JP2001518312A - 血圧調節およびｉｉｉ型バーター症候群を診断する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＣＬＣＮＫＢ遺伝子およびそれがコードするタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法を開示する。本発明は、高血圧、異常な体液量や鬱血性心不全に関与する症状、およびそれらに関与する症状を治療するそのような薬剤の使用にも関連する。また、患者がＣＬＣＮＫＢ遺伝子の突然変異またはそれがコードするタンパク質によって病気にかかっているのか、あるいはそれを保有するのかを判定する組成および方法も提供する。本発明は、さらに、ＩＩＩ型バーター症候群を起こす、ＣＬＣＮＫＢ遺伝子の特異的な突然変異した核酸配列にも関係する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、塩と体液保持に影響を及ぼすことにより血圧を調節する分野に関連
する。本発明は、ＩＩＩ型バーター症候群の患者を診断する分野にも関連する。
さらに具体的には、本発明は、個人が、腎臓の塩素イオン輸送に関与する欠陥或
いは欠失タンパク質をコードするＣＬＣＮＫＢ遺伝子中の変異（突然変異）によ
って病気にかかっているのか、あるいはそれを保有するのかを判定する組成およ
び方法を提供する。

【０００２】

【従来の技術】

高等真核生物において、適当なイオン組成と血管内容量の維持は、正常な神
経筋の機能および組織への酸素と養分の輸送に重要である。腎臓は、体液と電解
質バランスの長期セットポイントを決定し、様々な環境変化にかかわらずホメオ
スタシスを維持する上で主要な役割を果たす。腎臓のこれらの機能における機能
障害は、血圧の調節から血管内容量の変化にわたる、電解質ホメオスタシスの異
常によって生じる臨床上の様々な疾患の原因らしい。体液と電解質ホメオスタシ
スのメンデル異常を調べることにより、この過程を支配する基礎的なメカニズム
を詳しく調べる機会が得られる。この試みは基礎的生理への洞察を提供し、より
微妙な変異が普通、集団に影響を及ぼしている標的も同定される（Ｌｉｆｔｏｎ
，Ｒ．Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：８５４
５−８５５１（１９９５））。

【０００３】 バーター症候群とギッテルマン症候群 バーター症候群は、塩の消耗に伴う低カリウム血症性代謝性アルカローシスを
特徴とする常染色体劣性疾患である（Ｂａｒｔｔｅｒ，Ｆ．Ｃ．ら、Ａｍ．Ｊ．
Ｍｅｄ．３３：８１１−８２８（１９６２））。罹患した患者は、多様なさらな
る代謝性異常を有することが示されており、それには血漿レニン活性の上昇（Ｂ
ａｒｔｔｅｒ，Ｆ．Ｃ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３：８１１−８２８（１９６
２））；高アルドステロン症（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ａ．Ｄ．ら、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．
Ｍｅｄ．２８１：１４３５−１４３９（１９６９））；変化したプロスタグラン
ジン代謝（Ｄｕｎｎ，Ｍ．Ｊ．，ＫｉｄＩｎｔ．１９：８６−１０２（１９８１
））；心房性ナトリウム利尿ペプチドレベルの上昇（Ｉｍａｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｐ
ｅｄ．７４：７３８−７４９（１９６９）；Ｇｒａｈａｍ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｈｙｐ
ｅｒｔｅｎｓｉｏｎ８：５４９−５５１（１９８６））；血小板機能の異常（Ｒ
ｏｄｒｉｇｕｅｓ Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｒ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎ．１５
：７９−８４（１９８３））；およびアンジオテンシンＩＩとノルエピネフリン
の血管収縮効果に対する非感受性（Ｂａｒｔｔｅｒ，Ｆ．Ｃ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｍ
ｅｄ．３３：８１１−８２８（１９６２）；およびＳｉｌｖｅｒｂｅｒｇ，Ａ．
Ｂ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．６４：２３１−２３５（１９７８））が含まれる。

【０００４】 罹患した患者における疾病の症状と徴候はこれらの多様な生理学的知見を反映
し、血管内容量の欠乏（Ｂｅｔｔｉｎｅｌｌｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．
１２０：３８−４３（１９９２））、発作（Ｉｗａｔａ，Ｆ．ら、Ａｃｔａ Ｐ
ａｅｄ．Ｊａｐｏｎｉｃａ３５：２５２−２５７（１９９３））、強直（Ｂｅｔ
ｔｉｎｅｌｌｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１２０：３８−４３（１９９２
））、筋脱力感（Ｍａｒｃｏ−Ｆｒａｎｃｏ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｃｌｉｎ．Ｎｅｐｈ
．４２：３３−３７（１９９４））、感覚異常（Ｚａｒｒａｇａ Ｌａｒｒｏｎ
ｄｏ，Ｓ．ら、Ｎｅｐｈｒｏｎ６２：３４０−３４４（１９９２））、および軟
骨石灰化を伴う関節痛（Ｓｍｉｌｄｅ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｊ． ｏｆ Ｒｈｅｕｍ．
２１：１５１５−１５１９（１９９４））の徴候を含む。電解質組成の持続的異
常により、結果として発育阻止と精神的遅延を起こす患者もいる（（Ｓｉｍｏｐ
ｏｕｌｏｓ，Ａ．Ｐ．ら、Ｎｅｐｈｒｏｎ２３：１３０−１３５（１９７９））
。電解質ホメオスタシスにおけるこれらの深刻な混乱により、罹病した患者を過
食症と誤診したり、および／または利尿剤の乱用に導きえる（Ｏｋｕｓａ，Ｍ．
Ｄ．とＢｉａ，Ｍ．Ｊ．Ｂａｒｔｔｅｒ'ｓ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ：Ｉｎ Ｈｏｒ ｍｏｎｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｐａｒａｄｏｘｅｓ 編者Ｃｏｈｅｎ，Ｐ．とＦｏａ，Ｐ．２３１−２６３（Ｓｐ
ｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７））。

【０００５】 バーター症候群は、ギッテルマン症候群（Ｇｉｔｅｌｍａｎ，Ｈ．Ｊ．，Ｇｒ
ａｈａｍ Ｊ．Ｂ．，およびＷｅｌｔ，Ｌ．Ｇ． Ａ ｎｅｗ ｆａｍｉｌｉａ
ｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｂｙ ｈｙｐｏｋａｌｅ
ｍｉａ ａｎｄ ｈｙｐｏｍａｇｎｅｓｅｍｉａ．Ｔｒａｎｓ．Ａｓｓｏｃ．Ａ
ｍ．Ｐｈｙｓ．７９：２２１−２３５（１９６６））と「真性バーター症候群」
（Ｂｅｔｔｉｎｅｌｌｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１２０：３８−４３（
１９９２））の少なくとも２つのサブセットとは異種のものであると提唱された
。ギッテルマン症候群は、低カルシウム尿症と低マグネシウム血症と共に低カリ
ウム血症性アルカローシスを示す主な患者に当てはまり、一方、真性バーター症
候群は、正常あるいは高カルシウム尿症と典型的な正常マグネシウムレベルを示
す患者に当てはまる。

【０００６】 真性バーター症候群の患者は臨床的に初期年齢（５才以下）で血管容量の欠乏
徴候を持って存在し、一方、ギッテルマン症候群の患者は典型的にさらに遅い年
齢で、明らかな血液量不足なしに存在すると言われる（Ｂｅｔｔｉｎｅｌｌｉ，
Ａ．ら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１２０：３８−４３（１９９２））。それにもか
かわらず、これらの疾患の特徴が重複することからその分類に関してかなりの混
乱と議論が生じ、ギッテルマン症候群の特徴を有する多くの患者がバーター症候
群であると文献に示されている（Ｒｕｄｉｎ，Ａ．ら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｕｒｏ
ｌ．Ｎｅｐｈｒｏｌ ２２：３５−３９（１９８８））。これらの疾患の病因は
不確かなままであり、観察された異常のどちらが一次的なものであり、どちらが
根底にある一次的異常の二次的結果であるのかについて様々に推測される（Ｃｌ
ｉｖｅ，Ｄ．Ｍ．Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄ．Ｄｉｓ．２５：８１３−８２３（１９９５
））。現在、これらの疾患を識別する簡便な方法が存在しないし、識別は、単に
現れた臨床的症状の評価に基づいている。

【０００７】 ギッテルマン症候群は、腎臓の遠位曲尿細管に存在するチアジド感受性Ｎａ−
Ｃｌ共輸送体タンパク質（ＴＳＣ）の機能消失変異によって起こる、遺伝的に均
一な常染色体劣性形質である。これらの患者に見られる主な臨床的および生理的
異常は、結果として起こるこのネフロン部分からの塩の消耗で説明できる。

【０００８】 腎臓の電解質ホメオスタシスの生理を分析することにより、ギッテルマン症候
群とバーター症候群の可能性ある候補遺伝子が数多く同定された。以前の研究で
は、心房性ナトリウム利尿ペプチドとアンジオテンシンＩＩレセプターをコード
する遺伝子（ＡＴ１）が調べられた（Ｇｒａｈａｍ，Ｒ．Ｍ．ら、Ｈｙｐｅｒｔ
ｅｎｓｉｏｎ ８：５４９−５５１（１９８６），Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．ら、Ｋ
ｉｄ．Ｉｎｔ．４６：１５０５−１５０９（１９９４））。他の興味ある候補遺
伝子として遠位曲尿細管のチアジド感受性Ｎａ−Ｃｌ共輸送体（チアジド感受性
共輸送体、ＴＳＣ）があるが、これはこのネフロン部位でナトリウムと塩素イオ
ンを再吸収する主要メディエータと考えられ、腎臓の純ナトリウム再吸収の重要
な画分である（Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｄ．Ｈ．，Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１１４：
８８６−８９４（１９９１））。この共輸送体は、高血圧の治療に用いられる主
要な薬剤の一つであるチアジド利尿薬の標的である。最近、ヒラメの膀胱とラッ
トの腎臓からＴＳＣをコードするｃＤＮＡがクローニングされた（Ｇａｍｂａ，
Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：２７４９
−２７５３（１９９３）；およびＧａｍｂａ，Ｇ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２６９：１７７１３−１７７２２（１９９４））。ラット由来のコードタンパ
ク質は１００２アミノ酸からなり、１２の推定的な膜貫通ドメインと長い細胞内
アミノおよびカルボキシ末端を含む。ギッテルマン症候群の患者とチアジド利尿
薬を投与されている患者の特徴にいくつかの類似性があることから、機能消失を
起こすＴＳＣの変異の結果としてギッテルマン症候群が生じるという可能性が高
まった。この考えから、ＴＳＣを症候群の候補遺伝子として調べる動機がでてく
る。

【０００９】 バーター症候群とギッテルマン症候群患者での先の知見は、バーター症候群は
ギッテルマン症候群の対立遺伝子変異体なのか、それとも異なる遺伝子における
突然変異によるのかという疑問を残したままである。バーター症候群の患者で塩
の消耗、尿濃度障害、およびカルシウムの消耗が起こることから、ヘンレ係蹄の
肥大上行脚（ＴＡＬ）での主要腎尿細管の欠陥が示唆される（Ｇｉｌｌ，Ｊ．Ｒ
．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．６５：７６６−７７２（１９７８））。ブメタニド感
受性Ｎａ−Ｋ−２Ｃｌ共輸送体の吸収性変異体（ＮＫＣＣ２、ＳＬＣ１２Ａ１と
しても知られる）は、このネフロン部位でのナトリウムと塩素イオン再吸収の主
要メディエータであり（Ｇｒｅｇｅｒ，Ｒ．，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．６５：
７６０−７９７（１９８５））、この共輸送体の機能消失により患者で見られる
多くの特色が起こり得る。実際、この共輸送体に対する特異的アンタゴニストで
あるループ利尿薬は、バーター症候群の患者で見られるのと非常に類似した電解
質障害を起こし得る（Ｇｒｅｇｅｒ，Ｒ．ら、Ｋｌｉｎ．Ｗｏｓｃｈｅｎｓｃｈ
ｒ．６１：１０１９−１０２７（１９９１））。

【００１０】 最近、ＮＫＣＣ２をコードするｃＤＮＡが、ラット（Ｇａｍｂａ，Ｇ．ら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６：１７７１３−１７７２２（１９９４））、ウサギ
（Ｐａｙｎｅ，Ｊ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ
．Ａ．）９１：４５４４−４５４８（１９９４）、およびマウス（Ｉｇａｒａｓ
ｈｉ，Ｐ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６９：Ｆ４０５−Ｆ４１８（１９
９５））からクローニングされた。この共輸送体の分泌性変異体、ＮＫＣＣ１（
ＳＬＣ１２Ａ２としても知られる）も、サメ（Ｘｕ，Ｊ．−Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）９１：２２０１−２２０５（１
９９４））およびヒト（Ｐａｙｎｅ，Ｊ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７０：１７９７７−１７９８５（１９９５））からクローニングされた。このフ
ァミリーのメンバーはすべて１２の推定膜貫通ドメインを有し、ＴＳＣと構造と
配列の類似性も示す。バーター症候群を持つファミリーを調べることにより、遺
伝性低カルシウム血症性アルカローシスのこの変異体は、ＮＫＣＣ２をコードす
る遺伝子の突然変異によって起こることが示された。これらの知見により、この
疾患の分子基礎が説明され、より通常のヘテロ接合性保有状態で起こり得る臨床
的特徴が示唆される。

【００１１】 以前、塩の消耗と低血圧を伴う常染色体劣性低カリウム血症性アルカローシス
は、ＴＳＣとＮＫＣＣ２の２つの遺伝子どちらかの変異によると考えられていた
。腎臓の遠位曲尿細管のチアジド感受性Ｎａ−Ｃｌ共輸送体をコードするＴＳＣ
（遺伝子座記号ＳＬＣ１２Ａ３、ＮＣＴＴと呼ばれることもある）の変異により
、著しい低カルシウム尿症と低マグネシウム血症に関連した塩の消耗と低カリウ
ム血症性アルカローシスを特徴とするギッテルマン症候群が生じる（Ｓｉｍｏｎ
，Ｄ．Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １２：２４−３０（１９９６））
。ヘンレ係蹄の肥大上行脚（ＴＡＬ）の腎臓ブメタニド感受性Ｎａ−Ｋ−２Ｃｌ
共輸送体をコードするＮＫＣＣ２（遺伝子座記号ＳＬＣ１２Ａ１）の変異により
、著しい高カルシウム尿症と度重なる腎石灰化症に関連した塩の消耗と低カリウ
ム血症性アルカローシスを特徴とするバーター症候群が生じる（Ｓｉｍｏｎ，Ｄ
．Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１３：１８３−１８８（１９９６））。
バーター症候群の患者は典型的に羊水過多で早産で生まれ、新生児期に著しい脱
水症を起こす一方、ギッテルマン症候群の患者は典型的に神経筋の徴候および症
状と共にさらに高い年齢で現れる（Ｗａｎｇ，Ｗ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ．５４：８１−９６（１９９２））。

【００１２】 その産物がこれらの共輸送体のいずれかの活性を制御する遺伝子の突然変異は
、潜在的に同様の臨床的表現型を表す可能性がある。頂端ＡＴＰ感受性Ｋ⁺チャ ンネルは、ＴＡＬにおけるＮａ−Ｋ−２Ｃｌ共輸送体のそのようなレギュレータ
ーの一つとして意味づけられる（Ｗａｎｇ，Ｗ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．５４：８１−９６（１９９２），Ｇｉｅｂｉｓｃｈ Ｇ．，Ｋｉｄｎｅ
ｙ Ｉｎｔ．４８：１００４−１００９（１９９５））。ＴＡＬにおけるＫ⁺レ ベルがＮａ⁺とＣｌ^-レベルに比べて非常に低いため、尿細管で利用できるＫ⁺が 共輸送体活性の律速となる。尿細管から細胞に入るＫ⁺は、共輸送活性の持続性 を可能にするため管腔に「再循環」されなければならない。共輸送体活性の制御
におけるＫ⁺の重要な役割は、カリウムチャネルアンタゴニストがＮａ−Ｋ−２ Ｃｌ共輸送体活性を実質的に失活させる能力により示される（Ｇｉｅｂｉｓｃｈ
，Ｇ．，Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．４８：１００４−１００９（１９９５））。

【００１３】 この制御チャネルの多くの特徴（低単一チャネルコンダクタンス、低レベルの
ＡＴＰとプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）による活性化、および電圧とカルシウ
ムに対する非感受性）を有する内向き整流Ｋ⁺チャネル（ＩＲＫ）がクローニン グされた（Ｈｏ，Ｋ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６２：３１−３８（１９９３））。
このチャネル、ＲＯＭＫ（遺伝子座記号ＫＣＮＪ１）はカリウムチャネルのＩＲ
Ｋファミリーのプロトタイプで、２つの膜貫通ドメインと特徴的なＨ５孔ドメイ
ンに相同な部位からなる。このチャネルは、正常なチャネル活性に必要なＰＫＡ
リン酸化部位を含む。選択的スプライシング（alternative splicing）により 、同じ染色体１１遺伝子座によりコードされる複数のＲＯＭＫアイソフォーム（
イソ型）が作られる（Ｙａｎｏ，Ｈ．ら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ
４５：８５４−８６０（１９９４）；Ｓｈｕｃｋ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６９：２４２６１−２４２７０（１９９４））。これらのアイソフ
ォームは腎臓、特にさらに遠位のネフロン部位と同様にＴＡＬの細胞の頂端膜で
発現することが示された（Ｌｅｅ，Ｗ．Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（
Ｒｅｎａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）２６８：Ｆ１
１２４−３１（１９９５）； Ｂｏｉｍ，Ｍ．Ａ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．（Ｒｅｎａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．）２６
８：Ｆ１１３２−４０（１９９５）；Ｈｅｂｅｒｔ，Ｓ．Ｃ．，Ｋｉｄｎｅｙ
Ｉｎｔ．４８：１０１０−１０１６（１９９５））。このチャネルは、遠位ネフ
ロンでの正味の純腎臓カリウム分泌と同様に、ＴＡＬでのカリウム再循環に関連
すると提唱されてきた。

