JP2001516341A

JP2001516341A - 造血細胞の増強

Info

Publication number: JP2001516341A
Application number: JP53457898A
Authority: JP
Inventors: リチャーズ，スーザン・エム; マーフィー，ウィリアム・ジェイ; ロンゴ，ダン・エル
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1997-01-21
Filing date: 1998-01-20
Publication date: 2001-09-25
Also published as: WO1998031385A1; AU6028298A; EP1049485A1; CA2277482A1

Abstract

(57)【要約】本発明は造血幹細胞又は前駆細胞をプロラクチンを含む組成物と接触させることにより造血を増強する方法に関する。好ましくは使用されるプロラクチンは組換えプロラクチンである。造血の刺激は、造血細胞が治療薬又は処置のために除去されるとき、それを置換するのに役立ち得る。この増強はまた、枯渇した又は機能が弱まった細胞集団に対して新たな又は追加的な細胞系統を補充するためにも機能し得る。さらに本発明は、プロラクチンを含む薬剤的に許容される組成物を投与することによって、造血を増強する又は造血抑制を予防するために動物を処置する方法に関する。さらに本発明は、造血を増強し得るサイトカイン及びプロラクチンを含む組成物に関する。さらに本発明は、造血抑制を起こし得る治療薬及びプロラクチンを含む組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】造血細胞の増強関連出願への相互参照本出願は、１９９７年１月２１日に提出された米国仮出願第６０／０３５，８７５号に関連し、その優先権を伴う。従来の技術胎児期の間、全血液細胞の産生は、始めは血島で、次いで肝臓及び脾臓で起こる。この機能は次第に骨髄に、そしてますます扁平骨に取って代わられる。それで、思春期までには、このプロセスは主として胸骨、脊椎、腸骨及び肋骨で起こるようになる。これらの骨に見出される赤色骨髄は、長柱の間に存在するスポンジに似た網様状の外郭構造より構成される。この外郭構造中の空間は脂肪細胞に満たされていて、脂肪細胞は成熟すると濃密な脈管洞の網から出て循環系の一部になる。すべての血液細胞は共通の幹細胞を起源とし、これが特殊な系統（即ち、赤血球系、巨核球系、顆粒球系、単球系及びリンパ球系）だけに専ら分化するようになる。骨髄中の前駆細胞の増殖及び分化はある種のサイトカインによって刺激される。これらサイトカインの多くが「コロニー刺激因子」とも呼ばれるのは、骨髄細胞由来の種々の白血球コロニーの成長及び発達を刺激するその能力によってアッセイされるからである。様々なサイトカインが様々な系統の骨髄前駆細胞の増殖及び成熟化を促進することが知られているが、自己再生的な多能性幹細胞の本質やそれが特定の系統だけに分化することを調節するメカニズムについてはほとんどわかっていない。上記のサイトカインはますます研究されていて、その造血調節的な性質に関連した潜在的な臨床応用に使用される場合もある。それらの潜在能力のために、同様な性質を有する物質の発見にも臨床応用の可能性があるかもしれない。そのような物質を発見する必要性が存在するのである。発明の概要本発明は造血多能性幹細胞又は前駆細胞をプロラクチンを含む組成物と接触させることにより造血を増強する方法に関する。好ましくは使用されるプロラクチンは組換えプロラクチンである。造血の刺激は、造血細胞が治療薬又は処置のために除去されるとき、それを置換するのに役立ち得る。この増強はまた、枯渇した又は機能が弱まった細胞集団に対して新たな又は追加的な細胞系統を補充するためにも機能し得る。さらに本発明は、プロラクチンを含む薬剤的に許容される組成物を投与することによって、造血を増進する又は造血抑制を予防するために動物を処置する方法に関する。さらに本発明は、造血を増強し得るサイトカイン及びプロラクチンを含む組成物に関する。さらに本発明は、造血抑制を起こし得る治療薬及びプロラクチンを含む組成物に関する。図面の簡単な説明図１Ａは、増進された累積細胞充実度によって証明されるように、組換えヒトプロラクチンが長期骨髄培養において造血前駆細胞の成長を促進することを示すグラフ図である。