysis was used (Beier et al., 1992; Bcier, 1993). Primer ・ 5′-GCGAGCGATCTACAGAGACC-3 ′ (SEQ ID NO: 9) and P of 5'-TGATGGTAGTTCCCACCCTC-3 '(SEQ ID NO: 10) Using CR amplification with C57BL / 6JM. spretusIdentify polymorphisms between strains Was. Backcrossed to Sprtus (C57BL / 6 X Split) as follows: us) BSS Jacks of backcross mice obtained from backcross of F1 mice. Mapping was performed using the on-laboratory panel: 10 mM T ris pH 8.0, 50 mM KCl, 2 mM MgCl_TwoAnd 0.001% zera 0.3 mM in a total volume of 12 ml PCR buffer containing³²P terminal 96-well microtiter plate with labeled forward and reverse primers 30 ng of DNA was amplified in the plate. After denaturation at 94 ° C for 5 minutes, 0.2 mM dNTPs and 0.5 unitsTaq DNA polymerase was added. 25 sa Amplification of cycle (55 ° C. annealing for 2 minutes, 72 ° C. extension for 3 minutes, 9 minutes for 1 minute) Denaturation at 4 ° C.) was performed with a final extension step of 7 minutes. PCR product with USB stop solution and 1 : 4 mixed, denatured at 95 ° C, transferred to ice, 0.5X TB at 4 ° C, 40W constant power. 2 ml of each sample by 5% non-denaturing polyacrylamide gel in E buffer Was electrophoresed for 2-3 hours. Using this method, C57BL / 6J andM. sp retus Allele heterozygous mice were homozygous for the C57BL / 6J allele. Distinguish from mouse We were able to.Aop2Of the C57BL / 6J allele and the ate Susceptibility to Rohm atherosclerosis was consistent in 100% of these mice. this Corresponds to a genetic distance of 0-xcM. Sequence analysis. C57BL / 6J, DBA / 2J and C3H / Fe by standard technology Using RT-PCR amplification from cDNA prepared from kidney and liver halo of J mice A clone containing the long open reading frame was obtained. For this amplification The primer used was AOP2 orf forward: 5'-AGCGTCACCA CTGCCGCCATG-3 '(SEQ ID NO: 11) and AOP2 orf River 5'-GTACTGGATGTGCAGATGCAGCC-3 '(SEQ ID NO: : 12). Perform multiple independent PCR reactions on each line to Cloned fragment into pCR2.1 (Invitrogen) Sequence using Sequenase (USB) according to manufacturer's instructions did. Example 5-Results Construction of congenic strain. Sensitive C57BL / 6 (B6) and And existing congenic B6. C-H25^cPolymorphism difference with B6 more than / By From another strain withAth1Congenic Lines with Different Resistance Alleles To doSprtusA region of the genome was introduced into B6, Are closely related but from different species. Marker-D1Mit14 And D1Mit136SprtusfromAth15 areas in B6 Intergenerational backcrossing and then outcrossing resulted in the F1 generation. N5F1 generation homozygous Attempts to mate mating failed; homozygous F2 mice were obtained, but not with N5F2. Exchange I did not arrange. The F2 males clearly have sperm defects, and these sperm Do not fertilize the eggs even by toro fertilization. Embryo frozen heterozygous congenic Saved as High resolution mapping of Ath1.Ath1To locate in high resolution Congenic strain B6 heterozygous with 57BL / 6 B6. Split-Ath1 ^{r / 5}while Backcrossing was carried out. This cross contains 1176 offspring,Ath1Adjacent to area 89 crossovers were obtained between the markers D1Mit14 and D1Mit356. Mice carrying the transfer were bred to B6, their female offspring were collected and fed a high fat diet. Give for 18 weeks. Measure the size of the lesion in each mouse and determine the total Average to the offspring of their parentsAth1Allele of resistance or susceptibility It was decided whether to have. Classify polymorphic loci in transgenic animals; high resolution The degree map is shown in FIG. Each transfer is 1763/100 or 0.057 cM inheritance Equivalent to the target distance. Ath1And SSLP loci D1Mit105, D1Mit266 and D1M No recombinant mice were found between it424.Aop2Is mouse chromosome 1 Because it was located in this area ofAop2That recognize polymorphism differences in the 3 'untranslated region Utilized a Limer pair. Have unique transfers in descendants of high-resolution backcrossing These were located in a group of mice.Ath1WhenAop2The recombinant between Not seen,Aop2ButAth1Implies that Sequencing of Ath1 / Aop2 cDNA.Ath1 / Aop2Guess C57BL / 6J, D using primers adjacent to the constant coding region From BA / 2J and C3H / FeJ inbred mouse strains This region was amplified and cloned from the prepared kidney and liver cDNAs; The loan arrangement is shown in FIG. C57BL / 6J and DBA / 2J pairs of this gene An allele encodes a protein with a single amino acid difference; amino acids 122 Is to aspartic acid in DBA / 2J and to alanine in C57BL / 6J Equivalent to. The translation product of the full-length coding sequence is the human sequence HUMORF06 and 89. % Identity and 93% similarity.Aop2Protein encoded by Quality is first found to be an abundant product in liver, kidney and brain homogenates (Elliott, 1979; Racine and Langley, 198). 