JP2001519655A

JP2001519655A - Attenuated poliovirus

Info

Publication number: JP2001519655A
Application number: JP54025498A
Authority: JP
Inventors: マイナー，フィリップ・デービッド; マカダム，アンドリュー・ジョゼフ; アーモンド，ジェフリー・ウィリアム
Original assignee: BTG International Ltd
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1997-03-19
Filing date: 1998-03-18
Publication date: 2001-10-23
Also published as: WO1998041619A1; GB2325463A; GB2325463B; GB9805810D0; GB9705669D0; EP0968278A1; CA2283638A1

Abstract

(57)【要約】灰白髄炎に対するワクチン接種に適しており、ポリオウイルスゲノムの５’非コード領域内ドメインＶのステム（ａ）又は（ｂ）においてＵ−Ｇ塩基対又は他の塩基対不適正を有しない弱毒化ポリオウイルス。弱毒化ポリオウイルスは、５’非コード領域内に；（ａ）４７２−５３７番目にＵ−Ａ、４７８−５３３番目にＵ−Ａ及び４８０−５３１番目にＵ−Ａ；（ｂ）４７２−５３７番目にＵ−Ａ、４８０−５３１番目にＵ−Ａ及び４８１−５３０番目にＵ−Ａ；（ｃ）４７２−５３７番目にＵ−Ａ、４８０−５３１番目にＵ−Ａ及び４８２−５２９番目にＡ−ＵのとおりＵ−Ａ塩基対を有する３型ポリオウイルスでもよい。 (57) [Summary] Suitable for vaccination against poliomyelitis, no UG or other base pairs in stem (a) or (b) of domain V in the 5 'non-coding region of the poliovirus genome. Attenuated poliovirus with no suitability. The attenuated poliovirus is within the 5 'non-coding region; (a) UA at positions 472-537, UA at positions 478-533 and UA at positions 480-531; (b) 472-537. UA at the 480th and 531st UA, and UA at the 481 and 530th; (c) UA at the 472-537th and UA and 482 and 529 at the 480-531th A type 3 poliovirus having UA base pairs as in AU may be used.

Description

【発明の詳細な説明】弱毒化ポリオウイルス発明背景１．発明の分野本発明は、弱毒化ポリオウイルス、その調製及びそれを含むワクチンに関する。より具体的には、本発明は定められた突然変異をウイルスゲノムに導入することにより弱毒化したポリオウイルスに関する。これらの突然変異は野生型ウイルスの毒性を弱毒化し、そして現存する弱毒化生ワクチンウイルス株を遺伝的に安定化し、よってそれらを毒性株に復帰させにくくする。２．先行技術の記載１９５０年代にＳａｂｉｎによって開発された弱毒化ポリオウイルス生ワクチンは全世界で広く使用されている。Ｓａｂｉｎ１型、２型及び３型として知られるポリオウイルスの３血清型それぞれに由来するワクチン株は、野生型ウイルスを培養細胞及び動物個体において、弱毒株が得られるまで継代することにより調製された。得られた弱毒化ウイルスは、原野生型株と比較してヒトにおいて灰白髄炎を発症させる能力が実質的に低い。弱毒化ウイルスは経口投与され腸において増殖し防御的免疫応答を誘導する。これらのワクチンは一般に安全であるとみなされているが、その使用は被接種者における低発生率の麻痺に関連がある。麻痺は、血清型２型及び３型において関連があることが多く１型においてはごくまれである。従って、安全性に優れる１型株に匹敵する２型及び３型の改良ワクチンが必要である。Ｓａｂｉｎワクチン株は本質的に経験的手法により開発された。その弱毒化の遺伝的根拠は完全には解明されていない。しかし、過去数年にわたり科学者達は、ワクチン株の神経毒性が弱毒化するメカニズムを解明する試みにおいて多数の分子生物学的手法を用いてきた。ほとんどの研究は血清型１型及び３型に集中している。両方のワクチン株について全核酸配列が神経毒性を持つそれぞれの前駆株と比較されてきた。１型ポリオウイルスの場合は、ワクチン株は７４４１塩基のゲノム中で４７ヶ所に前駆株と相違がある（Ｎｏｍｏｔｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７９，５７９３−５７９７，１９８２）。すべての相違は単純な点突然変異であり、その内２１ヶ所においてウイルスがコードするタンパク質にアミノ酸置換が生じている。数個の変異がワクチン株の弱毒表現型に寄与すると推測されるが、ゲノムの５’非コード領域内４８０番目のＡのＧへの変異にウイルスへの顕著な弱毒化効果があるという直接的な証拠が発表された。（Ｎｏｍｏｔｏら、ＵＣＬＡＳｙｍｐ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，ＮｅｗＳｅｒｉｅｓ，５４（ＥｄｓＭ．Ａ．ＢｒｉｎｔｏｎａｎｄＲ．Ｒ．Ｒｕｅｃｋｅｒｔ），４３７−４５２，ＮｅｗＹｏｒｋ：ＡｌａｎＲ．ＬｉｓｓＩｎｃ．，１９８７）。３型ポリオウイルスについての同様の研究により、ワクチン株と前駆株とにおいてゲノム７４３２塩基中にちょうど１０ヶ所の核酸配列の相違があることが明らかになった（Ｓｔａｎｗａｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１，１５３９−１５４３，１９８４）。このうち３ヶ所は、ウイルスにコードされているタンパク質にアミノ酸置換を生じさせる。本明細書では３型ポリオウイルスゲノムの５’非コード領域における塩基位置に１９８４年のＳｔａｎｗａｙらの番号付け法に従って番号を付ける。３型Ｓａｂｉｎワクチン株とその前駆株間で定められた組み換え体を構築することにより、どの突然変異が弱毒表現型に寄与しているかを同定できるようになった。それらの内の１ヶ所が２０３４番目の変異であり、これによりウイルスタンパク質ＶＰ３においてセリンがフェニルアラニンに置換される。他の興味深い突然変異は、ゲノム５’非コード領域内４７２番目のＣ（前駆株）からＵ（ワクチン株）への変異である。この４７２Ｕ突然変異は、ヒト腸内でのウイルス増殖時に前駆株（野生型）である４７２Ｃへ急速に復帰することが観察されている（Ｅｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ３１４，５４８−５５０，１９８５）。この復帰が神経毒性の増大に関連している。４７２番目のＣはまた、マウス／ヒト組み換えポリオウイルスのマウス脳における増殖に必須であることが明らかとなった（ＬａＭｏｎｉｃａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７，５１５−５２５，１９８６）。さらに最近、２型ポリオウイルスの４８１番目のＡもまたワクチン被接種者腸内でのウイルス増殖時にＧへ変異することが観察された（Ｍａｃａｄａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８１，４５１−４５８，１９９１）。３型ポリオウイルスＬｅｏｎ株ゲノムの５’非コード領域の２次構造モデルが既に提案されている（Ｓｋｉｎｎｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７，３７９−３９２，１９８９）。ドメインＶ（ヌクレオチド４７１−５３８）に関しては、４７１番目から４７３番目及び４７７番目から４８３番目の塩基はそれぞれ５３８番目から５３６番目及び５３４番目から５２８番目の塩基と以下の；４７１４７７４８３・・・ＵＣＣ・・・ＣＣＡＵＧＧＡ・・・・・・ＡＧＧ・・・ＧＧＵＧＣＣＵ・・・５３８５３４５２８とおり塩基対を形成している。便宜上、対合領域をステム（ａ）（４７１−４７３／５３８−５３６）及びステム（ｂ）（４７７−４８３／５３４−５２８）と定義する。４７２−５３７塩基対が逆転した、すなわち４７２Ｇ及び５３７Ｃである３型ポリオウイルスが弱毒化していることを以前我々は見出した。さらにこの弱毒化ウイルスは、４７２番目のＣのみがＧへ突然変異していて５３７番目については野生型と同じＧを保持している対応するポリオウイルスよりも若干低いＬＤ₅₀値を示す。ドメインＶのステム（ａ）又はステム（ｂ）中の塩基対が逆転している弱毒化ポリオウイルスは、ＥＰ−Ａ−０３８３４３３において開示されている。しかしながら、その後の実験により４７２−５３７塩基対が逆転している３型ポリオウイルスは３型Ｓａｂｉｎワクチン株と同程度には弱毒化していないことが示された。Ｓａｂｉｎワクチン株と実質的に同程度又はそれ以上に弱毒化されている（従って安全に使用できる）が、しかし遺伝的にはさらに安定である弱毒化ポリオウイルスを産生することがこの分野において課題として残されている。即ち、これらの弱毒化ポリオウイルスは、Ｓａｂｉｎワクチン株と同程度に弱毒化されることが可能であり、また野生型の神経毒性に復帰する危険性は低い。発明の概要今や、ポリオウイルスゲノム５’非コード領域内ドメインＶをさらに変異させることによりこの複数の性質の組み合わせが達成できることが見い出された。本発明の解決法は、ポリオウイルスゲノム５’非コード領域内ドメインＶのステム（ａ）又はステム（ｂ）においてＵ−Ｇ塩基対又は他の不適正塩基対を有しない弱毒化ポリオウイルスを提供することを含む。（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型塩基対から外れている塩基対を不適正塩基対とみなす。）ポリオウイルスは１型、２型又は３型ポリオウイルスであってよい。２型又は３型ポリオウイルスが好ましい。特に好ましくは、ポリオウイルスゲノムの５’非コード領域において４７２−５３７番目又は４８０−５３１番目あるいはその両方においてＵ−Ａ塩基対を有する３型弱毒化ポリオウイルスである。「弱毒化」とは、Ｓａｂｉｎワクチン株のそれぞれに関連する前駆株（各株には固有の前駆株がある）である野生型ポリオウイルスを鑑みて弱毒化されたものを意味する。総合的にウイルスは、安全に使用できる程度に充分に弱毒化されていなければならない。そのような安全性においての妥当な定義の１つが「ＷＨＯサル神経毒性試験」、世界保健機関（ＷＨＯ）：Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｆｏｒｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓｖａｃｃｉｎｅ（ｏｒａｌ）、ＷＨＯＴｅｃｈ．Ｒｅｐ．Ｓｅｒ．６８７，１０７−１７５，１９８３．である。図面の簡単な説明図１は、３型Ｓａｂｉｎ株ドメインＶ（ヌクレオチド４７１−５３８）ＲＮＡの推測される２次構造を示す（Ｓｋｉｎｎｅｒら、１９８９から改編）。矢印は３種のＳａｂｉｎワクチン株において見出された弱毒化の要因となるヌクレオチドの変異を示す（弱毒化の要因となる塩基は太字で、かっこ内に対応する血清型を示す）。５’非コード領域の長さが若干異なるためＳａｂｉｎ１におけるヌクレオチド４８０は図１においては４８３番目にあたり、Ｓａｂｉｎ２におけるヌクレオチド４８１は４８４番目にあたる。塩基対形成ステム領域は（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）と表示されている。図２は、各型ポリオウイルスについてＳａｂｉｎワクチン株ドメインＶのステム（ａ）及び（ｂ）の配列を示す。