図１Ｂは、コロニー形成単位−培養系アッセイによって測定されるように、組換えヒトプロラクチンが長期骨髄培養において造血前駆細胞の成長を促進することを示すグラフ図である。図１Ｃは、バースト形成単位−赤芽球系アッセイによって測定されるように、組換えヒトプロラクチンが長期骨髄培養において造血前駆細胞の成長を促進することを示すグラフ図である。図２は、アジドチミジン（ＡＺＴ）が骨髄細胞中の造血前駆細胞含量を有意に低下させること及びプロラクチンがヘマトクリットによって測定されるようにその効果を中和することを示すグラフ図である。図３Ａは、増進された累積細胞充実度によって証明されるように、骨髄細胞中の造血前駆細胞含量を有意に低下させるアジドチミジンの骨髄抑制効果をプロラクチンが中和することを示すグラフ図である。図３Ｂは、コロニー形成単位−培養系アッセイによって測定されるように、骨髄細胞中の造血前駆細胞含量を有意に低下させるアジドチミジンの骨髄抑制効果をプロラクチンが中和することを示すグラフ図である。図３Ｃは、バースト形成単位−赤芽球系アッセイによって測定されるように、骨髄細胞中の造血前駆細胞含量を有意に低下させるアジドチミジンの骨髄抑制効果をプロラクチンが中和することを示すグラフ図である。図４は、ヘマトクリットによって測定されるように、前処置したマウスにおいて、プロラクチンがＡＺＴの骨髄抑制効果を予防することを示すグラフ図である。図５は、ヘマトクリットによって測定されるように、プロラクチンがＡＺＴの骨髄抑制効果を逆転させ得ることを示すグラフ図である。図６Ａは、プロラクチンが血小板含量を増加させることを示すグラフ図である。図６Ｂは、プロラクチンが白血球数を増加させることを示すグラフ図である。図７Ａ及び７Ｂは、血球百分率分析によって、血液中のリンパ球及び好中球の比率が有意に増加し、プロラクチンが末梢リンパ球及び好中球の発達を増進させたことを示唆するグラフ図である。図８は、ＫＬＨ（アオガイ［ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔ］ヘモシアニン）特異的ＩｇＧ及びＩｇＭの増加した産生によって測定されるように、ＫＨＬに対する応答性を増進することによってプロラクチンがＢ細胞の前駆細胞に影響を及ぼしたことを示すグラフ図である。図９は、細胞毒性によって評価されるように、プロラクチンがナチュラルキラー細胞の機能を強めることを示すグラフ図である。発明の詳細な説明［定義］ここに使用される「プロラクチン」とは、当業者に知られた組織培養又は組換え技術及び他の技術によって得られるポリペプチドを指し、このタンパク質を特徴付ける活性スペクトルを示すものである。この言葉はヒトプロラクチン（ｈＰＲＬ）だけでなく、マウス、ラット、霊長類、ウサギ、ブタ（ヒツジ）及び雌牛（ウシ属）のプロラクチンのような他の哺乳類のプロラクチンも含む。組換えＰＲＬ（ｒ−ＰＲＬ）は、任意の活性フラグメント又は活性プロラクチン配列を含む。「組換えＰＲＬ」なる用語は、ｒ−ＰＲＬと略記され、好ましくはヒトプロラクチンであり、当業者に知られている組換えＤＮＡ技術によって製造される天然のプロラクチンに匹敵する生物活性を有するプロラクチンを指す。「血液形成(ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｓｉｓ)」又は「造血(ｈｅｍｏｐｏｉｅｓｉｓ)」なる用語は、多能性幹細胞、骨髄性前駆細胞、リンパ様の前駆細胞及びそれらから派生する血小板等の血液産物を含む種々のタイプの細胞の形成及び発達を含む従来からの言葉の意義を指す。「薬剤的に許容される組成物」という句は、動物に投与したときにその動物によって許容される任意のフォーミュレーション又は調製物を指す。投与には、経口投与及び皮下、腹膜腔内、静脈内、皮内、筋肉内投与等を含む注射がある。「造血抑制」なる用語は、ＡＺＴ、放射線、細胞減少性の処置、化学療法、細胞溶解療法、免疫細胞溶解療法又はそれらの組み合わせのような処置によって引き起こされる骨髄抑制又はリンパ抑制を含む。ここに使用される「サイトカイン」又は「サイトカイン類」なる用語は、幹細胞又は前駆細胞の増大及び分化を刺激し得る任意のサイトカイン又は成長因子又はコロニー刺激因子を意味するとされている。