【発明の詳細な説明】
キャピラリィ電気泳動用の装置及び方法
この発明は、多数の分離キャピラリィ（毛細管）と光検出システムとを備えた
キャピラリィ電気泳動用装置と、その種の装置で使用するための方法とに関する
。
物質及び混合物質の電気泳動分離は分析的過程としてとくに生化学や分子生物
学の分野で拡められている。分離されることになる物質は電場の影響を受ける分
離媒質内で分離されて、分離して検出される。キャピラリィ電気泳動法では分離
媒質はキャピラリィ（毛細管、内径は一般に１５０μｍより小さい）内に置かれ
る。分離過程はキャピラリィ内で実行され、検出はキャピラリィの内部と端との
両方で行なうことができる。これが速度、分解能及びサンプル量を最小とするこ
とという点で特に好都合である。複雑な生化学反応とか分子生物学的過程の分析
については（例えば複雑なゲノムや蛋白質の分析については）極めて多くの数の
異なる試料（例えば１０5ないし１０7）を使用することが必要とされる。
その結果、試料の処理量が大きく、また高度な並列分析を行なう複数キャピラ
リィ電気泳動用の装置に関心が集まっている。この目的のために、多チャンネル
もしくは多重化構成であって、以下の例に挙げたものが知られており、こういっ
たものは高度な並列処理ができるけれども、普通は非常にその構造が複雑で、ル
ーチンとしての使用が制限されている。US-A-5,498,324を例にとると、これは多
重ケイ光検出器システムでキャピラリィ電気泳動法用のものを記述していて、そ
こではキャピラリィが光ファイバに接続されていて、光ファイバを通って励起光
が別個にキャピラリィに導かれている。ケイ光検出がＣＣＤカメラを備えた顕微
鏡によって実行される。この構造は複雑であり、光ファイバとキャピラリィとの
結合が原因で干渉を受ける。結合できることになる光の量は制限されていて、ケ
イ光検出の感度もまた限界がある。このシステムはルーチン（日常業務）使用と
しては不適当であり、とくにその原因は光ファイバを備えたキャピラリィアレイ
により必要とされる実質的な保守努力にあり、キャピラリィの変換がむづかしい
ことである。
US-A-5,582,705は多重キャピラリィ電気泳動システムを開示し、このシステム
ではＣＣＤ検出器が光学的にキャピラリィに接続されて、キャピラリィの内部が
ＣＣＤ検出器の一つのピクセル上に作像される。このシステムの不都合な点は検
出器構成が複雑であり、しかも高度に特殊化されていて、特別に整合のとれた光
部品の使用が求められて、ケイ光検出用の既存の実験室システムとの互換性がな
くなってしまっている。さらに分析対象（アナライト）の濃度差が非常に大きい
chen)の危険が増大する。
US-A-5,584,982とUS-A-5,567,294とは複数のキャピラリィシステムでいわゆる
これは検出感度に増大をもたらしてはいるが、ルーチンとしての実験室動作に求
められる頑丈さに欠けた複雑な構造の故に不都合とされている。置換可能な分離
媒質の使用はこのようなキューベットではとくにむづかしいものであある。キュ
ーベットは媒質を置換えるときに破損され、分離中に分離媒質がゆっくりと流出
してしまう危険がある。
最後に、US-A-5,675,155はラスタあるいは走査用システムを開示し、そこでは
共平面キャピラリィ群のケイ光信号がスキャナ検出器により検出される。この検
出器を備えて、光の励起と測定とがミラーを移動することによって個々の分離キ
ャピラリィに向けて連続して行なわれる。ここでの不都合は可動部品を使用する
ことと読取り速度が限定されていることが原因となっての妨害に対する感じ易さ
ことになる試料が速すぎて信頼のおける検出が１ラスタ走査の間に不可能となる
ことがある。キャピラリィアレイの縁端にあるキャピラリィでは均等な時間で走
査がされなということもある。それ以上のことは走査用システムがルーチンの使
用に対して頑丈でないことがある。
複数キャピラリィ電気泳動法では、処理の安定度と並列動作とに関心がもたれ
ているほかに全分析過程のオートメーションにも関心がもたれていて、この過程
はフロントエンドの貯め（レザボア）に装入することから始まって、実際の分離
動作があり、分離キャピラリィの清浄化に至るものである。上述した不都合が理
由となって、キャピラリィ分離構成の自動化は今日までに複数キャピラリィシス
テムでは達成されておらず、単に単一キャピラリィシステムについて行なわれて
いるにすぎない。
この発明の目的はキャピラリィ電気泳動用の改良された装置を提供することで
あり、この装置は単純化された安定な構造に特徴があり、多数の試料の並列分離
のオートメーションを可能としている。またこの発明はこのような装置の使用の
ための方法も提供する。
こういった目的は特許請求の範囲請求項１の特徴をもつ電気泳動装置と同請求
項１７の特徴をもつ方法とによりそれぞれ解決されている。好都合な実施態様が
従属請求項で定義されている。
この発明は多数の分離キャピラリィを配設するという考え方を基礎としており
、各キャピラリィには検出レンジがあって、それによってすべての検出レンジ内
での試料が同時にしかも均一な照明もしくは励起にさらされて、また検出器装置
がすべての検出レンジの像を同時に検出するようにしている。このためには、次
のような形式が実現されている。すなわち一般的な多重キャピラリィ分離装置上
で単独にもしくは一緒に多数のサンプルをもつフロントエンド貯め（レザボア）
を備えるようにし、同じ多数の分離キャピラリィを備え（このキャピラリィの各
々には検出レンジがあるものとする）、それを共通の保持用装置上に取付ける。
またコレクタ装置と測定システムとを備えていて、測定システムには照明用装置
と検出器装置とが備わっている。
保持用装置は分離キャピラリィ用の支持体であって、その上に分離キャピラリ
ィが配置されて、検出レンジが真直な列を作る。検出レンジは、例えば、検出窓
であり、各分離キャピラリィの上にあり、キャピラリィには保護用もしくはシー
ルド用の層も備わっている。この保持器はまた“光学的な隔離（絶縁）”をキャ
ピラリィ間に与えて、クロストークを避けている。加えて、この保持器はモジュ
ール形式であり（例えば１６ずつのキャピラリィについての６の保持器）、いう
なれば全体の構成を分解することなく、小部分のキャピラリィアレイの置換えを
可能としている。照明用装置は線形で、均一な照明場を形成するのがよく、場の
形状は検出レンジの列に整合している。この発明の特別な利点は照明すなわちキ
ャピラリィ内の試料の励起が特定の検出レンジの領域内でのキャピラリィ壁の照
明によって外側から直接行なわれることである。それ以上のデバイスは何も必要
とせずに入力の結合がされ、また調節は固定ではあるがしかし独立した位置を保
持用装置上でとることにより実現される。
検出器装置はキャピラリィ壁を通って検出レンジ内で放出される光の検出に基
づいている。すべての検出レンジが検出器カメラ上で適当な作像装置により同時
に作像される。分析要件に依存して、検出器装置は単一の検出器列上に、もしく
は多数の検出器列上に作像する構成をとる。多数の検出器列上の場合には、少く
とも一つの分散素子を検出器装置上に用意して検出レンジの同時検出に加えて、
検出レンジから放出される光のスペクトル性質の解析を可能とすることもできる
。
分離キャピラリィは共通のコレクタ装置に出口が通じていて、この装置は二つ
の機能を完遂させる。第一は、コレクタ装置が分離キャピラリィを装着するため
のキャリヤ媒質を含んでいることであり、第二は分離された物質がコレクタ装置
上で一緒に集められることである。このために、コレクタ装置には分離されるこ
とになる試料の分子についての収集手段を含んでいるのがよい。この収集手段す
なわち分子トラップは半透性の壁素子であり、それが分離キャピラリィの端を高
電圧電源から分離している。この電源は分離キャピラリィ内での分子の動きを生
じさせるためのものである。
電気泳動分離の間に分子は泡を含んだ壁素子を通って電極に引き寄せられて、
それにより分子トラップ内に収集される。壁素子を通っての能動的な後方拡散は
泡が非常に小さいために大規模にはならないようにされている。分析完了後に５
ｂａｒ（５×１０5Ｐａ）がコレクタ装置（貯め）、もっとも分子トラップの外
側領域である、に加えられる。これが分析された分子がキャピラリィの内に押し
戻されて、後の分離を乱すことがないようにしている。
この発明による方法の重要な特徴は、検出レンジで分離されることになる試料
の照明もしくは励起と、キャピラリィの壁を介しての試料からの光の検出との両
方が外部からキャピラリィへとキャピラリィから外部へとに向けて行なわれる点
である。薄い壁のキャピラリィは約３５ないし５０μｍが背景信号を減らすため
に使用されるのが好ましい。しかしもっと大形の設計、すなわちもっと厚い壁の
キャピラリィも可能である。さらに、他の形式の検出レンジも可能であり、例え
ば、キャピラリィをキューベット内にあるいはチャンネルを備えた微細構造内に
結合させるものである。レンズと対物レンズとを備えた検出器ユニットの設計は
作像用目盛の簡単な変更ができるようにし（検出器素子の検出レンジの最適作像
をするようにする）、またこれによって検出レンジの形式について大きなフレキ
シビリティを与えるようにしている。この発明による分離装置は低粘度の分離媒
質で最も良く動作する。この方法では、コレクタ装置（もしくは出口容器）へ供
給される装入用圧力が減らされて、装入速度が高められる。分離媒質の簡単な置
換えはキャピラリィの適切なフラッシュ（流し洗い）を可能とし（分離媒質自体
を用いるか、あるいはクレンジング剤を始めに使用するかする）、これによって
キャピラリィのサービス寿命を延ばしている。
この発明は次のような利点を有している。分離装置がコンパクトであって、可
動部品がない。照明と検出とは利用可能な実験室設定と両立可能であり、また現
在使用されている染料（ダイ）マーカと両立可能である。このことは一方ではル
ーチン動作が、特殊の高度訓練なしに、要員によって行なわれ、また他方では保
守についてもそれが言えるということを意味している。この発明は、先ず、完全
な自動分析を可能とし、その詳細については後に説明する。ほぼ１５，０００の
異なる試料が、例えば操作者が最初に介入することになる前に解析できる。この
システムは高度の多重化機能を備えている。試料の供給（共通のフォーマットを
もっているのが好く、例えばマイクロタイタプレートからの供給）と、照明及び
検出の両方が分離キャピラリィにより作られたすべてのチャンネル内で同時に行
出構造は不必要である。分離キャピラリィ用の保持用装置は高低のある設計がさ
れていて、キャピラリィ間で迷光が生じないようにし、またキャピラリィのまと
めた取付けを可能として保守を簡単化するようにしている。キャリヤ媒質の装着
用圧力は約７０Ｂａｒ（７０×１０-5Ｐａ）（例えば２％ヒドロキシエチルセル
ローズで粘度がほぼ１０００センチStokes）のような通常のキャリヤ媒質から、
１００センチStokes（例えば１０ないし１５％のデクストランもしくは４ないし
８％のポリジメチルアクリルアミド）をもつキャリヤ媒質とが使用されるときに
は、約５Ｂａｒ（５×１０-5Ｐａ）にまで減らすことができる。
この発明の別な利点と詳細とは以下に添付の図面を参照して記述される。
図１：この発明による電気泳動装置の設定の模式的な全体図である。
図２：図１による分離装置の一部である保持用装置の部分図である。
図３：この発明によるスペクトル的に分解した検出を示す全体図である。
図４：この発明によるスペクトル的に分解した検出を示す別の全体図である。
図５：検出器信号の検出の例示である。
図６：図１による分離装置の一部であるコレクタ装置の模式的な側面図である。
図７：この発明による電気泳動分離で使用される特殊のキャピラリィ形式であり
、これによるとキャピラリィは端部で金属のコーテングが施されていて、電極と
して同時に機能している。
図８：ライン生成器による均一な照明を示す曲線である。
図９：３つの隣接する分離キャピラリィの検出器信号を示す曲線である。
図１０：分離媒体粘度の濃度依存性を示す曲線である。
図１１：この発明による分離装置での実験結果を示す曲線である。
以下でこの発明が好ましい実施例について記述されるが、この実施例ではマイ
クロタイタプレート内の試料が電気泳動法によって分離される。これは高電圧に
よって影響されるキャリヤ媒質をもつ分離キャピラリィを介してプローブ成分の
移動を検出して行なわれる。しかし、この発明はキャピラリィ入口のマイクロタ
イタプレートに対する整列、あるいはある種のキャリヤ媒質もしくはある種の分
離効果に限定されるものではない。それに代って、この発明は多数の分離キャピ
ラリィを備えているあらゆる電気泳動キャピラリィシステムにおいて実施できる
。
図１はこの発明による電気泳動装置を示し、ここでは多数の分離キャピラリィ
１０が共通の保持用装置５０に取付けられており、保持用装置の詳細は以下で図
２を参照して説明される。分離キャピラリィ１０は整列していて、例えば検出窓
の形をした、検出レンジが真直な列１３を形成している。照明用装置６０には光
源６１と作像用光学系６２とがあって、線形照明場６３を形成していて、この場
がキャピラリィ１０の検出窓の列１３と一致している。また検出器装置４０があ
り、そこには作像デバイス４１と、検出器カメラ４２と、分散素子４３とが含ま
れている。分散素子４３はオプションの装置であり、以下で述べるように、ある
種の応用に対して取付けることができる。検出器カメラ４２は制御兼データ記憶
装置４４に接続され、これは例えばコンピュータと電子制御器４５の形態をして
いる。
分離キャピラリィ１０は入口貯め（レザボア）２０（サンプルレザボア２１も
しくはストレージレザボア２４）からコレクタ装置７０に向けて延びている。電
気泳動分離回路は入口貯め２０とコレクタ装置７０との間で電極１１もしくは７
１を介して高電圧を印加することによって形成される。この目的のために、入口
貯め２０は例えば接地電位に接続され、またコレクタ装置７０は高電圧電源装置
７２に接続されている。この高電圧電源装置は直流電圧、あるいは特殊目的につ
いては変調（パルスもしくは正弦波）電圧を作ることができ、ユニット４４，４
５によって制御されている。入口貯め２０は、注入時には、試料貯め２１となり
、分離時にはストレージ貯め２４である。
試料貯め２１は、平坦な基板でそこには多数の試料が所定のやり方で配列され
ているのが好く、並列もしくは同時に電気泳動分離に従うようにされている。こ
の基板は共通形式をもったマイクロタイタプレートであるのがよい（例えば９６
孔（井戸）、３８４孔もしくは１５３６孔プレートである）。試料を供給するこ
とで始まる分離の完全オートメーションにとっては、試料貯めは移送装置２２上
