【発明の詳細な説明】
試料中の免疫学的反応性分子の存在検知法
この発明は１種もしくは複数種の免疫学的反応性標準分子の標準溶液をイン
キュベーション混合物中で試料と接触させることによって該標準分子と試料中の
免疫学的反応性分子との間で免疫複合体を形成させ、次いでインキュベーション
混合物の成分の分子量、電荷および形態の１もしくは複数の物理的パラメーター
を標準溶液の成分の同じ物理的パラメーターと比較することによって免疫複合体
の形成を決定することを含む試料中の免疫学的反応性分子の存在検知法に関する
。
この種の方法は、例えば、患者や試験動物のような被験体中において免疫反応
を惹起する分子を検出する場合に重要である。このような分子としてはハプテン
、高分子、病原体およびこれらの免疫反応惹起性フラグメントが例示される。こ
の種の分子は感染時の体内に存在する。しかしながら、試料中の別のタイプの他
の分子を検出することが望ましいことがある。例えば、植物中の特定タンパク質
の存在確認または土壌中もしくは試料水中の被験分子の検出を予期することが可
能である。決定されたタイプの抗体の存在を検知することはアレルギーもしくは
アレルギー反応の検出において重要である。
感染は通常は臨床的な症状および／または既往反応に基づき医者もしくは獣医
によって認定される。さらに、この場合、病原体に関する実験室的な試験または
病原体に対する被験体の反応は重要な要因となる。従来から試みられている試験
法としては培養法、血清学的決定法およびＤＮＡ試験法が例示される。アレルギ
ーの場合には、さらに皮膚試験も利用されている。
しかしながら、多数の疾患には、病原体（アレルギーの場合は抗体）が低濃度
で存在するにすぎないか、または被験体から単離できないという難点がある。例
えば、ヘルペスウイルスは血流中で検知できない場合が多いが、これは該ウイル
スが神経系中に存在するので、被験者に大きな損傷を与えることなく該ウイルス
に容易に接近することはできない。従って、このような疾患の発見は体液中の特
異的抗体を検出する間接的な方法によってのみおこなわれている。このような抗
体は疾患のオリジネーター（originator）の方向へ誘導される。抗体の存在は被
験者が関連する抗原および／または病原体と接触したことを意味する。
被験体の体内における病原体またはその抗体の存在を検知するためのこの種の
方法はヒトの医学的ケアおよび獣医の分野における健康ケアにおいて利用されて
いる。この場合、このような方法は迅速なだけでなく、信用できるので非常に重
要である。ヒトの健康ケアおよび獣医の分野における利用においては、偽陽性ま
たは偽陰性の結果が悲惨な結果をもたらすことは明らかである。
特に、獣医の分野における健康ケアにおいては、家畜類、特に牛、豚および家
禽の健康状態を決定する必要性は重要であって、しかも益々増大している。この
方法は一般的な診断、即ち、流行性の疾患もしくは病気の原因究明だけでなく、
準臨床的な感染と予後の進行の監視のためにより幅広く利用できる診断にも適用
できる。
寄生虫性疾患においてだけでなく、ウイルス性疾患、例えば、牛のＩＢＲ、豚
のオーズジェスキー（Auzjesky）病と小水疱病、家禽のマレック病、またはバク
テリア性疾患、例えば、サルモネラ菌による食中毒等においても、血清中の抗体
の存在を検知することは関連する疾患の制限と排除において非常に重要である。
従って、迅速で信頼性が非常に高くて低コストの１回の試験において好ましくは
複数の疾患に対して血清陽性を決定するための診断法を提供することが特に要請
されている。
特定の問題に応じて非常に多くの試料（場合によっては数百もしくは数千〜数
百万の試料）の試験をおこなわなければならないことが多いので、診断速度は重
要である。
この方法は信頼できるものでなければならない。何故ならば、獣医の分野にお
けるこのように多数の試料の１０００あたりのミスであっても多数の病気にかか
った動物を健康であると認定してしまうからである。このことは感染源の放置を
もたらす。ヒトの医療ケアの場合には明らかに可能な限り高い信頼性が要求され
る。
特に獣医の分野においてはマージンが比較的低いので低コストで実施できる方
法が重要である。しかしながら、ヒトの場合には行政府による価格統制も重要で
ある。
現在のところ、上述の感染診断にはＥＬＩＳＡ法および関連する免疫学的方法
が特に利用されている。これらの方法は診断速度とコストの要件は満たしている
が、採用する手順に起因して本来的にエラーを発生させる機会を内包している。
ＥＬＩＳＡ法においては、タンパク質（抗体または抗原）は被験試料で実質的
に満たされた小さな反応ウェルの壁上に吸着される。一定時間経過後、試料から
のタンパク質（抗原または抗体）は反応ウェルの壁部に既に結合しているタンパ
ク質に結合するが、このことはその後のステップにおいて試料中の抗原または抗
体に対して特異的な標識化抗体を添加することによって視覚的に確認される。
この方法においては、反応ウェルのすすぎを３回おこなって試料から非結合タ
ンパク質を除去することが非常に重要な要因である。すすぎ方法とすすぎ時間は
試料から検出する分子の特性に十分に適合するようにすべきである。不十分なす
すぎは偽陽性をもたらし、過度のすすぎは吸着タンパク質を除去するので偽陰性
の決定をもたらす。このような危険性はロボット化された自動化装置を用いるこ
とによって最小にすることができるが、本来的にエラーの発生する機会が特に多
数の試料を試験する場合には確実に発現するということは重大な方法的欠点であ
り、これによって感染源の非認識に起因する再感染が発生することになる。
全く異なった方法がオランダ国特許出願第９３／００９６５号明細書に記載さ
れている。血清反応陽性（被対象抗原に対する抗体または抗原の体内存在）は電
気泳動法によって決定される。試料は、インキュベーション混合物中に１種もし
くは複数種の免疫学的反応性標準分子の標準溶液と最初に接触させる。これによ
って、免疫学的反応性標準分子と試料中の検知されるべき免疫学的反応性分子と
の間の免疫複合体が形成される。標準分子は抗原または抗体であってもよい。
次いで、免疫複合体形成の決定を、インキュベーション混合物中の成分と標準
溶液中の成分を電気泳動法を用いて比較することによっておこなう。この方法の
基礎となる理論は、標準溶液中に標準分子として特異的抗原が存在すると、該抗
原はインキュベーション過程で試料中に存在する抗体と反応するというものであ
る。電気泳動後、標準溶液中の抗原は電気泳動ゲル上に決定された位置に存在す
るようになる。インキュベーション混合物中においては標準溶液中の抗原は試料
中の１種もしくは複数種の抗体と結合するので、抗原の物理的特性は変化する。
このため、電気泳動後は該抗原はゲル上の異なる位置に存在するようになり、免
疫複合体の一部を構成しない。標準分子が抗体であって、被検知分子が抗原であ
る逆の場合にも類似の機能が発揮される。免疫複合体の形成後は抗体の物理的特
性は変化するのでゲル上で識別可能となる。
電気泳動は等電点と分子量の物理的パラメーターに特異的に依存する。標準分
子の等電点の変化は等電点分画法（ＩＥＦ）によって決定されるが、分子量の差
は天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）によって決定される。い
ずれの方法においてもインキュベーション混合物のほかに標準溶液を基準として
包含させる。
ここに記載の検知方法においてはＩＥＦ電気泳動法には多くの欠点があること
が判明した。ＩＥＦの場合、例えば、所謂「フラットベッド−ゲル」を常に使用
しなければならない。このゲルはカバープレートのない水平表面上に注がれるの
で、得られるゲルが完全に平坦状になることは決してない。その結果、ゲルの非
平坦性に起因して、分離タンパク質の染色後に得られるバンドがすべて１本のラ
インとして並ぶことはない。ゲルの所謂「スマイリング（smiling）」もこのこ
とをもたらす。
人間の目は移動パターンにおけるこの種の変化を識別することはできる。しか
しながら、多量の試料を試験しなければならないときには、インキュベーション
混合物と標準溶液の電気泳動的分離はロボット化するのが好ましい。次いでコン
ピューターを用いて読み取りをおこなう。しかしながら、コンピューターによっ
ては実際に位置するバンドとゲルの非平坦性もしくはスマイリング効果の影響を
受ける条件下で異なる位置に存在するバンドを区別することはできない。このた
め、これによって引き起こされる誤った読み取りがもたらされる。
さらに、このようなフラットベッド−ゲル上での適用ストリップの位置決めを
ロボット化することは困難である。分離用試料はストリップから消失する場合が
多く、このため不十分な結果が得られる。
ＩＥＦゲル上で分離タンパク質を可視化するためには、実際には標準分子を標
識化しなければならない場合が多い。一般的には、これは染料を用いてＮＨ3 +
基上でおこなわせる。その結果、標準分子上でのＮＨ3 +基の遮蔽によって免疫複
合体の全体はより酸性となり、等電点分画中はゲル内の酸性ｐＨ域へ移行する。
しかしながら、この領域へ達すると、被検知分子と標準分子との複合体はこの領
域を支配する低ｐＨの影響によって分離し、その後、標識化標準分子は元の等電
点へ復帰する。このような条件下においては免疫複合体は実際に形成されるが、
検出されないことになる。このため偽陰性の結果がもたらされる。
さらに、実際には天然電気泳動法においてはスマイリング効果と免疫複合体の
大きさに起因して望ましい結果が得られないことが判明した。
従って、この発明の目的は、試料中の免疫学的反応性分子の存在を検知するた
めの全く新しい方法を提供することである。この方法は、免疫学的反応性標準分