サイトカインには、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン− ４、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−９、インターロイキン−１１，インターロイキン−１５、ｃ−Ｋｉｔリガンド、顆粒球単球コロニー刺激因子、単球コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｍｐｌリガンド、エリスロポエチン(Ｅｐｏ)、トロンボポエチン (Ｔｐｏ)、成長ホルモン(ＧＨ)、インスリン様増殖因子(ＩＧＦ)、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）及びそれらの混合物がある。実施例Ｉ：プロラクチンの造血前駆細胞含量に対するインビボ効果ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）マウス（８〜１２週齢）に、０．２ｍＬのハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）［メディアテック社、ハーンドン、ＶＡ］に再懸濁した組換えヒトプロラクチン（ｒ−ｈＰＲＬ、ジェンザイム社）を１０μｇ注射した。動物は１０日間隔日に腹膜腔内注射を受けた(全５回の注射)。マウスは週毎に体重を測定した。抗凝固剤としてＥＤＴＡを用いてマウスの外側尾静脈より血液を採取した。全血球計算はＨＣ８２０血液分析計（ダーナム・エレクトロニクス社、ダラス、ＴＸ）を用いて又はメトパス（Ｍｅｔｐａｔｈ）(ロックビル、ＭＤ)によって実施した。骨髄及び脾臓の細胞充実度はコウルター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）カウンター（コウルター・エレクトロニクス、ハイアレア、ＦＬ）を用いてアッセイした。１つの脛骨から採取した脾臓細胞及び骨髄細胞（ＢＭＣ）は、１０％のウシ胎仔血清(ＦＢＳ)、１％のＬ−グルタミン及び抗生物質を含むイスコーヴ（Ｉｓｃｏｖｅ）改良型ダルベッコ培養液（ＩＭＤＭ）で洗浄し、再懸濁した。長期骨髄培養（ＬＴＢＭＣ）は、ステムセルテクノロジーズ（ブリティッシュコロンビア、カナダ）より購入したＬＴＢＭＣ用の無血清培地にて維持した。これには、ＢＭＣのインビトロ発育に必要なすべての栄養成分とサイトカインが含まれる。マウス大腿骨より採取したＢＭＣは、２４穴プレートにて、１ｘ１０⁶／ｍＬの開始濃度で培養した。３日毎に、培養液の半量を新鮮な培地と交換した。この細胞濃度が２ｘ１０⁶／ｍＬ以上になったとき、培養物を希釈して、２つの穴に分けた。１０日毎に培養物の細胞充実度を評価するとともに、ＣＦＵ−ｃ及びＢＦＵ−ｅのコロニーアッセイを実施した。コロニー形成単位−培養系（ＣＦＵ−ｃ）アッセイは、Ｍｕｒｐｈｙ等(１９９２)、Ｂｌｏｏｄ８０：１４４３〜１４４７の記載に従って実施した。簡略に言うと、ＣＦＵ−ｃアッセイのためには、３５ｍｍルクスシャーレ（マイルズラボラトリーズ社、ナパービル、ＩＬ）の０．３％細菌用寒天培地（ディフコラボラトリーズ、デトロイト、ＭＩ）にて、１プレートあたり１ｘ１０⁶の脾臓細胞又は２ｘ１０⁵のＢＭＣ濃度で、細胞を培養した。コロニー形成は、組換えマウス顆粒球マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）１０ｎｇ／ｍＬ（アムジェン社、サウザンドオークス、ＣＡ）及び組換えマウスインターロイキン−３（ＩＬ−３）１０ｎｇ／ｍＬ（生体反応修飾物質プログラムレポジトリー(Biologica l Response Modifiers Repository)、フレデリック、ＭＤより提供）のような、至適濃度が前もって決定された成長促進サイトカインによって刺激された。プレートは３７℃、湿度１００％、５％ＣＯ2の空気条件にて７日間保温し、コロニー数を数えた。コロニーとは５０個以上の細胞の成長集団として定義された。バースト形成単位−赤芽球系（ＢＦＵ−ｅ）アッセイは、ＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎＪＲ等(１９７１)、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＵＳＡ，６８：１５４２の記載に従って実施した。バーストＢＦＵ−ｅアッセイには、５ｍＬの懸濁液（細胞液１．５ｍＬ、ＦＢＳ１．５ｍＬ、１０％ＢＳＡ０．５ｍＬ、１．０ｍＭ２−メルカプトエタノール０．５ｍＬ、Ｅｐｏ０．５ｍＬ及び組換えマウスＩＬ −３（ｒｍＩＬ−３）０．