JP2001516573A - Screening method for antimicrobial compounds - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】 本発明は、細菌、詳細にはスタフィロコッカス属およびストレプトコッカス属の細菌を用いる全細胞アッセイにおいて抗微生物化合物をスクリーニングする方法を提供する。 (57) [Summary] The present invention provides a method of screening antimicrobial compounds in a whole cell assay using bacteria, particularly Staphylococcus and Streptococcus bacteria.
Description
【０００１】 発明の分野 本発明は、細菌および他の微生物を用いて抗微生物化合物をスクリーニングす
る方法を提供する。また、１種以上の細菌または微生物、詳細には、例えばスタ
フィロコッカス（Staphylococcus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus） 属およびエシェリシア（Escherichia）属の細菌を用いてスクリーニングする方 法も本発明において提供される。[0001] The present invention provides methods for screening antimicrobial compounds using bacteria and other microorganisms. Also provided in the present invention is a method of screening using one or more bacteria or microorganisms, in particular, for example, bacteria of the genus Staphylococcus, Streptococcus and Escherichia. .
【０００２】 発明の背景 抗微生物化合物を検出するための二重培養アッセイは２種の同時培養される微
生物を用いて説明されている。Oldenberg, K, et al. J. Biomolecular Screeni
ng Vol. 1, No. 3: 123 (1996)。 多くの抗微生物薬を発見するためのインビトロにおける生物発光スクリーニン
グも報告されている。Arain, T.M., et al. Antimicrobial Agents and Chemoth
erapy. Vol. 40, No. 6: 1536 (1996)。 マクロファージにおいて抗微生物薬の活性を評価するためのリポーター遺伝子
法も知られている。Arain, T.M., et al. Antimicrobial Agents and Chemother
apy. Vol. 40, No. 6: 1542 (1996)。 その他、蛍光によるアッセイ法を用いる高処理量スクリーニングが報告されて
いる。Rogers, M. DDT Vol.2, No. 4: 156 (1997)。 本発明は、特に、培養細菌中の発光マーカー遺伝子産物を用いる新たな方法を
提供する。詳細には、この方法は、抗微生物薬のスクリーニング、特に高処理量
アッセイフォーマットに適する。抗微生物薬のスクリーニングにおいて有用な組
成物も提供される。本発明の方法および組成物は、既知の細胞による抗微生物薬
のアッセイに優る著しい改良を具現する。 抗微生物薬耐性細菌の出現傾向が増大することに鑑みると、新しい効果的な抗
微生物化合物に対する大きな必要性がある。本発明は、新たな抗微生物化合物の
発見に有用なスクリーニング法および組成物を提供する。これらのスクリーニン
グ法は迅速かつ低コストで行うことができ、新たな抗微生物化合物の開発を促進
するであろう。BACKGROUND OF THE INVENTION Double culture assays for detecting antimicrobial compounds have been described using two co-cultured microorganisms. Oldenberg, K, et al. J. Biomolecular Screeni
ng Vol. 1, No. 3: 123 (1996). In vitro bioluminescence screening to find many antimicrobial agents has also been reported. Arain, TM, et al. Antimicrobial Agents and Chemoth
erapy. Vol. 40, No. 6: 1536 (1996). Reporter gene methods for evaluating antimicrobial activity in macrophages are also known. Arain, TM, et al. Antimicrobial Agents and Chemother
apy. Vol. 40, No. 6: 1542 (1996). In addition, high-throughput screening using a fluorescent assay has been reported. Rogers, M. DDT Vol. 2, No. 4: 156 (1997). The present invention provides, inter alia, a new method using a luminescent marker gene product in cultured bacteria. In particular, the method is suitable for screening antimicrobial agents, especially for high-throughput assay formats. Compositions useful in screening for antimicrobial agents are also provided. The methods and compositions of the present invention embody significant improvements over assays of antimicrobial agents by known cells. In view of the increasing prevalence of antimicrobial resistant bacteria, there is a great need for new and effective antimicrobial compounds. The present invention provides screening methods and compositions useful for discovering new antimicrobial compounds. These screening methods can be performed quickly and at low cost and will facilitate the development of new antimicrobial compounds.
【０００３】 発明の概要 本発明は、工程（ａ）少なくとも２種の異なる細菌を含む組成物を用意し（そ
れぞれの細菌はマーカー遺伝子を含み、その生成物は光スペクトルの異なる波長
において検出可能である）；（ｂ）工程（ａ）の組成物を試験化合物と接触させ
；（ｃ）異なる波長のうち少なくとも１つの強度変化が起こるかどうかを検出し
；ついで（ｄ）試験化合物が強度変化に関連するものであるかどうかを調べるこ
とを含む、静細菌および殺細菌化合物のスクリーニング方法を提供する。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a composition comprising step (a) comprising at least two different bacteria, each comprising a marker gene, the products of which are detectable at different wavelengths of the light spectrum. (B) contacting the composition of step (a) with a test compound; (c) detecting whether at least one intensity change at different wavelengths occurs; and (d) subjecting the test compound to an intensity change. A method for screening bacteriostatic and bactericidal compounds is provided, which comprises checking for relatedness.
【０００４】 また本発明は、光スペクトルの波長が可視光スペクトル中にある方法も提供す
る。[0004] The invention also provides a method wherein the wavelength of the light spectrum is in the visible light spectrum.
【０００５】 さらに、細菌の１つがグラム陽性生物ストレプトコッカス（Streptococcus） 、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、グラム陰性生物イー・コリ（E. col
i）、ケー・ニューモニアエ（K. pneumoniae）およびレジオネラ・ニューモフィ
ラ（Legionella pneumophila）からなる群より選択される方法を提供する。In addition, one of the bacteria is a gram-positive organism, Streptococcus, Staphylococcus, a gram-negative organism, E. coli.
i), a method selected from the group consisting of K. pneumoniae and Legionella pneumophila.
【０００６】 さらに本発明は、マーカー遺伝子の１つがイー・コリｌｕｘＣＤＡＢＥ、エス
・アウレウスｌｕｘＡＢ、イー・コリｌｕｃおよびエス・アウレウスｌｕｃから
なる群より選択される方法を提供する。 また本発明は、マーカー遺伝子の１つがｌｕｘＣＤＡＢＥ、ｌｕｘＡＢおよび
ｌｕｃからなる群より選択される方法を提供する。[0006] The invention further provides a method wherein one of the marker genes is selected from the group consisting of E. coli luxCDABE, S. aureus luxAB, E. coli luc and S. aureus luc. The present invention also provides a method wherein one of the marker genes is selected from the group consisting of luxCDABE, luxAB and luc.
【０００７】 さらに、強度変化が、異なる波長のうち少なくとも１つの強度の増加である方
法が提供される。 強度変化が、異なる波長のうち少なくとも１つの強度の減少である方法も提供
される。Further provided is a method wherein the intensity change is an increase in the intensity of at least one of the different wavelengths. A method is also provided wherein the intensity change is a decrease in the intensity of at least one of the different wavelengths.
【０００８】 本発明は、工程（ａ）少なくとも２種の異なる細菌を含む組成物を用意し（そ
れぞれの細菌は光スペクトルの異なる波長において検出可能な化合物を含む）；
（ｂ）工程（ａ）の組成物を試験化合物と接触させ；（ｃ）異なる波長のうち少
なくとも１つの強度変化が起こるかどうかを検出し；ついで（ｄ）試験化合物が
強度変化に関連するものであるかどうかを調べることを含む、静細菌および殺細
菌化合物のスクリーニング方法を提供する。The present invention provides a composition comprising step (a) at least two different bacteria, each of the bacteria comprising a compound detectable at a different wavelength of the light spectrum;
(B) contacting the composition of step (a) with a test compound; (c) detecting whether at least one of the different wavelengths has an intensity change; and (d) detecting that the test compound is associated with the intensity change. A method of screening for bacteriostatic and bactericidal compounds, which comprises determining whether the bacteriostatic compound is a bacteriostatic and bactericidal compound.
【０００９】 また、少なくとも２種の細菌の単離培養物を含む組成物であって、少なくとも
２種の細菌がグラム陽性生物ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、グラム
陰性生物イー・コリ、ケー・ニューモニアエおよびレジオネラ・ニューモフィラ
からなる群より選択されるものである組成物も提供される。[0009] Also, a composition comprising an isolated culture of at least two bacteria, wherein at least two of the bacteria are Gram-positive organisms Streptococcus, Staphylococcus, Gram-negative organisms E. coli, K. pneumoniae and Legionella. -Also provided is a composition that is selected from the group consisting of Pneumophylla.
【００１０】 また本発明は、少なくとも２種の細菌の単離培養物を含む組成物であって、少
なくとも２種の細菌がｌｕｘＣＤＡＢＥ、ｌｕｘＡＢおよびｌｕｃからなる群よ
り選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子、詳細にはイー・コリｌｕｘＣＤ
ＡＢＥ、エス・アウレウスｌｕｘＡＢ、イー・コリｌｕｃおよびエス・アウレウ
スｌｕｃからなる群より選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子を含むもの
である組成物を提供する。[0010] The present invention also relates to a composition comprising an isolated culture of at least two kinds of bacteria, wherein at least two kinds of bacteria are at least one marker gene selected from the group consisting of luxCDABE, luxAB and luc, For more information, E. coli luxCD
Provided is a composition comprising at least one marker gene selected from the group consisting of ABE, S. aureus luxAB, E. coli luc, and S. aureus luc.