0; Goldman and Pikus, 1986). Example 6-Description Aop2IsJckm2It was first characterized as a candidate for an altered locus. Possible role of antioxidant protein in progression of polycystic kidney disease is unclear . However, atherosclerotic plaques develop when fed a high-fat diet In the relative susceptibility of C57BL / 6J and C3H / HeJ mouse strains to C57BL / 6J Atherosclerotic movement at a locus suggested to play a role in determining Pulse sclerosis 1 (Ath1) In the identified areaAop2It is important that You. The role of lipid oxidation in the pathogenesis of atherosclerosis is well known , Recent researchAth1Is the accumulation of lipid peroxides in tissues or such fats It is implicated in any of the cellular responses to cellular peroxides.Aop2 The protein product is polymorphic between C57BL / 6J and C3H / HeJ, and Because the biochemical functions of other members of the gene family in the (Iakoubava et al., 1997),Ao p2 IsAth1Should be considered as candidates.Aop2 cDNA is widely expressed It seems to be done. TIGR database (http: //www.tigr.o) rg / tdb / tdb. html)Aop2HUMORF06, a human homolog of Is identified (THC122873). This THC is 1 has been identified in cDNA libraries obtained from 24 different tissues Comprising 16 ESTs. Example 7 As explained above, it does not show any change in plasma HDL levels and Indicates lack of atherosclerotic injuryAth1When compared to resistant mice,Ath1 Shows reduced plasma HDL levels in susceptible mice when fed a high fat diet And increased atherosclerotic lesion formation. The first of the mouse genome Mapping this locus to chromosome cM83.6Aop2Cloning and And mapping. Based on amino acid homology,Aop2Is highly stored (Chae et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 7017-7021 (1994) The major thiol-specific antioxidants (TSA) It seems to code for a new member of Millie. These proteins Possesses the activity of protecting cells from oxidative damage caused by a more catalyzed oxidation system, Therefore, it is considered to be an important part of the complex cellular defense against oxidative stress You.Aop2 cDNA was isolated from liver and kidney but has been found in a variety of tissues. (Iakoubova et al.,Genomics 42: 474-478 (1997). This gene is the previously characterized Ltw- 4 protein was found to encode mouse C57BL / 6J And DBA / It was shown to be polymorphic between 2J lines. The cDNA corresponding to Aop2 has been independently isolated by two other laboratories. One of them is the bovine ciliary glutathione peroxidase (Frank etc,Oncogene 14: 915-921 (1997); Munz et al.J. Biochem .326: 579-585 (1997)). It is called glutathione peroxidase, and the other is Enzyme activity (Kim et al.,J. Biol. Chem.272: 2542-2550 (1997)) because of the presence of the "GXSXG" motif reminiscent of Called holipase. However,Aop2Is any other known gluta Does not show significant homology to thione peroxidase and has not been identified It does not resemble phospholipase. On the contrary,Aop2Has more than 50 known Shows significant homology with thiol-specific antioxidants. Furthermore, TSA activity actuallyA op2 Are shown for the human homolog of Therefore,Aop2Is the TSA gene Apparently a member of the family. LDL oxidation is a form of foam cell in the arterial wall As it is involved in the development of atherosclerotic lesionsAop2ToAth1 Was examined as a candidate gene. Ath1The locus was previously determined using a recombinant inbred line to the 3cM region on chromosome 1. Was positioned. Due to insufficient polymorphic markers between B6 and C3H, Atherosclerosis resistant field against C57BL / 6J background From raw strains, Spretus and PERAAth1Possesses an allele Two independent congenics were made. B6 background Using genetics Is the origin of these wild-derived strains that affect HDL and atherosclerosis. Avoid problems with all other genes,Ath1Multiple polymorphic markers in the region of Add the advantage of N5 early congenic from Sprtus Collected transgenic offspring; theoretically 5th generation congenic selection on chromosome 1 It has only about 3% of the Spretus gene excluding the region. Therefore, exchange with B6 In deliveryAth1Other Spletus genes affect HDL-C and damage The potential for impact is greatly reduced. 