【００１４】 Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ型バーター症候群 ＩおよびＩＩ型バーター症候群は、ブメタニド感受性Ｎａ−Ｋ−２Ｃｌ共輸送
体（ＮＫＣＣ２、遺伝子座記号ＳＬＣ１２Ａ１）あるいはＡＴＰ感受性Ｋ⁺チャ ネルＲＯＭＫ（遺伝子座記号ＫＣＮＪ１）をコードする２つの遺伝子のいずれか
の機能消失変異よって生じうる。臨床的疾患は、ヘンレ係蹄の肥大上行脚（ＴＡ
Ｌ）での塩化ナトリウムの不完全な腎再吸収によって起こり、そこでは濾過され
た塩の約３０％が通常、再吸収される。

【００１５】 最近、哺乳類の腎臓で特異的に発現する２つの非常に密接な塩素イオン（クロ
ライド）チャネルについて記述された（Ｋｉｅｆｅｒｌｅ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）９１：６９４３−６９４
７（１９９４））。異なるネフロン部位でのそれぞれの遺伝子の相対的な発現に
ついて議論がなされているが、ラットでの最近の研究により、ＣＬＣ−Ｋ１とＣ
ＬＣ−Ｋ２はヘンレ係蹄の薄上行脚からネフロンに沿って前方に発現することが
示されている（Ｖａｎｄｅｗａｌｌｅ，Ａ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（
Ｒｅｎａｌ Ｆｌｕｉｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．）２７２：Ｆ６
７８−６８８（１９９５）；Ａｄａｃｈｉ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６９：１７６７７−１７６８３（１９９４））。これら２つの遺伝子のヒトホ
モログ（真正遺伝子である必要はない）はＣＬＣＮＫＡとＣＬＣＮＫＢであり、
どちらも６８７アミノ酸からなるタンパク質をコードする（Ｋｉｅｆｅｒｌｅ，
Ｓ．ら、１９９４）。これらのチャネルは、少なくとも９つの異なる哺乳類塩素
イオンチャネルからなるＣＬＣファミリーのメンバーである。それぞれ１２の膜
貫通ドメインと細胞内アミノおよびカルボキシ末端を有すると考えられており、
シビレエイのこのファミリーのプロトタイプは電圧と塩素イオンの両方によりゲ
ートでコントロールされる（Ｊｅｎｔｓｃｈら、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １９：１
１７−１２６（１９９６））。

【００１６】

【課題を解決するための手段】

本発明は、３つめの遺伝子がバーター症候群のさらに別のサブタイプ、ＩＩＩ
型バーター症候群に関係しているという発見に関連する。この表現型は、腎臓の
塩素イオンチャネルＣＬＣＮＫＢを含む染色体１のセグメントにある遺伝子に結
びつけられる。この遺伝子の突然変異型を調べることにより、ヘンレ係蹄の肥大
上行脚での塩素イオンの腎再吸収を損なう機能消失変異であることを明らかにす
る。以下で述べるように、１７家系での突然変異を同定したが、これらは大きな
欠失、ナンセンス、およびミスセンス突然変異を含む。ＣＬＣＮＫＢ突然変異を
保有する患者は、塩の消耗、低血圧、正常マグネシウム、および高あるいは正常
カルシウム尿症を伴う低カリウム血症性アルカローシスにより特徴づけされる。
これらは、腎石灰化症のないバーター症候群患者の別の一組と定義する。

【００１７】 本発明は、ホメオスタシスの血圧と塩および体液保持の調節を必要とする患者
の、これらパラメータを調節する化合物を同定するために用いる組成と方法を提
供する。例えば、こうした薬剤は高血圧、浮腫、ネフローゼ症候群、鬱血性心不
全、および異常な体液量に関わる他の病気を治療するのに有効である。また、本
発明は、ＩＩＩ型バーター症候群と利尿薬の乱用を識別して診断するのに加え、
様々なタイプのイオン輸送欠損症、特にＩＩＩ型バーター症候群をバーター症候
群の他の２つの型（ＩおよびＩＩ）とギッテルマン症候群から識別して診断する
方法にも関連する。本発明は、さらに、ＩＩＩ型バーター症候群のヘテロ接合体
担体を同定するために用いることができる方法と組成を提供する。重篤な臨床的
症状を示さない担体は、それにもかかわらず軽度から中程度の症状を示す。

【００１８】 本出願を通して引用した発表論文、特許、他の出版物はすべて、１９９７年１
０月１日に出願した米国仮特許出願第６０／０６０，２１９号およびここで引用
文献としてそれら全体を援用する。本出願は、本発明者らの最近の米国特許出願
第０８／７７８，０５２号および第６０／０４０，１７１号（ＰＣＴ出願ＵＳ９
８／０４６８１に関連する）にも関連し、これらはここに引用文献として全体を
援用する。

【００１９】 本発明は、ヒト腎臓の塩素イオン共輸送体ＣＬＣＮＫＢの役割の同定に部分
的基づく。一つの側面では、ＣＬＣＮＫＢ遺伝子の突然変異型が塩の消耗と低血
圧に関係する病態を引き起こすという発見に関連する。よって、本発明の関連す
る側面は、正常あるいは野生型のＣＬＣＮＫＢ遺伝子を有する患者のＣＬＣＮＫ
Ｂタンパク質をアゴナイズあるいはアンタゴナイズすることにより、血圧と体液
、およびまたは体液量を調節する薬剤の同定と関連治療方法である。

【００２０】 本発明は、特に、ＣＬＣＮＫＢ遺伝子が存在しないという条件以外で、ＩＩＩ
型バーター症候群の様々なサブタイプを診断し、これらの病態を治療する方法と
薬剤を開発するのに有効なアミノ酸配列あるいは関連ＰＣＲプライマーを提供す
る。

【００２１】 本発明は、ＣＬＣＮＫＢ遺伝子の様々な突然変異型により、塩の消耗と低血圧
を伴う病態をもたらすタンパク質の機能消失変異型が生じるという発見に、部分
的基づく。これらの知見に基づき、本発明はＣＬＣＮＫＢタンパク質のアゴニス
トとアンタゴニストを同定するのに用いる組成と方法を提供する。したがって、
ＣＬＣＮＫＢタンパク質の野生型とその様々な対立遺伝子変異体は、正常遺伝子
産物の機能を調節する化合物をスクリーニングするのに有効な標的を提供する。
アンタゴニストは、浮腫、鬱血性心不全、高血圧、ネフローゼ症候群、および異
常な体液量を伴う他の病態を治療するのに用いる、利尿薬および高血圧治療薬と
して特に有効であると考えられる。

【００２２】 本発明のさらなる側面では、ＣＬＣＮＫＢタンパク質の活性を調節する化合物
の開発と臨床的応用のための方法が提供される。特に、アゴニスト、アンタゴニ
スト、および他のモジュレーターが考えられる。前記遺伝子に対するアンタゴニ
ストから利尿降圧剤が得られ、そして逆に、該遺伝子の発現産物に対するアゴニ
ストが低血圧治療薬として機能することが考えられる。

【００２３】 関連する側面において、本発明は、野生型あるいは正常ＣＬＣＮＫＢ遺伝子産
物に特異的に結合する抗体をも含む。そのようなモノクローナル抗体あるいはポ
リクローナル抗血清の免疫学的に重要な部分を含む断片も、そのままの（インタ
クト）抗体と同様にアンタゴニストとして利用し得る。ヒト化抗体や、Ｆ（ａｂ
’）₂断片のＦａｂ、Ｆａｂ’のような免疫学的反応性のある断片の使用がよく 好まれ、これらの断片は一般的に免疫グロブリン全体よりも免疫原性が低いため
、特に治療の場合に好まれる。そのような抗体あるいはＣＬＣＮＫＢ遺伝子や転
写産物にハイブリダイズするアンチセンス分子をアゴニストやアンタゴニストと
して使用することも考えられる。

【００２４】

【発明の実施の形態】

Ｉ． 全般的な説明 本発明は、ヒト腎臓塩素イオン輸送タンパク質ＣＬＣＮＫＢの変異型および欠
失変異型が及ぼす影響の同定に部分的に基づき、それは異常なイオン輸送に関連
した病理学的症状、特にＩＩＩ型バーター症候群を引き起こす。本発明のいくつ
かの側面は、本発明者の論文の中で開示されているが、それを本明細書に参考文
献として援用する。Ｓｉｍｏｎ，Ｄ．Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １
７：１７１−１７８（１９９７）。本発明は、ＣＬＣＮＫＢタンパク質の突然変
異体あるいは変異体の完全または部分的アミノ酸配列、およびそれらに相当する
ヌクレオチド配列を具体的に提供する。前記タンパク質および核酸分子は、正常
ＣＬＣＮＫＢタンパク質の活性を調節する薬剤を同定するため、また、イオン輸
送障害の診断、異なるイオン輸送障害の識別、これら病状の治療の方法と薬剤の
開発に利用可能である。特に、ＣＬＣＮＫＢ遺伝子が存在しない欠失突然変異体
を保有する患者を同定するのに使用可能なＰＣＲプライマーを提供する。本発明
は、ＣＬＣＮＫＢ遺伝子あるいはそれがコードするタンパク質を調節する薬剤を
単離することにより、高血圧（例えば本態性高血圧）や鬱血性心不全を伴う症状
を調節する化合物を同定する方法も提供する。

【００２５】 ＩＩ． 特定の実施の形態 Ａ．ＣＬＣＮＫＢタンパク質 本発明以前に、哺乳類の腎臓で特異的に発現する２つの関連する塩素イオンチ
ャネルが同定されていた（Ｋｉｅｆｅｒｌｅ，Ｓ．ら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）９１：６９４３−６９４７）。
異なるネフロン部位でのそれぞれの遺伝子の相対的な発現について議論がなされ
ているが、ラットでの最近の研究により、ＣＬＣ−Ｋ１とＣＬＣ−Ｋ２はヘンレ
係蹄の薄上行脚からネフロンに沿って前方に発現することが示されている（Ｖａ
ｎｄｅｗａｌｌｅ，Ａ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（Ｒｅｎａｌ Ｆｌｕ
ｉｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．）２７２：Ｆ６７８−６８８；Ａｄ
ａｃｈｉ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１７６７７−１７６８３
）。これら２つの遺伝子に相同的なヒト遺伝子はＣＬＣＮＫＡおよびＣＬＣＮＫ
Ｂと呼ばれ、どちらも６８７アミノ酸からなるタンパク質をコードする（Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ登録番号それぞれ５２１０７２および５２１０７４）。これらの特異的
塩素イオンチャネルは、少なくとも９つの哺乳類塩素イオンチャネルからなるＣ
ＬＣファミリーのメンバーである。それぞれ１２の膜貫通ドメインと、細胞内ア
ミノおよびカルボキシ末端を有すると考えられており、シビレエイのこのファミ
リーのプロトタイプは電圧と塩素イオンの両方によりゲートでコントロールされ
る（Ｊｅｎｔｓｃｈ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １９：１１７−１２６
（１９９６））。

【００２６】 本発明以前には、誰もＣＬＣＮＫＢタンパク質の自然に存在するヒト野生型変
異体を特徴づけしていなかった；そして、誰もＣＬＣＮＫＢタンパク質のヒト突
然変異体および変化した変異体（ａｌｔｅｒｅｄ ｖａｒｉａｎｔ）を特徴づけ
していなかった。本発明は、野生型ＣＬＣＮＫＢタンパク質の対立遺伝子変異体
、およびイオン輸送欠損症を生じるヒトＣＬＣＮＫＢタンパク質の変化した変異
体（図１０Ｃ）の完全あるいは部分的アミノ酸配列を提供し、あるいは特定の突
然変異または関連変異について述べ、また、関連ヌクレオチド配列、特にＰＣＲ
関連診断手法に有効なプライマーも提供する。

【００２７】 このようにして、一つの実施の形態では、本発明は、ＰＣＲ手法と図９に開示
したプライマーを用いてヒトＣＬＣＮＫＢ遺伝子の特定の突然変異体（図１０Ｃ
）と変化した変異体を同定する能力、およびここに記述したクローン化または合
成核酸分子を用いてそれらの関連タンパク質産物（図６Ｂ）を同定する能力を提
供する。

【００２８】 本明細書で用いる、下記の用語は次のような意味をもつ。

【００２９】 「野生型ヒトＣＬＣＮＫＢタンパク質」という用語は、正常なＣＬＣＮＫＢ活
性を有するヒトＣＬＣＮＫＢタンパク質の自然に存在する対立遺伝子変異体をす
べて含む。一般的には、ＣＬＣＮＫＢタンパク質の野生型対立遺伝子変異体は、
ＧｅｎＢａｎｋ Ｓｅｑ． ＩＤ Ｎｏ．５２１０７４で具体的に提供されるも
のとはわずかに異なるアミノ酸配列を有する。対立遺伝子変異体は、先に記した
配列とはわずかに異なるアミノ酸配列を有するが、それにもかかわらずＡＴＰ感
受性Ｋ⁺輸送体としての能力を有する。典型的に、野生型ＣＬＣＮＫＢタンパク 質の対立遺伝子変異体は、野生型配列からの保存的アミノ酸置換を含む、あるい
はＣＬＣＮＫＢホモログ（ヒト以外の生物体から単離されたＣＬＣＮＫＢタンパ
ク質）での対応する位置からのアミノ酸置換を含む。

【００３０】 「突然変異したまたは変化したヒトＣＬＣＮＫＢタンパク質」という用語は、
ヒトＣＬＣＮＫＢの突然変異体または変化した対立遺伝子変異体のアミノ酸配列
を有するタンパク質を指す。本発明の突然変異したまたは変化したヒトＣＬＣＮ
ＫＢタンパク質は、ここで具体的に同定され、特徴づけしたもの（図６Ｂ）と同
様に、過剰な実験によらず以下に概要を述べる方法に従って、単離し特徴づけさ
れ得る他の突然変異体と対立遺伝子変異体を含む。簡便にするため、本発明の突
然変異したまたは変化したヒトＣＬＮＫＢタンパク質をすべてまとめて変異また
は変化したＣＬＣＮＫＢタンパク質と呼ぶ。

【００３１】 さらに、「突然変異したまたは変化したヒトＣＬＣＮＫＢタンパク質」という
用語は、正常なＣＬＣＮＫＢ活性をもたないヒトＣＬＣＮＫＢタンパク質の自然
に存在する対立遺伝子変異体をすべて含む。一般的には、ＣＬＣＮＫＢタンパク
質の変異または変化した対立遺伝子変異体は、ここで野生型ＣＬＣＮＫＢタンパ
ク質として記載したＧｅｎＢａｎｋ Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．５２１０７４で具体
的に提供される配列とはわずかに、さらには根本的に異なるアミノ酸配列をもつ
。変異または変化した対立遺伝子変異体は、野生型ＣＬＣＮＫＢによって輸送さ
れる一つ以上のイオンを輸送することができない、あるいはそのようなイオンを
正常または野生型レベルで輸送することができない。典型的には、変異または変
化したＣＬＣＮＫＢタンパク質の対立遺伝子変異体は以下のものを含む。本明細
書に記載した野生型配列からの非保存的アミノ酸置換、ＣＬＣＮＫＢホモログ（
ヒト以外の生物体から単離されたＣＬＣＮＫＢタンパク質）の対応する位置に見
出されたアミノ酸以外のアミノ酸置換、フレームシフト突然変異、終止コドンの
挿入、あるいはＣＬＣＮＫＢ配列への一つもしくは複数のアミノ酸の欠失または
挿入。いくつかの家系では、関連する変異はＣＬＣＮＫＢ遺伝子の欠失である。

【００３２】 本発明のＣＬＣＮＫＢタンパク質（野生型および突然変異体）は、好ましくは
単離した形で用いられる。本明細書で用いる場合、通常タンパク質と結合してい
る細胞成分から物理的、機械的、あるいは化学的な方法を利用してＣＬＣＮＫＢ
タンパク質を除去する時に、タンパク質を単離すると言う。熟練者は、標準の精
製法を採用して、容易に単離ＣＬＣＮＫＢタンパク質を得ることができる。単離
の性質と程度は、意図する用途に依存する。

【００３３】 ＣＬＣＮＫＢをコードする核酸分子のクローニングにより、本発明のＣＬＣＮ
ＫＢタンパク質の明確な断片を作製することが可能となる。以下で述べるように
、本発明のＣＬＣＮＫＢタンパク質の断片は、ドメインに特異的な抗体の作製、
ＣＬＣＮＫＢタンパク質に結合する薬剤の同定、およびＣＬＣＮＫＢ細胞内ある
いは細胞外結合パートナーを同定する上で特に有効である。特に、ＣＬＣＮＫＢ
タンパク質の利用により、正常および変異型のＣＬＣＮＫＢタンパク質をアゴナ
イズあるいはアンタゴナイズする化合物を同定することが可能である。