で配列されていて、それによって、必要とされる試料貯め２１はストレージデバ
イス２３から分離キャピラリィの注入端にある動作位置まで、ユニット４４，４
５からの制御信号によって移動することができる。この目的のためには、移送装
置２２及び／又はストレージデバイス２３は動作開始（アクチュエート）のため
の適当な手段と位置決め器とを備えている。移送装置２２はまた分離キャピラリ
ィの注入端の装入後に、ストレージ貯め２４によって試料貯め２１を置換えるこ
とを意図したものであり、それによって回路が再び完成される。
分離キャピラリィ１０の注入端１１は整列していて、基板もしくは試料貯め２
１上にある分離されることになる試料の位置と整合している。分離キャピラリィ
１０はその外径が例えば１００ないし（４００μｍである。好ましい形は、外径
３７５μｍで内径１００μｍのキャピラリィとか、外径２００μｍで内径５０な
いし１００μｍのキャピラリィか、あるいは外径１５０μｍで内径７５μｍのキ
ャピラリィである。キャピラリィの壁厚はどんな数値でもよいが、以下で述べる
ように照明と検出装置での再現可能な検出ができるものとする。分離キャピラリ
ィの全長は約４０ないし５０ｃｍのものが実施されたが、この長さは応用での機
能に従って修正が可能である。
注入端では分離キャピラリィは本質的に平坦で、二次元の“ブラシ状をした”
扇（ファン）を形成しており、その寸法は幾分か試料貯め２１の形状をしている
。保持用装置５０に向って、分離キャピラリィは一緒にまとまって行き、検出レ
ンジが少くとも列１３として配列されるような長さにわたっていて、密接するよ
うになる（図２参照）。
分離キャピラリィが保持用装置５０の前に一緒になるところの領域では、調節
用装置を備えることが可能である。この調節用装置は調合された媒質（例えば空
気）を分離キャピラリィの周りに循環させて、熱を調整するように設計できる。
１０ないし６０℃の温度が設定されるのが好い。
照明用装置６０は保持用装置５０上で分離キャピラリィの検出レンジの列をで
きるだけ均一に照明することを意図されていて、それにより分離過程の中で検出
レンジを通過する試料成分が同量の光に露出される。検出レンジの列１３が例え
ばキャピラリィ群の幅約５ｃｍにわたって延びているとすると、レーザ光源６１
は光学系６２と組合されるのがよく、この光学系はいわゆるライン生成器（line
generater）である線形照明場を形成して、十分な照明すなわち励起強度を作る
ようにしている。レーザ６１は使用されるケイ光マーカの例えば約５０ないし２
００ｍＷのＡｒレーザスペクトル性質の関数として選ばれて、制御ユニット４４
，４５を介して駆動できる。
光学系６２は線形照明場を形成する。この光学系は例えば高速度で振れるか回
転するミラーの形をとることができるが、しかしこれは構成の安定度の点で不都
合があるかもしれない。円筒レンズの使用もまた可能であり、可能部分を避ける
のは好ましいが、照明場のガウス分布強度に拘らず、均質の照明が十分にキャピ
ラリィ列に与えられるような寸法としなければならない。その結果この発明の好
ましい実施にあたっては、光学系６２がいわゆるパウエル（Powell）レンズ（製
造者：カナダのＯｚ Optics）によって作られ、これがレーザパワーの均質照明
と最適利用とを可能としている（図８参照）。パウエルレンズはレーザ６１に光
ファイバ６４により直接接続することができ、頑丈な移送可能な構成を作り、こ
の構成には回転ミラーなどのような可動部品が何も含まれておらず、線形照明場
を除けば、コヒーレントなあるいは高度にフォーカスされた光の逃げがないこと
を確かにして使用者の安全に供している。
光ファイバ６４はまたレーザの簡単な交換を可能とし、例えば他のケイ光マー
カに適応するようにするとか、あるいは特殊のカップラと組合せて、２つの異な
るレーザからの光が１つの照明場に導かれるようにできる。
パウエルレンズの照明場の光強度は線の方向に均一に分散され、また線に垂直
方向（すなわち分離キャピラリィの向きと平行方向）にはガウス分布をしている
。パウエルレンズのパラメータと検出窓と呼ばれる構成とは約１ｍｍ以下の幅を
もつ線にフォーカスするように選ばれている。照明場が狭いほど分離装置によっ
て得られる分解能が高くなる。
検出装置４０とコレクタ装置７０の詳細は図３，４及び５と関係して以下で説
明する。
図２は保持用装置５０の一部分を模式的な斜視図を示し、図２の下側は保持用
装置の上部で分離キャピラリィの平面状の並列アタッチメントを、また図２の上
側は幻影状の見方をしたキャピラリィ部についての拡大した斜視図を示している
。保持用装置は少くとも図示のキャピラリィ保持器５１があって、照明用装置の
フォーカス面内で分離キャピラリィ１０を機械的に支持するとともに、分離キャ
ピラリィ間の光学的隔離を確かなものとしている。例えば１６のキャピラリィ毎
のキャピラリィ保持器のいくつかが用意できて、それによって、全体の保持器５
０がモジュール形式となり、単一のキャピラリィ保持器がモジュールとして交換
できる。検出レンジを除くと、分離キャピラリィには保護層が備えられ、この保
護層は光に対して非浸透性とすることができる。検出レンジ１０ａでは、分離キ
ャピラリィは何のコーテングも施していない。キャピラリィ保持器５１は検出レ
ンジが置かれている長さ方向の部分上では少くとも、分離キャピラリィを保持す
る。分離キャピラリィの全長についてみると、注入端から見て分離キャピラリィ
の長さの後方１／４もしくは１／３にわたっている。したがって、分離キャピラ
リイの検出範囲もしくは検出窓は、分離キャピラリィの長さを約５０ｃｍとする
と、
キャピラリィの出口端から約５ないし２０ｃｍ、好ましいのは１０ｃｍ、の垂直
方向間隔をもつ真直な列を形成している。一般に、分解能を改善するためには、
検出窓は分離されることになるサンプルの動く方向に対してできるだけ下流にあ
るようにする。
キャピラリィ保持器は溝５２のあるブロックであり、溝の中には分離キャピラ
リィが挿入される。分割壁５３は個々の分離キャピラリィの検出レンジ間で光学
的な隔離をしている。この分割壁は区分（セグメント）を形成し、それはできる
だけ薄いものとして、キャピラリィを稠密に積め込めるようにし、しかも照明も
しくは励起光に上からの影を作らないようにしている。これに代るものとして、
溝なしのキャピラリィ保持器５１を作ることも可能で、キャピラリィを次々にキ
ャピラリィ保持器の上部に平らに置くようにする。しかしこれは光学的な隔離の
ための分割壁５３に代って、光が浸透しないコーテングを隣のキャピラリィと接
する分離キャピラリィの側面上の検出レンジに作るか、正確な光像形成をするか
しなければならない。
保持用装置上にはまた、図示してはいないが、溝５２の中の分離キャピラリィ
の、例えばクランプのようなアタッチメント用レリーズ可能手段がある。保持用
装置は検出レンジの外側の長さ方向部分内で分離キャピラリィを支持することも
できる。しかし、原則としては分離キャピラリィにとっては入口貯め２０から保
持用装置５０に向けて空気を通すようにすることで十分である（図１参照）。し
かし、調節装置もこの領域内に用意することができて、それにより分離動作が所
定の温度条件下で行うことができるようにする。
スペクトル分解された多重検出の原理は図３と４とを参照して以下に説明され
る。簡単な分析でケイ光マーカが１つだけ検出される場合には、検出器装置４０
の作像装置４１に適当なフィルタを取付けて（図１参照）、ケイ光測定において
励起光をシールドするだけで十分であるが、もっと複雑な分析では検出レンジか
らの光のスペクトル分離が必要とされる。これは例えばＤＮＡシーケンシング（
配列決定）の場合であり、ニュクレオチドが特別にケイ光タグを備えていて、例
えば４つの別個のケイ光帯として選択的に検出されることになる場合である。
この発明は、優れたスペクトルと場所との分解能を同時に生み出すのであり、
それには二次元検出器マトリックス上の検出窓列を二つのマトリックス次元に対
応した分解能で写像をするようにしている。これが模式的に図３に示されている
。検出窓列１３を備えた分離キャピラリィ１０の垂直方向アレイは、動作位置の
差があって、図示していない作像装置と分散素子４３とによってＣＣＤマトリッ
クス４２上に写像される。分散素子４３はプリズムとして象徴化されているが、
大きな場所の分解能をもついずれかの波長分散性構造で形成できる。ＣＣＤマト
リックス上の作像はＹ軸上での場所の分解能と、Ｘ軸上のスペクトル分解能とを
生じさせる。こうして、マトリックスは照明されたピクセル列を含み、その数は
分離キャピラリィの数に対応している。各ピクセルは入射光の量の関数として検
出器信号を配信し、それによって各Ｘ列の検出器信号応答は分離キャピラリィか
らの光のスペクトル応答に対応する。使用されるケイ光染料もしくはタグに依存
して、読み出されることになるいくつかの列の一部レンジだけについて、使用す
るようにすることも可能で、ケイ光染料もしくはタグの予期される波長放出帯に
対応するようにする。スペクトル分解能は少くとも３つのスペクトル帯で測定を
するように設計されている。
スペクトル的と場所的とについて分解された検出の詳細は図４に示されている
。好ましい実施例では、検出器窓列１３は第１のオブジェクティブ４１１によっ
てスリット４１２上に作像される。第２の、反転オブジェクティブ４１３はスリ
ットからの光を分散素子４３を通って送る。励起光をマスクするためのいくつか
のフィルタ４１４は図示のようにオブジェクティブ４１１の前面に置かれてもよ
く、あるいは反転オブジェクティブ４１３と分散素子４３との間に置かれてもよ
い。分散素子４３はプリズム及び／又はグレーテングを備えた古典的なスペクト
ル装置であるか（欠点は作像方向の変更と場所的分解能の減）、好ましいのは直
接視界プリズム（Geradsichtprisma）４３１（いわゆるAmiciプリズム、図４Ａ
）であるか、プリズム／グレーテング／プリズムの組合せ４３２（図４Ｂ）、も
しくはＬ形構成でホログラヒック透過グレーテング４３３（図４Ｃ）のいずれか
である。図４Ｃのものでは、光はミラー４３４によってある角度で反射されて透
過グレーテング４３３上に向う。直接視界プリズム４３１もしくは組合せ４３２
もしくはＬ形構成で透過グレーテング４３３を備えたものはコンパクトであるこ
とと、
極めて丈夫であるという利点を与える。収差と非点収差とを介しての干渉は大部
分について除かれる。さらに大きな光の出力量（スループット）が保証され、そ
れに小さな焦点長が加わる。初めの２つの設計では、検出窓から検出器カメラに
至る直線光軸が維持される。オブジェクティブ、スリット、フィルタそれに分散
素子の全体構造は迷光に対してシールドされた管内に構成され、可搬形分光計（
スペクトロメータ）として機能するようにもできる。オブジェクティブと分散素
子の作像パラメータについて適当な選択をすることは広い範囲にわたって可変の
作像用スケールを作り出し、分離キャピラリィの数と、それらの直径についての
大きなフレキシビリティをもたらすことになる。
分散素子４３を通った光はオブジェクティブ４１５によってカメラ４２上で作
像される。カメラ４２のＣＣＤチップ４２１は、例えば５００×５００ピクセル
であり、そこからピクセル群が応用の関数として選ばれて分析動作での読取りに
あてられる（とくに、検出されることになる分離キャピラリィの寸法と数との応
用の関数として）。例えば、２４×２４μｍというピクセル寸法が与えられると
、極く僅かな調節の狂い（例えば分離キャピラリィのシフト）はＣＣＤマトリッ
クス上の像にシフトを生じさせる。この効果を避けるために、この発明は探査ア
ルゴリズムを使用する。このアルゴリズムは読取られることになるピクセル群を
決める。このことは制御器４４が検出窓列のスペクトル的と場所的に分解した像
の必要とされるピクセルを自動的に選ぶことを意味する。この読取りのためのア
ルゴリズムは画像データ処理の中からの適当な一つであり、例えばいわゆるウォ
ーターシエッド（分光界）アルゴリズム（S.Wegner et al．“Spektrum der Wis
se nschaft”,1997,p.113参照）、もしくは以下で図５を参照して説明するいわ
ゆるチェーンコードアルゴリズム（Chain-Code-Algorithmus）である。
１００のキャピラリィとｎのケイ光放出とを用いると、例えば１００×ｎピク
セル群の関心のある領域はＣＣＤチップ上に作像される。この群のピクセルはbi
n（貯蔵所）に入れられて相関をとって読出される。このピクセル群は第１の試
行段階でデータ処理アルゴリズムで自動的に決定されるか所定の方法で定義され
る。チェーンコードでは（図５）、マトリックス座標の出発点だけが記録され、
残りのピクセル群は所定の方向コードで検出されて読出される。例えば８つの方
向コードが用意できて、観測されたピクセルを取囲んでいる８つのピクセルと関
係している。番号付けされた方向に対応する数値トーケンスを入力することによ
って、あるピクセル群に属するピクセル全部がユニークに識別できる。このエン
トリィは僅かな像のシフト（像の左部分にある場所換えVersetzung）に感度をも
たないし、またある群を特徴付けるためのメモリ要件を減らすことができるとい
う点で好都合である。
図６はコレクタ装置（すなわち出口容器）７０の模式的な側面図の詳細を示す
（図１参照）。コレクタ装置７０は圧力容器７３で成り、そこにはｐＨ緩衝キャ
リヤ媒質７４が置かれている。圧力容器７３は圧力ライン７５によってポンプ装
置７７に接続されていて、そこで圧縮空気が作られて分離キャピラリィ１０にそ
の出口端をキャリヤ媒質内に置いての装入に使用される。ポンプ装置はユニット
４４，４５によって制御される。また、キャリヤ媒質内に突出して電極７１があ
り、高電圧電源（図示せず）が接続されている。電極７１と分離キャピラリィ１
０の出口端との間には分子トラップ７６があり、それが破線で示されていて、分
離された試料を収集することが意図されている。電場の効果を介して、分離され
た試料はキャピラリィ端から外へ出て、電極７１へ引き寄せられる。この間に、
分離された試料は泡のある分割壁（例えば膜とかゲル）であって、特性径が約１
０ないし１００ｎｍの泡を有する形をした分子トラップに到来する。分離された
試料もしくは分子の収集は次にあげる原理の一つによって実施される。
電場の影響下での動きの速度について見ると、拡散の動きの速度よりは実質的
に大きく、分子トラップを通って電極から出口端へ高電圧の遮断時の間に進む分
子の確率は極めて僅かである。この場合には泡の寸法を非常に精密に定義した限
界内に選ぶ必要はない。代りのやり方では、分離された試料は場に依存する伸び