【００１１】 さらに、少なくとも２種の細菌の単離培養物を含むキットであって、少なくと
も２種の細菌がグラム陽性生物ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、グラ
ム陰性生物イー・コリ、ケー・ニューモニアエおよびレジオネラ・ニューモフィ
ラからなる群より選択されるものであるキットも提供される。Further, a kit comprising an isolated culture of at least two bacteria, wherein the at least two bacteria are Gram-positive organisms Streptococcus, Staphylococcus, Gram-negative organisms E. coli, K. pneumoniae and Legionella. Kits are also provided that are selected from the group consisting of Pneumophylla.
【００１２】 また本発明は、少なくとも２種の細菌の単離培養物を含むキットであって、少
なくとも２種の細菌がｌｕｘＣＤＡＢＥ、ｌｕｘＡＢおよびｌｕｃからなる群よ
り選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子、詳細にはイー・コリｌｕｘＣＤ
ＡＢＥ、エス・アウレウスｌｕｘＡＢ、イー・コリｌｕｃおよびエス・アウレウ
スｌｕｃからなる群より選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子を含むもの
であるキットを提供する。[0012] The present invention also relates to a kit comprising an isolated culture of at least two kinds of bacteria, wherein at least two kinds of bacteria are at least one marker gene selected from the group consisting of luxCDABE, luxAB and luc. Into E. coli luxCD
There is provided a kit comprising at least one marker gene selected from the group consisting of ABE, S. aureus luxAB, E. coli luc and S. aureus luc.
【００１３】 用語 以下の定義は、本明細書に頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするや
めのものである。 「宿主細胞」は外来性ポリヌクレオチド配列により形質転換もしくはトランス
フェクションされた、または形質転換またはトランスフェクションすることので
きる細胞である。Terminology The following definitions are intended to facilitate understanding of certain terms used frequently herein. A “host cell” is a cell that has been transformed or transfected, or is capable of being transformed or transfected by an exogenous polynucleotide sequence.
【００１４】 「単離」とは、「人の手によって」天然の状態から変化させられた、すなわち
、天然物の場合、その本来の環境から変化または除去あるいはその両方が行われ
たことを意味する。例えば、天然において生体に存在するポリヌクレオチドまた
はポリペプチドは、「単離」されていないが、その天然状態で共存する物質から
分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書に用いる用語
としての「単離」がなされている。"Isolated" means altered "by the hand of man" from its natural state, ie, in the case of natural products, altered or removed from its original environment or both. I do. For example, a polynucleotide or polypeptide that is naturally occurring in a living organism is not `` isolated '', but the same polynucleotide or polypeptide separated from its coexisting material in its natural state is a term used herein. Has been "isolated".
【００１５】 ポリヌクレオチド」は、一般に、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡ、ま
たは修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい、ポリリボヌクレオチドまた
はポリデオキシリボヌクレオチドをも意味する。従って、「ポリヌクレオチド」
は、とりわけ一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物また
は一本鎖、二本鎖および三本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖
ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしく
はより典型的には二本鎖もしくは三本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合
物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を包含するがこれ
らに限らない。加えて、本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡもし
くはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を意味する。かかる領
域における鎖は同一の分子または異なる分子由来のものでよい。この領域はこれ
らの分子の一つまたはそれ以上の全てを含んでいてもよいが、より典型的にはい
くつかの分子の一領域のみを含む。三重らせん領域の分子の一つは、オリゴヌク
レオチドであることがしばしばである。本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオ
チド」なる用語は、一つまたはそれ以上の修飾した塩基を含有する、前記したＤ
ＮＡまたはＲＮＡを包含する。このように、安定性または他の理由で修飾された
骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも、本明細書が意図するろところの「ポリヌク
レオチド」である。さらに、イノシン等の普通でない塩基、またはトリチル化塩
基等の修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ（二つの例だけを示す）も、本明細書
での用語ポリペプチドである。当業者に既知の多くの有用な目的を提供するＤＮ
ＡおよびＲＮＡに、非常に多くの修飾がなされていることは、明らかであろう。
「ポリヌクレオチド」なる用語は、本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチドの
このような化学的、酵素的または代謝的に修飾した形態、ならびにウイルス、と
りわけ単純型細胞および複雑型細胞を含む、細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡ
の化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」は、しばしば、オリゴヌクレオ
チドと称される短鎖ポリヌクレオチドを包含する。"Polynucleotide" also generally means a polyribonucleotide or polydeoxyribonucleotide, which may be unmodified RNA or DNA, or modified RNA or DNA. Thus, a "polynucleotide"
DNA, single-stranded and double-stranded RNA, especially single- and double-stranded DNA, a mixture of single- and double-stranded regions or a mixture of single-, double- and triple-stranded regions, RNA, which is a mixture of single-stranded and double-stranded regions, DNA, which may be single-stranded or more typically double-stranded or triple-stranded, or a mixture of single- and double-stranded regions. Including, but not limited to, hybrid molecules including RNA. In addition, "polynucleotide" as used herein refers to triple-stranded regions comprising RNA or DNA or both RNA and DNA. The chains in such regions may be from the same molecule or from different molecules. This region may include all one or more of these molecules, but more typically includes only one region of some of the molecules. One of the molecules of the triple helix region is often an oligonucleotide. As used herein, the term "polynucleotide" refers to a D as defined above containing one or more modified bases.
NA or RNA. Thus, DNA or RNA having a backbone that has been modified for stability or for other reasons is also a "polynucleotide" as contemplated herein. In addition, DNA or RNA containing only unusual bases such as inosine or modified bases such as tritylated bases (only two examples are shown) is also the term polypeptide herein. DN providing many useful purposes known to those skilled in the art
It will be apparent that there are numerous modifications to A and RNA.
The term "polynucleotide", as used herein, refers to such chemically, enzymatically or metabolically modified forms of polynucleotides and viruses, especially cells, including simple and complex cells. Characteristic DNA and RNA
The chemical forms of "Polynucleotide" embraces short polynucleotides, often referred to as oligonucleotides.
【００１６】 本明細書で用いる「ポリペプチド」は、ペプチド結合により直鎖で互いに結合
している２個またはそれ以上のアミノ酸を含むペプチドまたは蛋白をいうのに用
いる。「ポリペプチド」は、当該分野で通常例えばペプチド、オリゴペプチドお
よびオリゴマーとも称される短鎖、および多くの型があり、当該分野で一般的に
蛋白と称する長鎖の両方を意味する。ポリペプチドは、遺伝子によりコードされ
る２０種のアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。「ポリペプチド」は、
プロセッシングおよび他の翻訳後修飾のような自然の工程により、ならびに化学
修飾によるものを包含する。かかる修飾は基礎的なテキストおよびさらに詳細な
論文ならびに多数の研究文献にも詳しく記載されており、これらは当業者に周知
である。同じタイプの修飾がポリペプチド中にいくつかの部位に同程度または種
々の程度で存在してもよいことが理解されるであろう。修飾は、ペプチド骨格、
アミノ酸側鎖、およびアミノもしくはカルボキシ末端を包含するポリペプチドの
いずれの場所にあってもよい。修飾としては、例えば、アセチル化、アシル化、
ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌ
クレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有
結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結
合形成、脱メチル化、共有結合架橋形成、シスチン形成、ピログルタミン酸塩形
成、ホルミル化、ガンマー−カルボキシル化、糖鎖形成、ＧＰＩアンカー形成、
ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白加水分解プ
ロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アル
ギニル化などの転移ＲＮＡ媒介の蛋白へのアミノ酸付加、およびユビキチネーシ
ョンがある。例えば、Proteins-Structure and Molecular Properties、第2版、
T.E.Creighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク（1993）に記載されて
いる。例えば、Posttranslational Covalent Modification of Proteins、B.C.J
ohnson編、アカデミック・プレス、ニューヨーク（1983）のWold,F., Posttrans
lational Protein Modifications：Perspective and Prospects、1〜12頁；Seif
terら、Meth.Enzymol. 182:626-646（1990）およびRattanら、Protein Synthesi
s：Posttranslational Modifications and Aging，Ann. N. Y. Acad. Sci. 663:
48-62（1992）参照。ポリペプチドは分枝状あるいは分枝ありまたはなしの環状 であってもよい。環状、分枝状、および分枝状かつ環状のポリペプチドは、翻訳
後の天然プロセスから生じるものであってもよく、同様に全く合成的な方法によ
り製造されるものであってもよい。As used herein, “polypeptide” is used to refer to a peptide or protein containing two or more amino acids linked together linearly by peptide bonds. "Polypeptide" means both short chains, commonly referred to in the art, for example, peptides, oligopeptides and oligomers, and long chains, which come in many forms and are commonly referred to in the art as proteins. Polypeptides may contain amino acids other than the 20 gene-encoded amino acids. "Polypeptide"
It includes by natural steps such as processing and other post-translational modifications, as well as by chemical modifications. Such modifications are well described in basic texts and in more detailed articles as well as in numerous research literatures, which are well known to those skilled in the art. It will be appreciated that the same type of modification may be present at the same or varying degrees at several sites in the polypeptide. Modifications include the peptide backbone,
It can be anywhere on the amino acid side chain, and on the polypeptide including the amino or carboxy terminus. Modifications include, for example, acetylation, acylation,
ADP-ribosylation, amidation, covalent bonding of flavin, covalent bonding of heme moieties, covalent bonding of nucleotides or nucleotide derivatives, covalent bonding of lipids or lipid derivatives, covalent bonding of phosphotidylinositol, cross-linking, cyclization, disulfide Bond formation, demethylation, covalent crosslink formation, cystine formation, pyroglutamate formation, formylation, gamma-carboxylation, sugar chain formation, GPI anchor formation,
Transfer RNA-mediated amino acid addition to proteins, such as hydroxylation, iodination, methylation, myristoylation, oxidation, proteolytic processing, phosphorylation, prenylation, racemization, selenoylation, sulfation, arginylation, and ubiquitination There is tinnation. For example, Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd edition,
TECreighton, WH Freeman and Company, New York (1993). For example, Posttranslational Covalent Modification of Proteins, BCJ
Ohnson ed., Academic Press, New York (1983), Wold, F., Posttrans
lational Protein Modifications: Perspective and Prospects, pp. 1-12; Seif
ter et al., Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990) and Rattan et al., Protein Synthesi.
s: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. NY Acad. Sci. 663:
48-62 (1992). The polypeptide may be branched or cyclic, with or without branching. Cyclic, branched, and branched and cyclic polypeptides may result from post-translation natural processes, as well as may be produced by entirely synthetic methods.