子と免疫学的反応性被検知分子との免疫複合体を形成させるためには、試料を１
種もしくは複数種の免疫学的反応性標準分子の標準溶液にインキュベーション混
合物中で接触させる。その後、インキュベーション混合物の成分の分子量、電荷
および形態のうちの１または複数の物理的パラメーターを、既知の検知法の場合
のように、標準溶液の成分の同じ物理的パラメーターと比較することによって免
疫複合体の形成の有無を決定する。しかしながら、免疫複合体の形成の有無はイ
ンキュベーション混合物の成分のカラムクロマトグラフィー分離と該分離と同じ
方法による標準溶液のカラムクマトフラフィー分離を比較することによって決定
することができる。この場合、標準溶液中の同じ免疫学的反応性標準分子の溶出
速度に対するインキュベーション混合物中の免疫学的反応性標準分子の溶出速度
の変化は免疫複合体の形成を示すものである。
カラムクロマトグラフィー分離はゲル浸透法によっておこなうのが好ましい。
この場合の分離は、標準溶液中の標準分子とインキュベーション混合物中の標準
分子との大きさの相違に従って排他的におこなわれる。
さらに、標準分子の電荷も複合体形成によって変化する。この場合、カラムク
ロマトグラフィー分離はイオン交換クロマトグラフィーに基づいておこなっても
よい。
電気泳動法の場合、何が変化をもたらすかが不明である。これに対して、本発
明による形成される免疫複合体の検知は分離に用いるゲルの質または形成された
免疫複合体の酸性に対する染料標識の効果には全く左右されない。
使用するクロマトグラフィーカラムの質は本発明による検知法の最終的な結果
に何ら影響を及ぼさない。これは、各々の試料と各々の標準物質が同一のカラム
上で試験されるからである。結果の判定における可能なエラーは極めて少ない。
何故ならば、系の機能に対してネガティブな効果をもたらす汚染やその他の要因
は不正確な判断をもたらさず、識別可能な溶出パターンの相違をもたらすからで
ある（該溶出パターンの相違は該系が本来的に機能しないことを直接的に示す）
。このような変化が観測されるときには、試験を再度おこなうことができる。偽
陽性または偽陰性の結果の代りに、変化のあるときには、変化として認識可能な
変動が溶出パターンにおいてみられる。ＥＬＩＳＡ法と電気泳動法による分離の
場合には、このような信頼性はない。
標準分子と複合体の分離は、出発点として被検知分子を使用する異なるゲル透
過物質を選択することによって特異的に最適化することができる。大きな抗原は
ハプテンとは異なるカラム材料を必要とする。当業者であれば、被検知分子につ
いての知識に基づいて適当なカラムを選択することができる。これによって系の
適応性は非常に広くなる。
カラムクロマトグラフィーによる全分離過程は自動化法によって非常に容易に
おこなうことができる。記録装置を備えた自動化クロマトグラフィー検知系は既
知である。従って、種々の操作を非常に簡単な方法で実施することができる。
上記方法の感度をさらに高めるためには、自体既知のタンパク質の染色反応の
適用によって形成される免疫複合体を検知することも可能である。標準溶液中の
標準分子は標識化して使用に供してもよい。標識化された分子のみが検知される
ので、無関係な分子は排除される。あらゆる種類の標識、例えば、繊維用染料、
蛍光物質および放射性標識等が使用できる。標識化および染色は標識化用もしく
は染色用の分子上で直接おこなってもよく、あるいは１種もしくは複数種の他分
子の介在によって間接的におこなってもよい。
被験用試料は、例えば、血清、精液、血液または唾液であってもよい。しかし
ながら、卵や牛乳のような物質を試験に供してもよい。さらに、生きた動物から
採取する試料のほかに、例えば、食肉処理場において解体家畜の肉汁液を試験す
ることも重要である。また、魚類が抗体を分泌することが知られている。これら
の抗体は集約的養魚における養魚場の水中で決定することができる。試料は付加
的な処理に付す必要はない。
免疫学的反応性被検知分子はハプテン、高分子、病原体またはこれらの免疫学
的反応性フラグメントから選択される抗原であってもよい（この場合、免疫学的
反応性標準分子は抗体である）。この逆の場合であってもよく、この場合には免
疫学的反応性被検知分子は抗体であり、免疫学的反応性標準分子はハプテン、高
分子、病原体およびこれらの免疫学的反応性フラグメントから選択される抗原で
ある。
抗原の場合、免疫複合体の形成は、例えば、インキュベーション混合物中の抗
原の分子量が少なくとも１６０キロダルトン増加することによって推定される。
何故ならば、ＩｇＧ抗体は１６０ｋＤａの分子量を有するからである。１つの抗
原に対して複数の抗体が結合することもある。
この後者の態様は特に小さな分子、例えば、小さなタンパク質、ペプチドおよ
びハプテン（例えば、ホルモン）に対して重要である。このような比較的小さな
分子に対する抗体の結合は分子量に関して大きな（即ち、検知が容易な）シフト
をもたらさない。分子に結合しない抗体と分子が結合した抗体との差は正確かつ
明確に確定することはできない。本発明によれば、被検知分子上において異なる
エピトープの方向へ誘導される２種の抗体を使用するのが好ましい。この場合、
２種の抗体のうち１種のみが標識化される。しかしながら、所望により、両方の
抗体を標識化してもよい。抗原が存在しないために結合が形成されないときには
、標識化抗体のピークのみが可視化される（分子量：１６０Ｋ）。しかしながら
、抗原が存在するときには、両方の抗体が結合し、これによって分子量の明確な
シフトがもたらされる。即ち、１つの抗体に対する１６０Ｋから２つの抗体と抗
原に対する少なくとも３２０Ｋへの分子量シフトが起こる。
本発明によれば、例えば、アレルギーを試験する場合には、試料中に抗体が存
在する態様は、同じタイプの抗体の方向へ誘導される２次抗体を用いるときにも
発現する。
アレルギー試験の場合、標識化抗原（この場合はアレルゲンと呼ばれる）およ
び標識化抗−ＩｇＥは、例えば試料へ添加される。アレルゲンに対するＩｇＥが
存在する場合には、試料中のＩｇＥが標識化抗原に結合すると共に標識化抗−Ｉ
ｇＥがＩｇＥに結合した複合体が形成される。異なる両方の標識が検知中に少な
くとも部分的に一致するときには、試料はアレルゲンに対するＩｇＥを含有して
いたことになる。このような場合、ＩｇＥの全量は試料中へ標識化抗−ＩｇＥの
みを添加することによって測定することができ、標識化アレルゲンの添加は不要
である。
ＩｇＧとＩｇＥとの濃度差は多くの場合は非常に大きいため、既知のＥＬＩＳ
Ａ法によって同時に決定することはできない。本発明による方法はＩｇＧとＩｇ
Ｅの通常の値並びに該値よりもかなり高い値を同時に測定するのに十分な感度を
示す。１回の試験でＩｇＥとＩｇＧを同時に決定できることは、保護ＩｇＧの濃
度に対するＩｇＥの濃度増加を確定して問題となる処置が有効かどうかを初期段
階で見分けるための過増感処置における臨床的応用において特に有効である。
このような方法においては、標識化アレルゲン、標識化の異なる抗−ＩｇＥお
よび標識化の異なる抗−ＩｇＧを試料中へ添加する。アレルゲンに対するＩｇＧ
が体内で形成されるとすぐに、抗−ＩｇＥ標識とアレルゲン標識とのコンビネー
ションのほかに、あるいは該コンビネーションの代りに抗−ＩｇＧ標識とアレル
ゲン標識とのコンビネーションを検知することが可能となる。
本発明によれば、異なる抗原に対して複数の異なる標識を使用することによっ
て、１回の試験で複数の診断をおこなうことが可能である。
多くの抗原に対して非常に多くの抗体が現在のところ市販されているが、本発
明によれば、被験体に固有の抗原および／または抗体を調製することが可能であ
る。本発明によれば両方のカテゴリーのものを利用することができる。
直接的試験のほかに、置換的試験も可能である。試料中へ未知量の抗原、既知
量の標識化された該抗原および標定化量の抗血清を添加することによって、非標
識化抗原の測定量を決定できる。これは未知量の標識化抗原の測定法である。
上記方法のほかに、本発明は該方法を実施するための多数のキットを包含する
。このようなキットは、例えば、抗原もしくは抗体のような標識化標準分子の貯
蔵溶液を含有する。これに対するサプルメントとして、キットは得られる免疫反
応
および／または関連する緩衝液系の分離と決定のための適当なカラムを保有して
いてもよい。
本願においては次の定義を用いる。
「免疫学的反応性」は他分子との「免疫複合体」の形成能を意味する。一般的
には、該複合体は抗原と抗体もしくはその一部との複合体を意味する。しかしな
がら、抗体と該抗体に対するイディオタイプ抗体との反応も可能である。「抗原
」には免疫反応を惹起する全てのもの、例えば、ハプテン、高分子、病原体また
はこれらの構成成分が含まれる。「抗体」は通常の意味で用いられるが、異なる
タイプの抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＥ等並びにこれらの
一部分も包含される。
「標準分子」は標準溶液中およびインキュベーション混合物中に存在する分子
を示すのに用いる。標準分子は抗原または抗体であってもよい。
「被検知分子」は被験試料中で検知されなければならない分子である。この分
子も抗体または抗原であってもよい。
「標準溶液」は少なくとも１種または複数種の標準分子を含有する溶液である
。「試料」は試験に供される液体もしくはそれ以外の物質である。一緒に添加す
ることによって、試料と標準溶液は「インキュベーション混合物」を形成する。
このような標準溶液は標準（reference）としても用いられる。
本発明を以下の実施例によってさらに説明する。これらの実施例は本発明を例