た分子（ポリ電解質）で成ると仮定し、この分子が電場の影響下で伸びた形で比
較的単純に泡を通るが、場が遮断されているときには球状の形態は泡を通るのに
困難があるとする。
この発明の好ましい実施例では、電極は図７に模式的に示したように入口でキ
ャピラリィに直接取付けられている。この目的のために、分離キャピラリィの入
口端は外側の金属コーテング１４が例えば銀力泊金で作られて備えてあり、電極
の機能も同時に達成するようにしている。これは注入体積を実質的に減らせるよ
うにしている。電極的な接続は接続装置１５（例えばクリップ）により作られる
。
上述の分離装置（図１参照）を用いる分離解析の過程は次に記載するところに
よる。先ず、キャリヤ媒質を装填するために、空の板または容器を分離キャピラ
リィの注入端の下に移動し、コレクタ装置７０の圧力容器７３に圧力が加えられ
て、キャリヤ媒質７４が分離キャリヤの出口端に入り、そこを通って注入端に向
って進む。十分な分離媒質がキャピラリィを通って流れるとすぐに圧力が減らさ
れる。次の段階では、試料貯め２１が下から分離キャピラリィの注入端まで移動
されて、注入端がストレージ貯め上に置かれたサンプル内に浸される。次に、高
電圧が分離キャピラリィにある装填時間にわたって加えられてサンプルを装入し
、言い換えると端部に試料の極く少量が注入される。装填時間と高電圧とは分離
キャピラリィの最初のミリメートルが分離されることになるサンプルで充填され
るように選ばれる。上述の場合にはキャピラリィの内径は例えば５０なし１００
μｍであり、また普通の溶剤が使用されていて、これは装填時間１ないし２０秒
、高電圧約１００ないし４００Ｖ／ｃｍ（好ましいのは約１０ｋＶとなる）。試
料装入後に、試料貯め２１は緩衝液（電解質溶液）を入れたストレージ貯め２４
によって置換され、それによって、分離キャピラリィの注入端は後続の分離過程
中接触を維持している。実際の分離過程にあたり、高電圧が再び応用に依存した
時間にわたり印加され、この時間は１０ないし３０分あるいは場合によっては数
時間に及ぶ。
全分離過程の間にわたり、ユニット４４による自動制御が可能であり、分離さ
れることになる試料（分子、ＤＮＡ破片、蛋白質、等）は分離キャピラリィの出
口端に向って移動する。媒質分離の結果“選択”がされる。すなわち、小さな分
子は大きな分子よりも早く検出窓に到着するから、試料組成についての完全な分
析が可能とされるが、これは場所的とスペクトル的とについて分解された検出が
時間の関数として各窓に現れることによる。分子の分離もまた他のやり方によっ
て可能となり、例えばいわゆる、エンドラベルのフリー溶液電気泳動（endlabel
ed free solution electrophoresis）によって可能とされる。
この発明による分離装置の実験結果を図８ないし１１に示す。図８は円筒レン
ズとライン生成器とによる検出レンジの照明間の比較を示す。ここで雑音性の信
号は単一モードではなく多モード光ファイバを使用することにより生じたもので
ある。円筒レンズはいわゆるガウス形のプロフィルを生成するが、ライン生成器
は高原状の形をしたプロフィルを示し、したがってより均質な照明となっている
。図９は異なる分離チャンネル（分離キャピラリィ）間のクロストークを実用上
除去することを例示している曲線を示す。３つの極大は隣の分離キャピラリィに
割当てられたピクセル群からの検出器信号に対応している。隣のキャピラリィ間
のクロストークは１％よりも小さいから、ユニークでしかも再現性のある検出器
信号を分離キャピラリィに対して指定することが可能である。ここで示した例で
は、キャピラリィは分割壁なしに互に次々と並べられた。クロストークはキャピ
ラリィ保持器の光学的な隔離によって一層減らされる。
図１０は、この発明による低粘度キャリヤ媒質（分離マトリックス）の選択を
示す。この曲線は特定のキャリヤ媒質濃度に対するキャリヤ媒質粘度の依存性を
示している。濃度は選択されて、粘度が１００センチストークス（ｍｍ2／Ｓ）
（これは約１００ｃＰに対応する）となるようにする。図１１は制御実験を示し
、この発明による分離装置の再現性を示すものとなっている。９６の同一のＤＮ
Ａ試料が同時に分離された。例として、８つのキャピラリィの検出器信号が約３
０分の検出時間間隔について累積して示してあり、異なるキャピラリィでの分離
結果に優れた相関を示している。
この発明はケイ光測定と関連して上で説明されている。しかし類似のやり方で
、光学的な検出が吸収、反射、もしくは透過測定に基いて実施できる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Apparatus and method for capillary electrophoresis The present invention relates to a device for capillary electrophoresis with a number of separating capillaries (capillaries) and a light detection system, and a method for use in such a device. Electrophoretic separation of substances and mixed substances is expanding as an analytical process, especially in the fields of biochemistry and molecular biology. The substances to be separated are separated in the separation medium affected by the electric field and are detected separately. In capillary electrophoresis, the separation medium is placed in a capillary (capillary, generally less than 150 μm inside diameter). The separation process is performed in the capillary, and detection can be performed both inside and at the end of the capillary. This is particularly advantageous in that it minimizes speed, resolution and sample volume. For the analysis of complex biochemical reactions or molecular biological processes (for example, for the analysis of complex genomes and proteins), a very large number of different samples (eg, 10 Five Or 10 7 ) Is required. As a result, there is an increasing interest in a multi-capillary electrophoresis apparatus that has a large sample throughput and performs highly parallel analysis. For this purpose, multi-channel or multiplex configurations, such as those listed in the following examples, are known, which can be highly parallelized, but are usually very complex. And its use as a routine is limited. Taking US-A-5,498,324 as an example, this describes a multi-silica photodetector system for capillary electrophoresis, where the capillary is connected to an optical fiber and passes through the optical fiber. The excitation light is separately guided to the capillary. Fluorescence detection is performed by a microscope equipped with a CCD camera. This structure is complicated and suffers from interference due to the coupling between the optical fiber and the capillary. The amount of light that can be coupled is limited, and the sensitivity of fluorescence detection is also limited. This system is unsuitable for routine use, especially because of the substantial maintenance effort required by capillary arrays with fiber optics, and the difficulty in converting the capillaries. US-A-5,582,705 discloses a multiple capillary electrophoresis system in which a CCD detector is optically connected to a capillary and the interior of the capillary is imaged on one pixel of the CCD detector. The disadvantage of this system is that the detector configuration is complex and highly specialized, which requires the use of specially matched optics, which is not compatible with existing laboratory systems for fluorescence detection. Has become incompatible. Furthermore, the concentration difference between the analytes (analytes) is very large chen) risk increases. US-A-5,584,982 and US-A-5,567,294 are so-called multiple capillary systems While this increases detection sensitivity, it is disadvantageous due to the lack of robustness required for routine laboratory operation. The use of replaceable separation media is particularly difficult in such cuvettes. The cuvette is damaged when replacing the medium and there is a risk that the separation medium will slowly flow out during the separation. Finally, US-A-5,675,155 discloses a raster or scanning system in which the fluorescence signals of a group of coplanar capillaries are detected by a scanner detector. With this detector, the excitation and the measurement of the light are carried out continuously by moving the mirrors towards the individual separating capillaries. The disadvantage here is the susceptibility to interference due to the use of moving parts and limited reading speed. The resulting sample may be too fast for reliable detection during one raster scan. In some cases, the capillary at the edge of the capillary array is not scanned in even time. More than that, the scanning system may not be robust for routine use. In multi-capillary electrophoresis, there is an interest in the stability of the process and the parallel operation, as well as in the automation of the entire analytical process, which is charged to a reservoir in the front end (reservoir). Starting from this, there is the actual separation operation, which leads to the cleaning of the separation capillary. Due to the disadvantages mentioned