３型ポリオウイルスのドメインＶは４７１番目から５３８番目に延在する。２型又は１型ポリオウイルスのドメインＶは４６８番目から５３５番目に延在する。図３は、各型ポリオウイルスについてのＳａｂｉｎワクチン株ドメインＶのステム（ｃ）及び（ｄ）の配列を示す。図４から６は、４７２番目がＣに置換された点突然変異を有するＳａｂｉｎ３株（Ｓ３／４７２Ｃ）、Ｓａｂｉｎワクチン株（Ｓ３）並びに本発明のＳ１５及びＳ１６突然変異株、Ｓ３及びＳ１５及びＳ１６の継代する前の株並びに細胞において１−５代継代後の株（ｐ１−ｐ５）についての遺伝的安定性試験の結果を示す。継代後のウイルスは分析され、プラーク形成単位に基づくパラメーター( Ｙ軸)を、分析時温度（Ｘ軸）に対してプロットした。グラフは継代回数が増すと、温度非感受性表現型においてと同様に、温度感受性が失われることを示す。好ましい態様の記載本発明の弱毒化ポリオウイルスは改変されており、ドメインＶのステム（ａ）及び（ｂ）はＵ−Ｇ塩基対又は１型Ｓａｂｉｎワクチン株にあるＵ−Ｕ不適正塩基対のような他の不適正塩基対を含まない。好ましくはステム（ｃ）及び（ｄ）もまたＵ−Ｇ塩基対又は他の不適正塩基対を含まない。不適正塩基対である位置には、結果として得られるポリオウイルスが十分に弱毒化されるように選んだ代替の塩基対が提供された。弱毒化は前述のとおりであるか、又はより好ましくは、同じポリオウイルス型のＳａｂｉｎワクチン株と実質的に同程度の弱毒化である。好ましくは、Ｕ−Ａ塩基対がＵ−Ｇ塩基対又は不適正塩基対の替わりに存在する。従って好ましくはＵ−Ａ塩基対が、３型ポリオウイルスドメインＶの４７２ −５３７番目及び又は４８０−５３１番目、並びに２型ポリオウイルスの５２７ −４７８番目においてＵ−Ｇ塩基対の替わりに存在する（図２参照）。他の変異はドメインＶの熱力学的安定性を調整するために導入され、これにより前述の望むべき弱毒化が達成される。好ましくは、しかし必然ではなく、これらの突然変異はドメインＶのステム（ａ）、（ｂ），（ｃ）及び（ｄ）の内のどれか１つ又はそれ以上の中に含まれる。突然変異には、例えば塩基対の復帰及び／又は神経毒性のある野生型ポリオウイルスに存在するＣ−Ｇ塩基対をＵ−Ａ若しくはＡ−Ｕ塩基対で置換することが含まれても良い。従って、Ｕ−Ａ又はＡ− Ｕ塩基対が３型ポリオウイルスドメインＶの４７８−５３３番目及び／又は４８１−５３０番目及び／又は４８２−５２９番目に存在しても良い。本発明の好ましい３型ポリオウイルスは以下のＵ−Ａ塩基対：（ａ）４７２−５３７番目にＵ−Ａ若しくはＡ−Ｕ、４７８−５３３番目にＵ− Ａ、及び４８０−５３１番目にＵ−Ａ；（ｂ）４７２−５３７番目にＵ−Ａ若しくはＡ−Ｕ、４８０−５３１番目にＵ− Ａ、及び４８１−５３０番目にＵ−Ａ；又は、（ｃ）４７２−５３７番目にＵ−Ａ若しくはＡ−Ｕ、４８０−５３１番目にＵ− Ａ、及び４８２−５２９番目にＡ−Ｕを含む。他の突然変異によって弱毒化が進んでおり、そしてこれらの塩基対の組み合わせが野生型からさらに異なったものとなっているのであれば４７２−５３７番目が野生型塩基対のＣ−Ｇであることもできる。このようなウイルス例は３型の塩基位置において以下の変異：（ｄ）４７２−５３７番目にＣ−Ｇ、４７８−５３３番目にＵ−Ａ、４８０−５３１番目にＵ−Ａ、及び４８１−５３２番目にＵ−Ａ；（ｅ）４７２−５３７番目にＣ−Ｇ、４７８−５３３番目にＵ−Ａ、４８０−５３１番目にＣ−Ｇ、及び４８１−５３２番目にＵ−Ａを有する。好ましい１型及び２型ポリオウイルスは、対応する神経毒性野生型１型及び２型ポリオウイルスのステム（ａ）及び（ｂ）の塩基配列に由来しても良い。全ての株は好ましくはＳａｂｉｎ株である。本発明は、本発明の弱毒化ポリオウイルスを調製する方法であって（ｉ）ポリオウイルスゲノムＤＮＡコピーの、突然変異を導入しようとするある又はそれぞれの位置（ｔｈｅｏｒｅａｃｈｐｏｓｉｔｉｏｎ）を含むサブクローン領域に、部位特異的突然変異によりある又はそれぞれの目的とする変異（ｔｈｅｏｒｅａｃｈｄｅｓｉｒｅｄｍｕｔａｔｉｏｎ）を導入し；（ｉｉ）当該修飾領域を完全ＤＮＡコピーの当該領域が由来する部位に再導入し；そして（ｉｉｉ）取得された当該ＤＮＡコピーにより生きたウイルスを得ることを含む、前記方法を提供する。従って、ポリオウイルスのゲノムＲＮＡに対応するＤＮＡコピーに部位特異的突然変異を導入することにより、ポリオウイルス株、通常はＳａｂｉｎ株、に突然変異を導入することも可能である。このことは、ポリオウイルスゲノムの感染性ＤＮＡコピーの適当な領域を、例えばＭ１３のようなバクテリオファージの一本鎖ＤＮＡ中にサブクローニングすることにより達成されても良い。ある又はそれぞれの突然変異の導入後、修飾されたサブクローンＤＮＡコピーは、完全ＤＮＡコピーのそれが由来する部分に再導入される。生きたウイルスは、突然変異が導入された完全ＤＮＡコピーから、典型的にはＴ７プロモーターを用いたｉｎｖｉｔｒｏ直接転写（ＶａｎｄｅｒＷｅｒｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３，２３３０−２３３４，１９８６）を使用してプラス鎖ＲＮＡを産出することにより回収される。得られたＲＮＡを標準的な技術（Ｋｏｃｈ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６１：８９−１３８，１９７３）を用いる組織培養に使用してもよい。２−３日間培養後、ウイルスは組織培養の上清から回収することも可能である。修飾されたウイルスの神経毒性の程度及び弱毒化の程度は、標準的なマウスＬＤ₅₀試験又は前述のＷＨＯ推奨のサルにおけるワクチン安全性試験を用いて修飾前のウイルスと比較することも可能である。ドメインＶによる弱毒化は、ＢＧＭ細胞中（Ｍａｃａｄａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８１，４５１−４５８，１９９１）又はＬ２０Ｂ細胞中（ＣＭ−１細胞に関しての記載としてＭａｃａｄａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８９，４１５ −４２２，１９９２）においての温度感受性とほぼ相関するものとしても示された。改変されたウイルスの温度感受性を、期待される弱毒化レベルを把握するための予備的スクリーニングとして測定することも可能である。このことを、同じ細胞においてプラーク形成単位（ｐｆｕ）値が３５℃時に得られた値より１０の１乗（１．０ｌｏｇ₁₀）だけ減少した時の温度（Ｔ）を用いて表すことも可能である。好ましくはこの温度は対応するＳａｂｉｎ株の（同時測定の場合の）値と同一であるか又は差が０．２℃以内である。Ｔ値が低ければ低いほど弱毒化の程度は大きい。弱毒化ポリオウイルスは、生ワクチンとしても使用可能である。従って弱毒化ポリオウイルスを、医薬的に許容可能な担体又は希釈剤をさらに含む医薬用組成物として処方しても良い。生ワクチン製剤に慣用されるどの担体又は希釈剤を使用しても良い。例えば本弱毒化ポリオウイルスを１ＭＭｇＣｌ₂水溶液中で安定化し、そして３種の血清型の混合物として投与しても良い。従って、本弱毒化ポリオウイルスは、ヒト患者において灰白髄炎を予防するために使用することも可能である。この目的において本弱毒化ポリオウイルスは、経口、経鼻又は非経口例えば皮下若しくは筋肉注射により投与されても良い。慣用のＳａｂｉｎワクチン株の投与量、例えば１０⁴から１０⁶ＴＣＩＤ₅₀、に相当する量が処方されても良い。以下の実施例は本発明を例示する。実施例材料と方法細胞ＨＥｐ２Ｃ、ＢＧＭ及びＶｅｒｏ細胞はＭａｃａｄａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８１，４５１−４５８，１９９１に記載された方法で単層培養された。Ｌ２０Ｂ細胞（ヒトポリオウイルスレセプターを発現しているマウスＬ細胞）は、Ｐｉｐｋｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ４１，３３３−３４０，１９９３に記載された方法で培養された。ＭＲＣ−５細胞は、ＢＭＧ細胞と同様の培地中で単層培養された。ウイルスの継代２５ｃｍ²フラスコ中で単層培養されたＭＲＣ−５、Ｖｅｒｏ又はＬ２０Ｂ細胞にウイルスを感染多重度（ｍｏｉ）０．１又は１０で接種した。感染させた細胞層は、３３℃又は３７℃で抗生物質を含むが血清を含まない最少必須培地（ＭＥＭ）中において完全細胞変性効果（ｃｐｅ）が認められるまで培養された。フラスコは−７０℃凍結及び融解を３回行われ、細胞残渣は遠心分離により除かれた。上清は上記と同様のさらなる継代に用いられたか又は生物学的及び分子的分析に用いられた。温度感受性ＢＧＭ細胞はＭａｃａｄａｍら、１９９１．に記載された方法で温度感受性（ｔｓ）分析に使用された。Ｌ２０Ｂ細胞は、ＣＭ−１細胞用にＭａｃａｄａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８９，４１５−４２２，１９９２．に記載された方法でｔｓ分析に使用された。簡潔には、異なる温度においてウイルスのプラーク形成が分析された。接種されたプレートを、温度変動を＜０．０１℃に抑えた水浴中に沈めた密閉プラスチック容器中で培養し、コントロールとした。全てのウイルスについて少なくとも２回分析を行い、確認のために表現型既知であるコントロールウイルスを常に一緒に分析した。結果は、ｌｏｇ₁₀（３５℃時と比較したｐｆｕの減少分）を温度に対してグラフにプロットした。曲線が最も正確である部分は１．０ｌｏｇ₁₀減少するまでの最初の部分であり、得られた図は潜在的変異株が１／１０を越えるレベルで存在するのでなければそれによって影響を受ることはない。Ｌｅｏｎ／ＬａｎｓｉｎｇのゲノムバックグラウンドをもつウイルスはＢＭＧ細胞において分析された；Ｓａｂｉｎ３，Ｌｅｏｎ及びこれらのウイルスの突然変異株はＬ２０Ｂ細胞で分析された。それを超えるとドメインＶの安定性における多様性がウイルスの増殖に影響を与えるようになる温度範囲は、使用された基質細胞に依存し（Ｍａｃａｄａｍら、１９９１及び１９９２既引用）、Ｌ２０Ｂ細胞においてはＢＭＧ細胞においてよりも低い。Ｓａｂｉｎ３に関しては主要ｔｓ決定要素はＶＰ３９１にある（Ｍｉｎｏｒら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７０，１１１７−１１２３，１９８９）。これはＬ２０Ｂ細胞においてはドメインＶよりも高い温度において影響を与えるが、ＢＭＧ細胞においてはドメインＶとほとんど同じ温度において影響を与える。従って、ＶＰ３９１中の残基に影響されることなくドメインＶ内の突然変異の差異によりウイルスを識別することに、Ｌ２０Ｂ細胞においてのｔｓ測定を使用することも可能である。部位特異的突然変異体の構築と回収Ｌｅｏｎ／Ｌａｎｓｉｎｇの由来と、Ｌ３Ｌ２４７２−５３７ＵＧ及びＬ２Ｌ２４９２−５３７ＵＡの構築は既引用文献Ｍａｃａｄａｍら、１９９２に記載されている。表２に記載した全ての突然変異体も同様に構築された。簡潔には、Ｍ１３内のＬｅｏｎ５’−ＮＣＲのサブクローンを「Ｍｕｔａｇｅｎ」キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いる突然変異誘発の基質とした。適当な配列はＭｌｕＩ−ＳｓｔＩ（２７９−７５１）断片として全長クローンに再導入された。Ｌｅｏｎ及び３型ＳａｂｉｎのｃＤＮＡクローンの由来はＷｅｓｔｒｏｐら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３，１３３８−１３４４，１９８９に記載されている。突然変異体ＬｅｏｎＵ−Ａ及びＬｅｏｎＵ−Ｇは、関連するＬｅｏｎ／Ｌａｎｓｉｎｇ突然変異体及びＴ７／Ｌｅｏｎの全長クローンとで、部分ＳｓｔＩ／ＳａｌＩ断片を交換することにより構築された。表３の突然変異体は２段階で構築された。関連するＬｅｏｎ／Ｌａｎｓｉｎｇ突然変異体由来のＭｌｕＩ−ＳｓｔＩ断片を、ＭｌｕＩ（２７９）及びＳｓｔＩ（７５１及び１９００）で完全消化したＳａｂｉｎ３クローンのゲノムに連結した。Ｓａｂｉｎ３のゲノム中に２ヶ所のＳｓｔＩ部位が存在するため、得られるクローンはＳｓｔＩ−ＳｓｔＩ（７５１−１９００）領域を欠失している。