【００１７】 本明細書で用いる「変種」なる用語は、対照ポリヌクレオチドまたはポリペプ
チドとは各々異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドであるが、本質的な特
性は保持している。典型的なポリヌクレオチドの変種は、別の対照ポリヌクレオ
チドとはヌクレオチド配列が異なる。変種のヌクレオチド配列の変化は、対照ポ
リヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させるも
のであってもよく、変化させないものであってもよい。以下に論じるように、ヌ
クレオチドの変化は結果的に、対照配列によりコードされるポリペプチドにおけ
るアミノ酸置換、付加、欠失、融合および末端切断を招く。典型的なポリペプチ
ドの変種は、別の対照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的には、差
異は、対照ポリペプチドおよび変種の配列が、全体的に非常に類似しており、多
くの領域で同一なものに限られる。変種および対照ポリペプチドは、１またはそ
れ以上の置換、付加、欠失が任意の組み合わせで起こることにより、アミノ酸配
列が変化し得る。置換または挿入されたアミノ酸残基は、遺伝学的コードにより
コードされたものであってもなくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドの変種は、例えば対立遺伝子変種のような自然発生的なものでもよく、または
自然発生することが知られていない変種でもよい。ポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの非自然発生変種は、突然変異技術または直接的合成、および当業者に
知られた他の組み換え法により製造できる。The term “variant” as used herein is a polynucleotide or polypeptide that differs from a reference polynucleotide or polypeptide respectively, but retains essential properties. A typical variant of a polynucleotide differs in nucleotide sequence from another, reference polynucleotide. Changes in the nucleotide sequence of the variant may or may not change the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the control polynucleotide. As discussed below, nucleotide changes result in amino acid substitutions, additions, deletions, fusions and truncations in the polypeptide encoded by the reference sequence. A typical variant of a polypeptide differs in amino acid sequence from another, reference polypeptide. Generally, differences are limited so that the sequences of the control polypeptide and the variant are closely similar overall and, in many regions, identical. Variant and control polypeptides can have an altered amino acid sequence by one or more substitutions, additions, deletions occurring in any combination. The substituted or inserted amino acid residue may or may not be one encoded by the genetic code. A variant of a polynucleotide or polypeptide may be naturally occurring, for example, an allelic variant, or may be a variant that is not known to occur naturally. Non-naturally occurring variants of polynucleotides and polypeptides can be made by mutagenesis techniques or direct synthesis, and other recombinant methods known to those of skill in the art.
【００１８】 発明の詳細な説明 本発明は、特に、２種またはそれ以上の生物に対する抗微生物化合物のスクリ
ーニングを一度に行うための単純かつ迅速な方法を提供する。該方法はいずれの
微生物を用いて行ってもよいが、抗微生物化合物に関する細菌のスクリーニング
に有用である。かかる化合物を用いて植物および動物における疾病を治療しても
よい。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention specifically provides a simple and rapid method for screening antimicrobial compounds against two or more organisms at one time. The method may be performed using any microorganism, but is useful for screening bacteria for antimicrobial compounds. Such compounds may be used to treat diseases in plants and animals.
【００１９】 本発明は、少なくとも２種の異なる細菌を含む組成物を用意し（それぞれの細
菌はマーカー遺伝子を含み、その生成物は光ペクトルの異なる波長において検出
可能である）；組成物を試験化合物と接触させ；異なる波長のうち少なくとも１
つの強度変化が起こるかどうかを検出し；ついで、試験化合物が強度変化に関連
するものであるかどうかを調べることを含む、静微生物および殺微生物化合物の
スクリーニング方法を提供する。The present invention provides a composition comprising at least two different bacteria, each of which comprises a marker gene, the products of which are detectable at different wavelengths of the light spectrum; Contacting with a compound; at least one of different wavelengths
A method for screening for microbiostatic and microbicidal compounds, comprising detecting whether one intensity change occurs; and then determining whether the test compound is associated with the intensity change.
【００２０】 光が本来的なものであっても、あるいは化合物をエネルギー源にさらすことに
より発生するものであっても、その産物が光を生じるマーカー遺伝子であれば本
発明の方法および組成物に使用することができる。光を発生する多くのよく知ら
れたマーカー遺伝子産物があり、例えば、イー・コリｌｕｘＣＤＡＢＥ、エス・
アウレウスｌｕｘＡＢ、イー・コリｌｕｃおよびエス・アウレウスｌｕｃの遺伝
子産物が含まれる。Whether the light is intrinsic or generated by exposing the compound to an energy source, if the product is a marker gene that produces light, the methods and compositions of the invention may be used. Can be used. There are many well-known marker gene products that generate light, for example, E. coli luxCDABE, S.
Gene products of Aureus luxAB, E. coli luc and S. aureus luc are included.
【００２１】 本発明方法の好ましい具体例において、本発明方法に使用されるマーカー遺伝
子はイー・コリｌｕｘＣＤＡＢＥ、エス・アウレウスｌｕｘＡＢ、イー・コリｌ
ｕｃおよびエス・アウレウスｌｕｃからなる群より選択される。しかしながら、
海洋または土壌細菌由来のｌｕｘ遺伝子、またはホタルもしくはコメツキムシの
ごとき真核生物由来のｌｕｃ遺伝子も本発明方法および組成物において有用であ
る。In a preferred embodiment of the method of the present invention, the marker gene used in the method of the present invention is E. coli luxCDABE, S. aureus luxAB, E. coli
uc and S. aureus luc. However,
Lux genes from marine or soil bacteria or eukaryotes such as fireflies or click beetles are also useful in the methods and compositions of the invention.
【００２２】 本明細書において「光」とは電磁気学的放射を意味し、肉眼で見える光ならび
に目に見えない光が含まれるが、好ましくは、目またはＣＣＤカメラおよび光子
カウンターのごとき光度測定装置、光電子倍増管デバイス、分光光度計または光
子検出器を用いて検出できる光である。本発明の組成物および方法の好ましい具
体例において、光は約３９００ないし７７００オングストロームの波長を有する
。他の好ましい具体例は、光スペクトルの波長が可視光スペクトル中にある方法
を提供し、その光としては肉眼で見える光または光検知装置を用いて可視化され
る光が含まれる。本発明方法における光の検出を、光検出のための知られた方法
またはデバイスのいずれを用いて行ってもよい。例えば、光子カウンター、分光
光度計および旋光計等の、光電子倍増管またはＣＣＤイメージングアレイを装備
したデバイスを用いて光の検出を行ってもよい。光を直接的に、例えば肉眼また
は顕微鏡を用いることにより検出してもよい。検出は定性的または定量的であっ
てよい。定性的検出方法には、例えば、光の色または強度の相違を目で見ること
が含まれる。定量的検出方法には、例えば、光の強度、光波の振幅、波長、周波
数、旋光度、光子数、エネルギー、光束または運動量を計算する方法またはデバ
イスを用いることが含まれる。好ましい方法は、特に、１つの方法において異な
る波長のうち少なくとも１つの強度増加を検出することにより光の強度変化を検
出する方法である。他の好ましい方法は、検出される異なる波長のうち少なくと
も１つの強度減少を検出する方法である。As used herein, “light” refers to electromagnetic radiation and includes light that is visible to the naked eye and light that is not visible, but preferably is a photometric device such as an eye or a CCD camera and a photon counter. , Light that can be detected using a photomultiplier tube device, a spectrophotometer, or a photon detector. In a preferred embodiment of the compositions and methods of the present invention, the light has a wavelength between about 3900 and 7700 angstroms. Other preferred embodiments provide a method wherein the wavelength of the light spectrum is in the visible light spectrum, including light that is visible to the naked eye or light that is visualized using a light sensing device. The detection of light in the method of the invention may be performed using any of the known methods or devices for light detection. For example, light may be detected using a device equipped with a photomultiplier tube or a CCD imaging array, such as a photon counter, spectrophotometer, and polarimeter. Light may be detected directly, for example by using the naked eye or a microscope. Detection may be qualitative or quantitative. Qualitative detection methods include, for example, visually observing differences in light color or intensity. Quantitative detection methods include, for example, using methods or devices that calculate light intensity, light wave amplitude, wavelength, frequency, optical rotation, photon count, energy, luminous flux or momentum. A preferred method is, in particular, a method for detecting a change in light intensity by detecting at least one increase in intensity of different wavelengths in one method. Another preferred method is to detect an intensity decrease of at least one of the different wavelengths detected.
【００２３】 本発明方法を種々の微生物とともに使用して、静微生物または殺微生物化合物
のごとき抗微生物化合物である化合物、をスクリーニングしてもよい。本明細書
において「微生物」とは、顕微鏡で見える生物および／または単細胞真菌類、細
菌類および原生生物を意味する。The method of the present invention may be used with various microorganisms to screen for compounds that are antimicrobial compounds, such as bacteriostatic or microbicidal compounds. As used herein, "microorganism" means a microscopic organism and / or unicellular fungi, bacteria and protists.