above, automation of the capillary separation configuration has not been achieved to date in multi-capillary systems, but only for single-capillary systems. It is an object of the present invention to provide an improved device for capillary electrophoresis, which is characterized by a simplified and stable structure, allowing automation of the parallel separation of a large number of samples. The invention also provides a method for using such a device. These objects have been solved by an electrophoretic device having the features of claim 1 and a method having the features of claim 17, respectively. Advantageous embodiments are defined in the dependent claims. The invention is based on the idea of arranging a large number of separation capillaries, each of which has a detection range, whereby the sample in all detection ranges is simultaneously and uniformly exposed to illumination or excitation. , And the detector device detects images in all detection ranges simultaneously. For this purpose, the following format is realized. That is, a common multi-capillary separation device is provided with a front-end reservoir (reservoir) having a large number of samples, either alone or together, and provided with the same multiple separation capillaries (each of which has a detection range). ) And mount it on a common holding device. Also provided is a collector device and a measurement system, wherein the measurement system includes a lighting device and a detector device. The holding device is a support for the separation capillaries on which the separation capillaries are arranged to form a straight line with a detection range. The detection range is, for example, a detection window, above each separation capillary, and the capillaries are also provided with a protective or shielding layer. The retainer also provides "optical isolation" between the capillaries to avoid crosstalk. In addition, the retainer is modular (e.g. 6 retainers for 16 capillaries), so that it is possible to replace a small part of the capillary array without disassembling the whole arrangement. The illuminating device should form a linear, uniform illumination field, the shape of the field matching the columns of the detection range. A particular advantage of the invention is that the illumination, ie the excitation of the sample in the capillary, is effected directly from the outside by illuminating the capillary wall in the region of the specific detection range. Further devices are coupled without requiring any input, and the adjustment is achieved by taking a fixed but independent position on the holding device. The detector arrangement is based on the detection of light emitted through a capillary wall in a detection range. All detection ranges are imaged simultaneously by a suitable imaging device on the detector camera. Depending on the analysis requirements, the detector arrangement may be configured to image on a single detector row or on multiple detector rows. In the case of a large number of detector rows, at least one dispersive element can be provided on the detector device to enable simultaneous detection of the detection range and analysis of the spectral properties of light emitted from the detection range. You can also. The separation capillaries have an outlet leading to a common collector device, which performs two functions. The first is that the collector device includes a carrier medium for mounting the separation capillary, and the second is that the separated materials are collected together on the collector device. For this purpose, the collector device may include a collecting means for the molecules of the sample to be separated. The collection means or molecular trap is a semi-permeable wall element which separates the end of the separation capillary from the high voltage power supply. This power supply is for generating the movement of molecules in the separation capillary. During the electrophoretic separation, the molecules are attracted to the electrodes through the bubble-containing wall elements and are thereby collected in a molecular trap. Active back diffusion through the wall element is not to be large due to the very small bubbles. After the analysis is completed, 5 bar (5 × 10 Five Pa) is added to the collector device (reservoir), which is the outermost region of the molecular trap. This ensures that the analyzed molecules are not pushed back into the capillary, disturbing subsequent separation. An important feature of the method according to the invention is that both the illumination or excitation of the sample, which is to be separated by the detection range, and the detection of light from the sample through the walls of the capillary, are both external to the capillary and from the capillary. It is a point that goes to the outside. Preferably, a thin wall capillary of about 35 to 50 μm is used to reduce the background signal. However, larger designs, ie, thicker wall capillaries, are also possible. In addition, other types of detection ranges are possible, for example coupling the capillaries into cuvettes or into microstructures with channels. The design of the detector unit with the lens and the objective lens allows a simple change of the imaging scale (optimal imaging of the detection range of the detector elements), and thereby the detection range. I try to give great flexibility to the format. The separation device according to the invention works best with low viscosity separation media. In this way, the charging pressure supplied to the collector device (or outlet vessel) is reduced and the charging speed is increased. Simple replacement of the separation medium allows for a proper flushing of the capillary (whether using the separation medium itself or using a cleansing agent first), thereby extending the service life of the capillary. The present invention has the following advantages. The separation device is compact and has no moving parts. Illumination and detection are compatible with available laboratory settings and are compatible with currently used dye (dye) markers. This means that, on the one hand, routine operations are carried out by personnel without special altitude training and, on the other hand, also for maintenance. The present invention first enables a fully automatic analysis, the details of which will be described later. Approximately 15,000 different samples can be analyzed, for example, before