５ｍＬ）を調製した。エリスロポエチン(Ｅｐｏ、ステムセルテクノロジーズ、ブリティッシュコロンビア、カナダ）、ｒｍＩＬ−３、細胞の最終濃度は、それぞれ、２Ｕ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１ｘ１０⁵／ｍＬであった。ＢＦＵ−ｅは保温１２日後にスコア化した。ＢＦＵ−ｅとは、５０又はそれ以上のベンチジン陽性細胞を含む集団として定義された。すべてのアッセイには各群少なくとも３匹のマウスを用いて少なくとも３回実施し、代表的な実験結果を示した。この軟寒天コロニーアッセイは、プロラクチンがＢＭＣ及び脾臓の造血前駆細胞含量を変化させ得ることを示した。上記表１に示された結果は、ｒ−ｈＰＲＬの投与がマウスの２つの系統において脾臓及びＢＭＣのコロニー形成単位−培養系（ＣＦＵ−ｃ）及びバースト形成単位−赤芽球系（ＢＦＵ−ｅ）の有意な（ｐ＜０．０１）増加をもたらすことを示した。しかしながら、ＢＭＣ及び脾臓の細胞充実度については有意な効果を検出しなかったし(上記の表１)、ｒ−ｈＰＲＬを１００μｇ投与しても正常レシピエントの末梢血球百分率数は変化しなかった (データ示さず)。さらに、ｒ−ｈＰＲＬを１０μｇ注射されたレシピエントの体重にも優位な増加を認めなかった(データ示さず)。従って、ｒ−ｈＰＲＬはインビボ投与後に造血性の成長促進効果を有意に発揮すると思われる。実施例ＩＩ．プロラクチンの造血前駆細胞含量に対するインビトロ効果造血成長に対するｒ−ｈＰＲＬの直接効果を証明するために短期コロニー培養系（ＣＦＵ−ｃ及びＢＦＵ−ｅ）及び長期懸濁培養系（ＬＴＢＭＣ）が評価された。この軟寒天培地のコロニーアッセイの方法は上記の実施例１に記載された。上記実験の結果は、ｒ−ｈＰＲＬが用量依存的にＣＦＵ−ｃ及びＢＦＵ−ｅの形成を促進することを実証した(下記の表２)。マウスのＣＦＵ−ｃ及びＢＦＵ−ｅ形成の至適用量はプロラクチン５０ｎｇであり、ヒトの系での最適用量は１００ｎｇであった。また、懸濁培養の累積細胞充実度が５０日間の培養の間増加することを示し、ｒ−ｈＰＲＬがＬＴＢＭＣにおいて造血前駆細胞の成長を促進することも認められた(図１ａ)。長期ＢＭ培養においては、造血前駆細胞含量（ＣＦＵ−ｃ及びＢＦＵ−ｅ）もｒ−ｈＰＲＬ処置後に増加した(図１ｂ及び図１ｃ)。実施例ＩＩＩ．骨髄抑制を誘発する手段としてＡＺＴを投与されたマウスにおける造血前駆細胞含量に対するプロラクチンの効果ＡＺＴの用量制限毒性のひとつがその骨髄毒性的な性質に由来する貧血であるので、マウスをｒ−ｈＰＲＬ及びＡＺＴで同時に処置することが血液学的パラメータの改善をもたらすかどうかを決定するための試験が行われた。Ｂ６マウスにＡＺＴ（飲料水１ｍＬあたり２．５ｍｇ）を数週間与えた。分析すると、これらのマウスは、正常マウスに比べて、ＣＦＵ−ｃ及びＢＦＵ−ｅで測定される（下記の表３）ように有意に低い（ｐ＜０．０１）造血前駆細胞含量と有意に低いヘマトクリット（ＨＣＴ）を示した(図２)。これらの効果はＡＺＴをより長く与えるとよりはっきりした。ほとんどの血液学的数値が対照値のほぼ半分に近づいたからである。数群のマウスに同時に１、１０又は１００μgのｒ−ｈＰＲＬを２０日間隔日に腹膜腔内投与した。細胞充実度及びコロニーアッセイ（ＣＦＵ−ｃ及びＢＦＵ −ｅ）を１４日目又は２８日目に測定した。上記表３に示された結果は造血及び血液学的パラメータがプロラクチンの同時投与で有意に（ｐ＜０．０１）改善したことを示している。ＣＦＵ−ｃ／大腿骨又はＢＦＵ−ｅ／大腿骨は、コロニー数／２ｘ１０⁵ｘ大腿骨の細胞充実度、として計算した。造血前駆細胞含量（ＣＦＵ−ｃ及びＢＦＵ−ｅ）は正常値又はそれ以上に完全に回復した。ＨＣＴ値もｒ−ｈＰＲＬの処置に反応して増加し(図２)、ＡＺＴ投与と同時にｒ−ｈＰＲＬで処置した後１４日目に検査したマウスでは、２９．５＋／−１．３％から４０．３＋／−３．２％へ増加していた。同様の結果は２８日目でも得られた。さらに、ｒ−ｈＰＲＬの反復注射に由来する明らかな病理効果をマウスは示さなかった。マウスは試験期間中ずっと良好な健康状態であったと考えられる。それらは一定の体重を維持し、試験終了時に屠殺したマウスは肉眼的に見て病的異常性を示さなかった。ｒ−ｈＰＲＬがＡＺＴの骨髄抑制効果を直接中和し得るかどうかを決定するための実験も行われた。ＡＺＴ及び様々な用量のｒ−ｈＰＲＬの存在下でＣＦＵ− ｃ及びＢＦＵ−ｅコロニーアッセイを行った。