感染性のある全長クローンはＳｓｔＩ／ＳｍａＩ（２７６８）による消化及びＳａｂｉｎ３クローンのＳｓｔＩ／ＳｍａＩ（７５１−２７６８）部分断片の挿入によって構築された。ウイルスは単層培養ＨＥｐ２Ｃに、＞２μｇのＴ７転写因子と共にトランスフェクションされ（ＶａｎｄｅｒＷｅｒｆら、既引用）、完全ｃｐｅが認められるまでの２４−４８時間３４℃で培養されることにより回収された。全突然変異体のヌクレオチド４５０−５５０の配列は、次くＲＮＡ抽出、及び逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって確認された。神経毒性ウイルスは、ウイルスあたりに使用した動物数を減じたこと以外は、既引用のワクチンの安全性に関する標準ＷＨＯ推奨試験（ＷＨＯ、１９８３）の方法で分析された。必要数の動物を使用して得られる結果と実質的に異ならないと推測される。結果初期検討ワクチン関連灰白髄炎症例から単離された３型Ｓａｂｉｎの神経毒性復帰株は、全てヌクレオチド４７２番目にＣを有している。ｉｎｖｉｖｏで単離された株において５７３番目のＧがＡに置換されていたものが観察されなかったことから、４７２−５３７番目のＵ−Ａ塩基対がＣ−Ｇ塩基対と比較してほとんど選択利益を与えてないことが推測される。４７２−５３７番目にＵ−Ａ塩基対を有する株がＣ−Ｇ塩基対を形成するためには２回の突然変異が必要である；その２回の突然変異は個々に塩基対を弱めるか又は解離させるであろうし、不利な選択を受けるだろう。従ってヌクレオチド５３７がＡであるＳａｂｉｎ３は、この領域のゲノムに関してワクチン株よりも遺伝的に安定だろう。しかしながら下記表１に示されるように（Ｌｅｏｎ−ＵＡ、Ｌｅｏｎ−ＵＧ）、本研究の結果からこのような株はＳａｂｉｎ３よりも弱毒化の程度が低いことが示された。 a Ｌ２０Ｂ細胞においてｐｆｕが３５℃時のｐｆｕと比較して１．０ｌｏｇ₁ ₀ 減少したときの温度（Ｔ）℃ b 麻痺発症動物数／全数 c 平均組織学的病変数 d Ｔ７／Ｌｅｏｎ結果、Ｗｅｓｔｒｏｐら、１９８９既引用Ｌｅｏｎ／Ｌａｎｓｉｎｇ株における弱毒化表現型従ってさらなる突然変異を有するウイルスを構築した。突然変異はＬｅｏｎ／Ｌａｎｓｉｎｇ（Ｌ３Ｌ２）ゲノムバックグラウンドに導入されたのでその温度感受性データを以前の研究（Ｍａｃａｄａｍら、１９９２）の値と比較することが可能である。構築された突然変異体とそのｔｓ表現型を表２に示す。４７２−５３７番目がＵ−Ａである突然変異体Ｌ１は、４７２−５３７番目がＣ−ＧであるＬｅｏｎ−Ｌａｎｓｉｎｇ及び４７２−５３７番目がＵ−Ｇである突然変異体Ｌ２の表現型の中間のｔｓ表現型を示した、これら全てはＬｅｏｎ− Ｌａｎｓｉｎｇゲノムバックグラウンドを有している。Ｌ３Ｌ２４７２−５３７Ｕ−Ａの本来Ｃ−Ｇである位置、４７８−５３３番目、４８１−５３０番目又は４８２−５２９番目にＵ−Ａ又はＡ−Ｕというさらなる突然変異を導入するとＴ値が大幅に減少した、すなわち温度感受性が増大した（突然変異体Ｌ１を突然変異体Ｌ５、Ｌ８及びＬ１０と比較した）。このことは過弱毒化という結果になるであろうと考えられた。Ｌ５，Ｌ８及びＬ１０株のヌクレオチド５３１に存在するＧをＡに置換するさらなる突然変異を導入することにより４８０−５３１番目のＵ−Ｇ塩基対をＵ− Ａ塩基対に変えた。結果として得られたウイルス（突然変異体Ｌ１４、Ｌ１５及びＬ１６）は、Ｌ３Ｌ２４７２−５３７ＵＧに非常に近いｔｓ表現型を示した。ｔｓと弱毒化に関連があるということから、これらの組み合わせの突然変異はＳａｂｉｎ３の弱毒表現型を有意に変えないことが見込まれる。＊ＢＧＭ細胞においてｐｆｕが３５℃時のｐｆｕと比較して１．０ｌｏｇ₁₀減少したときの温度（Ｔ）℃Ｓａｂｉｎ株における弱毒表現型突然変異体Ｌ１４、Ｌ１５及びＬ１６のドメインＶへの突然変異は、Ｓａｂｉｎ３のゲノムバックグラウンドに導入され、そしてウイルスのＬ２０Ｂ細胞において温度感受性が分析された。これらの株（突然変異体Ｓ１４、Ｓ１５及びＳ１６）のｔｓ表現型はＳａｂｉｎ３のものに近かったがＳ１４は、Ｓａｂｉｎ３より若干温度感受性が強かった（表３）。突然変異体Ｓ１５及びＳ１６についてもサルにおいて神経毒性が測定され、結果を２セットのクローン化Ｓａｂｉｎ３株（「Ｔ７／Ｓａｂｉｎ３」）と共に表３に示す、１セットは同時に行った測定、他方は現在までにこのウイルスについて行われた全神経毒性試験からの値である。Ｓ１５株の弱毒表現型はＴ７／Ｓａｂｉｎ３の表現型とほとんど異ならなかった。どのウイルスにおいても麻痺を発症した動物はなかった。Ｓ１５株の平均病変数はＴ７／Ｓａｂｉｎ３の全試験の値よりは高かったが本試験においての値とほとんど同じだった。Ｓ１６株はＴ７／Ｓａｂｉｎ３よりも若干強く弱毒化されているようだった。これらの結果を初期前提とすると、Ｓ１５株及びＳ１６株の両方が既引用のＷＨＯサル神経毒性試験に合格するだろう。Ｓａｂｉｎ３よりさらにｔｓであるＳ１４株も合格するだろう。Ｌ２０Ｂ細胞においてのＳ１５及びＳ１６の繰り返し継代は神経毒性が復帰しないことを表している。遺伝的安定性現行の３型ポリオウイルスワクチン株はヒト腸内で急速に復帰し、そしてワクチン被接種者及びその接触者における低程度の麻痺性灰白髄膜炎に関連している。ヒト消化管内での増殖中においてこれらの株とＳａｂｉｎ３の安定性を比較することはできないので細胞培養モデルが求められた。ヌクレオチド４７２において急速に復帰がおきた条件は、ヒト腸内での疑似選択圧を推定したものだった。培養細胞中におけるＳａｂｉｎ３株継代時のヌクレオチド４７２のＵからＣへの復帰は、温度及び細胞依存性であり、３７℃、Ｌ２０Ｂ細胞での増殖はこの復帰を厳しく選択することが明らかになった。Ｔ７／Ｓａｂｉｎ３及びＳ１５株及びＳ１６株は、感染多重度（ｍｏｉ）１０で３７℃においてＬ２０Ｂ細胞で５代継代された。すべての継代時試料について温度感受性をＬ２０Ｂ細胞中で測定し、５代継代試料については神経毒性を測定した。さらに、ウイルスＲＮＡを抽出してＲＴ−ＰＣＲ後にドメインＶ内の配列分析を行った。配列分析とＭＡＰＲＥＣ（ポリメラーゼ連鎖反応と制限酵素切断による突然変異体分析）測定（Ｌｕら、ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌ．３，１７６−１８０（１９９３））により、３代継代までにＳａｂｉｎ３ウイルス数の５０％以上においてヌクレオチド４７２が野生株表現型のＣに復帰し、５代継代までにほぼ１００％においてヌクレオチド４７２がＣに復帰することが示された。これらのウイルスのドメンインＶにおいて他のヌクレオチドの変異は認められなかった。５代継代後のＳ１５株又はＳ１６株のドメインＶにおいてはヌクレオチドの変異は認められなかった。温度感受性測定においては、プラーク形成及び４７２番目がＣであるウイルスと４７２番目がＵであるウイルスを識別することができることから、Ｓａｂｉｎ３のｔｓ表現型は継代中にＵからＣへの変異と並行して急速に失われることが見い出された（図４）。特に、３代継代後ウイルスは５代継代後又は完全復帰ウイルス（Ｓ３／４７２Ｃ）よりも若干温度感受性があるにすぎなかった。対照的にＳ１５株及びＳ１６株のｔｓ表現型はそれよりもかなり安定だった（図５及び６）。これら両株において、ドメインＶ以外での突然変異によるものである継代中の温度感受性の漸減が発生した。神経毒性試験においては、臨床的影響のあった動物数及び組織学的病変数で示されるとおり、Ｓａｂｉｎ３の５代継代後試料はＳａｂｉｎ３ワクチン株よりも顕著に毒性であったが、一方Ｓ１５株及びＳ１６株の５代継代後試料は原試料及びＳａｂｉｎ３ワクチン株と同程度の弱毒性だった（表３）。従って、Ｓ１５株及びＳ１６株において、継代中に発生した突然変異によって毒性が増大することはなかった。従ってＳａｂｉｎ３の神経毒性変異株が急速に選択されるような条件下においても、Ｓ１５株及びＳ１６株の弱毒表現型は安定だった。これらの結果はＳ１５株及びＳ１６株が新しいワクチン株候補であると考えるに非常に適切な表現型を保持していることを表している。a ＢＧＭ細胞においてｐｆｕが３５℃時のｐｆｕと比較して１．０ｌｏｇ₁₀ 減少したときの温度（Ｔ）℃ b 麻痺発症動物数／全数 c 平均組織学的病変数DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Attenuated poliovirus Background of the Invention 1. Field of the invention The present invention relates to attenuated poliovirus, its preparation and vaccines containing it . More specifically, the present invention introduces defined mutations into the viral genome. And attenuated poliovirus. These mutations are wild-type Attenuates the toxicity of the virus and genetically reduces the existing live attenuated vaccine virus strain. And thus make it difficult to revert them to virulent strains.2. Description of prior art A live attenuated poliovirus vaccine developed by Sabin in the 1950's Is widely used worldwide. Known as Sabin type 1, type 2 and type 3 Vaccine strains derived from each of the three serotypes of poliovirus In cultured cells and animal individuals by subculturing until an attenuated strain is obtained. Was made. The resulting attenuated virus is gray in humans compared to the original wild-type strain. Substantially low ability to develop myelitis. Attenuated virus administered orally and intestines Proliferate and induce a protective immune response. These vaccines are generally considered safe, but their use is Is associated with a low incidence of paralysis in the elderly. Paralysis in serotypes 2 and 3 It is often related and very rare in type 1. Therefore, it is excellent in safety There is a need for improved type 2 and 3 vaccines comparable to type 1 strains. The Sabin vaccine strain was developed essentially by an empirical approach. Its attenuated The genetic basis has not been fully elucidated. But over the past few years, scientists In a number of attempts to elucidate the mechanisms by which vaccine strains attenuate neurotoxicity, Molecular