【００３４】 ＣＬＣＮＫＢタンパク質の断片は、標準のペプチド合成技術とここで開示した
アミノ酸配列を用いて作製することができる。別法として、組換え法を用いて、
ＣＬＣＮＫＢタンパク質の断片をコードする核酸分子を作製することができる。
図６Ｂ（図の考察において）および８では、本明細書に記載するＣＬＣＮＫＢタ
ンパク質の変化した変異体で、野生型残基から変化したアミノ酸残基を同定して
いる。これらの残基／変化を含む断片は、変化した変異体に特異的な抗ＣＬＣＮ
ＫＢ抗体を作製するのに特に有効である。

【００３５】 以下に述べるように、ＣＬＣＮＫＢタンパク質（すなわち、野生型または変異
体のいずれか）の利用は、（１）ＣＬＣＮＫＢ活性を遮断または促進する薬剤を
同定する標的、（２）ＣＬＣＮＫＢタンパク質に結合する結合パートナーを同定
して単離する標的またはおとり、（３）ＣＬＣＮＫＢタンパク質の活性を遮断ま
たは促進する薬剤を同定する方法、および（４）ＣＬＣＮＫＢを介する活性また
は疾病を同定するアッセイ標的、を含むがこれらに限定されない。

【００３６】 Ｂ．抗ＣＬＣＮＫＢ抗体 さらに本発明は、本発明のＣＬＣＮＫＢタンパク質に選択的に結合する抗体を
提供する。最も好ましい抗体は、ＣＬＣＮＫＢタンパク質の特に変化した変異体
に結合するが、野生型変異体に結合しない、あるいはＣＬＣＮＫＢタンパク質の
野生型変異体に結合するが変化した変異体に結合しない。特に考慮される抗ＣＬ
ＣＮＫＢ抗体は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体と同様に、抗原結合
ドメインおよびまたは一つもしくは複数の相補性決定領域を含む断片（例えば、
Ｆｖ，Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）₂，およびｓｖＦｖ）を含む。

【００３７】 抗体は、一般的に、ＣＬＣＮＫＢタンパク質、そのポリペプチド断片、あるい
は単離または免疫複合化した変異体を用いて適当な哺乳類宿主（例えば、マウス
、ニワトリ、ウサギ、ヤギ、あるいはウマ）を免疫して作製する（Ｈａｒｌｏｗ
，Ｅ．ら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８））。患
者ＢＡＲ２４２、ＢＡＲ２７６、およびＢＡＲ２２６からの変異体は、野生型Ｃ
ＬＣＮＫＢとその変化型の一つを識別するのに用いることができるタンパク質配
列の例である。これらの残基を含む断片は、野生型または突然変異した変異体に
特異的な抗ＣＬＣＮＫＢ抗体を作製するのに特に適している。変化特異的抗体と
は、ＣＬＣＮＫＢ遺伝子の変異（または非野生型）型を認識する抗体を意味する
。

【００３８】 免疫原として使用するタンパク質を調製する方法、およびＢＳＡやＫＬＨ等の
担体、あるいは他の担体タンパク質とタンパク質との免疫原性コンジュゲートを
調製する方法は、当該技術で周知である。ある状況では、例えばカルボジイミド
試薬を用いた直接的な結合が利用される。他の例では、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬが販売しているような結合試薬が効
果的である。担体のコンジュゲーシュンについてのさらに詳細な記述は、Ｈａｒ
ｌｏｗ，Ｅ．ら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ ａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ（１９８８）
を参照。

【００３９】 ＣＬＣＮＫＢ免疫原の投与は、一般的に、適当な周期で適当なアジュバント（
例えば、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント）を
用いて行い、これは一般的に、当該技術分野で理解されているものである。免疫
化のスケジュール期間は、抗体形成の妥当性を決定するため抗体の力価を測定す
る。

【００４０】 抗体をＣＬＣＮＫＢアンタゴニストとして使用することが考えられる。上記の
ように作製したポリクローナル抗血清は、いくつかの応用や医薬品成分には充分
であるが、モノクローナル抗体製剤が好ましい。ＫoｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉ ｎの標準方法、あるいはリンパ球または脾臓細胞の不死化を達成する修飾法を利
用することにより、目的のモノクローナル抗体を分泌する不死化細胞株を作製す
ることができ、これは一般的に知られている（Ｋoｈｌｅｒ，Ｇ．およびＣ．Ｍ ｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７；Ｋoｈ ｌｅｒ，Ｇ．およびＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ． ６：５１１−５１９；Ｋoｈｌｅｒ，Ｇ．ら、（１９７６）Ｅｕｒ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２９２−２９５）。目的の抗体を分泌する不死化細胞
株は、抗原がＣＬＣＮＫＢタンパク質あるいはそのポリペプチドであるイムノア
ッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）によりスクリーニングする。目的の抗体を分泌して
いる適当な不死化細胞株を同定したら、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏあるいは腹水中
での生産によって培養する。

【００４１】 続いて、目的のモノクローナル抗体を培養上清または腹水の上清から回収する
。モノクローナルまたは免疫学的に重要な部分を含むポリクローナル抗血清の断
片は、そのままの抗体と同様、アンタゴニストとして使用できる。Ｆ（ａｂ’） ₂ のＦａｂ、Ｆａｂ’、あるいはｓｖＦｖ断片等の免疫学的に反応性のある断片 の使用が、これらの断片は一般的に免疫グロブリン全体よりも免疫原性が低いた
め、しばしば特に治療の場合に好まれる。

【００４２】 抗体や断片は、最近の技術、組換え法によっても作製できる。多種起源のキメ
ラまたはＣＤＲ移植抗体（例えばキメラ抗体）と関連して、輸送体の目的の領域
に特異的に結合する領域も作製することができる。

【００４３】 以下に記載するように、抗ＣＬＣＮＫＢ抗体はＣＬＣＮＫＢ活性モジュレータ
ーとして有効であり、ＣＬＣＮＫＢ発現／活性を測定するイムノアッセイや、Ｃ
ＬＣＮＫＢタンパク質の野生型および変化した変異体を精製するのに有効である
。これらはＣＬＣＮＫＢのアンタゴニストとしても有効である。

【００４４】 Ｃ．ＣＬＣＮＫＢコード核酸分子 上記のように、本発明は、野生型ＣＬＣＮＫＢタンパク質の変化した突然変異
体をコードするヒトから単離した核酸分子に部分的に基づく。したがって、本発
明はさらに、ＣＬＣＮＫＢタンパク質のここで開示した変化または突然変異した
変異体（図６Ｂを参照）をコードする、好ましくは単離した形の核酸分子を提供
する。便宜上、関連本文により強い特異性を意味していない限り、すべてのＣＬ
ＣＮＫＢコード核酸分子をＣＬＣＮＫＢコード核酸分子、ＣＬＣＮＫＢ遺伝子、
あるいはＣＬＣＮＫＢと呼ぶ。

【００４５】 本明細書で用いる、「核酸分子」または「ヌクレオチド」を、上記で定義した
ようなペプチドをコードする、あるいはそのようなペプチドをコードする核酸配
列に相補的なＲＮＡまたはＤＮＡ分子として定義する。特に好ましい核酸分子は
、ここで開示したヒトｃＤＮＡ配列と同一、または相補的なヌクレオチド配列を
有する。具体的に考えられるものは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡ（
ｒＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、アンチセンス分子、さらに代替バックボーンを基にした
、または天然源や合成由来の代替塩基を含む核酸である。しかしながら、そのよ
うな核酸分子を、新規であり先行技術で明らかでないＣＬＣＮＫＢのヒトまたは
非ヒトホモログをコードする核酸分子としてさらに定義する。

【００４６】 本明細書で用いる場合、その核酸分子が他のペプチドをコードする核酸混入物
から実質的に分離された時に、核酸分子は「単離」されたと言う。熟練者は、核
酸単離法を採用して、容易にＣＬＣＮＫＢコード核酸分子を単離できる。Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｉｒ ｙ Ｍａｎｕａｌ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）を参照。

【００４７】 本発明はさらに、本発明のＣＬＣＮＫＢコード核酸分子の断片を提供する。本
明細書で用いる、「断片」とは全体のタンパク質をコードする配列の小さな部分
を意味する。断片のサイズは、意図する用途により決定される。例えば、細胞内
または細胞外ドメインのようなＣＬＣＮＫＢタンパク質の活性部位をコードする
ように断片を選択するのであれば、その断片はＣＬＣＮＫＢタンパク質の機能的
領域をコードするに十分な大きさである必要がある。断片を核酸プローブやＰＣ
Ｒプライマーとして利用するのであれば、プロービング／プライミング中に比較
的少数の偽陽性が得られるように断片の長さを選択する。

【００４８】 プローブやポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の特異的プライマー、あるいはＣ
ＬＣＮＫＢタンパク質をコードする遺伝子配列を合成するのに利用する本発明の
ＣＬＣＮＫＢコード核酸分子断片（すなわち合成オリゴヌクレオチド）は、例え
ばＭａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ（１９８１）１０３：３
１８５−３１９１のホスホトリエステル法等の化学的手法または自動合成法を用
いて容易に合成できる。特に、図９のＰＣＲプライマー配列が考えられる。さら
に、周知の方法によってより大きなＤＮＡ部位を調製することができ、例えば、
ＣＬＣＮＫＢ遺伝子の様々な調節部位を限定するオリゴヌクレオチドのグループ
を合成し、オリゴヌクレオチドを連結して完全な修飾ＣＬＣＮＫＢ遺伝子を構築
する。

【００４９】 本発明のＣＬＣＮＫＢコード核酸分子をさらに修飾して、診断やプローブ用に
検出可能な標識を含ませることができる。上記のように、そのようなプローブを
使用して、野生型または変化したＣＬＣＮＫＢタンパク質の他の対立遺伝子変異
体をコードする核酸分子を同定することができ、以下に示すように、ＣＬＣＮＫ
Ｂ遺伝子の変異や欠失に関連した異常なイオン輸送によって起こる病理学的症状
を診断する手段として、そのようなプローブを使用して変異遺伝子の存在やＣＬ
ＣＮＫＢ遺伝子の欠失を診断することができる。そのような様々な標識は、当該
技術分野で公知であり、ここで示したヌクレオチド分子とともに容易に用いるこ
とができる。適当な標識には、ビオチン、放射標識ヌクレオチド、および同類の
ものが含まれるがこれらに限らない。熟練者は、当該技術分野の公知のいずれか
の標識を採用して標識ＣＬＣＮＫＢコード核酸分子を得ることができる。

【００５０】 Ｄ．他の野生型および突然変異または変異型ＣＬＣＮＫＢコード核酸分子の単 離 上記のように、イオン輸送の介する欠損による病気／重症度においてＣＬＣＮ
ＫＢタンパク質の変異型が演じる役割を同定することにより、異常なイオン輸送
に関連する病態を起こす野生型ＣＬＣＮＫＢの他の突然変異体と変異体が同定で
きるようになった。熟練者は、これらの知見によって、ここで開示した特定の変
異とこれに対応するＤＮＡ配列に加えて、ＣＬＣＮＫＢタンパク質の他の突然変
異体をコードする核酸分子を単離できる。

【００５１】 基本的に、熟練者は、ヒトＣＬＣＮＫＢタンパク質のアミノ酸配列とその変異
体を使用して、細胞から調製した発現ライブラリーをスクリーニングするための
抗体プローブを容易に作製することができる。典型的には、（以下に記載するよ
うな）精製タンパク質を免疫化したウサギ等の哺乳類由来ポリクローナル抗血清
あるいはモノクローナル抗体を用いて、正常または病気の個人から調製した８ｇ
ｔｌｌ等のヒトｃＤＮＡまたはゲノム発現ライブラリーをプローブし、ＣＬＣＮ
ＫＢタンパク質の野生型または変化した変異体の適当なコード配列を得ることが
できる。クローン化したｃＤＮＡ配列は、融合タンパク質として、それ自体の制
御配列を用いて直接、あるいはその酵素の発現に用いた特定の宿主に適した制御
配列を用いた構築体により発現させることができる。ＣＬＣＮＫＢの活性に関与
する領域は、プローブ用、診断用、および治療用抗体を作製するのに好ましい標
的である。これらの方法の詳細な解説については、Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．
Ｌａｎｅ（１９８８）を参照。

【００５２】 また、本明細書に記載したＣＬＣＮＫＢコード配列の一部を合成してプローブ
として使用することにより、正常なイオン輸送を有する個人、または異常なイオ
ン輸送の結果である病理学的症状を患う個人からタンパク質のＣＬＣＮＫＢファ
ミリーのメンバーをコードするＤＮＡを回収することができる。約１８〜２０ヌ
クレオチドのオリゴマー（約６〜７アミノ酸をコードする）を調製し、ゲノムＤ
ＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに使用して、ストリン
ジェント条件あるいは不適当なレベルの偽陽性を除去するのに充分なストリンジ
ェンシー条件下でハイブリダイゼーションを得ることができる。この方法を用い
て、ＣＬＣＮＫＢコード配列の変化したおよび野生型変異体を同定して、単離す
ることができる。異常な（または異常と疑いのある）腎機能を有する患者のＣＬ
ＣＮＫＢ配列を正常ＣＬＣＮＫＢ配列と比較することにより、この遺伝子の他の
変異体型が同定できる。

【００５３】 さらに、オリゴヌクレオチドプライマー対を調製して、ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）で使用し、ＣＬＣＮＫＢコード核酸分子またはその断片を選択的に増
幅／クローニングすることができる。このようなＰＣＲプライマーを用いてのＰ
ＣＲ変性／アニール／伸張サイクルは当該技術分野で周知であり、他のＣＬＣＮ
ＫＢコード核酸分子の単離に使用するのに容易に適合させることができる。図９
に、ＩＩＩ型バーター症候群を診断するプローブまたはプライマーとしての使用
に特に適したＣＬＣＮＫＢのオリゴヌクレオチドを示す。図１０Ｃに、５人の患
者（患者の病歴を図８にまとめる）に見られる６つの核酸変異とＣＬＣＮＫＢタ
ンパク質配列でのこれに対応する影響を示す。一般的には、好ましいプライマー
はＣＬＣＮＫＢコード核酸分子の一つもしくは複数のエキソンを挟む。

【００５４】 Ｅ．異常なイオン輸送に伴う病理学的症状を同定する方法 さらに本発明は、腎臓の塩素イオン輸送タンパク質ＣＬＣＮＫＢの活性ある変
化した突然変異体および変異体を発現する細胞および個人を同定し、それらをＮ
ａ−Ｋ−２Ｃｌ共輸送体ＮＫＣＣ２、腎臓のチアジド感受性Ｎａ−Ｃｌ共輸送体
ＴＳＣ、およびＡＴＰ感受性カリウムチャネルＲＯＭＫに変異を有する患者と識
別する方法を提供する。そのような方法は、利尿薬濫用者のＩＩＩ型バーター症
候群患者に対するものと別の診断においても有効であろう。（Ｉ〜ＩＩＩ型）バ
ーター症候群を患う患者は、頻繁に利尿薬濫用者として誤診されてきた。そのよ
うな方法を用いて、変化したイオン輸送に関連した生物学的および病理学的過程
、特にバーター症候群の様々な変種（例えばＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ型）とギッ
テルマン症候群、ＩＩＩ型バーター症候群の進行、ＩＩＩ型バーター症候群の治
療に対する感受性、およびＩＩＩ型バーター症候群の治療の有効性を診断するこ
とができる。本発明の方法は、腎臓の塩素イオン輸送タンパク質ＣＬＣＮＫＢ変
異の担体を同定するのに特に有効である。具体的には、ＣＬＣＮＫＢタンパク質
の変化した変異体の存在は、ＣＬＣＮＫＢタンパク質の野生型または変化した変
異体、あるいはこれらのタンパク質を一つ以上の核酸が細胞で発現しているか否
かを決定することにより同定できる。異常なＣＬＣＮＫＢ活性／発現を介する病
理学的症状を診断して、様々なイオン輸送欠損症を識別する手段として、変化し
た変異体の発現、またはＣＬＣＮＫＢ発現の正常レベルからの逸脱を用いて、イ
オン輸送欠損の担体を同定することができる。

【００５５】 様々な免疫学的および分子遺伝学的手法を使用し、ＣＬＣＮＫＢタンパク質の
野生型または変化した変異体が特定の細胞で発現／生産されているか、および／
またはそのタンパク質がどのレベルで発現されているかを決定することができる
。好ましい方法は、ＣＬＣＮＫＢタンパク質の野生型または変異型が発現されて
いるか否かを識別する。

【００５６】 一般的には、個人の細胞から、核酸分子を含む抽出物またはタンパク質を含む
抽出物を調製する。次にその抽出液をアッセイし、ＣＬＣＮＫＢタンパク質また
はＣＬＣＮＫＢコード核酸分子が細胞で産生されるか否かを決定する。発現され
るタンパク質／核酸分子の型または発現の程度／レベルにより、ＣＬＣＮＫＢ活
性の性質と程度の測定が提供される。