【００２４】 本発明方法および組成物の好ましい具体例において、微生物はヒトおよび／ま
たは非ヒト脊椎動物、特に非ヒト哺乳動物に対して病原性を有する。本発明方法
および組成物において有用な微生物細胞の例は、グラム陽性細菌、グラム陰性細
菌、およびStreptococcus、Staphylococcus、Bordetella、Corynebacterium、My
cobacterium、Neisseia、Haemophilus、Actinomyces、Streptomyces、Nocardia 、Enterobacter、Yersinia、Fancisella、Pasturella、Moraxella、Acinetobact
er、Erysipelothrix、Branhamella、Actinobacillus、Streptobacillus、Lister
ia、Calymmatobacterium、Brucella、Bacillus、Closterdium、Treponema、Esch
erichia、Salmonella、Kleibsiella、Vibrio、Proteus、Erwinia、Borrelia、Le
ptospira、Spirillum、Campylobacter、Shigella、Legionella、Pseudomonas、A
eromonas、Rickettsia、Chlamydia、BorreliaおよびMycoplasma属のメンバー、 さらにはグループＡのStreptococcus、グループＢのStreptococcus、グループＣ
のStreptococcus、グループＤのStreptococcus、グループＧのStreptococcus、S
treptococcus pneumoniae、Streptococcus pyrogenes、Streptococcus agalacti
ae、Streptococcus faecalis、Streptococcus faecium、Streptococcus durans 、Neisseria gonorrheae、Neisseria meningitidis、Staphylococcus aureus、S
taphylococcus epidermidis、Corynebacterium diptheriae、Garnella vaginali
s、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium bovis、Mycobacterium ulcera
ns、Mycobacterium leprae、Actinomyces israelli、Listeria monocytogenes、
Bordetella pretusis、Bordetella parapretusis、Bordetella bronchiseptica 、Esherichia coli、Shigella dysenteriae、Haemophilus influenzae、Haemoph
ilus aegyptius、Haemophilus parainfluenzae、Haemophilus ducreyi、Bordete
lla、Salmonella typhi、Citrobacter freundii、Proteus mirabilis、Proteus
vulgaris、Yersinia pestis、Klebsiella pneumoniae、Serratia marcessens、V
ibrio cholera、Shigella dysenterii、Shigella flexneri、Pseudomonas aerug
inosa、Franscisella tularensis、Brucella abortis、Bacillus anthracis、Ba
cillus cereus、Clostridium perfringens、Clostridium tetani、Clostridium
butulinum、Treponema pallidum、Rickettsia rickettsiiおよびChlamydia trac
homitisである種またはグループ（これらに限らない）のメンバーを包含する原 核生物、（ｉｉ）Archaebacter（これに限らない）を包含する古細菌、および（
ｉｉｉ）原生動物、真菌類、Saccharomyces、KluveromycesまたはCandida属（こ
れらに限らない）のメンバー、およびSaccharomyces cerevisiae、Kluveromyces
lactisまたはCandida albicans種のメンバーのごとき細菌を包含するが、これ らに限らない。In a preferred embodiment of the methods and compositions of the present invention, the microorganism is pathogenic for humans and / or non-human vertebrates, especially non-human mammals. Examples of microbial cells useful in the methods and compositions of the present invention include gram positive bacteria, gram negative bacteria, and Streptococcus, Staphylococcus, Bordetella, Corynebacterium, My
cobacterium, Neisseia, Haemophilus, Actinomyces, Streptomyces, Nocardia, Enterobacter, Yersinia, Fancisella, Pasturella, Moraxella, Acinetobact
er, Erysipelothrix, Branhamella, Actinobacillus, Streptobacillus, Lister
ia, Calymmatobacterium, Brucella, Bacillus, Closterdium, Treponema, Esch
erichia, Salmonella, Kleibsiella, Vibrio, Proteus, Erwinia, Borrelia, Le
ptospira, Spirillum, Campylobacter, Shigella, Legionella, Pseudomonas, A
members of the genus eromonas, Rickettsia, Chlamydia, Borrelia and Mycoplasma, as well as Group A Streptococcus, Group B Streptococcus, Group C
Streptococcus, Group D Streptococcus, Group G Streptococcus, S
treptococcus pneumoniae, Streptococcus pyrogenes, Streptococcus agalacti
ae, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecium, Streptococcus durans, Neisseria gonorrheae, Neisseria meningitidis, Staphylococcus aureus, S
taphylococcus epidermidis, Corynebacterium diptheriae, Garnella vaginali
s, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium ulcera
ns, Mycobacterium leprae, Actinomyces israelli, Listeria monocytogenes,
Bordetella pretusis, Bordetella parapretusis, Bordetella bronchiseptica, Esherichia coli, Shigella dysenteriae, Haemophilus influenzae, Haemoph
ilus aegyptius, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus ducreyi, Bordete
lla, Salmonella typhi, Citrobacter freundii, Proteus mirabilis, Proteus
vulgaris, Yersinia pestis, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcessens, V
ibrio cholera, Shigella dysenterii, Shigella flexneri, Pseudomonas aerug
inosa, Franscisella tularensis, Brucella abortis, Bacillus anthracis, Ba
cillus cereus, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium
butulinum, Treponema pallidum, Rickettsia rickettsii and Chlamydia trac
prokaryotes, including, but not limited to, members of a species or group that are homitis;
iii) Protozoa, fungi, members of, but not limited to, the genus Saccharomyces, Kluveromyces or Candida, and Saccharomyces cerevisiae, Kluveromyces
Includes but is not limited to bacteria such as members of the lactis or Candida albicans species.
【００２５】 細菌の１つがグラム陽性生物、例えばストレプトコッカス、スタフィロコッカ
ス、グラム陰性生物、例えばイー・コリ、ケー・ニューモニアエおよびレジオネ
ラ・ニューモフィラからなる群より選択されるものである好ましい方法がさらに
本発明により提供される。A further preferred method wherein one of the bacteria is selected from the group consisting of a Gram-positive organism, such as Streptococcus, Staphylococcus, a Gram-negative organism, such as E. coli, K. pneumoniae and Legionella pneumophila. Provided by the invention.
【００２６】 本発明方法に使用される細菌を、試験化合物に接触させた後、多くの方法で調
製することができる。細菌を溶解または固定してもよい。しかしながら、本発明
方法の好ましい具体例において、栄養培地中で生存可能であり、特に生存可能か
つ増殖する細菌を用いる。After contacting the bacterium used in the method of the present invention with a test compound, it can be prepared in a number of ways. Bacteria may be lysed or fixed. However, in a preferred embodiment of the method according to the invention, bacteria are used which are viable in nutrient media, in particular viable and grow.
【００２７】 マーカー遺伝子により発現されるポリペプチド 本発明のマーカー遺伝子ポリペプチドは本明細書に記載されたものであっても
よく、また光の放射に関する当業者に知られた他のマーカー遺伝子蛋白であって
もよい。当業者は、本明細書記載の方法を用い、かかるマーカー遺伝子およびそ
れらの遺伝子産物を使用することができる。そのうえ、本発明のこれらのマーカ
ーポリペプチドは上記マーカー遺伝子産物のポリペプチド（特に、成熟ポリペプ
チド）ならびにマーカー遺伝子産物の生物学的活性を有するポリペプチドおよび
フラグメントを包含する。Polypeptides Expressed by Marker Genes The marker gene polypeptides of the present invention may be those described herein and may be other marker gene proteins known to those of skill in the art for light emission. There may be. One of skill in the art can use such marker genes and their gene products using the methods described herein. Moreover, these marker polypeptides of the present invention include the polypeptides of the above marker gene products (especially mature polypeptides) as well as polypeptides and fragments having the biological activity of the marker gene product.
【００２８】 フラグメントは、上記ポリペプチドの一部と完全に同一であるが全部とは同一
でないアミノ酸配列を有する変種ポリペプチドである。マーカー遺伝子産物であ
るポリペプチドについては、フラグメントは「独立して存在」したものであって
もよく、あるいは大きなポリペプチド中に含まれていてもよい（フラグメントが
その一部分または領域を形成している）。A fragment is a variant polypeptide having an amino acid sequence that is completely identical, but not entirely, to a portion of the polypeptide. For polypeptides that are marker gene products, the fragments may be "independently present" or may be included in a larger polypeptide (where the fragment forms a part or region thereof). ).
【００２９】 例えば光を発することによりマーカー遺伝子産物の活性を伝達するフラグメン
トである生物学的活性フラグメントも好ましく、類似の活性または改善された活
性を有するもの、あるいは望ましくない活性を減じたものが包まれる。[0029] Biologically active fragments that are fragments that convey the activity of a marker gene product, for example, by emitting light, are also preferred, and include those that have similar or improved activity, or that have reduced undesirable activity. It is.
【００３０】 １またはそれ以上のプロ配列に融合したポリペプチドの成熟形態を有する前駆
体蛋白はポリペプチドの不活性形態であってもよい。プロ配列が除去された場合
、一般的にはかかる不活性前駆体は活性化される。いくつかまたはすべてのプロ
配列は活性化前に除去されうる。一般的には、かかる前駆体はプロ蛋白と呼ばれ
る。[0030] A precursor protein having a mature form of the polypeptide fused to one or more prosequences may be an inactive form of the polypeptide. When the prosequence is removed, such inactive precursors are generally activated. Some or all prosequences may be removed prior to activation. Generally, such precursors are called proproteins.