biology techniques have been used. Most studies focus on serotypes 1 and 3 ing. Individual precursors whose entire nucleic acid sequence is neurotoxic for both vaccine strains stock Has been compared to In the case of type 1 poliovirus, the vaccine strain has 47 strains in the genome of 7441 bases. Where there is a difference from the precursor strain (Nomoto et al., Proc. Natl. Acad. S. ci. ScL USA 79, 5793-5797, 1982). All differences are simple A point mutation, of which 21 An amino acid substitution has occurred. Several mutations contribute to the attenuated phenotype of vaccine strains It is speculated that mutation of A to G at position 480 in the 5 'non-coding region of the genome is Direct evidence has been published that there is a significant attenuating effect on Rus. (Nomo to et al., UCLA Symp. Mol. Cell. Biol. , New Ser ies, 54 (Eds MA Brinton and RR Rueck) ert), 437-452, New York: Alan R.S. Less In c. , 1987). Similar studies on type 3 poliovirus have shown that vaccine and progenitor strains It is clear that there are exactly 10 nucleic acid sequence differences in 7432 bases in the genome. (Stanway et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. SA 81, 1539-1543, 1984). Three of these are viruses Making amino acid substitutions in the encoded protein. In this specification, type 3 The base position in the 5 'non-coding region of the riovirus genome is sta Numbering is performed according to the numbering method of nway et al. Construct a defined recombinant between a type 3 Sabin vaccine strain and its precursor Can identify which mutations contribute to the attenuated phenotype. Was. One of them was the 2034th mutation, which Serine is replaced by phenylalanine in protein VP3. Another interesting mutation is C at position 472 (precursor strain) in the 5 'non-coding region of the genome. ) To U (vaccine strain). This 472U mutation is Rapidly reverted to 472C, a precursor strain (wild type), when the virus multiplied. (Evans et al., Nature 314, 548-550, 198). 5). This reversion is associated with increased neurotoxicity. The 472nd C is also And human recombinant poliovirus are essential for growth in mouse brain Karato (La Monica et al., J. Virol. 57, 515-525, 19). 86). More recently, the 481st A of type 2 poliovirus was also vaccinated. It was observed that the virus mutated to G when the virus was propagated in the intestine (Macadam). Et al., Virology 181, 451-458, 1991). The secondary structural model of the 5 'non-coding region of the poliovirus type 3 Leon strain genome is It has already been proposed (Skinner et al., J. Mol. Biol. 207, 37). 9-392, 1989). Regarding domain V (nucleotides 471-538) Means that the bases 471 to 473 and 477 to 483 are respectively The bases 538 to 536 and 534 to 528 and the following; 471 477 483 ... UCC ... CCAUGGA ... ... AGG ... GGUGCCU ... 538 534 528 As shown in FIG. For convenience, the mating region is defined as stem (a) (471-473 / 538-536) and stem (a). System (b) (477-483 / 534-528). 472-537 salt Poliovirus type 3 with reversed base pairs, ie, 472G and 537C, is weak Earlier we found that it was poisoning. In addition, the attenuated virus has 472 Only the Cth is mutated to G, and the 537th keeps the same G as the wild type. LD slightly lower than the corresponding poliovirus₅₀Indicates a value. Domain V Attenuated polyoil whose base pairs in stem (a) or stem (b) are reversed Is disclosed in EP-A-0383433. However, that In a later experiment, type 3 poliovirus in which 472-537 base pairs are reversed is type 3 It was shown not to be as attenuated as the Sabin vaccine strain. Attenuated to substantially the same extent or higher than the Sabin vaccine strain ( Attenuated polio which is safer, but more genetically stable Producing ils remains a challenge in this field. That is, this These attenuated polioviruses can be as attenuated as the Sabin vaccine strain. And the risk of reverting to wild-type neurotoxicity is low.Summary of the Invention Now, domain V in the 5 'non-coding region of the poliovirus genome is further mutated. It has been found that the combination of these properties can be achieved by the above. Book The solution of the invention comprises the stem of domain V in the 5 'non-coding region of the poliovirus genome. No UG base pairs or other mismatched base pairs in (a) or stem (b) Providing an attenuated poliovirus. (Watson-Crick type salt Base pairs that deviate from the base pair are regarded as inappropriate base pairs. ) Poliovirus type 1 It may be a type 2 or 3 poliovirus. Type 2 or 3 poliovirus is preferred New Particularly preferably, 47% in the 5 'non-coding region of the poliovirus genome. UA base pair at position 2-537 or position 480-531 or both Is a type 3 attenuated poliovirus having "Attenuation" means Sabin Wakuchi Wild-type, which is a precursor strain associated with each of the strains (each strain has its own precursor strain) Means attenuated in view of poliovirus. Overall, the virus is cheap Must be sufficiently attenuated to be fully usable. Such safety One of the valid definitions of gender is the WHO Monkey Neurotoxicity Test, a World Health Organization ( WHO): Requirements for poliomyelitis vaccine (oral), WHO Tech. Rep. Ser. 687, 1 07-175, 1983. It is.BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1. Type 3 Sabin strain domain V (nucleotides 471-538) RNA. (Indicated by Skinner et al., 1989). Arrow Nucleotides contributing to attenuation found in three Sabin vaccine strains (The bases that cause attenuation are in bold, and the corresponding serotype is shown in parentheses.) Is shown). Since the length of the 5 'non-coding region is slightly different, Leotide 480 corresponds to position 483 in FIG. Cletide 481 is the 484th. The base pairing stem regions are (a), (b) ), (C) and (d). Figure 2. Stein of Sabin vaccine strain domain V for each type of poliovirus. 