【００５７】 例えば、核酸分子に基づく診断試験を行うには、通常の手法を用いて患者から
適当な核酸サンプルを得て調製する。ＤＮＡは、例えばサンプルをドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）でボイルすることにより簡単に調製できる。核酸サンプル
ではさらに典型的に、血液サンプル、頬の内側の細胞、毛包標本、あるいは鼻の
吸引液が核酸分子を供給する細胞源として利用される。次に抽出した核酸を、例
えば標準手順に従ってポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅反応にかけ
、ＣＬＣＮＫＢコード核酸分子またはその断片を選択的に増幅する。続いて、増
幅された断片のサイズ（典型的には制限酵素消化の後）をゲル電気泳動により決
定し、あるいは断片をシークエンシングする（例えば、ＷｅｂｅｒおよびＭａｙ
Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９）４４：３８８−３３９；Ｄａｖ
ｉｅｓ，Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９４）３７１：１３０−１３６を参照）。
そして結果として生じる断片サイズまたは配列を、問題のタンパク質の既知の野
生型、予測される野生型、既知の変化した変異体、および予測される変化した変
異体と比較する。しかしながら、いくつかの例ではＣＬＣＮＫＢ遺伝子がなく、
関連する診断アッセイでその存在よりも欠損を確認しなければならないことを特
筆しておく。これらの方法を利用して、ＣＬＣＮＫＢ核酸分子の野生型または変
化した変異体およびタンパク質の存在を識別し、同定することができる。

【００５８】 別法として、ＣＬＣＮＫＢコード核酸分子内の一つもしくは複数の一塩基対多
型（一ヌクレオチド多型、ＳＮＰとしても知られる）の存在または非存在は、通
常の方法により決定することができ、それには手動および自動化蛍光ＤＮＡシー
クエンシング、選択的ハイブリダイゼーションプローブ、プライマー伸長法（Ｎ
ｉｋｉｆｏｒｏｖ，Ｔ．Ｔ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９４）
２２：４１６７−４１７５）；オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（Ｏ
ＬＡ）（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：８９２３−８９２７）；対立遺伝子特異的ＰＣ
Ｒ法（Ｒｕｓｔ，Ｓ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９３）６：３
６２３−３６２９）；ＲＮａｓｅミスマッチ切断、一本鎖構造多型（ＳＳＣＰ）
（Ｏｒｉｔａ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８
６：２７６６−２７７０（１９８９））；変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＧ
ＧＥ）等などが含まれるがこれらに限定されない。本診断方法は、開発中のバイ
オチップ技術での利用に特に適しており、これを利用して多くの配列変異または
ＳＮＰの一つがサンプル中に存在するかどうかを同定することができる。熟練究
者は、核酸分析法を容易に適応させ、サンプルがＣＬＣＮＫＢタンパク質の野生
型または変化した変異体をコードする核酸分子を含むか否かを決定することがで
きる。

【００５９】 タンパク質に基づく診断試験を行うには、従来の手法を用いて、患者から適当
なタンパク質サンプルを得て調製する。タンパク質サンプルは、例えばＳＤＳと
混合し、タンパク質画分を塩析することにより簡単に調製できる。典型的には、
タンパク質サンプルとして、血液サンプル、頬の内側の細胞、鼻の吸引液、ある
いはＣＬＣＮＫＢタンパク質を発現している組織の細胞の生体組織片がタンパク
質分子を供給する細胞源として使用される。次に、既知の方法により抽出したタ
ンパク質を分析し、ＣＬＣＮＫＢタンパク質の野生型または変化した変異体の存
在を決定する。例えば、タンパク質の特異的サイズまたは荷電した変異体の存在
は、電場での移動度を用いて特定できる。また、野生型または変化した変異体に
特異的抗体を用いることが可能である。熟練者は、既知のタンパク質分析法を容
易に適合させ、サンプルがＣＬＣＮＫＢタンパク質の野生型または変化した変異
体を含むか否かを決定することが可能である。

【００６０】 ＣＬＣＮＫＢの発現は、自然に存在するＣＬＣＮＫＢ遺伝子の発現の増加また
は減少の結果として起こる疾患を同定する方法にも使用できる。具体的には、ｍ
ＲＮＡを検出する核酸プローブを使用して、ＣＬＣＮＫＢタンパク質を発現する
細胞または組織を同定し、そのようなｍＲＮＡ発現のレベルを同定することが可
能である。

【００６１】 劣性低カリウム性アルカローシスの患者の分類には問題があったが、この特性
の根底にある変異の同定により、分類はより単純にする。現在までに、チアジド
感受性Ｎａ−Ｃｌ共輸送体ＮＣＣＴ（遺伝子座ＳＬＣ１２Ａ３）に変異を有する
全ての患者が、低カリウム性アルカローシス、塩消耗、低カルシウム尿症および
低マグネシウム血症の表現型を有する（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｊ．ら、（１９８
９）Ａｍ．Ｊ．Ｒｏｅｎｔｇｅｎ．１５２：１２５１−１２５３；Ｓｉｍｏｎ，
Ｄ．Ｂ．，ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１２：４−３０）。本発
明者は、これらの患者をギッテルマン（Ｇｉｔｅｌｍａｎ）症候群と呼ぶ。ＮＫ
ＣＣ２、ＲＯＭＫまたはＣＬＣＮＫＢのいずれかに変異を有する患者は皆、低カ
リウム性アルカローシス、塩喪失、および正常マグネシウムレベルの表現型を共
有する（Ｓｉｍｏｎ，Ｄ．Ｂ．，ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１
４：１５２−１５６；Ｓｉｍｏｎ，Ｄ．Ｂ．，ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｇ
ｅｎｅｔ．１３：１８３−１８８）。本発明者は、これらの後者の患者を、それ
ぞれ、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型バーター症候群と呼ぶ。これらの患者のほとんど
は、尿カルシウム：クレアチニン比（Ｕ_Ca：Ｕ_Cr）が上昇していたが、この所見
は、ＣＬＣＮＫＢ変異を有する患者の間で変動するようである。腎石灰沈着症は
ＮＫＣＣ２およびＲＯＭＫに変異を有する非処置の患者においてほぼ不変である
が、この特色はＣＬＣＮＫＢに変異を有する患者にはない。何の変異も同定され
ていない６人の近親バーター家系の中、これらの唯１人がＮＫＣＣ２、ＲＯＭＫ
またはＣＬＣＮＫＢに及ぶ遺伝子座においてホモ接合性であることに注目された
い。この所見は、少なくとも１つの未だ同定されていない遺伝子座の変異の存在
が、この表現型を引き起こすことを示す。

【００６２】 多くの患者がホモ接合性ＣＬＣＮＫＢ欠失を有するという観察により、これら
の変異が正常な遺伝子機能の消失をもたらすことが示される。これらの患者の生
理学的および生化学的研究により、ＴＡＬにおけるクロライド再吸収の欠陥が実
証される。欠陥の機構は、Ｃｌ^-が側底膜を通り血流へと正常に通過できないと 推定されている（図７Ｂ）。この単一の遺伝子の変異によりこの表現型を引き起
こすことができるという事実により、このチャネルの欠乏を完全に補える、他の
余分なクロライドイオン出口の経路があってはならないことを示し、それ故、最
近の相違にもかかわらず、高度に関連した遺伝子ＣＬＣＮＫＡおよびＣＬＣＮＫ
Ａの産物は、ヒトにおける単に余分な機能ではないことが示される。この観察は
、これらの家系においてＣＬＣＮＫＡを変化させる機能的変異が見かけ上存在し
ないことによりさらに支持された。同様に、クロライドが腎上皮の側底膜を通る
他の通過機構も提唱されているが、例えばＫ⁺−Ｃｌ^-共輸送（Ｇｒｅｇｅｒ，Ｒ
．，ら（１９８３）Ｐｆｌuｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．３９６：３２５−３３４）、 他のどの輸送体またはチャネルもこのチャネルの機能の消失を完全に補えないこ
とはＣＬＣＮＫＢ変異の表現型効果から明らかである。

【００６３】 １７個中１０個の見かけ上独立した変異体のＣＬＣＮＫＢ対立遺伝子が欠失し
ているという観察は幾分驚きである。非常に類似したＣＬＣＮＫＡおよびＣＬＣ
ＮＫＢ遺伝子の密接な連鎖は、かかる消失（不等交差または遺伝子変換による遺
伝子欠失を含む）について可能性ある機構を示唆する。このような機構は、数個
のヒト疾病〔サラセミア（Ｌａｕｅｒ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ（１９８０）２０：１
１９−１３０）、赤緑色盲（Ｎａｔｈａｎｓ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８
６）２３２：２０３：２１０）、ステロイド２１−ヒドロキシラーゼ欠損症（Ｗ
ｈｉｔｅ，Ｐ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８８）
８５：４４３６−４４４０）およびグルココルチコイドで治癒可能なアルドステ
ロン症（Ｌｉｆｔｏｎ，Ｒ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５５：２６２
−２６５）を含む〕における変異の原因と同定された。

【００６４】 本発明者は、１つの家系ＢＡＲ２２６に見られる欠失は、イントロン２のＣＬ
ＣＮＫＡとＣＬＣＮＫＢの間の不等交差により生じることを実証した（図６Ａお
よび８参照）。いくつかの他の大きな欠失がまた、各遺伝子のコード領域の３' 末端を越えた相同性セグメントにおける不等交差から生じ得ることが可能である
。注目すべきは、１０人の欠失患者の中で、これらの中の３人がポルトガル祖先
であり（２人がポルトガルで、１人がアメリカで確認された）、５人がアフリカ
系アメリカ人であることである（図８）。

【００６５】 別に、下記でより詳細に議論するように、ＣＬＣＮＫＢ発現はまた、自然に存
在するＣＬＣＮＫＢ遺伝子の発現レベルを増加または減少させる薬剤の同定法に
使用できる。例えば、ＣＬＣＮＫＢタンパク質を発現する細胞または組織を試験
薬剤と接触させ、ＣＬＣＮＫＢ発現に対する薬剤の効果を決定することができる
。ＣＬＣＮＫＢ発現を活性化する薬剤は、ＣＬＣＮＫＢ活性のアゴニストとして
使用でき、一方、ＣＬＣＮＫＢ発現を減少させる薬剤は、ＣＬＣＮＫＢ活性のア
ンタゴニストとして使用できる。ＣＬＣＮＫＢ活性のアンタゴニストは、異常な
体液量により媒介される症状の治療に意図される。好ましいＣＬＣＮＫＢアンタ
ゴニストは、高血圧、鬱血性心不全、および鬱血性心不全に関連した症状を治療
するか、または調節するものを含む。

【００６６】 Ｆ．ＣＬＣＮＫＢコード核酸分子を含むｒＤＮＡ分子 本発明は、さらに、本明細書に記載した、１つ以上の野生型または変化したＣ
ＬＣＮＫＢをコードする配列または本明細書に記載した核酸分子の断片を含む組
換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）を提供する。本明細書で用いる場合、ｒＤＮＡ分子
は、インビトロで分子操作に供したＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子の生成法は
、当該技術分野で周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）参照）
。好ましいｒＤＮＡ分子において、野生型または変化した変異体のＣＬＣＮＫＢ
タンパク質をコードするＣＬＣＮＫＢコードＤＮＡ配列を、１つ以上の発現制御
配列および／またはベクター配列に作動可能に連結する。最も好ましくは、ＣＬ
ＣＮＫＢコード核酸分子は、正常なＣＬＣＮＫＢタンパク質を調節、より具体的
には拮抗する薬剤を同定するシステムで使用するために、本明細書に記載した新
規な変化した、または野生型の変異体の１つをコードする。

【００６７】 本発明のＣＬＣＮＫＢコード配列の１つを作動可能に結合する、ベクターおよ
び／または発現制御配列の選択は、当該技術分野では周知のように、直接、所望
の機能的特性（例えばタンパク質発現）および形質転換する宿主細胞に依存する
。本発明により考えられるベクターは、少なくとも、ｒＤＮＡ分子に含まれるＣ
ＬＣＮＫＢコード配列の、複製または宿主染色体への挿入、および好ましくは発
現を指示できる。

【００６８】 作動可能に連結したタンパク質コード配列の発現を調節するために使用する発
現制御エレメントは、当該技術分野で周知であり、誘導プロモーター、構成プロ
モーター、分泌シグナル、エンハンサー、転写ターミネーターおよび他の調節エ
レメントを含むが、これらに限定されない。好ましくは、宿主細胞培地の栄養分
に応答性であるなど、容易に制御される誘導プロモーターを使用する。

【００６９】 １つの実施の形態において、ＣＬＣＮＫＢコード核酸分子を含むベクターは、
原核レプリコン、すなわち、それで形質転換した原核宿主細胞（例えば細菌宿主
細胞）において染色体内で組換えＤＮＡ分子の自己複製およびを維持を指示する
能力を有するＤＮＡ配列を含む。該レプリコンは、当該技術分野で周知である。
加えて、原核レプリコンを含むベクターはまた、その発現により薬剤耐性などの
検出マーカーを付与する遺伝子を含み得る。典型的な細菌薬剤耐性遺伝子は、ア
ンピシリン（Ａｍｐ）またはテトラサイクリン（Ｔｅｔ）に耐性を付与するもの
である。

【００７０】 原核レプリコンを含むベクターはさらに、大腸菌などの細菌宿主細胞において
ＣＬＣＮＫＢコード遺伝子配列の発現（転写および翻訳）を指示できる原核また
はウイルス性プロモーターを含むことができる。プロモーターは、ＲＮＡポリメ
ラーゼの結合および転写を可能とするＤＮＡ配列により形成された発現制御エレ
メントである。細菌宿主に適合するプロモーター配列は、典型的に、本発明のＤ
ＮＡセグメントの挿入に便利な制限部位を含むプラスミドベクターに提供される
。典型的な該ベクタープラスミドは、Ｂｉｏｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）から入手可能な、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２
２およびｐＢＲ３２９、Ｐｈａｒｍａｃｉａ （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）
から入手可能なｐＰＬおよびｐＫＫ２２３である。

【００７１】 また、真核細胞に適合する、好ましくは脊椎細胞に適合する発現ベクターを使
用して、ＣＬＣＮＫＢコード配列を含む変異体ＤＮＡ分子を発現することができ
る。真核細胞発現ベクターは当該技術分野で周知であり、数個の市販源から入手
できる。典型的には、該ベクターは、所望のＤＮＡセグメントの挿入に便利な制
限部位を具備する。典型的な該ベクターは、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ、３１
２５５番）、本明細書に記載のベクターｐＣＤＭ８、および他の同等な真核発現
ベクターである。

【００７２】 本発明のｒＤＮＡ分子の構築に使用した真核細胞発現ベクターはさらに、真核
細胞において効果的な選択マーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカーを含み得
る。好ましい薬剤耐性マーカーは、その発現によりネオマイシン耐性が生じる遺
伝子、すなわち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子であ
る。Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８２）１
：３２７−３４１。別に、選択マーカーは、別々のプラスミド上に存在し得、２
つのベクターが宿主細胞の共トランスフェクションにより導入され、選択マーカ
ーに適当な薬剤の存在下で、培養することにより選択する。

【００７３】 Ｇ．外来的に供給されたＣＬＣＮＫＢコード核酸分子を含む宿主細胞の調製 本発明はさらに、本発明のヒト野生型または変化したＣＬＣＮＫＢタンパク質
をコードする核酸分子で形質転換した宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核ま
たは真核のいずれかであり得る。ＣＬＣＮＫＢタンパク質の発現に有用な真核細
胞は、細胞系が細胞培養法と適合する限り、および発現ベクターの増殖に、およ
びＣＬＣＮＫＢ遺伝子産物の発現に適合する限り、限定されない。好ましい真核
宿主細胞は、酵母、昆虫および哺乳動物細胞を含むが、これらに限定されず、好
ましくは脊椎細胞（例えばマウス、ラット、サルまたはヒト繊維芽細胞系由来の
細胞）、最も好ましくはヒトＣＬＣＮＫＢタンパク質を天然に発現しない細胞で
ある。

【００７４】 いかなる原核宿主もＣＬＣＮＫＢをコードするｒＤＮＡ分子の発現に使用でき
る。好ましい原核宿主は、大腸菌である。

【００７５】 本発明のｒＤＮＡ分子を用いた適当な細胞宿主の形質転換は、使用したベクタ
ーの型および宿主系に典型的に依存する公知の方法により達成される。原核宿主
細胞の形質転換に関して、電気穿孔法および塩処理法を典型的には使用する。例
えば、Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９７
２）６９：２１１０；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ ｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、
ＮＹ（１９８２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）を参照。ｒＤＮＡを含む
ベクターを用いた脊椎細胞の形質転換に関して、電気穿孔法、カチオン性脂質ま
たは塩処理法を典型的には使用する。例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ（１９７３）５２：４５６；Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７９）７６：１３７３−７６を参照。

【００７６】 形質転換の成功した細胞、すなわち、本発明のｒＤＮＡ分子を含む細胞は、公
知の手法により同定できる。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入から得られた細胞
をクローン化して、単一のコロニーを産生できる。これらのコロニー由来の細胞
を、採取し、溶解し、そのＤＮＡ含量をｒＤＮＡの存在に関して、Ｓｏｕｔｈｅ
ｒｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７５）９８：５０３、またはＢｅｒｅｎｔ
ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９８５）３：２０８により記載の方法等を使用して調
べる、あるいは免疫学的方法を介してアッセイした細胞から産生されたタンパク
質を調べることができる。

【００７７】 Ｈ．組換え核酸分子を用いるＣＬＣＮＫＢタンパク質の産生 本発明は、さらに、本明細書に記載のＣＬＣＮＫＢコード核酸分子の１つを使
用した、ヒト野生型または変化したＣＬＣＮＫＢタンパク質を産生する方法を提
供する。かかるヌクレオチドは、診断プローブとして、スクリーニング研究に使
用するＣＬＣＮＫＢタンパク質の産生において、および研究目的に使用できる。
一般的な用語で言えば、組換えヒト野生型または変化したＣＬＣＮＫＢタンパク
質の産生は、典型的には、以下の工程を含む。