【００３１】 マーカー遺伝子ポリヌクレオチド 本発明のもう１つの態様は、マーカー遺伝子産物をコードする単離ポリヌクレ
オチドならびに上記単離ポリヌクレオチドに密接に関連していて本発明方法にお
いて有用なポリヌクレオチドおよびそれらの変種に関する。Marker Gene Polynucleotides Another aspect of the present invention is an isolated polynucleotide encoding a marker gene product, as well as polynucleotides closely related to the above isolated polynucleotides and useful in the methods of the invention and their use. About the variant.
【００３２】 本発明は、その全長にわたりマーカー遺伝子のコーディング配列と同一である
マーカーポリヌクレオチド配列を提供する。成熟ポリペプチドまたはフラグメン
ト自体ならびに他のコーディング配列に読み枠を合わせた成熟ポリペプチドまた
はフラグメントのコーディング配列、例えばリーダーまたは分泌配列をコードす
る配列、プレ−またはプロまたはプレプロ配列をコードする配列も本発明により
提供される。ポリヌクレオチドは非コーディング配列を含んでいてもよく、非コ
ーディング配列としては、非コーディング５’および３’配列、例えば転写、非
転写配列、終結シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡを安定化させる配列、
ポリアデニル化シグナルならびに付加的なアミノ酸をコードする付加的コーディ
ング配列があるが、これらに限らない。本発明のポリヌクレオチドは構造遺伝子
を含むポリヌクレオチドならびにそれに本来的に結合していて遺伝子発現を制御
する配列も包含するが、これらに限らない。The present invention provides marker polynucleotide sequences that are identical over their entire length to the coding sequence of the marker gene. The present invention also includes the mature polypeptide or fragment itself as well as the coding sequence of the mature polypeptide or fragment in reading frame with other coding sequences, eg, a sequence encoding a leader or secretory sequence, a sequence encoding a pre- or pro or prepro sequence. Provided by A polynucleotide may include non-coding sequences, including non-coding 5 'and 3' sequences, such as transcribed, non-transcribed sequences, termination signals, ribosome binding sites, mRNA stabilizing sequences,
There are, but are not limited to, polyadenylation signals as well as additional coding sequences that encode additional amino acids. The polynucleotide of the present invention also includes, but is not limited to, a polynucleotide containing a structural gene and a sequence that naturally binds to the gene and controls gene expression.
【００３３】 用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、本発明のマーカーポ
リペプチド、詳細には細菌のポリペプチド、より詳細にはマーカー遺伝子産物の
ポリペプチドをコードする配列を包含する。この用語はコードおよび／非コーデ
ィング配列を含んでもよいさらなる領域と共に、該ポリペプチドをコードする単
一の連続または非連続領域（例えば、組み込まれたファージにより、挿入された
配列により、またはＲＮＡエデティング（editing）により中断されている）を 含むポリヌクレオチドを包含する。The term “polynucleotide encoding a polypeptide” encompasses a sequence encoding a marker polypeptide of the invention, particularly a bacterial polypeptide, more particularly a polypeptide of a marker gene product. The term includes a single contiguous or non-contiguous region encoding the polypeptide (eg, by an integrated phage, by an inserted sequence, or by RNA editing (along with additional regions that may include coding and / or non-coding sequences). (interrupted by editing).
【００３４】 本発明はさらに、マーカーポリペプチドの変種をコードする、本明細書に記載
したマーカー遺伝子ポリヌクレオチドの変種に関する。[0034] The invention further relates to variants of the marker gene polynucleotides described herein that encode variants of the marker polypeptide.
【００３５】 また本発明は、付加的なアミノ末端アミノ酸もしくはカルボキシ末端アミノ酸
を伴った成熟蛋白、あるいは成熟ポリペプチド内部のアミノ酸（例えば成熟形態
が１個よりも多いポリペプチド鎖を有する場合）を伴った成熟蛋白であるポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。かかる配列は前駆体から成熟
蛋白へのプロセッシングにおいて役割を果たす可能性があり、蛋白輸送を可能に
し、蛋白の半減期を延長または短縮し、あるいはとりわけ、アッセイまたは製造
の場合に蛋白の処理を容易にする可能性がある。インビボにおいて一般的に、付
加的アミノ酸は細胞酵素により成熟アミノ酸からプロセッシングにより除かれう
る。The invention also involves mature proteins with additional amino-terminal or carboxy-terminal amino acids, or amino acids within the mature polypeptide (eg, where the mature form has more than one polypeptide chain). Also provided is a polynucleotide encoding a polypeptide that is a mature protein. Such sequences may play a role in the processing of the precursor to the mature protein, allowing for protein transport, extending or shortening the half-life of the protein, or, inter alia, facilitating the processing of the protein in the case of assays or production. Could be Generally, in vivo, additional amino acids can be processed away from mature amino acids by cellular enzymes.
【００３６】 さらに特に好ましい具体例は、マーカー遺伝子産物の変種のアミノ酸配列を有
するマーカー遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドであり、該マーカー遺伝
子産物変種はその配列中にいくつかの、少しの、５ないし１０、１ないし５、１
ないし３、２、１または０個のアミノ酸残基を置換、欠失または付加を任意の組
み合わせで施したアミノ酸配列を有する。中でもとりわけ好ましいものは、マー
カー遺伝子産物の特性および活性、詳細には発光特性を変化させないサイレント
置換、付加および欠失である。A further particularly preferred embodiment is a polynucleotide encoding a marker gene product having an amino acid sequence of a variant of the marker gene product, wherein said variant of the marker gene product has several, a few, 5 to 5 amino acids in its sequence. 10, 1 to 5, 1
It has an amino acid sequence obtained by substituting, deleting, or adding 3, 2, 1 or 0 amino acid residues in any combination. Especially preferred among these are silent substitutions, additions and deletions, which do not alter the properties and activities of the marker gene product, particularly the luminescent properties.
【００３７】 好ましい具体例は、マーカー遺伝子のＤＮＡによりコードされる成熟ポリペプ
チドと同じ生物学的機能または活性、例えば発光機能または活性を実質的に保有
するポリペプチドコードするポリヌクレオチドである。A preferred embodiment is a polynucleotide encoding a polypeptide that substantially possesses the same biological function or activity as the mature polypeptide encoded by the DNA of the marker gene, eg, a luminescent function or activity.
【００３８】 要するに、本発明のポリヌクレオチドは成熟蛋白、リーダー配列を加えた成熟
蛋白（プレ蛋白と称することができる）、プレ蛋白のリーダー配列ではない１ま
たはそれ以上のプロ配列を有する成熟蛋白の前駆体、またはリーダー配列および
１またはそれ以上のプロ配列を有するプロ蛋白の前駆体であるプレプロ蛋白をコ
ードしていてもよく、通常、プロ配列はポリペプチドの活性および成熟形態を生
成するプロセッシング段階で除去される。In short, the polynucleotide of the present invention may be a mature protein, a mature protein to which a leader sequence is added (also referred to as a preprotein), or a mature protein having one or more prosequences which are not the leader sequence of the preprotein. It may encode a precursor, or a preproprotein which is a precursor of a proprotein having a leader sequence and one or more prosequences, and usually the prosequence is a processing step that produces an active and mature form of the polypeptide. Is removed by
【００３９】 マーカー遺伝子を含むベクターおよび宿主細胞、ならびにマーカー遺伝子発現 本発明はまた、本発明のマーカーポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレ
オチドを含むベクター、本発明のかかるベクターで遺伝子操作された宿主細胞お
よび組換え技法による本発明のポリペプチドの製造にも関する。本発明ＤＮＡ構
築物に由来するＲＮＡを用い、無細胞翻訳系を用いてこのような蛋白を製造する
こともできる。 組換え体を製造するために、宿主細胞を遺伝子操作して、マーカー遺伝子発現
系もしくはそれらの一部または本発明のマーカーポリヌクレオチドを組み込むこ
とができる。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、例えば、Davis et al.,
Basic Methods in Molecular Biology（1986）；Sambrook et al., Molecular C
loning；A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)のように、多くの標準的な実験マニュアル
に記載される方法により行うことができ、例えばリン酸カルシウムトランスフェ
クション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクシ
ョン、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エ
レクトロポレーション、トランスダクション、スクレープ負荷、バリスティック
導入および感染等がある。Vectors and Host Cells Containing Marker Genes, and Marker Gene Expression The present invention also relates to vectors comprising the marker polynucleotides of the present invention or the polynucleotides of the present invention, host cells genetically engineered with such vectors of the present invention and It also relates to the production of the polypeptide of the invention by recombinant techniques. Such a protein can also be produced using a cell-free translation system using RNA derived from the DNA construct of the present invention. To produce recombinants, the host cells can be genetically engineered to incorporate a marker gene expression system or a portion thereof or a marker polynucleotide of the invention. Introduction of a polynucleotide into a host cell is described, for example, in Davis et al.,
Basic Methods in Molecular Biology (1986); Sambrook et al., Molecular C
loning; A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, Cold Spring Harbor, NY (1989), and can be performed by methods described in many standard laboratory manuals, such as calcium phosphate transfection, DEAE-dextran mediated transfection, transvection, microinjection, Cationic lipid-mediated transfection, electroporation, transduction, scrape loading, ballistic transfer and infection, and the like.