マウス及びヒトのコロニー培養系において、プロラクチンは、ＡＺＴ誘発性のＣＦＵ−ｃ及びＢＦＵ−ｅ形成抑制を用量依存的に中和し得た(下記の表４)。さらに、すでに記載されたようにして実施した長期ＢＭ培養系（図３）において、ｒ−ｈＰＲＬは、増進された累積細胞充実度（図３ａ）及び増加した造血前駆細胞含量（ＣＦＵ−ｃ、図３ｂ及びＢＦＵ−ｅ、図３ｃ）によって示されるように、ＡＺＴによる成長阻害を逆転させた。実施例ＩＶ．プロラクチンの早期投与はマウスにおけるＡＺＴ誘発性骨髄抑制を予防する。ＡＺＴによって引き起こされるような骨髄抑制の前に投与されたプロラクチンが造血パラメータを予防及び改善するかを確かめるための試験がなされた。Ｂ６マウスに１４日間隔日に１０μｇのｒ−ｈＰＲＬを腹膜腔内に注射した後、さらに１４日間、ｒ−ｈＰＲＬの注射をせずに、ＡＺＴを飲料水で投与した(飲料水１ｍＬあたり２．５ｍｇ)。種々の時点で細胞充実度及び前駆細胞含量（ＣＦＵ −ｃ及びＢＦＵ−ｅ）を決定した。ＡＺＴによって誘発される骨髄抑制に対する有意な予防が観察された。ＨＣＴ値は２９日目から３４日目にかけて有意に（ｐ＜０．０１）増加した(図４)。造血前駆細胞（ＣＦＵ−ｃ及びＢＦＵ−ｅ）もｒ −ｈＰＲＬで前処置したマウスにおいてＡＺＴ投与期間に有意に（ｐ＜０．０１）増加した(下記の表５)。以上の結果は、ｒ−ｈＰＲＬがインビボで前駆細胞を予防し得ること及びその骨髄抑制へ抵抗する能力を高め得ることを示唆している。実施例Ｖ．プロラクチンの後期投与はマウスにおいてＡＺＴ誘発性骨髄抑制を逆転する。ＡＺＴによって引き起こされるような骨髄抑制の後にｒ−ｈＰＲＬを投与すると造血及び血液学パラメータが改善するかを決定するための試験がなされた。Ｂ６マウスに１４日間ＡＺＴを飲料水で投与した(飲料水１ｍＬあたり２．５ｍｇ) 。この２週間後に、マウスを評価して骨髄抑制されていることを確かめた。動物はその後２０日間隔日に１０μｇのｒ−ｈＰＲＬを腹膜腔内注射された(全１０回の注射)。動物は種々の時点で細胞充実度及び前駆細胞含量を評価された。２９日目（７回のｒ−ｈＰＲＬ注射）にｒ−ｈＰＲＬ処置マウスにおいてＢＭＣ造血細胞含量の有意な改善が認められた(下記の表６)。ＣＦＵ−ｃ／大腿骨又はＢＦＵ−ｅ／大腿骨は、コロニー数／２ｘ１０⁵ｘ大腿骨の細胞充実度、として計算した。数値は各群３〜４匹のマウスを含む３回の実験結果を代表している。ＨＣＴ値も２４日目（ｒ−ｈＰＲＬ処置後１０日目）までにはほぼ正常レベルに回復し、ＨＢＳＳ対照よりも有意に高かった(図５)。以上の知見は、ｒ−ｈＰＲＬがＡＺＴに誘発される骨髄抑制を逆転し得ることを示唆している。実施例ＶＩ．プロラクチンは致死的放射線照射に次ぐ骨髄移植後の造血復元を促進する。レシピエントのＢＡＬＢ／ｃマウス（８〜１２週齢）を¹³⁷Ｃｓの放射線源にさらし、細胞復元試験のためにその動物を致死的に放射線照射した。マウスは全身に８５０センチグレイ（ｃＧｙ）の放射線を受けた。このマウスに１ｘ１０⁶ 個の同系ＢＭＣを静脈内（ｉｖ）投与した。この方法は同系骨髄移植（ＳＢＭＴ）として知られている。各群５匹のマウスに対し、各実験を３〜４回実施した。同系骨髄移植（ＳＢＭＴ）後１日目に、１０μｇｒ−ｈＰＲＬ又は対照としてハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）の処置を開始した。０．２ｍＬのＨＢＳＳに再懸濁したｒ−ｈＰＲＬを隔日腹膜腔内注射して、その後マウスはアッセイするか又は２０日間にわたり全１０回の注射をした。マウスは週毎に体重を測定した。抗凝固剤としてＥＤＴＡを用いてマウスの外側尾静脈より血液を採取した。全血球計算はＨＣ８２０血液分析計（ダーナム・エレクトロニクス社、ダラス、ＴＸ）を用いて又はメトパス（Ｍｅｔｐａｔｈ）(ロックビル、ＭＤ)によって実施した。骨髄、脾臓及び胸腺の細胞充実度はコウルター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）カウンター（コウルター・エレクトロニクス、ハイアレア、ＦＬ）を用いてアッセイした。脾臓細胞及び骨髄細胞は、その細胞充実度及びそのコロニー形成能によって決定される前駆細胞含量を評価された。要約すると、インビトロ造血アッセイはすでに記載されたようにして実施された。要約すると、脾臓細胞及び骨髄細胞（ＢＭＣ）は１つの脛骨から採取し、１０％のウシ胎仔血清(ＦＢＳ)、１％のＬ−グルタミン及び抗生物質を含むイスコーヴ（Ｉｓｃｏｖｅ）改良型ダルベッコ培養液（ＩＭＤＭ）で洗浄し、再懸濁した。