【００７８】 第一に、ＣＬＣＮＫＢタンパク質をコードする核酸分子を得る。ＣＬＣＮＫＢ
コード配列がイントロンにより中断されていない場合、直接、任意の宿主におけ
る発現に適している。中断されている場合、ＣＬＣＮＫＢコード核酸分子のスプ
ライス変異体を産生および使用できるか、またはイントロン含有核酸分子を、適
合可能な真核細胞発現系で使用できる。

【００７９】 次いで、ＣＬＣＮＫＢコード核酸分子を、好ましくは、上記の適切な制御配列
と共に作動可能に連結して配置する。発現単位を使用して適切な宿主を形質転換
し、形質転換した宿主を、ＣＬＣＮＫＢタンパク質の産生が可能な条件下で培養
する。随意的に、ＣＬＣＮＫＢタンパク質を、培地または細胞から単離し、タン
パク質の回収および精製は、ある程度の不純物が許容され得る場合には必要では
ない。

【００８０】 前記の各工程は、様々な方法で実施できる。例えば、所望のコード配列を、ゲ
ノム断片から得、適当な宿主で直接使用し得る。様々な宿主で作動できる発現ベ
クターの構築は、レプリコンと制御配列の適当な組合せを使用して達成される。
制御配列、発現ベクター、および形質転換法は、遺伝子発現に使用する宿主細胞
の型に依存し、前記に詳細に議論した。適切な制限部位は、普通に得られない場
合、コード配列の末端に付加し、よって切出し遺伝子をこれらのベクターに挿入
し得る。当該技術分野の熟練者は、ＣＬＣＮＫＢコード配列を用いてＣＬＣＮＫ
Ｂタンパク質を産生ために使用するのに、当該技術分野で公知の任意の宿主／発
現系を容易に適合させることができる。特によく適したものは、発現タンパク質
を含む脂質小胞の産生を生じる発現系である。該脂質含有小胞は、ＣＬＣＮＫＢ
タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストの同定によく適している。

【００８１】 Ｉ．イオン輸送 前記したように、ＣＬＣＮＫＢタンパク質の変化により、異常なイオン輸送の
結果である病理学的症状が引き起こされる。従って、本発明のＣＬＣＮＫＢタン
パク質の野生型および変化した変異体を、細胞外または細胞内Ｃｌ^-濃度を変化 させる方法に使用できる。一般的に、Ｃｌ^-の細胞外または細胞内濃度は、ＣＬ ＣＮＫＢタンパク質の発現、またはＣＬＣＮＫＢタンパク質の活性を変化させる
ことにより変化できる。Ｃｌ^-レベルの変化はまた、Ｎａ⁺、Ｃａ⁺²、Ｍｇ⁺²およ
び／またはＫ⁺のレベルの変化を間接的にもたらし得る。

【００８２】 Ｎａ⁺、Ｃａ⁺²、Ｃｌ−、Ｍｇ⁺²および／またはＫ⁺の細胞外または細胞内濃度
を変化することが望ましい状況が数多くある。異常な細胞外または細胞内ｐＨに
より、水分貯留、血圧上昇、慢性呼吸性および代謝性アシドーシス、炎症、精子
活性化／不活性化、水脳瘤、緑内障、大腸炎等がもたらされる。例えば、血圧の
高い個体の血圧を下げるために、ＣＬＣＮＫＢ発現を調節することは有用であり
得る。なぜなら、ＣＬＣＮＫＢの変異により罹患個体の血圧は下げられるからで
ある。

【００８３】 従って、ＣＬＣＮＫＢタンパク質またはＣＬＣＮＫＢ遺伝子発現は、Ｎａ⁺、 Ｃａ⁺²、Ｃｌ^-、Ｍｇ⁺²および／またはＫ⁺の細胞外または細胞内濃度を変化させ
る、標的としてまたは手段として使用できる。例えば、ＣＬＣＮＫＢ遺伝子を細
胞に導入し発現して、ＣＬＣＮＫＢ発現を増加させることができる。別に、ＣＬ
ＣＮＫＢによりコードされたタンパク質またはＣＬＣＮＫＢ遺伝子自体の変異形
または野生型形の活性を調節する小分子はまた、ＣＬＣＮＫＢタンパク質機能を
も調節し得る。ＣＬＣＮＫＢ活性を調節する該薬剤は、細胞外または細胞内イオ
ンレベルを調節する手段を提供する。

【００８４】 Ｊ．ＣＬＣＮＫＢタンパク質に結合する薬剤の同定 本発明の別の実施の形態は、本明細書に記載のＣＬＣＮＫＢタンパク質、特に
本明細書に開示した、天然または野生型タンパク質およびその対立遺伝子変異体
のアゴニストまたはアンタゴニストである薬剤の同定法に関する。特に、ＣＬＣ
ＮＫＢタンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストは、第一に、本明細書に記
載のＣＬＣＮＫＢタンパク質の野生型または変化した変異体の１つへの薬剤の結
合能により同定できる。次いで、ＣＬＣＮＫＢタンパク質に結合する薬剤を、Ｃ
ＬＣＮＫＢ発現細胞においてイオン輸送を促進または遮断する能力について試験
できる。

【００８５】 詳細には、１つの実施の形態において、ＣＬＣＮＫＢタンパク質を薬剤と混合
する。ＣＬＣＮＫＢが薬剤と会合できる条件下で混合した後、混合物を分析して
、薬剤がＣＬＣＮＫＢタンパク質に結合し、ＣＬＣＮＫＢ活性をアップレギュレ
ートまたはダウンレギュレートしたかをそれぞれ決定する。アゴニストまたはア
ンタゴニストは、それぞれ、ＣＬＣＮＫＢタンパク質に結合し、ＣＬＣＮＫＢ活
性をアップレギュレートまたはダウンレギュレートできるものとして同定される
。別にまたは連続的に、下記のように、ＣＬＣＮＫＢ活性は、直接、ＣＬＣＮＫ
Ｂ活性のアンタゴニストまたはアゴニストを同定する手段として評価できる。

【００８６】 上記のアッセイで使用したＣＬＣＮＫＢタンパク質は、単離され完全に特徴づ
けられたタンパク質であるか、部分的に精製されたタンパク質であるか、ＣＬＣ
ＮＫＢタンパク質を発現するように変化させた細胞において見られるか、または
ＣＬＣＮＫＢタンパク質を発現するように変化させた細胞の画分であり得る。さ
らに、ＣＬＣＮＫＢタンパク質は、全ＣＬＣＮＫＢタンパク質またはＣＬＣＮＫ
Ｂタンパク質の特異的断片であり得る。ＣＬＣＮＫＢタンパク質を薬剤結合に関
して、例えば分子量シフト、または細胞イオン含量変化によりアッセイできる限
り、本アッセイを使用できることは当業者には明らかである。より簡単には、Ｃ
ＬＣＮＫＢを、固体支持体に結合させ、ＣＬＣＮＫＢ活性を調節する可能性のあ
る薬剤で洗浄することができる。薬剤がＣＬＣＮＫＢに結合できるかを決定する
ことは、それがＣＬＣＮＫＢ活性も調節できるかを決定する第一段階である。Ｃ
ＬＣＮＫＢを調節する薬剤の単離により、ＩＩＩ型バーター担体だけでなく、ま
た高血圧、浮腫、鬱血性心不全、および鬱血性心不全を含む症状、ネフローゼ症
候群、および他の症状（異常体液量を含む）に罹患する個体の治療も可能となり
得る。なぜなら、ＣＬＣＮＫＢ変異および遺伝子自体の欠失は、塩消耗および血
圧下降と関連があるからである。

【００８７】 薬剤がＣＬＣＮＫＢタンパク質に結合するかを同定するために使用した方法は
、基本的に、使用するＣＬＣＮＫＢタンパク質の性質に基づく。例えば、ゲル遅
延アッセイを使用すると、薬剤がＣＬＣＮＫＢタンパク質の可溶性断片に結合し
たかを決定でき、一方、パッチ・クランプ、電圧クランプ、イオン感受性微小プ
ローブまたはイオン感受性クロマフォアを使用すると、薬剤がＣＬＣＮＫＢタン
パク質を発現する細胞に結合し、発現されたタンパク質の活性に影響を及ぼした
かを決定できる。当該分野の熟練者は、特定の薬剤がＣＬＣＮＫＢタンパク質に
結合するかを決定するために数多くの手法を容易に使用できる。

【００８８】 一旦結合が実証されれば、薬剤を、例えば、ＣＬＣＮＫＢタンパク質の野生型
または変化した変異体の活性の調節能について、細胞または卵母細胞系およびＣ
ＬＣＮＫＢ活性を検出するアッセイを使用して、さらに試験できる。例えば、電
圧またはパッチ・クランプ、イオン感受性微小プローブまたはイオン感受性クロ
マフォアおよびアフリカツノガエル卵母細胞または組換え宿主細胞における発現
を使用して、ＣＬＣＮＫＢタンパク質に結合する薬剤がＣＬＣＮＫＢ活性に作用
または拮抗できるかを決定できる。

【００８９】 本明細書で用いる場合、薬剤が、別様に存在するＣＬＣＮＫＢ活性を減少させ
るとき、薬剤はＣＬＣＮＫＢ活性に拮抗すると言われる。好ましいアンタゴニス
トは、選択的に、ＣＬＣＮＫＢに拮抗するが、任意の他の細胞性タンパク質、特
に他のイオン輸送タンパク質（例えばＡＴＰ感受性Ｋ⁺チャネルＲＯＭＫ）には 影響を及ぼさない。さらに、好ましいアンタゴニストは、約５０％以上、より好
ましくは約９０％以上ＣＬＣＮＫＢ活性を減少させ、最も好ましくは実質的に全
てのＣＬＣＮＫＢ活性を消失させる。

【００９０】 本明細書で用いる場合、薬剤が、別様に存在するＣＬＣＮＫＢ活性を増加させ
るとき、薬剤はＣＬＣＮＫＢ活性に作用すると言われる。好ましいアゴニストは
、選択的に、ＣＬＣＮＫＢの正常、変化した、または突然変異体に作用するが、
任意の他の細胞性タンパク質、特に他のイオン輸送タンパク質には影響を及ぼさ
ない。さらに、好ましいアゴニストは、ＣＬＣＮＫＢ活性を、約５０％以上、よ
り好ましくは約９０％以上、最も好ましくはＣＬＣＮＫＢ活性レベルの倍以上、
例えば、ＴＳＣ、ＮＫＣＣ２またはＲＯＭＫイオン輸送タンパク質に影響を及ぼ
すことなく増加させる。

【００９１】 上記の方法でアッセイする薬剤は、ランダムに選択し得るか、または合理的に
選択または設計し得る。本明細書で用いる場合、薬剤をＣＬＣＮＫＢタンパク質
の特異的な配列を考慮せずにランダムに選択する場合、薬剤をランダムに選択す
ると言う。ランダムに選択した薬剤の例は、化学ライブラリーまたはペプチド組
合せライブラリー、または生物体の増殖ブイヨンの使用である。

【００９２】 本明細書で用いる場合、薬剤を、薬剤の作用と関連した標的部位の配列および
／またはそのコンフォメーションを考慮したランダムではない根拠を基に選択す
るとき、薬剤を合理的に選択または設計すると言う。薬剤は、ＣＬＣＮＫＢタン
パク質を作るペプチド配列を利用することにより合理的に選択、または合理的に
設計できる。例えば、合理的に選択したペプチド剤は、アミノ酸配列がＣＬＣＮ
ＫＢタンパク質の断片と同一であるペプチドであり得る。

【００９３】 本発明の薬剤は、例えば、ペプチド、小分子、およびビタミン誘導体、ＣＬＣ
ＮＫＢコードｍＲＮＡまたはＤＮＡに（検出可能なレベルの特異的結合を生成す
るに適当なストリンジェンシー条件下）ハイブリダイズするアンチセンス核酸配
列、ＣＬＣＮＫＢに結合する抗体、並びに炭水化物であり得る。当該技術分野の
熟練者は、本発明の薬剤の構造的な性質に関して全く制限がないことを容易に認
識できる。本発明の薬剤の１つのクラスは、アミノ酸配列を、ＣＬＣＮＫＢタン
パク質のアミノ酸配列に基づいて選択したペプチド剤である。

【００９４】 本発明のペプチド剤は、当該技術分野で公知であるように、標準的な固相（ま
たは液相）ペプチド合成法を使用して製造できる。加えて、これらのペプチドを
コードするＤＮＡは、市販で入手可能なオリゴヌクレオチド合成装置を使用して
合成および標準的な組換え生産システムを使用して、組換え法で生産し得る。固
相ペプチド合成を使用した生産は、遺伝子でコードされないアミノ酸が含まれる
場合、必要である。

【００９５】 本発明の別のクラスの薬剤は、ＣＬＣＮＫＢタンパク質の重要な部位と免疫反
応する抗体である。上記のように、抗体は、抗体により標的化されるＣＬＣＮＫ
Ｂタンパク質の部分である抗原領域を含むペプチドを用いて、適当な哺乳動物被
検者を免疫化することより得られる。これらの抗体は、ポリクローナルまたはモ
ノクローナル、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る。

【００９６】 Ｋ．ＣＬＣＮＫＢタンパク質に結合する薬剤の使用 従来技術の項で記述されたように、ＣＬＣＮＫＢタンパク質は、腎クロライドチ
ャネルに関する細胞内および細胞外イオン濃度の調節に関与する。ＣＬＣＮＫＢ
タンパク質に結合し、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用する薬剤を使
用して、ＣＬＣＮＫＢ機能および活性に関連した生物学的および病理学的プロセ
スを調節できる。詳細には、ＣＬＣＮＫＢにより媒介される生物学的または病理
学的プロセスは、ＣＬＣＮＫＢタンパク質に結合し、ＣＬＣＮＫＢ活性のアゴニ
ストまたはアンタゴニストとして作用する薬剤の治療有効量を被検者に投与する
ことにより調節できる。

【００９７】 本明細書で用いる、被検者とは、哺乳動物がＣＬＣＮＫＢにより媒介される病
理学的または生物学的プロセスの調節を必要とする限り、任意の哺乳動物であり
得る。「哺乳動物」なる用語は、哺乳類に属する個体を意味する。本発明はヒト
被検者の治療に特に有用である。

【００９８】 本明細書で用いる、ＣＬＣＮＫＢにより媒介される生物学的または病理学的プ
ロセスとは、ＣＬＣＮＫＢタンパク質により媒介される様々な細胞事象を意味す
る。病理学的プロセスは、有害または有益な効果のいずれかをもたらす生物学的
プロセスの部類を意味する。例えば、ＣＬＣＮＫＢにより媒介される病理学的プ
ロセスは、塩消耗、低血圧、正常なマグネシウムおよび低または正常カルシウム
尿症を伴う低カリウム性アルカローシスを示す表現型が現れることを特徴とする
。これらの病理学的プロセスは、ＣＬＣＮＫＢタンパク質の活性を減少または増
加させる薬剤を使用して調節できる。好ましくは、薬剤は、本態性高血圧などの
高血圧、および鬱血性心不全および鬱血性心不全に関連した病状の治療において
、正常ＣＬＣＮＫＢタンパク質の活性に拮抗するように働く。また、ＣＬＣＮＫ
Ｂタンパク質の、さもなければそれほど活性でない突然変異体または変異体の活
性を調節、例えば正常下レベルの活性を特徴とする突然変異体、または変異体の
活性を増加させる薬剤が考えられる。

【００９９】 本明細書で用いる場合、薬剤がプロセスの度合いまたは重症度を軽減するとき
、病理学的プロセスを調節すると言う。例えば、薬剤で処置しないで放置したと
きの血圧に比較して患者の血圧が上昇または下降する場合、薬剤は、さもなけれ
ば正常な細胞内および細胞外イオン濃度を含めて。正常ＣＬＣＮＫＢ遺伝子を有
する患者の血圧を調節すると言う。

【０１００】 Ｌ．ＣＬＣＮＫＢタンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストの投与 ＣＬＣＮＫＢタンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストは、非経口、皮下
、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、または口内経路を介して投与できる。別法と
して、または併用的に、投与は経口投与により得る。投与した用量は、受容体の
年齢、健康、および体重、併用処置の種類、ある場合、処置の頻度、および所望
の効果の性質に依存する。例えば、水分貯留、血圧上昇、慢性呼吸性および代謝
性アシド−シス、炎症等の異常イオン輸送から生じた病態を治療するために、天
然ＣＬＣＮＫＢ活性を調節する薬剤を、処置する個体に全身または局所投与する
。下記のように、当該技術分野の熟練者により容易に適応できる、多くの前記薬
剤の投与法がある。

【０１０１】 本発明はさらに、本明細書に記載の方法により同定されるＣＬＣＮＫＢタンパ
ク質のアンタゴニストまたはアゴニストを含む組成物を提供する。個体要求量は
異なるが、各成分の有効量の最適な範囲の決定は、当業者の熟練度の範囲内であ
る。典型的な用量は、約０．１〜約１００ｇ／ｋｇ体重からなる。好ましい用量
は、約０．１〜約１０ｇ／ｋｇ体重からなる。最も好ましい用量は、約０．１〜
約１ｇ／ｋｇ体重からなる。