an operator first intervenes. This system has a high degree of multiplexing capability. Sample supply (preferably having a common format, eg from a microtiter plate), and both illumination and detection are performed simultaneously in all channels created by the separation capillaries. No output structure is required. The holding device for the separating capillaries is designed with a certain height to prevent stray light between the capillaries and to allow for the collective mounting of the capillaries to simplify maintenance. The mounting pressure of the carrier medium is about 70 Bar (70 × 10 -Five Pa) (for example, 2% hydroxyethyl cellulose with a viscosity of approximately 1000 centimeters Stokes) to a carrier with 100 centimeters Stokes (eg, 10-15% dextran or 4-8% polydimethylacrylamide). When a medium is used, about 5 Bar (5 × 10 -Five Pa). Further advantages and details of the present invention are described below with reference to the accompanying drawings. FIG. 1 is a schematic overall view of settings of an electrophoresis apparatus according to the present invention. FIG. 2: a partial view of a holding device that is part of the separating device according to FIG. FIG. 3: Overall view showing spectrally resolved detection according to the invention. FIG. 4: Another overall diagram showing spectrally resolved detection according to the invention. FIG. 5: An example of detector signal detection. FIG. 6: a schematic side view of a collector device which is part of the separation device according to FIG. FIG. 7: Special capillary format used in the electrophoretic separation according to the invention, according to which the capillaries are metal-coated at the ends and function simultaneously as electrodes. FIG. 8: Curve showing uniform illumination by the line generator. FIG. 9: Curves showing detector signals of three adjacent separation capillaries. FIG. 10 is a curve showing the concentration dependency of the separation medium viscosity. FIG. 11: Curves showing the results of experiments with the separation device according to the invention. In the following, the present invention will be described with reference to a preferred embodiment, in which samples in a microtiter plate are separated by electrophoresis. This is done by detecting the movement of the probe components through a separation capillary with a carrier medium affected by the high voltage. However, the invention is not limited to the alignment of the capillary inlet with respect to the microtiter plate, or to certain carrier media or certain separation effects. Alternatively, the present invention can be implemented in any electrophoresis capillary system with multiple separation capillaries. FIG. 1 shows an electrophoresis device according to the invention, in which a number of separation capillaries 10 are mounted on a common holding device 50, the details of which are described below with reference to FIG. The separation capillaries 10 are aligned and form a straight row 13 of detection ranges, for example in the form of a detection window. The illumination device 60 includes a light source 61 and an imaging optical system 62 to form a linear illumination field 63, which coincides with the row 13 of detection windows of the capillary 10. There is also a detector device 40, which includes an imaging device 41, a detector camera 42, and a dispersive element 43. The dispersive element 43 is an optional device and can be mounted for certain applications, as described below. The detector camera 42 is connected to a control and data storage device 44, which is in the form of, for example, a computer and an electronic controller 45. The separation capillary 10 extends from the inlet reservoir (reservoir) 20 (the sample reservoir 21 or the storage reservoir 24) toward the collector device 70. The electrophoresis separation circuit is formed by applying a high voltage between the inlet reservoir 20 and the collector device 70 via the electrode 11 or 71. For this purpose, the inlet reservoir 20 is connected, for example, to ground potential and the collector device 70 is connected to a high-voltage power supply 72. The high voltage power supply can produce a DC voltage or, for special purposes, a modulated (pulse or sine wave) voltage and is controlled by units 44,45. The inlet reservoir 20 is a sample reservoir 21 during injection and a storage reservoir 24 during separation. The sample reservoir 21 is preferably a flat substrate on which a number of samples are arranged in a predetermined manner, so as to be subjected to parallel or simultaneous electrophoretic separation. The substrate may be a common type of microtiter plate (eg, a 96-well (well), 384-well or 1536-well plate). For full automation of the separation, which starts with the supply of the sample, the sample reservoir is arranged on a transfer device 22, whereby the required sample reservoir 21 is moved from the storage device 23 to the operation at the injection end of the separation capillary. It can be moved to a position by a control signal from the units 44,45. For this purpose, the transfer device 22 and / or the storage device 23 are provided with suitable means for actuation and a positioner. The transfer device 22 is also intended to replace the sample reservoir 21 by the storage reservoir 24 after charging of the injection end of the separation capillary, whereby the circuit is completed again. The injection end 11 of the separation capillary 10 is aligned and aligned with the position of the sample to be separated on the substrate or sample reservoir 21. The separation capillary 10 has an outer diameter of, for example, 100 to (400 μm. A preferable shape is a capillary having an outer diameter of 375 μm and an inner diameter of 100 μm, a capillary having an outer diameter of 200 μm and an inner diameter of 50 to 100 μm, or a capillary having an outer diameter of 150 μm and an inner diameter of 75 μm. The capillary may have any wall thickness, but shall be capable of reproducible detection with illumination and detection equipment as described below.The total length of the separation capillary is approximately 40 to 50 cm. However, this length can be modified according to the function of the application: At the injection end, the separation capillary is essentially flat, forming a two-dimensional "brush-like" fan, whose The dimensions are somewhat in the shape of the sample