2 shows the sequences of the programs (a) and (b). Domain V of type 3 poliovirus is number 471 It extends 538th from the eye. Domain V of type 2 or type 1 poliovirus is 46 It extends from the eighth to the 535th. FIG. 3 shows the Sabin vaccine strain domain V scan for each type of poliovirus. 2 shows the sequences of tems (c) and (d). Figures 4 to 6 show Sabin3 with a point mutation in which the 472th was replaced by a C. Strain (S3 / 472C), Sabin vaccine strain (S3) and S15 and S15 of the present invention. And S16 mutant strains, strains and cells before passage of S3 and S15 and S16 The results of the genetic stability test on the strain (p1-p5) after passage 1-5 Show. The virus after passage is analyzed and parameters based on plaque forming units ( Y-axis) was plotted against temperature at analysis (X-axis). Graphs increase passage times Indicates that temperature sensitivity is lost, as in the temperature-insensitive phenotype.Description of the preferred embodiment The attenuated poliovirus of the invention is modified and comprises the stem of domain V (a) And (b) U-U mismatched salts in UG base pair or type 1 Sabin vaccine strain Does not include other mismatched base pairs, such as base pairs. Preferably stems (c) and (d) Also do not contain UG base pairs or other mismatched base pairs. Positions that are incorrect base pairs Some choices were made to ensure that the resulting poliovirus was sufficiently attenuated. Alternate base pairs were provided. The attenuation is as described above, or more preferably Are substantially as attenuated as Sabin vaccine strains of the same poliovirus type. You. Preferably, UA base pairs are present instead of UG base pairs or mismatched base pairs. You. Thus, preferably, the UA base pair is 472 of poliovirus domain V type 3. -537 and / or 480-531, and 527 of type 2 poliovirus At position -478, it is present instead of UG base pair (see FIG. 2). Other mutations have been introduced to modulate the thermodynamic stability of domain V, The desired attenuation described above is achieved. Preferably, but not necessarily, this These mutations were found in any of stems (a), (b), (c) and (d) of domain V. Included in one or more of them. Mutations include, for example, base pair reversion and CG base pairs present in wild-type poliovirus with neurotoxicity Alternatively, substitution with AU base pairs may be included. Therefore, UA or A- U base pair is 478-533 and / or 48 of type 3 poliovirus domain V It may be present at the 1-530th and / or 482-529th. Preferred of the present invention A new type 3 poliovirus has the following UA base pairs: (A) UA or AU at 472-537th, U- at 478-533th A, and 480-531 UA; (B) UA or AU at 472-537th, U- at 480-531th A, and UA at positions 481-530; or (C) UA or AU at 472-537th, U- at 480-531th A, and A-U at 482-529 including. Other mutations are attenuating, and these base pair combinations If the set is even more different from the wild type, 472-537 Can be wild-type base pair CG. Examples of such viruses are type 3 salts The following mutations at the base position: (D) CG at 472-537th position, UA at 478-533th position, 480-5 UA at position 31 and UA at position 481-532; (E) CG at 472-537th, UA at 478-533th, 480-5 CG at 31st and UA at 481-532th Having. Preferred type 1 and 2 polioviruses are the corresponding neurotoxic wild type 1 and 2 It may be derived from the nucleotide sequences of stems (a) and (b) of type poliovirus. all Is preferably a Sabin strain. The present invention provides a method for preparing the attenuated poliovirus of the present invention, (I) an attempt to introduce a mutation in a poliovirus genomic DNA copy Or a sub that includes the or each position Mutations in the cloned region due to site-specific mutations or the respective mutations of interest (The or each desired mutation); (Ii) reintroducing the modified region into the site of the complete DNA copy from which the region is derived ; And (Iii) obtaining a live virus from the obtained DNA copy. , Wherein the method is provided. Thus, site-specific DNA copies corresponding to poliovirus genomic RNA By introducing the mutation, a poliovirus strain, usually a Sabin strain, is suddenly introduced. It is also possible to introduce mutations. This means that the poliovirus genome An appropriate region of the sex DNA copy is ligated to a bacteriophage such as M13. It may be achieved by subcloning into a single-stranded DNA. Modified subclone DNA copy after introduction of one or each mutation Is reintroduced into the portion of the complete DNA copy from which it was derived. Live virus From the mutated complete DNA copy, the T7 promoter is typically In vitro direct transcription used (Van der Werf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 2330-2334, 1986) To produce positive stranded RNA. The resulting RNA was prepared using standard techniques (Koch, Curr. Top. Microb). iol. Immunol. 