1763 backcrossed offspring from this cross D1Mit14 and D1Mi at a genetic distance of 10 cM based on MIT maps collected Tested on progeny with recombination events during t356. 162 pairs in total Transgenic mice were collected and analyzed in a two step process. Step 1: High quantitative traits Phenotype from each individual mouse due to Finally, the female recombinants were tested for damage. This defines the area as D1Mit14- D1Mit110 was narrowed to the region of 3-4 cM. Step 2: In this 3-4 cM region Male mice with a recombination event are bred and female offspring are atherogenic phenotype Was tested for To determine the phenotype of a single recombinant mouse By testing groups, this progeny test avoids the problem of high diversity. This 2 The stepwise method has considerably reduced the area. Each recombination is 1/1763 or 0.05c Equal to the distance of M. If 1 cM is equal to 1.75 megabases, the physical The approximate distance can be estimated to be about 87.5 kb. (Area with many genes and It is estimated that genes exist every 40kb on average Is done. From the fine structure map of this area,Ath1Is D1Mit105, D1Mi t266 and D1Mit424 D1Mit159 and D1Mit, which show no recombination and are 0.15 cM in length 398 are shown. This is a candidate whose map position is this area Except for the lower apolipoprotein A2. Also located above this area ACAT, an enzyme that metabolizes cholesterol to cholesterol ester as a storage molecule (Acyl coenzyme A: cholesterol acyl tra (Spherase). Aop2Has previously been found to be a polymorphism between C57BL / 6J and Sprtus. As shown,Ath137 mice that were recombinant in the region WhichAop2Alleles were assayed directly for retention. These results FromAth1No recombination was indicated. Antioxidant protein is Athero Next step, because it is an attractive candidate gene for atherosclerosisAop2ActuallyAth1 Is to determine if Different resistance and susceptibility phenotypesAop2Determine if it correlates with an allele Susceptible C57BL / 6J strain, four atherosclerosis resistant Sex inbred lines (C3H / HeJ, BALB / cJ, DBA and 129 / SvJ) ToAth1Two atheromas used to guide the congenic independently From the atherosclerosis-resistant wild strains Spretus and PERAAop2 cDNA Was amplified and sequenced. In each systemAop2In the coding area of The corresponding nucleotide sequence and the corresponding amino acid sequence were determined. All four endurance Sex inbreds differ from susceptible B6 strains by a single amino acid (at amino acid number 124) Held. This amino acid is alanine in the sensitive C57BL / 6J strain. Aspartic acid in each of the four resistant inbred lines. This Although the functional significance of the difference between the amino acids is not known, from the analysis of the difference, Previously reported between DB6 and DBAAop22D gel transfer pattern for proteins It is shown that it can explain the imminent approach. In contrast, the two accounts analyzed The atherosclerosis resistant wild-type strains, PERΛ and spretus, No difference in acid, same as sensitive C57BL / 6JAop2Keep alleles Seems to have. Therefore, the mere existence of this amino acid difference is Could not explain the resistance to For this reason,Aop2mRNA Attempt to characterize expression and determine if these lines show differences in Aop2 expression did. 4 or 10 weeks on both diet or high fat diet, sensitive B6 strain, resistant BA LB / cJ strain and two resistancesAth1Congenic strain, B6. PERA And B6. Spletus from liver tissueAop2mRNA levels were compared . Total RNA was isolated from individual livers, and each line was used on either diet or high fat diet. RNA from two individual mice and a pool of 10 mice were analyzed . Has aspartic acid at amino acid position 124Aop2Carry allele In resistant liverAop2Expression was similar on diet and high fat diet. In contrast, amino acid bond 124 encodes alanineAop2Allele All strains with high-fat dietAop2Marked induction. 