【００４０】 適当な宿主の代表的なものには、細菌細胞、例えばストレプトコッカス属 （Streptococci）、スタフィロコッカス属（Staphylococci）、エンテロコッカ ス属（Enterococci）、イー・コリ（E.coli）、ストレプトミセス（Streptomyce
s）およびバチルス・ズブチリス（Bacillus subtiis）細胞；真菌細胞、例えば 酵母細胞およびアスペルギルス属（Aspergillus）細胞；昆虫細胞、例えばドロ ソフィラＳ２（Drosophila S2）およびスポドプテラＳｆ９（Spodoptera Sf9） 細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ
、２９３およびボウズ（Bows）黒色腫細胞；ならびに植物細胞等がある。Representative of suitable hosts include bacterial cells, such as Streptococci, Staphylococci, Enterococci, E. coli, Streptococcus. Mrs. (Streptomyce
s) and Bacillus subtiis cells; fungal cells, eg, yeast cells and Aspergillus cells; insect cells, eg, Drosophila S2 and Spodoptera Sf9 cells; animal cells, eg, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK
, 293 and Bows melanoma cells; and plant cells.
【００４１】 本発明のマーカーポリペプチドを製造するために非常に多くの発現系を使用で
きる。このようなベクターには、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベク
ター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由
来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例
えばバキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス
、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等
のウイルス由来のベクター、ならびにそれらを組み合わせたものに由来するベク
ター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来の
ベクター、例えばコスミドおよびファージミド等がある。発現系の構築物は発現
を制御および引き起こす調節領域を含有していてもよい。この点に関して、一般
的には、宿主中にポリヌクレオチドを保持、伸長または発現するのに、および／
またはポリペプチドを発現するのに適した任意の系またはベクターを発現に使用
できる。周知のおよび通常的な種々の任意の技術により、適当なＤＮＡ配列を発
現系に挿入してもよく、例えばSambrookら、Molecular Cloning，A Laboratory
Manual（上記）に記載されている。Numerous expression systems can be used to produce the marker polypeptides of the present invention. Such vectors include chromosomal, episomal and viral derived vectors, such as bacterial plasmid derived, bacteriophage derived, transposon derived, yeast episomal derived, insertion element derived, yeast chromosomal element derived such as baculovirus, papovavirus such as SV40, Vectors derived from viruses such as vaccinia virus, adenovirus, fowlpox virus, pseudorabies virus and retrovirus, and vectors derived from combinations thereof, such as vectors derived from genetic elements of plasmids and bacteriophages, such as cosmids And phagemids. The expression system constructs may contain regulatory regions that control and cause expression. In this regard, generally, to retain, extend or express a polynucleotide in a host, and / or
Alternatively, any system or vector suitable for expressing the polypeptide can be used for expression. Appropriate DNA sequences may be inserted into the expression system by any of a variety of well-known and conventional techniques, for example, see Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory.
Manual (above).
【００４２】 翻訳されたマーカー蛋白を、小胞体内腔、ペリプラスミックスペースまたは細
胞外環境へ分泌させるために、発現されるポリペプチド中に適当な分泌シグナル
を含ませることができる。これらのシグナルはポリペプチドに本来的なものであ
ってもく、あるいは異種性のシグナルでもよい。In order to secrete the translated marker protein into the lumen of the endoplasmic reticulum, into the periplasmic space or into the extracellular environment, an appropriate secretion signal can be included in the expressed polypeptide. These signals may be native to the polypeptide or they may be heterologous signals.
【００４３】 本発明のポリペプチドは周知の方法により、組換え細胞培養物から回収および
精製でき、その方法には、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽
出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマ
トグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー
、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィ
ー等がある。高速液体クロマトグラフィーを精製に用いるのが最も好ましい。ポ
リペプチドが単離および／または精製中に変性した場合、再び活性なコンホーメ
ーションにするために、蛋白再生のための周知の技法を用いることができる。本
発明の光検出工程の代わりに、あるいはこれに加えて単離または精製を用いて、
マーカー遺伝子発現および／またはマーカー蛋白のレベルおよび／または活性を
検出および／または測定してもよい。The polypeptides of the invention can be recovered and purified from recombinant cell culture by well known methods, including, for example, ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose Chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxylapatite chromatography and lectin chromatography. Most preferably, high performance liquid chromatography is used for purification. If the polypeptide is denatured during isolation and / or purification, well-known techniques for protein regeneration can be used to regain an active conformation. Using isolation or purification instead of or in addition to the light detection step of the present invention,
Marker gene expression and / or marker protein level and / or activity may be detected and / or measured.
【００４４】 抗体 本発明のマーカーポリペプチドもしくはそれらの変種、またはそれらを発現す
る細胞を免疫源として用いて、かかるポリペプチドに免疫特異的な抗体を得るこ
とができる。本明細書の用語「抗体」には、モノクローナルおよびポリクローナ
ル抗体、キメラ、一本鎖、サル化抗体およびヒト化抗体、ならびにＦａｂフラグ
メントが包含され、さらに免疫グロブリン発現ライブラリーの産物等のＦａｂフ
ラグメントも包含される。Antibodies Antibodies immunospecific for such polypeptides can be obtained using the marker polypeptides of the present invention or variants thereof, or cells expressing them, as an immunogen. As used herein, the term "antibody" includes monoclonal and polyclonal antibodies, chimeric, single chain, monkey and humanized antibodies, and Fab fragments, as well as Fab fragments, such as the products of an immunoglobulin expression library. Included.
【００４５】 本発明のマーカーポリペプチドに対して生じる抗体は、ポリペプチドまたはエ
ピトープが付いたフラグメント、アナログまたは細胞を、好ましくは非ヒト動物
に通常の実験法を用いて投与することにより得ることができる。連続的細胞系培
養により産生される抗体を提供する当業者周知の技術を用いて、モノクローナル
抗体を調製することができる。例としては、Kohler， G.およびMilstein, C.，N
ature， 256:495-497 （1975）； Kozborら、Immunology Today， 4:72 （1983 ）；Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc. 、77-96頁（1985）に記載されるような種々の技法がある。[0045] Antibodies raised against the marker polypeptides of the present invention can be obtained by administering the polypeptides or epitope-tagged fragments, analogs or cells, preferably to non-human animals, using conventional laboratory techniques. it can. Monoclonal antibodies can be prepared using techniques well known to those skilled in the art that provide antibodies produced by continuous cell line cultures. Examples include Kohler, G. and Milstein, C., N
Nature, 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today, 4:72 (1983); Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss, Inc., pp. 77-96 (1985). There are various techniques.
【００４６】 一本鎖抗体の産生のために記載された技術（米国特許第４９４６７７８号）を
適用して、本発明ポリペプチドに対する一本鎖抗体を得ることができる。また、
トランスジェニックマウスまたはその他の生物、例えばその他の哺乳動物を用い
てヒト化抗体等の抗体を発現させてもよい。The techniques described for the production of single-chain antibodies (US Pat. No. 4,946,778) can be applied to obtain single-chain antibodies to the polypeptides of the invention. Also,
Transgenic mice or other organisms, such as other mammals, may be used to express antibodies such as humanized antibodies.
【００４７】 別法として、ファージディスプレイ技法を用いて、抗−マーカー遺伝子産物を
有することにつきスクリーニングされたヒト・リンパ球のＰＣＲ増幅されたｖ遺
伝子のレパートリーから、抗−マーカー遺伝子産物を有することについてスクリ
ーニングされたヒトから、あるいは無処理のライブラリーから、ポリペプチドに
対する結合活性を有する抗体遺伝子を選別することもできる（McCafferty, J.ら
、Nature 348:552-554 （1990）； Marks, J.ら、Biotechnology 10:779-783 （
1992））。これらの抗体の親和性はチェインシャフリング（chain shuffling） により改善することもできる（Clackson, T.ら、Nature 352:624-628 （1991） ）。Alternatively, using the phage display technique to have an anti-marker gene product from a repertoire of PCR amplified v genes of human lymphocytes screened for having an anti-marker gene product Antibody genes having binding activity to polypeptides can also be selected from screened humans or from untreated libraries (McCafferty, J. et al., Nature 348: 552-554 (1990); Marks, J. et al. Et al., Biotechnology 10: 779-783 (
1992)). The affinity of these antibodies can also be improved by chain shuffling (Clackson, T. et al., Nature 352: 624-628 (1991)).
【００４８】 二つの抗原結合ドメインが存在する場合、各ドメインは「二特異性」抗体と称
する異なるエピトープに対して指向される。上記抗体を用いて、例えば、マーカ
ー蛋白を単離し、あるいはマーカー蛋白レベルを確認してもよい。When two antigen binding domains are present, each domain is directed against a different epitope, termed a “bispecific” antibody. Using the above antibody, for example, a marker protein may be isolated or the level of the marker protein may be confirmed.
【００４９】 抗微生物試験化合物 本明細書に示される方法を、抗細菌化合物の発見および開発に使用してもよい
。本発明は、殺微生物性および／または静微生物性で、マーカー蛋白のレベルお
よび／または活性の低下に関連している化合物をスクリーニングする方法も提供
する。該スクリーニング方法は、例えば当業者によく知られた多ウェルフォーマ
ットまたは多サンプル検出フォーマットを包含する高処理量的手法を使用するも
のであってもよい。Antimicrobial Test Compounds The methods provided herein may be used for the discovery and development of antibacterial compounds. The invention also provides a method of screening for compounds that are microbicidal and / or bacteriostatic and that are associated with reduced levels and / or activity of a marker protein. The screening methods may use high-throughput techniques, including, for example, multi-well or multi-sample detection formats well known to those skilled in the art.