61: 89-138, 1973). May be used. After 2-3 days of culture, the virus can be recovered from the tissue culture supernatant. Both are possible. The degree of neurotoxicity and attenuation of the modified virus is Standard mouse LD₅₀Studies or vaccine safety studies in WHO-recommended monkeys as described above It is also possible to compare with the virus before modification using experiments. Attenuation by domain V was detected in BGM cells (Macadam et al., Virolo gy 181, 451-458, 1991) or in L20B cells (CM-1 cells) As described by Macadam et al., Virology 189,415. -422, 1992). Was. Determine the temperature sensitivity of the modified virus to determine the expected level of attenuation. It can also be measured as a preliminary screening. This is the same The plaque forming unit (pfu) value in the cells was 10% lower than the value obtained at 35 ° C. 1st power (1.0 log_Ten) Can also be expressed using the temperature (T) at the time of the decrease It is. Preferably, this temperature is the value of the corresponding Sabin strain (for simultaneous measurements) Or the difference is within 0.2 ° C. The lower the T value, the more attenuated The degree is large. Attenuated poliovirus can also be used as a live vaccine. Therefore attenuated A pharmaceutical composition further comprising a poliovirus, a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. It may be prescribed as a product. Use any carrier or diluent commonly used for live vaccine formulations. May be used. For example, the attenuated poliovirus is 1M MgCl_TwoCheap in aqueous solution And may be administered as a mixture of the three serotypes. Therefore, the attenuated poliovirus has been shown to prevent poliomyelitis in human patients. It can also be used for For this purpose, the attenuated poliovirus It may be administered orally, nasally or parenterally, for example, by subcutaneous or intramuscular injection. Custom Dose of Sabin vaccine strain for use, for example 10^FourFrom 10⁶TCID₅₀, Equivalent to An amount may be prescribed. The following examples illustrate the invention.Example Materials and methods cell HEp2C, BGM and Vero cells are described in Macadam et al., Virology. 181, 451-458, 1991. L2 OB cells (mouse L cells expressing human poliovirus receptor) ipkin et al. Virol. Methods 41,333-340,19 The cells were cultured by the method described in No. 93. MRC-5 cells are cultured in the same manner as BMG cells. Monolayer culture was performed in the ground.Passage of virus 25cm^TwoMRC-5, Vero or L20B cells cultured monolayer in flask Vesicles were inoculated with virus at a multiplicity of infection (moi) of 0.1 or 10. Infected thin The alveolar layer was obtained at 33 ° C. or 37 ° C. with minimal essential medium (M) containing antibiotics but no serum. The cells were cultured until a complete cytopathic effect (cpe) was observed in (EM). H Lasco was frozen and thawed three times at -70 ° C, and cell debris was removed by centrifugation. Was. Supernatants were used for further passages as described above or used for biological and molecular analysis. Used for analysis.Temperature sensitivity BGM cells are described in Macadam et al., 1991. Temperature sensitivity by the method described in ( ts) Used for analysis. L20B cells were purchased from Macadam et al. For CM-1 cells. Virology 189, 415-422, 1992. In the manner described in Used for ts analysis. Briefly, viral plaque formation at different temperatures Was analyzed. Place the inoculated plate in a water bath with temperature fluctuations <0.01 ° C The cells were cultured in a closed plastic container immersed in a dish to serve as a control. All will Analysis at least twice and confirm that the control is Virus was always analyzed together. The result is log_Ten(Decrease in pfu compared to 35 ° C.) versus temperature Plotted. The part where the curve is most accurate is 1.0 log_TenUntil it decreases The figure shows that potential mutants are present at levels exceeding 1/10. If not, it is not affected by it. The virus with a genomic background of Leon / Lansing is BMG Analyzed in cells; Sabin3, Leon and sudden of these viruses Mutants were analyzed in L20B cells. Beyond that, in the stability of domain V The temperature range over which the diversity affects virus growth depends on the substrate used. Dependent on cytoplasmic cells (Macadam et al., 1991 and 1992, cited above), L20 It is lower in B cells than in BMG cells. Major for Sabin3 The ts determinant is in VP3 91 (Minor et al., J. Gen. Virol. 70, 1117-1123, 1989). This is the domain in L20B cells. Effect at higher temperatures than domain V, but in BMG cells domain V Affects at almost the same temperature. Thus, residues in VP391 are shadowed. Identifying viruses by mutational differences in domain V without being affected Alternatively, it is also possible to use the ts measurement in L20B cells.Construction and recovery of site-specific mutants Origin of Leon / Lansing and L3L2 472-537 UG and L The construction of 2L2 492-537 UA is described in the previously cited reference Macadam et al., 1992. It is described in. All mutants described in Table 2 were constructed similarly. Concise The subclones of Leon5'-NCR in M13 were (Bio-Rad) as a substrate for mutagenesis. A suitable sequence is Ml It was reintroduced into the full-length clone as a uI-SstI (279-751) fragment. The origin of the Leon and type 3 Sabin cDNA clones is described in Westrop et al. J. Virol. 