示的に説明するものであって、本発明を限定するものではない。
実施例 実施例１ 血清試料中における大腸菌の抗原Ｆ１１に対する抗体の検知
豚の血清中における大腸菌の抗原Ｆ１１に対する抗体の存在（陽性血清反応）
を検知するために、血清試料０.５ｍｌを、ＰＢＳにＦＩＴＣ−標識化Ｆ１１抗
原を加えた標準溶液１００μｌと混合した。得られた混合物を混合後、オートサ
ンプラー中において室温下で放置した。
インキュベーション混合物１０μｌをさらに処理することなくゲル透過カラム
（内容物：１ｍｌ）を用いて処理した。このカラムをＰＢＳを用いる溶出処理に
付した。溶出液を蛍光検出器を用いてオンラインで測定した。血清反応が陽性お
よび陰性（標準）の血清をこのようにして処理した。図１はこの結果を示すもの
である。
グラフ中の最初のピークは血清反応が陰性の標準血清を示す。他の６つのピー
クは、同量の標準溶液を含有する血清反応が陽性の一連の希釈液に関するもので
ある。最初のピークと他の６つのピークを比較すれば明らかなように、血清中に
抗体が存在すると、より多くの物質のピークは抗原のピークの次に現われる。こ
れは抗原−抗体複合体である。より多くの血清が存在すると、複合体のピークは
より大きくなる。一定の点においては、複合体のピークのみが現われる。ここで
は標準溶液中の全ての抗原は血清中の抗体と結合する。ピークの形状も有意であ
る。血清反応が陰性の場合には、ピークはガウス型であるが、血清反応が陽性の
場合には、標準溶液中の全ての抗原または抗体は結合し、ピークはもはやガウス
型を示さなくなる。
実施例２ ワクチンに対する抗体の検知
実施例１の場合と同様にして、ワクチン接種した豚の血清中におけるワクチン
に対する抗体の存在を検知した。図２に結果を示す。
最初のピークはワクチン接種しない豚の血清を用いた試験の結果を表す。この
ピークは明白なガウス曲線を示す。他の５つのピークは陽性血清を含有する標準
溶液の一連の希釈液に関するものである。第１の血清反応が陽性のピークの感度
は通常のＥＬＩＳＡの感度に対応する。希釈度がより高くて血清反応が陽性の他
の４つのピークは、本発明による試験の感度がＥＬＩＳＡの感度よりも明らかに
高いことを示す。濃度が高くなるとピークが２つのピークに分離することも図２
は示す。
実施例３ アレルギー患者の体液試料中におけるＩｇＧとＩｇＥの濃度決定
アレルギー患者の血清中においてＩｇＥの増量を、標識化の異なるアレルゲン
と抗−ＩｇＥを含有する貯蔵溶液を該血清中へ添加することによって決定した。
特異的ＩｇＥの濃度を、カラム上で分離させた後、アレルゲンと抗−ＩｇＥの両
方の標識物を含有するピークを測定することによって決定した。ＩｇＥの全量は
、アレルゲンを含まない標識化抗−ＩｇＥのみを試料へ添加することによって測
定した。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Method of Detecting the Presence of an Immunologically Reactive Molecule in a Sample The present invention provides a method for contacting a standard solution of one or more immunologically reactive standard molecules with a sample in an incubation mixture. An immune complex is formed between the standard molecule and the immunologically reactive molecule in the sample, and then one or more physical parameters of the molecular weight, charge and morphology of the components of the incubation mixture are adjusted to the same as the components of the standard solution. A method for detecting the presence of an immunologically reactive molecule in a sample, comprising determining the formation of an immune complex by comparing to physical parameters. This type of method is important, for example, in detecting molecules that elicit an immune response in a subject such as a patient or test animal. Such molecules include haptens, macromolecules, pathogens and their immunogenic fragments. These molecules are present in the body at the time of infection. However, it may be desirable to detect other types of other molecules in the sample. For example, it is possible to expect to confirm the presence of a specific protein in a plant or to detect a test molecule in soil or sample water. Detecting the presence of a determined type of antibody is important in detecting allergies or allergic reactions. Infection is usually identified by a physician or veterinarian based on clinical symptoms and / or previous reactions. Furthermore, in this case, laboratory tests for the pathogen or the subject's response to the pathogen are important factors. As a test method which has been tried conventionally, a culture method, a serological determination method and a DNA test method are exemplified. For allergies, skin tests are also used. However, many diseases have the disadvantage that the pathogen (antibody in the case of allergy) is only present at low concentrations or cannot be isolated from the subject. For example, herpes viruses are often undetectable in the bloodstream, but because they are present in the nervous system, they cannot be easily accessed without significant damage to the subject. Thus, the discovery of such diseases has been made only by indirect methods of detecting specific antibodies in body fluids. Such antibodies are directed towards the originator of the disease. The presence of the antibody indicates that the subject has contacted the relevant antigen and / or pathogen. This type of method for detecting the presence of a pathogen or its antibody in the body of a subject is used in human medical care and health care in the veterinary field. In this case, such a method is very important as it is not only quick but also reliable. It is clear that false positive or false negative results can have disastrous consequences in human health care and veterinary applications. Particularly in health care in the