reservoir 21. Towards the holding device 50, the separation capillaries are put together. It stops and becomes intimate, spanning at least as long as the detection range is arranged as row 13. In the area where the separation capillaries come together before the holding device 50, The conditioning device can be designed to circulate the prepared medium (eg air) around the separation capillary to regulate the heat. Preferably, the illumination device 60 is intended to illuminate the columns of the detection range of the separation capillaries on the holding device 50 as uniformly as possible, so that they pass through the detection range during the separation process. Assuming that the detection range row 13 extends, for example, over a width of about 5 cm of the capillary group, the laser light source 61 is optically exposed. It may be combined with a system 62, which forms a linear illumination field, a so-called line generator, so as to produce sufficient illumination or excitation intensity.The laser 61 is used. The fluorescent marker is selected as a function of the Ar laser spectral properties of, for example, about 50 to 200 mW, and can be driven via the control units 44, 45. The optical system 62 forms a linear illumination field, which for example is It can take the form of a mirror that swings or rotates at high speed, but this may have disadvantages in terms of stability of the configuration: the use of cylindrical lenses is also possible, avoiding possible parts Preferably, the dimensions must be such that a uniform illumination is provided to the capillary array irrespective of the Gaussian intensity of the illumination field. As a result, in a preferred embodiment of the invention, the optical system 62 is made by a so-called Powell lens (manufacturer: Oz Optics, Canada), which allows for uniform illumination and optimal use of the laser power (FIG. 8). reference). The Powell lens can be connected directly to the laser 61 by an optical fiber 64, creating a rugged transportable configuration that does not include any moving parts such as a rotating mirror and provides a linear illumination field. Apart from that, there is no escape of coherent or highly focused light, which is safe for the user. The optical fiber 64 also allows for simple exchange of lasers, for example to accommodate other fluorescent markers, or in combination with special couplers, to direct light from two different lasers into one illumination field. I can make him go. The light intensity of the illumination field of the Powell lens is uniformly distributed in the direction of the line, and has a Gaussian distribution in a direction perpendicular to the line (that is, in a direction parallel to the direction of the separation capillary). The parameters of the Powell lens and the configuration called the detection window are chosen to focus on lines having a width of about 1 mm or less. The smaller the illumination field, the higher the resolution obtained by the separation device. Details of the detection device 40 and the collector device 70 are described below in connection with FIGS. FIG. 2 is a schematic perspective view showing a part of the holding device 50. The lower part of FIG. 2 shows a planar parallel attachment of a separation capillary at the upper part of the holding device, and the upper part of FIG. FIG. 2 is an enlarged perspective view of a capillary section taken as an example. The holding device comprises at least a capillary holder 51 as shown, which mechanically supports the separation capillaries 10 in the focus plane of the illumination device and ensures optical isolation between the separation capillaries. For example, some of the capillary holders for each of the 16 capillaries can be provided so that the entire holder 50 is modular and a single capillary holder can be replaced as a module. Excluding the detection range, the separation capillaries are provided with a protective layer, which can be impermeable to light. In the detection range 10a, the separation capillary is not coated at all. The capillary holder 51 holds at least the separation capillary on the lengthwise portion where the detection range is located. As for the total length of the separation capillary, it extends over the rear 1/4 or 1/3 of the length of the separation capillary as viewed from the injection end. Thus, the detection area or window of the separation capillary forms a straight row with a vertical spacing of about 5 to 20 cm, preferably 10 cm, from the exit end of the capillary, assuming a separation capillary length of about 50 cm. are doing. In general, to improve resolution, the detection window should be as downstream as possible with respect to the direction of movement of the sample to be separated. The capillary holder is a block having a groove 52, into which a separation capillary is inserted. The dividing wall 53 provides optical isolation between the detection ranges of the individual separation capillaries. This dividing wall forms a segment, which is as thin as possible, so that the capillaries can be densely packed and do not create overhead shadows on the illumination or excitation light. As an alternative, it is possible to make a capillary holder 51 without a groove, in which the capillaries are successively laid flat on top of the capillary holder. However, in this case, instead of the dividing wall 53 for optical isolation, a light impervious coating is formed in the detection range on the side of the separation capillary in contact with the adjacent capillary, or accurate light imaging is performed. There must be. Also on the holding device is a releaseable means for attachment, such as a clamp, of a separation capillary in the groove 52, not shown, for example. The holding device may also support the separation capillaries within a longitudinal section outside the detection range. However, in principle, it is sufficient for the separation capillary to allow air to flow from the inlet reservoir 20 to the holding device 50 (see FIG. 1). However, an adjusting device can also be provided in this area, so that the separating operation can be performed under predetermined temperature conditions. The principle of spectrally resolved multiple detection is described below with reference to FIGS. If only one fluorescent marker is detected by a simple analysis, an appropriate filter is attached to the imaging device 41 of the detector