63, 1338-1344, 1989. suddenly Mutants Leon UA and UG have the related Leon / Lans ing mutant and the full-length T7 / Leon clone, the partial SstI / Sa It was constructed by exchanging the 11 fragment. The mutants in Table 3 were constructed in two steps. Was. MluI-SstI from related Leon / Lansing mutant The fragment was completely digested with MluI (279) and SstI (751 and 1900). To the genome of the Sabin3 clone. Two places in the Sabin3 genome The resulting clone was SstI-SstI (75 1-1900) region. The infectious full-length clone was SstI / S digestion with mal (2768) and SstI / Smal of Sabin3 clone (751-2768) was constructed by insertion of a partial fragment. The virus was transfected into monolayer HEp2C with> 2 μg of the T7 transcription factor. (Van der Werf et al., Cited above), and a complete cpe is recognized. The cells were collected by culturing at 34 ° C. for 24-48 hours until they were removed. All sudden change The sequence of the variant nucleotides 450-550 can then be extracted from RNA, and reverse transcribed. It was confirmed by the remerase chain reaction (RT-PCR).Neurotoxicity The virus was previously cited except that the number of animals used per virus was reduced. Determined by standard WHO recommendations for vaccine safety (WHO, 1983). Was analyzed. Speculated not to be substantially different from results obtained using the required number of animals It is.result Initial consideration A neurotoxic revertant of type 3 Sabin isolated from a case of vaccine-associated gray medulla inflammation , All have a C at nucleotide 472. Isolated in vivo Did not observe that the 573rd G was replaced with A in the strain? Et al., That the UA base pair at positions 472-537 is almost selected as compared to the CG base pair. It is presumed that no benefit is given. Has a UA base pair at position 472-537 Two mutations are required for a strain to form a CG base pair; Mutations will individually weaken or dissociate base pairs, leading to disadvantageous selection. Will receive. Thus, Sabin3, in which nucleotide 537 is A, Will be more genetically stable than vaccine strains in terms of their genome. However, Table 1 below As shown in (Leon-UA, Leon-UG), from the results of this study, Such strains were shown to be less attenuated than Sabin3. a In L20B cells, pfu was 1.0 log compared to pfu at 35 ° C.₁ ₀ Temperature at the time of decrease (T) ℃ b Number of animals with paralysis / Total number c Average number of histological lesions d T7 / Leon results, Westrop et al., 1989, cited.Attenuated phenotype in Leon / Lansing strains Therefore, viruses with additional mutations were constructed. The mutation is Leon / Lansing (L3L2) temperature as introduced into genomic background Comparing susceptibility data with values from previous studies (Macadam et al., 1992) Is possible. The mutants constructed and their ts phenotypes are shown in Table 2. Mutant L1 in which 472-537 is UA is 472-537. Leon-Lancing which is CG and 472-537th are UG It showed a ts phenotype intermediate to that of mutant L2, all of which were Leon- Has a Lansing genomic background. L3L2 472-53 7 U-A positions that are originally CG, 478-533rd, 481-530th Or introducing an additional mutation UA or AU at positions 482-529 And the T value were significantly reduced, ie, the temperature sensitivity was increased (mutant L1 But compared to mutants L5, L8 and L10). This has the consequence of being over-attenuated It was thought to be. Substitution of G at nucleotide 531 of strains L5, L8 and L10 with A 480-531 UG base pair by introducing a mutation Changed to A base pairs. The resulting viruses (mutants L14, L15 and And L16) show a ts phenotype very close to L3L2 472-537 UG. Was. Mutations in these combinations because of their association with ts and attenuation Does not significantly alter the attenuated phenotype of Sabin3.* In BGM cells, pfu is 1.0 log compared to pfu at 35 ° C._TenDecrease Temperature at the time of (T) ℃Attenuated phenotype in Sabin strain Mutations of the mutants L14, L15 and L16 to domain V were made by Sabi n3 genomic background and introduced into viral L20B cells. And temperature sensitivity was analyzed. These strains (mutants S14, S15 and S1 The ts phenotype of 6) was close to that of Sabin3, but S14 was It was slightly more temperature sensitive (Table 3). Mutants S15 and S16 also Neurotoxicity was measured in monkeys and the results were compared to two sets of cloned Sabin3 strains. ("T7 / Sabin3"), as shown in Table 3, one set of measurements performed simultaneously, The other is from all neurotoxicity tests performed on this virus to date . The attenuated phenotype of the S15 strain is almost identical to the T7 / Sabin3 phenotype Was. No animal developed paralysis of any of the viruses. Average disease of S15 strain The variable was higher than the value of all tests of T7 / Sabin3, but was different from the value in this test. Almost the same. S16 strain is slightly more attenuated than T7 / Sabin3 It seemed to be. Assuming these results as initial assumptions, the strains S15 and S16 Both will pass the cited WHO monkey neurotoxicity test. More than Sabin3 In addition, the ts S14 shares will also pass. Repeated passage of S15 and S16 in L20B cells restored neurotoxicity It means that there is no.Genetic stability Current poliovirus type 3 vaccine strains rapidly revert in the human intestine, and Associated with low-grade paralytic gray meningitis in chin recipients and their contacts . Compare the stability of these strains with Sabin3 during growth in the human gastrointestinal tract As a result, a cell culture model was sought. At nucleotide 472 The condition of rapid return was an estimate of pseudoselective pressure in the human intestine. Conversion of nucleotide 472 from U to C during passage of Sabin 3 strain in cultured cells Reversion is temperature and cell dependent, and growth at 37 ° C. in L20B cells It became clear to choose strictly. T7 / Sabin3 and S15 and S16 strains have a multiplicity of infection (moi) of 10 For 5 passages at 37 ° C. in L20B cells. For all samples at passage Measure temperature sensitivity in L20B cells and measure neurotoxicity for 5 passage samples did. Furthermore, after extracting the viral RNA and performing RT-PCR, Analysis was carried out. Sequence analysis and MAPREC (polymerase chain reaction and restriction enzyme cleavage) Mutant Analysis by) (Lu et al., PCR Methods Appl. 3) 176-180 (1993)) by the third passage. In more than 50% of the numbers, nucleotide 472 reverted to wild-type phenotype C and Nucleotide 472 is shown to revert to C in almost 100% by passage. Was. Mutations of other nucleotides were observed in domain V of these viruses. I couldn't. In the domain V of the S15 or S16 strain after 5 passages, No leotide mutations were found. Plaque formation in temperature sensitivity measurements And the virus whose 472nd is C and the virus whose 472nd is U As a result, the Sabin3 ts phenotype was mutated from U to C during passage. And rapidly lost in parallel (Fig. 4). Especially after 3 generations Ruth is more temperature sensitive than after 5 passages or completely reverted virus (S3 / 472C) It was just a thing. In contrast, the ts phenotype of strains S15 and S16 Was also quite stable (FIGS. 5 and 6). In both these strains, except for domain V A gradual decrease in temperature sensitivity during the passage, which was due to mutations in. Neurotoxicity test As indicated by the number of animals with clinical effects and the number of histological lesions The sample after 5 passages of Sabin3 is significantly more toxic than the Sabin3 vaccine strain. On the other hand, the sample after 5 passages of the S15 strain and the S16 strain was the original sample and Sabin. It was as virulent as the three vaccine strains (Table 3). Therefore, the S15 strain and the S16 strain Did not increase toxicity by mutations that occurred during the passage. Thus, under conditions where a neurotoxic mutant of Sabin3 is rapidly selected. Also, the attenuated phenotype of the S15 strain and the S16 strain was stable. These results are from S15 strain And S16 maintain a phenotype that is very relevant to be considered a new vaccine strain candidate. It represents that you have.a In BGM cells, pfu was 1.0 log compared to pfu at 35 ° C._Ten Temperature at the time of decrease (T) ℃ b Number of animals with paralysis / Total number c Average number of histological lesions

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者アーモンド，ジェフリー・ウィリアムイギリス国リーディングアールジー４・９エイエイチ，チャルクハウス・グリーン，グリーンバンク────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (72) Inventor Almond, Jeffrey William UK Leading Earl G 9H, Charkhouse Glee Green Bank

Claims

[Claims] 1. In the stem (a) or (b) of domain V in the 5 'non-coding region of the genome No base pair mismatch, sufficient to pass WHO monkey neurotoxicity test (1983) Attenuated to a greater extent than the corresponding Sabin strain for reversal of neurotoxicity. A more stable, attenuated poliovirus. 2. 2. The method of claim 1, wherein the strain has substantially the same attenuation as the corresponding Sabin strain. Poliovirus. No base pairing in stem (a) or (b) of domain V in the 3.5 'non-coding region Without appropriateness, in type 3 472-537 of domain V in the 5 'non-coding region The UA base pair at position 469-534 in the 1st or 1st or 2nd type And attenuated enough to pass the WHO monkey neurotoxicity test (1983) , Attenuated poliovirus. 4.3, the 480-531st UA of domain V in the 5 'non-coding region The poliovirus according to claim 1, 2 or 3, wherein base pairs are present. 5. U-A base pairs exist at positions 472-537 and 480-531. The poliovirus according to claim 4. 6.3 poliovirus, with UA base pairs in domain V in the 5 'non-coding region But; (A) The 472-537th is UA, the 478-533th is UA and 480- 531th is UA; (B) 472-537th are UA, 480-531th are UA and 481- 530th is UA; (C) 472-537th is UA, 480-531th is UA and 482- 529th is AU The poliovirus according to claim 1, which is present as described above. 7. The polio according to any one of claims 1 to 6, which is used for a vaccine. Ils. 8. An attenuated poliovirus and a medicament as defined in any one of claims 1 to 6. A vaccine comprising a chemically acceptable carrier or diluent.