4 by diet By week, induction had occurred in all three lines. However, the sensitive C57BL / 6J when compared to both diet and high fat dietAop2The level of expression It was significantly larger in the resistant lines. Aop2ButAth1To further support the conclusion that In fatal diet imposed significant mimic shearsAth1Phenotype andAop2Investigate relationship Solid. The presence or absence of atherosclerotic damage in these individuals was assessed by liver work. TheseAop2Expression was compared. Two resistant B6. Spletus Congeni Animals (N6) had high levels after 14 weeks on a high fat diet.Aop2Showed expression. These animals were not damaged. In addition, four transgenic animals lacking damage and Comparison of 4 animals with atherosclerotic injury by 14 weeks on high and high fat diet did. Animals that were resistant to injury were 14 on a higher fat diet than those that caused injury. Higher level after a weekAop2Was expressed. Therefore, atherosclerotic injury And the occurrence ofAop2There is a correlation between the expression levels of Example 8-Materials and Methods (A)Aop2Genomic clone isolation and subcloning mouseAop2To isolate a genomic clone of a gene,Aop2orf (5'-AGCGTCACCACTGCCGCCCATG-3 ') andA op2 orf reverse (5'-GTACTGGATGTGCAGATGCAGC C-3 ') Mouse from DBA mouse strain by PCR using primersAop 2 Increase 0.7 kb cDNA fragment covering the entire coding region of the cDNA Width. This fragment was isolated and random primed (Amersham). By RediPrimeKit)³²Radioactively labeled with P and 129 / SvJ I FIXRII genomic library (Stratagene, La Jolla, C A, USA) were used as probes to screen. About 1.8 x 10⁶Plaques were screened. Individual positives after second screening Select clones and select each clone using standard techniques Phage DNA was isolated. To distinguish unique sequences³²Radioactively labeled with P WasAop2 For genomic clone digested with EcoRI using cDNA probe And the actual Southern blotting was performed. M13 for both forward and reverse Primers and publishedAop2 cDNA sequences (Iakoubova et al.,Genomics 42: 474-478 (1997)). Lambda claw using dideoxy chain termination method with fixed primer Pre-sequencing was performed. The vocal clones were digested with NotI and pB luesscript SK-vector (Stratagene, La Jolla) , CA, USA) and dideoxy chain termination The sequence was performed using the method (USB). (B) Intron / exon junction, intron size and promoter sequence Decision Subcloned using exon-specific primers flanking each intron By sequencing the isolated genomic fragmentsAop2Intron / Exon junctions were determined. These are exon 1F (5'-GAGGATTGC TTCTCGGGG-3 '), exon 2R (5'-CCGTGGGTGGGA AAAGAG-3 '), exon 2F (5'-CATTCTCTTTTTCCA) C-3 '), exon 3R (5'-TTTCCGTGGGTGTTTCAC-3 )), Exon 4F (5'-CCTCTACCTGCCACCAC-3 '), Exon 5R (5'-ACCATCACGCTCTTCTCC-3 ') . Except for the fully sequenced intron number 4, all introns were Primer combination: exon 1F and exon 2R; exon 2F And exon 3R: Approximate size of PCR product using exon 4F and exon 5R The size was determined by calculation. The following parameters: 94 ° C, 1 minute; 55 ° C, 1 minute; The PCR reaction was carried out at 72 ° C. for 30 cycles of 2 minutes using standard conditions. PCR The products were separated on a 0.8% agarose gel and analyzed for λ / HindIII and λ / BstI The size was estimated based on the comparison with the size standard (Promega). Exon 1 reverse primer (5'-GTCCCCGAGAAGCAAACC-3 ') Designed for the exon 2R primer and the upstream region sequenced above. Upstream forward primer (5'-CCCACGTCACAAGCTCTGG- 3 ') was used to obtain the 5' non-coding sequence. At least three separate seeks The ensing reaction confirmed the putative promoter sequence reported.result mouseAop2 Using a probe made from the coding region of cDNA Genomic library generated from 129 / SvJ mouse strain I did it. Twenty-one distinct positive clones were identified and identified using Southern blotting. Distinct sequences were distinguished. The results from this analysis show that at least three different genes Suggests; these areAop2And two highly related intronless genes Inclusive. Isolated from mouse C57BL / 6J and DBA / 2J strainsAop2 c As indicated by more than 99% nucleotide identity to DNA, One group of geoclones is trueAop2It contained overlapping sequences of the gene.Ao p2 Initial release of cDNA differs between DBA / 2J and C57BL / 6J strains Two nuclei in the coding region Reotides; one of them is cDNA sequence number 80, which has the code And the other is nucleotide number 439, It is adenine in DBA / 2J and cytosine in C57BL / 6J. The corresponding amino acid at this position is aspartic acid in DBA / 2J and C57 In BL / 6J, it is alanine. 