field of veterinary medicine, the need to determine the health of livestock, especially cattle, pigs and poultry, is important and growing. This method is applicable not only to general diagnosis, i.e., to determine the cause of epidemic diseases or illnesses, but also to diagnoses that are more widely available for subclinical infection and monitoring the progression of prognosis. Not only in parasitic diseases, but also in viral diseases such as IBR in cattle, Auzjesky disease and vesicle disease in pigs, Marek's disease in poultry, or bacterial diseases such as food poisoning due to Salmonella. However, detecting the presence of antibodies in serum is very important in limiting and eliminating related diseases. Therefore, there is a particular need to provide a diagnostic method for determining seropositivity for multiple diseases, preferably in a single test that is rapid, very reliable and low cost, preferably. The speed of diagnosis is important because often a large number of samples (sometimes hundreds or thousands to millions of samples) must be tested depending on the particular problem. This method must be reliable. This is because even a mistake per thousand of such a large number of samples in the field of veterinary medicine will qualify a number of diseased animals as healthy. This leads to the neglected source of infection. Clearly, the highest possible reliability is required for human medical care. Particularly in the veterinary field, a method that can be implemented at low cost is important because the margin is relatively low. However, in the case of humans, price control by the executive branch is also important. At present, ELISA and related immunological methods are particularly used for the above-mentioned infection diagnosis. Although these methods meet the diagnostic speed and cost requirements, they inherently have the opportunity to generate errors due to the procedures employed. In the ELISA method, proteins (antibodies or antigens) are adsorbed on the walls of small reaction wells substantially filled with a test sample. After a period of time, proteins (antigens or antibodies) from the sample bind to proteins already bound to the walls of the reaction wells, which in a subsequent step are specific for the antigens or antibodies in the sample. It is confirmed visually by adding a labeled antibody. In this method, rinsing the reaction well three times to remove unbound protein from the sample is a very important factor. The rinsing method and rinsing time should be well adapted to the properties of the molecules to be detected from the sample. Insufficient rinsing results in false positives, and excessive rinsing removes adsorbed proteins, resulting in a false negative determination. While such dangers can be minimized by using robotized automation, it is inherently unlikely that the opportunity for error will occur, especially when testing large numbers of samples. This is a significant methodical drawback that will result in re-infection due to the lack of awareness of the source of the infection. A completely different method is described in Dutch patent application 93/00965. Seropositivity (the presence of antibodies or antigens in the body against the antigen of interest) is determined by electrophoresis. The sample is first contacted with a standard solution of one or more immunologically reactive standard molecules in the incubation mixture. This forms an immune complex between the immunologically reactive standard molecule and the immunologically reactive molecule to be detected in the sample. The standard molecule may be an antigen or an antibody. The determination of immune complex formation is then made by comparing the components in the incubation mixture with those in the standard solution using electrophoresis. The theory underlying this method is that when a specific antigen is present as a standard molecule in a standard solution, the antigen reacts with the antibodies present in the sample during the incubation. After electrophoresis, the antigen in the standard solution will be present at the determined position on the electrophoresis gel. In the incubation mixture, the physical properties of the antigen change as the