【０１０２】 薬理学的に活性な薬剤に加えて、本発明の組成物は、作用部位への送達に医薬
的に使用できる製剤へと、活性化合物を加工することを容易にする賦形剤および
助剤を含む適切な医薬的に許容される担体を含み得る。非経口投与に適切な製剤
は、水溶性形態中、例えば水溶性塩の活性化合物水溶液を含む。加えて、活性化
合物の懸濁液および適当である場合、油性注射懸濁液を投与し得る。適した親油
性溶媒またはビヒクルは、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、
例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリドを含む。水性注射懸濁液は、懸濁
液の粘度を増加させる物質を含み得、例えば、ナトリウム カルボキシメチルセ
ルロース、ソルビトール、および／またはジントラン（ｄｉｎｔｒａｎ）を含む
。随意的に、懸濁液はまた安定剤を含んでもよい。また、リポソームを使用して
、細胞への送達に薬剤をカプセル化することができる。

【０１０３】 本発明の全身投与用の医薬製剤は、経腸、非経口または局所投与用に製剤化し
得る。実際、３つの全ての型の製剤を同時に使用して、活性成分を全身投与し得
る。経口投与に適切な製剤は、硬または軟ゼラチンカプセル、丸剤、錠剤（覆膜
錠剤を含む）、エリキシル、懸濁液、シロップ、または吸入およびそれらの徐放
形態を含む。

【０１０４】 Ｍ．併用療法 ＣＬＣＮＫＢ活性を調節する本発明の薬剤は、単独で、または特定の生物学的
または病理学的プロセスを調節する他の薬剤と組合せて提供することができる。
例えば、ＣＬＣＮＫＢ活性を減少させる本発明の薬剤は、イオン輸送体または関
連した輸送体に影響を及ぼす他の薬剤、例えば利尿剤と組合せて投与できる。本
明細書で用いる場合、２つの薬剤を同時投与するか、または薬剤が同時に作用す
るように独立して投与するとき、２つの薬剤を組合せて投与すると言う。

【０１０５】 Ｎ．動物モデルおよび遺伝子療法 ＣＬＣＮＫＢ遺伝子およびＣＬＣＮＫＢタンパク質はまた、種々の情況で遺伝
子療法の標的として働き得る。例えば、ある適用において、ＣＬＣＮＫＢ欠損非
ヒト動物は、標準的なノックアウト方法を使用してＣＬＣＮＫＢ遺伝子を不活性
化して産生できる。別に、かかる動物が生育不能な場合、誘導可能なＣＬＣＮＫ
Ｂアンチセンス分子を使用して、ＣＬＣＮＫＢ活性／発現を調節できる。ＣＬＣ
ＮＫＢまたはアンチセンス分子の発現を組織特異的に指向する変異ＣＬＣＮＫＢ
またはアンチセンスＣＬＣＮＫＢ発現単位を含むように動物を改変できる。かか
る使用において、正常または変異ＣＬＣＮＫＢ遺伝子の発現が不活性化または活
性化により変化した、非ヒト動物、例えばマウスまたはラットが作られる。これ
は、標的化組換えなどの種々の当該技術分野で公知の方法を使用して達成できる
。一旦作り出されれば、ＣＬＣＮＫＢ欠損動物、ＣＬＣＮＫＢを組織特異的に発
現する動物、またはアンチセンス分子を発現する動物を使用して、（１）ＣＬＣ
ＮＫＢにより媒介される生物学的および病理学的プロセスを同定、（２）ＣＬＣ
ＮＫＢと相互作用するタンパク質および他の遺伝子を同定、（３）ＣＬＣＮＫＢ
欠損を克服するために外来的に供給できる薬剤の同定、および（４）活性を増加
または減少させるＣＬＣＮＫＢ内の変異の同定における適当なスクリーンとして
働くことができる。

【０１０６】 例えば、ＣＬＣＮＫＢのヒトミニ遺伝子を組織特異的に発現するトランスジェ
ニックマウスを作りし、通常ＣＬＣＮＫＢを含まない細胞または組織におけるタ
ンパク質の過剰発現の効果を試験することが可能である。この戦略は、他のタン
パク質、すなわちｂｃｌ−２における使用では成功した（Ｖｅｉｓら、（１９９
３）Ｃｅｌｌ ７５：２２９）。かかるアプローチは、ＣＬＣＮＫＢタンパク質
に容易に適用でき、特異的組織領域におけるＣＬＣＮＫＢの可能性ある有益な効
果の結果を知るために使用できる。

【０１０７】 別の実施の形態において、遺伝子療法は、ＣＬＣＮＫＢ媒介生物学的または病
理学的プロセスを調節する手段として使用できる。例えば、治療を受けている被
検者に、アンチセンスをコードする核酸分子またはＣＬＣＮＫＢコード核酸分子
、または機能的ＣＬＣＮＫＢ発現単位などの、ＣＬＣＮＫＢ発現のモジュレータ
ーをコードする遺伝子発現単位を導入することが望ましい。このようなモジュレ
ーターは、細胞または特異的標的組織内で、構成的に産生されるか、または誘導
し得る。これにより、被検者において、ＣＬＣＮＫＢのモジュレーターまたはタ
ンパク質発現の連続的または誘導性供給が可能となる。

【０１０８】 Ｏ．アンチセンス療法 本発明の別の側面は、「アンチセンス」療法における単離した核酸の使用に関
する。本明細書で用いる、「アンチセンス療法」とは、ＣＬＣＮＫＢをコードす
る細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと、細胞性条件下で特異的にハイ
ブリダイズ（例えば結合）して、例えば転写および／または翻訳の阻害により、
コードされたタンパク質の発現を阻害する、オリゴヌクレオチドまたはその誘導
体の投与またはｉｎ ｓｉｔｕおける産生を意味する。結合は、慣用的な塩基対
相補性により、または例えばＤＮＡ二本鎖への結合の場合、二重らせんのメジャ
ーグローブの特異的相互作用を介してなされ得る。一般的に、「アンチセンス療
法」とは、当該技術分野で一般的に採用される範囲の手法を指し、オリゴヌクレ
オチド配列への特異的結合に依拠するいかなる療法をも含む。

【０１０９】 本発明のアンチセンス構築物は、例えば、細胞で転写された場合、ＣＬＣＮＫ
Ｂタンパク質をコードする細胞性ｍＲＮＡの少なくともユニークな一部と相補的
であるＲＮＡを産生する発現プラスミドとして送達できる。別法として、アンチ
センス構築物は、生体外で産生され、細胞への導入時に、ＣＬＣＮＫＢ遺伝子の
ｍＲＮＡおよび／またはゲノム配列とのハイブリダイズにより、発現の阻害を引
き起こす、オリゴヌクレオチドプローブである。このようなオリゴヌクレオチド
プローブは、好ましくは、内因性ヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼおよ
び／またはエンドヌクレアーゼに耐性な修飾オリゴヌクレオチドであり、よって
ｉｎ ｖｉｖｏで安定である。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用する
核酸分子の例は、ＤＮＡのホスホルアミデート、ホスホチオエートおよびメチル
ホスホネート類似体である（また、米国特許第５，１７６，９９６号、第５，２
６４，５６４号、および第５，２５６，７７５号を参照）。加えて、アンチセン
ス療法に有用なオリゴマーの構築に関する一般的なアプローチは、例えば、Ｖａ
ｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら、（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５
８−９７６；およびＳｔｅｉｎら、（１９８８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４８：
２６５９−２６６８により論評されている。

【０１１０】 従って、本発明の修飾オリゴマーは、治療、診断、および研究という意味合い
において有用である。治療適用において、オリゴマーは、一般的にアンチセンス
療法に適当な方法で利用される。前記療法において、本発明のオリゴマーは、全
身および局所または局在投与を含む、種々の投与経路用に製剤化できる。全身投
与において、注射が好ましく、筋肉内、静脈内、腹腔内、および皮下が含まれる
。注射において、本発明のオリゴマーは、液体溶液、好ましくは生理学的に適合
性の緩衝液、例えばハンク溶液またはリンガー溶液に製剤化できる。加えて、オ
リゴマーは、固体形で製剤化し得るか、または使用直前に再溶解または懸濁し得
る。凍結乾燥形も考えられる。

【０１１１】 化合物は、経口、または経粘膜または経皮手段により投与できる。経粘膜また
は経皮投与において、透過するバリヤーに適当な浸透剤を製剤に使用する。この
ような浸透剤は、当該技術分野で公知であり、例えば、経粘膜において、胆汁酸
塩およびフシジン酸誘導体、および界面活性剤を含む。経粘膜投与は、経鼻スプ
レーを介して、または坐剤を使用して行い得る。経口投与において、オリゴマー
は、カプセル剤、錠剤およびトニックなどの慣用的な経口投与形に製剤化する。
局所投与において、本発明のオリゴマーは、当該技術分野で公知の軟膏、ロウ膏
、ゲル、またはクリームに製剤化する。

【０１１２】 治療における使用に加えて、本発明のオリゴマーは、特異的に結合する標的Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡ配列の存在または非存在を検出するための診断薬として使用し
得る。

【０１１３】 本発明のアンチセンス構築物は、ＣＬＣＮＫＢの正常な生物学的活性に拮抗す
ることにより、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ組織培養物の両方における
イオン濃度の操作に使用できる。本発明のこの側面は、高血圧、高血圧、ネフロ
ーゼ症候群、異常体液量を含む他の慢性症状に罹患する個体における使用を特に
意図する。

【０１１４】 以下の実施例は、本発明の様々な側面を説明するものであり、限定するもので
はない。

【０１１５】

【実施例】

実施例１ ＣＬＣＮＫＡおよびＣＬＣＮＫＢの同定および特徴づけ ＤＮＡサンプルを、高または正常カルシウム尿および正常マグネシウムレベル
を有する自然発症低カリウム性代謝性アルカローシスを基準に定義した、６６家
系のバーター症候群家系から集めた。家系を、罹患発端者らの確認を介して募集
した。ゲノムＤＮＡを、標準的な手順によりバーター症候群家系のメンバーの静
脈血から調製した（Ｂｅｌｌ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：５７５９−５７６３（１９８１））。一本鎖ＤＮＡ高次構
造多型解析（ＳＳＣＰ）によって変異についてのＮＫＣＣ２およびＲＯＭＫのコ
ードエキソンのスクリーニングをして、これらの家系の２２人に４０の変異対立
遺伝子が同定された（非刊行データ；Ｂｅｔｔｉｎｅｌｌｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｐｅ
ｄｉａｔｒ．１２０：３８−４３（１９９２）；Ｓｉｍｏｎ，Ｄ．Ｂ．ら、Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１３：１８３−１８８（１９９６））が、残りの家系に
おいてはこれらの遺伝子の変異を同定できなかった（Ｏｒｉｔａ，Ｍ．ら、ＰＲ
ＯＣ．ＮＡＴＬ ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：２７６６−２７７０（
１９８９））。これらの観察により、別の遺伝子または遺伝子群の変異がこれら
のファミリーにおける病気の原因であり得ることが示唆される。

【０１１６】 ＣＬＣＮＫＡおよびＣＬＣＮＫＢのゲノム構成 ヒトゲノムＣＬＣＮＫＡおよびＣＬＣＮＫＢ遺伝子を含むＰＡＣおよびコスミ
ドクローンを、ＣＬＣＮＫＡ ｃＤＮＡの断片へのハイブリダイゼーションによ
り同定した。各遺伝子の地図およびイントロン−エキソン構造は、前記のように
決定した。各遺伝子のイントロンのサイズは、配列データから正確に知られてい
るか、または隣接するエキソンのプライマーを使用したＰＣＲにより各遺伝子か
ら特異的に導いた産物のサイズから推定する。２つの遺伝子間の距離は、Ａ遺伝
子の３'末端およびＢ遺伝子の５'末端に特異的なプライマーを使用して（プライ
マーｈＣＬＣＡ８：ＴＣＡＧＴＣＣＣＴＣＴＴＣＧＴＧＡＣＡＴＣ、およびｈＣ
ＬＣＢ７：ＣＴＣＧＧＡＣＣＡＣＡＣＴＣＴＣＡＡＣＡＧ）、広範囲ＰＣＲによ
り決定した。全ＤＮＡ配列分析は、標準的なプロトコールに従って、ＡＢＩ３７
７機器を使用してジデオキシチェインターミネーション法により実施した。

【０１１７】 これらの知見は、単に不完全な変異検出を反映するものではないことを確かめ
るために、これらの２つの遺伝子座に堅く結合させたマーカーを、１１人の家系
（この中で罹患被検者は、親近婚の子孫であった）に遺伝子型化し、ホモ接合性
による連鎖について試験した（Ｌａｎｄｅｒ，Ｅ．Ｓ．，ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３６：１５６７−１５７０（１９８７））。１１の発端者の１つが、ＮＫＣＣ
２の遺伝子座に及ぶマーカーにホモ接合性を示したが、これらの１１のいずれも
ＲＯＭＫ遺伝子座に及ぶマーカーにはホモ接合性を示さなかった。これらの結果
は、連鎖は全くないとの帰無仮説下での予測から有意に異ならず、他の非連鎖遺
伝子座における変異が、これら全てではなくとも大半の家系のバーター症候群を
説明することを示す。

【０１１８】 ＣＬＣＮＫＡおよびＣＬＣＮＫＢ遺伝子座の特徴づけ 次いで、クロライドチャネルＣＬＣＮＫＡおよびＣＬＣＮＫＢを、これらのフ
ァミリーの候補遺伝子と考えた。これらの遺伝子をコードするＰＡＣおよびコス
ミドゲノムクローンを単離し、ＰＣＲおよびサザンブロットの両方の結果の分析
により、全６つのＰＡＣクローン上に両方の遺伝子の存在が実証され、これは、
ＣＬＣＮＫ ｃＤＮＡを使用したｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより
以前に示唆されたように（Ｓａｉｔｏ−Ｏｈａｒａ，Ｆ．，ら（１９９６）Ｇｅ
ｎｏｍｉｃｓ ３６：３７２−３７４）、これらの遺伝子が互いに密接に連鎖し
ていることを示す。

【０１１９】 各遺伝子のイントロン−エキソン構造を決定すると、２つのチャネル遺伝子は
同一の構造を有し、各チャネルは１９エキソンにコードされていることが判明し
た（図１Ａ）。各遺伝子のイントロンの長さは、一般的に類似している。全体と
して、遺伝子はエキソンにおいて９４％のＤＮＡ配列同一性を示す。

【０１２０】 ゲノムＤＮＡにおけるこれらの２つの遺伝子の局所的関係は、ＰＣＲを実施す
ることににより決定した。ＣＬＣＮＫＡの３'末端から３'を、およびＣＬＣＮＫ
Ｂの５'末端から５'を伸張するプライマーの使用により、その配列が、ＣＬＣＮ
ＫＢの５'末端に結合したＣＬＣＮＫＡの真正な３'末端を含む特異的産物が得ら
れ、これは２つの遺伝子が、ＣＬＣＮＫＢの５'ＣＬＣＮＫＡと共に、同一のＤ ＮＡ鎖から転写されることを示す（図１Ｂ）。産物のサイズから、２つの遺伝子
はゲノムＤＮＡにおいて１１ｋｂ離れていると推量された。この構成は、家系Ｂ
ＡＲ２２６に欠失を有する染色体の構造により、独立して確認される。

【０１２１】 ＳＳＣＰ、ＤＮＡシークエンシングおよびサザンブロット 遺伝子の分子変異体は、前記したようにＳＳＣＰを使用して探した（Ｏｒｉｔ
ａ，Ｍ．，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：２
７６６−２７７０（１９８９））。単一のエキソンに使用した全プライマー対に
より、１５０ないし３００塩基対のサイズの産物が作成された（図９）。同定さ
れた変異体を、ゲルから溶出し、ＰＣＲにより再増幅し、両鎖からのＤＮＡをす
べての場合においてシークエンスした。欠失したエキソンの場合、対照増幅を各
ＰＣＲ反応において実施し、全欠失エキソンを少なくとも２つの独立した増幅に
より確認した。

【０１２２】 ＣＬＣＮＫＡ：ＣＬＣＮＫＢのエキソンの増幅比の比較を、両方の遺伝子のエ
キソン７を増幅するプライマーを使用して３０サイクル増幅して得られた、ＰＣ
Ｒの産物の分析により実施した。産物を、ＳＳＣＰにより分画し、産物をＭｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｄｙａｍｉｃｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ^TMを使用して定量
した。２５および３５サイクルの増幅後の結果も分析したが、有意な差はなかっ
た。

【０１２３】 サザンブロットを、ＢｇｌＩＩでゲノムＤＮＡを消化し、得られた産物を０．
７％アガロースゲル上での電気泳動により分画し、ナイロンメンブランに移し、 ³² Ｐ標識プローブとハイブリダイゼーションした。