129 / SvJ, like DBA / 2J From the strainAop2The gene encodes aspartic acid at nucleotide number 439 I do. From 129 / SvJAop2The allele is guani in 129 / SvJ The difference from DBA / 2J only in the variant nucleotide number 80 which is Encodes the same amino acids as all of the strains. Further sequence analysis of these clones showed that the gene had 5 exons and 4 And was shown to span about 10.7 kb. mouseAop2 The genomic structure of the gene is shown in FIG.Aop2Panel of exon positions in gene A. As shown, all four introns are coding regions of the gene. Included in the region. Exon and intron exact size and location and int The confirmed sequence of the Ron / exon boundary is shown in Panel B. The nucleotide numbers are Previously reported (Munz et al.,J. Biochem.326: 579-585 ( 1997); Frank et al.Oncogene 14: 915-921 (199) 7)) Overall length on ShiiAop2 corresponds to the cDNA. The size of the intron is 47 It varies from 1 bp to about 3.5 kb in length, but the first four exons are relatively large. The size is close, between 147 and 163 bp. 3 'end of coding region And a 667 bp 3'UTR are found in the last exon. 129 / SvJ systemAop23'UTR Were partially isolated from the C57BL / 6 strain and previously reported. Full length 3 'UTR from BALB / cJ [Munz et al.J. Biochem.3 26 : 579-585 (1997), # 2672]. nucleotide A single nucleotide difference was found at number 1037, which was a C57BL / 6J In 129 / SvJ and BALB / cJ, it is thymine. This They areAop2Is the only known strain. Aop2Begin to understand how is likely to be regulated in vivo As previously reported (Munz et al.,J. Biochem.326: 5 79-585 (1997); Frank et al.Oncogene 14: 915- 921 (1997)), the region upstream of the most 5 'cDNA sequence was isolated and Ens. About 500 nucleotides of this upstream region are shown in FIG. Minutes of this array Analysis did not identify a common TATA-box. However, how many The likely SP1 binding site is 60 nuclei upstream of the putative +1 transcription start site Located within the otide, like many other ubiquitously expressed genes,Aop2 Suggest that the basal transcription of E. coli may be regulated by these transcription factors. Also, the transcription initiation sequence (CTC) commonly found in promoters without TATA ANTCT). The actual sequence is this consensus sequence plus a single nucleotide Varies by insertion. However, this component is not a putative transcript as previously reported. Located 20 nucleotides downstream of the start site. Some additional consensus recognition sequences for known transcription factors are putative proximal promoters -Found inside. As shown in FIG. (Upstream stimulating factor), SREBP (sterol response element binding protein), lipid Two have been shown to be important in the so-called clauses of numerous parasites involved in metabolism Potential binding sites for DNA binding proteins. Estimated USF recognition distribution The columns are 100% consistent with the known binding sites, while the putative SREBP binding site is 1 Contains 11 of the 2 nucleotide consensus sequence. Also identical to known binding sites ADR1 (alcohol dehydrogenase regulatory gene 1) is also a common recognition sequence is there. In addition, this region has some potential for heat shock transcription factor (HSF). It contains certain binding sites, all of which perfectly match the consensus recognition sequence. Aop2In addition to the genes, two very relevant artifacts from the initial screening The gene was also identified. These genes areAop2-rs1as well asAop2-rs2(A op2 Related sequences 1 and 2). In FIG. 8AAop2Coding 4 shows a comparison of the nucleotide sequences of all three genes corresponding to the regions. Will be shown Sea urchinAop2-rs1Is in the coding areaAop2And 93% of the nucleus Shares otide identity.Aop2-rs1The difference between each nucleotide is base substitution Results in several amino acid mutations, but Bring the ding frame. On the contrary,Aop2-rs2Is quite different Seems to