antigen in the standard solution binds to one or more antibodies in the sample. Thus, after electrophoresis, the antigen will be present at different positions on the gel and will not form part of the immune complex. A similar function is exerted when the standard molecule is an antibody and the molecule to be detected is an antigen. After the formation of the immune complex, the physical properties of the antibody change so that it can be distinguished on a gel. Electrophoresis depends specifically on physical parameters of isoelectric point and molecular weight. Changes in the isoelectric point of the standard molecule are determined by isoelectric focusing (IEF), while differences in molecular weight are determined by natural polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). In each case, a standard solution is included as a reference in addition to the incubation mixture. In the detection method described here, it has been found that IEF electrophoresis has many disadvantages. In the case of the IEF, for example, a so-called "flatbed-gel" must always be used. Since this gel is poured on a horizontal surface without a cover plate, the resulting gel will never be completely flat. As a result, due to the non-flatness of the gel, all bands obtained after staining of the separated proteins do not line up as one line. The so-called "smiling" of gels also leads to this. The human eye can identify this type of change in movement patterns. However, when large numbers of samples have to be tested, the electrophoretic separation of the incubation mixture and the standard solution is preferably robotized. Then, reading is performed using a computer. However, some computers cannot distinguish bands that are actually located from bands that are located at different locations under conditions that are affected by the non-flatness of the gel or the smiling effect. This results in erroneous readings caused by this. Furthermore, it is difficult to robotize the positioning of the application strip on such a flatbed-gel. Samples for separation often disappear from the strip, which gives poor results. In order to visualize separated proteins on an IEF gel, it is often necessary to actually label standard molecules. Generally, this is done on NH 3 + groups with a dye. As a result, the entire immune complex becomes more acidic due to the shielding of the NH 3 + group on the standard molecule, and shifts to an acidic pH range in the gel during the isoelectric focusing. However, upon reaching this region, the complex of the molecule to be detected and the standard molecule separates due to the low pH effect that governs this region, after which the labeled standard molecule returns to its original isoelectric point. Under these conditions, an immune complex is actually formed but will not be detected. This results in false negative results. Furthermore, it has been found that, in practice, desirable results cannot be obtained in natural electrophoresis due to the smiling effect and the size of the immune complex. Accordingly, it is an object of the present invention to provide an entirely new method for detecting the presence of an immunologically reactive molecule in a sample. In this method, in order to form an immune complex between an immunologically reactive standard molecule and an immunologically reactive detection molecule, a sample is prepared by using a standard solution of one or more immunologically reactive standard molecules. In the incubation mixture. The immunoconjugate is then compared by comparing one or more of the physical parameters of the molecular weight, charge and morphology of the components of the incubation mixture with the same physical parameters of the components of the standard solution, as in known detection methods. Determine the presence or absence of body formation. However, the presence or absence of the formation of an immune complex can be determined by comparing the column chromatography separation of the components of the incubation mixture with the column chromatography separation of the standard solution by the same method. In this case, a change in the elution rate of the immunologically reactive standard molecule in the incubation