【０１２４】 実施例２ ＣＬＣＮＫＡおよびＣＬＣＮＫＢの遺伝子位置決定およびバーター 症候群への連鎖 マーカー遺伝子座の遺伝子型化は、前記した特異的プライマーを使用してポリ
メラーゼ連鎖反応により実施した（Ｓｉｍｏｎ，Ｄ．Ｂ．ら、（１９９６）Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１３：１８３−１８８）。ＮＫＣＣ２への連鎖を試験す
るために遺伝子型化したマーカーは、Ｄ１５Ｓ１３２、Ｄ１５Ｓ１６１およびＤ
１５Ｓ２０９であり、ＲＯＭＫへの連鎖を試験するために遺伝子型化したマーカ
ーは、Ｄ１１Ｓ９６８、Ｄ１１Ｓ９１２、およびＤ１１Ｓ４１９８であった。近
親婚の子孫が罹患した家系におけるホモ接合性マッピングによる連鎖を、帰無仮
説、および家系の一部においてマーカーＤ１Ｓ２７２８、Ｄ１Ｓ４３６およびＤ
１Ｓ２６９７のヘテロ接合性を７４％、７５％および７０％とそれぞれ指定した
別の連鎖仮説の下で、全ての堅く結合したマーカー遺伝子座におけるホモ接合性
の可能性の計算から分析した（Ｇｙａｐａｙ，Ｇ．，ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎ
ｅｔ．７：２４６−３３９（１９９４））。帰無仮説下で、全マーカーがホモ接
合性である可能性は、発端者が、偶然に先祖からの下降により両対立遺伝子上に
同じ染色体セグメントを遺伝する可能性、および独立したマーカーが状態により
ホモ接合性となる可能性である。遺伝子座の異質性を可能とする、連鎖に関する
ＬＯＤスコアは、ＬＲ（ＣＬＣＮＫ）＋（１−ａ）（ここで、ａは、遺伝子座Ｃ
ＬＣＮＫに結合したファミリーの比であり、ＬＲ（ＣＬＣＮＫ）はＣＬＣＮＫで
の連鎖が好ましい可能性比である）から計算し、ＬＯＤスコアは、全ファミリー
について合計したこれらの値のｌｏｇ₁₀として計算する（Ｏｔｔ，Ｊ．、Ａｎａ
ｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｌｉｎｋａｇｅ（Ｊｏｈｎｓ
Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ
１９８５）。

【０１２５】 これらの遺伝子座は、ＣＬＣＮＫＡ（マーカーＣＬＣＫＡ１３）のエキソン１
３の三対立遺伝子多形の遺伝形質を第１染色体上の他の遺伝子座の遺伝形質と比
較して、ＣＥＰＨ家系における連鎖の分析により、ヒト遺伝子地図上に位置づけ
た。連鎖の多点分析により、組換え割合画分が０でのＤ１Ｓ４３６への連鎖にお
いて１５．８の見込みの消失（ＬＯＤ）スコアが実証され、遺伝子が１０００：
１以上の見込みで、Ｄ１Ｓ５０７とＤ１Ｓ１９９により挟まれる（フランキング
）される区間内の１０ｃＭセグメントに位置づけた（図１Ｃ）。

【０１２６】 これらの結果により、ＣＬＣＮＫＡおよびＣＬＣＮＫＢに密接に連鎖する高度
に多形な遺伝子座が同定された。これら３つの遺伝子座、Ｄ１Ｓ４３６、Ｄ１Ｓ
２６９７およびＤ１Ｓ２７２８（ＣＬＣＫＡ１３での推定組換え画分、ゼロ、ゼ
ロおよび３ｃＭ）を、ＮＫＣＣ２またはＲＯＭＫへの連鎖の徴候を全く示さなか
った１１の近親ＩＩＩ型バーター症候群血統において遺伝子型化した。これらの
家系の５人の罹患被検者は、全ての遺伝子座においてホモ接合性であり（図２）
、これらのファミリーの部分集合における連鎖と一致する。遺伝子座異質性を可
能とする、バーター症候群およびＣＬＣＮＫＡ／ＣＬＣＮＫＢの連鎖におけるＬ
ＯＤスコアは、組換え画分ゼロにおいて４．７２であり、連鎖について有意な証
拠を提供する。

【０１２７】 実施例３ ＣＬＣＮＫＢ欠失 これらの前記の発見は、ＮＫＣＣ２またはＲＯＭＫに変異を示さないバーター
家系において、変異についてＣＬＣＮＫＡおよびＣＬＣＮＫＢを検証する動機付
けとなった。全エキソンを、選択的にＣＬＣＮＫＡまたはＣＬＣＮＫＢを増幅す
るか、または乱雑にこれらの非常に類似した遺伝子の両方のセグメントを増幅す
るプライマーを使用して、ＳＳＣＰにより、各家系の発端者における変異体につ
いてスクリーニングした。

【０１２８】 結果は、罹患した１０家系のメンバーにおいて、全ＣＬＣＮＫＢ遺伝子または
この遺伝子の実質的な部分の増幅はないことを実証し（図３Ａ〜Ｅおよび図５参
照）、これはＣＬＣＮＫＢのホモ接合性消失と一致する。例えば、家系ＢＡＲ２
５１（標識２５１−１）の発端者は、ＣＬＣＮＫＢのエキソン１〜２、６〜９ま
たは１７〜１９を特異的に増幅するプライマーを使用して、増幅が全くなされな
いことを示す（図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃ）。同様に、これらの遺伝子両方を増幅
するプライマーを使用した場合、ＣＬＣＮＫＢの産物は存在しないが、ＣＬＣＮ
ＫＡの産物は存在し（図３Ｄおよび３Ｅ）、ＣＬＣＮＫＢの個々のエキソンはい
ずれも、ＰＣＲにより増幅できない（図５）。このＣＬＣＮＫＢの不在は疾病と
共に分離し、ホモ接合性消失を示す子供の親６人は誰も、ＣＬＣＮＫＢがなくホ
モ接合性ではなかった（図３Ｅ）。ＣＬＣＮＫＢの完全な消失は、ＣＬＣＮＫＢ
のエキソン３〜９または１０〜１７に対応するｃＤＮＡプローブを使用した、ゲ
ノムＤＮＡのサザンブロットにより確認される（図４）。この同じ形式のＣＬＣ
ＮＫＢの完全な消失が、６人の追加の家系において見られる（図３−５）。ＣＬ
ＣＮＫＢエキソンの不在は、スクリーニングした８０人の非関連、非罹患被検者
には検出されなかった。

【０１２９】 観察されたＣＬＣＮＫＢの消失は、２つの別の機構−欠失またはＣＬＣＮＫＡ
配列との遺伝子変換から生じえる。これらの可能性は、これらの変異対立遺伝子
のヘテロ接合性担体におけるＣＬＣＮＫＡとＣＫＣＮＫＢ遺伝子の数を比較する
ことにより区別できる。遺伝子欠失の場合、ヘテロ接合体は、２コピーのＣＬＣ
ＮＫＡおよび１コピーのＣＬＣＮＫＢを有し、遺伝子変換の場合、この比は３：
１である。ＣＬＣＮＫＡおよびＣＬＣＮＫＢのエキソン７の増幅を、１０人の正
常な対照、およびＣＬＣＮＫＢのホモ接合性消失の患者の６人のヘテロ接合性親
において、両方の遺伝子を増幅するプライマーセットを使用して比較した（例え
ば、図３Ｅ）。この結果により、ヘテロ接合体においてＣＬＣＮＫＡ：ＣＬＣＮ
ＫＢの平均比１．９７：１が実証され（標準偏差０．１２、範囲１．８７〜２．
１０：１）、これは欠失に予期された２：１に非常に近似し、遺伝子変換に予期
される３：１とは不一致であった。

【０１３０】 ２人の家系が、ＣＬＣＮＫＢの部分のホモ接合性消失を示した。家系ＢＡＲ２
７６において、ＰＣＲにより、ＣＬＣＮＫＢのエキソン１５〜１９が不在である
ことが判明し、サザンブロットにより、本発明者らがＣＬＣＮＫＢのエキソン１
０〜１４を含むと推論する誘導体産物による、正常３'ＢｇｌＩＩ断片の置換が 実証された（図４Ａ）。同様に、ＢＡＲ２４２は、ＰＣＲによりエキソン３〜１
２の不在を示し（図３および５）、この場合、サザンブロットにより、正常５' ＢｇｌＩＩ産物（図示せず）の不在、および正常３'ＢｇｌＩＩ産物のサイズの 断片へのはるかに弱いハイブリダイゼーションが示され（図４Ａ）、これは誘導
体断片と一致する。

【０１３１】 実施例４ 不等交差によるＣＬＣＮＫＢの欠失 ＣＬＣＮＫＡおよびＣＬＣＮＫＢの堅い連鎖およびトポロジーは、これらの遺
伝子間または相同的なフランキング配列のブロック間の不等交差は、ＣＬＣＮＫ
Ｂ配列の欠失を引き起こす１つの機構になり得るかの問題を提起する。不等交差
がこれらの遺伝子のコードエキソン間で生じた場合、ＣＬＣＮＫＡおよびＣＬＣ
ＮＫＢ配列の相互消失が見られる（図６Ａ（ｉｉ））。かかる同形式がＢＡＲ２
２６において見られ、ＣＬＣＮＫＢのホモ接合性消失はエキソン１〜２のみであ
り、ＣＬＣＮＫＡのホモ接合性消失はエキソン３〜１９のみである（図３〜５）
。不等交差によりＣＬＣＮＫＡとＣＬＣＮＫＢ配列が融合した場合、エキソン２
でＣＬＣＮＫＡに特異的な５'プライマーおよびエキソン４でＣＬＣＮＫＢに特 異的な３'プライマーを使用したＰＣＲにより、この家系のメンバーに２．０ｋ ｂの産物が生じるが、対照には生じるはずはない。この予測は一致する（図６Ａ
（ｉ））。この産物のＤＮＡ配列の分析により、この断片はＣＬＣＮＫＡおよび
ＣＬＣＮＫＢ配列の分子キメラを含むことが確認され、ＣＬＣＮＫＡ特異的配列
はエキソン１および２を通って伸展し、次いでイントロン２でＣＬＣＮＫＢ特異
的配列に交差している。ＣＬＣＮＫＢ特異的調節配列が遺伝子の５'または付近 に存在すると仮定し、本発明者らは、この唯一残った遺伝子が、正常ＣＬＣＮＫ
Ａとして調節され、結果として（想定）ＣＬＣＮＫＢ発現形式が消失すると推量
する。

【０１３２】 ＣＬＣＮＫＡエキソン２（ｈＣＬＣＡ１３：ＧＣＴＡＴＧＣＣＡＴＧＡＡＣＴ
ＴＴＧＣＣＡＴＣ）およびＣＬＣＮＫＢエキソン４（ｈＣＬＣＢ４：ＡＧＧＡＡ
ＧＡＧＧＧＴＧＣＴＧＣＣＡＣＡＧ）の特異的プライマーを使用して、この家系
の親および２人の罹患メンバーにおいて独特なキメラＰＣＲ産物を増幅した。

【０１３３】 実施例５ ＣＬＣＮＫＢにおけるミスセンスおよびナンセンス変異 病気と共分離する、コードされたＣＬＣＮＫＢ遺伝子産物を変化させる７個の
異なる変異も同定した（図６Ａおよび６Ｂ）。４家系の症例は、同定した変異に
ついてホモ接合性であり、２つの発端者は複合ヘテロ接合体であり、単一の変異
が１家系において同定された（図８）。２つの見かけ上関係のないトルコ家系Ｂ
ＡＲ２７４およびＢＡＲ２９４の症例は、コドン１２４のプロリンをロイシンに
置換する、同一の変異におけるホモ接合性である（図６Ｂ（ｉｖ））。このプロ
リン残基は、ＣＬＣファミリーの全ての哺乳動物メンバーに保存されている。２
人のスペイン家系ＢＡＲ２０５およびＢＡＲ１８４は、第５膜貫通ドメインのコ
ドン２０４のアラニンをトレオニンで置換したホモ接合性である（図６Ｂ（ｉｉ
ｉ））。Ｓ．ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅのＣＬＣ関連チャネルを含む、全ＣＬＣチャ
ネルメンバーが、高度に保存された疎水性セグメントＡＡＡＡまたはＡＧＡＡ内
の、この位置にアラニンまたはグリシンを有する。他のミスセンス変異は、Ｒ４
３８Ｃ（ここでＲ４３８はＣＬＣファミリーの全メンバーに保存されている）、
Ａ３４９Ｄ（これは第８トランスメンブランドメインに荷電残基を導入する（図
６Ｂ（ｉ））、およびＹ４３２Ｈを含む。

【０１３４】 これらのミスセンス変異に加えて、コドン５１３にナンセンス変異が（図６Ｂ
（ｉｉ））、および共通スプライス部位ＧＴをＴＴに変異するエキソン９の末端
に１つのスプライス部位変異が存在する。この部位の消失により、正常なスプラ
イシングの消失がもたらされるか、または先行する塩基はＧであるので、異常な
スプライシングによりフレームシフト変異がもたらされると予測される。

【０１３５】 これらのどの変異も、１６０の対照染色体上で同定されなかった。さらに、非
保存的な変異がＣＬＣＮＫＡには全く見られず、これらの変異の特異性を示唆す
る。要約すると、本発明者らは、１７人のバーター症候群家系における３３の変
異対立遺伝子を説明する、ＣＬＣＮＫＢを変化させる１１の異なる変異を同定し
た。

【０１３６】 本発明者らは、追加のバーターＩＩＩ型症候群変異を同定し、これは表１に示
す。これらの変異は、上記の方法を使用して得た。

【０１３７】

【表１】

【０１３８】 実施例６ ＣＬＣＮＫＢ変異を有する患者の生理学的および臨床学的特徴 ＣＬＣＮＫＢに変異を有する患者の生化学的および臨床的特徴の検証により、
全員が、血清Ｋ⁺レベルが１．１と低い自然発症低カリウム血症であり、全員が 、率直に上昇した、または正常の上限の血清重炭酸イオンレベルを有し、ある患
者らは重炭酸イオンレベルが顕著に上昇していることが判明する（図８）。全員
が塩消耗の徴候が見られ、１２の症例で生後１年目で脱水および生命を危険にさ
らす低血圧が示された。残り５つの症例は、より高齢にて多尿および／または脱
水症を示し、全員が、年齢および性における平均の少なくとも１つ下の標準偏差
における血圧を示した。全員とも、塩補充に依存性であった。研究した６人の患
者の中で、全員が血漿レニン活性および血漿アルドステロン濃度が上昇し、体液
量の枯渇が確認された。腎臓での水負荷の処理（これにより厚上行脚における分
別クロライド再吸収の測定が可能となる）は、発端者ＢＡＲ２１８およびＢＡＲ
２２６において決定された。ＴＡＬにおける塩素イオンの分別再吸収は、通常８
０〜９５％であり、これらの２人の患者において、分別塩素イオン再吸収は、そ
れぞれ２４％および２５％と大きく抑制され、これによりＴＡＬにおける塩素イ
オン再吸収の顕著な欠陥が示唆される。同様な結果が、３つの追加の発端者にお
いて得られた。尿カルシウム：クレアチニン比は広く変動するが、１７の発端者
中１１が高カルシウム尿症（比０．５〜１．７）であり、６人が正常な範囲の値
であった。

【０１３９】 これらの患者の臨床的特徴の重症度には著しい差があり、低カリウム性アルカ
ローシスおよび呼吸停止を伴う致死に近い容量の枯渇（ＢＡＲ１５７およびＢＡ
Ｒ１９０）または大量の静脈内Ｋ⁺置換（２０ｍｅｑ／ｋｇ／日）の必要性（Ｂ ＡＲ２７６）から、１６歳で多尿および虚弱しか提示しない非常に軽度な病状（
ＢＡＲ１８４）までの範囲に及ぶ。ホモ接合性欠失の患者間でさえ、提示された
年齢および臨床的重度は非常に変動する（図８）。

【０１４０】 この広い臨床的変動にもかかわらず、ＣＬＣＮＫＢ変異を有する患者を、ＮＫ
ＣＣ２またはＲＯＭＫに変異を有する患者からほぼ完全に識別する１つの所見が
ある。腎石灰沈着症（処置しない場合、腎不全をもたらす腎石灰化）は、生誕時
に後者のグループには、ほぼ不変的に存在するが（実験した２０の発端者中１９
において腎超音波により診断された）、この所見は、ＣＬＣＮＫＢに変異を有す
る全１７の発端者らには存在しない。この表現型のこれらの２グループ間での差
異は、非常に意義がある（ｃ²１ｄｆ＝３３．１、ｐ＜０．０００１）。この差 異がカルシウム取扱いまたは他の生理学的続発症における差異に起因するかどう
かは、さらなる調査が必要である。バーターおよびギッテルマン症候群の異なる
診断に関する追加の資料については、Ｓｉｍｏｎ，Ｄ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ
．Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．、７：４３−７（１９９８）；Ｓｉｍ
ｏｎ，Ｄ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１０：４５０−４
５４（１９９８）を参照。これはその全体を引用文献としてここに援用する。

【０１４１】 提示した前記の議論および実施例は、単にある好ましい実施の形態の詳細な記
載を提示すると理解されるべきである。それ故、様々な修飾および同等なものは
、本発明の精神および範囲から逸脱することなく実施され得ることは当業者には
明白である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＣＬＣＮＫＡとＣＬＣＮＫＢ遺伝子の構成図である。 Ａ． ＣＬＣＮＫＡとＣＬＣＮＫＢのイントロン−エキソン構成 注釈をつけた以外では、ＣＬＣＮＫＡとＣＬＣＮＫＢは同一の構成をしており
、単一の模式図を示す。灰色のボックスはコードエキソンを示し、細い水平線は
非コードゲノムＤＮＡを示す。各コードエキソンの第一塩基のコドン番号とその
コドン内での位置を示す。例えば、エキソン２の始めにある記号３４₂は、この エキソンの第一塩基がコドン３４の第二塩基であることを表す。遺伝子の上にイ
ントロンの推定サイズを示す。示したところで、記号ＡとＢは、それぞれＣＬＣ
ＮＫＡとＣＬＣＮＫＢのイントロンの異なるサイズを表す。ＣＬＣＮＫＡとＣＬ
ＣＮＫＢのゲノム配列のデータはＧｅｎＢａｎｋに寄託した（登録番号：それぞ
れＺ２３０６４３とＺ３０６６４）。 Ｂ． ＣＬＣＮＫＡとＣＬＣＮＫＢの局所的関係 ＣＬＣＮＫＡとＣＬＣＮＫＢの局所的関係図である。２つの遺伝子の模式図を
示す。模式図の上に、制限酵素ＢｇｌＩＩの切断位置を示し、距離をｋｂ対で示
す。ＣＬＣＮＫＡ５'ＣＬＣＮＫＢで、２つの遺伝子は同じ転写方向に編成され ており、２つの遺伝子間の距離は１１ｋｂである。 Ｃ． ヒト遺伝子地図上でのＣＬＣＮＫ遺伝子座の位置決定 ヒト遺伝子地図上でのＣＬＣＮＫ遺伝子座の位置決定図である。マーカーＣＬ
ＣＫＡ１３の分離をＣＥＰＨ家系中の他の染色体１遺伝子座の分離と比較したマ
ルチポイント連鎖の結果を、地図の位置に対してプロットしたロッドスコアとし
て表す。地図上のマーカー遺伝子座の位置を示し、ＣＬＣＮＫ遺伝子座の位置と
の１０００：１補助間隔を図の上部の水平線で示す。