beAop2Shares only 80% nucleotide identity with 67 Includes nucleotide substitutions, 24 nucleotide deletions and 39 nucleotide insertions. The first nucleotide deletion prevents codon number 114, disrupts the reading frame and 119 amino acids. This results in a deleted protein that is no acid in length. well-knownAop2Protein sequence and The alignment of the putative protein products is shown in FIG. 8B. PresumedAop2-rs1 ProteinAop2At 86 % Identity,Aop2-rs2Share only 42% amino acid identity You.X. References The following references are exemplary methods or supplements to those described herein. As giving other details, they are specifically incorporated herein by reference:

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/10 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １１１ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/21 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｑ 1/68 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 ──────────────────────────────────────────────────続き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification symbol FI theme coat ゛ (Reference) A61P 9/10 C07K 14/47 43/00 111 16/18 C07K 14/47 C12N 1/21 16/18 C12P 21/08 C12N 1/21 C12Q 1/68 A C12P 21/08 G01N 33/15 Z C12Q 1/68 33/50 Z G01N 33/15 C12N 15/00 ZNAA 33/50 A61K 37/02

Claims

[Claims] 1. An isolated polypeptide designated AOP2. 2. 2. The isolated polypeptide of claim 1, wherein said polypeptide is a human polypeptide. 3. 2. The isolated polypeptide of claim 1, wherein said polypeptide is a mouse polypeptide. 4. 3. The isolated polypeptide of claim 2, wherein said polypeptide has the sequence set forth in SEQ ID NO: 2. 5. 4. The isolated polypeptide of claim 3, wherein said polypeptide has the sequence set forth in SEQ ID NO: 4. 6. An antigen composition comprising an Aop2 polypeptide or a fragment thereof and a pharmaceutically acceptable buffer or diluent. 7. 7. The antigen composition according to claim 6, wherein the polypeptide is a human polypeptide. 8. 7. The antigen composition according to claim 6, wherein the polypeptide is a mouse polypeptide. 9. The antigen composition according to claim 7, wherein the polypeptide has the sequence set forth in SEQ ID NO: 2. 10. The antigen composition according to claim 9, wherein the polypeptide has the sequence set forth in SEQ ID NO: 4. 11. A nucleic acid encoding an AOP2 polypeptide. 12. 12. The nucleic acid according to claim 11, wherein said polypeptide is a human polypeptide. 13. 12. The nucleic acid according to claim 11, wherein the polypeptide is a mouse polypeptide. 14． 12. The nucleic acid of claim 12, wherein the polypeptide has the sequence set forth in SEQ ID NO: 2. 15. 13. The nucleic acid of claim 13, wherein the polypeptide has the sequence set forth in SEQ ID NO: 4. 16. An oligonucleotide comprising at least about 10 contiguous bases of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. 17． 17. The oligonucleotide according to claim 16, wherein said oligonucleotide is at least about 15 contiguous bases of the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. 18. 18. The oligonucleotide of claim 17, wherein said oligonucleotide is at least about 20 contiguous bases of the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. 19. 19. The oligonucleotide of claim 18, wherein said oligonucleotide is at least about 25 contiguous bases of the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. 20. 20. The oligonucleotide of claim 19, wherein said oligonucleotide is at least about 30 contiguous bases of the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. 21. 21. The oligonucleotide of claim 20, wherein said oligonucleotide is at least about 35 contiguous bases of the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. 22. 22. The oligonucleotide of claim 21 wherein said oligonucleotide is at least about 40 contiguous bases of the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. 23. 23. The oligonucleotide of claim 22, wherein said oligonucleotide is at least about 45 contiguous bases of the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. 24. 17. The oligonucleotide according to claim 16, wherein said oligonucleotide is at least about 50 contiguous bases of the nucleic acid set forth in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. 