mixture relative to the elution rate of the same immunologically reactive standard molecule in the standard solution is indicative of the formation of an immune complex. The column chromatography separation is preferably performed by a gel permeation method. The separation in this case is performed exclusively according to the difference in size between the standard molecules in the standard solution and the standard molecules in the incubation mixture. Further, the charge of the standard molecule also changes upon complex formation. In this case, the column chromatography separation may be performed based on ion exchange chromatography. In the case of electrophoresis, it is unknown what causes the change. In contrast, the detection of immune complexes formed according to the present invention is not at all influenced by the quality of the gel used for the separation or the effect of the dye label on the acidity of the formed immune complexes. The quality of the chromatography column used has no effect on the end result of the detection method according to the invention. This is because each sample and each standard is tested on the same column. There are very few possible errors in determining the result. This is because contamination and other factors that have a negative effect on the function of the system do not result in inaccurate judgments and result in discernable elution patterns that differ. Directly indicates that does not work by nature). When such a change is observed, the test can be performed again. Instead of false-positive or false-negative results, when there is a change, there is a discernible change in the elution pattern as a change. In the case of separation by ELISA and electrophoresis, there is no such reliability. Separation of the standard molecule from the complex can be specifically optimized by choosing different gel permeants that use the molecule to be detected as a starting point. Large antigens require different column materials than haptens. One skilled in the art can select an appropriate column based on knowledge of the molecule to be detected. This greatly increases the adaptability of the system. The entire separation process by column chromatography can be performed very easily by an automated method. Automated chromatography detection systems with a recording device are known. Therefore, various operations can be performed in a very simple manner. To further increase the sensitivity of the method, it is also possible to detect immune complexes formed by the application of a protein staining reaction known per se. The standard molecule in the standard solution may be labeled before use. Irrelevant molecules are excluded because only labeled molecules are detected. All kinds of labels can be used, such as textile dyes, fluorescent substances and radioactive labels. Labeling and staining may be performed directly on the molecule for labeling or staining, or indirectly through the interposition of one or more other molecules. The test sample may be, for example, serum, semen, blood or saliva. However, substances such as eggs and milk may be subjected to the test. In addition to the samples taken from live animals, it is also important to test the broth of demolition livestock, for example, in slaughterhouses. It is also known that fish secrete antibodies. These antibodies can be determined in fish farm water in intensive fish farming. The sample need not be subjected to additional processing. The immunologically reactive detectable molecule may be an antigen selected from a hapten, a macromolecule, a pathogen or an immunologically reactive fragment thereof (where the immunologically reactive standard molecule is an antibody). . The reverse may be the case, where the immunologically reactive detected molecule is an antibody and the immunologically reactive standard molecule is a hapten, macromolecule, pathogen and immunologically reactive fragments thereof. An antigen selected from: In the case of an antigen, the formation of an immune complex is estimated, for example, by increasing the molecular weight of the antigen in the incubation mixture by at least 160 kilodaltons. This is because IgG antibodies have a molecular weight