device 40 (see FIG. 1), and only the excitation light is shielded in the fluorescent measurement. Is sufficient, but more complex analysis requires spectral separation of light from the detection range. This is the case, for example, in the case of DNA sequencing (sequencing), where the nucleotide is specially equipped with a fluorescent tag and will be selectively detected, for example, as four separate fluorescent bands. The present invention simultaneously produces excellent spectral and location resolution by mapping a row of detection windows on a two-dimensional detector matrix with a resolution corresponding to the two matrix dimensions. This is shown schematically in FIG. The vertical array of the separation capillaries 10 with the detection window array 13 is imaged on the CCD matrix 42 by the image forming device and the dispersing element 43 (not shown) with the difference of the operation positions. The dispersive element 43 is symbolized as a prism, but can be formed of any wavelength dispersive structure having a large location resolution. Imaging on a CCD matrix yields a location resolution on the Y axis and a spectral resolution on the X axis. Thus, the matrix contains illuminated pixel columns, the number corresponding to the number of separation capillaries. Each pixel delivers a detector signal as a function of the amount of incident light, so that the detector signal response of each X row corresponds to the spectral response of the light from the separation capillaries. Depending on the fluorescent dye or tag used, it may be possible to use only a partial range of several rows to be read, the expected wavelength emission of the fluorescent dye or tag. Make it correspond to the obi. The spectral resolution is designed to measure in at least three spectral bands. Details of the spectrally and spatially resolved detection are shown in FIG. In a preferred embodiment, the detector window array 13 is imaged by the first objective 411 on the slit 412. A second, inverting objective 413 sends light from the slit through the dispersive element 43. Some filters 414 for masking the excitation light may be placed in front of the objective 411 as shown, or may be placed between the inverting objective 413 and the dispersive element 43. The dispersive element 43 is a classical spectral device with prisms and / or gratings (disadvantages of changing the imaging direction and reducing the spatial resolution), preferably a direct view prism (Geradsichtprisma) 431 (so-called Amici) Either a prism, FIG. 4A), a prism / grating / prism combination 432 (FIG. 4B), or a holographic transmission grating 433 in an L-shaped configuration (FIG. 4C). In FIG. 4C, light is reflected at an angle by mirror 434 and is directed onto transmission grating 433. A direct-view prism 431 or combination 432 or an L-shaped configuration with a transmission grating 433 offers the advantage of being compact and extremely robust. Interference via aberrations and astigmatism is largely eliminated. A larger light output (throughput) is guaranteed, with a small focal length. In the first two designs, a straight optical axis from the detection window to the detector camera is maintained. The overall structure of the objectives, slits, filters and dispersive elements can be configured in a tube that is shielded from stray light and can also function as a portable spectrometer. Proper selection of the imaging parameters of the objectives and dispersive elements creates a variable imaging scale over a wide range and results in great flexibility in the number of separation capillaries and their diameter. The light passing through the dispersive element 43 is imaged on the camera 42 by the objective 415. The CCD chip 421 of the camera 42 is, for example, 500 × 500 pixels, from which a group of pixels is selected as a function of the application and read for analysis (in particular the dimensions of the separation capillary to be detected and the size of the separation capillary to be detected). As a function of number and application). For example, given a pixel size of 24 × 24 μm, very little misalignment (eg, a shift in the separation capillary) will cause a shift in the image on the CCD matrix. To avoid this effect, the present invention uses a search algorithm. This algorithm determines which pixels will be read. This means that the controller 44 automatically selects the required pixels of the spectrally and spatially resolved image of the detection window train. The algorithm for this reading is a suitable one from image data processing, for example, a so-called water-shed (spectral field) algorithm (S. Wegner et al., "Spektrum der Wis se nschaft", 1997, p. 113) or a so-called chain code algorithm (Chain-Code-Algorithmus) described below with reference to FIG. With 100 capillaries and n fluorescent emissions, for example, a region of interest of 100 × n pixels is imaged on a CCD chip. This group of pixels is binned (repository) and correlated and read out. This group of pixels is automatically determined by a data processing algorithm in a first trial stage or defined in a predetermined manner. In the chain code (FIG. 5), only the starting point of the matrix coordinates is recorded, and the remaining pixels are detected and read out with a predetermined direction code. For example, eight direction codes can be provided and are associated with the eight pixels surrounding the observed pixel. By inputting a numerical token corresponding to the numbered directions, all pixels belonging to a certain pixel group can be uniquely identified. This entry is advantageous in that it is insensitive to slight image shifts (replacement in the left part of the image) and can reduce the memory requirements for characterizing certain groups. FIG. 6 shows details of a schematic side view of a collector device (ie outlet vessel) 70 (see FIG. 1). The collector device 70 comprises a pressure vessel 73 in which a pH buffered carrier medium 74 is located. The pressure vessel 73 is connected by a pressure line 75 to a pump device 77, where compressed air is produced and used for charging the separation capillary 10 with its outlet end in the carrier medium. The pump device is controlled by units 44 and 45. An electrode 71 protrudes into the carrier medium, and is connected to a high-voltage power supply (not shown). Between the electrode 71 and the exit end of the separation capillary 