【００５０】 例えば、殺微生物および／または静微生物化合物をスクリーニングするために
、マーカー遺伝子または遺伝子産物を含有する合成反応混合物、膜、細胞エンベ
ロープもしくは細胞壁のごとき細胞コンパートメント、またはそれらの調合物を
試験化合物不存在下または存在下においてインキュベーションする。For example, to screen for microbicidal and / or bacteriostatic compounds, a synthetic reaction mixture containing a marker gene or gene product, a cell compartment such as a membrane, a cell envelope or cell wall, or a formulation thereof is tested with a test compound. Incubate in the absence or presence.
【００５１】 試験化合物は化合物またはエレメントであってよい。例えば、試験化合物は小
型有機分子、ペプチド、ペプチド模倣物、ポリペプチドおよび抗体を包含する。
他の試験化合物はアンチセンス分子を包含する（これらの分子についての説明に
関してはOkano,J.，Neurochem.56:560（1991）；Oligodeoxy-nucleotides as An
tisense Inhibitors of Gene Expression， CRC Press, Boca Raton, FL (1988)
参照）。The test compound can be a compound or an element. For example, test compounds include small organic molecules, peptides, peptidomimetics, polypeptides and antibodies.
Other test compounds include antisense molecules (for a description of these molecules, see Okano, J., Neurochem. 56: 560 (1991); Oligodeoxy-nucleotides as An
tisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)
reference).
【００５２】 組成物、キットおよび投与 本発明は、上記の本発明スクリーニングに使用する微生物を含む組成物にも関
する。本発明の微生物を未滅菌担体もしくは滅菌担体または試験化合物とともに
使用される担体と組み合わせて使用してもよい。かかる組成物は、例えば、培地
添加物、担体のバッファーを含んでいてもよい。かかる担体としてはセイライン
、緩衝化セイライン、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの
組み合わせがあるが、これらに限らない。処方は使用スクリーニングに適合させ
るべきである。Compositions, Kits and Administration The present invention also relates to compositions comprising the microorganism used for the above-mentioned screening of the present invention. The microorganisms of the present invention may be used in combination with a non-sterile or sterile carrier or carrier used with test compounds. Such a composition may include, for example, a culture medium additive and a carrier buffer. Such carriers include, but are not limited to, saline, buffered saline, glucose, water, glycerol, ethanol and combinations thereof. The formulation should be adapted for use screening.
【００５３】 さらに本発明は、マーカー遺伝子または微生物のごとき本発明の上記成分の１
つまたはそれ以上を入れた１個またはそれ以上の容器を含む、化合物のスクリー
ニングに有用なパックおよびキットに関する。そのうえ、グラム陽性生物ストレ
プトコッカス、スタフィロコッカス、グラム陰性生物イー・コリ、ケー・ニュー
モニアエおよびレジオネラ・ニューモフィラからなる群より選択される少なくと
も２種の細菌単離培養物を含むキットが本発明により提供される。少なくとも２
種の細菌がｌｕｘＣＤＡＢＥ、ｌｕｘＡＢおよびｌｕｃからなる群より選択され
る、特に、イー・コリｌｕｘＣＤＡＢＥ、エス・アウレウスｌｕｘＡＢ、イー・
コリｌｕｃおよびエス・アウレウスｌｕｃからなる群より選択される少なくとも
１種のマーカー遺伝子を含むものである、少なくとも２種の細菌培養物を含むキ
ットも提供される。Further, the present invention relates to one of the above-mentioned components of the present invention, such as a marker gene or a microorganism.
Packs and kits useful for screening compounds, comprising one or more containers containing one or more containers. In addition, the present invention provides a kit comprising at least two bacterial isolated cultures selected from the group consisting of the gram-positive organisms Streptococcus, Staphylococcus, the gram-negative organisms E. coli, K. pneumoniae and Legionella pneumophila. Is done. At least 2
The species of bacteria is selected from the group consisting of luxCDABE, luxAB and luc, in particular, E. coli luxCDABE, S. aureus luxAB, e.
Also provided is a kit comprising at least two bacterial cultures comprising at least one marker gene selected from the group consisting of E. coli luc and S. aureus luc.
【００５４】 本明細書において引用された各文献を参照により本明細書に全体が記載されて
いるものとみなす。そのうえ、本願が優先権を主張している各特許出願も参照に
より本明細書に全体が記載されているものとみなす。Each document cited herein is considered to be fully incorporated herein by reference. Moreover, each patent application for which this application claims priority is deemed to be fully incorporated herein by reference.
【００５５】 実施例 下記実施例は、特記しない限り当業者によく知られ、常套的である標準的方法
を用いて実施される。実施例は説明的なものであって、本発明を限定するもので
はない。EXAMPLES The following examples are performed using standard methods which are well known and routine to those skilled in the art unless otherwise specified. The examples are illustrative and do not limit the invention.
【００５６】 実施例１：細菌株 イー・コリＪＭ１０９［ｐＳＢ３１１］は、フォトラブドス・ルミネセンス（
Photorhabdus luminescens）由来のｌｕｘ遺伝子カセット（ｌｕｘＣＤＡＢＥ）
全体を含むプラスミドを有している。この生物において、生物発光の開始はアル
デヒド基質の添加とは独立である。 エス・アウレウスＲＮ４２２０［ｐＫＦ１］はｌｕｘＡＢ遺伝子のみを含み、
その結果、生物発光はアルデヒド基質の添加に依存する。クロラムフェニコール
耐性をプラスミド維持の選択マーカーとして使用する。Example 1 Bacterial strain E. coli JM109 [pSB311] was obtained from Photolabdos luminescence (
Lux gene cassette (luxCDABE) from Photorhabdus luminescens
It has a plasmid containing the whole. In this organism, the initiation of bioluminescence is independent of the addition of the aldehyde substrate. S. aureus RN4220 [pKF1] contains only the luxAB gene,
As a result, bioluminescence depends on the addition of the aldehyde substrate. Chloramphenicol resistance is used as a selectable marker for plasmid maintenance.
【００５７】 実施例２：アッセイ法 脳心臓浸潤物（ＢＨＩ）ブロス中でイー・コリＪＭ１０９を３７℃で一晩増殖
させて約１ｘ１０9ＣＦＵとした。 １０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール含有する脳心臓浸潤物（ＢＨＩ）ブロ
ス中でエス・アウレウスＲＮ４２２０［ｐＫＦ１］を３７℃で一晩増殖させて約
１ｘ１０9ＣＦＵとした。 イー・コリの一晩培養物を希釈して１ｘ１０6ＣＦＵ／ｍｌとし、エス・アウ レウスの一晩培養物を希釈して１ｘ１０7ＣＦＵ／ｍｌとし、２５μｌの各生物 を各ウェルに添加した。 試験化合物をＢＨＩで系列希釈し、５０μｌを９６マイクロタイターウェルプ
レートの各ウェルに添加した。 プレートを３７℃で５時間インキュベーションし、ルミノメーター（Wallac L
B96B）を用いて化合物で処理された微生物からの生物発光を未処理細胞と比較し
て、イー・コリについての生物発光アウトプット（基質無添加）を得た。 エス・アウレウスの生物発光に対する抗生物質の影響をモニターするために、
０．０１％（ｖ／ｖ）のオクタナール基質５０μｌを各ウェルに添加し、各ウェ
ルに基質を添加した後すぐに生物発光を測定した（イー・コリおよびエス・アウ
レウスの両方に関する全ＲＬＵ）。エス・アウレウスに関するＲＬＵを得るため
に、基質添加後すぐに得られた読みから最初のＲＬＵの読みを差し引いた。Example 2 Assay E. coli JM109 was grown in brain heart infiltrate (BHI) broth at 37 ° C. overnight to approximately 1 × 10 9 CFU. S. aureus RN4220 [pKF1] was grown overnight at 37 ° C. in brain heart infiltrate (BHI) broth containing 10 μg / ml chloramphenicol to about 1 × 10 9 CFU. The overnight culture of E. coli was diluted to 1 × 10 6 CFU / ml, and the overnight culture of S. aureus was diluted to 1 × 10 7 CFU / ml, and 25 μl of each organism was added to each well. Test compounds were serially diluted in BHI and 50 μl was added to each well of a 96 microtiter well plate. Plates were incubated at 37 ° C for 5 hours and luminometer (Wallac L
Bioluminescence from microorganisms treated with compounds using B96B) was compared to untreated cells to obtain a bioluminescence output for E. coli (without substrate). To monitor the effect of antibiotics on S. aureus bioluminescence,
50 μl of 0.01% (v / v) octanal substrate was added to each well and bioluminescence was measured immediately after adding the substrate to each well (total RLU for both E. coli and S. aureus). To obtain the RLU for S. aureus, the initial RLU reading was subtracted from the reading obtained immediately after the substrate addition.
【００５８】 実施例２のアッセイ法の結果 イー・コリに対してアモキシシリンはムピロシン（生物発光抑制には６４μｌ
／ｍｌ以上の濃度が必要、図１）よりも大きな影響を及ぼした。これらの結果は
、イー・コリのみでの生物発光アッセイで得られた結果と一致した。予想された
ように、両化合物はエス・アウレウスに対して大きな影響を示し（図３）、エス
・アウレウスの単一培養を用いて行った生物発光アッセイの結果を反映した。 これらの結果は、二重培養生物発光アッセイが抗微生物活性に関する化合物の
評価に有用であり、都合よく実行されることを示す。このアッセイに使用した生
物発光イー・コリ株は基質不存在下において発光するので、最初の生物発光の読
みを用いて抗微生物化合物の効果をモニターすることができる。この実施例２に
おいて、エス・アウレウスにおける生物発光は該来世オクタナール基質の添加に
依存的であり、それゆえ、基質添加後に得られた光の全アウトプットを用いて、
両微生物に対する抗微生物化合物の影響を評価することができる。同時培養にお
いて増殖したエス・アウレウスに対する抗微生物薬の影響を調べるためには、最
初の光アウトプットシグナルを、基質添加後に得られた光アウトプットシグナル
から差し引けばよいAmoxicillin against E. coli was compared with mupirocin (64 μl for bioluminescence suppression).