of 160 kDa. Multiple antibodies may bind to one antigen. This latter aspect is particularly important for small molecules, such as small proteins, peptides and haptens (eg, hormones). Binding of the antibody to such relatively small molecules does not result in a large (ie, easily detectable) shift in molecular weight. The difference between an antibody that does not bind to the molecule and an antibody that binds to the molecule cannot be determined accurately and unambiguously. According to the invention, it is preferred to use two antibodies which are directed towards different epitopes on the molecule to be detected. In this case, only one of the two antibodies is labeled. However, if desired, both antibodies may be labeled. When no bond is formed due to the absence of antigen, only the peak of the labeled antibody is visualized (molecular weight: 160K). However, when an antigen is present, both antibodies bind, resulting in a distinct shift in molecular weight. That is, a molecular weight shift occurs from 160K for one antibody to at least 320K for two antibodies and antigen. According to the present invention, for example, when testing for allergies, the aspect in which the antibody is present in the sample also manifests when using a secondary antibody directed towards the same type of antibody. In the case of an allergy test, a labeled antigen (in this case called an allergen) and a labeled anti-IgE are added, for example, to the sample. When IgE for the allergen is present, a complex is formed in which IgE in the sample binds to the labeled antigen and labeled anti-IgE binds to IgE. When both different labels at least partially match during detection, the sample has contained IgE for the allergen. In such a case, the total amount of IgE can be measured by adding only labeled anti-IgE to the sample, and the addition of labeled allergen is not required. The concentration difference between IgG and IgE is often very large and cannot be determined simultaneously by known ELISA methods. The method according to the invention is sensitive enough to simultaneously measure the usual values of IgG and IgE as well as considerably higher values. The ability to simultaneously determine IgE and IgG in a single test is a clinical application in hypersensitization treatment to determine the increased concentration of IgE relative to the concentration of protected IgG and to determine at an early stage whether the treatment in question is effective. Is particularly effective in In such a method, a labeled allergen, a differently labeled anti-IgE and a differently labeled anti-IgG are added to the sample. As soon as the IgG for the allergen is formed in the body, it is possible to detect the combination of the anti-IgE label and the allergen label in addition to or instead of the combination of the anti-IgE label and the allergen label. Become. According to the present invention, it is possible to make multiple diagnoses in one test by using multiple different labels for different antigens. Although numerous antibodies are currently commercially available for many antigens, it is possible according to the present invention to prepare antigens and / or antibodies specific to a subject. According to the invention, both categories can be used. In addition to direct tests, substitution tests are also possible. By adding an unknown amount of the antigen, a known amount of the labeled antigen and a standardized amount of antiserum to the sample, the measured amount of unlabeled antigen can be determined. This is a method for measuring unknown amounts of labeled antigen. In addition to the methods described above, the present invention includes a number of kits for performing the methods. Such a kit contains, for example, a stock solution of a labeled standard molecule such as an antigen or antibody. As a supplement to this, the kit may have a suitable column for the separation and determination of the resulting immune response and / or the relevant buffer system. The following definitions are used in this application. “Immunological reactivity” means the ability to form an “immune complex” with another molecule. Generally, the complex means a complex of the antigen and the