コロニー形成アッセイ（ＣＦＵ−ｃ及びＢＦＵ−ｅ）は上記実施例Ｉに記載したようにして実施した。表７（下記に示す）に示された結果は、ｒ−ｈＰＲＬの投与が、ＳＢＭＴ後１４日目又は２１日目のＣＦＵ−ｃ及びＢＦＵ−ｅによって決定されるように、ＢＭＣと脾臓の両方の前駆細胞含量を有意に（ｐ＜０．０１）増加させることを証明している。大腿骨又は脾臓当たりの全前駆細胞数（大腿骨の細胞充実度／２ｘ１０⁵ＢＭＣｘＣＦＵ−ｃ又はＢＦＵ−ｅ／大腿骨又は脾臓のプレート）は、ｒ −ｈＰＲＬを受けたマウスで増加した。ＢＭＣの全造血前駆細胞（ＣＦＵ−ｃ）数は１４日目に６．２倍に、２１日目に１１．７倍に増加した。ｒ−ｈＰＲＬを受けたマウスにおいて、脾臓のＣＦＵ−ｃは１４日目に５．４倍に、２１日目に１０．８倍に増加した。ｒ−ｈＰＲＬがＳＢＭＴ後の造血復元を促進し得ることを上記の結果が示唆したので、成熟細胞集団におけるその後の変化を調べるために末梢血を検査した。図６ａに示されるように、ｒ−ｈＰＲＬ１０μｇの投与は１５日、１８日、２１日（ｐ＜０．０１）及び２８日（ｐ＜０．０５）において血小板含量を有意に増加させた。この濃度で、プロラクチンはまた白血球数を有意に（７、１５、１８日はｐ＜０．０１、２１日はｐ＜０．０５）増加させた(図６ｂ)。血球百分率分析（図７）は、血液中のリンパ球及び好中球の比率が７日及び２１日目に有意に（ｐ＜０．０１）増加したことを示したが、このことはｒ−ｈＰＲＬが末梢リンパ球と好中球の発達を増進したことを示唆している。顆粒球に対するプロラクチン投与の効果もフローサイトメトリーによって上記のマウスで評価した。１４日目又は２１日目まで隔日にｒ−ｈＰＲＬを受けたマウスを４群に分ける一方で、ＨＢＳＳを受けた対照動物も他の４群に分けた。２つのｒ−ｈＰＲＬ処置マウス群及び２つのＨＢＳＳ処置マウス群の脛骨（ＢＭ）より単一細胞懸濁液を採取した。脾臓由来の単一細胞懸濁液は、ｒ−ｈＰＲＬ及びＨＢＳＳ処置群の残り２つの群より採取した。ＢＭ及び脾臓細胞の両方をすでに記載された（Ｍｕｒｐｈｙ等、１９９２．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ１４８：３７９９〜３８０５）二重色サイトメトリック分析法によって分析した。要約すると、ベクトンディキンソン（マウンテンビュー、ＣＡ）より入手したラットＦＩＴＣ標識抗５Ｅ６（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）抗体及びラットＰＥ標識８Ｃ５（顆粒球）抗体で細胞を染色した。この細胞を１００％パラホルムアルデヒドに固定し、ＥＰＣＩＳフローサイトメーターで分析した。対照としてＦＩＴＣ又はＰＥで標識した正常ラットの免疫グロブリン（ＮＲＩｇ）を用いて、各群あたり３〜４匹のマウスを使用した。この方法を用いると、８Ｃ５⁺（顆粒球マーカー）細胞の含量がＢＭと脾臓の両方で増加していることが認められた。ＢＭと脾臓の細胞充実度も増加した（ＢＭ群対ＢＭ＋ｒ−ｈＰＲＬ群：ＢＭでは７．８ｘ１０⁶対１２．６ｘ１０⁶、脾臓では５４．５ｘ１０⁶対７８．５ｘ１Ｏ⁶）ので、ＢＭと脾臓における８Ｃ５⁺顆粒球の絶対数も１４日目にはそれぞれ２．２４倍と２．８５倍に増加した。この細胞集団は２１日目には２．０３倍と１．９２倍に増加した。まとめれば、上記の実験結果は、ｒ−ｈＰＲＬ処置がＢＭＣの生着を促進し、造血前駆細胞の発達を増進させ、成熟細胞集団数の増加をもたらしたことを証明している。実施例ＶＩＩ．ＢＭＴ後のプロラクチン処置はＢ細胞系統の発達を増進する。Ｂ細胞前駆体含量及び、Ｂ細胞の機能性アッセイとして、Ｂ細胞分裂誘発因子への応答性をＳＢＭＴ後のマウスを用いて評価した。６群のマウスがｒ−ｈＰＲＬ処置を受けた（１４日又は２１日目まで隔日１０μｇの注射）のに対し、６群の対照マウスはＨＢＳＳを受けた。Ｂ細胞前駆体含量は、上記の二重標識法及びベクトンディキンソンより入手したＦＩＴＣ標識抗Ｂ２２０及びＰＥ標識ｓＩｇＭを用いたフローサイトメトリーによって決定された。Ｂ細胞前駆体はＢ２２０マーカーには陽性に、表面ＩｇＭ（ｓＩｇＭ）には陰性に染色される。このＢ細胞前駆体（Ｂ２２０⁺ｓＩｇＭ^-細胞）の含量は、ｒ−ｈＰＲＬ処置後１４日及び２１日目のＢＭ及びリンパ節（ＬＮ）では増加したが、脾臓では増加しなかった。