/ Ml or more was required, which had a greater effect than in FIG. 1). These results were consistent with those obtained in a bioluminescence assay with E. coli alone. As expected, both compounds had a significant effect on S. aureus (FIG. 3), reflecting the results of a bioluminescence assay performed using a single culture of S. aureus. These results indicate that the dual culture bioluminescence assay is useful for evaluating compounds for antimicrobial activity and is conveniently performed. Since the bioluminescent E. coli strain used in this assay luminesces in the absence of substrate, an initial bioluminescence reading can be used to monitor the effect of the antimicrobial compound. In this Example 2, the bioluminescence in S. aureus is dependent on the addition of the afterlife octanal substrate, and therefore, using the total output of light obtained after substrate addition,
The effect of antimicrobial compounds on both microorganisms can be evaluated. To examine the effect of antimicrobial agents on S. aureus grown in co-culture, the initial light output signal can be subtracted from the light output signal obtained after addition of substrate
【図１】 図１は、３７℃で５時間後のイー・コリ／エス・アウレウス同時培養物の生物
発光に対するアモキシシリンおよびムピロシンの影響を示す。オクタナール基質
添加前に生物発光を測定した（この実験はイー・コリに対する抗生物質の影響を
示す）。FIG. 1 shows the effect of amoxicillin and mupirocin on the bioluminescence of an E. coli / S. Aureus co-culture after 5 hours at 37 ° C. Bioluminescence was measured before addition of the octanal substrate (this experiment shows the effect of the antibiotic on E. coli).
【図２】 図２は、３７℃で５時間後のイー・コリ／エス・アウレウス同時培養物の生物
発光に対するアモキシシリンおよびムピロシンの影響を示す。オクタナール基質
添加後に生物発光を測定した（この実験はイー・コリおよびエス・アウレウスの
両方に対する抗生物質の影響を示す）。FIG. 2 shows the effect of amoxicillin and mupirocin on the bioluminescence of an E. coli / S. Aureus co-culture after 5 hours at 37 ° C. Bioluminescence was measured after addition of the octanal substrate (this experiment shows the effect of the antibiotic on both E. coli and S. aureus).
【図３】 図３は、３７℃で５時間後のイー・コリ／エス・アウレウス同時培養物の生物
発光に対するアモキシシリンおよびムピロシンの影響を示す。オクタナール基質
添加後の読みから基質添加前の最初の読みを差し引いた後、ＲＬＵをプロットし
た（この実験はエス・アウレウスに対する抗生物質の影響を示す）。FIG. 3 shows the effect of amoxicillin and mupirocin on the bioluminescence of an E. coli / S. Aureus co-culture after 5 hours at 37 ° C. The RLU was plotted after subtracting the first reading before substrate addition from the reading after addition of octanal substrate (this experiment shows the effect of the antibiotic on S. aureus).
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 イアン・エイ・クリッチリー アメリカ合衆国19341ペンシルベニア州エ クストン、リンデンウッド・ドライブ269 番 Ｆターム(参考） 2G045 BB20 BB41 BB50 CB21 FA11 2G054 EA02 4B024 AA01 AA11 CA01 CA11 DA05 EA04 GA11 GA30 HA11 4B063 QA18 QQ98 QR32 QR35 QR75 QR80 QS38 QX02 4B065 AA01X AA26X AA29X AA49X AB01 BA02 CA44 CA46 ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI Theme coat ゛ (Reference) G01N 21/78 G01N 33/50 Z 33/50 C12N 15/00 A (72) Inventor Ian A. Crichley 19341 Lindenwood Drive, Exton, PA 19341 F-term (reference) AB01 BA02 CA44 CA46
Claims (14)
マーカー遺伝子を含み、その生成物は光スペクトルの異なる波長において検出可
能である）； （ｂ）工程（ａ）の組成物を試験化合物と接触させ； （ｃ）異なる波長のうち少なくとも１つの強度変化が起こるかどうかを検出し
；ついで （ｄ）試験化合物が強度変化に関連するものであるかどうかを調べる を含む、静細菌および殺細菌化合物のスクリーニング方法。1. A method comprising the steps of: (a) providing a composition comprising at least two different bacteria, each bacteria comprising a marker gene, the products of which are detectable at different wavelengths of the light spectrum; (B) contacting the composition of step (a) with a test compound; (c) detecting whether at least one change in intensity at different wavelengths occurs; and (d) relating the test compound to the change in intensity. A method for screening bacteriostatic and bactericidal compounds, comprising:
ococcus）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、グラム陰性生物イー・コ リ（E. coli）、ケー・ニューモニアエ（K. pneumoniae）およびレジオネラ・ニ
ューモフィラ（Legionella pneumophila）からなる群より選択される請求項１の
方法。3. The method of claim 1, wherein one of the bacteria is a gram-positive organism, Streptococcus.
ococcus), Staphylococcus, the gram-negative organism E. coli, K. pneumoniae, and Legionella pneumophila. the method of.
ス・アウレウス（S. aureus）ｌｕｘＡＢ、イー・コリｌｕｃおよびエス・アウ レウスｌｕｃからなる群より選択される請求項１の方法。4. The method of claim 1, wherein one of said marker genes is selected from the group consisting of E. coli luxCDABE, S. aureus luxAB, E. coli luc and S. aureus luc.
ス・アウレウスｌｕｘＡＢ、イー・コリｌｕｃおよびエス・アウレウスｌｕｃか
らなる群より選択される請求項２の方法。5. The method of claim 2, wherein one of said marker genes is selected from the group consisting of E. coli luxCDABE, S. aureus luxAB, E. coli luc and S. aureus luc.
加である請求項１の方法。6. The method of claim 1, wherein said intensity change is an increase in intensity of at least one of said different wavelengths.
少である請求項１の方法。7. The method of claim 1, wherein said change in intensity is a decrease in intensity of at least one of said different wavelengths.
光スペクトルの異なる波長において検出可能な化合物を含む）； （ｂ）工程（ａ）の組成物を試験化合物と接触させ； （ｃ）異なる波長のうち少なくとも１つの強度変化が起こるかどうかを検出し
；ついで （ｄ）試験化合物が強度変化に関連するものであるかどうかを調べる を含む、静細菌および殺細菌化合物のスクリーニング方法。9. The following steps: (a) providing a composition comprising at least two different bacteria, each of the bacteria comprising a compound detectable at a different wavelength of the light spectrum; (b) step (a) Contacting the composition with a test compound; (c) detecting whether at least one of the different wavelengths undergoes an intensity change; and (d) determining whether the test compound is associated with the intensity change. And a method for screening bacteriostatic and bactericidal compounds.
光スペクトルの１つの波長において検出可能な化合物を含む）； （ｂ）工程（ａ）の組成物を試験化合物と接触させ； （ｃ）該波長のうち少なくとも１つの強度変化が起こるかどうかを検出し；つ
いで （ｄ）試験化合物が強度変化に関連するものであるかどうかを調べる を含む、静細菌および殺細菌化合物のスクリーニング方法。10. The following steps: (a) providing a composition comprising at least two different bacteria, each bacteria comprising a compound detectable at one wavelength of the light spectrum; Contacting the composition of (a) with a test compound; (c) detecting whether at least one of the wavelengths undergoes an intensity change; and (d) determining whether the test compound is associated with the intensity change. A method for screening bacteriostatic and bactericidal compounds, comprising:
、少なくとも２種の細菌がグラム陽性生物ストレプトコッカス、スタフィロコッ
カス、グラム陰性生物イー・コリ、ケー・ニューモニアエおよびレジオネラ・ニ
ューモフィラからなる群より選択されるものである組成物。11. A composition comprising an isolated culture of at least two bacteria, wherein the at least two bacteria are Gram-positive organisms Streptococcus, Staphylococcus, Gram-negative organisms E. coli, K. pneumoniae and Legionella. A composition selected from the group consisting of Pneumophylla;
、少なくとも２種の細菌がｌｕｘ、ｌｕｘＣＤＡＢＥ、ｌｕｘＡＢおよびｌｕｃ
からなる群より選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子を含むものである組
成物。12. A composition comprising an isolated culture of at least two bacteria, wherein the at least two bacteria are lux, luxCDABE, luxAB and luc.
A composition comprising at least one marker gene selected from the group consisting of:
、少なくとも２種の細菌がグラム陽性生物ストレプトコッカス、スタフィロコッ
カス、グラム陰性生物イー・コリ、ケー・ニューモニアエおよびレジオネラ・ニ
ューモフィラからなる群より選択されるものであるキット。13. A kit comprising an isolated culture of at least two bacteria, wherein at least two of the bacteria are gram-positive organisms Streptococcus, staphylococcus, gram-negative organisms E. coli, K. pneumoniae and Legionella. A kit selected from the group consisting of Pneumophylla.
、少なくとも２種の細菌がｌｕｘ、ｌｕｘＣＤＡＢＥ、ｌｕｘＡＢおよびｌｕｃ
からなる群より選択される少なくとも１つのマーカー遺伝子を含むものであるキ
ット。14. A kit comprising an isolated culture of at least two bacteria, wherein the at least two bacteria are lux, luxCDABE, luxAB and luc.
A kit comprising at least one marker gene selected from the group consisting of:
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