antibody or a part thereof. However, it is also possible to react the antibody with an idiotypic antibody against said antibody. "Antigen" includes anything that elicits an immune response, for example, haptens, macromolecules, pathogens or components thereof. "Antibody" is used in its ordinary sense, but also encompasses different types of antibodies, such as IgG, IgM, IgA and IgE, and portions thereof. "Standard molecule" is used to indicate a molecule present in a standard solution and in the incubation mixture. The standard molecule may be an antigen or an antibody. "Detected molecule" is a molecule that must be detected in a test sample. This molecule may also be an antibody or antigen. A “standard solution” is a solution containing at least one or more standard molecules. A “sample” is a liquid or other substance to be tested. By adding together, the sample and the standard solution form an “incubation mixture”. Such a standard solution is also used as a reference. The present invention is further described by the following examples. These examples illustrate the present invention by way of example and do not limit the present invention. To detect the presence of antibodies to the antigen F11 E. coli in serum detection pig antibodies to the antigen F11 E. coli in Example Example 1 Serum samples (positive serum reaction), a serum sample 0.5 ml, in PBS It was mixed with 100 μl of a standard solution to which FITC-labeled F11 antigen was added. After mixing the obtained mixture, the mixture was allowed to stand at room temperature in an autosampler. 10 μl of the incubation mixture were treated without further treatment using a gel permeation column (content: 1 ml). This column was subjected to elution treatment using PBS. The eluate was measured online using a fluorescence detector. Sera with positive and negative (standard) serum reactions were processed in this way. FIG. 1 shows this result. The first peak in the graph indicates a standard serum with a negative serum reaction. The other six peaks are for a series of positive serum reactions containing the same amount of standard solution. As can be seen by comparing the first peak with the other six peaks, the presence of antibody in the serum causes more material peaks to appear next to the antigen peaks. This is an antigen-antibody complex. In the presence of more serum, the peak of the complex is larger. At certain points, only the complex peak appears. Here, all the antigens in the standard solution bind to the antibodies in the serum. The shape of the peak is also significant. If the serum response is negative, the peak is Gaussian, but if the serum response is positive, all antigens or antibodies in the standard solution bind and the peak no longer exhibits Gaussian. Example 2 Detection of Antibody to Vaccine In the same manner as in Example 1, the presence of the antibody to the vaccine was detected in the serum of vaccinated pigs. FIG. 2 shows the results. The first peak represents the results of a test using unvaccinated pig serum. This peak shows a clear Gaussian curve. The other five peaks are for a series of dilutions of a standard solution containing positive sera. The sensitivity of the peak positive for the first serum reaction corresponds to the sensitivity of a normal ELISA. The other four peaks with a higher dilution and a positive serum response indicate that the sensitivity of the test according to the invention is clearly higher than that of the ELISA. FIG. 2 also shows that at higher concentrations the peak separates into two peaks. Example 3 Determination of IgG and IgE Concentrations in Body Fluid Samples of Allergic Patients Increased IgE in serum of allergic patients was determined by adding a stock solution containing differently labeled allergens and anti-IgE to the serum. Were determined. The concentration of specific IgE was determined by measuring peaks containing both allergen and anti-IgE labels after separation on the column. The total amount of IgE was measured by adding only labeled allergen-free anti-IgE to the sample.
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Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ
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