処置後１４日目のＢＭ及びＬＮにおけるＢ細胞前駆体の絶対数はそれぞれ２．５６倍及び３．７８倍（細胞充実度ｘ陽性細胞数）に増加したが、このことはｒ −ｈＰＲＬがＢ細胞系統の生着及び発達を促進させることを示唆している。また、成熟Ｂ細胞（Ｂ２２０⁺ｓＩｇＭ⁺細胞）含量も、ＳＢＭＴ後１４日及び２１日目で脾臓とＬＮのいずれでも増加していることが認められた。Ｂ細胞数の増加に加えて、脾臓Ｂ細胞の機能性も評価された。このことは、標準的なトリチウム化チミジン増殖アッセイを利用して、Ｂ細胞の分裂誘発因子であるＬＰＳへの増殖応答性を評価することによってなされた。下記の表８に示されるように、ｒ−ｈＰＲＬ処置群のＣＰＭ（カウント毎分）は対照群よりも有意に高く(いずれのＬＰＳ用量でもｐ＜０．０１)、各ＬＰＳ用量で刺激指数（ＳＩ）が増加していることから、ｒ−ｈＰＲＬを受けたマウスの脾細胞で、Ｂ細胞分裂誘発因子に対する増殖応答性が増加したことが証明された。ＢＭＣ移植マウスは、ＫＬＨで免疫しその後のＩｇＧ及びＩｇＭ応答を測定することにより、さらにＢ細胞機能を評価した。２１日目（例えば、ＫＬＨ免疫化の２週間後）に脾臓を採取し、細胞懸濁液を用いてＫＬＨに特異的な応答を評価した。ｒ−ｈＰＲＬ処置マウスでは、ＫＬＨ特異的ＩｇＧ及びＩｇＭのいずれもが増加していた(図８参照)。上記の知見は、ＰＲＬが造血前駆細胞由来のＢ細胞系統の発達及び機能をＳＢＭＴ後に増進させ得ることを証明している。実施例ＶＩＩＩ．ＢＭＴ後のプロラクチン処置はＴ細胞系統の発達を増進する。ＳＢＭＴ後ｒ−ｈＰＲＬで処置した動物の胸腺におけるＴ細胞前駆体（ＣＤ４⁺ ＣＤ８⁺細胞）含量とＴ細胞の機能を評価した。Ｔ細胞前駆細胞の含量はすでに記載した二重色フローサイトメトリー分析法によって分析した。使用した試薬は、ベクトンディキンソンより入手したＦＩＴＣ標識抗Ｌｙｔ−２（ＣＤ８）及びＰＥ標識抗Ｌ３Ｔ４（ＣＤ４）を含む。胸腺中のＴ細胞前駆体含量（ＣＤ４⁺ＣＤ８⁺細胞）は、ＳＢＭＴ後１４日目及び２１日目に試験したとき増加していた。脾臓及びリンパ節の成熟Ｔ細胞（ＣＤ４⁺ＣＤ８^-又はＣＤ４^-ＣＤ８⁺細胞）含量もまた増加していた。Ｔ細胞機能に対するｒ−ｈＰＲＬ投与の効果も評価された。一次免疫応答時の抗原特異的Ｔ細胞に対するプロラクチンの効果は、ＳＢＭＴ後にＫＬＨで免疫したマウスにおけるＫＬＨに対する脾臓Ｔ細胞の増殖性を検査することによって評価した。マウスは、ＳＢＭＴ後７日目に、完全フロインドアジュバントに溶かした１００μｇのＫＬＨを皮下注射して免疫した。２１日目（即ち、ＫＬＨ免疫後２週目）に脾臓を採取し、細胞懸濁液を用いてＫＬＨ特異的な増殖性を評価した。要約すると、平底９６穴プレート（コスター）にＫＬＨ（１００μｇ／ｍＬ）及び脾細胞（１ｘ１０⁶／２００ｍＬ／穴）を加えた。４日後、１ｍＣｉの³Ｈ−チミジン（６．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ニューイングランドヌクレア、ボストン、ＭＡ）で８時間パルスし、次いでＭＡＳＨＩＩ装置（ミクロバイオロジカルアソシエーツ、ベテスダ、ＭＤ）を用いて細胞を採取することすることにより増殖性をアッセイした。取り込まれた標識ＤＮＡをシンチレーションカウンターを用いてカウントした。この実験の結果を表９に示す。このデータは、ｒ−ｈＰＲＬ処置を受けたマウスにおいてＫＨＬに対するインビトロの増殖性が有意に増加したことで示されるように、ｒ−ｈＰＲＬ投与が有意な免疫増強効果を発揮したことを示している。このデータは、ｒ−ｈＰＲＬが造血前駆細胞由来のＴ細胞系統の発達及び機能をＳＢＭＴ後に増進させ得ることを証明している。実施例ＩＸ．プロラクチンはＢＭＴ後のＮＫ回復を増進する。ＮＫ細胞は、腫瘍及びウィルス被感染細胞に対するＭＨＣ非拘束性の殺傷反応を仲介するリンパ系細胞である。最近、ＮＫ細胞が造血において重要な役割を果たしていることが報告された。それ故、ＳＢＭＴ後、ｒ−ｈＰＲＬ処置の有無でのＮＫ細胞の発達及び機能を検査する試験がなされた。全ＮＫ細胞（５Ｅ６⁺細胞）含量に対する効果は、すでに記載したフロ−サイトメトリーを用いて評価した。下記の表１０に示したように、ＢＭ及び脾臓のＮＫ（５Ｅ６⁺細胞）含量は、ＳＢＭＴ後にｒ−ｈＰＲＬ投与を受けたマウスで増加した。ＢＭと脾臓、いずれの細胞充実度も増加した（ＢＭ群対ＢＭ＋ｒ−ｈＰＲＬ群：ＢＭでは７．８ｘ１０⁶対１２．６ｘ１０⁶、脾臓では５４．５ｘ１０⁶対７８．