【図２】 バーター症候群がＣＬＣＮＫに関連している証拠。 ５つの血縁バーター家系における家族関係を示す。罹患患者を“＃”または“
！”の記号で示す。マーカー遺伝子座でＣＬＣＮＫに強く連鎖した遺伝子型を示
してある。これらの５つの家系は、すべての遺伝子座でＣＬＣＮＫに強く連鎖す
るホモ接合性を示す。

【図３】 ＩＩＩ型バーター症候群の患者におけるＣＬＣＮＫＢのホモ接合性消失を示す
。 Ａ〜Ｃ． ＣＬＣＮＫＢに特異的なプライマーを用いて、正常な被験者あるい
は無関係なバーター家系の発端者のＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲした。Ｐ
ＣＲの産物を１％アガロースゲル電気泳動により分画した。各反応に用いたテン
プレートＤＮＡの名前を各レーンの上に表示する（「ｎｌ」は、病気でない正常
なコントロールのゲノムＤＮＡを示す）。正のコントロールとして、無関係な遺
伝子ＮＣＣＴのエキソン１に特異的なプライマーを各反応に加え、産物がないこ
とが単にＰＣＲの失敗でないことを確認した。（Ａ）エキソン１と２のフォワー
ド（順方向）およびリバースプライマー（逆方向）を用いての増幅（図９のｈＣ
ＬＣＮＫＢｅｘ１−２）。（Ｂ）エキソン６と９のフォワードおよびリバースプ
ライマーを用いての増幅（図９のｈＣＬＣＮＫＢｅｘ６−９）。（Ｃ）エキソン
１７と１９のフォワードおよびリバースプライマーを用いての増幅（図９のｈＣ
ＬＣＮＫＢｅｘ１７−１９）。 Ｄ〜Ｅ． ＣＬＣＮＫＡとＣＬＣＮＫＢ両方のエキソン８（パネルＤ）とエキ
ソン７（パネルＥ）を増幅するプライマーを用いてＰＣＲを実施し、放射性産物
をＳＳＣＰにより分析した。ＣＬＣＮＫＡとＣＬＣＮＫＢから生じるそれぞれの
産物を示す。パネル（Ｅ）では、２つの家系（ＢＡＲ２３８−１およびＢＡＲ２
５１−１）の発端者らを彼らの親（２３８〜２と３、２５１〜２と３）と病気で
ない兄弟（２３８〜４）と並べて表す。

【図４】 サザンブロッティングによるＣＬＣＮＫ配列の消失図である。 表示した家系の発端者らのゲノムＤＮＡをＢｇｌＩＩで切断し、０．７％アガ
ロースゲル電気泳動にて分画し、変性し、ナイロンメンブレンに転写した。ＣＬ
ＣＮＫＡ ｃＤＮＡのエキソン１０〜１７（パネルＡ）あるいはエキソン３〜９
（パネルＢ）に対応する³²Ｐ標識ＣＬＣＮＫＢプローブをフィルターにハイブリ
ダイズした。パネルＡで、正常被験者ではＣＬＣＮＫＢのエキソン１０〜１７を
含む断片に相当する９．５ ｋｂ長の単一断片が得られるのがわかる。ＣＬＣＮ
ＫＡは、８．５および６．５ ｋｂの２つの対立遺伝子断片を持つ、ＲＦＬＰを
表す。家系ＢＡＲ２７６は ＰＣＲにより部分的欠失を示す。部分的欠失による
産物に一致する異常な断片の位置を矢印により表す。パネルＢでは、正常被験者
は、ＣＬＣＮＫＢから２．０ ｋｂ断片およびＣＬＣＮＫＡからの２．８ ｋｂ
断片を生じる。

【図５】 ＩＩＩ型バーター症候群の患者で欠失しているＣＬＣＮＫＡとＣＬＣＮＫＢエ
キソン このデータは、ＩＩＩ型バーター症候群を表す家系のメンバーにおけるエキソ
ンの消失を示す。これらのメンバーの大多数は、ＣＬＣＮＫＢ遺伝子を完全に欠
失している。３人は、ＣＬＣＮＫＢの機能消失へと導くいくつかのエキソン欠失
を選択的にしていた（ＢＡＲ２４２、ＢＡＲ２７６、およびＢＡＲ２２６）。

【図６】 ＩＩＩ型バーター症候群の患者での不等交差と点突然変異 Ａ． 家系ＢＡＲ２２６で欠失を生じる不等交差 （ｉ）ＣＬＣＮＫＡに特異的なフォワードプライマーとＣＬＣＮＫＢに特異的な
リバースプライマーを用いてＰＣＲを行った。産物をアガロースゲルで分画した
。病気の２例と彼らの親は不等交差によって予測される。不等交差から２．０
ｋｂの産物を生じるが、８０人の無関係、正常被験者のうち誰もこれらのプライ
マー用いて産物を生じない。この産物の配列によりそのキメラの性質が確認され
る。 （ｉｉ）ＢＡＲ２２６でのキメラ遺伝子の起源としての不等交差の模式図、不等
交差によってできた子孫染色体の１つは、５' ＣＬＣＮＫＡ配列がさらに遠位 のＣＬＣＮＫＢ配列に融合した単一のキメラ遺伝子を有する。 Ｂ． ＩＩＩ型バーター症候群患者におけるＣＬＣＮＫＢのミスセンスおよび
ナンセンス突然変異 ＳＳＣＰおよびＤＮＡ配列分析によって変異体を同定した。オートラジオグラ
フの代表的なサンプルを各パネルの上部に表し、変異型（左）と野生型対立遺伝
子（右）のセンス鎖に対応するＤＮＡ配列を各パネルの下部に示す。家系番号を
表示し、バーター症候群の患者を星印“＊”で表す。記号“ｎｌ”は、無関係な
正常被験者を示す。矢印は、バーター症候群家系に特異的な変異体を示す。変異
体の塩基を配列図の上に星印“＊”によって表す。 （ｉ）ＢＡＲ２８２では、ヘテロ接合性一塩基置換により、Ａ３４９のコドンＧ
ＣＴがＤ３４９のＧＡＴに変化している。親（被験者２と３）を分析することに
より、被験者２である母親からの伝達が示される。 （ｉｉ）ＢＡＲ２８３では、ヘテロ接合性置換により、Ｑ５１３のＣＡＧコドン
がＵＡＧ終止コドンに変化している。 （ｉｉｉ）家系ＢＡＲ１８４およびＢＡＲ２０５では、ホモ接合性ミスセンス突
然変異により、Ａ２０４のＧＣＧがＴ２０４のＡＣＧに変化している。 （ｉｖ）ＢＡＲ２７４とＢＡＲ２９４では、ホモ接合性ミスセンス突然変異によ
り、コドンＣＣＧ Ｐ１２４がＣＴＧ Ｌ１２４に変化している。

【図７】 突然変異と機能の模式図である Ａ． ＩＩＩ型バーター症候群患者におけるＣＬＣＮＫＢの点突然変異の位置 ＣＬＣＮＫＢの模式図を表し、１２回の形質膜の貫通を描写した（Ｊｅｎｔｓ
ｃｈ，Ｔ．Ｊ．ら、（１９９６）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ １９：１１７−１２６）
。バーター症候群で同定された変異の位置と結果を示す。 Ｂ． 腎臓の肥大上行脚（ＴＡＬ）でのＮａＣｌ再吸収の生理。 ＴＡＬ細胞の模式図を表す。ＮａＣｌは、腎尿細管の管腔からＮａ−Ｋ−２Ｃ
ｌ共輸送体（ＮＫＣＣ２の遺伝子産物）を介して頂端膜を越えて細胞に入る。Ｋ ⁺ は、Ｋ⁺チャネルＲＯＭＫを介して管腔に再循環され、ＴＡＬに入るＮａＣｌの
大きな画分の再吸収を可能とする。Ｎａ⁺は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼを介して 出ていくが、側底膜を越えてのＣｌ^-の排出はＣｌ^-チャネルを介すと考えられる
。ここでの証拠により、ＣＬＣＮＫＢがＴＡＬでの塩素イオン再吸収の主要なメ
ディエータであることが実証される。

【図８】 バーター症候群の発端者の臨床的特徴 バーター症候群に患う患者の病歴の詳細：診断（Ｄｘ）の年齢；血清カリウム
レベル（ｍＭ，ｎｌ ３．５〜５．０）；「ＨＣＯ₃ ^-」は血清炭酸水素塩である
（ｍＭ，ｎｌ ２２〜２８）；“Ｕ_ca／Ｕ_cr”、尿中カルシウム：クレアチン比
（ｍＭ：ｍＭ，ｎｌ ０．２〜０．４）。「Ｎｅｐｈｒｏｃａｌ」は、超音波検
査で決定される腎石灰化症である。“＊”はホモ接合性の変異の存在を示す。“
ｎｌ”は正常範囲を指す。

【図９】 ヒトＣＬＣＮＫＢ遺伝子の解析用ＰＣＲプライマーである。 開始コドンの基部に位置するｈＣＬＣＮＫＢｅｘ１−フォワードと正常な終止
コドンの末端に位置するｈＣＬＣＮＫＢｅｘ１９−リバース以外は、ＳＳＣＰプ
ライマーはすべてイントロン内にある。「＊」はＣＬＣＮＫＢ特異的プライマー
を表わし、他のプライマー対はＣＬＣＮＫＡとＣＬＣＮＫＢの両方を増幅する。
広範囲ＰＣＲプライマーは、すべてＣＬＣＮＫＢエキソン内に位置する。

【図１０】 ＣＬＣＮＫＢのヌクレオチドおよびアミノ酸配列である。 Ａ． ＣＬＣＮＫＢのヌクレオチド配列 ＣＬＣＮＫＢ核酸配列はＫｉｅｆｅｒｌｅ，Ｓ．ら、（１９９４），（Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．），９１：６９４３−
６９４７に発表され、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号はＺ３０６４４である。 Ｂ． ＣＬＣＮＫＢのアミノ酸配列である。 ＣＬＣＮＫＢタンパク質は６８７アミノ酸長である。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号
は５２１０７４である。 Ｃ． ＩＩＩ型バーター症候群患者のＣＬＣＮＫＢにおける変異 この表は、５人の患者で見出された一ヌクレオチド突然変異を一覧表にしたも
ので、ＣＬＣＮＫＢ核酸およびタンパク質がそれぞれ図１０Ａと図１０Ｂに示し
た野生型配列から変化している。核酸残基番号は、残基の近傍の番号によって示
す。変化したアミノ酸残基番号は、残基の近傍の番号で示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA39 AA40 BB20 CA25 CB01 CB09 CB17 CB21 DA12 DA13 DA14 DA36 DA80 DB16 FB02 FB03 FB04 FB05 FB06 JA20 4B024 AA01 AA11 CA01 CA09 CA11 CA20 DA03 HA11 HA17 4B063 QA01 QA17 QA18 QA19 QQ08 QQ42 QQ52 QQ79 QR48 QR51 QR56 QR59 QR62 QR77 QS24 QS25 4H045 BA10 EA23

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被検者から核酸サンプルを得ること、そして ＣＬＣＮＫＢ遺伝子が存在するか、または変異しているかを決定する段階を含む
   ことを特徴とする、被検者における腎イオン輸送の欠陥に関連した病理学的症状
   を診断する方法。
2. 【請求項２】 前記変異を、ＩＩＩ型バーター症候群に特徴的な既知の変異
   と比較する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記変異の性質が、ＩＩＩ型バーター症候群とギッテルマン
   症候群、ＩＩＩ型バーター症候群と他の低または高血圧症状、またはＩＩＩ型バ
   ーター症候群とＩおよびＩＩ型バーター症候群との間の異なる診断の実施に寄与
   する、請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記核酸サンプルを、ＣＬＣＮＫＢタンパク質の不在を導く
   変異の存在、またはヒトＣＬＣＮＫＢタンパク質（ここでＣＬＣＮＫＢタンパク
   質は、野生型ヒトＣＬＣＮＫＢタンパク質と比較した場合、１つ以上のアミノ酸
   の変化を含み、該変化は、ＩＩＩ型バーター症候群の（ホモ接合性変化）または
   ＩＩＩ型バーター症候群（ヘテロ接合性変化）の担体の診断となる）をコードす
   る核酸分子の存在について分析することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
5. 【請求項５】 前記方法は、核酸増幅法、および前記ＣＬＣＮＫＢコード核
   酸分子の少なくとも１つのエキソンを挟み、選択的に増幅するプライマーを使用
   して、前記サンプルにおける核酸分子を増幅し、変異が該増幅核酸分子に存在す
   るかを決定する段階を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記方法は、核酸増幅法、および前記ＣＬＣＮＫＢコード核
   酸分子の少なくとも１つのエキソンを挟み、選択的に増幅するプライマーを使用
   して、前記サンプルにおける核酸分子を増幅し、変異が該増幅核酸分子に存在す
   るかを同定する段階を含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 イオン輸送に変化を付与する、タンパク質の不在または変異
   タンパク質の存在を決定する方法であって、ＩＩＩ型バーター症候群に特徴的な
   変異の存在についてタンパク質サンプルを分析する段階を含むことを特徴とする
   前記方法。
8. 【請求項８】 前記変異タンパク質は、図１０Ｃおよび表１に列挙したＣＬ
   ＣＮＫＢ変異から選択することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記方法を用いて、イオン輸送に変化を付与するタンパク質
   の不在または変異タンパク質の存在を決定し、該方法はヒト腎クロライドチャネ
   ルタンパク質ＣＬＣＮＫＢにおける変異の不在または存在について、タンパク質
   サンプルを分析する段階を含む、ことを特徴とする請求項７に記載の方法。
10. 【請求項１０】 野生型ヒトＣＬＣＮＫＢタンパク質と比較した場合、１つ
    以上のアミノ酸において変化している、ヒトＣＬＣＮＫＢタンパク質の存在につ
    いて、またはヒトＣＬＣＮＫＢタンパク質の不在について、前記タンパク質サン
    プルを分析することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 そのアミノ酸配列が野生型ＣＬＣＮＫＢ配列とは１つ以上
    のアミノ酸において変化している、ヒトＣＬＣＮＫＢタンパク質の存在について
    、前記タンパク質サンプルを分析することを特徴とする、請求項９に記載の方法
    。
12. 【請求項１２】野生型ＣＬＣＮＫＢタンパク質ではなく、変化したＣＬＣＮ
    ＫＢタンパク質を認識して、結合する抗体に、該変化したＣＬＣＮＫＢタンパク
    質が結合できるかどうかを決定することにより、変化したヒトＣＬＣＮＫＢタン
    パク質の存在について分析することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記変異ＣＬＣＮＫＢタンパク質を、ゲル電気泳動の移動
    度および等電点電気泳動からなる群より選択した方法を使用して同定することを
    特徴とする、請求項９に記載の方法。
14. 【請求項１４】 野生型ヒトＣＬＣＮＫＢタンパク質ではなく、変異ヒトＣ
    ＬＣＮＫＢタンパク質に結合する抗体。
15. 【請求項１５】 ＣＬＣＮＫＢタンパク質の変化したヒト変異体またはその
    一部をコードする単離された核酸分子。
16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の核酸分子を含むベクター。
17. 【請求項１７】 請求項１５に記載の核酸分子を含むように形質転換された
    た宿主細胞。
18. 【請求項１８】 前記核酸分子が発現してそれがコードするタンパク質を産
    生する条件下で、請求項１７に記載の宿主を培養することを含む、ＣＬＣＮＫＢ
    タンパク質の突然変異体または変化した変異体、またはその一部を産生する方法
    。
19. 【請求項１９】 薬剤とタンパク質の間に会合ができる適当な条件下で、タ
    ンパク質を該薬剤と接触させ、該会合がタンパク質の活性レベルを阻害または増
    強するかを決定する段階を含む、ＣＬＣＮＫＢタンパク質の活性を調節する薬剤
    を同定する方法。
20. 【請求項２０】 図９（配列番号 ）で開示したプライマーから選択される
    ＰＣＲプライマーの対を含む組成物。
21. 【請求項２１】 図９（配列番号 ）で開示したプライマーから選択される
    ＰＣＲプライマーの対を含む、ＩＩＩ型バーター症候群を診断する試験キット。
22. 【請求項２２】 請求項１９に記載の方法により同定した薬剤を治療有効投
    与量で投与することからなる、高血圧、浮腫、鬱血性心不全または鬱血性心不全
    と共におこる症状、ネフローゼ症候群、または異常な体液量を含む症状の治療方
    法。