10 is a molecular trap 76, indicated by a dashed line, intended to collect the separated sample. Via the effect of the electric field, the separated sample exits the capillary end and is drawn to the electrode 71. During this time, the separated sample arrives at a molecular trap in the form of a bubble dividing wall (eg a membrane or gel) having bubbles with a characteristic diameter of about 10 to 100 nm. Collection of the separated sample or molecule is performed according to one of the following principles. Looking at the speed of movement under the influence of an electric field, the speed of movement is substantially greater than the speed of diffusion, and the probability of molecules traveling through the molecular trap from the electrode to the exit end during high voltage interruptions is very small . In this case, it is not necessary to select the size of the foam within very precisely defined limits. An alternative approach assumes that the separated sample consists of a field-dependent elongated molecule (polyelectrolyte), which passes through the bubble relatively simply in a stretched form under the influence of the electric field, but the field is It is assumed that the spherical form has difficulty passing through the bubbles when blocked. In a preferred embodiment of the invention, the electrodes are mounted directly on the capillary at the inlet, as shown schematically in FIG. For this purpose, the entrance end of the separation capillary is provided with an outer metal coating 14, for example made of silver metal, so as to simultaneously fulfill the function of an electrode. This allows the injection volume to be substantially reduced. An electrode-like connection is made by a connection device 15 (eg a clip). The process of separation analysis using the above-described separation device (see FIG. 1) is as follows. First, an empty plate or container is moved below the injection end of the separation capillary to load the carrier medium, and pressure is applied to the pressure container 73 of the collector device 70 so that the carrier medium 74 is moved to the separation end of the separation carrier. And go through it towards the injection end. The pressure is reduced as soon as sufficient separation medium flows through the capillary. In the next step, the sample reservoir 21 is moved from below to the injection end of the separation capillary and the injection end is immersed in the sample placed on the storage reservoir. Next, a high voltage is applied to the separation capillary for a certain loading time to load the sample, in other words a very small amount of sample is injected at the end. The loading time and high voltage are chosen such that the first millimeter of the separation capillary is filled with the sample to be separated. In the above case, the inside diameter of the capillary is, for example, 50 to 100 μm, and a common solvent is used, which requires a loading time of 1 to 20 seconds, a high voltage of about 100 to 400 V / cm (preferably about 10 kV Becomes). After sample loading, the sample reservoir 21 is replaced by a storage reservoir 24 containing a buffer (electrolyte solution), whereby the injection end of the separation capillary remains in contact during the subsequent separation process. In the actual separation process, a high voltage is again applied for a time which depends on the application, which may be 10 to 30 minutes or even several hours. During the entire separation process, the unit 44 can be automatically controlled and the sample to be separated (molecules, DNA fragments, proteins, etc.) moves towards the outlet end of the separation capillary. "Selection" is made as a result of medium separation. That is, small molecules arrive at the detection window sooner than large molecules, allowing for a complete analysis of the sample composition, which means that the spatially and spectrally resolved detection is a function of time as a function of time. By appearing in the window. Separation of molecules is also possible in other ways, for example by so-called endlabeled free solution electrophoresis. Experimental results of the separation apparatus according to the present invention are shown in FIGS. FIG. 8 shows a comparison between illumination of the detection range with a cylindrical lens and a line generator. Here, the noisy signal is generated not by using a single mode but by using a multimode optical fiber. The cylindrical lens produces a so-called Gaussian profile, while the line generator shows a plateau-shaped profile, thus resulting in a more homogeneous illumination. FIG. 9 shows curves illustrating the practical elimination of crosstalk between different separation channels (separation capillaries). The three maxima correspond to detector signals from the group of pixels assigned to the neighboring separation capillaries. Since the crosstalk between adjacent capillaries is less than 1%, a unique and reproducible detector signal can be specified for the separation capillaries. In the example shown here, the capillaries were lined up one after the other without a dividing wall. Crosstalk is further reduced by the optical isolation of the capillary holder. FIG. 10 shows the selection of a low-viscosity carrier medium (separation matrix) according to the invention. This curve illustrates the dependence of carrier medium viscosity on a particular carrier medium concentration. The concentration was selected and the viscosity was 100 centistokes (mm Two / S) (this corresponds to about 100 cP). FIG. 11 shows a control experiment, which shows the reproducibility of the separation apparatus according to the present invention. Ninety-six identical DNA samples were simultaneously separated. As an example, the detector signals of eight capillaries are shown cumulatively for a detection time interval of about 30 minutes, showing excellent correlation with the separation results for different capillaries. The invention has been described above in connection with fluorescence measurements. However, in a similar manner, optical detection can be performed based on absorption, reflection, or transmission measurements.
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ベーア、ズベン
ドイツ連邦共和国、デー―13591 ベルリ
ン、エルンスト―ブルーフ―ザイレ 22────────────────────────────────────────────────── ───
Continuation of front page
(72) Inventor Beer, Zuben
Day 13591 Berlin, Germany
, Ernst-Bruch-Zaire 22