25. A method of diagnosing a predisposition to atherosclerotic damage in said patient, comprising: (i) obtaining a sample from the patient; and (ii) evaluating said sample for the presence of AOP2 polypeptide. 26. The sample may be heart, artery, vein, skin, muscle, face, brain, prostate, breast, endometrium, lung, pancreas, small intestine, blood cells, liver, testis, ovary, colon, skin, stomach, esophagus, spleen, 26. The method of claim 25, wherein the method is selected from the group consisting of lymph nodes, bone marrow or kidney, lymph, ascites, serous fluid, pleural effusion, sputum, cerebrospinal fluid, tears, stool and urine. 27. 26. The method of claim 25, wherein said patient is a human. 28. 26. The method of claim 25, wherein said assessing comprises measuring the antioxidant activity of the AOP2 polypeptide in said sample. 29. 26. The method of claim 25, wherein said assessing comprises measuring the level of AOP2 polypeptide in cells of said sample. 30. 30. The method of claim 29, wherein said measuring comprises quantitative PCR. 31. 30. The method of claim 29, wherein said measuring comprises contacting said sample with an antibody that immunologically binds to an AOP2 polypeptide. 32. 26. The method of claim 25, wherein said assessing comprises determining the sequence of a nucleic acid from said sample encoding an AOP2 polypeptide. 33. (I) providing an AOP2 polypeptide having antioxidant activity; (ii) contacting the AOP2 polypeptide with a candidate stimulant; and (iii) an antioxidant of the AOP2 polypeptide in the presence or absence of the candidate stimulant. A method for screening a compound for AOP2 stimulating activity, comprising measuring the activity. 34. (I) providing a cell comprising a nucleic acid encoding an active AOP2 polypeptide; (ii) contacting the cell with a scavenger stimulant; and (ii) antioxidant the cell in the presence or absence of the candidate stimulant. A method for screening a compound for antioxidant stimulating activity, comprising measuring an agent activity. 35. 35. The method of claim 34, wherein said cells are located in a non-human animal. 36. (I) providing a lipid; (ii) contacting the lipid with a candidate antioxidant; and (ii) screening a compound for anti-atherosclerotic activity comprising measuring the oxidation state of the lipid. Method. 37. A monoclonal antibody that binds immunologically to an AOP2 polypeptide. 38. Polyclonal antisera, antibodies that immunologically bind to AOP2 polypeptide. 39. An expression vector comprising a nucleic acid encoding an AOP2 polypeptide, wherein the nucleic acid is placed in a functional relationship with a promoter. 40. A recombinant host cell comprising a nucleic acid encoding an AOP2 polypeptide, wherein the nucleic acid is in a functional relationship with a promoter. 41. (I) providing a nucleic acid encoding an AOP2 polypeptide having antioxidant activity, wherein the nucleic acid is located in a functional relationship with a promoter; (ii) providing the nucleic acid under conditions that permit incorporation of the nucleic acid. A method for increasing AOP2 function in a cell, comprising contacting the cell with a nucleic acid. 42. 42. The method of claim 41, wherein said AOP2 polypeptide is a human polypeptide. 43. 43. The method of claim 42, wherein said AOP2 polypeptide has the sequence set forth in SEQ ID NO: 2. 44. 42. The method of claim 41, wherein said nucleic acid further comprises an expression vector. 45. The method of claim 44, wherein said expression vector is encapsulated in a liposome. 46. The method of claim 44, wherein said expression vector is a viral vector. 47. 47. The method of claim 46, wherein said viral vector is selected from the group consisting of an adenovirus vector, a retrovirus vector, a vaccinia virus vector, an adeno-associated virus vector or a herpes virus vector. 48. 42. The method of claim 41, wherein said cells are located in a human patient. 49. 42. The method of claim 41, wherein said cells are located in a laboratory animal. 50. 50. The method of claim 49, wherein said nucleic acid is administered intravenously. 51. 42. The method of claim 41, wherein said promoter is selected from the group consisting of CMV, RSV and E1A. 52. A method of reducing atherosclerotic damage in a patient, comprising administering to the patient a lipid antioxidant composition.