５ｘ１０⁶）ので、ＢＭと脾臓におけるＮＫ細胞の絶対数も１４日目にはそれぞれ５．４１倍と４．８３倍に増加した。この数値は２１日目には２．３４倍と１．７８倍に増加した。ＮＫ細胞毒性を評価することによって上記ＮＫ細胞の機能性も試験した。ＹＡＣ−１（ＮＫ感受性の標的細胞）をＮａ⁵¹ＣｒＯ₄（ニューイングランドヌクレア、ボストン、ＭＡ、比活性約４００μＣｉ／μｇ）とともに３７℃１時間保温して標識した。保温後、この標的細胞を、アッセイ使用前に２％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ１６４０で３回洗浄した。エフェクタ細胞（脾細胞）と標的細胞を、エフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）細胞比が、４０／１、２０／１、１０／１及び５／１になるように合わせて丸底９６穴プレート（コスター）に入れた。４複製穴を用いた。標準的な４時間保温の後、上澄液を回収し、ガンマカウンター（モデル５０００、ベックマンインスツルメント、アービン、ＣＡ）を用いて分析した。特異的細胞溶解比率は以下のように計算された：特異的細胞溶解（％）＝（ＣＰＭ_試験−ＣＰＭ_自発／ＣＰＭ_最大−ＣＰＭ_自発）ｘ１００。この方法を用いたとき、標準的なＹＡＣ−１細胞標的を用いた細胞毒性によって評価されるように、ＳＢＭＴを受けたマウスにおいて、ｒ−ｈＰＲＬがＮＫ機能を確かに増強させていることが観察された(図９)。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者マーフィー，ウィリアム・ジェイアメリカ合衆国メリーランド州21701，フレデリック，スクーナー・コート 7996 (72)発明者ロンゴ，ダン・エルアメリカ合衆国メリーランド州20895― 3503，ケンジントン，バーロール・レイン 9610

Claims

【特許請求の範囲】１．造血幹細胞又は前駆細胞にプロラクチンを含む組成物を加えることから成る造血を増強する方法。２．プロラクチンが組換えプロラクチンである請求項１の方法。３．プロラクチンがヒトプロラクチンである請求項１の方法。４．プロラクチンを含む薬剤的に許容される組成物の有効量を投与することから成る、造血を増進するために動物を処置する方法。５．プロラクチンが組換えプロラクチンである請求項４の方法。６．プロラクチンがヒトプロラクチンである請求項４の方法。７．動物が造血抑制を蒙っている請求項４の方法。８．ＡＺＴ、放射線曝露、細胞減少性の処置、化学療法、細胞溶解療法、免疫細胞溶解療法及びそれらの組み合わせより構成されるグループから選択される治療的処置によって造血抑制が引き起こされている請求項７の方法。９．プロラクチンを含む薬剤的に許容される組成物の有効量を投与することから成る、造血抑制を予防するために動物を処置する方法。１０．プロラクチンが組換えプロラクチンである請求項９の方法。１１．プロラクチンがヒトプロラクチンである請求項９の方法。１２．ＡＺＴ、放射線曝露、細胞減少性の処置、化学療法、細胞溶解療法、免疫細胞溶解療法及びそれらの組み合わせより構成されるグループから選択される治療的処置によって造血抑制が引き起こされる請求項９の方法。１３．造血を増強し得るサイトカイン及びプロラクチンを含む組成物。１４．プロラクチンが組換えプロラクチンである請求項１３の組成物。１５．プロラクチンがヒトプロラクチンである請求項１３の組成物。１６．インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−９、インターロイキン−１１、インターロイキン−１５、ｃ−Ｋｉｔリガンド、顆粒球単球コロニー刺激因子、単球コロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｍｐｌリガンド、Ｅｐｏ、Ｔｐｏ，ＧＨ、ＩＧＦ、ＴＧＦ−β及びそれらの混合物より構成されるグループからサイトカインが選択される請求項１３の組成物。１７．造血抑制を起こす可能性がある治療薬及びプロラクチンを含む組成物。１８．プロラクチンがヒトプロラクチンである請求項１７の組成物。１９．プロラクチンが組換えプロラクチンである請求項１７の組成物。２０．プロラクチンが組換えヒトプロラクチンである請求項１７の組成物。２１．ＡＺＴ、化学療法薬、抗細胞溶解薬、免疫細胞溶解薬及びそれらの組み合わせより構成されるグループから治療薬が選択される請求項１７の組成物。